JPH02119780A - バチラス　スリンギエンシスの形質転換 - Google Patents

バチラス　スリンギエンシスの形質転換

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JPH02119780A JP1127721A JP12772189A JPH02119780A JP H02119780 A JPH02119780 A JP H02119780A JP 1127721 A JP1127721 A JP 1127721A JP 12772189 A JP12772189 A JP 12772189A JP H02119780 A JPH02119780 A JP H02119780A
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    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明ハ、バチラス　スリンギエンシス（１３ａｃｉｌ
ｌｕｓ　Ｌｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）および密接に関
連したバチラス　セレウス（Ｂ、　ｃｅｒｅｕｓ）の直
接的でぞして標的金定めた遺伝子操作を、前記バチラス
種に対する効率のよい形質転換法に基づいて、最初に可
能にする方法を記載する。
本発明はさらに、グラスミドおよび「シャトル」ベクタ
ーの構築、並びにそれらベクターで形質転換されたバチ
ラス　スリンギエンシスおよび／またはバチラス　セレ
ウス株に関する。
本発明は萱り、バチラス　スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス　セレウス内に遺伝子またはその他の有用
な１）ＮＡ配列全挿入］〜、そして所望する場合には発
現させる方法に関するが、しかしプロトキシン遺伝子全
挿入し、イーシて発現させる方法に特に関する。
本発明は１だ、バチラス　スリンギエンシスおよび／ま
たはバチラス　セレウス内での新規遺伝子ｌたはその他
の有用なＤＮＡ配列の直接クローニングそして所望する
場合には発現および同定の方法を包含１〜、その結果と
して直接バチラス　スリンギエンシスおよび／またはバ
チラス　セレウス内に遺伝子バンクを確立すること、そ
してそｆＬらをその中で発現させることが初めて可能で
ある。
〔従来の技術〕
バチラス　スリンギエンシスはダラム陽性、好気性、内
胞子形成性細菌の大きな群に属する。
非常に密接に関連したバチラスの種、バチラスセレウス
およびバチラス　アントラシス（Ｂ。
ａｎ　１ｒａｃ　ｉ　ｓ　）とは違い、これ１で知られ
ているバチラス　スリンギエンシス棟の大部分は、それ
らの胞子形成の間に、その結晶構造物のために般に結晶
体とも呼ばれるバラ胞子封入体を産生する。この結晶体
は殺虫有効性の結晶性プロトキシンタンパク質、いわゆ
るδ−エンドトキ／ン（δ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）から
なる。
こむらのタンパク質結晶はバチラス　スリンギエンシス
の昆虫に対する毒性に関与する。結晶体の口からの取込
みの後、該結晶体が標的昆虫のアルカリ性の腸液内に溶
け、そして該昆虫の消化管からのグロテアーゼの作用に
より引き起こされる制限タンパク質加水分解の結果とし
て実際の毒性成分がグロトキシンから遊離きれるｌで、
ｂ−エンドトキシンはその殺虫有効性を示さない。
樺々のバチラス　スリンギエンシス株のδエンドトキシ
ンは、ある種の標的昆虫、喘に種々の鱗翅目（ｂｅｐｉ
ｄｏｐｔｅｒａ）　、鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）
および双翅目（１）ｉｐＬｅｒａ）の幼虫に関する高い
特異性により、および有効性の七ｇらの高い程度により
区別される。バチラス　スリンギエンシスのδ−エンド
トキシンを１史用うることにおけるその他の利点は、標
的昆虫が成長中に結晶タンパク買に対する耐性を有する
という明らかな困難、および毒素が上記標的昆虫音線い
てヒト、その他のホ乳類、鳥類、魚類および昆虫類に無
害であるという事実にある。
バチラス　スリンギエンシスのプロトキシンの殺虫可能
性は極く早い時期に認められた。
１９２０年代の終り以来、バチラス　スリンギエンシス
製剤は、栽培植物の昆虫により引き起こされる撞々の病
気を防除するための生物殺虫剤として使用されてきた。
１）　ＧｏｌｄｂｅｒｇおよびＭａｒｇａｌｉＬ　（１
９７７）によるバチラススリンギエンシス　イスラエレ
ンシス１ｆｉ（Ｂ。
Ｌｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　１ｓｒａｅｌ
ｅｎｓｉｓ）および２）Ｋｒｉｅｇ等（１９８３）によ
るバチラス　スリンギエンシス　テネブリオニス変ｉ（
Ｂ。
Ｌｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　Ｌｅｎｅｂｒ
ｉｏｎｉｓ）の発見でもって、バチラス　スリンギエン
シスの使用範囲？蚊や甲虫の幼虫に１で広げることが可
能となった。
遺伝子操作の導入およびそれから生じる新しい可能性で
もって、バチラス　スリンギエンシス毒素の分野は新鮮
な刺激全党けた。
例を挙けると、外来宿主生物、例えは大腸菌におけるｂ
−エンドトキ／ン遺伝子のクローニングはすでに普通の
ことである。この結果として一方では、δ−エンドトキ
シン遺伝子の全体の連続したＤＮＡ配列が今では知られ
ている（例えば、３）　５ｃｈｎｅｐｆ　ｌ土Ｅ、およ
びＷｈｉ　Ｌｅｌｅｙ　１４．　Ｒ，。
１９８１　；　４）　Ｋ１１ｅｒ　Ａ、等、　　１９８
２；　”）Ｇｅｉｓｅｒ鼠等、　　１９８６　；　６）
Ｈａｉｄｅｒ　Ｍ、　Ｚ。等、＋９８７）。
バチラス　スリンギエンシス橿の多くは殺虫有効性のタ
ンパク質全コードする種々の遺伝子全含有する。これら
の遺伝子は胞子形成相の間にだけ発現されるが、これは
大多数の場合、大きな転移可能なグラスミド（３０−１
５０Ｍｄ）上に位置さｎ、そしてそれ故にバチラス　ス
リンギエンシスｉ　ｎ　１７４１およびバチラス　スリ
ンギエンシスとバチラス　セレウスとの間でもし−ｆ：
ｆＬらが両立するならば容易に交換キｔ″Ｌ得る（　７
）（Ｊｏｎｚａｌｅｚ　Ｊ、ｉＶ、等、１９８２）。
バチラス　スリンギエンシス　クルスタキ変（重（Ｈ，
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、ｋｕｒｓｔａｋ
ｉ　）のフロトキシン遺伝子は、関連する遺伝子の一群
に属し。
その遺伝子の多くはすでにクローン化され、そして配列
決定されている。この仕事は特に大腸菌クローニング糸
で行われてきた。
バチラス　スリンギエンシス遺伝子のクローニングはＣ
４で、いくつかの少数でそしてもっばら異種の宿主系に
実質的には限られており、その中で大Ｍ１菌系が最もよ
く研究をれ、そして理解さ扛ている。
しかしながら、その間に、その他の宿主系での７０トキ
シン選伝子の成功したクローニングおよび発現に関する
報告が刊行さ汎ており１例えばバチラス　サブチリス（
Ｂ、　５ｕＬ）ｔｉｌｉｓ）において（４）Ｋｌｉｅｒ
等、１９８２）、　シｘ−ドモナスフルオレセ：ｙ　ｙ
、　（Ｌ’ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｓ）において（”）Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ　Ｍ、Ｕ、　
４ｆ−、１９８６）、およびサツカロミセス　セレビシ
エｘ　（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓＣｅ　ｒ　ｅ　Ｖ
　Ｉ　Ｓ　ｌ　ａりにおいて（ＥＰ　　０２３８４４１
）である。
植物宿主細胞内でのδ−エンドトキシン遺伝子の挿入お
よび発現もｌた成功した（ＥＰ０２９２４３５）。
大腸菌でのクローニングにおいて、いくつがのフロトキ
シン遺伝子は、グラム陽性ブロモターに加えて犬腸醒様
プロモーター金もたまた一ｆ言有するという事実を大い
に利用する。これらのプロモーター様Ｄ」＼Ａ配列に、
これらが１−記調節配列（１１−認識できるならば、バ
チラス　スリンギエンシスのフロトキシン遺伝子が異種
宿主系内でも発現をれること？可能にする。
宿主細胞全壊してあけた後に、発現をｔｌ、たノロトキ
ンンタンパク質金次に公知の方法ケ用いて単離（〜、そ
して同定し７得る。
しかしながらそれ以来、大ｇＪ菌様プロモータが全ての
プロトキシン吠伝子に存在−Ｊ乙ものでない（９Ｌ１）
ｏ口ｏｖａｎ等、１９８８）、そして結果的に今１では
上記必賛粂件に適合する非常に特異的なフロトキシン遺
伝子だけが異種宿主系内で発現され、そして従って同定
され得るということがホさ′ｎだ。
〔発明が解決しようとする課題〕
天然宿主生物の外側での遺１八子のクローニングおよび
実際に生物殺虫剤としてのこｉＬら株の使用に従って多
くの欠点と関連し、そのうちのいくつ力）を列挙する： Ｘ１）天然発現配列からのバチラス　スリンギエンシス
のプロトキシン遺伝子の発現は、ある場合に限り可能で
ある。
ｂ）発現された外来タンパク質の分泌が一般には全くな
いが、ｌたけどくわすがである。
Ｃ）δ−エンドトギンンの正確な折りたたみが異種宿主
細胞の還元培地中では常に保証されているとは限らず、
そしてこのことが特異活性ｌたは毒素の宿主範囲に望ぽ
しくない変化を生じイ尋イ５゜ ｄ）発現が全てで起こるならば、天然発現配列の中のク
ローン化外来遺伝子の発現率は極めて低い。
６）　；１０）ＳｃｂｎｅｐｆおよびＷｈｉｆｅｌｙ（
１９ａ　１；１９８５）は、大腸菌内でクローン化され
たバチラス　スリンギエンシスの毒素が大腸菌の総細胞
タンパク質の０５％ないし１％のみを構成し、一方バチ
ラス　スリンギエンシス内の結晶タンパク質が胞子形成
培養体の乾燥重斂で６０％と４０％の間の量であると見
積もっている。発現率の間のこ扛らのかなりの相違は、
異種宿主系における胞子形成に特異的な調節信号の欠如
およびバチラス　スリンギエンシスプロモータの認識に
おける困難さおよび／′よｆｃは外来宿主による毒素分
子の翻訳後の改変の問題による可能性がある。
ｅ）発現のために一般に使用される宿主株の多くはバチ
ラス　スリンギエンシスおよびバチラス　セレウスのよ
うに毒物学的に無害ではない。
ｆ）　　バチ５ｒス　スリンキニンシスおよびバチラス
　セレウスは微生物の土壌７０−ラの天然主成分全形成
し、これは発現のために一般に使用される宿主株の多く
には当てに１らない。
発現のためのプロトキシン遺伝子の天然グラム陽性プロ
モーターの使用ｋ　０Ｊ’　Ｗヒにする同柚宿主系内に
バチラス　スリンギエンシス遺伝子を直接クローン化し
得るならば、上記問題点および困難全克服できる。
しかしながら今ｌでのところ、商業的観点から重要な細
菌で、直接遺伝子改変全行いやすいバチラス　スリンギ
エンシスを作ａするであろう方法がなく、そして例えば
バチラス　スリンギエンシス採肉にクローン化されたプ
ロトキシン遺伝子の効率のよい再挿入を結果として可能
にするであろう方法がない。
このための理由は、適度に旨い形質転換率を確実にし、
そして結果として確立きれたｒＤＮＡ技術ノバチラス　
スリンギエンシスへの適用モげ能にするであろうバチラ
ス　スリンギエンシスおよび密接に関連したバチラス　
セレウスのための効率のよい形質転換系の開発が今だ成
功していないという事実であると特にみなされ得る。
新規な殺虫性を有する新規なバチラス　スリンギエンシ
ス株全作製するためにこれ１で使用さｔした方法は、プ
ラスミドコード化プロトキシン遺伝子の接合による転移
に主として基づいている。
テ３（１ バチラス　スリンギエン７ス内ニクローン化す、ｆ′Ｌ
′ｆｃバチラス　スリンギエンシスの結晶性タンパク質
遺伝子の成功した再挿入は今日ｐで１件のみ記載されて
いるが（１１）　Ｋｌ　ｉｅｒ　Ａ、等。
１９８３）、しかしこの場合においても、バチラス　ス
リンギエンシスのための適当な形質転換系がないために
、バチラス　サブチリスとバチラス　スリンギエンシス
との接合による転移という手段を用いる必要があった。
さらにＫｌ　ｉｅｒ等により記載されたこの方法におい
て、大腸菌が中間宿主として使用されている。
しかしながら、接合による転移の方法は、バチラス　ス
リンギエンシスおよび／またはバチラス　セレウスの遺
伝子改変に普通に使用うるために不適当であると思わｎ
る一連の重大な欠点全方する。
ａ）接合によるプラスミドコード化プロトキシン遺伝子
の転移は、バチラス　スリンギエンシス株間および互い
に両立できるバチラス　セレウスとバチラス　スリンギ
エンシスとの間でのみ可能である。
リ　より離れた株間の接合によるグラスミドの転移では
、しばしば低い形質転換頻度しか達成されない。
リ　フロトキシン遺伝子の発現ｔＸ節するか。
または改変する可能な方法がない。
ｄ）遺伝子自体を改変する可能な方法がない。
ｅ）　　８々のプロトキシン遺伝子が１つの株に存在す
るならば、個々の遺伝子の発現はいわゆる遺伝子量効果
（ｇｅｎｅ　ｄｏｓａｇｅ　ｅｆｆｅｃｔ）の結果とし
て著しく低下し得る。
ｆ）不安定性は関連プロトキシン遺伝子の可能な相同組
換えの結果として生じ得る。
従来、多くのグラム陽性生物に普通に使用さｎて＠た他
の形質転換法は、バチラス　スリンギエンシスおよびバ
チラス　セレウスの両方に不適当であることが判明した
。
上記方法の１つは、例えばポリエチレングリコール処理
による微生物のプロトプラストの直接形質転換であり、
これは多くのストレプトミセス（ＳｊｒｅｐＬｏｍｙｃ
ｅｓ）株の場合（１２）　Ｂｉｂｂ　Ｊ、Ｊ。
等、１９７８）およびバチラス　サブチリス（Ｂ。
５ｕｂＬｉｌｉｓ）　（１３）　ＣｈａｎｇＳ、および
Ｃｏｈｅｎ　Ｓ、Ｎ、。
１９７９）、バチラス　メガテリウム（ＢｍｅｇａＬｅ
ｒｉｕｍ）　（１４’　Ｅｒｏｗｎ　Ｂ、Ｊ、およびＣ
ａｒｌＬｏｎＢ、Ｃ，，１９８０）、ストレプトコッカ
ス　ラクティス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１ａｃ
ｔｉｓ）　（１５）　Ｋｏｎｄｏ　Ｊ、Ｋ。
およびＭｃＫａｙ　Ｌ、Ｌ、、　　＋９８４）、ストレ
プトコッカス　フェカリス（Ｓ、ｆａｅｃａｌｉｓ）　
（’Ｕ　ＷｉｒＬｈＬ　等、　　１９８６）、コリネバ
クテリウム　グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍｇｌｕＬａｍｉｃｕｍ）（Ｙｏｓｈｉｈａｍａ　
Ｍ、等、１９８５）おまひ釉々のその他のグラム陽性細
菌の場合においで成功裡に使用さｔ′した。
この方法を用いるために、微生物細胞伊１ず最初にプロ
トプラストに変換しなければならず、即ち細胞壁を分解
酵累で消化する。
この直接形質転換法の成功のためのもう一つの必要条件
は、例えば選択可能なマーカーを用いて成功した形質転
換全検出し得る前に、新し５１］ く導入された遺伝情報の発現および複合固体培地上で形
質転換されたプロトプラストの再生でル〕る。
この形質転換法はバチラス　スリンギエンシスおよび密
接に関連したバチラス　セレウスには不適当であること
が判明した。バチラス　スリンギエンシス細胞のりゾチ
ームに対する高い耐性およびプロトプラストの完全な細
胞壁含有細胞への非常に低い再生性の結果として、可能
な形質転換の割合は低い１１で、そして再現が困難な１
１である（　　　Ａ１１ｋｈａｎｉａｎ　Ｓ、Ｊ、等。
１９８１　；　１９）　Ｍａｒｔｉｎ　Ｐ、Ａ、等、１
９８１；２０）　Ｆｉｓｃｈｅｒ　ｌｉ瀧等、１９８４
）。
それ故にこの方法ではせいぜい１組換え１）ＮＡの仕事
に不適当である極く単純なプラスミドがバチラス　スリ
ンギエンシスまたはバチラスセレウス細胞内に低い頻度
で挿入されることが可能である。
上記の方法を用いて達成することが可能となった形質転
換の満足できる割合に関する個々のに０ 報告は、非常に複雑な最適化プログラムの明確な説明に
よっているが、しかしこれらのプログラムは１つの特定
のバチラス　スリンギエンシス株のみに特異的に常に適
用ｉ」能であり、そして時間と金銭の点から高い消費を
含む （５ｃｈａｌｌ　Ｄ、、　　１９８６　）　。そのよう
な方法はそれ故に工業的規模での通常の施用に不適当で
ある。
バチラス　スリンギエンシスの遺伝学の分野での集中的
な研究が示すように、バチラス　スリンギエンシスまた
は密接に関連したバチラスセレウスを直接遺伝子改変に
従うようにし、そして従って、例えば天然の宿主系にお
いてフロトキシン遺伝子のクローニング全可能にするで
あろう新規な方法を開発することに実質的な興味がある
。この研究にもかかわらず、存在する困難および問題に
対する満足できる解決は依然存在しない。
適度に高い形質転換頻度でバチシス　スリンギエンシス
および／’ＦｆｃＵバチラス　セレウスのｌｌ！！床で
、効率がよくそして再現性のある形質転換を呵ＩＳ目に
する適当な形質転換法は現在は利用できず、そしてその
池の微生物の宿主系に対し一℃暁に確立゛さ才また組換
え１）ＩＮＡ技術のバテラススリンギ：Ｉ＝ンンスー＼
の適用ケｒｉＪ能にするクロングベク２ターもＨた適当
でない。バチラスセレウスに対しても同様である。
（Ｉ≧くべきことに、この目的は、そのいくつかが公知
である単純な工程段階の使用による本発明の範囲内で令
達成さ扛た。
〔課題を解決するだめの手段〕
従って本発明汀、バチラス　スリンギエンシスおよび／
′まりはバチラス　セレウスの遺伝子操作に適当である
組換えＤＮＡ　ｉ用いる単純な形質転換法によって、高
頻度で、バチラス　スリンギエンシスおよび／またはバ
チラス　セレウスを形質転換することによりバチラス　
スリンギエンシスふ・よびバチラス　セレウスの直接的
で、明確に調節嘱れ、（シて再現性のある遺伝子操作を
初めて１］］能にする１組換えＬ）ＮＡ技術に基づいた
新規方法に関する。
本発明はさらに。
ａ）遺伝子またはその他の有用なＤＮＡ配列を単離し。
ｂ）　　ＰＪ＋望する場合には、バチラス　スリンギエ
ンシスおよび／またはバチラス　セレウス内で機能し得
る発現配列に前記単離遺伝子またはＤＮＡを操作可能に
結合し、 Ｃ）項ｂ）からの遺伝子構築物をバチラス　スリンギエ
ンシスお↓び／盪たハバチラスセレウス内に適当なベク
ターを用いる形質転換により導入し、そして ｄ）　　ｆ９Ｔ望する場合には、相当する遺伝子産生物
を発現させ、そして所望する場合にはそれ全単離する。
ことからなるバチラス　スリンギエンシスおよヒ／　−
ｔ　＊−ｆｌバチラス　セレウス内に遺伝子′：ｌたは
その他の有用なＩＪＮＡ配列、しかし特にプロトキシン
遺伝子全挿入し、クローニングし、そして発現させる方
法に関する。
に；） 本発明はなた、 ａ）　　バチラス　スリンギエンシスノ全体０）　ＤＮ
Ａを適当な制限酵素を用いて消化し、 ｂ）生成した制限断片から適当な大きさのもの全分離し
。
Ｃ）前記断片を適当なベクター内に挿入し、ｄ）　　バ
ーｙ−ｙス　スリンギエンシスおよび／またはバチラス
　セレウス全前記ベクターで形質転換し、そして ｅ）適当なスクリーニング法會用いて新規なＤＮＡ配列
を位置決めし、そして所望する場合には形質転換細胞か
らそれらを分離する、ことからなるバチラス　スリンギ
エンシスおよび／ｌたはバチラス　セレウス内に遺伝子
またはその他の有用な１ＪＮＡ配列をクローニングし、
発現させ、そして同定する直接方法をも包含する。
構造遺伝子とは別に１本発明による方法においてあらゆ
るその他の有用な１ＪＩＮＡ配列、例えば調節機能を有
する非コード性ＤＩＮＡ配列、例えば「アンチセンス１
）ＮＡＪ（Ｈ使用できることは明らかである。
従って本発明の方法は、科学的および商業的の両方の観
点から著しく興味深い非常に多くの新しい可能性全開発
する。
例えは、δ−エンドトキシン合成の調節について、特に
胞子形成に関する遺伝子レベルでの情報金得ることが今
や初めて可能である。
昆虫に対する毒性に関する領域が毒素分子のどの部位に
位置するかを明らかにし、そしてｌたこれ（これら）が
とこ１で宿主特異性と関連するかを明らかにすることも
１ｆＣ今や可能であろ５゜ 種々の毒素分子の分子組織化およびバチラススリンギエ
ンシスの様々な種からのこれらの分子全コードする毒素
遺伝子に関する知Ｒは、これら遺伝子の調節された遺伝
子操作に対して著しく実際的に興味深いものであり、こ
れは本発明の方法を用いて今や初めて可能である。
δ−エンドトキシン遺伝子自体の調節さｆ′ｌ−た改変
に加えて、本発明の新規な方法はｌた、そｎらの遺伝子
の発現を制御する調節ｆＪＮＡ配列の操作音もげ能にし
７、その結果としてδ−エンドトキソンの特性、例えば
それらの宿生特異性、とりわけ再吸収性（ｒｅｓｏｒｐ
ｔｉｏｎ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）Ｈ，％異的に制御され
た様式で改変され得、そしてδエンドトキンンの産生率
が例えばより強力で、セしてより効率のよいプロモータ
ー配列の挿入により高められ得る。
試験管内での選択さ７′１．ｆｃ遺伝子またはサブ遺伝
子（ｓｕｂｇｅｎｃ）の特異的に制御さ扛た突然変異に
より、新規なバチラス　スリンギエンシス於よび／また
はバチラス　セレウス変種ヲ祷ることが従って可能であ
る。
新規ナバグラス　スリンギエンシスおよび／′ｆたはバ
チラス　セレウス変種全作製するも５１つの可能な方法
は、異なるバチラス　スリンギエンシス源に由来する遺
伝子ぼたは遺伝子の部分を切り磨ぎ、より広範囲の用途
を有するバチラス　スリツギエンシスおよび／またハノ
＜チラス　セレウスを生成することからなる。合成″！
ｆたは半合成的に頬生きれた毒素遺伝子を新規なバチラ
ス　スリツギエンシスお１び／−ｆたけバチラス　セレ
ウス変種ｅ　Ｉ’ｉ；製するこの方法に使用することも
可能である。
芒らに、本発明による方法は、形質転換頻度の著しい増
加および該方法の単純さの結果としてバチラス　スリン
ギエンシスおよび／−またをよバチラス　セレウスにお
ける遺伝子バンクの確立並びに改変きれた、および新規
な遺伝子の迅速なスクリーニング全初めて可能にする。
特に、本発明の方法は、バチラス　スリンギエンシスお
よば／　ｉ　ｆｃｒｓバチラス　セレウスにお（ｒＴる
遺伝子バンクの直接発現並ひｒ（公知の、灯ＩＬ＜は免
疫学的または生物学的方法を用いてバチラス　スリンギ
エンシスにお・ける新規なプロトキシン遺伝子の同定を
今や初めて可能にする。
本発明の主題ぐま従って、バチラス　スリツギエンシス
および／またはバチラス　セレウスゲに゛ン ノムの直接遺伝子改変全初めて可ぼヒにする、バチラス
　スリツギエンシス／バチラス　セレウス形質転換の公
知方法に比べて効率における著しい増加に基づいた方法
である。
特に、本発明は、組換え１〕〜Ａ、とりわ灯プラスミド
および／またはベクター１）ＮＡ、　ｆ、エレクトロポ
レーションによりバグラス　スリツギエンシスおよび／
またはバチシス　セレウス細胞内に挿入−Ｊ−ることに
よるバチシス　スリンギエンシスおよび／ｌたけバチラ
ス　セレウスの形質転換法に関する。
Ｏ−エンドトギシンをコードするＩＪＮＡ配列およびバ
チラス　スリンギエンシス毒素の殺虫毒性を実質的に有
するタンパク質をコードするＩＪＮＡ配列でバチルス　
スリンギエンシスおよび／またはバチルス　セレウスを
形質転換する方法が好−よしい。
本発明に′−ｆ、た。形質転換頻度だバチラス　スリツ
ギエンシスおよび／’Ｅ；ｉＵバチラス　セレウス細胞
内でｂ−エンドトキシン乞コードする６只 が、または少なくともバチラス　スリンギエンシス毒素
の殺虫毒性を実質的に有するタンパク質全コードするＤ
ＮＡ配列の発現にも関する。
本発明はまた、パテラス　スリツギエンシスおよび／葦
たはバチラス　セレウスのための２官能性ベクター、い
わゆるシャトルベクターの作製方法、およびバチラス　
スリンギエンシスおよび、／”ｆ；Ａはバチラス　セレ
ウス細胞の形質転換のために前記７ヤトルベクターの使
用をも包含する。
バチラス　スリンギエンシスおよび／＝ｚ　；ｌｄパテ
ラス　セレウスにおける複製に加えて、１種またほそれ
以上のその他の異種宿主系、しかし特に大腸菌細胞にお
いても複製する２官能性ベクターの構築が好筐しい。
本発明は、バチラス　スリンギエンシス内で天然に生じ
るδ−エンド］・キシン、’ｉｉｈ少なくともそ扛らと
実質的に相同であるポリペ７°チド、即ち少なくともパ
テラス　スリンギエンシス毒素の殺虫毒性を実質的に有
するボリベプチド全コードするＪＪＮＡ配列を含有する
バチラススリンギエンシスおよび／逢タハバチラス　セ
レウスのためのンヤトルベクター作製方法に特に関する
。本発明ｒ；ｌ：　′ｆだ、バチラス　スリンギエンシ
スおよび／またはバチラス　セレウス細胞を形質転換す
るためのこれらの／−ヤトルベクターの使用、および該
シャトルベクター上に存在するＩＪＮＡ配列、特にバチ
シス　スリンギエンシスのδ−エンドトキシンまたは少
なくともバチラス　スリンギエンシス毒素の殺虫毒性ケ
実質的に有するタンパク質全コードするこｔしらのＤＮ
Ａ配列の発現全包含する。
本発明はぼた同種および特にｌた異種ＤＮＡぽたは同種
ＩＪＮＡと異種ＤＮＡの組合せ全クローニングし、そし
て発現させるための一般的な？ｍ主生物としてのバチラ
ス　スリンギエンシスおよび／１だはバチラス　セレウ
スの使用を包含する。
本発明ｔユ葦だ、上記のより厳密に特徴つげられたフ゛
ラスミドおよびシャトルベクターそれ自体、バチ’５ｒ
ス　スリンギエンシスおよび／ｌたはバチラス　セレウ
スを形質転換するためのそｎらの使用、およびそｆｂら
でもって形質転換さｔＬ　ｌｔバチラス　スリンギエン
シスおよびバチラス　セレウスに関１゛る。
本発明のＩＩｌα囲内で、２官能性（シャトル）ベクタ
ーｐＸＬ６１（＝ｐｌ（６１）Ｊ？よびｐＸｉ　９５　
（＝１）Ｋ９５）が好１しく、と扛らはバチラス　スリ
ンギエンシス　クルスタギ１−ＩＤ　１　ｃｒｙ　Ｂ変
種（Ｂ。
ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｋｕｒｓＬａ
ｋｉ　ＨＤＩｃｒｙＨ）およびパテラス　セレウス５６
９に内に形質転換により導入さ７したもので、プダベス
ト条約に従って国際寄託機関として認められている［ド
イチェザンムルンク　７オン　ミクロオルガニスメン（
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｒｒｒｎｌｕｎｇ　ｖａｎ　Ａ
４ｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ）（１コイツ連邦共和
国、ブラウンシュヴアイヒ）に寄託てれており、そｔし
ぞ扛寄託香号が１）ＳＭ４５７２　（ｐＸ６＋、バチシ
ス　スリンキエンンスクルスタキＨＤ　１　ｃｒｙ　Ｂ
変種内に形質転換により導入きｔしたもの）およびＤＳ
Ｍ４５７１　（ｐＸｌ　９３゜バチラス　スリンギエン
シス　クルスタキｌ１１）　１゛ン２ ｃｒｙＢ変種内に形質転換によｐ導入源れたもの）およ
びＩ）８Ｍ４５７３（ｐＸＩ９３、バチラス　セレウス
５６９に内に形質転換により導入きれたもの）である。
本発明は特に、バチラス　スリンギエンシスのδ−エン
ドトキシンをコードするＬ）ＮＡ配列で形質転換さノ［
、イして発現され＋！＋るが、ぼたはバチラス　スリン
ギエンシス毒素の毒性全実質的に有する少なくとも１種
のタンパク質全コドするＩＪＮＡ配列で形質転換された
新規なバチラス　スリンギエンシスおよびバチラス　セ
レウス変種に関する。
形質転換されたバチラス　スリンギエンシスおよびバチ
ラス　セレウス細胞およびそれらにより産生きれた毒素
は、殺虫組成物の製造のために使用でさ、これにも本発
明は関する。
本発明は−ｆ　＃、　、　　上記のより厳密に特徴づｋ
すらｔＬｆｃバチラス　スリンギエンシスおよび／ｌた
（ｒ：Ｊ、バチシス　セレウス細胞により賄生きれた〕
「１）・ギ／ン會含侍する該バチラス細胞−王だは無細
胞結晶体（６−エンドトキシン）製剤を用いて昆虫全防
除する方法および防除のための組成物に関する。
以Ｆは図面の簡単な説明である。
第１図は、ｐ１封も５２２での大腸菌ＨＢｊ０１の形質
転換（０）およびｐＢｃ１６での来バチラス　スリンギ
エンシスＩ：：Ｉ１）　ｉ　ｃｒｙ　Ｂの形質転換（・
）の結果を示すグラフである（／＼ｔ、工生き残りのＨ
ｌ、）１ｃｒｙＢ細胞数を表す）。
第２図は、形質転換頻度に関する米バチノススリンギエ
ン７ス８１）　１ｃｒｙ　１３培養物の齢の影響全示す
グラフである。
第６図は、形質転換頻度に関する円３Ｓ緩衝溶液のｐ　
ｌｊ値の影響を示すグラフである。
第４図は、形質転換類１．１に関するＰｉ３８緩衝溶液
のショ糖濃度の影響全示１グラフである。
第５図は、形質転換細胞数と形質転換歯たジ使用さ扛た
ＤＮＡ　ｉとの相互依存を示すグラフである１゜ 第６図は、シャトルベクター来ｐ入１６１の制限地図を
示す概略図である。図中、影を付した領域はダラム陽性
ｐＢｃ１６に由来する配列を表し、残りの領域はグラム
陰性プラスミドｐＵｃ８に由来する。
第７図は、’ｐＸＩ９３の制限地図令・示す概略図であ
る。図中、影を付した領域はプロトキシン構造遺伝子（
矢印、Ｋｕ　ｒ　ｈ旧）並びに５′および５′非コ一ド
性配列を表し、残りの領域にシャトルベクター”ｐＸＩ
６１に由来する。
第８ａ図および第８ｈ図は、来バチラス　スリンキニン
シスト１Ｄ１ｃｒｙＨ，”バチシス　セレウス５６９に
およびそれらの誘導体の胞子形成性培養物の抽出物の５
ＩＪＳ（ドデシル硫酸すトリウム）／ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果台・表す生物の形態會示す写真で
ある。〔図中、１：札１１月ｃｒｙ１３（ｐＸＩ　９３
　）、　　２　：米に４ＪＪ　ｊ　ｃｒｙ　Ｂ　（ｐＸ
６１　）。
６：米１１）１　ｃｒｙＢ、４　：ｌ−４ＤＩ、ＬＨＯ
Ｂ−４４９５，５二鼾；チラス　セレウス５６９Ｋ（ｐ
Ｋ１９３）、６：５６９Ｋ）ぞして、第８ａ図はクーマ
ーソー染色したものであり、〔図中、Ｍ′句子層標準、
　Ｎｏｗ分子誦゛（ダルトン）、矢印：１３０，０００
ダルトンのプロトキシンの位置〕 第８ｂ図にバチラス　スリンギエンシスｌ刊〕１のに一
１結晶性タンパク質に対するポリクロナル抗体全添加し
た一Ｆ上記ルのウェスタン７０ツトである。
陽性のバンドが標識し、た抗ヤギ抗体ゲ用いて見い出さ
れた〔図中、矢印：１５０，０００ダルトンのプロトキ
シンの位置、その他のバンド：プロトキシンの消化産物
〕。
第９図は、バチラス　スリンキニンシスに対して最適化
されたエレクトロポレーション法ヲ用いたｐ１３ｃ１６
グラスミド１）ＮＡでのバチラスザブチリスＬＢＧＢ−
４４６８の形質転換の結果を示すグラフである。〔図中
、０．形質転換組ＶμＶプラスミドＬＩＮＡ　；　−：
生存細菌数／罰〕米：優先権証明誉におけるシラスミド
の６６名法に選択さ扛た内部径黒符号ｐ１＼に５本願明
細書では公式に認められた表示ｐＸ、Ｌに置き代えた。
具体的な実施例において便用いれ女胞子形成′７５ 不能性バチラス　スリンギエンシスＨＤ１変異体に対す
る名称もよたｃｒｙ　７からｃｒｙ　Ｂへ変更した。
本発明の実質的な面は、プラスミドＤＮＡのバチラス　
スリンギエンシスおよび／またはバチラス　セレウス細
胞内への挿入に基づいた、それ自体公知であるエレクト
ロポレーション技術音用いるバチラス　スリンギエンシ
スおよびバチシス　セレウスの新規な形質転換方法に関
する。
バチラス　スリンギエンシスおよび密接に関連したバチ
ラス　セレウスへその他の細菌宿主系にすでに確立さｇ
た形質転換法ケ適用１゛る本発明のなさ扛た時点１での
全ての試みは失敗していたが、本発明の範囲内でエレク
トロボレー／ワン技術および句加的な段階を用いて驚く
べき成功全おきめることが今やり能である。
％ＶＣ，ハチシス　スリンギエンシスのフロドプラスト
でのエレン］・ロポレーションテストがより早い時期に
ノ連グループ（２２）　５ｈｉｖａｒｏｖａ゛７に Ｎ１等、　　１９８３）により行われたが、しかし達成
された形質転換頻度は非常に低いためこの方法はバチラ
ス　スリンギエンシスの形質転換には使用不用能である
と見なさｔＬ、そして結局その他の試みがなはれなかっ
たから、上記の成功は驚くべきことであり、そして予期
草汁なかつたことであるとみなされなければならない。
バチラス　スリンキニンシスお↓ヒ／’！Ｊｌ’ｃｉＪ
バチラス　セレウス細胞のエレクトロポレーションに対
し重壁であるプロセスパラメータの研究を蓄積すると、
バチラス　スリンギエンシスおよびパテラス　セレウス
の必要条件に理想的に適合し、そじて１０６ないし１０
８細胞／プラスミドＤＮＡμ７、特に１０６ないし１０
７細胞／プラスミドＩＪＮＡμノの４＋１囲にある形質
転換率全結果として生じる形質転換方法全開発１−るこ
とが篤くべきことに今や可能となりｆＣ，。
１０２ないし最大１０６形質転換細胞／プラスミドＪＪ
ＮＡｔｔ？の値に大体等しい高い形質転換率は、２’）
　５ｃｈａ１１　（１９８６）により記載芒れｆｃＰＥ
Ｇ′／８ （ポリエチレングリコール）形質転換法でのみこむ−ま
で達成さ！′し得た。し、かしｌがら、ＰｊシＧ法が非
常に時間全消費する最適化研究においてそれに竹に採用
さｔｌ、たバチラス　スリンギエンシスには高い形質転
換率は制限さｆした１１であり、このこと１１この方法
を実際的用途にＣユ不適当であるように思わせている。
さＣ−）に、実際のその方法の再現性（グ多くの場合全
くないが、′ｔｉたは低い。
こｔしに対し、本発明の方法は、原理的には全テノバチ
ラス　スリンギエンシスおよびバチラス　十しウス株に
適用＋１能であり、そして従来のＰＥ（Ｊ形質転換法に
比べてより時間の消費が少なく、より合理的で、そして
結果としてより効率のよい形質転換法である。
例えは、本発明の方法においで、例えば全体の完全な細
胞を使用することもｉＪ能であり、従ってバチラス　ス
リンギエンシスおよびバチラス　セレウスには難しい時
