FR2679568A1 - Nouveau type de replicon gram-positif - construction de vecteurs recombinants le contenant. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un vecteur recombinant capable de se répliquer dans des bactéries gram positives, caractérisé en ce qu'il contient: a) un enchaînement nucléotidique I de Bacillus thuringiensis d'une taille d'environ 2,6 kb compris entre les sites BalI-HpaI ou, - tout fragment compris dans cet enchaînement dès lors qu'il permet la réplication du vecteur recombinant, lorsqu'il est sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez les bactéries gram-positives ou, - toute séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I ou du fragment ci-dessus, dans des conditions de forte stringence, et b) au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec l'enchaînement ci-dessus.

Description

Nouveau type de réplicon gram-positif - Construction de vecteurs recombinants le contenant
L'invention concerne un nouveau type de réplicon gram-positif et son utilisation pour la construction de vecteurs recombinants.

Les plasmides bactériens naturels se trouvent d'une manière générale être dotés d'un degré de stabilité élevé. S'ils sont répartis au hasard, la probabilité théorique (L) de produire une cellule exempte de plasmide est donnée par l'équation : L = (1/2)2n (où n est le nombre de molécules de plasmide par chromosome. On suppose que 2n copies du plasmide sont présentes immédiatement avant la division. Ainsi, des plasmides à nombre de copies élevé peuvent être maintenus de façon stable suivant une répartition aléatoire, alors que des mécanismes efficaces sont nécessaires pour empêcher la perte des plasmides à faible nombre de copies en l'absence d'une pression sélective (Nordstram et Austin, 1989 Annu. Rev. Genet.

23: 37-69).

Dans les bactéries gram-négatives, plusieurs systèmes comportant des fonctions de maintien des plasmides ont été décrits pour des plasmides à faible nombre de copies tels que F, Pl ou RI. Ils comprennent les systèmes hok/sok et ccd responsables de la destruction post-ségrégationnelle des cellules perdant des plasmides (Jaffé et al, 1985 J. Bacteriol. 163: 841-849; Gerdes et al, 1986 Mol. Microbiol. 4: 18071818), et des fonctions de partition vraie assurant que chaque cellule fille reçoit une molécule de plasmide (Austin et Nordstrom, 1990 Cell 60: 351-354). De plus, des fonctions auxiliaires qui permettent une répartition aléatoire des réplicons ont été décrites.

Des exemples comprennent le système de recombinaison site-spécifique de ColE1 (Summers et Sherrat, 1984 Cell 36: 1097-1103) et le locus par de pSC101 (Tucker et al, 1984 Cell 38: 191-201).

Dans les bactéries gram-positives, bien moins d'informations sont disponibles au sujet des fonctions requises pour un maintien stable des plasmides. Dans les plasmides à nombres faibles ou élevés de copies, qui se répliquent par un mécanisme à "cercle roulant", par un intermédiaire à ADN simple brin (te Riele et al, 1986a EMBO J. 5: 631-637, 1986b Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 83: 2541-2545; Gruss et Ehrlich, 1989 Microbiol.

Rev. 53: 231-241), la stabilité est couplée avec la réplication et non avec une fonction discrète. Pour différents plasmides connus pUB110, pTA1060, pMV158 (Bron et al, 1991b Plasmid 19: 231-241), et pLS11 (Chang et al, 1987 J. Bacteriol. 169: 3952-3962), les régions de stabilité sont les origines "négatives" contrôlant la conversion de l'ADN simple brin en ADN plasmidique à double brin. La réplication de ces plasmides est assurée par une protéine codée par le plasmide. Ces plasmides sont fréquemment instables du point de vue structural et ségrégationnel lorsqu'ils sont utilisés en tant que vecteurs de clonage, et ceci est probablement dû à leur mode particulier de réplication.

Une deuxième classe de réplicons gram-positifs comprend les grands plasmides à faible nombre de copies pTB19, pIP404 et pAMss1 (Imanaka et al, 1986 Mol. Gen.

Genet. 205: 90-96; Garnier et Cole, 1988 Plasmid 19: 151-160; Swinfield et al, 1990 Gene 87: 79-90). Leur réplication nécessite une protéine codée par le plasmide qui ne partage aucune homologie avec celle des plasmides dont la réplication fait intervenir un mécanisme à "cercle roulant". Ces plasmides n'accumulent pas d'ADN simple brin pendant la réplication (Garnier et Cole, 1988 Plasmid 19: 151-160;
Jannière et al, 1990 Gene 87: 53-61), et sont stables du point de vue structural (Jannière et al, 1990 Gene 87: 53-61).

Aucune information n'est disponible au sujet des fonctions de partition potentielles de ces plasmides à faible nombre de copies. Cependant, ces fonctions sont essentielles pour leur maintien dans les bactéries gram-positives sporulantes, telles que l'espèce
Bacillus. Pendant l'étape de différenciation de ces bactéries, le compartiment sporal représente seulement environ un sixième de la cellule, et la probabilité de produire une spore exempte de plasmide est : L = (5/6)2n. Une répartition aléatoire des plasmides pendant la sporulation peut par conséquent conduire à une perte drastique de réplicons (avec n < 10) dans la population de spores.

La bactérie sporulante gram-positive Bacillus thurinqiensis, est connue pour sa capacité à produire des toxines insecticides pendant la sporulation (Lereclus et al, 1989b Regulation of Procaryotic
Development. American Society for Microbiology,
Washington DC, 255-276). Ces protéines parasporales (6-endotoxines) sont chacune classifiées comme étant soit CryI, II, III ou IV en fonction de leur spectre d'activité à l'encontre des larves d'insectes (Hofte and Whiteley, 1989 Microbiol. Rev. 53: 242-255).

Différents gènes cry codant pour des 6-endotoxines actives à l'encontre de divers ordres d'insectes ont été clonés, et la transformation par électroporation rendent maintenant possible l'analyse de leur expression dans leur hôte naturel et la construction de souches obtenues par génie génétique présentant des propriétés améliorées pour la lutte contre les insectes. B thurunqiensis présente une série complexe de plasmides résidents dans la plupart des souches examinées (Gonzalez et al, 1981 Plasmid 5: 351-365;
Lereclus et al, 1982 Mol. Gen. Genet. 186: 391-398;
Kronstad et al, 1983 J. Bacteriol 154: 419-428). La présence largement répandue de ces plasmides suggère des fonctions de réplication et de stabilité très efficaces.A partir de cette constatation, des études de clonage et de caractérisation de petits plasmides cryptiques (Mahillon et al, 1988 Plasmid 19: 169-173;
Mahillon et Seurinck, 1988 Nucleic Acids Res. 16: 11827-11828; McDowell et al, 1991 Plasmid 25: 113-120) et l'isolement des régions de réplication de grands plasmides (Baum et al, 1990 Appl. Environ. Microbiol.

56: 3420-3428) et de deux plasmides plus petits pHT1000 et pHT1030 de respectivement 8,6 kb et 15 kb (Lereclus et al, 1988 FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422) ont été réalisés. pHT1030 a été étudié en raison de sa stabilité de ségrégation élevée dans B subtilis, et un fragment d'ADN de 2,9 kb incluant la fonction de réplication et de stabilité du pHT1030 a été utilisé pour construire le vecteur navette pHT3101 (Lereclus et al., 1989a FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218). Ce plasmide chimérique permet le clonage de grands fragments d'ADN qui sont maintenus de façon stable à la fois dans B subtilis et B thurinqiensis (Lereclus et al, 1989a FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218;
Debarbouillé et al, 1990 J. Bacteriol. 172: 3966-3973).

Dans le but de définir des moyens propres à la construction de vecteurs de clonage et le cas échéant de vecteurs d'expression adaptés à la transformation de bactéries et en particulier de bactéries à grampositif, les inventeurs ont identifié, au sein du fragment d'ADN de 2, 9 kb du plasmide pHT1030 (Lereclus et al 1989a FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218) un enchaînement de nucléotides d'environ 2,6 kb et au sein de cet enchaînement, différentes séquences spécifiques des fonctions de réplication et de stabilité de plasmides utilisés pour transformer des bactéries gram-positives.

L'identification de ces séquences spécifiques a permis de déterminer plus exactement quels pourraient être les éléments du fragment de 2,6 kb utilisables dans le cadre de la construction de vecteurs recombinants destinés au clonage et le cas échéant à l'expression de séquences dans des bactéries grampositives, en vue de moduler le comportement du vecteur dans son hôte, par exemple en vue de moduler la stabilité et le nombre de copies de tels vecteurs, dans une bactérie donnée. En effet les inventeurs ont constaté que la fonction de stabilité portée par le fragment de 2,6 kb peut être gênante dans certaines applications, comme la préparation d'un vecteur recombinant utilisé pour transformer des bactéries destinées elles-mêmes à être disséminées dans l'environnement.

Les résultats obtenus par les inventeurs dans le cadre de cette invention permettent donc d'envisager la construction de vecteurs pouvant être adaptés à des applications spécifiques.

Différents niveaux d'adaptation peuvent être envisagés compte tenu des connaissances acquises par les inventeurs : à titre d'exemple le degré de réplication de vecteurs recombinants construits sur la base de la présente invention dans des bactéries grampositives peut être modulé.

De même la stabilité ségrégationnelle de ces vecteurs peut être contrôlée en agissant sur certains paramètres déterminés.

Un autre avantage de l'invention résulte du fait que les vecteurs, utilisés pour transformer des bactéries gram-négatives et de façon particulièrement avantageuse, gram-positives, utilisent pour leur réplication, les protéines de l'hôte.

L'invention a donc pour objet un vecteur recombinant capable de se répliquer dans des bactéries gram-positives, et le cas échéant de fonctionner en temps que vecteur d'expression dans ces bactéries.

L'invention vise aussi les différents fragments nucléotidiques utilisables dans le cadre de la construction de vecteurs adaptés à la transformation de bactéries gram-positives, intervenant dans les fonctions de réplication et/ou de stabilité du vecteur construit. Entrent également dans le cadre de l'invention, des cellules hôtes transformées par les vecteurs ci-dessus définis ainsi que des compositions faisant intervenir des souches cellulaires transformées (transformants).

L'invention concerne aussi un procédé de préparation des vecteurs ainsi qu'un procédé de transformation des souches cellulaires.

Un vecteur recombinant capable de se répliquer dans des bactéries gram-positives, est caractérisé en ce qu'il contient
a) un enchaînement nucléotidique I de Bacillus thurinqiensis d'une taille d'environ 2,6 kb compris entre les sites BalI-HpaI et répondant à la séquence ci-dessous et délimité par les nucléotides 1 à 2642 ou,
- tout fragment compris dans cet enchaînement dès lors qu'il permet la réplication du vecteur recombinant, lorsqu'il est sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez les bactéries gram-positives ou,
- toute séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I ou du fragment cidessus, dans des conditions de forte stringence, et
b) au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec l'enchaînement ci-dessus.

