KR100599414B1 - 나비목 해충에 살충효과를 보이는 신규한 내독소 단백질유전자를 보유한 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주 및 이를 이용한 미생물 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 해충에 대하여 살충 활성을 가지는 신규한 바실러스 투린지엔시스 균주, 상기 균주로부터 유래되는 내독소 단백질 유전자 및 상기 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 나비목을 포함하는 해충의 유충에 대하여 살충 활성을 가지는 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주, 상기 균주 유래로서 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 신규한 내독소 단백질 유전자와 상기 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주 및 상기 균주에 의해 생산되는 내독소 단백질은 나비목을 포함하는 해충의 유충에 대하여 강력한 살충 효과를 보이며, 이를 포함하는 본 발명의 미생물 제제는 환경친화적인 미생물 제제로서 작물에 미치는 영향을 최소화하고, 식물의 병해를 방제하는데 효과적일 뿐만 아니라 저비용으로 제조할 수 있으므로, 들깨, 토마토, 오이 및 딸기 등과 같은 다양한 농작물의 병해 방제에 유용하게 사용될 수 있다.

바실러스 투린지엔시스, 내독소 단백질, 미생물 제제

Description

나비목 해충에 살충효과를 보이는 신규한 내독소 단백질 유전자를 보유한 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주 및 이를 이용한 미생물 제제{BACILLUS THURINGIENSIS K-3 STRAIN HAVING NOVEL GENES SHOWING INSECTICIDAL ACTIVITY FOR LEPIDOPTERAN LARVAE AND MICROBIOLOGICAL FORMULATION USING THE SAME}

도 1은 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주의 자가분해(autolysis) 전(A) 및 자가분해 후(B)의 위상차 현미경 사진이다.

S ; 포자, C ; 내독소 단백질

도 2는 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주의 플라스미드 패턴을 나타내는 아가로스 겔 전기영동 사진이다.

M1: 람다(lambda) DNA를 HindⅢ 제한효소로 절단한 DNA 마커,

M2: 1 kb DNA 래더,

제 1열, 제 3열 및 제 5열 ; 바실러스 투린지엔시스 케냐에 균주,

제 2열, 제 4열 및 제 6열 ; 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주,

제 1열 및 제 2열 ; 제한효소 무처리,

제 3열 및 제 4열 ; 제한효소 EcoRⅠ처리,

제 5열 및 제 6열 ; 제한효소 HindⅢ 처리

도 3a는 바실러스 투린지엔시스 케냐에 및 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주로 부터의 PCR 산물의 전기영동 사진이다.

M ; 1 kb DNA 래더(ladder),

제 1열 ; 바실러스 투린지엔시스 케냐에 균주,

제 2열 ; 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주

도 3b는 상기 PCR 산물에 제한효소를 처리한 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphysm) 전기영동 사진이다.

M ; 100 bp DNA 래더

제 1열, 제 2열 및 제 3열 ; 바실러스 투린지엔시스 케냐에 균주,

제 4열, 제 5열 및 제 6열 ; 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주,

제 1열 및 제 4열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 ClaⅠ 동시처리,

제 2열 및 제 5열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 PstⅠ 동시처리,

제 3열 및 제 6열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 XbaⅠ 동시처리,

도 4는 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주 유래 내독소 단백질 유전자의 제한효소 패턴 전기영동 사진이다.

M ; 100 bp DNA 래더,

제 1열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 ClaⅠ 동시처리,

제 2열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 PstⅠ 동시처리,

제 3열 ; 제한효소 EcoRⅠ과 XbaⅠ 동시처리.

본 발명은 나비목 해충에 살충효과를 보이는 신규한 내독소 단백질 유전자를 보유한 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis, 이하 '비티'라 약칭함) 케이-3 균주 및 상기 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.

비티 균주는 그람 양성의 토양세균으로서 농작물, 산림 및 위생 해충의 방제에 유용한 생물 농약으로 잘 알려져 있다. 생장조건이 악화되면 비티 균주는 내생 포자와 함께 내독소 단백질을 생산하는데, 이러한 내독소 단백질은 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등과 같은 다양한 목의 곤충에 대해 강력한 독성을 가지므로, 비티 균주 및 이들이 생산하는 내독소 단백질은 유용한 미생물 살충제로 사용될 수 있다.

비티 균주를 이용한 무공해 미생물 농약제제는 이미 오래 전부터 미국 등의 선진국에서 개발되어 상업화되어 왔으며, 우리나라에서도 슈리사이드(산도스사, 미국), 센타리(애보트사, 미국) 등이 수입되어 시판되고 있다. 미생물 살충제에 도입된 비티 아종에는 투린지엔시스(thuringiensis), 쿠르스타키(kurstaki), 덴드로리무스(dendrolimus), 갈레리에(galleriae), 이스라엘렌시스(israelensis), 아이자와이(aizawai), 테네브리오니스(tenebrionis) 등이 있으며, 나비목, 파리목, 딱정벌레목 등의 해충 방제에 이용되고 있다.

또한, 최근에는 비티 균주에 대한 숙주범위의 확대와 독성 증진을 위한 분자유전학적 연구와 더불어 새로운 비티 균주의 분리가 계속 시도되고 있다.

현재까지 보고 된 바에 따르면, 비티 균주는 자연 환경에서 매우 다양하게 분포되어 있다. 특히 비티 균주는 세계 각국의 여러 토양에서 분리되고 있고[DeLucca et al., Can. J. Microbiol., 1981, 27, 865-870; Martin & Travers, Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55, 2437-2442; Ohba & Aizawa, J. Invertebr. Pathol., 1986, 47, 12-20], 모기 유충에 독성이 강한 비티 아종 이스라엘렌시스[B.t subsp. israelensis]는 이스라엘의 사막의 연못에서 분리된 바 있으며[Goldberg & Margalit, Mosq. News, 1977, 37, 355-358], 딱정벌레목에 독성이 강한 비티 아종 테네브리오니스[B.t subsp. tenebrionis]는 죽은 유충에서 분리되었다(Krieg et al., J. Appl. Bacteriol., 1983, 96, 500-508]. 이외에도 몇몇 비티 균주는 저장작물에서 분리되거나[DeLucca et al., Can. J. Microbiol., 1982, 28, 452-456], 잎 표면에서 분리된 경우도 보고 된 바 있다[Smith & Couche, Appl. Environ. Microbiol., 1991, 57, 311-315].