間を消費う゛るプロトプラストの作製および複合栄養培
地上での引き続く再生を行う必要がない。
芒らに、ＰＥＧ法を用いる場合、必要な工程段階を行う
ことは１週間！で要するが、−力木発明の形質転換法で
は形質転換された細胞は数時間以内（一般に一晩）で得
ることができる。
本発明の方法のもう１つの利点は、単位時間当たり形質
転換をれ得るバチラス　スリンギエンシスおよび／また
はバチラス　セレウス細胞の数に関係する。
従来のＰＥＧ法において、あ１りにも密集した細胞の増
殖の結果として再生の阻害を避けるために、少量の一部
分のみが同時に平板培養されイｎるが、エレクトロポレ
ーション技術奮用いた場合、大量のバチラス　スリンギ
エンシスおよび／またはバチラス　セレウス細胞が同時
に平板培養され得る。
このことは、上記の方法では不可能であるが、−または
かなりの消費でのみ可能である非常に低い形質転換頻度
でさえも形質転換細胞の検出を可能する。
さらに、少なくともいくつかの形質転換細胞全得るため
には、ナノグラム（ｎｒ）卸囲のＬ）ＮＡで十分である
。
このことは、非常に効率のよい形質転換系が必要である
場合、例えばバチラス　スリンキニンシス細胞における
菟し７く強い制限系のために、バチラス　スリンギエン
シスＬ）ＮＡに比べて１０３の因子で形質転換頻度の減
少ケ導き得る大腸菌からの１）ＮＡ材料を用いた場合に
、特に車装である。
本発明の形質転換法Ｑユそれ自体公知であるエレクトロ
ポレーション技術に実質的に基づいており、以下の特定
の一１程段階： ；Ｉ）バチラス　スリンキニンシス細胞の成長に適当で
ある培養培地中、該細胞の成長に適度な通気を行って、
適当な細胞密度の細胞懸濁液の調製、 Ｅ））該細胞懸濁液から細胞の分離および次のエレクト
ロポレーションに適当な接セト緩衝液中への再懸濁。
Ｃ）エレクトロポレーションに適当な濃度でＤＩ’ｊｋ
試料の添加。
ｄ）段階ｂ）およびＣ）に記載したバッチのエレクトロ
ポレーション装置への導入、 ｅ）　　バチラス　スリンギエンシスおよび／またはバ
チラス　セレウス細胞の組換えＤＮＡでの形質転換に適
度である期間、高電界強度の短期間生成のために細胞懸
濁液に対してコンデンサの１回またはそれ以上の短い放
′屯、 ｆ）エレクトロポレーションを行った細胞の選択的な再
培養、 ｇ）エレクトロポレーションを行った細胞の適当な選択
培地上での平板培養、および ｂ）　　形質転換された細胞の選択 からなることを特徴とする。
本発明の範囲内で好ましい本発明方法の特定の実施態様
では、バチラス　スリンギエンシス細胞ケ１ず最初に、
適度に通気しそして適当な温度、好’ＦＬ＜は２０℃な
いし３５℃で適当な栄養培地中、０．１　ｆ！いし１．
０の光学密度（０Ｄ５５ｏ　）に達する１で培養する。
エレクトロポレーションに供されたバチラス培養物の１
菟１．↓、形質転換頻度に明らかな影響がある。０１な
いしＩ］、３、しかしとりわけ０２のバチラス培養物の
光学密度はそれ故に特に好ぽしい。しかしながら、その
他の牛長相からのバチラス培養物、特に−晩培養物で良
好な形質転換頻度全達成することもまた可能であるとい
う１■実に注意が引かれる（第２図参照）。
一般に、新鮮細胞または胞子は出発材料として便用芒れ
るが、しかし超低温冷凍した細胞材料全同様に１史用す
ることもできる。細胞飼料は、有利にはある量の「不凍
溶液」を添加した適当な液体培地中のバチラス　スリン
ギエンシスおよび／Ｙたはバチラス　セレウス細胞の細
胞懸濁液が々了１（７い。
適当な不凍ｋｉ液Ｃ′Ｉ特に水′ｆ、たは適当な緩衝溶
液中の浸透活性／ｊ７分とＤＭＳＯの混付物である。
不凍浴液中に使用されイ４するその他の適当な成分は、
糖、多１ｉ＋Ｉｉアルコール、例えはグリセロール、糖
アルコール、アミノ酸およびポリ−７＝、例えばポリエ
チレングリコール全包含する。
バチラス　スリンギエンシスを出発拐料として使用する
場合、それら？ｉ”ｆず最初に、適当な培地に接種され
、そして適当な温度、好１しくけ２５℃ないし２８℃お
よび適度に通気した状態で一晩培養される。このバッチ
ケ次に希釈し、そして上記の方法でさらに処理する。
バチラス　スリンギエンシス内に胞子形成を誘導するた
めにそのような胞子形成を引き起こすあらゆる培地音用
いることが可能である。本発明の範囲内？：””）　Ｙ
ｏｕｓｊｅｎ　Ａ、Ａ　ａｎｄ　ｌ（ｏｇｏｆｆ　ｌ’
ｖ１．１ｌ（１９６９）によるＵＹＳ培地が好ましい。
培地を動かすことにより１例えば振盪器ケ用い、好１し
くは５０ないし３００往復／分の回転速度で動かして酸
累は通常培地中に導入される。
パテラス　スリンギエンシスの胞子および栄養微生物細
胞が本発明の範囲内で、公知の一般的に慣用の方法に従
って培養筋れるが、液体栄養培地が実行可能性の理由で
好１しくは使用芒８〆１ れる。
栄養培地の組成は陸用されるバチラス　スリンギエンシ
スまたはバチラス　セレウスの株によってわずかに変化
しても良い。一般には、莫然と尾義され容易に同化可能
な炭素（Ｃ−）および窒素（Ｎ−）源を有する複合培地
が好’ＦＬ＜、例えば好気性バチラス種を培養するため
に慣用のものである。
さらに、ビタミンおよび必須金属イオンが必要であるか
、しかしこれらは使用きれる複合栄養培地中の成分−１
ｙｃｔま不純物としてＪ度な＃度で通常含有きれる。
所望する場合には、前記成分例えば必須ビタミンオヨび
−１ｐ　Ｎ　ａ　＋＋　Ｋ＋＋　Ｃｕ　２＋、Ｃａ　２
＋２Ｍ　ｇ　２＋Ｅ’　ｅ　６＋、　ＮＨ４■、　）’
０４３．　Ｓ（，１４，Ｃ１、Ｃｏ３’−イ第一 ン並ひに微量元素コバルトおよびマンガン、即鉛その他
がそれらの塩の形態で添加はれ得る。
酵母抽出物、酵母氷解物、酵母自己分解物および酵母細
胞に加えて、窒素源は特に大豆粉、トウモロコシ粉、オ
ートミール、エダミン（酵素消化されたラクトアルブミ
ン）、ペプトン、カゼイン氷解物、コーン浸漬液および
内袖出物が適当であるか、本発明はこれに限定きれるも
のではない。
上記Ｎ源の好−ましい濃度は１．ｏｙ７ｔないし２０？
／ｌである。
適当なＣ源は特にブドウ糖、乳糖、ショ糖、デキストロ
ース、麦芽糖、デンプン、セレウス（ｃｅｒｅｌｏｓｅ
）　、セルロースおよび麦芽抽出物である。好ましいａ
度範囲は１．０？／ｌないし２０？／１である。
複合栄養培地の他に、上記栄養分全適当な濃度で含有す
る半合成ｌたは全合成培地を使用することも明らかに可
能である。
本発明の範囲内で好ましいものとして使用尽れるＬＢ培
地の他に、バチラス　スリンギエンンチバイオティノク
メデイウム３　（Ａｎ　Ｌ　ｉ　ｂ　ｉ　ｏ　Ｌ　ｉ　
ｃＭｅｄｉｕｍ　３　）　、　　８ＣＧＹ培地その他全
便用することも可能である。胞子ｋ・形成したバチラス
　スリンギエンシス培養物は好１しくはＧＹＳ培地（傾
斜寒天）上４℃の温度で貯蔵される。
細胞培養物が所望の細胞密度に達した後、細胞を遠心分
離により集め、ぞして好１しくけ氷で予め冷却（〜た適
当な緩衝液中に懸濁する。
（ｉｆｆ究の途、ヒで、温度は重要でないことが判明し
、そしてそれ故に広い範囲全自由に選択できる。０℃な
いし６５℃、好覆しくけ２℃ないし１５℃の温度範囲そ
して々りわけ４℃の温度が好ましい。エレクトロポレー
ションの前後のバチラス細胞の培養期間は得られる形質
転換頻度にわずかに影響ケ与える（第１表参照）。過剰
に長い培養は形質転換ノ瑣変の減少を招く。０１ないし
３０分、特に１０分の培養期間が好ましい。この操作は
１回ｌたはそれ以１：繰り返され得る。本発明の範囲内
で特に適当である緩衝ｍ液は、安定剤として糖アルコー
ル、例えばマンート−ルケ含有し、そしてｐ１１値全５
０ないし８０に設定し、た浸透的に安矩化されたリン酸
緩衝液である。５０ないしａＯ１好”ｆｆ１Ｌ＜は５５
ないし６．５のｐＨ値を有し、安定剤としてプクカロー
スを０．１Ｍないし１．０Ｍ、　ＴＩｆｉ　Ｌ　＜は０
．３Ｍないし０．５Ｍの濃度で含有するＰ　ｆ３Ｓ型の
リン酸緩衝液がとりわけ好−よしい（第３図シよび第４
図参照）。
懸濁されたバチラス細胞の一部會次にキーベットまたは
あらゆるその他の適当な容器内に移し、そして適当な期
間、好ＩＬ＜は０１ないし３０分、特に５ないし１５分
、そして適当な温度、好’Ｅｌ、＜は０ないし３５℃、
特に２ないし１５℃、そしてとりわけ４℃の温度で１）
ＮＡ試料と一緒に培養する。
低温での操作の場合、すでに予備冷却したキュベツト、
ｌたはあらゆるその他の予備冷却した容器を用いること
が有利である。
形質転換された細胞数とエレクトロポレーションに使用
されたＤＮＡ濃度との間には広範、囲にわたり直線関係
があジ、ＬＩＮＡ濃度が高するにつれて形質転換された
細胞数が増加する（第５図８＋７ 参照）。本発明の範囲内で好ましいＩ）ＮＡ濃度はＩｎ
７ないし２０μ２の範囲内にある。１０ｎ９ないし２μ
２のＤＮＡ４度が特に好ましい。
バチーｊス　スリンギエンシスおよび／またはバチラス
　セレウス細胞およびプラスミドＬＩＮＡ′ｆたは別の
適当なＩ）ＮＡ試料を含有する全体のバッチを引き続い
てエレクトロポレーション装置内に導き、そしてエレク
トロポレーションに供する、即ち電気パルスに短時間晒
す。
本発明の方法における使用に適当であるエレクトロポレ
ーション装置は棟々の製造業社、例えばバイオ　ラド（
ｌ（ｉｏ　Ｒａｄ）　（米国、カリフォルニア州、リッ
チモンド：パジーン　パルザーアパレイタス（（１）ｅ
ｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　Ａｐｐａｒａｔｕｓ）　”　　バ
イオチクノロシーズ　アンド　エクスベリメンタル　リ
サーチ社（Ｂｉｏｔｅｃｔｎｌｏｌｏｇｉｅｓ　ａｎｄ
Ｅｘｐｅｒｉｒｎｃｎ＋ａｌ　１−ｔｅｓｅａｒｃｈ　
Ｉｎｃ、　）　（米国、カリフォルニア州、サンジエゴ
；”ＢＴＸ）ランスフェクタ−１００（ＩＪＴＸ　Ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｏｒｌｌｏｏ）”　）。
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　（米Ｌｌｉｌ＋ウィスコ
ンンン州マジソン；ゝゝメーセル２０００エレクトロボ
レシＢ７　　システム（Ｘ−Ｃｅｌｌ　　２０００■う
１ｅｃｔｒｏｐｏｒａＬｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）つ、そ
の他から入手できる。
本発明の方法においてあらゆるその他の適当な装ｆｊｔ
ｋ使用することも明らかに可能である。
棟々のパルス形、例えば長方形のパルスｌたは指数関数
的に減衰するパルスが使用され得る。
後者のものが本発明の範囲内では好ましい。
それらはコンデンサーの放電により生成され、そして初
期の非常に早い電圧の増加および引き続く抵抗と容量の
関数としての指数関数的減衰相を特徴とする。時間定数
１（Ｃは指数関数的減衰時間の長さの程度を与える。そ
れは初期電圧（νＯ）の３７％１で減衰するためのその
電圧に必要な時間に相当する。
細菌細胞に影響全与える決雉的な１つのパラメータは、
細胞に作用する電界の強さに関１糸し。
これは印加電圧：電極板間の距離の比〃・ら計算でれる
。
使用された装置の形状（例えばコンデンサの容量）およ
びその他のパラメータ、例えば緩ｆｄｆｉ　を合液の不
１１ｈ又１１こはエレクトロポレーションに供さｎ／こ
細胞懸濁液の各号に依存する指数関数的減衰時間もまた
この点で非常に重較で、ｆ＝）る。
？ＩＪ＋究の途上で、例えば、エレクトロポレーション
に供された細胞懸濁液の容量を半分に減らすことは、形
質転換頻度を１０の因子で増加させる。
使用される緩衝ζ谷液の最適化による指数曲数的減衰時
間の延長はぼた、形質転換頻度の明瞭な増加音生じる。
それ故に、指数関数的減衰時間の延長および結果として
形質転換頻度の増加ケ生じるあらゆる手段が本発明の範
囲内で好゛ましい。
本発明の方法の血ジ囲内で９ｆぽしい減衰時間は、約２
ｒｎｓないし約５０ｍｓであるが゛、しかしとりわけ約
８ｍｓないし約２０ｍｓである。約ｊａｍｓないし約１
２＋ｒ＋ｓの指数関数的減衰時間が最も好ましい。
本発明の範囲内で、ＤＮＡ含有細胞懸濁液に対するコン
デンサーの短時間の放電によっで、細菌細胞は短期間非
常に高い電界強をにより作用される。この結果として、
バチラス　スリンギエンンス細胞の透過性が少しの間お
よび可逆的に高よる。エレクトロポレーションのパラメ
タは、本発明の方法の間に互いに調整きれ、その結果エ
レクトロポレーション緩衝液中に位置されているＤＮＡ
のバチラス細胞内へのＭ：適な吸収全確実にする。
本発明の範囲内でコンデンサーの容量の設定は、有利に
は１μＦないし２５０μＦであるか、しかし特に１μＦ
ないし５０μＦ１そしてとりわけ２５μ）゛である。初
期電圧の選択は重要ではなく、そしてそれ故に広い範囲
全自由に選択６丁能である。初期電圧Ｖｏは０．２　ｋ
　Ｖないし５０ｋＶ、特に０、２　ｋ　Ｖないｌ、２．
５ｋＶ、そＬ［とりわけ１．２　ｋ　Ｖないし１．８　
ｋ　Ｖが好凍しい。
電極板間の距離は、とりわけエレクトロポレーション装
置の大きさに依存する。それは０１０ないし１．　Ｏｃ
ｌｎ、好１しくは０．２ｃｍないし１．０ｍ、そして特
に０４αである。細胞懸濁液に作用する電界強きの値は
電極板間の距離とコンデンサーに設定された初期電圧の
結果上して起こる。
これらの値は１００ｖ／ｃｒｎないし５００００Ｖ／ｚ
の範囲が有利である。１００ないし＋００００Ｖ／α、
特に３０００ないし４５００　Ｖ／ｃｒｎの電界強さが
好ｌしい。
自由に選択可能なパラメータ例えはコンデンサーの容量
、初期′電圧、電極板間の距離その他の細かい調整Ｉｉ
、ある程度使用きれた装置の構造に依存しており、そし
てそれ故にある範囲内で各場合で変えられる。それ故に
ある場合には、示された限界値を超えるが、または下回
ることも０■能であり、これは最適な′電界強度′に得
るために必要であろうａ 実際のエレクトロポレーション操作は、当該の糸に対し
て最適な形質転換頻度が達成場れる１で１１ｉ、Ｊ　ｌ
ｉたはそれ以上繰り返すことができる。
エレクトロポレーションに続いで、処理きれ５）；） たバチラス細胞は、好１しくはＣＬｌないし３０分の期
間、０℃ないし３５℃、好１しくけ２℃ないし１５℃の
温度で再び培養される。エレクトロポレーションを行っ
た細胞を次に適当な培地で希釈し、そして適当な期間、
ｔＥ’ＦＬ＜は２ないし５時間、適度に通気して、そし
て適当な温度、好２Ｌ＜は２０℃ないし６５℃で培養す
る。
次いでバチラス　スリンギエンシス細胞金、細菌細胞内
に導入された新しいＩ）ＮＡ配列ケ選択するのに適当で
ある薬剤を添加剤として含有する固体培地上で平板培養
する。使用されたＩＪＮＡの性質に依存して該薬剤は例
えばとりわけ抗生物的に活性な化合物ぽたは染料であり
得る。テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェ
コールおよびエリスロマイシンからなる群から選択され
る抗生物質がバチラス　スリンギエンシスおよび／また
けパテラス　セレウス細胞全選択するために本発明の範
囲内で特に好ましい。
色素物質、例えばＸ−ｇａｔ（５−ブロモ−４クロロ−
６−インドリル−β−Ｄ　−カラクｌ−ンド）もまたＱ
ｆ−１ｕ　＜、これｆｉ、　’Ｂ定の色反応により検出
へれ得る。
その他の表現型マーカーは当業者に公知であり、そして
なた本発明の範囲内で使用されても良い。
バチラス　スリンギエンシス細胞全培養するために適当
であるあらゆる栄養培地を便用ずにとがｉｉＪ能てあり
、この培地には慣用の固化媒体の１つ１例えば穿入、ｆ
カロース、ゼラチンその他が冷加される。
これ−牙でバチラス　スリンギエンシスに対して＋’ｉ
４シ＜　ｉｔＬ：載したグ１コセスパラメータはバチラ
ス　セレウス細胞にも同様にユ１に用できる。
１疋来技術で適用「コ」能なこｔｌｌでの方法とは異な
り、上記のバチラス　スリンギエンシスおよびバチラス
　セレウスの形質転換のための本究明の方法は、バチラ
ス　スリンギエンシスおよびぼたはバチラス　セレウス
に生じる特定の天然プラスミドの使用に制限されずに、
全てのタイプのＤＩＮＡに適用可能である。
従って、制御された方法でバチラス　スリンギエンシス
および／よたはバチラス　セレウスを形質転換すること
がはじめて今可能となり。
同種のプラスミドＤ　Ｎ　Ａ、即ち−くチラス　スリン
ギエンシス−または密接に関連した・（チラス　セレウ
スに天然に生じるプラスミドＬＩＮＡの他に異種起源の
プラスミドＬＪＮＡもまた使用することができる。
これは、バチラス　スリンギエンシスｌたは密接に関連
したバチラス　セレウス以外の生物に天然に生じるプラ
スミド」刀ＮＡ、例えばスタフィＤコツカス　”アウレ
ウス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）　
カらのプラスミドｐＬＩＢ１１０およびｐｃｉ　９４　
（２４）　ｌ−１ｏｒｉｎｏｕｃｌ＋ｉ　Ｓ、およびＷ
ｅｉｓｂｌｕｍ　Ｂ、。
１９８２；　２５）Ｐｏｌａｋ　ＪおよびＮＯＶ　ｉｃ
ｋ　Ｒ，Ｐ、。
＋９８２）およびバチラス　サブチリス（ＢｓｕｂＬｉ
ｌｉｓ）　カらのプラスミドｐ　１Ｍ１５＜、　２６）
ＭａｈｌｅｒＪ、およびＨａｌｖｏｒｓｏｎ　Ｈ，Ｏ，
、１９８０）　（これらはバチラス　スリンキニンシス
および／　ｘ　ｙｃ　ｈ　バチラス　セレウス内で複製
可能である）であるが、ｌたは同種プラスミドＩ）ＮＡ
もしくは異種プラスミドもしくは同ｉ　ＬＩＮＡと異種
りへへの組合せから組換えＤＮＡ技術により構築窟れる
ハイブリッドプラスミド１）ＮＡで矛）っても良い。最
後に記載１〜だハイブリッドプラスミドＩ）ＮＡが天然
分離物より組換え１月ＮＡの仕事に適合していてより良
い。
ここで例としてプラスミドｐ　８　、ｉ、）　６４　（
２７）　Ｇｒｙｃｚａｎ′■゛。等、１９８０）、ｐＢ
Ｄ６４７．ｐＨ０３４８およＵｐＵＢ１６６４ｆ記載し
得るが、本発明はこれに制限きれない。
バチラス　サブチリスに対してずでに確立されたクロー
ニングベクター、例えばｐＢ１）６４が。
種々のバチシス　スリンギエンシスおよびバチラス　セ
レウス株でのクローニング実験ケ実施するのに特に重要
であり得る。
プラスミドＤ１＼Ａの他に、本発明の範囲内であらゆる
その他のＩ）ＮＡ、　２バチラス　スリンキニン１］に シスおよびバチラス　セレウス内に形質転換により導入
することが今や可能である。形質転換されたＤＮＡは染
色体内に自律的に１次は組込ｌれて複製し得る。例えば
、グラスミドからでなく７７−ジから誘導されたベクタ
ーｆ）ＮＡであって良い。
本究明は’ｔ′ｆｃ、２官能性のベクター（シャトルベ
クター）の構築にも関する。
バチラス　スリンギエンシスまたは密接に関連したバチ
ラス　セレウスの他に１橿またけ数種の異種宿主生物内
で複製し得る、並びに同種および異棟宿主系の両方にお
いて同定可能である２官能性（ハイブリッド）プラスミ
ドベクタ■ 、いわゆるシャトルベクター構築および使用が本発明の
範囲内で特に好ましい。
異種宿主生物は本発明の範囲内で、バチラススリンギエ
ンシス／バチラス　セレウス群ニ属さない、そして適当
な条件下で自己複製性ＩＪＮＡ會維持し得る全ての生物
と理解すべきである。
上記定義に従って、それ故に原核生物および丸核生物が
異種イ百主生物として機能することができる。この点で
、例としては原核宿生生物群の代表として、バチラス属
からの個々の例、例乏ばバチラス　ザブヂリスまたはバ
チラス　マガデリウノ、スタフィロコッカス属、例えば
スタフィロコッカス　アウレＴンス、ストレプトコツカ
ス属１例えばストレプトコツカス属フェカリス、スト［
／ブトミセス属、例えばストレプトミセス種、／コード
モナス属、例えば／ニードモナス種、ニスクリ、ノチア
属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）　、例えば大腸菌、アク
ロバクテリウム属 （Ａｇｒｏｂ；Ｉｃｔｅｒｉｕｒｎ）、例えばアグロバ
クテリウムチュメ７　Ｔ　ソｘ　ンｙｚ、　（Ａ、　ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　！たはアグロバクテリウム　
リゾグネ、ｚ、　（Ａ、　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、ザ
ルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌａ）、エルヴイニア
属（Ｅｒｗｉｎｉａ）その他葡記載し得る。真核宿主群
からは、特に酵母、並びに動物および植物細胞全記載し
７＃る。この例示で終わりでなく、本発明の範囲全（”
］ら限定されるものではない。原核および真核生物群か
らのその他の適当な代表例は白業者に公知である。
原核宿主の群からのバチラス　ツブチリスまたはバチラ
ス　マガテリウム、シュードモナス棟および特に大腸菌
、並びに真核宿主の群からの酵母および動物または植物
細胞が本発明の範囲内で特に好ましい。
バチラス　スリンギエンシスおよび／テたけバチラス　
セレウス細胞の両方で、並びに大腸菌内で複製可能であ
る２官能性ベクターがとりわけ好ましい。
本発明はまた、バチラス　スリンギエンシスおよびバチ
ラス　セレウスの形質転換用の前記２官能性ベクターの
使用を包含する。
シャトルベクターは組換えＪＪＮＡ技術を用い、同！（
バチラス　スリンギエンンス、バチラスセレウス）なた
は異種起源のプラスミドおよび／またはベクターＤＮＡ
　’ｉ適当な制限酵素を用いて１ず切断し、そして次に
各々所望の宿主系内で複製に必須である機能全含有する
ＬＩＮＡ　＠片全適当な酵素の存在下で再び互いに結合
することに■） より構築される。
上記異種宿主生物は異種起源のプラスミドおＪ：ひ／′
ｆ、たはベクターＤＩＮＡの源として作用し得る。
種々のＤＮＡ断片の結合は、異なる宿主系での複製に必
須である機能が保持されるような方法で行われなければ
ならない。
きらに、純粋に異種起源のプラスミド１）ＮＡおよび／
またはベクターＪＪＮＡもまた明らかに、シャトルベク
ターの構築のために使用され得るが。
しかし異種の融合相手の少なくとも１つは同種のバチラ
ス　スリンギエンシス／バチラス　セレウス宿主系内で
の複製に一４’Ｊ能にするＬ）ＮＡの領域全含有してい
なければならない。
バチラス　スリンギエンシス／バチラス　セレウス宿主
系内で複製できる異種起源のプラスミドＤＮＡおよび／
’ＥｅｌよベクターＬＩＮＡＯ源として、この点で例と
して、スタフィロコッカス属、例ｉ　バスタフィロコツ
カス　アウレウス、ストレプトコツカス属、例えばスト
レプトコッカス１．００ フェカリス、バチラス属、例えばバチラス　丈ブチリス
Ｉｉはバチラス　マガテリウム、ストレプトミセス属１
例えばストレプトコツス属、その他からなる群から選択
されるダラム陽性菌からの数種を記載し得る。例として
ここに挙げたダラム陽性菌の群からの代表例に加えて１
本発明の方法に使用きれ得る当業者には公知のその他の
生物のあらゆるものがある。
従って本発明は′ｆた、 ａ）　　ｉず最初に、適当な制限酵素を用いて同種また
は異種起源のプラスミドＩＪＮＡ　２断片に切断し、そ
して ｂ）次いで、各々の所望の宿主系における複製および選
択に必須の機能全含有する断片を、適当な酵素の存在下
、種々の宿主系内での複製および選択に必須な機能が保
持されるような方法で互いに再び結合する、 ことからなるバチラス　スリンギエンシスおよび／Ｒた
はパテラス　セレウスを形質転換するのに適当である２
官能性ベクターの作製方法に関する。
このようにして、バチラス　スリンギエンシスｌたはバ
チラス　セレウス内での複製に必要な機能に加え、少な
くとも１種のその他の異種宿主系内での腹＃全可能にす
るその他のＬＩＩ’ｌＡ配列全含有する２官能性プラス
ミドが得られる。
同種および異種の両方の宿主系において２官能性ベクタ
ーの迅速で効率の良い選択を可能にするために、該ベク
ターにバチラス　スリンギエンシスおよび／またはバチ
ラス　セレウス並びに異種宿主系で使用づれ得る釉定の
選択可能なマーカー、即ち迅速で容易な選択全可能にす
るマーカー全供給することが有利で々〕る。抗生物質耐
性全コードするＩＪＮＡ配列、和にカナマイシン、テト
ラサイクリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシ
ンぞの他からなる群から選択孕れる抗生物質に対する耐
性をコードするＤＮＡ配列の使用が本発明の範囲内で特
に好フしい。
色素物質１例えばＸ−ｇａｌ（５−プロモー４−りｏｏ
−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）を有する酵
素をコードする遺伝子もｌた好覆しい。このとき形質転
換きれたコロニーは、特定の色反応により非常に容易に
検出はれ得る。
その他の表現型マーカー遺伝子は当業者に公知であり、
−′ｆニジてぼた本発明の範囲内で使用され得る。
バチラス　スリンギエンシスモＬ、＜ｎｙ’ｆラス　セ
レウスｌたけ両方の宿主系において複製ヲ１」能にする
ＩＪＮＡ配列に加えて、その他の宿主系、例えはバチラ
ス　サブチリス、バチラスマガ７　１）ラム、シュード
モナス棟、大腸菌その他の中で複製に必要であるＤＮＡ
の領域をも含有するシャトルベクターの構築が本発明の
範囲内で特に好ｌしい。
また、一方でハバチラス　スリンギエンシスもしくはバ
チラス　セレウス、またはその両方のいずれかで複製し
、そして他方では酵母、動物細胞および植物細胞その他
からなる群から選択妊れる真核宿主系で複製するシャト
ルベクタ１（Ｉ（ １０〆１ が好ｌしい。
バチラス　スリンギエンシスもしくはバチラス　セレウ
スまたは両方の宿主系においてシャトルベクターの複製
に必要であるＤｊＮＡ配列に加えて、大腸菌内で該ベク
ターの複＃全可能にするＤＮＡ配列全も含有うるンヤト
ルベクターの構築が本発明の範囲内で特に好ｎしい。
バチラス　スリンギエンンスーバテラス　セレウス／犬
腸附系のためのンヤトルベクターの構築用の出発プラス
ミドの例は、バチラス　セレウスプラスミドｐＢｃ＋６
、および大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２から誘導された
グラスミドｐＵｃ８（２”）　Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、およ
びＭｅＳＳｉｎｇ　Ｊ、。
＋９８２）であるか、これに限定されない。
本発明はまた、同種および異種宿生系での複製および選
択に必須である機能に加え１発現可能な形の１種もしく
はそれ以上の遺伝子またはその他の有用な１．ＪＮＡ配
列をも含有する２官能性（シャトル）ベクターに関する
。本発明はｆ、た、上記遺伝子ｎたはその他の有用なＬ
ＩＮＡ配列をこれらの２官能性ベクター内に適当な酵素
でもって挿入することからなる該ベクターの作製方法奮
包含する。
本発明のシャトルベクターおまひ上記形質転換法を用い
て、高い効率を有する形質転換によりバチラス　スリン
ギエンシスおよび／’！ｆＣ，ｉｊ：バチラス　セレウ
ス細胞内にバチラス　スリンギエンシス細胞の外の外来
宿主系内でクローン化されたＩＪＮＡ配列を導入するこ
とが初めて今や可能である。
遺伝子１ｆＣはその他の有用なｆ）ＮＡ配列、特に調節
機能をも有するものが、バチラス　スリンギエンシスお
よびバチラス　セレウスＩ細胞内に適当な方法で導入さ
れ、そして所望の場合にはその中で発現され、その結果
として新規で望ましい特性を有するバチラス　スリンギ
エンシスおよびバチラス　セレウスが得られることが、
従って今や初めて可能である。
本発明の範囲で与えられた定義による、同種および異種
両方の遺伝子もしくはＩＪＮＡ、　−またはｎ− １０（： 合成遺伝子もしくは１）ＮＡ　、並びに該ＩＪＮＡの組
合せが本発明の方法における遺伝子として使用され得る
。
コードＤＮＡ配列は、ゲノムＩＪＩ＼Ａから、　　ｃＬ
ＩＮＡから、１ｆ（は合成ＩＪＮＡだけから構築をれ得
る。
もう１つの可能性Ｕ’、　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡとゲノムＪＪ
ＮＡ、および／′または合成ＩＪＮＡか「）なるハイプ
リタドＩＪＮＡ配列、１にはそれらＪＪＮＡの組合せの
構築である。
その場合には、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ｉｉゲノムＩＪｉ＼Ａ
と同じ遺伝子に由来しても良く、デたｃＤＮＡおよびゲ
ノム１）ＮＡは異なる遺伝子に由来しても良い。しかし
ながら、あらゆる場合に訃いて、ゲノムＤＮＡおよび／
ぽたはｃＤＮＡの両方は各々向−または異なる遺伝子か
ら個々に調製０′ｉ″Ｌ得る。
ＤＮＡ配列が１　Ｉｍ以上の遺伝子の部分を含有する場
合、これらの遺伝子は同一および同神生物に由来しても
、異なる株、　′ｆたけ同一種の変種もしくは同−属の
異なる種に属する種々の生物に由来しても、ｌたは同一
もしくはも′）一つの分類単位の１つ以−ヒの属に属す
る生物に由来しでも良い。
細菌細胞内での前記構造遺伝子の発現全確実にするため
に、ｉｆ最初にコード遺伝子配列會バチラス　スリンギ
エンシスおヨヒ／１ｆｃｌｉノＺチラス　セレウス細胞
内で機能し得る発現配列に操作可能に結合されなければ
ならない。
従って、本発明の／・・ｆグリッド遺伝子構築物は、構
造遺伝子に加えて、プロモーターおよびターミネータ−
両方の配列並びに６′および５′非翻訳領域のその他の
調節配列を包含する発現信号全含有する。
天然配列と実質的に相同であるバチラス　スリンギエン
シスおよび／テ几ハバチラス　＋レウス自体並びにそわ
らの突然変異体および変椙の天然発現信号が本発明の範
囲内で釉に好ｌしい。本発明の範囲内で、第一の１）Ｎ
Ａ配列と第一のＩＪＮＡ配列と（・ま、該ＤＮＡ配列の
活性領域の少なくとも７０％、好１しくは少なくとも８
０％、特に少なくとも９０％が相同である場合に実質的
に相同である１、「実′Ｗ的に相同」といり表現１（）
′ン の現在の定義によｔｌば、コード領域のＤＮＡ配列内の
２つの異なるヌクレオチドは、一方の多方への父換が不
活動突然変異であるならば相同とみなされている。
胞子形成の機能としての発現全確実にするバチラス　ス
リンギエンシスの胞子形成依存プロモーターの使用が特
に好ましい。
本発明の範囲内でバチラス　スリンギエンシスｌたはバ
チラス　セレウスの形質転換にとって、ｂ−エンドトキ
シンをコードするＩ）ＮＡ配列の使用が特に好運しい。
本発明のキメシ遺伝子のコード領域は、好１しくけバチ
ラス　スリンギエンシス内に自然に生じるポリペプチド
ｌたはそれと実質的に相同であるポリペプチド、即ち少
なくともバチラススリンギエンシスの結晶性θ−エンド
トキシンタンパク質の毒性ケ実質的に有するポリペプチ
ドケコードするヌクレオナト配列を＠有する。
本発明の範囲内で、定義によりポリペプチドは、それが
バチラス　スリンギエンシスの能棟からの結晶タンパク
質と同様に、類似した範囲の昆虫幼虫に対して殺虫性で
ある場合、バチラススリンギエンシスのδ−エンドトキ
シン結晶タンパク質の前件を実質的に有する。いくつか
の適当な亜種は、例えは、バチラススリンギエンシス　
クルスタキ（ｋｕｒｓｌａｋｉ）　、ベルリナ（ｂｅｒ
ｌｉｎｅｒ）、アレスチ（ａｌｅｓｔｉ）、トルウオル
チ（ｆｏｌｗｏｒｔｂｉ）　、　　ソフト−（ｓｏ口Ｏ
）、デンドロリマス（ｄｅｎｄｒｏｌ　ｉｍｕｓ）　、
　　テネブリオニス（ｔｅｎｅｂ口ｏｎｉｓ）およヒイ
スラエレンシス（１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）からなる群
から選択されるものである。鱗翅目の幼虫に対する好−
よしい亜種はクルスタキであり、そして特にクルスタキ
１１Ｄ１である。
従って、コード領域はバチラス　スリンギエンシス内に
もともと存在していても良い。１だ、コード領域ｕ　、
バチラス　スリンギエンシス内に存在する配列とは異な
るがしかし遺伝コー　ドの線取のために等価である配列
ケ含んでいても良い。
１０：（ キメラ遺伝子のコード領域は天然に生じる結晶タンパク
質δ−エンドトキシンとは異なるポリペプチド全コー　
ドしでも良いが、しかし結晶タンパク質の昆虫毒性を実
質的に依然として有する。そのようなコード配列は通常
天然のコド領域の異形（ｖａｒｉａｎｔ）であろう。本
発明の範囲内の天然の１）ＮＡ配列の「異形」は、定義
により、同一機能ゲ示す天然の配列の変更された形と理
解σｆＬるべきである。異形は突然変異体であっても良
＜、　’ｚ′ｆＣ，合成ＤＮＡ配列であって良く、そし
て４（」肖する天然の配列に実質的に相同である。
本発明の範囲内で、ＩＩＮ’Ａ配列の活性領域の少なく
とも７０％、好運しくけ少なくとも８０％、そして最も
Ｕｆ−ましくは少なくとも９０％が相同である場付に、
１ｎＱＡ配列は第二の初′ＩＩＡ配列に実質的に相同で
ある。「実質的に相同」という現在の定義によれば、あ
るものの他への置換が不活動突然変′ｊｌｃケ構成する
ＬＭｊ旨、２つの異なるヌクｌ／　Ｊチドは、コード領
域の１）ＮＡ配列において相同であると見なされる。
このように本発明の範囲内で、開示袋れそして特許請求
きれた必要条件に適合（〜、そしてバチラス　スリンギ
エンシス６−エンドトキシンの殺虫性を有するアミノ酸
の配列をコードするあらゆるキメラ遺伝子全使用するこ
とがこのように可能である。殺虫有効性および／または
バチラス　スリンギエンシス毒素の宿主特異性に関する
天然の配列の少なくとも部分に実質的に相同であるヌク
レオチド配列の使用が特に好ｌしい。
キメラ遺伝子により発現でれるポリペプチドは、それが
少なくともいくつかの同一な抗原決定基を有するから、
一般に、天然の結晶タンパク質と共通の少なくともいく
つかの免疫学的特性を有するであろう。
従って、前記キメラ遺伝子によりコードもれるポリペプ
チドは、パテラス　スリンギエンシスにより産生きれる
結晶タンパク質のクーエンドトギシンに好ｌしくけ構造
的に関連する。バ１１：） チラス　スリンギエンシスンま約１３０，０００ないし
