PL164138B1 - Sposób bezposredniego, docelowo ukierunkowanego i odtwarzalnego manipulowania genetycznego bakteriami Gram-dodatnimi PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób bezposredniego, docelowo ukierunkowanego i odtwarzalnego manipulowa- nia genetycznego bakteriami Gram- dodatnimi, wybranymi ze zbioru obejmujacego B. thuringiensis i B. cereus, znamienny tym, ze (a) wyodrebnia sie wlaczany DNA, przy czym korzystnie chodzi o DNA plazmidowy, DNA kodujacy lub DNA o funkcji regulatorowej; (b) tak wyodrebniony DNA w wektorze, który jest w stanie replikowac w bakteryjnej komórce gospodarza, wybranego ze zbioru obejmujacego B.thuringiensis i B.cereus, klonuje sie wewnatrz heterologicznego ukladu klonowania; (c) tak sklonowany DNA wyodrebnia sie i wlacza bezposrednio w omówiona komórke bakteryjna z szybkoscia transformacji, która wystarcza na przeciwzwyciezenie bariery restrykcyjnej istniejacej wewnatrz tej komórki bakteryjnej; i (d) tak stransformowana komórke bakteryjna hoduje sie i ewentualnie wyod- rebnia sie sklonowany wektor-DNA. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób docelowo ukierunkowanego i odtwarzalnego manipulowania genetycznego bakteriami Gram- dodatnimi, który za pomocą technologii rekombinantowego DNA po raz pierwszy umożliwia bezpośrednie i docelowe ukierunkowane manipulowanie genetyczne bakteriami Bacillus thuringiensis i blisko spokrewnionymi bakteriami B.cereus, bazując na skutecznym sposobie transformacji dla omówionych gatunków Bacillus.

W sposobie według wynalazku wykorzystuje się włączanie i ewentualnie ekspresję genów lub innych użytecznych sekwencji DNA w bakterii Bacillus thuringiensis i/lub Bacillus cereus, zwłaszcza zaś włączanie i ekspresję genów protoksyny.

Bacillus thuringiensis należy do dużej grupy Gram-dodatnich, aerobowych bakterii zarodnikujących. W odróżnieniu od bardzo blisko spokrewnionych rodzajów Bacillus, takich jak B. cereus i B. abthracis, większość z dotychczas znanych gatunków B. thuringiensis produkuje w toku swej sporulacji parasporalne ciałka wtrętowe, które z powodu swej krystalicznej struktury na ogół zwane są też ciałkami krystalicznymi. To ciałko krystaliczne jest złożone z owadobójczo czynnych, krystalicznych protein protoksyny z tzw. 8-endotoksyny.

Te kryształy proteinowe są odpowiedzialne za insektotoksyczność bakterii B. thuringiensis. Ta δ-endotoksyna wykazuje jednak swą aktywność owadobójczą dopiero po doustnym wchłonięciu ciałka krystalicznego i po jego roztworzeniu w alkalicznym soku żołądkowym owadów docelowych oraz po uwolnieniu właściwego składnika toksycznego na drodze ograniczonej proteolizy wskutek oddziaływania proteaz z przewodu trawiennego tych owadów.

Te δ-endotoksyny różnych szczepów B. thuringiensis odznaczają się swą wysoką specyficznością wobec określonych owadów docelowych, zwłaszcza wobec larw różnych Lepigoptera, Coleoptera i Diptera oraz odznaczają się swą wysoką skutecznością. Dalsze zalety, które odgrywają rolę w przypadku stosowania 8-endotoksyn bakterii B. thuringiensis, mają uzasad12 nienie w oczywistej trudności wykazania przez owady docelowe oporności na krystaliczną proteinę oraz w nieszkodliwości tych toksyn wobec ludzi, innych ssaków, ptaków, ryb lub owadów z wyjątkiem wyżej omówionych owadów docelowych.

Potencjał owadobójczy protoksyn bakterii B. thuringiensis rozpoznano już bardzo dawno temu. Już od końca lat 20-tych stosuje się preparaty z B. thuringiensis jako bioinsektycydy do zwalczania różnych, przez owady spowodowanych chorób roślin uprawnych. Wraz z odkryciem B. thuringiensis var. israelensis przez ¹⁷ Goldberg’a i Margalit’a (1977r.) oraz B. thuringiensis var. tenebrionis przez ²⁷ Krieg’a i współpracowników (1983r.) można było zakres stosowania B. thuringiensis rozciągnąć nawet na larwy długoczułkich i chrząszczy.

Z wprowadzeniem technologii genetycznej i wynikających z niej nowych możliwości nabrała dziedzina toksyn B. thuringiensis nowego rozmachu.

I tak klonowanie genów 8-endotoksyny w organizmach obcych gospodarzy, jak np. w E. coli, należy już do rutyny. Doprowadziło to do tego, że tymczasem sekwencje DNA całego szeregu genów endotok^ny są znane (np. ³⁷ Schnepf HE i Whiteley HR, 1981; ⁴⁷ Klier A i współpracownicy, 1982;⁵⁷ Geiser M i współpracownicy, 1986; Haider MR i współpracownicy, 1987).

Większość gatunków B. thuringiensis zawiera kilka genów, które kodują owadobójczą proteinę. Te geny, które tylko podczas fazy sporulacji podlegają ekspresji, są w większości przypadków zlokalizowane na dużych, dających się przenieść plazmidach (30-150 Md) i mogą przeto być bardzo łatwo wymienione pomiędzy różnymi szczepami B. thuringiensis oraz pomiędzy B. thuringiensis a B. cereus, jeżeli te są zdolne do przystosowania się (' Gonzalez JM i współpracownicy, 1982).

Geny protoksyny z B.thuringiensis var. kurstaki należą do rodziny pokrewnych genów, z których różne już klonowano i dzielono na sekwencje. Prace te przede wszystkim przeprowadzano w układzie klonowania E. coli.

Klonowanie genów B. thuringiensis zatem było dotychczas ograniczone zasadniczo do pewnych nielicznych i wyłącznie heterologicznych układów gospodarza, z których najlepiej przebadanym i zrozumianym jest układ E. coli.

Tymczasem jednak znane się stały również sprawozdania o uwieńczonych powodzeniem klonowaniu i ekspresji genów protoksyny o układach innych gospodarzy, jak np. w B. subtilis (47 Klier A i współpracownicy, 1982), Pseudomonas fluorestens (® Obukowicz Mg i współpracownicy, 1986), oraz Saccharomyces cerevisiae (europejski opis EP 0 238 441). Także wbudowanie i ekspresja genu endotoksyny w komórkach gospodarza roślinnego udała się w tym czasie (opis europejski EP nr 0 292 435).

W przypadku klonowania w E. coli wykorzystuje się fakt, że niektóre geny protoksyny dodatkowo do Gram-dodatnich promotorów zawierają przypadkiem również promotor E. colipodobny. Te promotoro-podobne sekwencje DNA czynią możliwym to, że geny protoksyny B. thuringiensis także w heterologicznych układach gospodarza mogą podlegać ekspresji, jeśli są one w stanie rozpoznawać wyżej wspomniane sekwencje kontrolne.

Podległe ekspresji proteiny protoksyny można wówczas, po otwarciu komórek gospodarza, wyodrębniać i identyfikować za pomocą znanych sposobów.

Jednak w tym czasie okazało się, że nie we wszystkich przypadkach w genach protoksyny są obecne promotory E. coli-podobne (^9/ Donovan i współpracownicy, 1988), tak więc dotychczas tylko całkiem określone geny protoksyny, spełniające warunki poprzednio omówione, mogły w heterologicznych układach gospodarza podlegać ekspresji i tym samym być identyfikowane.

Klonowanie genów poza organizmem naturalnego gospodarza oraz stosowanie tych szczepów praktyczne jako bioinsektycydów jest przeto związane z szeregiem niedogodności po części obciążających:

a) Ekspresja genów protoksyny B. thuringiensis jest możliwa tylko w określonych przypadkach.

b) Nie następuje na ogół żadne lub następuje tylko nieznaczne wydzielanie podległych ekspresji protein obcych.

138

c) Prawidłowe pofałdowanie tych δ-endotoksyn jest w redukującym środowisku heterologicznych komórek gospodarza nie zawsze zapewnione, co w następstwie może prowadzić do niepożądanej zmiany specyficznej aktywności lub żywicielskiego zasięgu tych toksyn.

d) Jeżeli ekspresja w ogóle zachodzi, to szybkości ekspresji klonowanych genów obcych wśród sekwencji naturalnej ekspresji są przeważnie tylko nieznaczne.

^3/: 1^Q/Schnepf i Whidey (1981; 1985) szacują, że klonowana w E. coli toksyna B. thuringiensis stanowi tylko 0,5-1% wszystkich protein komórkowych E. coli, podczas gdy proteina krystaliczna w B. thuringiensis stanowi 30-40% suchej masy kultur zarodnikujących. Te niekorzystne różnice w szybkości ekspresji prawdopodobnie sprowadzają się do braku specyficznych dla sporulacji sygnałów kontrolnych w heterologicznych układach gospodarzy oraz do trudności podczas rozpoznawania promotorów B. thuringiensis i/lub do problemów podczas potranslacyjnej modyfikacji cząsteczki toksyny przez obcego gospodarza.

e) Wiele z ogólnie do ekspresji stosowanych szczepów gospodarzy jest pod względem toksykologicznym nie tak nieszkodliwych, jak B. thuringiensis i B. cereus.

f) B. thuringiensis i B. cereus tworzą naturalny składnik główny mikrobowej flory glebowej, co nie dotyczy większości ze szczepów gospodarzy stosowanych ogólnie do ekspresji.

Te poprzednio omówione problemy i trudności można byłoby przezwyciężyć, gdyby udało się wspomniane geny B. thuringiensis klonować bezpośrednio w homologicznym układzie gospodarza, gdzie naturalne Gram-dodatnie promotory genów protoksyny mogłyby zostać wykorzystane do ekspresji.

Nie istnieje dotąd żaden sposób, który bakterii B. thuringiensis, tej z komercyjnego punktu widzenia tak ważnej bakterii, dawałby możliwość bezpośredniej modyfikacji genetycznej i tym samym, np. umożliwiałby skuteczne ponowne włączanie sklonowanego genu protoksyny do szczepu B. thuringiensis.

Przyczynę tego należy przede wszystkim widzieć w tym, że dotąd nie udało się opracować sprawnego systemu transformacji dla B. thuringiensis oraz dla blisko spokrewnionej B. cereus, który zapewniłby wystarczająco duże wydajności transformacji i tym samym umożliwiałby też wobec B. thuringiensis stosowanie już opanowanych technik-rDNA.

Dotychczas stosowane sposoby wytwarzania nowych szczepów B. thuringiensis o nowych właściwościach owadobójczych opierają się przede wszystkim na koniugalnym przenoszeniu kodowanych plazmidem genów protoksyny.

Uwieńczone powodzeniem ponowne włączenie do B. thuringiensis sklonowanego genu krystalicznej^proteiny B. thuringiensis jest dotychczas opisane dopiero w jednym jedynym przypadku (^IlfKlier A i współpracownicy, 1983), przy czym jednak nawet tu, z braku odpowiedniego systemu transformacji dla B. thuringiensis, musiano sięgnąć do koniugalnego przenoszenia między B. subtilis a B. thuringiensis. Również w przypadku tego, przez Kliefa i współpracowników opisanego sposobu stosuje się E. coli jako gospodarza pośredniego.

Te sposoby koniugalnego przenoszenia wykazują jednak cały szereg ciążących niedogodności, pozwalających uznać te sposoby za nieodpowiednie dla rutynowego stosowania w celu genetycznej modyfikacji B. thuringiensis i/lub B. cereus.

a) Koniugalne przenoszenie kodowanych plazmidem genów protoksyny jest możliwe tylko między szczepami B. thuringiensis lub między B. cereus a B. thuringiensis, które są ze sobą zdolne do przystosowania się.

b) W przypadku koniugalnego przenoszenia plazmidu między bardziej odległymi szczepami często osiąga się tylko nikłą częstość przeniesienia.

c) Nie istnieje żadna możliwość regulowania lub modyfikowania ekspresji genów protoksyny.

d) Nie istnieje żadna możliwość modyfikowania samego genu.

e) W przypadku obecności wielu genów protoksyny w jednym szczepie może ekspresja poszczególnych genów być silnie zredukowana z powodu tzw. efektu gen-dawka.

f) Może dojść do wystąpienia niestabilności z powodu możliwej homologicznej rekombinacji stosowanych genów protoksyny.

Alternatywne sposoby transformacji, tymczasem znajdujące rutynowe zastosowanie przykładowo w przypadku wielu organizmów Gram- dodatnich, okazało się nieodpowiednie zarówno w przypadku B. thuringiensis jak i w przypadku B. cereus.

Do poprzednio wspomnianych sposobów należą np. bezpośrednia transformacja protoplastów bakterii za pomocą traktowania glikolem polietylenowym, którą z powodzeniem stosowano w przypadku wielu szczepów Streptomyces (^12/ Bibb JJ i współpracownicy, 1978) oraz w przypadku B. subtilis (^13/ Chang S i Cohen SN, 1979), B. megaterium (^14/ Brown BJ i Carlton BC, 1980), Streptococcus lactis (^15/ Kondo JK i McKay LL, 1984), S. faecalis (^16/ Wirth R i współpracownicy), Corynebacterium glutamicum (^17/ Yoshihama M i współpracownicy, 1985) oraz w przypadku licznych innych bakterii Gram-dodanich.

W celu stosowania tych sposobów należy najpierw komórki bakterii przeprowadzić w protoplasty, tzn. błony komórkowe trawi się za pomocą enzymów litycznych.

Dalszy warunek skutecznego stosowania tego sposobu bezpośredniej transformacji stanowi ekspresja nowo wprowadzonej informacji genetycznej oraz regeneracja stransformowanych protoplastów na kompleksowej pożywce stałej, zanim będzie można stwierdzić, np. za pomocą markera selekcyjnego skuteczną transformację.

Ten sposób transformacji okazał się nieodpowiedni dla B. thuringiensis i dla blisko spokrewnionej B. cereus. Z powodu wysokiej oporności komórek B. thuriengiensis na lizozym i z powodu tylko wadliwej zdolności regeneracji tych protoplastów do postaci komórek o nienaruszonej błonie komórkowej pozostaje nikłą osiągalna wydajność transformacji i trudną do otworzenia (^18/ Alikhanian SJ i współpracownicy, 1981; ^19/ Martin PA i współpracownicy, 1981; 2^θ/ Fischer H-M i współpracownicy, 1984).

Za pomocą tych sposobów można zatem do komórek B. thuringiensis lub B. cereus z nikłą częstością włączać co najwyżej bardzo proste plazmidy, nieodpowiednie dla postępowania z rekombinantowym DNA.

Poszczególne sprawozdania o zadawalającej wydajności transformacji, którą można osiągać za pomocą poprzednio omówionych sposobów, polegają na opracowaniu bardzo korzystnych programów ulepszania, które jednak można zawsze stosować tylko konkretnie dla jednego określonego szczepu B. thuringiensis i które związane są z wysokimi nakładami czasu i kosztów, (21/ Schall D, 1986). Sposoby te są zatem nieodpowiednie do rutynowego stosowania w skali przemysłowej.

Jak można poznać z intensywnych prac badawczych w dziedzinie genetyki B. thuringiensis, istnieje duże zainteresowanie rozwojem nowych sposobów, które bakterii B. thuringiensis lub blisko spokrewnionej bakterii B. cereus udostępniałyby bezpośrednią modyfikowalność genetyczną, a tym samym umożliwiałyby np. klonowanie genów protoksyny w układzie naturalnego gospodarza. Mimo to nie udało się dotychczas zadowalająco rozwiązać istniejące trudności i problemy.

Obecnie nie dysponuje się ani odpowiednimi sposobami transformacji, które umożliwiałyby szybką wydajną i odtwarzalną transformację B. thuringiensis i/lub B. cereus z wystarczająco wysoką częstością transformacji, ani nie dysponuje się odpowiednimi wektorami klonowania, które wobec B. thuringiensis pozwalałyby na stosowanie technik rekombinantowego DNA, już opanowanych dla innych bakteryjnych układów gospodarzy. Dotyczy to w tej samej mierze bakterii B. cereus.

Zagadnienie to nieoczekiwanie udało się rozwiązać za pomocą sposobu według wynalazku, dzięki zastosowaniu łatwych środków postępowania, po części analogicznych do znanych.

Wynalazek dotyczy zatem nowoczesnego sposobu, który w oparciu o technologię rekombinantowego DNA po raz pierwszy umożliwia bezpośrednie, docelowo ukierunkowane i odtwarzalne manipulowanie genetyczne bakterią B. thuringiensis i B. cereus, polegającego na tym, że Bacillus thuringiensis i/lub B. cereus za pomocą łatwego postępowania transformacyjnego transformuje się z wysoką wydajnością, stosując rekombinantowy DNA, który jest odpowiedni dla przewidzianego manipulowania genetycznego bakterią Bacillus thuringiensis i/lub bakterią Bacillus cereus.

164 138

W szczególności sposób bezpośredniego, docelowo ukierunkowanego i odtwarzalnego manipulowania genetycznego bakterią B. thuringiensis oraz B. cereus, polega według wynalazku na tym, że (a) wyodrębnia się włączany DNA, przy czym korzystnie chodzi o DNA plazmidowy, DNA kodujący lub DNA o funkcji regulatorowej, i ewentualnie najpierw poddaje się ligacji z sekwencjami ekspresyjnymi, które są zdolne do funkcjonowania w komórce bakteryjnej, wybranej ze zbioru obejmującego B. thuringiensis i B. cereus; (b) tak wyodrębniony DNa w wektorze, który jest w stanie replikować w bakteryjnej komórce gospodarza, wybranego ze zbioru obejmującego komórki B. thuringiensis i B. cereus, klonuje się wewnątrz heterologicznego układu klonowania; (c) tak sklonowany DNA wyodrębnia się i włącza bezpośrednio w omówioną komórkę bakteryjną z szybkością transformacji, która wystarcza na przezwyciężenie bariery restrykcyjnej istniejącej wewnątrz tej komórki bakteryjnej; i (d) tak stransformowaną komórkę bakteryjną hoduje się i ewentualnie wyodrębnia się sklonowany wektor-DNA lub produkt ekspresji.

Sposób ten umożliwia też bezpośrednie klonowanie, ekspresję i identyfikację użytecznych sekwencji DNA, zwłaszcza zaś genów protoksyny, w bakterii B. thuringiensis i/lub B. cereus, przy czym

a) cały DNA z Bacillus thuringiensis trawi się za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych;

b) z wynikowych fragmentów restrykcyjnych wyodrębnia się fragmenty o odpowiedniej wielkości;

c) wspomniane fragmenty wplata w odpowiedni wektor;

d) komórki Bacillus thuringiensis i/lub B. cereus transformuje się ze wspomnianym wektorem; i

e) z tych transformantów za pomocą odpowiedniego postępowania screeningowego wyszukuje się nowe sekwencje DNA i ewentualnie wyodrębnia.

Obok genów struktury można oczywiście w sposobie według wynalazku stosować też dowolne inne, użyteczne sekwencje DNA, np. niekodujące sekwencje DNA, które wykazują funkcję regulatorową, takie jak antysensowny DNA.

Sposób według wynalazku otwiera zatem liczne nowe możliwości, które są nadzwyczaj interesujące zarówno z punktu widzenia naukowego jak i komercyjnego.

I tak np. obecnie jest możliwe po raz pierwszy uzyskanie na płaszczyźnie genetycznej informacji o regulacji syntezy δ-endotoksyny, zwłaszcza odnośnie sporulacji.

Także problem, w jakim miejscu cząsteczki toksyny znajduje(ją) się odcinek(nki) odpowiedzialny(e) za insektotoksyczność i w jakim stopniu jest (są) on(e) związany(e) ze specyfiką gospodarza, powinien się obecnie wyjaśnić.

Znajomość molekularnej organizacji różnych cząsteczek toksyn oraz genów toksyny kodujących te cząsteczki w różnych gatunkach B. thuringiensis ma niezwykłe znaczenie praktyczne dla celowego manipulowania genetycznego tymi genami, które to manipulowanie jest po raz pierwszy możliwe za pomocą sposobu według wynalazku.

Nowy sposób według wynalazku pozwala obok celowej modyfikacji genów δ-endotoksyny nawet na manipulowanie regulatorowymi sekwencjami DNa, kontrolującymi ekspresję tych genów, dzięki czemu zarówno mogą być celowo zmienione specyficzne właściwości tych δ-endotoksyn, takie jak np. ich specyfika gospodarza, ich właściwości resorpcyjne i inne, mogą być zwiększone szybkości ich wytwarzania, np. na drodze wbudowania silniejszych i wydajniejszych sekwencji promotora.

Na drodze celowej mutacji wybranych genów lub subgenów in vitro dochodzi się zatem do nowych wariantów B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Dalsza możliwość konstruowania nowych wariantów B. thuringiensis i/lub B. cereus polega na spleceniu genów lub odcinków genów, pochodzących z różnych źródeł B. thuringiensis, dzięki czemu powstają szczepy B. thuringiensis i/lub B. cereus o rozszerzonym zakresie zastosowania. Również syntetycznie lub półsyntetycznie wytworzone geny toksyny można na tej drodze stosować do konstrukcji nowych odmian B. thuringiensis i/lub B. cereus.

164 138

Ponadto sposób według wynalazku z powodu silnego podwyższenia częstości transformacji oraz uproszczenia postępowania umożliwia po raz pierwszy założenie banków genów oraz szybki screening modyfikowanych i nowych genów w B. thuringiensis i/lub B. cereus.

W szczególności sposób według wynalazku umożliwia obecnie po raz pierwszy bezpośrednią ekspresję banków genów w B. thuringiensis i/lub B. cereus oraz identyfikację nowych genów protoksyny w B. thuringiensis za pomocą znanych sposobów, korzystnie immunologicznych lub biologicznych.

Przedmiotem wynalazku jest zatem sposób, który, bazując na silnym zwiększeniu wydajności transformacji B. thuringiensis /B. cereus, umożliwia w porównaniu z uprzednio znanymi sposobami po raz pierwszy bezpośrednią modyfikację genetyczną genomu B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Zgodny z wynalazkiem sposób genetycznego manipulowania bakteriami B. thuringiensis i/lub B. cereus na drodze włączania rekombinantowego DNA, zwłaszcza DNA plazmidowego i/lub wektorowego, do komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus można korzystnie przeprowadzać za pomocą elektroporacji.

Korzystny przy tym jest sposób włączania do B. thuringiensis i/lub B. cereus sekwencji DNA kodujących δ-endotoksynę, zdolnych do ekspresji w B. thuringiensis i/lub B. cereus, oraz sekwencji DNA kodujących proteinę, która co do istoty rzeczy wykazuje insektotoksyczne właściwości wspomnianych toksyn B. thuringiensis.

Wynalazek obejmuje również sposób manipulowania genetycznego bakteriami B. thuringiensis i/lub B. cereus z zastosowaniem wektorów dwufunkcyjnych, tzw. shuttle-wektorów, dla B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Korzystne są przy tym wektory dwufunkcyjne, które oprócz w B. thuringiensis i/lub B. cereus ulegają replikacji w jednym lub w wielu innych heterlogicznych układach gospodarzy, zwłaszcza zaś w komórkach E. coli.

Szczególnie korzystnymi są shuttle-wektory dla bakterii B. thuringiensis i/lub B. cereus, zawierające sekwencje DNA, kodującą polipeptyd δ-endotoksyny, który naturalnie występuje w B. thuringiensis, albo kodującą przynajmniej polipeptyd, który co do istoty rzeczy jest homologiczny z tym naturalnym, tj. który przynajmniej w głównych zarysach wykazuje insektotoksyczne właściwości toksyny z B. thuringiensis.

Tak samo wynalazek obejmuje sposób genetycznego manipulowania bakterią B. thuringiensis i/lub B. cereus z stosowaniem B. thuringiensis i/lub B. cereus jako generalnych organizmów gospodarzy do klonowania i ekspresji homologicznego a zwłaszcza też heterologicznego DNA lub kombinacji homologicznego i heterologicznego DNA.

Korzystnymi więc są same, poprzednio bliżej scharakteryzowane plazmidy i shuttle-wektory, ich stosowanie do transformacji B. thuringiensis i/lub B. cereus oraz same nimi stransformowane komórki B. thurigiensis i B. cereus.

Przykładami stosowanych, dwufunkcyjnych (shuttle-) wektorów są wektory pXI61 (=pK61) i pXI93 (=pK93), które, transformowane w B. thuringiensis var. kurstaki HDl cryB, względnie w B. cereus 569 K, zostały w uznanym za Międzynarodową Kolekcję zbiorze mikroorganizmów Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Brunswik, RFN) zgodnie z postanowieniemi Umowy Budapeszteńskiej zdeponowane pod numerami: DSM 4573 (pXI61, transformowany w B. thuringiensis var. kurstaki HDl cryB) lub DSM 4571 (pXI93, transformowany w B. thurigiensis var. kurstaki HDl ery B) i DSM 4573 (pXI93, transformowany w B. cereus 569 K).

Z zastosowaniem sposobu według wynalazku jest zatem możliwe otrzymanie nowych odmian B. thuringiensis i B. cereus, stransformowanych sekwencją DNA, która koduje i wprowadza w ekspresję δ-endotoksynę z B. thuringiensis, albo która przynajmniej koduje i wprowadza w ekspresję proteinę, wskazującą w głównych zarysach toksyczne właściwości toksyn z B. thuringiensis.

