JP2002247997A - 新型グラム陽性レプリコン−それを含む組換え型ベクターの構築 - Google Patents
新型グラム陽性レプリコン−それを含む組換え型ベクターの構築Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
-
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- C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】新型のグラム陽性レプリコン及びそれを含む組
換え型ベクターの提供。 【解決手段】グラム陽性菌の中で複製でき、しかも
（ａ）ＢａｌＩ−ＨｐａＩ部位間で約２．６kbのサイズ
をもつBacillus thuringiensisのヌクレオチド鎖Ｉ、又
は、グラム陽性菌内で機能的なプロモーターの制御下に
あるとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎり
において、前記鎖に含まれている全てのフラグメント、
又は高度にストリンジェントな条件下で鎖Ｉ又は上述の
フラグメントの相補的配列とハイブリダイズするあらゆ
る配列、及び（ｂ）上述の鎖と同一相で挿入された少な
くとも１つの有利なＤＮＡ配列、を含む組換え型ベクタ
ー及び殺虫剤への利用に関する。
換え型ベクターの提供。 【解決手段】グラム陽性菌の中で複製でき、しかも
（ａ）ＢａｌＩ−ＨｐａＩ部位間で約２．６kbのサイズ
をもつBacillus thuringiensisのヌクレオチド鎖Ｉ、又
は、グラム陽性菌内で機能的なプロモーターの制御下に
あるとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎり
において、前記鎖に含まれている全てのフラグメント、
又は高度にストリンジェントな条件下で鎖Ｉ又は上述の
フラグメントの相補的配列とハイブリダイズするあらゆ
る配列、及び（ｂ）上述の鎖と同一相で挿入された少な
くとも１つの有利なＤＮＡ配列、を含む組換え型ベクタ
ー及び殺虫剤への利用に関する。
Description
【０００１】本発明は、新型のグラム陽性レプリコン及
び組換え型ベクターの構築のためのその利用に関する。
び組換え型ベクターの構築のためのその利用に関する。
【０００２】天然の細菌プラスミドは、一般に高い安定
性を備えた状態にある。これらのプラスミドが偶然に分
布しているならば、プラスミドを含まない細胞が生じる
理論上の確率（Ｌ）は、Ｌ＝（1/2）2nという等式から
得られる（なお、式中、ｎは細胞１つあたりのプラスミ
ド分子数であり、プラスミドの２ｎ個のコピーが分裂の
直前に存在すると仮定されている）。かくして、選択的
圧力が無い状態で少ないコピー数のプラスミドの損失を
避けるためには効果的なメカニズムが必要であるのに対
し、コピー数の多いプラスミドは、無作為分布に従って
安定した形で維持されることができる（Nordstrom 及び
Austin, 1989, Annu. Rev. Genet. 23:37-69)。
性を備えた状態にある。これらのプラスミドが偶然に分
布しているならば、プラスミドを含まない細胞が生じる
理論上の確率（Ｌ）は、Ｌ＝（1/2）2nという等式から
得られる（なお、式中、ｎは細胞１つあたりのプラスミ
ド分子数であり、プラスミドの２ｎ個のコピーが分裂の
直前に存在すると仮定されている）。かくして、選択的
圧力が無い状態で少ないコピー数のプラスミドの損失を
避けるためには効果的なメカニズムが必要であるのに対
し、コピー数の多いプラスミドは、無作為分布に従って
安定した形で維持されることができる（Nordstrom 及び
Austin, 1989, Annu. Rev. Genet. 23:37-69)。
【０００３】グラム陰性菌においては、Ｆ、Ｐ１又はＲ
１といったコピー数の少ないプラスミドに関して、プラ
スミドの維持機能を有する複数の系が記載されてきた。
これらには、プラスミド分子を各娘細胞が確実に受入れ
るようにする真の分配機能（Austin及びNordstrom, 199
0, Cell 60: 351-354)及びプラスミドを失う細胞の分離
後の破壊に関与するｈｏｋ／ｓｏｋ及びｃｃｄ系（Jaff
e et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841- 849; Gerde
s et al., 1986, Mol. Microbiol. 4: 1807-1818) が含
まれている。さらに、レプリコンの無作為分布を可能に
する補助的機能についても記載されてきた。
１といったコピー数の少ないプラスミドに関して、プラ
スミドの維持機能を有する複数の系が記載されてきた。
これらには、プラスミド分子を各娘細胞が確実に受入れ
るようにする真の分配機能（Austin及びNordstrom, 199
0, Cell 60: 351-354)及びプラスミドを失う細胞の分離
後の破壊に関与するｈｏｋ／ｓｏｋ及びｃｃｄ系（Jaff
e et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841- 849; Gerde
s et al., 1986, Mol. Microbiol. 4: 1807-1818) が含
まれている。さらに、レプリコンの無作為分布を可能に
する補助的機能についても記載されてきた。
【０００４】例としては、ｐＳＣ１０１のｐａｒ遺伝子
座（Tucker et al., 1984, Cell 38: 191-201)及びＣｏ
ｌＥ１の部位特異的組換え系（Summers 及びSherrat, 1
984,Cell 36: 1097-1103)が挙げられる。
座（Tucker et al., 1984, Cell 38: 191-201)及びＣｏ
ｌＥ１の部位特異的組換え系（Summers 及びSherrat, 1
984,Cell 36: 1097-1103)が挙げられる。
【０００５】グラム陽性菌においては、プラスミドの安
定した維持のために必要な機能に関して利用可能な情報
ははるかに少ない。一本鎖ＤＮＡをもつ中間体による
「ローリングサークル」メカニズムによって複製するコ
ピー数の少ない又は多いプラスミドにおいては（te Rie
le et al., 1986a, EMBO J. 5: 631-637, 1986b, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83: 2541-2545; Gruss及びEhrli
ch, 1989, Microbiol.Rev. 53: 231-241) 、安定性は、
離散的機能(fonction discrete) とではなく複製と結び
つけられる。既知の異なるプラスミドｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＡ１０６０、ｐＭＶ１５８（Bron et al., 1991b, Pl
asmid 19: 231-241)及びｐＬＳ１１（Chang et al., 19
87, J. Bacteriol. 169: 3952-3962) については、安定
性領域は、二本鎖プラスミドＤＮＡへの一本鎖ＤＮＡの
変換を制御する「負の」起点である。これらのプラスミ
ドの複製は、プラスミドによってコードされるタンパク
質によって確保される。これらのプラスミドは、往々に
して、クローニングベクターとして利用される場合に構
造及び分離の観点から見て不安定であり、これはおそら
くその特殊な複製様式に起因するものと思われる。
定した維持のために必要な機能に関して利用可能な情報
ははるかに少ない。一本鎖ＤＮＡをもつ中間体による
「ローリングサークル」メカニズムによって複製するコ
ピー数の少ない又は多いプラスミドにおいては（te Rie
le et al., 1986a, EMBO J. 5: 631-637, 1986b, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83: 2541-2545; Gruss及びEhrli
ch, 1989, Microbiol.Rev. 53: 231-241) 、安定性は、
離散的機能(fonction discrete) とではなく複製と結び
つけられる。既知の異なるプラスミドｐＵＢ１１０、ｐ
ＴＡ１０６０、ｐＭＶ１５８（Bron et al., 1991b, Pl
asmid 19: 231-241)及びｐＬＳ１１（Chang et al., 19
87, J. Bacteriol. 169: 3952-3962) については、安定
性領域は、二本鎖プラスミドＤＮＡへの一本鎖ＤＮＡの
変換を制御する「負の」起点である。これらのプラスミ
ドの複製は、プラスミドによってコードされるタンパク
質によって確保される。これらのプラスミドは、往々に
して、クローニングベクターとして利用される場合に構
造及び分離の観点から見て不安定であり、これはおそら
くその特殊な複製様式に起因するものと思われる。
【０００６】グラム陽性レプリコンの第２のクラスは、
コピー数の少ない大きなプラスミド、ｐＴＢ１９、ｐＩ
Ｐ４０４及びｐＡＭβ１を含む（Imanaka et al., 198
6, Mol. Gen. Genet. 205: 90-96; Garnier及びCole, 1
988, Plasmid 19: 151-160; Swinfield et al., 1990,
Gene 87: 79-90)。その複製には、「ローリングサーク
ル」メカニズムが複製に関与してくるプラスミドのもの
と全く相同性を共有しないプラスミドによってコードさ
れるタンパク質が必要である。これらのプラスミドは、
複製中に一本鎖ＤＮＡを蓄積せず（Garnier 及び Cole,
1988, Plasmid 19: 151-160; Janniere et al., 1990,
Gene 87: 53-61)、構造的見地からみて安定している
（Janniere et al., 1990, Gene 87: 53-61)。
コピー数の少ない大きなプラスミド、ｐＴＢ１９、ｐＩ
Ｐ４０４及びｐＡＭβ１を含む（Imanaka et al., 198
6, Mol. Gen. Genet. 205: 90-96; Garnier及びCole, 1
988, Plasmid 19: 151-160; Swinfield et al., 1990,
Gene 87: 79-90)。その複製には、「ローリングサーク
ル」メカニズムが複製に関与してくるプラスミドのもの
と全く相同性を共有しないプラスミドによってコードさ
れるタンパク質が必要である。これらのプラスミドは、
複製中に一本鎖ＤＮＡを蓄積せず（Garnier 及び Cole,
1988, Plasmid 19: 151-160; Janniere et al., 1990,
Gene 87: 53-61)、構造的見地からみて安定している
（Janniere et al., 1990, Gene 87: 53-61)。
【０００７】コピー数の少ないこれらのプラスミドの潜
在的分配機能に関しては、いかなる情報も利用可能でな
い。しかしながら、これらの機能は、バチルス(Bacillu
s;桿菌) のような胞子形成性グラム陽性菌におけるその
維持にとって不可欠なものである。これらの細菌の分化
段階中、胞子区画は細胞の約６分の１を占めているにす
ぎず、プラスミドを含まない胞子が産生される確率は、
Ｌ＝（5/6)2nである。その結果、胞子形成中のプラスミ
ドの無作為分布が、胞子集団におけるレプリコンの徹底
的な損失を導く可能性がある（ｎ≦１０で）。
在的分配機能に関しては、いかなる情報も利用可能でな
い。しかしながら、これらの機能は、バチルス(Bacillu
s;桿菌) のような胞子形成性グラム陽性菌におけるその
維持にとって不可欠なものである。これらの細菌の分化
段階中、胞子区画は細胞の約６分の１を占めているにす
ぎず、プラスミドを含まない胞子が産生される確率は、
Ｌ＝（5/6)2nである。その結果、胞子形成中のプラスミ
ドの無作為分布が、胞子集団におけるレプリコンの徹底
的な損失を導く可能性がある（ｎ≦１０で）。
【０００８】胞子形成性グラム陽性菌Bacillus thuring
iensisは、胞子形成中に殺虫毒素を産生するその能力に
よって知られている（Lereclus et al., 1989b, 原核生
物発生の調節(Regulation of Procaryotic Developmen
t) 、米国微生物学会、ワシントンＤＣ、255-276)。こ
れらのパラ胞子タンパク質（δ−エンドトキシン）は、
各々、幼虫に対するその活性スペクトルに応じてＣｒｙ
Ｉ、II、III又はIVとして分類される（Hofte 及びWhite
ley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255)。さまざま
な昆虫目に対して活性なδ−エンドトキシンをコードす
る異なるｃｒｙ遺伝子がクローニングされ、その自然宿
主内でのその発現の分析、及び遺伝子工学によって得ら
れる防虫のための改善された特性を呈する菌株の構築
が、電気穿孔法による形質転換によって今や可能となっ
ている。B. thurungiensisは、検査された大部分の菌株
において常在する一連の複合プラスミドを呈する（Gonz
alez et al., 1981, Plasmid 5: 351-365; Lereclus et
al., 1982, Mol. Gen. Genet.186: 391-398; Kronstad
et al., 1983, J. Bacteriol. 154: 419-428）。これ
らのプラスミドが広範に存在することは、非常に有効な
複製及び安定性機能を示唆している。この確認事実に基
づいて、小さなクリプティック（隠性）プラスミドのク
ローニング及び特徴づけの研究（Mahillon et al., 198
8, Plasmid 19: 169-173; Mahillon及びSeurinck, 198
8, Nucleic Acids Res. 16: 11827-11828,McDowell et
al., 1991, Plasmid 25: 113-120) 、ならびに大きなプ
ラスミド（Baum et al., 1990, Appl. Environ. Microb
iol. 56: 3420-3428) 及びそれぞれ８．６kbと１５kbの
２つのさらに小さいプラスミドｐＨＴ１０００とｐＨＴ
１０３０（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. L
ett. 49: 417-422）の複製領域の単離が行なわれた。
iensisは、胞子形成中に殺虫毒素を産生するその能力に
よって知られている（Lereclus et al., 1989b, 原核生
物発生の調節(Regulation of Procaryotic Developmen
t) 、米国微生物学会、ワシントンＤＣ、255-276)。こ
れらのパラ胞子タンパク質（δ−エンドトキシン）は、
各々、幼虫に対するその活性スペクトルに応じてＣｒｙ
Ｉ、II、III又はIVとして分類される（Hofte 及びWhite
ley, 1989, Microbiol. Rev. 53: 242-255)。さまざま
な昆虫目に対して活性なδ−エンドトキシンをコードす
る異なるｃｒｙ遺伝子がクローニングされ、その自然宿
主内でのその発現の分析、及び遺伝子工学によって得ら
れる防虫のための改善された特性を呈する菌株の構築
が、電気穿孔法による形質転換によって今や可能となっ
ている。B. thurungiensisは、検査された大部分の菌株
において常在する一連の複合プラスミドを呈する（Gonz
alez et al., 1981, Plasmid 5: 351-365; Lereclus et
al., 1982, Mol. Gen. Genet.186: 391-398; Kronstad
et al., 1983, J. Bacteriol. 154: 419-428）。これ
らのプラスミドが広範に存在することは、非常に有効な
複製及び安定性機能を示唆している。この確認事実に基
づいて、小さなクリプティック（隠性）プラスミドのク
ローニング及び特徴づけの研究（Mahillon et al., 198
8, Plasmid 19: 169-173; Mahillon及びSeurinck, 198
8, Nucleic Acids Res. 16: 11827-11828,McDowell et
al., 1991, Plasmid 25: 113-120) 、ならびに大きなプ
ラスミド（Baum et al., 1990, Appl. Environ. Microb
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２つのさらに小さいプラスミドｐＨＴ１０００とｐＨＴ
１０３０（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. L
ett. 49: 417-422）の複製領域の単離が行なわれた。
【０００９】B. subtilis における分離安定性が高いこ
とから、ｐＨＴ１０３０が研究され、シャトルベクター
ｐＨＴ３１０１を構築するため、ｐＨＴ１０３０の複製
及び安定性の機能を含む２．９kbのＤＮＡフラグメント
が利用された（Lereclus etal., 1989a, FEMS Microbio
l. Lett. 60: 211-218 ）。このキメラプラスミドは、
B. subtilis 及びB. thuringiensisの両方において安定
した形で維持される大きいＤＮＡフラグメントのクロー
ニングを可能にする（Lereclus et al., 1989a, FEMS M
icrobiol. Lett. 60: 211-218; Debarbouille et al.,
1990, J. Bacteriol. 172: 3966-3973）。
とから、ｐＨＴ１０３０が研究され、シャトルベクター
ｐＨＴ３１０１を構築するため、ｐＨＴ１０３０の複製
及び安定性の機能を含む２．９kbのＤＮＡフラグメント
が利用された（Lereclus etal., 1989a, FEMS Microbio
l. Lett. 60: 211-218 ）。このキメラプラスミドは、
B. subtilis 及びB. thuringiensisの両方において安定
した形で維持される大きいＤＮＡフラグメントのクロー
ニングを可能にする（Lereclus et al., 1989a, FEMS M
icrobiol. Lett. 60: 211-218; Debarbouille et al.,
1990, J. Bacteriol. 172: 3966-3973）。
【００１０】細菌、特にグラム陽性菌の形質転換に適合
させたクローニングベクター、場合によっては発現ベク
ターを構築するのに適した手段を構成する目的で、本発
明者は、プラスミドｐＨＴ１０３０の２．９kbのＤＮＡ
フラグメントの内部に（Lereclus et al., 1989a, FEMS
Microbiol. Lett. 60: 211-218)約２．６kbのヌクレオ
チド鎖を、又この鎖の内部にグラム陽性菌を形質転換す
るために利用されるプラスミドの複製及び安定性機能に
特異的な異なる配列を同定した。
させたクローニングベクター、場合によっては発現ベク
ターを構築するのに適した手段を構成する目的で、本発
明者は、プラスミドｐＨＴ１０３０の２．９kbのＤＮＡ
フラグメントの内部に（Lereclus et al., 1989a, FEMS
Microbiol. Lett. 60: 211-218)約２．６kbのヌクレオ
チド鎖を、又この鎖の内部にグラム陽性菌を形質転換す
るために利用されるプラスミドの複製及び安定性機能に
特異的な異なる配列を同定した。
【００１１】これらの特異的配列の同定により、宿主内
のベクターの挙動を調節するため、例えば一定の与えら
れた細菌内でのベクターのコピー数及び安定性を調節す
るため、グラム陽性菌の中での配列のクローニング、場
合によっては発現を目的とする組換え型ベクターの構築
の枠内で利用できる２．６kbのフラグメントの要素は何
でありうるかを、さらに正確に決定することが可能にな
った。実際、本発明者は、それ自体環境内で散布される
目的をもつ細菌を形質転換するために利用される組換え
型ベクターの調製のようないくつかの利用分野におい
て、２．６kbのフラグメントが有する安定性機能が、邪
魔なものでありうるということを確認した。
のベクターの挙動を調節するため、例えば一定の与えら
れた細菌内でのベクターのコピー数及び安定性を調節す
るため、グラム陽性菌の中での配列のクローニング、場
合によっては発現を目的とする組換え型ベクターの構築
の枠内で利用できる２．６kbのフラグメントの要素は何
でありうるかを、さらに正確に決定することが可能にな
った。実際、本発明者は、それ自体環境内で散布される
目的をもつ細菌を形質転換するために利用される組換え
型ベクターの調製のようないくつかの利用分野におい
て、２．６kbのフラグメントが有する安定性機能が、邪
魔なものでありうるということを確認した。
【００１２】本発明の枠内で本発明者が得た結果は、従
って、特定の利用分野に適合することのできるベクター
の構築を考慮できるようにするものである。
って、特定の利用分野に適合することのできるベクター
の構築を考慮できるようにするものである。
【００１３】本発明者が獲得した知識を考慮に入れて、
さまざまなレベルの適合を考えることができる：例え
ば、本発明に基づいて構築される組換え型ベクターの複
製の度合をグラム陽性細菌の中で調節することが可能で
ある。
さまざまなレベルの適合を考えることができる：例え
ば、本発明に基づいて構築される組換え型ベクターの複
製の度合をグラム陽性細菌の中で調節することが可能で
ある。
【００１４】同様にして、これらのベクターの分離安定
性は、定められた或る種のパラメーターに作用を加える
ことによって制御が可能である。
性は、定められた或る種のパラメーターに作用を加える
ことによって制御が可能である。
【００１５】本発明のもう１つの利点は、グラム陰性
菌、そして特に有利にはグラム陽性菌を形質転換するた
めに利用されるベクターが、その複製のために宿主のタ
ンパク質を利用する、という事実の結果としてもたらさ
れるものである。
菌、そして特に有利にはグラム陽性菌を形質転換するた
めに利用されるベクターが、その複製のために宿主のタ
ンパク質を利用する、という事実の結果としてもたらさ
れるものである。
【００１６】従って、本発明は、グラム陽性菌の中で複
製でき、場合によってはこれらの細菌において発現ベク
ターと同時に機能することのできる組換え型ベクターを
目的とする。本発明は、同様に、構築されたベクターの
複製及び／又は安定性の機能に介入する、グラム陽性菌
の形質転換に適合させたベクターの構築の枠内で利用可
能な、異なるヌクレオチドフラグメントをもその目的と
している。同様に本発明の枠内に入るのは、上述のベク
ターによって形質転換された宿主細胞及び形質転換され
た細胞（菌）株（形質転換体）が関与する組成物であ
る。
製でき、場合によってはこれらの細菌において発現ベク
ターと同時に機能することのできる組換え型ベクターを
目的とする。本発明は、同様に、構築されたベクターの
複製及び／又は安定性の機能に介入する、グラム陽性菌
の形質転換に適合させたベクターの構築の枠内で利用可
能な、異なるヌクレオチドフラグメントをもその目的と
している。同様に本発明の枠内に入るのは、上述のベク
ターによって形質転換された宿主細胞及び形質転換され
た細胞（菌）株（形質転換体）が関与する組成物であ
る。
【００１７】本発明は同様に、ベクターの調製方法及び
細胞株の形質転換方法に関する。
細胞株の形質転換方法に関する。
【００１８】グラム陽性菌の中で複製可能な組換え型ベ
クターは： ａ）ヌクレオチド１〜２６４２により限定され下記配列
を満たし、ＢａｌＩ−ＨｐａＩ部位の間に含まれる約
２．６kbのサイズのBacillus thuringiensisのヌクレオ
チド鎖Ｉ、又は − グラム陽性菌内で機能的プロモーターの制御下にあ
るとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎりに
おいて、この鎖の中に含まれている全てのフラグメン
ト、又は、 − 高度にストリンジェントな条件下で、鎖Ｉ又は上述
のフラグメ ントの相補的配列とハイブリダイズする全
ての配列、及びｂ）上述の鎖と同一相で（相を合わせ
て）挿入された少なくとも１つの有利なＤＮＡ配列を含
むことを特徴とする。
クターは： ａ）ヌクレオチド１〜２６４２により限定され下記配列
を満たし、ＢａｌＩ−ＨｐａＩ部位の間に含まれる約
２．６kbのサイズのBacillus thuringiensisのヌクレオ
チド鎖Ｉ、又は − グラム陽性菌内で機能的プロモーターの制御下にあ
るとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎりに
おいて、この鎖の中に含まれている全てのフラグメン
ト、又は、 − 高度にストリンジェントな条件下で、鎖Ｉ又は上述
のフラグメ ントの相補的配列とハイブリダイズする全
ての配列、及びｂ）上述の鎖と同一相で（相を合わせ
て）挿入された少なくとも１つの有利なＤＮＡ配列を含
むことを特徴とする。
【００１９】本発明の枠内で鎖Ｉ又はＩのフラグメント
の相補的配列とハイブリダイズする配列は、５０％ホル
ムアミド、６６０mM塩化ナトリウム、６６mMクエン酸ナ
トリウムを含む媒体と４２℃で１２時間のインキュベー
ションによって構成される高度にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする。
の相補的配列とハイブリダイズする配列は、５０％ホル
ムアミド、６６０mM塩化ナトリウム、６６mMクエン酸ナ
トリウムを含む媒体と４２℃で１２時間のインキュベー
ションによって構成される高度にストリンジェントな条
件下でハイブリダイズする。
【００２０】
【表１】
【００２１】
【表２】
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】ヌクレオチド鎖Ｉが由来するB. thuringie
nsis菌株は、Lereclusらの１９８８年の刊行物 (FEMS M
icrobiol. Lett. 49: 417-422)中に記載されている菌株
である。
nsis菌株は、Lereclusらの１９８８年の刊行物 (FEMS M
icrobiol. Lett. 49: 417-422)中に記載されている菌株
である。
【００２５】上述の配列により決定される複製機能は、
プロモーターの選択によって調節されうる。このプロモ
ーターは、２．６kbのフラグメント内に存在するプロモ
ーターであってもよいし、或は又、グラム陽性菌内で機
能することのできるあらゆるプロモーターであってもよ
く、好ましいのはｖｅｇ型の強いプロモーター（Moran
et al., Mol. Gen. Genet. 186: 339-346)である。
プロモーターの選択によって調節されうる。このプロモ
ーターは、２．６kbのフラグメント内に存在するプロモ
ーターであってもよいし、或は又、グラム陽性菌内で機
能することのできるあらゆるプロモーターであってもよ
く、好ましいのはｖｅｇ型の強いプロモーター（Moran
et al., Mol. Gen. Genet. 186: 339-346)である。
【００２６】鎖Ｉの相補的配列とハイブリダイズするそ
の能力によって規定される本発明の実施に適した配列
は、上述の高度にストリンジェントな条件下で、この鎖
又は上述のフラグメントと結合することができる。
の能力によって規定される本発明の実施に適した配列
は、上述の高度にストリンジェントな条件下で、この鎖
又は上述のフラグメントと結合することができる。
【００２７】一定の与えられたヌクレオチド配列との関
係において本発明の枠内で相補的配列と呼ぶのは、この
ヌクレオチド配列との関係において相補的な逆配列のこ
とである。「逆」という表現は、自ら含むヌクレオチド
の性質により一定の与えられた基本配列に対しても相補
的である核酸の５′−３′の向きの回復を考慮に入れた
ものである。
係において本発明の枠内で相補的配列と呼ぶのは、この
ヌクレオチド配列との関係において相補的な逆配列のこ
とである。「逆」という表現は、自ら含むヌクレオチド
の性質により一定の与えられた基本配列に対しても相補
的である核酸の５′−３′の向きの回復を考慮に入れた
ものである。
【００２８】いわゆる「有利なＤＮＡ配列」というの
は、その自然宿主でも又はその特性にとって有利な異な
る株でもよい宿主細胞中でクローニングし、さらには発
現させようとしている、研究の枠内での利点又は経済的
利点を呈する可能性のある配列である。
は、その自然宿主でも又はその特性にとって有利な異な
る株でもよい宿主細胞中でクローニングし、さらには発
現させようとしている、研究の枠内での利点又は経済的
利点を呈する可能性のある配列である。
【００２９】一例を挙げると、有利なＤＮＡ配列として
は、昆虫の幼虫に対する毒性をもつ結晶の産生に関与す
る、B. thuringiensisのδ−エンドトキシンをコードす
るＤＮＡ配列がある。この点において、さらに具体的に
は、Hofte 及びWhiteleyの刊行物（1989, Microbiol. R
ev. 53: 242-255 ）に記載されているＣｒｙＩ、Ｃｒｙ
II、ＣｒｙIII又はＣｒｙIVと呼ばれるＤＮＡ配列、又
は殺虫活性を呈するδ−エンドトキシンをコードするそ
の他全てのＣｒｙ遺伝子が挙げられる。
は、昆虫の幼虫に対する毒性をもつ結晶の産生に関与す
る、B. thuringiensisのδ−エンドトキシンをコードす
るＤＮＡ配列がある。この点において、さらに具体的に
は、Hofte 及びWhiteleyの刊行物（1989, Microbiol. R
ev. 53: 242-255 ）に記載されているＣｒｙＩ、Ｃｒｙ
II、ＣｒｙIII又はＣｒｙIVと呼ばれるＤＮＡ配列、又
は殺虫活性を呈するδ−エンドトキシンをコードするそ
の他全てのＣｒｙ遺伝子が挙げられる。
【００３０】その他の有利なＤＮＡ配列は、例えば発酵
その他の方法によって工業的規模でグラム陽性菌中で産
生させうる配列である。一例としては、タンパク質分解
酵素（プロテアーゼ）、脂肪分解酵素（リパーゼ）、ア
ミラーゼのような酵素及びタンパク質ホルモンが挙げら
れる。
その他の方法によって工業的規模でグラム陽性菌中で産
生させうる配列である。一例としては、タンパク質分解
酵素（プロテアーゼ）、脂肪分解酵素（リパーゼ）、ア
ミラーゼのような酵素及びタンパク質ホルモンが挙げら
れる。
【００３１】その他の有利な配列は、宿主細胞との関係
において非相同な配列により構成される。例えば、免疫
原として利用可能な細菌性抗原、例えばＨＢｓ抗原のよ
うなウイルス性抗原、さらにはP.falciparumのもののよ
うな寄生虫の抗原をコードする配列を挙げることができ
る。
において非相同な配列により構成される。例えば、免疫
原として利用可能な細菌性抗原、例えばＨＢｓ抗原のよ
うなウイルス性抗原、さらにはP.falciparumのもののよ
うな寄生虫の抗原をコードする配列を挙げることができ
る。
【００３２】本発明の有利な実施態様によると、上述の
組換え型ベクターは、 − ヌクレオチド鎖Ｉの中に含まれ、しかも、形成され
た組換え型 ベクターの自律的複製を確保することがで
き、B.thuringiensis の中で約１kbの長さのＢａｌＩ−
ＡｆｌII部位（ヌクレオチド１〜１０１６）又はＢａｌ
Ｉ−ＳｃａＩ部位（ヌクレオチド１〜１０７６）によっ
て制限されていることを特徴とするフラグメントII、 − 又は、高度にストリンジェントな条件下でフラグメ
ントIIとハ イブリダイズする配列；及び − 前記フラグメントと同一相で挿入される少なくとも
１つの有利 なＤＮＡ配列を含んでいる。
組換え型ベクターは、 − ヌクレオチド鎖Ｉの中に含まれ、しかも、形成され
た組換え型 ベクターの自律的複製を確保することがで
き、B.thuringiensis の中で約１kbの長さのＢａｌＩ−
ＡｆｌII部位（ヌクレオチド１〜１０１６）又はＢａｌ
Ｉ−ＳｃａＩ部位（ヌクレオチド１〜１０７６）によっ
て制限されていることを特徴とするフラグメントII、 − 又は、高度にストリンジェントな条件下でフラグメ
ントIIとハ イブリダイズする配列；及び − 前記フラグメントと同一相で挿入される少なくとも
１つの有利 なＤＮＡ配列を含んでいる。
【００３３】IIと呼称されるこのフラグメントの存在に
よって、形成された組換え型ベクターの自律的複製が、
この複製のためにその宿主タンパク質が利用されるグラ
ム陽性菌の中で確保されることになる。
よって、形成された組換え型ベクターの自律的複製が、
この複製のためにその宿主タンパク質が利用されるグラ
ム陽性菌の中で確保されることになる。
【００３４】本発明のもう１つの実施態様によると、組
換え型ベクターは、グラム陽性菌内で機能的なプロモー
ターと同一相で、 − B. thuringiensisの中で約７０５bpの長さをもちヌ
クレオチド３１２〜１０１６を含むＳｐｅＩ−ＡｆｌII
部位により限定されているヌクレオチド配列IIIに対応
し、前述の鎖Ｉ及び鎖IIの中に含まれるＤＮＡフラグメ
ント（レプリコンとも呼ばれる）、又は高度にストリン
ジェントな条件下で配列IIIの相補的配列とハイブリダ
イズするフラグメント、又は、プロモーターの制御下に
置かれたとき、グラム陽性菌の中で形成されたベクター
の複製を可能にするかぎりにおいて配列IIIとの関係に
おいて変更されたフラグメント、及び −レプリコンと同一相で挿入された少なくとも１つの有
利な ＤＮＡ配列を含んでいる。
換え型ベクターは、グラム陽性菌内で機能的なプロモー
ターと同一相で、 − B. thuringiensisの中で約７０５bpの長さをもちヌ
クレオチド３１２〜１０１６を含むＳｐｅＩ−ＡｆｌII
部位により限定されているヌクレオチド配列IIIに対応
し、前述の鎖Ｉ及び鎖IIの中に含まれるＤＮＡフラグメ
ント（レプリコンとも呼ばれる）、又は高度にストリン
ジェントな条件下で配列IIIの相補的配列とハイブリダ
イズするフラグメント、又は、プロモーターの制御下に
置かれたとき、グラム陽性菌の中で形成されたベクター
の複製を可能にするかぎりにおいて配列IIIとの関係に
おいて変更されたフラグメント、及び −レプリコンと同一相で挿入された少なくとも１つの有
利な ＤＮＡ配列を含んでいる。
【００３５】ベクターの複製に関して機能的であるため
には、ヌクレオチド配列IIIは、配列IIIと同じ方向に向
けられたプロモーターの制御下に置かれなくてはならな
い。
には、ヌクレオチド配列IIIは、配列IIIと同じ方向に向
けられたプロモーターの制御下に置かれなくてはならな
い。
【００３６】配列Ｉ、II及びIIIは、ヌクレオチドの位
置３９０のところに対称の中心点が局在している対称配
列を含む、約７０ヌクレオチドの核酸フラグメントを含
んでいる。ヌクレオチド３５５と４２４の間に含まれる
この配列は、不完全に対称であり、それ自体、対称の中
心が位置４０８にあるヌクレオチド３９５と４２１の間
に含まれる対称配列を含んでいる。
置３９０のところに対称の中心点が局在している対称配
列を含む、約７０ヌクレオチドの核酸フラグメントを含
んでいる。ヌクレオチド３５５と４２４の間に含まれる
この配列は、不完全に対称であり、それ自体、対称の中
心が位置４０８にあるヌクレオチド３９５と４２１の間
に含まれる対称配列を含んでいる。
【００３７】本発明に従った組換え型ベクターの複製の
効果は、このベクターの自律的複製を可能にし、かつB.
