JPH04229170A - 線虫類に対して活性のある新規なバシラス・スリンギエンシス微生物及びそれをコードしたポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明は、線虫類に対して活性の
ある新規なバシラス・スリンギエンシス微生物、及びバ
シラス・スリンギエンシス分離体からクローン化された
新規な線虫類活性毒素をコード化した遺伝子に関する。

【従来の技術】望んでいない生物の防除に化学薬品を定
期的に使用すると、薬剤耐性種ができてくる。これは経
済的に重要な昆虫の多くの種で起きており、また羊、や
ぎ、馬の線虫類にも起きている。薬剤耐性の発達により
、異なる作用方式をもった新しい防除剤を絶えず探求す
る必要がある。最近、線虫類の防除について認められた
方法は、ベンズイミダゾールという薬剤とその同類を中
心としている。これらの薬剤を大規模に使用したことで
、線虫類に多くの耐性種がもたらされた［プリチャード
・アール・ケイ（Ｐｒｉｃｈａｒｄ，　Ｒ．Ｋ．）ら（
１９８０年）「線虫類における駆虫耐性の問題」Ａｕｓ
ｔｒ．　Ｖｅｔ．　Ｊ．　５６巻２３９−２５１頁；コ
ールズ・ジー・シー（Ｃｏｌｅｓ，　Ｇ．Ｃ．）（１９
８６年）「羊の駆虫耐性」北米獣医学診療：食用動物診
療の実際、２巻４２３−４３２頁（ハード・アール・ピ
ー編）ダブリュー・ビー・ソーンダース社、ニューヨー
ク州］。線虫類の記述された種は１０万種以上ある。細
菌バシラス・スリンギエンシス（Ｂ．ｔ．）は、δ−エ
ンドトキシンポリペプチドを生産し、これは急増する数
の昆虫種に対して活性をもつことが示された。初期には
鱗翅目昆虫に対してのみ毒性が観察されたが、双翅目及
び鞘翅目昆虫に対して毒性をもったＢ．ｔ．分離体が記
述されて範囲が拡大した。これらの毒素は生物体内に結
晶性封入体として蓄積される。多くのＢ．ｔ．菌株は、
試験された昆虫に対して毒性を示さない結晶性封入体を
生産する。Ｂ・スリンギエンシス種からのδ−エンドト
キシンの線虫卵の生育に対する効果について、少数の研
究論文が発表されている。ボッジャー（Ｂｏｔｔｊｅｒ
）、ボーン（Ｂｏｎｅ）及びギル（Ｇｉｌｌ）（Ｅｘｐ
ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　６０
巻２３９−２４４頁、１９８５年）は、Ｂ．ｔ．カース
タキ及びＢ．ｔ．イスラエレンシスが生体外で線虫トリ
コストロンギルス・コルブリフォルミス（Ｔｒｉｃｈｏ
ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）
の卵に対して有毒であることを報告した。更に、その他
の２８Ｂ．ｔ．菌株が試験されて、多様な毒性をもって
いた。最も効力のあるものは、ナノグラムの範囲のＬＤ
５０をもっていた。イグノフォ及びドロプキン［イグノ
フォ・シー・エム（Ｉｇｎｏｆｆｏ，　Ｃ．Ｍ．）及び
ドロプキン・ヴィー・エッチ（Ｄｒｏｐｋｉｎ，　Ｖ．
Ｈ．）（１９７７年）　Ｊ．　Ｋａｎｓ．Ｅｎｔｏｍｏ
ｌ．　Ｓｏｃ．　５０巻３９４−３９８頁］は、Ｂ・ス
リンギエンシスからの熱安定な毒素（β−エキソトキシ
ン）が自由生活の線虫であるパナグレルス・レジビブス
（Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ　ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）グッ
デイ（Ｇｏｏｄｅｙ）；植物寄生線虫であるメロイドギ
ネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｉｎｅ　ｉｎｃｏ
ｇｎｉｔａ）チトウッド（Ｃｈｉｔｗｏｏｄ）；及びカ
ビを食べる線虫のアフェレンクス・アベナ（Ａｐｈｅｌ
ｅｎｃｈｕｓ　ａｖｅｎａ）バスチアン（Ｂａｓｔｉｅ
ｎ）に対して活性があることを報告した。β−エキソト
キシンは、特異性のほとんどない一般化された細胞毒剤
である。また、エッチ・シオーディア（Ｈ．　Ｃｉｏｒ
ｄｉａ）及びダブリュー・イー・ビゼル（Ｗ．Ｅ．　Ｂ
ｉｚｚｅｌｌ）［Ｊｏｕｒ．　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏ
ｌｏｇｙ　４７巻４１頁［アブストラクト］１９６１年
］は、幾つかの牛線虫類に対するＢ・スリンギエンシス
の効果について予備的な報告をしている。吸虫類は扁形
動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）の吸虫綱（
Ｔｒｅｍａｔｏｄａ）、二生類亜綱（Ｄｉｇｅｎｅａ）
に属している。これらの二生類は、いずれも中間ホスト
をもち、ヒトを含めた脊椎動物に排他的に見出される。 獣医学的にかなり重要な吸虫を含む科は、ファスキオリ
ダエ（Ｆａｓｃｉｏｌｉｄａｅ）科、ジクロコエリダエ
（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｉｄａｅ）科、パラムフィスト
マチダエ（Ｐａｒａｍｐｈｉｓｕｔｏｍａｔｉｄａｅ）
、及びスキストソマチダエ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｔ
ｉｄａｅ）科である。成虫となった吸虫は、主に胆管、
消化管、及び血管系に出現する。好みの場所にもよるが
、卵は、通常糞便や尿中の最終ホストから抜け出し、幼
虫段階は軟体動物の中間ホスト中で発育する。寄生虫の
数及び発育段階と、ある種の細菌（クロストリジウム・
ノビ　Ｃｌｏｓｔｒｉ−ｄｉｕｍ　ｎｏｖｙｉ）の存在
ないし不在にもよるが、幾つかの臨床症侯群は肝臓吸虫
（ファスキオラ種　Ｆａｓｃｉｏｌａ　ｓｐ．）の感染
に関係している。急性の吸虫病は摂取されたばかりのメ
タケルカリア科（ｍｅｔａｃｅｒｃａｒｉａｅ）による
肝臓への侵入によって起こる。羊は、局在性肝臓壊死及
び多量の皮下出血のため、急速に死に至る。 合衆国における駆虫剤は、現在、基本的にはアルベンダ
ゾールからなり、これはファスキオラ・ヘパチカ（Ｆａ
ｓｃｉｏｌａ　ｈｅｐａｔｉｃａ　肝蛭）が重大問題と
なっている少数の州でのみ利用できる。合衆国の他の州
では、アルベンダゾールで羊を処置するには、特別な認
可が必要である。その他の有効な殺吸虫剤のジアンフェ
ネサイド、ニトロキシニル、オキシクロザナイド、ラフ
ォキサナイド、及びトリクラベンダゾールは、合衆国で
は利用できない。

【発明が解決しようとする課題】現在、感染しやすいホ
ストに相当な被害をもたらす多くの線虫類と吸虫類を防
除するための、より有効な手段をもつ必要がある。この
ような手段が生物薬剤を使用するのが有利である。

【課題を解決する手段】本発明は、生物学的に活性な毒
素をつくりだすバシラス・スリンギエンシスの分離体、
遺伝子、及び遺伝子断片に関する。これらの毒素は、線
虫類に対して活性のあることが示された。特定的に例示
されるものは、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａ
ｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｃｅ）、プラ
チレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種、及びパナ
グレルス・レジビブス（Ｐａｎａｇｒｅｌｌｕｓ　ｒｅ
ｄｉｖｉｖｕｓ）に対する活性である。ビールマット線
虫とも呼ばれるパナグレルス・レジビブスは、一般的な
自由生活の線虫であって、実験室で維持するのが比較的
容易である。これは、しばしば線虫活性の指示薬（モデ
ル）として使用される。本発明の毒素は、肝臓吸虫のフ
ァスキオラ・ヘパチカを含めた吸虫類の防除にも使用で
きる。本発明の新規なＢ．ｔ．分離体はＢ．ｔ．菌株Ｐ
Ｓ８０ＪＪ１、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．
菌株ＰＳ１６７Ｐ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ
．菌株ＰＳ１７７Ｆ１、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ
．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０
４Ｇ６である。本発明に従って使用されるＢ．ｔ．分離
体は、標準手順により、本明細書に記述のとおりに生育
され、生産されるδ−エンドトキシンを回収できる。殺
線虫剤又は殺吸虫剤製品の使用に関する標準手順を用い
て、回収された毒素又はＢ．ｔ．分離体自体を処方でき
る。 更に、本発明はＢ．ｔ．ＰＳ１７、Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ
２、ＰＳ６３Ｂ、ＰＳ５２Ａ１、及びＰＳ６９Ｄ１と指
定されるバシラス・スリンギエンシス分離体からクロー
ン化された遺伝子又は遺伝子断片に関する。本発明はＢ
．ｔ．ＰＳ１７と指定されたバシラス・スリンギエンシ
ス分離体からクローン化された４遺伝子に関する。これ
らの遺伝子は、ＰＳ１７ａ、ＰＳ１７ｂ、ＰＳ１７ｄ、
及びＰＳ１７ｅと指定された。ＰＳ１７からの遺伝子、
並びにＢ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２、Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂ、Ｂ
．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１と指定され
たＢ．ｔ．分離体の各々からの特異な遺伝子は、殺線虫
活性をもったバシラス・スリンギエンシスδ−エンドト
キシンをコード化している。本発明の遺伝子又は遺伝子
断片は、組替えＤＮＡベクターを経て適当なホストに運
搬できる。本明細書でそれぞれ配列１〜１０とはそれぞ
れ図面に記載された配列１〜１０をさす。本発明に従っ
て使用できるＢ．ｔ．分離体には、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７、
Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２、Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．ｔ
．ＰＳ６３Ｂ、Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ８
０ＪＪ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６
７Ｐ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｆ１
、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ４、及
びＢ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ６がある。本発明の新規な毒素
遺伝子又は遺伝子断片は、ＰＳ１７、ＰＳ３３Ｆ２、Ｐ
Ｓ６３Ｂ、ＰＳ５２Ａ１、及びＰＳ６９Ｄ１と指定され
た線虫活性Ｂ・スリンギエンシス（Ｂ．ｔ．）分離体か
ら得られる。殺線虫毒素をコードした遺伝子は、Ｂ．ｔ
．ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．
ＰＳ１６７Ｐ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１
７７Ｆ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４
Ｇ４、及びＢ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ６からも得られる。本
発明の毒素遺伝子を宿したＢ・スリンギエンシス分離体
及び大腸菌ホストの二次培養基は、合衆国イリノイ州ピ
オリア、農務省北部研究センターの永久保存施設に寄託
された。呼出番号は以下のとおりである。 培養基　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　受託番号　　　　　　　　　　　　　　　　寄
託期日Ｂ．ｔ．分離体ＰＳ１７　　　　　　　　　　　
　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４３　　　　　　
　　　　　　１９８７年７月２８日Ｂ．ｔ．分離体ＰＳ
３３Ｆ２　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　
Ｂ−１８２４４　　　　　　　　　　　　１９８７年７
月２８日Ｂ．ｔ．分離体ＰＳ６３Ｂ　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４６　　　　　
　　　　　　　１９８７年７月２８日Ｂ．ｔ．分離体Ｐ
Ｓ５２Ａ１　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ
　Ｂ−１８２４５　　　　　　　　　　　　１９８７年
７月２８日Ｂ．ｔ．分離体ＰＳ６９Ｄ１　　　　　　　
　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８２４７　　　　
　　　　　　　　１９８７年７月２８日大腸菌ＮＭ５２
２（ｐＭＹＣ１６２７）　　　　　　　　　　　ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１８６５１　　　　　　　　　　　　１９９０
年５月１１日大腸菌ＮＭ５２２（ｐＭＹＣ１６２８）　
　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６５２　　　
　　　　　　　　　１９９０年５月１１日Ｂ．ｔ．ＰＳ
８０ＪＪ１　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６７９　　　　　　　　　　　　
１９９０年７月１７日Ｂ．ｔ．ＰＳ１５８Ｄ５　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１
８６８０　　　　　　　　　　　　１９９０年７月１７
日Ｂ．ｔ．ＰＳ１６７Ｐ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６８１　　　　　
　　　　　　　１９９０年７月１７日Ｂ．ｔ．ＰＳ１６
９Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｎ
ＲＲＬ　Ｂ−１８６８２　　　　　　　　　　　　１９
９０年７月１７日Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｆ１　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６
８３　　　　　　　　　　　　１９９０年７月１７日Ｂ
．ｔ．ＰＳ１７７Ｇ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６８４　　　　　　　
　　　　　１９９０年７月１７日Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ
４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲ
Ｌ　Ｂ−１８６８５　　　　　　　　　　　　１９９０
年７月１７日Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ６　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６８６
　　　　　　　　　　　　１９９０年７月１７日大腸菌
ＮＭ５２２（ｐＭＹＣ２３２１）　　　　　　　　　　
　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７７０　　　　　　　　　　　　
１９９１年２月１４日大腸菌ＮＭ５２２（ｐＭＹＣ２３
１６）　　　　　　　　　　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７８
５　　　　　　　　　　　　１９９１年５月１５日大腸
菌ＮＭ５２２（ｐＭＹＣ２３１７）　　　　　　　　　
　　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８８１６　　　　　　　　　　　
　１９９１年４月２４日本発明に従って使用される毒素
遺伝子は、例えばＰＳ１７と指定されるＢ・スリンギエ
ンシス分離体から得られる。 上に示すように、本発明の毒素遺伝子を宿したＢ．ｔ．
ＰＳ１７の二次培養基は寄託されている。本発明の毒素
遺伝子を宿したＢ．ｔ．分離体のＢ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２
、Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂ、Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．ｔ
．ＰＳ６９Ｄ１、及び大腸菌ホストも寄託されている。 本培養基は３７　ＣＦＲ１．１４及び３５　ＵＳＣ　１
２２の下に特許庁長官に権利ありと認められた者は、本
特許出願の係属中に、培養基を入手できることを保証さ
れるという条件下に寄託された。また、本出願又はその
子孫の対応特許出願が提出されている国々の外国特許法
で要求されるならば、寄託物は入手できる。しかし、寄
託物が入手できるからといって、行政行為によって付与
された特許権を損わしめて本発明を実施する権利を構成
するものではないことを理解すべきである。更に、本培
養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約の規定に従っ
て保存され、一般の人々に入手可能とされる。すなわち
、寄託物の試料提供に対する最も最近の請求後少なくと
も５年間、かつどんな場合も、寄託期日から少なくとも
３０年間か、又は培養基を開示して発行される特許の権
利行使可能な期間中、これらの寄託物は、生育可能で汚
染されていない状態に保つために必要なあらゆる配慮を
もって保存される。要求を受けた受託施設が、寄託物の
状態のために試料を供給できない場合には、寄託者は寄
託物を補充する義務を認めるものである。本培養基寄託
物の一般への入手可能性に関するすべての制限は、これ
らを開示した特許の付与に際して永久に取り除かれる。 本発明の新規なＢ．ｔ．遺伝子は、試験された線虫類に
対して活性を示す毒素をコード化している。一般に蠕虫
病として記述される疾病群は、蠕虫として知られる寄生
虫による動物ホストの感染による。蠕虫病は豚、羊、馬
、牛、やぎ、犬、猫、及び家禽のような家畜において優
勢かつ重大な経済問題である。蠕虫のうち、線虫として
記述される群の虫類は、種々の動物種において広範囲の
、しばしば重大な感染をひき起こす。上述の動物に感染
する線虫類の最も一般的な属は、ヘモンクス（Ｈａｅｍ
ｏｎｃｈｕｓ）、トリコストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏ
ｓｔｒｏｎｇｉｌｕｓ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒ
ｔａｇｉａ）、ネマトジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ
）、コウオペリア（Ｃｏｏｐｅｒｉａ）、アスカリス（
Ａｓｃａｒｉｓ）、ブノストマム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕ
ｍ）、エソファゴストマム（Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏ
ｍｕｍ）、カベルチア（Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、トリク
リス（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ）、ストロンギルス（Ｓｔｒ