Stransformowane komórki B. thuringiensis i B. cereus oraz przez nie produkowane toksyny można stosować do wytwarzania środków owadobójczych.

Niżej krótko omówiono figury 1-9 przedstawione na rysunkach.

138

Fig. 1: transformacja E. coli HB 101 za pomocą pBR322(o) i *B. thuringiensis HDl cryB za pomocą pBCl6(.) (liczba przeżywających komórek *HD1 cryB).

Fig. 2: wpływ starzenia się kultury *B. thuringiensis HD1 cryB na częstość transformacji. Fig. 3: wpływ wartości pH roztworu buforowego - PBS na częstość transformacji.

Fig. 4: wpływ stężenia sacharozy w roztworze buforowym - PBS na częstość transformacji. Fig. 5: zależność między liczbą transformantów a ilością DNA wprowadzoną na transformację.

Fig. 6: uproszczona mapa restrykcyjna shuttle-wektora *pXI61.

Kreskowane łuki oznaczają sekwencje pochodzące z Gram-dodatniego pBC16, pozostała część pochodzi z Gram-ujemnego plazmidu pUC8.

Fig. 7: uproszczona mapa restrykcyjna *p XI93. Kreskowane łuki oznaczają gen struktury protoksyny (strzałka, kurhd 1) i niekodujące sekwencje-5’ i -3’. Pozostała, nie kreskowana część pochodzi z shuttle-wektora, *p XI61.

Fig. 8: Elektroforeza SDS (siarczan dodecylowosodowy) (poliakryloamid-żelowa ekstraktów zarodnikujących kultur *B. thuringiensis HD1 cryB, B. cereus 569K i ich pochodnych.

[1:*HD1 cryB (pXI93), 2:*HD1 cryB (pXI61), 3:*HD1 cryB, 4: HD1, LBG B-4449, 5:*B.cereus 569K (pXI93), 6: 569K]

a) Comassie-barwiony, M:wzorzec masy cząsteczkowej, MG: masa cząsteczkowa (daltony), strzałka: pozycja protoksyny o masie 130000 daltonów.

b) Western biot tego samego żelu, zadany poliklonalnymi przeciwciałami przeciwko K1 krystalicznej proteinie z B. thuringiensis HD1. Wykrycie pozyty-wnych pasm następowało za pomocą znaczonych przeciwciał antykozich. Strzałka: pozycja protoksyny o masie 130000 daltonów. Dalsze pasma: produkty rozkładu protoksyny.

Fig. 9: transformacja B. subtilis LBG B-4468 z DNA plazmidu pBC16 za pomocą metody elektroporacji, zoptymalizowanej dla B. thuringiensis.(o: transformanty) gg DNA plazmidu; .:liczba żywych zarodników (ml).

♦Wewnętrzne oznakowanie pK, przyjęte dla nazw plazmidów w dowodzie pierwszeństwa, zostało w opisach przeznaczonych do patentowania zagranicą zastąpione przez oficjalnie uznawane oznakowanie pXI.

Również w nazwie asporogennego mutanta B. thuringiensis HD1, stosowanego w ramach przykładów wykonania, zmieniono słowo cryP na cryB.

Istotny aspekt wynalazku dotyczy nowoczesnego sposobu transformacji dla B. thuringiensis i B. cereus, który polega na włączeniu DNA plazmidowego do komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus w warunkach stosowania znanej w zarysie technologii elektroporacji.

Gdy przed momentem dokonania wynalazku zostały zakończone niepowodzeniem wszystkie próby przeniesienia na bakterię B. thuringiensis i na blisko spokrewnioną bakterią B. cereus sposobów transformacji już opanowanych dla innych układów gospodarzy bakteryjnych, wówczas udało się w ramach wynalazku osiągnąć nieoczekiwany rezultat dzięki zastosowaniu technologii elektroporacji oraz towarzyszących środków.

Rezultat ten należy uznać za zaskakujący i nieoczekiwany zwłaszcza dlatego, że przez grupę badaczy radzieckich (^22/ Shivarova N i współpracownicy, 1983) zostały już we wcześniejszym okresie przeprowadzone próby elektroporacji na protoplastach B. thuringiensis, lecz osiągnięte częstości transformacji były tak małe,, że w następstwie sposób ten został uznany za nieużyteczny dla transformacji B. thuringiensis i wskutek tego nie poświęcono mu już dalszej uwagi.

Opierając się na badaniach parametrów postępowania, krytycznych dla elektroporacji komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus, można było teraz nieoczekiwanie opracować metodę transformacji, która w idealny sposób jest dopasowana do wymagań B. thuringiensis i B. cereus i prowadzi do wydajności transformacji, mieszczących się w zakresie 10⁶-10⁸ komórek /gg DNA plazmidowego, zwłaszcza w zakresie 1()6-10⁷ komórek/ (tg DNA plazmidowego.

W przybliżeniu jednakowo wysokie wydajności transformacji o wartościach od 10 do co najwyżej 10° transformantów /jig DNA plazmidowego można było dotychczas osiągnąć tylko za pomocą sposobu PEG (glikol polietylenowy)-transformacji, opisanego u^21/ Schall’a (1986). Wysokie wydajności transformacji pozostają jednak ograniczone do tych szczepów B. thuringiensis, dla których ten sposób PEG został w bardzo czasochłonnych studiach optymalizacyjnych specyficznie dopasowany, co każe uznać ten sposób za nieodpowiedni do praktycznego stosowania.

Ponadto sposoby te w praktyce okazały się wielu przypadkach nie odtwarzalne lub tylko źle odtwarzalne.

W przeciwieństwie do tego, w przypadku sposobu według wynalazku, chodzi o dający się zasadniczo do wszystkich szczepów B. thuringiensis oraz B. cereus stosować sposób transformacji, który jest mniej czasochłonny, racjonalniejszy i tym samym wydajniejszy niż tradycyjne sposobu PEG-transformacji.

I tak w sposobie według wynalazku może stosować całe, nienaruszone komórki, dzięki czemu unika się czasochłonnego i dla B. thuringiensis oraz B. cereus krytycznego przeprowadzania w protoplasty a także unika się następnej regeneracji na kompleksowych pożywkach.

Ponadto w przypadku stosowania tych sposobów-PEG może przeprowadzenie niezbędnych operacji postępowania wymagać okresu do 1 tygodnia, podczas gdy za pomocą sposobu transformacji według wynalazku stransformowane komórki otrzymywane są w ciągu kilku godzin (z reguły w ciągu nocy).

Dalsza zaleta sposobu według wynalazku dotyczy liczby komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus, które mogą zostać stransformowane w jednostce czasu.

Podczas gdy w przypadku tradycyjnych sposobów-PEG równocześnie można tylko małe części nakładać warstwą na podłoże, by uniknąć zahamowania regeneracji przez zbyt gęsty wzrost komórek, to w przypadku stosowania techniki elektroporacji można równocześnie nakładać warstwą na podłoże duże ilości komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Umożliwia to wykrywanie transformantów nawet w przypadku bardzo małych częstości transformacji, co za pomocą poprzednio omówionych sposobów nie jest możliwe lub jest możliwe tylko przy poważnych nakładach.

Ponadto wystarczają już ilości DNA rzędu nanogramów, by otrzymać przynajmniej kilka transformantów.

Ma to bardzo szczególne znaczenie wtedy, gdy wymaga się bardzo wydajnego układu transformacji, jak np. w przypadku stosowania materiału-DNA z E. coli, co ze względu na bardzo wyraźny układ restrykcji w komórkach B. thuringiensis wobec DNA z E. coli może prowadzić do redukcji częstości transformacji o współczynnik 10³.

Sposób transformacji według wynalazku, który co do istoty rzeczy opiera się na znanej w zarysie technologii elektroporacji, charakteryzuje się następującymi specyficznymi zabiegami postępowania:

a) wytworzenie zawiesiny komórek o odpowiedniej gęstości komórek w pożywce hodowlanej odpowiedniej dla hodowli komórek B. thuringiensis i wobec napowietrzenia wystarczającego dla wzrostu tych komórek;

b) oddzielenie tych komórek z zawiesiny komórek i ponowne przeprowadzenie w stan zawiesiny w buforze inokulacyjnym, odpowiednim dla kolejno następującej elektroporacji;

c) dodanie próbki DNA w stężeniu odpowiednim dla elektroporacji;

d) wprowadzenie opisanej pod b) i c) szarży do aparatury elektroporacyjnej;

e) jedno lub wiele krótkotrwałych wyładowań kondensatora poprzez zawiesinę komórkową dla krótkoterminowego wytworzenia wysokiego natężenia pola elektrycznego w ciągu okresu, który jest wystarczający dla transformacji komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus rekombinantowym DNA;

f) ewentualnie następcza inkubacja elektroporowanych komórek;

g) nakładanie warstwy z elektroporowanych komórek na odpowiednim podłożu selekcyjnym; i

h) selekcja stransformowanych komórek.

164 138

W specyficznej i w ramach wynalazku korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku komórki B. thuringiensis najpierw inkubuje się w odpowiedniej pożywce wobec wystarczającego napowietrzenia w odpowiedniej temperaturze, korzystnie w temperaturze 20-35°C, aż do osiągnięcia absorbcji (ODsso) równej 0,1-1,0. Wiek (starość) kultur Bacillus, przewidzianych do elektroporacji, ma wyraźny wpływ na częstość transformacji. Szczególnie korzystna jest przeto absorbancja kultur Bacillus równa 0,1-0,3, a zwłaszcza równa 0,2. Należałoby jednak wskazać na to, że również za pomocą kultur Bacillus z innych faz wzrostowych, zwłaszcza też za pomocą kultur prowadzonych w ciągu nocy, można osiągać (patrz fig. 2) dużą częstość transformacji.

Jako materiał wyjściowy stosuje się z reguły świeże komórki lub zarodniki, można jednak równie dobrze sięgać także po zamrożony materiał komórkowy. Chodzi tu korzystnie o zawiesiny komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus w odpowiednich środowiskach ciekłych, do których korzystnie dodaje się określoną ilość substancji zapobiegającej zamarzaniu.

Odpowiednimi środkami zapobiegającymi zamarzaniu są przede wszystkim mieszaniny składników osmotycznie czynnych i DMsO (sulfotlenku dwumetylowego) w wodzie lub w odpowiednim roztworze buforowym. Dalszymi odpowiednimi składnikami, które wchodzą w rachubę przy stosowaniu w roztworach środka zapobiegającego zamarzaniu, są cukry, alkohole wielowodorotlenowe, takie jak gliceryna, alkohole cukrowe, aminokwasy i polimery, takie jak glikol polietylenowy.

Jeśli jako materiał wyjściowy stosuje się zarodniki, to najpierw inokuluje się je w odpowiednim podłożu i w ciągu nocy inkubuje w odpowiedniej temperaturze, korzystnie w temperaturze 25-28°C wobec wystarczającego napowietrzenia. Szarżę tę następnie rozcieńcza się i w wyżej omówiony sposób poddaje dalszej obróbce.

Dla wzbudzenia sporulacji u B. thuringiensis można stosować wszystkie podłoża, wywołujące taką sporulację. Korzystną w ramach wynalazku jest pożywaka GYS-Medium według 23 ^rYousten’a AA i Rogoffa MH, (1969).

Wprowadzanie tlenu do pożywki hodowlanej następuje z reguły drogą poruszania kulturą, np. na wstrząsarce, przy czym korzystne są prędkości obrotowe 50-300 obrotów/minutę.

Hodowla zarodników B. thuringiensis oraz wegetatywnych komórek mikroorganizmów w ramach wynalazku następuje znanymi, ogólnie praktykowanymi metodami, przy czym z powodów wykonalności stosuje się korzystnie pożywki ciekłe. Skład pożywek można zależnie od zastosowanego szczepu B. thuringiensis lub B. cereus łatwo zmieniać. Na ogół stosuje się pożywki kompleksowe z mało zdefiniowanymi, łatwo przyswajalnymi źródłami (-C) węgla i (-N) azotu, takimi jakie zwykle wykorzystuje się do hodowli aerobowych gatunków Bacillus.

Dodatkowo potrzebne są witaminy i jony istotnych metali, które jednak z reguły są zawarte w stosowanych pożywkach kompleksowych w wystarczającym stężeniu jako składniki lub zanieczyszczenia.

Ewentualnie można dodawać wspomniane składniki, takie jak istotne witaminy oraz jony Na+, K+, Cu2⁺, Ca2⁺, Mg2+, Fe3+, NH4+, PO43- ,so42-,c-,co32- i mikroelementy kobalt i mangan, cynk i inne w postaci swych soli.

Jako szczególnie odpowiednie źródła azotu należy obok ekstraktów drożdży, hydrolizatów drożdży, autolizatów drożdży oraz komórek drożdżowych wspomnieć przede wszystkim mąkę sojową, mąkę kukurydzianą, mąkę owsianą, Edamin’ę (trawioną enzymatycznie albuminę mleka), pepton, hydrolizat kazeiny, ługi pokukurydziane oraz ekstrakty mięsne, nie ograniczając żadną miarą zakresu wynalazku do tych przykładowych wyliczeń.

Korzystne stężenie omówionych źródeł-N (azotu) mieści się w zakresie 1,0-20 g/litr.

Jako źródła-C (węgla) wchodzą w rachubę przede wszystkim glukoza, laktoza, sacharoza, dekstroza, maltoza, skrobia, cereloza, celuloza oraz ekstrakt słodowy. Korzystny zakres stężeń mieści się w przedziale 1,0-20 g/litr.

Oprócz pożywki LB-Medium, korzystnie stosowanej w ramach wynalazku, można też stosować wszystkie inne pożywki hodowlane, odpowiednie dla hodowli B. thuringiensis i/lub B. cereus, takie jak pożywki np. Antibiotic Medium 3, SCGY-Medium i inne.Przechowywanie zarodnikujących kultur B. thuringiensis następuje korzystnie na pożywkach GYS (agar ukośny) w temperaturze 4°C.

1(64138

Po osiągnięciu przez kulturę komórkową żądanej gęstości komórek zbiera się komórki za pomocą odwirowania i przeprowadza w stan zawiesiny w odpowiednim roztworze buforowym, który uprzednio korzystnie chłodzi się lodem.

Temperatura w toku badań okazała się być nie limitującą i dlatego jest swobodnie dobierana w szerokim zakresie. Korzystnym jest przedział temperaturowy 0-35°C, zwłaszcza 2-15°C, a w szczególności temperatura 4°C. Czas trwania inkubacji komórek Bacillus przed i po elektroporacji ma tylko nieznaczny wpływ na osiąganą częstość transformacji (patrz tabela 1). Jedynie zbyt długa inkubacja prowadzi do spadku częstości transformacji. Korzystny jest czas trwania inkubacji rzędu 0,1-30 minut, zwłaszcza rzędu 10 minut. Proces ten można powtarzać kilkakrotnie. Szczególnie odpowiednimi roztworami buforowymi w ramach wynalazku są osmotycznie stabilizowane bufory fosforanowe, które jako czynnik stabilizujący zawierają cukry, takie jak glukoza lub sacharoza, albo alkohole cukrowe, takie jak mannit, i są nastawione na odczyn o wartości pH=5,0-8,0. Całkiem szczególnie korzystnymi są bufory fosforanowe typu PBS z odczynem o wartości pH=5,0-8,0, korzystnie pH=5,5-6,5, zawierające jako czynnik stabilizujący sacharozę w stężeniu0,1-1,0M, korzystnie w stężeniu0,3-0,5M (patrz fig. 3 i 4).

Podwielokrotne części szarży komórek Bacillus przeprowadzonych w stan zawiesiny wprowadza się następnie do kiuwet lub innych podobnych naczyń i z próbką DNA wspólnie inkubuje się w ciągu odpowiedniego czasu, korzystnie w ciągu 0,1-30 minut, zwłaszcza w ciągu

5-15 minut, w odpowiedniej temperaturze, korzystnie w temperaturze 0-35°C, zwłaszcza w temperaturze 2-15°C, a szczególnie w temperaturze 4°C.

W przypadku prowadzenia postępowań w niskiej temperaturze korzystne jest stosowanie już wstępnie ochłodzonych kiuwet lub dowolnych innych, odpowiednich i wstępnie ochłodzonych naczyń.

Między częstością transformacji a stężeniem DNA stosowanym podczas elektroporacji istnieje w szerokim zakresie zależność liniowa, przy czym częstość transformacji rośnie wraz ze zwiększającym się stężeniem DNA (patrz fig. 5). Stężenie DNA, korzystne w ramach wynalazku, mieści się w zakresie od 1 ng do 20 μg. Szczególnie korzystne jest stężenie DNA od 10 ng do 2 μg.

Następnie całą szarżę, zawierającą komórki B. thuringiensis i/lub B. cereus oraz plazmidowy DNA lub inne odpowiednie próbki DNA, wprowadza się do aparatury elektroporacyjnej i poddaje elektroporacji, tj. krótkotrwale wystawia na działanie impulsu elektrycznego.

Aparatury elektroporacyjne, odpowiednie do stosowania w sposobie według wynalazku, są już oferowane przez różnych producentów, takich jak np. firmy; Bio Rad (Richmond, CA, St. Zjedn. Am.; Gene Pulser Apparatus), Biotechnologies and Experimental Research, Inc. (San Diego, CA, St. Zjedn. Am.; BTX Transfector 100), Promiga (Madison, WI, St. Zjedn. Am.; X-Cell 2000 Elektroporation System), itd. _x

W sposobie według wynalazku można oczywiście stosować także każde dowolne, inne odpowiednie urządzenie.

Można przy tym stosować różne postacie impulsów, i tak np. impulsy prostokątne lub impulsy wykładniczo zanikające.

Te ostatnie są korzystne w sposobie według wynalazku. Dochodzą one do skutku dzięki wyładowaniu kondensatora i charakteryzują się najpierw bardzo szybkim wzrostem napięcia oraz następnie wykładniczą fazą zaniku jako funkcją oporu i pojemności. Stała czasowa RC stanowi miarę długości czasu zaniku wykładniczego. Odpowiada ona temu czasowi, który jest niezbędny, by napięcie mogło zmniejszyć się do 37% napięcia wyjściowego (Vo).

Parametrem roztrzygającym o wywieraniu wpływu na komórki bakteryjne jest natężenie pola elektrycznego, którym obciąża się komórki i które oblicza się ze stosunku przyłożonego napięcia i odległości płytek elektrod.

Również w związku z tym ma duże znaczenie czas wykładniczego zaniku, który zależy zarówno od ukształtowania stosowanej aparatury (np. od pojemności kondensatora) jak i od innych parametrów, takich jak skład roztworu buforowego lub wprowadzone objętości zawiesiny komórkowej, przeznaczonej do elektroporacji.

164 138

I tak np. w toku badań okazało się, że zmniejszenie objętości zawiesiny komórkowej, przeznaczonej do elektroporacji, o połowę prowadzi do zwiększenie częstości transformacji o współczynnik 10.

Przedłużenie czasu zaniku wykładniczego powyżej optymalnej wartości dla stosowanego roztworu buforowego daje w wyniku również wyraźne zwiększenie częstości transformacji.

Wszystkie zabiegi, które prowadzą do przedłużenia czasu zaniku wykładniczego i w następstwie do zwiększenia częstości transformacji są zatem korzystne w ramach wynalazku.

Czas zaniku, korzystny w ramach wynalazku, mieści się w zakresie około 2-50 ms, zwłaszcza w zakresie około 8-20 ms. Całkiem szczególnie korzystnym jest czas zaniku wykładniczego około 10-12 ms.

W ramach wynalazku komórki bakteryjne drogą krótkotrwałego(łych) wyładowania(wań) kondensatora poprzez zawierającą DNA zawiesinę komórek obciąża się krótkoterminowo bardzo wysokim natężeniem pola elektrycznego, skutkiem czego przepuszczalność komórek B. thuringiensis krótkoterminowo i odwracalnie podwyższa się. Parametry elektroporacji uzgadnia się ze sobą w toku sposobu według wynalazku tak, żeby zapewnione było wchłonięcia DNA znajdującego się w buforze elektroporacyjnym do komórek Bacillus.

Ustawienie pojemności na kondensatorze wynosi w ramach wynalazku korzystnie 1-250 gF, zwłaszcza 1-50 gF, a szczególnie korzystnie 25 gF. Dobór napięcia wyjściowego jest nie limitujący w szerokim zakresie i stąd napięcie to może być swobodnie wybierane. Korzystnym jest napięcie wyjściowe Vo rzędu 0,2-50 kV, zwłaszcza 0,2-2,5 kV, a szczególnie korzystnie

1,2-1,8 kV. Odległość płytek elektrod zależy m.in. od rozmiarów aparatury elektroporacyjnej i wynosi ona korzystnie 0,1-1,0 cm, zwłaszcza 0,2-1,0 cm, a szczególnie korzystnie 0,4 cm. Z odległości płytek elektrodowych i z nastawionego na kondensatorze napięcia wyjściowego wynika wartość natężenia pola elektrycznego, działająca na zawiesinę komórek. Wartość ta korzystnie mieści się w zakresie 100-50000 V/cm, zwłaszcza w zakresie 100-10000 V/cm, a szczególnie korzystnie w zakresie 30000-4500 V/cm.

Dokładne zestrojenie swobodnie dających się wybierać parametrów, takich jak pojemność, napięcie wyjściowe, odległość płytek, itd., zależy w pewnym stopniu od budowy stosowanego urządzenia i może przeto od przypadku do przypadku zmieniać się w określonych granicach. Podane wartości graniczne mogą zatem w pewnych przypadkach być w górę i w dół · przekraczane, o ile miałoby to być potrzebne dla osiągnięcia optymalnej wartości natężenia pola elektrycznego.

Właściwy proces elektroporacji może być wielokrotnie powtarzany, aż dla danego układu osiągnie się optymalną częstość transformacji.

Zaraz po elektroporacji można korzystnie przeprowadzić inkubację następczą, korzystnie w ciągu 0,1-30 minut, w temperaturze 0- 35°C, korzystnie w temperaturze 2-15°C. Następnie te elektroporowate komórki rozcieńcza się odpowiednią pożywką i ponownie inkubuje się w ciągu odpowiedniego czasu, korzystnie w ciągu 2-3 godzin wobec wystarczającego napowietrzenia w odpowiedniej temperaturze, korzystnie w temperaturze 20-35°C. Następnie te komórki B. thuringiensis nakłada się warstwą na pożywkę stałą, która jako dodatek zawiera czynnik odpowiedni dla selekcji nowo w komórkę bakteryjną wprowadzonych sekwencji DNA. W zależności od rodzaju zastosowanego DNA może w przypadku wspomnianych czynników chodzić np. o związki antybiotycznie czynne, o barwniki i inne. Szczególnie korzystnymi w ramach wynalazku dla selekcji komórek Bacillus thuringiensis i/lub B. cereus są antybiotyki, wybrane z grupy obejmującej tetracyklinę, kanamycynę, chloroamfenikol i erytromycynę.

Również korzystnymi są substraty chromogenne, takie jak X-gal (5- bromo-4-chloro-3indolilo-|3-D-galaktozyd), których obecność można stwierdzać za pomocą specyficznej reakcji barwnej.

Inne markery fenotypowe są fachowcowi znane i mogą również być stosowane w ramach wynalazku.

Mogą przy tym być stosowane pożywki odpowiednie dla hodowli komórek B. thuringiensis, do których to pożywek dodaje się zwykle stosowane podłoża zestalające, takie jak agar, agaroza, żelatyna i inne.

164 138

Parametry postępowania, poprzednio omówione szczegółowo dla B. thuringiensis, można w taki sam sposób stosować do komórek B. cereus.

Poprzednio omówiony, zgodny z wynalazkiem sposób transformacji B. thuringiensis względnie B. cereus nie ogranicza się, jak to dotychczas było w sposobach oddanych do dyspozycji przez stan techniki, tylko do stosowania określonych plazmidów naturalnie występujących w B. thuringiensis i/lub B. cereus, lecz daje się stosować dla wszystkich rodzajów DNA.

Tym samym jest teraz po raz pierwszy możliwe celowe transformowanie B. thuringiensis i/lub B. cereus, przy czym obok homologicznego, tj. w bakterii B. thuringiensis lub blisko spokrewnionej bakterii B. cereus naturalnie występującego DNA plazmidowego, można też stosować plazmidowy DNA pochodzenia heterologicznego.

Może przy tym chodzić zarówno o DNA plazmidowy, naturalnie występujący w organizmie innym niż bakteria B. thuringiensis lub blisko spokrewniona bakteria B. cereus, taki przykładowo jak plazmidy pUB110 i pC194 ze Staphylococcus aureus (^24/ Horinouchi S i Weisblum B, 1982;^25/ Polak J i Novick RP, 1982) oraz plazmid pIM13 z B. subtilis (2⁶⁷ Mahler J i Halvorson HO, 1980), które są zdolne do replikowania w B. thuringiensis i/lub w B. cereus, jak i może chodzić o hybrydowy DNA plazmidowy, który za pomocą technologii rekombinantowego DNA konstruuje się z homologicznego DNA plazmidowego lub z heterologicznego DNA plazmidowego lub z kombinacji homologicznego i heterologicznego DNA plazmidowego. Ten ostatnio omówiony hybrydowy DNA plazmidowy jest bardziej odpowiedni do prac z rekombinantowym DNA niż naturalne izolaty.