thuringiensis内でヌクレオチド１〜１４６を含むＢａ
ｌＩ−ＮｄｅＩ部位によって限定されるヌクレオチド配
列IVに対応するか又はこの配列IVの中に含まれる鎖III
と同一相のプロモーター、又は高度にストリンジェント
な条件下で配列IVの相補的配列とハイブリダイズする配
列から成るプロモーター、又は、レプリコンと同一相に
あるとき、上述の条件下で機能的であるプロモーターを
構成するかぎりにおいて配列IVとの関係において変更さ
れた配列、を利用することによって確保できる。
効果は、このベクターの自律的複製を可能にし、かつB.
thuringiensis内でヌクレオチド１〜１４６を含むＢａ
ｌＩ−ＮｄｅＩ部位によって限定されるヌクレオチド配
列IVに対応するか又はこの配列IVの中に含まれる鎖III
と同一相のプロモーター、又は高度にストリンジェント
な条件下で配列IVの相補的配列とハイブリダイズする配
列から成るプロモーター、又は、レプリコンと同一相に
あるとき、上述の条件下で機能的であるプロモーターを
構成するかぎりにおいて配列IVとの関係において変更さ
れた配列、を利用することによって確保できる。
【００３８】本発明に従ったもう１つの組換え型ベクタ
ーは、上述のような配列III又はその誘導体の他に、 − 形成された組換え型ベクターのグラム陽性菌におけ
る自律的複製に必要な要素及びベクターの分離安定性に
寄与する要素を含み、B. thuringiensisにおいてヌクレ
オチド１〜３０４及び１〜３１４をそれぞれ含むＢａｌ
Ｉ−ＳｓｐＩ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩ部位により限定さ
れたヌクレオチド配列Vに対応するか又はこの配列Vの中
に含まれる配列 − 又は、高度にストリンジェントな条件下で配列Vの
相補的配列 とハイブリダイズする配列、 − 又は、ベクターの内部の配列Vの自律的複製及び安
定性という機能的特性を保存するかぎりにおいて、配列
Vとの関係において変更された配列を含むことを特徴と
する。
ーは、上述のような配列III又はその誘導体の他に、 − 形成された組換え型ベクターのグラム陽性菌におけ
る自律的複製に必要な要素及びベクターの分離安定性に
寄与する要素を含み、B. thuringiensisにおいてヌクレ
オチド１〜３０４及び１〜３１４をそれぞれ含むＢａｌ
Ｉ−ＳｓｐＩ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩ部位により限定さ
れたヌクレオチド配列Vに対応するか又はこの配列Vの中
に含まれる配列 − 又は、高度にストリンジェントな条件下で配列Vの
相補的配列 とハイブリダイズする配列、 − 又は、ベクターの内部の配列Vの自律的複製及び安
定性という機能的特性を保存するかぎりにおいて、配列
Vとの関係において変更された配列を含むことを特徴と
する。
【００３９】本発明は同様に、グラム陽性菌内での組換
え型ベクターの安定した維持を確保し、しかも − B. thuringiensisにおいて約１，２３４bpの長さを
有し、ヌクレオチド１４０８〜２６４２を含むＨａｅII
I−ＨｐａＩ部位によって限定されたヌクレオチド配列V
I、又は細菌内での安定した維持に寄与する配列VIの全
ての部分、特に約３５１bpの配列VIの鎖ＨａｅIII−Ａ
ｃｃＩを含むフラグメント、 − 又は、形成されたベクターに対して安定性を付与す
る配列VIの能力を保存するかぎりにおいて、上述のフラ
グメントとの関係において変更されたＤＮＡフラグメン
ト、 − 又は、上述の相補的配列とハイブリダイズするフラ
グメントに対応するＤＮＡフラグメントをさらに含むこ
とを特徴とする、上述の定義づけの１つを満たすベクタ
ーにも関する。
え型ベクターの安定した維持を確保し、しかも − B. thuringiensisにおいて約１，２３４bpの長さを
有し、ヌクレオチド１４０８〜２６４２を含むＨａｅII
I−ＨｐａＩ部位によって限定されたヌクレオチド配列V
I、又は細菌内での安定した維持に寄与する配列VIの全
ての部分、特に約３５１bpの配列VIの鎖ＨａｅIII−Ａ
ｃｃＩを含むフラグメント、 − 又は、形成されたベクターに対して安定性を付与す
る配列VIの能力を保存するかぎりにおいて、上述のフラ
グメントとの関係において変更されたＤＮＡフラグメン
ト、 − 又は、上述の相補的配列とハイブリダイズするフラ
グメントに対応するＤＮＡフラグメントをさらに含むこ
とを特徴とする、上述の定義づけの１つを満たすベクタ
ーにも関する。
【００４０】グラム陽性菌における組換え型ベクターの
維持は、このベクターの用途に応じて重要でありうる。
維持は、このベクターの用途に応じて重要でありうる。
【００４１】例えば、高レベルで発現又はクローニング
することが望まれる配列を含む本発明のベクターでグラ
ム陽性菌を形質転換する場合、ベクターが安定している
ことが重要である。求められる安定性は、構造的安定性
である可能性もあれば分離安定性である可能性もあり、
この分離安定性は、上述の条件下での配列VI又はこの配
列のフラグメントの存在によって付与されるか、又は少
なくとも増大させられる。
することが望まれる配列を含む本発明のベクターでグラ
ム陽性菌を形質転換する場合、ベクターが安定している
ことが重要である。求められる安定性は、構造的安定性
である可能性もあれば分離安定性である可能性もあり、
この分離安定性は、上述の条件下での配列VI又はこの配
列のフラグメントの存在によって付与されるか、又は少
なくとも増大させられる。
【００４２】本発明の実施のためにはさまざまなベクタ
ーを利用することができる。有利には、プラスミドタイ
プのベクター、特に、B.thuringiensis から得られるよ
うな上述の要素の他に、ＰＵＣ１８又はＰＵＣ１９のよ
うなプラスミド要素を介入させるベクターを利用する。
ーを利用することができる。有利には、プラスミドタイ
プのベクター、特に、B.thuringiensis から得られるよ
うな上述の要素の他に、ＰＵＣ１８又はＰＵＣ１９のよ
うなプラスミド要素を介入させるベクターを利用する。
【００４３】本発明に従った組換え型ベクターは、さら
に、形質転換の後、組換え型ベクターを含むグラム陽性
菌を選択することを可能にする特異的選択系を含んでい
てもよい。
に、形質転換の後、組換え型ベクターを含むグラム陽性
菌を選択することを可能にする特異的選択系を含んでい
てもよい。
【００４４】このような系は、形質転換された細菌の代
謝に必要な酵素をコードする遺伝子で構成されていても
よい。この点において、これは、トリプトファン、ウラ
シル又はチミンのような代謝産物の合成を可能にする遺
伝子、又は糖の利用を可能にする遺伝子でありうる。
謝に必要な酵素をコードする遺伝子で構成されていても
よい。この点において、これは、トリプトファン、ウラ
シル又はチミンのような代謝産物の合成を可能にする遺
伝子、又は糖の利用を可能にする遺伝子でありうる。
【００４５】選択系は、同様に、組換え型クローンの着
色選択を可能にするｌａｃＺ又はＸｙｌＥ遺伝子のよう
な遺伝子、又はエリスロマイシン又はアンピシリン耐性
遺伝子のような一定の与えられた抗生物質に対する耐性
遺伝子により構成されていてもよい。
色選択を可能にするｌａｃＺ又はＸｙｌＥ遺伝子のよう
な遺伝子、又はエリスロマイシン又はアンピシリン耐性
遺伝子のような一定の与えられた抗生物質に対する耐性
遺伝子により構成されていてもよい。
【００４６】この最後のタイプの選択系は、好ましくは
形質転換体（本発明のベクターによって形質転換された
細菌）が環境内で散布される目的をもつものでない場合
に選択される。
形質転換体（本発明のベクターによって形質転換された
細菌）が環境内で散布される目的をもつものでない場合
に選択される。
【００４７】本発明の枠内で好ましい１つの組換え型ベ
クターは、Ｉ−１１１１という番号で１９９１年６月７
日付けでＣＮＣＭ〔フランス、パリにある国立微生物培
養収蔵機関(Collection Nationale de Cultures de Mic
roorganismes) 〕に寄託されたプラスミドｐＨＴ３１５
である。
クターは、Ｉ−１１１１という番号で１９９１年６月７
日付けでＣＮＣＭ〔フランス、パリにある国立微生物培
養収蔵機関(Collection Nationale de Cultures de Mic
roorganismes) 〕に寄託されたプラスミドｐＨＴ３１５
である。
【００４８】B. thuringiensis又はB. subtilis タイプ
の細菌内に組込まれた場合、約１５のコピー数を産生し
うるこのプラスミドは、出発プラスミドとしても利用で
き、例えば上述の有利な遺伝子の取込みによって変更さ
れうる。
の細菌内に組込まれた場合、約１５のコピー数を産生し
うるこのプラスミドは、出発プラスミドとしても利用で
き、例えば上述の有利な遺伝子の取込みによって変更さ
れうる。
【００４９】本発明の枠内で有利なもう１つのベクター
は、B. thuringiensisのＨａｅIII−ＨｐａＩの約１，
２３４bpのＤＮＡ配列と組換えられた、B. thuringiens
isの約１，０７６bpのＢａｌＩ−ＳｃａＩ配列又は約
１，０００bpのＤＮＡ配列IVのＢａｌＩ−ＡｆｌIIを含
むプラスミドｐＨＴ３１２０である。
は、B. thuringiensisのＨａｅIII−ＨｐａＩの約１，
２３４bpのＤＮＡ配列と組換えられた、B. thuringiens
isの約１，０７６bpのＢａｌＩ−ＳｃａＩ配列又は約
１，０００bpのＤＮＡ配列IVのＢａｌＩ−ＡｆｌIIを含
むプラスミドｐＨＴ３１２０である。
【００５０】本発明の好ましい一実施態様においては、
組換え型プラスミドは、各々グラム陽性菌の中で機能的
であるクローニングプロモーター、場合によっては発現
プロモーターの制御下にある、少なくとも２つの有利な
ＤＮＡ配列を含んでいる。
組換え型プラスミドは、各々グラム陽性菌の中で機能的
であるクローニングプロモーター、場合によっては発現
プロモーターの制御下にある、少なくとも２つの有利な
ＤＮＡ配列を含んでいる。
【００５１】有利なＤＮＡ配列をクローニングし、場合
によっては発現させるために上述のヌクレオチド鎖を利
用するには、これらのヌクレオチド配列が、有利なＤＮ
Ａ配列との関係においてシス位置にあることが必要であ
る。
によっては発現させるために上述のヌクレオチド鎖を利
用するには、これらのヌクレオチド配列が、有利なＤＮ
Ａ配列との関係においてシス位置にあることが必要であ
る。
【００５２】本発明は同様に、Ｉ、II、III、IV、V及び
VIという参照記号で上で記載されてきた、以下のように
定義づけされる異なるヌクレオチド配列にも関する：
VIという参照記号で上で記載されてきた、以下のように
定義づけされる異なるヌクレオチド配列にも関する：
【００５３】☆ 上述の配列のＢａｌＩ−ＨｐａＩ部位
の間に含まれた約２．６ kbのサイズのB. thuringiensi
sのヌクレオチド鎖Ｉ、又は、 − グラム陽性菌の中で機能的なプロモーターの制御下
にあるとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎ
りにおいて、この鎖の中に含まれる全てのフラグメン
ト、又は − 高度にストリンジェントな条件下で、上述の鎖又は
フラグメントの相補的配列とハイブリダイズするあらゆ
る配列；
の間に含まれた約２．６ kbのサイズのB. thuringiensi
sのヌクレオチド鎖Ｉ、又は、 − グラム陽性菌の中で機能的なプロモーターの制御下
にあるとき、組換え型ベクターの複製を可能にするかぎ
りにおいて、この鎖の中に含まれる全てのフラグメン
ト、又は − 高度にストリンジェントな条件下で、上述の鎖又は
フラグメントの相補的配列とハイブリダイズするあらゆ
る配列；
【００５４】☆ 鎖Ｉの中に含まれ、しかもB. thuring
iensisの約１，０１６bp （１．０１６kb）のＢａｌＩ
−ＡｆｌII又はＢａｌＩ−ＳｃａＩ部位により制限さ
れ、形成された組換え型ベクターの自律的複製を確保す
ることができることを特徴とするＤＮＡフラグメント、
又は高度にストリンジェントな条件下で上述のフラグメ
ントとハイブリダイズするあらゆる配列；
iensisの約１，０１６bp （１．０１６kb）のＢａｌＩ
−ＡｆｌII又はＢａｌＩ−ＳｃａＩ部位により制限さ
れ、形成された組換え型ベクターの自律的複製を確保す
ることができることを特徴とするＤＮＡフラグメント、
又は高度にストリンジェントな条件下で上述のフラグメ
ントとハイブリダイズするあらゆる配列；
【００５５】☆ 配列Ｉの中に含まれ、しかもBacillus
thuringiensisにおいてヌクレオチド３１２〜１０１６
を含むＳｐｅＩ−ＡｆｌII部位によって限定されたヌク
レオチド配列IIIに対応するか又はこの配列IIIの中に含
まれていることを特徴とするＤＮＡフラグメント又はレ
プリコン、又は、配列IIIの相補的配列とハイブリダイ
ズするフラグメント、又は、プロモーターと同一相にあ
るとき、グラム陽性菌内で、中にそれを組込む組換え型
ベクターの複製を可能にするかぎりにおいて、配列III
との関係において変更されたフラグメント；
thuringiensisにおいてヌクレオチド３１２〜１０１６
を含むＳｐｅＩ−ＡｆｌII部位によって限定されたヌク
レオチド配列IIIに対応するか又はこの配列IIIの中に含
まれていることを特徴とするＤＮＡフラグメント又はレ
プリコン、又は、配列IIIの相補的配列とハイブリダイ
ズするフラグメント、又は、プロモーターと同一相にあ
るとき、グラム陽性菌内で、中にそれを組込む組換え型
ベクターの複製を可能にするかぎりにおいて、配列III
との関係において変更されたフラグメント；
【００５６】☆B. thuringiensisにおいてヌクレオチド
１〜１４６を含む ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ部位によって限
定されたヌクレオチド配列IVに対応するか又はこの配列
IVの中に含まれていることを特徴とするプロモーター、
又は配列IVの相補的配列とハイブリダイズする配列、又
は、レプリコンと同一相にあるとき、組換え型ベクター
の自律的複製を可能にするその能力を、形成されたプロ
モーターが保持している限りにおいて配列IVとの関係に
おいて変更された配列；
１〜１４６を含む ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ部位によって限
定されたヌクレオチド配列IVに対応するか又はこの配列
IVの中に含まれていることを特徴とするプロモーター、
又は配列IVの相補的配列とハイブリダイズする配列、又
は、レプリコンと同一相にあるとき、組換え型ベクター
の自律的複製を可能にするその能力を、形成されたプロ
モーターが保持している限りにおいて配列IVとの関係に
おいて変更された配列；
【００５７】☆ グラム陽性菌の中でそれを含む組換え
型ベクターの複製を可能にする要素及びこのベクターに
対してその分離安定性を付与するのに貢献する要素を含
むプロモーターをそれ自体含んでおり、B. thuringiens
isの中でそれぞれヌクレオチド１〜３０４及び１〜３１
４を含むＢａｌＩ−ＳｓｐＩ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩ部
位により限定された配列Vに対応するか又はこの配列Vの
中に含まれていることを特徴とする、鎖Ｉ内に含まれた
ヌクレオチド配列、又は高度にストリンジェントな条件
下で配列Vの相補的配列とハイブリダイズする配列、又
は配列IIIの安定性及び自律的複製という機能的特性を
保っているかぎりにおいて配列Vとの関係において変更
された配列； − グラム陽性菌に導入された場合に、組換え型ベクタ
ーに対し て、グラム陽性菌内で安定した形で自らを維
持するか又は自らの安定性を増大させる能力を付与する
ことができ、B.thuringiensis において約１，２３４bp
の長さのヌクレオチド１４０８〜２６４２を含むか又は
約３５１bpの配列VIのＨａｅIII−ＡｃｃＩ鎖を含むＨ
ａｅIII−ＨｐａＩ部位によって限定されたヌクレオチ
ド配列VIに対応することを特徴とするＤＮＡフラグメン
ト、又はグラム陽性菌内でそれを含むベクターの安定性
に関する配列VIの特性を保持しているかぎりにおいて上
述のフラグメントとの関係において変更されたＤＮＡフ
ラグメント、又は上述のフラグメントの相補的配列とハ
イブリダイズするフラグメント。
型ベクターの複製を可能にする要素及びこのベクターに
対してその分離安定性を付与するのに貢献する要素を含
むプロモーターをそれ自体含んでおり、B. thuringiens
isの中でそれぞれヌクレオチド１〜３０４及び１〜３１
４を含むＢａｌＩ−ＳｓｐＩ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩ部
位により限定された配列Vに対応するか又はこの配列Vの
中に含まれていることを特徴とする、鎖Ｉ内に含まれた
ヌクレオチド配列、又は高度にストリンジェントな条件
下で配列Vの相補的配列とハイブリダイズする配列、又
は配列IIIの安定性及び自律的複製という機能的特性を
保っているかぎりにおいて配列Vとの関係において変更
された配列； − グラム陽性菌に導入された場合に、組換え型ベクタ
ーに対し て、グラム陽性菌内で安定した形で自らを維
持するか又は自らの安定性を増大させる能力を付与する
ことができ、B.thuringiensis において約１，２３４bp
の長さのヌクレオチド１４０８〜２６４２を含むか又は
約３５１bpの配列VIのＨａｅIII−ＡｃｃＩ鎖を含むＨ
ａｅIII−ＨｐａＩ部位によって限定されたヌクレオチ
ド配列VIに対応することを特徴とするＤＮＡフラグメン
ト、又はグラム陽性菌内でそれを含むベクターの安定性
に関する配列VIの特性を保持しているかぎりにおいて上
述のフラグメントとの関係において変更されたＤＮＡフ
ラグメント、又は上述のフラグメントの相補的配列とハ
イブリダイズするフラグメント。
【００５８】本発明は同様に、上述の定義を満たす組換
え型ベクターによって形質転換されていることを特徴と
するグラム陽性菌をも目的としている。
え型ベクターによって形質転換されていることを特徴と
するグラム陽性菌をも目的としている。
【００５９】これらの形質転換された細菌は、例えば結
晶タンパク質又はδ−エンドトキシンをコードするＤＮ
Ａ配列を補足的なコピー数でクローニングするように変
更されたBacillus thuringiensis又はBacillus subtili
s といった細菌でありうる。形質転換されうるその他の
桿菌は、例えば、B. cereus 、B.sphaericus又はB.mega
terium である。
晶タンパク質又はδ−エンドトキシンをコードするＤＮ
Ａ配列を補足的なコピー数でクローニングするように変
更されたBacillus thuringiensis又はBacillus subtili
s といった細菌でありうる。形質転換されうるその他の
桿菌は、例えば、B. cereus 、B.sphaericus又はB.mega
terium である。
【００６０】従って、本発明の手段は、有利なＤＮＡの
クローニング、そして場合によってはその発現に適した
組換え型グラム陽性菌の実現に適合されている。このよ
うにして得られた細菌は、例えばB.thuringiensis のよ
うな細菌が適している発酵工程が関与するプロセスにお
いて大量のＤＮＡ又はタンパク質を生産するため、又は
医療用組成物の生産のため、工業的に利用することがで
きる。
クローニング、そして場合によってはその発現に適した
組換え型グラム陽性菌の実現に適合されている。このよ
うにして得られた細菌は、例えばB.thuringiensis のよ
うな細菌が適している発酵工程が関与するプロセスにお
いて大量のＤＮＡ又はタンパク質を生産するため、又は
医療用組成物の生産のため、工業的に利用することがで
きる。
【００６１】本発明は特に、細菌性抗原又は免疫原、Ｂ
型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓ）のようなウイルス
性抗原、ＨＩＶの抗原又は免疫原、P. falciparum のよ
うな寄生虫の抗原を発現することができる全ての組換え
型細菌を目的とする。
型肝炎ウイルスの表面抗原（ＨＢｓ）のようなウイルス
性抗原、ＨＩＶの抗原又は免疫原、P. falciparum のよ
うな寄生虫の抗原を発現することができる全ての組換え
型細菌を目的とする。
【００６２】本発明のもう１つの目的は、昆虫の幼虫に
対して活性な殺幼虫組成物において、有利な配列が、鱗
翅目、甲虫目又は双翅目に対して活性なδ−エンドトキ
シンをコードする結晶遺伝子、特にｃｒｙＩ遺伝子、ｃ
ｒｙII遺伝子、ｃｒｙIII遺伝子又はｃｒｙIV遺伝子で
ある、前述の態様に従って形質転換された細菌を有効成
分として含むことを特徴とする組成物にある。
対して活性な殺幼虫組成物において、有利な配列が、鱗
翅目、甲虫目又は双翅目に対して活性なδ−エンドトキ
シンをコードする結晶遺伝子、特にｃｒｙＩ遺伝子、ｃ
ｒｙII遺伝子、ｃｒｙIII遺伝子又はｃｒｙIV遺伝子で
ある、前述の態様に従って形質転換された細菌を有効成
分として含むことを特徴とする組成物にある。
【００６３】一般に、本発明に従った組換え型ベクター
は、昆虫の幼虫、特に鱗翅目、甲虫目又は双翅目に対し
て毒性をもつ毒素、特にポリペプチドの産生に適用する
ことができ、この毒素の産生は、グラム陽性菌タイプの
微生物を介して行なわれる。
は、昆虫の幼虫、特に鱗翅目、甲虫目又は双翅目に対し
て毒性をもつ毒素、特にポリペプチドの産生に適用する
ことができ、この毒素の産生は、グラム陽性菌タイプの
微生物を介して行なわれる。
【００６４】このように形質転換された菌株は、生物学
的殺虫剤を構成する。
的殺虫剤を構成する。
【００６５】本発明に基づくベクター及びヌクレオチド
配列のもう１つの利用分野は、選択されたＤＮＡ配列の
クローニングである。これらのクローニングされた配列
は、次に、例えば組換えられたE. coli(大腸菌）菌株を
構築するため、一定の宿主細胞において利用できる。
配列のもう１つの利用分野は、選択されたＤＮＡ配列の
クローニングである。これらのクローニングされた配列
は、次に、例えば組換えられたE. coli(大腸菌）菌株を
構築するため、一定の宿主細胞において利用できる。
【００６６】本発明に従った組換え型ベクターを用い
て、細菌やその他のタイプの細胞の形質転換を行なう方
法は、慣習的に利用され、例中で記載されているような
技術である。
て、細菌やその他のタイプの細胞の形質転換を行なう方
法は、慣習的に利用され、例中で記載されているような
技術である。
【００６７】従って、Lereclus et al. により記載され
た電気穿孔法（1989, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-
218)のような技術を活用することができる。本発明のそ
の他の特徴及び利点は、以下の実施例及び図を見れば理
解できるだろう。
た電気穿孔法（1989, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-
218)のような技術を活用することができる。本発明のそ
の他の特徴及び利点は、以下の実施例及び図を見れば理
解できるだろう。
【００６８】図１（１Ａ及び１Ｂ）：ｐＨＴ１０３０の
ＢａｌＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列、及びｏ
ｒｆ１（図１Ａ及び図１Ｂ）及びｏｒｆ２（図１Ａ）か
ら推定されるアミノ酸配列 桿状及びループ状構造を形成する可能性のある逆方向反
復配列は、矢印によって強調されている。推定プロモー
ターの−３５及び−１０の領域は、ｓｐｂＡ遺伝子座に
見つかり、下線を引かれている。リボソームの固定部位
及びｓｐｂＢ翻訳の潜在的開始コドンは、太文字で表わ
されている。星印は、翻訳停止コドンを示す。
ＢａｌＩ制限フラグメントのヌクレオチド配列、及びｏ
ｒｆ１（図１Ａ及び図１Ｂ）及びｏｒｆ２（図１Ａ）か
ら推定されるアミノ酸配列 桿状及びループ状構造を形成する可能性のある逆方向反
復配列は、矢印によって強調されている。推定プロモー
