JPH0292287A - 抗甲虫類毒素およびその遺伝子 - Google Patents
抗甲虫類毒素およびその遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
- C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、細菌分子生物学の分野、特に甲虫類の害虫か
ら植物を保護することを目的とする組換え技術による遺
伝子工学に関する。ここでは、バチルス チューリンゲ
ンシスｖａｒ、テネプリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ）由来の無傷および部分修飾δ−内毒素遺伝子
のクローニングと特徴づけと選択的発現とを開示する。
ら植物を保護することを目的とする組換え技術による遺
伝子工学に関する。ここでは、バチルス チューリンゲ
ンシスｖａｒ、テネプリオニス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ）由来の無傷および部分修飾δ−内毒素遺伝子
のクローニングと特徴づけと選択的発現とを開示する。
また、宿主微生物中にクローン化遺伝子を移入して、該
生物が甲虫に対する毒性をもつタンパクを生産できるよ
うにすることを開示する。本発明は。
生物が甲虫に対する毒性をもつタンパクを生産できるよ
うにすることを開示する。本発明は。
作物栽培学的価値を有する新規な毒素を発現する細菌の
遺伝子工学を容易にするものである。
遺伝子工学を容易にするものである。
（従来の技術）
昆虫に対して病原性の細菌のうち、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓが主要グループを形成する
胞子形成バチルスは、害虫群の処理に利用される可能性
が最も高いと見なされている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎ−■ｅｎｓｉｓ胞子形成中胞子形成中休毒素
前駆体。これらのタンパクは、胞子外封入体として、ま
たは胞子の表面に蓄積される。毒性作用は、封入体また
は胞子が感受性のある幼虫によって摂取された時゛に起
こる。毒素効果の機構は詳細は知られていないが、その
うち数段階は知られている。摂取後。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓが主要グループを形成する
胞子形成バチルスは、害虫群の処理に利用される可能性
が最も高いと見なされている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔ
ｈｕｒｉｎ−■ｅｎｓｉｓ胞子形成中胞子形成中休毒素
前駆体。これらのタンパクは、胞子外封入体として、ま
たは胞子の表面に蓄積される。毒性作用は、封入体また
は胞子が感受性のある幼虫によって摂取された時゛に起
こる。毒素効果の機構は詳細は知られていないが、その
うち数段階は知られている。摂取後。
毒素前駆体は中腸内で溶解し、そこでｐＨ条件とプロテ
アーゼが毒素前駆体を毒素に変え９次いで毒素は中腸上
皮細胞の表面にあるリセプター分子に結合し、中腸の構
造および機能を崩壊させ、ついには死に至らしめる。主
として多くの種類の鱗翅類、数種の双翅類、および近年
発見された甲虫類を含み、ある範囲の活性を有する数種
のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ由来の
毒素が開示されている。
アーゼが毒素前駆体を毒素に変え９次いで毒素は中腸上
皮細胞の表面にあるリセプター分子に結合し、中腸の構
造および機能を崩壊させ、ついには死に至らしめる。主
として多くの種類の鱗翅類、数種の双翅類、および近年
発見された甲虫類を含み、ある範囲の活性を有する数種
のＢａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ由来の
毒素が開示されている。
実際の有害生物防除にＢＬｔｈｕｒｉｎ■ｅｎｓｉｓを
用いる１つの利点は、従来の有害生物防除適用装置にお
いて使用するために容易に処方され、かつヒト、他の哺
乳類および標的としない動物相には無害な安定した胞子
産生にある。しかしながら１葉に散布された胞子および
胞子外結晶は雨に洗い流されたり太陽光線によって不活
化されたりするので、自然環境下では存続せず、その結
果−度数布しただけでは、比較的短い期間しか、害虫を
保護できないため問題である。このため、 Ｂ、 ＄ｓ
ｉｓを従来の殺虫剤として用いる時、農作物を長期間保
護するためには、ＬＬ μｔｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ工
を繰り返し散布しなければならない。さらに鱗翅類に対
してスペクトルの広い毒性を有するＢ、 ＄−山の単離
物が入手可能であるのに、すべての有害生物種に対して
活性な単離物はない。
用いる１つの利点は、従来の有害生物防除適用装置にお
いて使用するために容易に処方され、かつヒト、他の哺
乳類および標的としない動物相には無害な安定した胞子
産生にある。しかしながら１葉に散布された胞子および
胞子外結晶は雨に洗い流されたり太陽光線によって不活
化されたりするので、自然環境下では存続せず、その結
果−度数布しただけでは、比較的短い期間しか、害虫を
保護できないため問題である。このため、 Ｂ、 ＄ｓ
ｉｓを従来の殺虫剤として用いる時、農作物を長期間保
護するためには、ＬＬ μｔｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ工
を繰り返し散布しなければならない。さらに鱗翅類に対
してスペクトルの広い毒性を有するＢ、 ＄−山の単離
物が入手可能であるのに、すべての有害生物種に対して
活性な単離物はない。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの多くの亜種の分
類が鞭毛のセロタイプおよび結晶のセロタイプに基づい
て試みられている（Ｈ，Ｔ、 Ｄｕｌｍａｇｅ（１９８
１）、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐ
ｅ５ｔｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ
、 Ｈ，Ｄ。
類が鞭毛のセロタイプおよび結晶のセロタイプに基づい
て試みられている（Ｈ，Ｔ、 Ｄｕｌｍａｇｅ（１９８
１）、ＭｉｃｒｏｂｉａｌＣｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐ
ｅ５ｔｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ
、 Ｈ，Ｄ。
Ｂｕｒｇｅｓｓ、 １９７０−１９８０＋ Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏｎ 。
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｌｏｎｄｏｎ 。
ｐｐ、１９３−２２２）。大部分で鞭毛（１１）のセロ
タイプと結晶の七ロタイブの間に相関性が見られた。（
例えば、大部分のＬ 田藍ｕ訂並社辷ｖａｒ、且肛旦れ
ｅｎｓｉｓ （セロタイブト１）の単離物はｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶型のものである）。各血清学的
グループにおけるこのような１つの結晶型の優勢に対す
る例外が２つの結晶型（Ｋ−１型およびに一７３型）に
分がれるＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｋｕｒｓｔａｋｉの単離物中に見い出された。Ｋ
−１型およびに一７３型単離物も。
タイプと結晶の七ロタイブの間に相関性が見られた。（
例えば、大部分のＬ 田藍ｕ訂並社辷ｖａｒ、且肛旦れ
ｅｎｓｉｓ （セロタイブト１）の単離物はｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓの結晶型のものである）。各血清学的
グループにおけるこのような１つの結晶型の優勢に対す
る例外が２つの結晶型（Ｋ−１型およびに一７３型）に
分がれるＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｋｕｒｓｔａｋｉの単離物中に見い出された。Ｋ
−１型およびに一７３型単離物も。
異なる活性スペクトルで識別された。他の例外も見い出
された。血清学的に同一の結晶が異なった鞭毛の七ロタ
イブに現れた。例えば、に−１結晶はｋｕｒｓ ｔａｋ
ｉおよびμリエ崩１暉扛五地−の亜種の両方に存在し
た。さらに、単離物によっては混合した結晶型を含有し
ていたものもあり、これは１つの単離物が２つの毒素前
駆体を含有するか、またはある毒素前駆体が両方の主要
な抗原決定基を有することを示している（Ｊ、 Ｋｒｙ
ｗｉｅｎｃｚｙｋら（１９７８） Ｊ。
された。血清学的に同一の結晶が異なった鞭毛の七ロタ
イブに現れた。例えば、に−１結晶はｋｕｒｓ ｔａｋ
ｉおよびμリエ崩１暉扛五地−の亜種の両方に存在し
た。さらに、単離物によっては混合した結晶型を含有し
ていたものもあり、これは１つの単離物が２つの毒素前
駆体を含有するか、またはある毒素前駆体が両方の主要
な抗原決定基を有することを示している（Ｊ、 Ｋｒｙ
ｗｉｅｎｃｚｙｋら（１９７８） Ｊ。
ｒｎｖｅｒｔｅｂｒ、 Ｐａｔｈｏｌ、３１：３７２−
３７５；（１９８１） Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ。
３７５；（１９８１） Ｊ、Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ。
Ｐａｔｈｏｌ、 ３１：６２−６５） 、 ｋｕｒｓｔ
ａｋｉ亜種由来のに一１結晶型が２つの異種毒素、すな
わち鱗翅類に対する量が多い方の毒素前駆体（δ−内毒
素またはＰｉ）および鱗翅類と双翅類の両者に対して活
性の量が少ない方の毒素（Ｐ２）を含有する。Ｋ−１型
結晶または他の亜種にも存在し、 ＰＩとＰ２の両方が
、これらの非ｋｕｒｓｔａｋｉ単離物中に見い出される
可能性もある。
ａｋｉ亜種由来のに一１結晶型が２つの異種毒素、すな
わち鱗翅類に対する量が多い方の毒素前駆体（δ−内毒
素またはＰｉ）および鱗翅類と双翅類の両者に対して活
性の量が少ない方の毒素（Ｐ２）を含有する。Ｋ−１型
結晶または他の亜種にも存在し、 ＰＩとＰ２の両方が
、これらの非ｋｕｒｓｔａｋｉ単離物中に見い出される
可能性もある。
結晶型は活性スペクトルに基づいてさらに細分されてい
る。Ｄｕｌｍａｇｅ（１９８１） （前出）は、１恒扛
ユ１１ニーｅｎｓｉｓ型結晶を含有する３８個の単離物
およびに一１型を含有する３６個の単離物のスペクトル
活性を調べた。３８個のｔｈｕｒｉ四ｌμ５ｓｉｓ−調
製物を１３個の活性グループに分けたところ、そのうち
最大のグループは、 １０個の単離物を包含していた。
る。Ｄｕｌｍａｇｅ（１９８１） （前出）は、１恒扛
ユ１１ニーｅｎｓｉｓ型結晶を含有する３８個の単離物
およびに一１型を含有する３６個の単離物のスペクトル
活性を調べた。３８個のｔｈｕｒｉ四ｌμ５ｓｉｓ−調
製物を１３個の活性グループに分けたところ、そのうち
最大のグループは、 １０個の単離物を包含していた。
同様に３６個のに一１調製物を１９個のグループに分け
たところ。
たところ。
そのうちの最大のグループは、４個の単離物を含有して
いた。これらのサブグループ化は、同じ結晶セロタイプ
の２つの単離物が活性スペクトルにおいて著しく異なる
こともあるという点で、ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓ＋
ｓ結晶の複雑さと多様性を再度強調するものである。こ
れらの天然の単離物の中でプラスミド（または毒素前駆
体遺伝子またはその両方）の交換が行われているという
説明が考えられている。細胞交配によって毒素前駆体を
コード化するプラスミドの移入があり、２つの異なる胞
子外抗原を産生ずる株が作り出されたことが示されてい
る。（Ｊ、 Ｇｏｎｚａｌｅｓ ら（１９８２） Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
いた。これらのサブグループ化は、同じ結晶セロタイプ
の２つの単離物が活性スペクトルにおいて著しく異なる
こともあるという点で、ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓ＋
ｓ結晶の複雑さと多様性を再度強調するものである。こ
れらの天然の単離物の中でプラスミド（または毒素前駆
体遺伝子またはその両方）の交換が行われているという
説明が考えられている。細胞交配によって毒素前駆体を
コード化するプラスミドの移入があり、２つの異なる胞
子外抗原を産生ずる株が作り出されたことが示されてい
る。（Ｊ、 Ｇｏｎｚａｌｅｓ ら（１９８２） Ｐｒ
ｏｃ、 Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、７９：６９５１−６９５５； Ａ
、Ｋ１１ｅｒら（１９８３） Ｍｏｌ。
、Ｋ１１ｅｒら（１９８３） Ｍｏｌ。
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １９１：２５７−２６２；
Ｂ、 ＣａｒｌｔｏｎおよびＪ。
Ｂ、 ＣａｒｌｔｏｎおよびＪ。
Ｇｏｎｚａｌｅｓ、 Ｊｒ、 （１９８４）、 Ｇｅｎ
ｅｔｉｅｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏ
ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｉ 、 Ａ、 Ｔ、 ＧａｎｅＳａ
ｎおよびＪ、Ａ。
ｅｔｉｅｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ−ｎｏｌｏ
ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｉ 、 Ａ、 Ｔ、 ＧａｎｅＳａ
ｎおよびＪ、Ａ。
Ｈｏｃｈ鳩、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ＋ Ｉｎ
ｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ｐｐ。
ｃ、、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ｐｐ。
３８７−４００ ）。
このような交換は自然に起こるもので、２つあるいはそ
れ以上の異なる毒素前駆体遺伝子が存在すること、ある
いはこれらの２つの遺伝子間の組換えにより新種の毒素
前駆体を作り出して新しいタイプに寄与する。あるＢ、
ｔｌすより１達」且シー株が１種以上の毒素前駆体
を産生じ、さらにある株の結晶さえも１種以上の毒素前
駆体を含有しうろことは明らかである。これらの毒素前
駆体の活性スペクトルおよび免疫学的性質は互いに異な
りうる。
れ以上の異なる毒素前駆体遺伝子が存在すること、ある
いはこれらの２つの遺伝子間の組換えにより新種の毒素
前駆体を作り出して新しいタイプに寄与する。あるＢ、
ｔｌすより１達」且シー株が１種以上の毒素前駆体
を産生じ、さらにある株の結晶さえも１種以上の毒素前
駆体を含有しうろことは明らかである。これらの毒素前
駆体の活性スペクトルおよび免疫学的性質は互いに異な
りうる。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの２つの新しい株
、すなわちｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ （Ｋｒｉ
ｅｇ ら（１９８３） Ｚｓｃｈｒ、 Ａｎｇｅｗ。
、すなわちｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ （Ｋｒｉ
ｅｇ ら（１９８３） Ｚｓｃｈｒ、 Ａｎｇｅｗ。
Ｅｎ ｔｏｍｏ Ｉ 、 ９６ ： ５００−５０８
）およびｖａｒ、 ｓａｎ ％ （１１ｅｒｒｎｓ ｔ
ａｄ ｔら（１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ土：３０５−３０８）。
）およびｖａｒ、 ｓａｎ ％ （１１ｅｒｒｎｓ ｔ
ａｄ ｔら（１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ土：３０５−３０８）。
が近年報告されている。両亜種ともに、甲虫類の昆虫に
対して病原性であり、さらに両者とも板状結晶の封入体
を産生じ、かっ６４−６８ｋＤａの主要ポリペプチド成
分を有する。特に、 ｖａｒ、 ｓａｎ 牡町乞は、
下記の昆虫に毒性を示す： 目 種 甲虫類ＰｙｒｒｈａｌＬａ ＩｕｔｅｏｌａＬｅｐｔｉ
ｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ Ｈａｌｔｉｃａ ｔｏｍｂａｃｉｎａ 俗名 活性度 エルム リーフ ビートル ＋＋＋＋コロラド
ポテト ビートル ＋＋＋千十＋ Ａｕｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ｆ−
ル ウイービイル ＋＋＋０ｔｉｏｈｙｎｃ
ｈｕｓ ５ｕｌｃａｔｕｓ ブラック ヴアイン
ライ−ビル ＋＋Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ
イエロー ミールウオーム ＋＋Ｄ
ｉａｂｒｏｔｉｃａ ウエスタ
ンスポフテイＦ ＋ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔ
ａｔａ キューカンバー ビートルしか
し３次の昆虫には病原性ではない：（異なるスケール） 甲虫類 Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｕｎｉｃｏｌｏｒ
ブラック トベフト ビートルＧｉｂｂｉｕｍ ｐ
ｓｙｌｌｏｉｄｅｓＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａ
ｎｅｕｍ レフト フラワー ビートル双翅類 Ａｅ
ｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ イエロー
フィーバ−モスキード鱗翅＄９ ５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｅｘｉｇｕａ ビート アーミーウオームＴ
ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 力ページ
ルーパーｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓは下記の
昆虫に毒性活性を示す：甲虫類 Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒ
ｓａ コロラド ポテト ビートル
＋＋＋＋ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ウェスタ
ン コーン ルートウオーム ＋＋ｖｉｒｇｉｆｅｒａ
ｖｉｒｇｉｆｅｒａＤｉａｂｒｏｔｉｃａ
サザン コーン ルート ウオーム ＋
ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｓａ
ｎ 」江りの殺虫活性が６４ｋＤａの分子量をもつタ
ンパクによるものであることを示すために、 ６４ｋＤ
ａのタンパクを単離し、 ＨＰＬＣにより精製し、かつ
エルムルーフビートル（Ｐ、 １ｕｔｅｏｌａ ）に
対して、生物学的定量検定を行った。投与量（対数）と
死亡率（プロビット）の関係をプロットしたところ、葉
の表面１平方センチメートルあたり０．１２μｇ毒性タ
ンノマクのＬＤ５０となった。
対して病原性であり、さらに両者とも板状結晶の封入体
を産生じ、かっ６４−６８ｋＤａの主要ポリペプチド成
分を有する。特に、 ｖａｒ、 ｓａｎ 牡町乞は、
下記の昆虫に毒性を示す： 目 種 甲虫類ＰｙｒｒｈａｌＬａ ＩｕｔｅｏｌａＬｅｐｔｉ
ｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ Ｈａｌｔｉｃａ ｔｏｍｂａｃｉｎａ 俗名 活性度 エルム リーフ ビートル ＋＋＋＋コロラド
ポテト ビートル ＋＋＋千十＋ Ａｕｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ ｆ−
ル ウイービイル ＋＋＋０ｔｉｏｈｙｎｃ
ｈｕｓ ５ｕｌｃａｔｕｓ ブラック ヴアイン
ライ−ビル ＋＋Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ
イエロー ミールウオーム ＋＋Ｄ
ｉａｂｒｏｔｉｃａ ウエスタ
ンスポフテイＦ ＋ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔ
ａｔａ キューカンバー ビートルしか
し３次の昆虫には病原性ではない：（異なるスケール） 甲虫類 Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｕｎｉｃｏｌｏｒ
ブラック トベフト ビートルＧｉｂｂｉｕｍ ｐ
ｓｙｌｌｏｉｄｅｓＴｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａ
ｎｅｕｍ レフト フラワー ビートル双翅類 Ａｅ
ｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ イエロー
フィーバ−モスキード鱗翅＄９ ５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ
ｅｘｉｇｕａ ビート アーミーウオームＴ
ｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ 力ページ
ルーパーｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓは下記の
昆虫に毒性活性を示す：甲虫類 Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒ
ｓａ コロラド ポテト ビートル
＋＋＋＋ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ウェスタ
ン コーン ルートウオーム ＋＋ｖｉｒｇｉｆｅｒａ
ｖｉｒｇｉｆｅｒａＤｉａｂｒｏｔｉｃａ
サザン コーン ルート ウオーム ＋
ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｓａ
ｎ 」江りの殺虫活性が６４ｋＤａの分子量をもつタ
ンパクによるものであることを示すために、 ６４ｋＤ
ａのタンパクを単離し、 ＨＰＬＣにより精製し、かつ
エルムルーフビートル（Ｐ、 １ｕｔｅｏｌａ ）に
対して、生物学的定量検定を行った。投与量（対数）と
死亡率（プロビット）の関係をプロットしたところ、葉
の表面１平方センチメートルあたり０．１２μｇ毒性タ
ンノマクのＬＤ５０となった。
封入体の数と形状と組成はｖａｒ、ｓａｎ 坦旦註の
亜種によって変化する。最も一般的な結晶型封入体は、
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉで例示すると、１ｌＡ
ｌ翅類の幼虫に対して毒性を示し、１個の細胞につき封
入体１個（時には、２個または３個）の割合で存在し。
亜種によって変化する。最も一般的な結晶型封入体は、
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉで例示すると、１ｌＡ
ｌ翅類の幼虫に対して毒性を示し、１個の細胞につき封
入体１個（時には、２個または３個）の割合で存在し。
両錐体形（形状が不規則なものも見つかっているが）
であり、６−内毒素マタハ、 １３０−１４０ｋＤａ（
７）分子量を持ったＰＬポリペプチドからなる。この毒
素前駆体は３次いで分解されて約５５−７０ｋＤａの活
性Ｐ１毒素となる。β、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの場合１本来
のあるいは改変した状況下で、ポリアクリルアミドゲル
中の主要なポリペプチド約２８ｋＤａであるが、 ６５
ｋＤａよりも大きい種が近年報告された（ＬｅｅらＢｉ
ｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ
ｕｎ。
であり、６−内毒素マタハ、 １３０−１４０ｋＤａ（
７）分子量を持ったＰＬポリペプチドからなる。この毒
素前駆体は３次いで分解されて約５５−７０ｋＤａの活
性Ｐ１毒素となる。β、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの場合１本来
のあるいは改変した状況下で、ポリアクリルアミドゲル
中の主要なポリペプチド約２８ｋＤａであるが、 ６５
ｋＤａよりも大きい種が近年報告された（ＬｅｅらＢｉ
ｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 Ｒｅｓ、 Ｃｏｍｍ
ｕｎ。
１２６ ：９５３−９６０） １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ
の最も強力な毒性タンパクは分子全豹１３０ｋＤａのも
のである。（参考文献（Ｗａｒｄ、 Ｅ、Ｓ、ら（１９
８７） Ｎｕｃｌ、 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １５
ニア１９５） 、 ｋｕｒｓｔａｋｉ亜種においては、
ＰＩとＰ２はともに毒素前駆体であるように思われ、
鱗翅類に特異的なＰｌまたはδ−内毒素が約１３５ｋＤ
ａの分子量を持っているのに対し、鱗翅類および双翅類
に対して活性なＰ２２次の分子量は、約６５ｋＤａであ
る（Ｗａｒｄ。
の最も強力な毒性タンパクは分子全豹１３０ｋＤａのも
のである。（参考文献（Ｗａｒｄ、 Ｅ、Ｓ、ら（１９
８７） Ｎｕｃｌ、 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 １５
ニア１９５） 、 ｋｕｒｓｔａｋｉ亜種においては、
ＰＩとＰ２はともに毒素前駆体であるように思われ、
鱗翅類に特異的なＰｌまたはδ−内毒素が約１３５ｋＤ
ａの分子量を持っているのに対し、鱗翅類および双翅類
に対して活性なＰ２２次の分子量は、約６５ｋＤａであ
る（Ｗａｒｄ。
Ｅ、Ｓ、ら（１９８７） Ｎｕｃｌ、 Ａｃ１ｄｓ
Ｒｅｓ、 １５ニア１９５）。
Ｒｅｓ、 １５ニア１９５）。
甲虫類（すなわち、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびシ
頃倶見ド）に対して病原性であることがわかっている２
種のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ 亜種において、主ペプチド
成分は、 ６４−６８ｋＤａの分子量をもつことがわか
った。
頃倶見ド）に対して病原性であることがわかっている２
種のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ 亜種において、主ペプチド
成分は、 ６４−６８ｋＤａの分子量をもつことがわか
った。
種々の亜種より単離した様々毒素は、アミノ酸組成の差
異と、免疫学的相同性の欠如に基づいてさらに分化され
ている。ｋｕｒ’５ｔａｋｉ ｐｌ （８−内毒素）
タンパク（甲虫類に対して毒性あり）に対する抗血清は
、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓのタンパク双翅類の幼虫に
対して活性であるが、鱗翅類の幼虫に対しては活性でな
いと交さ反応しなかった。同様に、 ｓａｎ牡■乞（甲
虫類に対して病原性であるが、鱗翅類および双翅類に対
しては病原性でない）に対する抗血清は、 ｖａｒ、
ｋｕｒｓｔａｋｉ Ｈｄ−１株、 ＨＤ−７３株の鱗翅
類に特異的な毒素と交さ反応しなかった。
異と、免疫学的相同性の欠如に基づいてさらに分化され
ている。ｋｕｒ’５ｔａｋｉ ｐｌ （８−内毒素）
タンパク（甲虫類に対して毒性あり）に対する抗血清は
、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓのタンパク双翅類の幼虫に
対して活性であるが、鱗翅類の幼虫に対しては活性でな
いと交さ反応しなかった。同様に、 ｓａｎ牡■乞（甲
虫類に対して病原性であるが、鱗翅類および双翅類に対
しては病原性でない）に対する抗血清は、 ｖａｒ、
ｋｕｒｓｔａｋｉ Ｈｄ−１株、 ＨＤ−７３株の鱗翅
類に特異的な毒素と交さ反応しなかった。
鱗翅類に対して活性なりａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ株の
殺虫活性は、昆虫の腸にあるプロテアーゼによって。
殺虫活性は、昆虫の腸にあるプロテアーゼによって。
分子全豹６５ｋＤａの活性毒素分子に変換される毒素前
駆体（分子全豹１３５ｋＤａ ）に存在する。毒素前駆
体活性部位は、ポリペプチドのアミノ末端側の半分に位
置する。ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ（口１ｐｅｌ）毒
素前駆体のクローン化された遺伝子の一連の欠損誘導体
を。
駆体（分子全豹１３５ｋＤａ ）に存在する。毒素前駆
体活性部位は、ポリペプチドのアミノ末端側の半分に位
置する。ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ（口１ｐｅｌ）毒
素前駆体のクローン化された遺伝子の一連の欠損誘導体
を。
遺伝子の活性領域の位置決定に用いた。毒素前駆体タン
パクのアミノ末端側５５％で鱗翅類に対する毒性には十
分であることが示された。５′末端から５０番目のコド
ンの欠失あるいは３ ”末端から６０３番目のコドンの
欠失により毒性は失われるが、他方５ ゛末端から１０
番目のコドンの欠失あるいは。
パクのアミノ末端側５５％で鱗翅類に対する毒性には十
分であることが示された。５′末端から５０番目のコド
ンの欠失あるいは３ ”末端から６０３番目のコドンの
欠失により毒性は失われるが、他方５ ゛末端から１０
番目のコドンの欠失あるいは。
３ ”末端から６４５番目のコドンの欠失によっては。
毒性は失われない。結晶タンパク遺伝子の３ ゛末端の
６４５番目から１１７６１７６番目ンまでは毒性に対し
て必須ではなく、最初から１０個のコドンを２つの異種
断片に置き換えることが可能である。（（Ｈ，５ｃｈｎ
ｅｐｆら（１９８５）Ｊ、 Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、 ２