Przykładowo należałoby tu wspomnieć plazmidowy pBD64 (¹¹ GryczianTi współpracownicy, 1980), pBD347, pBD348 oraz pUB 1664, jednak tym nie ograniczając w żaden sposób zakresu wynalazku.

Szczególne znaczenie dla przeprowadzenia eksperymentów klonowania w przypadku różnych szczepów B. thuringiensis lub B. cereus mogą mieć wektory klonowania opanowane już dla B. subtilis, takie jak np. pBD64.

Obok DNA plazmidowego można w ramach wynalazku transformować do B. thuringiensis lub do B. cereus każdy dowolny inny DNA. Stransformowany DNA może przy tym replikować albo autonomicznie albo zintegrowany w chromosomie. Przykładowo może tu chodzić o DNA wektorowy, który wywodzi się z nie plazmidu, lecz z faga.

Tym samym wynalazek dotyczy sposobu genetycznego manipulowania bakterią B. thuringiensis i/lub B. cereus z zastosowaniem dwufunkcyjnych (hybrydowych) wektorów plazmidowych tzw. shuttle-wektorów, które oprócz w bakterii B. thuringiensis lub blisko spokrewnionej bakteri B. cereus są zdolne do replikowania w jednym lub w wielu heterologicznych organizmach gospodarzy i które są identyfikowalne zarówno w homologicznych jak i w heterologicznych układach gospodarzy.

Jako heterologiczne organizmy gospodarzy należy w ramach wynalazku rozumieć wszystkie te organizmy, które nie należą do grupy B. thuringiensis/B. crerus i są zdolne do stabilnego utrzymywania samoreplikującego się DNA.

Jako heterologiczne organizmy gospodarzy mogą zgodnie z powyższą definicją funkcjonować zatem organizmy zarówno prokariotyczne, jak i eukariotyczne. Przykładowo należałoby w tym miejscu jako przedstawicieli ze zbioru prokariotycznych organizmów gospodarzy wspomnieć poszczególnych przedstawicieli z rodzajów Bacillus, takich jak np. B. subtilis lub B. megaterium, Staphylococcus, takich jak np. S. aureus, Streptococcus, takich jak np. Streptococcus faecalis, Streptomyces, takich jak np. Streptomyces spp., Pseudomonas, takich jak np. Pseudomonas spp., Escherichia, takich jak np. E. coli, Agrobacterium, takich jak np. A. tumefaciens lub A. rhizogenes, Salmonella, Erwinia, itd. Ze zbioru gospodarzy eukariotycznych należy przede wszystkim wspomnieć drożdże oraz komórki zwierzęce i roślinne. To przykładowe wyliczenie nie jest zamykające i nie stanowi w żaden sposób ograniczenia wynalazku. Fachowcowi są znani dalsi, odpowiedni przedstawiciele ze zbioru prokariotycznych i eukariotycznych organizmów gospodarzy.

164 138

Szczególnie korzystnymi w ramach wynalazku są B. subtilis lub B. megaterium, Pseudomonas spp., a zwłaszcza E. coli, ze zbioru prokariotycznych gospodarzy oraz drożdże i komórki zwierzęce lub roślinne ze zbioru eukariotycznych gospodarzy.

Całkiem szczególnie korzystnymi są wektory dwufuzyjne, które są zdolne do replikowania zarówno w komórkach B. thuringiensis i/lub B. cereus jak i w E. coli.

Konstruowanie shuttle-wektorów następuje za pomocą technologii rekombinantowego DNA, przy czym plazmidowy i/lub wektorowy DNA pochodzenia homologicznego (B. thuringiensis, B. cereus) oraz heterologicznego najpierw tnie się za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych, a następnie te fragmenty dNa, które zawierają funkcje istotne dla replikacji w danym żądanym układzie gospodarza, w obecności odpowiednich enzymów ponownie wiąże się ze sobą.

Jako źródło dla plazmidowego i/lub wektorowego DNA pochodzenia heterologicznego mogą służyć poprzednio omówione, heterologiczne organizmy gospodarzy.

Połączenie różnych fragmentów DNA musi następować w taki sposób, żeby zostały zachowane funkcje istotne dla replikacji w różnych układach gospodarzy.

Obok tego można oczywiście stosować także plazmidowy i/lub wektorowy DNA pochodzenia czysto heterologicznego do konstrukcji shuttle-wektorów, przy czym jednak przynajmniej jeden z partnerów fuzji heterologicznej musi zawierać odcinki DNA, które umożliwiają replikację w homologicznym B. thuringiensis/B. cereus układzie gospodarza.

Jako źródło plazmidowego i/lub wektorowego DNA pochodzenia heterologicznego, które mimo to jest zdolne replikować w układzie gospodarza B. thuringiensis/B. cereus, należałoby w tym miejscu przykładowo podać kilku przedstawicieli ze zbioru bakterii Gram-dodatnich, wybranych z grupy obejmującej rodzaje Staphylococcus, takie jak np. Staphylococcus aureus, Streptococcus, takie jak np. Streptococcus faecalis, Bacillus, takie jak np. Bacillus megaterium lub B. subtilis, Streptomyces, takie jak np. Streptomyces spp., itd. Obok tu przykładowo wyliczonych przedstawicieli ze zbioru bakterii Gram-dodatnich istnieje cały szereg dalszych organizmów, które można stosować w sposobie według wynalazku i które są znane fachowcowi.

W celu zapewnienia szybkiego i efektywnego selekcjonowania wektorów dwufunkcyjnych zarówno w homologicznym(ych) jak i w heterologicznym(ych) układzie(dach) gospodarzy jest korzystnym wyposażenie wspomnianych wektorów w specyficzne markery selekcyjne, użyteczne zarówno w B. thuringiensis i/lub B. cereus jak i w heterologicznym(nych) układzie(dach) gospodarzy, tzn. umożliwienie szybkiego i nieskomplikowanego selekcjonowania. Szczególnie korzystnym w ramach wynalazku jest stosowanie sekwencji DNA kodujących oporność na antybiotyki, zwłaszcza sekwencji DNA, które kodują oporność na antybiotyki wybrane z grupy obejmującej kanamycynę, tetracyklinę, chloramfenikol, erytromycynę i inne.

Równie korzystnymi są geny, które kodują enzymy z substratem chromogennym, takie jak np. X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo- β-D-aldaktozdd). Obccoość sraasffnmoowayych kolonii można wtedy bardzo łatwo stwierdzić za pomocą specyficznej reakcji barwnej.

Inne fenotypowe geny markerowe są fachowcowi znane i również mogą być stosowane w ramach wynalazku. '

Szczególnie korzystnie w ramach wynalazku stosuje się shuttle- wektory, które obok sekwencji DNA, pozwalających na replikację w B. thuricgiecsis lub w B. cerus, lub w obu układach gospodarzy, zawierają też takie odcinki DNA, które są niezbędne do replikacji w dalszych bakteryjnych układach gospodarzy, jak w B. subtilis, B. megaterium, Pseudomonas spp., E. coli.

Równie korzystnymi są shuttle- wektory, które po pierwsze replikują zarówno w B. thuringiecsis lub B. cereus lub w nich obu, jak i po drugie, replikują w eukariotycznych układach gospodarzy, wybranych z grupy obejmującej drożdże, komórki zwierzęce i roślinne i inne.

Całkiem szczególnie korzystne są s^nl^-wektory, które obok sekwencji DNA, niezbędnych dla replikacji wspomnianych wektorów w B. thuricgiensis lub w B. cereus lub w obu układach, zawierają również takie sekwencje DNA, które umożliwiają replikację wspomnianych shuttle-wektorów w E. coli.

164 138

Przykładami takich plazmidów wyjściowych do konstruowania shuttle-wektorów dla układu B. thuringiensis-B. cereus/E. coli, które jednak żadną miarą nie należy uznawać za ograniczające zakresu wynalazku, są plazmid pUC8 Vieira J i Messing J, 1982), wywodzący się z B. cereus plazmidu pBC16 i z E. coli plazmidu pBR322.

Dalszy przedmiot wynalazku dotyczy sposobu genetycznego manipulowania bakterią B. thuringiensis i B. cereus, z zastosowaniem dwufunkcyjnych (shuttle) wektorów, które obok funkcji istotnych dla replikacji i selekcji w homologicznych i heterologicznych układach gospodarzy zawierająjeszcze dodatkowo jeden lub wiele genów w postaci podlegającej ekspresji lub inne użyteczne sekwencje DNA.

Dzięki stosowaniu shuttle-wektorów w nowym sposobie genetycznego manipulowania bakterią B. thuringiensis i/lub B. cereus jest przeto obecnie po raz pierwszy możliwe transformowanie z wysoką wydajnością do komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus sekwencji DNA sklonowanych w układzie obcego gospodarza, poza komórkami B. thuringiensis.

Tym samym obecnie można po raz pierwszy geny lub inne użyteczne sekwencje DNA, zwłaszcza sekwencje z funkcją regulatorową, stabilnie wprowadzać do komórek B. thuringiensis lub B. cereus i tu ewentualnie poddawać ekspresji, dzięki czemu powstają komórki B. thuringiensis lub B. cereus o nowych i pożądanych właściwościach.

Jako geny, które mogą znaleźć zastosowaniem w ramach wynalazku, wchodzą w rachubę zarówno homologiczny(e) jak i heterologiczny(e) gen(y) lub DNA,oraz syntetyczny (e) gen (y) lub DNA, zgodne z definicją podaną w ramach wynalazku, oraz kombinacje wspomnianych DNA.

Kodująca sekwencja DNA może przy tym być skonstruowana wyłącznie z genomowego DNA, z cDNA lub z syntetycznego DNA. Inna możliwość polega na skonstruowaniu hybrydowej sekwencji DNA, składającej się zarówno z cDNA jak i z genomowego DNA i syntetycznego dNa albo z kombinacji tych DNA.

W tym przypadku może cDNA pochodzić z tego samego genu, co genomowy DNA, albo też zarówno cDNA, jak i genomowy DNA mogą pochodzić z różnych genów. W każdym razie jednak, zarówno genomowy DNA i/lub cDNA, każde z osobna, mogą być wytworzone z jednakowych lub różnych genów.

Jeśli części sekwencji DNA zawierają więcej niż jeden gen, to mogą te geny pochodzić albo z jednego i tego samego organizmu, z wielu organizmów należących do różnych szczepów lub odmian tego samego gatunku lub do różnych gatunków tego samego rodzaju, albo z organizmów należących do więcej niż jednego rodzaju tej samej lub innej jednostki taksonomicznej.

W celu zapewnienia ekspresji wspomnianych genów struktury w komórce bakteryjnej należy te kodujące sekwencje genowe najpierw operatywnie sprzęgnąć z sekwencjami ekspresji, sprawnymi w komórkach B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Te hybrydowe konstrukcje genowe, znajdujące zastosowanie w ramach wynalazku, zawierają zatem, obok tego (tych) genu(ów) struktury, sygnały ekspresji obejmujące zarówno sekwencje promotora i terminatorowe jak i dalsze sekwencje regulatorowe regionów -3’ i -5’ nie podlegających translacji.

Szczególnie korzystnymi w ramach wynalazku są naturalne sygnały ekspresji z samej B. thuringiensis i/lub B. cereus oraz z ich mutantów i wariantów, którzy co do istoty rzeczy są homologiczni z sekwencją naturalną. W ramach wynalazku jedna sekwencja DNA jest co do istoty rzeczy homologiczna z drugą sekwencją DNA wtedy, gdy co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, zwłaszcza zaś co najmniej 90%, tych aktywnych odcinków sekwencji DNA jest homologicznych. Zgodnie z przedstawioną definicją pojęcia homologiczny co do istoty rzeczy dwa różne nukleotydy w sekwencji DNA regionu kodującego uznaje się za homologiczne wtedy, gdy wymiana jednego nukleotydu na drugi stanowi cichą mutację.

Całkiem szczególnie korzystnym jest stosowanie zależnych od sporulacji promotorów z B. thuringiensis, zapewniających ekspresję w zależności od sporulacji.

Szczególnie korzystnym dla transformacji B. thuringiensis lub B. cereus w ramach wynalazku jest stosowanie sekwencji DNA kodujących δ-endotoksynę.

164 138

Kodujący region chimerycznego genu według wynalazku zawiera korzystnie sekwencję nukleotydów kodującą polipeptyd, który naturalnie występuje w B. thuringiensis, albo kodującą polipeptyd, który z tym naturalnym co do istoty rzeczy jest homologiczny, tj. który przynajmniej co do istoty rzeczy wykazuje toksyczności krystalicznej proteiny δ-endotoksyny z bakterii B. thuringiensis. W ramach wynalazku polipeptyd zgodnie z definicją ma co do istoty rzeczy właściwości toksyczności krystalicznej proteiny δ-endotoksyny z bakterii B. thuringiensis wówczas, gdy na podobny zakres larw owadów działa owadobójczo tak, jak krystaliczna proteina podgatunku bakterii B. thuringiensis. Kilkoma odpowiednimi podgatunkami są np. podgatunki wybrane z grupy obejmującej: kurstaki, berliner, alesti, tolworthi, sotto, dendrolimus, tenebrionis i israelensis. Korzystnym podgatunkiem przeciwko larwom Lepidopterajest kurstaki, zwłaszcza zaś kurstaki HD1.

W przypadku regionu kodującego może chodzić o region, który naturalnie występuje w B. thuringiensis. Alternatywnie do tego jednak może region kodujący zawierać ewentualnie też sekwencję różniącą się od sekwencji w B. thuringiensis, która jednak ze względu na degenerację kodu genetycznego jest jej równoważna.

Kodujący region tego chimerycznego genu może też kodować polipeptyd różniący się od naturalnie występującej, krystalicznej proteiny δ-endotoksyny, który jednak ciągle jeszcze ma co do istoty rzeczy właściwości insektotoksyczności proteiny krystalicznej. Taka kodująca sekwencja będzie zazwyczaj wariantem naturalnego regionu kodującego. Jako wariant naturalnej sekwencji DNA należy w ramach wynalazku zgodnie z definicją rozumieć zmodyfikowaną postać sekwencji naturalnej, która jednak jeszcze spełnia tę samą funkcję. Wariant może być mutantem lub syntetyczną sekwencją DNA i jest co do istoty rzeczy homologiczny z odpowiednią sekwencją naturalną. W ramach wynalazku jedna sekwencja DNA jest co do istoty rzeczy homologiczna z drugą sekwencją DNA wtedy, gdy co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 80%, zwłaszcza zaś co najmniej 90%, tych aktywnych odcinków sekwencji DNA jest homologicznych. Zgodnie z przedstawioną definicją pojęcia homologiczny co do istoty rzeczy dwa różne nukleotydy w sekwencji DNA regionu kodującego uznaje się za homologiczne wtedy, gdy wymiana jednego nukleotydu na drugi stanowi cichą mutację.

W ramach wynalazku można stosować każdy, aminokwasową sekwencję kodujący gen chimeryczny, który wykazuje owadobójcze właściwości δ-endotoksyny z B. thuringiensis i który spełnia wyjawione i zastrzeżone wymagania. Szczególnie korzystnym jest stosowanie sekwencji nukleotydów, która do istoty rzeczy jest homologiczna przynajmniej z częścią lub częściami sekwencji naturalnej, odpowiedzialną(nymi) za aktywność owadobójczą i/lub za specyfiką gospodarza toksyny z B. thuringiensis.

Polipeptyd, podległy ekspresji dzięki genowi chimerycznemu, ma z reguły też przynajmniej kilka właściwości immunologicznych wspólnych z naturalną proteiną krystaliczną, gdyż przynajmniej po części wykazuje jednakowe determinanty antygenowe.

Zgodnie z tym polipeptyd, który koduje się przez wspomniany gen chimeryczny, jest korzystnie spokrewniony strukturalnie z δ-endotoksyną krystalicznej proteiny produkowanej przez B. thuringiensis. B. thuringiensis produkuje krystaliczną proteinę z podjednostką, która odpowiada protoksynie o masie cząsteczkowej (MG) około 130000-140000. Tę podjednostkę można dzięki proteazom lub dzięki alkaliom rozszczepić na owadobójcze fragmenty o MG70000 i ewentualnie nawet na mniejsze.

Dla konstruowania genów chimerycznych, których kodujący odcinek obejmuje takie fragmenty protoksyny lub ich jeszcze mniejsze części, może fragmentaryzacja regionu kodującego postępować tak długo, jak te fragmenty lub części tych fragmentów jeszcze wykazują żądaną aktywność owadobójczą. Protoksynę, owadobójcze fragmenty protoksyny i owadobójcze części tych fragmentów można wiązać z innymi cząsteczkami, takimi jak polipeptydy i proteiny.

Kodujące regiony, nadające się do stosowania w ramach sposobu według wynalazku, można otrzymywać z genów bakterii B. thuringiensis, które kodują gen krystalicznej toksyny (Whiteley i współpracownicy, zgłoszenie PCT nrW080/011530 oraz opisy patentowe St. Zjedn. Am. US-PS nr nr 4 448 885 i 4 467 036). Korzystna sekwencja nukleotydów, kodującą krystaliczną proteinę, znajduje się między nukleotydami 156 i 3623 we wzorze 1 lub jest krótszą

164 138 sekwencją, która koduje owadobójczy fragment takiej krystalicznej proteiny (^5/ Geiser i współpracownicy, 1986 oraz europejskie zgłoszenie EP nr 238 441).

Kodujący region, zdefiniowany przez nukleotydy 156-3623 we wzorze 1, koduje polipeptyd o wzorze 2.

W celu transformowania chimerycznego genu za pomocą sposobu według wynalazku do komórek B. thuringiensis, wbudowuje się ten gen korzystnie najpierw w wektor. Szczególnie korzystne jest wbudowanie w dwufunkcyjne wektory.

Jeśli odpowiednim genem nie dysponuje się w ilości, która wystarcza do włączenia w komórki Bacillus, to można wektor ten najpierw amplifikować drogą replikacji w heterologicznej komórce gospodarza. Najodpowiedniejsze dla amplifikacji genów są komórki bakteryjne lub drożdżowe. Jeśli dysponuje się wystarczającą ilością tego genu, to włącza się go do komórek Bacillus. Wprowadzenie tego genu do komórek B. thuringiensis lub B. cereus może następować za pomocą tego samego wektora, który wykorzystano do replikacji, albo za pomocą innego wektora. Szczególnie odpowiednimi są dwufunkcyjne wektory.

Kilka przykładów bakteryjnych komórek gospodarza, odpowiednich dla replikacji tego genu chimerycznego, obejmuje bakterie wybrane z rodzajów: Escherichia, takich jak E. coli, Agrobacterium, takich jak A. tumefaciens lub A. rhizogenes, Pseudomonas, takich jak Pseudomonas spp., Bacillus, takich jak B. megaterium lub B. subtilis, itd. Dzięki sposobowi transformacji według wynalazku staje się obecnie w ramach wynalazku po raz pierwszy możliwe stosowanie również samych B. thuringiensis lub B. cereus jako komórek gospodarza. Sposoby klonowania heterologicznych genów w bakteriach są przedstawione w opisach patentowych St. Zjedn. Am. US-PS nr nr 4 237 224 i 4 468 464.

Replikacja genów w E. coli, kodujących krystaliczną proteinę z B. thuringiensis jest opisana przez ²⁹⁷ Wong’a i współpracowników.

Kilka przykładów drożdżowych komórek gospodarza, nadających się do replikacji genów według wynalazku, obejmuje komórki drożdży wybranych z rodzaju Saccharomyces (europejskie zgłoszenie patentowe EP nr 0 238 441).

Dla amplifikacji genów według wynalazku można stosować każdy dowolny wektor, w który można wbudować gen chimeryczny i który replikuje się w odpowiednich komórkach, takich jak bakterie lub drożdże. Wektor ten może wywodzić się np. z faga lub z plazmidu. Przykładami wektorów, które wywodzą się z fagów i mogą być stosowane w ramach wynalazku, są wektory pochodzące z fagów-M13 i -λ Parę odpowiednich wektorów, wywodzących się z fagów-M13, obejmuje M13mp18 i M13mpl9. Parę, wywodzących się z fagów-λ, odpowiednich wektorów, obejmuje Xgt11, Xgt7 i XCharon4.

Spośród wektorów, które wywodzą się z plazmidów i są całkiem szczególnie odpowiednie dla replikacji w bakteriach, należałoby tu przykładowo wspomnieć pBR322 (3°' Bolivar i współpracownicy, 1977), pUC18 i pUC19) (^33/ Norrander i współpracownicy, 1983) oraz plazmidy Ti (32 Bevan i współpracownicy, 1983), żadną miarą nie ograniczając tym zakresu wynalazku. Korzystnymi wektorami do amplifikowania genów w bakteriach są pBR322, pUC 18 i pUC19.

Dla klonowania bezpośrednio w B. thuringiensis i/lub B. cereus należy przede wszystkim wyszczególnić wektory bezpośredniego klonowania, takie jak pBD347,pBD348, pBD64 oraz pUB 1664, zwłaszcza zaś shuttle-wektory, poprzednio omówione szczegółowo, nie ograniczając jednak do tego zakresu wynalazku.

Szczególnie korzystnymi w ramach wynalazku są dwufunkcjonalne (shuttle-) wektory pXI61 (=pK61) i pXI93 (=pK93), które transformowane w B. thuringiensis var. kurstaki HD1 cryB lub w B. cereus 569 K, zostały w uznanym za Międzynarodową Kolekcję zbiorze mikroorganizmów Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (Brunświk, RFN) zgodnie z postanowieniami Umowy Budapesztańskiej złożone pod numerami: DSM 4573 (pXI61, transformowany w B. thuringiensis var. kurstaki HD1 cryB) lub DSM 4571 (pXI93, transformowany w B. thuringiensis var. kurstaki HD1 cryB) i DSM 4573 (pXI93, transformowany w B. cereus 569 K).

W celu skonstruowania chimerycznego genu, odpowiedniego dla replikacji w bakteriach, włącza się sekwencję promotora, nie podlegającą translacji sekwencję-5’, sekwencję kodującą i

164 138 nie podlegającą translacji sekwencję-3’ w wektor, albo we właściwej kolejności montuje się w jednym z poprzednio omówionych wektorów. Odpowiednimi wektorami są zgodnie z wynalazkiem takie, które są zdolne do replikowania w komórce gospodarza.

Promotor, nie podlegający translacji region-5’, kodujący region i nie podlegający translacji region-3’ można ewentualnie najpierw zmontować w jednostkę poza tym wektorem i następnie włączyć w wektor. Alternatywnie z tym można także części tego chimerycznego genu pojedynczo włączać w wektor.

W przypadku wektorów klonowania B. thuringiensis lub B. cereus można ten etap postępowania zaniechać, gdyż cała, z B. thuringiensis wyodrębniona jednostka, składająca się z nie podlegającego translacji regionu-5’, kodującego regionu i nie podlegającego translacji regionu-3’, może zostać wpleciona w ten wektor.

Ponadto wektor ten korzystnie zawiera też gen markerowy, który komórce gospodarza nadaje właściwość, dzięki której można rozpoznawać komórki stransformowane tym wektorem. Korzystnymi są geny markerowe, kodujące antybiotykoopomość. Paroma przykładami odpowiednich antybiotyków są ampicylina, chloramfenikol (chloromycetyna), erytromycyna, tetracyklina, higromycyna, G418 i kanamycyna.

Również korzystnymi są geny markerowe, które kodują enzymy z substratem chromogennym, takie jak np. X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolilo-^D-galaktozyd). Stransformowane kolonie można następnie bardzo łatwo wykrywać za pomocą specyficznej reakcji barwnej.

Włączanie lub montaż tego genu w wektorze przeprowadza się za pomocą sposobów standartowych, przykładowo za pomocą stosowania rekombinantowego DNA Maniatis i współpracownicy, 1982) i stosowania homologicznej rekombinacji (3^4/ Hinnen i współpracownicy, 1978).

Sposób z technologią rekombinantowego DNA polega na tym, że wektor najpierw przecina się a żądaną sekwencję DNA włącza się między te przecięte kawałki wektora; końce żądanej sekwencji DNA wiąże się następnie z odpowiednimi końcami tego wektora.

Wektor ten korzystnie tnie się za pomocą odpowiednich endonukleaz restrykcyjnych. Odpowiednimi endonukleazami restrykcyjnymi są np. takie, które tworzą tępe końce, jak Smal, Hpal i EcoRV, oraz takie, które tworzą lepkie końce, jak EcoRI, SacI i BamHI.

Żądana sekwencja DNA istnieje zwykle jako część większej cząsteczki DNA, takiej jak chromosom, plazmid, transpozon lub fag. Żądaną sekwencję DNA w tych przypadkach wycina się z jej pierwotnego źródła i ewentualnie modyfikuje tak, żeby jej końce mogły związać się z końcami przeciętego wektora. Jeśli końce żądanej sekwencji DNA i przeciętego wektora są końcami tępymi, to można je ze sobą związać np. za pomocą ligaz specyficznych dla końców tępych, tj. takich ligaz, jak T4 ligaza-DNA.

Końce tej żądanej sekwencji DNA można też w postaci lepkich końców wiązać z końcami przeciętego wektora i w tym przypadku wykorzystuje się ligazę specyficzną dla końców lepkich, którą może być też T4 ligaza-DNA. Inną odpowiednią ligazą specyficzną dla lepkich końców jest E. coli ligaza-DNA.