Une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I ou d'un fragment de
I dans le cadre de l'invention, hybride dans des conditions de forte stringence définies par un milieu contenant 50% de formamide, 660 mM de chlorure de sodium, 66 mM de citrate de sodium, et une incubation pendant 12 heures à 42"C. CCATCCTCCAAAGTTGGAGAGTGAGTTTTATGTCGCAAATATTAATGTTTCTGGTGAACC 61
TTATCAAATTTTCGTTGATTTAATAGAAACATAGCGGTAAAATTAGCAGTAACTTAATAG 121 -35 -10
AACGGAAATGAAAAAAGCCACTCTCATATGCTATTGGCTACCAACCTTTAGCGAGAATGA 181
CTTAATCCTGTACAGCCATACAGGACTTCGACTTATAAGAGGCGCCAACCTCAAATAAGT 241
TATTTGCCTTGTTTTCGCGAACAAGGCTTATTAGATACACCTATTGTACCGTTACTCTAC 301
GAATATTTCCACTAGTAATTACTAGCATTGTCATATACATAATAAAACGGATATAAAAGG 361
GCGTTTTCTATACCTAGAAGTCTTGTAAATGTACAGGGCGTTTAGATATAGAGAACGCCC 421
TTTTTGTGTTCCGTTCCAGTGGAAGCTACCACTTTAAAAAGATGGTCTAGTGTAGCCAAT 481
GCAGGAGAGTACACTCGGATATCAGTTGTCGTTGCATTCAACTGTCTGACGTAAGCGAGG 541
TAAAGGACACAAGCCTTGCATAAAACAAGCCTACGGGATGTAAATCCTAATAATGATGAT 601
AACCAAGACGTTAGCGGCAAAAAGTGTTGGGGGTTCAAAATAAGACATGATTGTGCGACT 661
GGAGTTAAACAGTTACTCGTAAGCGGCGATCATGACACTGATTCACGGCTATTCTTGTAC 721
AAGCTTTATTACAAGGATATGCGGGTTATATAGCGAATCACCCGAAAGGGAACGGTGTTG 781
GGCGTGAGAAACGCACCGTACGGCGCAATACAATGCCAATAAGCTATATACGGACGGTAT 841
AGTAGTTTTGTAAGCTATAACCGTTTGTCGTCAATGCAACCAATCTCAATTCGAGACCTC 901
GGCATCTAAGCCAGTACGAATGAGTGGGCGTTTTAACCTCGTAAATTTTCAACAGGGGTT 961
ACTATGCCCAAAACTACATTCAGATTTCCTAACAAACTCGCCAGTATGAAAACCTTAAGA 1021
CCTTAAAGTCAAGGGATTTGAAGGATTTTAACCTCGATTAGCAAAAAATGTAGAGTACTG 1081
AAGGAACTACCATTAACTAAGATAGTGGGGGATTGAGGAAGAATCCAGAGCTGTTTAAAT 1141
CAAGTGAAAGACAAGATGAAATTAAAAGAATAGTGAAAGATAGGGGAGTGGTTCTCTATG 1201
AGAAAGGAAATGGCTAGAGAACAAAGGCAGCGGTTTATTGATCTATTGTTAGACTTTATG 1261
GTAAAGAATCCTCATTTATTTGTTAATGGTACAGAGGATGAAAGTAATAATGTTGTTACA 1321
AAATGTAATAGTGATATTAAAGAGGTTGCGGAGTCATATTTAACTCTTTTATAGTGAGAG 1381
GGTTAAAACTAATTAATATGTATTAACCCCCAATGTTGGAATTATTGTATTTCACTAGGC 1441
AACCTACTTACTAAAAGTAAGATTATCCATTAGTGGATGTTATAATATTGGGTTTTTTAA 1501
CACAATAATCATCGCCTTTCGGTGTCGTTTGATAGAAAAGTAACCATTAGGGATGAAAAA 1561
GTCAATATAAAAAGCCATCCGTAAAAAACGGATGGCTTACCGTACATAGGATCGTTGGTA 1621
GGGCGGCGTATCCTACATCTCTGGTAACTTACCTAGCCAATCAAATGCTTGAGAACGGCG 1681
GTTAGATAAGCGCGTGGGGAACCTTTCCCACCTCAAAGATCCTATATCATTATTATGTTA 1741
CTTTCTACAGGTAGTATACCATGTTCTTATATTTTAGTAAACTCCCCGTTAGCTTAACAG 1801
CTCTTTGTAAGCAATTAAACGTCCACTATTCAATCGTCTTTGGATTTTCGCAGGACCGTT 1861
TTTTAGATCGAACATAGTTGATAAGAACAAATAACCGCTTGGGTCCAACTTTATAGCAAT 1921
TAGTATATGGTCATTTAAAATCTTTACCAATTCAACGCTATTAGGTTCTTTAGGATTTTG 1981
CCCGACATAGTCGGGGTGTTCAACGATATCTTTTATGTGCGATGAATATTTTCATAAAAT 2041
ACCAGGATGTTGTTTCTTTACGTGCTTTATAAATCCGGGAAAGATTTTTACATCGTTAGA 2101
AGTGCAAGTCAAGTTATATGTATCTATAATGATTTGTGGAAGTTTTGCCACAACAGTTGG 2161
TTTATTTACAATCTTTTTTTTATTAGCCGTCAAATTTCTCCCTCATCTCGTCTCTTTATA 2221
TCTTTATTTTATCATAAAGGAGTATTTGAACCGTCGCGCGGGACAGGTTTATGATAGGGA 2281
TATTTTATTTAATAATTGATGGTATAAGGGACTTTCATGCTTGGAAAGTGGGGATTATGA 2341
ATTAGATGCTTGTCCACAATATGTTCCAATGTAACCAAAATTTATGTTCCCACCTTGACC 2401
AAACATCACGTCCATACTTAAATCGTCCCTCCTTTAATAGGTAAAATATTAATTTACCTT 2461
AATAAAAAAATAATGGATAATAGTATTCGTCTGAATTTATATAATCAGGGGGAACTATTG 2521
ATGCTGGGGATACTATTTACAGCGGCGCCATCTACTGATGTCGTAAAGGATTTGCAAGAT 2581
AAAGTTATATCATTGCAGGATCATGAGGTAGCGTTTTTGAACACCACGATATCTAATATG 2641
TT
La souche de B thuringiensis dont provient l'enchaînement nucléotidique I est la souche décrite dans la publication de Lereclus et al 1988 (FEMS
Microbiol. Lett. 49: 417-422).

La fonction de réplication, déterminée par la séquence ci-dessus, peut être modulée par le choix du promoteur. Ce promoteur peut soit être le promoteur présent dans le fragment de 2,6 kb, ou tout promoteur capable de fonctionner dans des bactéries grampositives et de préférence un promoteur fort du type veq (Moran et al Mol Gen. Genet. 186: 339-346).

Une séquence propre à la réalisation de l'invention, définie par sa capacité d'hybridation avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I, est capable de se lier avec cet enchaînement ou un fragment précité dans des conditions de forte stringence données ci-dessus.

On appelle séquence complémentaire dans le cadre de cette invention, par rapport à une séquence nucléotidique donnée, une séquence inverse complémentaire par rapport à cette séquence nucléotidique. Le terme "inverse" rend compte de la restauration de l'orientation 5' - 3' de l'acide nucléique, qui est aussi complémentaire par la nature des nucléotides qu'il contient, à la séquence de base donnée.

Une séquence dite "séquence d'ADN d'intérêt" est une séquence susceptible de présenter un intérêt économique ou un intérêt dans le cadre de recherches, que l'on cherche à cloner, ou encore à exprimer dans un hôte cellulaire qui peut être son hôte naturel ou encore une souche différente présentant un intérêt pour ses propriétés.

A titre d'exemple, parmi des séquences d'ADN d'intérêt, on cite la séquence d'ADN codant pour les 6-endotoxines de B thuringiensis, qui sont à l'origine de la production de cristaux ayant une activité toxique vis à vis de larves d'insectes. A cet égard on désigne plus particulièrement les séquences d'ADN appelées
CryI, CryII, CryIII ou CryIV décrites dans la publication de Hôfte and Whiteley (1989 Microbiol. Rev.

53: 242-255) ou tout autre gène Cry codant pour une 6endotoxine présentant une activité insecticide.

D'autres séquences d'ADN d'intérêt sont des séquences qui peuvent être produites dans des bactéries gram-positives à l'échelle industrielle par exemple par fermentation ou d'autres procédés. A titre d'exemple on cite les enzymes telles que des protéases, lipases, amylases et hormones protéiques.

D'autres séquences d'intérêt sont constituées par des séquences hétérologues par rapport à l'hôte cellulaire.Par exemple on peut citer des séquences codant pour des antigènes bactériens utilisables comme immunogènes, pour des antigènes viraux, par exemple l'antigène HBs ou encore pour des antigènes de parasites tels que ceux de P. falciparum.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant précédemment défini contient
- soit un fragment II compris dans l'enchaînement nucléotidique I et caractérisé en ce qu'il est limité par les sites BalI-AflII (nucléotides 1 à 1016) ou
BalI-ScaI (nucléotides 1 à 1076) d'une longueur d'environ 1 kb chez B thurinqiensis, capable d'assurer la réplication autonome du vecteur recombinant formé,
- soit une séquence hybridant dans des conditions de stringence forte avec le fragment II et,
- au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec le fragment ci-dessus.

La présence de ce fragment désigné par II assure la réplication autonome du vecteur recombinant formé et ce dans des bactéries gram-positives dont les protéines hôtes sont utilisées pour cette réplication.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le vecteur recombinant contient en phase avec un promoteur fonctionnel dans les bactéries grampositives,
- un fragment d'ADN (encore désigné par le terme réplicon) compris dans ltenchaînement I précédent et dans l'enchaînement II précédent, et correspondant à la séquence nucléotidique III délimitée par des sites
SpeI-AflII comprenant les nucléotides 312 à 1016 et d'une longueur d'environ 705 pb chez B thurinqiensis, ou un fragment hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence III dans des conditions de forte stringence, ou encore un fragment modifié par rapport à la séquence III, dès lors que ce fragment permet la réplication du vecteur formé chez une bactérie gram-positive, lorsqu'il est placé sous le contrôle d'un promoteur et,
- au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec le réplicon.

Pour être fonctionelle s'agissant de la réplication du vecteur, la séquence nucléotidique III doit être placée sous le contrôle d'un promoteur, orienté dans le même sens que la séquence III.

Les séquences I, II et III contiennent un fragment d'acide nucléique d'environ 70 nucléotides, comportant une séquence symétrique, dont le centre de symétrie est localisé à la position 390 des nucléotides. Cette séquence comprise entre les nucléotides 355 et 424 est imparfaitement symétrique et comprend elle-même une séquence symétrique comprise entre les nucléotides 395 et 421 dont le centre de symétrie est situé à la position 408.

L'efficacité de la réplication du vecteur recombinant selon l'invention, peut être assurée par l'utilisation d'un promoteur en phase avec l'enchaînement III, permettant la réplication autonome de ce vecteur et correspondant à ou compris dans la séquence nucléotidique IV délimitée par les sites
BalI-NdeI, comprenant les nucléotides 1 à 146 chez B thuringiensis, ou un promoteur constitué par une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence IV, ou encore une séquence modifiée par rapport à la séquence IV, dès lors qu'elle définit un promoteur fonctionnel dans les conditions ci-dessus, lorsqu'il est en phase avec le réplicon.

Un autre vecteur recombinant selon l'invention est caractérisé en ce qu'il contient, outre la séquence III ou ses dérivés tels que précédemment définis
- soit une séquence contenant des éléments nécessaires à la réplication autonome du vecteur recombinant formé dans une bactérie gram-positive et des éléments contribuant à la stabilité ségrégationnelle du vecteur, cette séquence correspondant à ou étant comprise dans la séquence nucléotidique V délimitée par les sites BalI-SspI ou BalI-SpeI comprenant respectivement les nucléotides 1 à 304 et 1 à 314 chez B thurinqiensis,
- soit une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence V,
- soit une séquence modifiée par rapport à la séquence V, dès lors qu'elle conserve les propriétés fonctionnelles de réplication autonome et de stabilité de la séquence V au sein du vecteur.

L'invention concerne également un vecteur recombinant répondant à l'une des définitions décrites ci-dessus, caractérisé en ce qu'il contient en outre un fragment d'ADN assurant le maintien stable du vecteur recombinant chez une bactérie gram-positive, ce fragment correspondant
- soit à la séquence nucléotidique VI délimitée par les sites HaeIII-HpaI comprenant les nucléotides 1408 à 2642 et, d'une longueur d'environ 1234 pb chez
B thuringiensis, ou à toute partie de la séquence VI contribuant au maintien stable dans une bactérie, en particulier un fragment comprenant l'enchaînement
HaeIII-AccI de la séquence VI d'environ 351 pb,
- soit à un fragment d'ADN modifié par rapport aux fragments ci-dessus, dès lors qu'il conserve la capacité de la séquence VI de conférer la stabilité au vecteur formé,
- soit à un fragment hybridant avec la séquence complémentaire des fragments ci-dessus.

Le maintien du vecteur recombinant dans une bactérie gram-positive peut être important selon les applications auxquelles ce vecteur est destiné.

Par exemple si l'on transforme des bactéries gram-positives avec un vecteur de l'invention comprenant une séquence que l'on souhaite cloner ou exprimer à un niveau élevé, il est important que le vecteur soit stable. La stabilité recherchée peut être une stabilité structurale ou une stabilité ségrégationnelle, cette dernière étant conférée ou à tout le moins augmentée par la présence de la séquence VI ou d'un fragment de cette séquence dans les conditions définies ci-dessus.

Différents vecteurs peuvent être utilisés pour la réalisation de l'invention. On aura de façon avantageuse recours à un vecteur du type plasmide et notamment un vecteur faisant intervenir, outre les éléments décrits ci-dessus, tels qu'obtenus à partir de
B thuringiensis, des éléments de plasmides tels que PUC18, ou PUC19.

Un vecteur recombinant selon l'invention peut en outre contenir un système de sélection spécifique permettant de sélectionner les bactéries gram-positives contenant le vecteur recombinant après transformation.

Un tel système peut être constitué par un gène codant pour une enzyme nécessaire au métabolisme de la bactérie transformée. A cet égard il peut s'agir de gènes permettant la synthèse de métabolites comme le tryptophane, l'uracile ou la thymine, ou de gènes permettant l'utilisation de sucres.

Le système de sélection peut aussi être constitué par un gène permettant une sélection colorée des clones recombinants, comme les gènes lacZ ou XylE ou par un gène de résistance à un antibiotique donné, par exemple un gène de résistance à l'érythromycine ou à l'ampicilline.

Ce dernier type de système de sélection est choisi de préférence lorsque les transformants (bactéries transformées par le vecteur de l'invention) ne sont pas destinées à être disséminées dans l'environnement.

Un vecteur recombinant préféré dans le cadre de l'invention est le plasmide pHT315 déposé le 7 Juin 1991 à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de
Microorganismes à Paris France) sous le numéro I-llll.

Ce plasmide qui lorsqu'il est intégré dans une bactérie du type B thurinqiensis ou B subtilis peut produire un nombre de copies d'environ 15, peut être également utilisé comme plasmide de départ, et être modifié, par exemple par incorporation de gènes d'intérêt dont on a parlé plus haut.

Un autre vecteur intéressant dans le cadre de l'invention, est le plasmide pHT3120 contenant la séquence d'ADN IV d'environ 1000 pb BalI-AflII, ou la séquence BalI-ScaI d'environ 1076 pb de B thurinaiensis, recombinée avec la séquence d'ADN, d'environ 1234 pb HaeIII-HpaI de B thuringiensis.