ｏｎｇｙｌｕｓ）、トリコネマ（Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ
）、ジクチオカウルス（Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、
カピラリア（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ）、ヘテラキス（Ｈ
ｅｔｅｒａｋｉｓ）、トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）
、アスカリジア（Ａｓｃａｒｉｄｉａ）、オキシウリス
（Ｏｘｙｕｒｉｓ）、アンシロストーマ（Ａｎｃｙｌｏ
ｓｔｏｍａ）、ウンシナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、
トキサスカリス（Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ）、カエノルハ
ブジチス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ）、及びパラ
スカリス（Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ）である。ネマトジル
ス、コウオペリア、及びエソファゴストマムのようなあ
る線虫類は、主に腸管を攻撃するが、ジクチオカウルス
のような他のものは肺に見出される。またその他の寄生
虫は、その他の身体組織や器官にいる。本発明の新規な
Ｂ．ｔ．遺伝子によってコード化された毒素は、ブルサ
ファレンクス（Ｂｕｒｓａｐｈａｌｅｎｃｈｕｓ）、ク
リコネメラ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌａ）、ジチレンク
ス（Ｄｉｔｙｌｅｎ−ｃｈｕｓ）、グロボデラ（Ｇｌｏ
ｂｏｄｅｒａ）、ヘリコチレンクス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙ
ｌｅｎｃｈｕｓ）、ヘテロデラ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ
）、メロジオギネ（Ｍｅｌｏｄｉｏｇｙｎｅ）、プラチ
レンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、ラドルフォル
ス（Ｒａｄｏｌｐｈｏｌｕｓ）、ロテリンクス（Ｒｏｔ
ｅｌｙｎｃｈｕｓ）又はチレンクス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕ
ｓ）の属から選ばれる土壌線虫類と植物寄生虫類の防除
用殺線虫剤として有用である。本発明方法及び組成物は
、脊椎動物に寄生する肝臓吸虫類の防除にも使用できる
。特定的には、本発明はヒト、家畜、愛玩動物その他の
動物における吸虫の防除に使用できる。本明細書で使用
される用語の「家畜」は、例えば羊、牛、豚、及びやぎ
を包含する。本発明方法及び組成物は未成熟及び成熟し
た吸虫類を防除するのに使用できる。防除法は牧草地処
理（脊椎動物及び中間ホスト用）、毒素を肝臓又は胆管
へ運ぶためのリポソームその他の担体、及び脊椎動物ホ
ストの胃腸管にいる自由生活型の吸虫類の処置を包含す
るが、これらに限定はされない。本明細書に記載の殺吸
虫性Ｂ．ｔ．毒素は、単独で、又は例えばアルベンダゾ
ールのような他の殺吸虫剤とローテーションにして、又
は組み合わせて使用できる。本明細書に記述のように、
発明のＢ．ｔ．分離体は、肝臓吸虫類に対して活性をも
っている。これらの分離体は、本明細書に明らかにされ
ているように、その他の吸虫類に対して活性をもつこと
が予想される。本発明のＢ．ｔ．毒素は、カプセル剤、
丸塊、又は錠剤のような単位適量形式で、又は哺乳類の
駆虫薬として使用する時は液体飲薬として経口投与でき
、かつ植物線虫類の防除のため土中で使用できる。飲薬
は通常、ベントナイトのような懸濁剤や湿潤剤等の助剤
を伴った水中における活性成分の溶液、懸濁液又は分散
液である。概して、飲薬は消泡剤をも含有する。飲薬処
方剤は一般に活性化合物約０．００１ないし０．５重量
％を含有する。 好ましい飲薬処方剤は０．０１ないし０．１重量％を含
有している。カプセル剤と丸塊は澱粉、滑石、ステアリ
ン酸マグネシウム又は燐酸二カルシウムのような担体賦
形剤と混和した活性成分を含めてなる。乾燥固体適量形
式の毒素化合物を投与したい場合は、活性成分の所望量
を含有するカプセル剤、丸塊又は錠剤が普通に使用され
る。これらの適量形式は、澱粉、乳糖、滑石、ステアリ
ン酸マグネシウム、植物ゴム等のような適当な微粉砕増
量剤、充填剤、崩壊剤及び／又は結合剤に活性成分を密
接均一に混合することによって調製される。このような
適当な単位適量処方剤は、処置される宿主動物の種類、
感染程度及び種類、宿主重量のような因子に応じて、活
性薬剤の全重量及び含有量が大幅に変わる。動物飼料経
由で活性化合物を投与する時は、これを餌によく分散さ
せるか、トップドレッシングとして使用するか、又はペ
レットの形にして、これを最終飼料に添加するか、又は
任意に別個に摂取させる。その代わりに、毒素化合物を
非経口的に、例えば反すう胃内、筋肉内、気管内、又は
皮下注射によって動物に投与でき、その場合活性成分は
液体担体賦形剤に溶解又は分散される。非経口投与には
、活性成分を好ましくは落花生油、綿実油等のような植
物油種の受け入れられる賦形剤と適当に混和する。ゾル
ケタール、グリセロール、ホルマルを使用する有機調製
剤や水性非経口処方剤のような他の非経口賦形剤も使用
される。活性化合物は投与のため非経口処方剤に溶解又
は懸濁される。このような処方剤は一般に０．００５な
いし５重量％の活性化合物を含有する。動物飼料の一成
分として毒素を投与するか、又は飲み水に溶解又は懸濁
させるかすると、活性化合物が不活性担体又は増量剤中
に密接に分散された組成物類が提供される。不活性担体
とは、活性薬剤と反応しないもの、及び動物に安全に投
与できるものを意味している。飼料投与用担体が動物飼
料の一成分である（又はありうる）ような担体であるの
が好ましい。 適当な組成物は、活性成分を比較的多量に存在させた飼
料プレミックス又は補充物を包含し、これらは動物への
直接給餌に適したもの、又は飼料への直接添加又は中間
的な希釈又は配合段階後の添加に適したものである。こ
のような組成物に適した典型的な担体又は増量剤は、例
えば蒸留酒製造業者の乾燥穀類、コーンミール、カンキ
ツ類穀粉、発酵残留物、粉砕かき殼、小麦くず、糖蜜ソ
リュブル、トウモロコシ穂軸粉、食用豆粉飼料、大豆か
す、粉砕石灰石等を包含する。哺乳類の消化管内の殺線
虫及び殺吸虫活性のほか、Ｂ．ｔ．分離体からの胞子は
動物の消化管を通過して糞便中で増殖し、それによって
糞便中で孵化、増殖する幼虫の追加的防除を提供する。 本発明の新規なＢ．ｔ．分離体からの遺伝子は、欧州特
許出願第０　２００　３４４号の手順に従って、植物の
植物領域を占有し、そこで生存、繁殖できるような微生
物中に導入することができる。線虫や吸虫を宿した動物
が、このような植物を摂取すると、毒素が動物ホスト中
で利用可能となり、線虫や吸虫の出没を防除する。本発
明の毒素遺伝子又は遺伝子断片は、広範囲の微生物ホス
トへ導入できる。毒素遺伝子の発現は、直接又は間接に
殺虫剤の細胞内生産と保持をもたらす。適当なホスト、
例えばシュードモナスの場合、微生物は線虫類の発生位
置に施用されると、そこで増殖し、線虫に摂取される。 その結果、望んでいない線虫を防除できる。その代わり
に、毒素遺伝子をもった微生物を、細胞内でつくられる
毒素の活性を持続させるような条件下に処理できる。次
に処理細胞を目標害虫環境に施用できる。生ずる生成物
はＢ．ｔ．毒素の毒性を保持している。遺伝子の安定な
維持及び発現を可能とするような条件下に、毒素発現す
るＢ．ｔ．遺伝子を微生物ホストに導入するには、広範
囲の方法が利用できる。毒素遺伝子発現用の転写翻訳調
節信号とその調節制御下の毒素遺伝子、及び組込みを行
なうためのホスト生物内の配列と相同のＤＮＡ配列、ま
た組込みや安定な保持が起こるための、ホスト内で機能
的な複製系などを含んだＤＮＡ構造体を用意することが
できる。転写開始信号はプロモータと転写開始出発位置
を包含しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を提供
して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるように
するのが望ましいこともある。これはオペレータ、又は
アクチベータやエンハンサに結合する領域、によって達
成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化
によって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域を使
用すると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育でき、
環境へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実験室
で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、一
方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを使
用できる。翻訳開始には、リボソーム結合位置と開始コ
ドンが存在しよう。メッセンジャーＲＮＡの安定性を強
化する配列を使用すると共に、特に活性プロモータを使
用してメッセンジャーの発現を強化するために種々の操
作を使用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、
終結領域、及び任意にポリアデニル化信号を包含しよう
。転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の
５’から３’への方向で、構造体は転写調節領域（これ
がある場合）とプロモータ（制御領域はプロモータの５
’又は３’のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、
開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもっ
た構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列（
使用する場合）、及び終結領域を包含しよう。二本鎖と
してのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使
用できるが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴って
おり、この第二のＤＮＡ配列をホストへのＤＮＡ導入中
に毒素発現構造体に結合させることができる。マーカー
とは、変更又は形質転換されたホストの選定を行なうた
めの構造遺伝子のことである。マーカーは通常、選択的
利点を提供するもので、例えば抗生物質や重金属への耐
性などの殺生物耐性や、栄養素要求ホストに原栄養性を
与える相補性等を提供する。変更されたホストが選定さ
れるだけでなく、野外で競合的であるように、相補性を
使用するのが好ましい。 構造体の開発に、またホストの変更に、一つ以上のマー
カーを使用できる。野外で他の野性型微生物に対する競
合的利点を提供することによって、生物を更に変更でき
る。例えば、金属キレート剤、例えばシデロフォア類の
発現用遺伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒にホス
トへ導入できる。この方法で、シデロフォアの強化され
た発現が毒素生産ホストに競合的利点を提供するため、
ホストは野性型微生物と効果的に競合し、環境中で安定
した生態的地位を占めるようになる。機能的な複製系が
存在しない場合、構造体はホスト内の配列と相同な、少
なくとも５０塩基対（ｂｐ）、好ましくは約１００　ｂ
ｐ、及び通常約１，０００　ｂｐまでの配列を包含しよ
う。こうして合法的な組換えの可能性が強化されるため
、遺伝子はホストへ組み込まれ、ホストによって安定に
保持される。毒素遺伝子が相補性を提供する遺伝子並び
に競合的利点を提供する遺伝子に近接しているのが望ま
しい。従って、毒素遺伝子が失われる場合、生ずる生物
は相補性遺伝子及び／又は競合的利点を提供する遺伝子
も失う可能性が強く、このため無傷の構造体を保持して
いる遺伝子と環境中で競合できなくなる。細菌、バクテ
リオファージ、シアノバクテリア、藻類、カビ等のよう
な広範囲の微生物ホストから多数の転写調節領域が入手
できる。種々の転写調節領域は、ｔｒｐ遺伝子、ｌａｃ
遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右プロモータ、Ｔ
ａｃプロモータ、及びホスト中で機能的な場合は毒素遺
伝子と関連して天然に生ずるプロモータを包含する。例
として合衆国特許第４，３３２，８９８号、第４，３４
２，８３２号、及び第４，３５６，２７０号を参照のこ
と。 終結領域は、普通は転写開始領域と関連する終結領域か
、又は異なる転写開始領域（二つの領域がホスト内で適
合的で機能的である限りにおいて）でありうる。安定な
エピゾーム保持又は組込みを所望する場合は、ホスト中
で機能的な複製系をもったプラスミドが使用されよう。 複製系は染色体、ホストや別のホスト内に通常存在する
エピゾーム要素、又はホスト内で安定なウイルスの複製
系から誘導される。ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、
ＲＳＦ１０１０、ｐＲＯ１６１４等のような多数のプラ
スミドが入手できる。例として、オルソン（Ｏｌｓｏｎ
）ら、（１９８２年）　Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１
５０巻６０６９頁、及びバグダサリアン（Ｂａｇｄａｓ
ａｒｉａｎ）ら、（１９８１年）　Ｇｅｎｅ　１６巻２
３７頁、並びに合衆国特許第４，３５６，２７０号、第
４，３６２，８１７号、及び第４，３７１，６２５号を
参照のこと。 Ｂ．ｔ．遺伝子は開始領域の調節制御下にあるように、
転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に導入でき
る。 この構造体はプラスミドに含有され、プラスミドは少な
くとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を包含でき
、その場合一つの複製系はプラスミドの開発中にクロー
ニング用に使用され、第二の複製系は最終ホストでの機
能発揮に必要である。更に、すでに述べた一つ以上のマ
ーカーが存在できる。組込みを望む場合は、プラスミド
はホストゲノムと相同の配列を含むのが望ましい。形質
転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在する時は
、それらに対して所望生物を選定できるように、慣用の
方法に従って選定手法を使用して単離できる。次に形質
転換体を殺線虫又は殺吸虫活性のために試験できる。 Ｂ．ｔ．毒素遺伝子が適当なベクターを経て微生物ホス
トへ導入されて、このホストが生きている状態で環境へ
施用される場合に、あるホスト微生物を使用することが
必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要作物の「
植物領域」（葉面、葉領域、根領域、及び／又は根表面
）を占有することが知られたものを選択する。これらの
微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中で野
性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリペプ
チド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現を提
供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活性化
からの改良された保護を提供する。広範囲の重要作物の
葉面（植物の葉の表面）と根の領域（植物の根の周囲の
土壌）に生息する多数の微生物が知られている。これら
の微生物は細菌、藻類及びカビを包含している。特に興
味あるものは、細菌、例えばシュードモナス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏ−ｎａｓ）、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）
、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、クレブシェラ（Ｋ
ｌｅｂｓｉｅｌ−ｌａ）、キサントモナス（Ｘａｎｔｈ
ｏｍｏｎａｓ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、ロー
ドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
）、メチロフィリウス（Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｉｕｓ
）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、乳酸
杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アースロバクタ
ー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター（Ａ
ｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、リューコノストック（Ｌｅｕ
ｃｏｎｏｓｔ−ｏｃ）、及びアルカリゲネス（Ａｌｃａ
ｌｉｇｅｎｅｓ）属の細菌；カビ類、特に酵母、例えば
サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリ
プトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クルイベ
ロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、スポロボロ
ミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ロードトル
ラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、及びオーレオバシジウ
ム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）属などの微生物であ
る。特に重要なものは、シュードモナス・シリンガエ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュー
ドモナス・フルオレッセンス、セラティア・マルケスケ
ンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、ア
セトバクター・キシリヌム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ　
ｘｙｌｉｎｕｍ）、アグロバクテリウム・ツメファシエ
ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ
ｅｎｓ）、ロードシュードモナス・スフェロイデス（Ｒ
ｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｈｅｒｏｉｄｅ
ｓ）、キサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏ
ｍｏｎａｓ　　ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、リゾビウム・
メリオチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｏｔｉ）、ア