ターの−３５及び−１０の領域は、ｓｐｂＡ遺伝子座に
見つかり、下線を引かれている。リボソームの固定部位
及びｓｐｂＢ翻訳の潜在的開始コドンは、太文字で表わ
されている。星印は、翻訳停止コドンを示す。
【００６９】図２：ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の構
築、及び桿菌におけるその複製及び安定性の分析 図の上部には、本文中に記載されている複製起点プロー
ブベクターｐＨＴ１８１が表わされている。ｐＵＣ１８
内にＥｍr 遺伝子を担持する１．２kbのＤＮＡフラグメ
ントをクローニングするのに使用される制限部位は、カ
ッコ内に入っている。エリスロマイシン（Ｅｍr)及びβ
−ラクタマーゼ（Ａｐr)の遺伝子の位置及び向きは、矢
印によって表わされている。プラスミドｐＨＴ３１０３
〜ｐＨＴ３１３０を与えるためにｐＨＴ１８１のクロー
ニング部位にクローニングされたｐＨＴ１０３０の異な
る制限フラグメントは、ｐＨＴ１８１の地図の下に示さ
れている。これらのプラスミドは、適切な制限フラグメ
ントのアガロースゲルからの溶出、及び適切な酵素によ
り切断されたｐＨＴ１８１へのクローニングによって構
築される。組換え型プラスミドは、以下のような制限フ
ラグメントを有している：ｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ１０
３０の全２．９kbのＢａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１
３０△ＨｐａII、ＨｐａII部位が除去されているＢａｌ
Ｉフラグメント（本文参照）；ｐＨＴ３１２０、隣接し
た形でクローニングされた１．１kbのＢａｌＩ−Ｓｃａ
Ｉフラグメント及び１．５kbのＨａｅIII−ＢａｌＩフ
ラグメント；ｐＨＴ３１１５、２．７kbのＮｄｅＩ−Ｂ
ａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１１４、２．３kbのＨａ
ｅIIフラグメント；ｐＨＴ３１１３ａ及びｂ、１．２kb
のＳｓｐＩフラグメント；ｐＨＴ３１１２ａ及びｂ、
２．６kbのＳｐｅＩ−ＢａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３
１１１ａ及びｂ、２．２kbのＨｉｎｄIII−ＢａｌＩフ
ラグメント；ｐＨＴ３１１０、１．１kbのＡｃｃＩ−Ｂ
ａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１０９、２．６kbのＢａ
ｌＩ−ＨｐａＩフラグメント；ｐＨＴ３１０８、２．１
kbのＢａｌＩ−ＨａｐIIフラグメント；ｐＨＴ３１０
７、１．７kbのＢａｌＩ−ＸｈｏIIフラグメント；ｐＨ
Ｔ３１０６、１．４kbのＢａｌＩ−ＨａｅIIIフラグメ
ント；ｐＨ３１０５ａ及びｂ、１．１kbのＢａｌＩ−Ｓ
ｃａＩフラグメント；ｐＨＴ３１０４ａ及びｂ、１kbの
ＢａｌＩ−ＡｆｌIIフラグメント、及びｐＨＴ３１０
３、０．７kbのＢａｌＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント。
全ての構築は、組換え型プラスミドの制限地図作成によ
って確認された。配列ｏｒｆ１及びｏｒｆ２の位置及び
向きは、図１に表わされているヌクレオチド配列によっ
て示されているように、区画及び矢印で表わされてい
る。一点に集中する矢印は、逆方向反復配列群を象徴す
る。ｐと矢印は、ｐＵＣ１８のｌａｃＺプロモーターの
位置及び向きを示す。
築、及び桿菌におけるその複製及び安定性の分析 図の上部には、本文中に記載されている複製起点プロー
ブベクターｐＨＴ１８１が表わされている。ｐＵＣ１８
内にＥｍr 遺伝子を担持する１．２kbのＤＮＡフラグメ
ントをクローニングするのに使用される制限部位は、カ
ッコ内に入っている。エリスロマイシン（Ｅｍr)及びβ
−ラクタマーゼ（Ａｐr)の遺伝子の位置及び向きは、矢
印によって表わされている。プラスミドｐＨＴ３１０３
〜ｐＨＴ３１３０を与えるためにｐＨＴ１８１のクロー
ニング部位にクローニングされたｐＨＴ１０３０の異な
る制限フラグメントは、ｐＨＴ１８１の地図の下に示さ
れている。これらのプラスミドは、適切な制限フラグメ
ントのアガロースゲルからの溶出、及び適切な酵素によ
り切断されたｐＨＴ１８１へのクローニングによって構
築される。組換え型プラスミドは、以下のような制限フ
ラグメントを有している：ｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ１０
３０の全２．９kbのＢａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１
３０△ＨｐａII、ＨｐａII部位が除去されているＢａｌ
Ｉフラグメント（本文参照）；ｐＨＴ３１２０、隣接し
た形でクローニングされた１．１kbのＢａｌＩ−Ｓｃａ
Ｉフラグメント及び１．５kbのＨａｅIII−ＢａｌＩフ
ラグメント；ｐＨＴ３１１５、２．７kbのＮｄｅＩ−Ｂ
ａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１１４、２．３kbのＨａ
ｅIIフラグメント；ｐＨＴ３１１３ａ及びｂ、１．２kb
のＳｓｐＩフラグメント；ｐＨＴ３１１２ａ及びｂ、
２．６kbのＳｐｅＩ−ＢａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３
１１１ａ及びｂ、２．２kbのＨｉｎｄIII−ＢａｌＩフ
ラグメント；ｐＨＴ３１１０、１．１kbのＡｃｃＩ−Ｂ
ａｌＩフラグメント；ｐＨＴ３１０９、２．６kbのＢａ
ｌＩ−ＨｐａＩフラグメント；ｐＨＴ３１０８、２．１
kbのＢａｌＩ−ＨａｐIIフラグメント；ｐＨＴ３１０
７、１．７kbのＢａｌＩ−ＸｈｏIIフラグメント；ｐＨ
Ｔ３１０６、１．４kbのＢａｌＩ−ＨａｅIIIフラグメ
ント；ｐＨ３１０５ａ及びｂ、１．１kbのＢａｌＩ−Ｓ
ｃａＩフラグメント；ｐＨＴ３１０４ａ及びｂ、１kbの
ＢａｌＩ−ＡｆｌIIフラグメント、及びｐＨＴ３１０
３、０．７kbのＢａｌＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメント。
全ての構築は、組換え型プラスミドの制限地図作成によ
って確認された。配列ｏｒｆ１及びｏｒｆ２の位置及び
向きは、図１に表わされているヌクレオチド配列によっ
て示されているように、区画及び矢印で表わされてい
る。一点に集中する矢印は、逆方向反復配列群を象徴す
る。ｐと矢印は、ｐＵＣ１８のｌａｃＺプロモーターの
位置及び向きを示す。
【００７０】プラスミドｐＨＴ３１２０の構築 プラスミドｐＨＴ３１３０（図２）は、一方では酵素Ｋ
ｐｎＩ及びＳｃａＩを用いて、又他方では酵素ＨａｅII
I及びＢａｍＨＩを用いて消化する。１．１kbのＫｐｎ
Ｉ−ＳｃａＩ制限フラグメント（複製領域のＢａｌＩ−
ＳｃａＩセグメントを含む）及び１．５kbのＨａｅIII
−ＢａｍＨＩ制限フラグメント（安定性領域のＨａｅII
I−ＢａｌＩセグメントを含む）を、それぞれアガロー
スゲルから別々に得て、精製する。２つの制限フラグメ
ントを、酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより消化したベ
クターｐＨＴ１８１の存在下で、及びＤＮＡリガーゼの
存在下で、合わせ、連結する。連結混合物を、E. coli
ＴＧ１株を形質転換するために利用し、アンピシリン
（１００μg／ml）及びＸ−ｇａlを含むＬＢ培地上で、
組換え体クローンを選択する。形質転換体の中から、Ａ
ｐr の白色コロニーを単離した。そのプラスミドＤＮＡ
を分析すると、クローンが予想どおりの制限地図をもつ
プラスミドを担持していることがわかる。ｐＨＴ３１２
０と呼ばれるこのプラスミドは、ｐＨＴ３１３０の０．
３kbのＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラグメントを含んでいな
い。ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の各々の複製は、B. s
ubtilis 及びB. thuringiensisの形質転換によりテスト
した。＋は、エリスロマイシン耐性をもつ形質転換体ク
ローンが得られたことを示している；−は、Ｅｍr 形質
転換体が得られなかったことを示す。組換え型プラスミ
ドの各々の分離安定性は、「実験的作業様式」(les Mod
es Operatoires Experimentaux) に記載されているよう
にＬＢ培地中でB. subtilis(Ｂ．ｓ）及びB. thuringie
nsis（Ｂ．ｔ）においてテストした。選択圧力無しで、
約２５世代（B. subtilis について）及び４０世代（B.
thuringiensisについて）後、Ｅｍr であったクローン
の百分率が示されている。ＮＴは、「テストせず」を意
味する。
ｐｎＩ及びＳｃａＩを用いて、又他方では酵素ＨａｅII
I及びＢａｍＨＩを用いて消化する。１．１kbのＫｐｎ
Ｉ−ＳｃａＩ制限フラグメント（複製領域のＢａｌＩ−
ＳｃａＩセグメントを含む）及び１．５kbのＨａｅIII
−ＢａｍＨＩ制限フラグメント（安定性領域のＨａｅII
I−ＢａｌＩセグメントを含む）を、それぞれアガロー
スゲルから別々に得て、精製する。２つの制限フラグメ
ントを、酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩにより消化したベ
クターｐＨＴ１８１の存在下で、及びＤＮＡリガーゼの
存在下で、合わせ、連結する。連結混合物を、E. coli
ＴＧ１株を形質転換するために利用し、アンピシリン
（１００μg／ml）及びＸ−ｇａlを含むＬＢ培地上で、
組換え体クローンを選択する。形質転換体の中から、Ａ
ｐr の白色コロニーを単離した。そのプラスミドＤＮＡ
を分析すると、クローンが予想どおりの制限地図をもつ
プラスミドを担持していることがわかる。ｐＨＴ３１２
０と呼ばれるこのプラスミドは、ｐＨＴ３１３０の０．
３kbのＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラグメントを含んでいな
い。ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の各々の複製は、B. s
ubtilis 及びB. thuringiensisの形質転換によりテスト
した。＋は、エリスロマイシン耐性をもつ形質転換体ク
ローンが得られたことを示している；−は、Ｅｍr 形質
転換体が得られなかったことを示す。組換え型プラスミ
ドの各々の分離安定性は、「実験的作業様式」(les Mod
es Operatoires Experimentaux) に記載されているよう
にＬＢ培地中でB. subtilis(Ｂ．ｓ）及びB. thuringie
nsis（Ｂ．ｔ）においてテストした。選択圧力無しで、
約２５世代（B. subtilis について）及び４０世代（B.
thuringiensisについて）後、Ｅｍr であったクローン
の百分率が示されている。ＮＴは、「テストせず」を意
味する。
【００７１】図３：ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体を含む
細胞における一本鎖ＤＮＡ産生の分析。 ｐＨＶ３３（レーンＡ及びＡ′）、ｐＨＴ３１３０（レ
ーンＢ及びＢ′）又はｐＨＴ３１０４ａ（レーンＣ及び
Ｃ′）を含むB. subtilis の細胞ライセート及び、ｐＨ
Ｔ３１３０（レーンＤ及びＤ′）又はｐＨＴ３１０４ａ
（レーンＥ及びＥ′）を含むB.thuringiensis の細胞ラ
イセートを、アガロースゲル上での電気泳動法によって
分離した。ゲル１は変性後、ゲル２は変性無しで、ニト
ロセルロースフィルター上に移した。次に、分析した全
てのプラスミドの中に同様に存在するＤＮＡ配列を含む
32Ｐで標識されたｐＵＣ１８に対し、フィルターをハイ
ブリダイズさせた。この図は、露光後得られたオートラ
ジオグラフィを表わしている。ｓｓ、ｓｃ、ｏｃ及びｈ
ｍｗは、それぞれ、ｐＨＶ３３のＤＮＡの一本鎖形態、
スーパーヘリックス形態、開環状形態（又は二量体）及
び高分子量を表わしている。
細胞における一本鎖ＤＮＡ産生の分析。 ｐＨＶ３３（レーンＡ及びＡ′）、ｐＨＴ３１３０（レ
ーンＢ及びＢ′）又はｐＨＴ３１０４ａ（レーンＣ及び
Ｃ′）を含むB. subtilis の細胞ライセート及び、ｐＨ
Ｔ３１３０（レーンＤ及びＤ′）又はｐＨＴ３１０４ａ
（レーンＥ及びＥ′）を含むB.thuringiensis の細胞ラ
イセートを、アガロースゲル上での電気泳動法によって
分離した。ゲル１は変性後、ゲル２は変性無しで、ニト
ロセルロースフィルター上に移した。次に、分析した全
てのプラスミドの中に同様に存在するＤＮＡ配列を含む
32Ｐで標識されたｐＵＣ１８に対し、フィルターをハイ
ブリダイズさせた。この図は、露光後得られたオートラ
ジオグラフィを表わしている。ｓｓ、ｓｃ、ｏｃ及びｈ
ｍｗは、それぞれ、ｐＨＶ３３のＤＮＡの一本鎖形態、
スーパーヘリックス形態、開環状形態（又は二量体）及
び高分子量を表わしている。
【００７２】図４：E. coli のインビトロ転写−翻訳系
におけるｓｐｂＢ遺伝子の発現 １２．５％のアクリルアミドゲル上で分離された
〔35Ｓ〕−メチオニンで標識されたポリペプチドのオー
トラジオグラフィは、次のものから生成されている：レ
ーン１、ｐＨＴ１８１；レーン２、ｐＨＴ３１０９；レ
ーン３、ｐＨＴ３１１４；レーン４、ｐＨＴ３１３０か
ら単離され、ｓｐｂＢ遺伝子を含む４６４bpのＢｓｔＵ
Ｉフラグメント；レーン５、つまりｐＨＴ３１３０△Ｈ
ｐａIIから単離され、中断されたｓｐｂＢ遺伝子を含む
４６２bpのＢｓｔＵＩフラグメント。Ｅｒｍ、Ｂｌａ及
びＳｐｂＢは、それぞれｅｒｍ、ｂｌａ及び遺伝子ｓｐ
ｂＢの産物を表わす。ペプチドの分子量のサイズマーカ
ーが示されている（kDa)。
におけるｓｐｂＢ遺伝子の発現 １２．５％のアクリルアミドゲル上で分離された
〔35Ｓ〕−メチオニンで標識されたポリペプチドのオー
トラジオグラフィは、次のものから生成されている：レ
ーン１、ｐＨＴ１８１；レーン２、ｐＨＴ３１０９；レ
ーン３、ｐＨＴ３１１４；レーン４、ｐＨＴ３１３０か
ら単離され、ｓｐｂＢ遺伝子を含む４６４bpのＢｓｔＵ
Ｉフラグメント；レーン５、つまりｐＨＴ３１３０△Ｈ
ｐａIIから単離され、中断されたｓｐｂＢ遺伝子を含む
４６２bpのＢｓｔＵＩフラグメント。Ｅｒｍ、Ｂｌａ及
びＳｐｂＢは、それぞれｅｒｍ、ｂｌａ及び遺伝子ｓｐ
ｂＢの産物を表わす。ペプチドの分子量のサイズマーカ
ーが示されている（kDa)。
【００７３】図５：栄養増殖中のｐＨＴ１０３０の欠失
誘導体の分離安定性 さまざまなプラスミドを担持するB. subtilis(表Ａ）及
びB. thuringiensis（表Ｂ）の対数増殖中の細胞を、
「実験的作業様式」に記載されている通りに、非選択的
ＢＨＩ培地でその分離安定性について評価した。さまざ
まなプラスミドを収容する細胞の間で、増殖率の有意な
差は見られなかった。各プラスミドに対する符号は表Ｂ
に示されている。
誘導体の分離安定性 さまざまなプラスミドを担持するB. subtilis(表Ａ）及
びB. thuringiensis（表Ｂ）の対数増殖中の細胞を、
「実験的作業様式」に記載されている通りに、非選択的
ＢＨＩ培地でその分離安定性について評価した。さまざ
まなプラスミドを収容する細胞の間で、増殖率の有意な
差は見られなかった。各プラスミドに対する符号は表Ｂ
に示されている。
【００７４】図６：胞子形成中のｐＨＴ１０３０の欠失
誘導体分離安定性 さまざまなプラスミドを担持するB. subtilis(表Ａ）及
びB. thuringiensis（表Ｂ）の胞子形成中の細胞を、
「実験的作業様式」の中で記載されているような非選択
的ＳＰ又はＨＣＴ培地でプラスミドの安定性について評
価した。各プラスミドについて利用されている符号は、
図５に示されている。
誘導体分離安定性 さまざまなプラスミドを担持するB. subtilis(表Ａ）及
びB. thuringiensis（表Ｂ）の胞子形成中の細胞を、
「実験的作業様式」の中で記載されているような非選択
的ＳＰ又はＨＣＴ培地でプラスミドの安定性について評
価した。各プラスミドについて利用されている符号は、
図５に示されている。
【００７５】図７：ｓｐｂＢ遺伝子座の領域を担持する
ｐＢＣ１６の変異体の構築 図の上部部分には、組換え型プラスミドｐＨＴ１６１８
の物理的地図が示されている。ｐＢＣ１６及びｐＵＣ１
８の複製領域は、それぞれｏｒｉ．Ｂｃ及びｏｒｉ．Ｅ
ｃと記されている。テトラサイクリン（Ｔｅｔr)及びア
ンピシリン（Ａｐr)に対する耐性を付与する遺伝子の位
置及び向きは、矢印によって示されている。ｐＢＣ１６
△１のクローニングのために利用されるｐＵＣ１８の制
限部位（ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
によって末端が充たされている２．９kbのＥｃｏＲＩセ
グメント）は、カッコ内に入れられている。ＢａｌＩの
ＤＮＡフラグメントの物理的及び遺伝的編成は、本文中
に記されている結果に従って表わされている。ｓｐｂＡ
及びｓｐｂＢは、遺伝子座の位置を示す。ｏｒｉ．Ｂｔ
は、ｐＨＴ１０３０の最小レプリコンを表わす。その他
の符号は図２の凡例に記されている通りである。実線
は、プラスミドｐＨＴ１６０９〜ｐＨＴ１６１１を与え
るため、ｐＨＴ１６１８のクローニング部位にクローニ
ングされたＢａｌＩフラグメントのセグメントを表わし
ている。ＤＮＡセグメントは、アガロースゲルから別々
に精製し、適切な酵素によって切断されたｐＨＴ１６１
８にクローニングした。ｐＨＴ１６１１は、ｐＨＴ３１
３０から単離され、ｐＨＴ１０３０の２．２kbのＨｉｎ
ｄIII−ＢａｌＩフラグメントに対応する２．２kbのＨ
ｉｎｄIII−ＨｉｎｄIIIフラグメントを有する（第２の
ＨｉｎｄIII部位はｐＨＴ３１３０のポリリンカーに由
来する）。ｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIは、ｐＨＴ３１３
０△ＨｐａIIから単離された２．２kbのＨｉｎｄIII−
ＨｉｎｄIIIフラグメントを有している。ｐＨＴ１６１
０は、１．１kbのＡｃｃＩ−ＢａｌＩフラグメントを有
し、ｐＨＴ１６０９は、ｐＨＴ１０３０の１．６kbのＳ
ｃａＩ−ＨｐａＩフラグメントを有する。構築は、組換
え型プラスミドの制限地図作成によって確認した。ｐと
矢印は、ｐＵＣ１８のｌａｃＺプロモーターの位置及び
向きを示す。
ｐＢＣ１６の変異体の構築 図の上部部分には、組換え型プラスミドｐＨＴ１６１８
の物理的地図が示されている。ｐＢＣ１６及びｐＵＣ１
８の複製領域は、それぞれｏｒｉ．Ｂｃ及びｏｒｉ．Ｅ
ｃと記されている。テトラサイクリン（Ｔｅｔr)及びア
ンピシリン（Ａｐr)に対する耐性を付与する遺伝子の位
置及び向きは、矢印によって示されている。ｐＢＣ１６
△１のクローニングのために利用されるｐＵＣ１８の制
限部位（ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント
によって末端が充たされている２．９kbのＥｃｏＲＩセ
グメント）は、カッコ内に入れられている。ＢａｌＩの
ＤＮＡフラグメントの物理的及び遺伝的編成は、本文中
に記されている結果に従って表わされている。ｓｐｂＡ
及びｓｐｂＢは、遺伝子座の位置を示す。ｏｒｉ．Ｂｔ
は、ｐＨＴ１０３０の最小レプリコンを表わす。その他
の符号は図２の凡例に記されている通りである。実線
は、プラスミドｐＨＴ１６０９〜ｐＨＴ１６１１を与え
るため、ｐＨＴ１６１８のクローニング部位にクローニ
ングされたＢａｌＩフラグメントのセグメントを表わし
ている。ＤＮＡセグメントは、アガロースゲルから別々
に精製し、適切な酵素によって切断されたｐＨＴ１６１
８にクローニングした。ｐＨＴ１６１１は、ｐＨＴ３１
３０から単離され、ｐＨＴ１０３０の２．２kbのＨｉｎ
ｄIII−ＢａｌＩフラグメントに対応する２．２kbのＨ
ｉｎｄIII−ＨｉｎｄIIIフラグメントを有する（第２の
ＨｉｎｄIII部位はｐＨＴ３１３０のポリリンカーに由
来する）。ｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIは、ｐＨＴ３１３
０△ＨｐａIIから単離された２．２kbのＨｉｎｄIII−
ＨｉｎｄIIIフラグメントを有している。ｐＨＴ１６１
０は、１．１kbのＡｃｃＩ−ＢａｌＩフラグメントを有
し、ｐＨＴ１６０９は、ｐＨＴ１０３０の１．６kbのＳ
ｃａＩ−ＨｐａＩフラグメントを有する。構築は、組換
え型プラスミドの制限地図作成によって確認した。ｐと
矢印は、ｐＵＣ１８のｌａｃＺプロモーターの位置及び
向きを示す。
【００７６】図８：ｓｐｂＢ領域を有する変異体ｐＢＣ
１６の安定性 さまざまなプラスミドを収容するB. subtilis の対数増
殖中の細胞を、「実験的作業様式」に記されている通
り、非選択的ＢＨＩ培地で分離安定性について評価し
た。各プラスミドの符号は、図に示されている。
１６の安定性 さまざまなプラスミドを収容するB. subtilis の対数増
殖中の細胞を、「実験的作業様式」に記されている通
り、非選択的ＢＨＩ培地で分離安定性について評価し
た。各プラスミドの符号は、図に示されている。
【００７７】図９：ｐＨＴ１０３５のＨｉｎｄIII部位
の削除及びコピー数の多い変異体の選択 図の最初の部分に示されているように、ｐＨＴ１０３５
のＨｉｎｄIII部位を削除した。以前に記載されたとお
り（Humphreys et al., 1976, Mol. Gen. Genet. 145:
101-108)、ヒドロキシルアミンによる処理によって、ｐ
ＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIのインビトロ突然変異誘発
を行なった。E. coli のＪＭ８３株を形質転換させるた
め、処理済みＤＮＡ２０μgを利用した。Ｃｍ耐性（５
μg／ml）をもつクローン約１０，０００個をまとめ、
プラスミドＤＮＡを抽出した。次に、B. subtilis のコ
ンピテント細胞を約１０μgのプラスミドＤＮＡで形質
転換させ、１mlあたり２５μgのＣｍを含むＬＢゲロー
ス上に広げた。得られた約１００個のＣｍr クローンか
ら、１４個をそのプラスミド含有量についてテストし
た。ＤＮＡ調製物のアガロースゲル上での電気泳動は、
そのうち９個が、親プラスミドｐＨＴ１０３５△Ｈｉｎ
ｄIIIよりも多いコピー数を伴うプラスミドを収容して
いることを示した。中程度のコピー数及び多いコピー数
を伴うプラスミドを収容する２つのクローンが選択され
た。「ｃａｔ」及び「ｏｒｉＥｃ」より上の矢印は、そ
れぞれｃａｔ遺伝子の転写方向及びｐＢＲ３２２の複製
方向を示している。「ｏｒｉ１０３０」より上の２重の
矢印は、ｐＨＴ１０３０の複製の向きがわかっていない
ということを示している。プラスミドの独特の制限部位
は太文字で示されている。
の削除及びコピー数の多い変異体の選択 図の最初の部分に示されているように、ｐＨＴ１０３５
のＨｉｎｄIII部位を削除した。以前に記載されたとお
り（Humphreys et al., 1976, Mol. Gen. Genet. 145:
101-108)、ヒドロキシルアミンによる処理によって、ｐ
ＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIのインビトロ突然変異誘発
を行なった。E. coli のＪＭ８３株を形質転換させるた
め、処理済みＤＮＡ２０μgを利用した。Ｃｍ耐性（５
μg／ml）をもつクローン約１０，０００個をまとめ、
プラスミドＤＮＡを抽出した。次に、B. subtilis のコ
ンピテント細胞を約１０μgのプラスミドＤＮＡで形質
転換させ、１mlあたり２５μgのＣｍを含むＬＢゲロー
ス上に広げた。得られた約１００個のＣｍr クローンか
ら、１４個をそのプラスミド含有量についてテストし
た。ＤＮＡ調製物のアガロースゲル上での電気泳動は、
そのうち９個が、親プラスミドｐＨＴ１０３５△Ｈｉｎ
ｄIIIよりも多いコピー数を伴うプラスミドを収容して
いることを示した。中程度のコピー数及び多いコピー数
を伴うプラスミドを収容する２つのクローンが選択され
た。「ｃａｔ」及び「ｏｒｉＥｃ」より上の矢印は、そ