Lepkie końce tworzy się celowo w ten sposób, że żądaną sekwencję DNA i wektor tnie się jednakową endonukleazą restrykcyjną. W tym przypadku żądana sekwencja DNA i przecięty wektor mają lepkie końce, które wzajemnie są komplementarne.

Lepkie końce można też konstruować w ten sposób, że za pomocą terminalnej transferazy dezoksynukleotydylowej doczepia się komplementarne, homopolimeryczne ogony na końcach żądanej sekwencji DNA i przeciętego wektora. Alternatywnie można też końce lepkie wytwarzać w ten sposób, że doczepia się syntetyczną sekwencję oligonukleotydową, którą rozpoznaje określona endonukleaza restrykcyjna i która jest znana pod nazwą linker, i sekwencję tę rozszczepia się endonukleazą (patrz np. 33/ Maniatis i współpracownicy, 1982).

Tym samym jest obecnie w ramach wynalazku po raz pierwszy możliwe to, by geny B. thuringiensis, zwłaszcza zaś sekwencje DNA kodujące δ-endotoksynę, poza bakterią B. thuringiensis genetycznie modyfikować, klonować i następnie sprowadzać do komórek B. thuringiensis i/lub B. cereus, gdzie wspomniane geny δ-endotoksyny mogą podlegać ekspresji (w homologicznym bakteryjnym układzie gospodarza).

Oznacza to, że obecnie nawet genomem B. thuringiensis można celowo manipulować genetycznie, uzyskując najpierw duże ilości materiału plazmidowego w obcym układzie klonowania i transformując następnie ten materiał do B. thuringiensis.

Szczególnie interesującą jest przy tym możliwość modyfikacji genów δ-endotoksyny oraz kontrolnych sekwencji regulujących ekspresję tych genów.

Obok chomerycznych genów można oczywiście za pomocą sposobu według wynalazku włączać do komórek Bacillus thuringiensis i/lub Bacillus cereus każdą dowolną inną chimeryczną konstrukcję genetyczną.

I tak np. w warunkach stosowania sposobu według wynalazku jest do pomyślenia włączanie nie kodującego, antysensownego dNa do genomu komórki Bacillus thuringiensis i/lub Bacillus cereus, tak więc w toku ekspresji wspomnianego antysensownego DNA transkrybuje się mRNA, który hamuje ekspresję korespondującego sensownego DNA. Na tej drodze możliwe jest celowe tłumienie ekspresji określonych, niepożądanych genów w Bacillus thuringiensis i/lub Bacillus cereus.

Ponadto powstała obecnie też, obok oddania do dyspozycji udoskonalonych, dokładnie zdefiniowanych szczepów B. thuringiensis dla wytwarzania bioinsektycydów, możliwość stosowania B. thuringiensis jako generalnego gospodarza dla klonowania i ewentualnej ekspresji genów heterologicznych i/lub homologicznych.

W specyficznej i korzystnej postaci wykonania sposobu według wynalazku jest obecnie po raz pierwszy możliwe klonowanie nowych genów, zwłaszcza zaś nowych genów protoksyny, bezpośrednio w naturalnym gospodarzu, tj. w B. thuringiensis lub B. cereus.

W przypadku poszukiwania nowych genów protoksyny zakłada się najpierw bibliotekę genów B. thuringiensis.

W pierwszym etapie postępowania wyodrębnia się przy tym cały DNA szczepu B. thuringiensis produkującego protoksynę i następnie rozkłada na poszczególne fragmenty. DNA z B. thuringiensis można przy tym dzielić na fragmenty albo mechanicznie, np. działając siłami ścinania, albo też korzystnie trawiąc odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. W zależności od wyboru enzymów otrzymuje się częściowe lub całkowite trawienie próbki DNA. Szczególnie korzystne w ramach wynalazku jest stosowanie enzymów restrykcyjnych, zawierających czwartorzędowe miejsca rozpoznawania i/lub prowadzących do częściowego trawienia DNA z B. thuringiensis, takich jak enzym restrykcyjny SaulllA, nie ograniczając jednak do niego zakresu wynalazku. W sposobie według wynalazku można oczywiście stosować też wszystkie inne odpowiednie enzymy restrykcyjne.

Uzyskane na poprzednio omówionej drodze fragmenty restrykcyjne rozdzielasię następnie za pomocą znanych sposobów według ich wielkości. Dla od wielkości zależnego rozdzielania fragmentów DNA stosuje się z reguły odwirowywania, takie jak sacharozowe odwirowania gradientowe, albo sposoby elektroforetyczne, takie jak agarozowa elektroforeza żelowa, lub kombinacja tych sposobów.

Te frakcje, które zawierają fragmenty o właściwej wielkości, tj. fragmenty, które ze względu na swą wielkość są zdolne do kodowania protoksyny, łączy się (jednoczy się) i stosuje w dalszych etapach postępowania.

Najpierw te poprzednio wyodrębnione fragmenty, stosując standardowe sposoby, wplata się w odpowiednie wektory klonowania i następnie za pomocą sposobu transformacji według wynalazku włącza się w Bacillus thuringiensis lub B. cereus, korzystnie jednak w wolne od protoksyny szczepy Bacillus thuringiensis.

Jako wektory można stosować zarówno Gram-dodatnie plazmidy, takie jak pBC16, pUB110, pC194, jak i poprzednio szczegółowo omówione shuttle-wektory. Szczególnie korzystnym w ramach wynalazku jest shuttle-wektor pXI200, który szczegółowo jest omówiony niżej (patrz przykład IX-1.). Odpowiednie wektory zawierają korzystne sekwencje DNA, które zapewniają łatwą identyfkowalność zawierających wektor, stransformowanych klonów wśród niezliczonej ilości klonów nie stransformowanych. Szczególnie korzystnymi są sekwencje DNA, kodujące specyficzny marker, który w przypadku ekspresji prowadzi do łatwo dającej się selekcjonować cechy, takiej np. jak antybiotykoopomość. Przykładowo należy tu wspomnieć o

164 138 oporności na ampicylinę, chloramfenikol, erytromycynę, tetracyklinę, higromycynę, G418 lub kanamycynę.

Również korzystnymi są geny markerowe, które kodują enzymy z substratem chromogennym, takie jak np. X-gal (5-bromo-4-chloro-3- indolilo-P-D-galaktozyd). Obecność stransformowanych kolonii można wówczas bardzo łatwo stwierdzić za pomocą specyficznej reakcji barwnej.

Po elektroporacji traktowane komórki Bacillus thuringiensis lub B. cereus przenosi się na selektywną pożywkę sporulacyjną i tu aż do zupełnej sporulacji inkubuje się w temperaturze 10-40°C korzystnie w temperaturze 20-35°C, a szczególnie korzystnie w temperaturze 29-31°C. Pożywka sporulacyjna zawiera jako substancję selektywną korzystnie jeden z wyżej omówionych antybiotyków, zależnie od zastosowanego wektora, oraz odpowiedni środek zestalający, taki np. jak agar, agaroza, żelatyna, itd.

W toku sporulacji dochodzi do autolizy zarodnikujących komórek, co dla kolejno następującego screening’u stanowi dużą zaletę pod względem postępowania technicznego, gdyż zbędne staje się sztuczne rozrywanie komórek. W przypadku klonów, które zawierają poszukiwany gen protoksyny i podlegają ekspresji pod kontrolą swego naturalnego promotora, utworzone proteiny krystaliczne występują swobodnie dostępne w pożywce. Te w pożywce swobodnie występujące proteiny krystaliczne można następnie wyłapać np. za pomocą filtrów membranowych lub dzięki innym odpowiednim środkom. Odpowiednimi filtrami membranowymi są przykładowo filtry nylonowe (poliamidowe 66) lub nitrocelulozowe. Membrany tego rodzaju są dostępne w handlu.

Te tak wyłapane proteiny krystaliczne można wówczas bardzo łatwo w ramach odpowiedniego screeningu wyszukać i zidentyfikować.

Korzystnym w ramach tego sposobu jest screening immunologiczny z zastosowaniem przeciwciał specyficznych wobec protoksyny. Sposoby screening’ u immunologicznego są znane i np. szczegółowo opisane przez 3 Young’a i współpracowników, 1983. Szczególnie korzystne w ramach tego sposobu jest stosowanie przeciwciał monoklonalnych, które całkiem specyficznie rozpoznają określoną część cząsteczki tej proteiny. Przeciwciała te można stosować albo pojedynczo albo w postaci mieszaniny. Nadto można oczywiście w celu screening’u immunologicznego stosować też przeciwsurowice poliklonalne. Również mieszaniny zawierające przeciwciała monoklonalne i poliklonalne mogą być stosowane.

Sposoby wytwarzania monoklonalnych przeciwciał przeciwko proteinom protoksyny Bacillus thuringiensis są znane i szczegółowo opisane np. przez 3 Huber-Lukaca, (1984) lub przez 3⁷/ Huber-Lukaca i współpracowników, (1986). Sposoby te można również stosować w tym przypadku.

Ponadto w ramach wynalazku można oczywiście stosować też inne odpowiednie sposoby screeningowe w celu wyszukiwania nowych sekwencji DNA w B. thuringiensis i/lub B. cereus.

Komórki Bacillus thuringiensis i B. cereus, które zostały stransformowane za pomocą poprzednio omówionego sposobu, oraz toksyny wyprodukowane przez te stransformowane komórki Bacillus thuringiensis nadają się znakomicie do zwalczania owadów, zwłaszcza zaś do zwalczania owadów z rzędów: Lepidoptera, Diptera i Coleoptera.

Można przy tym owady lub ich biotyp

a) traktować komórkami B. thuringiensis lub B. cereus lub zmieszanymi komórkami ich obu, stransformowanymi rekombinantową cząsteczką DNA, zawierającą gen struktury, kodujący polipetyd δ-endotoksyny, który naturalnie występuje w bakterii B. thuringiensis, lub kodujący polipeptyd, który co do istoty rzeczy jest z tym naturalnym homologiczny, albo owady i ich biotyp; lub też

b) traktować bezkomórkowymi preparatami ciałka krystalicznego, zawierającymi protoksynę, którą wytwarzają wspomniane, stransformowane komórki Bacillus.

Stransformowane mikroorganizmy, zawierające zrekombinowany gen toksyny B. thuringiensis, korzystnie stransformowane żywe lub martwe komórki B. thuringiensis lub B. cereus, włącznie z mieszaninami żywych i martwych komórek B. thuringiensis i B. cereus, oraz proteiny toksyny wytworzone przez wspomniane stransformowane komórki, w celu stosowania jako

164 138 insektycydy wprowadza się w nie zmienionej postaci lub korzystnie wraz z rozpowszechnionymi w technice sporządzenia środków użytkowych substancjami pomocniczymi i w znany sposób sporządza środki użytkowe, np. koncentraty zawiesinowe, pasty do malowania, roztwory gotowe do bezpośredniego opryskiwania lub roztwory rozcieńczane, proszki zwilżalne, proszki rozpuszczalne, środki do opylania, granulaty lub też mikrokapsułki w np. tworzywach polimeryconycC.

Sposoby stosowania, takie jak opryskiwanie, rozpylanie mgławicowe, opylanie, rozsiewanie, malowanie lub polewanie, dobiera się tak samo jak i rodzaj środków, odpowiednio do zamierzonego celu i do podanych warunków.

Ponadto można oczywiście stosować mieszaniny owadobójcze, składające się ze stransformowanych, żywych lub martwych komórek B. tCuricgiensis i/lub B. cereus oraz z bezkomórkowych preparatów ciałka krystalicznego, zawierających protoksynę, którą wytwarzają wspomniane, stracsformkwacb komórki Bacillus.

Preparaty użytkowe, tzn. środki lub kompozycje, zawierające stransformowane żywe lub martwe komórki Bacillus lub ich mieszaniny oraz proteiny toksyny wytworzone przez wspomniane stracsformkwace komórki Bacillus i ewentualnie zawierające stałe lub ciekłe substancje pomocnicze, sporządza się w znany sposób, np. drogą starannego wymieszania tych stransformowanych komórek i/lub protein toksyny ze stałymi nośnikami i ewentualnie związkami powierzchniowo czynnymi (tensydami).

Jako stałe nośniki, np. dla środków do opylania i dla proszków dyspergowanych, z reguły stosuje się mączki ze skał naturalnych, takich jak kalcyt, talk, kaolin, monmorylonit lub attapulgit. W celu polepszenia właściwości fizycznych można też dodawać wysokodyspersyjny kwas krzemowy lub wysokodyspersyjne polimery nasiąkliwe. Jako ziarnisty, adsorpcyjny nośnik granulatorowy wchodzą w rachubę typy porowate, np. pumeks, kruszonka ceglana, sepiolit lub bentonit, a jako nie sorpcyjne substancje nośnikowe, np. kalcyt lub piasek. Ponadto można stosować cały szereg wstępnie zgranulowanych substancji pochodzenia nieorganicznego, takich zwłaszcza jak dolomit, albo rozdrobnione pozostałości roślinne.

Jako związki powierzchniowo czynne wchodzą w rachubę niejonowe, kationowe i/lub anionowe tensydy o silnych właściwościach dyspergujących i zwilżających. Pod określeniem tensydy należy rozumieć także mieszanny tensydów.

Odpowiednimi tensydami amonowymi mogą być zarówno tzw. mydła rozpuszczane w wodzie, jak i w wodzie rozpuszczane, syntetyczne związki powierzchniowo czynne.

Jako mydła należy wspomnieć sole litkwckwe, sole wapnikwyowe i ewentualnie podstawione sole amoniowe wyższych kwasów tłuszczowych (o 10-22 atomach węgla), takie jak sól sodowa lub potasowa kwasu klbickwbgk lub stearynowego, lub takież sole mieszanin naturalnych kwasów tłuszczowych, które można uzyskiwać np. z oleju kokosowego lub łojowego. Nadto wspomnieć należy sole metylotauryny z kwasem tłuszczowym, takie jak sól sodowa kwasu yis-2-(mbtylfoktadecen-9-ylkamico)-etacosulfocowegk (zawartość w preparatach korzystnie około 3%).

Częściej jednak stosuje się tak zwane tensydy syntetyczne, zwłaszcza wyższe alka^s^fkniacy, siarczany alkoholi tłuszczowych, sulfonowane pochodne benoimidaoklu, alkiloarylosulfoniany lub alkohole tłuszczowe, takie jak np. 2,4,7,9-cotbrombtylkdecynk-5-diol-4,7 (zawartość w preparatach około 2%).

Sulfoniany lub siarczany alkoholi tłuszczowych z reguły występują w postaci soli litowcowych, soli wapniow^w^^ lub ewentualnie podstawionych soli amoniowych i wykazują rodnik alkilowy o 8-22 atomach węgla, przy czym rodnik alkilowy także obejmuje część alkilową rodników acylowych, np. sól sodowa lub wapniowa kwasu lignicosulfonowegk, estru kwasu dodecylosiarkowego lub mieszaniny siarczanu alkoholu tłuszczowego, wytworzonej z naturalnych kwasów tłuszczowych. Należą tu też sole estrów kwasu siarkowego i kwasów sulfonowych z adduktami alkohol tłusocoowy-tlenekbtylenu. Sulfonowane pochodne bbnomidaoklu zawierają korzystnie 2 grupy sulfonowe i grupę kwasu tłuszczowego o 8-22 atomach węgla. Alkiloarylosulfonianami są np. sole sodowe, wapniowe lub trójbtacoloaminowe kwasu dodecylobenobcosulffcowego, kwasu dwubutylocaftalenosulfknowegk lub produktu kondensacji kwas naftalecfsufonowy-formaldehyd.

164 138

Nadto w rachubę wchodzą również odpowiednie fosforany, takie jak sole estrów kwasu fosforowego z adduktera p-nonylofenol-tlenek etylenu (o 4-14 jednostkach tlenku).

Do niejonowych tensydów zaliczają się przede wszystkim pochodne eterów glikolu polietylenowego z alkoholami alifatycznymi lub cykloalifatycznymi, z nasyconymi lub nienasyconymi kwasami tłuszczowymi i alkilofenolami, zawierające 3-30 grup glikoloeterowych i 8-20 atomów węgla w (alifatycznym) rodniku węglowodorowym oraz 6-18 atomów węgla w rodniku alkilowym alkilofenolu.

Dalszymi odpowiednimi niejonowymi tensydami są rozpuszczalne w wodzie, 20-250 grup eterowych glikolu etylenowego i 10-100 grup eterowych glikolu propylenowego zawierające poliaddukty tlenku etylenu z glikolem polipropylenowym, glikolem etylenodwuaminopolipropylenowym i glikolem alkilopolipropylenowym o 1-10 atomach węgla w łańcuchu alkilowym. Omawiane związki na jednostkę glikolu propylenowego zawierają zwykle 1-5 jednostek glikolu etylenowego.

Jako przykład niejonowych tensydów należy podać nonylofenolopolietoksyetanole, etery oleju rącznikowego z glikolem polietylenowym, addukty polipropylenopolietylenotlenkowe, trójbutylofenoksypolietoksyetanol, glikol polietylenowy i oktylofenoksypolietoksyetanol. Dalej wchodzą w rachubę też estry kwasów tłuszczowych z polioksyetylenoanhydrosorbitem, takie jak trójoleinian polioksyetylenoanhydrosorbitu.

W przypadku kationowych tensydów chodzi przede wszystkim o czwartorzędowe sole amoniowe, które jako podstawnik azotu zawierają co najmniej jeden rodnik alkilowy o 8-22 atomach węgla, a jako dalsze podstawniki wykazują niższe ewentualnie chlorowcowane rodniki alkilowe, benzylowe lub hydroksyalkilowe. Sole te występują korzystnie w postaci halogenków, metylosiarczanów lub etylosiarczanów, takich jak chlorek stearylotrójmetyloamoniowy lub bromek benzylodwu(2-chloroetylo)etyloamoniowy.

Tensydy, rozpowszechnione w technice sporządzania preparatów użytkowych, są m.in. opisane w następujących publikacjach: 3 1986 International McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents, The Manufacturing Confectioner Publishing Co., Glen Rock, NJ, St. Zjedn. Am.; Helmut Stache Tensid-Taschenbuch, wyd. Carl Hanser- Verlag, Monachium-Wiedeń 1981.

Środki agrochemiczne zawierają z reguły 0,1-99%, zwłaszcza zaś 0,1-95%, stransformowanych, żywych lub martwych komórek Bacillus lub ich mieszanin względnie protein toksyny wytworzonych przez wspomniane stransformowane komórki Bacillus, 99,9-1%, zwłaszcza 99,8-5%, stałego lub ciekłego dodatku i 0-25%, zwłaszcza 0,1-25%, substancji powierzchniowo czynnej.

Chociaż jako wybór handlowy jest korzystny środek stężony, to jednak z reguły użytkownik ostateczny stosuje środki rozcieńczone.

Środki te mogą też zawierać dalsze dodatki, takie jak stabilizatory, substancje przeciwpieniące, regulatory lepkości, lepiszcza, środki polepszające przyczepność oraz nawozy syntetyczne lub inne substancje czynne dla uzyskania efektów specjalnych.

Stransformowane żywe lub martwe komórki Bacillus lub ich mieszaniny, zawierające geny rekombinantowe toksyny B. thuringiensis, oraz same proteiny toksyny wytworzone przez wspomniane stransformowane komórki Bacillus znakomicie nadają się do zwalczania szkodliwych owadów. Przede wszystkim zaliczają się do nich żerujące na roślinach owady z rzędu Lepidoptera, zwłaszcza owady z rodzajów: Pieris, Heliothis, Spodoptera i Plutella, takich przykładowo jak Pieris brassicae, Heliothis virescens, Heliothis zea, Spodoptera littoralis i Plutella xylostella.

Dalszymi owadami szkodliwymi, które można zwalczać za pomocą poprzednio omówionych preparatów owadobójczych, są np. chrząszcze z rzędu Coleoptera, zwłaszcza chrząszcze z rodziny Chrysomelidae, takie jak np. Diabrotica undecimpunctata, D. longicomis, D. virgitera,

D. undecimpunctata howardi, Agelastica alni, Leptinotarsa decemlineata itd.., oraz owady z rzędu Diptera, takie jak np. Anopheles sergentii, Uranatenia unguiculata, Culeż unvittatus, Aedes aegypti, Culex pipiens, itd.

Dawki, w których wprowadza się komórki Bacillus lub przez nie wytworzone proteiny toksyny, zależą od danych warunków takich jak warunki atmosferyczne, właściwości glebowe, wzrost roślin i moment aplikowania.

Niżej podano receptury sporządzania preparatów użytkowych dla materiału zawierającego toksynę B. thuringiensis.

W niżej podanych recepturach F1.-F6. pod określeniem komórki Bacillus należy rozumieć takie komórki B. thuringiensis i/lub B. cereus, które zawierają zrekombinowany według wynalazku gen B. thuringiensis (w przypadku danych chodzi o procenty wagowe).

F1. Granulaty komórki Bacillus i/lub przez nie	a)	b)
wytworzona proteina toksyny	5%	10%
kaolin	94%	-
wysokodyspersyjny kwas krzemowy	1%	-
attapulgit	-	90%.

Z komórek Bacillus i/lub z przez nie wytworzonej proteiny toksyny najpierw sporządza się zawiesinę w chlorku metylenu, następnie zawiesinę tę rozpyla się na nośnik, po czym fazę

rozpraszającą odparowuje się pod próżnią.
F2. Środek do opylania	a)	b)
komórki Bacillus i/lub przez nie
wytworzona proteina toksyny	2%	5%
wysokodyspersyjny kwas krzemowy	1%	5%
talk	97%	-
kaolin	-	90%.

Gotowy do użytku środek do opylania otrzymuje się na drodze starannego wymieszania nośników z komórkami Bacillus i/lub z przez nie wytworzoną proteiną toksyny.

F3. Proszek zwilżalny	a)	b)	c)
komórki Bacillus i/lub przez nie
wytworzona proteina toksyny	25%	50%	75%
ligninosulfonian sodowy	5%	5%	-
siarczan laurylowo-sodowy	3%	-	5%
dwuizopropylonaftalenosulfonian sodowy	-	6%	10%
eter glikolu polietylenowego z oktylofe-
nolem (7-8 moli denku etylenu) -	2%	-
wysokodyspersyjny kwas krzemowy	5%	10%	10%
kaolin	62%	27%	-.
Komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzoną proteinę toksyny miesza się starannie

dodatkami a otrzymaną mieszaninę następnie miele się dokładnie w odpowiednim młynie. Otrzymuje się proszek zwilżalny, który za pomocą wody można rozcieńczać do każdego żądanego stężenia.

F4. Granulaty wytłaczane komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzona proteina toksyny 1010 ligninosulfonian sodowy 2% karboksymetyloceluloza 1% kaolin 87%.

Komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzoną proteinę toksyny miesza się z substancjami pomocniczymi, starannie miele się i zwilża wodą. Mieszaninę tę poddaje się wytłaczaniu i następnie suszy w strumieniu powietrza.

F5. Granulat powlekany komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzona proteina toksyny 3% glikol polietylenowy o m.cz. 200 3% kaolin 94%.

Jednorodnie wymieszne komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzoną proteinę toksyny równomiernie nanosi się w mieszarce na kaolin zwilżony glikolem polietylenowym. Tą drogą otrzymuje się niepylące granulaty powlekane.

138

F6. Koncentrat zawiesinowy
komórki Bacillus i/lub przez nie
wytworzona proteina toksyny	40%
glikol etylenowy	100%
eter glikolu polietylenowego z nonylo-
fenolem (15 moli tlenku etylenu)	66%
sól trójetanoloaminowa kwasu alkilo*-
benzenosulfonowego	33%
karboksymetyloceluloza	1%
olej silikonowy w postaci	75%
emulsji wodnej	0,1%
woda	39%.
Alkil jest kcjystnierydnikiemhniowymo 10-14, zwłaszczao 12- bł, at2mach węglcu 3akmajaknp.roknik

w soli trójetanoloaminowej kwasu n-dodecylobenzenosulfonowego.

Jednorodnie wymieszane komórki Bacillus i/lub przez nie wytworzoną proteinę toksyny miesza się starannie z dodatkami. Otrzymuje się koncentrat zawiesinowy, z którego drogą rozcieńczania wodą można sporządzać zawiesiny o każdym żądanym stężeniu.

Podane niżej przepisy A.-H. omawiają ogólne techniki rekombinantowego DNA.

Ponieważ wiele z wykorzystanych w wynalazku technik rekombinantowego DNA stanowi dla fachowca zajęcie rutynowe, podano niżej krótkie omówienie tych ogólnie używanych technik, by z tych ogólnych wskazówek można było zrezygnować w konkretnych przykładach wykonania. O ile wyraźnie nie wskazano inaczej, to wszystkie te sposoby są omówione w publikacji^33/ Maniatis’a i współpracowników, 1982.

A. Cięcie endonukleazami restrykcyjnymi

Zazwyczaj szarża reakcyjna zawiera około 50-500 gg/ml DNA w roztworze buforowym, polecanym przez producenta - New England Biolabs, Beverly, MA. Na każdy 1 gg DNA dodaje się 2-5 jednostek endonukleaz restrykcyjnych i tę szarżę reakcyjną inkubuje się w ciągu 1-3 godzin w temperaturze zalecanej przez producenta. Reakcja ta na drodze ogrzewania w temperaturze 65°C lub na drodze ekstrakcji fenolem, a następnie na drodze strącania osadu DNa etanolem zostaje zakończona. Technikę tę opisano także na stronach 10-4-106 publikacji 33/ Maniatis’a i współpracowników.