현재까지 보고 된 비티 내독소 단백질 유전자의 수는 179개에 이르고 있으며, 비티 균주는 살충성 내독소 단백질을 만드는 내독소 단백질 유전자를 1개에서 많게는 3∼5개씩 보유하고 있는 것으로 알려져 있다[Aronson et al., Microbiol. Rev., 1986, 50, 1-24]. 일반적으로 비티 균주에 포함된 내독소 단백질 유전자의 수 및 종류는 다양한 것으로 알려져 있는데, 이들 유전자들은 각기 독성범위 및 발현정도가 달라 비티 균주 자체의 독성범위 및 독성효과를 특정 짓는 역할을 하게 된다.

한편, 그린라운드 선언 중 농업환경 분야에서는 유기합성 농약의 남용에 의한 환경오염과 생태계 파괴 등이 문제점으로 제기됨에 따라 유기합성농약의 사용을 매년 30% 감소시키기로 의결한 바 있는데, 이러한 추세에 따라 미생물 등을 포함하는 생물 농약은 유기합성 농약을 대체할 농약으로 기대되고 있다. 생물농약 중에서도 비티 균주를 사용한 살충제제는 균체 내 내독소 단백질이 수 시간 내에 해충을 사멸시킬 수 있어 유기합성농약과 경쟁할 수 있는 살충력을 가지므로, 미생물 살충제 중에서도 가장 각광을 받고 있다.

이에, 본 발명자들은 종래에 보고 된 비티 균주와는 다른 특성을 가지는 새로운 강독성 비티 균주를 이용한 미생물 살충제를 개발하기 위하여 우리나라의 토양에서 해충에 대해 강독성을 보이는 비티 균주를 지속적으로 분리ㆍ동정한 결과, 나비목의 해충에 대하여 강력한 살충작용을 보이는 신규한 비티 균주를 분리하였고, 상기 균주로부터 기존에 보고 되어 있지 않은 내독소 단백질 유전자를 확인하였고 이로부터 생성된 내독소 단백질 및/또는 균주를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제가 살충제로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 나비목 해충에 살충효과를 보이는 신규한 내독소 단백질 유전자를 보유한 비티 케이-3 균주, 상기 비티 케이-3 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 나비목 곤충에 대하여 살충 활성을 가지는 신규한 비티 케이-3 균주(수탁번호 ; KCTC 10557BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 분리되며 살충 활성을 가지는 신규한 내독소 단백질 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 해충에 대하여 살충 활성을 가지는 비티 케이-3 균주(수탁번호 ; KCTC 10557BP)를 제공한다. 상기에서, 해충은 나비목에 속하는 해충인 것이 바람직하지만, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 균주는 전라북도 남원 지역에서 채취한 토양시료로부터 분리ㆍ동정되었으며, 영양 평판 배지(Nutrient agar)에 도말한 후 생성된 콜로니들 중 내독소 단백질 유전자를 형성하는 균주로부터 선발되었다. 선발된 균주를 일차적으로 동정하 기 위하여, 알려진 33가지의 비티 편모항체에 대한 편모항원성을 조사한 결과, 본 발명의 균주는 비티 케냐에(kenyae) 균주의 경우와 동일한 편모응집 반응을 보이는 것이 확인되었다(표 1 참조). 또한, 상기 균주의 플라스미드 패턴을 동일한 편모응집반응을 보인 비티 케냐에 균주의 플라스미드 DNA 패턴과 비교해 본 결과, 이들 플라스미드 DNA 패턴 사이에는 많은 차이가 있었다(도 2 참조). 따라서 본 발명의 균주는 비티 케냐에 균주와는 다른 아종의 균주임을 알 수 있었다.

본 발명자들은 상기 균주를 "바실러스 투린지엔시스 케이-3" 균주라 명명하고, 이를 2003년 12월 4일 자로 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호 : KCTC 10557BP).

또한, 본 발명은 상기 균주로부터 분리되며 살충 활성을 가지는 신규한 내독소 단백질 유전자를 제공한다.

본 발명의 비티 케이-3 균주 유래의 내독소 단백질 유전자는 각각 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 것이 바람직하다.

도 1은 비티 케이-3 균주의 자가분해(autolysis) 전(A) 및 자가분해 후(B)의 위상차 현미경 사진으로서, 본 발명의 비티 케이-3 균주 유래의 내독소 단백질은 윤곽이 뚜렷한 이중 피라미드형의 결정체 구조를 가지며, 이는 나비목의 곤충에 독성을 갖는 내독소 단백질 유전자의 전형적인 형태로써 이전의 보고들과 일치하는 구조이 다[Whiteley & Schnepf, Ann. Rev. Microbiol., 1986, 40, 549-576].

본 발명의 비티 케이-3 균주 및 상기 균주에 의해 생산되는 내독소 단백질의 살충성을 나비목 곤충 중 가장 감수성이 높은 것으로 알려진 누에(Bombyx mori)와 파리목 해충인 빨간집 모기(Culex pipiens)에 대해 조사한 결과, 본 발명의 비티 케이-3 균주는 나비목 곤충에 대해서는 높은 독성을 보이나, 파리목 해충에 대해서는 상대적으로 낮은 독성을 가지는 것으로 확인되었다(표 2 참조). 비티 케이-3 균주의 경우 이중 피라미드 형태의 내독소 결정체를 형성하는데, 이러한 이중 피라미드 형태의 결정체는 나비목 해충에 대하여 독성을 갖는 cry1 유형의 내독소 단백질과 파리목 해충에 대하여 독성을 갖는 cry4 유형의 내독소 단백질에 의하여 생성되는 것으로 보고 된 바 있다[Whiteley & Schnepf, Ann. Rev. Microbiol., 1986, 40, 549-576]. 그러나 상기 결과에서 본 발명의 비티 케이-3 균주는 나비목 곤충에 비해 파리목 해충인 빨간집 모기 유충에 대하여 그다지 높은 살충성을 보이지 않은 것으로 볼 때, 본 발명의 균주는 주로 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자를 보유한 것으로 추정된다.