１４０．０００の分子ｔ　（１１Ｊｗ）　（ｒ有するプ
ロトキシンに相当するサブユニッｌｌｒ有する結晶タン
パク質’ｃ　ｋ生する。このサブユニノ１４−プロテア
ゼ盈たはアルカリにより切断し、７０，０００そしてＩ
Ｊ能性としでより低いＭｗｉ何する殺虫性断片とする。
コード領域がプロトキシンのそのような断片または十ｔ
Ｌらのより小さい部分を包含−するキメニア遺伝子の構
築に対し、そのコード領域の断片化は、その断片Ｌ１よ
その部分が不可欠の殺虫有効性を有する限りは継続され
得る。プロトキシン、プロトキシンの殺虫性断片および
これら断片の殺虫性部分は、その他の分子、例えばポリ
ペプチドおよびタンパク質に結合され得る。
号および同第４，４６７．０５６号）。結晶タンノくり
質？コードする好ましいヌクレオチド配列は、下のｔｉ
２力（１１で表わされる配列の１５６ないし６６２６位
のヌクレオチドまたはそのような結晶タンノくり質の殺
虫性断片をコードするより短い配列である（　”）　Ｇ
ｅ１ｓｅｒ等、１９８６年、およびＥ１）２３８４４１
　）。
ドするバチラス　スリンギエンシスの遺伝子から得られ
ても良い（Ｗｂｉ＋ｅｌｅｙ等、　ＰＣ’ｒ’出願ＷＯ
３６１０１５６６号オヨヒ米国特許第４，４４８，８８
５１１：＜ め己フＪ １３０　　　　　　］　４０　　　　　１５０　　　　
　１６０　　　　　１７０　　　　　　＋８０ＡＡＴＴ
ＧＧＴＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡＧ　　ＡＧＡＴＧＧＡ
ＧＧＴ　　ＡＡＣＴＴＡＴＧＧＡ　　ＴＡＡＣＡＡＴＣ
ＣＧ　　ＡＡＣＡＴＣＡＡＴＧ＋９０　　　　　２００
　　　　　２＋０　　　　　２２０　　　　　２３０　
　　　　２４０ＡＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＡＴＡ、ＡＴ
ＴＧＴＴＴＡＡＧＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＧＡＡＧ
ＴＡＴ丁ＡＧＧＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＣ丁丁ＡＡＣＡ
ＣＣＣＴＧＧＧ丁ＣＡＡＡＡ　　Ａ丁子ＧＡＴＡＴ丁丁
　ＡＧ丁ＡＡＡＡＴＴＡ　　ＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴ　　
ＧＴＧＣＡ丁ＴＴＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＧＧ　　ＴＴＡ
ＣＡＣＣＣＣＡ　　ＡＴＣＧＡＴＡＴＴＴ　　ＣＣＴＴ
（ｉＴＣＧＣＴ　　ＡＡＣＧＣＡＡＴＴＴ　　ＣＴＴＴ
ＴＧＡＧＴＧ７０　　　　　　　　Ｂｏ　　　　　　　
　９０　　　　　　１００　　　　　　１１０　　　　
　　　＋２０丁ＣＡ丁ＡＡＧＡＴＧ　　ＡＧＴＣＡＴＡ
ＴＧＴ　　丁子ＴＡＡＡ丁τＧＴ　　ＡＧＴＡＡＴＧＡ
ＡＡ　　ＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡ　　ＴＡＴＣＡＴＡＡＴ
Ｇ３］　０　　　　　３２０　　　　　３３０　　　　
　３４０　　　　　３５０　　　　　３６０ＡＡＴＴＴ
Ｇ丁ＴＣＣＣＧＧ丁ＧＣＴＧＧＡ　　ＴＴＴＧＴＧＴＴ
ＡＧ　　ＧＡＣＴＡＧＴＴＧＡ　　ＴＡＴＡＡＴＡＴＧ
Ｇ　　ＧＧＡＡＴＴ丁丁ＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＣＡＡＴ
ＧＧＧＡＣＧＣＡＴ丁丁Ｃ丁ＴＧＴＡＣＡＡＡ丁丁ＧＡ
ＡＣＡＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＡＧ４３
０　　　　　　ム４０　　　　　４５０　　　　　　＾
６０　　　　　４７０　　　　　４８０ＡＡＧＡＡＴＴ
ＣＧＣＴＡＧＧＡＡＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＴＡＧＡ
ＴＴＡＧＡＡＧＧＡＣＴＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴＴＡＴＣ
ＡＡＡＴＴＴＡＣＧＣＡＧＡＡ丁ＣＴＴＴＴＡＧＡＧＡ
ＧＴＧＣ；ＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＡＡＴＣＣ
ＡＧＣＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧＴＡＴ　
　ＴＣＡＡＴＴＣＡＡＴ　　ＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡ　　
ＧＴＧＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴ　　ＣＣＴ
ＣＴＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＡＡ　丁ＴＡＴＣＡＡ
ＧＴＴ　　ＣＣＴＣ丁丁ＴＴＡＴ　　ＣＡＧＴＡＴＡＴ
ＧＴ　　ＴＣＡＡＧＣＴＧＣＡ　　ＡＡＴＴＴＡＣＡＴ
Ｔ６７０　　　　６８０　　　　６９０　　　　７００
　　　　７１０　　　　７２０ＴＡＴＣＡＧＴＴＴＴ　
　（ｉＡＧＡＧＡＴＧＴＴ　　ＴＣＡＧＴＧＴ丁ＴＧ　
　ＧＡＣＡＡＡＧＧ丁Ｇ　　ＧＧＧＡＴＴ丁ＧＡＴ　　
ＧＣＣＧＣＧＡＣＴＡ７９０　　　　８００　　　　８
］０　　　　８２０　　　　８３０　　　　８４０ＧＣ
ＴＧＧＴＡＣＡＡ　　ＴＡＣＧＧＧＡＴＴＡ　　ＧＡＧ
ＣＧＴＧＴＡＴ　　ＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡ　　ＴＴＣＴ
ＡＧＡＧＡＴ　　ＴＧＧＡＴＡＡＧＡＴ１１に Ａ丁ＡＡＴＣＡＡＴＴＴＡＧＡＡＧＡＧＡＡ丁ＴＡＡＣ
ＡＣ丁ＡＡＣＴＧＴＡ丁丁ＡＧＡＴＡ丁ＣＧＴ丁ＴＣＴ
ＣＴＡＴＴＴＣＣＧＡ１５７０　　　　　　　］＋５８
０　　　　　１５９０　　　　　　　＋６００　　　　
　　１６１０　　　　　　　＋６２０ＣＡＣＡＡ／ＬＴ
ＴＡＣＡＣＩＶｔＡＴＡＣＣＴ　　丁ＴＡＡＣＡＡＡＡ
Ｔ　　ＣＴＡＣＴＡＡＴＣ丁　ＴＧＧＣＴＣ丁ＧＧＡ　
　ＡＣＴＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＡＴＧＡＴＡＯＴＡＧＡ
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ｌｕＬｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ
　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＶａｌ　　丁ｙｒ　
　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　Ａｓｎ　　Ｔｈｒ　　Ｖａｌ　　
Ｔｈｒ　　ＣｙＳ　ＡｓｎＡｓｐ　　丁ｙｒ　　Ｔｈｒ
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Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ａｒｇ　　Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　
Ｇ１．ｙ　　ＴｙｒＡ５１１ＧＩＹＡｌａ丁ｙｒＧｌｕ
ＳｅｒＡｓｎＳｅｒＳｅｒｖａｌＰｒｏ　Ａ１．ａ　Ａ
Ｓｐ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＡｌａＴｙｒ　（ｌｌ
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ｄ本発明の方法を用いて形質転換により、バチラス　ス
リンギエンシスまたはバチラス　セレウス細胞内にキメ
ラ遺伝子を導入するために、好ましくは遺伝子を最初に
ベクター内に挿入する。この挿入は本発明の２官能性ベ
クター内に行うのが特に好ましい。
相当する遺伝子がバチラス　スリンギエンシス内への挿
入に十分な麓で利用できない場合には、ベクターは、ま
ず最初に異種の宿主細胞内での複製により増幅させても
良い。遺伝子の増幅のための最も適した宿主細胞は細菌
細胞または酵母細胞である。十分量の遺伝子が利用でき
る場合、それをバチラス細胞に導入する。遺伝子のバチ
ラス　スリンギエンシスまたはバチラス　セレウス細胞
内への導入は、複製のために用いられたのと同じベクタ
ーによっても、また異なるベクターによっても良い。本
発明の２官能性ベクターが特に適している。
キメラ遺伝子を複製するのに適当な細菌の宿主細胞のい
くつかの例は、エスケリソチ７（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉ
ａ　）属、例えば大腸菌およびアグロバクテリウム属、
例えばアグロバクテリウム　チュメフ了シエンスまたは
アグロバクテリウム　リゾゲネス、ンユードモナス属、
例えばシコードモナス種、バチラス属、例えばバチラス
　マガテリウムまたはバチラス　サブチリスその他から
なる群から選択される細菌を包含する。本発明の形質転
換法の結果として、バチラス　スリンギエンシスおよび
バチラス　セレウス自体ヲ用いることもまた本発明の範
囲内で初めて今や可能である。細菌内で異種遺伝子をク
ローニングする方法は、米国特肝第４．２３７．２２４
号および同第４．４６８．４６４　号に記載されている
。
バチラス　スリン竹エンシスの結晶タンパク質をコード
する遺伝子の大腸菌内での複製は、２９）Ｗｏｎｇ等（
１９８３年）に記載されティる。
本発明の遺伝子を複製するのに適当な酵母＜ｄ生細胞の
いくつかの例は、ツ′ツカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ　）から選択されるものを含む（欧州特許
出願ＥＰＯ２３８４４＋）。
１２°ン キメラ遺伝子が挿入され得、そして適当な宿主細胞、例
えば細菌または酵母内で複製されるあらゆるベクターは
、本発明の遺伝子を増幅するために使用しても良い。ベ
クターは例えばファージまたはプラスミドから誘導され
得る。本発明において使用され得、そしてファージから
誘導されるベクターの例は、Ｍｌ３およびラムダ（λ）
ファージから誘導されるベクターである。
Ｍ１３ファージから誘導されるいくつかの適当なベクタ
ーは、Ｍｌ　５　ｍｐ　１８およびＭｌ　５　ｍｐ　１
９を含む。λ−ファージから誘導されるいくつかの適当
なベクターは、λｇｔ　１１、λｇｔ　７およびλシャ
ロン（Ｃｈａｒｏｎ　）　４を含む。
細菌内での複製に特に適当であり、そしてプラスミドか
ら誘導されるいくつかのベクターとしては、ｐＢＲ３２
２（”）＋　Ｂｏｌｉｖａｒ等、１９７７）。
ｐＵＣ１８およびｐＵＣ１９（”＋、　Ｎａｒｒａｎ　
ｄｅｒ等。
１９８３）およびＴ１プラスミド（３２）；Ｂｅｖａｎ
等。
１９８！１）が記載され得るが、これに限定されなり０
細菌内で遺伝子を増１商する好ましいベクタけ、ｐｌ、
（Ｒ３２２、ｐＵＣ１８およびｐＵｃ１９である。
特に、直妥クローニングベクターは、例えばｐＢＤ　３
４７、Ｉ）Ｂ１．）３４８、ｐＢＤ　６４およびｐＵＢ
１６６４、そしてとりわけすでに詳しく記載したシャト
ルベクターが、バチラス　スリンギエンシス内、１：　
ヒ／　’Ｅたはバチラス　セレウ、Ｚ、内Ｋｔｍ接クロ
ーニングするために記載され得るが、これに限定されな
い。
本発明の範囲内で、２官ｈヒ性（７ヤトル）ベクターｐ
ＸＩ　６１　（＝ｐＫ６１　）およびｐＸＩ　９３　（
ｐＫ９ろ）が好ましく、これらはバチラス　スリンギエ
ンシス　クルスタキ■ＩＤ　ｉ　ｃｒｙ　Ｂ　変４　オ
よびバチラス　セレウス５６９に内に形ａｈ換により導
入されたもので、ブダペスト条約に従って国際寄託機関
として認められている［トイチエ　ザンムルンク　フォ
ノ　ミクロオルカニスメン（ドイツ連邦共和国、ブラウ
ンシーヴアイヒ）に寄託されており、それぞれ寄託番号
がＤＳＩＶＩ４５７２　（ｐＸＬ　６１　、バチラス　
スリンキエンシス　クルスタキＨ１）　１　ｃｒｙ　Ｂ
　　変種内に形質転換により導入されたもの）およびＤ
ＳＭ４５７１（ｐＸＩ　ｑ　３、バチラス　スリンキニ
ンシス　クルスタキＨ１）　１　ｃｒｙ　Ｂ変種内に形
質転換により導入されたもの）およびＤＳＭ　４５７３
　（１）Ｘ　１９３、バチラス　セレウス５６９に内に
形質転換により導入されたもの）である。
細菌内での抜入に逸したイーメラ遺伝子を製、へするた
めに、プロセーター配列、５′非翻訳配列、コード配列
および６′非翻訳配列をベクター内に挿入するが、才た
は上記のベクターの１つの中に正（７い順序で組立てる
。本発明に適当であるベクターは宿主細胞内で複製でき
るものである。
ブロモ−ター　５′非翻訳領域、コード領域および６′
非翻訳領域は、最初にベクターの外で１つのユニットに
結合されて、そして次にベクタ内に挿入されても良い。
寸だ、キメラ遺伝子の部分はベクター内に別々に挿入さ
れても良い。
バチラス　スリンキニンシスおよびバチラスセレウスク
ローニングベクターの場合、５’非ｉ１＋ＪＩ訳領域、
コード領域および６′非翻訳領域からなるバチラス　ス
リンキニンシスから単離すれた全体のユニットがベクタ
ー内に挿入され得るからこの段階を省略することができ
る。
ベクターで形質転換さｆ′シた細胞を識別することがｉ
Ｊ　’ｆｆＥて゛ある％６Ｊ、を宿主＋＋ａ胞に付与す
るマーカー１共伝子をベクターが貧有することはさらに
奸才しい。抗午物質耐性をコードするマーカ遺伝子が好
ましい。適当な抗生物質のいくつか）例Ｕ　、アンピシ
リン、クロラムノ１ニコール、エリスロマイシン、テト
シザイクリン、ハイグロマイ、／ン、０４１Ｂおよびカ
ナマイシンである。
色素物質、例えばＸ　ｇａＪ（５−ブロモ−４クロロ−
５−インドリル−β−Ｄ−ガラクト７ド）を有する酵素
をコードするツーカー遺伝子も−また好ましい。このと
き形質転換されたコロニーは、特定の色反応により非常
に容易に検出され得る。
ベクター内への遺伝子の挿入または組立ては、標準法、
例えはｓｗ　ｓ＆えＤＮＡ　（３３）Ｍａｎ＋ａｔｉｓ
等、１：３１ ＋９８２）および相同組換え（”　）１１ｎｎｅｎ等、
１９７８　）の使用により行われる。
組換えＤＮＡ法は、１ず最初にベクターを切断し、そし
て所望のＤＮＡ配列をベクターの切断部分の間に挿入す
ることに基づいており、そして所望のＤＮＡ配列の端部
をベクターの相当する端部に連結する。
ベクターは適当な制限エンドヌクレアーゼにより好捷し
くは切断される。適当な制限エンドスフレアーゼはプラ
ント末端を形成するもの、例えばＳｍａ　ｌ、Ｉ−４，
ｐａ　ｌおよびＥｃｏ　ＲＶ、並びに粘着端を形成１゛
るもの、例えばＥｃｏ　Ｒ１、Ｓａｃ■およびＢａｍＨ
Ｉである。
Ｊヅ１望のＩ）ＮＡＡ配列通常、より大きいｆ）ＮＡ分
子、例えば染色体、グラスミド、トランスポゾンまたは
ファージの領域として存在する。所望のＤＮＡ配列はこ
れらの場合、その供給源から切り出され、そして端部が
切断されたベクターの端部に結合され祷るように場合に
よっては修飾される。所望のｆ）ＮＡＡ配列切断されだ
べフタ−の端部がプラント末端である場合には、それら
はプラント末端に特異的なリカーゼ、例えば’ｌ”　４
１．）ＮＡリカーゼにより互いに結合される。
重重しいＤＮＡ配列の末端は、粘着端の形態で切断さｔ
したベクターの末端に結合させても良く、その場合には
粘ノｕ端に特異的なり刀−セは’Ｉ’　４１）ＮＡ　リ
カーゼであって艮い。　その他の適当な粘着端に特異的
なリカーゼは例えば大腸菌ＤＮＡＮカリゼである。
粘着端は１力望のＩ）　Ｎ　Ａ配列およびベクターを同
一の制限エンドヌクレアーゼで切断することにより有利
に形成される。そのような場合、重重しい１）　Ｎ　Ａ
配列および切断されたベクターは互いに相補的な粘着端
を有する。
粘着端は、所望のＤ　Ｎ　Ａ配列の末端および切断され
たベクターに相補的なホモポリマーテルヲ、末端テオキ
シヌクレオチゾルトランスフェラーゼを用いて添加する
ことにより横築され得る。
脣た粘着端は、特定の制限エンドヌクレアゼにより認識
さｆｌ、そしてリンカ−として公知である合成オリゴヌ
クレオチド配列を添加し、そしてその配列をエンドヌク
レアーゼで切断することによっても製造され得る（例え
ば、３３）Ｍａｎｉａｔｉｓ等、１９８２参照）。
バチラス　スリンキニンシス遺伝子、そして特にδ−エ
ンドトギ７ンコード化ＤＮＡ配列をバチラス　スリンギ
エンシスの外で遺伝子的ニ変更し、それらの遺伝子をク
ローン化し、次いでそれらをバチラス　スリンギエンシ
スおよび／またけバチラス　セレウスｒＭＩＪ胞内に戻
し、そこで前記δ−エンドトキ／ン遺伝子は（同種細菌
宿主系内で）発現され得ることが初めて本発明の範囲内
で今やｉｈｆ能である。
このことは、まず最初に外来クローニング系内で大量の
プラスミド材料を生成し、そして次いでこれを形質転換
によりバチラス　スリンキニンシス内に導入することに
より特異的に調節された方法での遺伝子慄作をバチラス
　スリンキニンシスのゲノムに対して可能であるＣとを
意味する δ−エンドトキンン遺伝子およびこれらの遺伝子の発現
を制御する調節配列を変更する可能性は、ここで特に興
味深い。
キメラ遺伝子の他に、あらゆるその他のギメラ遺伝子構
築物を、本発明の方法を用すてバチラス　スリンギエン
シスおよび／またはバチラス　セレウス細胞内に挿入す
ることもまた明らかに可能である。
従って、例えば本発明の方法を用いて、非コ−ｈ”ｕｒ
アンチセンスＪ　ＤＮＡ　ヲバチラス　スリンキニンシ
スおよび／またはバチラス　セレウス細胞のゲノム内に
挿入し、その結果、前記「アンチセンス」　１）ＮＡの
発現の間に、ｍｌ（−ＮＡが転写され、そｔｒは相当す
る［センスＪ　　１）ＮＡの発現を阻害することが考え
られる。このようにして、ある桃の望ましくない遺伝子
のバチラス　スリンキニンシスおよび／またはバチラス
セレウス内での発現を％）４的に調節された方法で阻害
することが可能である。
１３（コ さらに、改良された生物殺虫剤の調製のだめの改良され
た十分に規定されたバチラス　スリンキニンメス株の調
製のほかに、異種および／または同種遺伝子のクローニ
ング、そして所望の場合には発現のだめの一般的な宿主
としてバチラス　スリンキニンシスを使用することも今
やＩＪＴ能である。
本発明の特定の七して好筐しい実施態様において、新規
遺伝子、そして特に新規グロトキンン遺云子を天然宿主
内、即ちバチラス　スリンギエンシスまたはバチラス　
セレウス内に直接クローン化することが今や初めて可能
である。
イノ「規なプロトギゾン遺伝子の探求において、捷ず最
初にバチラス　スリンギエンシスの遺伝子ライブラリィ
が創られる。
第一段階において、グロトギシン産生性バチラス　スリ
ンキニンシス株の全てのＩ）ＮＡをそれ自体公知の方法
で分離し、そして次に個々の断片に切断する。バチラス
　スリンキニンシス１）へＡは機械的に、例えば剪断力
の作用によるが、または好ましくは適当な制限酵素での
消化により断片化され得る。ＤＮＡ試料の消化は酵素の
選択によって部分的であるが、完全である。
本発明の範囲内で、４次の認識部位を含み、および／ま
たはバチラス　スリンキニンシスＩ）Ｎ　Ａの部分消化
を行う制限酵素の使用が特に好ましく、例えば制限酵素
５ａｕｌＡであるか、Ｃれに制限されない。本発明の方
法において、あらゆるその他の適当な制限酵素を用いる
ことも可能である。
上記の方法で得られた制限断片を次にそれ自体公知の方
法で大きさに従って分離する。ＤＮＡ断片の大きさに依
存した分離は通常り、し分離法、例えばショ糖密度勾配
遠心分離によるが、または電気泳動法、例えばアガロー
スゲル′屯気泳動によるが、またはこれらの方法の組合
せにより行われる。
適切な大きさの断片、即ちそれらの大きさのためにグロ
トギシンをコードし得る断片を含有する両分を集め、そ
して次の工程段階に用いる。
前に分離された断片を１ず最初に標準法を用いて適当な
りローニングベクター内に挿入し、そして次にバチラス
　スリンキニン７スまたはバチラス　セレウス、特にバ
チラス　スリンギエンシスのプロトキシンを含１ない枕
内ニ本発明の形質転換法を用いて１１１接挿入する。
使用されるベクターは、ダラムＩＷ件プラスミド、例え
ば［）ＢＣｌ２、ｐｕＢ＋　１０、ｐＣ１９４または上
で詳細に記載したシャトルベクターのいずれでも良い。
シャトルベクターｐｘｉ２ｏｏＨ後記するが（実施例９
．１参照）、こ贋、け本発明の範囲内で相に好ましい。
適当なベクターは、非常に多くの形質転換されていない
クローンの間から形質転換さｒしたベクター包有クロー
ンの容易な同定を確実にする１）ＮＡ配列を好才しくは
含有する。発現時に容易に選択可能な％似、例えば抗生
物；員耐性を生じる特定のマーカーをコドするＤＮＡ配
列が特に好ましい。ここでは例トシて、アンビンリン、
クロラムフェニコール、エリスロマイシン、テトラサイ
クリン、ノ為イグロマイシン、（１４１１Ｊｊたはカナ
マイシンに対する耐性が記載され缶る。
色素物質、例えばＸ−ｇａｅ（５−ブロモ−４クロロ−
６−インドリル−、！？−Ｄ−ガラクト７Ｆ）をイ」す
る酵素全一！−ドするマーカー遺伝子も壕だ好ましい。
このとき形質転換されたコロ−は、特定の色反Ｌ［１、
により非′１・δに容易に検出され冑る。
エレクト０．１：レーンヨンの後、処理すり、　ｆｃ　
ハゲシス　スリンキニンシス１叩バチラス　セレウス細
胞を選沢的胞子形成培地に移し、そして胞子ノヒ成が充
Ｔする１で１０℃ないし４０℃、好１しくけ２０℃ない
し６５℃、そして勾に２９℃ない１〜６１℃の温ｊ技で
招養する１、胞子形成培地は、ス１り択物質として好ま
し７〈け上記抗生物質の１１！ＩＩを、使用さｔｔだベ
クターに依イメして含有し、そして号だ適当な同化剤、
例えば尊大、アガロ−ス、ゼラチンその他を含有する。
胞子形成の間に胞子形成性細胞の自己分所が起こり、こ
ｉｌばＡａ胞を人工的に帳して開くことを省けるので、
工業的規模の方法において引き続くスクリーニングにイ
］利である。
所望のプロトキシン遺伝子を含有し、そしてそり、らの
天然のプロモーターのｔｆｔｌｌ　＜ｔｍ下で発現され
るクローンにおいて、形成さｈだ結晶タンパク質は培地
に遊離されて入手できる。培地中に遊離されて存在する
これらの結晶タンパク質を次に２例えば膜フィルターま
たｌ”Ｊ：　ｌ１Ｍ当な手段で固に化しイ４１る。適当
な膜フィルターは例えばナイロンまだはニトロセルロー
ス膜である。この種の暎は市販のものを自由に利用でき
る。
この方法で固定化さハた結晶タンパク賀は次に位置が決
められ、そして適当なスクリーニング法で非常に簡単に
同定さえしる。
プロトキシン特異性抗体を用いる免投学的スクリーニン
グが本発明の範囲内で好ましい。免疫学的スクリーニン
グは公知であり、そして例えば３５）Ｙｏｕｎｇ等、１
９８５に眸しく記載されている。タンパク質分子の特定
領域を全く特異的に認識する七ツクローナル抗体の使用
は、本発明１〆１０ の範囲内で特に好ましい。これらの抗体はそれ自体また
は混合物の形態のいずれかで使用され得る。（７かしな
がら、免疫学的スクリーニングのためにポリクローナル
抗血清を用いることももちろん可能である。モノクロー
ナルおよびポリクローナル抗体に基づいた混合物も吐た
可能である、っ バチラス　スリンキニン７スの７０トキシンタンパク質
にダ」するモノクローナル抗体の作製方法は、例えば　
Ｈｕｂｅｒ−ＬｕｋａＸ　（１９８４）および”Ｈｕｂ
ｅｒ−ＬｕｋａｙｃＱ９　（１９８６）に詳しく記載さ
れてｂる。こｈらの方法は捷だ本発明の場合に使用され
得る。
抗体に基づいた免疫学的スクリーニング法は、本発明の
一部である。
バチラス　スリンキニンシスおよび／ｌ＆！１バチラス
　セレウス内の店規な１）ＮＡ配列の位置を決める／こ
めのその他の適当なスクリーニング法を用いることもま
た１４ｉＪらかに本発明の）艶囲内で可能である。
上記の方法を用いて形質転換されたバチラススリンギエ
ンシス及びバチラス　セレウス、並びにこね、らの形質
転換されたバチラス細胞により製造された毒素は、殺虫
のために、時に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ　）、
多列目（１月ｐｔｅｒａ）及び鞘翅目（Ｃｏ１ｅｏｐｔ
ｃｒａ　）の−ノ除のために適している。
従って、本発明はさらに、昆虫またはその生育地を ａ）バチラス　スリンキニン７スに天然に生じるδ−エ
ンドトキシン　ポリペプチドまたはそれらと実質的に同
じポリペプチドをコード化する構築遺伝子を含む組み換
えＤＮＡ分子で形質転換さノ１だバチラス　スリンキニ
ンシス、バチラス　セレウス細胞、またはそれら二つの
混合物で処理するか：捷たはそれでなければ、ｂ）上記
の形質転換されたバチラス細胞により製造されたゾロト
キシンを含む、細）抱を含まない結晶体製剤で処理する
ことからなる昆虫の防除方法にも関する。
本発明は、慣用的に使用される１１↓体、分散剤またけ
担体及び分散剤に加えて、 ａ）バチラス　スリンキニンシスに天然に生じるδ−エ
ンドトキシン　ポリペプチド捷たはそれらと実質的に同
じポリペプチドをコード化する構築遺臥子を含む組み換
えＤＮＡ分子で形質転換きレタバチラス　スリンキニン
シス、バチラス　セレウス細胞、またはそれら二つの混
合物で処理するか；捷たはそれでなければ、ｂ）上記の
形質転換されたバチラス細胞により製造されたプロトキ
シンを含む、細胞を含まない結晶体製剤を含有する殺虫
用組成物をも含む。
殺虫剤としての開用のためには、組み換え体のバチラス
　スリンキニンジス毒素遺伝子を倉む形質転換された倣
生物、好ましくは形質転換さえしだ住き−しいる件たけ
死んでいるバチラススリンギエンシス捷たはバチラス　
セレウス細胞、または、住きている及び死んでいるバチ
ラス　スリンキニンシス及びバチラス　セレウスの混合
物、並ひに上記の形質転換された細胞により製造さｉ′
１．た？＃系タンパク質は、その１捷の形で、或いは好
甘しくは製剤技術で慣用の補助剤と共に使用され、公知
の方法により乳剤原液、直接噴霧可能なまたけ希釈可能
な溶液、希釈乳剤、水和剤、水浴剤、粉剤、粒剤、およ
び例えばポリマー物質によるカプセル化剤に製剤化され
る。
組成物の性質と同様、噴き、散水捷たは注水のような適
用法は、目的とする対象および使用環境に依存して選ば
れる。
さらに、形質転換された生きているまたは死んでいるバ
チラス　スリンキニンシス及ヒ／捷タハバチラス　セレ
ウス細胞並ひに上記の形質転換されたバチラス細胞によ
り装填されるゾロトキシンを含有する細胞を官まない結
晶体製剤からなる殺虫性混合物を部用することもできる
ことが明らかである３゜ 製剤、即ち形質転換された生きている若しくは死んでい
るバチラス細胞またはそれらの混合物及びさらに上記の
形質転換されたバチルス細胞により製造された毒素タン
パク１ｊおよび適当１ｔ１・１ な場合には固体捷たは液体の補助剤を含む組成物捷たけ
製剤は、公知の方法により、例えば有効成分を溶媒、固
体担体および適当な場合には表面活性化合物（界面活性
剤）のような増量剤と均一に混合および／１だけ摩砕す
ることにより製造される。。
例えば粉剤および分散性粉末に使用できる固体担体は通
常、方Ｍ石、メルク、カオリン、モンモリロナイトまた
はアタパルジャイトのような天然鉱物充填剤である。物
性を改良するために、高分散ケイ酸まだは１％分散吸収
性ポリマーを加えることも用北である。適当な粒状化吸
収性担体は多孔性型のもので、例えば軽石、破砕レンガ
、セビオライトまたはベントナイトであり：そして過当
な非吸収性担体は方解石または砂のような物質である。
更に非常に多くの予備粒状化した無機質および廟＠質の
物質、特にドロマイｌ−ｔたは粉状化植物残骸、が使用
し得る。
適当な表面活性化合物は良好な乳化性、分散性および湿
肋件を有する非イ側ン性、カチオン性および／またはア
ニオン性界面活１６［剤である。
”界面活性剤”の用語は界面活性剤の混合物をも含むも
のと理解されたい。
適当なアニオン性界面活性剤は、水浴性石鹸および水溶
性合成表面油性化合物の両名であり得る。
適当な石鹸は高級脂肪酸（Ｃ＋ｏ−Ｃ２２）のアルカリ
金属塩、アルカリ土類金ｈ４　Ｗ、または非置換または
置換のアンモニウム塩、例えばオレイン緻またはステア
リン酸、或いは例えばココナツツ油または獣脂から得ら
れる天然脂肪酸混合物のナトリウムまだはカリウム塩で
ある。脂肪酸メチルタウリン塩、例えば／スー２−（メ
チル−９−オクタデセニルアミノ）−エタンスルホン酸
のナトリウム塩（製炸ｊ中の含廂量が好ましくは約３％
）も捷だ記載されつる。
し７かしながら、いわゆる合成界面活性剤社、特に脂肪
族スルホネート、脂肪族ザルフェート、スルホン化ベン
ズイミダゾールφ導体捷たけアルギルアリールスルボネ
ート、２，４，７．９−テトラメチル−５−デシン−４
，フージオール（製剤中の含有量が約２％）が更に頻繁
に使用される。
脂肪スルホネ−１・才だけサルフェートは通常アルカリ
金属塩、アルカリ土類金属塩或いは非置換または置換の
アンモニウム塩の形態にあり、そしてアンル基のアルキ
ル部分をも含む炭素原子数８ないし２２のアルギル基を
含み、例えばリグノスルホン酸、ドデゾルサルフエート
マたは天然脂肪酸から得られる脂肪族アルコールサルフ
ェートの混合物のナトリウムまたはカルシウム塩である
。こ！１らの化合物には硫酸エステルの塙及び脂肪族ア
ルコールサルフェートの混合物のナトリウムまたはカル
シウム塩である。
これらの化合物には硫酸エステルの塩および脂肪族アル
コール／エチレンオキノド付加物のスルホン酸の塩も含
１れる。スルホン化ベンズイミダゾール誘導体は、好斗
しくけ二つのスルポンを吸糸と８ないし２２個の炭素原
子を含む一つノＪＩＷ　Ｕｊ　ｈ　基トを含む。アルギ
ルアリールスルホ１ｔｉ’７ ｔ１８ ネートの例は、ドブフルベンセンスルホン酸、ジブチル
ナフタレンスルホン酸、またはナフタレンスルホン酸／
ホルムアルデヒド縮合生成物のナトリウム、カルシウム
塩たはトリエタノールアミン塩である。対応するホスフ
ェート、例えば４ないし１４モルのエチレンオギ／ドを
含むｐ−ノニルフェノール付加物のリン酸エステルの塩
も壕だ適当である。
非イオン性界面清＋イ１剤は、好１しくは脂肪族捷たは
脂環式アルコール、捷たは飽和または不飽和脂肪酸およ
びアルキルフェノールのポリグリコールエーテル誘、０
体であり、該訪〃一体は５ない１〜５０個のクリコール
エーテル基、（Ｉｎ７　肪族）炭化水素部分に８ないし
２Ｕ１１Ｉ！１１の炭素原子、そしてアルギルフェノー
ルのアル邑ル部分ニ６ないし１８個の炭素原子音３゛む
。
他の適当な非イオン性界面１１２＋性剤は、ポリエチレ
ンオキノドとポリプロピレンクリコール、エチレンジア
ミンボリフロヒレンク＋）　コ−）ｌｉ　オよびアルキ
ル鎖中に１なりし１０個の炭素原子ヲ含むアルキルポリ
プロピレングリコールトノ水溶性付加物であり、その付
加物は２０ないし２５０個のエチレングリコールエーテ
ル基および１０ないし１００個のプロピレンクリコール
エーテル基を含む。これらの化合物は通常プロピレンク
リコール却位当たり１ないし５個のエチレングリコール
単位を宮む。
非イオン性界ｔｆｕ活性剤の代表例は、ノニルフェノー
ル−ポリエトギソエタノール、ヒマシを山ポリグリコー
ルエーテル、ポリプロピレン／ポリエチレンオギ／ド付
加物、トリブチルフエノキンホリエトキ／エタノール、
ポリエチレングリコールおよ０・オクチルフエノキシエ
トキゾエタノールである。ボリスキゾエチレンノルビタ
ンおよびポリオギ７エチレンノルビクントリオレートの
脂肪順エステルもまた適当な非イオン性界面活性剤であ
る。
カブ−オン性界面粘性剤は、好１しくはＮ−置換基とし
て少なくとも一つの炭素原子数８ないし２２のアルキル
基と、他の置換基として低級非置換まだは・・ロケン化
アルキル基、ベンジル基またけ低級ヒドロキン−ｆルキ
ル基とを含む第四アンモニウム塩である。該塩は好寸［
７くはハロゲン化物、メチル硫酸塩捷たはエチル硫酸塩
の形態にあり、例えばステアリルトリメデルアンモニウ
ムクロリド捷たはベンジル−（２″−ククロロエチル）
エチルアンヤニウムブロミトテある。
製ハリ業界で慣用の界■活性剤は例えば下記の、３８） （」１行物に記載されている゛　　　１９８６　インタ
ナショナル　マクカノチャンズ　エマルシフ了イアーズ
　アンド　アータージエンツ（１９８５Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　Ｍｃ　　Ｃｕｔｃｈｃｏｒ／ｓ　　Ｅ
ｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　　＆Ｄｅ−ｔｅｒｇｅｎｔｓ　
）＋グレンロック　ニューシャーシー州、アメリカ会衆
１ｇ１９８５年；へルムート／コクｒ　ヘ（Ｈｅｌｍｕ
ｔ　５ｔａｃｈｅ　）　、　　”　ｆ　ンジツドタツ−
７ｘ　ンプー７　（Ｔｅｎ５ｉｄ−Ｔａｓｌ＋ｅｎｂｕ
ｃｈ　）’カール　ハンザ−フェルラーク（Ｃ，Ｈａｎ
ｓｅｒＶｅｒｌａｇ　）　、ミ、−ンヘン訃よびウィー
ン、１９８１年。
農薬組成物は通常、形質転換された生きている若しくは
死んでいるバチラス細胞またはそれらの混合物及びさら
に上記の形質転換されたバチルス細胞により製造された
毒素タンパク質０１ないし９９チ、好才しくは０１ない
し９５チ、固体才たは液体補助Ｍ１１９９．９ないし１
チ、好ましくは９９８ないし５％、および界面活性剤０
．１ないし２５係を含む。
市販品は好１しくけ濃厚物として製剤化されるが、消費
４は通常実質的に低濃度の希釈製剤を使用する。
この組成物は１だ他の成分例えば安定剤、消泡ハ１１、
粘度調節剤、結合剤、粘漸付与剤並ひに肥料、または特
別な効果のだめの他の有効成分を含有してもよい。
組み換えバチラス　スリンキエンンス毒素選云子を含有
する形質転換された生きているか若しくは死んでいるバ
チラス細胞捷たはそれらの混合物、並ひに上記の形質転
換されたバチラス細胞により製造されて毒素タンパク質
は、害虫１５］ Ｆ５２ の防除のために非常に適している。ここでは鱗翅目の植
物損傷性の昆虫、特にビニリス（Ｐｉｅｒ１５）科、ヘ