ルカリゲネス・エントロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｅｎｔｒｏｐｈｕｓ）、及びアゾトバクター・ヴィン
ランディ（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｎｌａｎｄｉ
ｉ）のような植物領域の細菌種；及びロードトルラ・ル
ブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）、Ｒ．グ
ルチニス（Ｒ．　ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、Ｒ．マリーナ（
Ｒ．　ｍａｒｉｎａ）、Ｒ．オーランティアカ（Ｒ．ａ
ｕｒａｎｔｉａｃａ）、クリプトコッカス・アルビダス
（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｌｂｉｄｕｓ）、Ｃ．
ジフルエンス（Ｃ．　ｄｉｆｆｌｕｅｎｓ）、Ｃ．ロー
レンティ（Ｃ．　ｌａｕｒｅｎｔｉｉ）、サッカロミセ
ス・ロゼイ（Ｓ．　ｒｏｓｅｉ）、Ｓ．プレトリエンシ
ス（Ｓ．　ｐｒｅｔｏｒｉｅｎｓｉｓ）、Ｓ．セレビシ
エ（Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、スポロボロミセス
・ロゼウス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ　ｒｏｓｅ
ｕｓ）、Ｓ．オドルス（Ｓ．　ｏｄｏｒｕｓ）、クルイ
ベロミセス・ヴェローナエ（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅ
ｓ　ｖｅｒｏｎａｅ）及びオーレオバシジウム・ポルラ
ンス（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ　ｐｏｌｌｕｌａｎ
ｓ）のような植物領域の酵母種である。特に重要なのは
有色素微生物である。処理細胞を目標害虫環境に施用す
る時に細胞内毒素の活性を持続させるために、殺線虫剤
又は殺吸虫剤含有細胞を処理するのに適したホスト細胞
は、原核生物か真核生物を包含するが、通常、哺乳類の
ような高等動物に有毒な物質を生じない細胞に限定され
る。しかし、毒素が不安定か、哺乳類ホストへの毒性の
可能性を回避するのに十分な低い施用水準である場合に
は、高等生物に有毒な物質をつくる生物も使用できる。 ホストとして特に興味あるものは、原核生物と、カビの
ような低級真核生物である。グラム陰性・陽性双方の原
核生物の例はエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、シゲラ（Ｓｈｉｇ
ｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び
プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）のような腸内細菌科（Ｅ
ｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）；バシラス科（
Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）；リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂ
ｉｕｍ）のようなリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅ
ａｅ）；発光細菌、ジモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）
、セラティア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、アエロモナス（Ａ
ｅｒｏｍｏｎａｓ）、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）、デス
ルホビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、スピリ
ルム（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）のようならせん菌科；乳酸
かん菌科；シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
及びアセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）のよう
なシュードモナス科；アゾトバクター科及びニトロバク
ター科を包含する。真核生物には藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍ
ｙｃｅｔｅｓ）と子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ
）のようなカビがあり、これはサッカロミセス（Ｓａｃ
ｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）とシゾサッカロミセス（Ｓｃｈ
ｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のような酵母、ロ
ードトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、オーレオバシ
ジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、スポロボロミ
セス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）のような担子菌
類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）酵母を包含する。 生産目的のためにホスト細胞を選択する上で特に重要な
特性は、Ｂ．ｔ．遺伝子のホストへの導入の容易さ、発
現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺線虫剤又は殺吸
虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包含する。 殺線虫剤又は殺吸虫剤ミクロカプセルとして使用するの
に重要な特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細胞内パッ
ケージング又は封入体の形成のような殺虫剤保護性；葉
親和性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取させるための
誘引力；毒素に損害を与えない殺菌固定の容易さ等を包
含する。他の考慮としては、処方と取扱いの容易さ、経
済性、保存安定性等がある。特に重要なホスト生物は、
ロードトルラ種、オーレオバシジウム種、サッカロミセ
ス種、スポロボロミセス種のような酵母；シュードモナ
ス種、エルウィニア種、及びフラボバクテリウム種のよ
うな葉面に生息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌
種、バシラス種等の他の生物を包含する。特定的な生物
は、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・フ
ルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、サッ
カロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、バシラス・スリンギエンシ
ス、大腸菌、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等を包含
する。　　細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子型
よりも実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も使
用できる。微生物細胞、例えばＢ．ｔ．毒素遺伝子又は
遺伝子断片を含有する微生物の処理は、毒素の性状に悪
影響を及ぼさないか、又は毒素を保護する細胞能力を消
滅させない限り、化学的又は物理的手段によるか、又は
化学的及び物理的手段の組合わせによる。化学的試薬の
例はハロゲン化剤、特に原子番号１７−８０のハロゲン
である。もっと特定的には、ヨウ素を温和な条件下に、
所望の結果を達成するのに十分な時間に使用できる。他
の適当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒ
ドのようなアルデヒド類；塩化ゼフィランと塩化セチル
ピリジニウムのような抗感染剤；イソプロピルアルコー
ルとエタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤、
及びヘリー固定剤［フマソン（Ｈｕｍａｓｏｎ）、グレ
ッチェン・エル（Ｇｒｅｔｃｈｅｎ，　Ｌ．）「動物組
織手法」ダブリュー・エッチ・フリーマン社、１９６７
年、を参照］のような種々の組織学的固定剤等での処理
；又はホスト動物に細胞を投与する時に細胞中につくら
れる毒素の活性を保存し、持続させるような物理的処理
（加熱）と化学薬剤処理との組合わせを包含する。物理
的手段の例は、ガンマ放射線とＸ線のような短波長放射
線、凍結、ＵＶ照射、凍結乾燥等である。一般に細胞は
、環境条件に対する耐性を強化するような、強化された
構造安定性をもつであろう。殺虫剤がプロ型の場合は、
目標害虫病原体による殺虫剤のプロ型から成熟型への加
工を抑制しないように、不活性化方法を選定すべきであ
る。例えばホルムアルデヒドはタンパクを架橋し、プロ
型ポリペプチド殺虫剤の加工を抑制しうる。不活性化な
いし殺菌方法は、毒素の少なくとも実質量の生物学的利
用率又は生物活性を保持する。Ｂ．ｔ．毒素遺伝子を含
有する細胞ホストは任意慣用の栄養培地で生育できるが
、ＤＮＡ構造体は選択的利点を提供するため、細胞の全
量又は実質的全量がＢ．ｔ．遺伝子を保持するように選
択培地となる。次にこれらの細胞を慣用方法に従って取
り入れる。その代わりに、細胞を取り入れる前に処理す
ることもできる。Ｂ．ｔ．細胞を種々の方法で処方でき
る。これらを無機鉱物（フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩
、燐酸塩等）又は植物材料（粉末トウモロコシ穂軸、も
み殻、クルミ殻等）と混合することにより、水和剤、粒
剤又は粉剤として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安
定化剤、その他殺虫添加物、又は表面活性剤を包含でき
る。液体処方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フ
ォーム、ゲル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分
は流動剤、表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包
含できる。毒素濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液か
直接使用されるかによって、広範囲にわたる。 毒素は少なくとも１重量％で存在し、１００重量％であ
りうる。乾燥処方剤は約１−９５重量％の毒素をもつが
、液体処方剤は一般に約１−６０重量％の固体を液相中
にもつであろう。処方剤は概してｍｇ当たり約１０２な
いし約１０４個の細胞をもつであろう。これらの処方剤
はヘクタール当たり約５０　ｍｇ（液体又は乾燥）ない
し１　ｋｇ以上の率で投与されよう。処方剤は線虫類又
は吸虫類の環境、例えば植物、土壌、又は水に噴霧、散
布、散水等によって施用できる。 その代わりに、幾つかの植物寄生線虫類は強制寄生虫で
あるから、殺線虫Ｂ．ｔ．毒素をコードした遺伝子は、
線虫耐性植物を生じさせるために植物へ工学処理できる
。植物細胞を工学処理する方法は、十分に確立されてい
る［ネスター・イー・ダブリュー（Ｎｅｓｔｅｒ，　Ｅ
．Ｗ．）、ゴードン・エム・ピー（Ｇｏｒｄｏｎ，　Ｍ
．Ｐ．）、アマジノ・アール・エム（Ａｍａｓｉｎｏ，
　Ｒ．Ｍ．）、及びヤノフスキ・エム・エフ（Ｙａｎｏ
ｆｓｋｙ，　Ｍ．Ｆ．）Ａｎｎ．　Ｒｅｖ．　Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．　３５巻３８７−３９９頁、１９８４年を参照
］。この技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列
は、ＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定される。遺
伝暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに
使用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号
化ヌクレオチドトリプレット（コドン）を使用できるた
め、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配
列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のように描
くことができる。 　　フェニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　　　ＴＴＫ　　
　　　　ヒスチジン（Ｈｉｓ）　　　　　　　　　　　
ＣＡＫ　　ロイシン（Ｌｅｕ）　　　　　　　　　　　
　　ＸＴＹ　　　　　　グルタミン（Ｇｌｎ）　　　　
　　　　　　　ＣＡＪ　　イソロイシン（Ｉｌｅ）　　
　　　　　　　ＡＴＭ　　　　　　アスパラギン（Ａｓ
ｎ）　　　　　　　　　ＡＡＫ　　メチオニン（Ｍｅｔ
）　　　　　　　　　　　ＡＴＧ　　　　　　リジン（
Ｌｙｓ）　　　　　　　　　　　　　　　ＡＡＪ　　バ
リン（Ｖａｌ）　　　　　　　　　　　　　　　ＧＴＬ
　　　　　　アスパラギン酸（Ａｓｐ）　　　　　　　
ＧＡＫ　　セリン（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　　　　
　　　ＱＲＳ　　　　　　グルタミン酸（Ｇｌｕ）　　
　　　　　　　ＧＡＪ　　プロリン（Ｐｒｏ）　　　　
　　　　　　　　　ＣＣＬ　　　　　　システイン（Ｃ
ｙｓ）　　　　　　　　　　　ＴＧＫ　　スレオニン（
Ｔｈｒ）　　　　　　　　　　　ＡＣＬ　　　　　　ト
リプトファン（Ｔｒｐ）　　　　　　　ＴＧＧ　　アラ
ニン（Ａｌａ）　　　　　　　　　　　　　ＧＣＬ　　
　　　　アルギニン（Ａｒｇ）　　　　　　　　　　　
ＷＧＺ　　チロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　　　　　
　　ＴＡＫ　　　　　　グリシン（Ｇｌｙ）　　　　　
　　　　　　　　ＧＧＬ　　終結信号　　　　　　　　
　　　　　　　　　　ＴＡＪ解読法：各三文字のデオキ
シヌクレオチドの三つ組は、左側に５’末端、右側に３
’末端をもつ伝令ＲＮＡのトリヌクレオチドに対応する
。本明細書に記載のＤＮＡはすべて、ウラシルにはチミ
ンを置き換えた、ｍＲＮＡの配列に対応する配列のＤＮ
Ａ鎖のものである。文字はデオキシヌクレオチド配列を
形成するプリン又はピリミジン塩基を示す。 Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＧの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ．ＹがＣまたは
Ｔの場合は、Ｘ＝Ｃ．ＸがＣの場合は、Ｙ＝Ａ，　Ｇ，
　Ｃ又はＴ．ＸがＴの場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ．ＺがＡ又
はＧの場合は、Ｗ＝Ｃ又はＡ．ＺがＣ又はＴの場合は、
Ｗ＝Ｃ．ＷがＣの場合は、Ｚ＝Ａ，　Ｇ，　Ｃ又はＴ．
ＷがＡの場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ．ＳがＡ，　Ｇ，　Ｃ又
はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ．又はその代わりにＳがＴ又
はＣの場合は、ＱＲ＝ＡＧ．Ｊ＝Ａ又はＧＫ＝Ｔ又はＣ
Ｌ＝Ａ，　Ｔ，　Ｃ又はＧ．Ｍ＝Ａ，　Ｃ又はＴ．上記
は、Ｂ．ｔ．毒素の新規なアミノ酸配列が、このタンパ
クの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオチド
配列によって調製できることを示す。従って、本発明は
このような同等なヌクレオチド配列を包含する。更に、
アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更しない
ならば、確認された構造及び機能のタンパクが、このよ
うな変更によって構築できることが示された［カイザー
・イー・ティー（Ｋａｉｓｅｒ，　Ｅ．Ｔ．）及びケズ
ディ・エフ・ジェイ（Ｋｅｚｄｙ，　Ｆ．Ｊ．）（１９
８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３巻２４９−２５５頁］
。このように、本発明はタンパクの二次構造を変更しな
いような本明細書に記載のアミノ酸配列の突然変異株、
又は構造が変更される場合、生物活性がある程度保持さ
れるような突然変異株を包含する。更に、本発明は、発
明遺伝子をコード化した毒素の全部又は一部をもった生
物の突然変異種も包含する。このような微生物の突然変
異種は、当業者に周知の手法によってつくることができ
る。例えば、ＵＶ照射を用いてホスト生物の変異株をつ
くることができる。同様に、このような変異株は胞子非
形成ホスト細胞を包含し、これもこの技術に周知の手順
によって調製できる。プラスミドの調製とホスト生物の
形質転換に使用される種々の方法はこの技術で周知であ
る。これらの手順はすべて、マニアチス・ティー（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，　Ｔ．）、フリッシュ・イー・エフ（Ｆ
ｒｉｔｓｃｈ，　Ｅ．Ｆ．）及びサムブロック・ジェイ
（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，　Ｊ．）（１９８２年）、「分子
クローニング：実験マニュアル」（コールド・スプリン
グ・ハーバー研究所、ニューヨーク州）に記述されてい
る。このように、微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限
酵素での消化を行ない、ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、
プラスミドのテーリングとアニーリングを行ない、ＤＮ
Ａを挿入、再結合し、細胞を形質転換し、プラスミドＤ
ＮＡを調製し、タンパクを電気泳動にかけ、ＤＮＡの配
列を決定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範囲にあ
る。本明細書で明らかにされている制限酵素は、ベセス
ダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバーグ）、ニュー
イングランド・バイオラブ（マサチューセッツ州ビバリ
ー）、及びベーリンガー・マンハイム（インディアナ州
インディアナポリス）から購入できる。酵素は、供給側
から提供される指示に従って使用される。

【実施例】以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順
を例示した実施例である。これらの例は限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて
重量、溶媒混合物割合はすべて容量による。 実施例１　　Ｂ．ｔ．分離体類の培養 Ｂ．ｔ．分離体の二次培養基を使用して次の培地、すな
わちペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種した。 バクト・ペプトン　　　　　　　　７．５　ｇ／ｌブド
ウ糖　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　３
．４　ｇ／ｌＫ２ＨＰＯ４　　　　　　　　　　　　　
　　　　　４．３５　ｇ／ｌ塩溶液　　　　　　　　　
　　　　　　　　　５．０　ｍｌ／ｌＣａＣｌ２溶液　
　　　　　　　　　　　　　　５．０　ｍｌ／ｌ塩溶液
（１００　ｍｌ） ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　２
．４６　ｇＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　０．０４　ｇＺｎＳＯ４・７Ｈ２０　　　　　
　　　　　　　　　０．２８　ｇＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ
　　　　　　　　　　　　　　０．４０　ｇＣａＣｌ２
溶液（１００　ｍｌ） ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　　　　　　　　　　　　　　３
．６６　ｇｐＨ　７．２ 塩溶液とＣａＣｌ２溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ
処理し調理したブロスに、接種時に添加する。２００　
ｒｐｍで操作される回転振とう機で、フラスコを３０℃
、６４時間培養する。上の手順は、この技術で周知の手
順により、大発酵装置まで容易に規模拡大できる。上の
発酵で得られるＢ．ｔ．胞子及び結晶は、この技術で周
知の手順により単離できる。しばしば用いられる手順は
、取り入れた発酵液を分離手順、例えば遠心分離にかけ
ることである。 実施例２　　精製及びアミノ酸配列決定本発明の毒素タ
ンパクの給源として使用できるバシラス・スリンギエン
シス（Ｂ．ｔ．）分離体は、例えばＢ．ｔ．ＰＳ１７、
Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２、Ｂ．ｔ
．ＰＳ６３Ｂ、Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ８
０ＪＪ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６
７Ｐ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｆ１
、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ４、及
びＢ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ６でありうる。分離体を実施例
１に記述されたとおりに、又はこの技術で知られたその
他の標準的な培地及び発酵手法を用いて培養できる。毒
素タンパク封入体は標準的な沈降遠心分離によって取り
入れられる。回収されたタンパク封入体は、臭化ナトリ
ウム（２８−３８％）密度勾配平衡遠心によって部分的
に精製できる。［ファネンスチール・エム・エイ（Ｐｆ
ａｎｎｅｎｓｔｉｅｌ，　Ｍ．Ａ．）、イー・ジェイ・
ロス（Ｅ．Ｊ．　Ｒｏｓｓ）、ヴィー・シー・クレーマ
ー（Ｖ．Ｃ．　Ｋｒａｍｅｒ）、及びケイ・ダブリュー
・ニッカーソン（Ｋ．Ｗ．　Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ）（１
９８４年）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｌｅｔｔ
．　２１巻３９頁］。次に、個々の毒素タンパクは、結
晶性タンパク錯体をアルカリ緩衝液に可溶化し、ＤＥＡ
Ｅ−セファロースＣＬ−６Ｂ（シグマケミカル社、ミズ
ーリ州セントルイス）クロマトグラフィにより、ＮａＣ
ｌ含有緩衝液の濃度を増大させる段階的増量によって個
々のタンパクを分画することによって分割できる［レイ
チェンバーグ・ディー（Ｒｅｉｃｈｅｎｂｅｒｇ，　Ｄ
．）、「有機・生化学におけるイオン交換体」［シー・
カルモン（Ｃ．　Ｃａｌｍｏｎ）及びティー・アール・
イー・クレスマン（Ｔ．Ｒ．Ｅ．　Ｋｒｅｓｍａｎ）編
、インターサイエンス社、ニューヨーク州、１９５７年
］。線虫カエノルハブジチス・エレガンス（ＣＥ）に対
して有毒なタンパクを含有するフラクションは、ウエス
タン・ブロット手法［トウビン・エッチ（Ｔｏｗｂｉｎ
，Ｈ．）、ティー・ステーヘリン（Ｔ．　Ｓｔａｅｈｅ
ｌｉｎ）及びケイ・ゴードン（Ｋ．　Ｇｏｒｄｏｎ）（
１９７９年）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓ
ｃｉ．　ＵＳＡ　７６巻４３５０頁］によってＰＶＤＦ
膜（ミリポア社、マサチューセッツ州ベドフォード）に
結合され、Ｎ末端アミノ酸は自動化気相配列決定装置で
の標準的なエドマン反応によって決定された［ハンカピ
ラー・エム・ダブリュー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，　
Ｍ．Ｗ．）、アール・エム・ヘウィック（Ｒ．Ｍ．　Ｈ
ｅｗｉｃｋ）、ダブリュー・エル・ドライヤー（Ｗ．Ｌ
．　Ｄｒｅｙｅｒ）、及びエル・イー・フッド（Ｌ．Ｅ
．Ｈｏｏｄ）（１９８３年）、Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ．９１巻３９９頁］。得られた配列は以下を包含す
る。 ＰＳ１７ａ　　　　　　　ＡＩＬＮＥＬＹＰＳＶＰＹＮ
ＶＰＳ１７ｂ　　　　　　　ＡＩＬＮＥＬＹＰＳＶＰＹ
ＮＶＰＳ３３Ｆ２　　　　　　ＡＴＬＮＥＶＹＰＶＮＰ
Ｓ５２Ａ１　　　　　　ＭＩＩＤＳＫＴＴＬＰＲＨＳＬ
ＩＮＴＰＳ６３Ｂ　　　　　　　ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹ
ＮＶＬＡＰＳ６９Ｄ１　　　　　　ＭＩＬＧＮＧＫＴＬ
ＰＫＨＩＲＬＡＨＩＦＡＴＱＮＳ 更に、内部アミノ酸配列データはＰＳ６３Ｂから誘導さ
れた。毒素タンパクは本質的に既述のとおりに［クリー
ブランド・ディー・ダブリュー（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，
　Ｄ．Ｗ．）、エス・ジー・フィッシャー（Ｓ．Ｇ．　
Ｆｉｓｃｈｅｒ）、エム・ダブリュー・カーシュナー（
Ｍ．Ｗ．　Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ）、及びユウ・ケイ・レ
ムリ（１９７７年）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　
２５２巻１１０２頁］スタフィロコッカス・オーレウス
Ｖ８プロテアーゼ（シグマケミカル社、ミズーリ州セン
トルイス）で部分的に消化された。消化された材料をＰ
ＶＤＦ膜でブロット処理し、約２８　ｋＤａ限界ペプチ
ドを上記のようにＮ−末端配列決定用に選定した。得ら
れた配列は次のものであった。６３Ｂ（２）　ＶＱＲＩ
ＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫこれらの配列データからオリゴ
ヌクレオチドプローブが、他のＢ．ｔ．毒素遺伝子の入
手可能な配列から組立てられたコドン頻度表を用いて設
計された。プローブは、アプライド・バイオシステムズ
社のＤＮＡ合成機で合成された。 実施例３　　新規な毒素遺伝子のクローニングと大腸菌
への形質転換 Ａ．Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ Ｂ．ｔ．ＰＳ１７細胞を低光学密度（ＯＤ６００＝１．
０）に生育させ、細胞を遠心分離によって回収して、全
細胞ＤＮＡを調製した。２０％庶糖と５０　ｍｇ／ｍｌ
リゾチームを含有するＴＥＳ緩衝液（３０　ｍＭトリス
−Ｃｌ、１０　ｍＭ　エチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴ
Ａ］、５０　ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ＝８．０）中で細胞を
プロトプラスト化させた。プロトプラストを４％の最終
濃度までドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）添加によっ
て溶菌化した。細胞材料を最終濃度１００ｍＭの中性塩
化カリウム中、４℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフェ
ノール／クロロホルム（１：１）で２回抽出した。ＤＮ
Ａをエタノール中で沈殿させ、塩化セシウム／臭化エチ
ジウム勾配上の密度平衡バンディングによって精製した
。ＰＳ１７からの全細胞ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化させ
、０．８％アガロースゲル−ＴＡＥ（５０　ｍＭトリス
−Ｃｌ、２０　ｍＭ　ＮａＯＡｃ、０．２５　ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、ｐＨ＝８．０）緩衝化ゲル上の電気泳動によっ
て分離した。ゲルのサザンブロットを、ＰＳ１７からの
精製された１３０　ｋＤａタンパクのＮ末端アミノ酸配
列から誘導される［３２Ｐ］−放射性標識つきオリゴヌ
クレオチドプローブとハイブリッド形成させた。合成さ
れたオリゴヌクレオチドの配列は（ＧＣＡＡＴＴＴＴＡ
ＡＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＴＣＣ）であった。 結果は、ＰＳ１７のハイブリッド化ＥｃｏＲＩ断片が５
．０ｋｂ、４．５　ｋｂ、２．７　ｋｂ及び１．８　ｋ
ｂの大きさにあることを示し、それぞれ少なくとも四つ
の新しい線虫活性毒素遺伝子のＰＳ１７ｄ、ＰＳ１７ｂ
、ＰＳ１７ａ、及びＰＳ１７ｅを推定的に確認した。Ｓ
ａｕ３Ａで部分消化されたＰＳ１７全細胞ＤＮＡからラ
イブラリーを構築し、電気泳動によってサイズ分画した
。ゲルの９−２３　ｋｂ領域を切り出し、ＤＮＡを電気
溶離し、ＥＬＵＴＩＰＴＭ−ｄイオン交換カラム（シュ
ライヒャー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー
州キーン）を用いて濃縮した。単離されたＳａｕ３Ａ断
片をラムダＧＥＭ−１１ＴＭ（ＰＲＯＭＥＧＡ）に連結
した。パッケージにしたファージをＫＷ２５１大腸菌細
胞（ＰＲＯＭＥＧＡ）上に高滴定価でプレートし、核酸
ハイブリッド形成プローブとして上の放射性標識つき合
成オリゴヌクレオチドを用いて選定した。ハイブリッド
化プラークを精製し、低プラーク密度で再選定した。プ
ローブとハイブリッド形成させた単離精製プラークを用
いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製のため、液体培養基
中でＫＷ２５１大腸菌細胞に感染させた。ＤＮＡを標準
手順によって単離した。回収された組替えファージＤＮ
ＡをＥｃｏＲＩで消化させ、０．８％アガロース−ＴＡ
Ｅゲル上の電気泳動によって分離した。ゲルをサザンブ
ロット処理し、ラムダライブラリーから単離された毒素
遺伝子を特性化するために、オリゴヌクレオチドプロー
ブとハイブリッド形成させた。二つのパターンがあり、
４．５　ｋｂ（ＰＳ１７ｂ）又は２．７　ｋｂ（ＰＳ１
７ａ）ＥｃｏＲＩ断片を含有するクローンであった。フ
ァージＤＮＡの分離量をＳａｌＩで消化させ（挿入ＤＮ
Ａをラムダアームから放出させるため）、０．６％アガ
ロース−ＴＡＥゲル上の電気泳動によって分離した。大
断片（上記のように電気溶離し濃縮したもの）を、Ｓａ
ｌＩで消化させ脱ホスホリル化処理したｐＢＣｌａｃに
連結させた。連結体をＮＭ５２２コンピテント大腸菌細
胞へ形質転換によって導入し、アンピシリン、イソプロ
ピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ
−ガラクトシド（ＸＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上にプ
レートした。所望のプラスミド類を単離するために、白
色集落（ｐＢＣｌａｃの（β）−ガラクトシダーゼ遺伝
子中に推定挿入体をもつもの）を標準的な急速プラスミ
ド精製手順にかけた。２．７　ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含
有する選定プラスミドをｐＭＹＣ１６２７と名付け、ま
た４．５　ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含有するプラスミドを
ｐＭＹＣ１６２８と名付けた。 毒素遺伝子は、上記の合成オリゴヌクレオチドプローブ
を用いた標準的なサンガージデオキシ連鎖終結法によっ
て、また新しい毒素遺伝子の配列に対してつくられたプ
ライマーとの“ウォーキング”によって配列決定された
。標準的なＢ．ｔ．発現法を用いて、ＰＳ１７毒素遺伝
子をシャトルベクターｐＨＴ３１０１に二次クローン化
した［レレクルス・ディー（Ｌｅｒｅｃｌｕｓ，　Ｄ．
）ら、（１９８９年）ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．　
Ｌｅｔｔ．　６０巻２１１−２１８頁］。要約すると、
分離用アガロースゲル電気泳動、電気溶離によってＰＳ
１７ａ及びＰＳ１７ｂ毒素遺伝子を含有するＳａｌＩ断
片を、それぞれｐＭＹＣ１６２９及びｐＭＹＣ１６２７
から単離し、上記のように濃縮した。これらの濃縮断片
をＳａｌＩで切断され脱ホスホリル化されたｐＨＴ３１
０１へ連結した。連結混合物を別個に使用して、凍結コ
ンピテント大腸菌ＮＭ５２２を形質転換させた。各組替
え大腸菌菌株からのプラスミドをアルカリ溶菌によって
調製し、アガロースゲル電気泳動によって分析した。 生ずる二次クローンのｐＭＹＣ２３１１とｐＭＹＣ２３
０９は、それぞれＰＳ１７ａとＰＳ１７ｂ毒素遺伝子を
保持していた。標準的なエレクトロポレーション手法（
指示マニュアル、バイオラド社、カリフォルニア州リッ
チモンド）により、これらのプラスミドを結晶非生産性
のＢ．ｔ．菌株ＨＤ−１　ｃｒｙＢ［アロンソン・エイ
（Ａｒｏｎｓｏｎ，　Ａ．）、パーデュー大学、インデ
ィアナ州ウェストラファイエット］に形質転換した。組
替えＢ．ｔ．菌株ＨＤ−１　ｃｒｙＢ［ｐＭＹＣ２３１
１］及び［ｐＭＹＣ２３０９］を胞子形成まで生育させ
、タンパクを野性型Ｂ．ｔ．タンパクについて上述され
たとおりに、ＮａＢｒ勾配遠心分離によって精製した。 Ｂ．Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１ ６００　ｎｍで１．０の光学密度まで生育させたバシラ
ス・スリンギエンシスＰＳ５２Ａ１細胞から全細胞ＤＮ
Ａを調製した。 細胞を遠心分離によってペレット化し、プロトプラスト
緩衝液（０．３Ｍ庶糖、２５　ｍＭ　トリス−Ｃｌ［ｐ
Ｈ８．０］、２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ中リゾチーム２０　
ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁させた。３７℃で１時間培養後
、２回の冷凍／解凍サイクルでプロトプラストを溶菌さ
せた。溶菌を終了させるため、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、０
．１％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス−Ｃｌの溶液９倍量を加
えた。透明になった溶菌液をフェノール：クロロホルム
（１：１）で２回抽出した。核酸を２倍量のエタノール
で沈殿させ、遠心分離によってペレット化した。ペレッ
トをＴＥ中で再懸濁させ、ＲＮアーゼを５０μｇ／ｍｌ
の最終濃度に添加した。 ３７℃で１時間培養後、フェノール：クロロホルム（１
：１）とＴＥ−飽和クロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽
出した。１／１０量の３Ｍ　ＮａＯＡｃと２倍量のエタ
ノールの添加によって、ＤＮＡを水相から沈殿させた。 ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタノ
ールで洗い、乾燥し、ＴＥ中で再懸濁した。　　制限断
片長多型性（ＲＦＬＰ）分析は、３２Ｐ−標識つきオリ
ゴヌクレオチドプローブのプローブ５２Ａ１−ＣとＢ．
ｔ．ＰＳ５２Ａ１ＤＮＡサザンブロットとの標準的なハ
イブリッド形成によって行なわれた。このプローブの配
列は次のとおりである。５’　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＡＴＴ
　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＡＡＡ　ＡＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＡ　
ＣＣＡＡＧＡ　ＣＡＴ　ＴＣＡ／Ｔ　ＴＴＡ　ＡＴＡ／
Ｔ　ＡＡＴ　ＡＣＡ／Ｔ　ＡＴＡ／ＴＡＡ　３’ハイブ
リッド形成帯は、約３．６　ｋｂｐ　Ｈｉｎｄ〓断片と
約８．６　ｋｂｐＥｃｏＲＶ断片を包含した。Ｓａｕ３
Ａで部分消化させたＢ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１ＤＮＡから遺
伝子ライブラリーを構築した。部分制限消化物をアガロ
ースゲル電気泳動で分画した。６．６−２３　ｋｂｐの
大きさのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ゲルスライス
から電気溶離し、Ｅｌｕｔｉｐ−Ｄイオン交換カラムで
の精製後、エタノール沈殿によって回収した。Ｓａｕ３
Ａ挿入物をＢａｍＨＩで消化させたラムダＧｅｍ−１１
（プロメガ）へ連結した。組替えファージをパッケージ
し、大腸菌ＫＷ２５１細胞（プロメガ）にプレートした
。放射性標識つきプローブ５２Ａ１−Ｃとのハイブリッ
ド形成によってプラークを選定した。ハイブリッド化フ
ァージをプラーク精製し、標準手順（マニアティスら）
によってファージＤＮＡの単離用大腸菌ＫＷ２５１細胞
の液体培養基の感染に使用した。二次クローン化には、
分離量のＤＮＡをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消化させ、ア
ガロースゲル上で電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有
する約３．１　ｋｂｐ帯をゲルから切り出し、ゲルスラ
イスから電気溶離し、上のようにイオン交換クロマトグ
ラフィによって精製した。精製されたＤＮＡ挿入物をＥ
ｃｏＲＩ＋ＳａｌＩで消化させたｐＨＴＢｌｕｅ〓（ｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳ／Ｋ［ストラタジーン］と、レ
ジデントＢ．ｔ．プラスミドからの複製開始点とからな
る大腸菌／Ｂ・スリンギエンシスシャトルベクター［デ
ィー・レレクルスら（１９８９年）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６０巻２１１−２
１８頁］）へ連結した。連結混合物を使用して、凍結コ
ンピテント大腸菌ＮＭ５２２（ＡＴＣＣ　４７０００）
に形質転換した。形質転換体をアンピシリン、イソプロ
ピル−（β）−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び
５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ
−ガラクトシド（ＸＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上にプ
レートした。 プラスミドをアルカリ溶菌（マニアチスら）によって推
定組替え体から精製し、アガロースゲル上のＥｃｏＲＩ
及びＳａｌＩ消化物の電気泳動によって分析した。所望
のプラスミド構造体ｐＭＹＣ２３２１は、殺線虫タンパ
クをコード化したその他の毒素遺伝子の地図に較べて新