비티 케이-3 균주에는 3 종류의 cry1 유형의 유전자가 존재하며(도 3a 및 도 3b 참조), 클로닝된 유전자의 제한효소 패턴을 확인한 결과, 그 중 하나는 종래에 보고 된 cry1Ja 유전자와 동일하나 나머지 두 유전자는 종래에 보고 된 내독소 단백질 유전자와는 전혀 다른 제한효소 패턴을 보임으로써 새로운 내독소 단백질 유전자임 을 확인하였다(도 4 참조).

비티 케이-3 균주 유래의 새로운 내독소 단백질 유전자를 더욱 자세히 조사하기 위하여 상기에서 클로닝된 유전자들의 DNA 염기서열을 분석한 결과, 그 중 하나는 제한효소 패턴에서의 결과와 같이 종래에 보고 된 cry1Ja 유전자임이 확인되었다. 그러나, 다른 두 가지 유전자는 서열번호 3 및 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지며, 각각 cry1Ac 유전자와 87.6%의 상동성을 보이고 cry1Ae 유전자와 89.6%의 상동성을 보였다. 진뱅크 데이터베이스(Genbank data base)로 검색한 결과, 비티 케이-3 균주로부터 유래한 본 발명의 두 가지 신규한 내독소 단백질 유전자의 염기서열은 아직 보고된 바 없는 새로운 내독소 단백질 유전자로 확인되었다.

또한, 본 발명은 상기 균주 및/또는 내독소 단백질을 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제를 제공한다. 또한, 상기 해충은 나비목에 속하는 해충인 것이 바람직하지만, 반드시 여기에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 미생물 제제에 이용되는 비티 케이-3 균주 및 상기 균주 유래의 내독소 단백질은 해충, 바람직하게는 나비목에 속하는 해충에 대해 강력한 살충효과를 갖고 있으므로, 이를 이용하는 미생물 제제는 작물에 발생하는 해충을 방제하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 미생물 제제를 적용할 수 있는 작물은 특별히 제한되지는 않으며, 배추, 양배추, 오이, 무, 들깨, 고추, 결구상추(양상추), 딸 기, 토마토 등의 경제작물 이외에도 화훼 또는 특용작물에도 적용할 수 있다.

본 발명의 비티 케이-3 균주를 함유하는 해충 방제용 미생물 제제, 더욱 바람직하게는 나비목 해충 방제에 유용한 미생물 제제는 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말 5 내지 90 중량%에 계면활성제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제 등을 혼합하여 미생물 살충제 조성물로 제조하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 제 1 실시형태에 따르면 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말 5 내지 60 중량%에 0 내지 40 중량%의 무기염류, 5 내지 30 중량%의 계면활성제, 잔량으로서의 증량제를 균일하게 혼합하고 분쇄하여 수화제로 제조하여 이루어진다.

상기 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말은 해충에 직접적인 활성을 나타내는 역할을 하는 것으로 내생 포자와 독소로 이루어져 있으며, 비티에 의해 생성된 독소가 해충의 중장에서 강알칼리 소화액과 단백질 분해효소에 의해 활성화된 후 중장벽에 구멍을 형성하여 혈림프와 중장사이에 형성된 삼투압의 붕괴를 통해 패혈증을 유발함으로써 살충작용을 나타낸다.

상기 비티 케이-3 균주의 배양액 및 비티 케이-3 균주의 건조된 분말은 1.0 × 10⁶ 내지 1.0 × 10¹¹ spores/ml(g)의 포자수로 이루어진다.

상기 무기염류는 비티 케이-3 내독소 단백질과 함께 해충의 중장에 들어가서 독소 단백질이 빠르게 활성독소의 형태로 전환되는 것을 도와주거나 중장벽에 물리적인 상처를 주어 독소의 활성을 증진시킬 뿐만 아니라 해충의 체내에서 생리적인 변화를 유도하여 독소의 작용효과를 높일 수 있도록 작용하는 물질로서 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 구입하여 사용할 수 있는 것이다.

상기 계면활성제는 분자 중에 친수성 분자단과 친유성 분자단을 동시에 갖는 양친매성 물질로서, 세정력, 분산력, 유화력, 가용화력, 습윤력, 살균력, 기포력 및 침투력이 우수하다는 특징으로 갖는 것으로 이해되는 물질로서, 본 발명에 따른 미생물 살충제 조성물 중의 비티가 효과적으로 약효를 발현하도록 수화, 현탁, 분산시키는 작용을 하는 것으로 이해될 수 있다.

상기 계면활성제로는 알킬벤젠설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트, 디알킬설포석시네이트, 리그닌설포네이트, 알킬나프탈렌설포네이트포르마린축합물, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설포네이트와 같은 설포네이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬설페이트, 폴리옥시알킬렌알킬페닐설페이트와 같은 설페이트의 나트륨염 또는 칼슘염, 나프탈렌설포석시네이트, 폴리옥시알킬렌석시네이트와 같은 석시네이트의 나트륨염 또는 칼슘염 등의 음이온성 계면활성제, 에톡실화 알킬에테르, 폴리옥시알킬렌알킬페닐폴리머, 다중 알코올과 같은 비이온성 계면활성제가 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있으며, 이들은 모두 예시적으로 열거한 것들로서 이들 이외의 계면활성제가 사용될 수 있음은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 용이하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 증량제는 상기 계면활성제와 함께 사용되어 상기 계면활성제를 흡착, 분상화 하고, 이 계면활성제, 약효 증진제, 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말과 함께 비티제 조성물의 미립자 표면을 이루는 물질로 기능하며, 전분, 대두박, 밀기울, 입상 섬유질, 유안, 규조토, 제올라이트, 벤토나이트, 탈크, 카올린, 파이로필라이트, 화이트카본 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 제 2 실시형태에 따르면 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말 5 내지 60 중량%에 0 내지 40 중량%의 무기염류, 5 내지 30 중량%의 계면활성제, 1 내지 10 중량%의 결합제 및 잔량으로서의 증량제를 균일하게 혼합하고 분쇄하여 반죽한 후 조립기를 통하여 사출, 건조하여 과립수화제로 제조하여 이루어진다.