リオラス（Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　）科、スボドグテラ（
５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ）科及びプルテラ（Ｐｌｕｔｅｌ
ｌａ　）科の昆虫、例ｉはヒエリス　プラノシカ（＋）
ｒａｓｓｉｃａｅ　）、へりオチス　ビレッセンス（ｖ
ｉ−ｒｅｓｃｅｎｓ　）、へりオチヌ　ジー（ｚｅａ）
、スボドプテラ　リットラリス（１口ｔｏｒａｌｉｓ　
）　　及びフルテラ　キンロステラ（ｘｙｌｏｓｔｅｌ
　ｌａ　）　　が好ましいとして特記されるべきである
。
上記の殺虫剤により防除されうる他の害虫は栖’ｒ　ｉ
Ｕ目の甲虫、特にハＪ、ゾ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌ　ｉ
ｄａｅｆａｍｉｌｙ　）の昆虫、例えばジアブロチカ　
ランチ’／　ムバンクタタ（Ｄｉａ１）ｒｏｔｉｃａ　
ｕｎｄｅｃｉｒｎｐｕｎｃｔａｔａ）、ジアプロチカ　
ロＯ／ジコルニス（ｋｌ、　ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ　
）、ジアブロチ力　バーシフエラ（１）、　ｖｉｒｇｉ
ｆｅｒａ　）、ジアフロチカ　ウンテンムバンクタタ　
ホワルディ（Ｄ、　ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔｒ＋ｔａ
　ｌｔｏｗａｒｄｉ　）、アジェラスディカ　アルニ（
Ａｇ（シＩａｓｔｉｃａａｌｎｉ　）、レプチノタルサ
　デセムリ不夕（１＋ｅｐｔ蒐ｎｏｔａｒｓａｄｃｃｅ
ｍ１ｉｎｅａｔａ　）　’４、　並ひに多翅目の昆虫、
例えばアノフェシシス　　セルジエンチー（Ａｎｏｐｈ
ｃｌｅｓ　ｓｅｒ−ｇｅｎｔｉｉ）、ウラナテニアウン
キクラタ（ＩＪｒａｎａｉｅｎｉａ　ｕｎｇｕｉｃｕｌ
ａｌａ　）、クレノクス　ウニヴイタトゥス（Ｃｕ１ｅ
ｘ　ｕｎｉｖｉｔｔａｔｕｓ　）、　エジプトヤプ蚊（
Ａｅｄｃｓ　ａｅｇｙｐｔｉ　）、赤家蚊（Ｃｕ１ｅｘ
　ｐｉｐｉｃｎｓ　）等である。
ハチフス細胞捷たけそｉｌらにより製造される毒素タン
パク質の便用Ｊｉ・け、各々の条件、例えは気候朱ｆｉ
、土Ｊ誠条件、４Ｊｔ物／：ＩＦ長及び施用時期に依存
する。
下記の配合実施例において、　ノ（チラノｕ＋１”の用
６１１は、本発明の組み換え）（チラノ　スリンキニン
シス遺伝子を含む７＜チラノ　スリンギエンシス及び／
または）・チラノ　セレウスを意味するものとして使用
さｒｌ、る（数字は全て重に％で示される）。
１（１粒子１リ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ａ）　　　　　　ｂ）Ｆ３．水利剤 ａ） ｂ） Ｃ） カオリン　　　　　　　　　　　　　　　　９４％窩分
散性ケイ酸　　　　　　　　　　　　　　１チアタバル
ジヤイト　　　　　　　　　　　　　−９０％まず最初
に、バチラス細胞及び／または該細胞により製造される
毒素タンパク寅をメチレンクロライドに懸濁させ、その
後、懸濁液を担体上に噴霧し、そして、懸濁液を続いて
減圧下で留去する。
■パ２．１分沖１ Ｆｌ　）　　　　ｂ　） 高分散性ケイ酸 １チ　　　５チ タルク ９７チ カオリン ９０係 その捷ま使用しつる粉剤は担体をバチラス細胞と、及び
／またはこれらの７１４１Ｉ胞により製造された毒素タ
ンパク質と均一に混合することによりイ４する。
リグノスルホン酸ナトリウム ５係 ５％ ラウリル硫酸ナトリウム　　　　　　　３％　　−５％
シイノブ「１ビルナフタレンスルホ ン１ジナトリウム　　　　　　　　　　　　　　　　６
％　１０％副分散ケイ酸　　　　　　　　　　　　５％
　１０係　１０係カオリン　　　　　　　　　　　　　
６２チ　２７係バチラス細胞と及び７またはこれらの細
胞により製造さ１１だ毒素タンパク質を助剤と注意深く
混合し、その後、得られた混合物を適当なミル中で完全
にｄ砕し　水和剤を得る。これは水で希釈することによ
り１９「望のｍ度の懸濁液とすることができる。
Ｆ４　押し出［７粒剤 リグノスルホン酸ナトリウム ２％ Ｆ５５ １　’、５（、ｉ カルボキシメチルセルロース　　　　　　　　　　　１
％カオリン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
８７％バチラス細胞及び／−１だは該細胞により製造さ
れる毒素タンパク質を助剤と混合［７、注意深く摩砕［
７、そして続いて該混合物を水で湿らす。
混合物を押し出し、その後、空気流中で乾燥する。
ポリエチレングリコール２００ ５％ カオリン ９４％ 均一に混合されたバチラス細胞及び／または該細胞によ
り製造される毒素タンパク賀を、ミモザ−中、ポリエチ
レングリコールで湿らせたカオリンに均一に施用する。
この方法で非粉塵性被覆粒剤が得られる。
Ｆ６　　　　Ｆ＠　濁　バ跣　液 エチレングリコール １０％ カルボキシメチルセルロース １％ 水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　５９％本アルキルは好ましくは１０ないし４０、特に
１２ないし１４の炭素原子を有する線状アルキル基、ｆ
ｌばｎ−ドテシルペンセンスルホン酸トリエタノールア
ミン月である。
均一に混合されたバチラス細胞及び／または該細胞によ
り製造される毒素タンパク質を助剤と均一に混合し、水
で希釈することにより所望の濃度の懸濁液を得ることの
できる懸濁原液を得る。
〔実施例および発明の効果〕
以下に本発明の詳細な説明するが、本発明はこれに限定
されるものではない。
１Ｆ３′ン 一般的な組換えＩ）　Ｎ　Ａ法 本発明において用いらノ′シる組換えＩ）ＮＡ法の多く
は当該分野の熟練者にとって決まりきったものであるの
で、これらの普通に用いられる方法の簡潔な記載はそれ
らが以下に示す各々の事実におけるよりもむしろここに
含めら１Ｌる。記載したものを除いて、Ｃれらの決１り
きった操作の全ては３３）　マ＝　アチ７．　（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ　）等（１９８２年）による参考文献内にｄ
［シ載されている。
Ａ、制限エンドヌクレアーゼによる開裂典型的には、Ｄ
ＮＡを反応混合物内に約５０−５００μｇ／ｒｘｌで、
マサチューセソノ、ビバリのニューイングランドバイオ
ラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎ−ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　
）　　社により推奨さｔＬる緩衝液中に入れる。制限エ
ンドヌクレアーゼ２−５Ｊｉ位をＤＮＡ　１μｓにつき
添加し、そして反応混合物をＡｉＪ記の会社により推奨
さｈる温度で１ないし５時間培養する。６５℃１０分間
加熱するかまたはフェノールでの抽出により反応を終結
させ、ｆ−タンールでＤＮＡを沈殿させる。この方法ば
５５ゝマニアチス等の文献の第１０４−１０６頁にも記
載されている。
１３、ブラント末端（ｂｌｕｎｔ　ｅｍｌ　）を製造す
るだめのＩ）　Ｎ　Ａのポリメラーゼでの処理ＤＮＡ断
片を反応混合物に５０−５００１ｔＱ／ｎｌで、ニュー
イングランド　バイオラプス社により推奨される緩衝液
中に添加する。反応混合物−二全ての４（虫のチオキシ
ヌクレオチドトリホスフェ−１・を０．２ｍＭの濃度で
含有する。反応は１５℃で６０分間桁、ｊべされ、そし
て次に６５℃に１０分間加熱するＣとにより終結される
。５′突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例え
ばＥｃｏｌ、ＬＩおよびｌｊ　ａｍ　Ｉ−］　Ｉでの消
化により製造される断片のためには、ＤＮＡポリメラー
ゼの大断片捷た（ｄクレノー（ｆ（ｌｅｎｏｗ　）断片
が使用さｔする。５′−突出末端を製造するエンドヌク
レアーゼ例えばｐｓｔ　Ｉ　Ｌ・よひＳａｃ■により製
造される断片のためには、’Ｌ’　４　ＪＪＮＡポリメ
ラーゼが使用される。これらの２つの酵素の使用はマニ
アチス等の文献の第１１３−１２１頁に記載さｉｔてい
る。
Ｃアガロースゲル電気泳動およびゲルからＤＮＡ断片の
程製 アガロースゲル電気泳動を３３）マニアチス等の文献の
第１５０−１６３負に記載のように水平型装置で行なう
。使用される緩衝液はその中に記載されているトリス−
硼酸塩緩衝液である。ＤＮＡ断片は電気泳動の間にケル
およびタンク緩衝液に存在するが、または電気泳動に続
いて冷加されたいずれかの０５μｙ１ｍｌ　共化エチジ
ウムて゛の染色により視覚化す心。１）ＮＡを短波畏才
たは長波長の紫外線の照射により視覚化する。断片をケ
ルから分離する場合には、使用されるアカロースは低い
ゲル化温度のものであり、こｆｌはミズーリ　セントル
イスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ　ｃｈｅｍｉｃａｌ
　）からイ４１られる。　電気泳動後、望ましい断片を
削シ取り、プラスチｌり管内に入れ、約１５分間６５℃
に加熱し、次いでフェノールで５度抽出し、エタノール
で２度沈殿すせる。この方法は３３）マニアチス等の文
献の第１７０頁に記載さねたものとはわすかに異ってい
る。
さもなければ、ＤＮＡ　Ｉｄ、　”　Ｇｅｎｅｃｌｅａ
ｎ　Ｋｉｔ’（Ｂｉｏ　１０１　　Ｉｎｃ、、　Ｌａ　
Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ、　ＵＳＡ　）　　により、アカロ
ース　ゲルから単離されつる。
Ｄ　、　　Ｉ）　Ｎ　Ａ断片からの５′末端のポスフェ
ートの除去 プラスζドクローニング工程の間に、ベクタプラスミド クターの再循環化′１ｆ：減少させる（マニアチス等の
文献の第１３頁に記載されている）。適当な１ｂ１１限
エンドヌクレア−ヒで］）　Ｎ　Ａを消化した後、イン
デイアナ州，インティアナポリスのベーリンカー−　−
７　ンハイＡ　（　Ｂｏｃｌ＋ｒｉｎｇｃ＋　ＪＪａｎ
ｎｂｅｉｍ　）がらイ仔られる仔つ／消化管のアルカリ
ポスファタゼ１単位を冷加する。Ｌ）ＮＡを３７℃で１
時間培養し、そして次いでフェノールで２度抽出し、そ
してエタノールで沈殿させる５ Ｅ，ＤＮＡ断片の連結 相補的な付右端を有する断片を結合させる場Ｇ１ 合、各々の断片ムＺＪ＋００ｎｇは、ニュイングランド
バイオラフ゛スからのＴ４ＤＮＡリカーセ約０２単位を
この会社により推奨される緩衝液中に含有する２０−４
０μｌの反応混合物中で培養される。培養は１５℃で１
−２０時間行なう。　フラソンー末端を有するＤＮＡ断
片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡＩＪカーゼの
童を２−４単位に増加させる以外は上記と同様に垢養さ
ｔしる。
Ｆ、ＤＮＡの大腸菌内への形質転換 大腸菌ｌｌＢ１０１株が多くの実験に使用されている。
マニアチス等の文献の第２５０−２５１負ニ記載されて
いる塩化カル／ラム法を用いて］）ＮＡを大ｌ＃ｊ菌内
に導入する。
Ｏ，プラスミドのだめの大腸菌のスクリーニング 形質転換に続いて、大腸ＧＩの生成したコロニを、ラビ
ンドプラスミド（ｒａｐｉｃｌ　ｐｌａｓｍｉｄ　）分
離法により所望のプラスミドの存在を求めてスクリーニ
ングする。２ｗｉの慣用の方法はマニアニチス等の文献
の第３６６−３６９頁に記録されている。
１−１．プラスミドＤＮＡの大規模な分離大腸菌内の大
輪のシラスミドを分離するだめの方法は、マニアゲス等
の文献の第８８−９４頁に見い出される。
Ｌｉｔ培地 トリプトン イースト抽出物 ＮａＣ／ 牛肉抽出物 イースト抽出物 ペグトン グルコース Ｎ　；Ｉ　（、”　Ｉ Ｋ　２１−Ｉ　Ｐ　Ｏ４ Ｋｌ−１、、Ｐ　Ｏ。
五６８ １６；３ ＳＣＧＹ培地 カヤミノ（ｃａｓａｍｉｎｏ　）酸 イースト抽出物 グルコース に２ＨＰ０４ Ｋｌ−１２ＰＯ４ Ｎａ３−クエン酸 （ＮＨ４）　２　Ｓ　０４ Ｍｇ５Ｃ１４・７Ｈ２０ ＣＦｌ／ｌ　Ｊ Ｃｐ／ｌ　） ＩＬ５ ０．２ ０．０８ ブの前に、ｐＨを１６に合わせ サッカＬコース Ｍ　ｇ　Ｃ／’　。
リン敵地緩衝液 グルコース イースト抽出物 （ＮＨ４）、８０４ に２）（ＰＯ４ ＮｇＳＯイ・７１−Ｊ、０ ＣａＣ１２−２Ｈ２０ Ｍｎ　８０４　、Ｈ２Ｏ オートフレ る。
’ｌ’ｗｅｅｎ　２０ｈ　　　　　　　　　　　　　　
　　０．０５　％（Ｗ／Ｖ） Ｔｒｉｓ／ＨＣ／市（ｐＫａＯ）　　　　　　　　　　
　　１ＯＮａＣｚ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１　ｓ。
＊　’［”ｗｅｅｎ　２０　　　ポリエトキンノルビタ
ンラウレート ＊ｌＪ１月ｓ／ＨＣｌ！：　　α　α　α−トリス（ヒ
ドロキシメチル）メチルアミン塩酸 ｊ温 オースランズフ了ソスング（ｔｈｅ　Ａｕ５ｌａｎｄｓ
ｆａζｓｕｎｇ　）　（外ｊａｉｌの提出書類）におい
て、浚先権証明曹におけるプラスミドを目的として選ば
れた内部参考ｐｋは、公的に認めら？＋だ参考ｐＸ■で
置き換えられている。
捷だ、実施例において便用される無胞子性のバチラス　
スリンキニン／ス１．４　Ｄ　ｉミュータン１に５ １６（： トのだめの指定はＣｒｙβからｃｒｙ　Ｂに変更されて
いる。
実施例ｔ　１：　ＬＢ培地１０ａ＋ｊ（）リプトン１０
ｇ／ｅ、イースト抽出物５　ｇ／ｌ　、ＮａＣ／　５　
ｇ／ｌ　）に、ｋｕｒｓｔａｋｉ　１（Ｄ　１　ｃｒｙ
　Ｂ　（”　５ｔａｂｌｙ　Ｄ、ｌ’、ｃｔａｌ、、１
９７８）　　種のバチラス　スリンギエンシス、　ｋｕ
ｒｓｔａｋｉ　ＨＤ　１　　種のバチラス　スリンギエ
ンシスのプラスミドを含まない神を接種する。
このバッチを、ロータリーシ丁−カーを５０回転／分で
用いて、２７’Ｃの温度で一晩インキーベートする。続
いてバチラス　スリンキニンシス培養液をｉｏｏないし
４００ゴのＬＢ培地中で１００倍に希釈し、さらにロー
タリー７エーカーを２５０回転回転室用いて６０℃の温
度で、光学的濃度（ＯＤ　５５０　）が０２に到るまで
培養する。
細胞を遠心分離により採取し、氷冷した１）　ｌ：３　
Ｓ緩衝液（サッカＤ　−：１．４００　ｍＡＩ、ｆｖ１
ｇｃＪ２１　ｍＭ　。
ｐＨ６，０のリン酸塩緩衝液７　ｒｎＭ　）　１／４０
　量に愁濁する。遠ノし分離及び採取したバチラス　ス
リンギエンシス細胞のｆ）　Ｂ　Ｓ緩衝液への懸九をさ
らに１回繰り返す。
この方法で＋ｉｉＪ処理した細胞は直接、才だけグリセ
リンを緩衝液に冷刀口〔２０チ（Ｗ／Ｖ）ＩＬだ後、エ
レクトロポレートすることができ、−２０℃ないし一７
０℃で貯蔵され、陵に適当な時期に使用さｒする。
その後、氷冷しだ細胞のアリコード８００μｌを予じめ
冷却したクヴエ・ノドに移し、続いてｐＢＣ＋６プラス
ミドＪ−）ＮＡ　（４０）Ｂｅｒｎｈａｒｄ　Ｋ、　ｃ
ｌａｌ、、　　１９７８　）　（２０μｉ／ｍ１）　　
を添１）ＩＪ　Ｌ、そり、でバッチ全体を４℃で１０分
同インキーベートする。
深く丑で凍結した訓胞月料を使用する場合、凍結した細
胞の適当なアリコードを最初に氷中１だは室温で俗解さ
せる。他の処理は、新しいＩＩ　ＩＬＬ’材料のために
用いられる方法と同様である。
その佼、クヴエノトをエレクトロポレーション装置に入
れ、懸濁液中に存在するバチラス１（Ｊ−（ スリンギエンシス細胞を、コンデンッーーのンングル放
電（ｓｉｎｇｌｅ　ｄｉｓｃｈａｒｇｅ　）からのαｉ
　ｋＶ　　なイｌ、２．５ｋＶの電圧の作用によりエレ
クトロポレトする。
使用されるコンデンサーは２５μＦの容量を有し、クヴ
エノト内の旺極間の距離は０．４　ｃｍ−′Ｃあり、Ｃ
れにより、放電が生じると、電場の強さｄ］セツティン
グに依存して、初期ピーク値が０、２５　ｋＶ／ｃｒｎ
ないし６．２５に■／Ｃ１ｎであり、指数的に減少して
いく。指数崩解時間は１０ｒｎｓないし１２　ｍｓの範
囲にある。
上記のエレクトロポレーション実験には、例えばｔｈｅ
　ｆｉｒｍ　１３ｉｕ　１（、ａｄからのエレクトロボ
レーシー１ン装置（”　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ　Ａｐ
ｐａｒａｔｕｓ　’　、　＃　１６５−２０７５　、　
Ｂｉｏ　Ｒａｄ、　１４１４　Ｈａｒｂｏｕｒ　Ｗａｙ
　５ｏｕｔｈ。
几ｉｃｈｍｏｎｄ　、　ＣＡ　９４８０４　、　ＵＳＡ
　）が使用されつる。
本発明の方法において、他の適当な装置を使用すること
もできることは明らかである。
４℃でさらに１０分間インキュベーションした後、細胞
懸濁液を１．２　ａｔのＬＬ３培地で希釈し、その後ロ
ータリーシェーカーを２５０回転回転室用いて３０℃の
温度で２時間インキュベートする。
その後、適当な希釈液を、ふ加削として新しく得られた
プラスミドの選択に適する抗生物質を含有するＪ、ＪＢ
寒天（寒天で固化きれたＬＢ培」也、１５　ｉ／ｌ　）
、上に延べる。ｐＬｌｃ１６の場合、これはテトラライ
クリンであり、培地中に２０ｍｙ／ｌの潤度で冷加され
る。
バチラス　スリンギエンシス１−ＩＤ　１　ｃｒｙ　１
３　及０：ｐ　１３　Ｃ”、　＋　６について達成され
る形質転換頻度を、プレート間に示さ′ｉ′Ｌだ距離に
対して適用される初」υｊ電圧の関数として、第１図に
再現する。
仲人さｔｌ−たｊＪＮＡの発現は、テトラサイクリン耐
性の発現により検出されつる。バチラス　スリンギエン
シスへのｐｌＪｃ　１６の形質転倶による尋人後、２時
１４で、新しく導入されたデトラサイクリン再ｊ性の完
全な表現型の発現が生ずる。
（第２表参照） 実施例１２　バチラス　スリンキニンシスの細１（ｉ！
１ １′ン（） ｍ　ノ形’］　＆　換１ｄ、、エレクトロボレーション
ニ供される細胞懸濁液の量を４００μｌにする以外は実
施例１．１に記載したのと全く同じ方法で実施する。
この方法により、形質転換頻度はファクター１０により
増加しうる。
転換 試験のほとんどは、バチラス　セレウスの天然に生じる
プラスミドであるプラスミドｐ　Ｂ　Ｃ１６で行なわれ
る。しかしながら、さらに、他の天然に生じるシラスミ
ド、例えば１）ＬＩｉ３１１０（２”）Ｐｏｌａｃｋ　
Ｊ、　ａｎｄ　Ｎｏｖｉｋ　Ｒ，Ｐ、、　＋　９８２　
）　、　　ｐＣ１９４（２４）Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　
　Ｓ、ａｎｄ　Ｗｃｉｓｂｌｕｍ　Ｂ、　、　１９８２
）及びｐ　ＩＪ４１３　（２６）Ｍａｈｌｅｒ　Ｉ、　
ａｎｄ　ｌ−１ａｌｖｏｒｓｏｎ　１１，０゜１９８０
）（第３表参照） 一介だ、天然の単離体よりも組み換えＤＮＡと作用させ
るのに適するこｉ′１．らのシラスミドの変種、例えば
バチラス　サブチリス（１３，５ｕｂｌ山Ｓ）クローニ
ング　ベクターｐ１３１）　６４　（”７）Ｇｒｙｃｚ
ａ＋＋’１’、　ｃｌ　ａｌ、、　１９８０　）及びプ
ラスミドｐＵＤ３４７ｐＢＤ３４８及びｐＵＦ３１６６
４（第５表６照）：シラスミドｐＢＤ３４７、Ｉ）　Ｂ
１ノ′５４８及びｐ　［Ｊ　Ｂ１６６４（第６表参照；
プラスミドｐ１３Ｄ　３４７　。
１）　ＢＩ）３４８及びｐＵｋ：３１６　＋！＋　４は
Ｉ）ｒｊへ’、　５ｃｈｕｒｔｅｒ　。
ＣＩ　ＢＡ　−（ｊＥ　Ｉ　Ｕ　Ｙ　ＡＧ　、　Ｂａ５
ｔｅ　　から得られる）が、本発明の方法を用いて形質
転換によりバチラス　スリン−Ａ−」−ンシス菌神１−
１１＋　１　ｃｒｙＢに尋人することができる。
第３−ｉ＜の形質転換の結果により、本発明の形質転換
方法を用めると、１史用したプラスミド１’ｌ　Ｎ　Ａ
に関係なく、一つの例外を除いて全ての形質転換阿４１
．ＩＪＩが１０５ないし１０７の・組曲内となることが
明らかに示される。
大腸菌及びバチラス　サブチリスのだめの現存（’）　
三官能ｔ＜Ｉベクタ−１例工ばｐ）ｉＶ　６３　（”）
１’ｒｉｒｎｒｏｓｅ　　Ｓ、　　Ｈ，；＋ｎｄ　　Ｅ
Ｉ＋ｒｌ　ｉｃｈ　　Ｓ、１）、、　　　Ｐｌａｓｍｉ
ｄ　、　　６１９３〜２０１．１９８１）　Ｉ″ｉ、バ
チラス　スリンキニンシスＨ１，ｌ　１　ｃｒｙ　Ｂ（
第５表参照）のだめには適していない。
有力な二官能性ベクターの構築のために、−まず、ｐＢ
ｃ１６の大きなＥｃｏｌ（、Ｉ断片を’１’４１）ＮＡ
リカーゼを用いてシラスミドｐＬＪｃ８のＥｃｏＲ１部
位に導入する（　２８’　Ｖ　１ｃｉｒａ　Ｊ、　ａｎ
ｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ　。
１９８２）。その後、Ｅ、Ｃｏ１１訓胞をこの構築物で
形質転換する。制限分析により正しいと理解される構築
物をｐＸｉ６２とする。
その後、続いてｐ（ＪＣ８ボＩＪ　ＩＪンカー領域から
末端に位置するＥ　ｃｏ　ｆ（、Ｉ開裂部位の除去が行
なわｔする。結合力のめるＥｃｏ）目末端ｄクレノウ（
ｋｌｅｎｏｗ　）ポリメラーゼで処理され、再びＴ４Ｌ
）ＮＡリカーセで結合さＪ土る。　形質転換によるＥ、
ｃｏｌｉへの導入の後、Ｈｒｌｌ限分析により正しいと
理解される構築物が選択され、１）Ｘ１６１と定めら才
１、る。Ｉ）ＸＩ　６１を１回だけ開裂する制限酵素の
開裂部位を有するｐＸＩ６＋のマッシをｌ・ｌ　１ｇ６
に示す。
この構築物は実施例１に記載し７た形質転換方法ヲ用イ
てバチラス　スリンキニンシスＨＤ１ｃｒｙＢ［直接梼
入されうる。
バチラス　スリンキニンシスｇｔの強力な制限バリアの
だめ、Ｅ、ｃｏｌｉ起源のｐＸＩ　６１１ＪＮＡを用イ
／こ場合）形質法４％　率ｆ＜１、バチルス　スリンキ
ニンシス）Ｈ，）　ｉ　ｃｒｙ　Ｂ　（第３表参照）起
源の７ラスミド１）へＡを用いた場合より低い。それに
もかかイ）らず、ｐＸＪ　６１　＆：ｌ：バチルス　ス
リンギエンシスにおけるりｌ］−ニンク実験を行なうた
めに非常に適することが証明されている。
本発明の範囲内でバチラス　スリンキニンシス及びバチ
ラス　セレウス内の挿入及び発３Ｊｔに使用されるクル
ートル　デルタ−エンドトキシンタンパク質のだめのＤ
ＮＡ配列コードはプラスミドＩ）ＩＮ３６由来である。
該シラスミドｐｂ、３６は、時計を受りる１的のための
低生物の寄ｉｉＬの１”７：３ １’７４ 囲障的承認に関するブタベスト条約の要求に従って、国
際的寄託機関として承認されているドイツ連邦共和国の
ｔｈｅ　Ｉ）ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏ
ｎＭ　ｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｃｎに、１９８６年５
月４日に寄託されている。
δ−エンドトギシン遺伝子を同定及び単離するだめの方
法及びシラスミド１）ｌ（３６を構築するだめの方法の
詳細な記載は、ヨーロッパ特許出願ＥＰＯ２３８４４１
に宮捷れておす、参考として本発明の一部を構成する。
ｐＫ　３６ンラスミドＤＮＡは制限酵′ＡＰｓｔ　１及
びＢａｍＨｌで完全に消化され、クルートル　チルター
エンドトキシン遺伝子（式Ｉ参照）を含む４．３ｋｂが
アカロースクールから単離される。
その後、この断片は予じめｐｓｔｌ及びＢａｒｎ　Ｈ１
で消化し、ウシの冑からのアルカリホスファタゼで処理
されたＩ）ＸＩ６１に挿入される。　１シ。
ｃｏｌｉ　Ｈｆ３１０１の形質転換の後、制限分析によ
りＩＥし７いと理解される構築物を単配し、こｒＬをｐ
ＸＩ９５と定める。Ｉ）ＸＩ　９３の制限マツプを第７
図に再現する。
ｐＸＩ９３は２つの異なった方法でパテラススリンキニ
ンメス）１１）　１　ｃｒｙ　Ｂに導入さｈうる。
ａ）バチラス　スリン４−エン／ス細胞は、実施例１に
ｄじ叔した本発明の形質転換方法を用いて、Ｅ、ｃｏｌ
ｉのｐＸＩ　９３単離体で山接刑質転換される。
ｂ）ｉｆ、ｐＸＩ９１ｉ形質転換により、Ｃｈａｎｇａ
ｎｄ　Ｃｏｂｅｎ　、　１９７９に記載し７たように、
バチラス　サブチリスにｍ人する。形質転換体に含寸れ
る完全なその壕１のｐＸＩ９３プラスミドＤＮＡを単離
し、その後、実施例１に記載されたエレクトロボレーン
ヨン方法を用いて、形質転換にヨリバチラス　スリンキ
ニンシスＨＤ　１　ｃｒｙＢに？導入する。
どちらの方法によっても、制限分析により確認しうる損
わ１１ていないＩ）Ｘ１９３を言む形質転換体を借るこ
とができる。
バチラス　スリンキニン７スｌ［）１ｃｒｙＢ。
Ｈ１）　１　ｃｒｙＢ　（ｐＸＩ　６１　）、ＨＤ　１
　ｃｒｙＢ　（ｐＸＩ９３　）及びＨ１）１の胞子形成
性培養液を、位相差顕微鏡により、４００倍で比較する
。典型的なパイビリミダ／ｌ／　（ｂｉｐｙｒｉｍｉｄ
ａｌ　）タンパク質の結晶は、ｐＸＩ　９５を含む菌及
びＩ］Ｄ１の中でのみ検出することができた。同じ培養
液からの抽出物は、Ｓ　１）　Ｓポリアクリルアミドケ
ル上、電気泳動により分離される。クルートル遺伝子性
成物に相当する１３０，０００　ダルトンのクンバク質
の帯は、プラスミドｐＸＩ９３を含む菌及び１」Ｄ１内
のみに、ゲル上で検出することができた。（第８ａ図） ウェスタンプロット分析（第８ｂ図）において、この１
３０，０００　ダルトンのクンバク質及び４２）　　　
　　　　　　　　　讐 その破壊生成物は、　　Ｈｕｂｅｒ−ＬｕｋａｃＨ，、
１９８２に記載された方法に従って、バチラス　スリン
キニン７スのクルスタキｌ−１１）１ｆｉの結晶性タン
パク質に対して予じめ製造されたポリクローナル抗体と
特異的に反応する。この方法の詳細な説明は、ヨーロッ
パ特許出ＭＥＰ２３８４４１　　に記載されており、こ
れは参考として本発明の一部を構成する。上記の胞子形
成依存性タンデムプロモーター（ＷｏｎｇＩ−１，（’
、ｅｔａｌ、、１９８３）を含Ｏｉ　５６　Ｂ＋）　］
）ＮＡ領域は、プラスミドｐｘｒ９６の毒素−コード化
領域の上流側に位置する。
この配列は、チルターエンドトキシン遺伝子のバチラス
　スリンギエンシスＨＤ　１　ｃｒｙＢ及びバチラス　
セレウス５６９に内での商い発埃のために適している、
。
バチラス　スリンキニンシス１−ＩＤ１ｃｒｙＢとＨＤ
　１　ｃｒｙＢ　（ｐ、ＸＩ　９３　）を胞子形成培地
（ＣＩＹＳ培地）中、２５℃で培養する。胞子形成が完
了したら、位相差顕微鏡を用いてｉＷＪべ、胞子及びプ
ロトキシン結晶（もし存在すれば）を遠心分離により採
取し、そして噴き乾燥する。得られた粉末なへりオチス
　ヴイレノセンス（１−１ｃｌ＋ｏｔｌ＋ｉｓ　ｖｉｒ
ｅｓｃｅｎｓ　）　（ｔｏｂａｃｃｏ　ｂｕｄｗｏｒｍ
　）のＬ−１１゛７７ １′７８ 坑虫の餌と種々の濃度で混合する。６日後に幼虫の死出
率を確認する。
期待したとおり、プロトキシン遺伝子フリーｆ４４　Ｈ
ｌ−）　１　ｃｒｙ　Ｂはへりオチス　ヴイレノセンス
に対しては非−毒性であり、一方、グラスミドｐＸＩ　
９３で形質転換された菌はへりオチス　ヴイレ・ノセン
スの投与依存殺虫を引き起こす。これは、エレクトロポ
レーション法により製造された組み換え菌がバイオ殺虫
剤として実際に使用しつることを示している。
の ラスＨＤ１ｃｒｙＢのため形質転換の方法を他の菌にも
適用することができる。
全ての試験したバチラス　スリンキエンンスクルスタキ
種のｌ１ｌｄ、この方法によシ非常に簡単且つ有効に形
質転換されつる。
バチラス　セレウスの実験用ｕ１についても、優れた形
質転摂頻吸が達成さバーうる。同様に、他の試験された
バチラス　スリンキニンシス種（イスラエレンンス棟、
クルスタキ種）にも適用さ１しる。対照については、エ
レクトロボレションによるバチラス　ップチリスの形質
転換は非常に少ない。
万、バチラス　サブチリスのだめのノ“ロトグラストー
依存性ＰＥＣ１法を用りると、４％１０６／μｇプラス
ミドＤＮＡの形質転換率が達成される。
エレクトロボｌ／−／ヨン技術を用いて得うレるバチラ
ス　“丈ブチリスの低い形質転換率は、パラメーターの
選ｎ−＜の誤まや、例えば不適当な電圧や、電気パルス
により引き起Ｃされる高す死出率とは関係がなく、この
Ｃとは第９図により示されつる。
転換 ＨＩ制限開裂部の直接の挿入 プラスミドｐｉｗｉ’ｌ’ｈｓからのβ−カラクトトル
ーゼ遺云子（Ｄｒ　、　Ｍ、　Ｇｅ１ｓｅｒ　、　Ｃ：
　Ｉ　ＢＡ　−ＧＥＩＵＹＡ（）　、　Ｂａ５ｌｅ　、
　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄから得られる）がバチルス　
スリンギエンシスのクルートルδ−エンドトキシン遺伝
子のプロモーターに連結しつる以前に、最初に、ＡＵＧ
開始コドンの領域に位置しているプ「１トキノン遺伝子
の］）　Ｎ　Ａ配列が変形されなければならない。
この変形はオリゴヌクレオチド−直接ムタゲンシスによ
り、その遺伝子の５′領賊を含むδエンドトキシン遺伝
子の、１．８４＜、１３　Ｈｉｎｃ、　ｌ　−Ｈｉｎｄ
■断片を含有する一重鎖フ了−ジＭ　ｉ　５　ｍｐ　８
を用いて行なわれる。
捷ず、シラスミドｐ４＜−３６（実施例４診照）５μｇ
を制限酵累月１ｎｃｌ　ＩＩ及び１１ｉｎｃ　ｌｌで消
化する。
得られるｔａｋｂの断片はアカロースヶルエレクトロフ
ォレンスにより精製され、その後ゲルがら単離される。
こノ′１と１どイ１して、Ｉ’ｖｌ　１３　＋Ｔ〕Ｉ）
　８　Ｈ，Ｆファージ１−）Ｎ　Ａ（Ｕｉｏｌａｂ、Ｔ
ｏｚｅｒ　１（ｏａｄ、　Ｂｅｖｅｒ１）＋ＭＡ、　　
Ｄ１９１５゜ＵＳＡまたは他の製造業者）を制し酵累Ｓ
ｍａ　ｌ及びＩ−］ｉｎｄ　ｌ　　ｆ消化し、フェノー
ルで処Ｊ里し、エタノールの添カロにより沈殿させる。
この方法により処理されだファージＤＮＡをｉｉ」もっ
て単＃ｌ　したプロトキシン断片２００ｎｇと混合し、
Ｔ４１ｊＮＡリガーゼのイ５刀Ｈに、［りそこに）上納
する。
Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　ｉ　０３σ）トランスノエクン
ヨンの後、６個の白色のプフークが選択され、ＩＬ１］
限マリピングにより分析される。
β−ガラクトゾターゼ遺伝子とバチラス　スリンギエン
シスのクルートルδ−エンドトキシン遺伝子のプロモー
ターとの間の連結が正確に行なわれている分離が選択さ
ｔし、Ｍ　１３ｍｐ　８　／Ｈｉ　ｎｃ　−Ｈｉ　ｎｄ
として指定びノＬる。
下記の配列 （Ｅ＋’）ＧＴＴＣ（）ＧＡＴ’ｌ”（）０（）Ａ’ｌ
ｌ’（’Ｃ八へ］’ＡＡＵ（３’）を有するオリゴヌク
レオチドが１．）　Ｎ　Ａ合成装置（Ａ　Ｐ　Ｐ　Ｊ、
１ｊづｌ＋　　　ＢＪ（ＪＳＹＳＴ　トルＡ４　　１〕
ＮＡ　　５ＹＮＴＩＪＥＳＩＺＥＩＩ・２）を用いて合
成される。
１パ１ １８；２ この合成オリゴヌクレオチドは、クルートルさ一エンド
トキンン遺伝子（式Ｉ参照）の１５３位ないし１７３位
に広がる領域におけるＩ’ｖＮ３ｍｐ８／山ｎｃ　−Ｈ
ｉｎｄ　ＤＮＡに対して補足的である。
しかしながら、上記に記載されたオリゴヌクレオチド配
列は、配列Ｉに記載した配列に比べると、１６２位と１
６６位とに”ミスマツチ”を有し、従って、Ｂａｍ　Ｈ
Ｉ開裂部位の形成が必要となる。突然変異の誘発のだめ
の一般的な方法は、Ｊ、Ｍ、　Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　
Ｍ、Ｓｍ１ｔｈにより記載されている（　４３）Ｊ、　
Ｍ、　Ｚｏｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｂ　；　
１９　）。−重鎖Ｍ　１５　ｍｐ　１８　／Ｈｉｎｃ−
Ｈｉｎｄ　ｐｈａｇｅ　ＤＮＡ約５　Ａｌｌをホスホリ
ル化オリゴヌクレオチドトリホスフェート０５μｇと、
総容址４０μｇで混合する。
この混合物を６５℃で５分間加熱し、最初に５０℃１で
冷却し、その後、徐々に４℃１で冷却する。その後、緩
衝液、ヌクレオチドトリホスファクーゼ、Ａ’ｌ’　Ｐ
Ｔ　４　ＪＪＮＡリカーゼ及びＤＮＡポリメラーゼの大
きな断片を冷加し、バッチを記載された方法で１５℃で
一晩インキュべ一卜する（　　　Ｊ、　Ｍ、　Ｚｏｌｌ
ｅｒ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈ　）。
アカロースゲルのエレクトロフォレシスの後、環状の二
重鎖ＤＮＡを精製し、トランスフェクンヨンによりす、
ｃｏｌ＋露１ＪＭ１０３に１中入する。
さもなければＥ、ｃｏｌｉ作、ｉＪ’Ｍ１０７を使用す
ることもできる。
得られたプラークは、３２）Ｐで標識されたオリゴヌク
レオチドとハイブリッド化する配列についで試験さｒす
る。ファージはＤＮＡ制限エンドヌクレつ′−ゼ分析に
よ、って試験される。
Ｂａｒｎ　）Ｉ　Ｉ開裂部位がグロトギ７ン遺伝子の最
初のＡＩＪＩＪコドンの前に直接位置している正確な構
築物を含むファージはｆｖｌ　１３　＋７１ｐ８　／ｌ
旧＋１ｔ’Ｈｉ　ｍｌ　／　１３　ａｍと指定される。
」８；イ ＆２１．δ−エンドトキ７ンプロモーターは、Ｍ　ｉ　
３ｍｐ　８／Ｈｉｎｃ−Ｈｉｎｄ／ＢａｍファージＤＮ
Ａの１６２Ｂｐ　Ｅｃｏ　Ｒ１／Ｂａｍ　Ｈ１断片上に
ある。ＲＦファージＤＮＡは制限酵素ＢａｍＨＩで消化
される。
５′末端に生じるプロジェクション（ｐｒｏｊｅｃｔｉ
ｏｎｓ　）は、製造業者の指示に従って、　ムング　ビ
ア　（Ｍｕｎｇ　Ｂｅａｎ　）　”ヌクレアーゼ（Ｂｉ
ｏｌａｂｓ　）　　で処理することにより除去される。
続いて、　ＤＮＡを制限エンドヌクレアーセＥｃｏＲＩ
で消化し、そしてアガロースゲルエレクトロフォレシス
ヲ実施した後、１６２Ｂｐ断片をアガロースゲルがら単
離する。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子をプラスミドｐ　ｉＷｉ　
Ｔｈ　５から単離する。ｐ　１ＷｉＴｈ　５　ＤＮＡを
、まず、シングルＢｉｎｄ　［１開裂部位で開裂させる
。〈はんり３′−末端はＤＮＡポリメラーゼのフレノウ
断片（！′３）Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１
９８５　、　ｐａｇｅ　１１３−１１４）を用いて製造
され、その後、変性されたＤＮＡをを制限酵素Ｓａｌ　
Ｉで消化する。β〜ガラクトトルーゼ遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片はアガロースゲルエレクトロフォレシスによ
り単離される。
ベクターｐＸＩ６１（実施例５参照）は制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳａｌ　Ｉで消化し、前もって単離された断片