規な毒素遺伝子を含有する。プラスミドｐＭＹＣ２３２
１をエレクトロポレーションにより、結晶非生産性Ｂ．
ｔ．菌株ｃｒｙＢに導入した。約５５−６０　ｋＤａの
結晶タンパクの発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び殺線
虫活性によって検証された。プラチレンクス・スクリブ
ネリ（Ｐｌａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ　ｓｃｒｉｂｎｅｒｉ
）（植物寄生性）及びパナグレルス・レジビブス（Ｐａ
ｎａｇｒｅｌｌｕｓ　ｒｅｄｉｖｉｖｕｓ）（自由生活
性）に対するクローン化遺伝子生成物の毒性決定のため
、ＮａＢｒ精製された結晶を調製した（前掲ファンネン
スチールら）。クローン化遺伝子生成物はこれらの線虫
類に対して活性であった。 Ｃ．Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２ ６００　ｎｍで１．０の光学密度まで生育させたＢ．ｔ
．ＰＳ３３Ｆ２細胞から全細胞ＤＮＡを調製した。細胞
を遠心分離によってペレット化し、プロトプラスト緩衝
液（０．３Ｍ庶糖、２５　ｍＭ　トリス−Ｃｌ［ｐＨ８
．０］、２５　ｍＭ　ＥＤＴＡ中リゾチーム２０　ｍｇ
／ｍｌ）中に再懸濁させた。３７℃で１時間培養後、０
．１Ｍ　ＮａＣｌ、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍ　トリス
−Ｃｌの溶液９倍量の添加に続いて２回の冷凍／解凍サ
イクルによってプロトプラストを溶菌させた。透明にな
った溶菌液をフェノール：クロロホルム（１：１）で２
回抽出した。核酸を２倍量のエタノールで沈殿させ、遠
心分離によってペレット化した。 ペレットを１０　ｍＭ　トリス−Ｃｌ、１　ｍＭ　ＥＤ
ＴＡ（ＴＥ）中で再懸濁させ、ＲＮアーゼ（リボヌクレ
ア−ゼ）を５０μｇ／ｍｌの最終濃度に添加した。３７
℃で１時間培養後、溶液をフェノール：クロロホルム（
１：１）とＴＥ−飽和クロロホルムでそれぞれ１回ずつ
抽出した。１／１０量の３Ｍ　ＮａＯＡｃと２倍量のエ
タノールの添加によって、ＤＮＡを水相から沈殿させた
。ＤＮＡを遠心分離によってペレット化し、７０％エタ
ノールで洗い、乾燥し、ＴＥ中に再懸濁した。上記のよ
うに調製されたプロトプラストからプラスミドＤＮＡを
抽出した。１０ｍＭトリス−Ｃｌ、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
、０．０８５Ｎ　ＮａＯＨ、０．１％ＳＤＳの溶液（ｐ
Ｈ＝８．０）９倍量の添加によって、プロトプラストを
溶菌した。溶菌を終了させるため、１％の最終濃度まで
ＳＤＳを添加した。次に３Ｍ　ＫＯＡｃ２分の１容量を
加え、細胞材料を４℃で一夜沈殿させた。遠心分離後、
ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、塩化セシウム−臭化エ
チジウム勾配上の密度匂配平衡遠心によってプラスミド
を精製した。ＰＳ３３Ｆ２プラスミド及び全細胞ＤＮＡ
のサザンブロットと、実施例２に既述されたＮ−末端ア
ミノ酸配列用に設計された３２Ｐ標識つきオリゴヌクレ
オチドプローブとの標準的なハイブリッド形成によって
ＲＦＬＰ分析を行なった。 　　プローブ３３Ｆ２Ａ：　 　　　　５’ＧＣＡ／Ｔ　ＡＣＡ／Ｔ　ＴＴＡ　ＡＡＴ
　ＧＡＡ　ＧＴＡ／Ｔ　ＴＡＴ　　３’　　プローブ３
３Ｆ２Ｂ： 　　　　５’ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＴＡ／Ｔ　ＴＡＴ　Ｃ
ＣＡ／Ｔ　ＧＴＡ／Ｔ　ＡＡＴ　　３’ハイブリッド形
成帯は約５．８５　ｋｂｐＥｃｏＲＩ断片を包含した。 プローブ３３Ｆ２Ａと逆ＰＣＲプライマーは、ＰＳ３３
Ｆ２毒素遺伝子のクローン化用のハイブリッド形成プロ
ーブとして使用される約１．８　ｋｂｐのＤＮＡ断片を
増幅するために使用された。逆プライマーの配列は以下
のとおりであった。 ５’ＧＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＡＡ
ＡＴＴＣＡＡＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｃ／Ｔ　Ｔ／Ｇ
　Ａ／Ｇ　ＴＣ　Ｔ／Ａ　Ａ　　３’ＥｃｏＲＩで消化
させたＰＳ３３Ｆ２プラスミドＤＮＡから遺伝子ライブ
ラリーを構築した。制限消化物をアガロースゲル電気泳
動で分画した。ＤＮＡ断片４．３−６．６　ｋｂｐをゲ
ルから切り出し、ゲルスライスから電気溶離し、Ｅｌｕ
ｔｉｐ−Ｄイオン交換カラム（シュライチャー・エンド
・シュエル社、ニューハンプシャー州キーン）上で精製
後、エタノール沈殿によって回収した。ＥｃｏＲＩ挿入
物をＥｃｏＲＩで消化させたｐＨＴＢｌｕｅ〓（ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔＳ／Ｋ［ストラタジーン］と、レジデ
ントＢ．ｔ．プラスミドからの複製開始点とからなる大
腸菌／Ｂ・スリンギエンシスシャトルベクター［ディー
・レレクルスら（１９８９年）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６０巻２１１−２１８
頁］）へ連結した。連結混合物を使用して、凍結コンピ
テントＮＭ５２２（ＡＴＣＣ　４７０００）に形質転換
した。形質転換体をアンピシリン、イソプロピル−（β
）−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及び５−ブロモ
−４−クロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ−ガラクト
シド（ＸＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上にプレートした
。上記の放射性標識つきＰＣＲ増幅されたプローブとの
ハイブリッド形成によって、集落を選定した。プラスミ
ドをアルカリ溶菌によって想定上の毒素遺伝子クローン
から精製し、制限消化物のアガロースゲル電気泳動によ
って分析した。所望のプラスミド構造体ｐＭＹＣ２３１
６は、約５．８５　ｋｂｐＥｃｏＲＩ挿入物を含有する
。このＤＮＡ断片（３３Ｆ２ａ）上にある毒素遺伝子は
、殺線虫タンパクをコード化したその他の毒素遺伝子の
ＤＮＡ配列に比べて新規である。　　プラスミドｐＭＹ
Ｃ２３１６をエレクトロポレーションにより、結晶非生
産性の（Ｃｒｙ−）Ｂ．ｔ．ホストＨＤ−１　ＣｒｙＢ
に導入した。約１２０−１４０　ｋＤａの結晶タンパク
の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検証された。 プラチレンクス（Ｐｌａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）種に対す
るクローン化遺伝子生成物の毒性決定のため、ＮａＢｒ
勾配（前掲エム・エイ・ファンネンスチールら、１９８
４年）上で結晶を精製した。 Ｄ．Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１ 他の分離体について上に記述されたとおりに、全細胞Ｄ
ＮＡをＢ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１から調製した。ＲＦＬＰ分
析は、６９Ｄ１−Ｄと指定された３２Ｐ標識つきオリゴ
ヌクレオチドプローブとＰＳ６９Ｄ１ＤＮＡのサザンブ
ロットとの標準的なハイブリッド形成によって行なわれ
た。６９Ｄ１−Ｄプローブの配列は以下のとおりである
。 　　５’ＡＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　Ｇ
ＣＡ　ＣＡＴ　ＡＴＴ　ＴＴＴ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＧＣＡ　ＡＣＡ　ＣＡＡ　ＡＡ
　　３’ハイブリッド形成帯は約２．０　ｋｂｐ　Ｈｉ
ｎｄ〓断片を含有した。Ｓａｕ３Ａで部分消化させたＰ
Ｓ６９Ｄ１ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを構築した。 部分的制限消化物をアガロースゲル電気泳動によって分
画した。６．６−２３　ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を
ゲルから切り出し、ゲルスライスから電気溶離し、Ｅｌ
ｕｔｉｐ−Ｄイオン交換カラムでの精製後、エタノール
沈殿によって回収した。Ｓａｕ３Ａ挿入物をＢａｍＨＩ
で消化させたラムダＧｅｍ−１１（プロメガ、ウィスコ
ンシン州マディソン）へ連結した。組替ファ−ジは大腸
菌ｋｗ２５１細胞上でパッケ−ジし、プレ−トにした（
ウィスコンシン州マディソンのプロメガ）。放射性標識
つき６９Ｄ１−Ｄオリゴヌクレオチドとのハイブリッド
形成によってプラークを選定した。ハイブリッド化ファ
ージをプラーク精製し、標準手順［マニアティスら、（
１９８２年）「分子クローニング：　　実験マニュアル
」ニューヨーク州コールドスプリングハーバー］によっ
てファージＤＮＡの単離用大腸菌ＫＷ２５１細胞の液体
培養基を感染するのに使用した。二次クローン化には、
分離量のＤＮＡをＨｉｎｄ〓で消化させ、アガロースゲ
ル上で電気泳動にかけた。毒素遺伝子を含有する約２．
０　ｋｂｐ帯をゲルから切り出し、ゲルスライスから電
気溶離し、上のようにイオン交換クロマトグラフィによ
って精製した。精製されたＤＮＡ挿入物を、Ｈｉｎｄ〓
で消化させたｐＨＴＢｌｕｅ〓（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔＳ／Ｋ［ストラタジーン、カリフォルニア州サンディ
エゴ］と、レジデントＢ．ｔ．プラスミドからの複製開
始点とからなる大腸菌／Ｂ．ｔ．シャトルベクター［デ
ィー・レレクルスら（１９８９年）ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　６０巻２１１−２
１８頁］）へ連結した。連結混合物を使用して、凍結コ
ンピテント大腸菌ＮＭ５２２細胞（ＡＴＣＣ　４７００
０）に形質転換した。形質転換体を５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドリル−（β）−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ
ＧＡＬ）を含有するＬＢ寒天上にプレートした。プラス
ミドをアルカリ溶菌（前掲マニアチスら）によって推定
組替え体から精製し、アガロースゲル上のＨｉｎｄ〓消
化物の電気泳動によって分析した。所望のプラスミド構
造体ｐＭＹＣ２３１７は、殺線虫タンパクをコード化し
たその他の毒素遺伝子の地図に較べて新規な毒素遺伝子
を含有する。 Ｅ．Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂ 実施例２は、標準エドマンタンパク配列決定法によって
決定されるとおりに、ＰＳ６３Ｂ毒素タンパクのアミノ
末端及び内部ポリペプチド配列を示す。これらの配列か
ら、δ−エンドトキシンをコード化したＢ．ｔ．遺伝子
から組立てられたコドン頻度表を用いて、二つのオリゴ
ヌクレオチドプライマーが設計された。順プライマー（
６３Ｂ−Ａ）の配列は、遺伝子の５’末端で推定される
ＤＮＡ配列と相補的であった。６３Ｂ−Ａ　−　５’　
ＣＡＡ　Ｔ／ＣＴＡ　ＣＡＡ　ＧＣＡ／Ｔ　ＣＡＡ　Ｃ
Ｃ３’逆プライマー（６３Ｂ−ＩＮＴ）の配列は、内部
推定されたＤＮＡ配列の逆配列と相補的であった。６３
Ｂ−ＩＮＴ　−　５’　ＴＴＣ　ＡＴＣ　ＴＡＡ　ＡＡ
Ｔ　ＴＣＴ　ＴＴＧ　Ａ／ＴＡＣ　　３’これらのプラ
イマーは、ＤＮＡクローニングプローブとして使用され
る６３Ｂ毒素遺伝子の約４６０　ｂｐ断片を増幅するた
めに、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（シータス・コー
ポレーション）で使用された。ＰＳ６３Ｂからの全細胞
ＤＮＡのサザンブロットを放射性標識つきＰＣＲプロー
ブとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成帯は約
４．４　ｋｂｐＸｂａＩ断片、約２．０　ｋｂｐＨｉｎ
ｄＩＩＩ断片、及び約６．４　ｋｂｐＳｐｅＩ断片を含
んでいた。実施例４　　Ｂ．ｔ．毒素タンパク及び遺伝
子生成物のカエノルハブジチス・エレガンスに対する活
性Ｓ−基本培地１　ｍｌ、アンピシリン０．５　ｍｇ、
及びコレステロール０．０１　ｍｇを含有するコーニン
グ（コーニング・ガラス・ワークス、ニューヨーク州コ
ーニング）の２４穴組織培養基プレート中で、シンプキ
ン及びコールズ（Ｊ．　Ｃｈｅｍ．　Ｔｅｃｈ．　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．　３１巻６６−６９頁、１９８１年
）に記述のとおりにカエノルハブジチス・エレガンス（
ＣＥ）を培養した。各穴は、大腸菌菌株ＯＰ−５０（ウ
ラシル栄養要求株）の細胞約１０８個も含有した。各穴
当たり１００−２００個のＣＥを穴に接種し、２０℃で
培養した。タンパク試料（野性型Ｂ．ｔ．又は組替えＢ
．ｔ．から得られたもの）を連続希釈によって穴に添加
した。水は、対照として、またタンパクを穴に導入する
ビヒクルとしての役目を果たした。各穴を毎日検査し、
代表的な結果は以下のとおりである。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　％致死率　　　　　　　　μｇ毒素　　
　　　　　ｐＭＹＣ２３０９　　　　　　　　ｐＭＹＣ
２３１１　　　　　　　　ＰＳ１７　　　　　　　　　
　１００　　　　　　　　　　　　２５　　　　　　　
　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　７５　
　　　　　　　　　　３２　　　　　　　　　　　　２
５　　　　　　　　　　　　　　５０　　　　　　　　
　　　　　７５　　　　　　　　　　　１０　　　　　
　　　　　　　５０　　　　　　　　　　　　　　２５
　　　　　　　　　　　　　５０　　　　　　　　　　
　　１　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　　　０実施
例５　　植物線虫プラチレンクス種に対する活性Ｂ．ｔ
．ＰＳ１７ａによってコード化された毒素は、プラチレ
ンクス種に対して活性があることがわかった。活性は、
実施例４でＣ・エレガンスに対して明らかにされたもの
とほぼ同水準にあるプラチレンクス種、例えばＰ・スク
リブネリとＰ・レジビブスは、トウモロコシ、落花生、
大豆、アルファルファ、ビーン、トマト、かんきつ類を
含めた多くの経済的に重要な作物の知られた病原体であ
る。これらの「根病変性」線虫類は、第二の経済的に最
も被害を与える属の植物寄生線虫類（メリオドギネ　−
　すなわち「根こぶ線虫」にちなむ）であり、移動性内
部寄生虫を典型的に代表している。ガンバーグＢ５培地
（ＧＩＢＣＯＲラボラトリーズ、ニューヨーク州グラン
ドアイランド）中で、切り取ったトウモロコシ根でプラ
チレンクス種を無菌的に生育させた。ツァイ（Ｔｓａｉ
）及びバン・ガンディ（ｖａｎ　Ｇｕｎｄｙ）［Ｊ．　
Ｎｅｍａｔｏｌ．　２２巻（３号）３２７−３３２頁］
に記述されたとおりに、第３−４齢幼虫を使用して、２
４穴検定プレート（コーニング＃２５８２０）中で生物
検定を行なった。各穴に約２０匹の線虫を入れた。計８
０−１６０匹の線虫を各処理に使用した。手で支えるダ
ウンスホモジナイザーを使用して、水溶液中にタンパク
試料を懸濁させた。致死率は処置の３日又は７日後に肉
眼で評価された。幼虫がほぼまっすぐになっていて、先
の尖っていない探り針でつついても動かず、反応しない
ものは、死にかかっていると考えられた。代表的な結果
は以下のとおりである。 　　　　　　　　毒素　　　　　　率（ｐｐｍ）　　　
　　　　処置後日数　　　　　　致死率％　　　　　　
　　ＰＳ３３Ｆ２　　　　　　７５　　　　　　　　　
　　　　　　　３　　　　　　　　　　　　　　７８　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　
　　　　　　　　　　　　　３　　　　　　　　　　　
　　　１２　　　　　　　　ＰＳ５２Ａ１　　　　　２
００　　　　　　　　　　　　　　　　７　　　　　　
　　　　　　　　７５　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　　　　　７
　　　　　　　　　　　　　　　５実施例６　　パナグ
レルス・レジビブスに対するＢ・スリンギエンシス分離
体の活性 ぜん虫を管に集め、約１５分落着かせ、水を傾斜させ、
水が澄んでくるまで、３回か４回新しい水と取り替える
。 ２５０μｌのリンスした線虫（２０−３０匹）と胞子／
結晶懸濁液１００μｌをトレーの各穴の中の６５０μｌ
の水に添加する。 線虫類を数え、数を記録する。４日後、生きている虫を
数え、致死率を計算する。〔生物検定結果〕先行技術（
ＵＳＳＮ　０８４，６５３、１９８７年８月１２日出願
）Ｂ．ｔ．菌株番号　　　　　　　　　　　　　　致死
率ＰＳ１７　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９
０％ＰＳ３３Ｆ２　　　　　　　　　　　　　　　　　
３０％ＰＳ５２Ａ１　　　　　　　　　　　　　　　　
１００％ＰＳ６３Ｂ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　９２％ＰＳ６９Ｄ１　　　　　　　　　　　　　　
　　１００％新規なＢ．ｔ．菌株番号 ＰＳ８０ＪＪ１　　　　　　　　　　　　　　　　９９
％ＰＳ１５８Ｄ５　　　　　　　　　　　　　　　　９
９％ＰＳ１６７Ｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　
９６％ＰＳ１６９Ｅ　　　　　　　　　　　　　　　　
１００％ＰＳ１７７Ｆ１　　　　　　　　　　　　　　
　　９６％ＰＳ１７７Ｇ　　　　　　　　　　　　　　
　　１００％ＰＳ２０４Ｇ４　　　　　　　　　　　　
　　　１００％ＰＳ２０４Ｇ６　　　　　　　　　　　
　　　　１００％対照　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０％次の表は、先行技術のＢ．ｔ．菌株と比
較した、各々の新規な線虫活性菌株におけるアルカリ可
溶性タンパク分子の長さを示す。 　　　　　　　　　　　　　　先行技術の線虫活性菌株
　　　　　　　　Ｂ．ｔ．菌株　　　　　　　　タンパ
ク分子の大体の長さ（ｋＤａ）　　　　　　　　ＰＳ１
７　　　　　　　　　　　　１５５，　１４５，　１３
５　　　　　　　　ＰＳ３３Ｆ２　　　　　　　　　　
１４０，　９４，　８６，　６８，　６５，　６２　　
　　　　　　ＰＳ５２Ａ１　　　　　　　　　　５７，
　４５　　　　　　　　ＰＳ６３Ｂ　　　　　　　　　
　　８４，　８２，　７８　　　　　　　　ＰＳ６９Ｄ
１　　　　　　　　　　１３５，　４６，　３２　　　
　　　　　　　　　　　新規な線虫活性菌株　　　　　
　　　Ｂ．ｔ．菌株　　　　　　　　タンパク分子の大
体の長さ（ｋＤａ）　　　　　　　　ＰＳ８０ＪＪ１　
　　　　　　　　１３０，　９０，　４７，　３７　　
　　　　　　ＰＳ１５８Ｄ５　　　　　　　　　８０　
　　　　　　　ＰＳ１６７Ｐ　　　　　　　　　　１２
０　　　　　　　　ＰＳ１６９Ｅ　　　　　　　　　　
１５０，　１２８，　３３　　　　　　　　ＰＳ１７７
Ｆ１　　　　　　　　　１４０，　１１６，　１０３，
　６２　　　　　　　　ＰＳ１７７Ｇ　　　　　　　　
　　１３５，　１２５，　１０７，　９８，　６２　　
　　　　　　ＰＳ２０４Ｇ４　　　　　　　　　１０５
，　９８，　９０，　６０，　４４，　３７　　　　　
　　　ＰＳ２０４Ｇ６　　　　　　　　　２３，　２１
実施例７　　ファスキオラ・ヘパチカに対する活性Ｂ．
ｔ．タンパクを発現する野性型Ｂ．ｔ．分離体及び組替
え微生物が生産する毒素を、その殺吸虫活性について試
験した。生体外培養基（３７℃、５％ＣＯ２）は、イバ
ラ（Ｉｂａｒｒａ）及びジェンキンズ（Ｊｅｎｋｉｎｓ