れぞれｃａｔ遺伝子の転写方向及びｐＢＲ３２２の複製
方向を示している。「ｏｒｉ１０３０」より上の２重の
矢印は、ｐＨＴ１０３０の複製の向きがわかっていない
ということを示している。プラスミドの独特の制限部位
は太文字で示されている。
【００７８】図１０：シャトルベクターｐＨＴ３０４、
ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０の構築 ｐＨＴ１０３０の複製及び安定性領域を有する２．６kb
のＨｐａＩ−ＢａｌＩのＤＮＡフラグメントは、ｐＨＴ
１０３５△ＨｉｎｄIII、ｐＨＴ１０３５−１５△Ｈｉ
ｎｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△ＨｉｎｄIIIから別
々に単離し、精製した。Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩフラ
グメントの形で、Ｔｎ１５４５に由来する構成的ｅｒｍ
遺伝子を有する１．２kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メント（Trieu-Cuot et al., 1990, Nucleic Acids Re
s. 18: 3660）を単離し、末端をＰｏｌＩｋで平滑にし
た。各ＨｐａＩ−ＢａｌＩフラグメントを、三重連結に
よりｅｒｍ遺伝子を含むフラグメントとｐＵＣ１９のＳ
ｓｐＩ部位のレベルにクローニングした。３つの連結混
合物を、E. coli ＪＭ８３株を形質転換するため別々に
利用し、組換え型クローンを、Ａｐ（１００μg／ml）
及びＥｒ（１５０μg／ml）を含むＬＢゲロースボック
ス上で選択した。同一の向きで、同じ場所に異なるＤＮ
Ａフラグメントがクローニングされているシャトルベク
ターｐＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０を、
制限地図作成によって選択した。平滑接合部レベルで破
壊された部位は、カッコ内に入れられている。「Ｅｒ
R 」、「Ａｐ R 」の上及び「ｌａｃＺｐｏ」の前の矢印
は、それぞれｅｒｍ、ｂｌａ及びｌａｃＺ遺伝子の転写
方向を示す。各ベクターについてB. thuringiensis内の
プラスミドのコピー数を示す。その他の符号は、図９の
凡例の中に記されている通りである。
ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０の構築 ｐＨＴ１０３０の複製及び安定性領域を有する２．６kb
のＨｐａＩ−ＢａｌＩのＤＮＡフラグメントは、ｐＨＴ
１０３５△ＨｉｎｄIII、ｐＨＴ１０３５−１５△Ｈｉ
ｎｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△ＨｉｎｄIIIから別
々に単離し、精製した。Ａｓｐ７１８−ＢａｍＨＩフラ
グメントの形で、Ｔｎ１５４５に由来する構成的ｅｒｍ
遺伝子を有する１．２kbのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグ
メント（Trieu-Cuot et al., 1990, Nucleic Acids Re
s. 18: 3660）を単離し、末端をＰｏｌＩｋで平滑にし
た。各ＨｐａＩ−ＢａｌＩフラグメントを、三重連結に
よりｅｒｍ遺伝子を含むフラグメントとｐＵＣ１９のＳ
ｓｐＩ部位のレベルにクローニングした。３つの連結混
合物を、E. coli ＪＭ８３株を形質転換するため別々に
利用し、組換え型クローンを、Ａｐ（１００μg／ml）
及びＥｒ（１５０μg／ml）を含むＬＢゲロースボック
ス上で選択した。同一の向きで、同じ場所に異なるＤＮ
Ａフラグメントがクローニングされているシャトルベク
ターｐＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０を、
制限地図作成によって選択した。平滑接合部レベルで破
壊された部位は、カッコ内に入れられている。「Ｅｒ
R 」、「Ａｐ R 」の上及び「ｌａｃＺｐｏ」の前の矢印
は、それぞれｅｒｍ、ｂｌａ及びｌａｃＺ遺伝子の転写
方向を示す。各ベクターについてB. thuringiensis内の
プラスミドのコピー数を示す。その他の符号は、図９の
凡例の中に記されている通りである。
【００７９】図１１：ｃｒｙIIIＡ遺伝子を発現するB.
thuringiensisの形質転換体のタンパク質分析 以前に記載されたとおり（Lereclus et al., 1989a, FE
MS Microbiol. Lett.60: 211-218 ）、結晶−胞子の調
製物を得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルーでの
着色により分析した。各ウエル中に同量の試料（２０μ
l）を充てんした。レーン１、２、３、４：それぞれｐ
ＨＴ３１５；ｐＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡ；ｐＨＴ３１
５ΩｃｒｙIIIＡ及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙIIIＡを含む
kurstakiＨＤ１ Ｃｒｙ- Ｂ株；レーン５：分子量マー
カー。矢印は結晶の７３kDa 及び６７kDa の構成成分を
示す。
thuringiensisの形質転換体のタンパク質分析 以前に記載されたとおり（Lereclus et al., 1989a, FE
MS Microbiol. Lett.60: 211-218 ）、結晶−胞子の調
製物を得、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルーでの
着色により分析した。各ウエル中に同量の試料（２０μ
l）を充てんした。レーン１、２、３、４：それぞれｐ
ＨＴ３１５；ｐＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡ；ｐＨＴ３１
５ΩｃｒｙIIIＡ及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙIIIＡを含む
kurstakiＨＤ１ Ｃｒｙ- Ｂ株；レーン５：分子量マー
カー。矢印は結晶の７３kDa 及び６７kDa の構成成分を
示す。
【００８０】
【実施例】例１： ｐＨＴ１０３０レプリコンのヌクレオチド配列の分析 ｐＵＣ１８ベクターのＳｍａＩ部位に２つの向きに、ｐ
ＨＴ１０３０の複製領域を含む２．９kbのＢａｌＩのＤ
ＮＡフラグメント（Lereclus et al., 1988, FEMS Micr
obiol. Lett. 49: 417-422）を挿入し、配列決定のた
め、ファージＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９に異な
るＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。Dale e
t al. (1985, Plasmid 13: 31-40) の技術を用いて、１
３ｍｐ１９にクローニングされた全ＢａｌＩフラグメン
トから、重複欠失も同様に得られた。予備配列決定の結
果から推論した特異的オリゴヌクレオチドプライマーの
合成により、鋳型として利用した適切な組換え型ファー
ジから、配列についてのより多くの情報を得ることがで
きた。２，８７２bpのＢａｌＩフラグメントの完全なヌ
クレオチド配列（図１）を、ＤＮＡの二本鎖について決
定した。ＤＮＡフラグメントの総括的ｄＡ＋ｄＴ含有量
は６３％であり、これはB. thuringiensisの染色体のも
の、つまり６３．６％にきわめて近い（Kaneko et al.,
1978, Microbiol. Immunol. 22: 639-641) 。
ＨＴ１０３０の複製領域を含む２．９kbのＢａｌＩのＤ
ＮＡフラグメント（Lereclus et al., 1988, FEMS Micr
obiol. Lett. 49: 417-422）を挿入し、配列決定のた
め、ファージＭ１３ｍｐ１８及びＭ１３ｍｐ１９に異な
るＤＮＡフラグメントをサブクローニングした。Dale e
t al. (1985, Plasmid 13: 31-40) の技術を用いて、１
３ｍｐ１９にクローニングされた全ＢａｌＩフラグメン
トから、重複欠失も同様に得られた。予備配列決定の結
果から推論した特異的オリゴヌクレオチドプライマーの
合成により、鋳型として利用した適切な組換え型ファー
ジから、配列についてのより多くの情報を得ることがで
きた。２，８７２bpのＢａｌＩフラグメントの完全なヌ
クレオチド配列（図１）を、ＤＮＡの二本鎖について決
定した。ＤＮＡフラグメントの総括的ｄＡ＋ｄＴ含有量
は６３％であり、これはB. thuringiensisの染色体のも
の、つまり６３．６％にきわめて近い（Kaneko et al.,
1978, Microbiol. Immunol. 22: 639-641) 。
【００８１】配列は、潜在的に安定した桿−ループのＲ
ＮＡ構造を形成することができる２つの主要な逆方向の
相補的反復配列を含む。２つの領域のうち大きい方に
は、ヌクレオチド位置３９０のレベルに対称の中心があ
る状態で７０のヌクレオチドが含まれている。Tinoco e
t al. 〔1973, Nature (London) New Biol. 246: 40-4
1〕に従って計算された相互作用自由エネルギーは、−
１５６．５kJ／モルである。２つの対称な配列は不完全
に反復され、位置３９２と４２５の間の図１Ａ上のＤＮ
Ａ領域地図は、それ自体、−６６．１kJ／モルの計算上
の相互作用自由エネルギーをもつ一対の逆方向反復配列
を含んでいる。相補的配列の第２の主要群は、位置１５
７２と１５９８の間にある。１１のヌクレオチドが完全
に反復され、−９５．４kJ／モルという計算上の相互作
用自由エネルギーで１つの桿−ループ構造を形成するこ
とができる。
ＮＡ構造を形成することができる２つの主要な逆方向の
相補的反復配列を含む。２つの領域のうち大きい方に
は、ヌクレオチド位置３９０のレベルに対称の中心があ
る状態で７０のヌクレオチドが含まれている。Tinoco e
t al. 〔1973, Nature (London) New Biol. 246: 40-4
1〕に従って計算された相互作用自由エネルギーは、−
１５６．５kJ／モルである。２つの対称な配列は不完全
に反復され、位置３９２と４２５の間の図１Ａ上のＤＮ
Ａ領域地図は、それ自体、−６６．１kJ／モルの計算上
の相互作用自由エネルギーをもつ一対の逆方向反復配列
を含んでいる。相補的配列の第２の主要群は、位置１５
７２と１５９８の間にある。１１のヌクレオチドが完全
に反復され、−９５．４kJ／モルという計算上の相互作
用自由エネルギーで１つの桿−ループ構造を形成するこ
とができる。
【００８２】図１Ａに示されているヌクレオチド配列
を、潜在的タンパク質をコードする領域について２方向
で検査した。これらの領域は、寸法（７０コドンより大
きい）及び適切な翻訳開始シグナル（Mc Laughlin et a
l., 1981, J. Biol. Chem. 256: 11283-11291)に基づい
て定義づけされた。想定されるわずか２つの読取り枠
（ＯＲＦ−オープンリーディングフレーム）のみが見い
出され、これらは、相反する向きにコードする（図
１）。推定されたｏｒｆ１（ＵＵＧ）及びｏｒｆ２（Ａ
ＵＧ）の出発コドンの前には、B.subtilisの１６Ｓのｒ
ＲＮＡのＯＨ−３′末端と一致する適切なリボソームに
対する結合部位が先行している（Mc Laughlin et al.,
1981) 。Tinoco et al.(1973）に従って推論された相互
作用自由エネルギーは、−５７．５kJ／モル（ｏｒｆ
１）及び−５１kJ／モル（ｏｒｆ２）である。ｏｒｆ１
は、位置２１９３で開始し、位置１７９２で停止する１
３４個のアミノ酸をコードする。想定されたｏｒｆ１産
物の計算上の分子量は１５，５２４である。ｏｒｆ２
は、ＢａｌＩのＤＮＡフラグメントのクローニングによ
り位置２８７２で中断された、位置２５２１に始まるポ
リペプチドをコードする。
を、潜在的タンパク質をコードする領域について２方向
で検査した。これらの領域は、寸法（７０コドンより大
きい）及び適切な翻訳開始シグナル（Mc Laughlin et a
l., 1981, J. Biol. Chem. 256: 11283-11291)に基づい
て定義づけされた。想定されるわずか２つの読取り枠
（ＯＲＦ−オープンリーディングフレーム）のみが見い
出され、これらは、相反する向きにコードする（図
１）。推定されたｏｒｆ１（ＵＵＧ）及びｏｒｆ２（Ａ
ＵＧ）の出発コドンの前には、B.subtilisの１６Ｓのｒ
ＲＮＡのＯＨ−３′末端と一致する適切なリボソームに
対する結合部位が先行している（Mc Laughlin et al.,
1981) 。Tinoco et al.(1973）に従って推論された相互
作用自由エネルギーは、−５７．５kJ／モル（ｏｒｆ
１）及び−５１kJ／モル（ｏｒｆ２）である。ｏｒｆ１
は、位置２１９３で開始し、位置１７９２で停止する１
３４個のアミノ酸をコードする。想定されたｏｒｆ１産
物の計算上の分子量は１５，５２４である。ｏｒｆ２
は、ＢａｌＩのＤＮＡフラグメントのクローニングによ
り位置２８７２で中断された、位置２５２１に始まるポ
リペプチドをコードする。
【００８３】推論されたｏｒｆ１及びｏｒｆ２配列を、
遺伝子バンク／ＥＭＢＬ及びＮＢＲＦで利用可能なタン
パク質配列、特にプラスミドによってコードされた配列
と比較したところ、有意な相同性は全く明らかにされな
かった。
遺伝子バンク／ＥＭＢＬ及びＮＢＲＦで利用可能なタン
パク質配列、特にプラスミドによってコードされた配列
と比較したところ、有意な相同性は全く明らかにされな
かった。
【００８４】ｏｒｆ１及びｏｒｆ２に関する潜在的なプ
ロモーターを、B. subtilis のプロモーターの既知のコ
ンセンサス配列と、ｏｒｆ１及びｏｒｆ２の上流の領域
との比較によって同定した〔Moran, 1986, Regulation
of Procaryotic Development（原核生物発生の調節）、
米国微生物学会、ワシントンＤＣ、167-184 〕（図
１）。位置１５７２と１５９８の間にある対称領域は、
ｏｒｆ１のための転写ターミネーターに一致しうる。ｏ
ｒｆ１と同じ鎖上で読みとられる場合、潜在的桿−ルー
プＲＮＡ構造の後には、２つのＡ残基によって中断され
た６つのＵ残基のセグメントが続く。この構造は、ｒｈ
ｏ非依存性のターミネーターを復元する（繰り返す）。
ロモーターを、B. subtilis のプロモーターの既知のコ
ンセンサス配列と、ｏｒｆ１及びｏｒｆ２の上流の領域
との比較によって同定した〔Moran, 1986, Regulation
of Procaryotic Development（原核生物発生の調節）、
米国微生物学会、ワシントンＤＣ、167-184 〕（図
１）。位置１５７２と１５９８の間にある対称領域は、
ｏｒｆ１のための転写ターミネーターに一致しうる。ｏ
ｒｆ１と同じ鎖上で読みとられる場合、潜在的桿−ルー
プＲＮＡ構造の後には、２つのＡ残基によって中断され
た６つのＵ残基のセグメントが続く。この構造は、ｒｈ
ｏ非依存性のターミネーターを復元する（繰り返す）。
【００８５】ｐＨＴ１０３０の最小複製領域の決定 ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩフラグメントからのＤＮＡフ
ラグメントの複製活性をテストするために、グラム陽性
菌にエリスロマイシン耐性を付与する遺伝子を有する
１．２kbのＤＮＡフラグメント（Trieu-Cuot et al., 1
990, Nucleic Acids Res. 18: 3660) がｐＵＣ１８のＳ
ｓｐＩ部位（図２）にクローニングされている複製起点
プローブベクターｐＨＴ１８１を構築した。ＳｓｐＩ部
位のレベルに挿入されたＥｍr の遺伝子が、ポリリンカ
ークローニング部位もβ−タクタマーゼ遺伝子も中断し
ないことから、E. coli におけるクローニング実験のた
めに、ｐＵＣ１８としてｐＨＴ１８１を利用することが
できる。かくして全ＢａｌＩＤＮＡフラグメント及びそ
の複数のフラグメントをｐＨＴ１８１中にクローニング
し、B.subtilis及びB. thuringiensisにおいてその複製
をテストした（図２）。桿菌における組換え型プラスミ
ドの複製を担持することのできる最小のＤＮＡセグメン
トは、７０５bpのＳｐｅＩ−ＡｆｌIIフラグメントであ
った（ｎｔ３１２〜１０１６、図１）。しかしながら、
このＤＮＡセグメントの複製能力は、ｐＵＣ１８のｌａ
ｃＺプロモーターとの関係におけるその向きにより左右
されていた。ｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１３ａ
は、エリスロマイシンに対する耐性に関して桿菌を形質
転換することができたが、フラグメントが相対する向き
にある、ｐＨＴ３１１２ｂ、ｐＨＴ３１３３ｂ、ｐＨＴ
３１１４及びｐＨＴ３１１５を用いては、形質転換体は
得られなかった。
ラグメントの複製活性をテストするために、グラム陽性
菌にエリスロマイシン耐性を付与する遺伝子を有する
１．２kbのＤＮＡフラグメント（Trieu-Cuot et al., 1
990, Nucleic Acids Res. 18: 3660) がｐＵＣ１８のＳ
ｓｐＩ部位（図２）にクローニングされている複製起点
プローブベクターｐＨＴ１８１を構築した。ＳｓｐＩ部
位のレベルに挿入されたＥｍr の遺伝子が、ポリリンカ
ークローニング部位もβ−タクタマーゼ遺伝子も中断し
ないことから、E. coli におけるクローニング実験のた
めに、ｐＵＣ１８としてｐＨＴ１８１を利用することが
できる。かくして全ＢａｌＩＤＮＡフラグメント及びそ
の複数のフラグメントをｐＨＴ１８１中にクローニング
し、B.subtilis及びB. thuringiensisにおいてその複製
をテストした（図２）。桿菌における組換え型プラスミ
ドの複製を担持することのできる最小のＤＮＡセグメン
トは、７０５bpのＳｐｅＩ−ＡｆｌIIフラグメントであ
った（ｎｔ３１２〜１０１６、図１）。しかしながら、
このＤＮＡセグメントの複製能力は、ｐＵＣ１８のｌａ
ｃＺプロモーターとの関係におけるその向きにより左右
されていた。ｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１３ａ
は、エリスロマイシンに対する耐性に関して桿菌を形質
転換することができたが、フラグメントが相対する向き
にある、ｐＨＴ３１１２ｂ、ｐＨＴ３１３３ｂ、ｐＨＴ
３１１４及びｐＨＴ３１１５を用いては、形質転換体は
得られなかった。
【００８６】この結果は、ｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ
３１１３ａの場合において、クローニング部位の上流に
あるｌａｃＺプロモーターの領域がこれらの欠失誘導体
で失われていたプロモーター活性を提供する、というこ
とを示唆している。従って、ｐＨＴ１０３０の自律的複
製のために必須のプロモーターは、１４６bpのＢａｌＩ
−ＮｄｅＩのＤＮＡフラグメント（ｎｔ１〜１４６、図
１）内に存在しうる。それぞれ７５〜８０及び９８〜１
０３（図１）のヌクレオチド位置レベルで、このＤＮＡ
セグメント内に可能な−３５領域（ＴＴＧＡＴＴ）及び
−１０領域（ＴＡＡＡＡＴ）が見い出される。このこと
は、１kbのＢａｌＩ−ＡｆｌIIフラグメント及びＢａｌ
Ｉ−ＳｃａＩフラグメントが、ｐＨＴ１８１内にいずれ
か１方の向きでクローニングされてプラスミドｐＨＴ３
１０４ａ、ｂ及びｐＨＴ３１０５ａ、ｂ（図２）を与え
る場合、桿菌内で効率の良い複製を提供する、という事
実と一致している。かくして、自律的複製を付与するｐ
ＨＴ１０３０の最小領域は、プラスミドｐＨＴ３１０４
ａ、ｂ（図２）にクローニングされた１，０１６bpのＢ
ａｌＩ−ＡｆｌII制限フラグメント内に完全に包含され
ている。この複製領域の２つの主要な特徴は、７０ヌク
レオチドという長さの点対称配列が存在することと、複
製に必要とされるプラスミドによりコードされる全ての
タンパク質が見かけ上存在しないことである。このＤＮ
Ａ領域内に見い出される最大のＯＲＦ（９５コドン）
は、翻訳開始のための適切なシグナルを提示しない。
３１１３ａの場合において、クローニング部位の上流に
あるｌａｃＺプロモーターの領域がこれらの欠失誘導体
で失われていたプロモーター活性を提供する、というこ
とを示唆している。従って、ｐＨＴ１０３０の自律的複
製のために必須のプロモーターは、１４６bpのＢａｌＩ
−ＮｄｅＩのＤＮＡフラグメント（ｎｔ１〜１４６、図
１）内に存在しうる。それぞれ７５〜８０及び９８〜１
０３（図１）のヌクレオチド位置レベルで、このＤＮＡ
セグメント内に可能な−３５領域（ＴＴＧＡＴＴ）及び
−１０領域（ＴＡＡＡＡＴ）が見い出される。このこと
は、１kbのＢａｌＩ−ＡｆｌIIフラグメント及びＢａｌ
Ｉ−ＳｃａＩフラグメントが、ｐＨＴ１８１内にいずれ
か１方の向きでクローニングされてプラスミドｐＨＴ３
１０４ａ、ｂ及びｐＨＴ３１０５ａ、ｂ（図２）を与え
る場合、桿菌内で効率の良い複製を提供する、という事
実と一致している。かくして、自律的複製を付与するｐ
ＨＴ１０３０の最小領域は、プラスミドｐＨＴ３１０４
ａ、ｂ（図２）にクローニングされた１，０１６bpのＢ
ａｌＩ−ＡｆｌII制限フラグメント内に完全に包含され
ている。この複製領域の２つの主要な特徴は、７０ヌク
レオチドという長さの点対称配列が存在することと、複
製に必要とされるプラスミドによりコードされる全ての
タンパク質が見かけ上存在しないことである。このＤＮ
Ａ領域内に見い出される最大のＯＲＦ（９５コドン）
は、翻訳開始のための適切なシグナルを提示しない。
【００８７】ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の複製挙動 ｐＨＴ３１０４ａにクローニングされた最小レプリコン
の複製機能の完全性は、その複製特性を、複製起点プロ
ーブベクターｐＨＴ１８１（図２）に全ＢａｌＩ ＤＮ
ＡフラグメントがクローニングされているｐＨＴ３１３
０の複製特性と比較することによって確認した。
の複製機能の完全性は、その複製特性を、複製起点プロ
ーブベクターｐＨＴ１８１（図２）に全ＢａｌＩ ＤＮ
ＡフラグメントがクローニングされているｐＨＴ３１３
０の複製特性と比較することによって確認した。
【００８８】２つのプラスミドのコピー数を測定した。
B. subtilis とB. thuringiensisの両方で同時に、ｐＨ
Ｔ３１３０及びｐＨＴ３１０４ａは、相当染色体当た
り、共有結合により閉じられた環状プラスミド４．２±
０．６分子と見積られる同一コピー数を示した。コピー
数の制御のために必要な機能が全て、ｐＨＴ３１０４ａ
にクローニングされた最小レプリコンに存在する、とい
う結論を下すことができる。
B. subtilis とB. thuringiensisの両方で同時に、ｐＨ
Ｔ３１３０及びｐＨＴ３１０４ａは、相当染色体当た
り、共有結合により閉じられた環状プラスミド４．２±
０．６分子と見積られる同一コピー数を示した。コピー
数の制御のために必要な機能が全て、ｐＨＴ３１０４ａ
にクローニングされた最小レプリコンに存在する、とい
う結論を下すことができる。
【００８９】ｐＨＴ３１０４ａの複製機能の完全性をテ
ストするためのもう１つの方法は、その一本鎖ＤＮＡの
産生を見極めることから成っていた。グラム陽性菌から
の数多くのプラスミドが「ローリングサークル」タイプ
のメカニズムにより複製され、負の起点配列の欠失は、
一本鎖プラスミドＤＮＡの蓄積を導く（Gruss 及び Ehr
lich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-241; Devine et
al., 1989）。ｐＨＴ３１００及びｐＨＴ３１０４ａ
を、te Riele et al. により記載された作業様式（1986
a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2541-2545）を利
用して、一本鎖プラスミドＤＮＡ産生についてテストし
た。アガロースゲルにかけて分離した総ＤＮＡ調製物