Dans un mode de réalisation préférée de l'invention, le plasmide recombinant comporte au moins deux 2 séquences d'ADN d'intérêt chacune d'elles étant sous le contrôle d'un promoteur de clonage et le cas échéant z ' d'expression, fonctionnel chez des bactéries gram-positives.

L'utilisation des enchaînements nucléotidiques qui ont été décrits dans les pages précédentes, pour cloner et le cas échéant exprimer des séquences d'ADN d'intérêt, nécessite que ces séquences nucléotidiques soient en position cis par rapport aux séquences d'ADN d' intérêt.

L'invention se rapporte également aux différentes séquences nucléotidiques qui ont été décrites ci-dessus sous les références I, II, III, IV, V et VI et qui sont définies dans les termes suivants
* un enchaînement nucléotidique I de B thuringiensis d'une taille d'environ 2,6 kb compris entre les sites BalI-HpaI de la séquence ci-dessous ou,
- tout fragment compris dans cet enchaînement dès lors qu'il permet la réplication du vecteur recombinant, lorsqu'il est sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez les bactéries gram-positives ou;
- toute séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement ou du fragment cidessus, dans des conditions de forte stringence;;
* un fragment d'ADN inclus dans l'enchaînement I et caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment limité par les sites BalI-AflII ou BalI-ScaI d'environ 1016 pb (1,016 kb) de B thurinqiensis, capable d'assurer la réplication autonome du vecteur recombinant formé, ou toute séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec le fragment ci-dessus;;
* un fragment d'ADN ou réplicon compris dans la séquence I et caractérisé en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il est compris dans la séquence nucléotidique
III délimitée par des sites SpeI-AflII comprenant les nucléotides 312 à 1016 chez Bacillus thuringiensis, ou d'un fragment hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence III ou encore d'un fragment modifié par rapport à la séquence III, dès lors que ce fragment permet la réplication d'un vecteur recombinant dans lequel il est intégré, chez une bactérie gram-positive, lorsqu'il est en phase avec un promoteur; ;
* un promoteur caractérisé en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique IV délimitée par les sites BalI-NdeI comprenant les nucléotides 1 à 146 chez B thuringiensis, ou correspondant à une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence IV ou encore d'une séquence modifiée par rapport à la séquence IV, dès lors que le promoteur formé conserve sa capacité de permettre la réplication autonome d'un vecteur recombinant, lorsqu'il est en phase avec le réplicon;;
* une séquence nucléotidique comprise dans l'enchaînement I et comprenant elle-même un promoteur contenant des éléments permettant la réplication d'un vecteur recombinant le contenant chez une bactérie gram-positive et des éléments contribuant à conférer à ce vecteur sa stabilité ségrégationnelle, caractérisé en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il est compris dans la séquence V délimitée par les sites BalI-SspI ou BalI-SpeI comprenant respectivement les nucléotides I à 304 et 1 à 314 chez B thurinqiensis, ou une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence V, ou encore une séquence modifiée par rapport à la séquence V dès lors qu'elle conserve des propriétés fonctionnelles de réplication autonome et de stabilité de la séquence
III;;
* un fragment d'ADN capable de conférer à un vecteur recombinant sa capacité de se maintenir de façon stable chez une bactérie gram-positive ou d'augmenter la stabilité de ce vecteur, lorsqu'il est introduit chez une bactérie gram-positive, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence nucléotidique VI délimitée par les sites HaeIII-HpaI comprenant les nucléotides 1408 à 2642, d'une longueur d'environ 1234 pb chez B thurinqiensis, ou comprenant l'enchaînement
HaeIII-AccI de la séquence VI d'environ 351 pb ou un fragment d'ADN modifié par rapport aux fragments cidessus, dès lors qu'il conserve les propriétés de la séquence VI s'agissant de la stabilite d'un vecteur le contenant chez une bacterie gram-positive, ou encore un fragment hybridant avec la séquence complémentaire des fragments ci-dessus.

L'invention vise aussi une bactérie gram-positive caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant répondant aux définitions données dans les pages précédentes.

Ces bactéries transformées peuvent être des bactéries telles que Bacillus thuriniensis ou Bacillus subtilis, modifiées pour cloner en un nombre de copies supplémentaires, des séquences d'ADN codant par exemple pour des protéines du cristal ou 6-endotoxines.

D'autres z autre bacillus pouvant être transformés sont par exemple B cereus, B sphaericus ou B meqaterium.

Les moyens de l'invention sont donc adaptés à la réalisation de bactéries gram-positives recombinantes propres au clonage et le cas échéant à l'expression d'un ADN d'intérêt.Des bactéries ainsi obtenues peuvent avoir des applications dans l'industrie pour produire de grandes quantités d'ADN ou de protéines , par exemple dans des procédés faisant intervenir des étapes de fermentation, auxquels se prêtent des bactéries comme B thuringiensis, ou pour la production de compositions à usage médical.

L'invention vise notemment toute bactérie recombinante capable d'exprimer des antigènes ou des immunogènes bactériens, des antigènes viraux tels que l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (HBs), des antigènes ou immunogènes de HIV, des antigènes de parasites tels que ceux de P. falciparum.

L'invention a aussi pour objet une composition larvicide active contre les larves d'insectes, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif, des bactéries transformées selon le mode décrit précédemment, dans lesquelles la séquence d'intérêt est un gène de cristal codant pour une 6-endotoxine active contre les lêpidopères, les coléoptères ou les diptères, notamment le gène cryI, le gène CryII, le gène CryIII ou le gène cryIV.

D'une manière générale, les vecteurs recombinants selon l'invention peuvent être appliqués à la production de toxines, en particulier de polypeptides toxiques vis à vis de larves d'insectes et en particulier vis à vis de lépidoptères, de coléoptères ou de diptères, cette production de toxines étant effectuée par l'intermédiaire de microorganismes de type bactéries gram-positives.

Les souches ainsi transformées constituent des biopesticides.

Une autre application des vecteurs et séquences nucléotidiques selon l'invention est le clonage de séquences d'ADN choisies. Ces séquences clonées peuvent être ensuite utilisées dans des hôtes cellulaires déterminés, pour construire des souches recombinées par exemple des souches de E.coli recombiné.

Les procédés de transformation de cellules que ce soit des bactéries ou d'autres types de cellules avec le vecteur recombinant selon l'invention sont les techniques habituellement mises en oeuvre et telles que décrites dans les exemples.

On pourra donc avoir recours à une technique telle que l'éîectroporation décrite par Lereclus et al (1989
FEMS Microbiol Lett. 60: 211-218).

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et dans les figures qui suivent.

FIGURES
Figure 1 (1A et 1B) : Séquence nucléotidique du fragment de restriction BalI de pHT1030 et séquences d'acides aminés déduites d'orfl (figures 1A et 1B) et orf2 (figure 1A).

Les séquences inversées répétées susceptibles de former une structure en tige et boucle sont soulignées par des flèches. Les régions -35 et -10 du promoteur putatif, trouvé dans le locus spbA, sont soulignées. Le site de fixation des ribosomes et le codon de démarrage potentiel de la traduction de spbB sont représentés en caractère gras. Les astérisques indiquent le codon d'arrêt de traduction.

Figure 2 : Construction des dérivés de délétion du pHT1030 et analyse de leur réplication et de leur stabilité dans les Bacilli.

Dans la partie supérieure de la figure, le vecteur sonde d'origine de réplication pHT181 décrit dans le texte est représenté. Les sites de restriction utilisés pour cloner le fragment d'ADN de 1,2 kb portant le gène Emr dans pUC18 sont entre parenthèses.

La localisation et l'orientation des gènes de l'érythromycine (Emr) et de la p-lactamase (Apr) sont indiquées par des flèches.

Les différents fragments de restriction du pHT1030 cloné dans les sites de clonage du pHT181 pour donner les plasmides pHT3103 à pHT3130 sont indiqués sous la carte de pHT181. Ces plasmides sont construits par élution du fragment de restriction approprié à partir de gels d'agarose et clonage dans pHT181 coupé par les enzymes appropriées.Les plasmides recombinants portent les fragments de restriction suivants pHT3130, le fragment BalI de 2,9 kb entier de pHT1030; pHT3130tHpaII, le fragment BalI dans lequel le site
HpaII est retiré (voir texte) ; pHT3120, le fragment
BalI-ScaI de 1,1 kb et le fragment HaeIII-BalI de 1,5 kb cloné de façon contiguë; pHT3115, le fragment NdeI
BalI de 2,7 kb; pHT3114, le fragment HaeII de 2,3 kb; pHT3113a et b, le fragment SspI de 1,2 kb; pHT3112a et b, le fragment SpeI-BalI de 2,6 kb; pHT3llla et b, le fragment Hindîli-BalI de 2,2 kb; pHT3110, le fragment
AccI-BalI de 1,1 kb; pHT3109, le fragment BalI-HpaI de 2,6 kb; pHT3108, le fragment BalI-HapII de 2,1 kb; pHT3107, le fragment BalI-XhoII de 1,7 kb; pHT3106, le fragment BalI-HaeIII de 1,4 kb; pH3105a et b, le fragment BalI-ScaI de 1,1 kb; pHT3104a et b, le fragment BalI-AflII de 1 kb, et pHT3103, le fragment
BalI-HindIII de 0,7 kb. Toutes les constructions ont été vérifiées par la cartographie de restriction des plasmides recombinants. La localisation et l'orientation des séquences orfl et orf2 sont représentées par un compartiment et une flèche, comme indiqué par la séquence nucléotidique représentée sur la Fig. 1. Les flèches convergentes symbolisent les groupes de séquences répétées inversées. p et la flèche indiquent la position et l'orientation du promoteur lacZ de pUC18.

Construction du plasmide pHT3120
Le plasmide pHT3130 (Fig. 2) est digéré, d'une part avec les enzymes KpnI et ScaI et d'autre part, avec les enzymes HaeIII et BamHI. Le fragment de restriction de 1,1 kb KpnI-ScaI (contenant le segment
BalI-ScaI de la région de réplication) et le fragment de restriction de 1,5 kb HaeIII-BamHI (contenant le segment HaeIII-BalI de la région de stabilité) sont respectivement obtenus et purifiés séparément à partir d'un gel d'agarose. Les deux fragments de restriction sont ligaturés ensemble en présence du vecteur pHT181 digéré par les enzymes KpnI et BamHI et en présence d'ADN ligase.

Le mélange de ligature est utilise pour transformer la souche d'E.coli TG1 et les clones recombinés sont sélectionnés sur milieu LB contenant de l'ampicilline (100 Ag/ml) et du X-gal. Parmi les transformants, une colonie blanche Apr a été isolée, et l'analyse de son ADN plasmidique indique que le clone porte un plasmide ayant la carte de restriction attendue. Ce plasmide appelé pHT3120 ne contient pas le fragment de 0,3 kb ScaI-HaeIII du pHT3130.

La réplication de chacun des dérivés de délétion du pHT1030 a été testée par transformation de B subtilis et B thurinqiensis. + indique que des clones transformants résistant à l'érythromycine ont été obtenus ; - indique qu'il n'a pas été obtenu de transformants Emr. La stabilité de ségrégation de chacun des plasmides recombinants a eté testée dans B subtilis (B.s) et B thuringiensis (B.t) dans un milieu
LB comme décrit dans les Modes Opératoires
Expérimentaux. Les pourcentages des clones qui étaient
Emr après environ 25 générations (pour B subtilis) et 40 générations (pour B thuringiensis) sans pression de selection ont été indiqués. NT : non testé.

Figure 3 : Analyse de la production d'ADN simple brin dans des cellules contenant des dérivés de délétion du pHT1030.

Des lysats cellulaires de B subtilis contenant pHV33 (voies A et A'), pHT3130 (voies B et B') ou pHT3104a (voies C et C'), et de B thuringiensis contenant pHT3130 (voies D et D') ou pHT3104a (voies E et E') ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose.

Le gel 1 a été transféré sur un filtre de nitrocellulose après dénaturation et le gel 2 sans dénaturation. Les filtres ont été ensuite hybridés à pUC18 marqués au 32P qui contient des sequences d'ADN également présentes dans tous les plasmides analysés.

La figure représente les autoradiographies obtenues après exposition. ss, sc, oc et hmw indiquent respectivement les formes simple brin, superhélicoïdale, ouvert-circulaire (ou dimère), et de masse moléculaire élevée de l'ADN de pHV33.

Figure 4 : Expression du gène spbB dans un système de transcription-traduction in vitro dlE. coli.

L'autoradiographie des polypeptides marqués à la [- 5S]-méthionine, separés sur un gel d'acrylamide à 12,5%, produit à partir de : voie 1, pHT181 ; voie 2, pHT3109 ; voie 3, pHT3114 : voie 4, un fragment BstUI de 464 bp isolé de pHT3130 et contenant le gène spbB; voie 5, ou le fragment BstUI de 462 bp isolé à partir du pHT313OtHpaII et contenant un gène spbB interrompu.

Erm, Bla et SpbB indiquent respectivement les produits des gènes erm, bla et spbB. La taille des marqueurs de masse moléculaire des peptides est indiquée (kDa).

Figure 5 Stabilité de ségrégation des dérivés de délétion du pHT1030 pendant la croissance végétative.