をベクター１）ＸＩ６１に挿入する。
このＥ−ｃｏｌｉ菌Ｈ１３１０１またはＪＭ１０７中の
連結混合物の形質転換の後、正確に連結されたクローン
を、制限分析及びそれらのβ−ガラクトシダーゼ作用に
より、染色物質Ｘ−ｇａｌ（５−プロモー４−クロロ−
３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド）について選択
する。正確な遺伝子構築物を含むクローンをｐＸＩ８０
と指定する。
ａ２２．別の実施例において、δ−エンドトキンン７０
モーターを含有する１　６２　ＢｐＥｃｏ　Ｒ１／Ｂａ
ｍ　ＨＩ断片を、Ｍ　１３ｍｐ　８／Ｈｉｎｃ−Ｈｉｎ
ｄ／ＢａｍのＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩによる開裂し、
その後、ゲルエレクトロフォレシスにより分離すること
により単離する。
β−ガラクトシダーゼ遺伝子も、この例にお］８５ いてプラスミドｐ　ｉＷｉ　Ｔｈ　５から単離される（
実施例ａ１参照）。この場合、プラスミドＤＮＡは制限
酵素ＢａｍＨＩ及びＢｇｔ　ｎで消化され、ゲルエレク
トロフォレシスの後、大きな断片をアガロスケルから溶
離する。
市販品として得られるベクターりＨＹ５００　ＰＬＫ（
すＰＨＹ−００１；　Ｔｏｙｏｂｏ　　Ｃｏ、、Ｌｔｄ
、、　　２−８　ＤｏｊｉｍａＨａｍａ　２−Ｃｈｏｍ
ｅ　、　Ｋｉｔａ　−Ｋｕ　、　０ｓａｋａ　、　！Ｍ
＋ＯＪａｐａｎ　）（実施例９１参照）は制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＢｇｌｌで消化される。その後、２個の前も
って単離された断片がベクターｐＨＹ３００ＰＬＫに挿
入される。
その後、完全な連結混合物は、形質転換によりＥ、　ｃ
ｏｌｉ菌ＪＭ１０７　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（ＢＲＬ　）　、
　４１１Ｎ　、　５ｔｏｎｅｓｔｒｅｅｔＡｖｅｎｕｅ
　、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　、ＭＤ２０８５０　、　Ｕ
ＳＡ　）に挿入される。β−ガラクシダーゼ活性を有す
るクロンは、さらに制限消化により分析される。対応す
る遺伝子構築物を含むクローンは、ｐＸｌｌｏｌと定め
られる。
ａ、Ｘ　　ブ５　ｘ　ミドｐＸＩ８０１　ｆｃｎ　ｐＸ
ｌｌｏｌ　（Ｄハます、ｐＸＩ　８０またはｐＸＩ　１
０　ｊプラスミドＤＮＡを、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ
　（”Ｃｈａｎｇ　ａｎｄ　Ｃｎｈｅｎ。
＋９７９　）に記載された公知の試験プロトコルによる
形質転換により、バチラス　ザプチリスのプロトプラス
トに導入する。
正確なりローンが選択され、形質転換されるべきＤＮＡ
が標準方法により単離され、エレクトロポレーションに
よりバチラス　スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ細胞に
形質転換により導入される（実施例１参照）。
形質転換されたバチラス　スリンキニンシス細胞を添加
剤としてＸ−ｇａｌを有するＧＹＳ寒天（胞子形成培地
）に延べる。
正確に形質転換されたクローンは胞子形成が開始すると
青色に変わる。
他方、ｐＸ１６１ベクターにより形質転換されタバチラ
ス　スリンギエンシスＨＤ　１　ｃｒｙＢ　ｉｌｕ同１
８′ン １を（票 じ粂件下で白色にとど唸っている。
制限分析により、正確に形質転換されたクローンヲ用い
るト、バチルス　スリンギエンシス細胞内には損われて
いないＩ）ＸＩ８０４たはｐＸ１１０１プラスミドが存
在することが示される。
プラスミドｐＸＩ８０ｔたはｐＸｌｌｏｌを含有するパ
テラス　スリンギエンシスＨＤ１ｃｒｙＢ細胞を、前記
の方法により、ＧＹＳ培地上で培養する。生長期の間の
間隔に（草丈生長期の間及び胞子形成期の間の両方）、
　　Ｊ、　Ｈ，Ｍｉ　ｌ　１ｅｒ（”Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｈｎｒ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ　、　１９７２　。
Ｅｘｐｅｒｉｍｅ、ｎｔ　４８　ａｎｄ　４９　）に記
載された試験方法に従って、β−カラクトゾダーセ分析
が行なわれる。
上記の試験方法の個々の違いは、染色物質としてのＸ−
ｇａｌの使用、及び細胞により約１時１１］後に形成さ
れる着色された加水分解生成物の測足に関係する。
その後、細胞を遠心分離により除去し、上清液の光学濃
度を６５０　ｎｍ（ＯＤ６ｓｏ）の波長で確認する。
胞子形成の関数としての光学密度の増加が見られる。一
方、形質転換されたパテラス　スリンギエンシス細胞は
染色性物質Ｘ−ｇａｌを加水分解することができない。
プラスミドｐＸＩ２００はグラスミドｐＨＹ　３　［１
ＬｌｌＰＬＫの誘導体であり、Ｔｏｙｏｂｏ　Ｃｏ、、
　Ｌｔｄ、　（すＰＨＹｏｏｌ　；Ｔｏｖｏｂｏ　Ｃｏ
、、　Ｌｔｄ；、　２−８　　Ｄｏ負ｍａ　Ｈａｍａ２
−Ｃｈｏｍｅ、　Ｋｉｔａ　−Ｋｕ、　０ｓａｋａ、　
５３０　Ｊａｐａｎ　）から市販品として得ることがで
きる。グラスミドｐＨＹ？＋００はヨーロッパ特許出願
ＥＰ１６２７２５号に記載された構築物でありアンピシ
リン（ａｍｐＲ）耐性遺伝子とテトラサイクリン（ｔｅ
ｔｒ、”）耐性遺伝子の両方を含む。
プラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫはＢｇｌ　Ｉ及びＰｖｕ
　１により完全に消化される。得られた制限断片を、そ
の後、アカロースゲルエレクトロフォレゾスにより分離
する。４．４ｋｂ断片をアカロースゲルから単離し、精
製し、その後Ｔ４ＤＮＡＩＪカーゼで丙連結する。
連結バッチ全体を形質転換によりＥ、　ｃｏｌｉ　ＨＢ
ｌｏｌに導入する。形質転換されたＥ、　ｃｏｌｉ　Ｈ
Ｂ１０１細胞を、テトラサイクリン２０μｇ／ｌｉｅ　
ｆ含む選択性Ｌ−アカー上、６７℃でインキュベトした
後、テトラサイクリン（Ｔｃｒ）耐性形質転換体を選択
する。ぞの俊、アンピシリン−感受性（Ａｐｓ）クロー
ン（アンピシリン１００μｇ／１）から、α３ＫｂのＰ
ｖｕ　Ｉ／Ｂｇｌ　ｌ断片を伴うＡｐｒ遺伝子内にＰｓ
ｔ　１　　開裂部位を欠いているプラスミドを単離する
ことが可能となる。このプラスミドはｐＸＩ２００と定
められる。
９．２　　バチラス　スリンギエンシス１（Ｄ１ｃｒｙ
Ｂバチラス　スリンギエンシス　クルスタキＨＤ１変推
のＤＮＡ総量（５０μｇ９　を、制限酵素Ｐｓｔ　１及
びＨｐａ　１とインキュベーションすることにより、完
全に消化する。そのようにして得られた制限断片を、密
度勾配遠心法により大きさによって分離が付なわれる連
続的サッカｏ　−スクラディエントし５％（ｗ／ｖ）−
２３％（Ｗ／ｖ））に移し、５００μｔのフラクション
で集メる。
ＴＳＴ　４１−ｏ−ター（Ｋｏｎｔｒｏｎ　Ａｕｓｓｃ
ｈｗｉｎｇｒｏｔｏｒ　）内で、１５℃の温度で、最大
２．４Ｘ１０’ｒで１６時間、遠！し分離を行なう。続
いて、断片サイスアリコーＢ、調べるために、各々５０
μｔをアカロースゲル〔トリスアセテートＥＤＴＡ　ｔ
たはトリスボレーｈ　ＥＤＴＡ中の０８％（ｗ／ｖ）７
、３５）　　　　− カロース、　　　Ｍａ＋ＩＩａｔｉｓ　ｅｔ　ａｔ、、
　１９８２参照〕に移す。３ｋｂと６ｋｂの間の断片を
含むこれらのフラクションを集め、エタノール沈紋によ
り１０μｔの体Ｍ筐で濃縮した。
実施例９１に記載されたシャトルベクタｐＸＩ２００５
μｇ　ｆｒ：、制限酵素Ｐｓｔ　１及びＳｍａ　１で消
化する。その後、得られた制限断片の５′リ−１ε月 １’：）：？ ン酸塩租・全ウシ胃内アルカリホスファターゼで処理す
ることにより除去される。その後、予じめ単離したＨＤ
ｊ　ＤＮＡ　Ｏ，２μｇないしＣＬ５μｇを、ｐＸＩ２
００ベクターＤＮＡ　［１５μｇと混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リカーゼ（いわゆる”　Ｗｅｉｓｓ　Ｕｎｉｔｓ”；　
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ユニットは、　　ＩｎＭ（３２Ｐ
］ｉヒロリン酸塩から、３７℃の温度で、２０分間以内
に、Ｎｏｒｉｔａｂｓｏｒｂａｂｌｅ材料に転化するの
に充分な酵素活性に相当する）を添加して１４℃で一晩
インキユベートする。連結バッチ全体を形質転換により
直接、エンクトロボレーションニヨルバテラス　スリン
ギエン７スＨＤｊｃｒｙＢ細胞に導入する（実施例１参
照）、、その後、エレクトロボレートされたバチラス　
スリンギエンシス細胞を、選択剤として２０μｇ／−の
テトラサイクリンを含有する選択性胞子形成アガー上に
廷へ、２５℃で、胞子形成が完了するまでインキ−ベト
する。
バチラス　スリンギエンシスのクルイタキＨＤ１種に対
するモノクローナル抗体の製造は、”Ｈｕｂｅｒ−Ｌｕ
ｋａ３　（１９８４）及び”　Ｈｕｂｅｒ　−Ｌｕｋａ
活ｅｔ　ａｌ、、　（＋９８６　）に記載されたのと同
様に実施される。
抗体の製造に使用される・・イブリドーマ細胞はＳｐ　
２１０−Ａｇ　ｍｙｅｌｏｍａ　ｇｌｌ胞（４５）Ｓｈ
ｕｌｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、。
４９７８　；　”Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１
ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｉｎ　Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ　、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　、ＵＳＡで得られる）と
、予し；メバチラス　スリンギエンシスのクルスタキＨ
Ｄ１種のｂ−エンドトキシンで免役感作させたＢａ１ｂ
／ｃマウスの肝細胞との融合生成物である。
この方法において、バチラス　スリンギエンシスのδ−
エンドトキシンに対して特異的に指向するモノクローナ
ル抗体を得ることができる。
特に好ましいのは、プロトキシンタンパク質のＮ−末端
の半分にあるエピトープに特異的に結合するモノクロー
ナル抗体（例えばＨｕｂｅｒＬｕｋａｃ　ｅｔ　ａｌ、
、　＋　９８６参照）、マたはレビドプテラ活性グロト
キシンのＣ末端の半分に常にあるＪ５）’、＜ タンパク質の部分にあるエピトープを認識する抗体（例
えばＨｕｂｅｒ−Ｌｕｋａｃ’　ｅｔ　ａｌ、、　１９
８６参照）である。
しかしながら、続いての免疫学的スクリーニングに使用
される、他のモノクローナルまたはポリクローナル抗体
も全く可能である（実施例９．４参照）。
９４　免疫学的スクリーニング 実施例９５に従って製造きれたモノクローナル抗体、ま
たは他の適当なモノクローナル抗体は免疫学的スクリー
ニングに使用される。
−ｆｆ、バチラス　スリンギエンシス細胞の胞子形成の
後、自由な形で存在する結晶性タン・くり質を、トラン
スファーメンプラン（例えば、Ｐａ１ｌ　Ｂｉｏｄｙｎ
ｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　：　Ｐａ１
ｌ　Ｕｌｔ　−ｒａｆｉｎｅ　Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　
Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｇｌｅｎ　Ｃｏｖｅ。
ＮｔＹ）ｉ用いてフィルターメンプランを約５分間プレ
ート適用することにより結合する。続いて、フィルター
を５分間ＴＢＳＴ緩衝液〔００５％（ｗ／ｖ　）　Ｔｗ
ｅｅｎ　２０．１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／Ｔ（ＣＩ　（ｐＫ
ａＯ）、１５０ｍＭのＮａＣｔｉｎ　ｂｉｄｉｓｔ、　
Ｒ２０３で５分間洗浄し、その後、非特異的な結合をブ
ロックするために、ＴＢＳＴ緩衝液と１％（Ｗ／Ｖ）ス
キムミルクの混合物内で１５ないし６０分間インキ−ベ
ートする。
その彼、この方法で製造されたフィルターをグロトキゾ
ン特異性抗体〔５４１及び８五１６の抗体混合物（３′
）Ｈｕｂｅｒ−Ｌｕｋａｃ　ｅｔ　ａｌ、　、（＋９８
６）と−晩インキユベートする。未結合の抗体を、フィ
ルターをＴＢＳＴ緩衝液で各回５ないし１０分間で５回
洗浄することにより除去する。抗体結合プロトキシンを
検出するために、フィルタを他の抗体と共にイノギーベ
ートする。使用される第二の抗体は、市販品として、例
えばＢｉｏ−Ｒａｄ　［Ｋａｔａｌｏｇ　＋１７０〜６
５２０．ｇｏａｔ’ｓ　ａｎｔｉｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　
（Ｈ＋Ｌ）−ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓ
ｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ　）から得ることのできる、アル
カリホスファターゼで標識された抗−マウス抗体である
。３０分間インキュベーションした後、未結合の第二抗
体を上記の方法により、フィルタ−をＴＢＳＴ緩衝液で
６回（各回５ないし１０分間洗浄することにより除去す
る。その佐、該フィルターヲ、ＮＢＴ〔′ｐ−ニトロブ
ルーテトランリウムクロライド；ニトロ−ブルーテトラ
ゾリウムクロライド〕及びＢＣＩＰ　Ｃ５−７０モー４
クロロ−６−インドリルホスフェート−ｐトルイジン塩
〕からなる基質混合物と共にインキュベートする。酵素
反応は製造者の指示（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　；　１４１４　
Ｈａｒｂｏｕｒ　ｗａｙ　５ｏｕｔｈ、Ｒ４ｃｈｍｏｎ
ｄ　ＣＡ。
９４８０４　、　ＵＳＡ　３に従って行なわれる。
陽性、即ちプロトキシン含有クローンはそれらの紫色の
着色により非常に容易に認識される。
これは、アルカリ性ホスファターゼと上記の基質混合物
との酵素的反応の結果として生じる。
実施例９２に記載した形質転換から、該実施例に記載し
た連結バッチを用いて、８００′ｆｘいし１０００の形
質転換体が得られる。これらの形質転換体の２個のコロ
ニーが上記酵素反応において明らかに陽性のシグナルを
示す。
プラスミドＤＮＡを、プロトキシン遺伝子の発ｌｌ 現が上記の酵素反応により検出されうる陽性クローンか
ら単離する。さらに、クローン化したプロトキシン遺伝
子は、さらに特定され、最終的に公知の制限マツプと比
較しての制限分析により同定されうる。
両方のクローンが４．３　Ｋｂの挿入物を伴う組み換え
プラスミドを含有しうる。続いてのＨｉｎｄ■１、Ｐｖ
ｕ　ｌ、Ｅｃｏ　Ｒ１及びＸｂａ　Ｉによる制限消化に
、ｌ：　リ、バチラス　スリンギエンシスのクルスタキ
　ＨＤｌｉのエンドトキシン遺伝子の公知の制限マツプ
と比較しての挿入物上の遺伝子の同定が可能になる。両
方の場合において、遺伝子は、５．３　Ｋｂのプロトキ
シン遺伝子としても知られ、５）Ｇｅｉｓｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、　、　１９８６に記載されているクルートル遺伝
子である。
この遺伝子は、バチラス　スリンギエンシス内で直接ク
ローン化され、免疫学的スクリーニングにより同定され
たものであり、さらにプラスミドｐＫ３６　（５）Ｇｅ
ｉｓｅｒ　ｅｔ　ａｌ−、１９８６）内の５、３　Ｋｂ
遺伝子の１８４７　Ｂｐ　ＢａｍＨ１／Ｈｉｎｄ　Ｉｌ
ｌ断片とハイブリッド化する。ＳＤＳ／ＰＡＧＥにおい
て、両方のクローンが、つ丁スターンプロット（４６）
Ｔｏｗｂｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、　　１９７９　）内で上
記（実施例９．４参照）のモノクローナル抗体と特異的
に反応する１３０，０００ダルトンの典型的なプロトキ
７ンのバンドを示す。
表 第１表：エレクトロポレーションの前後の４℃における
インキュベーション時間の形質転換頻度に対する影響。
エレクトロポレーション方法を用い、バッチあたり０２
μｇのｐＢＣ１６でノくテラス　スリンギエンシスＨＤ
ｉ　　ｃｒｙ　Ｂ　（ｄｆｅ質転換する。
Ｅ’１ 第２表：形質転換によるパテラス　スリンギエンシスの
導入後のｐＢＣ＋６のテトラサイクリン耐性の発現 パテラス　スリンギエンシスＨＤ１　ｃｒｙ　Ｂ　’ｃ
、本発明によるエレクトロポレーション法ヲ用いてｐＢ
Ｃ１６プラスミドＤＮＡで形質転換する。
ＬＢ培地内、３０℃で穐々のインキュベーション期間の
後、形質転換した細胞を２０μｇ／ｄのテトラサイクリ
ンを官有するＬＢアカ−上に延べることにより選択する
。
天然に生じるプラスミド 変性プラスミ ド／クロ ニンダベクタ シャトルベクタ 第３表：ａＩ々のプラスミドによるバチラスリンキニン
７ス菌）（１）１　ｃｒｙ　Ｂの形質転換１：Ｔｃ：テ
トラサイクリン；　Ｋｍ　：カナマイシン：ＢＩｅ：ｂ
　ｌｅｏｍｙｃ　ｉｎ　；　Ｃｍ　：クロラムフエニコ
ール：　Ｅｍ　ニエリスロマイシン ２゛全てのプラスミドＤＮＡは、 バチラス サブチリス ＢＧ から単離されるもの以外はバチラス　スリンギエンシス
）（［）１ｃｒｙＢから得られる。
第４表：ヘリオラス　ヴイレソセンスに対するバチラス
　スリンギエンシスＨＤ　１　ｃｒｙ　Ｂ　及ＵＨＤ１
　ｃｒｙ　Ｂ　（ｐＸＩ　９３　）の生物試験噴霧乾燥
した胞子形成カルチャー（胞子及び（存在すれば）プロ
トキシン結晶）を、示した量でヘリオラス　グイレソセ
ンスのＬ−１幼虫の餌と混合する。
トロボレーション法に従って、グラスミドｐＢＣ１６で
形質転換された。
菌 形質転換類、１） ＨＤｌ　ｃｒｙＢ ＨＤｌ　　ｄｉｐｅｌ ＨＤｌ−９ Ｄ７３ Ｄ１９１ バチラス　スリンギエンシスのスリンエンシス種ＨＤ２
−０６−４ 第５表口バチラス　スリンギエンシス、ノ（チラス　セ
レウス及びバチラス　サブチリスの形質転換。全ての菌
は実施例１に記載されたエレクＬＢＧ　　Ｂ−４４４４ バチラス　セレウス ６９　Ｋ バチラス　サブチリス ＬＢＧ　　Ｂ−４４６８ ２，６ ０，０００２ １）バチラス　スリンギエンシスのクルスタキＨＤ　１
　ｃｒｙ　Ｂ種で達成される、１で定義したような形質
転換頻度に基つく相対的な値 ２０：（ 微生物の寄託 本発明において使用される下記の微生物の各々の培養は
、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタ
ペスト条約の要求に従って、西ドイツ国ゲノテンゲンに
ある国際寄託機関”微生物の西ドイツコレクション（Ｄ
ｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖ　ｏｎ　Ｍｉｋ
ｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　）（ＤＳＭ）に寄託し、そ
して生存確認が前記国際寄託機関によってなされた： 優先権証明書におけるプラスミドの指定のために選択さ
れた内部参考値ｐＫは、公式に認められている指定ｐＸ
ＩによるＡｕｓｌａｎｄｓｆａｓｓｕｎｇ　（外国出願
テキスト）に置き換えられている。
さらに、実施例において使用される無胞子性のバーｊ−
５ス　スリンギエンシス　ＨＤ１ミュータントは、Ｃｒ
ｙβからｃｒｙＢに変化させている。
参考文献 ｉ、　　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　Ｌ、　ａｎｄ　Ｍａｒｇａ
ｌｉｔ　Ｊ、、　Ｍｏ５ｑｕｉｔｏ　Ｎｅｗｓ。
３７　：　３５５−３５８　、１９７７２、　　Ｋｒｉ
ｅｇＡ、ｅｔａｌ、、Ｚ、Ａｎｇ、Ｅｎｔ、、９６：５
００５０８．１９８３ ３、　５ｃｈｎｅｐｆ、Ｈ，Ｅ、ａｎｄＷｈｉｔｅｌｅ
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Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７８　：２８９３−２８
９７．１９８１４、　　Ｋ１１ｅｒ　Ａ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｔｂｅ　ＥＭＢＯＪ、、　１　：　７９１−７９
９．１９８２ ５、　　ＧｅｉｓｅｒＭ、ｅｔａｌ、、Ｇｅｎｅ、４８
；１０９−１１８゜６、　　ＨａｉｄｅｒＭ、Ｚ、ｅｔ
ａｌ、、Ｇｅｎｅ、５２：２８５−２９０゜７、　　Ｇ
ｏｎｚａｌｅｚ　Ｊ、〜Ｌ　ｃ＋　ａｌ、、Ｊ’ｒｏｃ
、Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　ＵＳＡ。
７９：６９５１−６９５５．１９８２ ａ　　Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ　Ｍ、　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
すｎ＋− ２０Ｔ； １６８：９８２−９Ｂ９．１９８６ Ｄｏｎｏｖａｎ　　Ｌ、Ｐ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、、２１４：３６５−３７２．１９
Ｅ１８ Ｓｃｈｎｅｐｆ　　Ｈ−Ｅ、ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｙ　
Ｈ，Ｒ，、Ｊ、Ｂｉｏｌ。
Ｃｈｅｍ−，２６０：６２７５．　１９８５Ｋｌｉｅｒ
　　Ａ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ
、、　　１９１　：２５７−２６２．　１９８３ Ｂｉｂｂ　　Ｊ、Ｊ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ、
２７４：３９８−４０１１１゜Ｃｈａｎｇ　Ｓ、　ａｎ
ｄ　Ｃｏｈｅｎ　Ｓ−Ｎ、、　Ｍｏ１ｅｃ、（Ｊａｎ、
（ｊ−ｅｎｅｔ、。
１６８二１１１−１１５．１９７９ Ｂｒｏｗｎ　　Ｂ、Ｊ、ａｎｄ　Ｃａｒｌｔｏｎ　Ｂ、
Ｃ，、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４２：５０８−５
１２．　１９８０Ｋｏｎｄｏ　　Ｊ、に、ａｎｄ　Ｍｃ
Ｋａｙ　　Ｌ−Ｌ、Ａｐｐｌ、Ｅｎｖｉｒｏｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、４８：２５２−２５９．　１９８
４Ｗｉｒｔｈ　　Ｒ，ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌ、、１６５：８５１−８５６．　１９８６ Ｙｏｓｈｉｈａｍａ　Ｍ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ、、１６２　：５９１−５９７．　１９８
５ Ａｌｉｋｈａｎｉａｎ　Ｓ−Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ
、Ｂａｃｔｅｒｊｏｌ−。
１４６、　７−９．　１９８１ １９、　　Ｍａｒｔｉｎ　Ｐ、Ａ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ
−Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４５：９８０−９８３．１
９８１ ２０、　　Ｆｉｓｃｈｅｒ　　Ｈ，Ｍ−、Ａｒｃｈ、Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ−，１３９：２１３−２１７．　１９
８４ ２１、　５ｃｈａｌｌ　　Ｄ、、Ｇｅｎ’＋ｉｂｅｒｔ
ｒａｇｕｎｇ　　ｚｗｉｓｃｈｅｎ　　Ｉｓ。
Ｉａｔｅｎ　　ｖｏｎ　　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｈｕ
ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　ｄｕｒｃｈＰｒｏｔｏｐｌａ
ｓｔｅｎｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　　ｕｎｄ　−
ｆｕｓｊｏｎ（Ｇｅｎｅ　　ｔｒａｎｓｆｅｒ　　ｂｅ
ｔｗｅｅｎ　　１ｓｏｌａｔｅｓ　　ｏｆＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　ｂｙ　　ｐｒ
ｏｔｏｐｌａｓｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎ
ｄ　ｆｕｓｉｏｎ）、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ。
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｉｉｂｉｎｇｅｎ、　
　１９８６゜２２、　５ｈｉｖａｒｏｖａ　Ｎ、、Ｚｅ
ｉｔｓｃｈｒ、Ａｌｌｇｅｍ、Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、。
２３二５９５−５９９．１９８３ ２１　　Ｙｏｕｓｔｏｎ　Ａ、Ａ、ａｎｄ　Ｒｏｇｏｆ
ｆ　Ｍ、Ｈ，、Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏＬ、１００二１２
２９−１２３６．１９６９２４、　　　Ｈｏｒｉｎｏｕ
ｃｈｉ　　Ｓ、、　　ａｎｄ　　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ　　
Ｂ、、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、。
１５０：８１５−８２５．　１９８２ ２５、　　Ｐｏ１ａｋ　Ｊ−ａｎｄ　Ｎｏｖｉｃｋ　Ｒ
，Ｐ−、Ｐｌａｓｍｉｄ、７　　：１５２−１６２．　
１９８２ ２（）ン ２　（）　２＜ Ｍａｈｌｅｒ　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ　Ｈ
，０，、Ｊ、　Ｇｅｎ。
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　１２０　　二　２５９−２
６５．　　１９８０Ｇｒｙｃｚａｎ　Ｔ、　ｅｔ　　ａ
ｌ、、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１４１　：２
４６−２５５．　１９８０ Ｖｉｅｉｒａ　　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ　Ｊ、
、　Ｇｅｎｅ、　１９　：　２５９２６８、１９８２ Ｗｏｎｇ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、、２５８　：　１９６０１９６７、　１９８３ Ｂｏｌｉｖａｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　　２　
　：　　９５−１１３，１９７７Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　
　ｅｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、２６：　１０１−１０４
゜Ｂｅｖａｎ　　ｅｔ　　ａｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３０４
：１８４−１８７．１９８３Ｍａｎｉａｔｉｓ　　ｅｔ
　　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＡＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−−ｒａｔｏｒｙ、
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＵＳＡ、　
　１９８２Ｈｉｎｎｅｎ　ｅｔ　　ａｔ、、Ｐｒｏｃ−
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。
７５：１２９−ｆ９５３．　１９７８ Ｙｏｕｎｇ　Ｒ−Ａ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ。
８０：ｊ１９４−１１９８．１９８３ Ｈｕｂｅｒ−Ｌｕｃａｃ　Ｍ、、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉ
ｏｎ　Ａ７５４７”ＺｕｒＩｎｔｅｒａｋｔｉｏｎ　　
ｄｅｓ　　ｄｅｌｔａｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ　　ｗｏｎ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｔｂｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　　
ｍｉｔ　　ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅｎＡｎｔｉｋ’ｉ；
ｒｐｅｒｎ　　ｕｎｄ　　Ｌｉｐｉｄｅｎ　”　（ｏｎ
　　ｔｈｅ　　１ｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔ
ｈｅ　　ｄｅｌｔａ−ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ　　ｏｆ　　
Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｗｉｔ
ｈ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａ
ｎｄ　１ｉｐｉｄｓ　）、　ＥＴＨＺｉｒｉｃｈ、　　
１９８４３７、　　Ｈｕｂｅｒ−Ｌｕｃａｃ　Ｍ、ｅｔ
　　ａｌ、、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。
５４　：　２２８−２３２．１９８６ ３ａ　　ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ、　１９８６　　Ｉ
ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ
Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　＆　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ、
　Ｔｈｅ　ＭａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇＣｏｎｆｅｃｔ
ｉｏｎｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｇｌｅｎ
　Ｒｏｃｋ、　ＮＪ。
ＵＳＡ。
３９、　５ｔａｈｌｙ　Ｄ、　Ｐ、　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。
Ｃｏｍｍ、、８４’、５８１−５８８．　１９７８４０
、　　Ｂｅｒｎｈａｒｄ　　Ｋ、ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１３３：８９７−９０３．　１
９７８ ４１、　　Ｐｒｉｍｒｏｓｅ　　Ｓ−Ｂ、、Ｅｈｒｌｉ
ｃｈ　　Ｓ−Ｄ、、Ｐｌａｓｍｉｄ６　：　　１９３−
２０１．　１９８４４２、　　Ｈｕｂｅｒ−Ｌｕｋａｃ
Ｈ，、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｅｉｄｇｅｎｏｓｓ
ｉｓｃｈｅ　Ｔｅｃｈｎｉｓｃｈｅ　Ｈｏｃｈｓｃｈｕ
ｌｅ、　Ｚｉｉｒｉｃｈ、　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、
Ａ　７０５０，１９８２ ４１　　Ｚｏｌｌｅｒ　　Ｊ、Ｍ、ａｎｄ　　Ｓｍ１ｔ
ｈ　Ｍ、、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、１０：６４
８７．ｆ９８２ ４４、　　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｊ、　Ｈ−、Ｅｘｐｅｒｉｍ
ｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ
、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ。
４５、　　Ｓｈｕｌｍａｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｎａｔ
ｕｒｅ、２７６：２６９，１９７８４６、　　Ｔｏｗｂ
ｉｎ　Ｈ，ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、。
ＵＳＡ、７６：４５５０−４５５４．１９７９特許文献 ＥＰ　　１６２７２５ ＥＰ　　２３８４４１ ＷＯ８６１０１５３６ ＵＳ　−Ｐ　４４４８８８５ ＵＳ−ｐ　４４４７　０５６ ｔＪｓ−ｐ　４２５７　２２４ ＵＳ−ｐ　４４６８４６４ 、図面の簡単な説明 第１図は、ｐＢＲ５２２での大腸菌１（Ｂ１０１の形質
転換（０）およびｐＢｃ１６でのバチラス　スリンギエ
ンシスＨＤ１ｃｒｙＢの形質転換（・）の結果を示すグ
ラフである（△は生き残りのＨＤ１ｃｒｙＢ細胞数を表
す）。
＋＠２図は、形質転換頻度に関するバチラススリンギエ
ンシスＨＤｉｃｒｙＢ培養物の齢の影響を示すグラフで
ある。
第３図は、形質転換頻度に関するＰＢＳ緩衝溶液のｐＨ
値の影響を示すグラフである。
第４図は、形質転換頻度に関するＰＢＳ緩衝溶液のンヨ