６０ ：６２７３６２８０ ； Ｍ、 Ａｄａｎ
ｇら （１９８５） Ｇｅｎｅ ３６： ２８
９−３００）。
６４５番目から１１７６１７６番目ンまでは毒性に対し
て必須ではなく、最初から１０個のコドンを２つの異種
断片に置き換えることが可能である。（（Ｈ，５ｃｈｎ
ｅｐｆら（１９８５）Ｊ、 Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、 ２
６０ ：６２７３６２８０ ； Ｍ、 Ａｄａｎ
ｇら （１９８５） Ｇｅｎｅ ３６： ２８
９−３００）。
毒素前駆体分子のカルボキシル基側半分の機能はまだわ
かっていないが、４個の月ユ 旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子（すなわち
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ（Ｄｉｐｅｌ）と５
ｏｔｔｏ ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３ とｋｕｒｓ
ｔａｋｉＨＤＩ）のヌクレオチド領域の比較に基づいて
、アミノ酸レベルでかなりの保存があるように思われる
。
かっていないが、４個の月ユ 旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子（すなわち
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ（Ｄｉｐｅｌ）と５
ｏｔｔｏ ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３ とｋｕｒｓ
ｔａｋｉＨＤＩ）のヌクレオチド領域の比較に基づいて
、アミノ酸レベルでかなりの保存があるように思われる
。
カルボキシル末端は、毒素前駆体分子の特異性の決定か
りセプタ一部位への毒素の結合決定が封入体としての毒
素前駆体の蓄積決定の際に機能しうる。クローン化され
た遺伝子およびサブクローンはさらに、毒性を高めたタ
ンパクあるいは宿主特異性を改変したタンパクをコード
化する新規遺伝子を生産する目的で、毒素分子の種々の
領域の機能を解明する上で有用である。毒素の活性の、
タンパクのある特定の部分に対する関係は、甲虫類に対
する毒素の活性については報告されていない。
りセプタ一部位への毒素の結合決定が封入体としての毒
素前駆体の蓄積決定の際に機能しうる。クローン化され
た遺伝子およびサブクローンはさらに、毒性を高めたタ
ンパクあるいは宿主特異性を改変したタンパクをコード
化する新規遺伝子を生産する目的で、毒素分子の種々の
領域の機能を解明する上で有用である。毒素の活性の、
タンパクのある特定の部分に対する関係は、甲虫類に対
する毒素の活性については報告されていない。
１３、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの数個の亜種（例えば、 ｖａ
ｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ、ｖａｒ、ｋｕｒｓｔ
ａｋｉＨＤＩ（Ｄｉｐｅｌ） 、ｋｕｒｓｔａｋｉ
１１０７３． ｂｅｒｌｉｎｅｒ １７１５ 。
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの数個の亜種（例えば、 ｖａ
ｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ、ｖａｒ、ｋｕｒｓｔ
ａｋｉＨＤＩ（Ｄｉｐｅｌ） 、ｋｕｒｓｔａｋｉ
１１０７３． ｂｅｒｌｉｎｅｒ １７１５ 。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ＨＤ２，５ｏｔｔｏ、
ａｉｚａｗａｉ＋ ５ｕｂｔｏｘｉｃｕｓ。
ａｉｚａｗａｉ＋ ５ｕｂｔｏｘｉｃｕｓ。
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ由来の毒素遺伝子がクローン化
され。
され。
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩおよび１ｓｒａｅ
ｌｅｎｓｉｓの組み換えクローンが昆虫の幼虫に対して
毒性であることがわかった。ＤＮＡの断片がプラスミド
由来のものであれば、これらのクローンはＥ、 ｃｏ
ｌｉ内で毒素を産生じた。しかしながら、 ｖａｒ、
ｂｅｒｌｉｎｅｒまたは変種ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋ
ｉ由来の染色体遺伝子は、免疫学的方法または生物学的
検定により検出可能な毒素をＥ、 ｃｏｌｉ内で再現
しなかった。βよ ｔｈｕｒｉｎ−［胆旺ｓ ｖａｒ
、 ｋｕｒｓｔａｋｉについては、染色体にコード化
されている胞子外タンパクは、胞子形成の間プラスミド
にコード化されているタンパクよりも合成されるのが遅
く、従って遺伝子の位置によって調節の様式が異なるこ
ともある（Ａ、 Ａｒ’ｏｎｓｏｎら（１９８６年）
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、５０：１−２４）。
ｌｅｎｓｉｓの組み換えクローンが昆虫の幼虫に対して
毒性であることがわかった。ＤＮＡの断片がプラスミド
由来のものであれば、これらのクローンはＥ、 ｃｏ
ｌｉ内で毒素を産生じた。しかしながら、 ｖａｒ、
ｂｅｒｌｉｎｅｒまたは変種ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋ
ｉ由来の染色体遺伝子は、免疫学的方法または生物学的
検定により検出可能な毒素をＥ、 ｃｏｌｉ内で再現
しなかった。βよ ｔｈｕｒｉｎ−［胆旺ｓ ｖａｒ
、 ｋｕｒｓｔａｋｉについては、染色体にコード化
されている胞子外タンパクは、胞子形成の間プラスミド
にコード化されているタンパクよりも合成されるのが遅
く、従って遺伝子の位置によって調節の様式が異なるこ
ともある（Ａ、 Ａｒ’ｏｎｓｏｎら（１９８６年）
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ、５０：１−２４）。
Ｂ、 ｔ ｈ ｕ ｒ ｉ 吐ｊμ辻Ｌｖ ａ ｒ、
ｋ ｕ ｒ ｓ ｔ ａ ｋ ｉ ＩＩ Ｄ ７３
または、 ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ （Ｄｉ
ｐｅｌ）由来の構造遺伝子を植物の根や葉に群生するＰ
、亜匣虹り内に導入する方法が明らかにされている（Ｃ
，Ａ、 ５ｔａｃｋヨ一ロツパ特許出願公開第０２５５
３１１号）。また、 ＤＮＡプラスミド内に導入した切
断結晶タンパク遺伝子を毒素の前駆体であるタンパク断
片を産生ずるのに利用している（Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ、
ヨーロッパ特許出願第０２０９３７０号）。つい最
近、ＢＬ 旦肛釦「町旦Ｌｖａｒ、ｂｅｒｌｉｎｅｒ
１７１５由来の 改変遺伝子をタバコ植物に挿入し、タ
バコ植物内が幼虫から形質転換体タバコ植物を保護する
のに十分な毒素を産生した。（Ｖａｅｃｋら（１９８７
年） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３３−３７ ； Ｍ、Ｊ
。
ｋ ｕ ｒ ｓ ｔ ａ ｋ ｉ ＩＩ Ｄ ７３
または、 ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤＩ （Ｄｉ
ｐｅｌ）由来の構造遺伝子を植物の根や葉に群生するＰ
、亜匣虹り内に導入する方法が明らかにされている（Ｃ
，Ａ、 ５ｔａｃｋヨ一ロツパ特許出願公開第０２５５
３１１号）。また、 ＤＮＡプラスミド内に導入した切
断結晶タンパク遺伝子を毒素の前駆体であるタンパク断
片を産生ずるのに利用している（Ｍ、Ｊ、Ａｄａｎｇ、
ヨーロッパ特許出願第０２０９３７０号）。つい最
近、ＢＬ 旦肛釦「町旦Ｌｖａｒ、ｂｅｒｌｉｎｅｒ
１７１５由来の 改変遺伝子をタバコ植物に挿入し、タ
バコ植物内が幼虫から形質転換体タバコ植物を保護する
のに十分な毒素を産生した。（Ｖａｅｃｋら（１９８７
年） Ｎａｔｕｒｅ ３２８：３３−３７ ； Ｍ、Ｊ
。
Ａｄａｎｇら（１９８５年） Ｇｅｎｅ ３６：２８
９−３００）。
９−３００）。
細菌遺伝子はタバコ植物内に安定に組み込まれ。
次世代へ受は継がれた。
甲虫活性毒素遺伝子に関して、 Ｈｅｒｒｎｓｔｅｄｔ
（１９８６年）（前出）は、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １
ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ 得亙践ＤＮＡのＲａｍ
旧断片５．８ｋｂをｐＢＲ３２２クローニングベクター
を用いてＥ、 ｃｏｌｉにクローン化された。発現し
たタンパクはＰＬｌｕｔｅｏｌａ（エルム リーフ ビ
ートル）に対して毒性であり、その分子量は約８３ｋＤ
ａであった。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 ｓａｎ 倶互眩遺伝子由来のこの８３ｋＤａの
毒素産物ばＢ、 ｔｈｕｒｉｎ−ｎμ臣国ｖａｒ、１
ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｓａｎ劇！眼細胞か
ら単離した６４ｋＤａ結晶毒素よりも大きい。このこと
は・Ｂ、−−〇！１」エロ」互にｖａｒ、 ｓ憇 狸至
胚−結晶タンパクは、結晶化される前にＥ、 ｃｏｌ
ｉではなくＢ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ牡
弧虹によって、プロセッシングをうける。より大きな前
駆体分子として合成されうる。
（１９８６年）（前出）は、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １
ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ 得亙践ＤＮＡのＲａｍ
旧断片５．８ｋｂをｐＢＲ３２２クローニングベクター
を用いてＥ、 ｃｏｌｉにクローン化された。発現し
たタンパクはＰＬｌｕｔｅｏｌａ（エルム リーフ ビ
ートル）に対して毒性であり、その分子量は約８３ｋＤ
ａであった。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 ｓａｎ 倶互眩遺伝子由来のこの８３ｋＤａの
毒素産物ばＢ、 ｔｈｕｒｉｎ−ｎμ臣国ｖａｒ、１
ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｓａｎ劇！眼細胞か
ら単離した６４ｋＤａ結晶毒素よりも大きい。このこと
は・Ｂ、−−〇！１」エロ」互にｖａｒ、 ｓ憇 狸至
胚−結晶タンパクは、結晶化される前にＥ、 ｃｏｌ
ｉではなくＢ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ牡
弧虹によって、プロセッシングをうける。より大きな前
駆体分子として合成されうる。
（以下余白）
異なるＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ亜種由来の５個のクローン化
され、塩基配列が決定されたδ−内毒素遺伝子のうち、
４個は鱗翅類に対して活性があり、プラスミド（すなわ
ち、 ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ亜種由来の５個のクローン化
され、塩基配列が決定されたδ−内毒素遺伝子のうち、
４個は鱗翅類に対して活性があり、プラスミド（すなわ
ち、 ｖａｒ。
ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ（Ｄｉｐｅｌ）、 ｋｕｒｓｔ
ａｋｉＨＤ７３．５ｏｔｔｏ、およびｋｕｒｓｔａｋｉ
ＨＤＩ ）にコード化されており、コード領域の５°側
の数百ヌクレオチドからコード領域内の約９００ｂｐま
で、実質的に同一の配列を有していた。鱗翅類に対して
活性なりａｒ、 ｂｅｒｌｉｎｅｒ１７１５からの、
染色体遺伝子由来の５番目のクローン化遺伝子は、他の
ものとの相同性を示さなかった。実質上同一のδ−内毒
素遺伝子３個のうちの１個の上流側の領域には、３つの
異なるプロモータ部位があることがわかった：それらの
部位のうち１つはＥ、 ｃｏｌｉのＲＮ＾ポリメラー
ゼによって、２つはＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓのＲＮＡポリメラーゼによって認識される。下流側の
Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモータにマツピングされる転写物
は、胞子形成段階第■期ごろに見られたが、第■期また
は第■期ごろに減少し。
ａｋｉＨＤ７３．５ｏｔｔｏ、およびｋｕｒｓｔａｋｉ
ＨＤＩ ）にコード化されており、コード領域の５°側
の数百ヌクレオチドからコード領域内の約９００ｂｐま
で、実質的に同一の配列を有していた。鱗翅類に対して
活性なりａｒ、 ｂｅｒｌｉｎｅｒ１７１５からの、
染色体遺伝子由来の５番目のクローン化遺伝子は、他の
ものとの相同性を示さなかった。実質上同一のδ−内毒
素遺伝子３個のうちの１個の上流側の領域には、３つの
異なるプロモータ部位があることがわかった：それらの
部位のうち１つはＥ、 ｃｏｌｉのＲＮ＾ポリメラー
ゼによって、２つはＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓのＲＮＡポリメラーゼによって認識される。下流側の
Ｂａｃｉｌｌｕｓプロモータにマツピングされる転写物
は、胞子形成段階第■期ごろに見られたが、第■期また
は第■期ごろに減少し。
この時上流側のプロモータからの転写物が現れた。
δ−内毒素遺伝子の上流側の領域は、ハイフンで結ばれ
たダイアトの対称性を有する２つの領域をも包含してい
た。これらの領域は１両方の転写開始部位を含むような
位置にあり、それ故調節要素結合部位となりうる。さら
にリボゾーム結合が起こりうる部位は、開始ＡＴＧコド
ンから３塩基上流の所に位置している。
たダイアトの対称性を有する２つの領域をも包含してい
た。これらの領域は１両方の転写開始部位を含むような
位置にあり、それ故調節要素結合部位となりうる。さら
にリボゾーム結合が起こりうる部位は、開始ＡＴＧコド
ンから３塩基上流の所に位置している。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｓａｎ
％由来の５．８ｋｂ断片内にある。甲虫類に対して活
性な毒素遺伝子の予備的記載（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔら
（１９８６）前出）は毒素遺伝子を十分に開示するもの
ではなかった。すなわち、 ＤＮＡ断片のヌクレオチド
配列、断片の制限地図、および毒素タンパクのアミノ酸
配列が文献の中に発表されなかった（Ｉｌｅｒｒｎｓｔ
ａｄｔら（１９８６’）前出）。Ｂ、ｔ、ｓｄ毒素をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が、染色体に由来
するものなのか、あるいはプラスミドＤＮＡに由来する
ものなのかを。
％由来の５．８ｋｂ断片内にある。甲虫類に対して活
性な毒素遺伝子の予備的記載（Ｈｅｒｒｎｓｔａｄｔら
（１９８６）前出）は毒素遺伝子を十分に開示するもの
ではなかった。すなわち、 ＤＮＡ断片のヌクレオチド
配列、断片の制限地図、および毒素タンパクのアミノ酸
配列が文献の中に発表されなかった（Ｉｌｅｒｒｎｓｔ
ａｄｔら（１９８６’）前出）。Ｂ、ｔ、ｓｄ毒素をコ
ードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片が、染色体に由来
するものなのか、あるいはプラスミドＤＮＡに由来する
ものなのかを。
上記の著者らは決定しなかった。また、この生物の入手
しやすさについても、報告の中で開示されなかった。
しやすさについても、報告の中で開示されなかった。
限定数の遺伝子を用いた転写の研究によって。
相同性のあるδ−内毒素遺伝子は、異なる生物学的活性
のプロフィールをもったポリペプチド毒素を生じうるこ
とか示されている。例えば、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ
とＨＤ７３遺伝子は実質的に同一のものであるが。
のプロフィールをもったポリペプチド毒素を生じうるこ
とか示されている。例えば、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ
とＨＤ７３遺伝子は実質的に同一のものであるが。
結果として生ずる毒素は、ある鱗翅類について異なる５
０％致死濃度を有する（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８３
）＾ｒｃｈ 。
０％致死濃度を有する（Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９８３
）＾ｒｃｈ 。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ、 ２２７：２３３
−２４１）。さらに、これらの毒素前駆体遺伝子を含有
するプラスミドは。
−２４１）。さらに、これらの毒素前駆体遺伝子を含有
するプラスミドは。
Ｂ、 ｃｅｒｅｕｓに導入すると、異なって調節され
る（Ｍｉｎｎｉｃｈら（１９８４） Ｊ、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、１５８：４４７−４５４）。
る（Ｍｉｎｎｉｃｈら（１９８４） Ｊ、 Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、１５８：４４７−４５４）。
プロモータ配列以外の因子およびＲＮＡポリメラーゼの
独特の形態が、調節に関わっていると考えられている。
独特の形態が、調節に関わっていると考えられている。
完全長の旦２遺伝子（ｖａｒ、 ｂｅｒｌｉｎｅｒ１
７１５由来の毒素遺伝子の１１５５コドン）、または切
断した遺伝子（毒素遺伝子の５゛領域の８６０コドン）
を有する。遺伝子導入タバコ植物において、切断したｂ
ｔ２遺伝子のみが強力な殺虫力のある発現レベルをもた
らすという報告は非常に興味深い（ｖｑｅｃｋら（１９
８７）前出）。同じプロモー、夕が、その発現を指示す
るのに使われているにもかかわらず、完全長の唇２コー
ド配列を用いたものでは有意な殺虫活性がみられなかっ
た。遺伝子導入植物の葉における完全長の姓２タンパク
の量およびＲＮＡ０量は、切断されたＢ、ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓνａｒ、ポリペプチドのタンパクの量お
よびＲＮＡの量よりも１０〜５０倍低かった。
７１５由来の毒素遺伝子の１１５５コドン）、または切
断した遺伝子（毒素遺伝子の５゛領域の８６０コドン）
を有する。遺伝子導入タバコ植物において、切断したｂ
ｔ２遺伝子のみが強力な殺虫力のある発現レベルをもた
らすという報告は非常に興味深い（ｖｑｅｃｋら（１９
８７）前出）。同じプロモー、夕が、その発現を指示す
るのに使われているにもかかわらず、完全長の唇２コー
ド配列を用いたものでは有意な殺虫活性がみられなかっ
た。遺伝子導入植物の葉における完全長の姓２タンパク
の量およびＲＮＡ０量は、切断されたＢ、ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓνａｒ、ポリペプチドのタンパクの量お
よびＲＮＡの量よりも１０〜５０倍低かった。
完全長の曇２遺伝子が、植物細胞内で等しく高レベルで
発現されない理由はわからない。
発現されない理由はわからない。
−ａに、β−劫！±ｌ匡旺艮シａｒ、渾種は、プラスミ
ド中に潜在的遺伝情報の実質的な部分を含んでいる。交
差ハイブリダイゼーションに基づき。
ド中に潜在的遺伝情報の実質的な部分を含んでいる。交
差ハイブリダイゼーションに基づき。
毒素前駆体遺伝子は主として大きな（＞ ３０ＭＤａ
）プラスミドの中に見られ、場合によっては所定の亜種
における１個以上のプラスミドに見られた（Ａｒｏｎｓ
ｏｎ ら（１９８６） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、５０：１−２４ ）。
）プラスミドの中に見られ、場合によっては所定の亜種
における１個以上のプラスミドに見られた（Ａｒｏｎｓ
ｏｎ ら（１９８６） Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｒｅｖ
、５０：１−２４ ）。
ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤＩ亜種において、 １１０ 、２
９．４．９ ＭＤａのプラスミドが毒素前駆体合成調節
機能を有する。
９．４．９ ＭＤａのプラスミドが毒素前駆体合成調節
機能を有する。
調節の役割を有するこのような比較的小さいプラスミド
の中には、毒素前駆体遺伝子を含有しないものもある。
の中には、毒素前駆体遺伝子を含有しないものもある。
他の亜種においては（例えば、 ｖａｒ。
ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ７３） ＋調節遺伝子が毒素前駆
体遺伝子を持つ同じプラスミド中に組み込まれているた
め。
体遺伝子を持つ同じプラスミド中に組み込まれているた
め。
比較的単純な調節のプロフィールが存在する。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞交配によるプラスミドの導入は
、 Ｇｏｎｚａｌｅｓらによって初めて報告された（Ｇ
ｏｎｚａｌｅｓら（１９８２年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞交配によるプラスミドの導入は
、 Ｇｏｎｚａｌｅｓらによって初めて報告された（Ｇ
ｏｎｚａｌｅｓら（１９８２年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ７９：６９５１−６９５５ ）
、次いでＫ１１ｅｒ らが細胞交配によってＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓか←Ｌ連±士ｌ比ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓヘクローン化した毒素前駆
体遺伝子を導入したことを報告した。ｂｅｒｌｉｎｅｒ
１７１５ δ−内毒素をコードするプラスミドを含有
する組み換え体プラスミドを、 ＢＬｓｕｂｔｉｌｉｓ
がらｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＤｌおよびｖａｒ、
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ中に導入した。後者の場合、
レピドプテランに対して活性のあるｂｅｒｌｉｎｅｒ１
７１５およびデイブチランに対して活性のある１ｓｒａ
ｅｌｅｎｓｉｓはともに通常量で発現した。これは２つ
の異なる毒素が、同じ株内に発現されうろことを示す。
、次いでＫ１１ｅｒ らが細胞交配によってＢ、
５ｕｂｔｉｌｉｓか←Ｌ連±士ｌ比ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓヘクローン化した毒素前駆
体遺伝子を導入したことを報告した。ｂｅｒｌｉｎｅｒ
１７１５ δ−内毒素をコードするプラスミドを含有
する組み換え体プラスミドを、 ＢＬｓｕｂｔｉｌｉｓ
がらｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＤｌおよびｖａｒ、
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ中に導入した。後者の場合、
レピドプテランに対して活性のあるｂｅｒｌｉｎｅｒ１
７１５およびデイブチランに対して活性のある１ｓｒａ
ｅｌｅｎｓｉｓはともに通常量で発現した。これは２つ
の異なる毒素が、同じ株内に発現されうろことを示す。
（おそらく、生物学的制御に用いられる株の宿主の範囲
が広げられた可能性がある。） （発明の要旨） 昆虫が与える損傷から植物を保護するための手段を提供
することが本発明の包括的な目的である。
が広げられた可能性がある。） （発明の要旨） 昆虫が与える損傷から植物を保護するための手段を提供
することが本発明の包括的な目的である。
本発明の一つの目的は、β工劫狙±１国眩旦シａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの甲虫類に対して殺虫性を有す
るタンパクをコードするクローン化された遺伝子を提供
することにある。
るタンパクをコードするクローン化された遺伝子を提供
することにある。
本発明の他の目的は、甲虫類に対して殺虫性の活性を有
する改変されたタンパクをコードするＢ。
する改変されたタンパクをコードするＢ。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓの改変されたクローン化遺伝子を提供するこ
とにある。
ｉｏｎｉｓの改変されたクローン化遺伝子を提供するこ
とにある。
本発明のクローン化ＤＮＡ配列は、 Ｂａｃ目１ｕｓ
ｔｈｕ−６四住肋１ｂｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓの７３ｋｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に対して、少
なくとも７５％の相同性があるヌクレオチド配列を含み
、該ヌクレオチド配列は甲虫類の昆虫に毒性のある約６
５ｋｄのタンパクをコードする。
ｔｈｕ−６四住肋１ｂｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓの７３ｋｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目
のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列に対して、少
なくとも７５％の相同性があるヌクレオチド配列を含み
、該ヌクレオチド配列は甲虫類の昆虫に毒性のある約６
５ｋｄのタンパクをコードする。
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの栄養細胞において発現
可能な本発明のクローン化遺伝子は、甲虫類の昆虫に対
して毒性のあるＢａｃｉｌ−１ｕｓ ｔｈｕｒｉｎ １
ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの７３
ｋｄタンパクの遺伝子のプロモータに対して、少なくと
も９０％の相同性があるヌクレオチド配列を有するＤＮ
Ａ部分と、コード領域とを含む。
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの栄養細胞において発現
可能な本発明のクローン化遺伝子は、甲虫類の昆虫に対
して毒性のあるＢａｃｉｌ−１ｕｓ ｔｈｕｒｉｎ １
ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの７３
ｋｄタンパクの遺伝子のプロモータに対して、少なくと
も９０％の相同性があるヌクレオチド配列を有するＤＮ
Ａ部分と、コード領域とを含む。
本発明の他の目的は、甲虫類に対して殺虫性を有する新
規な７３ｋＤａタンパクを提供することにある。
規な７３ｋＤａタンパクを提供することにある。
甲虫類の昆虫に対して特異的な毒性を有する生物学的制
御剤を提供することが２本発明の特定の目的である。
御剤を提供することが２本発明の特定の目的である。
本発明は、特にコロラド ポテト ビートルウェスタン
コーン ルートウオーム、およびサザン コーン ル
ートウオーム（甲虫類の昆虫の例）から植物を保護する
ための生物学的制御方法を提供する。
コーン ルートウオーム、およびサザン コーン ル
ートウオーム（甲虫類の昆虫の例）から植物を保護する
ための生物学的制御方法を提供する。
本発明は、遺伝的に改変された細菌内で、殺虫性δ−内
毒素タンパクを生産する方法を提供する。
毒素タンパクを生産する方法を提供する。
特に２、本発明は形質転換されたＥ、 ｃｏｌｉまた
は他のグラム陰性菌の細胞内で発現された。 ｊｊ、
ｔｈｕ−旦」江閃圏ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
由来のδ−内毒素遺伝子の生産物として、δ−内毒素タ
ンパクを生産する方法を提供する。得られた生物学的に
活性な生産物は甲虫類の昆虫に対して毒性を示す特異的
な活性プロフィールを示す。
は他のグラム陰性菌の細胞内で発現された。 ｊｊ、
ｔｈｕ−旦」江閃圏ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
由来のδ−内毒素遺伝子の生産物として、δ−内毒素タ
ンパクを生産する方法を提供する。得られた生物学的に
活性な生産物は甲虫類の昆虫に対して毒性を示す特異的
な活性プロフィールを示す。
本発明の他の目的は、Ｂ、田五卦１ヱ吐込株の結晶タン
パクをコードする遺伝子をＥ、 ｃｏｌｉまたは他の
グラム陰性菌の株内に導入して、農業的には良性の菌株
を昆虫に対して毒性を有する菌株に形質転換する方法を
提供することにある。
パクをコードする遺伝子をＥ、 ｃｏｌｉまたは他の
グラム陰性菌の株内に導入して、農業的には良性の菌株
を昆虫に対して毒性を有する菌株に形質転換する方法を
提供することにある。
甲虫類の昆虫に毒性のあるタンパクを発現し得る微生物
を調製する本発明の方法は、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｕ−亘７ ｖａｒ、 むｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの７３
ｋｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目のアミノ酸
をコードするヌクレオチド配列に対して、少な（とも７
５％の相同性があるヌクレオチド配列を含むクローン化
ＤＮへ部分と、形質転換された微生物中において構造遺
伝子を発現させ得るプロモータとを含む遺伝子で微生物
を形質転換させることを包含し、該ヌクレオチド配列は
甲虫類の昆虫に毒性のある約６５ｋｄタンパクをコード
する。
を調製する本発明の方法は、 Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈ
ｕ−亘７ ｖａｒ、 むｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの７３
ｋｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目のアミノ酸
をコードするヌクレオチド配列に対して、少な（とも７
５％の相同性があるヌクレオチド配列を含むクローン化
ＤＮへ部分と、形質転換された微生物中において構造遺
伝子を発現させ得るプロモータとを含む遺伝子で微生物
を形質転換させることを包含し、該ヌクレオチド配列は
甲虫類の昆虫に毒性のある約６５ｋｄタンパクをコード
する。
本発明は、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖ
ａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ。
ａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ。
ｎｉｓのδ−内毒素遺伝子の発現をグラム陰性菌の宿主
（Ｅ、 ｃｏｌｉ）内で行うことによって例証される
。
（Ｅ、 ｃｏｌｉ）内で行うことによって例証される
。
このように遺伝的に形質転換された菌株は、植物保護お
よび農業的有害生物防除のための生物学的調節法を提供
する。
よび農業的有害生物防除のための生物学的調節法を提供
する。
さらに本発明鴫形質転換された細菌系において維持され
た殺虫活性を有する結晶タンパク毒素を発現するための
組み換え構築物にδ−内毒素遺伝子を利用するに先立ち
、δ−内毒素遺伝子を改変する方法を提供する。
た殺虫活性を有する結晶タンパク毒素を発現するための
組み換え構築物にδ−内毒素遺伝子を利用するに先立ち
、δ−内毒素遺伝子を改変する方法を提供する。
特に９本発明では結晶性毒素をコードするＢ。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｔｓ由来のδ−内毒素遺伝子をコード領域のＮ−
末端領域における特異的欠失によって改変した。この遺
伝子派生物発現は甲虫類に特異的な活性を有するタンパ
ク毒素の生産をもたらした。
ｉｏｎｔｓ由来のδ−内毒素遺伝子をコード領域のＮ−
末端領域における特異的欠失によって改変した。この遺
伝子派生物発現は甲虫類に特異的な活性を有するタンパ
ク毒素の生産をもたらした。
本発明はまた。 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓ内において、殺虫
性の結晶性タンパク遺伝子を一時的に調節する方法を提
供する。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓ内において、殺虫
性の結晶性タンパク遺伝子を一時的に調節する方法を提
供する。
さらに１本発明は、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ 結晶性タンパク遺伝子発現の紅旦ｙ違ｆμ臣堕ｖ
ａｒ、圏虹ｅｂｒｉｏｎｉｓプロモーター誘導性調節方
法および殺虫活性をもつ、対応する抗原の生産方法を提
供する。
ｓ 結晶性タンパク遺伝子発現の紅旦ｙ違ｆμ臣堕ｖ
ａｒ、圏虹ｅｂｒｉｏｎｉｓプロモーター誘導性調節方
法および殺虫活性をもつ、対応する抗原の生産方法を提
供する。
（以下余白）
溌１目ｌ戊
次の定義を、明細書および特許請求の範囲におけるそれ
らの使用の意図または範囲を明確にするために、説明す
る。
らの使用の意図または範囲を明確にするために、説明す
る。
■とは、構造遺伝子の転写および／または翻訳をさして
いう。
いう。
プロモータとは、転写の開始を指示する構造遺伝子の５
゛末端のヌクレオチド配列をさしていう。
゛末端のヌクレオチド配列をさしていう。
プロモータ配列は、下流領域の遺伝子の発現を引き起こ
すために必要であるが、常に十分であるとは限らない。
すために必要であるが、常に十分であるとは限らない。
原核生物では、プロモータはＲＮＡポリメラーゼと他の
開始因子および活性化因子との結合部位を提供すること
によって、転写を駆動する。通常、プロモータは、下流
域方向の転写を好適に駆動する。しかし、遺伝子がプロ
モータの上流域に位置するときにもプロモータ活性が示
され得る（その場合には９発現レベルが低下する）。
開始因子および活性化因子との結合部位を提供すること
によって、転写を駆動する。通常、プロモータは、下流
域方向の転写を好適に駆動する。しかし、遺伝子がプロ
モータの上流域に位置するときにもプロモータ活性が示
され得る（その場合には９発現レベルが低下する）。
転写のレベルは、プロモータ配列によって調節される。
従って、異種プロモータと構造遺伝子との組み合わせの
構築においては、構造遺伝子は、遣伝子の発現がプロモ
ータ配列によって制御されているような、プロモータの
調節的な制御の下に置かれている。プロモータは、好ま
しくは、構造遺伝子の上流域に配置され、そして好まし
くは、プロモータがその本来の配置で制御する遺伝子と
プロモータとの間の距離を近づけるような転写開始部位
からの距離の位置に、配置される。当該分野で知られて
いるように、この距離が幾分異なっていてもプロモータ
の機能が失なわれなければ許容され得る。
構築においては、構造遺伝子は、遣伝子の発現がプロモ
ータ配列によって制御されているような、プロモータの
調節的な制御の下に置かれている。プロモータは、好ま
しくは、構造遺伝子の上流域に配置され、そして好まし
くは、プロモータがその本来の配置で制御する遺伝子と
プロモータとの間の距離を近づけるような転写開始部位
からの距離の位置に、配置される。当該分野で知られて
いるように、この距離が幾分異なっていてもプロモータ
の機能が失なわれなければ許容され得る。
遺伝ヱＭとは、タンパク合成に包含されるＤＮＡ部分の
全体をさしていう。遺伝子は、５′末端での翻訳開始コ
ドン（通常はＡＴＧ ）で始まり。
全体をさしていう。遺伝子は、５′末端での翻訳開始コ
ドン（通常はＡＴＧ ）で始まり。
３′末端での停止コドン（ＴＡＧまたはＴＧ＾またはＴ
ＡＡ ）まで伸長する構造的な部分、あるいはコードし
ている部分を具体的に表わす。遺伝子はまた。プロモー
タ領域を含んでいて、それは通常、構造遺伝子の５゛位
あるいは上流域に位置し、構造遺伝子の発現を開始させ
、そして調節する。
ＡＡ ）まで伸長する構造的な部分、あるいはコードし
ている部分を具体的に表わす。遺伝子はまた。プロモー
タ領域を含んでいて、それは通常、構造遺伝子の５゛位
あるいは上流域に位置し、構造遺伝子の発現を開始させ
、そして調節する。
盪遣遺猛工とは、タンパク質、ポリペプチドまたはそれ
らの部分をコードするＤＮＡ部分を包含し。
らの部分をコードするＤＮＡ部分を包含し。
そして転写の開始を駆動する５゛配列を除外した遺伝子
の部分である。構造遺伝子は、一般に、細胞内で見出さ
れるものであったり、あるいはそれが導入されるべき細
胞中には８通常は見い出されないようなものであり、こ
の場合はその遺伝子は異１遺伝ヱと呼ばれる。異種遺伝
子は全体的にも部分的にも当該分野で既知の任意の供給
源から取得され得る。供給源としては、バクテリアゲノ
ムまはエピソーム、真核生物の核ＤＮＡまたはプラスミ
ドＤＮＡ 、 ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ 、または化
学的に合成されたＤＮＡが包含される。構造遺伝子は、
コード領域または非翻訳領域（それは、生物的な活性ま
たは発現産物の化学的構造９発現率、または発現の制御
方法に影響を与えうる）のいずれかに１またはそれ以上
の修飾を含み得る。そのような修飾は、限定されてない
が、１またはそれ以上のヌクレオチドの変異、挿入、欠
失および置換を包含する。構造遺伝子は、中断されない
コード配列を構成するか、または、適当なスプライス結
合によって結合した１つまたはそれ以上のイントロンを
含有し得る。構造遺伝子は、天然に存在するまたは合成
した複数の源から得られる断片の複合体であり得る。構
造遺伝子はまた。融合タンパクもコードし得る。
の部分である。構造遺伝子は、一般に、細胞内で見出さ
れるものであったり、あるいはそれが導入されるべき細
胞中には８通常は見い出されないようなものであり、こ
の場合はその遺伝子は異１遺伝ヱと呼ばれる。異種遺伝
子は全体的にも部分的にも当該分野で既知の任意の供給
源から取得され得る。供給源としては、バクテリアゲノ
ムまはエピソーム、真核生物の核ＤＮＡまたはプラスミ
ドＤＮＡ 、 ｃＤＮＡ、ウィルスＤＮＡ 、または化
学的に合成されたＤＮＡが包含される。構造遺伝子は、
コード領域または非翻訳領域（それは、生物的な活性ま
たは発現産物の化学的構造９発現率、または発現の制御
方法に影響を与えうる）のいずれかに１またはそれ以上
の修飾を含み得る。そのような修飾は、限定されてない
が、１またはそれ以上のヌクレオチドの変異、挿入、欠
失および置換を包含する。構造遺伝子は、中断されない
コード配列を構成するか、または、適当なスプライス結
合によって結合した１つまたはそれ以上のイントロンを
含有し得る。構造遺伝子は、天然に存在するまたは合成
した複数の源から得られる断片の複合体であり得る。構
造遺伝子はまた。融合タンパクもコードし得る。
椿悶皿檄は、植物の分化組織および未分化組織を包含す
る。植物の分化および未分化組織は、特に限定されない
が、根、茎９葉、花粉２種子、腫瘍組織、および培養物
の種々の形態（例えば、単一細胞、プロトプラスト胚お
よびカルス組織）を包含する。植物組織はイン ブラン
ク（ｉｎ 旦並凰）あるいは器官内１組織または細胞培
養物の中にあり得る。
る。植物の分化および未分化組織は、特に限定されない
が、根、茎９葉、花粉２種子、腫瘍組織、および培養物
の種々の形態（例えば、単一細胞、プロトプラスト胚お
よびカルス組織）を包含する。植物組織はイン ブラン
ク（ｉｎ 旦並凰）あるいは器官内１組織または細胞培
養物の中にあり得る。
ｍとはヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一であるこ
とまたは同一に近いことをさしていう。当該分野で理解
されているように、ヌクレオチドの不一致は、コドン中
の３番目の塩基またはゆらぎ塩基で生じ得、最終的なポ
リペプチド配列ではアミノ酸置換が起こらない。また、
遺伝子配列のある領域での軽微なヌクレオチド修飾（例
えば、置換、挿入、欠失）は許容され得、そのような修
飾により、最終生産物の機能を変化させないようなアミ
ノ酸配列の変化を生じるような場合には、有意な差はな
いと見なされ得る。遺伝子配列の全体的なあるいは部分
的な化学合成コピーにより、遺伝子の機能を失なうこと
なく天然の遺伝子中の関連した領域が１換され得ること
が示されてきた。特異的なりＮＡ配列の相同性は、当該
分野でよく知られている（Ｈａｍｅｓおよび旧ｇｇｅｎ
ｓ １１７４． （１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄ Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
、０ｘｆｏｒｄ。
とまたは同一に近いことをさしていう。当該分野で理解
されているように、ヌクレオチドの不一致は、コドン中
の３番目の塩基またはゆらぎ塩基で生じ得、最終的なポ
リペプチド配列ではアミノ酸置換が起こらない。また、
遺伝子配列のある領域での軽微なヌクレオチド修飾（例
えば、置換、挿入、欠失）は許容され得、そのような修
飾により、最終生産物の機能を変化させないようなアミ
ノ酸配列の変化を生じるような場合には、有意な差はな
いと見なされ得る。遺伝子配列の全体的なあるいは部分
的な化学合成コピーにより、遺伝子の機能を失なうこと
なく天然の遺伝子中の関連した領域が１換され得ること
が示されてきた。特異的なりＮＡ配列の相同性は、当該
分野でよく知られている（Ｈａｍｅｓおよび旧ｇｇｅｎ
ｓ １１７４． （１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１
ｄ Ｈｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ
、０ｘｆｏｒｄ。
ＯＫに記載）ような厳しい条件下で核酸の交差ハイブリ
ダイゼーション試験を使用し、当業者により同定され得
る。相同性の程度は、比較される配列間の同一性の割合
（％）により、しばしば測定される。従って、この明細
書においては、相同配列間に軽微な配列の違いがあり、
少なくとも７５％の相同性を示す任意の配列は同等であ
るとみなされる。
ダイゼーション試験を使用し、当業者により同定され得
る。相同性の程度は、比較される配列間の同一性の割合
（％）により、しばしば測定される。従って、この明細
書においては、相同配列間に軽微な配列の違いがあり、
少なくとも７５％の相同性を示す任意の配列は同等であ
るとみなされる。
ｌ米とは、ある（化学的におよび／または生物学的な）
ソース（源）から得られる（ｔａｋｅｎ。
ソース（源）から得られる（ｔａｋｅｎ。
ｏｂｔａｉｎｅｄ、 ｒｅｃｅｉｖｅｄ） 、あるソー
スを起源とする。
スを起源とする。
あるソースを複製する。またはその系統をひくという意
味で用いられる。誘導体は、もとのソースを化学的ある
いは生物学的に操作すること（置換。
味で用いられる。誘導体は、もとのソースを化学的ある
いは生物学的に操作すること（置換。
添加、挿入、欠失、抽出、単離、変異および複製を包含
し、これに限定されない）によって生産され得る。
し、これに限定されない）によって生産され得る。
ＤＮＡの配列に関係する止工金底とは構成成分であるヌ
クレオチドがインビトロで組み立てられることを意味す
る。手作業でのＤＮＡの化学合成は。
クレオチドがインビトロで組み立てられることを意味す
る。手作業でのＤＮＡの化学合成は。
充分に確立された方法によって達成され得る（Ｍ、 Ｃ
ａｒｕｔｈｅｒｓ （１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏ
ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄＲＮＡ Ｓｅ ｕｅｎｃｉｎ
、 −ｅｉｓｓｍａｎｌ１４． Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 Ｃｈａｐ
ｔｅｒ １ ） 、あるいは、市販の入手し得る多くの
機械のうちの１つを使用し、自動的に化学合成され得る
。
ａｒｕｔｈｅｒｓ （１９８３）、Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏ
ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄＲＮＡ Ｓｅ ｕｅｎｃｉｎ
、 −ｅｉｓｓｍａｎｌ１４． Ｐｒａｅｇｅｒ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、 Ｃｈａｐ
ｔｅｒ １ ） 、あるいは、市販の入手し得る多くの
機械のうちの１つを使用し、自動的に化学合成され得る
。
ＩＢＪｒ叉ＺべＬまたは庭益員案またはδ−エンドトキ
シン（δ−内毒素）は、Ｌ 肋！士１国旺ハｖａｒ、の
菌株内で形成された胞子外の結晶の主タンパク成分をさ
していう。
シン（δ−内毒素）は、Ｌ 肋！士１国旺ハｖａｒ、の
菌株内で形成された胞子外の結晶の主タンパク成分をさ
していう。
このタンパク成分は１種々の種の昆虫に選択的な病原性
を示す。胞子外の結晶から単離された主タンパクの分子
サイズは、それが得られたβ工匠旦■圏ｎ５ｉｓの菌株
によって異なる。約１３２．６５および２８ｋＤａの分
子量を有する結晶タンパクが報告されている。鱗翅類に
毒性を示すｆｌ、劾ｙ道ｌ匡旺旦株は、 １３５ ｋＤ
ａポリペプチドを含み、甲虫類に活性であるポリペプチ
ドは、約６５ｋＤａの毒素タンパクを有する。他方、双
翅類に対して特異的なｈｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ株
は２８ｋＤａのポリペプチド毒素と１３０ｋＤａの毒素
とを生産し、後者は、はとんど力５双翅類に対する毒性
を有する。Ｂ、勅五頂（１）且吐堕ｖａｒ。
を示す。胞子外の結晶から単離された主タンパクの分子
サイズは、それが得られたβ工匠旦■圏ｎ５ｉｓの菌株
によって異なる。約１３２．６５および２８ｋＤａの分
子量を有する結晶タンパクが報告されている。鱗翅類に
毒性を示すｆｌ、劾ｙ道ｌ匡旺旦株は、 １３５ ｋＤ
ａポリペプチドを含み、甲虫類に活性であるポリペプチ
ドは、約６５ｋＤａの毒素タンパクを有する。他方、双
翅類に対して特異的なｈｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ株
は２８ｋＤａのポリペプチド毒素と１３０ｋＤａの毒素
とを生産し、後者は、はとんど力５双翅類に対する毒性
を有する。Ｂ、勅五頂（１）且吐堕ｖａｒ。
ｋｕｒｓｔａｋｉにおいては、約１３５ ｋＤａのポリ
ペプチドが毒素前駆体であり、それは昆虫の中腸内で開
裂し、約６８ｋＤａの毒素を形成することが示されてい
る。さらに、毒素前駆体の活性部分がそのポリペプチド
のＮ末端側半分に位置していることが明らかになった。
ペプチドが毒素前駆体であり、それは昆虫の中腸内で開
裂し、約６８ｋＤａの毒素を形成することが示されてい
る。さらに、毒素前駆体の活性部分がそのポリペプチド
のＮ末端側半分に位置していることが明らかになった。
開裂して毒素を形成した後も維持されるのは、そのポリ
ペプチドのＮ末端部分である。
ペプチドのＮ末端部分である。
日 ンバク゛ −あるいはＬ二古皇索這誕玉とは、完全
長の毒素前駆体または毒素形のいずれかで殺虫性結晶タ
ンパクをコードするＤＮＡ配列をさしていう。そして、
それは、その遺伝子が得られたＢ、旦五力１国吐ｕ株に
依存して様々である。
長の毒素前駆体または毒素形のいずれかで殺虫性結晶タ
ンパクをコードするＤＮＡ配列をさしていう。そして、
それは、その遺伝子が得られたＢ、旦五力１国吐ｕ株に
依存して様々である。
皿ｍ復二元王とは、一般には共存しないＤＮＡ配列が、
遺伝子工学の開裂および連結酵素の技術を利用して２人
工的に持ち込んだときの構築物をさしていう。
遺伝子工学の開裂および連結酵素の技術を利用して２人
工的に持ち込んだときの構築物をさしていう。
クローニングとは、 ＤＮＡ断片を天然の配置からそれ
が再生産される別の部位へと再配置するために遺伝子工
学で利用される方法をさしていう。そのクローニング方
法は、所望のＤＮＡ断片の切除および単離、 ＤＮＡ断
片のベクター分子への挿入、およびその組み換えベクタ
ーの細胞（ＤＮＡの断片の複数コピーまたはクローンが
複製する）への導入を包含する。
が再生産される別の部位へと再配置するために遺伝子工
学で利用される方法をさしていう。そのクローニング方
法は、所望のＤＮＡ断片の切除および単離、 ＤＮＡ断
片のベクター分子への挿入、およびその組み換えベクタ
ーの細胞（ＤＮＡの断片の複数コピーまたはクローンが
複製する）への導入を包含する。
本発明は、＊翅頻に対して毒性を示すＦ３Ｌｔｈｕｒ口
【μｒｓｉｓのほとんどの菌株、および双翅類に対して
働くいくつかのＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの活
性に反して、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓが、甲虫類に対して
特異性を示す、という報告に基づいている（Ａ、 Ｋｒ
ｉｅｇら（１９８３） （前出））。第２のβ工Ｕ肛膿
ｔｌは植株、つまり、シリ−倶四阻もまた。甲虫類に対
して毒性を有することが見い出された。
【μｒｓｉｓのほとんどの菌株、および双翅類に対して
働くいくつかのＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの活
性に反して、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓが、甲虫類に対して
特異性を示す、という報告に基づいている（Ａ、 Ｋｒ
ｉｅｇら（１９８３） （前出））。第２のβ工Ｕ肛膿
ｔｌは植株、つまり、シリ−倶四阻もまた。甲虫類に対
して毒性を有することが見い出された。
農業経済的に重要ないくつかの害虫は甲虫目に属する（
例えば、コロラドジャガイモハムシ、ユタミゾウムシ、
コーン ルートワーム）。このように、宿主範囲は、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓについて広げられた
。このβ工ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓは、ａ業的な殺
虫剤として一般に非常に好適な病原菌である。さらに、
この報告は、ユタミゾウムシ（Ａｎ ｔｈｏｎｏｍｕｓ
［甜ユバ） 、コロラドじゃがいもハムシ（ｋＨ釦とυ
ｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ） 、および特にウ
ェスタンコーン ルートワーム（Ｄｉａｂｒｉｏｔｉｃ
ａ 魁」土ｆｅｒａ史」上国側）を包含するいくつかの
経済的に重要な害虫を制御するための新規方法を提供す
る可能性を開いた。
例えば、コロラドジャガイモハムシ、ユタミゾウムシ、
コーン ルートワーム）。このように、宿主範囲は、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓについて広げられた
。このβ工ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓは、ａ業的な殺
虫剤として一般に非常に好適な病原菌である。さらに、
この報告は、ユタミゾウムシ（Ａｎ ｔｈｏｎｏｍｕｓ
［甜ユバ） 、コロラドじゃがいもハムシ（ｋＨ釦とυ
ｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ） 、および特にウ
ェスタンコーン ルートワーム（Ｄｉａｂｒｉｏｔｉｃ
ａ 魁」土ｆｅｒａ史」上国側）を包含するいくつかの
経済的に重要な害虫を制御するための新規方法を提供す
る可能性を開いた。
本発明では、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ−ｏｎｉｓの結晶タンパクを
コードする遺伝子が、植物を防御することを目的とし、
害虫の生物的な制御法を与えるために利用される。Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子で形質転換されたＥ、
ｃｏ旦は、甲虫類の昆虫に対して毒性を示すようにな
る。（宿主細菌の遺伝子の制御された発現についての方
法および組成物（実施例３に記載される）とが与えられ
る。構造遺伝子およびそのプロモータ領域を包含するＤ
ＮＡ配列が用いられた（実施例４）。これらは、 ＲＮ
Ａポリメラーゼの認識および結合部位、および転写開始
配列（ｃａｐ部位）を包含する。その調節系は、翻訳開
始コドンの上流のδ−内毒素遺伝子の５′隣接領域に位
置する６００ ｂｐより短いＤＮＡ断片に見い出される
。ここで使用されているように、上流という用語は転写
と反対の方向を意味し、他方、下流という用語は転写の
方向を意味している。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ−ｏｎｉｓの結晶タンパクを
コードする遺伝子が、植物を防御することを目的とし、
害虫の生物的な制御法を与えるために利用される。Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子で形質転換されたＥ、
ｃｏ旦は、甲虫類の昆虫に対して毒性を示すようにな
る。（宿主細菌の遺伝子の制御された発現についての方
法および組成物（実施例３に記載される）とが与えられ
る。構造遺伝子およびそのプロモータ領域を包含するＤ
ＮＡ配列が用いられた（実施例４）。これらは、 ＲＮ
Ａポリメラーゼの認識および結合部位、および転写開始
配列（ｃａｐ部位）を包含する。その調節系は、翻訳開
始コドンの上流のδ−内毒素遺伝子の５′隣接領域に位
置する６００ ｂｐより短いＤＮＡ断片に見い出される
。ここで使用されているように、上流という用語は転写
と反対の方向を意味し、他方、下流という用語は転写の
方向を意味している。
プロモータおよび構造遺伝子配列は、原核生物の複製系
（原核細胞の宿主中での増幅を可能にする）１選択のた
めのマーカー、および他のＤＮＡ Ｍ域により結合され
得る。ベクターに既述の細菌宿主中に挿入された遺伝子
の調節された転写および翻訳を与えるために、ベクター
はまた。プロモータの転写制御下で遺伝子を挿入するた
めの制限部位を有する他のＤＮＡ配列を含有し得る。
（原核細胞の宿主中での増幅を可能にする）１選択のた
めのマーカー、および他のＤＮＡ Ｍ域により結合され
得る。ベクターに既述の細菌宿主中に挿入された遺伝子
の調節された転写および翻訳を与えるために、ベクター
はまた。プロモータの転写制御下で遺伝子を挿入するた
めの制限部位を有する他のＤＮＡ配列を含有し得る。
δ−内毒素遺伝子は、 ５．９ ｋｂのＢａｎ＋ＨＩ断
片として、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの９
０ｋＤａのプラスミドから単離され得る（第４図）、そ
の完全長の断片は。
片として、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの９
０ｋＤａのプラスミドから単離され得る（第４図）、そ
の完全長の断片は。
適当なベクターのＢａｍＨＥ挿入部位へ挿入することに
よって利用され得る。 ５．９ｋｂの影υＨＩ挿入物は
。
よって利用され得る。 ５．９ｋｂの影υＨＩ挿入物は
。
ベクター内において、その前に存在するＩａｃＺプロモ
ータに関して同じ方向か反対の方向のどちらかに配向し
得る。その遺伝子の配向が１ａｃＺプロモータの配向と
同じ場合には、転写は数倍に増大する。
ータに関して同じ方向か反対の方向のどちらかに配向し
得る。その遺伝子の配向が１ａｃＺプロモータの配向と
同じ場合には、転写は数倍に増大する。
組み換えプラスミドベクターは、適当な宿主細胞を形質
転換するために利用され得る。次に、挿入遺伝子は、そ
れ自身の調節系および翻訳開始因子の制御の下で、挿入
された遺伝子に対応する天然のポリペプチドとして発現
する。
転換するために利用され得る。次に、挿入遺伝子は、そ
れ自身の調節系および翻訳開始因子の制御の下で、挿入
された遺伝子に対応する天然のポリペプチドとして発現
する。
あるいは、 ５．９ ｋｂのＤＮＡ断片はさらに制限さ
れ得る。構造遺伝子に隣接する５゛および３′領域は。
れ得る。構造遺伝子に隣接する５゛および３′領域は。
塩基対の所望の数を除去するために９選択された時間の
間、適当な制限エンドヌクレアーゼあるいは二本鎖エキ
ソヌクレアーゼを使用する。制御された分解を受は得る
。得られた短くなった断片は。
間、適当な制限エンドヌクレアーゼあるいは二本鎖エキ
ソヌクレアーゼを使用する。制御された分解を受は得る
。得られた短くなった断片は。
次に、ベクターの挿入部位に適合するような、存在して
いるまたは結合した制限部位を使用して。
いるまたは結合した制限部位を使用して。
ベクター中へ挿入され得る。この方法では、調節領域お
よびコード領域は同定され、修飾され得る。
よびコード領域は同定され、修飾され得る。
実施例２に記載された本発明の実施態様では。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素をコードする遺伝子は、３つ
のＤＮＡ断片の、うちの１つとしてＥ、 ｃｏｌｉに
導入された。つまり、 ５．９ ｋｂのＢａｍ１ｌ Ｉ
断片として、 ３．０ ｋｂのｔｌｉｎｄＩ［［サブク
ローンとして。
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素をコードする遺伝子は、３つ
のＤＮＡ断片の、うちの１つとしてＥ、 ｃｏｌｉに
導入された。つまり、 ５．９ ｋｂのＢａｍ１ｌ Ｉ
断片として、 ３．０ ｋｂのｔｌｉｎｄＩ［［サブク
ローンとして。
または５．９ ｋｂＢａｍｌｌ Ｉ断片から酵素を用い
て誘導された欠失誘導体であるｐ５４４ Ｐｓｔ−Ｍｅ
ｔ５として、ＮＬ人された。特に、Ｂ、劫五セ頗！旺ｉ
ｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素
をコードする遺伝子断片は。
て誘導された欠失誘導体であるｐ５４４ Ｐｓｔ−Ｍｅ
ｔ５として、ＮＬ人された。特に、Ｂ、劫五セ頗！旺ｉ
ｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素
をコードする遺伝子断片は。
毒素タンパクをコードしている配列をｐＵＣ１２プラス
ミドにクローニングして、 Ｅ、 ｃｏｌｉを形質転
換するためにこの組み換えプラスミドを用いることによ
って、 Ｌｃｏｌｉに導入された。これら３種のすべて
の遺伝子断片は１発現した。つまり、 、５．９ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片あるいは３．Ｏｋｂの旧ｎｄｌ［［サブ
クローンを利用する発現系では７３ｋＤａの毒性ポリペ
プチドが生産され、他方、Ｎ末端欠失誘導体であるｐ５
４４ Ｐｓｔ−Ｍｅｔ５では６５ｋＤａのポリペプチド
毒素が得られた。その６５ｋＤａの組み換えポリペプチ
ド発現生産物は、２報文中では、結晶毒素として単離さ
れた６５ｋＤａのポリペプチドとは異なるとされている
。その天然の６５ｋＤａの単離物質は、Ｎ末端に変異性
を持つ、非常に類似したタンパクの混合物を含んでいる
が１組み換え発現生産物は多分均一であり、Ｎ末端メチ
オニンを有する。約６５ｋＤａの分子量を持つ数種の殺
虫性ポリペプチドは、 ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから単離され得
る。そしておそらく、それぞれのポリペプチドは、より
大きな７３ｋＤａの結晶タンパクのタンパク分解プロセ
ッシングの様々な程度を示している。
ミドにクローニングして、 Ｅ、 ｃｏｌｉを形質転
換するためにこの組み換えプラスミドを用いることによ
って、 Ｌｃｏｌｉに導入された。これら３種のすべて
の遺伝子断片は１発現した。つまり、 、５．９ｋｂの
ＢａｍＨＩ断片あるいは３．Ｏｋｂの旧ｎｄｌ［［サブ
クローンを利用する発現系では７３ｋＤａの毒性ポリペ
プチドが生産され、他方、Ｎ末端欠失誘導体であるｐ５
４４ Ｐｓｔ−Ｍｅｔ５では６５ｋＤａのポリペプチド
毒素が得られた。その６５ｋＤａの組み換えポリペプチ
ド発現生産物は、２報文中では、結晶毒素として単離さ
れた６５ｋＤａのポリペプチドとは異なるとされている