Des cellules en croissance exponentielle de B subtilis (tableau A) et B thurinqiensis (tableau B) portant divers plasmides ont été évaluées pour leur stabilité de ségrégation dans un milieu BHI nonsélectif comme décrit dans les Modes Opératoires
Experimentaux. Il n'a pas eté observé de différences significatives dans les taux de croissance entre les cellules abritant les divers plasmides. Le symbole pour chaque plasmide est indiqué dans le tableau B.

Figure 6 : Stabilité de ségrégation des dérivés de délétion du pHT1030 pendant la sporulation.

Des cellules en sporulation de B subtilis (tableau
A) et de B thuringiensis (tableau B) portant divers plasmides ont été évaluées pour la stabilité du plasmide dans un milieu SP ou HCT non-sélectif comme décrit dans les Modes Opératoires Expérimentaux. Le symbole utilisé pour chaque plasmide est indiqué sur la
Fig. 5.

Figure 7 : Construction des variants de pBC16 portant des régions du locus spbB.

La carte physique du plasmide recombinant pHT1618 est représentee à la partie supérieure de la figure.

Les régions de réplication du pBC16 et du pUC18 sont marquées respectivement ori.Bc et ori.Ec. Les positions et les orientations des gènes conférant la résistance à la tétracycline (Tetr) et à l'ampicilline (Apr) sont indiquées par des flèches. Les sites de restriction utilisés pour le clonage du pBC16A1 (segment EcoRI de 2,9 kb dont les extrémités ont été remplies par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase
I) dans pUC18 sont entre parenthèses.

L'organisation physique et génétique du fragment d'ADN BalI est représentée conformément aux résultats decrits dans le texte. spbA et spbB montrent les positions des loci. ori.Bt représente le réplicon minimal du pHT1030. Les autres symboles sont tels que décrits dans la légende de la Fig. 2.

Les traits pleins représentent les segments du fragment BalI cloné dans les sites de clonage du pHT1618 pour donner les plasmides pHT1609 à pHT1611
Les segments d'ADN ont été purifiés séparément à partir du gel d'agarose et clonés dans pHT1618 coupé par les enzymes appropriées. pHT1611 porte le fragment HindIII-HindIII de 2,2 kb isolé à partir de pHT3130 et correspondant au fragment HindIII-BalI de 2,2 kb du pHT1030 (le deuxième site HindIII provient du polylinker de pHT3130). pHT1611tHpaII porte le fragment HindIII-HindIII de 2,2 kb isolé à partir du pHT3130AHpaII. pHT1610 porte le fragment AccI-BalI de 1,1 kb et pHT1609 porte le fragment ScaI-HpaI de 1,6 kb du pHT1030. Les constructions ont été vérifiees par cartographie de restriction des plasmides recombinants.

p et la flèche indiquent la position et l'orientation du promoteur lacZ du pUC18.

Figure 8 : Stabilité des variants pBC16 portant les régions de spbB.

Des cellules en croissance exponentielle de B subtilis abritant divers plasmides ont été évaluées pour la stabilité de ségrégation dans un milieu BHI nonsélectif comme décrit dans les Modes Opératoires
Expérimentaux. Le symbole de chaque plasmide est indiqué sur la figure.

Figure 9 : Elimination du site Hindili du pET1035 et sélection de variants à nombre de copies élevé.

Le site HindIII du pHT1035 a eté éliminé comme indiqué dans la première partie de la figure. La mutagenèse in vitro du pHT11035#HindII a été effectuée par traitement par l'hydroxylamine comme décrit auparavant (Humphreys et al, 1976 Mol. Gen. Genet. 145: 101-108). 20 g de l'ADN traité ont été utilisés pour transformer la souche JM83 d'E. coli. Approximativement dix mille clones résistant au Cm (5 pg/ml) ont été rassemblés et 1'ADN plasmidique a été extrait. Par la suite, des cellules de B subtilis compétentes ont été transformées par environ 10 g d'ADN plasmidique et étalées sur de la gélose LB contenant 25 iig de Cm par ml. A partir d'environ cent clones Cmr obtenus, quatorze ont été testés pour leur teneur en plasmides.

L'électrophorèse sur gel d'agarose des préparations d'ADN a indiqué que neuf d'entre eux abritaient des plasmides avec un nombre de copie supérieur au plasmide parental pHTl035L:HindIII. Deux clones abritant des plasmides avec des nombres de copies intermédiaires et élevés ont été sélectionnés. Les flèches au-dessus de "cat" et "oriEc" indiquent respectivement le sens de transcription du gène cat et le sens de réplication de pBR322. La double flèche au-dessus de "oril030" indique que l'orientation de la réplication du pHT1030 n'est pas connue. Les sites de restriction uniques des plasmides sont présentes en caractères gras.

Figure 10 : Construction des vecteurs navettes pHT304, pHT315 et pHT370.

Le fragment d'ADN de HpaI-BalI de 2,6 kb portant les régions de réplication et de stabilité du pHT1030 a été isolé et purifié séparément à partir de pHT1035SHindIII, pHT1035-15SHindIII et pHT1035-70 SHindIII. Un fragment KpnI- BamHI de 1,2 kb portant le gène erm constitutif provenant de Tnl545 (Trieu-Cuot et al, 1990 Nucleic Acids Res. 18: 3660) a été isolé sous la forme d'un fragment Asp718-BamHI et les extrémités ont été rendues franches avec Pollk. Chaque fragment
HpaI-BalI a été cloné au niveau du site SspI du pUC19 avec le fragment contenant le gène erm par une triple ligature.Les trois mélanges de ligature ont été utilisés séparément pour transformer la souche JM83 d'E. coli, et les clones recombinants ont été sélectionnés sur des boîtes de gélose LB contenant Ap (100 ssg/ml) et Er (150 g/ml). Les vecteurs navettes, pHT304, pHT315 et pHT370, dans lesquels les différents fragments d'ADN sont clonés à la même place dans la même orientation ont été sélectionnés par cartographie de restriction. Les sites détruits au niveau des jonctions franches sont représentés entre parenthèses.

Les flèches au-dessus de "ErR", "ApR" et devant "lacZpo" indiquent respectivement le sens de transcription des gènes erm, bla et lacZ. Le nombre de copies du plasmide dans B thurinqiensis est indiqué pour chaque vecteur. Les autres symboles sont tels que décrits dans la légende de la figure 9.

Figure 11 : Analyse des protéines des transformants de
B thuringiensis exprimant le gène cryIIIA.

Des préparations de spores-cristaux ont été obtenues et analysées par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie comme cela a été décrit auparavant (Lereclus et al, 1989a FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218). Un volume identique d'echantillon (20 pl) a été chargé dans chaque puits. Voies 1, 2, 3, 4 souche kurstaki HD1 Cry-B contenant respectivement pHT315 ; pHT304ncryIIIA ; pHT315QcryIIIA et pHT370ncryIIIA. Voie 5 : marqueurs de masse moléculaire. Les flèches indiquent les composants de 73 et 67 kDa des cristaux.

EXEMPLES 1ER EXEMPLE
ANALYSE DE LA SéQUENCE NUCLEOTIDIQUE DU REPLICON pHT1030
Le fragment d'ADN BalI de 2,9 kb contenant la région de réplication du pHT1030 (Lereclus et al, 1988
FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422) a été inséré dans les deux orientations dans le site SmaI du vecteur pUC18 et différents fragments d'ADN ont été sous-clonés dans les phages M13mpl8 et M13mpl9 pour le sequençage.

Des deletions chevauchantes ont été également obtenues à partir du fragment BalI entier cloné dans Ml3mpl9 en utilisant la technique de Dale et al, (1985, Plasmid 13: 31-40). La synthèse d'amorces oligonucléotidiques spécifiques, déduites des résultats du séquençage préliminaire, a permis d'obtenir davantage d'informations sur les séquences à partir de phages recombinants appropries utilisés en tant que matrices.

La séquence nucléotidique complète (Fig. 1) du fragment
BalI de 2872 bp a été déterminée sur les deux brins d'ADN. La teneur globale en dA + dT du fragment d'ADN, 63%, est très proche de celle du chromosome de B thurinqiensis : 63,6% (Kaneko et al, 1978 Microbiol.

Immunol. 22: 639-641).

La séquence comprend deux séquences majeures répétées complémentaires inversées, qui ont pu former des structures d'ARN tige-boucle potentiellement stables. La plus grande des deux régions comprend 70 nucléotides avec un centre de symétrie situé au niveau de la position nucléotidique 390. L'énergie libre d'interaction calculée conformément à Tinoco et al (1973, Nature (London) New Biol. 246: 40-41) est de -156,5 kJ/mole. Les deux sequences symetriques sont répétées imparfaitement, et la cartographie de la région d'ADN sur la figure 1A entre les positions 392 et 425 elle-même contient une paire de séquences répétées inversées ayant une énergie libre d'interaction calculée de -66,1 kJ/mole.Le deuxième groupe majeur de séquences complementaires est situé entre les positions 1572 et 1598. Onze nucléotides sont répétés parfaitement et peuvent former une structure tige-boucle avec une énergie libre d'interaction calculée de -95,4 kJ/mole.

La séquence nucléotidique présentée à la figure 1A a été examinée dans les deux sens pour les régions codant pour une protéine potentielle. Celles-ci ont été définies sur la base de la dimension ( > 70 codons) et des signaux d'initiation de traduction appropriés (Mc
Laughlin et al, 1981 J. Biol. Chem. 256: 11283-11291).

Seulement deux cadres de lecture ouverts (ORF - open reading frames) supposes ont été trouvés, ils codent dans des orientations opposées (Fig. 1). Les codons de départ présumés d'orfl (UUG) et orf2 (AUG) sont précédés par des sites de liaison aux ribosomes appropriés concordant avec l'extrémité OH-3' de 1'ARNr de 16S de B subtilis (Mc Laughlin et al, 1981). Les énergies libres d'interaction, déduites conformément à
Tinoco et al (1973), sont de -57,5 kJ/mole (orfl) et -51 kJ/mole (orf2). orfl code pour 134 acides aminés débutant en position 2193 et s'arrêtant en position 1792. La masse moléculaire calculée du produit d'orfl supposé est de 15 524. orf2 code pour un polypeptide débutant en position 2521, interrompu en position 2872 par clonage du fragment d'ADN BalI.

La comparaison des séquences ORF1 et ORF2 déduites, avec les séquences de protéines disponibles dans la Banque de Gènes/EMBL et NBRF et spécifiquement celles codes par des plasmides, n'a revéle aucune homologie significative.

Des promoteurs potentiels pour orfl et orf2 ont été identifiés par comparaison des régions en amont d'orfl et orf2 avec des séquences consensus connues de promoteurs de B subtilis (Moran, 1986 Regulation of
Procaryotic Development. American Society for
Microbiology, Washington DC, 167-184) (Fig. 1). La région de symétrie située entre les positions 1572 et 1598 peut correspondre à un terminateur de transcription pour orfl. Lorsqu'elle est lue sur le même brin qu'orfl, la structure d'ARN tige-boucle potentielle est suivie par un segment de 6 résidus U interrompu par deux résidus A. Cette structure rappelle un terminateur rho-indépendant.

DETERNINATION DE LA REGION DE REPLICATION MINIMALE DU pHT1030
Pour tester l'activité de réplication de fragments d'ADN issus du fragment BalI de pHT1030, le vecteur sonde d'origine de réplication pHT181 a été construit, dans lequel un fragment d'ADN de 1,2 kb portant un gène conférant la résistance à l'érythromycine aux bactéries gram-positives (Trieu-Cuot et al, 1990 Nucleic Acids
Res. 18: 3660) a été cloné au site SspI de pUC18 (Fig.

2). pHT181 peut être utilisé, comme pUC18, pour des expériences de clonage dans E. coli étant donné que le gène de Emr inséré au niveau du site SspI n'interrompt ni les sites de clonage du polylinker ni le gène de la p-lactamase. Ainsi, le fragment d'ADN BalI entier et plusieurs fragments de celui-ci ont été clonés dans pHT181, et leur réplication a été testée dans B subtilis et B thuringiensis (Fig. 2). Le plus petit segment d'ADN capable de supporter la réplication de plasmides recombinants dans des Bacilli était un fragment SpeI-AflII de 705 bp (nt 312-1016, Fig. 1).

Cependant, la capacité de réplication de ce segment d'ADN était dépendante de son orientation par rapport au promoteur lacZ de pUC18. pHT3112a et pHT3113a étaient capables de transformer des Bacilli pour la résistance à ltérythromycine, mais il n'a pas été obtenu de transformants avec pHT3112b, pHT3133b, pHT3114 et pHT3115, dans lesquels le fragment est dans une orientation opposée.

Ce résultat suggère que, dans le cas de pHT3112a et pHT3113a, la région du promoteur lacZ située en amont des sites de clonage fournit une activité de promoteur qui avait été perdue dans ces dérivés de délétion. Le promoteur essentiel pour la réplication autonome de pHT1030 pourrait donc être présent dans le fragment d'ADN BalI-NdeI de 146 bp (nt 1-146, Fig. 1).

On trouve les régions -35 (TTGATT) et -10 (TAAAAT) possibles dans ce segment d'ADN au niveau des positions nucléotidiques respectivement 75-80 et 98-103 (Fig. 1).