）［Ｚ．　Ｐａｒａｓｉｔｅｎｋｄ．　７０巻６５５−
６６１頁、１９８４年］の変法によった。培養基培地は
、５０％ｖ／ｖうさぎ血清及び２％ｖ／ｖうさぎＲＢＣ
を加えたＲＰＭＩ（ｐＨ　７．５）からなっていた。　
　〔試験化合物〕　　下記の実験で、肝臓吸虫への種々
の物質の影響を試験し、比較した。本明細書で使用され
る化合物ＰＳ１７は、上記のように、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７
の培養基から回収精製される毒素のことである。化合物
ＰＳ１７ａは、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ａと指定されるＢ．ｔ
．遺伝子で形質転換された組替え微生物の培養基から回
収精製された毒素のことである。化合物Ｃは、陰性対照
として使用された処方剤ブランクである。ＡＢＺは、ス
ミスクリン・ビーチャム社（ネブラスカ州リンカーン）
から得られる薬剤アルベンダゾールのことである。化合
物ＰＳ１７、ＰＳ１７ａ、及びＣは１００　ｐｐｍで培
地に直接添加され、ＡＢＺは培地添加に先立って、無水
エタノール１００μｌに溶解された。　　〔効力の基準
〕　　倒立顕微鏡を４０Ｘで使用し、吸虫を未処理対照
吸虫と比較して、死亡、致死率の乱れ、又は形態的変化
によって証拠づけられる薬剤処理の効果について、３−
８時間に毎時間、次いで１日１回又は２回の検査を行な
った。実験的に感染させたうさぎの肝臓から取り出した
生後３週間のファスキオラ・ヘパチカを、１．６　ｃｍ
のリンボ培養基プレート穴（培地２　ｍｌ、各穴に４−
６匹）中で５日間、生体外で培養した。５日間の培養後
、化合物ＰＳ１７ａ（１００　ｐｐｍ、５匹）、化合物
ＰＳ１７（１００　ｐｐｍ、６匹）を含有する培地と未
処理対照培地（４匹）に吸虫を移した。化合物ＰＳ１７
ａ中では、１８時間までに全吸虫が死亡した。化合物Ｐ
Ｓ１７中では、培地対照中の生存吸虫３匹に比べ、２４
時間に１匹のみ生存した（動きはにぶい）。形態的検査
のため全吸虫を固定し、染色した。 死亡吸虫の分析に起因するものを除いて、明白な形態的
変化は観察されなかった。５日の培養前期間中、吸虫は
活発な状態にあり、明らかに活発な消化機能をもって培
地からＲＢＣを摂取するのが見られた。 　　　　　　　表１．　　未成熟Ｆ・ヘパチカ（生後３
週、うさぎ起源）の生存数　　　　　　　　　　　　　
　　　　　化合物ＰＳ１７ａ　　　　　　　化合物ＰＳ
１７　　　　　　　　　　観察時間　　　　　　　　１
００　ｐｐｍ　　　　　　　　　　　１００　ｐｐｍ　
　　　　　　培地対照　　　　　　　　０　　　　　　
　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　
６　　　　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　
５分　　　　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　
　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　　　４　　
　　　　　　１時間　　　　　　　　　　　５　　　　
　　　　　　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　
　　４　　　　　　　　２時間　　　　　　　　　　　
５　　　　　　　　　　　　　　　６　　　　　　　　
　　　　　　　４　　　　　　　　３時間　　　　　　
　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　　６　　　
　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　　６時間　
　　　　　　　　　　５　　　　　　　　　　　　　　
　６　　　　　　　　　　　　　　　４　　　　　　　
　　　８時間　　　　　　　　　　　５　　　　　　　
　　　　　　　　６　　　　　　　　　　　　　　　４
　　　　　　　１８時間　　　　　　　　　　　０　　
　　　　　　　　　４（動きにぶい）　　　　　　　３
　　　　　　　２４時間　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１（動きにぶい）　　　　　　　３
　　自然感染の子牛から回収された成熟吸虫４匹を、培
地５　ｍｌの入った２５　ｃｍ２組織培養基フラスコ中
で、別個に２４時間生体外培養し、次に化合物ＰＳ１７
ａ（１００　ｐｐｍ）、化合物ＰＳ１７（１００　ｐｐ
ｍ）、ＡＢＺ（１０　ｐｐｍ）又は未処理培地を含有す
る同様なフラスコに移した（表２）。化合物ＰＳ１７ａ
中の吸虫は、１０時間と１８時間のあいだに死亡し、化
合物ＰＳ１７中では１８時間と２０時間のあいだ、また
ＡＢＺ中では６４時間までに死亡した。培地対照吸虫は
、混濁と黄色の培地着色で証拠立てられるように、汚染
との関連で、７２時間に死亡した。これらの吸虫は、試
験開始に先立って５日間、ＲＰＭＩ　４９％　＋　うさ
ぎ血清４９％　＋うさぎＲＢＣ２％中で培養された。実
験は２４時間後に終り、形態的検査のため全吸虫を固定
した。致死に先立つ吸虫の行動は、動きの不活発と培地
表面へ口の吸盤を向けることを伴っていた。 死亡時に体は収縮し、分解に先立って弛緩する。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
表２．　　成熟吸虫生存数　　　　　　　　　　　　　
　化合物ＰＳ１７ａ　　　　化合物ＰＳ１７　　　アル
ベンダ　　　　観察時間　　　　　　　　１００　ｐｐ
ｍ　　　　　　　１００　ｐｐｍ　　　　　ゾール１０
　ｐｐｍ　　　　　培地対照　　０　　　　　　　　　
　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　１　　　　
　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　
　　１　　５分　　　　　　　　　　　　　　１　　　
　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　
１　　　　　　　　　　　　　　　１　　１時間　　　
　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　１　　
　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　
　　　　１　　２時間　　　　　　　　　　　　１　　
　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　
　１　　　　　　　　　　　　　　　１　　３時間　　
　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　
　　　　　１　　６時間　　　　　　　　　　　　１　
　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　　
　　１　　　　　　　　　　　　　　　１　　８時間　
　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　１
　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　
　　　　　　１　１０時間　　　　　　　　　　　　１
　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　　　　　
　　　１　　　　　　　　　　　　　　　１　１８時間
　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　　
１＊　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　　
　　　　　　　１　２０時間　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　　
　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　１　３１時
間　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　　　　
　　　　　　　　１　６０時間　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１　　　　　　　　　　　　　　　１　６４
時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　
　　　　　　　　　１　７２時間　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０＊＊
　　　　＊　　　にぶい動き 　　　　＊＊　　体が収縮し、くねっている。培地は混
濁。 実施例８ 既知の効力をもった薬剤アルベンダゾール（ＡＢＺ）及
び未処理培地対照とに対する化合物ＰＳ１７とＰＳ１７
ａの効力を試験するために、追加実験を行なった。試験
は、１）　自然感染の子牛から取り出された成熟吸虫、
及び２）　うさぎ起源の生後５週間の未成熟吸虫、に対
して行なった。 〔未成熟吸虫〕　　生後５週間の未成熟Ｆ・ヘパチカを
、実験的に感染させたうさぎ肝臓から取り出し、三重試
験で培養基培地（１．６　ｃｍリンボ培養プレート、穴
当たり２−３匹）に入れた。次に化合物ＰＳ１７ａ（１
００　ｐｐｍ）、化合物ＰＳ１７（１００　ｐｐｍ）、
アルベンダゾール（ＡＢＺ，　１０　ｐｐｍ）、又は未
処理培地（表３）各２　ｍｌを含有する同様なリンボプ
レートに吸虫を移した。化合物ＰＳ１７ａでは、７匹中
全部が２０時間までに死亡した。暴露後８時間で、にぶ
い動きが認められた。化合物ＰＳ１７では、致死率（７
匹中２匹）と生存吸虫のにぶい動きが２０時間で認めら
れ、３１時間で７匹中５匹が死亡した。４８時間では、
全吸虫が死亡した。ＡＢＺ陽性対照では、７匹中１匹が
２０時間で死亡し、３１時間までに４匹が死亡し、残り
の吸虫は６０時間までに死亡した。未処理対照培地では
、３１時間に７匹中２匹、４８時間に３匹、５５時間に
４匹、６０時間に５匹、及び７２時間に７匹全部が死亡
した。（注：暴露後３５時間で、幾つかの穴の表層が混
濁したきた。全吸虫をＲＰＭＩ中で洗い、元の薬剤濃度
で新しい培地を含有する穴に移した。）〔成熟吸虫〕　
　肝蛭症のため廃棄処分にされた子牛肝臓３個（ロウチ
ャー・ミートパッキング社、ルイジアナ州プラークマイ
ン）から取り出した成熟吸虫を、無菌食塩水で洗い、食
塩水中に保持し（２−３時間）、化合物ＰＳ１７ａ（１
００　ｐｐｍ）、化合物ＰＳ１７（１００　ｐｐｍ）、
アルベンダゾール（ＡＢＺ，　１０　ｐｐｍ）、又は未
処理培地（表４）を含有する２５　ｍｌの組織培養フラ
スコ２個の各々に４匹の吸虫を入れた。化合物ＰＳ１７
ａでは１０−１１時間に、化合物ＰＳ１７では２０時間
に全吸虫が死亡した。ＡＢＺ中では、４８−５４時間に
吸虫が死亡した。対照培地では２匹が４８時間に死亡し
、６６時間までに全吸虫が死亡した。（注：　　３１−
４８時間にフラスコの汚染が認められた。）　　　　　
　　　　　表３．　　未成熟吸虫（うさぎ起源、生後５
週間）の生存数　　　　　　　　　　　　　　化合物Ｐ
Ｓ１７ａ　　　　化合物ＰＳ１７　　　アルベンダ　　
　　観察時間　　　　　　　　１００　ｐｐｍ　　　　
　　　１００　ｐｐｍ　　　　　ゾール１０　ｐｐｍ　
　　　　培地対照　　　　　　　　　　　　　　Ｗ１　
　　Ｗ２　　Ｗ３　　　Ｗ１　　　Ｗ２　　Ｗ３　　　
Ｗ１　　　Ｗ２　　　Ｗ３　　　　Ｗ１　　　Ｗ２　　
　Ｗ３　　０　　　　　　　　　　　２　　　　２　　
　３　　　　２　　　　２　　　３　　　　２　　　　
２　　　　２　　　　　２　　　　２　　　　３　　５
分　　　　　　　　　２　　　　２　　　３　　　　２
　　　　２　　　３　　　　２　　　　２　　　　２　
　　　　２　　　　２　　　　３　　１時間　　　　　
　　２　　　　２　　　３　　　　２　　　　２　　　
３　　　　２　　　　２　　　　２　　　　　２　　　
　２　　　　３　　２時間　　　　　　　２　　　　２
　　　３　　　　２　　　　２　　　３　　　　２　　
　　２　　　　２　　　　　２　　　　２　　　　３　
　３時間　　　　　　　２　　　　２　　　３　　　　
２　　　　２　　　３　　　　２　　　　２　　　　２
　　　　　２　　　　２　　　　３　　６時間　　　　
　　　２　　　　２　　　３　　　　２　　　　２　　
　３　　　　２　　　　２　　　　２　　　　　２　　
　　２　　　　３　　８時間　　　　　　　２＊　　　
２＊　　３＊　　　２　　　　２　　　３　　　　２　
　　　２　　　　２　　　　　２　　　　２　　　　３
　２０時間　　　　　　　０　　　　０　　　０　　　
　２＊　　　２＊　　１＊　　　２　　　　２　　　　
２　　　　　２　　　　２　　　　３　３１時間　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　１＊　　　０　
　　１＊　　　１　　　　１　　　　１　　　　　２　
　　　２　　　　１３５時間　　　　　注：幾つかの穴
の表層は混濁していた。培地を代え、吸虫をＲＰＭＩの
みで洗った。洗った生存吸虫を、元の濃度の薬剤を加え
た新しい培地に移した。 　４８時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　０　　　　０　　　０　　　　１　　　　１　　　　
１　　　　　１　　　　２　　　　１　５５時間　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１　　　　１　　　　１　　　　　１　
　　　２　６０時間　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　０
　　　　０　　　　　１＊　　　１＊　　　０　７２　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　０　　　　０　　　　０　　　　＊　　動きの
にぶい吸虫。 　　　　　　　　　　　　　　　　　表４．　　成熟吸
虫（牛起源）に対する効果　　　　　　　　　　　　　
　化合物ＰＳ１７ａ　　　　化合物ＰＳ１７　　　アル
ベンダ　　　　観察時間　　　　　　　　１００　ｐｐ
ｍ　　　　　　　１００　ｐｐｍ　　　　　ゾール１０
　ｐｐｍ　　　　　培地対照　　　　フラスコ　　　　
１　　　　２　　　　　　１　　　　２　　　　　　１
　　　　２　　　　　　１　　　　　　２　　０　　　
　　　　　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４
　　　　　４　　　　　　　４　　　　　４　　　　　
　　４　　　　　　　４　　５分　　　　　　　　　　
　４　　　　　４　　　　　　　４　　　　　４　　　
　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　　　　　　
　４　　１時間　　　　　　　　　４　　　　　４　　
　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　　　　　
４　　　　　　　４　　　　　　　４　　２時間　　　
　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　　　　
　４　　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　
　　　　　　４　　３時間　　　　　　　　　４　　　
　　４　　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４
　　　　　４　　　　　　　４　　　　　　　４　　８
時間　　　　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　
４　　　　　４　　　　　　　４　　　　　４　　　　
　　　４　　　　　　　４　１０−１１時間　　　　　
　０　　　　　０　　　　　　　４　　　　　４　　　
　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　　　　　　
　４　１８時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　４＊　　　　４＊　　　　　　４　　　　　
４　　　　　　　４　　　　　　　４　２０時間　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０　　　　
　０　　　　　　　４　　　　　４　　　　　　　４　
　　　　　　４　３１時間　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　４
　　　　　４　　　　　　　４　　　　　　　４　４８
時間　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　２　　　　　３　　　　
　　　４　　　　　　　２　　　　　　　　　　　　　
　　　注：　　３１−４８時間に明白なフラスコ内の汚
染　　　　　　　　　　　　　５４時間　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０　　　　　０　　　　　　　３　　　　　
　　１　６６時間　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０　　　　　　　０　　　　＊　　
にぶい動き 実施例９ 廃棄処分の子牛肝臓の胆管から吸虫を回収し、無菌のＲ
ＰＭＩ中で１０−２０匹ずつの群で２−３時間洗った。 ６穴リンブロ組織培養基プレート（サイズ１０　ｍｌ）
の、処理又は未処理培地４　ｍｌを含有する各穴で、１
匹ずつの吸虫を培養した。知られた殺吸虫活性をもたな
い処方ブランク（化合物Ｃ）も試験した。潜在的汚染源
を確認するために、２％ＲＢＣを加えた培地対照と２％
ＲＢＣなしの培地対照を包含する追加の対照を加えた。 ＡＢＺ濃度を２５　ｐｐｍに高めた。 汚染源の制御のため、薬剤又は培地のみを含有する対照
穴も含まれた。この実験は、１２のレプリカを包含した
（表５）。これらレプリカのうち６は処理又は未処理培
地のみの穴に対応した。化合物ＰＳ１７ａについては、
１２匹全部が１２時間までに死亡し、弱い動きが１０時
間の早い時期に観察された。化合物ＰＳ１７の吸虫全部
は１９時間又は２４時間の観察期までに死亡した。化合
物Ｃの吸虫致死率は、３６−５８時間に観察された。２
％ＲＢＣを加えた培地と２％ＲＢＣを加えない対照培地
では、１匹が３６時間に、２匹が５８時間に、及び３匹
が７２時間に死亡した。１匹は、２％ＲＢＣを加えた培
地で１１５時間生存した。１２レプリカのうち８匹、及
び対応培地対照の６匹のうち２匹については、暴露後２
４時間で、吸虫を入れた穴と吸虫を入れない穴とも、培
地を選択的に変更した。この余分の取扱い手順で、培地
の混濁と黄変から証拠づけられるように、明らかに汚染
のため、８レプリカのうち６匹が５８時間までに死亡す
る結果となった。２４時間で培地を変えた２レプリカは
、汚染されなかった。６培地対照（吸虫なし）レプリカ
は、１１５時間の培養中、汚染されなかった。 　　　　　表５．　　成熟ファスキオラ・ヘパチカ（牛
起源）に対する生体外効力　　　　　　　　化合物　　
　　　　化合物　　　　　　化合物　　　　ＡＢＺ　　
　　　　　培地　　　　培地時間　　　　ＰＳ１７ａ　
　　　　　　ＰＳ１７　　　　　　　　　　Ｃ　　　　
　　　　　　　　　　　　ＲＢＣ　　　　　ＲＢＣ　　
　　　　　　１００　ｐｐｍ　　　　　１００　ｐｐｍ
　　　　　１００　ｐｐｍ　　　２５　ｐｐｍ　　　　
なし　　　　あり　　　　１　　　　　　　１２　　　
　　　　　　　１２　　　　　　　　　　１２　　　　
　　　　１２　　　　　　　１２　　　　　　１２　　
２　　　　　　　１２　　　　　　　　　　１２　　　
　　　　　　　１２　　　　　　　　１２　　　　　　
　１２　　　　　　１２　　３　　　　　　　１２　　