B. Traktowanie DNA polimerazą w celu wytworzenia tępych końców.

50-500 gg/ml fragmentów DNA dodaje się do szarży reakcyjnej w buforze zalecanym przez producenta - New England Biolabs. Szarża reakcyjna zawiera wszystkie cztery trifosforany dezoksynukleotydowe w stężeniu 0,2 M. Reakcja następuje w ciągu 30 minut w temperaturze 15°C i następnie zostaje na drodze 10- minutowego ogrzewania w temperaturze 65°C zakończona. Dla fragmentów, które otrzymuje się na drodze cięcia endonukleazami restrykcyjnymi, wytwarzającymi wystające końce-5’, takimi jak EcoRI i BamHI, wykorzystuje się duży fragment, lub fragment Klenowa polimerazy DNA. Dla fragmentów, które otrzymuje się dzięki endonukleazom, wytwarzającym wystające końce-3’, takim jak PstI i SacI, wykorzystuje się T4 polimerazę DNA (polimeraze DNA z faga T4). Stosowanie tych dwóch enzymów opisano na stronach 113- 121 publikacji ™ Mamatis’a i współpracowników.

C. Agarozowa elektroforeza żelowa i oczyszczanie fragmentów DNA z żeli

Agarozową elektroforezę żelową przeprowadza się w poziomym aparacie, jaki opisano na stronach 150-163 pubLUkacj 33^χ Maniatis’a i współpracowników. Stosowany bufor jest tamże opisanym buforem Tris-boranowym. Fragmenty DNA barwi się dzięki 0,5 gg/ml bromku 3,8-dwuamino-5-etylo-6-fenylofenantrydyniowego, który albo jest obecny w buforze żelowym lub zbiornikowym podczas elektroforezy, albo wedle wyboru dodaje się go po elektroforezie. DNA staje się widzialne dzięki naświetlaniu długofalowym nadfioletem. Jeżeli fragmenty te nie mają być oddzielone od żelu, to stosuje się agarozę, która żeluje w niskiej temperaturze i może być sprowadzona z firmy Sigma Chemical, ST. Louis, Missouri. Po tej elektroforezie żądany fragment wycina się, wkłada do rurki z tworzywa sztucznego, ogrzewa w ciągu około 15 minut w temperaturze 65°C, trzykrotnie ekstrahuje fenolem i dwukrotnie strąca etanolem. Sposób ten

164 138

33/ w porównaniu ze sposobem opisanym na stronie 170 publikacji Maniatis’a i współpracowników jest nieco zmieniony.

Alternatywnie można ten DNA z żelu agarozowego izolować za pomocą środka o nazwie Geneclean Kits (firmy Bio 101 Inc.,La Jolla, CA, St. Zjedn. Am.).

D. Usunięcie 5’-terminalnych fosforanów z fragmentów DNA

Podczas etapu klonowania plazmidu traktowanie plazmidu wektorowego fosfatazą zmniejsza recyrkularyzację tego wektora (omówiono na stronie 13 publikacji ^33/Maniatis’a i współpracowników). Po cięciu DNA właściwą endonukleazą restrykcyjną dodaje się jednostkę alkalicznej fosfatazy z jelita cieląt, uzyskaną z firmy Boehringer-Mannheim, Mannheim. Ten DNA ikubuje się w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C, po czym dwukrotnie ekstrahuje fenolem i strąca etanolem.

E. Połączenie fragmentów DNA

Jeśli fragmenty o komplementarnych lepkich końcach mają być ze sobą połączone, to około 100 ng każdego fragmentu inkubuje się w mieszaninie reakcyjnej o objętości 20-40 μΐ z około 0,2 jednostek T4 ligazy DNA z firmy New England Biolabs w buforze zalecanym przez producenta. Inkubację prowadzi się w ciągu 1-20 godzin w temperaturze 15°C. Jeśli fragmenty o tępych końcach mają być połączone, /o /ińkjbuje się /e 3tdc, /di podirno wyżżjj z /ym, żż 3io&5 T4 ligazy DNA podwyższa się do 2-4 jednostek.

F. Transformacja DNA do E. coli

Szczep HB101 E. coli stosuje się w większości eksperymentów. DNA wprowadza się do

E. coii za pomocą sposobu z chlorkiem wapniowym, ak jik to opisano na 250-251 publikacji Maniatis’a i współpracowników.

G. Screening E. coli na plazmidach

Po transformacji wynikowe kolonie E. coli bada się na obecność żądanego plazmidu sposobem szybkiej izolacji plazmidu. Dwa praktykowane sposoby opisano na stronach 300-309 publikacj/ ^33rManiatis’a i współpracowników.

H. Izolowanie DNA plazmidowego w dużej skali

Sposoby izolowania w dużej skali plazmidów z E. coli omówione są na stronach 88-94 publ-iicaccj /3^; Maniatis’a i współpracowników.

Niżej zestawiono stosowane pożywki i roztwory buforowe.

Pożywka LB-Medium [gg/tr] trypton 10 ekstrakt drożdżowy 5

NaCl 5

Pożywka o nazwie Antibiotic Medium Nr. 3 (firmy Difco Laboratories) [[gUtrr wyciąg z mięsa bydlęcego 115 ekstrakt drożdżowy 1,5 peptony 5 glukoza 1

NaCl 3,5

K2HPO4 3,68

KH2PO4 1,32.

Pożywka SCGY-Medium Ε^Ιϊοτ]

Casaminoacids (hydrolizowana kwasem kazeina) 1 ekstrakt drożdżowy 0,1 glukoza 5

K2HPO4 114

KH2PO4 6 cytrynian trójsodowy 1 (NHhSO» 2

MgSO4’7H2Q 021.

164 138 [miM

400 pH=6,0 7.

[miM

0,05% [wagJobjęt.] (pH=8,0) 10 [15O]66a

Pożywka GYS-Medium (22 Yousten and Rogoff, 1969) [g/litr] glukoza 1 ekstrakt drożdżowy 2 (NH4)2SO4 2

K2HPO4 0,5

MgSO4’7H20 0,2

CaCl2'2H20 0,08

MnSOrftO 0,05 odczyn przed utrzymywaniem w autoklawie nastawia się na wartość pH= 7,3.

Bufor PBS sacharoza MgCl2 bufor fosforanowy,

Bufor TBST Tween 20*

Tris/HCl*

NaCl (w wodzie redestylowanej) *Tween 20: laurynian polietoksyanhydrosorbitu *Tirs/HCl: chlorowodorek α, α, α- tris(hydroksymetylo)metyloaminy.

Wewnętrzne oznakowanie pX, przyjęte dla nazwania plazmidów w dowodzie pierwszeństwa, zostało w opisie przeznaczonym do patentowania zagranicą zastąpione przez oficjalnie uznawane oznakowanie pXI.

Również w nazwie asporogennego mutanta B. thuringiensis, stosowanego w ramach przykładów wykonania, zmieniono słowo cryP na cryB.

Przykład I. Transformacja B. thuringiensis za pomocą elektroporacji

1.1. 10 ml pożywki LB-Medium [trypton 10 g/litr, ekstrakt drożdżowy 5 g/litr, NaCl g/litr] inokuluje się zarodnikami B. thuringiensis var. kurstaki HD1 cryB (^39/ Stahly DP i współpracownicy, 1978), bezplazmidowego wariantu bakterii B. thuringiensis var. kurstaki HD1.

Szarżę tę w ciągu nocy inkubuje się w temperaturze 27°C na wstrząsarce obrotowej przy 50 obrotach/minutę. Następnie tę kulturę B. thuringiensis 100-krotnie rozcieńcza się w 100-400 ml pożywki LB-Medium i w temperaturze 30°C nadal hoduje się na wstrząsarce obrotowej przy 250 obrotach/minutę, aż do osiągnięcia absorbancji (ODsm) równej 0,2.

Komórki te zbiera się za pomocą wirowania i sporządza zawiesinę w 1/40 objętości lodem chłodzonego buforu PBS (400 mM sacharozy, 1 mM MgC22, 7 mM bfforu fofforanowgoo o pH=6,0). Wirowanie i następne sporządzenie zawiesiny zebranych komórek B.thuringiensis w buforze PBS powtarza się jeszcze raz.

Tak wstępnie traktowane komórki można albo bezpośrednio elektropować, albo po dodaniu gliceryny do roztworu buforowego [20% wagowo/objętościowych] przechowywać w temperaturze od -20°C do -70°C i w późniejszym momencie stosować.

800 μΐ podwielnkrntnej części chłodzonych lodem komórek przeprowadza się następnie do wstępnie ochłodzonych kiuwet, po czym dodaje się 0,2 μg DNA plazmidu pBC16 (‘•/Bernhard K. i współpr^cowacy, 1978) [20 pg/ml] i tę całą szarżę inkubuje się w ciągu 10 minut w temperaturze 4°C.

W przypadku stosowania zamrożonego materiału komórkowego najpierw odpowiednią podwielokrotną część zamrożonych komórek pozostawia się do rozmrożenia w lodzie lub w temperaturze pokojowej. Dalsze traktowanie następuje analogicznie do postępowania z zastosowaniem świeżego materiału komórkowego.

Następnie kiuwetę tę wprowadza się do aparatury elektropnoacyjnej i występujące w zawiesinie komórki B. thuringiensis poddaje się elektroporacji, obciążając je jednokrotnym wyładowaniem kondensatora o napięciach 0,1-2,5 kV.

Stosowany tu kondensator ma pojemność 25 μF, kiuwety mają elektrody w odstępie 0,4 cm, co w przypadku wyładowania w zależności od nastawienia prowadzi do wykładniczo

164 138 malejącego natężenia pola elektrycznego o początkowych wartościach szczytowych 0,25-6,25 kV/cm. Czas wykładniczego zaniku mieści się w zakresie 10-12 ms.

Do omówionych prób elektroporacji można przykładowo stosować przyrząd elektroporacyjny firmy Bio Rad (Gene pulser Apparatus, Nr 165-2075, Bio Rad, 1414 Harbour Way South, Richmond, CA 94804, St. Zjedn. Am.).

Oczywiście również inne odpowiednie przyrządy można stosować w sposobie według wynalazku.

Po dalszej 10-minutowej inkubacji w temperaturze 4°C zawiesinę komórkową rozcieńcza się za pomocą 1,2 ml pożywki LB-Medium i w ciągu 2 godzin inkubuje w temperaturze 30°C na wytrząsarce obrotowej przy 250 obrotach/minutę.

Następnie odpowiednie rozcieńczenia nakłada się warstwą na LB-Agar [pożywka LB-Medium zestalona agarem, 15 g/litr], który dla selekcji nowo otrzymanego plazmidu zawiera jako dodatek odpowiedni antybiotyk. W przypadku pBC16 chodzi przy tym o tetracyklinę, którą do pożywki dodaje się w stężeniu 20 mg/litr.

Częstości transformacji, osiągnięte dla B. thuringiensis i pBCl6 w zależności od przyłożonego napięcia wyjściowego przy danej odległości płytek, są przedstawione na fig. 1.

Ekspresję włączonego DnA można stwierdzić za pomocą występującej oporności na tetracyklinę. Już po upływie 2 godzin od transformacji pBC16 w B. thuringiensis następuje całkowita fenotypowa ekspresja tej nowo wprowadzonej oporności na tetracyklinę (patrz tabela 2).

1.2. Transformację komórek B. thuringiensis przeprowadza się w dokładnie analogiczny sposób do przykładu 1.1. z wyjątkiem tego, że w tym przypadku objętość zawiesiny komórkowej, przewidzianej do elektroporacji wynosi 400 pl.

Dzięki temu środkowi postępowania można częstość transformacji podwyższyć 10-krotnie (o współczynnik 10).

Przykład II. Transformacja B. thuringiensis HD1cryB za pomocą szeregu różnych plazmidów

Większość prób przeprowadza się z plazmidem pBC16, naturalnie występującym plazmidem z B. cereus. Obok niego można jednak z powodzeniem włączyć też do komórki B. thuringiensis inne naturalnie występujące plazmidy, takie jak np. pUB 110 (2⁵/ Polack J. i Novik RP, 1982), pC194 Horinouchi S i Weisblum B, 1982) i pIM13 (26/ Mahler Ii Halvorson HO, 1980) (patrz tabela3).

Także warianty tych plazmidów, lepiej nadające się do prac z rekombinantowym DNA niż naturalne izolaty, można za pomocą sposobu według wynalazku transformować do szczepu B. thuringiensis HD1cryB, takie jak np. wektor klonowania B. subtilis pBD64 (2⁷/ Gryczan i współpracownicy, 1980) oraz plazmidy pBD347, pBD348 i pUB 1664) patrz tabela 3; plazmidy pBD347, pBD348 i pUB 1164 mogą być sprowadzane od dra W. Schurter’a, z firmy Ciba-Geigy AG, Bazylea).

Wyniki transformacji w tabeli 3 wyraźnie wskazują, że niezależnie od zastosowanego DNA plazmidowego w przypadku stosowania sposobu transformacji według wynalazku osiąga się częstości transformacji, które - z jednym wyjątkiem - mieszczą się wszystkie w zakresie 10⁵-107.

Przykład III. Konstrukcja shuttle-wektora dla Bacillus thuringiensis

Istniejące dwufunkcyjne wektory dla E. coli i B. subtilis, takie jak np. pHV 33 (41 Primrose SB i Ehrlich SD, Plasmid, 6: 193- 201, 1981), są dla B. thuringiensis HD1cryB nieodpowiednie (patrz tabela 3).

Dla skonstruowania mocnego wektora dwufunkcyjnego najpierw duży fragment EcoRI z pBC16 wplata się za pomocą T4 ligazy DNA w położenie-EcoRI plazmidu pUC8 (2®/ Vieira J i Messing J, 1982). Następnie komórki E. coli transformuje się z tym konstruktem. Konstrukcję, rozpoznaną jako prawidłowa za pomocą analizy restrukcyjnej, nazywa się pXI 62.

Następuje usunięcie dalej od polilinkerowego regionu pUC8 położonego miejsca cięcia EcoRI. Wskutek częściowego trawienia- EcoRI linearyzuje się pXI 62. Lepkie końce-EcoRI dopełnia się polimerazą-Klenowa i ponownie łączy ze sobą za pomocą t4 ligazy-DNA. Po transformacji do E. coli wybiera się konstrukcję, uznaną za pomocą analizy restrykcyjnej za

16138 prawidłową, i nazywająpXI61. Mapę dla pXI61 wraz z miejscami cięć przez enzymy restrykcyjne, które pXI61 przecinają tylko raz, przedstawiono na fig. 6.

Konstrukcję tę można za pomocą metody transformacji, opisanej w przykładzie I, transformować bezpośrednio do B. thuringiensis HDlcryB.

Ze względu na silne bariery restrykcyjne w szczepach B. thuringiensis częstości transformacji w tym przypadku stosowania DNA z pXI61, pochodzącego z E. coli, są niższe niż w przypadku stosowania plazmidowego DNA, pochodzącego z B. thuringiensis HDl cryB (patrz tabela 3). Mimo to pXI61 okazał się bardzo odpowiedni dla przeprowadzania eksperymentów klonowania w B. thuringiensis.

Przykład IV. Włączanie genu Kurhdl delta-endotoksyny do szczepów B. thuringiensis i B. cereus.

Te w ramach wynalazku do włączania i ekspresji w B. thuringiensis lub B. cereus stosowane sekwencje DNA, które kodują proteinę kurhdl delta-endotoksyny, pochodzą z plazmidu pK36, który z datą 4 marca 1986r. został w uznanym za międzynarodową kolekcję zbiorze mikroorganizmów Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (RFN) zgodnie z postanowieniami Umowy Budapesztańskiej o międzynarodowym uznawaniu deponowania mikroorganizmów dla celów patentowania zdeponowany pod numerem kolekcji DSM 3668.

Szczegółowe omówienie sposobu identyfikacji i wyodrębnienia genów 5-endotoksyny oraz konstrukcji plazmidu pK36 jest zawarte w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 0238441 i w postaci odsyłacza jest częścią składową wynalazku.

DNA plazmidu pK36 całkowicie trawi się enzymami restrykcyjnymi Pstl i BamHI, a fragment obejmujący 4,3 Kb, zawierający gen Kurhdl delta-endotoksyny (porównaj wzór 1), wyodrębnia się z żelu agarozowego. Fragment ten następnie zaplata się w pXI61, który uprzednio trawiono za pomocą Pstł i BamHI i traktowano alkaliczną fosfatazą z żołądka cielęcego. Po transformacji E. coli HB101 wyodrębnia się konstrukcję, rozpoznaną za pomocą analizy restrykcyjnej jako prawidłowa i otrzymującą nazwę pXI93. Mapa restrykcyjna pXI93 jest przedstawiona na fig. 7.

Konstrukcję pXI93 można do B. thuringiensis HDlcryB wprowadzić na 2 różnych drogach.

a) Komórki B. thuringiensis transformuje się bezpośrednio z izolatem pXI93 z E. coli za pomocą sposobu transformacji według wynalazku, omówionej w przykładzie I.

b) pXI93 najpierw transformuje się do komórek B. subtilis, tak jak to opisali Chang i Cohen, 1979. Z transformanta, który zawiera kompletny i nienaruszony DNA plazmidu pXI93, wyodrębnia się ten DNA i następnie transformuje do B. thuringiensis HDlcryB za pomocą metody elektroporacji, opisanej w przykładzie I.

Stosowanie obu sposobów prowadzi do transformantów, zawierających nienaruszony plazmid pXI93, co można wykazać za pomocą analizy restrykcyjnej.

Przykład V. Wykazanie ekspresji genu delta-endotoksyny w B. thuringiensis

Zarodnikujące kultury B. thuringiensis HD1 cryB, HD1cryB (pXI61) i HD1cryB (pXI93) porównuje się ze sobą w mikroskopie fazowo- kontrastowym przy 400-krotnym powiększeniu. Tylko w szczepie zawierającym pXI93 można wykryć obecność typowych, tworzących podwójną piramidę kryształów proteiny. Ekstrakty z tych samych kultur rozdziela się elektroforetycznie na żelu SDS- poliakryloamid.

Tylko dla szczepu zawierającego plazmid pXI93 można było na żelu wykryć pasmo proteiny o masie cząsteczkowej 130000 daltonów, odpowiadające produktowi genowemu Kurhdl (fig. 8a).

W analizie Western blot (fig. 8b) ta proteina o masie cząsteczkowej 130000 daltonów i jej produkty rozpadu reaguje specyficznie z poliklonalnymi przeciwciałami, które uprzednio, zgodnie ze sposobem podanym przez Huber- Lusac’a H, 1982, wytwarza się przeciwko krystalicznej proteinie z B. thuringiensis var. Kurstaki HD1. Szczegółowe omówienie tego sposobu znajduje się w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 238 441, które w postaci odsyłacza jest częścią składową wynalazku. Na plazmidzie pXI93 pod prąd regionu kodującego toksynę znajduje się odcinek DNA obejmujący 156 Bp, który zawiera zależny od sporulacji,

164 138 tandemowy promotor (²⁹/ Wong HC i współpracownicy, 1983). Sekwencja ta jest wystarczająca dla wysokiej ekspresji genu delta-toksyny w B. thuringiensis HD1 cryB i w B. cereus 569K.

Przykład Vl. Wykazanie toksyczności zrekombinowanej B. thuringiensis HD1 cryB (pXI93)

B. thuringiensis HD1 cryB i HD1 cyyB (pXI93) hoduje się w tempeaature 25°C w pożywce sporulacyjnej (GYS-Medium). Po całkowitej sporulacji, którą sprawdza się w mikroskopie fazowokontrastowym zbiera się drogą odwirowania zarodniki i (o ile są obecne) kryształy protoksyny oraz suszy rozpyłowo. Otrzymany w wyniku proszek domieszkowuje się w różnych stężeniach do diety larw Heliothis virescens (tobacco budworm - motyl, szkodnik tytoniu, bawełny, strączkowatych i innych roślin w Ameryce). Śmiertelność larw określa się po upływie 6 dni.

Zgodnie z oczekiwaniem szczep HD1 cryB nie zawierający genu protoksyny nie jest toksyczny dla Heliothis virecens, natomiast szczep stransformowany plazmidem pXl 93 powoduje zależną od dawki śmiertelność H. virescens (tabela 4). Świadczy to, że rekombinantowe szczepy, wytworzone na drodze postępowania elektroporacyjnego, mogą faktycznie być stosowane jako bioinsektycydy.

Przykład VII. Elektroporacja różnych szczepów B. thuringiensis i B. spec.

Proces transformacji, opisany w przykładzie I dla B. thuringiensis HD1 cryB, można stosować też do innych szczepów.

Wszystkie testowane szczepy B. thumgiensis var. kurstaki można tą metodą bardzo łatwo i wydajnie 5).

Ze szczepem laboratoryjnym B. cereus również można osiągnąć znakomite częstości transformacji. To samo obowiązuje także dla dalszych testowanych odmian B. thuringiensis (var. israelensis, var. thuringiensis). B. subtilis natomiast można drogą postępowania elektroporacyjnego transformować tylko z dużymi brakami.

W przypadku stosowania zależnej od protoplastów metody-PEG można było natomiast z B. subtitlis osiągnąć wydajność transformacji 4'10⁶Zgg DNA plazmidowego.

Niskie wydajności transformacji B. substilis w przypadku stosowania techniki elektroporacyjnej nie są związane z błędnie dobranymi parametrami, takimi jak np. nieodpowiednie napięcie, czy z dużym udziałem śmiertelności, powodowanej przez impulsy elektryczne, co potwierdza fig. 9.

Przykład VIII. Transformacja B. thuringiensis HD1 cryP za pomocą genu β-galaktozydazy

VIII. 1. Wbudowanie miejsca cięcia restrukcyjnego-BamHI bezpośrednio przed pierwszym kodonem-AUG genu protoksyny B. thuringiensis

Zanim gen P-galaktozydazy z plazmidu piWiTh5 (otrzymanego przez dra M. Geiser’a, z firmy Ciba-Geigy AG, Bazylea, Szwajcaria) będzie można połączyć z promotorem genu Kurhdl δ-endotoksyny z B. thuringiensis, należy najpierw zmodyfikować znajdującą się w otoczeniu tego starterowego kodonu- AUG sekwencję DNA genu protoksyny.

Modyfikację tę przeprowadza się za pomocą wspieranej oligonukleotydem mutagenezy, stosując jednoniciowy fag M13mp8, który zawiera obejmujący 1,8 kB fragment HincII-HindHI z genu δ-endotoksyny, wykazującego region-5’ tego genu toksyny.

Najpierw 3 gg plazmidu pK36 (porównaj przykład IV) trawi się enzymami restrykcyjnymi HindIII i HincII. Wynikowy fragment oczyszcza się drogą agarozowej elektroforezy żelowej, po czym wyodrębnia z żelu.

Równolegle z tym 100 ng DNA faga M13mp8 RF (Biolab, Tozer Road, Beverly MA, 01915, St. Zjedn. Am. lub każdy dowolny inny producent) trawi się enzymami restrykcyjnymi SmaI i HindIII, traktuje fenolem i dodając etanol strąca się osad. Tak traktowany dNa fagowy miesza się następnie z 200 ng poprzednio wyodrębnionego fragmentu protoksyny i dodając T4 ligazę-DNA z nim łączy.

Po transfekcji E. coli JM 103 odczytuje się 6 białych płytek i analizuje za pomocą mapowania restrykcyjnego.

164 138

Izolat, w przypadku którego połączenie między genem β- galaktozydazy a promotorem genu Kurhdl δ-endotoksyny z B. thuringiensis zaszło prawidłowo, wyselekcjonowuje się, nadając mu nazwę M13mp8/Hinc-Hind.

Za pomocą aparatu syntezy DNA (Applied Biosystem DNA Synthesizer) syntetyzuje się oligonukleotyd, który wykazuje następującą sekwencję:

(5’) GTTCGGATTGGGATCCATAAG (3’).

Ten syntetyczny oligonukleotyd jest komplementarny z regionem na DNA M 13mp8/HincHind, który sięga od pozycji 153 do pozycji 173 genu Kurhdl δ-endotoksyny (porównaj wzór 1). Odtworzona wyżej sekwencja oligonukleotydu wykazuje jednak w pozycji 162 i 163 niedopasowanie w porównaniu z sekwencją odtworzoną we wzorze 1, wskutek czego dochodzi do utworzenia miejsca cięcia restrykcyjnego BamHI. Ogólna droga postępowania w przypadku mutagenezy jest opisana przez JM Zoller’a i M Smith’a (⁴³⁷ JM Zoller i M Smith; 19). Około 5 μ g jednoniciowego DNA faga M13mp18 /Hinc-Hind miesza się z 0,3 pg fosforylowanych oligonukleotydów w łącznej objętości 40 pl. Mieszaninę tę ogrzewa się do temperatury 65°C, po czym najpierw chłodzi się do temperatury 50°C, a następnie stopniowo schładza się do temperatury 4°C.