Ceci est en accord avec le fait que les fragments
BalI-AflII et BalI-ScaI de 1 kb fournissent une réplication efficace dans les Bacilli lorsqu'ils sont clonés dans l'une ou l'autre orientation dans pHT181 pour donner les plasmides pHT3104a,b et pHT3105a,b (Fig. 2). Ainsi, la région minimale de pHT1030 conférant une réplication autonome est complètement incluse dans le fragment de restriction BalI-AflII de 1016 bp cloné dans les plasmides pHT3104a,b (Fig.2).

Les deux caractéristiques majeures de cette région de réplication sont la présence de la séquence de symétrie par rapport à un point, longue de 70 nucléotides et l'absence apparente de toute protéine codée par un plasmide, requise pour la réplication. L'ORF le plus large (95 codons) trouvé dans cette région d'ADN ne présente pas de signal approprié pour l'initiation de la traduction.

COMPORTEMENT DE REPLICATION DES DERIVES DE DELETION DU pHT1030
L'intégrité des fonctions de réplication du réplicon minimal cloné dans pHT3104a a été vérifiée par comparaison de ses caractéristiques de réplication avec celles du pHT3130, qui est le fragment d'ADN BalI entier cloné dans le vecteur sonde d'origine de réplication pHT181 (Fig. 2).

Le nombre de copies des deux plasmides a été mesuré. A la fois dans B subtilis et B thurinqiensis, pHT3130 et pHT3104a ont montré un nombre de copies identique estimé à 4,2 + 0,6 molécules de plasmide circulaire fermé par covalence par équivalent chromosome. Il peut être conclu que les fonctions requises pour le contrôle du nombre de copies sont toutes présentes dans le réplicon minimal cloné dans pHT3104a.

Une autre voie pour tester l'intégrité des fonctions de réplication du pHT3104a consistait à déterminer sa production d'ADN simple brin. De nombreux plasmides issus de bactéries gram-positives se répliquent par un mécanisme du type à "cercle roulant" et la délétion de la séquence d'origine négative conduit à l'accumulation d'ADN plasmidique simple brin (Gruss et Ehrlich, 1989 Microbiol. Rev. 53: 231-241;
Devine et al, 1989). pHT3100 et pHT3104a ont été testés pour la production d'ADN plasmidique simple brin en utilisant le mode opératoire décrit par te Riele et al.

(1986a Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2541-2545). Des préparations d'ADN total chargées sur des gels d'agarose séparés ont été transférées sur des filtres de nitrocellulose avec ou sans dénaturation préalable par NaOH.

Les résultats de leur hybridation par un plasmide pUC18 marqué au 32p sont présentés sur la Fig. 3.

pHT3130 et pHT3104a n'ont pas produit de quantités détectables d'ADN simple brin soit dans B subtilis soit dans B thuringiensis. De plus, Gruss et Ehrlich (1988) ont montré que l'insertion d'ADN étranger dans des plasmides de type à "cercle roulant" conduit à la formation de multimères en tandem de masse moléculaire élevée (HMW). Par comparaison avec le plasmide hybride pHV33 de type à "cercle roulant", il n'a pas été trouvé de quantités significatives de HMW avec pHT3100 et pHT3104a dans B subtilis (Fig., voies B et C) et seulement de faibles taux lorsque ces plasmides étaient dans B thuringiensis (Fig. 3, voies D et E).Ces résultats suggèrent fortement que pH1030 et ses dérivés de délétion ne se répliquent pas par un intermédiaire d'ADN simple brin et montrent que les comportements de réplication du pHT3l3o et pHT3104 ne sont pas significativement différents dans B subtilis et B thuringiensis. Ainsi, on peut conclure que les fonctions de réplication essentielles du pHT1030 sont conservées dans le réplicon minimal cloné dans pHT3104a.

STABILITE DE SEGREGATION DES DERIVES DE DELETION DU pHT1030
Pour déterminer les régions d'ADN nécessaires pour la stabilité de ségrégation du pHT1030, le maintien d'une sélection des dérivés de délétion Rep+ de ce réplicon a été caractérisé dans B subtilis ou B thuringiensis dans un milieu LB sans sélection d'antibiotique (Fig. 2).

L'instabilité la plus frappante résulte de la délétion des petits fragments d'ADN BalI-SspI ou BalI
SpeI. pHT3112a et pHT3113a pour lesquels ces fragments font défaut ont été rapidement perdus en l'absence de pression de sélection. En conséquence, ce fragment d'ADN court, dont on a montré ci-dessus qu'il était lié à la fonction de réplication du pHT1030, est également impliqué dans la stabilité du réplicon. Cette région de 300 bp a été désignée spbA (stabilité du plasmide dans les Bacilli).

Les autres plasmides Rep+ étaient plus stables dans B thurinaiensis que dans B subtilis. Cet effet de l'hôte sera discuté ci-après.

Indépendamment de la bactérie hôte, une délétion partielle d'orf2 (pHT3109) et une délétion du fragment
ScaI-HaeIII (pHT3120) a donné des plasmides aussi stables que pHT3130. Cependant, les plasmides dans lesquels orfl est partiellement ou totalement supprimé (pHT3108 à pHT3104) montrent une stabilité significativement réduite. Ces résultats suggèrent que le fragment d'ADN HaeIII-HpaI de 1234 bp contenant orfl est mis en jeu dans le maintien du pHT1030 dans les deux espèces de Bacilli. Ce locus est désigné spbB.

Pour déterminer si un produit de gène spbB potentiel est responsable ou non de la stabilité du pHT1030, un plasmide portant un gène spbB interrompu a été construit. Le site HpaII unique du fragment BalI de 2,6 kb du pHT1030 a été éliminé par clivage de HpaII et remplissage des extrémités par le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I, et le fragment BalI modifié a été cloné dans pHT181 pour donner le plasmide pHT3l30HpaII. La modification du site de restriction a été confirmée par le séquençage nucléotidique en utilisant une amorce oligonucléotidique de synthèse appropriée.Alors que la mutagenèse doit conduire à l'addition de 2 bp, le séquençage nucléotidique a révélé que, pour des raisons inconnues, 2 bp ont été perdus dans pHT3130SHpaII (la séquence d'ADN 5'
TAAATGGGA-3' a remplacé 5'-TAAATCCGGGA-3' au niveau des positions nucléotidiques 2070-2080). Néanmoins, cette modification provoque un décalage du cadre de lecture dans le gène spbB présumé (orfl) apportant un codon non-sens en aval des 14 codons du cadre. pHT3130aHpaII avait une stabilité de ségrégation inférieure à pHT1030 et analogue à celle des dérivés de délétion pHT3108 à pHT3104 (Fig.4).

Ces données expérimentales pourraient indiquer l'implication d'un polypeptide codé par spbB dans le maintien du pHT1030 dans les Bacilli. L'expression du spbB a été testée dans un système de transcriptiontraduction in vitro d'E. coli (Fig.4). Un fragment d'ADN BstUI de 564 bp (localisé entre les positions nucléotidiques 1692 et 2256 de la Fig. 1) contenant le gène spbB supposé a été purifié séparément à partir de chaque pHT3130 et de pHT3130AHpaII et teste en parallèle. Seul le fragment d'ADN BstUI de pHT3130 a dirigé l'expression d'une protéine de 15 kDa additionnelle (Fig. 4, voie 4). De plus la transcription-traduction in vitro des pHT3109 et pHT114 entiers a conduit à l'apparition d'une protéine montrant la même taille apparente.Cette protéine étant absente dans l'essai contenant pHT181. La taille apparente du polypeptide spbB est en accord avec la masse moléculaire calculée à partir de la séquence nucléotidique d'orf 1. Ces résultats démontrent que l'intégrité de cette séquence d'ADN est requise pour la stabilité, probablement par l'expression de la protéine codée.

Comme l'absence de spbB ne change pas le comportement de réplication apparent des plasmides, le produit de gène spbB est seulement impliqué dans la stabilité.

Est-ce que le locus a une fonction de
stabilisation active?
Nordstrom et Austin (1989, Annu. Rev. Genet. 23: 37-69) ont défini deux classes de facteurs de stabilité : ceux qui assurent une répartition aléatoire des plasmides pendant la division cellulaire et ceux qui permettent une stabilité meilleure que celle au hasard.

Pour déterminer à quelle classe appartient le locus spbB, il a par conséquent été nécessaire d'établir la fréquence de perte de plasmides par génération en l'absence et en présence de spbB. La comparaison de ces fréquences avec la fréquence théorique basée sur le nombre de copies du pHT1030 a pu indiquer le rôle du spbB.

Les expériences de stabilité effectuées dans le milieu LB ont indiqué la maintenance globale des plasmides dans des conditions non-sélectives (Fig. 2).

Cependant, elles n'ont pas permis l'estimation de la fréquence de perte de plasmides par génération. Une culture pendant toute une nuit dans un milieu LB provoque la sporulation de certaines des cellules.

Lorsqu'elles ont été évaluées après environ 25 générations, les valeurs obtenues pour la stabilité des plasmides résultent d'une population mixte de cellules végétatives et de sporulation.

Pour distinguer la stabilité des plasmides entre ces deux états de croissance, la production de cellules exemptes de plasmides a été suivie séparément dans un milieu riche (BHI) pour empêcher le déclenchement de la sporulation et dans des milieux spécifiques de sporulation (SP ou HCT) pour déterminer la fréquence de production d'une spore exempte de plasmides.

Dans le milieu BHI, les plasmides portant le locus spbB et la région de réplication entière (pHT3130, pHT3120 ou pHT3109) ont été maintenus de façon très stable, étant donné que plus de 95% des cellules de B subtilis abritaient ces plasmides après 60 générations (Fig. 5A) et 99% des cellules de B thuringiensis après 80 générations (Fig. 5B). Les plasmides pour lesquels spbB (pTH3104a et pHT3107) faisaient défaut ou ceux dans lesquels le gène spbB a été rompu (pHT3108 et pHT3130AHpaII) étaient significativement moins stables que les réplicons portant la séquence spbB entière (Fig. 5A et B).

Une deuxième classe de plasmides (pHT3112a et pHT3113a), dans lesquels le locus spbA est absent, apparaît être très instable, à la fois dans B subtilis et B thuringiensis. Cependant, la présence de la région d'ADN portant la séquence spbB (pHT3112a) réduit l'instabilité par comparaison avec son absence (pHT3113a).

La détermination de la stabilité du plasmide pendant la sporulation a été effectuée en utilisant des milieux SP et HCT dans lesquels B subtilis et B thurinqiensis sporulent de manière synchrone. Juste avant le t0 de sporulation, (environ 15 générations après l'inoculation du milieu sans antibiotique), la proportion de cellules Emr est inchangée ou seulement légèrement réduite (Fig. 6A et B). Ceci est en contraste net avec les résultats observés après l'évolution complète de la phase de sporulation. Les cellules abritant les plasmides pHT3130tHpaIIt pHT3108 et pHT3104a donnent naissance à une grande proportion de spores exemptes de plasmides, notamment dans B subtilis.Les plasmides pHT3130, pHT3120 et pHT3109 sont maintenus de façon stable pendant le processus de sporulation. Ces résultats sont en accord avec ceux obtenus dans la croissance végétative et suggèrent fortement que, pendant la sporulation, la stabilité des plasmides est dépendante de la région d'ADN portant spbB.

Après le t0 de sporulation, il n'y a pas de nouvelle croissance cellulaire significative.

L'instabilité de pHT3130tHpaII, pHT3108 et pHT3104a résulte par conséquent de l'étape de sporulation qui peut être considérée comme étant une division cellulaire simple. L L'un des premiers stades de ce processus de différenciation est la formation du septum de sporulation divisant la cellule en deux compartiments inégaux. A la fois dans B subtilis et B thuringiensis, le compartiment présporal représente environ un sixième du volume de la cellule mère (Ryter, 1965 ; Ribier et Lecadet, 1973). Ainsi, on devrait s'attendre à ce qu'une répartition aléatoire des plasmides conduise à une fréquence élevée de production d'une spore exempte de plasmides. Ceci est en accord avec le comportement des dérivés de délétion du pHT1030 pour lesquels spbB fait défaut.

Sur la base de la moyenne des résultats de stabilité obtenus dans la phase végétative (Fig. 5A et
B) ou dans la phase de sporulation (Fig. 6A et B), les fréquences de stabilité des plasmides portant le locus spbB ou dépourvues de ce locus,ont été déterminées et comparées aux fréquences théoriques attendues avec un plasmide ayant un nombre de copies de 4,2 par équivalent chromosome (Tableau 1). En raison de la difficulté d'extraire de 1'ADN de Bacilli au stade t0 de sporulation, le nombre de copies de plasmides n'a pas été mesuré pendant cette étape de différenciation et on émet l'hypothèse qu'il est identique à celui obtenu pendant la phase végétative.

Comme montré ci-dessus, il apparaît que tous les plasmides sont environ 4 fois moins stables dans B subtilis que dans B thurinqiensis. Dans ce dernier, la fréquence de perte des plasmides pHT3130tHpaII, pHT3108 et pHT3104a est très proche de la probabilité de perte théorique attendue pour une répartition aléatoire des plasmides pendant la phase végétative ou la phase de sporulation, alors qu'ils sont maintenus avec des fréquences plus mauvaises qu'aléatoires dans B subtilis.

