JP2002034582A - 線虫類に対して活性のある新規なバシラス・スリンギエンシス微生物、及びバシラス・スリンギエンシス分離体からクローン化された新規な線虫類活性毒素をコード化した遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 殺線虫毒素発現微生物等の提供 【構成】 本発明は、殺線虫活性のある毒素を発現する
バシラス・スリンギエンシスの新規な単離体及び遺伝子
に関する。また線虫及び吸虫を抑制する方法が記載され
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、線虫類に対して活性の
ある新規なバシラス・スリンギエンシス微生物、及びバ
シラス・スリンギエンシス分離体からクローン化された
新規な線虫類活性毒素をコード化した遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】望んでいない生物の防除に化学薬品を定
期的に使用すると、薬剤耐性種ができてくる。これは経
済的に重要な昆虫の多くの種で起きており、また羊、や
ぎ、馬の線虫類にも起きている。薬剤耐性の発達によ
り、異なる作用方式をもった新しい防除剤を絶えず探求
する必要がある。

【０００３】最近、線虫類の防除について認められた方
法は、ベンズイミダゾールという薬剤とその同類を中心
としている。これらの薬剤を大規模に使用したことで、
線虫類に多くの耐性種がもたらされた［プリチャード・
アール・ケイ(Prichard, R.K.)ら(1980年)「線虫類にお
ける駆虫耐性の問題」Austr. Vet. J. 56巻239-251頁；
コールズ・ジー・シー(Coles, G.C.)(1986年)「羊の駆
虫耐性」北米獣医学診療:食用動物診療の実際、2巻423-
432頁（ハード・アール・ピー編）ダブリュー・ビー・
ソーンダース社、ニューヨーク州］。線虫類の記述され
た種は10万種以上ある。

【０００４】細菌バシラス・スリンギエンシス（B.t.）
は、δ-エンドトキシンポリペプチドを生産し、これは
急増する数の昆虫種に対して活性をもつことが示され
た。初期には鱗翅目昆虫に対してのみ毒性が観察された
が、双翅目及び鞘翅目昆虫に対して毒性をもったB.t.分
離体が記述されて範囲が拡大した。これらの毒素は生物
体内に結晶性封入体として蓄積される。多くのB.t.菌株
は、試験された昆虫に対して毒性を示さない結晶性封入
体を生産する。

【０００５】Ｂ・スリンギエンシス種からのδ-エンド
トキシンの線虫卵の生育に対する効果について、少数の
研究論文が発表されている。ボッジャー(Bottjer)、ボ
ーン(Bone)及びギル(Gill)（Experimental Parasitolog
y 60巻239-244頁、1985年）は、B.t.カースタキ及びB.
t.イスラエレンシスが生体外で線虫トリコストロンギル
ス・コルブリフォルミス（Trichostrongylus colubrifo
rmis）の卵に対して有毒であることを報告した。更に、
その他の28B.t.菌株が試験されて、多様な毒性をもって
いた。最も効力のあるものは、ナノグラムの範囲のＬＤ
₅₀をもっていた。イグノフォ及びドロプキン［イグノフ
ォ・シー・エム(Ignoffo, C.M.)及びドロプキン・ヴィ
ー・エッチ(Dropkin, V.H.)(1977年) J. Kans. Entomo
l. Soc. 50巻394-398頁］は、Ｂ・スリンギエンシスか
らの熱安定な毒素（β-エキソトキシン）が自由生活の
線虫であるパナグレルス・レジビブス(Panagrellus red
ivivus)グッデイ(Goodey)；植物寄生線虫であるメロイ
ドギネ・インコグニタ(Meloidogine incognita)チトウ
ッド(Chitwood)；及びカビを食べる線虫のアフェレンク
ス・アベナ(Aphelenchus avena)バスチアン(Bastien)に
対して活性があることを報告した。β-エキソトキシン
は、特異性のほとんどない一般化された細胞毒剤であ
る。また、エッチ・シオーディア(H. Ciordia)及びダブ
リュー・イー・ビゼル(W.E. Bizzell)[Jour. of Parasi
tology 47巻41頁［アブストラクト］1961年］は、幾つ
かの牛線虫類に対するＢ・スリンギエンシスの効果につ
いて予備的な報告をしている。