Następnie dodaje się bufor, nukleotydotrifosforany, ATP, T4 Ugazę-DNA i duży fragment polimerazy DNA i inkubuje w ciągu nocy, tak jak to opisali 4 JM Zoller i M Smith. Po agarozowej elektroforezie żelowej oczyszcza się kolisty dwuniciowy DNA i za pomocą transfekcjikacji włącza do szczepu E. coli JM 103. Alternatywnie można też stosować szczep E. coli JM 107.

Wynikowe płytki bada się na obecność sekwencji, które hybrydyzują z P-znaczonym oligonukleotydem; fagi bada się za pomocą analizy DNA endonukleazami restrykcyjnymi.

Faga, który zawiera prawidłową konstrukcję, w której miejsce cięcia BamHI znajduje się bezpośrednio przed pierwszym kodonem- AUG genu protoksyny, nazywa się skrótem M13mp8(Hinc-Hind)Bam.

VIII.2. Połączenie genu β-galaktozydazy z promotorem δ-endotoksyny

Vm.2.1: Promotor δ-endotoksyny znajduje się na obejmującym 162 Bp fragmencie-EcoRI/BamHI z DNA faga M13mp8(Hinc- Hind)Bam. DNA RF-fagowy trawi się enzymem restrykcyjnym BamHI. Powstające wskutek tego nawisy na końcach-5’ usuwa się na drodze traktowania Mung-Bean-nukleozą (Biolabs) zgodnie z danymi producenta. Następnie ten DNA trawi się endonukleazą restrykcyjną EcoRI, a obejmujący 162 Bp fragment po przeprowadzeniu agarozowej elektroforezy żelowej wyodrębnia się z żelu agarozowego.

Gen β-galaktozydazy wyodrębnia się z plazmidu piWiTh5. DNA z piWiTh5 przecina się w jedynym miejscu cięcia HindIII. Wolno zostawione końce-3’ dopełnia się za pomocą fragmentu Klenowa polimerazy DNA (porównaj 33/ Maniatis i współpracownicy, 1983, strony 113-114), a zmodyfikowany DNA trawi się następnie enzymem restrykcyjnym SalI. Ten fragment DNA, który zawiera gen β-galaktozydazy, wyodrębnia się za pomocą agarozowej elektroforezy żelowej.

Wektor pXI61 (porównaj przykład ΠΙ) trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i SalI, a oba uprzednio wyodrębnione fragmenty wplata się w wektor pXI61.

Po transformacji tej mieszanki złączeniowej do szczepu E. coli HB101 lub JM 107, prawidłowo połączone klony komórkowe selekcjonuje się za pomocą analizy restrykcyjnej i za pomocą ich β-galaktozydazo-aktywności wobec chromogennego substratu X-gal (5-bromo-4chloro-3-indolilo^-D-galaktozyd). Klon, zawierający prawidłową konstrukcję genetyczną, nazywa się pXI80.

VIII. 2.2: Obemtująey 162 Bp faagment-EcoRI/BamHI, zawiraający roomotr r δ-endotoksyny, w alternatywnej postaci wykonania wyodrębnia się drogą cięcia faga M13mp8(hinc-Hind)Bam enzymami EcoRI i BamHI i następnego elektΓcforetycznegc rozdzielania żelowego.

Gen β-galzknozydzzy wyodrębnia się również w tym przypadku z plazmidu piWiTh5 (porównaj przykład VIII.1.). DNA plazmidowy trawi się przy tym enzymami restrykcyjnymi BamHI i Bglll i duży fragment po elektroforezie żelowej eluuje się z żelu zgarozowegc.

16138

Wektor pHY300 PLK (Nr PHY-001; Toyobo Co., Ltd., 2-8 Dojima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka, 530 Japonia), który jest dostępny w handlu (porównaj przykład IX. 1.), trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i BgllI. Oba poprzednio wyodrębnione fragmenty wplata się wówczas w wektor pHY300 PLK.

Całą tę mieszankę złączeniową transformuje się następnie do szczepu E. coli JM 107 [Bethesa Research Laboratories (BRL), 41 IN, Stonestreet Avenue, Rockville, MD 20850, St. Zjedn. Am.]. Klon, wykazujący aktywność wobec β-galaktozydazy, analizuje się dalej za pomocą trawień restrykcyjnych. Klon, zawierający prawidłową konstrukcję genetyczną, nazywa się pXI101.

VIH.3. Transformacja plazmidu pXI80 lub pXI101 w B. subtilis i B. thuringiensis

DNA plazmidów pXI80 lub 0X1101 zgodnie ze znanym, przez Chang’a i Cohen’a napisanym sprawozdaniem z prób (^n/ Chang i Cohen, 1979) transformuje się do protoplastów B. subtilis.

Prawidłowy klon selekcjonuje się, poddawany transformacji DNA izoluje się za pomocą standardowych sposobów i drogą elektroporacji (porównaj przykład I) transformuje do komórek B. thuringiensis HD1 cryB.

Stransformowane komórki B. thuringiensis nakłada się warstwą na agar GYS-Agar (pożywka sporulacyjna), zawierający X-gal jako dodatek.

Prawidłowo stransformowane klony przy rozpoczęciu sporulacji barwią się na niebiesko.

Szczep B. thuringiensis HD1 cryB, który transformuje się z wektorem pXI61, pozostaje natomiast biały w tych samych warunkach.

Analiza restrykcyjna wykazuje, że w przypadku prawidłowo stransformowanych klonów występuje w komórkach B. thuringiensis nienaruszony plazmid pXI80 lub pXI101.

VIII. 4. Gen β-galaktozydazy pod kontrolą promotora zależnego od sporulacji

Komórki B. thuringiensis HD1 cryB, zawierające plazmid pXI80 lub pXI101, hoduje się, tak jak opisano poprzednio, na pożywce GYS- Medium. W różnych momentach podczas fazy wzrostowej (zarówno podczas fazy wzrostu wegetatywnego jak i podczas fazy sporulacji) przeprowadza się oznaczenie β-galaktozydazy według podanego przez 4 JH Miller^ sprawozdania z prób (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, Experiment 48 i 49).

Jedyne różnice względem wyżej wspomnianego sprawozdania z prób odnoszą się do stosowania X-gal jako substratu chromogennego i do mierzenia barwnego produktu hydrolizy, który komórki tworzą po upływie około 1 godziny.

Komórki te następnie usuwa się za pomocą odwirowania, a absorbancję supematanta (OD650) określa się przy długości fali 650 nm.

Okazuje się, że wzrost absorbancji następuje w zależności od sporulacji..Nie stransformowane komórki B. thuringiensis natomiast nie mogą hydrolizować chromogennego substratu X-gal.

Przykład IX. Założenie banku genów w Bacillus thuringiensis

IX. 1. Konsirnkcja pXI200

Plazmid pXI200jest pochodną plazmidu pHY300 PLK, który może handlowo sprowadzać z firmy Toyobo Co., Ltd. (Nr PHY-001 ; Toyobo Co., Ltd., 2-8 Dojima Hama 2-Chome, Kita-ku, Osaka, 530 Japonia). Plazmid pHY300 PLK, którego konstrukcja jest opisana w europejskim zgłoszeniu patentowym EP nr 162 725, zawiera gen zarówno ampicylino (amp^R)- jak i tetracyklino (tetr^-oporności.

Plazmid pXY300 PLK całkowicie trawi się za pomocą BglI i Pvul. Wynikowe fragmenty restrykcyjne rozdziela się następnie za pomocą agarozowej elektroforezy żelowej. Fragment obejmujący 4,4 Kb izoluje się z żelu agarozowego, oczyszcza i następnie ponownie łączy za pomocą T4 ligazy-DNA.

Tę całą szarżę złączeniową transformuje się do E. coli HB101. Po inkubacji stransformowanych komórek E. coli HB101 w temperaturze 37°C ma selektywnym agarze L-Agar, zawierającym 20 gg/ml tetracykliny, selekcjonuje się transformanty (TcO oporne na tetracyklinę. Z wrażliwego na ampicylinę klonu (Ap^s) [100 μg/ml ampicyliny] można wówczas izolować

138 plazmid, który miejsce cięcia PstI w genie-Apr utracił wraz z obejmującym 0,3 Kb fragmentemPvuI/BglI. Plazmid ten otrzymuje nazwę pXI200.

IX.2. Klonowanie genów protoksyny z Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 w Bacillus thuringiensis HD1 cryP.

Cały DNA (50 μg) z Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 trawi się całkowicie drogą inkubacji z enzymami restrykcyjnymi Pstl i Hpal. Tak uzyskane fragmenty restrykcyjne przenosi się na ciągły gradient sacharozy [5-23% wagowo/objętościowych] i tu za pomocą pełnogradientowego wirowania rozdziela się odpowiednio do ich wielkości i zbiera frakcjami po 500 μ l. Wirowanie to przeprowadza się w urządzeniu o nazwie TST 41-Rotor (kontronowy wirnik wahliwy) wobec przyspieszenia co najwyżej 2,4 x 10⁵g w ciągu 16 godzin w temperaturze 15°C. Następnie przenosi się po 50 μl podwielokrotnych części na żel agarowy [0,8% wagowo/objętościowych agarozy w Tris Acetat EDTA lub Tris Borat EDTA; patrz ³³⁷ Maniatis i współpracownicy, 1982] w celu określenia wielkości fragmentu. Te frakcje, które zawierają fragmenty o 3-6 Kb, jednoczy się i po strąceniu etanolem zatęża do 10 μΐ.

μg Shuttle wektora pXI200, opisanego w przykładzie IX. 1.,całkowicie trawi się enzymami restrykcyjnymi Pstl i Smal. Grupy 5’-fosforanowe wynikowych fragmentów restrykcyjnych usuwa się następnie na drodze traktowania alkaliczną fostatazą z jelit cielęcych.

0,2-0,3 pg uprzednio wyodrębnionego HD1 DNA miesza się następnie z 0,5 μg DNA wektora pXI200 i dodając 0,1 U (tzw. jednostki Weiss’a; jednostka T4bgazy-DNA odpowiada aktywności enzymatycznej, która wystarcza na przekształcenie 1 nM [³²P] z pirofosforanu w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut w materiał absorbowalny w substancji Norit) T4 ligazyDNA inkubuje w ciągu nocy w temperaturze 14°C. Tę całą szarżę złączeniową następnie drogą elektroporacji (porównaj przykład I) transformuje się bezpośrednio do komórek Bacillus thuringiensis HD1 cryB. Te elektroporowane komórki B. thuringiensis następnie układa się warstwą na selektywny agar sporulacyjny, zawierający 20 pg/ml tetracykliny jako środka selekcyjnego i inkubuje w temperaturze 30°C aż do całkowitej sporulacji.

IX.3. Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko proteinie protoksyny B. thuringiensis

Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko δ- endotoksynie z Bacillus thuringiensis var. kurstaki HD1 przeprowadza się analogicznie do opisu podanego przez 36/ HuberLukac’a, (1984) lub przez ³⁷⁷ Huber-Lukac ’a i współpracowników, (1986).

W przypadku komórek hybridoma, stosowanych do wytwarzania przeciwciał, chodzi o produkty fuzji z komórek szpiczaka Sp2(0- Ag) opisanych przez ^⁷ Shulman’a i współpracowników, 1978; można sprowadzić z American Type Culture Collection W Rockville, Maryland, St. Zjedn. Am. (i limfocytów śledziony myszy BALB)c, które uprzednio immunizowano δ-endotoksyną z B. thuringiensis.

W ten sposób można otrzymać przeciwciała monoklonalne, które będą specyficznie skierowane przeciwko δ-endotoksynie z B. thuringiensis. Szczególnie korzystnymi są przeciwciała monoklonalne, które albo specyficznie wiążą się przy epitopie w N-terminalnej połówce proteiny protoksyny (np. przeciwciało 54.1 z publikacji Huber-Lukac’a i współpracowników, 1986) albo też rozpoznają epitop w C-terminalnej połówce, będącej stałą częścią proteiny u protoksyn aktywnych względem Lepidoptera (np. przeciwciało 83.16 z publikacji HuberLukac’a i współpracowników, 1986).

Można jednak też stosować całkiem inne monoklonalne lub nawet poliklonalne przeciwciała do kolejno następującego screeningu immunologicznego (porównaj przykład IX.4.).

IX.4. Screening immunologiczny

Do screeningu immunologicznego stosuje się wytworzone według przykładu IX.3. lub inne odpowiednie przeciwciała monoklonalne.

Najpierw krystaliczne proteiny, występujące wolno po sporulacji komórek B. thuringiensis, wiąże się za pomocą membran transferowych (np. Pall Biodyne Transfer-Membran; PallUltrafine Filtration Corporation, Glen Cove, N.Y.),wykładając je na te płytki w ciągu 5 minut. Filtry te następnie w ciągu 5 minut przemywa się buforem TBST [0,05% wagowo/objętościowych Tween’u 20, 10mM Tris/HCl (pH=8,0), 150 mM NaCl w wodzie redestylowanej], poczym

164 138 w ciągu 15-30 minut inkubuje się w mieszaninie z buforu TB ST i 1% wagowo/objętościowego mleka odtłuszczonego w celu zablokowania wiązań niespecyficznych.

Tak przygotowane filtry inkubuje się wówczas w ciągu nocy z przeciwciałami lkecyficrnymi wobec protoksyny [mieszanina kezeciwcikł 54.1 i 83.16 według publikacji 3 7 HuberLukac’a i współpracowników, (1986)]. Nie związane przeciwciała usuwa się drogą trzykrotnego krremyoknik filtra buforem TBST w ciągu każdorazowo 5-10 minut. W celu wykrycia protoksyny związanej przez przeciwciała inkubuje się filtry z dalszymi przeciwciałami. Jako wtórne krreciocikło funkcjonuje przy tym znaczone alkaliczną fosfatazą przeciwciało antymysie, które przykładowo można nabywać w firmie Bio-Rad [Katalogowy nr 170-6520, koniugat kozich antymysich immunoglobulin JgG (H+L) z alkaliczną fosfatazą]. Po 30ł4inutooy4 trwaniu inkubacji nie związane przeciwciała wtórne, takie jak poprzednio omówione, usuwa się drogą trzykrotnego przemywania (każdorazowo w ciągu 5-10 minut) filtrów buforem TBST. Następnie filtry te inkubuje się z mieszaniną substratu, składającą się z NBT [p-nitro blue tetrazohum chloride; chlorek tetrazoliowy nitro-błękitu] i z BCIP [p-toluidynowa sól 5łbeo4Oł 4-chloeOł3ł indolilofosforanu]. Reakcję enzymatyczną przeprowadza się według danych producenta [firma Bio-Rad; 1414 Harbour Way South, Richmond CA, 94804m St. Zjedn. Am.]

Pozytywne, tzn. protoksynę zawierające, klony można bardzo łatwo rozpoznawać za pomocą ich fioletowego zabarwienia. Dochodzi ono do skutku dzięki enzymatycznej reakcji fosfatazy alkalicznej z poprzednio wspomnianą mieszaniną substratów. Z opisanej w przykładzie IX.2. transformacji za pomocą tamże omówionej szarży złączeniowej otrzymuje się w wyniku 800-1000 transformantów. Spośród nich 2 kolonie wykazują wyraźnie pozytywne sygnały we wspomnianej poprzednio reakcji enzymatycznej.

Z pozytywnych klonów, u których za pomocą omówionej reakcji enzymatycznej można wykazać ekspresję genu protoksyny, izoluje się DNA plazmidowy. Za pomocą analizy restrykcyjnej i drogą porównania ze znanymi mapami restrykcyjnymi można sklonowane geny protoksyny dalej scharakteryzować i wreszcie zidentyfikować.

Oba klony zawierają zrekomninowany plazmid z wstawką 4,3 Kb. Kolejno następujące trawienia za pomocą HindIII, PvuII, EcoRI i Xbal pozwalają na zidentyfikowanie tego genu na tej wstawce dzięki porównaniu ze znanymi mapami restrykcyjnymi genów endotoksyny z B. thuringiensis var. kurstaki HD1. W obu przypadkach chodzi o gen kurhdl, który jest też znany jako 5,3 Kb gen protoksyny i jest opisany przez⁵¹ Geiser^ i współpracowników, 1986.

Ten bezpośrednio w B. thuringiensis sklonowany i za pomocą immunologicznego screeningu zidentyfikowany gen hybrydyzuje się nadto z obejmującym 1847 Bp fragmentem-BamHI/HindIII tego 5.3 Kb genu w plazmidzie pK36 (^5/ Geiser i współpracownicy, 1986). W SDS/PAGE oba klony wykazują typowe dla protoksyny pasmo 130000 daltonów, a w Western Blot ( ^w Towbin i współpracownicy, 1979) specyficznie reagują z poprzednio omówionymi (patrz przykład IX.4.) kereciwcikłkmi monoklonalnymi.

1(64 138

Niżej przedstawiono tabele 1-5 wspomniane już w tekście opisu.

Tabela 1

Wpływ czasu inkubagi w temperaturze 4°C przed i po elektroporagi na częstość transformacji. B. thuneaieesis HD1 cryB strαnsfcrmcwαec metodą elektrcpcracji za pomocą 0,2 pg pBC16 na szarzę

Próbka	1	2	3	4	5	6	7	8
Inkubacja wstępna* (minuty)	0	5	10	20	20	20	20	20
Inkubacja następcza** (minuty)	20	20	20	20	0	5	10	20
Częstość transformacji (tuaesfcrmzetów/μg DNA plazmidowego)	2.6x106	2.^106	6.6x106	2.3x106	2.5x106	1.9x106	3.3x106	1.7x106

Legenda tabeli 1:

♦Inkubacja w temperaturze 4°C między dodaniem DNA a elektrcpcrzcją.

** Inkubacja w temperaturze 4°C między blektropcracją a początkiem okresu ekspresji.

Tabela 2

Ekspresja tetracckheccpcmcści pBC16,. po transfomiagi w B. ώων^ιβικιβ HDlciyB. B. 0111171^^515 HD1 cryB stuaesfcrmcwanc plazmidowym DNA z zastosowaniem postępowania elektucpcrzcyjneac według wynalazku. Po różnym trwaniu inkubacji w pożywce LB-Medium w temperaturze 30°C selekcjonuje się straesfcumcwanb komórki, nakładając warstwę na agar LB-Agar, zawierający 20 pg/ml tetracykliny.

Czas ekspresji tbtΓαcykliecoporności (godziny)	Częstość transformacji (tuansfcrmznty/μg DNA)	Liczba żywych komórek
0,5	0	4x108
1	1.6x106	109
2	8.8xl06	1.4x109
3	8x106	1.6x109

164 138

Tabe la 3

Transformacja szczepu B. thuringiensis HD1 cryB z różnymi plazmidami

Plazmid	Pochodzenie Referencje	MarkeT oporności	Częstość2 transformacji
Gram-ujemny	Gram-dodatni
naturalnie występujące plazmidy
pBC16	B. cereus	-	Tc	1.9x106
pUB110	Staphylncnccus aureus	-	Km, Ble	3.3x106*
pC194	S. aureus	-	Cm	6x106*
pIM13	B. subtilis	-	Em	1.8x105
MODYFIKOWANE PLAZMIDY / wektory klonowania
pBD64	pUB 110 replikon	-	Km, Cm	0x106
pBD347	pIM13 replikon	-	Cm	2.9x104
pBD348	pIM13 replikon	-	Em,Cm	1.1xK)[
pUB1664	pUB 110 replikon	-	Cm, Em	3.0x10‘
	shuttle - wektory
pHV33	pBR322/pC194,	Amp, Tc	Cm	<00*
pK61	pUC8/pBC16,	Amp	Tc	2.8x104

Legenda tabeli 3:

¹ Tc: tetracyklina; Km: kanamycyna; Ble:bleomycyna; Cm:chlnramfeniknl; Emrerytromycyna.

² Cały DNA plazmidowy pochodzi z B. thuringiensis HD1 cryB z wyjątkiem * izolowanego z B. subtilis LBG4468.

Tabela 4

Test biologiczny z B. thuringiensis HD1 cryB i HD1 cryB (pXI93) przeciwko Heliothis virescens. Suszone rozpyłową sporulowane kultury [zarodniki i (jeśli są obecne) kryształy protoksyny] domieszkowano w podanych ilościach do diety larw L-1 Helmthis virescens.

Stężenie zarodników i kryształów protoksyny ^g/g diety)	Śmiertelność (%) larw H.virescens spowodowana przez:
HD1 cryB	HDl cryB (pXI93)
200	0	07
100	0	43
00	3	27
20	0	10
12.5	0	0

164 138

Tabela 5

Transformowalność szczepów B. thuringiensis, B. cereus i B. subtilis. Wszystkie szczepy transformowano z plazmidem pBC16 metodą elektroporacji omówioną w przykładzie I.

Szczep	Częstość transformacji
B. thuringiensis var. kurstaki
HD1cry^B	1
HD1 dipel	0.25
HD1-9	0.9
HD 73	0.1
HD 191	0.5
B. thuringiensis var. thunngiensis
HD 2-D6-4	13.8
B. thuringiensis var. israelensis
LBG B-4444	2.6
B.cereus
569 K	7.5
B. subtilis
LBG B-4468	0.0002

Legenda tabeli 5:

wartości względne, odniesione do zdefiniowanej jako 1 częstości transformacji, którą osiąga się za pomocą

B.thunngiensis var. kurstaki HD1 cryB.

Niżej omówiono zdeponowanie mikroorganizmów.

Z każdego z niżej zestawionych mikroorganizmów, stosowanych według wynalazku, zdeponowano kulturę w uznanym za Międzynarodową Kolekcję zbiorze mikroorganizmów Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, w Brunświku w Republice Federalnej Niemiec zgodnie z wymaganiami Umowy Budapesztańskiej o międzynarodowym uznawaniu deponowania mikroorganizmów w celu patentowania. Zaświadczenie o żywotności zdeponowanych próbek zostało sporządzone przez wspomnianą Międzynarodową Kolekcję.

Tabela 6

Zdeponowane mikroorganizmy

Mikroorganizmy	Data zdeponowania:	Numer zdeponowania:	Data zaświadczenia o żywotności
HB 101 (pK36) (E. coli HB101 stransformowana z DNA plazmidu pK36)	4 marca 1986	DSM 3668	7 marca 1986
*HD1 cryB (Bacillus tCuringlbC£is var. kurstaki HD1 cryP)	4 maja 1988	DSM4574	4 maja 1988
*HD1 cryB (*pK61) B. tCuringibnsis HD1 αγβ stransformowana z DNA plazmidu *pK61)	4 maja 1988	DSM 4572	4 maja 1988
*HD1 cryP (*pK 93) B. tCuringibcsis HD1 cryP stransfkrmkwana z DNA plazmidu *pK93)	4 maja 1988	DSM 4571	4 maja 1988
569 K (Bacillus cereus 569 K)	4 maja 1988	DSM 4575	4 maja 1988
569 K (*pK 93) B. cereus 569 K stracsfkrmkwana z DNA plazmidu *pK93)	4 maja 1988	DSM 4573	4 maja 1988

Wewnętrzne oznakowanie pK, przyjęte dla nazw plazmidów w dowodzie pierwszeństwa, zostało w opisach przeznaczonych do patentowania zagranicą zastąpione przez oficjalcie uznawane oznakowanie pXI.

Również w nazwie asporogencbgo mutanta B. tCuringiensis HD1, stosowanego w ramach przykładów wykonania, zmieniono słowo cry β na cryB.

Niżej przedstawiono spis publikacji powoływanych w opisie wynalazku.