상기 비티 케이-3 균주의 배양액 및 건조분말은 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 상기 수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로 이해될 수 있으며, 상기 수화제 조성물과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제는 본 발명에 따른 비티 함유 미생물 살충제 조성물 과립수화제를 수화, 현탁, 분산, 붕괴시키는 작용을 하는 것으로서, 상기 본 발명의 수화제 조성물에서 제시된 계면활성제들과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 무기염류 및 증량제는 상기 본 발명의 수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로서, 상기 수화제 조성물에서 제시된 무기염류 및 증량제들과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 결합제는 상기 활성성분인 비티 균주의 건조분말을 포함하여 약효 증진제, 증 량제 등을 서로 결합시키는 역할을 하는 것으로서, 수용성 전분, 덱스트린, 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴산나트륨, 폴리비닐알코올, 아라비아검 또는 잔탄검 등이 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 제 3의 실시형태에 따르면 비티 케이-3 균주의 배양액 또는 건조분말 5 내지 50 중량%에 0 내지 30 중량%의 무기염류, 5 내지 30 중량%의 계면활성제, 1 내지 10 중량%의 증량제 및 잔량으로서의 물을 혼합한 혼합물을 습식 분쇄하여 수득한 70 중량%의 분쇄부와 1 내지 20 중량%의 결합제, 1 내지 20 중량%의 동결방지제 및 잔량으로서의 물을 혼합한 30 중량%의 증점부를 균일하게 혼합하여 분산시켜 액상수화제로 제조하여 이루어진다.

상기 비티 케이-3 균주의 배양액 및 건조분말은 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 상기 수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로 이해될 수 있으며, 상기 수화제 조성물과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제는 본 발명에 따른 비티 함유 미생물 살충제 조성물 액상수화제를 수화, 현탁, 분산, 붕괴시키는 작용을 하는 것으로서, 상기 본 발명의 수화제 조성물에서 제시된 계면활성제들과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 결합제, 무기염류 및 증량제는 상기 본 발명의 액상수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로서, 상기 액상수화제 조성물에서 제시된 무기염류 및 증량제들과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 동결방지제는 상기 물을 포함하는 액상수화제 조성물 중, 물의 동결을 방지하 여 조성물 전체의 동결을 방지하는 것으로서 글리콜류의 동결방지제가 단독 또는 2종 이상 혼합되어 사용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 제 4 실시형태에 따르면 비티 케이-3 균주의 배양액 5 내지 90 중량%에 1 내지 5 중량%의 무기염류, 1 내지 10 중량%의 계면활성제 및 잔량으로서의 물을 혼합한 혼합물을 습식 분쇄한 분쇄부에 0.1 내지 3 중량%의 결합제, 0.1 내지 5 중량%의 동결방지제 및 잔량으로서의 물을 혼합하여 분산시켜 액상수화제로 제조하여 이루어진다.

상기 배양액은 본 발명의 제 1 실시형태에 따른 상기 액상수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로 이해될 수 있으며, 상기 액상수화제 조성물과 동일한 것이 사용될 수 있다.

상기 계면활성제, 결합제, 무기염류, 동결방지제 및 증량제는 상기 본 발명의 제 3 실시형태의 액상수화제 조성물에서와 동일한 작용을 하는 것으로서, 상기 조성물에서 제시된 것들과 동일한 것이 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 비티 케이-3 균주의 분리

전라북도 남원 지역에서 채취한 토양시료 1 g을 멸균 증류수 10 ㎖에 넣고 2분 동안 강하게 교반하였으며, 65℃에서 30분 동안 중탕한 후 10^-3 CFU/㎖ 농도로 희석하였다. 희석액 300 ㎕를 영양 평판배지(Nutrient agar)에 도말하고 30℃에서 3일간 배양한 후, 형성된 콜로니들 중에서 콜로니의 외형이 비티와 유사한 콜로니들에 대해서 위상차현미경으로 내독소 단백질과 포자의 형성여부를 관찰하였다. 내독소 단백질을 형성하는 콜로니를 비티 균주로 선발하여 순수 배양하고 4℃에 보관하였다.

<실시예 2> 비티 균주의 편모항원성 검정

상기 실시예 1에서 분리된 비티 균주를 일차적으로 동정하기 위하여, 알려진 33가지의 비티 편모항체에 대한 편모항원성을 오바 등의 방법[Ohba & Aizawa, J. Invertebr. Pathol., 1978, 32, 303-309]에 따라 조사하였다. 구체적으로, 비티 균주를 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물 및 1% 염화나트륨)에 접종하여 30℃, 100 rpm으로 12시간 동안 배양하였고, 상기 배양액에 100배 희석한 비티 편모항체 희석액을 동량으로 가한 후, 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 응집 반응 여부를 조사하였다.

그 결과, 본 발명의 비티 균주는 비티 케냐에(kenyae) 균주의 경우와 동일한 편모응집 반응을 보이는 것을 확인하였다(표 1).

편모 항원성	아종	응집 반응
1	투린지엔시스(thuringiensis)	-
2	피니티무스(finitimus)	-
3a	알레스티(alesti)	-
3a3b	쿠르스타키(kurstaki)	-
4a4b	소토(sotto)	-
4a4c	케냐에(kenyae)	+
5a5b	갈레리에(galleriae)	-
6	엔토모시두스(entomocidus)	-
7	아이자와이(aizawai)	-
8a8b	모리소니(morrisoni)	-
8a8c	오스트리니에(ostriniae)	-
8a8d	니거리엔시스(nigeriensis)	-
9	톨워티(tolworthi)	-
10	담스타디엔시스(darmstadiensis)	-
11a11b	토우마노피(toumanoffi)	-
11a11c	규수엔시스(kyushuensis)	-
12	톰프소니(thompsoni)	-
13	파키스타니(pakistani)	-
14	이스라엘렌시스(israelensis)	-
15	다코타(dakota)	-
16	인디아나(indiana)	-
17	토호구엔시스(tohokuensis)	-
18	쿠마모토엔시스(kumamotoensis)	-
19	토키지엔시스(tochigiensis)	-
20a20b	윤나넨시스(yunnanensis)	-
20a20c	폰디케리엔시스(pondicheriensis)	-
21	콜메리(colmeri)	-
22	산도지엔시스(shandogiensis)	-
23	자포넨시스(japonensis)	-
24	네오레오넨시스(neoleonensis)	-
25	코레아넨시스(coreanensis)	-
26	실로(silo)	-
27	멕시카넨시스(mexicanensis)	-

상기 결과로부터, 본 발명자들은 상기에서 선별된 비티 균주를 비티 아종 케냐에 균주에 속한다고 동정하였고, 이를 "비티 케이-3 균주"라 명명하였다. 본 발명자들은 상기 비티 케이-3 균주를 2003년 12월 4일자로 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(수탁번호 ; KCTC 10557BP).