糖濃度の影響を示すグラフである。
第５図は、形質転換細胞数と形質転換当たり使用された
ＤＮＡ量との相互依存を示すグラフである。
第６図は、シャトルベクターｐＸ［ｉの制限地図を示す
概略図である。図中、影を付した領域はグラム陽性ｐＢ
Ｃ１６に由来する配列を表し、残りの領域はダラム陰性
プラスミドｐＶｃ　ａに由来する。
第７図は、ｐｘｒ　９３の制限地図を示す概略図である
。図中、影を付した領域はプロトキシン２］：？ 構造遺伝子（矢印、　　Ｋｕｒｈｄｌ　）並びに５′お
よび６′非コ一ド性配列を表し、残りの領域はシー？）
ルベクターｐＸＩ６１に由来する。
第８ａ図および第８ｂ図は、バチラス　スリンギエンシ
スＨＤ　１　ｃｒｙ　Ｂ　、パテラス　セレウス５６９
におよびそれらの誘導体の胞子形成性培養物の抽出物の
ＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）／ポリアクリル　
アミドゲル電気泳動の結果を表す生物の形態を示す写真
である。〔図中、１：　ＨＤＩ　ｃｒｙＢ　（ｐＸＩ　
９５　）、２　：　ＨＤｌ　ｃｒｙ　Ｂ（ｐＸＩ４１）
。
３　　：　　ＨＤｌｃｒｙＢ、　　　４　　二　ＨＤＩ
　、　ＬＢＧ　　　Ｂ−４４９５、５：バチラス　セレ
ウス５６９Ｋ（ｐＫＩ　９３　）、６：５６９Ｋ〕 そして第８ａ図はクーマーシー染色したものであり、〔
図中、Ｍ二分子量標準、ＭＷ：分子ｔ（ダルトン）、矢
印：　１３０．ＯＤＤダルトンのプロトキシンの位１） 第８ｂ図はバチラス　スリンギエンシスＨＤ１のに一１
結晶性タンパク質に対するポリクローナル抗体を添加し
た上記ゲルのウェスタンプロ陽性のバンドが標識した抗
ヤギ抗体を用いて見い出された〔図中、矢印：１３０，
０００ダルトンのプロトキシンの位置、その他のバンド
：プロトキシンの消化産物〕。
第９図は、バチラス　スリンギエンシスに対して最適化
されたエレクトロボレー／コン法ヲ用いたｐＢＣ１６プ
ラスミドＤＮＡでのバチラスサブチリスＬＢＧ　　Ｂ−
４４６８の形質転換結果を示すグラフである。〔図中、
Ｑ：形質転換細胞７８ｇプラスミドＤＮＡ、；・：生存
細菌数／ｍＡ）特許出願人　　チバガイギー　アクチェ
ンゲゼルシャフトニ手−わｌｊ主甫ｊＬ言： （別　　　　紙） ■、事イ１の表示　平成１年特８′１願第１２７７２１
号２、発明の名称 バチラス　スリンキニンシスの形質転換３　補正する者 事件との関係　特許出願人 名称　チハーガイギー　アクチェンゲゼルシャフト４　
代理人 住所　東京都Ｔ代田区神田駿河台ｌの６お茶の水スクエ
ア’　Ｂ館 氏名　（６２７１，）萼　　優美（ほか２名）６、補正
の対象 明細書の特許請求の範囲の欄 ７、補正の内容 明細店の特許請求の範囲を別紙のとおり補正する。
２、特許請求の範囲 ｒ　（１）　　バチラス　スリンギエンシスを、該バチ
ラススリンギエンシスの遺伝子操作に適する組み換えＤ
ＮＡを用いる単純な形質転換方法により高い効率で形質
転換することからなる、直接的な、標的を定めた、そし
て再現可能な、！ｌＩノ換えＤＮＡを用いるバチラス　
スリンキニンシスの遺伝子操作のための方法。
（２）バチラス　セレウスを、該バチラス　セレウスの
遺伝子操作に適する組み換えＤＮＡを用いる単純な形質
転換方法により高い効率で形質転換することからなる、
直接的な、標的を定めた、そして再現可能な、組の換え
ＤＮＡを用いるバチラス　セレウスの遺伝子操作のため
の方法。
（３）バチラス　スリンキニンシスまたはバチラスセレ
ウスの形Ｍ　転ｍをエレクトロボレーシ４１ンを用いて
行うことを特徴とする請求項１及び請求Ｉｆ↓２のいず
オ′Ｌか１ｑｆに記載の方法。
（４）　　ハチ、・ノ、　フリニー１−エンユ／ス１．
たはハナラスレし・ウー入の形′ｆ１転換を以［゛の工
程段階、］）ハハチフ、　スリン１−：１−ンノソ、細
胞の成長に適当である’＋：　ｊ′に’：：　’Ｉ！！
中、該細胞の成ＪＰＪご適当な通気を行）この、適当な
細胞密度の細胞懸濁液（１）　；’ｉ、］整、 １））該８、■胞；υ、濁冶、からの細胞の分離及Ｏ・
次０）工Ｌ・り１．　ｎボレー、・−Ｊンに適当な１妾
種ｉだ動）夜中・＼の再勤（濁、 ［：　）　Ｉ　Ｌり１−１７ポレーシ…ｊンに適当な濃
度でのＤ　Ｎ　Ａ試１１の協力［１、 （１）段階ｂ　）及びｃ）４こ記載したハ、十の二ＩＬ
　Ｌ。
りｌ　ｎボし・−−−−１・−１７装置パ・の導入、（
・）Ｉ＼チラ′、ζ　ノ、リン１−二［ンノノ、及び／
またはハ・Ｊニシス　セレウス細胞の３１１力換えＩ）
ＮΔごの形質転換に適度であ２．１ｌＪ１間、高電界強
１度の短１！１１間イ１−成のための細胞懸、濁液に対
する二１ンｙンリ０）１回：ｌ、た心よそれ以ｌ−のシ
、りい放電、ｆ）上しり１川！ボ１−ンｊンを行った細
胞の選択的な再培養、 ｇ）エレクトロポレーショＪンを行った細胞の適当な選
択培地トでの平板培養、及び ｈ）形質転換された細胞の選ＩＲからなるごとを特徴と
する請求項３記載の方法。
（５）請求項４のａ）に記載の細胞懸濁液の製造のため
にバチラス　スリンキニンシスの胞子を用いることを特
徴とする請求項４記載の方法。
（（ｉ）　　、ｉｆｉ求項４のｅ）に記載した細胞懸濁
液のエレクトロポレーションのために、超−（ｆｆｉ　
？ｊ司噂されたバチラス　スリンギエンシス及び／また
ＩＩバチラス　セレウス細胞を用いることを特徴とする
請求項４記載の方法。
（７）バチラス　スリンギエンシス細胞の培養のために
、 ａ）好気性バチラス種の培養のために惧用的に使用され
ているような、容易に同化できる炭素源及び窒素源を有
する複合栄養培地を使用し、ａ＋）所望により、さらに
、ビタミン及び必須金属イオンをａ）に記載した培地に
添加するか：または ｂ） ＋）　ｌ　）　’ｔＭ合または限定された容易に同化で
きる炭素源及び窒素源またはそれら二つの組み合ね−Ｕ
、及びさらに、 ｂ２）必須ヒタミン及び金属イオンを含有する完全に合
成または゛１′１′の栄養培地を使用することを１．５
徴きする請求項４記載の方ｄ：。
（８）上記のバチラス細胞懸濁液の光学的濃度が０１な
いし１．０であることを特徴とする請求項４記載の方法
。
（９１ｂ）で記載した接種緩衝液が浸ｉＢ圧的に安定な
燐酸塩緩衝？ｌｋであることを′ＪＧ徴とする工ｌ′１
求項４記載の方法。
（１０）　ｊ−記の燐酸塩緩衝液か安定剤として糖また
はｉＪ、ｉ！アルコールを含有することを特徴とする請
求項９記載の方法。
（１１）上記安定剤りロナンカＵノースであり、０．１
Ｈないし２１．叶の濃度で存ンｌすることを特徴とする
請求項１０記載の方法。
（１２）上記燐酸塩緩衝液のｐ＋１がｐＨ５，［ｌない
しｐＨ８，０であることを特徴とする請求項９記戦の方
法。
（１３）バチラス細胞の接種が０°Ｃないし３５°Ｃの
温度でエレクＩ・ロポレーションの前、間及び後に行わ
れることを特徴とする請求項４記載の方法。
（１４）バチラス細胞の接種が２゛Ｃないし１５°Ｃの
温度てエレクトロポレーションの前、間及び後に行われ
ることを特徴とする請求項４記載の方法。
（１５）添加したＤＮＡ試料の濃度カ月ｎｇないし２０
μｇであることを特徴とする請求項４記載の方法。
（１６）上記ＤＮＡ試料がベクターＤＮＡであることを
特徴とする請求項１５記戦の方法。
（１７）エレクト［Ｉボレーソ４１ンの途中で、バクテ
リア細胞に、コンデンジーから１ＪＮＡ含イｊ細胞懸濁
液を通っての短い放電を、短期間、非常に高い’ＦＡＪ
−ＪＬＭで作用させ、結果としてバチラス　スリンギエ
ンシスまたはバチラス　セレウス細胞の透過性を、懸濁
液内のＤＮＡがバチラス細胞に吸収されるように増加さ
セるごとを特徴とする請求項４記載の方法。
（１８）電界強度−が１００Ｖ／ｃｍないし７５０，０
００Ｖ／ｃｍであるごとを特徴とずろ請求項１７記載の
方法。
（１９）　ｊＭ界附２度が１００Ｖ／ｃｍないし１０．
０００Ｖ／ｃｍであるこ７どを特徴とする請求項１７記
載の方法。
（２０）バチラス細胞懸濁液に作用さ−Ｕるパルスの指
数崩壊肋間か約２ｍｓないし約５０ｍｓの範囲内にある
ことを特徴とする請求項４記載の方法。
（２１）工し・りｌ−Ｔ：Ｉボレートされた細胞を、適
当な続いての培−■段階の後、形質転換されたバチラス
細胞の選択に適する添加剤を含有する固体培地」二に土
板−培−養するごとを特徴とする請求項４記載の方法。
（２２）上記の添加剤が、テトう→ノイクリン、カナマ
イノン、り「１ラムフＬニコール、コニリスロマイノン
から４Ｖ′る群から選択されるバチラス　スリンギエン
シスまたはバチラス　セレウスの選１尺に適する抗生物
質であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
（２３）上記の添加剤が、バチラス　スリンギエンシス
またはバチラス　セレウスの選択に適する、染色性物質
であることを特徴とする請求項２１記載の方法。
（２４）バチラス　スリンギエンシスまたはバチラスセ
レウスの形質転換に使用される組の換えＤＮＡが同種ま
たは異種の起源であるが、または同種及び異種のＤＮＡ
の組み合ね−Ｕであることを特徴とする請求項１及び２
記載の方法。
（２５）−）記の組み換えＩ］Ｎ八が１またはそれ以」
−の構築遺伝子及びバチラス　スリンギエンシスまたは
バチラス　セレウスまたはその両方において機能するこ
とかでき、ＩもしＨ；ｌ：（れ以」−の構築遺伝子に操
作可能に連結し、これによりバチラス　スリンギエンシ
スまたはバチラス　セレウスまたはその両方内での該＋
１−１築遺伝子の発現を保証する３′及び５′配配置節
配列をイＪすることを特徴とする請求項ｌ及び２のいず
れ力用虫に記載の方法。
（２６）上記構築遺伝子が、バチラス　スリンギエンシ
スに天然に生じるδ−エントド；１−シンポリペブチ１
、また（４１それらと実質的に同しポリペプチド、即し
少な（とも、バチラス　スリンギエンシスからの結晶性
δ−エントド−１−ノンポリベプチトの性質を実質的に
有するポリペプチドを二ノート化することを特徴とする
請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
（２７）上記δ−」−ン１１・−１−シン−コード化＋
１ＮＡ配列が殺虫活性の原因となる天然のδ−エンドト
キシン−コード化配列と少なくとも部分的に同し７であ
ることを特徴とする請求項２６記載の方法。
（２８）−１−記ＤＮＡがベクターＤＮＡであることを
特徴とする請求項２４記載の方法。
（２９）　−，１−記＼クタ−ＩＩＮＡかプシスミトＩ
ＩＮへから誘導されることを特徴とする請求項２８記載
の方法。
（３０）　、１−記載、フタ−ＤＮＡがファーンＩＩＮ
へから誘導されることを！ｆｊｒ　ｉｔｉとする請求項
２８記載の方法。
（３１）バチラス　スリンギコーンシス内で、または非
常に関係の深いバチラス　セレウス内で、または両石の
中で、複製することができること以外にも、少なくとも
一つの、さもなけれはいくつかの別の異種の宿主生物の
中で複製することができ、同種及び異種の両刀の宿主系
で同定可能な二官能性ベクターを形質転換のために用い
るごとを特徴とする請求項１及び２記叔の方法。
（３２）　上記の異種の宿主／Ｊ−物がａ）　下記の種
：バチラス（Ｉｌａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）、スタフィ１：
Ｉ　：：Ｊ　シラス（ＳＬａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
、ストレブＬ　二Ｉ　シラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）　、ストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒａｐ　Ｌｏｍ
ｙｃｅｓ）、シ”Ｉ−　　１：”Ｅナス（１”ｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（Ｈｓｃｈｅｒｉｃｂｉ
ａ）　、アグロバクテリウム（ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉ
ｕｍ）、リール壬子う（ＳａｌｍｏｎｅｌｌｃＩ）、エ
ルウィニア（ｌＥｒｗｉｎｉ；ｉ）等からなる群．Ｉ’
．　’Ｊ　’ＩＡ　！：１れる原核生物、または ｂ）　イースト、動物及び植物細胞ａ６からなるｌＩＹ
から選ばれる真核生物であることを特徴とする請求項３
１記載の方法。
（３３）　上記の異種の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉである
ことを特徴とする請求項３２記載の方法。
（３４）　ａ）　　まず、同種■トたは異種起ｊ皇のプ
ラスミＩＤＮＡを適当な制御ｉＤ酵素を用いて断片に壊
し、そして ｂ）次に、各々所望の宿主系内で複製及び選択に必須の
機能を含も断）−）を、適当な酵素の存在下、胃なる宿
主系内での複製及び選択のために必須の機能が保持され
るような方法で、再び互いに結合するごとからなる、バ
チラス　スリンギエンシス及び／またはバチラス　セレ
ウスの形質転換に適するニ官能性ー＼クターの製造方法
。
（３５）純粋に異種起片のシラスミドｌｌＮＡを用いる
ことを特徴とする請求項３４記載の方法。
（３６）　ａ）上記の同種のプラスミＩ用ＩＮＡが、バ
チラススリンキニンシスまたはバチラス　セレウスに天
然Ｑご牛しるが、またはそれらと実質的に同じＤＮＡ−
であり、 ｂＬ上記の５″４１１Ｆブラスミｌ’　＋１　Ｎ　Ａが
ＩＪ１）下記の種　バチラス（Ｉｌａｃｉｌｌｕｓ）、
スクフィＩー２二Ｉノカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ）、ス１〜しブｌ−コツカス（Ｓｌｒ（！ｐＬｏｃ
ｏｃｃｕｓ）　、ストレプトマイセス（ＳＬｒｅ（＋ｔ
ｏｍｙｃｃｓ）、ソニー１モナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）、エソ」−リキア（［！ｓｃ１１ｅｒｉｃｂｉ；
ｉ）　、アクロバクテリウム（ΔｇｒｏｂａｃＬｅｒｉ
ｕｍ）、リールモ不う（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　ｌ＋＋）エ
ルウィニア（Ｉｉｒｗｉｎｉａ）等からなるｌＩＹより
選ばれる原核生物、または ［）２）イースト、動物及び植物細胞等からなるＩＩＣ
から選ばれる真核生物に天然にノ１，シるｌ’ｌＮＡ　
−（あるが、 またはそれらと実質的に同しＤＮＡであることを特徴と
する請求項３４及び３５のいずれか１項に記載の方法。
（３７）　上記の異種のプラスミ１．’ｔ）Ｎ八がＩｉ
．ｃｏｌｉに天然に生じるが、またＧＪそれらと実質的
に同じであるＤＮＡであることを１１）徴とする請求項
３６記載の方法。
（３８）同種及び異種の宿主系におりる複製及び選択に
必須の機能に加えて、■もしくはそれ以Ｉ−の発現しう
る型の遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列を含み、該遺
伝子または有用なＤＮＡ配列が適当な酵素を用い゛ＣＣ
上記二官能性ツククー１Φ人されることを特徴とする請
求項；（４記載の一．官能性・・フタ−の製造方法。
（３９）　　上記遺伝了ｌにたは他の有用な１１　Ｎ　
へ配列か同種、異種または合成起源であるが、さもなけ
れば−上記遺伝子または１）ＮＡ配列の組み合わ−Ｕか
らなるごとを特徴とする請求項３８記載の方法。
（４０）　１−記の遺伝子が１もしく＋Ｊそれ基土の構
築遺伝子及びバーニーラス　スリンギエンシスまたはバ
チラスセレウス内で、ニドたＧＪその両者内で機能し７
うろ３′及び５′配置調節配列からなり、該配列が１も
しく番３１ぞれ基土の構築遺伝子に操イ１可能に連結し
、これによりバチラス　スリンギエンシスまたはバチラ
ス　セレウスまたはその両刀内での該構築遺伝子の発現
を保証することを１．１ｊ徴とするｉ！ｒ＋求項３））
記載の方法。
（４１）１記１凋節配列かプｌ−１モーター配列とター
ミ不ター配列の両方、並ひに３′及び５′未翻訳領域の
他の調節配列を含む発現シグナルであることを９１１徴
とする請求項４０記載の方法。
（４２）　　Ｉ記発現ツクナルかバチラス　スリンギエ
ンシスまた（Ｊバチラス　セレウスまたはその両者に天
然に４１−シるが、また４Ｊごれらの天然発現シグナル
の、天然配列と実質的に同し突然変異体（ｍｕＬａｎＬ
）及び変種（Ｖｉｌｒ　！ｆｉｎ　Ｌ）であることを’
１ＩｌｉＴｈとする請求項４１記載の方法。
（４３）　Ｊ１記発現ソゲナルがハーニ−ラス　スリン
ギエンシスの胞子形成依存＋ＩＵプｒＪモーターを含む
ことを特徴とする請求項４２記載の方法。
（４４）　上記構築遺伝子が、バチラス　スリンギエン
シスに天然に生じるδ−エンド１−キノンポリペブチＩ
・、またはそれらと実質的に同しポリペブチｌ、即ち少
なくとも、バチラス　スリンギエンシスからの結晶性δ
　エン１トキシンポリペプチドの性質を実質的に有する
ポリペブチ１をコード化することを特徴とする請求項４
０記載の方法。
（４５）　、Ｊ１記構築遺伝子が、バチラス　スリンギ
エンシスに天然に生じるδ−エントド：１−シンをコト
化するＤＮＡ配列であるが、さもなし」れば、少なくと
も、対応する天然配列と実質的に同しである天然ＤＮＡ
配列の変種であることを特徴とする請求項４０記載の方
法。
１コ３ （１〔ｉ）　　ｌ−記ボリベプチＩが、クルスタキ（ｋ
ｕｒｓｔａｋｉ）、ハーリリー（ｂｅｒｌｉｎｃｒ）、
アレスティ（ａｌｅｓｔｉ）、ソｙ　ｈ（ｓｏｔｔｏ）
　、Ｌルウォルチ（ｔｏ１ｗｏｒＬｌ＋ｉ）、テンＩ：
’　ａす１、ス（ｄｅｎｄｒｏｌｉｍｕｓ）　、テ子ブ
リオニス（ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）及びイスラエレン
シス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）からなる群より選はれ
るバチラス　スリンギエンシスの適当な亜種のδ−エン
１”　ｌ弓１−シンポリベプヂＩ・と実質的に同しであ
ることを特徴とする請求１．ｆ目４記載の方法。
（４７）上記のδ−１ンｌ’　ｌ−キシン−ツー１−化
へＮ八配列が、殺虫性のＩ＞ｉｉ因となる天然のδ−エ
ン１、Ｉ−キシン−１−ド化配列と、少なくとも部分的
に実質的に同しであることを特徴とする請求項４５記載
の方法。
（４８）　、ｉ：記のδ−エン］１・−１−ノンコード
化ＤＮＡ配列かバチラス　スリンギエンシス　クルスタ
ー１１１０１変種の、配列Ｉにおいてヌクレオチド１５
６と３６２３との間に位置する１１１１　Ａ断ｊ−１で
あるか、または昆虫毒性作用を有するポリペブチ１、を
コーＩ・化する、短いＩＩＮＡ配列であるごとを特徴と
する請求項４４記載の方法。
１［′（ ３７０　　　　　３８０　　　　　３９０　　　　　１
．００　　　　　４１０　　　　　４２０ＧＴＣＣＣＴ
ＣＴＣＡ　　Ａ丁ＧＧ（ｉＡｃＧｃＡ　　ＴＴＴＣ丁Ｔ
ＧｉＴＡＣＡＡＡＴＴＧＡＡＣＡ　　ＧＴＴＡＡＴＴＡ
ＡＣＣＡＡＡＧＡＡ丁ＡＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧ
ＧＡＡＣＣＡＡ　　ＧＣＣＡＴＴＴＣ丁Ａ　　ＧＡＴＴ
ＡＧＡＡＧＧ　　ＡＣＴＡＡＧＣＡＡＴ　　ＣＴＴＴＡ
丁ＣＡＡＡ４９０　　　　　５００　　　　　５１０　
　　　　５２０　　　　　５３０　　　　　５ムＯＴ丁
ＴＡＣＣＣＡＧＡ　　ＡＴＣＴＴ丁ＴＡＧＡ　　ＧＡＧ
ＴＧＧＧＡＡＧ　　ＣＡＧＡＴＣＣ丁Ａｃ　　ＴＡＡＴ
ＣＣＡＧＣＡ　　丁ＴＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＡＴＧＣＧ
ＴＡＴ　　ＴＣＡＡＴＴＣＡＡ丁　ＧＡＣＡＴＧＡＡＣ
Ａ　　Ｇ丁ＧＣＣＣＴＴＡＣＡＡＣＣＧＣＴＡＴＴ　　
ＣＣＴＣＴＴＴＴ丁Ｇ亙お引」 ＣＡＧ丁ＴＣＡＡＡＡ　　ＴＴＡＴＣＡＡＧＴＴ　　Ｃ
ＣＴＣＴＴＴＴＡＴ　　ＣＡＧ丁ＡＴＡ丁ＧＴ　　ＴＣ
ｋＡＧＣＴＧＣＡ　　ＡＡ丁丁子ＡＣＡＴＴ＋０　　　
　　　　２０　　　　　　　３０　　　　　　　４０　
　　　　　　５０　　　　　　　６０ＧＴＴＡＡＣＡＣ
ＣＣＴＧＧＧＴＣＡＡＡＡＡ丁丁ＧＡＴＡＴττＡＧＴ
ＡＡＡＡＴＴＡＧＴＴ（ｉＣＡＣＴＴＴＧＴＧＣＡＴＴ
ＴＴＴ６７０　　　　　　　　６８０　　　　　　　　
６９０　　　　　　　　７００　　　　　　　　　〕＋
０　　　　　　　　７２０ＴＡＴＣＡＧ丁丁丁Ｔ　　Ｇ
ＡＧＡＧＡＴＧ丁丁　丁ＣＡＧＴＣｉ丁子丁Ｇ　　ＧＡ
ＣＡＡＡＧＣｉＴＧ　　ＧＧＧＡＴ丁丁ＧＡ丁子　ＧＣ
ＣＧＣＧＡＣＴＡ７０　　　　　　　８０　　　　　　
　９０　　　　　　　＋００　　　　　　１＋０　　　
　　　１２０ＴＣＡＴＡＡＧＡＴＧ　　ＡＧτＣＡＴＡ
ＴＧＴ　　τττＡＡＡττＧＴ　　ＡＧＴＡＡＴＧＡ
ＡＡ　　ＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡ　　ＴＡＴＣＡＴＡＡＴ
Ｇ７３０フ４０７５０７６０’）フ０７８０ＴＣＡＡＴ
ＡＧＴＣＧ　　ＴＴＡＴＡＡＴＧＡＴ　　ＴＴＡＡＣＴ
ＡＧＧＣＴＴＡＴＴＧＧＣＡＡ　　ＣＴＡＴＡＣＡＧＡ
Ｔ　　ＣＡＴＧＣ丁ＧＴＡＣ１３０＋４０　　　　　　
１５０　　　　　　１６０　　　　　　１７０　　　　
　　　＋８０ＡＡＴＴＧＧＴＡＴＣＴＴＡＡＴＡＡＡＡ
Ｇ　　ＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴ　　ＡＡＣＴＴＡＴＧＧＡ
　　ＴＡＡＣＡＡＴＣＣＧ　　ＡＡＣＡ丁ＣＡＡＴＧ７
９０　　　　　８００　　　　　８１０　　　　　８２
０　　　　　８３０　　　　　８１１＋０ＧＣＴＧＧＴ
ＡＣＡＡ　　ＴＡＣＧＧＧＡＴＴＡ　　ＧＡＧＣＧＴＧ
ＴＡＴ　　ＧＧＧＧＡＣＣＧＧＡ　　ＴＴＣＴＡＧＡＧ
ＡＴ　　ＴＧ（ｉＡＴＡＡＧＡＴ１９０　　　　　　２
００　　　　　　２＋０　　　　　　２２０　　　　　
　２３０　　　　　　２４０ＡＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴ
ＡＴｋＡＴＴＧＴ　　ＴＴＡＡＧＴＡＡＣＣＣＴＧＡＡ
ＧＴＡＧＡ　　ＡＧＴＡＴＴＡＧＧＴ　　０ＧＡＧＡＡ
ＡＧＡＡ８５０　　　　　８６０　　　　　　Ｂ２Ｏ８
８０８９０９００ＡＴＡＡＴＣＡＡ丁丁　ＴＡＧＡＡＧ
ＡＧＡＡ　　ＴＴＡＡＣＡＣ丁ＡＡ　　ＣＴＣＴＡＴＴ
ＡＧＡ　　ＴＡＴＣＧτＴＴＣＴ　　ＣＴＡＴ丁丁Ｃ丁
子ＡτＡＧＡＡＡＣＴＯＧＴＴＡＣＡＣＣＣＣＡＡＴＣ
ＧＡＴＡＴ丁丁ＣＣ丁丁ＧＴＣＧＣＴＡＡＣＣＣＡＡＴ
ＴＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＡＣＴＡＴ（ｉＡＴＡＧ　　
ＴＡＧＡＡＣＧＴＡＴ　　ＣＣＡＡＴＴＣＧＡＡ　　Ｃ
ＡＧＴＴＴＣＣＣＡ　　ＡＴＴＡＡＣＡＡＧＡ　　ＧＡ
ＡＡＴＴＴＡＴＡ３１０　　　　　　３２０　　　　　
　３３０　　　　　　３ムＯ３５０３６０ＡＡＴττＣ
ＴＴＣＣＣＧＧＴＧＣＴＧＧＡ　　Ｔ丁ＴＧＴＧＴＴＡ
Ｇ　　ＧＡＣＴＡＧＴＴＧＡ　　ＴＡＴＡＡτＡＴＧＧ
　　ＧＧＡＡＴＴＴτ丁ＧＣＡＡＡＣＣＣＡＧＴ　ＡＴ
ＴＡＧＡＡＡＡＴ　ＴＴＴＧＡＴＧＧＴＡ　ＧＴＴＴＴ
ＣＧＡＧＧ　ＣＴＣＧＧＣＴＣＡＧ　ＧＧＣＡＴＡＧＡ
ＡＧｌｏ：１０　　　　１０４０　　　　１０５０　　
　　１０６０　　　　１０７０　　　　１０８０ＧＡＡ
（ｉ丁ＡＴＴＡＧ　　ＧＡＧＴＣＣＡＣＡＴ　　ＴＴＧ
ＡＴＧＧＡＴＡ　　ＴＡＣＴＴＡＡＣＡＧ　　ＴＡＴＡ
ＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣＧＧＡＴＧｌ〔； ＋０９０　　　　　１１００　　　　　１１］０　　　
　　１１２０　　　　　１１３０　　　　　　＋１４０
ＣＴＣＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＧ丁Ｃ
ＡＧ（ｉＧＣＡＴＣＡＡＡＴＡＡＴＧＧＣτ丁ＣＴＣＣ
ＴＧＴＡＣ；ＧｌｏＴ丁τ丁ＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＧ
ＣＡＡＣＴＡＴＧ　　ＡＧ丁ＡＧ丁ＧＧＧＡ　　ＧＴＡ
ＡＴ丁ＴＡＣＡ　　ＧＴＣＣＧＧＡＡＧＣ丁子ＴＡＧＧ
ＡＣＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡ（ｉＡＡ丁丁丁子Ｃ丁丁丁丁
ＣＣ（ｉＣＴＡＴＡＴＧＧＡＡＣＴＡＴＧＧＧＡＡＡＴ
ＧＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＡＣＡＡＣ７ＡＧＧＴＴＴＴＡ
ＣＴＡＣＴＣＣＧＴＴＴ　　ＡＡＣＴτＴＴＣＡＡ　　
ＡＴＧＧＡＴＣＡＡＧ　　ＴＧＴＡ丁丁τ丁子Ｇ　　丁
子ＡＡＧ丁ＧＣＴＣ１２１０＋２２０　　　　　１２３
０　　　　　　＋２ム０　　　　　１２５０　　　　　
１２６０ＧＴＡＴＴＧＴ丁ＧＣ丁ＣＡＡＣＴＡＧＧＴ　
　ＣＡＧＧＧＣＧＴＧＴ　　ＡＴＡＧＡＡＣＡ丁丁　Ａ
丁ＣＣ丁子ＣＡＣＴ　　ＴＴＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＧＴ
ＣＴＴＣＡＡ　　ＴＴＣＡＧＧＣＡＡ丁　０ＡＡＣ丁丁
ＴＡＴＡ　　ＴＡＧＡＴＣにＡＡＴ　　ＴＧＡＡＴＴＴ
ＧＴＴ　　ＣＣＧＧＣＡＧＡＡＧ＋２７０　　　　　１
２８０　　　　　１２９０　　　　　１３００　　　　
　１３＋０　　　　　１３２０ＧＡＣＣＴτ丁ＴＡＡ　
　ＴＡτ＾ＧＧＧＡＴＡ　　ＡＡＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡ
Ｃ丁Ａ丁ＣＴＧＴ　　ＴＣＴＴＧＡＣＧＧＧ　　ＡＣＡ
ＧＡＡ丁丁ＴＧ＋丁子０　　　　　２０００　　　　　
２０１０　　　　　２０２０　　　　　２０３０　　　
　　２０１ｔＯＴＡＡＣＣＴＴＴＧＡ　　ＧＧＣＡＧＡ
ＡＴＡＴ　　ＧＡＴＴＴＡＧＡＡＡ　　ＧＡ（ｉＣＡＣ
ＡＡＡＡ　　Ｃ１ＧＣＧＧＴＧＡＡＴ　　ＧＡＧＣ丁Ｇ
丁ＴＴＡ（ＴＴＡＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＡＡＴ丁
丁ＧＣＣＡ丁ＣＣＧＣＴＧＴＡＴＡＣ丁子ＡＡＡＡＡＧ
ＣＧＧＡＡＣＧ（ｉＴＡＧＡ丁Ｔ２Ｏ５０２０６０２０
７０２０８０２０９０２＋００ＣＴ丁ＣＴＴＣＣＡＡ　
　ＴＣＡＡＡＴＣＣ（ｉＧ　　ＴＴＡＡＡＡＡＣＡＧ　
　ＡＴＧ丁ＧＡＣ（ｉ（ｉＡ　　Ｔ丁ＡＴＣＡ丁ＡＴＴ
　　ＧＡＴＣＡＡＧＴＡＴ１３９０　　　　　１Ｚ１０
０　　　　　１１１１０　　　　　１４２０　　　　　
１４３０　　　　　１４４０ＣＧＣ丁ＧＧＡＴＧＡ　　
ＡＡＴＡＣＣＧＣＣＡ　　ＣＡＧＡＡＴＡＡＣＡ　　Ａ
ＣＧＴＧＣＣＡＣＣＴＡ（ｉＧＣＡＡＧＧＡ　　ＴＴＴ
ＡＧＴＣＡＴＣ２＋１０　　　　　２１２０　　　　　
２１３０　　　　　２１４０　　　　　２１５０　　　
　　２＋６０ＣＣＡＡＴ丁ＴＡＧＴ　　ＴＧＡＧ丁ＧＴ
ＴＴＡ　　ＴＣＴＧＡＴＧＡＡ丁　ＴＴＴＧＴＣＴＧＧ
Ａ　　ＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＧＡＡＴＴＧＴＣＣＧ１
ム５０　　　　　１４６０　　　　　１４７０　　　　
　１４８０　　　　　１４９０　　　　　　＋５００Ｇ
ＡＴＴＡＡＧＣＣＡ　　ＴＣＴＴＴＣＡＡＴＧ　　τ丁
子ＣＧＴＴＣＡＧ　　ＧＣＴＴＴＡＧＴＡＡ　　ＴＡＧ
ＴＡＧＴＧＴＡ　　ＡＧＴＡＴＡＡＴＡＡ２１７０　　
　　　２］８０　　　　　２］９０　　　　　２２００
　　　　　２２１０　　　　　２２２０ＡＧＡＡＡＧ丁
ＣＡＡ　　ＡＣＡＴＧＣＧＡＡＧ　　ＣＧＡＣＴＴＡＧ
ＴＧ　　ＡＴＧＡＧＣＧＧＡＡ　　ＴＴＴＡＣ丁丁ＣＡ
丁子　ＧＡＴＣＣＡＡＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＴＡＴ　　
Ｇ丁子ＣＴＣ丁丁ＧＧ　　ＡＴＡＣＡＴＣＧＴＡ　　Ｇ
ＴＧＣＴＧＡＡＴτ　τｊｔＡＴＡＡＴＡＴＡ　　ＡＴ
丁ＣＣＴＴＣＡτ丁丁Ａ丁丁ＧＧＧｋＴ　　ＣｋＡＴＡ
ＧＡＣＡＡ　　ＣＴＡＧＡＣＣＧＴＧ　　ＧＣＴＧＧＡ
ＧＡＧＧ　　ＡＡＧＴＡＣＧＧＡＴ　　ＡＴＴＡＣＣＡ
ＴＣＣ＋５７０　　　　　１５８０　　　　　１５９０
　　　　　１６００　　　　　１６］０　　　　　１６
２０ＣＡＣＡＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＴＴＴＡ
ＡＣＡＡＡＡ丁ＣＴＡＣＴＡＡＴＣ丁丁ＧＧＣＴＣＴＧ
ＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＣＧ２２９０　　　　２３００　
　　　２３］０　　　　２３２０　　　　２３３０　　
　　２３４０ＡＡＧＧＡＧＧｃＧＡ　　丁ＧＡＣＧＴＡ
ＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＴＴ　　ＡＣＧＴＴＡＣＧＣ丁
　ＡＴＴＧＧＧＴＡＣＣＴ丁子ＧＡＴＧＡＧＴ１６３０
　　　　　１６ム０　　　　　１６５０　　　　　１６
６０　　　　　　＋６７０　　　　　１６８０ＴＴＡＡ
Ａ（ｉ（ｉＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡ　　ＧＧＡＧＧ
ＡＧＡＴＡ　　ＴＴＣＴＴＣＧＡＡＧ　　ＡＡＣＴＴＣ
ＡＣＣＴ　　ＧＧＣＣＡＧＡＴＴ丁ＧＣＴＡＴＣＣＭＣ
ＧＴＡＴ丁ＴＡＴＡＴ　　ＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧ　　Ａ
ＴＧＡＧ丁ＣＧＡＡ　　ＡＴＴＡＡＡＡＧＣＣＴＡＴＡ
ＣＣＣＧ丁丁１６９０　　　　　１７００　　　　　１
７＋０　　　　　１７２０　　　　　１７３０　　　　
　１７４０ＣＡＡＣＣＴＴＡＡＧ　　ＡＧＴＡＡＡＴＡ
ＴＴ　　ＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴ　　ＴＡＴＣＡＣＡＡＡ
Ｇ　　ＡＴＡＴＣＧＧＧＴＡ　ＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡ
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ＡＧ丁ＣＡＡＧＡＣＴＴＡＧＡＡＡＴＣＴＡＴ丁ＴＡＡ
ＴＴＣＧＣＴＡＣＡ１７５０１７６０１〕７０］フ８０
１７９０＋８００ＡＣＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＡＡＡ丁
ＴＴＡ　　ＣＡＡ丁ＴＣＣＡＴＡ　　ＣＡＴＣＡＡＴＴ
ＧＡ　　ＣＧＧＡＡＧＡＣＣＴ　　ＡＴＴＡＡＴＣＡＧ
Ｇ２４７０　　　　２ム１１０　　　　２４９０　　　
　２５００　　　　２５］０　　　　２５２０ＡＴＧＣ
ＣＡＡＡＣＡ　　ＣＧＡＡＡＣＡＧτＡ　　ＡＡＴＧＴ
ＧＣＣＡＧ　　ＧＴＡＣＧＧＧＴ丁ＣＣＴＴＡＴＧＧＣ
ＣＧ　　ＣＴＴＴＣＡＣ；ＣＣＣ２５３０　　　　　２
５４０　　　　　２５５０　　　　　２５６０　　　　
　２５７０　　　　　２．５８０ＣＡＡＧ丁ＣＣＡＡＴ
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ＣＣＣＡ丁ＣＡ丁ＴＴＣ丁ＣＣＴＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡ
ＴＧ丁丁Ｇ３２５０３２６０３２フ０３２８０３２９０
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Ｃ丁Ｇ丁ＧＴＡＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＴＡＴム　丁ＣＣ
ＡＡＡＣＡＡＣＡＣＧＧＴｋｋＣＧＴ２５９０　　　　
　２６００　　　　　２６＋０　　　　　２６２０　　
　　　２６３０　　　　　２６４０（ｉＡＴＧＴＡｃＡ
ＧＡ　　ＣＴＴＡＡＡＴＧＡＧ　　ＧＡＣＴＴＡＧＧＴ
Ｇ　　ＴＡ丁ＧＧＧＴＧＡＴ　　ＡＴＴＣＡＡＧＡＴＴ
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３２０　　　　　３３３０　　　　　３３ム０　　　　
　３３５０　　　　　３３６０ＧＴＡＡＴＧＡＴＴＡＴ
ＡＣＴＧＣＧＡＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＡＴＡＴＧＡＧＧ
Ｇ丁ＡＣＧＴＡＣＡＣＴＴＣＴＣＧＴＡＡＴＣＧＡ（ｉ
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ＣＴＡＧＡＡ丁　τ丁ＣＴＣＧＡＡＧＡ　　ＧＡＡＡＣ
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Ｇ　　ＡＧＣＣＴＡ丁ＧＡＡ　　ＡＧＣＡＡＴＴＣ丁丁
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３４６０　　　　　３ム７０　　　　　３４８０ＡＡＧ
ＡＡＡＡＡＧＣＡＴＡＴＡＣＡＧＡＴＧＧＡＣＧＡＡＧ
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２８９０　　　　　２９００、　　　２９１０　　　　
　２９２０　　　　　２９３０　　　　　２９４０ＧＣ
Ｇ丁丁ＣＡＴＡＧ　　ＣＡ丁丁子ＧＡＧＡＡ　　ＧＣ丁
丁子ＴＣＴＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ丁ＣＴＧＴＧＡτ丁Ｃ
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０３６９０３）００３７＋０３フ２゜Ｇ／ｉＴ丁ＡＣＴ
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０　　　　　　　３）６０　　　　　　　３）フ０　　
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Ｔ丁ＡＴＴＣ丁丁ＴＣＴＡＡＡＡＡＧＣＴＡＧＣＴＡＧ
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０　　　　３９５０　　　　３９６０ＡＴＴＴＴＴＴＡ