を、ＮａＯＨによる予備変性を行って又は行わずにニト
ロセルロースフィルター上に移した。
ストするためのもう１つの方法は、その一本鎖ＤＮＡの
産生を見極めることから成っていた。グラム陽性菌から
の数多くのプラスミドが「ローリングサークル」タイプ
のメカニズムにより複製され、負の起点配列の欠失は、
一本鎖プラスミドＤＮＡの蓄積を導く（Gruss 及び Ehr
lich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-241; Devine et
al., 1989）。ｐＨＴ３１００及びｐＨＴ３１０４ａ
を、te Riele et al. により記載された作業様式（1986
a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 2541-2545）を利
用して、一本鎖プラスミドＤＮＡ産生についてテストし
た。アガロースゲルにかけて分離した総ＤＮＡ調製物
を、ＮａＯＨによる予備変性を行って又は行わずにニト
ロセルロースフィルター上に移した。
【００９０】32Ｐで標識したプラスミドｐＵＣ１８によ
るそのハイブリダイゼーションの結果を、図３に示す。
ｐＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１０４ａは、B. subtilis
又はB. thuringiensisのいずれにおいても、検出可能な
量の一本鎖ＤＮＡを産生しなかった。その上、Gruss 及
び Ehrlich (1988）は、「ローリングサークル」タイプ
のプラスミドへの外来性ＤＮＡの挿入は高分子量（ＨＭ
Ｗ）のタンデム多量体形成を導くということを示した。
「ローリングサークル」タイプのハイブリッドプラスミ
ドｐＨＶ３３と比較すると、B. subtilis においてｐＨ
Ｔ３１００及びｐＨＴ３１０４ａでは有意な量のＨＭＷ
は見い出されず（図、レーンＢ及びＣ）、B.thuringien
sis にこれらのプラスミドがある場合にはわずかな率で
しか見い出されなかった（図３、レーンＤ及びＥ）。こ
れらの結果は、ｐＨ１０３０及びその欠失誘導体が一本
鎖ＤＮＡを介して複製されないことを示唆しており、ｐ
ＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１０４の複製挙動が、B. sub
tilis 及びB. thuringiensisにおいて有意に相違しない
ということを示している。かくして、ｐＨＴ１０３０の
必須複製機能が、ｐＨＴ３１０４ａにクローニングされ
た最小レプリコンにおいても保たれるという結論を下す
ことができる。
るそのハイブリダイゼーションの結果を、図３に示す。
ｐＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１０４ａは、B. subtilis
又はB. thuringiensisのいずれにおいても、検出可能な
量の一本鎖ＤＮＡを産生しなかった。その上、Gruss 及
び Ehrlich (1988）は、「ローリングサークル」タイプ
のプラスミドへの外来性ＤＮＡの挿入は高分子量（ＨＭ
Ｗ）のタンデム多量体形成を導くということを示した。
「ローリングサークル」タイプのハイブリッドプラスミ
ドｐＨＶ３３と比較すると、B. subtilis においてｐＨ
Ｔ３１００及びｐＨＴ３１０４ａでは有意な量のＨＭＷ
は見い出されず（図、レーンＢ及びＣ）、B.thuringien
sis にこれらのプラスミドがある場合にはわずかな率で
しか見い出されなかった（図３、レーンＤ及びＥ）。こ
れらの結果は、ｐＨ１０３０及びその欠失誘導体が一本
鎖ＤＮＡを介して複製されないことを示唆しており、ｐ
ＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１０４の複製挙動が、B. sub
tilis 及びB. thuringiensisにおいて有意に相違しない
ということを示している。かくして、ｐＨＴ１０３０の
必須複製機能が、ｐＨＴ３１０４ａにクローニングされ
た最小レプリコンにおいても保たれるという結論を下す
ことができる。
【００９１】ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の分離安定性 ｐＨＴ１０３０の分離安定性に必要なＤＮＡ領域を決定
するため、抗生物質の選択無しにＬＢ培地で、B. subti
lis 又はB.thuringiensis におけるこのレプリコンの欠
失誘導体Ｒｅｐ+ の選択の維持を特徴づけした（図
２）。
するため、抗生物質の選択無しにＬＢ培地で、B. subti
lis 又はB.thuringiensis におけるこのレプリコンの欠
失誘導体Ｒｅｐ+ の選択の維持を特徴づけした（図
２）。
【００９２】最も顕著な不安定性は、ＢａｌＩ−Ｓｓｐ
Ｉ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩの小さなＤＮＡフラグメント
欠失の結果としてもたらされる。これらのフラグメント
が欠けているｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１３ａ
は、選択圧力の無い状態で急速に失われた。その結果、
ｐＨＴ１０３０の複製機能に結びついていることを上で
示した短いこのＤＮＡフラグメントは、同様にレプリコ
ンの安定性に関与している。この３００bpの領域はｓｐ
ｂＡ（桿菌におけるプラスミドの安定性）と呼称され
た。
Ｉ又はＢａｌＩ−ＳｐｅＩの小さなＤＮＡフラグメント
欠失の結果としてもたらされる。これらのフラグメント
が欠けているｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１３ａ
は、選択圧力の無い状態で急速に失われた。その結果、
ｐＨＴ１０３０の複製機能に結びついていることを上で
示した短いこのＤＮＡフラグメントは、同様にレプリコ
ンの安定性に関与している。この３００bpの領域はｓｐ
ｂＡ（桿菌におけるプラスミドの安定性）と呼称され
た。
【００９３】その他のＲｅｐ+ プラスミドは、B. subti
lis においてよりもB.thuringiensis においてさらに安
定していた。この宿主効果について以下で論述する。
lis においてよりもB.thuringiensis においてさらに安
定していた。この宿主効果について以下で論述する。
【００９４】宿主細菌とは独立して、ｏｒｆ２の部分的
欠失（ｐＨＴ３１０９）及びＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラ
グメントの欠失（ｐＨＴ３１２０）は、ｐＨＴ３１３０
と同様に安定したプラスミドを提供した。しかしなが
ら、ｏｒｆ１が部分的に又は全部削除されているプラス
ミド（ｐＨＴ３１０８〜ｐＨＴ３１０４）は、著しく減
少した安定性を示す。これらの結果は、ｏｒｆ１を含む
１，２３４bpのＨａｅIII−ＨｐａＩのＤＮＡフラグメ
ントが、２つの桿菌種におけるｐＨＴ１０３０の維持に
関与していることを示唆している。この遺伝子座はｓｐ
ｂＢと呼ばれる。潜在的なｓｐｂＢ遺伝子産物がｐＨＴ
１０３０の安定性に関与するか否かを決定するために、
中断されたｓｐｂＢ遺伝子を有するプラスミドを構築し
た。ｐＨＴ１０３０の２．６kbのＢａｌＩフラグメント
の独特の（ユニークな）ＨｐａII部位を、ＨｐａIIによ
る切断及びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トによる末端の充てんによって削除し、変更されたＢａ
ｌＩフラグメントをｐＨＴ１８１にクローニングして、
プラスミドｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIを得た。適切な合
成オリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ヌクレオ
チド配列決定により制限部位の変更を確認した。突然変
異誘発は２bpの付加に導くはずであるが、ヌクレオチド
配列決定は、未知の理由により、２bpがｐＨＴ３１３０
△ＨｐａIIにおいて失われたことを明らかにした（ＤＮ
Ａ配列５′−ＴＡＡＡＴＧＧＧＡ−３′はヌクレオチド
位置２０７０−２０８０のレベルで５′−ＴＡＡＡＴＣ
ＣＧＧＧＡ−３′に置き換わった）。それでも、この変
更は、推定上のｓｐｂＢ遺伝子（ｏｒｆ１）内の読み取
り枠のずれを誘発し、枠の１４コドンの下流にナンセン
スコドンをもたらす。ｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIは、ｐ
ＨＴ１０３０よりも低く、欠失誘導体ｐＨＴ３１０８〜
ｐＨＴ３１０４のものと類似の分離安定性をもっていた
（図４）。
欠失（ｐＨＴ３１０９）及びＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラ
グメントの欠失（ｐＨＴ３１２０）は、ｐＨＴ３１３０
と同様に安定したプラスミドを提供した。しかしなが
ら、ｏｒｆ１が部分的に又は全部削除されているプラス
ミド（ｐＨＴ３１０８〜ｐＨＴ３１０４）は、著しく減
少した安定性を示す。これらの結果は、ｏｒｆ１を含む
１，２３４bpのＨａｅIII−ＨｐａＩのＤＮＡフラグメ
ントが、２つの桿菌種におけるｐＨＴ１０３０の維持に
関与していることを示唆している。この遺伝子座はｓｐ
ｂＢと呼ばれる。潜在的なｓｐｂＢ遺伝子産物がｐＨＴ
１０３０の安定性に関与するか否かを決定するために、
中断されたｓｐｂＢ遺伝子を有するプラスミドを構築し
た。ｐＨＴ１０３０の２．６kbのＢａｌＩフラグメント
の独特の（ユニークな）ＨｐａII部位を、ＨｐａIIによ
る切断及びＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン
トによる末端の充てんによって削除し、変更されたＢａ
ｌＩフラグメントをｐＨＴ１８１にクローニングして、
プラスミドｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIを得た。適切な合
成オリゴヌクレオチドプライマーを利用して、ヌクレオ
チド配列決定により制限部位の変更を確認した。突然変
異誘発は２bpの付加に導くはずであるが、ヌクレオチド
配列決定は、未知の理由により、２bpがｐＨＴ３１３０
△ＨｐａIIにおいて失われたことを明らかにした（ＤＮ
Ａ配列５′−ＴＡＡＡＴＧＧＧＡ−３′はヌクレオチド
位置２０７０−２０８０のレベルで５′−ＴＡＡＡＴＣ
ＣＧＧＧＡ−３′に置き換わった）。それでも、この変
更は、推定上のｓｐｂＢ遺伝子（ｏｒｆ１）内の読み取
り枠のずれを誘発し、枠の１４コドンの下流にナンセン
スコドンをもたらす。ｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIは、ｐ
ＨＴ１０３０よりも低く、欠失誘導体ｐＨＴ３１０８〜
ｐＨＴ３１０４のものと類似の分離安定性をもっていた
（図４）。
【００９５】これらの実験データは、桿菌におけるｐＨ
Ｔ１０３０の維持に対する、ｓｐｂＢによりコードされ
たポリペプチドの関与を示している。ｓｐｂＢの発現に
ついて、E. coli のインビトロ転写−翻訳系においてテ
ストした（図４）。想定上のｓｐｂＢ遺伝子を含む（図
１のヌクレオチド位置１６９２と２２５６の間に局在す
る）５６４bpのＢｓｔＵＩのＤＮＡフラグメントを、各
々ｐＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIから別
々に精製し、平行してテストした。ｐＨＴ３１３０のＢ
ｓｔＵＩのＤＮＡフラグメントのみが、付加的な１５kD
a のタンパク質の発現を誘導した（図４、レーン４）。
その上、全ｐＨＴ３１０９及びｐＨＴ１１４のインビト
ロ転写−翻訳は、同じ見かけのサイズを示すタンパク質
の出現を導いた。このタンパク質は、ｐＨＴ１８１を含
む試験において欠如していた。ＳｐｂＢポリペプチドの
見かけのサイズは、ｏｒｆ１のヌクレオチド配列から計
算された分子量と一致している。これらの結果は、この
ＤＮＡ配列の完全性が、恐らくはコードされたタンパク
質の発現によって、安定性のために必要とされるという
ことを実証している。
Ｔ１０３０の維持に対する、ｓｐｂＢによりコードされ
たポリペプチドの関与を示している。ｓｐｂＢの発現に
ついて、E. coli のインビトロ転写−翻訳系においてテ
ストした（図４）。想定上のｓｐｂＢ遺伝子を含む（図
１のヌクレオチド位置１６９２と２２５６の間に局在す
る）５６４bpのＢｓｔＵＩのＤＮＡフラグメントを、各
々ｐＨＴ３１３０及びｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIから別
々に精製し、平行してテストした。ｐＨＴ３１３０のＢ
ｓｔＵＩのＤＮＡフラグメントのみが、付加的な１５kD
a のタンパク質の発現を誘導した（図４、レーン４）。
その上、全ｐＨＴ３１０９及びｐＨＴ１１４のインビト
ロ転写−翻訳は、同じ見かけのサイズを示すタンパク質
の出現を導いた。このタンパク質は、ｐＨＴ１８１を含
む試験において欠如していた。ＳｐｂＢポリペプチドの
見かけのサイズは、ｏｒｆ１のヌクレオチド配列から計
算された分子量と一致している。これらの結果は、この
ＤＮＡ配列の完全性が、恐らくはコードされたタンパク
質の発現によって、安定性のために必要とされるという
ことを実証している。
【００９６】ｓｐｂＢの不在はプラスミドの見かけの複
製挙動を変えないことから、ｓｐｂＢ遺伝子産物は、単
に安定性に関与するだけである。
製挙動を変えないことから、ｓｐｂＢ遺伝子産物は、単
に安定性に関与するだけである。
【００９７】遺伝子座は能動的安定化の機能を有するの
だろうか？ Nordstrom 及びAustin (1989, Annu. Rev. Genet. 23:
37-69)は、２つのクラスの安定性因子を定義づけした。
すなわち、細胞分裂中のプラスミドの無作為分布を確保
する因子及び偶然の安定性よりも優れた安定性を可能に
する因子である。
だろうか？ Nordstrom 及びAustin (1989, Annu. Rev. Genet. 23:
37-69)は、２つのクラスの安定性因子を定義づけした。
すなわち、細胞分裂中のプラスミドの無作為分布を確保
する因子及び偶然の安定性よりも優れた安定性を可能に
する因子である。
【００９８】従って、ｓｐｂＢ遺伝子座がどのクラスに
属するかを決定するため、ｓｐｂＢの不在下及び存在下
での世代毎のプラスミドの喪失頻度を立証することが必
要であった。ｐＨＴ１０３０のコピー数に基づく理論的
頻度とこれらの頻度を比較することにより、ｓｐｂＢの
役目を示すことができた。
属するかを決定するため、ｓｐｂＢの不在下及び存在下
での世代毎のプラスミドの喪失頻度を立証することが必
要であった。ｐＨＴ１０３０のコピー数に基づく理論的
頻度とこれらの頻度を比較することにより、ｓｐｂＢの
役目を示すことができた。
【００９９】ＬＢ培地で行なった安定性の実験は、非選
択的条件下でのプラスミドの包括的維持を示した（図
２）。しかしながら、この実験では、世代毎のプラスミ
ド喪失頻度の見積りを行なうことができなかった。ＬＢ
培地で一晩培養することにより、いくつかの細胞の胞子
形成が誘発される。約２５世代の後に評価した場合、プ
ラスミドの安定性について得られる値は、栄養細胞と胞
子形成細胞の混合集団の結果としてもたらされる。
択的条件下でのプラスミドの包括的維持を示した（図
２）。しかしながら、この実験では、世代毎のプラスミ
ド喪失頻度の見積りを行なうことができなかった。ＬＢ
培地で一晩培養することにより、いくつかの細胞の胞子
形成が誘発される。約２５世代の後に評価した場合、プ
ラスミドの安定性について得られる値は、栄養細胞と胞
子形成細胞の混合集団の結果としてもたらされる。
【０１００】これら２つの増殖状態の間でのプラスミド
の安定性を区別するために、プラスミドを含まない細胞
の産生を、胞子形成の開始を妨げるため富培地（ＢＨ
Ｉ）の中で、及びプラスミドを含まない胞子の産生頻度
を決定するため胞子形成特異培地（ＳＰ又はＨＣＴ）の
中で、別々に続行した。
の安定性を区別するために、プラスミドを含まない細胞
の産生を、胞子形成の開始を妨げるため富培地（ＢＨ
Ｉ）の中で、及びプラスミドを含まない胞子の産生頻度
を決定するため胞子形成特異培地（ＳＰ又はＨＣＴ）の
中で、別々に続行した。
【０１０１】ＢＨＩ培地では、ｓｐｂＢ遺伝子座及び全
複製領域を有するプラスミド（ｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ
３１２０又はｐＨＴ３１０９）は、B. subtilis の細胞
の９５％以上が６０世代の後にこれらのプラスミドを収
容し（図５Ａ）、B. thuringiensisの細胞の９９％が８
０世代の後に収容していた（図５Ｂ）ことから、きわめ
て安定した形で維持された。ｓｐｂＢが無かったプラス
ミド（ｐＨＴ３１０４ａ及びｐＨＴ３１０７）又はｓｐ
ｂＢ遺伝子が破断されたプラスミド（ｐＨＴ３１０８及
びｐＨＴ３１３０△ＨｐａII）は、全ｓｐｂＢ配列を有
するレプリコンに比べ、著しく不安定であった（図５Ａ
及びＢ）。
複製領域を有するプラスミド（ｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ
３１２０又はｐＨＴ３１０９）は、B. subtilis の細胞
の９５％以上が６０世代の後にこれらのプラスミドを収
容し（図５Ａ）、B. thuringiensisの細胞の９９％が８
０世代の後に収容していた（図５Ｂ）ことから、きわめ
て安定した形で維持された。ｓｐｂＢが無かったプラス
ミド（ｐＨＴ３１０４ａ及びｐＨＴ３１０７）又はｓｐ
ｂＢ遺伝子が破断されたプラスミド（ｐＨＴ３１０８及
びｐＨＴ３１３０△ＨｐａII）は、全ｓｐｂＢ配列を有
するレプリコンに比べ、著しく不安定であった（図５Ａ
及びＢ）。
【０１０２】ｓｐｂＡ遺伝子座が不在であった第２のク
ラスのプラスミド（ｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１
３ａ）は、B. subtilis 及びB. thuringiensisの両方に
おいてきわめて不安定であるように思われる。しかしな
がら、ｓｐｂＢ配列を有するＤＮＡ領域の存在（ｐＨＴ
３１１２ａ）は、それが不在である場合（ｐＨＴ３１１
３ａ）に比べて、不安定さを低減させる。
ラスのプラスミド（ｐＨＴ３１１２ａ及びｐＨＴ３１１
３ａ）は、B. subtilis 及びB. thuringiensisの両方に
おいてきわめて不安定であるように思われる。しかしな
がら、ｓｐｂＢ配列を有するＤＮＡ領域の存在（ｐＨＴ
３１１２ａ）は、それが不在である場合（ｐＨＴ３１１
３ａ）に比べて、不安定さを低減させる。
【０１０３】B. subtilis 及びB. thuringiensisが同調
して胞子形成するＳＰ及びＨＣＴ培地を用いることによ
り、胞子形成中のプラスミドの安定性の決定を行なっ
た。胞子形成のｔ0 の直前に（抗生物質無しの培地の接
種から約１５世代後）、Ｅｍr細胞の割合は、変化なし
であるか又はわずかだけ低減している（図６Ａ及び
Ｂ）。このことは、胞子形成段階の完全な推移後に観察
された結果と明確な対照をなしている。プラスミドｐＨ
Ｔ３１３０△ＨｐａII、ｐＨＴ３１０８及びｐＨＴ３１
０４ａを収容する細胞は、特にB.subtilisにおいて大き
い割合のプラスミドを含まない胞子を生み出す。プラス
ミドｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ３１２０及びｐＨＴ３１０
９は、胞子形成プロセス中、安定した形で維持される。
これらの結果は、栄養増殖において得られた結果と一致
しており、胞子形成中、プラスミドの安定性がｓｐｂＢ
を担持するＤＮＡ領域によって左右されるということを
強く示唆している。
して胞子形成するＳＰ及びＨＣＴ培地を用いることによ
り、胞子形成中のプラスミドの安定性の決定を行なっ
た。胞子形成のｔ0 の直前に（抗生物質無しの培地の接
種から約１５世代後）、Ｅｍr細胞の割合は、変化なし
であるか又はわずかだけ低減している（図６Ａ及び
Ｂ）。このことは、胞子形成段階の完全な推移後に観察
された結果と明確な対照をなしている。プラスミドｐＨ
Ｔ３１３０△ＨｐａII、ｐＨＴ３１０８及びｐＨＴ３１
０４ａを収容する細胞は、特にB.subtilisにおいて大き
い割合のプラスミドを含まない胞子を生み出す。プラス
ミドｐＨＴ３１３０、ｐＨＴ３１２０及びｐＨＴ３１０
９は、胞子形成プロセス中、安定した形で維持される。
これらの結果は、栄養増殖において得られた結果と一致
しており、胞子形成中、プラスミドの安定性がｓｐｂＢ
を担持するＤＮＡ領域によって左右されるということを
強く示唆している。
【０１０４】胞子形成のｔ0 の後、新たに有意な細胞増
殖は無い。従って、ｐＨＴ３１３０△ＨｐａII、ｐＨＴ
３１０８及びｐＨＴ３１０４ａの不安定性は、単純な細
胞分裂であるものとみなされうる胞子形成段階の結果と
してもたらされる。この分化プロセスの最初の段階の１
つは、細胞を２つの不等の区画に分割する胞子形成隔壁
の形成である。B. subtilis 及びB. thuringiensisの両
方において、前胞子区画は、母細胞の体積の約６分の１
を占めている（Ryter, 1965; Ribier 及びLecadet, 197
3)。かくして、プラスミドの無作為分布が、プラスミド
を含まない胞子の産生頻度を高くするようにすることを
期待すべきであろう。
殖は無い。従って、ｐＨＴ３１３０△ＨｐａII、ｐＨＴ
３１０８及びｐＨＴ３１０４ａの不安定性は、単純な細
胞分裂であるものとみなされうる胞子形成段階の結果と
してもたらされる。この分化プロセスの最初の段階の１
つは、細胞を２つの不等の区画に分割する胞子形成隔壁
の形成である。B. subtilis 及びB. thuringiensisの両
方において、前胞子区画は、母細胞の体積の約６分の１
を占めている（Ryter, 1965; Ribier 及びLecadet, 197
3)。かくして、プラスミドの無作為分布が、プラスミド
を含まない胞子の産生頻度を高くするようにすることを
期待すべきであろう。
【０１０５】栄養段階（図５Ａ及びＢ）又は胞子形成段
階（図６Ａ及びＢ）において得られた安定性の結果の平
均に基づいて、ｓｐｂＢ遺伝子座を有するか又はこの遺
伝子座を備えていないプラスミドの安定性頻度を決定
し、相当染色体あたり４．２というコピー数、つまり分
裂前の細胞１個につき約２０コピーを有するプラスミド
の場合に期待される理論上の頻度と比較した（表１）。
胞子形成のｔ0 の段階の桿菌のＤＮＡを抽出することが
困難であることから、この分化段階中のプラスミドのコ
ピー数は測定されず、この数が栄養段階中に得られたも
のと同一であるという仮定が出されている。
階（図６Ａ及びＢ）において得られた安定性の結果の平
均に基づいて、ｓｐｂＢ遺伝子座を有するか又はこの遺
伝子座を備えていないプラスミドの安定性頻度を決定
し、相当染色体あたり４．２というコピー数、つまり分
裂前の細胞１個につき約２０コピーを有するプラスミド
の場合に期待される理論上の頻度と比較した（表１）。
胞子形成のｔ0 の段階の桿菌のＤＮＡを抽出することが
困難であることから、この分化段階中のプラスミドのコ
ピー数は測定されず、この数が栄養段階中に得られたも
のと同一であるという仮定が出されている。
【０１０６】以上に示したように、全てのプラスミド
が、B. subtilis において、B. thuringiensisの場合に
比べて安定性が約４分の１低いと思われる。
が、B. subtilis において、B. thuringiensisの場合に
比べて安定性が約４分の１低いと思われる。
【０１０７】２つの生物体において、類似のｐＨＴ３１
０４ａの見かけの挙動及び計算上のコピー数が見い出さ
れたが、B. subtilis とB. thuringiensisの間のこのタ
イプのプラスミドの安定性の差異は、一部にはB. subti
lis の細胞集団におけるコピー数の変動を導く複製の制
御における欠陥の結果としてもたらされたと考えられ
る。それでも、胞子形成中のB. subtilis 及びB. thuri
ngiensisの細胞の間に観察されたプラスミドの安定性に