。その天然の６５ｋＤａの単離物質は、Ｎ末端に変異性
を持つ、非常に類似したタンパクの混合物を含んでいる
が１組み換え発現生産物は多分均一であり、Ｎ末端メチ
オニンを有する。約６５ｋＤａの分子量を持つ数種の殺
虫性ポリペプチドは、 ＢＬｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓから単離され得
る。そしておそらく、それぞれのポリペプチドは、より
大きな７３ｋＤａの結晶タンパクのタンパク分解プロセ
ッシングの様々な程度を示している。
活性な殺虫性結晶タンパクは、Ｎ末端領域中で修飾され
た（欠失した）ｈ卦■道ｌ□□□臣堕ｖａｒ、旦Ｌｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ結晶毒素遺伝子から生産され得るが、Ｃ末
端での４または５を超える数のアミノ酸の欠失は許容さ
れ得す、殺虫活性が１０倍を超える量での損失となる。
た（欠失した）ｈ卦■道ｌ□□□臣堕ｖａｒ、旦Ｌｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ結晶毒素遺伝子から生産され得るが、Ｃ末
端での４または５を超える数のアミノ酸の欠失は許容さ
れ得す、殺虫活性が１０倍を超える量での損失となる。
細菌宿主の中でそのベクターの増幅が可能となることは
望ましいことである。このことにより多量のベクターが
良好に特徴づけられた細菌系で生育することが可能とな
る。適当な原核生物複製系は当業者によ（知られていて
、それはｐＢＲ３２２，ｐＲＫ２９０゜Ｃｏ１Ｅ１のよ
うなプラスミドと、バクテリオファージとを包含する。
望ましいことである。このことにより多量のベクターが
良好に特徴づけられた細菌系で生育することが可能とな
る。適当な原核生物複製系は当業者によ（知られていて
、それはｐＢＲ３２２，ｐＲＫ２９０゜Ｃｏ１Ｅ１のよ
うなプラスミドと、バクテリオファージとを包含する。
その原核生物複製系は、宿主原核生物によって認識可能
な複製起源（オリジン）を含有していることが知られ、
宿主原核生物宿主中の形質転換体の選択のために、たい
てい１種あるいはそれ以上指標（マーカー）を含んでい
る。そのようなマーカーは、つまり、抗生物質耐性およ
び毒素耐性を包含する。
な複製起源（オリジン）を含有していることが知られ、
宿主原核生物宿主中の形質転換体の選択のために、たい
てい１種あるいはそれ以上指標（マーカー）を含んでい
る。そのようなマーカーは、つまり、抗生物質耐性およ
び毒素耐性を包含する。
本発明のベクターの調製のための例示された方法では、
δ−内毒素遺伝子は、それが増幅される適当な原核生物
プラスミドに挿入される。真核生物の宿主内で複製でき
る複製系を選択することが望ましい。適当な複製系は種
々のウィルス系から得られ、特にそれらは特異な宿主内
に高いコピー数で存在し得る系から得られる。これらの
情況においては、δ−内毒素遺伝子は、適当な細胞の位
置で毒素タンパク質の発現を目的として、直接。
δ−内毒素遺伝子は、それが増幅される適当な原核生物
プラスミドに挿入される。真核生物の宿主内で複製でき
る複製系を選択することが望ましい。適当な複製系は種
々のウィルス系から得られ、特にそれらは特異な宿主内
に高いコピー数で存在し得る系から得られる。これらの
情況においては、δ−内毒素遺伝子は、適当な細胞の位
置で毒素タンパク質の発現を目的として、直接。
真核生物（植物）宿主へ挿入されている。植物を形質転
換するために利用され、そして、当業者によって共通に
用いられる標準技術は、 ＡｄａｎｇおよびＫｅｍｐ、
ＥＰＯ公開Ｎａ ０１４２９２４．０５／２９／８５
に詳細に述べられている（ Ｖａｅｃｋら（１９８７）
前出）。
換するために利用され、そして、当業者によって共通に
用いられる標準技術は、 ＡｄａｎｇおよびＫｅｍｐ、
ＥＰＯ公開Ｎａ ０１４２９２４．０５／２９／８５
に詳細に述べられている（ Ｖａｅｃｋら（１９８７）
前出）。
細菌媒介系に存在する昆虫毒素は、 Ｂ、 ｔｈｕｒ
ｉｎ−ｄμ玉臘から得られる。βエ 封目１町区凹幻至
の種々の菌株は昆虫の害虫に対して様々な毒性スペクト
ルを示す。例えば、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉはＩＩＪＩ翅類に対し
て毒性を示し、 ｖａｒ、１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓは双
翅類に対して活性である。これに対してその亜種である
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよび５ａｎｄ圏銭は甲虫類に
対して活性を示す。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉのある株ば、鱗翅類およ
び双翅類の両方に対し毒性を有するが、この場合には１
種々のタンパクがそのような広い範囲の毒性を与えるこ
とに関係している。
ｉｎ−ｄμ玉臘から得られる。βエ 封目１町区凹幻至
の種々の菌株は昆虫の害虫に対して様々な毒性スペクト
ルを示す。例えば、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓ ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉはＩＩＪＩ翅類に対し
て毒性を示し、 ｖａｒ、１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓは双
翅類に対して活性である。これに対してその亜種である
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよび５ａｎｄ圏銭は甲虫類に
対して活性を示す。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉのある株ば、鱗翅類およ
び双翅類の両方に対し毒性を有するが、この場合には１
種々のタンパクがそのような広い範囲の毒性を与えるこ
とに関係している。
本発明の方法は、Ｌ旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの任意の
毒素遺伝子を利用し得る。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ。
毒素遺伝子を利用し得る。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子は、得られた遺伝
子的に修飾された細菌において所望の毒性範囲を得るた
めに１選択された。標的範囲をさらに変化させ。
子的に修飾された細菌において所望の毒性範囲を得るた
めに１選択された。標的範囲をさらに変化させ。
あるいは広げるために１種を超える毒素遺伝子を組み換
え細菌系に導入することが望ましい。異なった昆虫特異
性を持つ２種あるいはそれ以上の毒素遺伝子が並んだ配
置で挿入され、もしくは個々のプラスミドに導入され得
る。存在する月エ 並頁」ｎ旦ｎｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子の一部を、目的とする
構造遺伝子をさらに挿入することを可能にするために、
変化させる必要がある。これは、その遺伝子を内部の制
限部位で切断し、得られた線状ＤＮＡ配列を二本鎖エキ
ソヌクレアーゼで処理し、その結果、 Ｂ、 ｔｈｕｒ
ｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
え細菌系に導入することが望ましい。異なった昆虫特異
性を持つ２種あるいはそれ以上の毒素遺伝子が並んだ配
置で挿入され、もしくは個々のプラスミドに導入され得
る。存在する月エ 並頁」ｎ旦ｎｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子の一部を、目的とする
構造遺伝子をさらに挿入することを可能にするために、
変化させる必要がある。これは、その遺伝子を内部の制
限部位で切断し、得られた線状ＤＮＡ配列を二本鎖エキ
ソヌクレアーゼで処理し、その結果、 Ｂ、 ｔｈｕｒ
ｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの構造遺伝子の所望の部分が除
去され、そして所望の構造遺伝子の挿入が可能となるこ
とにより達成される。その構造遺伝子は、その遺伝子の
両末端に別々のリンカ−を用いることによって１発現の
ために、適当な方向で挿入され得る。本発明のその配列
の開示により、これらの延長された目標を可能にする毒
素遺伝子の必要な修飾および精製が可能となる。
去され、そして所望の構造遺伝子の挿入が可能となるこ
とにより達成される。その構造遺伝子は、その遺伝子の
両末端に別々のリンカ−を用いることによって１発現の
ために、適当な方向で挿入され得る。本発明のその配列
の開示により、これらの延長された目標を可能にする毒
素遺伝子の必要な修飾および精製が可能となる。
Ｆｉ、 ｃｏ旦は組み換え遺伝子構築物を発現させる
ためにもっともよく利用される。代わりに他のグラム陰
性細胞は、特異的なりＮＡ発現を示すために利用され得
る。例えば、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ９の結
晶タンパク遺伝子は、 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍに導入され
て発現された（Ａｄａｎｇら、ヨーロッパ特許出願、公
開第０２０９３７０号）。そして、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓにおいても発現された（Ｓｔｏｃｋら、ヨーロッ
パ特許出願第０２５５３１１号）。本発明の実施例に記
載されているように、その毒素タンパク配列を含む組み
換え体プラスミドは、 Ｅ、 ｃｏｌｔ細胞を形質転
換するために利用された。２つの組み換え体構築物であ
るｐＮＳＢＰ５４４およびｐ５４４Ｈｉｎｄｓｃは、
７３ｋＤａおよび６５ｋＤａのポリペプチドを生産した
が１Ｍｉみ換え体ｐ５４４Ｐｓｔ−Ｍｅｔ５誘導体は６
５ｋＤａのポリペプチドばかりを生産した。
ためにもっともよく利用される。代わりに他のグラム陰
性細胞は、特異的なりＮＡ発現を示すために利用され得
る。例えば、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ９の結
晶タンパク遺伝子は、 Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍに導入され
て発現された（Ａｄａｎｇら、ヨーロッパ特許出願、公
開第０２０９３７０号）。そして、 Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓにおいても発現された（Ｓｔｏｃｋら、ヨーロッ
パ特許出願第０２５５３１１号）。本発明の実施例に記
載されているように、その毒素タンパク配列を含む組み
換え体プラスミドは、 Ｅ、 ｃｏｌｔ細胞を形質転
換するために利用された。２つの組み換え体構築物であ
るｐＮＳＢＰ５４４およびｐ５４４Ｈｉｎｄｓｃは、
７３ｋＤａおよび６５ｋＤａのポリペプチドを生産した
が１Ｍｉみ換え体ｐ５４４Ｐｓｔ−Ｍｅｔ５誘導体は６
５ｋＤａのポリペプチドばかりを生産した。
その発現されたタンパク（７３ｋＤａのポリペプチド種
および６５ｋＤａのポリペプチド種）は、 ｖａｒ、ｔ
ｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓの精製された６５ｋＤａの結晶
タンパクに対する抗血清と交差反応させた（第３図）。
および６５ｋＤａのポリペプチド種）は、 ｖａｒ、ｔ
ｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓの精製された６５ｋＤａの結晶
タンパクに対する抗血清と交差反応させた（第３図）。
ｖａｒ、ｔｅμヒｂｒｉｏｎｉｓから単離された結晶は
、 ７３ｋＤａと６５ｋＤａの両方の成分を含んでいる
。しかし、胞子形成しているｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ細胞は２組み換え構築物による生産物の大きい
方に一致し、免疫反応性を有する７３ｋＤａのペプチド
を主として含む。より大きな翻訳生産物がタンパク分解
プロセッシングによりより小さい分子量のペプチドに変
換すると考えられる（Ｋ、Ｂｅｒｎｈａｒｄ （１９８
６） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
、 ７３ｋＤａと６５ｋＤａの両方の成分を含んでいる
。しかし、胞子形成しているｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ細胞は２組み換え構築物による生産物の大きい
方に一致し、免疫反応性を有する７３ｋＤａのペプチド
を主として含む。より大きな翻訳生産物がタンパク分解
プロセッシングによりより小さい分子量のペプチドに変
換すると考えられる（Ｋ、Ｂｅｒｎｈａｒｄ （１９８
６） ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
Ｌｅｔｔ、 ３３：２６１−２６５）。
本発明では、ここに記載されているように、殺虫性の結
晶タンパク転写物が出現する時期とβ工ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓに対
する結晶タンパク抗原が決定された。一般に、すべての
ｈｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの変種の結晶タンパク遺
伝子の発現は、胞子形成中期の間にのみ始まっているこ
とが示されてきた。その結晶タンパク遺伝子の発現の一
時的な調節は、胞子形成期に特異的な形のＲＮＡポリメ
ラーゼによって認識される高度に保持されたプロモータ
領域によってよく反映される（Ｅ、Ｗａｒｄら、 （
１９８６） Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１９１：１−
１１；Ｈ，Ｗｏｎｇら。
晶タンパク転写物が出現する時期とβ工ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓに対
する結晶タンパク抗原が決定された。一般に、すべての
ｈｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの変種の結晶タンパク遺
伝子の発現は、胞子形成中期の間にのみ始まっているこ
とが示されてきた。その結晶タンパク遺伝子の発現の一
時的な調節は、胞子形成期に特異的な形のＲＮＡポリメ
ラーゼによって認識される高度に保持されたプロモータ
領域によってよく反映される（Ｅ、Ｗａｒｄら、 （
１９８６） Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、１９１：１−
１１；Ｈ，Ｗｏｎｇら。
（１９８３） Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、 ２５８
：１９６０−１９６７） 、 Ｂ。
：１９６０−１９６７） 、 Ｂ。
旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓおよび他の肛旦五力【旦ｎ５ｉｓの変種の結晶
タンパク遺伝子のヌクレオチド配列を比較することによ
って、構造遺伝子における相違とは異なり、それらのプ
ロモータ領域はわずかな相同性のみを共有することが明
らかになった。
ｏｎｉｓおよび他の肛旦五力【旦ｎ５ｉｓの変種の結晶
タンパク遺伝子のヌクレオチド配列を比較することによ
って、構造遺伝子における相違とは異なり、それらのプ
ロモータ領域はわずかな相同性のみを共有することが明
らかになった。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓでは、他のＢ、 卦！セｌ旦ｎ５ｉｓ
の変種と比較して、その結晶タンパク転写物およびそれ
に対応する抗原が、野菜の細胞では検出し得る水準で作
られていることが２本発明では示されている（実施例６
に記！り。
ｅｂｒｉｏｎｉｓでは、他のＢ、 卦！セｌ旦ｎ５ｉｓ
の変種と比較して、その結晶タンパク転写物およびそれ
に対応する抗原が、野菜の細胞では検出し得る水準で作
られていることが２本発明では示されている（実施例６
に記！り。
その結晶タンパク遺伝子の発現は、初期定常状態の細胞
中では劇的に増加し、プラトーに達する。
中では劇的に増加し、プラトーに達する。
さらに、免疫プロッティング分析の結果は、その結晶タ
ンパク抗原は野菜の細胞では７３ｋＤａのペプチドとし
て作られ、定常期の細胞では、タンパク分解プロセッシ
ングによっである程度６５ｋＤａのペプチドに変換され
ていることを示唆している。
ンパク抗原は野菜の細胞では７３ｋＤａのペプチドとし
て作られ、定常期の細胞では、タンパク分解プロセッシ
ングによっである程度６５ｋＤａのペプチドに変換され
ていることを示唆している。
Ｂ、旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓのプロモータ領域によって示された結晶タ
ンパク遺伝子の発現の一時的な制御は、特異的な殺虫性
抗原の生産を調節るための修正された系に、好都合に利
用され得る。例えば、ＬＬ 旦ガ卦ゼ！旺ｉｓ ｖａ
ｒ、田ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶タンパク遺伝子のプロ
モータ領域は、他のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓの変種由来の毒素遺伝子に融合され得る。Ｂ、 ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｒｉｏｎｉｓのプロモータ領域によって示された結晶タ
ンパク遺伝子の発現の一時的な制御は、特異的な殺虫性
抗原の生産を調節るための修正された系に、好都合に利
用され得る。例えば、ＬＬ 旦ガ卦ゼ！旺ｉｓ ｖａ
ｒ、田ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶タンパク遺伝子のプロ
モータ領域は、他のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉ
ｓの変種由来の毒素遺伝子に融合され得る。Ｂ、 ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ中の結晶毒素に対して観察され
るのに類似した発現の調節を達成するために、目的とす
る他の外来構造遺伝子をＢ、独ｙ力（１）尺旺国ｖａｒ
。
るのに類似した発現の調節を達成するために、目的とす
る他の外来構造遺伝子をＢ、独ｙ力（１）尺旺国ｖａｒ
。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの殺虫性結晶タンパクプロモー
タの制御下に置くことも可能である。そのような遺伝子
工学において必要とされる技術は、標準的であり。
タの制御下に置くことも可能である。そのような遺伝子
工学において必要とされる技術は、標準的であり。
当業者によって共通に用いられている。
（以下余白）
本発明における発現産物、つまり毒素、は害虫集団を処
理するために、高い可能性を有する。精製した組換え生
産物を、散布により適当な宿生植物の葉の上に容易に付
与することができる。さらに、標的害虫の範囲を広げ、
付与した毒素の効果の持続性を延長させ、または毒素の
処方物を安定化するのを助長させる目的で、毒素産物に
、化学添加剤または殺菌性添加物が補われる。植物の表
面に昆虫毒素タンパクを供給するキャリアとして働く８
選択された細菌は、植物に対しては病原性のない２種々
の植物にコロニーを形成する広範囲の細菌から選択され
る。
理するために、高い可能性を有する。精製した組換え生
産物を、散布により適当な宿生植物の葉の上に容易に付
与することができる。さらに、標的害虫の範囲を広げ、
付与した毒素の効果の持続性を延長させ、または毒素の
処方物を安定化するのを助長させる目的で、毒素産物に
、化学添加剤または殺菌性添加物が補われる。植物の表
面に昆虫毒素タンパクを供給するキャリアとして働く８
選択された細菌は、植物に対しては病原性のない２種々
の植物にコロニーを形成する広範囲の細菌から選択され
る。
本発明においては、Ｂ、旦肛旦麩並旦ｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのδ−内毒素、遺伝子を有
する遺伝的に変化したＥ、 ｃｏｌｉが、昆虫に対し
て毒性を示すことが、昆虫ダイエツトバイオアッセイで
測定することによりわかった。組換えクローンから全タ
ンパクを抽出し、各々のクローンの一部を個々のジャガ
イモの葉に塗布、または１発芽したトウモロコシの穀粒
に付与し、そしてコロラドポテト ビートル（捷且ｔｉ
ｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ ） 。
する遺伝的に変化したＥ、 ｃｏｌｉが、昆虫に対し
て毒性を示すことが、昆虫ダイエツトバイオアッセイで
測定することによりわかった。組換えクローンから全タ
ンパクを抽出し、各々のクローンの一部を個々のジャガ
イモの葉に塗布、または１発芽したトウモロコシの穀粒
に付与し、そしてコロラドポテト ビートル（捷且ｔｉ
ｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ ） 。
ウェスタン コーン ルートワーム（Ｄｉａｂｒｉｏｔ
ｉｃａ旦ユ■肛Ｌ 」江■ハ■）、または、サザン コ
ーン ルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ 肪並虱
鼾叩とｔａｔａ ）＋ の新生の幼虫に与えた。各々
のクローンを２回テストし、昆虫の死亡率を記録した。
ｉｃａ旦ユ■肛Ｌ 」江■ハ■）、または、サザン コ
ーン ルートワーム（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ 肪並虱
鼾叩とｔａｔａ ）＋ の新生の幼虫に与えた。各々
のクローンを２回テストし、昆虫の死亡率を記録した。
細菌に導入された組換えベクターは、必ずしも安定に維
持されず、そして多世代を経ると、昆虫毒性の表現型が
失われることが示されてきた。安定化を達成するために
、当業者に利用され得る多くの方法がある。しばしば、
細胞の生存に必要な遺伝子が、所望の遺伝子１例えばδ
−内毒素遺伝子を有する組換えベクターの中に組み込ま
れる。
持されず、そして多世代を経ると、昆虫毒性の表現型が
失われることが示されてきた。安定化を達成するために
、当業者に利用され得る多くの方法がある。しばしば、
細胞の生存に必要な遺伝子が、所望の遺伝子１例えばδ
−内毒素遺伝子を有する組換えベクターの中に組み込ま
れる。
遺伝的に修飾された細菌株により植物の葉上にコロニー
形成させるためには、植物の葉は所望の細菌株を含む適
当な組成物と共に接種されねばならない。一般に、接種
物は、植物の成長の間のいかなる時にでも付与すること
ができる。特に大きな畑の植物の接種を、散布によって
最も効果的に行うことができる。
形成させるためには、植物の葉は所望の細菌株を含む適
当な組成物と共に接種されねばならない。一般に、接種
物は、植物の成長の間のいかなる時にでも付与すること
ができる。特に大きな畑の植物の接種を、散布によって
最も効果的に行うことができる。
効果的な殺虫剤として働くのに十分な毒素を生産するた
めに必要である遺伝的な形質転換をうけた細菌の濃度は
、実施例３に記述されているような定形のバイオアッセ
イで経験的に設定しなければならない。効果的な殺虫剤
量は、導入された正確なδ−内毒素遺伝子断片、用いた
プラスミドベクター、形質転換された細菌株、保護され
るべき植物の種類および毒素組成物の最終的な処方によ
り異なる。
めに必要である遺伝的な形質転換をうけた細菌の濃度は
、実施例３に記述されているような定形のバイオアッセ
イで経験的に設定しなければならない。効果的な殺虫剤
量は、導入された正確なδ−内毒素遺伝子断片、用いた
プラスミドベクター、形質転換された細菌株、保護され
るべき植物の種類および毒素組成物の最終的な処方によ
り異なる。
接種組成物は、農業上の使用および畑への散布に適さな
ければならない。一般に９組成物の成分は非植物毒素的
、非静菌的、および非殺菌的でなければならない。植物
の葉への適用を行うときには該葉に損傷を与えるか、あ
るいは傷つけてはならない。適当な液体または固体のキ
ャリアに加えて、接種組成物は固着性および粘着性の物
質、乳化および湿気付与剤、および細菌細胞の増殖を強
めるかあるいは安定化させるための細菌用の栄養物ある
いは試薬を含有し得る。害虫をコントロールするための
接種組成物はまた、昆虫の摂食を刺激する試薬を含有し
得る。
ければならない。一般に９組成物の成分は非植物毒素的
、非静菌的、および非殺菌的でなければならない。植物
の葉への適用を行うときには該葉に損傷を与えるか、あ
るいは傷つけてはならない。適当な液体または固体のキ
ャリアに加えて、接種組成物は固着性および粘着性の物
質、乳化および湿気付与剤、および細菌細胞の増殖を強
めるかあるいは安定化させるための細菌用の栄養物ある
いは試薬を含有し得る。害虫をコントロールするための
接種組成物はまた、昆虫の摂食を刺激する試薬を含有し
得る。
特定のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの毒素（つ
まり、 ｖａｒ。
まり、 ｖａｒ。
ｂｅｒｌｉｎｅｒ １７１５からの毒素遺伝子により生
産されたＢｔ２タンパク）に感受性を有する鱗翅類昆虫
に対して自己防衛的なエンジニアリング植物の可能性が
示されてきた（Ｖａｅｃｋら、 （１９Ｂ？）、前述）
、 ｖａｒ。
産されたＢｔ２タンパク）に感受性を有する鱗翅類昆虫
に対して自己防衛的なエンジニアリング植物の可能性が
示されてきた（Ｖａｅｃｋら、 （１９Ｂ？）、前述）
、 ｖａｒ。
ｂｅｒｌｉｎｅｒ １７１５毒素に感受性をほとんど持
たない他の鱗翅類昆虫に対して充分に植物を保護するた
めには、高レベルの発現が望まれ、そしてこれは。
たない他の鱗翅類昆虫に対して充分に植物を保護するた
めには、高レベルの発現が望まれ、そしてこれは。
より強い植物特異的プロモータを含むキメラ毒素遺伝子
を用いて達成され得る。例えば、カリフラワー モザイ
ク ウィルスの３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌら、 （
１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３ ： ８１０−８
１２）は、植物内で。
を用いて達成され得る。例えば、カリフラワー モザイ
ク ウィルスの３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌら、 （
１９８５）Ｎａｔｕｒｅ、 ３１３ ： ８１０−８
１２）は、植物内で。
通常のＴ−ＤＮＡプロモータよりも１０〜５０倍高い発
現を示す。さらに、他の重要な昆虫標的、特に、甲虫類
害虫に付して高い特異的な活性を有するキメラ毒素遺伝
子構築物で植物を形質転換できる可能性がある。
現を示す。さらに、他の重要な昆虫標的、特に、甲虫類
害虫に付して高い特異的な活性を有するキメラ毒素遺伝
子構築物で植物を形質転換できる可能性がある。
生物学的な昆虫コントロール試薬の適用および農業的な
接種の方法を記載した総説が利用できる。
接種の方法を記載した総説が利用できる。
例えば次の文献を参照されたい： ＣｏｕｃｈおよびＩ
ｇｎｏｆｆｏ （１９８１Ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｅ５ｔｓａｎｄ Ｐｌａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ １９７０−１９８０ ８ｕｒｇｅｓ
”１８．３４章。
ｇｎｏｆｆｏ （１９８１Ｌ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｃ
ｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｐｅ５ｔｓａｎｄ Ｐｌａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ １９７０−１９８０ ８ｕｒｇｅｓ
”１８．３４章。
ｐｐ、 ６２１−６３４ ；ＣｏｒｋｅおよびＲ１５ｈ
ｂｅｔｈ、 同誌。
ｂｅｔｈ、 同誌。
３９章＋ ｐｐ＋ ７１７−７３２； Ｂｒｏｃｋｗｅ
ｌｌ （１９８０）、 Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｅｖａ
ｌｕａｔｔｎ Ｎ１ｔｒｏ ｅｎ Ｆｉｘａｔｉｏ
ｎ、Ｂｅｒｇｅｒｓｅｎ編、 ｐＩ）、４１７−４８８
； Ｂｕｒｔｏｎ（１９８２）、、Ｂｉｏｌｏ １ｃａ
ｌ Ｎ１ｔｒｏ ｅｎ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏ ｆｏｒ Ｔｒｏ ｔｅａｌ
Ａ ｒｉｃｕｌ−ｔｕｒｅ ＧｒａｈａｍおよびＨ
ａｒｒｉｓ ｋｍ、 ｐｐ、１０５−１１４；およびＲ
ｏｕｇｈｌｙ （１９８２）同誌、 ｐｐ、１１５−１
２７゜要約すれば１本発明はＢ、旦肛旦紅叩旦ｓ ｖ
ａｒｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからの毒素遺伝子を含む組
換え系で生産される甲虫類特異的な毒素である０本発明
は！Ｌ 封貝１１回ｙ佳辷ｖａｒ、シリ−１堕［０によ
り生産される毒素に類似している。現在までは、甲虫類
に対して活性であることが知られているβエ ■ｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ−の２種の単離物があるだけである。
ｌｌ （１９８０）、 Ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒ Ｅｖａ
ｌｕａｔｔｎ Ｎ１ｔｒｏ ｅｎ Ｆｉｘａｔｉｏ
ｎ、Ｂｅｒｇｅｒｓｅｎ編、 ｐＩ）、４１７−４８８
； Ｂｕｒｔｏｎ（１９８２）、、Ｂｉｏｌｏ １ｃａ
ｌ Ｎ１ｔｒｏ ｅｎ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏ ｆｏｒ Ｔｒｏ ｔｅａｌ
Ａ ｒｉｃｕｌ−ｔｕｒｅ ＧｒａｈａｍおよびＨ
ａｒｒｉｓ ｋｍ、 ｐｐ、１０５−１１４；およびＲ
ｏｕｇｈｌｙ （１９８２）同誌、 ｐｐ、１１５−１
２７゜要約すれば１本発明はＢ、旦肛旦紅叩旦ｓ ｖ
ａｒｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓからの毒素遺伝子を含む組
換え系で生産される甲虫類特異的な毒素である０本発明
は！Ｌ 封貝１１回ｙ佳辷ｖａｒ、シリ−１堕［０によ
り生産される毒素に類似している。現在までは、甲虫類
に対して活性であることが知られているβエ ■ｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ−の２種の単離物があるだけである。
それらは、 ｖａｒ、ｓａｎ 劇１ｖ−およびｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓである。従って、これら２
つの毒素（ネイティブ型および組換え型タンパクの両者
）の特性の比較が本発明の他との相違および独自性につ
いての基礎を与えるために、示される。
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓである。従って、これら２
つの毒素（ネイティブ型および組換え型タンパクの両者
）の特性の比較が本発明の他との相違および独自性につ
いての基礎を与えるために、示される。
（以下余白）
表１
ｂ４４Ｐｓｔ−ｍｅｔｂ
１）、１） ＫＩＪａ
ｖａｒ、ｓａｎ 彰遣胚−およびｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓの両者から単離したＢ、 ｔｌ阻０四１μ＋５ｉ
ｓ−毒素は、昆虫特異性、毒素の結晶形および結晶毒素
タンパクの大体の大きさにおいて類似している。ＢＬｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ株は９両者とも甲虫類に毒性
を示す６４〜６５ｋＤａのタンパク種を有するが、 ｖ
ａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓはさらに、毒素タンパク
である７３ｋＤａポリペプチド種を少量成分として有す
る。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｆｏｎｉｓがらの毒素遺伝
子を含む組替え系において、毒性のある６５ｋＤａおよ
び７５ｋｄａポリペプチドが生産される。
ｉｓの両者から単離したＢ、 ｔｌ阻０四１μ＋５ｉ
ｓ−毒素は、昆虫特異性、毒素の結晶形および結晶毒素
タンパクの大体の大きさにおいて類似している。ＢＬｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ株は９両者とも甲虫類に毒性
を示す６４〜６５ｋＤａのタンパク種を有するが、 ｖ
ａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓはさらに、毒素タンパク
である７３ｋＤａポリペプチド種を少量成分として有す
る。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｆｏｎｉｓがらの毒素遺伝
子を含む組替え系において、毒性のある６５ｋＤａおよ
び７５ｋｄａポリペプチドが生産される。
これらのタンパクは、Ｂ、ｔｈμｍ旺農ｙ吐ＬＶａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶から単離されたものと同じ
サイズである。これに対して、 ｖａｒ、 ｓａｎ
虹且虹からの毒素遺伝子を含む組換え系は、ＢＬ 田
肛ｎ麩ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ …■虹結晶か
ら単離された６４ｋＤａポリペプチドよりも大きい８３
ｋＤａの毒素を生産する。それはおそらく毒素の前駆体
型を表している。
サイズである。これに対して、 ｖａｒ、 ｓａｎ
虹且虹からの毒素遺伝子を含む組換え系は、ＢＬ 田
肛ｎ麩ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｓａｎ …■虹結晶か
ら単離された６４ｋＤａポリペプチドよりも大きい８３
ｋＤａの毒素を生産する。それはおそらく毒素の前駆体
型を表している。
（以下余白）
次の実施例は９本発明を例示する目的のために示され１
本発明を限定するものではない。
本発明を限定するものではない。
実施例は分子生物学、細菌および植物組織における組換
えＯＮへの操作にたずされる当業者には公知であり利用
し得る多くの技術を利用している。
えＯＮへの操作にたずされる当業者には公知であり利用
し得る多くの技術を利用している。
特に指示するものを除き、クローニングの標準的な技術
、 ＤＮＡの単離、増幅および精製、 ＤＮＡリガ
ーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素などを含む酵
素反応、および種々の分離技術は、当業者に公知であり
、一般に用いられている。標準的な技術の多くは次の文
献に記載されている： Ｍａｎｉａｔｉｓら。
、 ＤＮＡの単離、増幅および精製、 ＤＮＡリガ
ーゼ、 ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素などを含む酵
素反応、および種々の分離技術は、当業者に公知であり
、一般に用いられている。標準的な技術の多くは次の文
献に記載されている： Ｍａｎｉａｔｉｓら。
（１９８２）＋ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃ１ｏｎｉｎ
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒｋＨＷｅ＆ｉ、 （
１９７９） Ｍｅｔｈ、 ｉｎ均ｖＤ立し ６８；Ｗ
ｕら［、（１９８３）Ｍｅｔｈ、 影区ヒ見Ｌ１００
および１０１； ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏ１ｄａｖ
ｅ ｌｉ、 Ｍｅｔｈ。
、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅｗ ＹｏｒｋＨＷｅ＆ｉ、 （
１９７９） Ｍｅｔｈ、 ｉｎ均ｖＤ立し ６８；Ｗ
ｕら［、（１９８３）Ｍｅｔｈ、 影区ヒ見Ｌ１００
および１０１； ＧｒｏｓｓｍａｎおよびＭｏ１ｄａｖ
ｅ ｌｉ、 Ｍｅｔｈ。
ハ■懸シロ５； Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｌ （１９７２）ａｘ
ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ。
ｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ 、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ。
Ｎｅｗ ＹｏｒｋＨＯｌｄおよびＰｒｉｍｒｏｓｅ（１
９８１） 紅旦虹鮭肋ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉ ｕｌ
ａｔｉｏｎ ＋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｃａ１ｉ
ｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ、 ＢｅｒｋｅｌｅｙＨ５ｃｈ
ｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ （１９８２）Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ； Ｇｌｏｖｅｒ１＋ （
１９８５）貼人工勅ｌ罰Ｖｏ１． １ ａｎｄ １１．
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ＋０ｘｆｏｒｄ、 ＵＫ； Ｈ
ａｍｅｓおよび旧ｇｇｉｎｓ ５． （１９８５）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ＩＩ ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ＋ ０ｘｆｏｒｄ。
９８１） 紅旦虹鮭肋ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉ ｕｌ
ａｔｉｏｎ ＋ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｃａ１ｉ
ｆｏｒｎｉａＰｒｅｓｓ、 ＢｅｒｋｅｌｅｙＨ５ｃｈ
ｌｅｉｆおよびＷｅｎｓｉｎｋ （１９８２）Ｐｒａｃ
ｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ； Ｇｌｏｖｅｒ１＋ （
１９８５）貼人工勅ｌ罰Ｖｏ１． １ ａｎｄ １１．
ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ＋０ｘｆｏｒｄ、 ＵＫ； Ｈ
ａｍｅｓおよび旧ｇｇｉｎｓ ５． （１９８５）Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ ＩＩ ｂｒｉｄｉｚａｔｉｏ
ｎ、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ＋ ０ｘｆｏｒｄ。
ＩＪＫ； Ｓｅｔｌｏｗ およびＨｏ１ｌａｅｎｄｅ
ｒ （１９７９） Ｇｅｎｅｔｉｃεｎ １ｎｅｅ
ｒｉｎ ： Ｐｒ１ｎｃｉ Ｉｅｓ ａｎｄ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ 、 Ｖｏｌｓ。
ｒ （１９７９） Ｇｅｎｅｔｉｃεｎ １ｎｅｅ
ｒｉｎ ： Ｐｒ１ｎｃｉ Ｉｅｓ ａｎｄ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ 、 Ｖｏｌｓ。
１−４＋ Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、 Ｎｅｗ、 Ｙ
ｏｒｋ 、これらの文献の内容は、ここで述べられてい
る。略語および術語はこの分野では標準的であり、この
中で引用されているような専門誌で一般に用いられてい
ると考えられる。
ｏｒｋ 、これらの文献の内容は、ここで述べられてい
る。略語および術語はこの分野では標準的であり、この
中で引用されているような専門誌で一般に用いられてい
ると考えられる。
次の株はＮｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ １８１８ Ｎｏ
ｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ５ｔｒｅｅｔ、 Ｐｅ
ｏｒｉａ。
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ＋ １８１８ Ｎｏ
ｒｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ５ｔｒｅｅｔ、 Ｐｅ
ｏｒｉａ。
１１１ｉｎｏｉｓ： に寄託されている。
Ｐｓｔ−Ｍｅｔｂ
！ＭＬ上： Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓＢ、 ｔｈｕ
ｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ は。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓＢ、 ｔｈｕ
ｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ は。
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ、
、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 ＦＲＧにより提供され、Ｌ
月肌ロ四ｌシ咀Ｉ−の他の株はＤｒ。
、 Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 ＦＲＧにより提供され、Ｌ
月肌ロ四ｌシ咀Ｉ−の他の株はＤｒ。
Ｉｌ、 Ｔ、 Ｄｕｌｍａｇｅ、 ＵＳＤＡ＋ Ｂｒｏ
ｗｎｓｖｉｌｌｅ、 Ｔｅｘａｓにより提供された。Ｂ
、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉ。
ｗｎｓｖｉｌｌｅ、 Ｔｅｘａｓにより提供された。Ｂ
、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉ。
旦りからの全ＤＮＡをＫｒｏｎｓ ｔａｄら（１９８３
） （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ。
） （Ｊ、 Ｂａｃｔｅｒｔｏｌ。
１５４ ：４１９−４２８）に記述されている方法に従
って単離し、 Ｂａｍ）ＩＩで分解した。旦エ ηリ
エ抽１ｂ」互１ｓ−ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
全ＤＮＡのＢａｍ旧断片をＢａｍ旧で分解した脱リン酸
化ｐＵｃ１２（Ｃ，Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎら（
１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）と混合
し、 Ｔ−４ＤＮＡリガーゼで１４°Ｃにて１８時間保
持し、連結させた。連結したＤＮＡ混合物をコンピテン
トＥ、 ｃｏ旦ＪＭ８３細胞に導入した。形質転換混
合物を５０ｄｇ７ｍｌのアンピシリンおよび３０ｄｇ７
ｍｌの色原体基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドイル−β−Ｄ−ガラクトシドを含むし一寒天平板上に
プレートした。
って単離し、 Ｂａｍ）ＩＩで分解した。旦エ ηリ
エ抽１ｂ」互１ｓ−ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
全ＤＮＡのＢａｍ旧断片をＢａｍ旧で分解した脱リン酸
化ｐＵｃ１２（Ｃ，Ｙａｎｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎら（
１９８５） Ｇｅｎｅ ３３：１０３−１１９）と混合
し、 Ｔ−４ＤＮＡリガーゼで１４°Ｃにて１８時間保
持し、連結させた。連結したＤＮＡ混合物をコンピテン
トＥ、 ｃｏ旦ＪＭ８３細胞に導入した。形質転換混
合物を５０ｄｇ７ｍｌのアンピシリンおよび３０ｄｇ７
ｍｌの色原体基質、５−ブロモ−４−クロロ−３−イン
ドイル−β−Ｄ−ガラクトシドを含むし一寒天平板上に
プレートした。
組換え体をβ−ガラクトシダーゼ活性の欠失により同定
した。６００を超える組換え体クローン（推定）が得ら
れた。組換え体クローンのレプリカをニトロセルロース
膜フィルター上に行った。
した。６００を超える組換え体クローン（推定）が得ら
れた。組換え体クローンのレプリカをニトロセルロース
膜フィルター上に行った。
組換え体クローン（推定）の溶解産物を含むニトロセル
ロースフィルターを、化学的に合成した２７量体のオリ
ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。ブロー
フ゛を８周製するために、Ｂ、ｔｈｕ−亘皿江旦ｎｖａ
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｆｏｎｉｓのδ−内毒素タンパクに
対するＮ−末端アミノ酸配列を得た。まず。
ロースフィルターを、化学的に合成した２７量体のオリ
ゴヌクレオチドプローブでスクリーニングした。ブロー
フ゛を８周製するために、Ｂ、ｔｈｕ−亘皿江旦ｎｖａ
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｆｏｎｉｓのδ−内毒素タンパクに
対するＮ−末端アミノ酸配列を得た。まず。
結晶封入体を、’ Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子／結晶粗混
合物から、直線的な（５５〜８８％）ショ糖密度勾配に
よりその混合物を２度通すことにより、精製した。尿素
変性した結晶タンパク試料（４，０ｄｇ）をトリプシン
で処理し、そしてトリプシン断片をＶｙｄａｃ Ｃ１逆
相カラムを用いてＶａｒｉａｎ ５０００１１ＰＬｃで
分離した。分離は、溶媒Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸
、 ＴＦＡ、水中）１００％から溶媒Ｂ （０，１％Ｔ
Ｆ＾。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子／結晶粗混
合物から、直線的な（５５〜８８％）ショ糖密度勾配に
よりその混合物を２度通すことにより、精製した。尿素
変性した結晶タンパク試料（４，０ｄｇ）をトリプシン
で処理し、そしてトリプシン断片をＶｙｄａｃ Ｃ１逆
相カラムを用いてＶａｒｉａｎ ５０００１１ＰＬｃで
分離した。分離は、溶媒Ａ（０，１％トリフルオロ酢酸
、 ＴＦＡ、水中）１００％から溶媒Ｂ （０，１％Ｔ
Ｆ＾。
アセトニトリル中）へのリニアグラジエンで行なった。
明瞭なピークから得た精製断片をマイクロシーケンサ−
にかけ、Ｎ末端タンパク配列決定を行なった。次に、ト
リプシン断片の９つのＮ末端アミノ酸の配列に対応する
２７量体のオリゴヌクレオチド（ＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴ
ＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＡＴＧ ）をオリゴヌク
レオチド合成により調製した。ＢＬ 月■わ１１ニーｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ株（Ａｄａ
ｎｇら、 （１９８５） Ｇｅｎｅ３６ ： ２８９
−３００）およびｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ
株（Ｗａａｌｗｉｊｋら、 （１９８５） Ｎｕｃｌ
、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １３：８２０７−８２１７
） の結晶タンパクにおける好ましいコドン使用を、
オリゴヌクレオチド合成のために、共通のコドンの偏り
を生ずることにおける指針として用いた。
にかけ、Ｎ末端タンパク配列決定を行なった。次に、ト
リプシン断片の９つのＮ末端アミノ酸の配列に対応する
２７量体のオリゴヌクレオチド（ＴＡＴＡＡＡＣＡＡＴ
ＡＴＣＣＡＴＴＴＧＴＴＡＴＧＡＴＧ ）をオリゴヌク
レオチド合成により調製した。ＢＬ 月■わ１１ニーｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ株（Ａｄａ
ｎｇら、 （１９８５） Ｇｅｎｅ３６ ： ２８９
−３００）およびｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ
株（Ｗａａｌｗｉｊｋら、 （１９８５） Ｎｕｃｌ
、 Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、 １３：８２０７−８２１７
） の結晶タンパクにおける好ましいコドン使用を、
オリゴヌクレオチド合成のために、共通のコドンの偏り
を生ずることにおける指針として用いた。
［ｒ −”Ｐ ］ ＡＴＰで末端標識した２７量体のオ
リゴヌクレオチドを、 Ｒ，Ｍ、 Ｔｏｒｃｚｙｎｓｋ
ｉ ら、 （１９８４）Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ８１：６４５１−６４５５の方法
に従って、δ−内毒素遺伝子の存在をｉｎ ５ｉｔｕ
コロニーハイブリダイイーシコン法により組換え体
クローン（推定）をスクリーニングするために用いた。
リゴヌクレオチドを、 Ｒ，Ｍ、 Ｔｏｒｃｚｙｎｓｋ
ｉ ら、 （１９８４）Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃ
ａｄ、 Ｓｃｉ、 ８１：６４５１−６４５５の方法
に従って、δ−内毒素遺伝子の存在をｉｎ ５ｉｔｕ
コロニーハイブリダイイーシコン法により組換え体
クローン（推定）をスクリーニングするために用いた。
ハイブリダイゼーション（９０ｍＭ ｌ−リス−ＨＣｌ
。
。
ｐＨ８，帆 ５×デンハルト溶液、 ９００ｍＭ Ｎ
ａＣ１，６ｍＭＮａｚＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＯＳおよ
び２５０ ｐｇ／ｍｌ加熱変性ｔＲＮＡ ）を、 １０
ｂｃｐｍ／１０成／フィルターを用いて１８時間室温で
行った。フィルターを、３７°Ｃにて５分間、最終的に
洗浄する前に、９０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、 ｐＨ８，０
，９００ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ ＮａｚＥＤＴＡおよ
び０．５％ＳＯＳを含む溶液で、室温にて繰り返し洗浄
した。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ−レ並■Ｌｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子に特異的な３２ｐ−標
識のオリゴヌクレオチドをプローブとして調べたところ
、１４のコロニーが特異的なハイブリダイゼーションを
示していることがわかった。
ａＣ１，６ｍＭＮａｚＥＤＴＡ、 ０．１％ＳＯＳおよ
び２５０ ｐｇ／ｍｌ加熱変性ｔＲＮＡ ）を、 １０
ｂｃｐｍ／１０成／フィルターを用いて１８時間室温で
行った。フィルターを、３７°Ｃにて５分間、最終的に
洗浄する前に、９０ｍＭ）リス−ＨＣｌ、 ｐＨ８，０
，９００ｍＭ ＮａＣ１，６ｍＭ ＮａｚＥＤＴＡおよ
び０．５％ＳＯＳを含む溶液で、室温にて繰り返し洗浄
した。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ−レ並■Ｌｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子に特異的な３２ｐ−標
識のオリゴヌクレオチドをプローブとして調べたところ
、１４のコロニーが特異的なハイブリダイゼーションを
示していることがわかった。
実施例３で記載するバイオアッセイを、これらの１４の
株、およびＬ 吐 Ｎ５ＢＰ５４４ １株の抽出物で行
なった。そして、それらは、コロラドボテドビートルの
幼虫に対して毒性を示した。
株、およびＬ 吐 Ｎ５ＢＰ５４４ １株の抽出物で行
なった。そして、それらは、コロラドボテドビートルの
幼虫に対して毒性を示した。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子を含む
クローン化したＤＮＡ断片における種々の制限酵素部位
の相対的な位置を、単数および複数の分解処理により決
定した。ｐｔｌｃ１２ベクターに挿入した５、９ｋｂ
Ｂａｍ旧断片を含む組換え体プラスミド、 ｐＮＳＢＰ
５４４は、第１図Ａに示すように、複数の制限エンドヌ
クレアーゼ部位を有する。
クローン化したＤＮＡ断片における種々の制限酵素部位
の相対的な位置を、単数および複数の分解処理により決
定した。ｐｔｌｃ１２ベクターに挿入した５、９ｋｂ
Ｂａｍ旧断片を含む組換え体プラスミド、 ｐＮＳＢＰ
５４４は、第１図Ａに示すように、複数の制限エンドヌ
クレアーゼ部位を有する。
クローン化されたＤＮＡ部分（つまり、 ｐＮＳＢＰ５
４４）内の結晶毒素遺伝子を位置決定するために、 ５
．９ｋｂＢａｍ旧挿入部分を、確立された方法（Ｌ、
Ｍａｒｓｈら。
４４）内の結晶毒素遺伝子を位置決定するために、 ５
．９ｋｂＢａｍ旧挿入部分を、確立された方法（Ｌ、
Ｍａｒｓｈら。
（１９８４） Ｇｅｎｅ ３２：４８１−４８５）を用
いて、ベクターｐｌｃ２０１（（Ｊ、 Ｌａｗｒｅｎｃ
ｅ−Ｍａｒｓｈ ら、 （１９８４） Ｇｅｎｅ
３２：４８１４８５）に移した。プラスミドベクターｐ
Ｉｃ２０Ｈを用い。
いて、ベクターｐｌｃ２０１（（Ｊ、 Ｌａｗｒｅｎｃ
ｅ−Ｍａｒｓｈ ら、 （１９８４） Ｇｅｎｅ
３２：４８１４８５）に移した。プラスミドベクターｐ
Ｉｃ２０Ｈを用い。
旦よ ｃｏｌｉ １８１０１株にサブクローンを行った
。サブクローンを、特定の断片の欠失により構築した。
。サブクローンを、特定の断片の欠失により構築した。
サブクローンを、結晶タンパクのコード領域を部分的に
決定するために用いた。Ｌｃｏｌｉ ５４４ Ｈｉｎｄ
■サブクローン（第１図Ｂで部分的な制限地図とシテ示
すトル） ハ、 ｐＮＳＢＰ５４４（７）３．０ｋｂ
Ｈｉｎｄ ＩＩ［断片をｐＩｃ２０Ｈにクローニング
することにより構築した。
決定するために用いた。Ｌｃｏｌｉ ５４４ Ｈｉｎｄ
■サブクローン（第１図Ｂで部分的な制限地図とシテ示
すトル） ハ、 ｐＮＳＢＰ５４４（７）３．０ｋｂ
Ｈｉｎｄ ＩＩ［断片をｐＩｃ２０Ｈにクローニング
することにより構築した。
サブクローンｐ５４４ Ｐｓｔ−Ｍｅｔ５を、Ｂ、ｄｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶タ
ンパク遺伝子の欠失誘導体として構築した。ｐＮｓＢＰ
５４４の２．９ｋｂ Ｂａｍ旧−Ｐｓｔ Ｉ断片を、
結晶タンパクのＮ末端４６アミノ酸残基を欠失させて除
去した。次に、 ｐ５４４ＰｓｔｓＣを力虫ＩおよびＰ
ｃｔｌで処理し、そして、第１図りに示されるリンカ一
部分と連結させ＋ Ｐｓｔ１部位の前にあるＢ、 ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ配列のＭｅｔを用いる必要がある。第２図には
Ｂ６ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓの結晶タンパク遺伝子由来の結晶タンパ
クのアミノ酸配列を示す。
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶タ
ンパク遺伝子の欠失誘導体として構築した。ｐＮｓＢＰ
５４４の２．９ｋｂ Ｂａｍ旧−Ｐｓｔ Ｉ断片を、
結晶タンパクのＮ末端４６アミノ酸残基を欠失させて除
去した。次に、 ｐ５４４ＰｓｔｓＣを力虫ＩおよびＰ
ｃｔｌで処理し、そして、第１図りに示されるリンカ一
部分と連結させ＋ Ｐｓｔ１部位の前にあるＢ、 ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓ配列のＭｅｔを用いる必要がある。第２図には
Ｂ６ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓの結晶タンパク遺伝子由来の結晶タンパ
クのアミノ酸配列を示す。
最初の４６アミノ酸をコードしている配列がＮ末端から
欠失したときには、翻訳開始ＡＴＧコドンもまた。失火
した。第１図Ｃおよび第１図りに示されるように、力１
■部位の前にある月エ 用肛旦麩肪ｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏ−ｎｉｓ配列内のＭｅｔ残基をコード
するコドンを修復すること、および細菌のリポソーム結
合部位を与えるために、リンカ−を作成した。陽性のＥ
、 ｃｏｌｉ形質転換体を、末端標識されたリンカ−分
子で同定した。
欠失したときには、翻訳開始ＡＴＧコドンもまた。失火
した。第１図Ｃおよび第１図りに示されるように、力１
■部位の前にある月エ 用肛旦麩肪ｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏ−ｎｉｓ配列内のＭｅｔ残基をコード
するコドンを修復すること、および細菌のリポソーム結
合部位を与えるために、リンカ−を作成した。陽性のＥ
、 ｃｏｌｉ形質転換体を、末端標識されたリンカ−分
子で同定した。
亥ｊｌ壓１： Ｅ、 ｃｏｔ＋におけるｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓδ−内毒素遺伝子の発現 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのＤＮＡ断片で形質転換され、
そしてｉｎ ５ｉｔｕ ハイブリダイゼーションア
ッセイで陽性であると分析されたＥ、 ｃｏｌｔ細胞
を、３７°Ｃで１８時間、１００ｍｊ！のＬ−ブロス培
地で個々に増殖させた。これらの組換え体により生産さ
れたタンパクをδ−内毒素タンパク。
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓδ−内毒素遺伝子の発現 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓからのＤＮＡ断片で形質転換され、
そしてｉｎ ５ｉｔｕ ハイブリダイゼーションア
ッセイで陽性であると分析されたＥ、 ｃｏｌｔ細胞
を、３７°Ｃで１８時間、１００ｍｊ！のＬ−ブロス培
地で個々に増殖させた。これらの組換え体により生産さ
れたタンパクをδ−内毒素タンパク。
δ−内毒素遺伝子の翻訳産物の存在についてスクリーニ
ングした。挿入された８、 ７μ＋５ｉｓ−ｖａｒ。
ングした。挿入された８、 ７μ＋５ｉｓ−ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ 遺伝子から合成されるδ−
内毒素タンパクの存在を分析するために、２つの基準を
設定した。翻訳タンパク産物は、（１）昆虫の幼虫に対
して毒性を示さねばならず；（２）結晶毒素特異的抗体
と反応しなければならない。
内毒素タンパクの存在を分析するために、２つの基準を
設定した。翻訳タンパク産物は、（１）昆虫の幼虫に対
して毒性を示さねばならず；（２）結晶毒素特異的抗体
と反応しなければならない。
オリゴマープローブに対して特異的なハイブリダイゼー
ションを示す組換え体クローンの生物学的活性は、これ
らのクローンから得た全タンパク質抽出物でコロラド
ポテト ピートル島並旦ｎｏ−ｔａｒｓａ ｄｅｃｅ
ｍｌｉｎｅａｔａ）の新生幼虫を処理することにより、
テストされる。各々のクローンからの全タンパク約５■
を個々のジャガイモの葉片に塗布し、幼虫に食べさせる
。各々のクローンについて１試料当たり５匹の幼虫を用
いて、２回ずつテストを行った。緩衝液だけで処理した
葉およびｐＵｃ１２プラスミドだけを含むＥ、 ｃｏ
ｌｉ株からの全タンパク５ ｍｇで処理した葉を標準と
して用いた。葉に結合したタンパクの量を１葉を水です
すぎ、洗浄水のタンパク成分を評価することにより測定
した。
ションを示す組換え体クローンの生物学的活性は、これ
らのクローンから得た全タンパク質抽出物でコロラド
ポテト ピートル島並旦ｎｏ−ｔａｒｓａ ｄｅｃｅ