<실시예 3> 비티 케이-3 균주가 생산하는 내독소 단백질의 분석

상기 실시예 2에서 동정된 비티 케이-3 균주에 대하여, 포자형성이 이루어진 배양액에 존재하는 내독소 단백질의 크기와 형태를 위상차 현미경으로 관찰하였다. 이를 위하여, 비티 케이-3 균주의 단일 콜로니를 100 ㎖의 GYS 배지[0.1% 포도당, 0.2% 효모추출물, 0.05% 인산제일칼륨, 0.2% 황산암모늄, 0.002% 황산마그네슘, 0.005% 황산망간, 0.008% 염화칼슘; Nickerson et al., Appl. Environ. Microbiol., 1974, 28, 124-128]에 접종하여 30℃, 150 rpm에서 진탕배양한 후 시료로 사용하였다. 멸균된 증류수로 현탁한 시료를 슬라이드 글래스 위에 떨어뜨린 후 커버 글래스를 덮고, 유화 오일(emulsion oil) 상에서 위상차 현미경(Nikon Optiphot-2)을 이용하여 1,000배의 배율로 관찰하였다.

그 결과, 비티 케이-3 균주 유래의 내독소 단백질은 윤곽이 뚜렷한 이중 피라미드형의 결정체 구조를 가짐을 확인하였다(도 1). 상기 구조는 나비목에 독성을 갖는 내독소 단백질의 전형적인 형태로써 이전의 보고들과 일치하는 구조이다[Whiteley & Schnepf, Ann. Rev. Microbiol., 1986, 40, 549-576].

<실시예 4> 비티 케이-3 균주의 플라스미드 분석

비티 케이-3 균주의 플라스미드 DNA를 개량된 알칼리 용해방법[Birnboim et al., Nucleic Acids Res., 1979, 7, 1513-1523]에 따라 분리하였다. 구체적으로, 비티 케이-3 균주를 LB 배지 50 ㎖에 접종하고 27℃에서 12시간 동안 배양시켰다. 상기 배양액 2.5 ㎖를 250 ㎖의 SPY 배지(0.2% 황산암모늄, 1.4% 인산제일칼륨, 0.6% 인 산제이칼륨, 0.1% 구연산 나트륨, 0.2% 황산마그네슘, 0.1% 효모추출물 및 0.1% 포도당)에 다시 접종하고 600 nm에서의 흡광도 값이 0.7이 될 때까지 27℃에서 배양하였다. 배양액을 5,000 × g에서 5분간 원심 분리하여 균체를 수확하고, 여기에 용액 Ⅰ(50 mM 포도당, 25 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM EDTA) 10 ㎖를 가한 후 볼텍스믹서 (vortex mixer)를 사용하여 교반하였다. 여기에 라이소자임(lysozyme)을 최종 농도 50 ㎎/㎖로 가하고 혼합한 후 실온에서 20분간 정치하였다. 사용 전에 제조한 용액 Ⅱ(0.2 N 수산화나트륨, 1% SDS) 20 ㎖을 첨가해서 용액을 균질화시킨 다음 얼음 속에 10분간 정치하였다. 여기에 용액 Ⅲ(5 M 초산칼륨 60 ㎖, 빙초산 11.5 ㎖, 멸균증류수 28.5 ㎖) 15 ㎖을 가하여 천천히 혼합하고 10분간 정치한 다음 상온에서 10,000 rpm으로 10분간 원심분리 하였다. 상등액에 2배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70℃에서 20분간 정치시킨 뒤, 12,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 침전물을 얻은 후 건조시켰다.

건조된 침전물에 TE 완충액(10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA) 8 ㎖을 가하고 잘 녹인 후, RNase A를 최종 농도 10 ㎍/㎖로 첨가하고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액에 페놀 용액을 처리하여 단백질을 제거하고, 상등액에 클로로포름 (chloroform)과 이소아밀알콜(isoamylalcohol)이 24:1로 혼합된 용액을 동량으로 처리하고 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상기 상등액에 두배 부피의 99% 에탄올을 가하고 -70℃에 20분간 정치한 후, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리하였다. 침전물을 70% 에탄올로 3회 세척한 후 건조시켰다. 침전물에 TE 완충액 100 ㎕을 가하고 잘 녹인 후, 260 nm에서 흡광도를 측정하여 DNA의 순수도와 농도를 측정하 였다. 그 후 DNA 1 ㎍를 0.7% 아가로스 겔에서 전기영동하여 플라스미드 DNA 패턴을 확인하였다. 본 실험에서 비교군으로는 비티 케냐에 균주를 사용하였다. 제한효소를 처리한 플라스미드 DNA 패턴은 각 균주로부터의 DNA 1 ㎍에 5 유니트(unit)의 EcoRⅠ 또는 HindⅢ(Roche 사)를 제조사의 방법에 따라 처리하고 37℃에서 한 시간 동안 효소반응을 시킨 후 0.7% 아가로스 겔에 전기영동하였다.

그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 비티 케이-3 균주의 플라스미드 패턴은 실시예 2에서 본 발명의 균주와 동일한 편모응집반응을 보였던 비티 케냐에 균주의 플라스미드 DNA 패턴과는 차이를 보였다. 상기 결과로부터, 본 발명의 비티 케이-3 균주는 비티 케냐에 균주와는 다른 아종의 균주임을 확인하였다.

<실시예 5> 비티 케이-3 균주의 살충효과 측정

비티 케이-3 균주의 살충성을 나비목 곤충 중 가장 감수성이 높은 것으로 알려진 누에(Bombyx mori)와 파리목 해충인 빨간집 모기(Culex pipiens)에 대해 조사하였다. 먼저, 누에에 대한 살충성은 비티 케이-3 균주를 GYS 배지에 접종하여 포자와 내독소 단백질이 형성되고 영양세포가 자연분해(autolysis) 될 때까지 30℃에서 5일간 배양하였다. 배양액을 수거한 후 포자의 농도를 10⁷ 포자/㎖로 희석하고, 상기 접종원을 인공사료(1 ㎝ × 1 ㎝ × 0.5 ㎝)에 첨가하였다. 누에 유충 20 마리를 각 처리구에 3반복으로 접종하고 25℃에서 사육하면서 72시간 동안의 치사율을 조사하였다. 다음으로, 빨간집 모기에 대한 살충성은 비티 케이-3 균주 배양액을 10^-6 CFU/㎖으로 희석하고, 희석액 20 ㎖에 빨간집 모기 유충 20 마리를 접종한 후그 치사성을 관찰하였다.