1. Goldberg L i Margalit J, Mosquito News, 37: 355-358,1977

2. Krieg A i inni, Z. Ang. EnL, 96: 500-508, 1983

3. Syhcepf, HE i Whiteley HR, Proc, Natl. Acad. Sci, USA, 78: 2893-2897,1981

4. Klier A i inni, The EMBO J, 1: 791-799, 1982

5. Geiser M i inni, Gene, 48: 109-118,1986

6. Haider MZ i inni, Gene, 52: 285-290,1987

7. Gonzales JM i inm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 6951-6955,1982

8. Obukowicz MG i inni, J. Bacteriol., 168: 982-989,1986

9. Donovan LP i inni, Mol. Gen. Genet., 214: 365-372, 1988

10. Sch^pf HE i Whitely HR, J. Biol. Chem., 260: 6273, 1985

11. Klier A i inni, Mol. Gen. Genet., 191: 257-262, 1983

12. Bibb JJ i mni, Nature, 274: 398-400, 1978

13. Chang S i Cohen SN, Molec. Gen. Genet., 168: 111-115,1979

14. Brown BJ i Carlton BC, J. Bacteriol., 142: 508-512, 1980

15. Kondo JK i McKay LL, Appl. Envirfn, Microbiol., 48: 252-259, 1984

16. Wirth R. i inm, J. bacteriol., 165: 831-836, 1986

17. YosCihama M i mni., J. Bacteriol., 162: 591-597, 1985

18. AH^a^an SJ i inm, J. Bacteriol., 146, 7-9, 1981

138

19. Martin PA i inni, J. Bacteriol., 145: 980-983, 1981

20. Fischer HM, Arch. Microbiol., 139: 213-217, 1984

21. Schall D, Genubertragung zwischen Isolaten von Bacillus thuringiensis durch Protoplastentransformation und -fusion. Dissertation, Universitat Tubingen, 1986

22. Shivarova N, Zeitschr. Allgem. Mikrobiol., 23: 595-599, 1983

23. Youston AA i Rogoff MH, J. Bacteriol., 100: 1969

24. Horinouchi S i Weisblum B, J. Bacteriol., 150: 815-825,1982

25. Polak J i Novick RP Plasmid, 7: 152-162,1982

26. Mahler J i Halvorson HO, J. Gen. Microbiol., 120: 259-263, 1980

27. Gryczan T i inni, J. Bacteriol., 141: 246-253, 1980

28. Vieira J i Messing J, Gene, 19: 259-268, 1982

29. Wong i inni, J. Biol. Chem. 258: 1960-1967, 1983

30. Bolivar i inni, Gene 2: 95-113, 1977

31. Norranderi inni, Gene, 26: 101-104, 1983

32. Bevan i inni, Nature, 304: 184-187,1983

33. Maniatis i inni, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, USA, 1982

34. Hinnen i inni, Proc. Natl. Acad. Sei, USA, 75: 1929-1933, 1978

35. Young RA i inni, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80: 1194-1198, 1983

36. Huber-Lucac M, Zur Interaktion des debad-nndotonis vvo Bacillus thurinniensis mit monoklonalen Antikorpern und Lipiden , Nr. 7547,

ETH Zurich, 1984

37. Huber-Lucac M i inni, Infect. Immunol., 54: 228-232, 1986

38. McCutcheon’s, 1986 Internctloncl McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents,

The Mcnrfcctrring Confections Publishing Co., Glen Rock, NJ, USA

39. Stahly DP i inni, Biochem. Biophys. Res. Comm, 84: 581-588, 1978

40. Bernhard K i inni, J. Bacteriol., 133: 897-903, 9978

41. Primrose SB, Ehrlich SD, Plasmid 6: 193-20L 93-81

42. Huber-Lukac H, DissertctSon, niegcnossischc Technische Hochschule, Zurych, Szwajcaria, No. 7050, 1982

43. Zoller JM i Smith M, Nuci. Acids Res., 10: 6487, 1982

44. Miller JH, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972

45. Shulman i inni, Nature, 276: 269, 1978

46. Towbin H i inni, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 4350-4354, 1979;

oraz literatura patentowa:

EP 162,725

EP 238,441

WO 86/01536

US-P 4,448,885

US-P 4,447,036

US-P 4,237,224

US-P 4,468,464.

164 138

1(64138

Transformanty

Fiigi 5

1(64138

Fig. Β

MG

200*000

116'250

97*500

66*200

Λ2*690

Μ

w»*

Fig.8b

-Fit

3 4 5 6

164 138

164 138

10 GTTAACACCC	20 TGGGTCAAAA	30 ATTGATATTT	40 AGTAAAATTA	50 GTTGCACTTT	60 GTGCATTTTT
70 TCATAAGATG	80 AGTCATATGT	90 TTTAAATTGT	100 AGTAATGAAA	110 AACAGTATTA	120 TATCATAATG
130 AATTGGTATC	140 TTAATAAAAG	150 AGATGGAGGT	160 AACTTATGGA	170 TAACAATCCG	180 AACATCAATG
190 AATGCATTCC	200 TTATAATTGT	210 TTAAGTAACC	220 CTGAAGTAGA	2 30 AGTATTAGGT	240 GGAGAAAGAA
2 50 TAGAAACIGG	260 TTACACCCCA	270 ATCGATATTT	280 CCTTGTCGCT	290 AACGCAATTT	300 CTTTTGAGTG
310 AATTTGTTCC	320 CGGTGCTGGA	330 TTTGTGTTAG	340 GACTAGTTGA	350 TATAATATGG	360 GGAATTTTTG
370 GTCCCTCTCA	380 ATGGGACGCA	390 TTTCTTGTAC	400 AAATTGAACA	410 GTTAATTAAC	420 CAAAGAATAG
4 30 AAGAATTCGC	440 TAGGAACCAA	4 50 GCCATTTCTA	460 GATTAGAAGG	470 ACTAAGCAAT	480 CTTTATCAAA
490 TTTACGCAGA	500 ATCTTTTAGA	510 GAGTGGGAAG	520 CAGATCCTAC	530 TAATCCAGCA	540 TTAAGAGAAG
550 AGATGCGTAT	560 TCAATTCAAT	570 GACATGAACA	580 GTGCCCTTAC	590 AACCGCTATT	600 CCTCTTTTTG
610 CAGTTCAAAA	620 TTATCAAGTT	6 30 CCTCTTTTAT	640 CAGTATATGT	650 TCAAGCTGCA	660 AATTTACATT
670 TATCAGTTTT	680 GAGAGATGTT	690 TCAGTGTTTG	700 GACAAAGGTG	710 GGGATTTGAT	720 GCCGCGACTA
7 30 TCAATAGTCG	740 TTATAATGAT	7 50 TTAACTAGGC	760 TTATTGGCAA	770 CTATACAGAT	780 CATGCTGTAC
790 GCTGGTACAA	800 TACGGGATTA	810 GAGCGTGTAT	820 GGGGACCGGA	830 TTCTAGAGAT	840 TGGATAAGAT
850 ATAATCAATT	860 TAGAAGAGAA	870 TTAACACTAA	880 CTGTATTAGA	890 TATCGTTTCT	900 CTATTTCCGA
910 ACTATGATAG	920 TAGAACGTAT	930 CCAATTCGAA	940 CAGTTTCCCA	950 ATTAACAAGA	960 GAAATTTATA
970 CAAACCCAGT	980 ATTAGAAAAT	990 TTTGATGGTA	1000 GTTTTCGAGG	1010 CTCGGCTCAG	1020 GGCATAGAAG
1030 GAAGTATTAG	1040 GAGTCCACAT	1050 TTGATGGATA	1060 TACTTAACAG	1070 TATAACCATC	1080 TATACGGATG

Wzór 1 ( częęść I )

164 138

1090	1100	1110	1120	1130	1140
CTCATAGAGG	AGAATATTAT	TGGTCAGGGC	ATCAAATAAT	GGCTTCTCCT	GTAGGGTTTT
1150	1160	1170	1180	1190	1200
CGGGGCCAGA	ATTCACTTTT	CCGCTATATG	GAACTATGGG	AAATGCAGCT	CCACAACAAC
1210	1220	12 30	1240	1250	1260
GTATTGTTGC	TCAACTAGGT	CAGGGCGTGT	ATAGAACATT	ATCGTCCACT	TTATATAGAA
1270	1280	1290	1300	1310	1320
GACCTTTTAA	TATAGGGATA	AATAATCAAC	AACTATCTGT	TCTTGACGGG	ACAGAATTTG
1330	1340	1350	1360	1370	1380
CTTATGGAAC	CTCCTCAAAT	TTGCCATCCG	CTGTATACAG	AAAAAGCGGA	ACGGTAGATT
1390	1400	1410	1420	1430	1440
CGCTGGATGA	AATACCGCCA	CAGAATAACA	ACGTGCCACC	TAGGCAAGGA	TTTAGTCATC
1450	1460	1470	1480	1490	1500
GATTAAGCCA	TGTTTCAATG	TTTCGTTCAG	GCTTTAGTAA	TAGTAGTGTA	AGTATAATAA
1510	1520	1530	1540	1550	1560
GAGCTCCTAT	GTTCTCTTGG	ATACATCGTA	GTGCTGAATT	TAATAATATA	ATTCCTTCAT
1570	1580	1590	1600	1610	1620
CACAAATTAC	ACAAATACCT	TTAACAAAAT	CTACTAATCT	TGGCTCTGGA	ACTTCTGTCG
1630	1640	1650	1660	1670	1680
TTAAAGGACC	AGGATTTACA	GGAGGAGATA	TTCTTCGAAG	AACTTCACCT	GGCCAGATTT
1690	1700	1710	1720	1730	1740
CAACCTTAAG	AGTAAATATT	ACTGCACCAT	TATCACAAAG	ATATCGGGTA	AGAATTCGCT
1750	1760	1770	1780	1790	1800
ACGCTTCTAC	CACAAATTTA	CAATTCCATA	CATCAATTGA	CGGAAGACCT	ATTAATCAGG
1810	1820	1830	1840	1850	1860
GGAATTTTTC	AGCAACTATG	AGTAGTGGGA	GTAATTTACA	GTCCGGAAGC	TTTAGGACTG
1870	1880	1890	1900	1910	1920
TAGGTTTTAC	TACTCCGTTT	AACTTTTCAA	ATGGATCAAG	TGTATTTACG	TTAAGTGCTC
1930	1940	1950	1960	1970	1980
ATGTCTTCAA	TTCAGGCAAT	GAAGTTTATA	TAGATCGAAT	TGAATTTGTT	CCGGCAGAAG
1990	2000	2010	2020	2030	2040
TAACCTTTGA	GGCAGAATAT	GATTTAGAAA	GAGCACAAAA	GGCGGTGAAT	GAGCTGTTTA
2050	2060	2070	2080	2090	2100
CTTCTTCCAA	TCAAATCGGG	TTAAAAACAG	ATGTGACGGA	TTATCATATT	GATCAAGTAT
2110	2120	2130	2140	2150	2160
CCAATTTAGT	TGAGTGTTTA	TCTGATGAAT	TTTGTCTGGA	TGAAAAAAAA	GAATTGTCCG

Wzór 1 (część TT)

2170 AGAAAGTCAA	2180 ACATGCGAAG	2190 CGACTTAGTG	2200 ATGAGCGGAA	2210 TTTACTTCAA	2220 GATCCAAACT
2230 TTAGAGGGAT	2240 CAATAGACAA	2250 CTAGACCGTG	2260 GCTGGAGAGG	2270 AAGTACGGAT	2280 ATTACCATCC
2290 AAGGAGGCGA	2 300 TGACGTATTC	2310 AAAGAGAATT	2320 ACGTTACGCT	2330 ATTGGGTACC	2340 TTTGATGAGT
2350 GCTATCCAAC	2360 GTATTTATAT	2370 CAAAAAATAG	2 380 ATGAGTCGAA	2390 ATTAAAAGCC	2400 TATACCCGTT
2410 ACCAATTAAG	2420 AGGGTATATC	2430 GAAGATAGTC	2440 AAGACTTAGA	2450 AATCTATTTA	2460 ATTCGCTACA
2470 ATGCCAAACA	2480 CGAAACAGTA	2490 AATGTGCCAG	2 500 GTACGGGTTC	2510 CTTATGGCCG	2520 CTTTCAGCCC
2 530 CAAGTCCAAT	2 540 CGGAAAATGT	2 550 GCCCATCATT	2560 CCCATCATTT	2570 CTCCTTGGAC	2 580 ATTGATGTTG
2590 GATGTACAGA	2600 CTTAAATGAG	2610 GACTTAGGTG	2620 TATGGGTGAT	2630 ATTCAAGATT	2640 AAGACGCAAG
2650 ATGGCCATGC	2660 AAGACTAGGA	2670 AATCTAGAAT	2680 TTCTCGAAGA	2690 GAAACCATTA	2700 GTAGGAGAAG
2710 CACTAGCTCG	2720 TGTGAAAAGA	2730 GCGGAGAAAA	2740 AATGGAGAGA	2750 CAAACGTGAA	2760 AAATTGGAAT
2770 GGGAAACAAA	2780 TATTGTTTAT	2790 AAAGAGGCAA	2800 AAGAATCTGT	2810 AGATGCTTTA	2820 TTTGTAAACT
2830 CTCAATATGA	2840 TAGATTACAA	2850 GCGGATACCA	2860 ACATCGCGAT	2870 GATTCATGCG	2880 GCAGATAAAC
2890 GCGTTCATAG	2900 CATTCGAGAA	2910 GCTTATCTGC	2920 CTGAGCTGTC	2930 TGTGATTCCG	2940 GGTGTCAATG
2950 CGGCTATTTT	2960 TGAAGAATTA	2970 GAAGGGCGTA	2980 TTTTCACTGC	2990 ATTCTCCCTA	3000 TATGATGCGA
3010 GAAATGTCAT	3020 TAAAAATGGT	3030 GATTTTAATA	3040 ATGGCTTATC	3050 CTGCTGGAAC	3060 GTGAAAGGGC
3070 ATGTAGATGT	3080 AGAAGAACAA	3090 AACAACCACC	3100 GTTCGGTCCT	3110 TGTTGTTCCG	3120 GAATGGGAAG
3130 CAGAAGTGTC	3140 ACAAGAAGTT	3150 CGTGTCTGTC	3160 CGGGTCGTGG	3170 CTATATCCTT	3180 CGTGTCACAG
3190 CGTACAAGGA	3200 GGGATATGGA	3210 GAAGGTTGCG	3220 TAACCATTCA	3230 TGAGATCGAG	3240 AACAATACAG
3250 ACGAACTGAA	3260 GTTTAGCAAC	3270 TGTGTAGAAG	3280 AGGAAGTATA	3290 TCCAAACAAC	3300 ACGGTAACGT

Wzór 1 (część III )

164 138

3310 GTAATGATTA	3320 TACTGCGACT	3330 CAAGAAGAAT	3340 ATGAGGGTAC	3350 GTACACTTCT	3360 CGTAATCGAG
3370 GATATGACGG	3380 AGCCTATGAA	3390 AGCAATTCTT	3400 CTGTACCAGC	3410 TGATTATGCA	3420 TCAGCCTATG
3430 AAGAAAAAGC	3440 ATATACAGAT	3450 GGACGAAGAG	3460 ACAATCCTTG	3470 TGAATCTAAC	3480 AGAGGATATG
3490 GGGATTACAC	3500 ACCACTACCA	3510 GCTGGCTATG	3520 TGACAAAAGA	3530 ATTAGAGTAC	3540 TTCCCAGAAA
3550 CCGATAAGGT	3560 ATGGATTGAG	3570 ATCGGAGAAA	3580 CGGAAGGAAC	3590 ATTCATCGTG	3600 GACAGCGTGG
3610 AATTACTTCT	3620 TATGGAGGAA	36 30 TAATATATGC	3640 TTTATAATGT	3650 AAGGTGTGCA	3660 AATAAAGAAT
3670 GATTACTGAC	3680 TTGTATTGAC	3690 AGATAAATAA	3700 GGAAATTTTT	3710 ATATGAATAA	3720 AAAACGGGCA
3730 TCACTCTTAA	3740 AAGAATGATG	3750 TCCGTTTTTT	3760 GTATGATTTA	3770 ACGAGTGATA	3780 TTTAAATGTT
3790 TTTTTTGCGA	3800 AGGCTTTACT	3810 TAACGGGGTA	3820 CCGCCACATG	3830 CCCATCAACT	3840 TAAGAATTTG
3850 CACTACCCCC	3860 AAGTGTCAAA	3870 AAACGTTATT	3880 CTTTCTAAAA	3890 AGCTAGCTAG	3900 AAAGGATGAC
3910 ATTTTTTATG	3920 AATCTTTCAA	3930 TTCAAGATGA	3940 ATTACAACTA	3950 TTTTCTGAAG	3960 AGCTGTATCG
3970 TCATTTAACC	3980 CCTTCTCTTT	3990 TGGAAGAACT	4000 CGCTAAAGAA	4010 TTAGGTTTTG	4020 TAAAAAGAAA
4030 ACGAAAGTTT	4040 TCAGGAAATG	4050 AATTAGCTAC	4060 CATATGTATC	4070 TGGGGCAGTC	4080 AACGTACAGC
4090 GAGTGATTCT	4100 CTCGTTCGAC	4110 TATGCAGTCA	4120 ATTACACGCC	4130 GCCACAGCAC	4140 TCTTATGAGT
4150 CCAGAAGGAC	4160 TCAATAAACG	4170 CTTTGATAAA	4180 AAAGCGGTTG	4190 AATTTTTGAA	4200 ATATATTTTT
4210 TCTGCATTAT	4220 GGAAAAGTAA	4230 ACTTTGTAAA	4240 ACATCAGCCA	42 50 TTTCAAGTGC	4260 AGCACTCACG
4270 TATTTTCAAC	4280 GAATCCGTAT	4290 TTTAGATGCG	4300 ACGATTTTCC	4310 AAGTACCGAA	4320 ACATTTAGCA
4330 CATGTATATC	4340 CTGGGTCAGG	4350 TGGTTGTGCA	4360 CAAACTGCAG

Wzór 1 (część IV)

164 138

Met	Asp	Asn	Asn	Pro	Asn	Ile	Asn	Glu	Cys	10
Ile	Pro	Tyr	Asn	Cys	Leu	Ser	Asn	Pro	Glu	20
Val	Glu	Val	Leu	Gly	Gly	Glu	Arg	Ile	Glu	30
Thr	Gly	Tyr	Thr	Pro	Ile	Asp	Ile	Ser	Leu	40
Ser	Leu	Thr	Gln	Phe	Leu	Leu	Se r	Glu	Phe	50
Val	Pro	Gly	Ala	Gly	Phe	Val	Leu	Gly	Leu	60
Val	Asp	Ile	Ile	Trp	Gly	Ile	Phe	Gly	Pro	70
Ser	Gln	Trp	Asp	Ala	Phe	Leu	Val	Gln	Ile	80
Glu	Gln	Leu	Ile	Asn	Gln	Arg	Ile	Glu	Glu	90
Phe	Ala	Arg	Asn	Gln	Ala	Ile	Ser	Arg	Leu	100
Glu	Gly	Leu	Ser	Asn	Leu	Tyr	Gln	Ile	Tyr	110
Ala	Glu	Se r	Phe	Arg	Glu	Trp	Glu	Ala	Asp	120
Pro	Thr	Asn	Pro	Ala	Leu	Arg	Glu	Glu	Met	130
Arg	Ile	Gln	Phe	Asn	Asp	Met	Asn	Ser	Ala	140
Leu	Thr	Thr	Ala	Ile	Pro	Leu	Phe	Ala	Val	150
Gln	Asn	Tyr	Gln	Val	Pro	Leu	Leu	Ser	Val	160
Tyr	Val	Gln	Ala	Ala	Asn	Leu	His	Leu	Ser	170
Val	Leu	Arg	Asp	Val	Ser	Val	Phe	Gly	Gln	180
Arg	Trp	Gly	Phe	Asp	Ala	Ala	Thr	Ile	Asn	190
Ser	Arg	Tyr	Asn	Asp	Leu	Thr	Arg	Leu	Ile	200
Gly	Asn	Tyr	Thr	Asp	His	Ala	Val	Arg	Trp	210
Tyr	Asn	Thr	Gly	Leu	Glu	Arg	Val	Trp	Gly	220
Pro	Asp	Ser	Arg	Asp	Trp	Ile	Arg	Tyr	Asn	2 30
Gln	Phe	Arg	Arg	Glu	Leu	Thr	Leu	Thr	Val	240
Leu	Asp	Ile	Val	Ser	Leu	Phe	Pro	Asn	Tyr	250
Asp	Ser	Arg	Thr	Tyr	Pro	Ile	Arg	Thr	Val	260
Ser	Gln	Leu	Thr	Arg	Glu	Ile	Tyr	Thr	Asn	270
Pro	Val	Leu	Glu	Asn	Phe	Asp	Gly	Ser	Phe	280
Arg	Gly	Ser	Ala	Gln	Gly	Ile	Glu	Gly	Ser	290
Ile	Arg	Ser	Pro	His	Leu	Met	Asp	Ile	Leu	300

Wzór 2 (część I)

164 138

Asn	Ser	Ile	Thr	Ile	Tyr	Thr	Asp	Ala	His	310
Arg	Gly	Glu	Tyr	Tyr	Trp	Ser	Gly	His	Gln	320
Ile	Met	Ala	Ser	Pro	Val	Gly	Phe	Ser	Gly	330
Pro	Glu	Phe	Thr	Phe	Pro	Leu	Tyr	Gly	Thr	340
Met	Gly	Asn	Ala	Ala	Pro	Gln	Gln	Arg	Ile	350
Val	Ala	Gln	Leu	Gly	Gln	Gly	Val	Tyr	Arg	360
Thr	Leu	Ser	Ser	Thr	Leu	Tyr	Arg	Arg	Pro	370
Phe	Asn	Ile	Gly	Ile	Asn	Asn	Gln	Gln	Leu	380
Ser	Val	Leu	Asp	Gly	Thr	Glu	Phe	Ala	Tyr	390
Gly	Thr	Ser	Ser	Asn	Leu	Pro	Ser	Ala	Val	400
Tyr	Arg	Lys	Ser	Gly	Thr	Val	Asp	Ser	Leu	410
Asp	Glu	Ile	Pro	Pro	Gln	Asn	Asn	Asn	Val	420
Pro	Pro	Arg	Gln	Gly	Phe	Ser	His	Arg	Leu	4 30
Ser	His	Val	Ser	Met	Phe	Arg	Ser	Gly	Phe	440
Ser	Asn	Ser	Ser	Val	Ser	Ile	Ile	Arg	Ala	450
Pro	Met	Phe	Ser	Trp	Ile	His	Arg	Ser	Ala	460
Glu	Phe	Asn	Asn	Ile	Ile	Pro	Ser	Ser	Gln	470
Ile	Thr	Gln	Ile	Pro	Leu	Thr	Lys	Ser	Thr	480
Asn	Leu	Gly	Ser	Gly	Thr	Ser	Val	Val	Lys	490
Gly	Pro	Gly	Phe	Thr	Gly	Gly	Asp	Ile	Leu	500
Arg	Arg	Thr	Ser	Pro	Gly	Gln	Ile	Ser	Thr	510
Leu	Arg	Val	Asn	Ile	Thr	Ala	Pro	Leu	Ser	520
Gln	Arg	Tyr	Arg	Val	Arg	Ile	Arg	Tyr	Ala	530
Ser	Thr	Thr	Asn	Leu	Gln	Phe	His	Thr	Ser	540
Ile	Asp	Gly	Arg	Pro	Ile	Asn	Gln	Gly	Asn	550
Phe	Ser	Ala	Thr	Met	Ser	Ser	Gly	Ser	Asn	560
Leu	Gln	Ser	Gly	Ser	Phe	Arg	Thr	Val	Gly	570
Phe	Thr	Thr	Pro	Phe	Asn	Phe	Ser	Asn	Gly	580
Ser	Ser	Val	Phe	Thr	Leu	Ser	Ala	His	Val	590
Phe	Asn	Ser	Gly	Asn	Glu	Val	Tyr	Ile	Asp	600
Arg	Ile	Glu	Phe	Val	Pro	Ala	Glu	Val	Thr	610
Phe	Glu	Ala	Glu	Tyr	Asp	Leu	Glu	Arg	Ala	620
Gln	Lys	Ala	Val	Asn	Glu	Leu	Phe	•Thr	Ser	630
Ser	Asn	Gln	Ile	Gly	Leu	Lys	Thr	Asp	Val	640
Thr	Asp	Tyr	His	Ile	Asp	Gln	Val	Ser	Asn	650
Leu	Val	Glu	Cys	Leu	Ser	Asp	Glu	Phe	Cys	660
Leu	Asp	Glu	Lys	Lys	Glu	Leu	Ser	Glu	Lys	670

Wzór 2 (część K)

16138

Val	Lys	His	Ala	Lys	Arg	Leu	Ser	Asp	Glu	680
Arg	Asn	Leu	Leu	Gln	Asp	Pro	Asn	Phe	Arg	690
Gly	Ile	Asn	Arg	Gln	Leu	Asp	Arg	Gly	Trp	700
Arg	Gly	Ser	Thr	Asp	Ile	Thr	Ile	Gln	Gly	710
Gly	Asp	Asp	Val	Phe	Lys	Glu	Asn	Tyr	Val	720
Thr	Leu	Leu	Gly	Thr	Phe	Asp	Glu	Cys	Tyr	7 30
Pro	Thr	Tyr	Leu	Tyr	Gln	Lys	Ile	Asp	Glu	740
Ser	Lys	Leu	Lys	Ala	Tyr	Thr	Arg	Tyr	Gln	7 50
Leu	Arg	Gly	Tyr	Ile	Glu	Asp	Ser	Gln	Asp	760
Leu	Glu	Ile	Tyr	Leu	Ile	Arg	Tyr	Asn	Ala	770
Lys	His	Glu	Thr	Val	Asn	Val	Pro	Gly	Thr	780
Gly	Ser	Leu	Trp	Pro	Leu	Ser	Ala	Pro	Ser	790
Pro	Ile	Gly	Lys	Cys	Ala	His	His	Ser	His	800
His	Phe	Ser	Leu	Asp	Ile	Asp	Val	Gly	Cys	810
Thr	Asp	Leu	Asn	Glu	Asp	Leu	Gly	Val	Trp	820
Val	Ile	Phe	Lys	Ile	Lys	Thr	Gln	Asp	Gly	830
His	Ala	Arg	Leu	Gly	Asn	Leu	Glu	Phe	Leu	840
Glu	Glu	Lys	Pro	Leu	Val	Gly	Glu	Ala	Leu	850
Ala	Arg	Val	Lys	Arg	Ala	Glu	Lys	Lys	Trp	860
Arg	Asp	Lys	Arg	Glu	Lys	Leu	Glu	Trp	Glu	870
Thr	Asn	Ile	Val	Tyr	Lys	Glu	Ala	Lys	Glu	880
Ser	Val	Asp	Ala	Leu	Phe	Val	Asn	Ser	Gln	890
Tyr	Asp	Arg	Leu	Gln	Ala	Asp	Thr	Asn	Ile	900
Ala	Met	Ile	His	Ala	Ala	Asp	Lys	Arg	Val	910
His	Ser	Ile	Arg	Glu	Ala	Tyr	Leu	Pro	Glu	920
Leu	Ser	Val	Ile	Pro	Gly	Val	Asn	Ala	Ala	930
Ile	Phe	Glu	Glu	Leu	Glu	Gly	Arg	Ile	Phe	940
Thr	Ala	Phe	Ser	Leu	Tyr	Asp	Ala	Arg	Asn	950
Val	Ile	Lys	Asn	Gly	Asp	Phe	Asn	Asn	Gly	960
Leu	Ser	Cys	Trp	Asn	Val	Lys	Gly	His	Val	970
Asp	Val	Glu	Glu	Gln	Asn	Asn	His	Arg	Ser	980
Val	Leu	Val	Val	Pro	Glu	Trp	Glu	Ala	Glu	990
Val	Ser	Gln	Glu	Val	Arg	Val	Cys	Pro	Gly	1000
Arg	Gly	Tyr	Ile	Leu	Arg	Val	Thr	Ala	Tyr	1010
Lys	Glu	Gly	Tyr	Gly	Glu	Gly	Cys	Val	Thr	1020
Ile	His	Glu	Ile	Glu	Asn	Asn	Thr	Asp	Glu	1030
Leu	Lys	Phe	Ser	Asn	Cys	Val	Glu	Glu	Glu	1040