ｍｌｉｎｅａｔａ）の新生幼虫を処理することにより、
テストされる。各々のクローンからの全タンパク約５■
を個々のジャガイモの葉片に塗布し、幼虫に食べさせる
。各々のクローンについて１試料当たり５匹の幼虫を用
いて、２回ずつテストを行った。緩衝液だけで処理した
葉およびｐＵｃ１２プラスミドだけを含むＥ、 ｃｏ
ｌｉ株からの全タンパク５ ｍｇで処理した葉を標準と
して用いた。葉に結合したタンパクの量を１葉を水です
すぎ、洗浄水のタンパク成分を評価することにより測定
した。
昆虫の死亡率を２日後に記録した。
さらに、オリゴマープローブに対して特異的なハイブリ
ダイゼーションを示す組換え体クローンを、コーン ル
ートワームに対する活性によりテストした。畑のトウモ
ロコシを漂白剤および石けんで洗浄することにより処理
した。穀粒は、実験に使用する前に発芽させた。Ｂ、
ｔｈｕｒｉ四ｌμ＋５ｉｓ−ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓタンパクを含む抽出物を２発芽したトウモロ
コシの穀粒と共に、インキュベートし、適当なコントロ
ールについても同様に行った。
ダイゼーションを示す組換え体クローンを、コーン ル
ートワームに対する活性によりテストした。畑のトウモ
ロコシを漂白剤および石けんで洗浄することにより処理
した。穀粒は、実験に使用する前に発芽させた。Ｂ、
ｔｈｕｒｉ四ｌμ＋５ｉｓ−ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓタンパクを含む抽出物を２発芽したトウモロ
コシの穀粒と共に、インキュベートし、適当なコントロ
ールについても同様に行った。
湿らせたフィルター紙を敷いた７ｃｍのベトリ皿の個々
に、１０コの処理した穀粒および１０匹の新生幼虫を加
えた。
に、１０コの処理した穀粒および１０匹の新生幼虫を加
えた。
内毒素タンパクの存在をイムノプロットアッセイでもテ
ストした。Ｅ、 ｃｏｌｉクローンを１００戚のし−
ブロスで一晩増殖させた。ｉｎ ５ｉｔｕハイブリダ
イゼーシヨンアツセイで陽性であることが示された組換
え体クローンからの全タンパク質抽出物を、 Ｈｅｒｒ
ｎｓｔａｄｔら＜１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ４：３０５−３０８に記載されているように調
製した。各々の試料からの全タンパク約１００ ｕｇを
、０．１χ（ｗ／ｖ） ＳＯＳの存在下における１０χ
（ｗ／ｖ）ポリアクリルアシドゲルで電気泳動した。電
気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜フィルター
に移し、そして膜に結合したタンパクのウェスタンプロ
ット分析を、Ｌ旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの６５ｋＤａ結晶タンパクに特
異的なマウス抗血清でフィルターをインキュベートする
ことにより行った。結晶タンパク抗血清に特異的に結合
することを示す膜結合タンパクを、２番目のウサギ抗マ
ウス抗血清で処理することにより検出した。特異的な結
合を １２５Ｉ−タンパク質＾の使用により検出した。
ストした。Ｅ、 ｃｏｌｉクローンを１００戚のし−
ブロスで一晩増殖させた。ｉｎ ５ｉｔｕハイブリダ
イゼーシヨンアツセイで陽性であることが示された組換
え体クローンからの全タンパク質抽出物を、 Ｈｅｒｒ
ｎｓｔａｄｔら＜１９８６） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ４：３０５−３０８に記載されているように調
製した。各々の試料からの全タンパク約１００ ｕｇを
、０．１χ（ｗ／ｖ） ＳＯＳの存在下における１０χ
（ｗ／ｖ）ポリアクリルアシドゲルで電気泳動した。電
気泳動後、タンパク質をニトロセルロース膜フィルター
に移し、そして膜に結合したタンパクのウェスタンプロ
ット分析を、Ｌ旦ｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの６５ｋＤａ結晶タンパクに特
異的なマウス抗血清でフィルターをインキュベートする
ことにより行った。結晶タンパク抗血清に特異的に結合
することを示す膜結合タンパクを、２番目のウサギ抗マ
ウス抗血清で処理することにより検出した。特異的な結
合を １２５Ｉ−タンパク質＾の使用により検出した。
２７量体オリゴヌクレオチドプローブで調べた時に、特
異的なハイブリダイゼーションを示すことが見い出され
た１４の組換え体クローンのうち、１つの組換え体クロ
ーン（ｐＮＳＢＰ５４４）のみが、コロラド ポテト
ビートルの幼虫に対し毒性を示した。
異的なハイブリダイゼーションを示すことが見い出され
た１４の組換え体クローンのうち、１つの組換え体クロ
ーン（ｐＮＳＢＰ５４４）のみが、コロラド ポテト
ビートルの幼虫に対し毒性を示した。
（表２下に示す）。５０χ致死を引き起こすための単離
した結晶タンパクの特異的な毒性は、約０．１８μｇ／
Ｃ１１！であることがわかった。同様の生物活性値ヲ、
５．９Ｋｂ Ｂａｍ 旧断片または旧ｎｄｌｉサブ
クローンを用いた組換え体発現産物についても得た。
した結晶タンパクの特異的な毒性は、約０．１８μｇ／
Ｃ１１！であることがわかった。同様の生物活性値ヲ、
５．９Ｋｂ Ｂａｍ 旧断片または旧ｎｄｌｉサブ
クローンを用いた組換え体発現産物についても得た。
（以下余白）
表２
緩衝液
Ｅ、 ｃｏｌｔ ｐｌｃ２０Ｈ
全タンパク１ 殺虫性タンパクゝ
３．６ ０
死亡率０
Ｅ、 ｃｏｌｉ ｐＮｓＢＰ５４４ ３６
１８００８１葉は推定３６μｇタンパク／
ｃ＋ｆｌを含有する３■タンパク／戚で処理した。
１８００８１葉は推定３６μｇタンパク／
ｃ＋ｆｌを含有する３■タンパク／戚で処理した。
ｂ、殺虫性タンパクＣＩＰ）の量はＥＬＩＳＡ分析法に
より算出した。
より算出した。
Ｃ６死亡率は、 Ｌ、 ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａの
幼虫に適用して２日後に評価した。これらの結果は、１
回の試行あたり最少でも１０匹の幼虫を用いた。少なく
とも２回の試行の平均データである。
幼虫に適用して２日後に評価した。これらの結果は、１
回の試行あたり最少でも１０匹の幼虫を用いた。少なく
とも２回の試行の平均データである。
ｄ、ｙエ 匹旦ｐｌｃ２０Ｈ＋ＩＰは、Ｌ 延粗抽出物
に可溶化したＩＰを添加することにより得られた。
に可溶化したＩＰを添加することにより得られた。
クローン化されたＢ、 劫ｙセ１国吋ｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓの遺伝子、および月エ
旦■力１１吐垣νａｒ。
ｔｅｎｅ−ｂｒｉｏｎｉｓの遺伝子、および月エ
旦■力１１吐垣νａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子／結晶混合物から抽出さ
れた結晶性毒素も、以下の表３に例示されているような
。
れた結晶性毒素も、以下の表３に例示されているような
。
ウェスタンコーンルートウオーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃ
ｏｒｎｒｏｏｔｗｏｒｍ）の死亡率をもたらすのに効果
的であった。
ｏｒｎｒｏｏｔｗｏｒｍ）の死亡率をもたらすのに効果
的であった。
（以下余白）
表３
ウェスタン コーン トトクオーム に対する殺虫性タ
ンパクの効果（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉＬ１１
Ｌ旦り旦 ヱ１Ｌ且１工旦工旦 ）処 理
生存数 死亡数 回収率組換λＢｔｔりトンＣ＃らの
抽出物二 Ｂａｍ１ｌｌ断片を用いて 用ｊＢｄｍ断片を用いて 水による対照 緩衝液による対照 ベクターによる対照 ２．０ ６．３ Ｂ３．３０．３ ７
，３ ７６．７ ９．３ ０．０ ９３．３ ７．７ ０．３ ８０．０ ７．０ ０．７ ７６．７ ａ、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓｂ、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
の胞子および結晶からの粗抽出物を９発芽しているトウ
モロコシ粒に散布した。この抽出物におけるタンパク濃
度は測定しなかった。−晩穏やかに振盪した後、 １０
匹の新生のウェスタンコーンルートウオームの幼虫を、
５粒ずつ入っている各ペトリ皿に入れた。３回の反復試
験と１回の水による対照試験を行った。６日後、これら
の幼虫を回収した。
ンパクの効果（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉＬ１１
Ｌ旦り旦 ヱ１Ｌ且１工旦工旦 ）処 理
生存数 死亡数 回収率組換λＢｔｔりトンＣ＃らの
抽出物二 Ｂａｍ１ｌｌ断片を用いて 用ｊＢｄｍ断片を用いて 水による対照 緩衝液による対照 ベクターによる対照 ２．０ ６．３ Ｂ３．３０．３ ７
，３ ７６．７ ９．３ ０．０ ９３．３ ７．７ ０．３ ８０．０ ７．０ ０．７ ７６．７ ａ、Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓｂ、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
の胞子および結晶からの粗抽出物を９発芽しているトウ
モロコシ粒に散布した。この抽出物におけるタンパク濃
度は測定しなかった。−晩穏やかに振盪した後、 １０
匹の新生のウェスタンコーンルートウオームの幼虫を、
５粒ずつ入っている各ペトリ皿に入れた。３回の反復試
験と１回の水による対照試験を行った。６日後、これら
の幼虫を回収した。
ｃ、Ｅ、 匹旦／Ｂｔｔクローンからの抽出物、Ｌｃ
ｏｌｉ／ベクターからの抽出物、緩衝液、および水によ
る対照を２発芽しているトウモロコシ粒に散布し、そし
て３０分分間中かに振盪しながらインキュベートした。
ｏｌｉ／ベクターからの抽出物、緩衝液、および水によ
る対照を２発芽しているトウモロコシ粒に散布し、そし
て３０分分間中かに振盪しながらインキュベートした。
湿らせた濾紙をひいた７ｃｍの各ペトリ皿に、１０匹の
新生幼虫を入れた。結果は３回の反復試験に対する平均
である。
新生幼虫を入れた。結果は３回の反復試験に対する平均
である。
表３は、抽出および組換え操作によって調製された。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素が、ウェスタンコーンルートウ
オームを死亡させることを示している。同様の生物学的
検定において、サザンコーンルートウォーム（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｃｏｒｎｒｏｏ ｔｗｏｒｍ）は、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉ血遺伝子によって発現される毒素、またはＢ、 ｔ
ｈｕ−＄ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子／
結晶混合物からのタンパク抽出物に対して、より感受性
が低いことが見い出された。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素が、ウェスタンコーンルートウ
オームを死亡させることを示している。同様の生物学的
検定において、サザンコーンルートウォーム（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ ｃｏｒｎｒｏｏ ｔｗｏｒｍ）は、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉ血遺伝子によって発現される毒素、またはＢ、 ｔ
ｈｕ−＄ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子／
結晶混合物からのタンパク抽出物に対して、より感受性
が低いことが見い出された。
２７−ｍａｒのプローブとハイブリダイズする１４個の
組換え体クローンからの全可溶性タンパクの免疫沈降分
析により、生物学的検定の結果が確証された。また、こ
の免疫沈降分析により、Ｅ、ｃｏ旦Ｎ５ＢＰ５４４だけ
が、 ６５ｋＤａの結晶性タンパク抗血清に特異的に結
合するタンパクを生産することが示された。（第３図Ａ
に例示されている）。さらに。
組換え体クローンからの全可溶性タンパクの免疫沈降分
析により、生物学的検定の結果が確証された。また、こ
の免疫沈降分析により、Ｅ、ｃｏ旦Ｎ５ＢＰ５４４だけ
が、 ６５ｋＤａの結晶性タンパク抗血清に特異的に結
合するタンパクを生産することが示された。（第３図Ａ
に例示されている）。さらに。
免疫特異的結合は、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓ
ｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎ−ｅｂｒｉｏｎｉｓからのδ−
内毒素遺伝子を有する３、０ｋｂのｌ１ｉｎｄｎＩ断片
を含むＥ、 ｃｏ旦５４４Ｈｉｎｄ ｍのサブクロー
ンを用いて得られた。
ｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎ−ｅｂｒｉｏｎｉｓからのδ−
内毒素遺伝子を有する３、０ｋｂのｌ１ｉｎｄｎＩ断片
を含むＥ、 ｃｏ旦５４４Ｈｉｎｄ ｍのサブクロー
ンを用いて得られた。
旦、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓの精製された結晶性封入体の免疫沈降
分析により１分子量６５ｋＤａの多量の結晶性抗原の存
在が示された（第３図の第２レーン）、より高濃度の結
晶性タンパク試料を電気泳動に供すると９分子量７３ｋ
Ｄａおよび５６ｋＤａの少量の付加的なペプチド成分が
現れた（第３図の第ル−ン）。他方、 ｖａｒ、 Ｂ
、 ハ虹社■圏服圏の胞子形成細胞（第■期〜第■期
）では２分子量７３ｋＤａの多量の結晶性抗原および分
子量６５ｋＤａの少量成分の生産が見られた（第３図の
第３レーン）。Ｌ 延 Ｎ５ＢＰ５４４の全可溶性タン
パクの分析により、このクローンが６５ｋＤａおよび７
３ｋＤａの両方の結晶性抗原を生産することが示された
（第３図の第５レーン）。両ペプチドは。
ｅｂｒｉｏｎｉｓの精製された結晶性封入体の免疫沈降
分析により１分子量６５ｋＤａの多量の結晶性抗原の存
在が示された（第３図の第２レーン）、より高濃度の結
晶性タンパク試料を電気泳動に供すると９分子量７３ｋ
Ｄａおよび５６ｋＤａの少量の付加的なペプチド成分が
現れた（第３図の第ル−ン）。他方、 ｖａｒ、 Ｂ
、 ハ虹社■圏服圏の胞子形成細胞（第■期〜第■期
）では２分子量７３ｋＤａの多量の結晶性抗原および分
子量６５ｋＤａの少量成分の生産が見られた（第３図の
第３レーン）。Ｌ 延 Ｎ５ＢＰ５４４の全可溶性タン
パクの分析により、このクローンが６５ｋＤａおよび７
３ｋＤａの両方の結晶性抗原を生産することが示された
（第３図の第５レーン）。両ペプチドは。
ベクタープラスミドの１ａｃＺ遺伝子に関する５、９ｋ
ｂのルυ旧挿入断片の方向に関係なく存在するが。
ｂのルυ旧挿入断片の方向に関係なく存在するが。
両抗原ペプチドの濃度は、 Ｅ、 ｃｏｌｔ ５４４
Ｂａｍ（−）ＳＣ抽出物では、大いに（約１０倍）減少
した（すなわち、挿入断片の方向は、ベクターの１ａｃ
Ｚプロモータと反対方向であった；第３図の第６レーン
）。
Ｂａｍ（−）ＳＣ抽出物では、大いに（約１０倍）減少
した（すなわち、挿入断片の方向は、ベクターの１ａｃ
Ｚプロモータと反対方向であった；第３図の第６レーン
）。
Ｅ、 ｃｏ旦Ｎ５ＢＰ５４４における結晶性抗原の濃
度は約５％であり、 Ｂａｍ（−）サブクローンにおけ
る結晶性抗原の濃度は、全タンパクの約０．５％である
と算出された。さらに、５”末端における５８８個のヌ
クレオチドおよび３゛末端における４８０個のヌクレオ
チドによって側面を固められた結晶性タンパク遺伝子を
含むＥ、 ｃｏｌｔ ５４４ＨｉｎｄＳＣサブクロー
ンは。
度は約５％であり、 Ｂａｍ（−）サブクローンにおけ
る結晶性抗原の濃度は、全タンパクの約０．５％である
と算出された。さらに、５”末端における５８８個のヌ
クレオチドおよび３゛末端における４８０個のヌクレオ
チドによって側面を固められた結晶性タンパク遺伝子を
含むＥ、 ｃｏｌｔ ５４４ＨｉｎｄＳＣサブクロー
ンは。
親株のＬ 延 ｐＮＳＢＰ５４４に等しいレベルで、７
３ｋＤａおよび６５ｋＤａのペプチドを発現する（第３
図の第７レーン）。４６個のアミノ酸を毒素遺伝子のＮ
末端から欠失させた場合１組換えプラスミドは。
３ｋＤａおよび６５ｋＤａのペプチドを発現する（第３
図の第７レーン）。４６個のアミノ酸を毒素遺伝子のＮ
末端から欠失させた場合１組換えプラスミドは。
約９８２番目から２７７５番目のヌクレオチドにまで及
ぶオーブンリーディングクレーム中にコードされる５９
７個のアミノ酸のポリペプチドに相当する６５ｋＤａの
ポリペプチドを主として発現した（第２図に例示されて
いる）。この６５ｋＤａの発現産物は。
ぶオーブンリーディングクレーム中にコードされる５９
７個のアミノ酸のポリペプチドに相当する６５ｋＤａの
ポリペプチドを主として発現した（第２図に例示されて
いる）。この６５ｋＤａの発現産物は。
ＨＰＬＣでは同種であると判定され、！Ｌ μ■わ１幻
ユ〜ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓか
ら単離された。 ６５ｋＤａの（ＩＩＰＬ（、では）異
種の結晶を包含するポリペプチドとは異なっている。６
５ｋＤａの結晶性タンパクとして単離された天然のポリ
ペプチドは、おそらくより大きな７３ｋＤａの結晶性タ
ンパクがタンパク分解のプロセッシングを受けた誘導体
を意味しているのに対し１組換え体ポリペプチド発現産
物はＮ末端のメチオニンを有する均一なタンパクである
。
ユ〜ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓか
ら単離された。 ６５ｋＤａの（ＩＩＰＬ（、では）異
種の結晶を包含するポリペプチドとは異なっている。６
５ｋＤａの結晶性タンパクとして単離された天然のポリ
ペプチドは、おそらくより大きな７３ｋＤａの結晶性タ
ンパクがタンパク分解のプロセッシングを受けた誘導体
を意味しているのに対し１組換え体ポリペプチド発現産
物はＮ末端のメチオニンを有する均一なタンパクである
。
第３図Ｂにおいて、第２レーンおよび第３レーンは、
ｖａｒ、ｔｅｎ−ｅｂｒ、１ｏｎｆｓ毒素遺伝子のコー
ド領域が元のままの場合（第２レーン）と、コード領域
のＮ末端において４６個のヌクレオチドが短かくされて
いる場合（第３レーン）とにおける発現産物を比較して
いる。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔ
ｅｎｅｂｒｉ−ｏｎｉｓの結晶性毒素遺伝子のＮ末端領
域における改変／欠失は結晶性毒素ポリペプチドの発現
を阻害しなかったが、Ｃ末端では、はんのわずかな（４
個または５個を超えないアミノ酸の）欠失でさえ。
ｖａｒ、ｔｅｎ−ｅｂｒ、１ｏｎｆｓ毒素遺伝子のコー
ド領域が元のままの場合（第２レーン）と、コード領域
のＮ末端において４６個のヌクレオチドが短かくされて
いる場合（第３レーン）とにおける発現産物を比較して
いる。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、ｔ
ｅｎｅｂｒｉ−ｏｎｉｓの結晶性毒素遺伝子のＮ末端領
域における改変／欠失は結晶性毒素ポリペプチドの発現
を阻害しなかったが、Ｃ末端では、はんのわずかな（４
個または５個を超えないアミノ酸の）欠失でさえ。
殺虫性が１０倍以上失活した。
１）ＮＡ配列の決定は、 ＭａｘａｍおよびＧ１１ｂｅ
ｒｔの化学的方法（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６
５：４９９−５５９（１９８０） ）により行った。結
晶性毒素のＲＮＡ転写物における５″末端のマツピング
は、マングビーンヌクレアーゼ転写物マツピングを用い
て行った。７３７ｂｐのｐｓｔＩ／１１ｉｎｄｌＩ［断
片（Ｐｓｔｌ末端で末端標識したもの）をプローブとし
て用いた。全ＲＮＡ （各３０μｇ）を、対数増殖期お
よび定常期のＥ、 ｃｏｌｔ Ｎ５ＢＰ ５４４細胞
から、そして定常初期（定常期の開始２時間後、胞子形
成の第２期）および定常中期（定常期に入って７１時間
、第■期〜第■期）から単離した。マツピング実験には
、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞を用いた。
ｒｔの化学的方法（Ｍｅｔｈ、 Ｅｎｚｙｍｏｌ、 ６
５：４９９−５５９（１９８０） ）により行った。結
晶性毒素のＲＮＡ転写物における５″末端のマツピング
は、マングビーンヌクレアーゼ転写物マツピングを用い
て行った。７３７ｂｐのｐｓｔＩ／１１ｉｎｄｌＩ［断
片（Ｐｓｔｌ末端で末端標識したもの）をプローブとし
て用いた。全ＲＮＡ （各３０μｇ）を、対数増殖期お
よび定常期のＥ、 ｃｏｌｔ Ｎ５ＢＰ ５４４細胞
から、そして定常初期（定常期の開始２時間後、胞子形
成の第２期）および定常中期（定常期に入って７１時間
、第■期〜第■期）から単離した。マツピング実験には
、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞を用いた。
第２図は、 ｐＮＳＢＰ５４４の３．Ｏｋｂ Ｈ釦ｄＩ
［［断片の６０１位から３０００位に対するヌクレオチ
ド配列を示す。
［［断片の６０１位から３０００位に対するヌクレオチ
ド配列を示す。
オーブンリーディングフレームは、８４１番目から２７
７５番目のヌクレオチドに拡がっている。このオープン
リーディングフレームは９分子！７３，１９９Ｄａに相
当する６４４個のアミノ酸からなるペプチドをコードす
る。３４１位のメチオニンコドンは、８２３〜８３２番
目のヌクレオチドにおいて、 ＡＴＧに先だつりボソー
ム結合可能部位（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの１６５ｒ
ＲＮＡに対する塩基対合の計算された自由エネルギーは
２１．３ｋｃａｌ ）が存在することから、おそらく開
始メチオニンである。クローン化された結晶性タンパク
の推定アミノ酸組成は、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓの報告された組成（Ｋ、 Ｂｅｒｎｈａｒｄ（１
９８６）ＰＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
７５番目のヌクレオチドに拡がっている。このオープン
リーディングフレームは９分子！７３，１９９Ｄａに相
当する６４４個のアミノ酸からなるペプチドをコードす
る。３４１位のメチオニンコドンは、８２３〜８３２番
目のヌクレオチドにおいて、 ＡＴＧに先だつりボソー
ム結合可能部位（Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの１６５ｒ
ＲＮＡに対する塩基対合の計算された自由エネルギーは
２１．３ｋｃａｌ ）が存在することから、おそらく開
始メチオニンである。クローン化された結晶性タンパク
の推定アミノ酸組成は、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓの報告された組成（Ｋ、 Ｂｅｒｎｈａｒｄ（１
９８６）ＰＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。
Ｌｅｔｔ、 ３３：２６１−２６５） とよく一致する
。
。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子形成初期および胞子形成中
期における結晶性タンパクのＲＮＡ転写物の５゛末端を
マツピングした。翻訳開始ＡＴＧコドンから１３０ｂｐ
上流に位置する単一の開始部位は、胞子形成初期および
胞子形成中期の間に、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓにより使用される。単一の転写開始部位はまた。Ｂ
、旦■セｌ旦ｎ５ｉｓνａｒ。
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子形成初期および胞子形成中
期における結晶性タンパクのＲＮＡ転写物の５゛末端を
マツピングした。翻訳開始ＡＴＧコドンから１３０ｂｐ
上流に位置する単一の開始部位は、胞子形成初期および
胞子形成中期の間に、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓにより使用される。単一の転写開始部位はまた。Ｂ
、旦■セｌ旦ｎ５ｉｓνａｒ。
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ （Ｗａａｌｊｉｋら（１９８
５） 、前述）の２８ｋＤａ遺伝子として報告されてい
る。これとは対照的に。
５） 、前述）の２８ｋＤａ遺伝子として報告されてい
る。これとは対照的に。
ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉは、胞子形成初期および胞子
形成中期の間に、２つの異なる部位で開始されるが、対
数増殖期および定常期のＥ、 ｃｏｌｔ細胞では単一
の部位で開始される（Ｈａｎｇら（１９８３） Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ。
形成中期の間に、２つの異なる部位で開始されるが、対
数増殖期および定常期のＥ、 ｃｏｌｔ細胞では単一
の部位で開始される（Ｈａｎｇら（１９８３） Ｊ、
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ。
％ｉ８：１９６０−１９６７）。ＲＮＡの開始部位に近
接する領域は、 Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの一１０位
および一３５位における共通プロモータ領域に対する有
意の相同性は示さなかった。−３５位の領域における８
個の塩基対のうちの５塩基対（ＧＡＡＴＧＡＴＴ）およ
び−１０位の領域における８個の塩基対のうちの３塩基
対（ＧＴＡＴＡＡＡＴ ）（下線を引いた塩基は同一で
あることを示す）には、 ｖａｒ、１ｓｒａｅｌｅｎｓ
ｉｓのＰＢＩプロモータおよびｖａｒ。
接する領域は、 Ｂ、 ５ｕｂｔｉｌｉｓの一１０位
および一３５位における共通プロモータ領域に対する有
意の相同性は示さなかった。−３５位の領域における８
個の塩基対のうちの５塩基対（ＧＡＡＴＧＡＴＴ）およ
び−１０位の領域における８個の塩基対のうちの３塩基
対（ＧＴＡＴＡＡＡＴ ）（下線を引いた塩基は同一で
あることを示す）には、 ｖａｒ、１ｓｒａｅｌｅｎｓ
ｉｓのＰＢＩプロモータおよびｖａｒ。
ｋｕｒｓｔａｋｉのＢＴＩプロモータに対する。ある程
度の相同性が存在する。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓ遺伝子は。
度の相同性が存在する。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓ遺伝子は。
ＲＮＡの開始部位から上流に、八およびＴ塩基の豊富な
領域を有する（第２図）。＾およびＴ塩基の豊富な同様
の領域が、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子およびｋｕ
ｒｓｔａｋｉ遺伝子の前方に位置している。マングビー
ンヌクレアーゼマツピングを用いたＥ、 ｃｏｌｔｐ
ＮＳＢＰ５４４中における結晶性タンパク遺伝子の転写
物の分析により、転写は開始ＡＴＧから約１７０ｂｐ上
流で始まることが示される。−１０位におけるＥ、 ｃ
ｏｌｉの共通プロモータ領域（ＴＡＴＡＡＴ）は、この
開 始部位近くに位置している。
領域を有する（第２図）。＾およびＴ塩基の豊富な同様
の領域が、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子およびｋｕ
ｒｓｔａｋｉ遺伝子の前方に位置している。マングビー
ンヌクレアーゼマツピングを用いたＥ、 ｃｏｌｔｐ
ＮＳＢＰ５４４中における結晶性タンパク遺伝子の転写
物の分析により、転写は開始ＡＴＧから約１７０ｂｐ上
流で始まることが示される。−１０位におけるＥ、 ｃ
ｏｌｉの共通プロモータ領域（ＴＡＴＡＡＴ）は、この
開 始部位近くに位置している。
サザンプロットハイプリダイゼーション技術を用いて、
異なるＤＮＡ試料間の相同性を確認した。
異なるＤＮＡ試料間の相同性を確認した。
β、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓの各種株、およびＥ
、 ｃｏｌｉの組換え株の染色体ＤＮＡおよびプラス
ミドＤＮＡを、 Ｅｃｋｈａｒｄｔの改変スロットーソ
ーシス法（１９８７，Ｐｌａｓｍｉｄ上＝５８４−５８
８）により、０．６％アガロースゲル上で分離しく第４
図のパネルＡ）、ニトロセルロースメンブレンフィルタ
ーに移した。ニックトランスレーションされた０、７ｋ
ｂの精製内部ＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシジン実験を、 ９
００ｍＭ ＮａＣ１，９００ｍＭクエン酸ナトＩＪ ラ
ム、 １０ｍＭ Ｎ−ｚＥＤＴＡ、 ５ Ｘデンハー
ト溶液、０．５％ＳＯＳ中で、１０６ＣＩ］Ｗ／ｌｈ＋
ｆ／フイルターにより、６５°Ｃにて１８時間行った。
、 ｃｏｌｉの組換え株の染色体ＤＮＡおよびプラス
ミドＤＮＡを、 Ｅｃｋｈａｒｄｔの改変スロットーソ
ーシス法（１９８７，Ｐｌａｓｍｉｄ上＝５８４−５８
８）により、０．６％アガロースゲル上で分離しく第４
図のパネルＡ）、ニトロセルロースメンブレンフィルタ
ーに移した。ニックトランスレーションされた０、７ｋ
ｂの精製内部ＥｃｏＲＩ断片をプローブとして用い、
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーシジン実験を、 ９
００ｍＭ ＮａＣ１，９００ｍＭクエン酸ナトＩＪ ラ
ム、 １０ｍＭ Ｎ−ｚＥＤＴＡ、 ５ Ｘデンハー
ト溶液、０．５％ＳＯＳ中で、１０６ＣＩ］Ｗ／ｌｈ＋
ｆ／フイルターにより、６５°Ｃにて１８時間行った。
このフィルターは、６５°Ｃにて９０分間最終的に洗浄
する前に、室温にて（４５０ｍＭＮａＣＩ、 ４５０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、および０．５％ＳＯ５中で）繰
り返し洗浄した。