関する大きな差異を説明するためには、恐らく宿主に関
するその他の要因も考慮に入れるべきであろう（図６及
び表１）。しかしながら、B. subtilis 及びB.thuringi
ensis の両方において、ｓｐｂＢ領域を有するプラスミ
ドは、この領域をもたないプラスミドに比べて優れた頻
度で維持された（表１）。
０４ａの見かけの挙動及び計算上のコピー数が見い出さ
れたが、B. subtilis とB. thuringiensisの間のこのタ
イプのプラスミドの安定性の差異は、一部にはB. subti
lis の細胞集団におけるコピー数の変動を導く複製の制
御における欠陥の結果としてもたらされたと考えられ
る。それでも、胞子形成中のB. subtilis 及びB. thuri
ngiensisの細胞の間に観察されたプラスミドの安定性に
関する大きな差異を説明するためには、恐らく宿主に関
するその他の要因も考慮に入れるべきであろう（図６及
び表１）。しかしながら、B. subtilis 及びB.thuringi
ensis の両方において、ｓｐｂＢ領域を有するプラスミ
ドは、この領域をもたないプラスミドに比べて優れた頻
度で維持された（表１）。
【０１０８】さらに、胞子形成中、ｓｐｂＢ+ プラスミ
ドは、無作為分布から推測される頻度に近い頻度で維持
されている。これらの結果は、あらゆる場合において、
ｓｐｂＢの存在が、約２０に等しい係数だけプラスミド
の損失頻度を減少させるということを示している。
ドは、無作為分布から推測される頻度に近い頻度で維持
されている。これらの結果は、あらゆる場合において、
ｓｐｂＢの存在が、約２０に等しい係数だけプラスミド
の損失頻度を減少させるということを示している。
【０１０９】ｓｐｂＢによって調節される安定性のメカ
ニズムの検査 非相同レプリコンを安定化するか又はトランスで機能さ
せるｓｐｂＢの能力及び細菌の増殖に対するその効果に
ついて、ｓｐｂＢのメカニズムに関する情報を得る目的
で検査した。
ニズムの検査 非相同レプリコンを安定化するか又はトランスで機能さ
せるｓｐｂＢの能力及び細菌の増殖に対するその効果に
ついて、ｓｐｂＢのメカニズムに関する情報を得る目的
で検査した。
【０１１０】非相同のプラスミドを安定化させるｓｐｂ
Ｂの能力をテストするため、ｐＵＣ１８のＳｓｐＩ部位
レベルでのレプリコンｐＢＣ１６△１のクローニング
（Polak 及びNovick, 1982）により、ベクターｐＨＴ１
６１８を構築した（図７）。ｐＢＣ１６△１は、グラム
陽性菌にテトラサイクリン耐性を付与するB. cereus の
レプリコンｐＢＣ１６の誘導体である。ｐＢＣ１６は
「ローリングサークル」タイプのプラスミドである（Gr
uss 及びEhrlich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-24
1）。
Ｂの能力をテストするため、ｐＵＣ１８のＳｓｐＩ部位
レベルでのレプリコンｐＢＣ１６△１のクローニング
（Polak 及びNovick, 1982）により、ベクターｐＨＴ１
６１８を構築した（図７）。ｐＢＣ１６△１は、グラム
陽性菌にテトラサイクリン耐性を付与するB. cereus の
レプリコンｐＢＣ１６の誘導体である。ｐＢＣ１６は
「ローリングサークル」タイプのプラスミドである（Gr
uss 及びEhrlich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-24
1）。
【０１１１】完全な又は中断されたｓｐｂＢ領域を含む
さまざまなＤＮＡフラグメントを、ｐＨＴ１６１８のク
ローニング部位においてクローニングした（図７）。こ
れらの組換え型プラスミドの安定性を、抗生物質無しで
栄養増殖中のB. subtilis において分析した（図８）。
ｐＨＴ１６１０及びｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIは、ｐＨ
Ｔ１６１８ほど安定性は高くなかった。この安定性の減
少は、前のデータと一致しており、ｐＢＣ１６と共通点
を有するプラスミドｐＵＢ１１０の分離安定性（Polak
及びNovick, 1982）がサイズによって左右され、ＤＮＡ
の挿入により著しく低減する（Bron et al., 1988)こと
を示している。ｐＨＴ１６１０の不安定性は、ｓｐｂＢ
遺伝子を含むＡｃｃＩ−ＢａｌＩフラグメントがレプリ
コンに対して安定性機能を付与しなかったことを明確に
示している。
さまざまなＤＮＡフラグメントを、ｐＨＴ１６１８のク
ローニング部位においてクローニングした（図７）。こ
れらの組換え型プラスミドの安定性を、抗生物質無しで
栄養増殖中のB. subtilis において分析した（図８）。
ｐＨＴ１６１０及びｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIは、ｐＨ
Ｔ１６１８ほど安定性は高くなかった。この安定性の減
少は、前のデータと一致しており、ｐＢＣ１６と共通点
を有するプラスミドｐＵＢ１１０の分離安定性（Polak
及びNovick, 1982）がサイズによって左右され、ＤＮＡ
の挿入により著しく低減する（Bron et al., 1988)こと
を示している。ｐＨＴ１６１０の不安定性は、ｓｐｂＢ
遺伝子を含むＡｃｃＩ−ＢａｌＩフラグメントがレプリ
コンに対して安定性機能を付与しなかったことを明確に
示している。
【０１１２】ｓｐｂＢ遺伝子の下流にあるＤＮＡセグメ
ント（ＳｃａＩ−ＡｃｃＩ又はＨｉｎｄIII−Ａｃｃ
Ｉ）のプラスミドに対する付加は、ｐＨＴ１６１０にお
けるｓｐｂＢ遺伝子のクローニングによる安定性の低減
を完全に除いた。実際、ｐＨＴ１６０９及びｐＨＴ１６
１１は、少なくともｐＨＴ１６１８と同じ位安定してお
り、類似の寸法のＤＮＡの挿入を有するｐＨＴ１６１０
及びｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIよりも有意なほどさらに
安定している。ＳＰ培地におけるプラスミドを含まない
胞子の産生頻度の決定も、類似の結果を示した。
ント（ＳｃａＩ−ＡｃｃＩ又はＨｉｎｄIII−Ａｃｃ
Ｉ）のプラスミドに対する付加は、ｐＨＴ１６１０にお
けるｓｐｂＢ遺伝子のクローニングによる安定性の低減
を完全に除いた。実際、ｐＨＴ１６０９及びｐＨＴ１６
１１は、少なくともｐＨＴ１６１８と同じ位安定してお
り、類似の寸法のＤＮＡの挿入を有するｐＨＴ１６１０
及びｐＨＴ１６１１△ＨｐａIIよりも有意なほどさらに
安定している。ＳＰ培地におけるプラスミドを含まない
胞子の産生頻度の決定も、類似の結果を示した。
【０１１３】従って、これらの結果は、ｐＢＣ１６から
来る組換え型プラスミドに対して安定性を付与するため
には、ｓｐｂＢ遺伝子に加えて遺伝子の下流に位置する
ＳｃａＩ−ＡｃｃＩのＤＮＡフラグメントが必要である
ということを示している。ＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラグ
メントの欠失は安定性を減少させず（ｐＨＴ３１２
０）、従って、安定性のための必須機能は、短いＨａｅ
III−ＡｃｃＩフラグメントにある。このＤＮＡフラグ
メントは、ｓｐｂＢ遺伝子産物の機能的発現に必要とさ
れうる潜在的ターミネーターである対称領域を含んでい
る。
来る組換え型プラスミドに対して安定性を付与するため
には、ｓｐｂＢ遺伝子に加えて遺伝子の下流に位置する
ＳｃａＩ−ＡｃｃＩのＤＮＡフラグメントが必要である
ということを示している。ＳｃａＩ−ＨａｅIIIフラグ
メントの欠失は安定性を減少させず（ｐＨＴ３１２
０）、従って、安定性のための必須機能は、短いＨａｅ
III−ＡｃｃＩフラグメントにある。このＤＮＡフラグ
メントは、ｓｐｂＢ遺伝子産物の機能的発現に必要とさ
れうる潜在的ターミネーターである対称領域を含んでい
る。
【０１１４】ｓｐｂＢタンパク質がトランスで機能する
か否かを見極めるために、不安定なプラスミドｐＨＴ３
１０４ａ又はｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIにより、ｐＨＴ
１６１８又はｐＨＴ１６０９を収容するＲｅｃ- のB. s
ubtilis 菌株を形質転換させた。ｐＨＴ１６０９は、こ
れら２つのプラスミドの安定性に対して検出可能な効果
をもたず、安定化のためにはレプリコンとｓｐｂＢ遺伝
子座が同じ分子上にあることが必要であるということを
示している。
か否かを見極めるために、不安定なプラスミドｐＨＴ３
１０４ａ又はｐＨＴ３１３０△ＨｐａIIにより、ｐＨＴ
１６１８又はｐＨＴ１６０９を収容するＲｅｃ- のB. s
ubtilis 菌株を形質転換させた。ｐＨＴ１６０９は、こ
れら２つのプラスミドの安定性に対して検出可能な効果
をもたず、安定化のためにはレプリコンとｓｐｂＢ遺伝
子座が同じ分子上にあることが必要であるということを
示している。
【０１１５】従って、ｓｐｂＢは、娘細胞に対するプラ
スミドの分布を確実にするためタンパク質がトランスで
機能する真の分配系（Austin及びNordstrom, 1990, Cel
l 60: 351-354)とはならない。この特徴及び非相同レプ
リコンを安定化する能力は、「ハンター（殺りく者）」
ｃｃｄ及びｈｏｋ／ｓｏｋ系の細胞に類似している（Ja
ffe et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841-849; Gerd
es et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 31
16-3120 ）。興味深いことに、ｓｐｂＢ+ プラスミドを
収容するB. subtilis の細胞は、ｓｐｂＢ- プラスミド
を収容する細胞と比べて約３分の１の数の生育可能な胞
子しか産生しない（表２）。このことも又「ハンター」
タイプの作用モデルと一致している。
スミドの分布を確実にするためタンパク質がトランスで
機能する真の分配系（Austin及びNordstrom, 1990, Cel
l 60: 351-354)とはならない。この特徴及び非相同レプ
リコンを安定化する能力は、「ハンター（殺りく者）」
ｃｃｄ及びｈｏｋ／ｓｏｋ系の細胞に類似している（Ja
ffe et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841-849; Gerd
es et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 31
16-3120 ）。興味深いことに、ｓｐｂＢ+ プラスミドを
収容するB. subtilis の細胞は、ｓｐｂＢ- プラスミド
を収容する細胞と比べて約３分の１の数の生育可能な胞
子しか産生しない（表２）。このことも又「ハンター」
タイプの作用モデルと一致している。
【０１１６】B. subtilis の細胞の胞子形成中に、プラ
スミドを含まない胞子の高い産生頻度がｓｐｂＢ- プラ
スミド及びｓｐｂＢ+ プラスミドで同等であると仮定し
たならば、ｓｐｂＢ+ プラスミドの見かけの安定性は、
ＳｐｂＢタンパク質の分離後活性の結果としてもたらさ
れうることだろう。ｓｐｂＢ+ プラスミドが失われた場
合、ＳｐｂＢタンパク質は機能的になり得、その生理学
的効果は、生育可能な胞子の形成と細胞の発育を妨げる
か又は遅延させることであると考えられる。
スミドを含まない胞子の高い産生頻度がｓｐｂＢ- プラ
スミド及びｓｐｂＢ+ プラスミドで同等であると仮定し
たならば、ｓｐｂＢ+ プラスミドの見かけの安定性は、
ＳｐｂＢタンパク質の分離後活性の結果としてもたらさ
れうることだろう。ｓｐｂＢ+ プラスミドが失われた場
合、ＳｐｂＢタンパク質は機能的になり得、その生理学
的効果は、生育可能な胞子の形成と細胞の発育を妨げる
か又は遅延させることであると考えられる。
【０１１７】考察 グラム陽性プラスミドｐＨＴ１０３０の複製及び安定性
の機能は、２．９kbのＢａｌＩ制限フラグメントのレベ
ルで地図上に予め局在化された（Lereclus etal., 198
8, FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422) 。
の機能は、２．９kbのＢａｌＩ制限フラグメントのレベ
ルで地図上に予め局在化された（Lereclus etal., 198
8, FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422) 。
【０１１８】ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の構築は、自
律的複製を付与する最小レプリコンが１kbのＤＮＡフラ
グメント内に包含されていることを明らかにしている。
このＤＮＡ領域を担持するプラスミドは、全ＢａｌＩ制
限フラグメントを担持するプラスミドのものと類似した
複製挙動を示す。これらはコピー数の少ないプラスミド
（相当染色体あたり４．２コピー）であり、複製中、一
本鎖ＤＮＡ分子を蓄積しない。この最後の特徴は、グラ
ム陽性レプリコンにおいて最も一般的に見られる「ロー
リングサークル」複製様式を除外している（Gruss 及び
Ehrlich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-241)。
律的複製を付与する最小レプリコンが１kbのＤＮＡフラ
グメント内に包含されていることを明らかにしている。
このＤＮＡ領域を担持するプラスミドは、全ＢａｌＩ制
限フラグメントを担持するプラスミドのものと類似した
複製挙動を示す。これらはコピー数の少ないプラスミド
（相当染色体あたり４．２コピー）であり、複製中、一
本鎖ＤＮＡ分子を蓄積しない。この最後の特徴は、グラ
ム陽性レプリコンにおいて最も一般的に見られる「ロー
リングサークル」複製様式を除外している（Gruss 及び
Ehrlich, 1989, Microbiol. Rev. 53: 231-241)。
【０１１９】この１kbのＤＮＡフラグメントの主要な特
徴は、潜在的タンパク質をコードする配列の不在であ
る。このため、これは、自分自身の複製のため宿主タン
パク質しか必要としないＣｏｌＥ１タイプのプラスミド
に似ている。しかしながら、ＣｏｌＥ１とは異なり、ｐ
ＨＴ１０３０からのプラスミドは、培地へのクロラムフ
ェニコール添加の後、増幅されない。これらの特徴は、
ｐＨＴ１０３０が、グラム陽性菌においてそれまで発見
されなかった１つのレプリコンクラスの中に位置づけさ
れるということを示している。
徴は、潜在的タンパク質をコードする配列の不在であ
る。このため、これは、自分自身の複製のため宿主タン
パク質しか必要としないＣｏｌＥ１タイプのプラスミド
に似ている。しかしながら、ＣｏｌＥ１とは異なり、ｐ
ＨＴ１０３０からのプラスミドは、培地へのクロラムフ
ェニコール添加の後、増幅されない。これらの特徴は、
ｐＨＴ１０３０が、グラム陽性菌においてそれまで発見
されなかった１つのレプリコンクラスの中に位置づけさ
れるということを示している。
【０１２０】ｐＨＴ１０３０の最小レプリコンのもう１
つの特殊な特徴は、２つの相補的領域のうちの１つがそ
れ自体逆方向反復配列を含んでいるＲＮＡ桿−ループ構
造を潜在的に形成する７０ヌクレオチドの配列にある
（図１のヌクレオチド位置３９２と４２５の間の地
図）。
つの特殊な特徴は、２つの相補的領域のうちの１つがそ
れ自体逆方向反復配列を含んでいるＲＮＡ桿−ループ構
造を潜在的に形成する７０ヌクレオチドの配列にある
（図１のヌクレオチド位置３９２と４２５の間の地
図）。
【０１２１】（イニシエーターＲＮＡ分子の合成のため
に必須でありうる）潜在的プロモーターを含む３００bp
のＤＮＡ領域の欠失は、ｐＨＴ１０３０の誘導体を複製
できないものにしてしまう。この欠陥は、ｐＵＣ１８の
ｌａｃＺプロモーター領域の付加によって除去される
が、結果として得られるプラスミド（ｐＨＴ３１１２ａ
及びｐＨＴ３１１３ａ）の分離安定性は、B. subtilis
及びB.thuringiensis において著しく低下する。従っ
て、３００bpのこのセグメントは、恐らくｐＨＴ１０３
０の複製機能に結びつけられる安定性遺伝子座（ｓｐｂ
Ａ）を規定する。
に必須でありうる）潜在的プロモーターを含む３００bp
のＤＮＡ領域の欠失は、ｐＨＴ１０３０の誘導体を複製
できないものにしてしまう。この欠陥は、ｐＵＣ１８の
ｌａｃＺプロモーター領域の付加によって除去される
が、結果として得られるプラスミド（ｐＨＴ３１１２ａ
及びｐＨＴ３１１３ａ）の分離安定性は、B. subtilis
及びB.thuringiensis において著しく低下する。従っ
て、３００bpのこのセグメントは、恐らくｐＨＴ１０３
０の複製機能に結びつけられる安定性遺伝子座（ｓｐｂ
Ａ）を規定する。
【０１２２】ｐＨＴ１０３０の異なる欠失誘導体の分離
安定性を、栄養増殖中と胞子形成段階中とで別々に検査
した。実験は、ｐＨＴ１０３０の最小レプリコンを担持
するプラスミド又はｓｐｂＢと呼ばれるＤＮＡ領域に欠
失があるプラスミドが、桿菌、特にB.thuringiensis に
おいて安定した形で維持されないことを示している。未
知の理由で、これらのプラスミドの安定性は、B. subti
lis においては不確実というよりもむしろ不良である。
興味深いことに、プラスミドを含まない胞子の高い産生
頻度は、胞子形成隔壁による細胞の不等分別に基づくプ
ラスミドの無作為分布に相関させることができた。しか
しながら、栄養段階においても胞子形成段階において
も、ｓｐｂＢ遺伝子座を担持するプラスミドは、２つの
桿菌種において安定した形で維持されている。
安定性を、栄養増殖中と胞子形成段階中とで別々に検査
した。実験は、ｐＨＴ１０３０の最小レプリコンを担持
するプラスミド又はｓｐｂＢと呼ばれるＤＮＡ領域に欠
失があるプラスミドが、桿菌、特にB.thuringiensis に
おいて安定した形で維持されないことを示している。未
知の理由で、これらのプラスミドの安定性は、B. subti
lis においては不確実というよりもむしろ不良である。
興味深いことに、プラスミドを含まない胞子の高い産生
頻度は、胞子形成隔壁による細胞の不等分別に基づくプ
ラスミドの無作為分布に相関させることができた。しか
しながら、栄養段階においても胞子形成段階において
も、ｓｐｂＢ遺伝子座を担持するプラスミドは、２つの
桿菌種において安定した形で維持されている。
【０１２３】ｓｐｂＢは、ｐＨＴ１０３０の安定性に関
与しうる１５kDa のポリペプチドをコードする。（ｐＢ
Ｃ１６からの）非相同レプリコン内にひとたびクローニ
ングされると、ｓｐｂＢ遺伝子座は、弱いが有意な分離
安定性を付与し、一方ｓｐｂＢ+ プラスミドは、ｓｐｂ
Ｂの欠失したプラスミド又は中断されたｓｐｂＢ遺伝子
を有するプラスミドをトランスで安定化しない。このこ
とは、その安定性機能を行使するためには、ｓｐｂＢ遺
伝子座をレプリコンに結びつけなくてはならないという
ことを表わしている。
与しうる１５kDa のポリペプチドをコードする。（ｐＢ
Ｃ１６からの）非相同レプリコン内にひとたびクローニ
ングされると、ｓｐｂＢ遺伝子座は、弱いが有意な分離
安定性を付与し、一方ｓｐｂＢ+ プラスミドは、ｓｐｂ
Ｂの欠失したプラスミド又は中断されたｓｐｂＢ遺伝子
を有するプラスミドをトランスで安定化しない。このこ
とは、その安定性機能を行使するためには、ｓｐｂＢ遺
伝子座をレプリコンに結びつけなくてはならないという
ことを表わしている。
【０１２４】従って、ｓｐｂＢは、複製機能とは独立し
てｐＨＴ１０３０の分離安定性に活発に（能動的に）関
与している。その機能メカニズムは、「ハンター」ｃｃ
ｄ及びｈｏｋ／ｓｏｋ系の細胞に似た特徴を示す（Jaff
e et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841-849; Gerdes
et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3116
-3120 ）このような遺伝子座を有するプラスミドは、ハ
ンタータンパク質及びｃｃｄ系のタンパク質である拮抗
作用物質（Ogura 及びHiraga, 1983, Proc. Natl. Aca
d. USA 80: 4784-4788; Miki et al., 1984, J. Mol. B
iol. 174: 605-625) 、及びｈｏｋ／ｓｏｋ系において
アンチセンスＲＮＡ（Gerdes et al., 1990, Mol. Micr
obiol. 4: 1807-1818)を産生する。プラスミドが失われ
た場合、遮断薬（ブロック剤）は、より安定したハンタ
ー決定因子よりも急速に消滅し、細胞の死滅を誘発する
ハンター活性の発現を可能にする。
てｐＨＴ１０３０の分離安定性に活発に（能動的に）関
与している。その機能メカニズムは、「ハンター」ｃｃ
ｄ及びｈｏｋ／ｓｏｋ系の細胞に似た特徴を示す（Jaff
e et al., 1985, J. Bacteriol. 163: 841-849; Gerdes
et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 3116
-3120 ）このような遺伝子座を有するプラスミドは、ハ
ンタータンパク質及びｃｃｄ系のタンパク質である拮抗
作用物質（Ogura 及びHiraga, 1983, Proc. Natl. Aca
d. USA 80: 4784-4788; Miki et al., 1984, J. Mol. B
iol. 174: 605-625) 、及びｈｏｋ／ｓｏｋ系において
アンチセンスＲＮＡ（Gerdes et al., 1990, Mol. Micr
obiol. 4: 1807-1818)を産生する。プラスミドが失われ
た場合、遮断薬（ブロック剤）は、より安定したハンタ
ー決定因子よりも急速に消滅し、細胞の死滅を誘発する
ハンター活性の発現を可能にする。
【０１２５】ｓｐｂＢとハンターメカニズムの間の類似
性は、プラスミドを含まない胞子の高い産生頻度を導く
条件下（B. subtilis での胞子形成）で得られた結果に
より強化される。生育可能な胞子の産生は、細胞がｓｐ
ｂＢ+ プラスミドを収容している場合、著しく減少す
る。ＳｐｂＢタンパク質がハンタータイプの効果を有す
るならば、このことが予想される。しかしながら、Ｓｐ
ｂＢとハンタータンパク質ＣｃｄＢ及びＨｏｋとの間に
はいかなる相同性も見られず、ＳｐｂＢの生理学的機能
をさらに特徴づけする必要がある。
性は、プラスミドを含まない胞子の高い産生頻度を導く
条件下（B. subtilis での胞子形成）で得られた結果に
より強化される。生育可能な胞子の産生は、細胞がｓｐ
ｂＢ+ プラスミドを収容している場合、著しく減少す
る。ＳｐｂＢタンパク質がハンタータイプの効果を有す
るならば、このことが予想される。しかしながら、Ｓｐ
ｂＢとハンタータンパク質ＣｃｄＢ及びＨｏｋとの間に
はいかなる相同性も見られず、ＳｐｂＢの生理学的機能
をさらに特徴づけする必要がある。
【０１２６】実験的作業様式菌株と増殖条件 クローニング及び配列決定の実験のためには、E. coli
Ｋ−１２のＴＧｌ株〔△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｓｕｐ
Ｅ ｔｈｉ ｈｄｓＤ５（Ｆ′ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡ+
ｐｒｏＢ+ ｌａｃＩq ｌａｃＺ△Ｍ１５）〕を利用し
た。B. subtilis の１６８株（ｔｒｐＣ２）（Anagnost
opoulos 及びSpizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 741-
746 ）及びB. thuringiensisのkurstakiＨＤ１ ｃｒｙ
- Ｂ株を、複製及び安定性の試験のために利用した。E.
coli、B. subtilis 及びB. thuringiensisを、それぞ
れCohen et al. (1972, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 6
9: 2110-2114)、 Anagnostopoulos及び Spizizen (196
1, J. Bacteriol. 81: 741-746) 及びLereclus et al.