【０００６】吸虫類は扁形動物門（Platyhelminthes）
の吸虫綱（Trematoda）、二生類亜綱（Digenea）に属し
ている。これらの二生類は、いずれも中間ホストをも
ち、ヒトを含めた脊椎動物に排他的に見出される。獣医
学的にかなり重要な吸虫を含む科は、ファスキオリダエ
(Fasciolidae)科、ジクロコエリダエ(Dicrocoeliidae)
科、パラムフィストマチダエ(Paramphisutomatidae)、
及びスキストソマチダエ(Schistosomatidae)科である。
成虫となった吸虫は、主に胆管、消化管、及び血管系に
出現する。好みの場所にもよるが、卵は、通常糞便や尿
中の最終ホストから抜け出し、幼虫段階は軟体動物の中
間ホスト中で発育する。

【０００７】寄生虫の数及び発育段階と、ある種の細菌
（クロストリジウム・ノビ Clostri-dium novyi）の存
在ないし不在にもよるが、幾つかの臨床症侯群は肝臓吸
虫（ファスキオラ種 Fasciola sp.)の感染に関係してい
る。急性の吸虫病は摂取されたばかりのメタケルカリア
科(metacercariae)による肝臓への侵入によって起こ
る。羊は、局在性肝臓壊死及び多量の皮下出血のため、
急速に死に至る。

【０００８】合衆国における駆虫剤は、現在、基本的に
はアルベンダゾールからなり、これはファスキオラ・ヘ
パチカ(Fasciola hepatica 肝蛭)が重大問題となってい
る少数の州でのみ利用できる。合衆国の他の州では、ア
ルベンダゾールで羊を処置するには、特別な認可が必要
である。その他の有効な殺吸虫剤のジアンフェネサイ
ド、ニトロキシニル、オキシクロザナイド、ラフォキサ
ナイド、及びトリクラベンダゾールは、合衆国では利用
できない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】現在、感染しやすいホ
ストに相当な被害をもたらす多くの線虫類と吸虫類を防
除するための、より有効な手段をもつ必要がある。この
ような手段が生物薬剤を使用するのが有利である。

【００１０】

【課題を解決する手段】本発明は、生物学的に活性な毒
素をつくりだすバシラス・スリンギエンシスの分離体、
遺伝子、及び遺伝子断片に関する。これらの毒素は、線
虫類に対して活性のあることが示された。特定的に例示
されるものは、カエノルハブジチス・エレガンス(Caeno
rhabditis elegance)、プラチレンクス(Pratylenchus)
種、及びパナグレルス・レジビブス(Panagrellus rediv
ivus)に対する活性である。ビールマット線虫とも呼ば
れるパナグレルス・レジビブスは、一般的な自由生活の
線虫であって、実験室で維持するのが比較的容易であ
る。これは、しばしば線虫活性の指示薬（モデル）とし
て使用される。本発明の毒素は、肝臓吸虫のファスキオ
ラ・ヘパチカを含めた吸虫類の防除にも使用できる。

【００１１】本発明の新規なB.t.分離体はB.t.菌株PS80
JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.t.菌株PS167P、B.t.菌株PS16
9E、B.t.菌株PS177F1、B.t.菌株PS177G、B.t.菌株PS204
G4、及びB.t.菌株PS204G6である。

【００１２】本発明に従って使用されるB.t.分離体は、
標準手順により、本明細書に記述のとおりに生育され、
生産されるδ-エンドトキシンを回収できる。殺線虫剤
又は殺吸虫剤製品の使用に関する標準手順を用いて、回
収された毒素又はB.t.分離体自体を処方できる。

【００１３】更に、本発明はB.t.PS17、B.t.PS33F2、PS
63B、PS52A1、及びPS69D1と指定されるバシラス・スリ
ンギエンシス分離体からクローン化された遺伝子又は遺
伝子断片に関する。本発明はB.t.PS17と指定されたバシ
ラス・スリンギエンシス分離体からクローン化された４
遺伝子に関する。これらの遺伝子は、PS17a、PS17b、PS
17d、及びPS17eと指定された。PS17からの遺伝子、並び
にB.t.PS33F2、B.t.PS63B、B.t.PS52A1、B.t.PS69D1と
指定されたB.t.分離体の各々からの特異な遺伝子は、殺
線虫活性をもったバシラス・スリンギエンシスδ-エン
ドトキシンをコード化している。本発明の遺伝子又は遺
伝子断片は、組替えＤＮＡベクターを経て適当なホスト
に運搬できる。