する前に、室温にて（４５０ｍＭＮａＣＩ、 ４５０ｍ
Ｍクエン酸ナトリウム、および０．５％ＳＯ５中で）繰
り返し洗浄した。
第４図に示すように、 ｐＮｓＢＰ５４４遺伝子由来の
０．７ｋｂの内部ＥｃｏＲＩ断片は、 ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ ＤＮＡにのみハイブリダイズし、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ−ｖａｒ、ｋｕ
ｒｓｔａｋｉ、 ｖａｒ、Ｌｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
、またはｖａｒ。
０．７ｋｂの内部ＥｃｏＲＩ断片は、 ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓ ＤＮＡにのみハイブリダイズし、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ−ｖａｒ、ｋｕ
ｒｓｔａｋｉ、 ｖａｒ、Ｌｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
、またはｖａｒ。
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓのＤＮＡにはハイブリダイズし
なかった。これは、甲虫類の遺伝子が、＊翅頻に活性の
あるＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３または双翅類に活性のあ
るＢ、 μ咀Ｌｈ１環狙ｓｉｓ ｖａｒ。
なかった。これは、甲虫類の遺伝子が、＊翅頻に活性の
あるＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３または双翅類に活性のあ
るＢ、 μ咀Ｌｈ１環狙ｓｉｓ ｖａｒ。
１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓの遺伝子に対するＤＮＡ相同性
をほとんど持たないことを示している。
をほとんど持たないことを示している。
サザンハイプリダイゼーションの評価によれば。
甲虫類の遺伝子は、鱗翅類に活性のあるＢ、 ｔｈｕ
−旦■江坦ｎｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ １１０７３
または双翅類に活性のあるβ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子に
対するＤＮＡ相同性をほとんど持たない。
−旦■江坦ｎｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉ １１０７３
または双翅類に活性のあるβ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅ
ｎｓｉｓ ｖａｒ、 １ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ遺伝子に
対するＤＮＡ相同性をほとんど持たない。
しかしながら、コンピュータ分析によると、 ｖａｒ
。
。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ遺伝子と、 ｖａｒ、ｋｕｒｓ
ｔａｋｉ ＨＤ７３遺伝子における３５３７個のヌクレ
オチドの５゛側における１８２７個のヌクレオチドとの
間には、 ５０．２％のアミノ酸相同性が存在する（第
５図Ａ）。ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ株へのｐＮＳＢＰ
５４４プローブ（しかし、 ０．７ｋｂの内部ＥｃｏＲ
Ｉ断片プローブではない）のハイブリダイゼーションは
、５゛領域におけるこの相同性によるものであり得る。
ｔａｋｉ ＨＤ７３遺伝子における３５３７個のヌクレ
オチドの５゛側における１８２７個のヌクレオチドとの
間には、 ５０．２％のアミノ酸相同性が存在する（第
５図Ａ）。ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋｉ株へのｐＮＳＢＰ
５４４プローブ（しかし、 ０．７ｋｂの内部ＥｃｏＲ
Ｉ断片プローブではない）のハイブリダイゼーションは
、５゛領域におけるこの相同性によるものであり得る。
これら２つのタンパクのアミノ酸配列を一列に並べた場
合、完全なりａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓタンパクと
、 ＨＤ７３タンパクのＮ末端における６０９個のアミ
ノ酸との間で、すべての対合が起こる。
合、完全なりａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓタンパクと
、 ＨＤ７３タンパクのＮ末端における６０９個のアミ
ノ酸との間で、すべての対合が起こる。
これは、活性毒素を含むＨＤ７３タンパクの領域である
。第５図には、 ＨＤ７３遺伝子における最初の６０９
個のアミノ酸に対するｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ
ｓ遺伝子産物の整列を示す。全体的に見て、この領域に
は２２．７％の同一性があり、１０６〜３８２番目のア
ミノ酸では３３．０％の相同性があり、４５１〜６４４
番目のアミノ酸では２２．４％の相同性がある。第５図
から明らかなように、３３個のアミノ酸間隙がＨＤ７３
配列の開始部位に挿入された後、 ｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓタンパクの６７〜９４番目の残基は、
ＨＤ７３タンパクの３５〜７０番目の残基と整列して
いる。これらの領域は、同様の疎水性度の予想値を有す
る（第５図Ｂ）。
。第５図には、 ＨＤ７３遺伝子における最初の６０９
個のアミノ酸に対するｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉ
ｓ遺伝子産物の整列を示す。全体的に見て、この領域に
は２２．７％の同一性があり、１０６〜３８２番目のア
ミノ酸では３３．０％の相同性があり、４５１〜６４４
番目のアミノ酸では２２．４％の相同性がある。第５図
から明らかなように、３３個のアミノ酸間隙がＨＤ７３
配列の開始部位に挿入された後、 ｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓタンパクの６７〜９４番目の残基は、
ＨＤ７３タンパクの３５〜７０番目の残基と整列して
いる。これらの領域は、同様の疎水性度の予想値を有す
る（第５図Ｂ）。
また、２つの短い領域、すなわち２７３〜２８５番目の
アミノ酸および４５１〜４７４番目のアミノ酸は。
アミノ酸および４５１〜４７４番目のアミノ酸は。
非常によ（似た疎水性度の予想値を有する。ｖａｒ。
Ｌｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓとｋｕｒｓｔａｋｉ ＨＤ７３
との間の毒素配列における最も顕著な差違は、 ［０７
３タンパクには存在しないｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓタンパクの４２３〜４４５番目のアミノ酸からな
る親水性領域である。これらの遺伝子をさらに比較する
と、これらの殺虫性タンパクの活性を改変し得る方法が
導かれる。これらの遺伝子によってコードされるタンパ
クは。
との間の毒素配列における最も顕著な差違は、 ［０７
３タンパクには存在しないｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏ
ｎｉｓタンパクの４２３〜４４５番目のアミノ酸からな
る親水性領域である。これらの遺伝子をさらに比較する
と、これらの殺虫性タンパクの活性を改変し得る方法が
導かれる。これらの遺伝子によってコードされるタンパ
クは。
類僚の殺虫特性を有するが、特定のＤＮＡ配列によリコ
ードされる異なった宿主域特性を有する。
ードされる異なった宿主域特性を有する。
（以下余白）
実施例６ ：Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ ｉｅ ｉｓ ｖ
ａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ里皿 スビチツェン塩（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ’ｓ ５ａｌｔ 、
ＳＰＹ ）を追加した培地中で振憑しながら、３０°
Ｃにて増殖させたＢ、 Ｌｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの一夜培養物を、
新しい培地で１０倍に希釈した。この培養物を、２度の
対数増殖転換を通じて振盪しなから３７°Ｃにて増殖さ
せた。この同調培養物の１００倍希釈物を、２Ｘ６００
ｄの新鮮な培地で調製した。
ａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ里皿 スビチツェン塩（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ’ｓ ５ａｌｔ 、
ＳＰＹ ）を追加した培地中で振憑しながら、３０°
Ｃにて増殖させたＢ、 Ｌｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの一夜培養物を、
新しい培地で１０倍に希釈した。この培養物を、２度の
対数増殖転換を通じて振盪しなから３７°Ｃにて増殖さ
せた。この同調培養物の１００倍希釈物を、２Ｘ６００
ｄの新鮮な培地で調製した。
この培養物の増殖速度は、 ６００ ｎｍの分光分析に
よってモニターした。この培養物の２つの試料（各３０
ｄ）を１種々の増殖期で得た。タンパク抽出物は一方の
試料から調製し、全ＲＮＡは他方の試料から抽出した。
よってモニターした。この培養物の２つの試料（各３０
ｄ）を１種々の増殖期で得た。タンパク抽出物は一方の
試料から調製し、全ＲＮＡは他方の試料から抽出した。
精製したＲＮＡ試料は、真空下で乾燥し、そしてローデ
ィング緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、 ｐＨ６，８。
ィング緩衝液（２０ｍＭリン酸緩衝液、 ｐＨ６，８。
５ｍＭ Ｎａｇ ＥＤＴＡ 、 ２５％ホルムアミド、
３％ホルムアルデヒド、および１０％グリセロール）中
に再懸濁した。、これらの試料は、６０°Ｃにて１０分
間変性させ、そして１ｖ／ＣＴ１１で１６時間、１％ア
ガロースゲル上で電気泳動させた。電気泳動したＲＮＡ
は、 Ｚｅｔａｂｉｎｄメンブランフィルタ−（ＣＵＮ
ＯＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。
３％ホルムアルデヒド、および１０％グリセロール）中
に再懸濁した。、これらの試料は、６０°Ｃにて１０分
間変性させ、そして１ｖ／ＣＴ１１で１６時間、１％ア
ガロースゲル上で電気泳動させた。電気泳動したＲＮＡ
は、 Ｚｅｔａｂｉｎｄメンブランフィルタ−（ＣＵＮ
ＯＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ。
Ｍｅｒｉｄｅｎ、 ＣＴ）に移し、そしてノザンプロッ
トを行なった。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｔｏｎｉｓの結晶性タンパク遺
伝子の０．７ ｋｂ内部ＥｃｏＲＴ断片（ニックトラン
スレーションにより′Ｐで標識した）は、結晶性タンパ
クに特異的な転写物を検出するためのプローブとして用
いた。このタンパク抽出物を、 ５ＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、そして抗原ペプチドを免疫
沈陣分析により検出した。１次マウス抗血清は、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎ−ｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓの６５ｋＤａ結晶性タンパクに対して
調製した。アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギー
抗マウス抗体は、２次抗血清として用いた。抗原ペプチ
ドは、アルカリホスファターゼに特異的な比色分析によ
って検出した。
トを行なった。Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｔｏｎｉｓの結晶性タンパク遺
伝子の０．７ ｋｂ内部ＥｃｏＲＴ断片（ニックトラン
スレーションにより′Ｐで標識した）は、結晶性タンパ
クに特異的な転写物を検出するためのプローブとして用
いた。このタンパク抽出物を、 ５ＯＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動に供し、そして抗原ペプチドを免疫
沈陣分析により検出した。１次マウス抗血清は、 Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎ−ｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓの６５ｋＤａ結晶性タンパクに対して
調製した。アルカリ性ホスファターゼに結合したヤギー
抗マウス抗体は、２次抗血清として用いた。抗原ペプチ
ドは、アルカリホスファターゼに特異的な比色分析によ
って検出した。
大部分のＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ株におけ
る結晶性タンパクの発現は胞子形成中期に始まり、そし
てすべての結晶性タンパク遺伝子の発現は厳密な−時的
調節下にあると一般的に考えられている。しかしながら
、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの場合、結晶性タンパク遺伝子
に特異的な２．２ ｋｂのＲＮＡ転写物は対数増殖細胞
中で検出された（第６図の第ル−ン）。この転写物の発
現レベルは。
る結晶性タンパクの発現は胞子形成中期に始まり、そし
てすべての結晶性タンパク遺伝子の発現は厳密な−時的
調節下にあると一般的に考えられている。しかしながら
、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの場合、結晶性タンパク遺伝子
に特異的な２．２ ｋｂのＲＮＡ転写物は対数増殖細胞
中で検出された（第６図の第ル−ン）。この転写物の発
現レベルは。
定常初期（すなわち、定常期の開始２時間後、ｔ２；こ
の期間は一般的に胞子形成第１期と呼ばれる）の細胞中
で劇的に増加しく第６図の第２レーンおよび第３レーン
）、定常中期（ｔ７．胞子形成期第■朋〜第■期）を通
じて、このレベルで維持された。同様に、検出可能レベ
ルの結晶性抗原は対数増殖中期の細胞（第７図Ｂの第ル
−ン）に現れ。
の期間は一般的に胞子形成第１期と呼ばれる）の細胞中
で劇的に増加しく第６図の第２レーンおよび第３レーン
）、定常中期（ｔ７．胞子形成期第■朋〜第■期）を通
じて、このレベルで維持された。同様に、検出可能レベ
ルの結晶性抗原は対数増殖中期の細胞（第７図Ｂの第ル
−ン）に現れ。
次いで定常初期および定常中期の細胞中に最高レベルで
蓄積された（第７図Ｂの第２レーン〜第４レーン） 、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子の発現
におけるこの独特な様式は、そのプロモータ領域により
与えられ得る。以下の表４には、Ｌ 旦ガカ頭至旺ｉｓ
ｖａｒ。
蓄積された（第７図Ｂの第２レーン〜第４レーン） 、
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子の発現
におけるこの独特な様式は、そのプロモータ領域により
与えられ得る。以下の表４には、Ｌ 旦ガカ頭至旺ｉｓ
ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ、および他のＬｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓ変種の結晶性タンパク遺伝子の一１０位お
よび一３５位における領域の比較を示す。Ｂ ｕ皿道
ｌ匡旺Ｕ変種における結晶性タンパク遺伝子の発現は、
胞子形成中期の間に始まり、後の期間に最高レベルに達
するが、これらのＢＬｔｈｕｒｉ＋（１）ｅｎｓｉｓ変
種には高度に保存されたプロモータ領域が含まれること
が観察された。しかしながら、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
１ｅｎｓｉｓ変種の結晶性タンパク遺伝子の一１０位お
よび一３５位における領域の比較を示す。Ｂ ｕ皿道
ｌ匡旺Ｕ変種における結晶性タンパク遺伝子の発現は、
胞子形成中期の間に始まり、後の期間に最高レベルに達
するが、これらのＢＬｔｈｕｒｉ＋（１）ｅｎｓｉｓ変
種には高度に保存されたプロモータ領域が含まれること
が観察された。しかしながら、 Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒ ｔｏｎ ｉｓの結晶性タンパク遺伝子の
プロモータは、他のＢ、−助旦員１（ｊル１もに種の結
晶性タンパク遺伝子のプロモータに対して、はとんど相
同性を持っていなかった。Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒら（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
プロモータは、他のＢ、−助旦員１（ｊル１もに種の結
晶性タンパク遺伝子のプロモータに対して、はとんど相
同性を持っていなかった。Ｓｈｉｖａｋｕｍａｒら（Ｊ
、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。
１６６：１９４−２０４．１９８６）は、 Ｂ、 ｔ
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ。
ｋｕｒｓｔａｋｉ Ｈｄｌ ｄｉｐｅｌの６．６ ｋｂ
の結晶遺伝子を含む組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ株の栄養増殖期における結晶性タンパクの発
現を観察した。しかし１本発明は、Ｂ、ｔｈガセ１国旺
込株の栄養増殖細胞における結晶性タンパク遺伝子の発
現を実証する最初の例を与える。
の結晶遺伝子を含む組換えＢａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ
ｔｉｌｉｓ株の栄養増殖期における結晶性タンパクの発
現を観察した。しかし１本発明は、Ｂ、ｔｈガセ１国旺
込株の栄養増殖細胞における結晶性タンパク遺伝子の発
現を実証する最初の例を与える。
（以下余白）
免疫沈降分析の結果は、栄養増殖期のＢ、 ｔｈ且ヒ
フ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞中では、結
晶性タンパクが７３ｋＤａの抗原として生産されること
を示した（第７図の第２レーン）。胞子形成初期では、
６５ｋＤａの付加的な少量の抗原ペプチドが現れた（
第７図の第３レーン）。このペプチドの蓄積は、胞子形
成中期を通じて増加した。中性ｐＨにおけるタンパク分
解酵素の活性は、いくつかの３エμすよりより」ｌＩ−
株の結晶封入体に関係していると報告されている。Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ
−ｂｒｉｏｎｉｓのクローン化された結晶性タンパク遺
伝子のヌクレオチド配列分析は、 ７３，１１９Ｄａの
コード容量を有する。 １９３２ｂｐのオープンリーデ
ィングフレームを示した。推定アミノ酸配列の分析は、
タンパク分解による推定開裂部位（ａｒｇ−ｍｅｔ）が
４８番目の残基と４９番目の残基との間に位置すること
を示した。７３ｋＤａの結晶性タンパクのＮ末端領域か
ら、このペプチドをタンパク分解により除去すると、胞
子形成後期の間に蓄積される正確な大きさの付加的な結
晶性抗原である６５ｋＤａのペプチドが生産される。本
研究において対照として用いられた精製結晶性タンパク
調製物は、 ＳＰ’ｌ培地中で増殖したＢ、ｔｈｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
培養物からｔｔ４に単離された。この調製物は、主要な
６５ｋＤａ結晶性抗原に加えて、痕跡量の７３ｋＤａペ
プチドを含んでいる（第７図Ｂの第５レーン）。しかし
ながら、Ｌ−肉汁中で増殖したμエ ｕ肛ｎ麩並ｓｉｓ
ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ培養物からｔｔ４に
単離された結晶調製物は、 ６５ｋＤａの結晶性抗原に
加えて、有意な量（約３０％）の７３ｋＤａペプチドを
含んでいた。
フ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ細胞中では、結
晶性タンパクが７３ｋＤａの抗原として生産されること
を示した（第７図の第２レーン）。胞子形成初期では、
６５ｋＤａの付加的な少量の抗原ペプチドが現れた（
第７図の第３レーン）。このペプチドの蓄積は、胞子形
成中期を通じて増加した。中性ｐＨにおけるタンパク分
解酵素の活性は、いくつかの３エμすよりより」ｌＩ−
株の結晶封入体に関係していると報告されている。Ｂ、
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ
−ｂｒｉｏｎｉｓのクローン化された結晶性タンパク遺
伝子のヌクレオチド配列分析は、 ７３，１１９Ｄａの
コード容量を有する。 １９３２ｂｐのオープンリーデ
ィングフレームを示した。推定アミノ酸配列の分析は、
タンパク分解による推定開裂部位（ａｒｇ−ｍｅｔ）が
４８番目の残基と４９番目の残基との間に位置すること
を示した。７３ｋＤａの結晶性タンパクのＮ末端領域か
ら、このペプチドをタンパク分解により除去すると、胞
子形成後期の間に蓄積される正確な大きさの付加的な結
晶性抗原である６５ｋＤａのペプチドが生産される。本
研究において対照として用いられた精製結晶性タンパク
調製物は、 ＳＰ’ｌ培地中で増殖したＢ、ｔｈｕｒｉ
ｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
培養物からｔｔ４に単離された。この調製物は、主要な
６５ｋＤａ結晶性抗原に加えて、痕跡量の７３ｋＤａペ
プチドを含んでいる（第７図Ｂの第５レーン）。しかし
ながら、Ｌ−肉汁中で増殖したμエ ｕ肛ｎ麩並ｓｉｓ
ｖａｒ、ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ培養物からｔｔ４に
単離された結晶調製物は、 ６５ｋＤａの結晶性抗原に
加えて、有意な量（約３０％）の７３ｋＤａペプチドを
含んでいた。
これらの結果から、精製結晶調製物中に存在する６５ｋ
Ｄａペプチドおよび７３ｋＤａペプチドの実際的な割合
は、培養培地に依存していることが示唆される。多量の
胞子形成を維持する培養培地（すなわち、 ｓｐｙ培地
のような培養培地）中では、 ７３ｋＤａの結晶性タン
パクの量は、胞子形成に伴う高いタンパク分解活性によ
ってかなり減少する。
Ｄａペプチドおよび７３ｋＤａペプチドの実際的な割合
は、培養培地に依存していることが示唆される。多量の
胞子形成を維持する培養培地（すなわち、 ｓｐｙ培地
のような培養培地）中では、 ７３ｋＤａの結晶性タン
パクの量は、胞子形成に伴う高いタンパク分解活性によ
ってかなり減少する。
（以下余白）
Ｍ ： Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの ８ プロモ
ー の における°−゛−の 本実施例では、βエ 則肛圏紅並ｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性毒素遺伝子プロモータ
の制御下における異種構造遺伝子の発現を調べるための
組換え系の構築について述べる。この系を利用すること
により、胞子形成バチルスにおける特定の殺虫性抗原の
発現を一時的に調節することができる。
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの ８ プロモ
ー の における°−゛−の 本実施例では、βエ 則肛圏紅並ｓｉｓ ｖａｒ、
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性毒素遺伝子プロモータ
の制御下における異種構造遺伝子の発現を調べるための
組換え系の構築について述べる。この系を利用すること
により、胞子形成バチルスにおける特定の殺虫性抗原の
発現を一時的に調節することができる。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子プロモータは、 Ｉ
）ＮＳＢＰ５４４ （実施例２）の３．０ｋｂＨｉｎｄ
ｍ断片を、制限エンドヌクレアーゼで分解することに
より得られる（第１図Ｂ中の制限酵素地図により示され
たＸｍｎ Ｉおよびハｌでの分解がその一例である）。
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの毒素遺伝子プロモータは、 Ｉ
）ＮＳＢＰ５４４ （実施例２）の３．０ｋｂＨｉｎｄ
ｍ断片を、制限エンドヌクレアーゼで分解することに
より得られる（第１図Ｂ中の制限酵素地図により示され
たＸｍｎ Ｉおよびハｌでの分解がその一例である）。
プロモータ領域、およびＡＴＧ翻訳開始コドンより３゛
側に約１３８ｂｐの領域を有する得られたＤＮＡ断片は
、３゛末端が酵素的に（すなわち、エキソヌクレアーゼ
で）削られて短くなり。
側に約１３８ｂｐの領域を有する得られたＤＮＡ断片は
、３゛末端が酵素的に（すなわち、エキソヌクレアーゼ
で）削られて短くなり。
所望のβ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｗａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓプロモータのみを含む断片
を与える。あるいは、！！。
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓプロモータのみを含む断片
を与える。あるいは、！！。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ毒素遺伝子プロモータは、第２図に示した
ＤＮＡヌクレオチド配列（６００番目のヌクレオチドか
ら約７１１番目のヌクレオチドにまで及ぶ）を利用して
、化学的に合成し得る。
ｒｉｏｎｉｓ毒素遺伝子プロモータは、第２図に示した
ＤＮＡヌクレオチド配列（６００番目のヌクレオチドか
ら約７１１番目のヌクレオチドにまで及ぶ）を利用して
、化学的に合成し得る。
殺虫性の結晶性タンパクをコードしている構造遺伝子は
、既に公表されている方法によって、所望のＤよ υμ
ユ旺旦μ注り株から調製し得る（−１Ｒｅｚｎｉｋｏｆ
ｆおよびり、 Ｇｏｌｄ（１９８６）による総説を参照
されたい） 。Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子
プロモータと、殺虫性タンパクの構造遺伝子との組換え
融合遺伝子の構築に用いられる方法は、当業者には標準
的で。
、既に公表されている方法によって、所望のＤよ υμ
ユ旺旦μ注り株から調製し得る（−１Ｒｅｚｎｉｋｏｆ
ｆおよびり、 Ｇｏｌｄ（１９８６）による総説を参照
されたい） 。Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａ
ｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子
プロモータと、殺虫性タンパクの構造遺伝子との組換え
融合遺伝子の構築に用いられる方法は、当業者には標準
的で。
明白なものである。発現複合体の構成成分は、インビト
ロでの取り扱いに便利な、天然に存在する。
ロでの取り扱いに便利な、天然に存在する。
または（人為的に）構築した制限酵素部位により。
連結し得る。制限断片の適合しない末端は、連結を行な
うために平滑末端に変更するか、あるいはリンカ−やア
ダプターの添加により改変することができる。主として
考慮すべきことは、その連結部分における配列が転写お
よび翻訳の機能を保持するようにすることである。
うために平滑末端に変更するか、あるいはリンカ−やア
ダプターの添加により改変することができる。主として
考慮すべきことは、その連結部分における配列が転写お
よび翻訳の機能を保持するようにすることである。
β、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性毒素遺伝子プロモータと異
種構造遺伝子との構築遺伝子は、一般によく使われてい
る。Ｌ 皿の菌株または他のグラム陰性細胞中に導入し
得る。
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性毒素遺伝子プロモータと異
種構造遺伝子との構築遺伝子は、一般によく使われてい
る。Ｌ 皿の菌株または他のグラム陰性細胞中に導入し
得る。
外来ＤＮＡで細菌細胞を形質転換することは、当業者に
公知の数多くの方法で行なうことができる。
公知の数多くの方法で行なうことができる。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性タンパク遺伝子プロモータ
によって制御される発現の調節様式を調べるために２組
換え遺伝子構築体の発現は、胞子形成細胞および栄養細
胞における一時的な調節を識別するのに適した胞子形成
バチルス中でモニターシ得る。βユ 貝すエ崩１環猥且
Ｉ−に加えて、数多くのバチルス（Ｂ、 ７． Ｂ。
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性タンパク遺伝子プロモータ
によって制御される発現の調節様式を調べるために２組
換え遺伝子構築体の発現は、胞子形成細胞および栄養細
胞における一時的な調節を識別するのに適した胞子形成
バチルス中でモニターシ得る。βユ 貝すエ崩１環猥且
Ｉ−に加えて、数多くのバチルス（Ｂ、 ７． Ｂ。
１ａｒｖａｅ、およびＢ、 且匝肛に吋を包含するが
、これらに限定はされない）は、胞子外封入体を生産す
る。しかしながら、大部分の株では、結晶性毒素の発現
が胞子形成中期に開始されるのに対し。
、これらに限定はされない）は、胞子外封入体を生産す
る。しかしながら、大部分の株では、結晶性毒素の発現