그 결과, 누에 및 빨간집 모기에 대한 생물검정 결과 비티 케이-3 균주는 나비목 곤충에 대해서는 높은 독성을 보이나, 파리목 해충에 대해서는 상대적으로 낮은 독성을 가지는 것으로 확인되었다(표 2). 비티 케이-3 균주의 경우 실시예 3에서 이중 피라미드 형태의 내독소 결정체를 형성하는 것이 확인되었는데, 이러한 이중 피라미드 형태의 결정체는 나비목 해충에 대하여 독성을 갖는 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자와 파리목 해충에 대하여 독성을 갖는 cry4 유형의 내독소 단백질 유전자에 의하여 생성되는 것으로 보고 된 바 있다[Whiteley & Schnepf, Ann. Rev. Microbiol., 1986, 40, 549-576]. 그러나 상기 실험 결과로부터 본 발명의 비티 케이-3 균주는 나비목 곤충에 비해 파리목 해충인 빨간집 모기 유충에 대하여 그다지 높은 살충성을 보이지 않은 것으로 보아 주로 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자로부터 합성된 단백질로 추정되었다.

	치사율 (%)
	누에	빨간집 모기
비티 케이-3	95	37.5

<실시예 6> 비티 케이-3 균주의 내독소 단백질 유전자 조성 확인

비티 케이-3 균주 내에 존재하는 비티 내독소 단백질의 유전자 조성을 PCR-RFLP 방법[Kuo and Chak, Appl. Environ. Microbiol., 1996, 62, 1369-1377]을 이용하여 확인하였다. PCR-RFLP 방법은 가장 손쉽게 비티 균주의 내독소 단백질 유전자 조성을 확인하는 방법 중 하나로 실시방법은 다음과 같다. 먼저, 나비목 해충에 대해 독성을 갖는 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자를 확인하기 위하여 서열번호 1로 기재되는 프라이머 K5un2 및 서열번호 2로 기재되는 프라이머 K3un2를 사용하였다. 상기 프라이머는 종래에 알려진 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자의 염기서열을 비교하여 가장 상동성이 높은 부위를 대상으로 고안된 것으로 거의 모든 cry1 유형의 내독소 단백질 유전자를 검출할 수 있는 프라이머이며, 예상되는 PCR 산물의 크기는 약 1.65 kb 이다.

비티 케이-3 균주의 cry1 유전자형을 분석하기 위하여, 비티 균주의 플라스미드 DNA를 분리하고 이를 주형으로 하여 상기 프라이머들과 함께 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 플라스미드 DNA 250 ng, 각 프라이머 100 pM과 Pyrobest ^ⓡ DNA 중합효소(TaKaRa Shuzo 사) 5 ㎕를 넣고 증류수를 이용하여 전체 부피를 100 ㎕로 조정한 후 실시하였다. 시료의 증발을 방지하기 위해서 미네랄 오일을 한 방울 떨어뜨리고 DNA Thermal Cycler로 변성(denaturation)을 94℃에서 1분간, 어닐링(annealing)은 52℃에서 2분간 그리고 연장(extension)은 72℃에서 1분간씩 35회 반복조건을 설정하여 수행하였다. PCR 반응이 종료된 후, 각 반응 산물에 제한효소를 처리한 후 3% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동 하여 RFLP 패턴에 따라 유전자형을 확인하였다. 본 실험에서 비교군으로는 비티 케냐에 균주를 사용하였다. 제한효소 처리는 PCR 증폭된 DNA 1 ㎍에 5 유니트(unit)의 EcoRⅠ과 ClaⅠ, EcoRⅠ과 PstⅠ 또는 EcoRⅠ과 XbaⅠ(Roche 사)을 각각 제조사의 방법에 따라 동시 처리하고 37℃에서 한 시간 동안 효소반응을 시켰다.

그 결과, 본 발명의 비티 케이-3 균주의 내독소 단백질 유전자 조성은 비교군인 케냐에 균주의 경우와 상이하였다. 비교군으로 사용된 비티 케냐에 균주의 경우 cry1Ab, cry1Ac 및 cry1E 유전자를 가지고 있다는 기존의 보고[Masson et al., Appl. Environ. Microbiol., 1992, 58, 642-646]와 일치하는 RFLP 패턴을 보였으나, 비티 케이-3 균주의 RFLP 패턴은 케냐에 균주뿐만 아니라 이미 알려진 비티 균주 중 어느 것과도 일치하지 않았으며, 이러한 결과는 본 발명의 비티 케이-3 균주가 아직까지 보고 된 바 없는 신규한 내독소 단백질 유전자를 보유하고 있음을 의미한다(도 3a 및 도 3b).

<실시예 7> 비티 케이-3 균주의 내독소 단백질 유전자 염기서열 확인

비티 케이-3 균주 유래의 내독소 단백질 유전자를 확인하기 위하여, 실시예 6에서 증폭된 PCR 산물을 제조사의 지침에 따라 pGemT-Easy PCR 클로닝 벡터(Promega 사)에 클로닝한 결과, 3 종류의 cry1 유형의 유전자가 존재함을 확인하였다. 클로닝 된 유전자에 대해 EcoRⅠ과 ClaⅠ, EcoRⅠ과 PstⅠ 및 EcoRⅠ과 Xba Ⅰ 제한효소를 동시처리하여 그 패턴을 확인한 결과, 그 중 하나는 종래에 보고된 cry1Ja 유전자와 동일하였으나 나머지 두 유전자는 종래에 보고된 내독소 단백질 유전자와는 전혀 다른 제한효소 패턴을 보임으로써 새로운 내독소 단백질 유전자임을 확인하였고, 이들을 각각 "cry1-208" 및 "cry1-210"으로 명명하였다(도 4).