(1989a, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218 ）により
記載されたとおりに形質転換させた。
Ｋ−１２のＴＧｌ株〔△（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｓｕｐ
Ｅ ｔｈｉ ｈｄｓＤ５（Ｆ′ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡ+
ｐｒｏＢ+ ｌａｃＩq ｌａｃＺ△Ｍ１５）〕を利用し
た。B. subtilis の１６８株（ｔｒｐＣ２）（Anagnost
opoulos 及びSpizizen, 1961, J. Bacteriol. 81: 741-
746 ）及びB. thuringiensisのkurstakiＨＤ１ ｃｒｙ
- Ｂ株を、複製及び安定性の試験のために利用した。E.
coli、B. subtilis 及びB. thuringiensisを、それぞ
れCohen et al. (1972, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 6
9: 2110-2114)、 Anagnostopoulos及び Spizizen (196
1, J. Bacteriol. 81: 741-746) 及びLereclus et al.
(1989a, FEMS Microbiol. Lett. 60: 211-218 ）により
記載されたとおりに形質転換させた。
【０１２７】E. coli の培養、及びB. subtilis 及びB.
thuringiensisでの予備的な安定性試験のためには、Lu
ria のブイヨン（ＬＢ）を利用した。栄養増殖中のプラ
スミドの安定性は、２つの桿菌について脳−心臓輸液
（ＢＨＩ，Difco)において決定し、胞子形成中の安定性
試験は、B. thuringiensisについてはＨＣＴ培地（Leca
det et al., 1980, J. Gen. Microbiol. 121: 203-212)
で、又B. subtilis についてはＳＰ培地で行なった。Ｓ
Ｐ培地は、１リットルあたり８ｇの栄養ブイヨン（Difc
o)、ＭｇＳＯ4 １mM、ＫＣｌ１３mM及びＭｎＣｌ2 １０
μMを含み、殺菌後、ＦｅＳＯ4 １μM、ＣａＣｌ2 １m
M及び１ｇのグルコースを補完した。
thuringiensisでの予備的な安定性試験のためには、Lu
ria のブイヨン（ＬＢ）を利用した。栄養増殖中のプラ
スミドの安定性は、２つの桿菌について脳−心臓輸液
（ＢＨＩ，Difco)において決定し、胞子形成中の安定性
試験は、B. thuringiensisについてはＨＣＴ培地（Leca
det et al., 1980, J. Gen. Microbiol. 121: 203-212)
で、又B. subtilis についてはＳＰ培地で行なった。Ｓ
Ｐ培地は、１リットルあたり８ｇの栄養ブイヨン（Difc
o)、ＭｇＳＯ4 １mM、ＫＣｌ１３mM及びＭｎＣｌ2 １０
μMを含み、殺菌後、ＦｅＳＯ4 １μM、ＣａＣｌ2 １m
M及び１ｇのグルコースを補完した。
【０１２８】細菌選択のための抗生物質濃度は、以下の
とおりであった：アンピシリン、１００μg／ml；エリ
スロマイシン、桿菌では２５μg／ml、E. coli では１
２５μg／ml、及びテトラサイクリン、１０μg／ml。
とおりであった：アンピシリン、１００μg／ml；エリ
スロマイシン、桿菌では２５μg／ml、E. coli では１
２５μg／ml、及びテトラサイクリン、１０μg／ml。
【０１２９】プラスミド ｐＨＴ１０３０の２．９kbのＢａｌＩ制限フラグメント
がＳｍａＩ部位のレベルに挿入されたプラスミドｐＵＣ
１８及びプラスミドｐＨＴ１０３１（Lerecluset al.,
1988, FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422）を、本研
究で利用するｐＨＴ１０３０のさまざまな欠失誘導体を
構築するためのＤＮＡ供給源として利用した。これらの
プラスミドについては、図２及び図７に示されている。
二機能ベクターｐＨＶ３３は、ｐＢＲ３２２及びｐＣｌ
９４で構成されている（Primrose及び Ehrlich, 1981,
Plasmid 6: 193-201）。ｐＢＣ１６△１は、B.cereus
のプラスミドｐＢＣ１６から誘導される（Bernhard et
al., 1978, J.Bacteriol. 133: 897-903)。
がＳｍａＩ部位のレベルに挿入されたプラスミドｐＵＣ
１８及びプラスミドｐＨＴ１０３１（Lerecluset al.,
1988, FEMS Microbiol. Lett. 49: 417-422）を、本研
究で利用するｐＨＴ１０３０のさまざまな欠失誘導体を
構築するためのＤＮＡ供給源として利用した。これらの
プラスミドについては、図２及び図７に示されている。
二機能ベクターｐＨＶ３３は、ｐＢＲ３２２及びｐＣｌ
９４で構成されている（Primrose及び Ehrlich, 1981,
Plasmid 6: 193-201）。ｐＢＣ１６△１は、B.cereus
のプラスミドｐＢＣ１６から誘導される（Bernhard et
al., 1978, J.Bacteriol. 133: 897-903)。
【０１３０】安定性試験 ＬＢ培地での予備的安定性試験を、以前に記載されたと
おり（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett.
49: 417-422）に行なった。
おり（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett.
49: 417-422）に行なった。
【０１３１】栄養増殖中の分離安定性についてテストす
べきプラスミドを含む菌株を、選択的ＢＨＩ培地に接種
し、３０℃で一晩インキュベートした。次に、培養を抗
生物質無しのＢＨＩ培地で１０6 倍に希釈し、３７℃で
インキュベートした。１５〜２０世代毎に、新鮮な非選
択的ＢＨＩ培地で培養を希釈した（１０5 〜１０6
倍）。規則的間隔（約２０世代）で、培養試料を、適当
な希釈後、非選択的ゲロースボックス上に広げた。プラ
スミドを含む細菌の割合を決定するため、適切な抗生物
質を含むゲロースボックス上に、つまようじを用いて、
各試料の約１００コロニーのレプリカを作った（複製し
た）。不安定なｓｐｂＡ- プラスミド（ｐＨＴ３１１２
ａ及びｐＨＴ３１１３ａ）の分離安定性は、適切な希釈
の後、非選択的及び選択的ゲロース培地上に同時に、約
５世代の間隔で回収した培養の試料を広げることによっ
て見積りした。
べきプラスミドを含む菌株を、選択的ＢＨＩ培地に接種
し、３０℃で一晩インキュベートした。次に、培養を抗
生物質無しのＢＨＩ培地で１０6 倍に希釈し、３７℃で
インキュベートした。１５〜２０世代毎に、新鮮な非選
択的ＢＨＩ培地で培養を希釈した（１０5 〜１０6
倍）。規則的間隔（約２０世代）で、培養試料を、適当
な希釈後、非選択的ゲロースボックス上に広げた。プラ
スミドを含む細菌の割合を決定するため、適切な抗生物
質を含むゲロースボックス上に、つまようじを用いて、
各試料の約１００コロニーのレプリカを作った（複製し
た）。不安定なｓｐｂＡ- プラスミド（ｐＨＴ３１１２
ａ及びｐＨＴ３１１３ａ）の分離安定性は、適切な希釈
の後、非選択的及び選択的ゲロース培地上に同時に、約
５世代の間隔で回収した培養の試料を広げることによっ
て見積りした。
【０１３２】胞子形成段階中の安定性試験のためには、
一晩選択的ＢＨＩ培地にあった培養を、エリスロマイシ
ン（５μg／ml）を含む特異的胞子形成培地（ＳＰ又は
ＨＣＴ）で１０3 倍に希釈し、３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。次に、培養を新鮮な非選択的ＳＰ又は
ＨＣＴ培地で１０3 倍に希釈し（時間ゼロ）、適当な温
度でインキュベートした（B. thuringiensisについて３
０℃、B.subtilisについて３７℃）。約１５世代の後
（胞子形成のｔ0 の直前）、上述のとおりプラスミドを
含む細胞の分画を決定するため、試料を利用した。２４
時間又は３６時間後、大部分の胞子が遊離した時点で、
胞子形成しなかった細胞を殺すため、１０分間、培養試
料を８０℃に加熱した。プラスミドを含む胞子の割合
を、次に、上述のとおり決定した。
一晩選択的ＢＨＩ培地にあった培養を、エリスロマイシ
ン（５μg／ml）を含む特異的胞子形成培地（ＳＰ又は
ＨＣＴ）で１０3 倍に希釈し、３７℃で２〜３時間イン
キュベートした。次に、培養を新鮮な非選択的ＳＰ又は
ＨＣＴ培地で１０3 倍に希釈し（時間ゼロ）、適当な温
度でインキュベートした（B. thuringiensisについて３
０℃、B.subtilisについて３７℃）。約１５世代の後
（胞子形成のｔ0 の直前）、上述のとおりプラスミドを
含む細胞の分画を決定するため、試料を利用した。２４
時間又は３６時間後、大部分の胞子が遊離した時点で、
胞子形成しなかった細胞を殺すため、１０分間、培養試
料を８０℃に加熱した。プラスミドを含む胞子の割合
を、次に、上述のとおり決定した。
【０１３３】プラスミドコピー数の決定 臭化エチジウムで着色された電気泳動ゲルから得られた
写真ネガのデンシトメトリー（密度測定）により、プラ
スミドのコピー数を決定した。コピー数の決定のために
利用した方法及びパラメーターは、Projan et al. (198
3, Plasmid 9:182-190)によって記載されたとおりであ
った。コピー数の計算を行なうために利用したB.subtil
is及びB. thuringiensisの染色体サイズは、４．２×１
０3 kbであった。
写真ネガのデンシトメトリー（密度測定）により、プラ
スミドのコピー数を決定した。コピー数の決定のために
利用した方法及びパラメーターは、Projan et al. (198
3, Plasmid 9:182-190)によって記載されたとおりであ
った。コピー数の計算を行なうために利用したB.subtil
is及びB. thuringiensisの染色体サイズは、４．２×１
０3 kbであった。
【０１３４】一本鎖ＤＮＡの産生の分析 粗製プラスミド調製物をアガロースゲル上での電気泳動
に付し、以前にB. subtilis の細胞についてRiele et a
l.（1986a, EMBO J. 5: 631-637)により記載されたよう
に、変性して又は変性せずにニトロセルロースフィルタ
ー上に移した（BA85、 0.45μm, Schleicher & Schuel
l) 。32Ｐで標識したｐＵＣ１８を用いて、フィルター
をハイブリダイズした。
に付し、以前にB. subtilis の細胞についてRiele et a
l.（1986a, EMBO J. 5: 631-637)により記載されたよう
に、変性して又は変性せずにニトロセルロースフィルタ
ー上に移した（BA85、 0.45μm, Schleicher & Schuel
l) 。32Ｐで標識したｐＵＣ１８を用いて、フィルター
をハイブリダイズした。
【０１３５】ＤＮＡの操作及び配列決定 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ及びＤＮＡポリメラーゼ
Ｉのクレノウフラグメントは、New England Biolabs, I
nc. から得たものであった。（ＫｐｎＩ部位レベルで切
断するのに利用した）制限酵素Ａｓｐ７１８及び仔牛の
腸のアルカリホスファターゼは、Boehringer Manheimか
ら得たものであった。全ての酵素は、製造業者の推奨事
項に従って利用した。Gene Cleanキット（Ｂｉｏ１０
１）を利用して、アガロースゲルからＤＮＡ制限フラグ
メントを精製した。U.S. Biochemical Corp.から購入し
たSequenase 配列決定キット及びAmershamCorp.より供
給された〔α−35Ｓ〕−ｄＡＴＰ（１１０TBq ／mmole)
を利用して、鎖成長停止反応法によりヌクレオチド配列
決定を行なった（Sanger et al., 1977, Proc. Natl.Ac
ad. Sci. USA 74: 5463-5467) 。製造業者により示され
ているように（International Biotechnologies In
c.）、サイクロン(Cyclone) 系を用いてDale et al. の
技術（1985, Plasmid 13: 31-40)に従って、オーバーラ
ップ欠失を得た。ここで記載するＤＮＡ配列は、ＥＭＢ
Ｌヌクレオチド配列データベースに、Ｘ５９２４５とい
う入力番号で現われる。インビトロ転写−翻訳試験を、
供給業者が示すとおりに、New England Nuclear のＤＮ
Ａ発現系でAmersham Corp.の〔35Ｓ〕−メチオニン（３
７TBq ／mmole)を用いて行なった。１２．５％（重量／
体積）のポリアクリルアミドゲルの中で、放射性標識さ
れたタンパク質を解像した。
Ｉのクレノウフラグメントは、New England Biolabs, I
nc. から得たものであった。（ＫｐｎＩ部位レベルで切
断するのに利用した）制限酵素Ａｓｐ７１８及び仔牛の
腸のアルカリホスファターゼは、Boehringer Manheimか
ら得たものであった。全ての酵素は、製造業者の推奨事
項に従って利用した。Gene Cleanキット（Ｂｉｏ１０
１）を利用して、アガロースゲルからＤＮＡ制限フラグ
メントを精製した。U.S. Biochemical Corp.から購入し
たSequenase 配列決定キット及びAmershamCorp.より供
給された〔α−35Ｓ〕−ｄＡＴＰ（１１０TBq ／mmole)
を利用して、鎖成長停止反応法によりヌクレオチド配列
決定を行なった（Sanger et al., 1977, Proc. Natl.Ac
ad. Sci. USA 74: 5463-5467) 。製造業者により示され
ているように（International Biotechnologies In
c.）、サイクロン(Cyclone) 系を用いてDale et al. の
技術（1985, Plasmid 13: 31-40)に従って、オーバーラ
ップ欠失を得た。ここで記載するＤＮＡ配列は、ＥＭＢ
Ｌヌクレオチド配列データベースに、Ｘ５９２４５とい
う入力番号で現われる。インビトロ転写−翻訳試験を、
供給業者が示すとおりに、New England Nuclear のＤＮ
Ａ発現系でAmersham Corp.の〔35Ｓ〕−メチオニン（３
７TBq ／mmole)を用いて行なった。１２．５％（重量／
体積）のポリアクリルアミドゲルの中で、放射性標識さ
れたタンパク質を解像した。
【０１３６】コンピューター解析 Data General MV8000 コンピューターでプログラムを利
用した。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、パスツール研
究所のプログラムを用いて解析した。
用した。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列を、パスツール研
究所のプログラムを用いて解析した。
【０１３７】
【表５】
【０１３８】（ａ）頻度は、図５Ａ及び５Ｂから決定さ
れている。一定の時点におけるＥｍS 細胞率を、対応す
る世代数で除した。結果は、示したプラスミドを用いて
得られたデータの平均に相当する。 （ｂ）頻度は、図６Ａ及び６Ｂから決定されている。プ
ラスミドの備わっていない胞子の生成頻度は、コロニー
ＥｍS を生み出した胞子に比例して見積られた。結果
は、示されたプラスミドを用いて得られたデータの平均
に相当する。 （ｃ）理論上の確率は、考慮対象となっている細胞区画
のサイズ及び細胞あたりのプラスミドのコピー数（２ｎ
＝２０）によって左右される。
れている。一定の時点におけるＥｍS 細胞率を、対応す
る世代数で除した。結果は、示したプラスミドを用いて
得られたデータの平均に相当する。 （ｂ）頻度は、図６Ａ及び６Ｂから決定されている。プ
ラスミドの備わっていない胞子の生成頻度は、コロニー
ＥｍS を生み出した胞子に比例して見積られた。結果
は、示されたプラスミドを用いて得られたデータの平均
に相当する。 （ｃ）理論上の確率は、考慮対象となっている細胞区画
のサイズ及び細胞あたりのプラスミドのコピー数（２ｎ
＝２０）によって左右される。
【０１３９】
【表６】
【０１４０】（ａ）生育可能な胞子の数は、８０℃で１
０分間のインキュベーションの後、非選択的寒天ボック
ス上に胞子形成させた培養の希釈物を広げることによっ
て見積った。胞子形成させた培養は、選択的ＳＰ培地で
得られた。 （ｂ）Ｅｍr 胞子の百分率は、エリスロマイシンを含む
寒天ボックス上への約１００のコロニーの２次培養によ
り見積った。
０分間のインキュベーションの後、非選択的寒天ボック
ス上に胞子形成させた培養の希釈物を広げることによっ
て見積った。胞子形成させた培養は、選択的ＳＰ培地で
得られた。 （ｂ）Ｅｍr 胞子の百分率は、エリスロマイシンを含む
寒天ボックス上への約１００のコロニーの２次培養によ
り見積った。
【０１４１】例２： シャトルベクターの構築実験部分と論述 Ａ）異なるコピー数を有するシャトルベクター １）ｐＨＴ１０３５のＨｉｎｄIII部位の削除ｐＨＴ１
０３５は、B. thuringiensisのプラスミドｐＨＴ１０３
０の複製領域（２．９kbのＢａｌＩのＤＮＡフラグメン
ト）、ｐＪＨ１０１のｃａｔ遺伝子を有するＨｉｎｄII
I−ＢａｌＩのＤＮＡフラグメント（Ferrari et al., 1
983, J. Bacteriol. 154: 1513-1515）及びｐＢＲ３２
２の複製起点を有する６．３kbのプラスミドである（図
９）（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett.
49: 417-422) 。ｐＨＴ１０３５の独自の（ユニーク
な）ＨｉｎｄIII部位は、シャトルベクターの構築に利
用するｐＵＣ１９（Yanisch-Perron et al., 1985,Gene
33: 103-119)の制限部位とのあらゆる重複を避けるた
め、除去した（図９）。ＨｉｎｄIII部位レベルでの変
更は、ｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIがB. subtilis の
１６８株（Anagnostopoulos 及び Spizizen, 1961, J.
Bacteriol. 81:741-746) をＣｍR(１０μg／ml）に形質
転換でき、選択的圧力無しに安定した形で維持されたこ
とから、プラスミドの複製及び安定性機能を妨げない
（９０％の細胞が、非選択的ＬＢ培地での約２５世代
後、プラスミドを含んでいた）。
０３５は、B. thuringiensisのプラスミドｐＨＴ１０３
０の複製領域（２．９kbのＢａｌＩのＤＮＡフラグメン
ト）、ｐＪＨ１０１のｃａｔ遺伝子を有するＨｉｎｄII
I−ＢａｌＩのＤＮＡフラグメント（Ferrari et al., 1
983, J. Bacteriol. 154: 1513-1515）及びｐＢＲ３２
２の複製起点を有する６．３kbのプラスミドである（図
９）（Lereclus et al., 1988, FEMS Microbiol. Lett.
49: 417-422) 。ｐＨＴ１０３５の独自の（ユニーク
な）ＨｉｎｄIII部位は、シャトルベクターの構築に利
用するｐＵＣ１９（Yanisch-Perron et al., 1985,Gene
33: 103-119)の制限部位とのあらゆる重複を避けるた
め、除去した（図９）。ＨｉｎｄIII部位レベルでの変
更は、ｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIがB. subtilis の
１６８株（Anagnostopoulos 及び Spizizen, 1961, J.
Bacteriol. 81:741-746) をＣｍR(１０μg／ml）に形質
転換でき、選択的圧力無しに安定した形で維持されたこ
とから、プラスミドの複製及び安定性機能を妨げない
（９０％の細胞が、非選択的ＬＢ培地での約２５世代
後、プラスミドを含んでいた）。
【０１４２】２）ｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIの高コ
ピー数の誘導体の選択 プラスミドｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIのＤＮＡをヒ
ドロキシルアミンで処理し（図９）、次にB. subtilis
を形質転換できるプラスミドのＤＮＡ分子（多量体形
態）を回収するべくE. coli 細胞を形質転換するために
利用した。次に、増大したコピー数をもつプラスミド
を、低コピー数のプラスミドｐＨＴ１０３５△Ｈｉｎｄ
III（相当染色体あたり４±１コピー）を収容する細胞
の増殖を妨げるＣｍ濃度（２５μg／ml）を含む含ゲロ
ースＬＢ培地上に、形質転換されたB.subtilis の細胞
を広げることによって選択した。
ピー数の誘導体の選択 プラスミドｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIIIのＤＮＡをヒ
ドロキシルアミンで処理し（図９）、次にB. subtilis
を形質転換できるプラスミドのＤＮＡ分子（多量体形
態）を回収するべくE. coli 細胞を形質転換するために
利用した。次に、増大したコピー数をもつプラスミド
を、低コピー数のプラスミドｐＨＴ１０３５△Ｈｉｎｄ
III（相当染色体あたり４±１コピー）を収容する細胞
の増殖を妨げるＣｍ濃度（２５μg／ml）を含む含ゲロ
ースＬＢ培地上に、形質転換されたB.subtilis の細胞
を広げることによって選択した。
【０１４３】増大したコピー数を有する２つのプラスミ
ドを、研究の続行のために選択した（図９）。そのコピ
ー数は、Projan et al. (1983,蛍光密度測定によるプラ
スミドコピー数の決定，Plasmid 9: 182-190) によって
記載されたパラメーターを利用して、アガロースゲル上
での電気泳動写真ネガのデンシトメトリー分析により決
定した。プラスミドは、ｐＨＴ１０３５−１５△Ｈｉｎ
ｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△ＨｉｎｄIIIと呼称さ
れ、それぞれ相当染色体あたり１５±５及び７０±２０
のコピーを有する。非選択的ＬＢ培地で約２５世代後、
１００％の細胞がプラスミドを含んでいたことから、こ
れらは分離の観点からみて安定している。
ドを、研究の続行のために選択した（図９）。そのコピ
ー数は、Projan et al. (1983,蛍光密度測定によるプラ
スミドコピー数の決定，Plasmid 9: 182-190) によって
記載されたパラメーターを利用して、アガロースゲル上
での電気泳動写真ネガのデンシトメトリー分析により決
定した。プラスミドは、ｐＨＴ１０３５−１５△Ｈｉｎ
ｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△ＨｉｎｄIIIと呼称さ
れ、それぞれ相当染色体あたり１５±５及び７０±２０
のコピーを有する。非選択的ＬＢ培地で約２５世代後、
１００％の細胞がプラスミドを含んでいたことから、こ
れらは分離の観点からみて安定している。
【０１４４】３）シャトルベクターの構築 ｐＨＴ１０３０の複製及び安定性領域が、ｐＨＴ１０３
５により担持されている２．７kbのＨｐａＩ−ＢａｌＩ
のＤＮＡフラグメント内に完全に包含されていることを
示した（図９）。従って、このＤＮＡフラグメントを、
プラスミドｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIII、ｐＨＴ１０
３５−１５△ＨｉｎｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△
ＨｉｎｄIIIの各々から単離し、それぞれプラスミドｐ
ＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０を構築する
ために別々に利用した（図１０）。
５により担持されている２．７kbのＨｐａＩ−ＢａｌＩ
のＤＮＡフラグメント内に完全に包含されていることを
示した（図９）。従って、このＤＮＡフラグメントを、
プラスミドｐＨＴ１０３５△ＨｉｎｄIII、ｐＨＴ１０
３５−１５△ＨｉｎｄIII及びｐＨＴ１０３５−７０△
ＨｉｎｄIIIの各々から単離し、それぞれプラスミドｐ
ＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０を構築する
ために別々に利用した（図１０）。
【０１４５】これらのプラスミドは、ポリリンカーのク
ローニング部位もｂｌａ遺伝子も中断しないＳｓｐＩ部
位レベルにフラグメントが挿入されていることから、E.
coli におけるクローニング実験のためにｐＵＣ１９と
同じ要領で利用可能である。ｐＵＣ１９のポリリンカー
のいかなる部位も重複していない。
ローニング部位もｂｌａ遺伝子も中断しないＳｓｐＩ部
位レベルにフラグメントが挿入されていることから、E.
coli におけるクローニング実験のためにｐＵＣ１９と
同じ要領で利用可能である。ｐＵＣ１９のポリリンカー
のいかなる部位も重複していない。
【０１４６】これらのシャトルベクターを、（Lereclus
et al., 1989a) により記載されているように、電気穿
孔法の作業様式によりB. thuringiensisのkurstaki Ｈ
Ｄ１Ｃｒｙ- Ｂ株を形質転換するために利用した。Ｅｒ
（２５μg／ml）を含むゲロースボックス上で、組換え
型クローンを選択した。これらのクローンから抽出した
全ＤＮＡ調製物のデンシトメトリー分析によると、３つ
のシャトルベクターが、B. subtilis の対応する親プラ
スミドのものと類似したコピー数を、B. thuringiensis
内で有していることがわかった（図１０）。
et al., 1989a) により記載されているように、電気穿
孔法の作業様式によりB. thuringiensisのkurstaki Ｈ
Ｄ１Ｃｒｙ- Ｂ株を形質転換するために利用した。Ｅｒ
（２５μg／ml）を含むゲロースボックス上で、組換え
型クローンを選択した。これらのクローンから抽出した
全ＤＮＡ調製物のデンシトメトリー分析によると、３つ
のシャトルベクターが、B. subtilis の対応する親プラ
スミドのものと類似したコピー数を、B. thuringiensis
内で有していることがわかった（図１０）。
【０１４７】Ｂ）δ−エンドトキシンの産生とプラスミ
ドコピー数の関係 ベクターｐＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０
の各々のＨｉｎｄIII部位レベルに、甲虫目に特異的な
B. thuringiensisのＬＭ７９株から単離されたｃｒｙII
IＡ遺伝子を有する３kbのＨｉｎｄIII制限フラグメント
をサブクローニングした。同じ向きでｃｒｙIIIＡ遺伝
子を有する、結果として得られた３つのプラスミド（ｐ
ＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡ、ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIＡ
及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙIIIＡ）を、電気穿孔法によ
りB.thuringiensis のkurstakiＨＤＩ Ｃｒｙ- Ｂ株に
導入した。
ドコピー数の関係 ベクターｐＨＴ３０４、ｐＨＴ３１５及びｐＨＴ３７０
の各々のＨｉｎｄIII部位レベルに、甲虫目に特異的な
B. thuringiensisのＬＭ７９株から単離されたｃｒｙII
IＡ遺伝子を有する３kbのＨｉｎｄIII制限フラグメント
をサブクローニングした。同じ向きでｃｒｙIIIＡ遺伝
子を有する、結果として得られた３つのプラスミド（ｐ
ＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡ、ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIＡ
及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙIIIＡ）を、電気穿孔法によ
りB.thuringiensis のkurstakiＨＤＩ Ｃｒｙ- Ｂ株に
導入した。
【０１４８】１mlあたり２５μgのＥｒの存在下又は不
在下で、ＨＣＴ培地（Lecadet et al., 1980, Ber. J.