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ＣＡＴＴＴＡＡＣＣＣＣＴＴＣＴＣＴＴＴ　　丁ＧＧＡ
ＡＧＡＡＣＴ　　ＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡ　　Ｔ丁ＡＧＣ
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　４０４０　　　　　４０５０　　　　　　ム０６０　
　　　　４０７０　　　　　４０８０ＡＣＧＡＡＡＧＴ
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ＡＴＧＴＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧτＣＡＡＣＧＴＡＣＡ
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　　　４１３０　　　　　４＋４０ＧＡＧＴＧＡＴＴＣ
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ＣＡＣＧＣＣＧＣＣＡＣＡＧＣＡＣＴＣＴＴＡ丁ＧＡＧ
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ＡＡＴＴＴＴＴＧＡＡ　　ＡＴＡＴＡ丁ＴＴＴＴ４２１
０　　　　　　ｋ２２０　　　　　４２３０　　　　　
４２１＋０　　　　　４２５０　　　　　４２６０ＴＣ
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ＡＡＣＧＡＡＴＣＣＧＴＡＴ　　丁ＴＴＡＧＡＴＧＣＧ
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　　　　４３５０　　　　　　４３６０ＣＡ丁Ｇ丁ＡＴ
ＡＴＣＣＴＧＧＧＴＣＡＧＧ丁ＧＧＴＴＧ丁ＧＣＡＣＡ
ＡＡＣＴＧＣＡＧ（４９）バチラス　スリンギエンシス
内で、または非常に関係の深いバチラス　セレウス内で
、または両者の中で、複製することができること以外に
、一つのもしくはそれ以上の別の異種の宿主生物の中で
複製するごとができ、同種及び異種の両方の宿主系で同
定可能な二官能性ヘクタ（５０）　Ｊ−記の異種の宿主
生物が ａ）下記の種；バチラス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）、ス
フフィロコツカス（ＳＬａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、
ス１〜レプｌ−：Ｉ　シラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓ）　、スｌ−Ｌ／ブトマイセス（Ｓ　Ｌｒｅｐ　Ｌ
ｏｍｙｃｅｓ）、ン上−トモナス（Ｐ　Ｓ　ｅ　１１　
ｄ　Ｏｍ　Ｏｎ　ｉｌ　Ｓ　）、エシェリキア（ｌＥｓ
ｃｈｔ＝ｒｉｃｈｉａ）　、アグロバクテリウム（八１
＋ｒｏｈａｃｔｃｒｉｕｍ）、１ナルモネラ（Ｓａ１ｍ
ｏｎｔ中＋１）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等か
らなる群よりｊＸばれる原核生物、または ｈ）　イースＩ−１動物及び植物細胞等からなるＩＹか
ら選ばれる真核生物であることを特徴とする請求項４９
記載の二官能性ヘクタ （５１）上記の異種の宿主生物がＥ、ｃｏｌｉであるこ
とを特徴とする請求項５０記載の二官能性・＼クタ（５
２）　、、Ｉ−記の二官能１」・−フタ−が、ハチーラ
ス　スリン−１−エン、／スまたはそれに非常Ｇこ関係
の深いバチラス　セレウス、またはそれらの両方、及び
さらに少なくとも１もしくはそれ以上の他の異種源の宿
ヨ１生物内−どの複製及び選択りこ必要な機能を少なく
とも部分的にコーＩ化ずろ同種または異種のプラスミ１
１１　Ｎ　Ａからなることを特徴とする請求項４９記載
の二、官能性ヘクタ（５３）純粋に異種起源のプラスミ
ｌ’　Ｄ　Ｎ　Ａからなることを特徴とする請求項４９
記載の二官能性へクク（、’＋　４　）　ｔ］）　、、
ｌ−：　：肥の同種のプラスミｌ−１１ＮＡかバチラス
スリンギ〕−ンンスまたはバチラス　セレウスに天然に
？−１しるが、またはそれらと実質的に同し７１１Ｎ八
　゛であり、 ｂ）上記の異種プラスミド’ＤＮＡか ■）ド記の種・バチラス（Ｉｆｃｉｌｌｕｓ）、スタフ
イ「ｌ　ｍｌ　／カス（Ｓｔａｐｂｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
）、スＩ゛レプトコンカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ）　、ストレプトマイセス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙ
ｃｅｓ）、シー、−１’モリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）、コニシ丁−りこ１−ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）　　　アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｃｒｉ
ｕｍ１）、リルモ不う（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、コー
ルライニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等からなる群より選ばれ
る原核４物、または １１２）イースト、動物及び植物細胞等からなる君Ｙか
ら選ばれる真核什物に天然に４トシろＤＮＡであるが、
またはそれらと実質的に同しＩＩＮＡであることを特徴
とする請求項５２及び５３のいずれ力用項に記載の二官
能性ヘクタ （５５）上記の異種のプラスミｌＤＮ　ＡがＥ．ｃｏｌ
ｉに天然に生じるが、またはそれらと実質的に同しであ
るＤＮＡであるごとを特徴とする請求１ｆｊ５４記赦の
一官能性一、フタ （５６）同種及び異種の宿主系におＩＪる複製及び選択
に必須の機能に加えて、１もしくはそれ以−Ｌの発現し
うる型の遺伝子または他の慣用なＤＮＡ配列を含むこと
を特徴とする請求項４９記載の二官能性ヘクタ （５７）　Ｊ−記遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列が
同種、異種または合成起源であるが、さもなｉＪれＬ；
ｆ−ｌ−記遺伝了また＋ＪＤＮ八配列へ組み合わせから
なることを特徴とする請求項５６記載の二官能性ヘクク （５Ｂ）　、ｉ記の遺伝子か１もしくはそれ以上の構築
遺伝子及びバチラス　スリンギエンシスまた心Ｊバチラ
スセレウス内で、またはその両者内で機能しうる３′及
び５′配配置部配列からなり、該配列か１もし２くはぞ
れ以−ｌｘの構築遺伝子に実施可能に連結し、これによ
りバチラス　スリンギエンシスまたはバチラス　セレウ
スまたはその両方内での腺構築遺伝子の発現を保証する
ことを特徴とする請求項５６記載の二官能性・＼フタ（
５９）上記調節配列がプ１１モーター配列とターミネタ
ー配列の両刃、ｉｌｆｊびに３′及び５′未翻訳領域の
他の調節配列を含む発現シグナルであることを１、１ｊ
徴とずろ請求項５８記載の一官ｆｉヒ性ヘク夕 （６０）前記発現ソクリ゛ルかバチラス　スリンギエン
シスマたはバチラス　セレウスまたＧＪソの両者に天然
に什し７るが、またはこれらの天然発現ソゲナルの、天
然配列と実質的に同し突然変異体（ｍｕＬａｎＬ）及び
変種（ｖＢｒｉａｎｔ）であるごとを１、′Ｉ徴とする
請求項５９記載の二官能性ヘクタ（６１）上記発現ソゲ
ナルがバチラス　スリンギＪ１ーンシの胞子形成依存性
プし１−し−ターを含むことを特徴とする請求項６０記
載の二官能性・＼フタ（６２）上記構築遺伝子が、バチ
ラス　スリンギエンシスに天然に生じるδ　エンドトキ
ソンボリペブチト、またはそれらと実質的に同しポリペ
プチド゛、即ち少なくとも、バチラス　スリンキー’＋
１ンシスからの結晶性δ−コーンＦ’　ｌ・キシンボリ
ペプチトの性質を実質的に有するポリペブチ１をヨー１
化することを特徴とする請求項５８記載の官能性ヘクタ （６３）−に記構築遺伝了が、バチラス　スリンギエン
シスに天然にη二しるδ　エン１１・−１−ソンヲー１
１化するＤＮＡ配列であるが、さもなｉＪれは、少なく
とも、対応する天然配列と実質的に同じ−（ある天然Ｄ
ＮＡ配列の変種であることを特徴とする請求項５８記載
の二官能性・＼クタ （６４）上記ポリペブチ１が、クルスクキ（ｋｕｒｓｔ
ａｋｉｌｌ、ハーリリ”−（ｂｅｒｌｉｎｅｒ）、アレ
ステイに＋Ｉｅｓｔｉ）、ソｙ　１−（ｓｏｉｌ、ｏ）
　、ｔ−ルウイル−ｆ　（Ｌｏｌｗｏｒｔｈｉ）、−）
−ントｌ！リムス（ｔｌｅｎｄｒｏｉｉｍｕｓ）　、テ
不ゾリオユス（Ｌｃｎｅｂｒｉｏｎｉｓ）及びイスラコ
、レンノス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓｉｓ）からなるＩＣＹ
より選はれるバチラス　スリン−トエンラスのｊ内当な
亜種のδ−エン１−トギシンボリペブ千１・と実質的に
同し７であることを４！ｌ：徴とする請求項６２記載の
二官能性ヘクタ （６５）　　ｌ二記のδ　上ントｉ−トン−くｌ−ト化
ＯＮへ配列が、殺虫性の原因となる天然の６−］〜ンエ
ン１〜キＣ・ソー＋−１〜化配列と、少なくとも部分的
に実質的に同１−７であることを特徴とする請求項６３
記載の一官能性一へフタ （６６）−１−記のδ−−−１−ント１−キシンコード
化１１Ｎ八配列がノ＼千ラス　スリンートエンラス　ク
ルスタキ＋＋０１変柚の、配列＋４こおいてヌクレオチ
］用５６と３Ｇ２３との間に位置するＤＮＡ断片である
が、または昆虫１ｊＩ（ＱＨ作用を有ずろポリペプチド
を：＋　−１−化するより短いＤＮＡ配列であることを
特徴とする請求項６２記載の一羽官−能ＩＩしΣ久り一
ニ）−２３号 人ＡττＴＧＴＴＣＣＣＧＣＴＧＣＴＧＧＡ　　τ丁丁
Ｇ丁ＧＴＴＡＧ　　ＧＡＣＴＡＣＴＴＣｉＡ　　ＴＡＴ
ＡＡＴＡ丁ＧＯＧＧＡＡ丁τ丁丁τ丁子７０　　　　　
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　　　　　４２０ＧＴＣＣＣＴＣＴＣＡ　　ＡＴＧＣＧ
ＡＣＧＣＡ　　τ丁子ＣＴＴＧＴＡＣＡＡＡ丁ＴＧＡＡ
ＣＡ　　ＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＧＡＡＴＡＧ４
３０　　　　　　　　ム４０　　　　　　　　４５０　
　　　　　　　４６０　　　　　　　　　ム７０　　　
　　　　　４８０ｋＡＧＡＡＴＴＣＧＣＴＡＧＧＡＡＣ
ＣＡＡ　　ＧＣＣＡ丁丁丁丁子Ａ　　ＧＡＡＴＡＧＡＡ
ＧＧ　　ＡＣＴＡＡＧＣ入八τ　ＣＴＴへ八τＣへＡＡ
４９０　　　　　５００　　　　　５］０　　　　　５
２０　　　　　５３０　　　　　５４０ＴＴＴＡＣＧＣ
ＡＧＡＡＴＣＴ丁ττＡＧＡＧＡＧＴＧＯＧＡＡＧＣＡ
ＧＡＴＣＣτ＾ＣＴＡＡ丁ＣＣＡｆｌＣＡＴＴＡＡＧＡ
ｌｌｉＡＡＧＡｍ；ＡＴ（ｉＣＧＴＡＴ　　τＣＡＡＴ
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ＴＴＡＣ人ＡＣＣＧＣＴＡ丁子　ＣＣＴＣτ丁丁Ｔ丁丁
子］０　　　　　６２０　　　　　６３０　　　　　６
４０　　　　　６５０　　　　　６６０ＣＡＧ丁ＴＣ人
ＡＡＡ　　ＴＴＡＴＣＡＡＧ丁τ　ＣＣＴＣ丁丁Ｔ丁子
丁　ＣＡＧＴＡＴＡＴＧτ　丁ＣＡＡＧＣＴＧＣＡ　　
ＡＡτ丁ＴＡＣＡ丁τ面２η°」１ 丁ＡＴＣＪｔｆ：τ丁子丁ＧＡＧＡＧＡＴＧ丁丁丁ＣＡ
ＧＴＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧＧＴＧＧＧＧＡＴＴＴＣ
ＡＴＧＣＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＡＣＣＣＴＧＧ
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ＡＡ丁τＡ　　ＧＴＴＧＣＡＣＴＴＴ　　ＧＴＧＣＡτ
丁τττフ３０　　　　　　　７ムＯ７５０７６０７７
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ＢＯ９０１００１１０１２０ 丁ＣＡＴＡＡＧＡＴＧＡＧＴＣＡＴＡＴＧ丁Ｔτ丁ＡＡ
Ａ丁ＴＧＴＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＡ
ＴＡＴＣＡＴＡＡＴＧ７９０　　　　　　８００　　　
　　　８１０　　　　　　８２０　　　　　　８３０　
　　　　　　ＢＩＩＯＧＣＴＧＧＴＡＣＡＡ　　丁ＡＣ
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ＡＣＣＧＧＡ　　τ丁ＣＴＡＧＡＧＡＴ　　ＴＧＧＡＴ
ＡＡＧＡ丁１３０１１ｔＯ１５０１６０１フ０】８０Ｍ
ＴＴＧＧＴＡ丁ＣＴ丁ＡＡＴＡＡＡＡＧ　　ＡＣｉＡＴ
ＣＧＡＧＣＴ　　ＡＡＣＴＴＡＴＧＧＡ　　ＴＡＡＣＡ
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０８８０８９０９００ＡＴＡＡＴＣＡＡＴ丁丁ＡＧＡＡ
ＧＡ［、ＡＡＴＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＴＴＡＧ
ＡＴ人丁ＣＧＴＴＴＣＴＣＴＡ丁ＴＴＣＣＧｋ１９０　
　　　　２００　　　　　２１０　　　　　２２０　　
　　　２３０　　　　　２ム０ＡＡＴＧＣＡＴＴＣＣＴ
丁ＡτＡＡ丁丁ＧＴ　　ＴＴＡＡＧＴＡＡＣＣＣＴＧＡ
ＡＧＴＡＧＡ　ＡＧＴＡＴＴＡＧＧτ　ＧＧＭ、ＡＡＡ
ＧＡＡ９］０　　　　　　９２０　　　　　　９３０　
　　　　　９４０　　　　　　９５０　　　　　　９６
０ＡＣＴＡＴＧＡＴＡＧ丁ＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣＣＡＡ
τＴＣＧＡＡＣ／へＧＴＴＴＣＣＣＡＡτＴＡ／〜ＣＡ
ＡＧＡＣ７ＪＩＪＩＴ丁丁八丁Ａ２５０　　　　　２６
０　　　　　２７０　　　　　２Ｂ０　　　　　２９０
　　　　　３００丁ＡＧＡＡＡＣＴＧＧ　　τ丁ＡＣＡ
ＣＣＣＣＡ　　ＡＴＣＧＡτＡＴＴＴ　　ＣＣＴＴＧＴ
ＣＧＣτ　ＡＡＣＧＣＡＡ丁τ丁　ＣＴＴＴＴＧＡＧ丁
Ｇ９フ０９８０９９０１０００１０１０１０２０ＣＡＡ
ＡＣＣＣＡＣＴ　　ＡＴＴＡＧＡＡＡＡ丁　１１１０人
丁ＧＧＴＡ　　Ｃ丁子ＴＴＣＧＡＧＧ　　ＣＴＣＧＧＣ
ＴＣＡＧ　　ＧＧＣＡ丁ＡＧＡＡＧＧＡｊｔＣＴＡＴＴ
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ＴＡＣ丁τＡＡＣＡＧτＡＴＡＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＣ
ＧＧＡＴＧＡＣＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣｊｔＡＡ丁丁丁
ＡＣＡＡＴＴＣＣＡＴＡＣＡＴＣＡＡＴＴ（ｉＡＣＧＧ
ｋＡＧＡＣＣＴＡＴＴＡＡＴＣＡＧＧ＋０９０　　　　
　１１００　　　　　１１１０　　　　　１１２０　　
　　　１１３０　　　　　１１４０ＣＴＣＡＴＡＧＡＣ
Ｇ　　ＡＧＡＡＴＡＴＴＡ丁　丁ＧＧ丁ＣＡＧＧＧＣＡ
ＴＣＡＡＡＴ人Ａ丁　ＧＧＣＴＴＣＴＣＣ丁　Ｃ丁ＡＧ
ＣＧτ丁丁丁１８１０　　　　　１８２０　　　　　１
８３Ｄ　　　　　　１８４０　　　　　１８５０　　　
　　１８６０ＧＧＡＡＴＴττＴＣＡＧＣＡＡＣＴｋＴ
Ｇ　　ＡＧＴＡＧＴＣＧＧＡ　　ＣＴＡＡτττＡＣＡ
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ＣＣＴＡＴＡＴＧ　　ＧＡＡＣＴＡ丁ＧＧＧ　　ＡＡＡ
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８０１８９０１９００１９＋０　　　　　　＋９２０Ｔ
ＡＧＧＴＴＴＴＡＣ丁ＡＣ丁ＣＣＧＴＴＴ　　ＡＡＣＴ
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ＴＡＣＧ　　ＴＴＡＡＧＴＧＣＴＣ０ＴＡＴＴＧＴＴＣ
ｉＣＴＣＡＡＣＴＡＣＧＴ　　ＣＡＧＧＧＣＧ丁（ｉＴ
　　ＡＴＡＧＡＡＣＡＴＴ　　ＡＴＣＧＴＣＣＡＣＴ　
　丁子ＡＴＡＴＡＧＡＡ１９３０　　　　　１９ム０　
　　　　１９５０　　　　　１９６０　　　　　１９７
０　　　　　１９８０ＡＴ（ｉＴＣ丁ＴＣＡＡ　　ＴＴ
ＣＡＧＧＣＡＡ丁　ＧＡＡＣＴＴＴＡＴＡ　　ＴＡＧＡ
ＴＣＣｉ人人丁　　τＧＡＡＴＴ丁ＣＴＴ　　ＣＣＧＧ
ＣＡＧｋＡＧ１２７０　　　　１２８０　　　　１２９
０　　　　１３００　　　　　　＋３１０　　　　１３
２０ＧＡＣＣＴＴＴＴＡＡ　　ＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡ　
　ＡＡＴＡＡＴＣＡＡＣＡＡＣＴＡＴＣＴＧＴ　　丁Ｃ
ＴＴＧＡＣＧＧＧ　　ＡＣＡＧＡＡＴＴＴＧ１９９０　
　　　　２０００　　　　　２０１０　　　　　２０２
０　　　　　２０Ｂ０　　　　　２０４０丁ＡＡＣＣＴ
丁丁ＧＡ　　ＧＧＣＡＧＡＡＴＡＴ　　ＧＡＴＴＴＡＧ
ＡＡＡ　　ＧＡＧＣＡＣＡＡＡＡ　　ＧＧＣＧＧＴＧＡ
ＡＴ　　ＧＡＧＣＴＧＴ丁ＴＡＣττＡＴＧＯＡＡＣＣ
ＴＣＣＴＣＡＡＡＴ　　丁ＴＧＣＣＡＴＣＣＧ　　ＣＴ
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ＴＧＣＡＧ（う７）請求項３４ないし４Ｈのいずれか１
項に記載の方法θルーつに従って製造された二官能性ベ
クター（ｆｉ）ｉ）バチラス　フ、リンギコーンシス　
クルスタキ１１１’］１ｃｒｙＢ（ＤＳ門４５７２）変
種に形質転換により導入された二官能性ベクターｐＸ　
！６］　（ｐＭ６１）。
（６９）バチラス　スリンギエンシス　クルスタキ１１
０ｂ：ｒｙＩｌ（ＤＳＭ　４５７１）変種及びバチラス
　セレウス５６９Ｋ（ＤＳＭ　４５７３）に形質転換に
より導入された官（ｉヒ性ベクター、ＩＸ　１９３　（
ｐＫ９３）。
（７０）請求項４９ないし６９のいずれ力用項に記載の
官能性ベクターを含有する宿主細胞。
（７１）宿主細胞か微住物である請求項７０記載の宿主
細胞。
（７２）宿主細胞かバクテリアである請求項７１記載の
宿主細胞。
（７３）宿主細胞かＥ、ｃｏｌｉである請求項７１記載
の宿圭細１１包。
（７４）宿主細胞かバチラス　スリンギエンシスまた番
」バチラス　セレウスである請求項７１記載の宿」１．
Ｉｌ胞。
３〔； ３゛ン （７５）宿主細胞がイースト及び動物及び植物の細胞か
らなる群からｊＫばれる真核細胞−（ある請求項７０記
載の宿主細胞。
（７６）請求、ＴＪｊ４９ないし６９のいずれか１項に
記載の官能性ベクターで形質転換されたバチラス　スリ
ンギエンシス。
（７７）請求項６６記載の二官能性ベクターで形質転換
されたバチラス　スリンギエンシス　クルスタキＩＩ　
Ｄ　１　ｃ、ｒ　ｙ　ｌＮ変種。
（７８）　ｍ官能性・＼クターｐＸ１６１　（ｐＫ６１
）で形質転換され、ＤＳＭ　４５７２の番月で寄託され
ているバチラススリンギエンシス　クルスタキ１ｌＤＩ
ｃｒｙｌｌ変種。
（７９）　−１官能性ヘク９−ｐＸＩ９３（ｐＫ９３）
で形質転換され、ＤＳＭ　４５７１の番号で寄託されて
いるバチラススリンギエンシス　クルスクキＩＩ　Ｄ　
Ｉ　ｃ　ｒ　ｙ　Ｂ変種。
（８０）請求項４９ないし６９のいずれか１項に記載の
官能性−・ククーで形質転換されたバチラス　セレウス
。
（８Ｉ）二官能性ベクター、Ｘｌ９３（＋）Ｋ２Ｓ）で
形質転換され、ＤＳＭ　４５７３の番号て寄託されてい
るバチラスセレウス５Ｇ！ＩＫ　。
（８２）バチラス　スリンキ」−ンシスまたはバチラス
セレウス、またはその両方の形質転換のために、請求ｓ
、Ｑｔ＋　９ないし６９のいずれ力用項に記載のニー官
能１４ｔ、−＼フタ−を用いることを特徴とする請求項
１及び２のいずれか１項に記載の方法。
（８３）バチラス　スリンギエンシス　クルスタキ１１
１１ｂ：ｒｙＢ変種か請求項４９ないし７６９のいずれ
か１項に記載の土官能竹ベクターて形質転換されること
を特徴とする請求項８２記載の方法。
（＋１４）　ｆｉ）　　バチラス　スリンギエンシスに
天然に生じるδ−エンドトキ、ノンポリペプ千１′をコ
ード化するが、またはこれらと実質的に同じボリベプヂ
１をコード化する横築造伝了を含有する組み換えＤＮＡ
分子で形質転換されたバチラス　スリン：Ｆ　二しンシ
スまたはハ゛チラス　セレウスて、または両石の混合物
で、さもなければ、１））　　上記の形質転換されたバ
チラス細胞を用いて製造されたプロＩ・−１−シンを含
有°づる、細胞を含：１・ない結晶体製剤−ζ、昆虫ま
たし、１その成台地を処理することからなる昆虫の防除
方法。
（８５）上記のａ）による、形質転換された牛きている
が、または死んでいるバチラス　スリンギエンシス及び
／またはバチラス　セレウス細胞と、上記のｈ）による
、上記の形質転換されたバチラス細胞で製造されるプロ
１キソンを含有−する、細胞を含まない結晶体製剤とか
らなる殺虫性／ｌＬ合物を用いることを特徴とする請求
項８４記載の方法。
（８６）　ａ）　　請求項４９ないし６９のいずれ力用
項に記載の二官能性ベクターで形質転換されたバチラス
スリンギエンシスまたはバチラス　セレウス、または両
者の混合物で、さもなければ、ｂ）　上記の形質転換さ
れたバチラス細胞で製造されるブロトキンンを含有する
細胞を含まない結晶体製剤で、昆虫またはその成育地を
処理することからなる昆虫の防除方法。
（８７）上記の、１）による形質転換された、生きてい
るが、または死ん（いるバチラス　スリツギ：１−ンン
ス及び／またはバチラス　セレウス細胞及び−Ｉ−記の
１］）による上記の形質転換されたバチラス細胞で製造
されろプし１１−）ノンを含イＪする細胞を含まない結
晶体製剤からなる殺虫性混合物を用いることを特徴とす
る請求項８Ｇ記載の方法。
（８８）昆虫が鱗翅目（Ｌ（！ｐ　１ｄｏｐ　ｔｅｒａ
）　、多翅目（ＤｉｐＬｅｒａ）　、及び鞘翅Ｊ］（Ｃ
ｏｌｅｏｐｔｅｒ；ｉ）の昆虫であるご七を特徴とする
請求項８４ないし８７のいずれ力用項記載の方法。
（８９）昆虫が鱗翅目の昆虫であるごとを特徴とする請
求項８８記載の方法。
（９０）　ａ）　　バチラス　スリンギエンシスに天然
に生じるδ−コニントー１・・）−ンンボリペブヂｌを
二ノー１化するが、またはこれらと実質的に同じボリペ
プナトをコーｌ化する構築遺伝子を含イｒする組み換え
ＤＮＡ分子で形質転換したバチラス　スリンギエンシス
またはバチラス　セレウス細胞で、または該バチラス細
胞の混合物、さもなければ、）＋）　　上記の形質転換
されたバチラス細胞で製造されるブＩ］トキノンを含有
する細胞を含まない結晶体製剤をａ、−＋＠　Ｊｌｊ偵
−にイ剌用ぐｔ−る担イ和−分−敗または　　　びノ　
　と廿に含有する昆虫防除用組成物。
（９１）　ａ）による形質転換された生きているが、ま
たは死んでいるバチラス　スリンギエンシス及び／また
はバチラス　セレウス細胞及び１〕）による上記の形質
転換されたバチラス細胞で製造されるブｏ　ｌ−キシン
を含有する細胞を含まない結晶体製剤からなる殺虫性混
合物を、慣用的に使用される担体、分散剤または担体及
び分散剤と共に含有するごとを特徴とする請求項９０記
載の昆虫防除用組成物。
（９２）　ａ）　　請求項４０ないし５４のいずれ力用
項に記載の二官能性ベクターで形質転換されたバチラス
スリンギエンシスまたはバチラス　セレウス細胞、また
は該バチラス細胞の／Ｆｔ合物、さもなければ、 ｂ）　上記の形質転換されたバチラス細胞により製造さ
れるブＩコ）・キノンを含有する細胞を含まない結晶体
製剤を、慣用的に使用される担体、分散剤または担体及
び分散剤と共に含有することを特徴とする昆虫防除用組
成物。
（９３）　ａ）による形質転換された生きているが、ま
たは死んでいるバチラス　スリンギエンシス及び／また
はバチラス　セレウス細胞及びｂ）による上記の形質転
換されたバチラス細胞で製造されるプロトキシンを含有
する細胞を含まない結晶体製剤からなる殺虫性混合物を
、慣用的に使用される担体、分散剤または担体及び分散
剤と共に含有するごとを特徴とする請求項９２記載の昆
虫防除用に；［ｉ酸物。
（！１４）　ａ）遺伝子を単離し、 ｂ）　所望する場合には、バチラス　スリンギエンシス
内で機能しうる発現配列に前記単離遺伝子を操作可能に
結合し、 ｃ）　　Ｉ−ｒｉｌ＋）からの遺伝子構築物をバチラス
　スリン−１−エンシス細胞内に適当なベクターを用い
た形質転換により導入し、そして （］）所望する場合には、相当する遺伝子産生物を発現
させ、そＵ７て所望する場合にはそれを単離゛Ｊろごと
からなるバチラス　スリンギエンソス内に遺伝子を挿入
し、りＩ′：１−ニングし、そして発現さ−Ｕる方法。
（９５）　ａ）ｉｊ！伝子転子離し、 ｂ）　　所望する場合には、バチラス　セレウス内で機
能しうる発現配列に前記単離遺伝子を操作可能に結合し
、 Ｃ）　項］））からの遺伝子構築物をバチラス　−シＬ
・ウス細胞内に適当なベクターを用いた形質転換により
導入し、そして ｄ）所望する場合には、相当する遺伝子産生物を発現さ
せ、そして所望する場合にはそれを単離することからな
るバチラス　セレウス内に遺伝子を挿入し、クローニン
グし、そして発現さ・Ｕる方法。
（９６）　前記のＭ転子がバチラス　スリンギエンシス
のプ［ＩＩ・キシン遺伝子であることを特徴とする請求
項９４及び９５のいずれ力司項に記載の方法。
（９７）　Ｊ−記発現配列が、バチラス　スリンギエン
シスの胞子形成依存プ１−ｚモーターを含むことを１．
１徴とする請求項９４及び９５のいずれ力用項に記載の
方法。
（９８）直接クローニングベクターか使用されることを
特徴とする請求項９４及び９５のいずれか１項に記載の
方法。
（９９）二官能性（ン＋　１−ル（ｓｂｕＬＬｌ（り：
ｌベクターが使用されることを特徴とする請求項９４及
び９５のいずれか１項に記載の方法。
（１００）　　遺伝子の代わりに他の有用なＤＮＡ配列
をハチシス　細胞に挿入し、その中でり［１−ン化する
ことを１、を徴とするごとを特徴とする請求項９４及び
９５のいずれか１項に記載の方法。
（１０］　）　ａ　）ハチシス　スリンギエンシスの全
体のＤＮＡを適当な制限酵素を用いて前イしし、ｂ）／
Ｌ成した制限断ハから適当な大きさのものを分離し、 Ｃ）　前記断へを適当なベクター内に挿入し、（１）　
　バチラス　スリンギエンシス細胞を前記ベクターで形
質転換し、そして Ｃ）　適当なスクリーニング法を用いて、形質転換体か
ら新規なＤＮＡ配列を単離することからな４Ｆ） るバチラス　スリンギ：［ンシス内に新しい遺伝子また
はその他の有用なＤＮＡ配列を直接りｌｉ＋　−ニング
し、発現さセ、そして同定する方法。
（１０２）　ａ）バチラス　スリンギエンシスの全体の
ＩＩＮ八を適当な制限酵素を用いて’（ｉ’ＵＬ　Ｌ、
、ｂ）　生成した制限断片から適当な大きさのものを分
離し、 Ｃ）　前記断片を適当なベクター内に挿入し、ｄ）　バ
チラス　セ１ノウス細胞を１１１１記・＼ククーて形質
転換し、そして ｅ）　適当なスクリーニング法を用いて新規なＯＮへ配
列を位置決めし、所望によってはそれを形質転換体から
単離するごとからなるハチうスセレウス内に新しい遺伝
子またはその他の有用なＤＮＡ配列を直接クローニング
し、発現さ−リ、そして同定する方法。
（１０３）　　Ｊ−記の新しい遺伝子がプｌ、１トキシ
ン追伝了であるごとを特徴とする請求項ｌｏｔ及び１０
２のいずれか１項に記載の方法。
（１，０４）　　直接り１７−ニンクー・ククーが使用
されるごとを特徴とする請求項１０１及び１０２のいず
れか１項記載の方法。
（１０５）　　シャ］・ルベクターが使用されることを
特徴とする請求項１０１及び１０２のいずれか１項に記
載の方法。
（１０６）　　新しいＤＮＡ配列を位置決めするために
免疫学的スクリーニング方法が使用されることを特徴と
する請求項１０１及び１０２のいずれ力ｑ項に記載の力
曾去。
（１０７）　　同種、及び特に異種のＤＮＡ　、または
同種の１１ＮＡと異種のＤＮＡとの組み合わせのクロー
ニング及び発現のための−・般的な宿主細胞としてのバ
チラス　スリンギエンシス及び／またはバチラス　セレ
ウスの使用方法。」 手叙εネ山正亡：

Claims (107)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）バチラススリンギエンシスを、該バチラススリン
    ギエンシスの遺伝子操作に適する組み換えＤＮＡを用い
    る単純な形質転換方法により高い効率で形質転換するこ
    とからなる、直接的な、標的を定めた、そして再現可能
    な、組み換えＤＮＡを用いるバチラススリンギエンシス
    の遺伝子操作のための方法。
  2. （２）バチラスセレウスを、該バチラスセレウスの遺伝
    子操作に適する組み換えＤＮＡを用いる単純な形質転換
    方法により高い効率で形質転換することからなる、直接
    的な、標的を定めた、そして再現可能な、組み換えＤＮ
    Ａを用いるバチラスセレウスの遺伝子操作のための方法
    。
  3. （３）バチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウ
    スの形質転換をエレクトロポレーションを用いて行うこ
    とを特徴とする請求項１及び請求項２のいずれか１項に
    記載の方法。
  4. （４）バチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウ
    スの形質転換を以下の工程段階：ａ）バチラススリンギ
    エンシス細胞の生長に適当である培養培地中、該細胞の
    生長に適当な通気を行っての、適当な細胞密度の細胞懸
    濁液の調整、 ｂ）該細胞懸濁液からの細胞の分離及び次のエレクトロ
    ポレーションに適当な接種緩衝液中への再懸濁、 ｃ）エレクトロポレーションに適当な濃度でのＤＮＡ試
    料の添加、 ｄ）段階ｂ）及びｃ）に記載したバッチのエレクトロポ
    レーション装置への導入、 ｅ）バチラススリンギエンシス及び／またはバチラスセ
    レウス細胞の組み換えＤＮＡでの形質転換に適度である
    期間、高電解強度の短期間生成のための細胞懸濁液に対
    するコンデンサーの１回またはそれ以上の短い放電、 ｆ）エレクトロポレーションを行った細胞の選択的な再
    培養、 ｇ）エレクトロポレーションを行った細胞の適当な選択
    培地上での平板培養、及び ｈ）形質転換された細胞の選択からなることを特徴とす
    る請求項３記載の方法。
  5. （５）請求項４のａ）に記載の細胞懸濁液の製造のため
    にバチラススリンギエンシスの胞子を用いることを特徴
    とする請求項４記載の方法。
  6. （６）請求項４のｅ）に記載した細胞懸濁液のエレクト
    ロポレーションのために、深く凍結されたバチラススリ
    ンギエンシス及び／またはバチラスセレウス細胞を用い
    ることを特徴とする請求項４記載の方法。
  7. （７）バチラススリンギエンシス細胞の培養のために、 ａ）好気性バチラス種の培養のために慣用的に使用され
    ているような、容易に同化できる炭素源及び窒素源を有
    する複合栄養培地を使用し、 ａ１）所望により、さらに、ビタミン及び必須金属イオ
    ンをａ）に記載した培地に添加するか；または ｂ） ｂ１）複合または限定された容易に同化できる炭素源及
    び窒素源またはそれら二つの組み合わせ、及びさらに、 ｂ２）必須ビタミン及び金属イオンを含有する完全に合
    成または半合成の栄養培地 を使用することを特徴とする請求項４記載の方法。
  8. （８）上記のバチラス細胞懸濁液の光学的濃度が０．１
    ないし１．０であることを特徴とする請求項４記載の方
    法。
  9. （９）ｂ）で記載した接種緩衝液が浸透圧的に安定な燐
    酸塩緩衝液であることを特徴とする請求項４記載の方法
    。
  10. （１０）上記の燐酸塩緩衝液が安定剤として糖または糖
    アルコールを含有することを特徴とする請求項９記載の
    方法。
  11. （１１）上記安定剤がサッカロースであり、０．１Ｍな
    いし１．０Ｍの濃度で存在することを特徴とする請求項
    １０記載の方法。
  12. （１２）上記燐酸塩緩衝液のｐＨがｐＨ５．０ないしｐ
    Ｈ８．０であることを特徴とする請求項９記載の方法。
  13. （１３）バチラス細胞の接種が０℃ないし３５℃の温度
    でエレクトロポレーションの前、間及び後に行われるこ
    とを特徴とする請求項４記載の方法。
  14. （１４）バチラス細胞の接種が２℃ないし１５℃の温度
    でエレクトロポレーションの前、間及び後に行われるこ
    とを特徴とする請求項４記載の方法。
  15. （１５）添加したＤＮＡ試料の濃度が１ｎｇないし２０
    μｇであることを特徴とする請求項４記載の方法。
  16. （１６）上記ＤＮＡ試料がベクターＤＮＡであることを
    特徴とする請求項１５記載の方法。
  17. （１７）エレクトロポレーションの途中で、バクテリア
    細胞に、コンデンサーからＤＮＡ含有細胞懸濁液を通っ
    ての短い放電を、短期間、非常に高い電場の強さで作用
    させ、結果としてバチラススリンギエンシスまたはバチ
    ラスセレウス細胞の透過性を、懸濁液内のＤＮＡがバチ
    ラス細胞に吸収されるように増加させることを特徴とす
    る請求項４記載の方法。
  18. （１８）電場の強さが１００Ｖ／ｃｍないし５０，００
    ０Ｖ／ｃｍであることを特徴とする請求項１７記載の方
    法。
  19. （１９）電場の強さが１００Ｖ／ｃｍないし１０，００
    ０Ｖ／ｃｍであることを特徴とする請求項１７記載の方
    法。
  20. （２０）バチラス細胞懸濁液に作用させるパルスの指数
    崩壊時間が約２ｍｓないし約５０ｍｓの範囲内にあるこ