【００１４】本明細書でそれぞれ配列１〜10とはそれぞ
れ図面に記載された配列１〜10をさす。

【００１５】本発明に従って使用できるB.t.分離体に
は、B.t.PS17、B.t.PS33F2、B.t.PS52A1、B.t.PS63B、
B.t.PS69D1、B.t.PS80JJ1、B.t.PS158D5、B.t.PS167P、
B.t.PS169E、B.t.PS177F1、B.t.PS177G、B.t.PS204G4、
及びB.t.PS204G6がある。

【００１６】本発明の新規な毒素遺伝子又は遺伝子断片
は、PS17、PS33F2、PS63B、PS52A1、及びPS69D1と指定
された線虫活性Ｂ・スリンギエンシス（B.t.）分離体か
ら得られる。殺線虫毒素をコードした遺伝子は、B.t.PS
80JJ1、B.t.PS158D5、B.t.PS167P、B.t.PS169E、B.t.PS
177F1、B.t.PS177G、B.t.PS204G4、及びB.t.PS204G6か
らも得られる。本発明の毒素遺伝子を宿したＢ・スリン
ギエンシス分離体及び大腸菌ホストの二次培養基は、合
衆国イリノイ州ピオリア、農務省北部研究センターの永
久保存施設に寄託された。呼出番号は以下のとおりであ
る。培養基 受託番号 寄託期日 B.t.分離体PS17 NRRL B-18243 1987年7月28日 B.t.分離体PS33F2 NRRL B-18244 1987年7月28日 B.t.分離体PS63B NRRL B-18246 1987年7月28日 B.t.分離体PS52A1 NRRL B-18245 1987年7月28日 B.t.分離体PS69D1 NRRL B-18247 1987年7月28日 大腸菌NM522(pMYC1627) NRRL B-18651 1990年5月11日 大腸菌NM522(pMYC1628) NRRL B-18652 1990年5月11日 B.t.PS80JJ1 NRRL B-18679 1990年7月17日 B.t.PS158D5 NRRL B-18680 1990年7月17日 B.t.PS167P NRRL B-18681 1990年7月17日 B.t.PS169E NRRL B-18682 1990年7月17日 B.t.PS177F1 NRRL B-18683 1990年7月17日 B.t.PS177G NRRL B-18684 1990年7月17日 B.t.PS204G4 NRRL B-18685 1990年7月17日 B.t.PS204G6 NRRL B-18686 1990年7月17日 大腸菌NM522(pMYC2321) NRRL B-18770 1991年2月14日 大腸菌NM522(pMYC2316) NRRL B-18785 1991年5月15日 大腸菌NM522(pMYC2317) NRRL B-18816 1991年4月24日

【００１７】本発明に従って使用される毒素遺伝子は、
例えばPS17と指定されるＢ・スリンギエンシス分離体か
ら得られる。上に示すように、本発明の毒素遺伝子を宿
したB.t.PS17の二次培養基は寄託されている。本発明の
毒素遺伝子を宿したB.t.分離体のB.t.PS33F2、B.t.PS63
B、B.t.PS52A1、B.t.PS69D1、及び大腸菌ホストも寄託
されている。

【００１８】本培養基は37 CFR1.14及び35 USC 122の下
に特許庁長官に権利ありと認められた者は、本特許出願
の係属中に、培養基を入手できることを保証されるとい
う条件下に寄託された。また、本出願又はその子孫の対
応特許出願が提出されている国々の外国特許法で要求さ
れるならば、寄託物は入手できる。しかし、寄託物が入
手できるからといって、行政行為によって付与された特
許権を損わしめて本発明を実施する権利を構成するもの
ではないことを理解すべきである。

【００１９】更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生
物寄託条約の規定に従って保存され、一般の人々に入手
可能とされる。すなわち、寄託物の試料提供に対する最
も最近の請求後少なくとも5年間、かつどんな場合も、
寄託期日から少なくとも30年間か、又は培養基を開示し
て発行される特許の権利行使可能な期間中、これらの寄
託物は、生育可能で汚染されていない状態に保つために
必要なあらゆる配慮をもって保存される。要求を受けた
受託施設が、寄託物の状態のために試料を供給できない
場合には、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるもの
である。本培養基寄託物の一般への入手可能性に関する
すべての制限は、これらを開示した特許の付与に際して
永久に取り除かれる。