Bien que l'on ait trouvé le nombre de copies calculé et le comportement apparent du pHT3104a analogue dans les deux organismes, la différence de stabilité de ce type de plasmides, entre B subtilis et
B thurinqiensis, pouvait résulter partiellement de défauts dans le contrôle de la réplication conduisant à une variation du nombre de copies dans la population des cellules de B subtilis. Néanmoins, d'autres facteurs concernant l'hôte doivent probablement être considérés pour expliquer la différence importante dans la stabilité des plasmides observée entre des cellules de B subtilis et B thurinqiensis en sporulation (Fig. 6 et Tableau 1).Cependant, à la fois dans B subtilis et
B thurinqiensis, les plasmides portant la région spbB ont été maintenus avec des fréquences meilleures que celles déduites d'une répartition aléatoire (Tableau 1).

Par conséquent, ces résultats montrent que, dans l'hôte naturel du pHT1030, le réplicon minimal est hérité de façon aléatoire pendant la phase végétative et la phase de sporulation, et que la région d'ADN portant le locus spbB contribue activement à améliorer la stabilité de ségrégation du plasmide dans les deux espèces de Bacilli.

Examen du mécanisme de la stabilité régulée par spbB
La capacité de spbB à stabiliser un réplicon hétérologue ou à fonctionner en trans, et son effet sur la croissance bactérienne ont été examinés pour obtenir des informations sur le mécanisme du spbB.

Pour tester la capacité du spbB à stabiliser un plasmide hétéroloque, le vecteur pHT1618 a été construit par clonage du réplicon pBC16Al (Polak et
Novick, 1982) au niveau du site SspI du pUC18 (Fig. 7).

pBC16A1 est un dérivé du réplicon pBCl6 de B cereus qui confère une résistance à la tétracycline aux bactéries gram-positives. pBCl6 est un plasmide de type à "cercle roulant" (Gruss et Ehrlich, 1989 Microbiol.

Rev. 53: 231-241).

Différents fragments d'ADN contenant la région spbB entière ou interrompue ont été clonés dans les sites de clonage du pHT1618 (Fig. 7). La stabilité de ces plasmides recombinants a été analysée dans B subtilis pendant la croissance végétative sans antibiotique (Fig. 8). pHT1610 et pHTl611aHpaII étaient moins stables que pHTl618. Cette réduction de stabilité est en accord avec les données précédentes montrant que la stabilité de ségrégation du plasmide pUB110, qui est lié à pBCl6 (Polak et Novick, 1982), dépend de la taille et est considérablement réduite par des insertions d'ADN (Bron et al., 1988).

L'instabilité du pHT1610 indique clairement que le fragment AccI-BalI contenant le gène spbB n'a pas conféré de fonction de stabilité au réplicon.

L'addition aux plasmides des segments d'ADN (ScaI-
AccI ou HindîlI-AccI) situés en aval du gène spbB a complètement supprimé la réduction de stabilité due au clonage du gène spbB dans pHT1610. En effet, pHT1609 et pHT1611 sont au moins aussi stables que pHT1618 et significativement plus stables que pHT1610 et pHT1611tHpaII qui portent des insertions d'ADN de dimensions analogues. Les déterminations de la fréquence de production d'une spore exempte de plasmides dans un milieu SP ont donné des résultats analogues.

Par conséquent, ces résultats montrent que, en plus du gène spbB, le fragment d'ADN ScaI-AccI situé en aval du gène, est nécessaire pour conférer la stabilité aux plasmides recombinants issus du pBC16. La délétion du fragment ScaI-HaeIII ne diminue pas la stabilité (pHT3120), et, par conséquent, la fonction essentielle pour la stabilité réside dans le court fragment
HaeIII-AccI. Ce segment d'ADN contient la région de symétrie, un terminateur potentiel, qui peut être requise pour l'expression fonctionnelle du produit du gène spbB.

Pour déterminer si la protéine spbB fonctionne ou non en trans, des souches de B subtilis Rec abritant pHT1618 ou pHT1609 ont été transformées par les plasmides instables pHT3104a ou pHT3130aHpaII. pHT1609 n'a pas eu d'effet détectable sur la stabilité de ces deux plasmides indiquant que la stabilisation nécessite que le réplicon et le locus spbB soient sur la même molécule.

spbB ne serait donc pas un système de partition vraie dans lequel les protéines fonctionnent en trans pour assurer la répartition du plasmide aux cellules filles (Austin et Nordstrôm, 1990 Cell 60: 351-354).

Cette caractéristique, et la capacité à stabiliser un réplicon hétérologue, sont analogues à celles des systèmes "tueurs" ccd et hok/sok (Jaffé et al, 1985 J.

Bacteriol 163: 841-849; Gerdes et al, 1986 Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 83: 3116-3120). De façon intéressante, les cellules de B subtilis qui abritent des plasmides spbB+ produisent seulement environ un tiers du nombre de spores viables par comparaison avec celles abritant les plasmides spbB- (Tableau 2). Ceci est également en accord avec un modèle d'action de type "tueur".

Si l'on suppose que, pendant la sporulation des cellules de B subtilis, la fréquence élevée de production d'une spore exempte de plasmides est équivalente avec les plasmides spbB- et spbB+, la stabilité apparente des plasmides spbB+ pourrait résulter par conséquent d'une activité postségrégationnelle de la protéine SpbB Lorsque le plasmide spbB+ est perdu, la protéine SpbB peut devenir fonctionnelle et son effet physiologique pourrait être d'empêcher ou de différer le développement cellulaire et la formation de spores viables.

DISCUSSION
Les fonctions de réplication et de stabilité du plasmide gram-positif pHT1030 ont été préalablement localisées sur une carte au niveau d'un fragment de restriction BalI de 2,9 kb (Lereclus et al, 1988 FEMS
Microbiol. Lett. 49: 417-422).

La construction des dérivés de délétion du pHT1030 révèle que le réplicon minimal conférant une réplication autonome est inclu dans un fragment d'ADN de 1 kb. Les plasmides portant cette région d'ADN manifestent un comportement de réplication analogue à celui des plasmides portant le fragment de restriction
BalI entier. Ce sont des plasmides à faible nombre de copies (4,2 copies par équivalent chromosome) et ils n'accumulent pas de molécules d'ADN simple brin pendant la réplication. Cette dernière caractéristique exclut un mode de réplication à "cercle roulant" que l'on trouve le plus communément dans les réplicons grampositifs (Gruss et Ehrlich, 1989 Microbiol. Rev. 53: 231-241).

La caractéristique principale de ce fragment d'ADN de 1 kb est l'absence d'une séquence codant pour une protéine potentielle. De ce fait, il ressemble aux plasmides de type ColE1 qui nécessitent seulement des protéines hôtes pour leur propre réplication.

Néanmoins, à la différence de ColE1, les plasmides issus de pHT1030 ne sont pas amplifiés après addition de chloramphénicol du milieu de culture. Ces caractéristiques indiquent que pHT1030 se situe dans une classe de réplicons qui n'a pas été trouvée auparavant dans les bactéries gram-positives.

Une autre caractéristique particulière du réplicon minimal du pHT1030 est une séquence de 70 nucléotides formant potentiellement une structure d'ARN tige-boucle dans laquelle l'une des deux régions complémentaires contient elle-même une séquence répétée inversée (cartographie entre les positions nucléotidiques 392 et 425 dans la Fig. 1).

La délétion d'une région d'ADN de 300 bp contenant un promoteur potentiel (qui pourrait être essentiel pour la synthèse de la molécule d'ARN initiateur) rend les dérivés de pHT1030 incapables de se répliquer. Ce défaut est supprimé par addition de la région promoteur lacZ du pUC18, mais la stabilité de ségrégation des plasmides résultants (pHT3112a et pHT3113a) est sérieusement diminuée dans B subtilis et Bthurinaiensis. Ce segment de 300 bp définit par conséquent un locus de stabilité (spbA) probablement lié à la fonction de réplication du pHT1030.

La stabilité de ségrégation des différents dérivés de délétion du pHT1030 a été examinée séparément pendant la croissance végétative et les phases de sporulation. Les expériences indiquent que les plasmides portant le réplicon minimal de pHT1030 ou les plasmides déficients en la région d'ADN désignée spbB sont distribués de maniere aléatoire dans B thurinqiensis. Pour des raisons inconnues, la stabilité de ces plasmides est plus mauvaise qu'aléatoire dans B subtilis. De façon intéressante, il est montré que dans B thurinqiensis la fréquence élevée de production d'une spore exempte de plasmides a pu être corrélée à une répartition aléatoire des plasmides sur la base d'une division inégale de la cellule par le septum de sporulation. Cependant, à la fois en phase végétative et en sporulation, les plasmides portant le locus spbB sont maintenus de façon stable dans les deux espèces de Bacilli.

spbB code pour un polypeptide de 15 kDa qui pourrait être impliqué dans la stabilité du pHT1030.

Une fois cloné dans un réplicon hétérologue (issu de pBCl6), le locus spbB confère une stabilité de ségrégation faible mais significative, alors qu'un plasmide spbB+ ne stabilise pas en trans des plasmides délétés de spbB ou portant un gène spbB interrompu.

Ceci indique que le locus spbB doit être lié au réplicon pour exercer sa fonction de stabilité.

spbB est donc activement impliqué dans la stabilité de ségrégation du pHT1030, indépendamment de la fonction de réplication. Le mécanisme par lequel il fonctionne présente des caractéristiques ressemblant à celles des sytèmes "tueurs" ccd et hok/sok (Jaffé et al, 1985 J. Bacteriol 163: 841-849; Gerdes et al, 1986
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3116-3120). Les plasmides portant de tels loci produisent une protéine tueuse et un agent antagoniste qui est une protéine dans le système ccd (Ogura et Hiraga, 1983 Proc. Natl.

Acad. USA 80: 4784-4788; Miki et al, 1984 J. Mol. Biol.

174: 605-625), et un ARN anti-sens dans le système hok/sok (Gerdes et al, 1990 Mol. Microbiol. 4: 1807-1818). Lorsque les plamides sont perdus, l'agent de blocage se disparait plus rapidement que le déterminant tueur plus stable, permettant l'expression de l'activité tueuse provoquant la mort cellulaire.

L'analogie entre spbB et le mécanisme tueur est renforcée par les résultats obtenus dans des conditions (sporulation dans B subtilis) conduisant à une fréquence élevée de production d'une spore exempte de plasmides. La production de spores viables est fortement réduite lorsque les cellules abritent un plasmide spbB+. On s'attendrait à ceci si la protéine
SpbB avait un effet de type tueur. Cependant, aucune homologie n'a été trouvée entre SpbB et les protéines tueuses CcdB et Hok, et la fonction physiologique de
SpbB doit encore être caractérisée.

MODES OPERATOIRES EXPERIMENTAUX
Souches bactériennes et conditions de croissance
La souche TG1 d'E. coli K-12 [(lac-proAB) supE thi hdsD5 (F'traD36 proA+ proB+ lacIq lacZEM15)] a été utilisée pour les expériences de clonage et de séquençage. La souche 168 (trpC2) de B subtilis (Anagnostopoulos et Spizizen, 1961 J. Bacteriol 81: 741-746) et la souche kurstaki HD1 cry@b de B thuringiensis ont été utilisées pour les essais de réplication et de stabilité. E. coli, B subtilis et B thuringiensis ont été transformés comme décrit respectivement par Cohen et al (1972 Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 69: 2110-2114), Anagnostopoulos et Spizizen (1961 J. Bacteriol 81: 741-746) et Lereclus et al (1989a FEMS Microbiol. Lett. 60 211-218).

Un bouillon de Luria (LB) a été utilisé pour les cultures de E. coli et des essais préliminaires de stabilité avec B subtilis et B thuringiensis. La stabilité du plasmide en croissance végétative a été déterminée dans une infusion cervelle-coeur (BHI,
Difco) pour les deux Bacilli, et les essais de stabilité pendant la sporulation ont été effectués dans un milieu HCT (Lecadet et al, 1980 J. Gen. Microbiol.

121: 203-212) pour B thuringiensis et dans un milieu SP pour B subtilis. Le milieu SP contenait 8 g de bouillon nutritif (Difco) par litre, MgSO4 1 mM, KCl 13 mM et MnC12 10 iiM complété après stérilisation par FeS04 1 AM, CaC12 1 mM et 1 g de glucose.

Les concentrations en antibiotiques pour la sélection bactérienne étaient les suivantes ampicilline, 100 pg/ml ; érythromycine, 25 Ag/ml dans les Bacilli et 125 g/ml dans E. coli, et tétracycline, 10 yg/ml.

Plasmides
Le plasmide pUC18 dans lequel le fragment de restriction BalI de 2,9 kb de pHT1030 a été inséré au niveau du site SmaI et le plasmide pHT1031 (Lereclus et al, 1988 FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422) ont été utilisés comme source dtADN pour construire les divers dérivés de délétion du pHT1030 utilisés dans cette étude. Ces plasmides sont décrits sur la Fig. 2 et la
Fig. 7.

Le vecteur bifonctionnel pHV33 est composé de pBR322 et pC194 (Primrose et Ehrlich, 1981 Plasmid 6: 193-201). pBC16A1 dérive du plasmide pBC16 de B cereus (Bernhard et al, 1978 J. Bacteriol 133: 897-903).

Essais de stabilité
Des essais préalables de stabilité dans un milieu
LB ont été effectués comme decrit auparavant(Lereclus et al, 1988 FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422).

Les souches bactériennes contenant des plasmides à tester pour la stabilité de ségrégation en croissance végétative ont été inoculées dans le milieu BHI selectif et incubées pendant toute une nuit à 30'C.