    とを特徴とする請求項４記載の方法。
  21. （２１）エレクトロポレートされた細胞を、適当な続い
    てのインキュベーション段階の後、形質転換されたバチ
    ラス細胞の選択に適する添加剤を含有する固体培地上に
    延べることを特徴とする請求項４記載の方法。
  22. （２２）上記の添加剤が、テトラサイクリン、カナマイ
    シン、クロラムフェニコール、エリスロマイシンからな
    る群から選択されるバチラススリンギエンシスまたはバ
    チラスセレウスの選択に適する抗生物質であることを特
    徴とする請求項２１記載の方法。
  23. （２３）上記の添加剤が、バチラススリンギエンシスま
    たはバチラスセレウスの選択に適する、染色性物質であ
    ることを特徴とする請求項２１記載の方法。
  24. （２４）バチラススリンギエンシスまたはバチラスセレ
    ウスの形質転換に使用される組み換えＤＮＡが同種また
    は異種の起源であるか、または同種及び異種のＤＮＡの
    組み合わせであることを特徴とする請求項１及び２記載
    の方法。
  25. （２５）上記の組み換えＤＮＡが１またはそれ以上の構
    築遺伝子及びバチラススリンギエンシスまたはバチラス
    セレウスまたはその両方において機能することができ、
    １もしくはそれ以上の構築遺伝子に操作可能に連結し、
    これによりバチラススリンギエンシスまたはバチラスセ
    レ ウスまたはその両方内での該構築遺伝子の発現を保証す
    る３′及び５′配置調節配列を有することを特徴とする
    請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
  26. （２６）上記構築遺伝子が、バチラススリンギエンシス
    に天然に生じるδ−エンドトキシンポリペプチド、また
    はそれらと実質的に同じポリペプチド、即ち少なくとも
    、バチラススリンギエンシスからの結晶性δ−エンドト
    キシンポリペプチドの性質を実質的に有するポリペプチ
    ドをコード化することを特徴とする請求項１及び２のい
    ずれか１項に記載の方法。
  27. （２７）上記δ−エンドトキシン−コード化ＤＮＡ配列
    が殺虫活性の原因となる天然のδ−エンドトキシン−コ
    ード化配列と少なくとも部分的に同じであることを特徴
    とする請求項２６記載の方法。
  28. （２８）上記ＤＮＡがベクターＤＮＡであることを特徴
    とする請求項２４記載の方法。
  29. （２９）上記ベクターＤＮＡがプラスミドＤＮＡから誘
    導されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
  30. （３０）上記ベクターＤＮＡがファージＤＮＡから誘導
    されることを特徴とする請求項２８記載の方法。
  31. （３１）バチラススリンギエンシス内で、または非常に
    関係の深いバチラスセレウス内で、または両者の中で、
    複製することができること以外にも、少なくとも一つの
    、さもなければいくつかの別の異種の宿主生物の中で複
    製することができ、同種及び異種の両方の宿主系で同定
    可能な二官能性ベクターを形質転換のために用いること
    を特徴とする請求項１及び２記載の方法。
  32. （３２）上記の異種の宿主生物が ａ）下記の種：バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフ
    ィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スト
    レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スト
    レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュー
    ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（
    Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇ
    ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
    ｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等からな
    る群より選ばれる原核生物、または ｂ）イースト、動物及び植物細胞等からなる群から選ば
    れる真核生物であることを特徴とする請求項３１記載の
    方法。
  33. （３３）上記の異種の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉであるこ
    とを特徴とする請求項３２記載の方法。
  34. （３４）ａ）まず、同種または異種起原のプラスミドＤ
    ＮＡを適当な制限酵素を用いて断片に壊し、そして ｂ）次に、各々所望の宿主系内で複製及び選択に必須の
    機能を含む断片を、適当な酵素の存在下、異なる宿主系
    内での複製及び選択のために必須の機能が保持されるよ
    うな方法で、再び互いに結合することからなる、バチラ
    ススリンギエンシス及び／またはバチラスセレウスの形
    質転換に適する二官能性ベクターの製造方法。
  35. （３５）純粋に異種起原のプラスミドＤＮＡを用いるこ
    とを特徴とする請求項３４記載の方法。
  36. （３６）ａ）上記の同種のプラスミドＤＮＡが、バチラ
    ススリンギエンシスまたはバチラスセレウスに天然に生
    じるか、またはそれらと実質的に同じＤＮＡであり、 ｂ）上記の異種プラスミドＤＮＡが ｂ１）下記の種：バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタ
    フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ス
    トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ス
    トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュ
    ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア
    （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アグロバクテリウム（Ａ
    ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏ
    ｎｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等から
    なる群より選ばれる原核生物、または ｂ２）イースト、動物及び植物細胞等からなる群から選
    ばれる真核生物に天然に生じるＤＮＡであるか、 またはそれらと実質的に同じＤＮＡであることを特徴と
    する請求項３４及び３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. （３７）上記の異種のプラスミドＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ
    に天然に生じるか、またはそれらと実質的に同じである
    ＤＮＡであることを特徴とする請求項３６記載の方法。
  38. （３８）同種及び異種の宿主系における複製及び選択に
    必須の機能に加えて、１もしくはそれ以上の発現しうる
    型の遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列を含み、該遺伝
    子または有用なＤＮＡ配列が適当な酵素を用いて上記二
    官能性ベクターに挿入されることを特徴とする請求項３
    ４記載の二官能性ベクターの製造方法。
  39. （３９）上記遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列が同種
    、異種または合成起源であるか、さもなければ上記遺伝
    子またはＤＮＡ配列の組み合わせからなることを特徴と
    する請求項３８記載の方法。
  40. （４０）上記の遺伝子が１もしくはそれ以上の構築遺伝
    子及びバチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウ
    ス内で、またはその両者内で機能しうる３′及び５′装
    置調節配列からなり、該配列が１もしくはそれ以上の構
    築遺伝子に操作可能に連結し、これによりバチラススリ
    ンギエンシスまたはバチラスセレウスまたはその両方内
    での該構築遺伝子の発現を保証することを特徴とする請
    求項３８記載の方法。
  41. （４１）上記調節配列がプロモーター配列とターミネー
    ター配列の両方、並びに３′及び５′未翻訳領域の他の
    調節配列を含む発現シグナルであることを特徴とする請
    求項４０記載の方法。
  42. （４２）上記発現シグナルがバチラススリンギエンシス
    またはバチラスセレウスまたはその両者に天然に生じる
    か、またはこれらの天然発現シグナルの、天然配列と実
    質的に同じ突然変移体（ｍｕｔａｎｔ）及び変種（ｖａ
    ｒｉａｎｔ）であることを特徴とする請求項４１記載の
    方法。
  43. （４３）上記発現シグナルがバチラススリンギエンシス
    の胞子形成依存性プロモーターを含むことを特徴とする
    請求項４２記載の方法。
  44. （４４）上記構築遺伝子が、バチラススリンギエンシス
    に天然に生じるδ−エンドトキシンポリペプチド、また
    はそれらと実質的に同じポリペプチド、即ち少なくとも
    、バチラススリンギエンシスからの結晶性δ−エンドト
    キシンポリペプチドの性質を実質的に有するポリペプチ
    ドをコード化することを特徴とする請求項４０記載の方
    法。
  45. （４５）上記構築遺伝子が、バチラススリンギエンシス
    に天然に生じるδ−エンドトキシンをコード化するＤＮ
    Ａ配列であるか、さもなければ、少なくとも、対応する
    天然配列と実質的に同じである天然ＤＮＡ配列の変種で
    あることを特徴とする請求項４０記載の方法。
  46. （４６）上記ポリペプチドが、クルスタキ（ｋｕｒｓｔ
    ａｋｉ）、バーリナー（ｂｅｒｌｉｎｅｒ）、アレステ
    ィ（ａｌｅｓｔｉ）、ソット（ｓｏｔｔｏ）、トルウォ
    ルチ（ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）、デンドロリムス（ｄｅｎ
    ｄｒｏｌｉｍｕｓ）、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉ
    ｏｎｉｓ）及びイスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓ
    ｉｓ）からなる群より選ばれるバチラススリンギエンシ
    スの適当な亜種のδ−エンドトキシンポリペプチドと実
    質的に同じであることを特徴とする請求項４４記載の方
    法。
  47. （４７）上記のδ−エンドトキシン−コード化ＤＮＡ配
    列が、殺虫性の原因となる天然のδ−エンドトキシンコ
    ード化配列と、少なくとも部分的に実質的に同じである
    ことを特徴とする請求項４５記載の方法。
  48. （４８）上記のδ−エンドトキシンコード化ＤＮＡ配列
    がバチラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１変種の、
    配列 I においてヌクレオチド１５６と３６２３との間
    に位置するＤＮＡ断片であるか、または昆虫毒性作用を
    有するポリペプチドをコード化する、短いＤＮＡ配列で
    あることを特徴とする請求項４４記載の方法。 ￥配列 I ￥ 【遺伝子配列があります】
  49. （４９）バチラススリンギエンシス内で、または非常に
    関係の深いバチラスセレウス内で、または両者の中で、
    複製することができること以外に、一つのもしくはそれ
    以上の別の異種の宿主生物の中で複製することができ、
    同種及び異種の両方の宿主系で同定可能な二官能性ベク
    ター。
  50. （５０）上記の異種の宿主生物が ａ）下記の種：バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフ
    ィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、スト
    レプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スト
    レプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュー
    ドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア（
    Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アグロバクテリウム（Ａｇ
    ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎ
    ｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等からな
    る群より選ばれる原核生物、または ｂ）イースト、動物及び植物細胞等からなる群から選ば
    れる真核生物であることを特徴とする請求項４９記載の
    二官能性ベクター。
  51. （５１）上記の異種の宿主生物がＥ．ｃｏｌｉであるこ
    とを特徴とする請求項５０記載の二官能性ベクター。
  52. （５２）上記の二官能性ベクターが、バチラススリンギ
    エンシスまたはそれに非常に関係の深いバチラスセレウ
    ス、またはそれらの両方、及びさらに少なくとも１もし
    くはそれ以上の他の異種源の宿主生物内での複製及び選
    択に必要な機能を少なくとも部分的にコード化する同種
    または異種のプラスミドＤＮＡからなることを特徴とす
    る請求項４９記載の二官能性ベクター。
  53. （５３）純粋に異種起源のプラスミドＤＮＡからなるこ
    とを特徴とする請求項４９記載の二官能性ベクター。
  54. （５４）ａ）上記の同種のプラスミドＤＮＡがバチラス
    スリンギエンシスまたはバチラスセレウスに天然に生じ
    るか、またはそれらと実質的に同じＤＮＡであり、 ｂ）上記の異種プラスミドＤＮＡが ｂ１）下記の種：バチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタ
    フィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ス
    トレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ス
    トレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュ
    ードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア
    （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、アグロバクテリウム（Ａ
    ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏ
    ｎｅｌｌａ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）等から
    なる群より選ばれる原核生物、または ｂ２）イースト、動物及び植物細胞等からなる群から選
    ばれる真核生物に天然に生じるＤＮＡであるか、または
    それらと実質的に同じＤＮＡであることを特徴とする請
    求項５２及び５３のいずれか１項に記載の二官能性ベク
    ター。
  55. （５５）上記の異種のプラスミドＤＮＡがＥ．ｃｏｌｉ
    に天然に生じるか、またはそれらと実質的に同じである
    ＤＮＡであることを特徴とする請求項５４記載の二官能
    性ベクター。
  56. （５６）同種及び異種の宿主系における複製及び選択に
    必須の機能に加えて、１もしくはそれ以上の発現しうる
    型の遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列を含むことを特
    徴とする請求項４９記載の二官能性ベクター。
  57. （５７）上記遺伝子または他の有用なＤＮＡ配列が同種
    、異種または合成起源であるか、さもなければ上記遺伝
    子またはＤＮＡ配列の組み合わせからなることを特徴と
    する請求項５６記載の二官能性ベクター。
  58. （５８）上記の遺伝子が１もしくはそれ以上の構築遺伝
    子及びバチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウ
    ス内で、またはその両者内で機能しうる３′及び５′配
    置調節配列からなり、該配列が１もしくはそれ以上の構
    築遺伝子に実施可能に連結し、これによりバチラススリ
    ンギエンシスまたはバチラスセレウスまたはその両方内
    での該構築遺伝子の発現を保証することを特徴とする請
    求項５６記載の二官能性ベクター。
  59. （５９）上記調節配列がプロモーター配列とターミネー
    ター配列の両方、並びに３′及び５′未翻訳領域の他の
    調節配列を含む発現シグナルであることを特徴とする請
    求項５８記載の二官能性ベクター。
  60. （６０）上記発現シグナルがバチラススリンギエンシス
    またはバチラスセレウスまたはその両者に天然に生じる
    か、またはこれらの天然発現シグナルの、天然配列と実
    質的に同じ突然変移体（ｍｕｔａｎｔ）及び変種（ｖａ
    ｒｉａｎｔ）であることを特徴とする請求項５９記載の
    二官能性ベクター。
  61. （６１）上記発現シグナルがバチラススリンギエンシの
    胞子形成依存性プロモーターを含むことを特徴とする請
    求項６０記載の二官能性ベクター。
  62. （６２）上記構築遺伝子が、バチラススリンギエンシス
    に天然に生じるδ−エンドトキシンポリペプチド、また
    はそれらと実質的に同じポリペプチド、即ち少なくとも
    、バチラススリンギエンシスからの結晶性δ−エンドト
    キシンポリペプチドの性質を実質的に有するポリペプチ
    ドをコード化することを特徴とする請求項５８記載の二
    官能性ベクター。
  63. （６３）上記構築遺伝子が、バチラススリンギエンシス
    に天然に生じるδ−エンドトキシンをコード化するＤＮ
    Ａ配列であるか、さもなければ、少なくとも、対応する
    天然配列と実質的に同じである天然ＤＮＡ配列の変種で
    あることを特徴とする請求項５８記載の二官能性ベクタ
    ー。
  64. （６４）上記ポリペプチドが、クルスタキ（ｋｕｒｓｔ
    ａｋｉ）、バーリナー（ｂｅｒｌｉｎｅｒ）、アレステ
    ィ（ａｌｅｓｔｉ）、ソット（ｓｏｔｔｏ）、トルウォ
    ルチ（ｔｏｌｗｏｒｔｈｉ）、デンドロリムス（ｄｅｎ
    ｄｒｏｌｉｍｕｓ）、テネブリオニス（ｔｅｎｅｂｒｉ
    ｏｎｉｓ）及びイスラエレンシス（ｉｓｒａｅｌｅｎｓ
    ｉｓ）からなる群より選ばれるバチラススリンギエンシ
    スの適当な亜種のδ−エンドトキシンポリペプチドと実
    質的に同じであることを特徴とする請求項６２記載の二
    官能性ベクター。
  65. （６５）上記のδ−エンドトキシン−コード化ＤＮＡ配
    列が、殺虫性の原因となる天然のδ−エンドトキシンコ
    ード化配列と、少なくとも部分的に実質的に同じである
    ことを特徴とする請求項６３記載の二官能性ベクター。
  66. （６６）上記のδ−エンドトキシンコード化ＤＮＡ配列
    がバチラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１変種の、
    配列 I においてヌクレオチド１５６と３６２３との間
    に位置するＤＮＡ断片であるか、または昆虫毒性作用を
    有するポリペプチドをコード化するより短いＤＮＡ配列
    であることを特徴とする請求項６２記載の方法。 ￥配列 I ￥ 【遺伝子配列があります】
  67. （６７）請求項３４ないし４８のいずれか１項に記載の
    方法の一つに従って製造された二官能性ベクター。
  68. （６８）バチラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１ｃ
    ｒｙＢ（ＤＳＭ４５７２）変種に形質転換により導入さ
    れた二官能性ベクターｐＸＩ６１（ｐＫ６１）。
  69. （６９）バチラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１ｃ
    ｒｙＢ（ＤＳＭ４５７１）変種及びバチラスセレウス５
    ６９Ｋ（ＤＳＭ４５７３）に形質転換により導入された
    二官能性ベクターｐＸＩ９３（ｐＫ９３）。
  70. （７０）請求項４９ないし６９のいずれか１項に記載の
    二官能性ベクターを含有する宿主細胞。
  71. （７１）宿主細胞が微生物である請求項７０記載の宿主
    細胞。
  72. （７２）宿主細胞がバクテリアである請求項７１記載の
    宿主細胞。
  73. （７３）宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである請求項７１記載
    の宿主細胞。
  74. （７４）宿主細胞がバチラススリンギエンシスまたはバ
    チラスセレウスである請求項７１記載の宿主細胞。
  75. （７５）宿主細胞がイースト及び動物及び植物の細胞か
    らなる群から選ばれる真核細胞である請求項７０記載の
    宿主細胞。
  76. （７６）請求項４９ないし６９のいずれか１項に記載の
    二官能性ベクターで形質転換されたバチラススリンギエ
    ンシス。
  77. （７７）請求項６６記載の二官能性ベクターで形質転換
    されたバチラススリンギエンシスクルスタ キＨＤ１ｃｒｙＢ変種。
  78. （７８）二官能性ベクターｐＸＩ６１（ｐＫ６１）で形
    質転換され、ＤＳＭ４５７２の番号で寄託されているバ
    チラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種
    。
  79. （７９）二官能性ベクターｐＸＩ９３（ｐＫ９３）で形
    質転換され、ＤＳＭ４５７１の番号で寄託されているバ
    チラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１ｃｒｙＢ変種
    。
  80. （８０）請求項４９ないし６９のいずれか１項に記載の
    二官能性ベクターで形質転換されたバチラスセレウス。
  81. （８１）二官能性ベクターｐＸＩ９３（ｐＫ９３）で形
    質転換され、ＤＳＭ４５７３の番号で寄託されているバ
    チラスセレウス５６９Ｋ。
  82. （８２）バチラススリンギエンシスまたはバチラスセレ
    ウス、またはその両方の形質転換のために、請求項４９
    ないし６９のいずれか１項に記載の二官能性ベクターを
    用いることを特徴とする請求項１及び２のいずれか１項
    に記載の方法。
  83. （８３）バチラススリンギエンシスクルスタキＨＤ１ｃ
    ｒｙＢ変種が請求項４９ないし６９のいずれか１項に記
    載の二官能性ベクターで形質転換されることを特徴とす
    る請求項８２記載の方法。
  84. （８４）ａ）バチラススリンギエンシスに天然に生じる
    δ−エンドトキシンポリペプチドをコード化するか、ま
    たはこれらと実質的に同じポリペプチドをコード化する
    構築遺伝子を含有する組み換えＤＮＡ分子で形質転換さ
    れたバチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウス
    で、または両者の混合物で、さもなければ、 ｂ）上記の形質転換されたバチラス細胞を用いて製造さ
    れたプロトキシンを含有する、細胞を含まない結晶体製
    剤で、昆虫またはその成育地を処理することからなる昆
    虫の防除方法。
  85. （８５）上記のａ）による、形質転換された生きている
    か、または死んでいるバチラススリンギエンシス及び／
    またはバチラスセレウス細胞と、上記のｂ）による、上
    記の形質転換されたバチラス細胞で製造されるプロトキ
    シンを含有する、細胞を含まない結晶体製剤とからなる
    殺虫性混合物を用いることを特徴とする請求項８４記載
    の方法。
  86. （８６）ａ）請求項４９ないし６９のいずれか１項に記
    載の二官能性ベクターで形質転換されたバチラススリン
    ギエンシスまたはバチラスセレウス、または両者の混合
    物で、さもなければ、 ｂ）上記の形質転換されたバチラス細胞で製造されるプ
    ロトキシンを含有する細胞を含まない結晶体製剤で、昆
    虫またはその成育地を処理することからなる昆虫の防除
    方法。
  87. （８７）上記のａ）による形質転換された、生きている
    か、または死んでいるバチラススリンギエンシス及び／
    またはバチラスセレウス細胞及び上記のｂ）による上記
    の形質転換されたバチラス細胞で製造されるプロトキシ
    ンを含有する細胞を含まない結晶体製剤からなる殺虫性
    混合物を用いることを特徴とする請求項８６記載の方法
    。
  88. （８８）昆虫が鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、多
    翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、及び鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔ
    ｅｒａ）の昆虫であることを特徴とする請求項８４ない
    し８７のいずれか１項記載の方法。
  89. （８９）昆虫が鱗翅目の昆虫であることを特徴とする請
    求項８８記載の方法。
  90. （９０）ａ）バチラススリンギエンシスに天然に生じる
    δ−エンドトキシンポリペプチドをコード化するか、ま
    たはこれらと実質的に同じポリペプチドをコード化する
    構築遺伝子を含有する組み換えＤＮＡ分子で形質転換し
    たバチラススリンギエンシスまたはバチラスセレウス細
    胞で、または該バチラス細胞の混合物、さもなければ、
    ｂ）上記の形質転換されたバチラス細胞で製造されるプ
    ロトキシンを含有する細胞を含まない結晶体製剤を含有
    する昆虫防除用組成物。
  91. （９１）ａ）による形質転換された生きているか、また
    は死んでいるバチラススリンギエンシス及び／またはバ
    チラスセレウス細胞及び ｂ）による上記の形質転換されたバチラス細胞で製造さ
    れるプロトキシンを含有する細胞を含まない結晶体製剤
    からなる殺虫性混合物を、慣用的に使用される担体、分
    散剤または担体及び分散剤と共に含有することを特徴と
    する請求項９０記載の昆虫防除用組成物。
  92. （９２）ａ）請求項４０ないし５４のいずれか１項に記
    載の二官能性ベクターで形質転換されたバチラススリン
    ギエンシスまたはバチラスセレウス細胞、または該バチ
    ラス細胞の混合物、さもなければ、 ｂ）上記の形質転換されたバチラス細胞により製造され
    るプロトキシンを含有する細胞を含まない結晶体製剤を
    、慣用的に使用される担体、分散剤または担体及び分散
    剤と共に含有することを特徴とする昆虫防除用組成物。
  93. （９３）ａ）による形質転換された生きているか、また
    は死んでいるバチラススリンギエンシス及び／またはバ
    チラスセレウス細胞及び ｂ）による上記の形質転換されたバチラス細胞で製造さ
    れるプロトキシンを含有する細胞を含まない結晶体製剤
    からなる殺虫性混合物を、慣用的に使用される担体、分
    散剤または担体及び分散剤と共に含有することを特徴と
    する請求項９２記載の昆虫防除用組成物。
  94. （９４）ａ）遺伝子を単離し、 ｂ）所望する場合には、バチラススリンギエンシス内で
    機能しうる発現配列に前記単離遺伝子を操作可能に結合
    し、 ｃ）項ｂ）からの遺伝子構築物をバチラススリンギエン
    シス細胞内に適当なベクターを用いた形質転換により導
    入し、そして ｄ）所望する場合には、相当する遺伝子産生物を発現さ
    せ、そして所望する場合にはそれを単離することからな
    るバチラススリンギエンシス内に遺伝子を挿入し、クロ
    ーニングし、そして発現させる方法。
  95. （９５）ａ）遺伝子を単離し、 ｂ）所望する場合には、バチラスセレウス内で機能しう
    る発現配列に前記単離遺伝子を操作可能に結合し、 ｃ）項ｂ）からの遺伝子構築物をバチラスセレウス細胞
    内に適当なベクターを用いた形質転換により導入し、そ
    して ｄ）所望する場合には、相当する遺伝子産生物を発現さ
    せ、そして所望する場合にはそれを単離することからな
    るバチラスセレウス内に遺伝子を挿入し、クローニング
    し、そして発現させる方法。
  96. （９６）上記の遺伝子がバチラススリンギエンシスのプ
    ロトキシン遺伝子であることを特徴とする請求項９４及
    び９５のいずれか１項に記載の方法。
  97. （９７）上記発現配列が、バチラススリンギエンシスの
    胞子形成依存プロモーターを含むことを特徴とする請求
    項９４及び９５のいずれか１項に記載の方法。
  98. （９８）直接クローニングベクターが使用されることを
    特徴とする請求項９４及び９５のいずれか１項に記載の
    方法。
  99. （９９）二官能性（シャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ））ベク
    ターが使用されることを特徴とする請求項９４及び９５
    のいずれか１項に記載の方法。
  100. （１００）遺伝子の代わりに他の有用なＤＮＡ配列をバ
    チラス細胞に挿入し、その中でクローン化することを特
    徴とすることを特徴とする請求項９４及び９５のいずれ
    か１項に記載の方法。
  101. （１０１）ａ）バチラススリンギエンシスの全体のＤＮ
    Ａを適当な制限酵素を用いて昇華し、 ｂ）生成した制限断片から適当な大きさのものを分離し
    、 ｃ）前記断片を適当なベクター内に挿入し、 ｄ）バチラススリンギエンシス細胞を前記ベクターで形
    質転換し、そして ｅ）適当なスクリーニング法を用いて、形質転換体から
    新規なＤＮＡ配列を単離することからなるバチラススリ
    ンギエンシス内に新しい遺伝子またはその他の有用なＤ
    ＮＡ配列を直接クローニングし、発現させ、そして同定
    する方法。
  102. （１０２）ａ）バチラススリンギエンシスの全体のＤＮ
    Ａを適当な制限酵素を用いて昇華し、 ｂ）生成した制限断片から適当な大きさのものを分離し
    、 ｃ）前記断片を適当なベクター内に挿入し、 ｄ）バチラスセレウス細胞を前記ベクターで形質転換し
    、そして ｅ）適当なスクリーニング法を用いて新規なＤＮＡ配列
    を位置決めし、所望によってはそれを形質転換体から単
    離することからなるバチラスセレウス内に新しい遺伝子
    またはその他の有用なＤＮＡ配列を直接クローニングし
    、発現させ、そして同定する方法。
  103. （１０３）上記の新しい遺伝子がプロトキシン遺伝子で
    あることを特徴とする請求項１０１及び１０２のいずれ
    か１項に記載の方法。
  104. （１０４）直接クローニングベクターが使用されること
    を特徴とする請求項１０１及び１０２のいずれか１項記
    載の方法。
  105. （１０５）シャトルベクターが使用されることを特徴と
    する請求項１０１及び１０２のいずれか１項に記載の方
    法。
  106. （１０６）新しいＤＮＡ配列を位置決めするために免疫
    学的スクリーニング方法が使用されることを特徴とする
    請求項１０１及び１０２のいずれか１項に記載の方法。
  107. （１０７）同種、及び特に異種のＤＮＡ、または同種の
    ＤＮＡと異種のＤＮＡとの組み合わせのクローニング及
    び発現のための一般的な宿主細胞としてのバチラススリ
    ンギエンシス及び／またはバチラスセレウスの使用方法
    。
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