비티 케이-3 균주 유래의 새로운 내독소 단백질 유전자를 더욱 자세히 조사하기 위하여 상기에서 클로닝된 cry1 유전자들의 DNA 염기서열을 분석한 결과, 그 중 하나는 제한효소 패턴에서의 결과와 같이 종래에 보고 된 cry1Ja 유전자임을 확인하였다. 또한, cry1-208 유전자는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 가지며 cry1Ac 유전자와 87.6%의 상동성을 보였고, cry1-210 유전자는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지며 cry1Ae 유전자와 89.6%의 상동성을 보였다. 진뱅크 데이터베이스(Genbank data base)로 검색한 결과, 비티 케이-3 균주로부터 유래한 본 발명의 cry1-208 및 cry1-210 내독소 단백질 유전자의 염기서열은 아직 보고 된 바 없는 새로운 내독소 단백질 유전자로 확인되었다.

상기 비티 케이-3 균주 및 상기 균주에 의해 생산되는 내독소 단백질 유전자를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제에 대한 구체적인 실시예는 하기와 같다.

<실시예 8>

30 kg의 비티 케이-3 균주의 건조분말에 10 kg의 에톡실화 알킬 에테르, 5 kg의 테트라메틸-5-데실-4,7-디올, 30 kg의 화이트카본 및 25 kg의 제올라이트를 균일하게 혼합하고 분쇄하여 수화제 형태의 미생물 살충제 조성물을 제조하였다.

<실시예 9>

30 kg의 비티 케이-3 균주의 건조분말에 20 kg의 염화칼륨, 10 kg의 에톡실화 알킬 에테르, 5 kg의 테트라메틸-5-데실-4,7-디올, 10 kg의 화이트카본 및 25 kg의 제올라이트를 균일하게 혼합하고 분쇄하여 수화제 형태의 미생물 살충제 조성물을 제조하였다.

<실시예 10>

40 kg의 비티 케이-3 균주의 건조분말에 20 kg의 염화칼륨, 5 kg의 리그닌설페이트 나트륨염, 10 kg의 에톡실화 알킬 에테르, 5 kg의 덱스트린 및 20 kg의 화이트카본을 균일하게 혼합하고 분쇄한 후 적량의 물을 이용하여 반죽하고 과립제조기를 통하여 입경 1 mm로 사출시켜 통풍 및 건조하여 과립 수화제를 제조하였다.

<실시예 11>

40 kg의 비티 케이-3 균주의 건조분말에 5 kg의 리그닌설페이트 나트륨염, 10 kg의 에톡실화 알킬 에테르, 5 kg의 덱스트린, 20 kg의 화이트카본 및 20 kg의 탄산칼슘 을 균일하게 혼합하고 분쇄한 후 적량의 물을 이용하여 반죽하고 과립제조기를 통하여 입경 1 mm로 사출시켜 통풍 및 건조하여 과립 수화제를 제조하였다.

<실시예 12>

20 kg의 비티 케이-3 균주의 건조분말에 10 kg의 염화칼륨, 5 kg의 에톡실화 알킬에테르, 10 kg의 테트라메틸-5-데실-4,7-디올, 5 kg의 화이트카본 및 20 kg의 물을 혼합한 혼합물을 습식 분쇄하여 수득한 70 kg의 분쇄부에 10 kg의 덱스트린, 5 kg의 에틸렌글리콜 및 15 kg의 물을 혼합하여 수득한 30 kg의 증량부를 균일하게 혼합하고 고르게 분산시켜 본 발명에 따른 미생물 살충제의 액상 수화제를 제조하였다. 제조된 액상수화제를 생물시험에 사용하였다.

<실시예 13>

80 kg의 비티 케이-3 균주의 배양액에 2 kg의 염화칼륨, 5 kg의 테트라메틸-5-데실-4,7-디올 및 3 kg의 물을 혼합한 혼합물을 습식 분쇄한 분쇄부에 1 kg의 잔탄검, 2 kg의 에틸렌글리콜 및 7 kg의 물을 혼합하여 분산시켜 액상수화제로 제조하였다.

<실험예 1> 배추좀나방에 대한 약효

상기 실시예 8 내지 실시예 12에서 제조된 미생물 제제의 배추좀나방에 대한 방제효과를 확인하고자 하기와 같이 실험하였다.

배추를 밭 토양에 정식 후 배추좀나방 발생초기에 상기 실시예에서 제조된 미생물 제제를 희석배수에 따라 경엽 처리하였다. 약효판정은 약제처리 후 3 일차, 5 일차, 7 일차에 각각 조사하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

배추좀나방에 대한 약효조사결과

구 분	희석배수	사전밀도	방제효과(%)
			3 일차	5 일차	7 일차
실시예8	1000	72	76.1	94.6	98.9
실시예9	1000	56	72.5	95.2	97.8
실시예10	1000	69	74.9	96.7	99.4
실시예11	1000	53	73.7	95.7	98.5
실시예12	1000	55	70.9	91.1	98.2
실시예13	1000	55	70.6	89.7	97.3
슈리사이드	1000	61	80.3	95.8	98.4

상기 표에서 보는 바와 같이 본 발명에 따른 비티 케이-3 균주 및 독소단백질을 함유하는 미생물 제제는 기존의 화학농약인 슈리사이드와 대등한 약효의 살충제 효과를 보였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 비티 케이-3 균주 및 상기 균주에 의해 생산되는 내독소 단백질 나비목을 포함하는 해충의 유충에 대하여 강력한 살충 효과를 보이므로, 이를 포함하는 본 발명의 미생물 제제는 환경친화적인 미생물 제제로 서 작물에 미치는 영향을 최소화하고 작물에 발생하는 해충을 방제하는데 효과적으로 사용될 수 있다.