　　　　　　　　１２　　　　　　　　　　１２　　　
　　　　　１２　　　　　　　１２　　　　　　１２　
　　１０　　　　　　　１２＊　　　　　　　　　１２
　　　　　　　　　　１２　　　　　　　　１２　　　
　　　　１２　　　　　　１２　１４　　　　　　　　
０　　　　　　　　　　１２　　　　　　　　　　１２
　　　　　　　　１２　　　　　　　１２　　　　　　
１２　１９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
０　　　　　　　　　　１２　　　　　　　　１２　　
　　　　　１２　　　　　　１２　２４　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　０　　　　　　　　　　１
２　　　　　　　　１１　　　　　　　１２　　　　　
　１２　　　３６　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　８（５）１　　　　　７（
４）　　　　　１１（５）　　　１１（５）　４４　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　４（３）　　　　　　５（２）　　　　　１１（
５）　　　１１（５）　５８＊＊　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０（０）　　　
　　　２（０）　　　　　　５（０）　　　　５（０）
　７４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　　　　
　　　　４　　　　　　　４　　　９８　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０　　　　　　　　１　　　　　
　　２　　１１５　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　０　　　　　　　１　　＊　　　弱
い動きのみ。 １　　（２４時間に培地変更を受けたレプリカ中の吸虫
生存数）＊＊　　２４時間に培地変更を受けた８レプリ
カ中６で、恐らく追加取扱いに関連する汚染のため、全
吸虫が５８時間に死亡した。２４時間に変更を受けた培
地対照の２レプリカは、汚染されなかった。 実施例１０　　毒素遺伝子の植物への挿入本明細書で明
らかにされている新規な殺虫剤毒素をコードした新規な
遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエンス（Ａｇｒ
ｏｂａｃｔｅｒ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）からのＴｉ
プラスミドを使用して、植物細胞へ挿入できる。次に植
物細胞を植物へ再生させる［ザンブリスキ・ピー（Ｚａ
ｍｂｒｙｓｋｉ，　Ｐ．）、ジョース・エッチ（Ｊｏｏ
ｓ，　Ｈ．）、ジェンテロ・シー（Ｇｅｎｔｅｌｌｏ，
　Ｃ．）、リーマンス、ジェイ（Ｌｅｅｍａｎｓ，　Ｊ
．）、バン・モンタギュー・エム（Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａ
ｇｕｅ，　Ｍ．）、及びシェル・ジェイ（Ｓｃｈｅｌｌ
，　Ｊ．）（１９８３年）Ｃｅｌｌ　３２巻１０３３−
１０４３頁］。この点で、特に有用なベクターはｐＥＮ
Ｄ４Ｋである［クリー・エッチ・ジェイ（Ｋｌｅｅ，　
Ｈ．Ｊ．）、ヤノフスキー・エム・エフ（Ｙａｎｏｆｓ
ｋｙ，　Ｍ．Ｆ．）及びネスター・イー・ダブリュー（
Ｎｅｓｔｅｒ，　Ｅ．Ｗ．）（１９８５年）Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３巻６３７−６４２頁］。このプ
ラスミドは、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセンジ
ャー遺伝子に対して複数のクローニング位置をもってい
る。例えば毒素遺伝子はｐＥＮＤ４ＫのＢａｍＨＩ位置
へ挿入され、大腸菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質
転換される。実施例１１　　新規なＢ．スリンギエンシ
ス遺伝子のバクロウイルスへのクローニング本発明の新
規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕ
ｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核ポリヘ
ドロシスウイルス（ＡｃＮＰＶ）のようなバクロウイル
スへクローン化できる。ｐＵＣ８のような市販のクロー
ニングベクターにクローン化されたＡｃＮＰＶゲノムを
含有するプラスミドを構築できる。ＡｃＮＰＶゲノムを
変更し、ポリヘドリン遺伝子のコード領域が除かれて、
パッセンジャー遺伝子の特異なクローニング位置がポリ
ヘドリンプロモータの真後ろに置かれるようにする。こ
のようなベクターの例はペノックら［ペノック・ジー・
ディー（Ｐｅｎｎｏｃｋ，Ｇ．Ｄ．）、シューメーカー
・シー（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，　Ｃ．）及びミラー・エ
ル・ケイ（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｋ．）（１９８４年）Ｍ
ｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．４巻３９９−４０６頁］に
記述されたｐＧＰ−Ｂ６８７４、及びスミスら［スミス
・ジー・イー（Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．）、サマーズ・エ
ム・ディー（Ｓｕｍｍｅｒｓ，　Ｍ．Ｄ．）及びフレー
ザー・エム・ジェイ（１９８３年）Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ
　Ｂｉｏｌ．３巻２１５６−２１６５頁］に記述された
ｐＡＣ３８０である。本発明の新規なタンパク毒素をコ
ードした遺伝子は、コード領域から上流及び下流の適当
な領域で、ＢａｍＨＩリンカーによって変更でき、Ａｃ
ＮＰＶベクター類の一つのもののパッセンジャー位置に
挿入できる。本明細書に記載の実施例及び態様は、例示
目的だけのものであり、これらに関する種々の変更が当
業者に示唆され、かつ本出願の精神と目的、及び添付の
特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

図１〜２は連続して配列１即ち、ＰＳ１７ａのＤＮＡを
明らかにしている。図３〜４は連続して配列２即ち、Ｐ
Ｓ１７ａによってコード化された毒素のアミノ酸配列を
明らかにしている。図５〜６は連続して配列３即ち、Ｐ
Ｓ１７ｂのＤＮＡを明らかにしている。図７〜８は連続
して配列４即ち、ＰＳ１７ｂによってコード化された毒
素のアミノ酸配列を明らかにしている。図９〜１０は連
続して配列５即ち、ＰＳ３３Ｆ２からの遺伝子のヌクレ
オチド配列である。図１１〜１６は連続して配列６即ち
、ＰＳ３３Ｆ２からの遺伝子によって発現されるタンパ
クのアミノ酸配列である。図１７は配列７即ち、ＰＳ５
２Ａ１からの遺伝子のヌクレオチド配列である。図１８
〜１９は連続して配列８即ち、ＰＳ５２Ａ１からの遺伝
子によって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。 図２０は配列９即ち、ＰＳ６９Ｄ１からの遺伝子のヌク
レオチド配列である。図２１〜２２は連続して配列１０
即ち、ＰＳ６９Ｄ１からの遺伝子によって発現されるタ
ンパクのアミノ酸配列である。

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　線虫類に対して活性のあるバシラス・
   スリンギエンシス分離体であって、 （ａ）　バシラス・スリンギエンシス菌株ＰＳ８０ＪＪ
   １；（ｂ）　バシラス・スリンギエンシス菌株ＰＳ１５
   ８Ｄ５；（ｃ）　バシラス・スリンギエンシス菌株ＰＳ
   １６７Ｐ；（ｄ）　バシラス・スリンギエンシス菌株Ｐ
   Ｓ１６９Ｅ；（ｅ）　バシラス・スリンギエンシス菌株
   ＰＳ１７７Ｆ１；（ｆ）　バシラス・スリンギエンシス
   菌株ＰＳ１７７Ｇ；（ｇ）　バシラス・スリンギエンシ
   ス菌株ＰＳ２０４Ｇ４；及び（ｈ）　バシラス・スリン
   ギエンシス菌株ＰＳ２０４Ｇ６；からなる群から選ばれ
   る分離体。
2. 【請求項２】　　以下の群、すなわち （ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又
   はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｂ）　
   殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はその断
   片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　殺線虫毒
   素をコードした配列５に示す配列、又はその断片、を含
   めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒素をコー
   ドした配列７に示す配列、又はその断片、を含めてなる
   ヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコードした配
   列９に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオ
   チド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと命名される殺
   線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体から得られ
   る、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド配列
   、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制限断
   片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　ＸｂａＩハイブ
   リッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡを包含す
   るＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦ
   ＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもったもの； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと命名される殺線虫活性バ
   シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
   スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
   子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
   ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
   ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
   シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
   スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
   子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
   ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
   ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
   リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
   ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
   Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
   １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
   ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
   られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
   殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
   るＤＮＡ。
3. 【請求項３】　　配列２、配列４、配列６、配列８、及
   び配列１０に示す配列からなる群から選ばれるアミノ酸
   配列をもった殺線虫毒素をコード化したＤＮＡ。
4. 【請求項４】　　Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２、Ｂ．ｔ．ＰＳ
   ６３Ｂ、Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１
   、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ａ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｂ、Ｂ．ｔ．
   ＰＳ１７ｄ、及びＢ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定された遺伝
   子からなる群から選ばれる遺伝子を含めてなる組替えＤ
   ＮＡ運搬ベクター。
5. 【請求項５】　　ｐＭＹＣ２３１６、ｐＭＹＣ２３２１
   、ｐＭＹＣ２３１７、ｐＭＹＣ１６２７、ｐＭＹＣ１６
   ２８、ｐＭＹＣ２３０９、及びＰＭＹＣ２３１１からな
   る群から選ばれる、請求項４による組替えＤＮＡ運搬ベ
   クター。
6. 【請求項６】　　線虫に対して活性のある毒素であって
   、以下の配列、 （ａ）　配列２に示すアミノ酸配列、又は配列２に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分； （ｂ）　配列４に示すアミノ酸配列、又は配列４に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分； （ｃ）　配列６に示すアミノ酸配列、又は配列６に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分； （ｄ）　配列８に示すアミノ酸配列、又は配列８に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分；及び （ｅ）　配列１０に示すアミノ酸配列、又は配列１０に
   示す配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上
   記配列の任意の部分；の一つを含めてなるアミノ酸配列
   をもった毒素。
7. 【請求項７】　　バシラス・スリンギエンシス殺線虫毒
   素を発現させるために形質転換されるホスト細胞であっ
   て、上記毒素が以下の群、すなわち （ａ）　配列２に示すアミノ酸配列、又は配列２に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分を有する毒素； （ｂ）　配列４に示すアミノ酸配列、又は配列４に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分を有する毒素； （ｃ）　配列６に示すアミノ酸配列、又は配列６に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分を有する毒素； （ｄ）　配列８に示すアミノ酸配列、又は配列８に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分を有する毒素；及び （ｅ）　配列１０に示すアミノ酸配列、又は配列１０に
   示す配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上
   記配列の任意の部分を有する毒素；から選ばれる場合の
   ホスト細胞。
8. 【請求項８】　　（ａ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７８５の
   確認殺線虫特性をもった大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹ
   Ｃ２３１６）、（ｂ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８７７０の確
   認殺線虫特性をもった大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ
   ２３２１）、（ｃ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８８１６の確認
   殺線虫特性をもった大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ２
   ３１７）、（ｄ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６５１の確認特
   性をもった大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ１６２７）
   、（ｅ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８６５２の確認特性をもっ
   た大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ１６２８）、（ｆ）
   　大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ２３１１）、及び（
   ｇ）　大腸菌（ＮＭ５２２）（ｐＭＹＣ２３０９）から
   なる群から選ばれる、請求項７による形質転換された細
   菌ホスト。
9. 【請求項９】　　少なくとも一つの細胞内殺線虫毒素を
   含めてなる実質的に不活性の組替え細胞であって、上記
   毒素が （ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又
   はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｂ）　
   殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はその断
   片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　殺線虫毒
   素をコードした配列５に示す配列、又はその断片、を含
   めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒素をコー
   ドした配列７に示す配列、又はその断片、を含めてなる
   ヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコードした配
   列９に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオ
   チド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと指定される殺
   線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体から得られ