が胞子形成中期に開始されるのに対し。
Ｂ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓでは、結晶性タンパク遺伝子の発
現は対数増殖細胞において検出された。
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓでは、結晶性タンパク遺伝子の発
現は対数増殖細胞において検出された。
（発明の要約）
本発明は、結晶性毒素および殺虫剤であり、挿入された
特定の遺伝子を安定な遺伝子構築体として導入すること
により遺伝子的に変化させた細菌の株の中で生産される
新規な生物学的制御タンパクに関する。特に２本発明は
、原核生物の調節系および複製系を含むクローニングベ
クターに、Ｂ。
特定の遺伝子を安定な遺伝子構築体として導入すること
により遺伝子的に変化させた細菌の株の中で生産される
新規な生物学的制御タンパクに関する。特に２本発明は
、原核生物の調節系および複製系を含むクローニングベ
クターに、Ｂ。
ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓ由来のδ内毒素遺伝子を挿入すること、
およびこのベクターを用いて、細菌の菌株を形質転換し
、甲虫類に対する病原菌にすることに関する。本発明の
遺伝子のコード領域を、ある限られた範囲で欠失させて
も２発現したタンパク中の殺虫活性は保存されている。
ｂｒｉｏｎｉｓ由来のδ内毒素遺伝子を挿入すること、
およびこのベクターを用いて、細菌の菌株を形質転換し
、甲虫類に対する病原菌にすることに関する。本発明の
遺伝子のコード領域を、ある限られた範囲で欠失させて
も２発現したタンパク中の殺虫活性は保存されている。
さらに９本発明は、昆虫に対して毒性があり、農業にお
ける有害生物の生物学的制御の新規な方法として使用し
得る。遺伝子的に変化させた細菌の菌株を提供する。
ける有害生物の生物学的制御の新規な方法として使用し
得る。遺伝子的に変化させた細菌の菌株を提供する。
４、′ のｐ な１ｌｌＩ
第１図は、 （Ａ） ｐＮｓＢＰ５４４ （実施例１に
記載）。
記載）。
（Ｂ） Ｉ）５４４Ｈｉｎｄ ＳＣ（実施例２に記載）
、 （Ｃ）ｐ５４４Ｐｓｔ−Ｍｅｔ ５ （実施例２
に記載）におけるＬｔｈｕｒ回ｔμ臣堕ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子を有するＤＮＡ
断片の部分制限エンドヌクレアーゼ地図の比較である。
、 （Ｃ）ｐ５４４Ｐｓｔ−Ｍｅｔ ５ （実施例２
に記載）におけるＬｔｈｕｒ回ｔμ臣堕ｖａｒ、 ｔｅ
ｎｅｂｒｉｏｎｉｓのδ−内毒素遺伝子を有するＤＮＡ
断片の部分制限エンドヌクレアーゼ地図の比較である。
（Ｄ） Ｂ、 肺■道頗至弦ｉｓ ｖａｒ。
ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ配列においてＭｅｔコドンを修
復するために力４１部位の前につけたリンカ−０太い矢
印は結晶性タンパクの転写の方向を示す。斜線の部分は
、結晶性タンパクをコードするＤＮＡを指す。太い線は
ベクターを指す。
復するために力４１部位の前につけたリンカ−０太い矢
印は結晶性タンパクの転写の方向を示す。斜線の部分は
、結晶性タンパクをコードするＤＮＡを指す。太い線は
ベクターを指す。
第２図はＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ由来の結晶性毒素遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列である。
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ由来の結晶性毒素遺伝子の
ＤＮＡ塩基配列である。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ ＤＮＡの２４
００ｂｐの塩基配列は７３ｋＤａの結晶性タンパクをコ
ードしている。オープンリーディングフレームのアミノ
酸配列を下側に示す。推定シャイン・ダルガノ配列は四
角で囲まれている。波線は、マング ビーン ヌクレア
ーゼを用いてマツピングすることによって決定されたＢ
、劫五道１国旺臘（Ｂｔ）およびＬ延（Ｅｃ）における
転写開始点を示す。遺伝子の３゛末端を超える逆位反復
（ＩＲ）を矢印で示す。
００ｂｐの塩基配列は７３ｋＤａの結晶性タンパクをコ
ードしている。オープンリーディングフレームのアミノ
酸配列を下側に示す。推定シャイン・ダルガノ配列は四
角で囲まれている。波線は、マング ビーン ヌクレア
ーゼを用いてマツピングすることによって決定されたＢ
、劫五道１国旺臘（Ｂｔ）およびＬ延（Ｅｃ）における
転写開始点を示す。遺伝子の３゛末端を超える逆位反復
（ＩＲ）を矢印で示す。
第３図は、形質転換体Ｅ、 ｃｏ旦において合成され
たタンパクのイムノ・プロット分析である。（Ａ）７３
ｋＤａおよび６５ｋＤａのポリペプチド成分を合成する
形質転換体。レーン１．２５ｅｎｇのｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性タンパク。レーン２．５０μｇ
の結晶性タンハク。レーア３．２５μｇのｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子形成（ＩＩ［Ｔ−ＩＶ期）
！ＩＩ胞由来タンパク。レーン４−７では次の各試料由
来の５ｅｎｇタンパクを分析したレーン４ 、 Ｅ、
ｃｏ１ｉｐｌＧ２０１１゜レーン５Ｅ、 ｃｏ１ｉｐ
ＮｓＢＰ５４４゜レーン６、Ｅ、ｃｏ旦５４４Ｂａｍ（
−）ＳＣ，レーン７Ｅ、 ｃｏｌｉ５４４１１ｉｎｄ
ＳＣ０タンパクのサイズ基準（ｋＤａ ）を左に示す
。（Ｂ）６５ｋＤａの成分のみを合成する形質転換体。
たタンパクのイムノ・プロット分析である。（Ａ）７３
ｋＤａおよび６５ｋＤａのポリペプチド成分を合成する
形質転換体。レーン１．２５ｅｎｇのｖａｒ、 ｔｅｎ
ｅｂｒｉｏｎｉｓ結晶性タンパク。レーン２．５０μｇ
の結晶性タンハク。レーア３．２５μｇのｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓの胞子形成（ＩＩ［Ｔ−ＩＶ期）
！ＩＩ胞由来タンパク。レーン４−７では次の各試料由
来の５ｅｎｇタンパクを分析したレーン４ 、 Ｅ、
ｃｏ１ｉｐｌＧ２０１１゜レーン５Ｅ、 ｃｏ１ｉｐ
ＮｓＢＰ５４４゜レーン６、Ｅ、ｃｏ旦５４４Ｂａｍ（
−）ＳＣ，レーン７Ｅ、 ｃｏｌｉ５４４１１ｉｎｄ
ＳＣ０タンパクのサイズ基準（ｋＤａ ）を左に示す
。（Ｂ）６５ｋＤａの成分のみを合成する形質転換体。
レーン１ 、 ｐＴｃ２０Ｈ対照ベクター レーン２．
完全なβ工ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ遺伝子を含有するｐＮＳＢＰ５４
４゜レーン３ 、 ｐ５４４ＰｓｔＳＣ０レーン４゜Ｂ
ａｍＨ１部位をもたないｐ５４４Ｐｓ ｔ４゜レーン５
．ｐ５４４Ｐｓ ｔ−Ｍｅ ｔ５゜レーン６、ＢａｍＨ
１部位をもたないｐ５４４Ｐｓｔ１３゜ 第４図は、サザンプロット分析である。β−ｔｈｕ−旦
■圏旦ｎ およびＬ 匹旦組み換え株Ｎ５ＢＰ５４４の
数珠のプラスミドＤＮＡ試料を０．６％アガロースゲル
で分離しくパネルＡ） 、 ３２Ｐで標識された０、７
ｋｂの内部のＥｃｏＲ■断片をプローブにした（パネル
Ｂ）。レーン１〜５は以下に示すＢ、 ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎ−１１株を含有していた。（１）−助工１鱈土
辿旦はＨＤ２ 、 （２）ｋｕｒｓｔａｋｉ １（Ｄｉ
、 （３）ｋｕｒｓｔａｋｉｌｌＤ７３． （４）ｉ
ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓＨＤ５６７、 （５）ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
のプラスミドアレイの各成分をドツトで示し、結晶性タ
ンパクをコードすると推定されるプラスミドのサイズ（
Ｍｄａで）を、右側の余白に示す。パネルＣ。
完全なβ工ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ、 ｔ
ｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ遺伝子を含有するｐＮＳＢＰ５４
４゜レーン３ 、 ｐ５４４ＰｓｔＳＣ０レーン４゜Ｂ
ａｍＨ１部位をもたないｐ５４４Ｐｓ ｔ４゜レーン５
．ｐ５４４Ｐｓ ｔ−Ｍｅ ｔ５゜レーン６、ＢａｍＨ
１部位をもたないｐ５４４Ｐｓｔ１３゜ 第４図は、サザンプロット分析である。β−ｔｈｕ−旦
■圏旦ｎ およびＬ 匹旦組み換え株Ｎ５ＢＰ５４４の
数珠のプラスミドＤＮＡ試料を０．６％アガロースゲル
で分離しくパネルＡ） 、 ３２Ｐで標識された０、７
ｋｂの内部のＥｃｏＲ■断片をプローブにした（パネル
Ｂ）。レーン１〜５は以下に示すＢ、 ｔｈｕｒｉｎ
１ｅｎ−１１株を含有していた。（１）−助工１鱈土
辿旦はＨＤ２ 、 （２）ｋｕｒｓｔａｋｉ １（Ｄｉ
、 （３）ｋｕｒｓｔａｋｉｌｌＤ７３． （４）ｉ
ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓＨＤ５６７、 （５）ｔｅｎｅｂ
ｒｉｏｎｉｓ ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ
のプラスミドアレイの各成分をドツトで示し、結晶性タ
ンパクをコードすると推定されるプラスミドのサイズ（
Ｍｄａで）を、右側の余白に示す。パネルＣ。
ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓより得た。精製さ
れたＤＮＡ （レーン１〜３）およびプラスミドＤＮＡ
試料 （レーン４〜６）調製物を、 ＢａｍＨＩ （
レーン１． ４） 、 ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２．５
）、影退Ｒ１（レーン３，６）で分解し、上記のプロー
ブでスクリーニングを行った。
れたＤＮＡ （レーン１〜３）およびプラスミドＤＮＡ
試料 （レーン４〜６）調製物を、 ＢａｍＨＩ （
レーン１． ４） 、 ＨｉｎｄＩＩＩ（レーン２．５
）、影退Ｒ１（レーン３，６）で分解し、上記のプロー
ブでスクリーニングを行った。
線形の分子量マーカーの相対移動度およびサイズ（ｋｂ
で）を左に示す。特異的なハイブリダイゼーションを表
す。断片のサイズ（ｋｂで）を右に示す。
で）を左に示す。特異的なハイブリダイゼーションを表
す。断片のサイズ（ｋｂで）を右に示す。
第５図はＢ、 ｔｈｕｒｉｎ １ｅｎｓｉｓ ｖａｒ
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびｖａｒ、 ｋｕｒ
ｓｔａｋｉＨＤ７３結晶性タンパク遺伝子を並べて、阻
水性プロフィールを比較したものである。（Ａ） ｖａ
ｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ７３ アミノ酸配列に
対し、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓのアミノ酸
配列を図面に並べた。数字はＮ末端側メチオニンから打
った。
、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓおよびｖａｒ、 ｋｕｒ
ｓｔａｋｉＨＤ７３結晶性タンパク遺伝子を並べて、阻
水性プロフィールを比較したものである。（Ａ） ｖａ
ｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ７３ アミノ酸配列に
対し、 ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓのアミノ酸
配列を図面に並べた。数字はＮ末端側メチオニンから打
った。
保存された残基については、垂直の線で示す。挿入され
た間隙は水平線で表す。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓ（Ｂ）およびｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ７
３（Ｃ）タンパクの阻水性プロフィールは、 ｋｙｌｅ
およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによって７個のアミノ酸のウ
ィンドウを用いて計算した（１９８２年、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、１５７：１０５−１３２） 、最適な
配列を行うため、阻水性プロフィールは、（Ａ）で示し
た間隙を含む。
た間隙は水平線で表す。ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉｏｎ
ｉｓ（Ｂ）およびｖａｒ、 ｋｕｒｓｔａｋｉＨＤ７
３（Ｃ）タンパクの阻水性プロフィールは、 ｋｙｌｅ
およびＤｏｏｌｉｔｔｌｅによって７個のアミノ酸のウ
ィンドウを用いて計算した（１９８２年、 Ｊ、 Ｍｏ
１． Ｂｉｏｌ、１５７：１０５−１３２） 、最適な
配列を行うため、阻水性プロフィールは、（Ａ）で示し
た間隙を含む。
第６図は、結晶性タンパク転写物の出現時間を示すもの
である。対数繁殖中期（レーンＩ）、定常初期またはｔ
ｚ （レーン２）、定常中期またはｔ７（レーン３）の
増殖段階で抽出した全ＲＮＡ （各５μｇ）を１．０
％アガロースゲルで分離した。結晶性タンパク特異性転
写物を、Ｂ、刊■セ１国旺圏ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子のｆ！ｃｏＲＩ断片の
０．７ ｋｂを用いて同定した。マーカーブロムモザイ
クウィルスＲＮＡ転写物のサイズ（ｋｂで）を左側の余
白に示す。
である。対数繁殖中期（レーンＩ）、定常初期またはｔ
ｚ （レーン２）、定常中期またはｔ７（レーン３）の
増殖段階で抽出した全ＲＮＡ （各５μｇ）を１．０
％アガロースゲルで分離した。結晶性タンパク特異性転
写物を、Ｂ、刊■セ１国旺圏ｖａｒ、 ｔｅｎｅｂｒｉ
ｏｎｉｓの結晶性タンパク遺伝子のｆ！ｃｏＲＩ断片の
０．７ ｋｂを用いて同定した。マーカーブロムモザイ
クウィルスＲＮＡ転写物のサイズ（ｋｂで）を左側の余
白に示す。
第７図は、結晶性タンパク抗原の出現時間を示す。種々
の増殖段階より抽出した全タンパク（各２５μｇ）を０
．１％５ＯＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し
た。混合物における結晶特異性抗原をイムノプロット分
析で同定した。クマシーブルーで染色したゲルをパネル
Ａに示し、対応するイムノプロットをパネルＢに示す。
の増殖段階より抽出した全タンパク（各２５μｇ）を０
．１％５ＯＳ−１０％ポリアクリルアミドゲルで分離し
た。混合物における結晶特異性抗原をイムノプロット分
析で同定した。クマシーブルーで染色したゲルをパネル
Ａに示し、対応するイムノプロットをパネルＢに示す。
対数増殖中期（レーンＩ）の細胞、定常初期すなわちｔ
ｏの細胞、定常期開始時点（レーン２）の細胞、定常前
期すなわち１．の細胞（レーン３）、定常中期すなわち
ｔ７（レーン４）の細胞から得たタンパクの試料を分析
した。レーン５は精製された結晶性タンパク調製物を５
０μｇ含有する。パネルＡのレーンＭは。
ｏの細胞、定常期開始時点（レーン２）の細胞、定常前
期すなわち１．の細胞（レーン３）、定常中期すなわち
ｔ７（レーン４）の細胞から得たタンパクの試料を分析
した。レーン５は精製された結晶性タンパク調製物を５
０μｇ含有する。パネルＡのレーンＭは。
タンパクの分子量基準を含有する。マーカーのサイズ（
ｋＤａで）を左側の余白に示す。微量７３ｋＤａ結晶性
成分の位置（パネルＢ中）矢印で示す。
ｋＤａで）を左側の余白に示す。微量７３ｋＤａ結晶性
成分の位置（パネルＢ中）矢印で示す。
ＦＩＧ、４Ａ
Ｆ Ｉ Ｇ、 ４８
ＦＩＧ。
Ｃ
ＦＩＧ、７
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ￥の７３ｋ
ｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目のアミノ酸を
コードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５
％の相同性があるヌクレオチド配列を含むクローン化Ｄ
ＮＡ配列であって、該ヌクレオチド配列が甲虫類の昆虫
に毒性のある約６５ｋｄのタンパクをコードする、クロ
ーン化ＤＮＡ。 ２、前記ヌクレオチド配列が￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥
ｔｈｕｒｉｎ−ｇｉｅｎｓｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓ￥の７３ｋｄ毒素タンパクの４７番目か
ら６４４番目のアミノ酸をコードする。 特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ部分。 ３、甲虫類の昆虫に対して毒性があり、Ｎ末端にメチオ
ニンを有する約６５ｋｄのタンパク。 ４、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅｂｒｉｏ￥−￥ｎｉｓ￥由
来のタンパクが実質的に夾雑していない、特許請求の範
囲第３項に記載のタンパク。 ５、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓ
ｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ￥の栄養細
胞において発現可能なクローン化遺伝子であって、甲虫
類の昆虫に対して毒性のある￥Ｂａｃｉｌ−ｌｕｓ￥
￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓ￥の７３ｋｄタンパクの遺伝子のプロモ
ータに対して、少なくとも９０％の相同性があるヌクレ
オチド配列を有するＤＮＡ部分と、コード領域とを含む
、クローン化遺伝子。 ６、前記コード領域が昆虫毒性タンパクをコードするＤ
ＮＡである、特許請求の範囲第５項に記載の遺伝子。 ７、前記昆虫毒性タンパクが、甲虫類の昆虫に対して毒
性があり、Ｎ末端にメチオニンを有する約６５ｋｄのタ
ンパクである、特許請求の範囲第６項に記載の遺伝子。 ８、前記昆虫毒性タンパクが、鱗翅類の昆虫に対して毒
性のある￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
ｎｓｉｓ￥ ＨＤ−１のタンパクである、特許請求の範
囲第６項に記載の遺伝子。 ９、前記昆虫毒性タンパクが鱗翅類の昆虫に対して毒性
のある￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｉｅｎｓ
ｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｋｕｒｓｔａｋｉ￥のタンパクであ
る、特許請求の範囲第６項に記載の遺伝子。 １０、前記昆虫毒性タンパクが、双翅類の昆虫に対して
毒性のある￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｉｅ
ｎｓｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｉｓｒａｅｌｉｅｎｓｉｓ￥の
タンパクである、特許請求の範囲第６項に記載の遺伝子
。 １１、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
ｓｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅｂｒｉｏ−ｎｉｓ￥の７
３ｋｄ毒素タンパクの４７番目から６４４番目のアミノ
酸をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも
７５％の相同性があるヌクレオチド配列を含むクローン
化ＤＮＡ配列を包含する遺伝子を有し、かつ発現する微
生物であって、該ヌクレオチド配列が甲虫類の昆虫に毒
性のある約６５ｋｄタンパクをコードする、微生物。 １２、前記微生物がグラム陰性生物である、特許請求の
範囲第１１項に記載の微生物。 １３、前記微生物が、￥Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｅａｅ、￥Ｐｓｅｕ￥−￥ｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ
￥、￥Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ￥、および￥Ｂｒａｄ
ｙｒｈｉｚｏ￥−￥ｂｉａｃｅａｅ￥からなる群より選
択されるグラム陰性生物である、特許請求の範囲第１１
項に記載の微生物。 １４、前記微生物が、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥の変種である、特許請求の範囲
第１１項に記載の微生物。 １５、甲虫類の昆虫に毒性のあるタンパクを発現し得る
微生物の調製方法であって、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥
ｔｈｕ−ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥ ｖａｒ．￥ｔｅｎｅ
ｂｒｉｏｎｉｓ￥の７３ｋｄ毒素タンパクの４７番目か
ら６４４番目のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列
に対して、少なくとも７５％の相同性があるヌクレオチ
ド配列を含むクローン化ＤＮＡ部分と、形質転換された
微生物中において構造遺伝子を発現させ得るプロモータ
とを含む遺伝子で微生物を形質転換させることを包含し
、該ヌクレオチド配列が甲虫類の昆虫に毒性のある約６
５ｋｄタンパクをコードする、調製方法。 １６、前記プロモータが、甲虫類の昆虫に毒性のある￥
Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥
ｖａｒ．￥ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ￥の７３ｋｄタン
パクの遺伝子のプロモータに対して、少なくとも約９０
％の相同性があるＤＮＡ部分である、特許請求の範囲第
１５項に記載の方法。 １７、前記微生物がグラム陰性細菌である、特許請求の
範囲第１５項に記載の方法。 １８、前記微生物が、￥Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ
ｃｅａｅ￥、￥Ｐｓｅｕ−ｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ￥
、￥Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ￥、および￥Ｂｒａｄｙ
ｒｈｉｚｏ￥−￥ｂｉａｃｅａｅ￥からなる群より選択
されるグラム陰性生物である、特許請求の範囲第１５項
に記載の方法。 １９、前記微生物が、￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥ ￥ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ￥の変種である、特許請求の範囲
第１５項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US10828587A | 1987-10-13 | 1987-10-13 | |
| US108285 | 1987-10-13 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0292287A true JPH0292287A (ja) | 1990-04-03 |
Family
ID=22321315
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63259289A Pending JPH0292287A (ja) | 1987-10-13 | 1988-10-13 | 抗甲虫類毒素およびその遺伝子 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0318143A3 (ja) |
| JP (1) | JPH0292287A (ja) |
| AU (1) | AU626804B2 (ja) |
| NZ (1) | NZ226442A (ja) |
| ZA (1) | ZA887480B (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5338544A (en) * | 1987-04-16 | 1994-08-16 | Ecogen Inc. | CryIIB protein, insecticidal compositions and methods of use thereof |
| US5073632A (en) * | 1987-04-16 | 1991-12-17 | Ecogen Inc. | CryIIB crystal protein gene from Bacillus thuringiensis |
| TR27832A (tr) * | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
| AU638438B2 (en) | 1989-02-24 | 1993-07-01 | Monsanto Technology Llc | Synthetic plant genes and method for preparation |
| US20010003849A1 (en) | 1989-08-07 | 2001-06-14 | Kenneth A. Barton | Expression of genes in plants |
| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| ATE174626T1 (de) * | 1991-08-02 | 1999-01-15 | Mycogen Corp | Neuer mikroorganismus und insektizid |
| FR2704860B1 (fr) * | 1993-05-05 | 1995-07-13 | Pasteur Institut | Sequences de nucleotides du locus cryiiia pour le controle de l'expression de sequences d'adn dans un hote cellulaire. |
| US5369027A (en) * | 1993-07-12 | 1994-11-29 | Plant Genetic Systems, N.V. | Bacillus thuringiensis strains toxic to diabrotica species |
| IL124020A (en) * | 1995-10-13 | 2003-05-29 | Dow Agrosciences Llc | Plant optimized nucleotide sequence that encodes an insecticidal crystal protein |
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|---|---|---|---|---|
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| US4764372A (en) * | 1985-03-22 | 1988-08-16 | Mycogen Corporation | Compositions containing bacillus thuringiensis toxin toxic to beetles of the order coleoptera, and uses thereof |
| AU590558B2 (en) * | 1985-04-30 | 1989-11-09 | Monsanto Company | Plant-colonizing microorganisms containing the toxin gene of b. thuringiensis as a chromosomal insertion |
| US4771131A (en) * | 1985-08-16 | 1988-09-13 | Mycogen Corporation | Cloning and expression of Bacillus thuringiensis toxin gene encoding a protein toxic to beetles of the order Coleoptera |
| TR27832A (tr) * | 1987-04-29 | 1995-08-31 | Monsanto Co | Zararli ucucu hasarata mukavim bitkiler. |
-
1988
- 1988-10-04 NZ NZ226442A patent/NZ226442A/xx unknown
- 1988-10-05 ZA ZA887480A patent/ZA887480B/xx unknown
- 1988-10-10 EP EP88309438A patent/EP0318143A3/en not_active Withdrawn
- 1988-10-12 AU AU23651/88A patent/AU626804B2/en not_active Ceased
- 1988-10-13 JP JP63259289A patent/JPH0292287A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU626804B2 (en) | 1992-08-13 |
| EP0318143A2 (en) | 1989-05-31 |
| AU2365188A (en) | 1989-04-13 |
| NZ226442A (en) | 1991-08-27 |
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| ZA887480B (en) | 1989-07-26 |
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