Gen. Microbiol. 121: 203-212）で、３０℃で２日間、
組換え型クローンを成長させた。培養から収穫した胞子
−結晶調製物を、位相差顕微鏡とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法）により検査した（図１１）。ｐＨＴ３０４Ωｃｒ
ｙIIIＡを収容するkurstaki組換え体ＨＤ１ΩＣｒｙ-
Ｂが、検出可能なパラ（擬似）胞子封入体を産生しなか
ったのに対して、ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIＡ又はｐＨ
Ｔ３７０ΩｃｒｙIIIＡのいずれかを収容する細胞は、
甲虫目の幼虫に対して活性な菌株の特徴である平坦な平
行四辺形結晶を産生した（Herrnstadt et al., 1986, B
io/Technology 4: 305-308）。これらの結晶の主要構成
成分は、約７３kDa と６７kDa の２つのポリペプチドで
あった（図１１）。このことは、B. thuringiensisのte
nebrionis 株のｃｒｙIIIＡ遺伝子が７３kDa 及び６５k
Da のペプチドを産生することを示した以前の結果（Sek
ar et al., 1987）と一致している。６５kDa の成分
は、７３kDa のペプチドのタンパク質分解的切断の結果
としてもたらされうる。ｐＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡを
収容する細菌から回収した胞子−結晶調製物中に、これ
らのポリペプチドが少量発見された（図１１、レーン
２）。この結果は、δ−エンドトキシンの産生レベル
が、少なくともここで記載されている実験条件下では、
ｃｒｙ遺伝子のコピー数の増大によって改善されうると
いうことを示している。しかしながら、ｐＨＴ３１５Ω
ｃｒｙIIIＡを収容する細胞及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙI
IIＡを収容する細胞により産生されるδ−エンドトキシ
ンの量の間に有意な差は見られず、このことは、染色体
１つあたりのプラスミドコピーが１５を超えると、ｃｒ
ｙ遺伝子のコピー数以外の要因が結晶のタンパク質の合
成を制限するということを表わしている。
在下で、ＨＣＴ培地（Lecadet et al., 1980, Ber. J.
Gen. Microbiol. 121: 203-212）で、３０℃で２日間、
組換え型クローンを成長させた。培養から収穫した胞子
−結晶調製物を、位相差顕微鏡とＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド
デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法）により検査した（図１１）。ｐＨＴ３０４Ωｃｒ
ｙIIIＡを収容するkurstaki組換え体ＨＤ１ΩＣｒｙ-
Ｂが、検出可能なパラ（擬似）胞子封入体を産生しなか
ったのに対して、ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIＡ又はｐＨ
Ｔ３７０ΩｃｒｙIIIＡのいずれかを収容する細胞は、
甲虫目の幼虫に対して活性な菌株の特徴である平坦な平
行四辺形結晶を産生した（Herrnstadt et al., 1986, B
io/Technology 4: 305-308）。これらの結晶の主要構成
成分は、約７３kDa と６７kDa の２つのポリペプチドで
あった（図１１）。このことは、B. thuringiensisのte
nebrionis 株のｃｒｙIIIＡ遺伝子が７３kDa 及び６５k
Da のペプチドを産生することを示した以前の結果（Sek
ar et al., 1987）と一致している。６５kDa の成分
は、７３kDa のペプチドのタンパク質分解的切断の結果
としてもたらされうる。ｐＨＴ３０４ΩｃｒｙIIIＡを
収容する細菌から回収した胞子−結晶調製物中に、これ
らのポリペプチドが少量発見された（図１１、レーン
２）。この結果は、δ−エンドトキシンの産生レベル
が、少なくともここで記載されている実験条件下では、
ｃｒｙ遺伝子のコピー数の増大によって改善されうると
いうことを示している。しかしながら、ｐＨＴ３１５Ω
ｃｒｙIIIＡを収容する細胞及びｐＨＴ３７０ΩｃｒｙI
IIＡを収容する細胞により産生されるδ−エンドトキシ
ンの量の間に有意な差は見られず、このことは、染色体
１つあたりのプラスミドコピーが１５を超えると、ｃｒ
ｙ遺伝子のコピー数以外の要因が結晶のタンパク質の合
成を制限するということを表わしている。
【０１４９】組換え型菌株におけるδ−エンドトキシン
の産生が、Ｅｒの存在又は不在によって影響されず、プ
ラスミドが宿主細胞内で安定した形で維持されているこ
とを示唆しているということがわかる。実際、抗生物質
を含まないＨＣＴ培地での胞子形成を後に伴う約１５世
代の増殖の後、全ての胞子（１００％）はプラスミドを
含んでいた。
の産生が、Ｅｒの存在又は不在によって影響されず、プ
ラスミドが宿主細胞内で安定した形で維持されているこ
とを示唆しているということがわかる。実際、抗生物質
を含まないＨＣＴ培地での胞子形成を後に伴う約１５世
代の増殖の後、全ての胞子（１００％）はプラスミドを
含んでいた。
【０１５０】例３： δ−エンドトキシンの複数（２つ）の遺伝子を有するプ
ラスミドの構築 上述のプラスミドｐＨＴ３１５ΩＣＲＹIIIＡを酵素Ｓ
ｍａＩにより消化し、次にアルカリホスファターゼで処
理する。次に、線形化されたプラスミドを、アガロース
ゲルから精製する。プラスミドｐＨＴ４０８（Lereclus
et al., 1989, FEMS 60: 211-218)を、酵素ＨｐａＩ及
びＳｍａＩにより消化する。ｃｒｙＩＡ（ａ）遺伝子を
有する５kbのＨｐａＩ−ＳｍａＩ制限フラグメントをア
ガロースゲルから精製し、ＤＮＡリガーゼの存在下で、
酵素ＳｍａＩによって線形化したプラスミドｐＨＴ３１
５ΩＣＲＹIIIＡと連結する。連結混合物をE. coli の
形質転換のために利用する。アンピシリン（１００％Ｇ
／ＭＬ）を含むＬＢ培地上で生育したコロニーをニトロ
セルロースフィルター上に複製（レプリカ）し、次に、
ｃｒｙＩａ（ａ）遺伝子の内部領域から成る放射性プロ
ーブ（α32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したもの）を用いてハイ
ブリダイズする。ＳｍａＩ部位に挿入されたｃｒｙＩＡ
（ａ）遺伝子を担持するプラスミドｐＨＴ３１５Ωｃｒ
ｙIIIＡによって形質転換されたクローンのみが、プロ
ーブとハイブリダイズする。これらのクローンのうちの
１つのプラスミドＤＮＡを抽出し、２つの遺伝子ｃｒｙ
IIIＡとｃｒｙＩＡ（ａ）の存在確認を目的として、プ
ラスミドの制限地図を決定する。
ラスミドの構築 上述のプラスミドｐＨＴ３１５ΩＣＲＹIIIＡを酵素Ｓ
ｍａＩにより消化し、次にアルカリホスファターゼで処
理する。次に、線形化されたプラスミドを、アガロース
ゲルから精製する。プラスミドｐＨＴ４０８（Lereclus
et al., 1989, FEMS 60: 211-218)を、酵素ＨｐａＩ及
びＳｍａＩにより消化する。ｃｒｙＩＡ（ａ）遺伝子を
有する５kbのＨｐａＩ−ＳｍａＩ制限フラグメントをア
ガロースゲルから精製し、ＤＮＡリガーゼの存在下で、
酵素ＳｍａＩによって線形化したプラスミドｐＨＴ３１
５ΩＣＲＹIIIＡと連結する。連結混合物をE. coli の
形質転換のために利用する。アンピシリン（１００％Ｇ
／ＭＬ）を含むＬＢ培地上で生育したコロニーをニトロ
セルロースフィルター上に複製（レプリカ）し、次に、
ｃｒｙＩａ（ａ）遺伝子の内部領域から成る放射性プロ
ーブ（α32Ｐ−ｄＣＴＰで標識したもの）を用いてハイ
ブリダイズする。ＳｍａＩ部位に挿入されたｃｒｙＩＡ
（ａ）遺伝子を担持するプラスミドｐＨＴ３１５Ωｃｒ
ｙIIIＡによって形質転換されたクローンのみが、プロ
ーブとハイブリダイズする。これらのクローンのうちの
１つのプラスミドＤＮＡを抽出し、２つの遺伝子ｃｒｙ
IIIＡとｃｒｙＩＡ（ａ）の存在確認を目的として、プ
ラスミドの制限地図を決定する。
【０１５１】結果として得られたプラスミド、すなわち
ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIΩｃｒｙＩＡ（ａ）は、δ−
エンドトキシンのもう１つの遺伝子を担持し、かつＳａ
ｌＩによって切断された部位との付着末端をもつ第３の
ＤＮＡフラグメントをクローニングするために利用され
うる、独特の（ユニークな）ＳａｌＩ制限部位を有して
いる。
ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIΩｃｒｙＩＡ（ａ）は、δ−
エンドトキシンのもう１つの遺伝子を担持し、かつＳａ
ｌＩによって切断された部位との付着末端をもつ第３の
ＤＮＡフラグメントをクローニングするために利用され
うる、独特の（ユニークな）ＳａｌＩ制限部位を有して
いる。
【０１５２】グラム陽性菌にエリスロマイシン耐性を付
与する遺伝子を担持する、このようなキメラプラスミド
ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIΩｃｒｙＩＡ（ａ）又はｐＨ
Ｔ３１５ΩｃｒｙIIIＡΩｃｒｙＩＡ５（ａ）Ωｃｒｙ
Ｘは、B. thuringiensisを形質転換し、かくして多数の
殺虫活性を発現できる組換え型菌株を構築するために利
用できる。
与する遺伝子を担持する、このようなキメラプラスミド
ｐＨＴ３１５ΩｃｒｙIIIΩｃｒｙＩＡ（ａ）又はｐＨ
Ｔ３１５ΩｃｒｙIIIＡΩｃｒｙＩＡ５（ａ）Ωｃｒｙ
Ｘは、B. thuringiensisを形質転換し、かくして多数の
殺虫活性を発現できる組換え型菌株を構築するために利
用できる。
【０１５３】配列表フリーテキスト ＯＲＦ１は、１３４アミノ酸をコードし、２１９３位か
ら開始し、１７８９位で終結する。
ら開始し、１７８９位で終結する。
【０１５４】
【図１Ａ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｂ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｃ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｄ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｅ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｆ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図１Ｇ】ｐＨＴ１０３０のＢａｌＩ制限フラグメント
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
のヌクレオチド配列、及びｏｒｆ１及びｏｒｆ２から推
定されるアミノ酸配列を表わす。
【図２】ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の構築、及び桿菌
におけるその複製及び安定性の分析を表わす。
におけるその複製及び安定性の分析を表わす。
【図３】ｐＨＴ１０３０の欠失誘導体を含む細胞におけ
る一本鎖ＤＮＡ産生の分析を表わす。
る一本鎖ＤＮＡ産生の分析を表わす。
【図４】E. coli のインビトロ転写−翻訳系におけるｓ
ｐｂＢ遺伝子の発現を表わす。
ｐｂＢ遺伝子の発現を表わす。
【図５】栄養増殖中のｐＨＴ１０３０の欠失誘導体の分
離安定性を表わす。
離安定性を表わす。
【図６】胞子形成中のｐＨＴ１０３０の欠失誘導体分離
安定性を表わす。
安定性を表わす。
【図７】ｓｐｂＢ遺伝子座の領域を担持するｐＢＣ１６
の変異体の構築を表わす。
の変異体の構築を表わす。
【図８】ｓｐｂＢ領域を有する変異体ｐＢＣ１６の安定
性を表わす。
性を表わす。
【図９】ｐＨＴ１０３５のＨｉｎｄIII部位の削除及び
コピー数の多い変異体の選択を表わす。
コピー数の多い変異体の選択を表わす。
【図１０】シャトルベクターｐＨＴ３０４、ｐＨＴ３１
５及びｐＨＴ３７０の構築を表わす。
５及びｐＨＴ３７０の構築を表わす。
【図１１】ｃｒｙIIIＡ遺伝子を発現するB. thuringien
sisの形質転換体のタンパク質分析を表わす。
sisの形質転換体のタンパク質分析を表わす。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:11） Ｃ１２Ｒ 1:11） (Ｃ１２Ｎ 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ルルクリュス，ディディエール フランス国、75015 パリ、リュー・セサ ール・フランク 12 Ｆターム(参考） 4B024 AA07 BA38 CA03 DA07 EA04 FA15 GA14 4B065 AA15X AA17X AA19X AA20X AA20Y AB01 AC14 BA03 CA48 4H011 AC01 BA01 BB21 BC18 DA15 DC05
Claims (35)
- 【請求項１】 図２に示される精製されたＤＮＡ断片で
あって、（５）ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片、（６）Ｂａｌ
Ｉ−ＳｐｅＩ断片、及び（７）ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片
からなる群より選択される、精製されたＤＮＡ断片。 - 【請求項２】 ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片である、請求項
１記載の精製されたＤＮＡ断片。 - 【請求項３】 ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片である、請求項
１記載の精製されたＤＮＡ断片。 - 【請求項４】 ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片である、請求項
１記載の精製されたＤＮＡ断片。 - 【請求項５】 （Ａ）図２に示されるＤＮＡ断片であっ
て、（５）ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片、（６）ＢａｌＩ−
ＳｐｅＩ断片、及び（７）ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片から
なる群より選択されるＤＮＡ断片、及び（Ｂ）タンパク
質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む組換え
ベクターであって、該組換えベクターが、（Ａ）のＤＮ
Ａ断片以外の図２に示されるＢａｌＩ−ＢａｌＩ断片の
断片を含まない、組換えベクター。 - 【請求項６】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片であ
る、請求項５記載のベクター。 - 【請求項７】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片であ
る、請求項５記載のベクター。 - 【請求項８】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片であ
る、請求項５記載のベクター。 - 【請求項９】 組換えベクターによって形質転換された
グラム陽性菌であって、該ベクターが、（Ａ）図２に示
されるＤＮＡ断片であって、（５）ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ
断片、（６）ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片、及び（７）Ｂａ
ｌＩ−ＳｓｐＩ断片からなる群より選択されるＤＮＡ断
片、及び（Ｂ）タンパク質をコードする少なくとも１つ
の核酸配列を含む組換えベクターであって、該組換えベ
クターが、（Ａ）のＤＮＡ断片以外の図２に示されるＢ
ａｌＩ−ＢａｌＩ断片の断片を含まないベクターであ
る、グラム陽性菌。 - 【請求項１０】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片で
ある、請求項９記載の形質転換された菌。 - 【請求項１１】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片で
ある、請求項９記載の形質転換された菌。 - 【請求項１２】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片で
ある、請求項９記載の形質転換された菌。 - 【請求項１３】 組換えベクターであって、（Ａ）図２
に示されるＤＮＡ断片であって、（５）ＢａｌＩ−Ｎｄ
ｅＩ断片、（６）ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片、及び（７）
ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片からなる群より選択されるＤＮ
Ａ断片、及び（Ｂ）タンパク質をコードする少なくとも
１つの核酸配列を含む、組換えベクターであり、該組換
えベクターが、（Ａ）のＤＮＡ断片以外の図２に示され
るＢａｌＩ−ＢａｌＩ断片の断片を含まないものであ
り、ここで、（Ａ）がグラム陽性菌における機能的なプ
ロモーターに、作動可能に連結されている、組換えベク
ター。 - 【請求項１４】 請求項１３記載のベクターによって形
質転換されたグラム陽性菌。 - 【請求項１５】 担体及び昆虫の幼虫に対して活性のグ
ラム陽性菌の有効量を含む殺虫剤であって、該グラム陽
性菌が、（Ａ）図２に示されるＤＮＡ断片であって、
（５）ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片、（６）ＢａｌＩ−Ｓｐ
ｅＩ断片、及び（７）ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片からなる
群より選択されるＤＮＡ断片、及び（Ｂ）昆虫の幼虫に
毒性であるBacillus thuringiensis のエンドトキシン
をコードするＤＮＡ配列を含む組換えベクターで形質転
換されており、該形質転換されたベクターが、（Ａ）の
ＤＮＡ断片以外の、図２に示されたＢａｌＩ−ＢａｌＩ
断片を含まないベクターである、殺虫剤。 - 【請求項１６】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＮｄｅＩ断片で
ある、請求項１５記載の殺虫剤。 - 【請求項１７】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｐｅＩ断片で
ある、請求項１５記載の殺虫剤。 - 【請求項１８】 （Ａ）が、ＢａｌＩ−ＳｓｐＩ断片で
ある、請求項１５記載の殺虫剤。 - 【請求項１９】 図１のヌクレオチド第１６９２位〜２
２５６位からなる単離されたＢｓｔＵＩ−ＢｓｔＵＩの
ＤＮＡ断片又はこの断片の突然変異体であって、該突然
変異体断片が； （ａ）突然変異していない断片と同じ長さを有し、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、突然変異していな
い断片の配列と相補的な配列とハイブリダイズし、そし
て（ｃ）グラム陽性菌において、それが挿入された組換
えベクター安定化する、突然変異体断片であるＤＮＡ断
片。 - 【請求項２０】 該突然変異体断片である、請求項１９
記載の単離されたＤＮＡ断片。 - 【請求項２１】 組換えベクターであって、（Ａ）図１
のヌクレオチド第１６９２位〜２２５６位からなるＢｓ
ｔＵＩ−ＢｓｔＵＩのＤＮＡ断片又はこの断片の突然変
異体であって、該突然変異体断片が；（ａ）突然変異し
ていない断片と同じ長さを有し、（ｂ）ストリンジェン
トな条件下で、突然変異していない断片の配列と相補的
な配列とハイブリダイズし、そして（ｃ）グラム陽性菌
において、それが挿入された組換えベクター安定化す
る、突然変異体断片であるＤＮＡ断片、及び（Ｂ）タン
パク質をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む組
換えベクターであって、該組換えベクターが、（Ａ）の
ＤＮＡ断片以外の図２に示されるＢａｌＩ−ＢａｌＩ断
片の断片を含まないベクター。 - 【請求項２２】 （Ａ）が、該突然変異体断片である、
請求項２１記載のベクター。 - 【請求項２３】 （Ｂ）が、昆虫の幼虫に毒性である、
Bacillus thuringiensisのδ−エンドトキシン、プロテ
アーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、タンパク質ホルモン、
又は細菌性、ウイルス性若しくは寄生虫由来の抗原をコ
ードする、請求項２１記載のベクター。 - 【請求項２４】 （Ｂ）が、ＣｒｙＩ、ＣｒｙII、Ｃｒ
ｙIII又はＣｒｙIVをコードする、請求項２１記載のベ
クター。 - 【請求項２５】 （Ａ）図１のヌクレオチド第１６９２
位〜２２５６位からなるＢｓｔＵＩ−ＢｓｔＵＩのＤＮ
Ａ断片又はこの断片の突然変異体であって、該突然変異
体断片が； （ａ）突然変異していない断片と同じ長さを有し、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、突然変異していな
い断片の配列と相補的な配列とハイブリダイズし、そし
て（ｃ）グラム陽性菌において、それが挿入された組換
えベクター安定化する、突然変異体断片であるＤＮＡ断
片、及び（Ｂ）タンパク質をコードする少なくとも１つ
の核酸配列を含む組換えベクターであって、該組換えベ
クターが、（Ａ）のＤＮＡ断片以外の図２に示されるＢ
ａｌＩ−ＢａｌＩ断片の断片を含まない組換えベクター
によって形質転換されたグラム陽性菌。 - 【請求項２６】 （Ａ）が、該突然変異体断片である、
請求項２５記載の形質転換された菌。 - 【請求項２７】 （Ｂ）が、昆虫の幼虫に毒性であるBa
cillus thuringiensisのδ−エンドトキシン、プロテア
ーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、タンパク質ホルモン、又
は細菌性、ウイルス性若しくは寄生虫由来の抗原をコー
ドする、請求項２５記載の形質転換された菌。 - 【請求項２８】 （Ｂ）が、ＣｒｙＩ、ＣｒｙII、Ｃｒ
ｙIII又はＣｒｙIVをコードする、請求項２５記載の形
質転換された菌。 - 【請求項２９】 Bacillusである、請求項２５記載の形
質転換された菌。 - 【請求項３０】 Bacillus thuringiensis、Bacillus s
ubtillus、Bacillussphaericus又はBacillus megarteri
umである、請求項２９記載の形質転換された菌。 - 【請求項３１】 担体及び昆虫の幼虫に対して活性のグ
ラム陽性菌の有効量を含む殺虫剤であって、該グラム陽
性菌が、（Ａ）図１のヌクレオチド第１６９２位〜２２
５６位からなるＢｓｔＵＩ−ＢｓｔＵＩのＤＮＡ断片又
はこの断片の突然変異体であって、該突然変異体断片
が； （ａ）突然変異していない断片と同じ長さを有し、
（ｂ）ストリンジェントな条件下で、突然変異していな
い断片の配列と相補的な配列とハイブリダイズし、そし
て（ｃ）グラム陽性菌において、それが挿入された組換
えベクター安定化する、突然変異体断片であるＤＮＡ断
片、及び（Ｂ）タンパク質をコードする少なくとも１つ
の核酸配列を含む組換えベクターであって、該組換えベ
クターが、（Ａ）のＤＮＡ断片以外の図２に示されるＢ
ａｌＩ−ＢａｌＩ断片の断片を含まないベクターによっ
て形質転換されたグラム陽性菌である、殺虫剤。 - 【請求項３２】 （Ａ）が、該突然変異体断片である、
請求項３１記載の殺虫剤。 - 【請求項３３】 （Ｂ）が、ＣｒｙＩ、ＣｒｙII、Ｃｒ
ｙIII又はＣｒｙIVをコードする、請求項３１記載の殺
虫剤。 - 【請求項３４】 該菌がBacillusである、請求項３１記
載の殺虫剤。 - 【請求項３５】 該菌がBacillus thuringiensis、Baci
llus subtillus、Bacillus sphaericus又はBacillus me
garteriumである、請求項３４記載の殺虫剤。
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