Les cultures ont été ensuite diluées 106 fois dans du milieu BHI sans antibiotique et incubées à 37 OC. Les cultures ont été diluées (105 à 106 fois) dans du milieu BHI non sélectif frais toutes les 15 à 20 générations. A intervalles réguliers (environ 20 générations), des échantillons des cultures ont été étales sur des boîtes de gélose non-sélective après dilutions appropriées. Environ 100 colonies de chaque echantillon ont été répliquées avec un cure-dents sur des boîtes de gélose contenant l'antibiotique approprié pour determiner la proportion de bactéries contenant des plasmides.La stabilité de ségrégation des plasmides spbA instables (pHT3112a et pHT3113a) a été estimée par étalement d'échantillons des cultures récupérées à des intervalles d'environ 5 générations à la fois sur un milieu gélosé non sélectif et sélectif après dilutions appropriées.

Pour les essais de stabilité pendant la phase de sporulation, des cultures pendant toute une nuit dans du milieu BHI sélectif ont été diluées 103 fois dans un milieu de sporulation spécifique (SP ou HCT) contenant de l'érythromycine (5 pg/ml) et incubées pendant 2 à 3 heures à 37 Oc. Les cultures ont été ensuite diluées 103 fois dans un milieu SP ou HCT non-sélectif frais (temps zéro) et incubées aux températures appropriées (30"C pour B thuringiensis et 37"C pour B subtilis).

Après environ 15 générations (juste avant le t0 de sporulation) les échantillons ont été utilisés pour déterminer la fraction des cellules contenant des plasmides comme décrit ci-dessus. Après 24 ou 36 heures, lorsque la plupart des spores ont été libérées, les échantillons de culture ont été chauffés à 800C pendant 10 minutes pour tuer les cellules nonsporulées. La proportion de spores contenant des plasmides a été ensuite déterminée comme ci-dessus.

Détermination du nombre de copies de plasmides
Le nombre de copies des plasmides a été déterminé par densitométrie de négatifs photographiques obtenus à partir de gels électrophorétiques colorés au bromure d'éthidium. La méthode et les paramètres utilisés pour la détermination du nombre de copies étaient tels que décrits par Projan et al (1983 Plasmid 9: 182-190). La taille du chromosome de B subtilis et B thuringiensis utilisé pour faire le calcul du nombre de copies était de 4,2 x 103 kb.

Analyse de la production d'ADN simple brin
Des préparations de plasmides bruts ont été soumises à une électrophorèse sur des gels d'agarose, et transférées sur des filtres de nitrocellulose avec ou sans dénaturation (BA85, 0,45 pm, Schleicher et
Schuell) comme décrit auparavant par te Riele et al.

(1986a EMBO J. 5: 631-637) pour les cellules de B subtilis. Les filtres ont été hybridés avec pUC18 marqué au 32p.

Manipulations et séquençage d'ADN
Des enzymes de restriction, l'ADN T4 ligase et le fragment de Klenow de 1'ADN polymérase I provenaient de
New England Biolabs, Inc. L'enzyme de restriction Asp718 (utilisée pour couper au niveau des sites KpnI) et la phosphatase alcaline d'intestin de veau provenaient de Boehringer Manheim. Toutes les enzymes ont été utilisées selon les recommandations des fabricants. Des fragments de restriction d'ADN ont été purifiés à partir de gels d'agarose en utilisant un kit
Gene Clean (BiolOl).

Le séquençage des nucléotides a été effectué par la méthode de terminaison de chaîne (Sanger et al, 1977
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467), en utilisant le kit de séquençage de Sequenase acheté auprès de U.S.

Biochemical Corp., et Ea-35S)-dATP (110 TBq/ mmole) fourni par Amersham Corp. Des délétions chevauchantes ont été obtenues, conformément à la technique de Dale et al, (1985 Plasmid 13: 31-40), en utilisant le système Cyclone comme indiqué par le fabricant (International Biotechnologies Inc.).

La séquence d'ADN décrite ici apparaîtra dans la base de données de séquences nucléotidiques EMBL sous le numéro d'entrée X59245.

Des essais de transcription-traduction in vitro ont été effectués avec (35S)-méthionine (37 TBq/mmole) d'Amersham Corp. avec le Système d'Expression d'ADN de
New England Nuclear, comme indiqué par le fournisseur.

Des protéines radiomarquées ont été résolues dans des gels de polyacrylamide à 12,5% (poids/volume).

Analyse par ordinateur
Les programmes ont été utilisés sur un ordinateur
Data General MV8000. Les séquences d'ADN et d'acides aminés ont été analysées avec les programmes de l'Institut Pasteur.

Tableau 1 : Stabilité du plasmide en phases végétative et de sporulation

<tb> <SEP> Fréquence <SEP> de <SEP> génération <SEP> de <SEP> Fréquence <SEP> de <SEP> génération
<tb> <SEP> cellules <SEP> dépourvues <SEP> de <SEP> de <SEP> spores <SEP> dépourvues <SEP> de
<tb> <SEP> plasmide <SEP> en <SEP> phase <SEP> végétative <SEP> (a) <SEP> plasmide <SEP> en <SEP> phasede <SEP> sporulation <SEP> (b)
<tb> <SEP> Plasmide
<tb> <SEP> Probabilité <SEP> Probabilité
<tb> <SEP> B.subtilis <SEP> B.thuringiensis <SEP> théorique(c) <SEP> B.subtilis <SEP> B.thuringiensis <SEP> théorique(c)
<tb> <SEP> (1/2)n <SEP> (5/6)n
<tb> <SEP> pHT3130#HpaII <SEP> 7 <SEP> x <SEP> 10-
<tb> <SEP> pHT3108 <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 1.8 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 2.2 <SEP> x <SEP> 10-
<tb> <SEP> pHT3104a
<tb> <SEP> pHT3130
<tb> <SEP> pHT3120 <SEP> 4 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 10-4 <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> 5 <SEP> x <SEP> 10- <SEP> < 10- <SEP> 2.2 <SEP> x <SEP> 10-
<tb> <SEP> pHT3109
<tb> (a) Fréquences déterminées à partir des figures 5A et 5B. Le taux des cellules Em à un moment donné
a été divisé par le nombre correspondant de générations. Les résultats correspondent à la
moyenne des données obtenues avec les plasmides inndiqués.

(b) Fréquences déterminées à partir des figures 6A et 6B. La fréquence de génération d'une spore
déprouve de plasmide a été estimée à la proportion des spores donnant lieu à des colonies Em.

Les résultats correspondent à la moyenne des données obtenues avec les plasmides inndiqués.

(c) La probabilité théorique dépend de la taille du compartiment cellulaire considéré et du nombre
de copies du plasmide (n=4,2).

Tableau 2 : Effet de spbB sur la sporulation de B.subtilis

<tb> <SEP> Plasmide <SEP> Génotype <SEP> Nombre <SEP> total <SEP> de <SEP> Pourcentage <SEP> de
<tb> <SEP> spores <SEP> variables <SEP> spores <SEP> Emr
<tb> <SEP> (par <SEP> ml) <SEP> (a) <SEP> (b)
<tb> <SEP> pHT3130 <SEP> spbA+spB- <SEP> 2 <SEP> x <SEP> 10-8 <SEP> 96%
<tb> <SEP> pHT3120 <SEP> spbA+spB- <SEP> 2.5 <SEP> x <SEP> 10-8 <SEP> 95%
<tb> <SEP> pHT3190 <SEP> spbA+spB- <SEP> 3 <SEP> x <SEP> 10-8 <SEP> 96%
<tb> <SEP> pHT31930#HpaII <SEP> spbA+spB- <SEP> 7 <SEP> x10-8 <SEP> 18%
<tb> <SEP> pHT3108 <SEP> spbA+spB- <SEP> 6.5 <SEP> x <SEP> 10-8 <SEP> 30%
<tb> <SEP> pHT3104a <SEP> spbA+spB- <SEP> 8 <SEP> x <SEP> 10-8 <SEP> 15%
<tb> (a) Le nombre de spores viables était estimé par étalement des dilutions de cultures sporulées sur des boîtes d'agar non sélectives, après incubation à 80 C pendant 10 minutes. Les cultures sporulées ont été obtenues dans un milieu sélectif SP.

(b) Le pourcentage de spores Em' a été estimé par repiquage d'environ 100 colonies sur des boîtes d'agar contenant de l'érythromycine.

2EME EXEMPLE
CONSTRUCTION DE VECTEURS NAVETTES
Partie expérimentale et discussion
A) Vecteurs navettes ayant différents nombres de
copies
1) Elimination du site HindIII du pHT1035
pHT1035 est un plasmide de 6,3 kb portant la région de réplication du plasmide pHT1030 de B thuringiensis (fragment d'ADN BalI de 2,9 kb), un fragment d'ADN de HindIII-BalI portant le gène cat de pJH101 (Ferrari et al, 1983 J. Bacteriol. 154 : 15131515) et l'origine de réplication de pBR322 (Fig. 9) (Lereclus et al., 1988 FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422). Le site HindIII unique de pHT1035 a été éliminé (Fig. 9) afin d'éviter toute duplication des sites de restriction de pUCl9 (Yanisch-Perron et al, 1985 Gene 33: 103-119) utilisés pour la construction des vecteurs navettes. La modification au niveau du site Hindili ne gêne pas les fonctions de réplication et de stabilité du plasmide, étant donné que pHT1035 AHindIII était capable de transformer la souche 168 de
B subtilis (Anagnostopoulos and Spizizen, 1961 J.

Bacteriol. 81: 741-746) en CmR (10 g/ml) et était maintenu de façon stable sans pression sélective (90% des cellules contenaient le plasmide après 25 générations environ dans un milieu LB non-sélectif).

2) Sélection des dérivés à nombre de copies élevé
de pHT1035tHindIII
L'ADN du plasmide pHT1035hHindIII a été traité par de l'hydroxylamine (Fig. 9) et a été ensuite utilisé pour transformer des cellules d'E. coli afin de récupérer des molécules d'ADN de plasmides (formes multimères) capables de transformer B subtilis. Des plasmides ayant un nombre de copies accru ont été ensuite sélectionnés par étalement des cellules de B subtilis transformées sur un milieu gélosé LB contenant une concentration de Cm (25 Zg/ml) empêchant la croissance des cellules abritant le plasmide à faible nombre de copies pHT1035tHindIII (4 + 1 copies par chromosome équivalent).

Deux plasmides ayant un nombre de copies accru ont été séléctionnés pour la poursuite de l'étude (Fig. 9).

Leurs nombres de copies ont été déterminés par analyse densitométrique de clichés photographiques d'électrophorèse sur gel d'agarose en utilisant les parametres décrits par Projan et al (1983, Determination of plasmid copy-number by fluorescence densitometry.

Pasmid 9, 182-190). Les plasmides ont été désignés pHT1035-lSEHindIII et pHT1035-70#HindIII et ont respectivement 15+5 et 70+20 copies par équivalent chromosome. Ils sont stables du point de vue de la ségrégation étant donné que 100% des cellules contenaient le plasmide après environ 25 générations dans un milieu LB non-sélectif.

3) Construction des vecteurs navettes
On a montré que les régions de réplication et de stabilité de pHT1030 étaient entièrement incluses dans le fragment d'ADN HpaI-BalI de 2,7 kb porté par pHT1035 (Fig. 9). Par conséquent, ce fragment d'ADN a été isolé de chacun des plasmides pHT1035tHindIII, pHT1035-l5AHindIII, et pHT1035-70tHindIII et utilisé de façon séparée pour construire les plasmides respectivement pHT304, pHT315 et pHT370 (Fig. 10).

Ces plasmides peuvent être utilisés de la même maniere que pUCl9 pour des expériences de clonage dans
E. coli etant donné que les fragments ont été insérés au niveau du site SspI n'interrompant ni les sites de clonage du polylinker ni le gène bla. Aucun site du polylinker de pUCl9 n'est dupliqué.

Ces vecteurs navettes ont été utilisés pour transformer la souche kurstaki HD1 Cry'B de B thuringiensis par le mode opératoire d'électroporation tel que décrit par (Lereclus et al., 1989a). Les clones recombinants ont été sélectionnés sur des boites de gélose LB contenant Er (25 g/ml). L'analyse densitométrique des préparations d'ADN total extraits de ces clones a montré que les trois vecteurs navettes avaient un nombre de copies dans B thuringiensis analogue à celui des plasmides parentaux correspondants dans B subtilis (Fig. 10).

B) Relation entre la production de 8-endotoxine et du
nombre de copies du plasmide
Un fragment de rectriction HindIII de 3 kb portant un gène cryIIIA isolé de la souche LM79 de B thurinqiensis spécifique des coléoptères a été souscloné au niveau du site HindIII de chacun des vecteurs pHT304, pHT315 et pHT370. Les trois plasmides résultants (pHT304#cryIIIA, pHT3l5ncryIIIA) et pHT370ncryIIIA), portant le gène cryIIIA dans la même orientation, ont été introduits dans la souche kurstaki
HDI Cry'B de B thuringiensis par électroporation.