Wzór 2 (część I)

164 138

Val	Tyr	Pro	Asn	Asn	Thr	Val	Thr	Cys	Asn	1050
Asp	Tyr	Thr	Ala	Thr	Gln	Glu	Glu	Tyr	Glu	1060
Gly	Thr	Tyr	Thr	Ser	Arg	Asn	Arg	Gly	Tyr	1070
Asp	Gly	Ala	Tyr	Glu	Ser	Asn	Ser	Ser	Val	1080
Pro	Ala	Asp	Tyr	Ala	Ser	Ala	Tyr	Glu	Glu	1090
Lys	Ala	Tyr	Thr	Asp	Gly	Arg	Arg	Asp	Asn	1100
Pro	Cys	Glu	Ser	Asn	Arg	Gly	Tyr	Gly	Asp	1110
Tyr	Thr	Pro	Leu	Pro	Ala	Gly	Tyr	Val	Thr	1120
Lys	Glu	Leu	Glu	Tyr	Phe	Pro	Glu	Thr	Asp	1130
Lys	Val	Trp	Ile	Glu	Ile	Gly	Glu	Thr	Glu	1140
Gly	Thr	Phe	Ile	Val	Asp	Ser	Val	Glu	Leu	1150
Leu	Leu	Met	Glu	Glu	End					1156

Wzór 2 (część IV)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (33)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób bezpośredniego, docelowo ukierunkowanego i odtwarzalnego manipulowania genetycznego bakteriami Gram- dodatnimi, wybranymi ze zbioru obejmującego B. thuringiensis i B. cereus, znamienny tym, że (a) wyodrębnia się włączany DNA, przy czym korzystnie chodzi o DNA plazmidowy, dNa kodujący lub DNA o funkcji regulatorowej; (b) tak wyodrębniony DNA w wektorze, który jest w stanie replikować w bakteryjnej komórce gospodarza, wybranego ze zbioru obejmującego B.thuringiensis i B.cereus, klonuje się wewnątrz heterologicznego układu klonowania; (c) tak sklonowany DNA wyodrębnia się i włącza bezpośrednio w omówioną komórkę bakteryjną z szybkością transformacji, która wystarcza na przeciwzwyciężenie bariery restrykcyjnej istniejącej wewnątrz tej komórki bakteryjnej; i (d) tak stransformowaną komórkę bakteryjną hoduje się i ewentualnie wyodrębnia się sklonowany wektor-DNA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że włączany DNA najpierw poddaje się ligacji z sekwencjami ekspresyjnymi, które są zdolne do funkcjonowania w komórce bakteryjnej, wybranej ze zbioru obejmującego komórki B. thuringiensis i B. cereus i ewentualnie wyodrębnia się ten produkt ekspresji.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że bezpośrednie włączenie DNA według etapu (c) przeprowadza się za pomocą elektroporacji.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym że włączanie za pomocą elektroporacji obejmuje następujące zabiegi postępowania a)-h): a) wytworzenie zawiesiny komórek o odpowiedniej gęstości komórek w pożywce odpowiedniej dla hodowli bakteryjnych komórek, wybranych ze zbioru obejmującego komórki B. thuringiensis i B.cereus i wobec napowietrzenia wystarczającego dla wzrostu tych komórek; b) oddzielenie tych komórek z zawiesiny komórek i ponowne przeprowadzenie w stan zawiesiny w buforze inokulacyjnym, odpowiednim dla kolejno następującej elektroporacji; c) dodanie próbki DNA w stężeniu odpowiednim dla elektroporacji; d) wprowadzenie opisanej pod b) i c) szarży do aparatury elektroporacyjnej; e) jedno lub wiele krótkotrwałych wyładowań kondensatora poprzez zawiesinę komórkową dla krótkoterminowego wytworzenia wysokiego natężenia pola elektrycznego w ciągu okresu, który jest wystarczający dla włączenia rekombinantowego DNA w komórkę bakteryjną; f) ewentualnie następcza inkubacja elektroporowanych komórek; g) nakładanie warstwy z elektroporowanych komórek na odpowiednim podłożu selekcyjnym; i h) selekcja stransformowanych komórek.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że dla wytworzenia omówionej pod 4a) zawiesiny stosuje się zarodniki B. thuringiensis.
6. 6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w przypadku omówionej pod 4e) elektroporacji stosuje się uprzednio wymrożone i następnie rozmrożone komórki Bacillus thuringiensis i/lub Bacillus cereus.
7. 7. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do hodowania komórek B. thuringiensis a) stosuje się kompleksowe pożywki z łatwo przyswajalnym źródłem węgla i azotu, takie jakie zwykle wprowadza się w hodowli aerobowych rodzjów Bacillus; ai) ewentualnie dodając do omówionych pod a) pożywek dodatkowo witaminy i jony istotnych metali; albo b) stosuje się całkowicie lub półsyntetyczne pożywki, które zawierają bi) kompleksowe lub też zdefiniowane, łatwo przyswajalne źródło węgla i azotu lub kombinację ich obu oraz b2) istotne witaminy i jony metali.
8. 8. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że omawiana zawiesina komórek Bacillus wykazuje absorbancję [OD550] rzędu 0,1-1,0.

   164 138
9. 9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że omówiony pod b) bufor inokulacyjny stanowi bufor fosforanowy, osmotycznie stabilizowany dodatkiem środka stabilizującego osmotycznie.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniany bufor fosforanowy jako czynnik stabilizujący osmotycznie zawiera cukry lub alkohole cukrowe.
11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że w przypadku wspomnianego czynnika stabilizującego chodzi o sacharozę, która występuje w stężeniu 0,1-1,0 M.
12. 12. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że wspomniany bufor fosforanowy wykazuje odczyn o wartości pH=5,0-8,0.
13. 13. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że inkubacja komórek Bacillus zarówno przed, podczas jak i po elektroporacji zachodzi w temperaturze 0-35°C.
14. 14. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że inkubacja komórek Bacillus zarówno przed, podczas jak i po elektroporacji zachodzi w temperaturze 2-15°C.
15. 15. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stężenie dodanej próbki DNA wynosi od 1 ng do 20 μg.
16. 16. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wartość natężenia pola wynosi 30004500 V/cm.
17. 17. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wykładniczy czas zaniku impulsu, którym obciąża się zawiesinę komórek Bacillus, mieści się w zakresie około 2-50 ms.
18. 18. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że po odpowiedniej fazie inkubacji następczej nakłada się warstwę z elektroporowanych komórek na stałe podłoża, które zawierają dodatek odpowiedni do selekcjonowania stransformowanych komórek Bacillus.
19. 19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że w przypadku wspomnianego dodatku chodzi o odpowiedni dla selekcji B. thuringiensis lub B. cereus antybiotyk, wybrany z grupy obejmującej tetracyklinę, kanamycynę, chloramfenikol, erytromycynę.
20. 20. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że w przypadku wspomnianego dodatku chodzi o odpowiedni dla selekcji B.thuringiensis lub B.cereus substrat chromogenny.
21. 21. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosowany dla włączenia do omówionych komórek bakteryjnych, wybranych ze zbioru obejmującego B. thuringiensis lub B. cereus, rekombinantowy DNA jest pochodzenia homologicznego lub heterologicznego, albo chodzi o kombinację homologicznego i heterologicznego DNA.
22. 22. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wspomniany rekombinantowy DNA zawiera jeden lub wiele genów struktury oraz 3’- i 5’-flankujące, w bakterii Bacillus thuringiensis lub Bacillus cereus lub w nich obu sprawne sekwencje regulatorowe, które operatywnie są sprzężone z tym(i) genem(ami) struktury i tym samym zapewniają ekspresję wspomnianego(nych) genu(ów) struktury w bakterii Bacillus thuringiensis lub w Bacillus cereus lub w nich obu.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że 3’- i 5’-flankujące sekwencje-DNA współwłączają zależny od sporulacji promotor z bakterii B. thuringiensis.
24. 24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że wspomniany gen struktury koduje polipeptyd δ- endotoksyny, który naturalnie występuje w B. thuringiensis, albo koduje polipeptyd, który z tym naturalnym co do istoty rzeczy jest homologiczny, tj. który przynajmniej co do istoty rzeczy wykazuje właściwości toksyczności krystalicznego polipeptydu δ-endotoksyny z bakterii B.thuringiensis.
25. 25. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wspomniana sekwencja DNA kodująca δ-endotoksynę jest co do istoty rzeczy homologięzna przynajmniej z częścią lub z częściami naturalnej sekwencji kodującej δ -endotoksynę, która(e) to część(ci) jest (są) odpowiedzialna(e) za aktywność owadobójczą.
26. 26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że wspomniany polipeptyd jest co do istoty rzeczy homologiczny z odpowiednim podgatunkiem bakterii B. thuringiensis, wybranym ze zbioru obejmującego kurstaki, berliner, alesti, sotto, tolworthi, dendrolimus, tenebrionis i israelensis.
27. 27. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że w przypadku wspomnianej sekwencjiDNA, kodującej δ-endotoksynę chodzi o fragment-DNA z B.thuringiensis var.kurstaki HDl,

    164 138 który w niżej podanym wzorze znajduje się między nukleotydami 156 i 3623, albo też o każdy dowolny krótszy fragment-DNA, który jeszcze koduje polipeptyd o właściwościach insektotoksycznych, przy czym wspomniany wzór ma następującą postać:

    10 20 30 40 50 GTTAACACCC TGGGTCAAAA ATTGATATTT AGTAAAATTA GTTGCACTTT 60 70 80 90 100 GTGCATTTTT TCATAAGATG AGTCATATGT TTTAAATTGT AGTAATGAAA 110 120 130 140 150 AACAGTATTA TATCATAATG AATTGGTATC TTAATAAAAG AGATGGAGGT 160 170 180 190 200 AACTTATGGA TAACAATCCG AACATCAATG AATGCATTCC TTATAATTGT 210 220 230 240 250 TTAAGTAACC CTGAAGTAGA AGTATTAGGT GGAGAAAGAA TAGAAACTGG 260 270 280 290 300 TTACACCCCA ATCGATATTT CCTTGTCGCT AACGCAATTT CTTTTGAGTG 310 320 330 340 350 AATTTGTTCC CGGTGCTGGA TTTGTGTTAG GACTAGTTGA TATAATATGG 360 370 380 390 400 GGAATTTTTG GTCCCTCTCA ATGGGACGCA TTTCTTGTAC AAATTGAACA 410 420 430 440 450 GTTAATTAAC CAAAGAATAG AAGAATTCGC TAGGAACCAA GCCATTTCTA 460 470 480 490 500 GATTAGAAGG ACTAAGCAAT CTTTATCAAA TTTACGCAGA ATCTTTTAGA

    164 138

    510 520 530 540 550 GAGTGGGAAG CAGATCCTAC TAATCCAGCA TTAAGAGAAG AGATGCGTAT 560 570 580 590 600 TCAATTCAAT GACATGAACA GTGCCCTTAC AACCGCTATT CCTCTTTTTG 610 620 630 640 650 CAGTTCAAAA TTATCAAGTT CCTCTTTTAT CAGTATATGT TCAAGCTGCA 660 670 680 690 700 AATTTACATT TATCAGTTTT GAGAGATGTT TCAGTGTTTG GACAAAGGTG 710 720 730 740 750 GGGATTTGAT GCCGCGACTA TCAATAGTCG TTATAATGAT TTAACTAGGC 760 770 780 790 800 TTATTGGCAA CTATACAGAT CATGCTGTAC GCTGGTACAA TACGGGATTA 810 820 830 840 850 GAGCGTGTAT GGGGACCGGA TTCTAGAGAT TGGATAAGAT ATAATCAATT 860 870 880 890 900 TAGAAGAGAA TTAACACTAA CTGTATTAGA TATCGTTTCT CTATTTCCGA 910 920 930 940 950 ACTATGATAG TAGAACGTAT CCAATTCGAA CAGTTTCCCA ATTAACAAGA 960 970 980 990 1000 GAAATTTATA CAAACCCAGT ATTAGAAAAT TTTGATGGTA gttttcgagg 1010 1020 1030 1040 1050 CTCGGCTCAG GGCATAGAAG GAAGTATTAG GAGTCCACAT TTGATGGATA 1060 1070 1080 1090 1100 TACTTAACAG TATAACCATC TATACGGATG CTCATAGAGG AGAATATTAT 1110 1120 1130 1140 1150 TGGTCAGGGC ATCAAATAAT GGCTTCTCCT GTAGGGTTTT CGGGGCCAGA

    164 138

    1160 1170 1180 1190 1200 ATTCACTTTT CCGCTATATG GAACTATGGG AAATGCAGCT CCACAACAAC 1210 1220 1230 1240 1250 GTATTGTTGC TCAACTAGGT CAGGGCGTGT ATAGA^lCATT ATCGTCCACT 1260 1270 1280 1290 1300 TTAl^A^I^A^GAA GACCTTTTAA TATAGGGATA AATAATCAAC AAClAlCTGT 1310 1320 1330 1340 1350 TCTTGACGGG ACAGAATTTG CTTATGGAAC CTCCTCAAAT TTGCCATCCG 1360 1370 1380 1390 1400 CTGTATACAG AAAAAGCGGA ACGGTAGATT CGCTGGATGA AATACCGCCA 1410 1420 1430 1440 1450 CAGAATAACA ACGTGCCACC TAGGCAAGGA TTTAGTCATC GATTAAGCCA 1460 1470 1480 1490 1500 TGTTTCAATG TTTCGTTCAG GCTTTAGTAA TAGTAGTGTA AGTATAATAA 1510 1520 1530 1540 1550 GAGCTCCTAT GTTCTCTTGG ATACATCGTA GTGCTGAATT lAATAATAlA 1560 1570 1580 1590 1600 ATTCCTTCAT CACAAATTAC ACAAATACCT TTAACAAAAT CTAClAAlCl 1610 1620 1630 1640 1650 TGGCTCTGGA ACTTCTGTCG TTAAAGGACC AGGATTTACA GGAGGAGATA 1660 1670 1680 1690 1700 TTCHCGAAG AACTTCACCT GGCCAGATTT CAACCTTAAG AGTAAAlAll 1710 1720 1730 1740 1750 ACTGCACCAT TATCACAAAG ATATCGGGTA AGAATTCGCT AOGCHdAC 1760 1770 1780 1790 1800 CACAAATTTA CAATTCCATA CATCAATTGA CGGAAGACCT ATTAATCAGG

    164 138

    1810 1820 1830 1840 1850 GGAATTTTTC AGCAACTATG AGTAGTGGGA GTAATTTACA GTCCGGAAGC 1860 1870 1880 1890 1900 TTTAGGACTG TAGGTTTTAC TACTCCGTTT AACTTTTCAA ATGGATCAAG 1910 1920 1930 1940 1950 TGTATTTACG TTAAGTGCTC ATGTCTTCAA TTCAGGCAAT GAAGTTTATA 1960 1970 1980 1990 2000 TAGATCGAAT TGAATTTGTT CCGGCAGAAG TAACCTTTGA GGCAGAATAT 2010 2020 2030 2040 2050 GATTTAGAAA GAGCACAAAA GGCGGTGAAT GAGCTGTTTA CTTCTTCCAA 2060 2070 2080 2090 2100 TCAAATCGGG TTAAAAACAG ATGTGACGGA TTATCATATT GATCAAGTAT 2110 2120 2130 2140 2150 CCAATTTAGT TGAGTGTTTA TCTGATGAAT TTTGTCTGGA TGAAAAAAAA 2160 2170 2180 2190 2200 GAATTGTCCG AGAAAGTCAA ACATGCGAAG CGACTTAGTG ATGAGCGGAA 2210 2220 2230 2240 2250 TTTACTTCAA GATCCAAACT TTAGAGGGAT CAATAGACAA CTAGACCGTG 2260 2270 2280 2290 2300 GCTGGAGAGG AAGTACGGAT ATTACCATCC AAGGAGGCGA TGACGTATTC 2310 2320 2330 2340 2350 AAAGAGAATT ACGTTACGCT ATTGGGTACC TTTGATGAGT GCTATCCAAC 2360 2370 2380 2390 2400 GTATTTATAT CAAAAAATAG ATGAGTCGAA ATTAAAAGCC TATACCCGTT 2410 2420 2430 2440 2450 ACCAATTAAG AGGGTATATC GAAGATAGTC AAGACTTAGA AATCTATTTA

    16 138

    2460 2470 2480 2490 2500 ATTCGCTACA ATGCCAAACA CGAAACAGTA AATGTGCCAG GTACGGGTTC 2510 2520 2530 2540 2550 CTTATGGCCG CTTTCAGCCC CAAGTCCAAT CGGAAAATGT GCCCATCATT 2560 2570 2580 2590 2600 CCCATCATTT CTCCTTGGAC ATTGATGTTG GATGTACAGA CTTAAATGAG 2610 2620 2630 2640 2650 GACTTAGGTG TATGGGTGAT ATTCAAGATT AAGACGCAAG ATGGCCATGC 2660 2670 2680 2690 2700 AAGACTAGGA AATCTAGAAT TTCTCGAAGA GAAACCATTA GTAGGAGAAG 2710 2720 2730 2740 2750 CACTAGCTCG TGTGAAAAGA GCGGAGAAAA AATGGAGAGA CAAACGTGAA 2760 2770 2780 2790 2800 AAATTGGAAT GGGAAACAAA TATTGTTTAT AAAGAGGCAA AAGAATCTGT 2810 2820 2830 2840 2850 AGATGCTTTA TTTGTAAACT CTCAATATGA TAG AT TAC AA GCGGATACCA 2860 2870 2880 2890 2900 ACATCGCGAT GATTCATGCG GCAGATAAAC GCGTTCATAG CATTCGAGAA 2910 2920 2930 2940 2950 GCTTATCTGC CTGAGCTGTC TGTGATTCCG GGTGTCAATG CGGCTATTTT 2960 2970 2980 2990 3000 TGAAGAATTA GAAGGGCGTA TTTTCACTGC ATTCTCCCTA TATGATGCGA 3010 3020 3030 3040 3050 GAAATGTCAT TAAAAATGGT GATTTTAATA ATGGCTTATC CTGCTGGAAC 3060 3070 3080 3090 3100 GTGAAAGGGC ATGTAGATGT AGAAGAACAA AACAACCACC GTTCGGTCCT

    164 138

    3110 3120 3130 3140 3150 TGTTGTTCCG GAATGGGAAG CAGAAGTGTC ACAAGAAGTT CGTGTCTGTC 3160 3170 3180 3190 3200 CGGGTCGTGG CTATATCCTT CGTGTCACAG CGTACAAGGA . GGGATATGGA 3210 3220 3230 3240 3250 GAAGGTTGCG TAACCATTCA TGAGATCGAG AACAATACAG ACGAACTGAA 3260 3270 3280 3290 3300 GTTTAGCAAC TGTGTAGAAG AGGAAGTATA TCCAAACAAC ACGGTAACGT 3310 3320 3330 3340 3350 GTAATGATTA TACTGCGACT CAAGAAGAAT ATGAGGGTAC GTACACTTCT 3360 3370 3380 3390 3400 CGTAATCGAG GATATGACGG AGCCTATGAA AGCAATTCTT CTGTACCAGC 3410 3420 3430 3440 3450 TGATTATGCA TCAGCCTATG AAGAAAAAGC ATATACAGAT GGACGAAGAG 3460 3470 3480 3490 3500 ACAATCCTTG TGAATCTAAC AGAGGATATG GGGATTACAC ACCACTACCA 3510 3520 3530 3540 3550 GCTGGCTATG TGACAAAAGA ATTAGAGTAC TTCCCAGAAA CCGATAAGGT 3560 3570 3580 3590 3600 ATGGATTGAG ATCGGAGAAA CGGAAGGAAC ATTCATCGTG GACAGCGTGG 3610 3620 3630 3640 3650 AATTACTTCT TATGGAGGAA TAATATATGC TTTATAATGT AAGGTGTGCA 3660 3670 3680 3690 3700 AATAAAGAAT GATTACTGAC TTGTATTGAC AGATAAATAA GGAAATTTTT 3710 3720 3730 3740 3750 ATATGAATAA AAAACGGGCA TCACTCTTAA AAGAATGATG TCCGTTTTTT

    16 138

    3760 3770 3780 3790 3800 GTATGATTTA ACGAGTGATA TTTAAATGTT TTTTTTGCGA AGGCTTTACT 3810 3820 3830 3840 3850 TAACGGGGTA CCGCCACATG CCCATCAACT TAAGAATTTG CACTACCCCC 3860 3870 3880 3890 3900 AAGTGTCAAA AAACGTTATT CTTTCTAAAA AGCTAGCTAG AAAGGATGAC 3910 3920 3930 3940 3950 ATTTTTTATG AATCTTTCAA TTCAAGATGA ATTACAACTA TTTTCTGAAG 3960 3970 3980 3990 4000 AGCTGTATCG TCATTTAACC CCTTCTCTTT TGGAAGAACT CGCTAAAGAA 4010 4020 4030 4040 4050 TTAGGTTTTG TAAAAAGAAA ACGAAAGTTT TCAGGAAATG AATTAGCTAC 4060 4070 4080 4090 4100 CATATGTATC TGGGGCAGTC AACGTACAGC GAGTGATTCT CTCGTTCGAC 4110 4120 4130 4140 4150 TATGCAGTCA ATTACACGCC GCCACAGCAC TCTTATGAGT CCAGAAGGAC 4160 4170 4180 4190 4200 TCAATAAACG CTTTGATAAA AAAGCGGTTG AATTTTTGAA ATATATTTTT 4210 4220 4230 4240 4250 TCTGCATTAT GGAAAAGTAA ACTTTGTAAA ACATCAGCCA TTTCAAGTGC 4260 4270 4280 4290 4300 AGCACTCACG TATTTTCAAC GAATCCGTAT TTTAGATGCG ACGATTTTCC 4310 4320 4330 4340 4350 AAGTACCGAA ACATTTAGCA CATGTATATC CTGGGTCAGG TGGTTGTGCA

    4360

    CAAACTGCAG

    164 138
28. 28. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że w przypadku wektora stosowanego w etapie (b) chodzi o wektor dwufunkcyjny, który jest nie tylko w stanie replikować w komórce bakteryjnej, wybranej ze zbioru obejmującego B. thuringiensis i B. cereus, lecz przynajmniej może jeszcze replikować w jednym lub też w kilku innych heterologicznych organizmach gospodarzy i który jest identyfikowalny zarówno w homologicznych jak i w heterologicznych układach gospodarzy.
29. 29. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że w przypadku wspomnianych heterologicznych organizmów gospodarzy chodzi o a) organizmy prokariotyczne, wybrane ze zbioru obejmującego rodzaje Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus, Streptomyces, Pseudomonas, Escherichia, Agrobacterium, Salmonella, Erwinia, itd.,albo o b) organizmy eukariotyczne, wybrane ze zbioru obejmującego drożdże, komórki zwierzęce i roślinne, itd.
30. 30. Sposób według zastrz. 29, znamienny tym, że w przypadku wspomnianego heterologicznego organizmu gospodarza chodzi o E.coli.
31. 31. Sposób według zastrz. 28, znamienny tym, że wspomniany dwufunkcyjny wektor obok funkcji istotnych dla replikacji i selekcji w homologicznych i heterologicznych układach gospodarzy zawiera jeszcze dodatkowo gen struktury pod kontrolą sekwencji ekspresyjnych, zdolnych do funkcjonowania w komórkach bakteryjnych, wybranych ze zbioru obejmującego B. thuringiensis i B. cereus, który koduje polipeptyd δ-endotoksyny, naturalnie występujący w B. thuringiensis, albo który koduje polipeptyd, będący z tym naturalnym co do istoty rzeczy homologiczny, tj. wykazujący przynajmniej co do istoty rzeczy właściwości toksyczności krystalicznego polipeptydu 8- endotoksyny z B.thuringiensis.
32. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że wspomniany sygnał ekspresji współwłącza zależy od sporulacji promotor z bakterii B.thuringiensis.
33. 33. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że włączony DNA według etapu (a) otrzymuje się drogą trawienia całego DNA bakteryjnego donora, wybranego ze zbioru obejmującego B. thuringiensis i B. cereus.