<110> DONGBU HANNONG CHEMICAL <120> BACILLUS THURINGIENSIS K-3 STRAIN HAVING GENES SHOWING INSECTICIDAL ACTIVITY FOR LEPIDOPTERAN LARVAE AND MICROBIOLOGICAL FORMULATION USING THE SAME <130> PA031218C01 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K5un2 primer <400> 1 aggaccagga tttacaggag g 21 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3un2 primer <400> 2 gctgtgacac gaaggatata gccac 25 <210> 3 <211> 1632 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis K-3 <400> 3 aggaccagga tttacaggag gggatattgt tcgaatggga gcagtgcacc aaatatatgc 60 aacggattta agtatgaatg ttcgacctag tgttgcattg agcagatatc ttataagact 120 tcgctatgct tgtaggggga gttcaaacat agttatacac ggtccttcta ttagatttgt 180 atcgctccca agtacaatga gtaatgatga acctttaaca tatcaatcat ttagatacgc 240 aagtatcaca actccaatta tccgtccaat atataacatg tttaatttat ctatatccag 300 aatttcaggt gtccaaaatt tgtttataga tcgaatagaa ttcattccag tagatgcaaa 360 cttcgaagca gaacgagatt tagagagagc gcagaaggcg gtgaatgctc tgtttacttc 420 cacaaaccaa agaggactaa aaatagatgt gactgactat catattgatc aagtatccaa 480 tttagttgat tgcttatcgg atgaattttg tcgggatgaa aagcgagaat tgtccgaaaa 540 atccaaacat gcgaagcgac tcagtgatga acgcaattta ctccaagatt taaatttcaa 600 agacattaat aggcaaccag aacgtggttg gagcggaagt acagggatta ccatccaagg 660 aggagatgac gtattcaaag agaattacgt tacactacca ggtacctttg atgagtgcta 720 tccaacatat ttgtatcaaa aaatcgatga atcaaaatta aaagcctata cccgctatca 780 attaagagga tacatcgaag atagtcaaga cttagaaatc tatttaattc gctacaatgc 840 aaaacatgag acagtaaatg ttcctggctc tggctcctta tggccacttt cagtcgaaag 900 ctcagttgga aaatgcggag agccaaatcg atgtgcatca cggatggaat ggaatcccga 960 cctagattgc tcgtgtaggg atggggagaa gtgtgcccat cattcccatc atttctcttt 1020 ggacattgat gtaggatgta cagacttaaa tgaggattta ggtgtatggg tgatattcaa 1080 gattaagaca caagatggcc atgcgaaaat aggaaatcta gaatttctca aagagaagct 1140 gttattagga gaagcattag cacgtgtgaa gaaagcggag aaaaaatgga gagacaaacg 1200 cgacaaattg gaatgggaaa caaatgttgt ttataaagag gcaaaagaat ctgtagatgc 1260 tttattcgta gattctcaat atagtagatt acaagcggat acgaacatcg caatgattca 1320 tgcggcagat aaacgcgttc atcgaattcg agaagcgtat ctcccagaac taactgtgat 1380 tccaggtgtc aatgcatcta ttttcgaaga attagaggga cgtattttca cagcgtattc 1440 cctatatggt gcaagaaatg tcataaaaaa tggcgatttc aataatggtt tatcttgctg 1500 gaacgtgaaa gggcatgtag aggtacaaca gattcatcat cgttcggttc ttgttgttcc 1560 aagttggaaa acagaagtat cacaagaggt gtgcgtctgt ccaggacgtg gctatatcct 1620 tcgtgtcaca gc 1632 <210> 4 <211> 1635 <212> DNA <213> Bacillus thuringiensis K-3 <400> 4 aggaccagga tttacaggag gagatatcct tcgtagaacg aatgctggta actttggaga 60 tgtacgagtc aatattgctg gatcattatc ccaaagatat cgcgtaagga ttcgttatgc 120 ttctactaca aatttacaat tccacacatc aattaacgga agagctatta atcaagcgaa 180 ttttccagca actatgaata taggtgctag cttaaactat agaaccttta gaactgtagg 240 atttacaact ccatttactt tttcagaagc atcaagcata tttacattaa gtactcattc 300 cttcagttca ggcaatgcag tttatataga tcgaattgaa tttgtcccgg cagaagtaac 360 attcgaggca gaatctgatc tagaaagagc acagaaggcg gtgaatgcgc tgtttacttc 420 ttccaatcaa atcggcttaa aaacagatgt gacggactat catattgatc aagtttccaa 480 tttagttgcg tgtttatcgg atgaattttg tctggatgaa aagcgagagt tgtccgagaa 540 agtcaaacat gcgaagcgac tcagtgatga gcgaaattta cttcaagatc caaacttcag 600 aggcatcaat agacaactag accgtggttg gagaggaagt acggatatta ccatccaagg 660 tggagatgac gtattcaaag agaattacgt cacactgccg ggtacctttg atgagtgcta 720 tccaacatat ttatatcaaa aaatagatga gtcgaaatta aaagcctata cccgctatga 780 attaagaggg tatattgaag atagtcaaga cttagaagtc tatttgatcc gttacaatgc 840 aaaacacgaa acgttaaatg tgccaggtac gggttcctta tggccacttg cagccgaaag 900 ttcaatcggg aggtgcggcg aaccgaatcg atgcgcgcca catattgaat ggaatcctga 960 cctagattgt tcgtgtaggg atggagaaaa atgtgcacat cattctcatc atttctcctt 1020 ggatattgat gttggatgta cagacttaaa tgaggattta ggtgtatggg tgatattcaa 1080 gattaagacg caagatggcc acgcaagact tggaaatcta gagtttctcg aagagaaacc 1140 attattagga gaagcgctag ctcgtgtgaa gagagcggag aaaaaatgga gagacaaacg 1200 cgacaaattg gaattggaaa caaatattgt ttataaagag gcaaaagaat ctgtagatgc 1260 tttattcgta gattctcaat ataatagatt acaaacggat acgaacattg cgatgattca 1320 tgcggcagat aaacgcgttc atcgaatccg agaagcgtat ctgccagagt tgtctgtaat 1380 tccgggtgtc aatgcggcta ttttcgaaga attagaaggt cttattttca ctgcattctc 1440 cctatatgat gcgagaaatg tcattaaaaa cggagatttc aatcatggtt tatcatgctg 1500 gaacgtgaaa gggcatgtag atgtagaaga acaaaataac caccgttcgg tccttgttgt 1560 cccggaatgg gaggcagaag tgtcacaaga agtccgcgta tgtccaggac gtggctatat 1620 ccttcgtgtc acagc 1635

Claims (6)

1. 해충에 대하여 살충 활성을 가지는 바실러스 투린지엔시스 케이-3 균주(수탁번호 ; KCTC 10557BP).
2. 제 1항에 있어서, 상기 해충이 나비목에 속하는 해충인 것을 특징으로 하는 상기 균주.
3. 삭제
4. 제 1항의 균주로부터 유래되며 서열번호 3 또는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 살충 활성을 가지는 내독소 단백질 유전자.
5. 제 1항의 균주 또는 제 4항의 내독소 단백질 유전자를 유효성분으로 함유하는 해충 방제용 미생물 제제.
6. 제 5항에 있어서, 상기 해충이 나비목에 속하는 해충인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.

Images