On a fait pousser les clones recombinants pendant 2 jours à 300C dans un milieu HCT (Lecadet et al, 1980
Ber. J. Gen. Microbiol. 121: 203-212) en présence ou en l'absence de 25 g de Er par ml. Les préparations de spores-cristaux, récoltées & partir des cultures, ont été examinées en microscopie en contraste de phase et par SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium et de polyacrylamide) (Fig. 11).Les recombinants de kurstaki HD1#CryB abritant pHT304ncryIIIA n'ont pas produit d'inclusions parasporales détectables,alors que les cellules abritant soit pHT315#cryIIIA soit pHT370DcryIIIA ont produit des cristaux rhomboïdes plats caractéristiques des souches actives à l'encontre des larves de coléoptères (Herrnstadt et al, 1986 Bio/Technology 4: 305-308). Les composants majeurs de ces cristaux étaient deux polypeptides d'environ 73 et 67 kDa (Fig.

11). Ceci est en accord avec des résultats précédents qui indiquaient que le gène cryIIIA de la souche tenebrionis de B thuringiensis produisait des peptides de 73 et 65 kDa (Sekar et al., 1987). Le composant de 65 kDa pourrait résulter du clivage protéolytique du peptide de 73 kDa. On a trouvé de petites quantités de ces polypeptides dans les préparations de sporescristaux, récupérées à partir des bactéries abritant pHT304ncryIIIA (Fig. 11, voie 2). Ce résultat montre que le niveau de la production de 8-endotoxine peut être amélioré par augmentation du nombre de copies du gene cry, au moins dans les conditions expérimentales décrites ici.Cependant, il n'y a pas eu de différence significative entre les quantités de 6-endotoxine produite par les cellules abritant pHT3l5ncryIIIA et celles abritant pHT370#cryIIIA, indiquant ainsi qu'audessus de quinze copies du plasmide par chromosome, des facteurs autres que le nombre de copies du gene cry limitent la synthèse de la protéine des cristaux.

On note que la production de 6-endotoxines dans les souches recombinantes n'est pas affectée par la présence ou l'absence de Er, suggérant que les plasmides sont maintenus de façon stable dans les cellules hôtes. En effet, après environ 15 générations de croissance suivie d'une sporulation dans un milieu
HCT sans antibiotique, toutes les spores (100%) contenaient le plasmide.

3EME EXEMPLE
CONSTRUCTION D'UN PLASMIDE PORTANT PLUSIEURS (2) GENES
DE 8-ENDOTOXINES
Le plasmide pHT315nCRYIIIA decrit plus haut est digéré par l'enzyme SmaI, puis traité à la phosphatase alcaline. Le plasmide linéarité est ensuite purifié à partir d'un gel d'agarose.

Le plasmide pHT408 (Lereclus et al, 1989 FEMS 60: 211-218) est digéré par les enzymes HpaI et SmaI. Le fragment de restriction de 5 kb HpaI-SmaI, portant le gène cryIA(a) est purifié à partir d'un gel d'agarose et ligature en présence d'ADN Ligase, avec le plasmide pHT315XCRYIIIA linéarisé par l'enzyme SmaI. Le mélange de ligature est utilisé pour transformer E.coli. Les colonies ayant poussé sur milieu LB contenant de l'ampicilline (100 %G/ML) sont répliquées sur filtre de nitrocellulose, puis hybridées avec une sonde radioactive (marquee avec de 1'a32P-dCTP) constituée par une région interne du gène cryIa(a). Seuls les clones transformés par le plasmide pHT315n cryIIIA portant le gène cryIA(a) inséré au site SmaI hybrident avec la sonde. L'ADN plasmidique de l'un de ces clones est extrait et la carte de restriction du plasmide est déterminée afin de vérifier la présence des deux gènes cryIIIA et cryIA(a).

Le plasmide résultant : pHT315ncryIIIncryIA(a) possède un site de restriction SalI unique qui peut être utilisé pour cloner un troisième fragment d'ADN portant un autre gène de b-endotoxine et ayant des extrémités cohésives avec un site coupé par SalI.

Un tel plasmide chimère : pHT315ncryIIIncryIA(a) ou pHT3 1SncryII IAncryIAS(a) ncryX, portant un gène conférant la résistance à llérythromycine aux bactéries gram-positives, peut être utilisé pour transformer B thuringiensis et ainsi construire des souches recombinées exprimant des activités insecticides multiples.

Claims (25)

REVENDICATIONS

1. Vecteur recombinant capable de se répliquer dans des bactéries gram-positives, caractérisé en ce qu'il contient

a) un enchaînement nucléotidique I de Bacillus thuringiensis d'une taille d'environ 2,6 kb compris entre les sites BalI-HpaI et répondant à la séquence ou,

- tout fragment compris dans cet enchaînement dès lors qu'il permet la réplication du vecteur recombinant, lorsqu'il est sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez les bactéries gram-positives ou,

- toute séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement I ou du fragment cidessus, dans des conditions de forte stringence, et

b) au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec l'enchaînement ci-dessus.

2. Vecteur selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient

- soit un fragment II compris dans l'enchaînement nucléotidique de 2,6 kb délimité par les sites BalI-AflII ou BalI-ScaI, d'une longueur d'environ 1019 pb chez B thuringiensis, capable d'assurer la réplication autonome du vecteur recombinant formé,

- soit une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec le fragment II et,

- au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec le fragment ci-dessus.

3. Vecteur recombinant selon la revendication 1 capable de se répliquer dans des bactéries grampositives, caractérisé en ce qu'il contient en phase avec un promoteur fonctionnel chez les bactéries grampositives

- un fragment d'ADN (ou réplicon) compris dans l'enchaînement nucléotidique de 2,6 kb BalI-HpaI, correspondant à ou compris dans la séquence nucléotidique III délimitée par des sites SpeI-AflII comprenant les nucléotides 312 à 1016 chez B thuringiensis, ou un fragment hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence III dans des conditions de forte stringence, ou encore un fragment modifié par rapport à la séquence III, dès lors que ce fragment permet la réplication du vecteur formé chez une bactérie gram-positive, lorsqu'il est placé sous le contrôle d'un promoteur et,

- au moins une séquence d'ADN d'intérêt insérée en phase avec le réplicon.

4. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisé en ce que le promoteur permet la réplication autonome du vecteur et en ce qu'il correspond à ou est compris

- soit dans la séquence nucléotidique IV délimitée par les sites BalI- NdeI, comprenant les nucléotides 1à 146 chez B thuringiensis,

- soit dans une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence IV, ou encore en ce qu'il s'agit d'une séquence modifiée par rapport à la séquence IV, dès lors qu'elle définit un promoteur permettant la réplication autonome d'un vecteur recombinant, lorsqu'il est en phase avec le réplicon.

5. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il contient

- soit une séquence contenant des éléments nécessaires à la réplication autonome du vecteur recombinant formé dans une bactérie gram-positive et des éléments contribuant à la stabilité ségrégationnelle du vecteur, cette séquence correspondant à ou étant comprise dans la séquence nucléotidique V délimitée par les sites BalI-SspI ou BalI-SpeI comprenant respectivement les nucléotides 1 à 304 et 1 à 314 chez B thuringiensis,

- soit une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence V,

- soit une séquence modifiée par rapport à la séquence V, dès lors qu'elle conserve les propriétés fonctionnelles de réplication autonome et de stabilité de la séquence V au sein du vecteur.

6. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il contient en outre un fragment d'ADN assurant le maintien stable du vecteur recombinant chez une bactérie gram-positive, ce fragment correspondant

- soit à la séquence nucléotidique VI délimitée par les sites HaeIII-HpaI comprenant les nucléotides 1408 à 2642 et, d'une longueur d'environ 1234 pb chez

B thuringiensis, ou comprenant l'enchaînement HaeIII

AccI de la séquence VI d'environ 351 pb,

- soit à un fragment d'ADN modifié par rapport aux fragments ci-dessus, dès lors qu'il conserve la capacité de la séquence VI de conférer la stabilité au vecteur formé,

- soit à un fragment hybridant avec la séquence complémentaire des fragments ci-dessus.

7. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un plasmide.

8. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il contient en outre un système de sélection spécifique permettant de sélectionner les bactéries gram-positives contenant le vecteur recombinant après transformation.

9. Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce que le système de sélection est un gène codant pour une enzyme nécessaire au métabolisme de la bactérie.

10. Vecteur recombinant selon la revendication 8, caractérisé en ce que le système de sélection est un gène de résistance à un antibiotique déterminé.

11. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à S , caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pHT315 déposé le 7 Juin 1991 à la CNCM, sous le numéro I-llll.

12. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt code pour une 6-endotoxine de

B thuringiensis et en particulier en ce qu'il s'agit d'un gène cryI, d'un gène cryII, d'un gène cryIII ou d'un gène cryIV.

13. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que la séquence d'ADN d'intérêt code pour un antigène ou un immunogène, d'origine bactérienne, virale, ou parasitaire.

14. Vecteur recombinant selon la revendication 1 ou la revendication 3, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pHT3120 contenant la séquence d'ADN II d'environ 1 kb BalI-AflII ou BalI-ScaI de B thuringiensis, recombinée avec la séquence d'ADN, d'environ 1234 pb HaeIII-HpaI de B thuringiensis.

15. Vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 2 séquences d'ADN d'intérêt chacune d'elles étant sous le contrôle d'un promoteur de clonage et le cas échéant d'expression, fonctionnel chez des bactéries gram-positives.

16. Enchaînement nucléotidique I de B thuringiensis d'une taille d'environ 2,6 kb compris entre les sites BalI-HpaI de la séquence ci-dessous ou,

- tout fragment compris dans cet enchaînement dès lors qu'il permet la réplication du vecteur recombinant, lorsqu'il est sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel chez les bactéries gram-positives ou,

- toute séquence hybridant avec la séquence complémentaire de l'enchaînement ou du fragment cidessus, dans des conditions de stringence forte.

17. Fragment d'ADN selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment de l'enchaînement nucleotidique de 2,6 kb limité par les sites Bali-Afîli ou BalI-ScaI d'environ 1019 pb (1,019 kb) chez B thuringiensis, capable d'assurer la réplication autonome du vecteur recombinant formé, ou toute séquence hybridant dans des conditions de stringence forte avec le fragment ci-dessus.

18. Fragment d'ADN ou réplicon selon la revendication 16, caractérise en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il est compris dans la séquence nucleotidique III délimitée par des sites SpeI-AflII comprenant les nucléotides 312 à 1016 chez Bacillus thurinqiensis, ou en ce qu'il s'agit d'un fragment hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence III ou encore d'un fragment modifié par rapport à la séquence III, des lors que ce fragment permet la réplication d'un vecteur recombinant dans lequel il est intégré, chez une bactérie gram-positive, lorsqu'il est en phase avec un promoteur.

19. Promoteur caractérisé en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique IV délimitée par les sites BalI-NdeI comprenant les nucléotides 1 à 146 chez B thurinqiensis, ou ce qu'il s'agit d'une séquence hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence IV ou encore d'une séquence modifiée par rapport à la séquence IV, dès lors que le promoteur formé conserve sa capacité de permettre la réplication autonome d'un vecteur recombinant, lorsqu'il est en phase avec le réplicon.

20. Séquence nucléotidique selon la revendication 16 comprenant un promoteur contenant des elements permettant la réplication d'un vecteur recombinant le contenant chez une bactérie gram-positive et des éléments contribuant à conférer à ce vecteur sa stabilité ségrégationnelle, caractérisé en ce qu'il correspond à ou en ce qu'il est compris dans la séquence V délimitée par les sites BalI-SspI ou BalI-

SpeI comprenant respectivement les nucléotides 1 à 304 et 1 à 314 chez B thuringiensis, ou en ce qu'il s'agit d'une séquence hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence complémentaire de la séquence V, ou encore d'une séquence modifiée par rapport à la séquence V dès lors qu'elle conserve des propriétés fonctionnelles de réplication autonome et de stabilité de la séquence III.

21. Fragment d'ADN capable de conférer à un vecteur recombinant sa capacité de se maintenir de façon stable chez une bactérie gram-positive ou d'augmenter la stabilité de ce vecteur, lorsqu'il est introduit chez une bactérie gram-positive, caractérisé en ce qu'il correspond à la séquence nucléotidique VI délimitée par les sites HaeIII-HpaI comprenant les nucléotides 1408 à 2642, d'une longueur d'environ 1234 pb chez B thuringiensis, ou comprenant l'enchaînement

HaeIII-AccI de la séquence VI d'environ 351 pb ou en ce qu'il s'agit d'un fragment d'ADN modifié par rapport aux fragments ci-dessus, des lors qu'il conserve les propriétés de la séquence VI s'agissant de la stabilité d'un vecteur le contenant chez une bactérie grampositive, ou encore un fragment hybridant avec la séquence complémentaire des fragments ci-dessus.

22. Bactérie gram-positive, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant selon l'une quelconque des revendications 1 à 15.

23. Bactérie gram-positive selon la revendication 22, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un bacillus, en particulier de B thuringiensis, B subtilis, B sphaericus, ou B megaterium.

24. Composition larvicide active contre les larves d'insectes, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de principe actif, des bactéries selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23 transformées par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lesquelles la séquence d'ADN d'intérêt est un gène de cristal codant pour une 6-endotoxine, choisi par exemple parmi les genes CryI, CryII , CryIII ou CryIV.

25. Bactérie gram-positive selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans lequel la séquence d'ADN d'intérêt est une séquence hétérologue par rapport à la bactérie et notamment une séquence permettant la production d'antigènes, d'immunogènes, d'origine bactérienne, virale ou parasitaire.