   る、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド配列
   、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制限断
   片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　ＸｂａＩハイブ
   リッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡを包含す
   るＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦ
   ＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもつもの； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと指定される殺線虫活性バ
   シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
   スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
   子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
   ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
   ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
   シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
   スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
   子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
   ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
   ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
   リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
   ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
   Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
   １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
   ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
   られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
   殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
   るＤＮＡによってコード化されたδ−エンドトキシンポ
   リペプチド毒素をコードしたバシラス・スリンギエンシ
   ス毒素遺伝子の発現結果である場合の組替え細胞。
10. 【請求項１０】　　請求項９の組替え細胞を含めてなる
    殺線虫組成物。
11. 【請求項１１】（ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１
    に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオチド
    配列； （ｂ）　殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又
    はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　
    殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はその断
    片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒
    素をコードした配列７に示す配列、又はその断片、を含
    めてなるヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコー
    ドした配列９に示す配列、又はその断片、を含めてなる
    ヌクレオチド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと指定
    される殺線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体か
    ら得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオ
    チド配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって
    、制限断片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　Ｘｂａ
    Ｉハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡ
    を包含するＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥ
    ＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもつも
    の； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
    リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
    ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
    Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
    １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
    ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
    られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
    殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
    るＤＮＡを含めてなる植物。
12. 【請求項１２】（ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１
    に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオチド
    配列； （ｂ）　殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又
    はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　
    殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はその断
    片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒
    素をコードした配列７に示す配列、又はその断片、を含
    めてなるヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコー
    ドした配列９に示す配列、又はその断片、を含めてなる
    ヌクレオチド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと指定
    される殺線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体か
    ら得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオ
    チド配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって
    、制限断片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　Ｘｂａ
    Ｉハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡ
    を包含するＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥ
    ＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもった
    もの； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
    リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
    ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
    Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
    １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
    ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
    られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
    殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
    るＤＮＡによってコード化された毒素の線虫防除有効量
    に上記の線虫を接触させることを含めてなる線虫防除法
    であって、上記のＤＮＡが植物その他のホスト細胞に形
    質転換された場合の線虫防除法。
13. 【請求項１３】　　線虫を宿した動物の処置法であて、
    （ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又
    はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｂ）　
    殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はその断
    片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　殺線虫毒
    素をコードした配列５に示す配列、又はその断片、を含
    めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒素をコー
    ドした配列７に示す配列、又はその断片、を含めてなる
    ヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコードした配
    列９に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオ
    チド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと指定される殺
    線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体から得られ
    る、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド配列
    、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制限断
    片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　ＸｂａＩハイブ
    リッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡを包含す
    るＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦ
    ＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもつもの； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
    リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
    ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
    Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
    １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
    ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
    られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
    殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
    るＤＮＡによってコード化された毒素の線虫防除有効量
    を上記の動物に投与することを含めてなる方法。
14. 【請求項１４】　　殺線虫毒素がバシラス・スリンギエ
    ンシス分離体から得られるバシラス・スリンギエンシス
    遺伝子によって発現され、この遺伝子が植物の根の領域
    や葉の領域を占有し、そこで生存、繁殖できるような植
    物又は異なる微生物中に遺伝的に工学処理される、請求
    項１３による方法。
15. 【請求項１５】　　吸虫を宿したホストに、又は上記吸
    虫に直接に、又は上記吸虫の場所に、野性型バシラス・
    スリンギエンシスからの毒素、又は組替えホスト中に形
    質転換され発現せしめたバシラス・スリンギエンシスＤ
    ＮＡによってコード化された毒素の殺吸虫量を投与する
    ことを含めてなる、吸虫の防除法。
16. 【請求項１６】　　上記のバシラス・スリンギエンシス
    が、バシラス・スリンギエンシス（Ｂ．ｔ．）ＰＳ１７
    、Ｂ．ｔ．ＰＳ３３Ｆ２、Ｂ．ｔ．ＰＳ５２Ａ１、Ｂ．
    ｔ．ＰＳ６３Ｂ、Ｂ．ｔ．ＰＳ６９Ｄ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ
    ８０ＪＪ１、Ｂ．ｔ．ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．ＰＳ１
    ６７Ｐ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｆ
    １、Ｂ．ｔ．ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ４、
    及びＢ．ｔ．ＰＳ２０４Ｇ６からなる群から選ばれる、
    請求項１５による方法。
17. 【請求項１７】　　上記のＤＮＡが、 （ａ）　殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又
    はその断片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｂ）　
    殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はその断
    片、を含めてなるヌクレオチド配列；（ｃ）　殺線虫毒
    素をコードした配列５に示す配列、又はその断片、を含
    めてなるヌクレオチド配列；（ｄ）　殺線虫毒素をコー
    ドした配列７に示す配列、又はその断片、を含めてなる
    ヌクレオチド配列；（ｅ）　殺線虫毒素をコードした配
    列９に示す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオ
    チド配列；（ｆ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ６３Ｂと指定される殺
    線虫活性バシラス・スリンギエンシス分離体から得られ
    る、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド配列
    、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制限断
    片長の多型性分析により、４．４ｋｂ　ＸｂａＩハイブ
    リッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡを包含す
    るＮ−末端アミノ酸配列、及びＶＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦ
    ＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸配列をもつもの； （ｇ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｄと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、５．０
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの； （ｈ）　Ｂ．ｔ．ＰＳ１７ｅと指定される殺線虫活性バ
    シラス・スリンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシ
    スＰＳ１７から得られる、殺線虫毒素をコードした遺伝
    子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含めてなるＤ
    ＮＡであって、制限断片長の多型性分析により、１．８
    ｋｂ　ＥｃｏＲＩハイブリッド形成帯をもつもの；及び （ｉ）　ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・ス
    リンギエンシス（Ｂ．ｔ．）菌株ＰＳ８０ＪＪ１、Ｂ．
    ｔ．菌株ＰＳ１５８Ｄ５、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６７Ｐ、
    Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１６９Ｅ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｆ
    １、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ１７７Ｇ、Ｂ．ｔ．菌株ＰＳ２０
    ４Ｇ４、及びＢ．ｔ．菌株ＰＳ２０４Ｇ６の一つから得
    られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、
    殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれ
    る、請求項１５による方法。
18. 【請求項１８】　　組替えホスト中に形質転換され発現
    せしめられたバシラス・スリンギエンシス遺伝子によっ
    てコード化された毒素、又は野性型バシラス・スリンギ
    エンシスを含み、更に殺吸虫剤の施用に適した担体を含
    む、吸虫防除用組成物。