【００２０】本発明の新規なB.t.遺伝子は、試験された
線虫類に対して活性を示す毒素をコード化している。一
般に蠕虫病として記述される疾病群は、蠕虫として知ら
れる寄生虫による動物ホストの感染による。蠕虫病は
豚、羊、馬、牛、やぎ、犬、猫、及び家禽のような家畜
において優勢かつ重大な経済問題である。蠕虫のうち、
線虫として記述される群の虫類は、種々の動物種におい
て広範囲の、しばしば重大な感染をひき起こす。上述の
動物に感染する線虫類の最も一般的な属は、ヘモンクス
(Haemonchus)、トリコストロンギルス(Trichostrongilu
s)、オステルタギア(Ostertagia)、ネマトジルス(Nemat
odirus)、コウオペリア(Cooperia)、アスカリス(Ascari
s)、ブノストマム(Bunostomum)、エソファゴストマム(O
esophagostomum)、カベルチア(Chabertia)、トリクリス
(Trichuris)、ストロンギルス(Strongylus)、トリコネ
マ(Trichonema)、ジクチオカウルス(Dictyocaulus)、カ
ピラリア(Capillaria)、ヘテラキス(Heterakis)、トキ
ソカラ(Toxocara)、アスカリジア(Ascaridia)、オキシ
ウリス(Oxyuris)、アンシロストーマ(Ancylostoma)、ウ
ンシナリア(Uncinaria)、トキサスカリス(Toxascari
s)、カエノルハブジチス(Caenorhabditis)、及びパラス
カリス(Parascaris)である。ネマトジルス、コウオペリ
ア、及びエソファゴストマムのようなある線虫類は、主
に腸管を攻撃するが、ジクチオカウルスのような他のも
のは肺に見出される。またその他の寄生虫は、その他の
身体組織や器官にいる。

【００２１】本発明の新規なB.t.遺伝子によってコード
化された毒素は、ブルサファレンクス（Bursaphalenchu
s）、クリコネメラ(Criconemella)、ジチレンクス（Dit
ylen-chus)、グロボデラ(Globodera)、ヘリコチレンク
ス(Helicotylenchus)、ヘテロデラ(Heterodera)、メロ
ジオギネ(Melodiogyne)、プラチレンクス(Pratylenchu
s)、ラドルフォルス(Radolpholus)、ロテリンクス（Rot
elynchus）又はチレンクス（Tylenchus)の属から選ばれ
る土壌線虫類と植物寄生虫類の防除用殺線虫剤として有
用である。

【００２２】本発明方法及び組成物は、脊椎動物に寄生
する肝臓吸虫類の防除にも使用できる。特定的には、本
発明はヒト、家畜、愛玩動物その他の動物における吸虫
の防除に使用できる。本明細書で使用される用語の「家
畜」は、例えば羊、牛、豚、及びやぎを包含する。本発
明方法及び組成物は未成熟及び成熟した吸虫類を防除す
るのに使用できる。防除法は牧草地処理（脊椎動物及び
中間ホスト用）、毒素を肝臓又は胆管へ運ぶためのリポ
ソームその他の担体、及び脊椎動物ホストの胃腸管にい
る自由生活型の吸虫類の処置を包含するが、これらに限
定はされない。本明細書に記載の殺吸虫性B.t.毒素は、
単独で、又は例えばアルベンダゾールのような他の殺吸
虫剤とローテーションにして、又は組み合わせて使用で
きる。

【００２３】本明細書に記述のように、発明のB.t.分離
体は、肝臓吸虫類に対して活性をもっている。これらの
分離体は、本明細書に明らかにされているように、その
他の吸虫類に対して活性をもつことが予想される。

【００２４】本発明のB.t.毒素は、カプセル剤、丸塊、
又は錠剤のような単位適量形式で、又は哺乳類の駆虫薬
として使用する時は液体飲薬として経口投与でき、かつ
植物線虫類の防除のため土中で使用できる。飲薬は通
常、ベントナイトのような懸濁剤や湿潤剤等の助剤を伴
った水中における活性成分の溶液、懸濁液又は分散液で
ある。概して、飲薬は消泡剤をも含有する。飲薬処方剤
は一般に活性化合物約0.001ないし0.5重量%を含有す
る。好ましい飲薬処方剤は0.01ないし0.1重量%を含有し
ている。カプセル剤と丸塊は澱粉、滑石、ステアリン酸
マグネシウム又は燐酸二カルシウムのような担体賦形剤
と混和した活性成分を含めてなる。

【００２５】乾燥固体適量形式の毒素化合物を投与した
い場合は、活性成分の所望量を含有するカプセル剤、丸
塊又は錠剤が普通に使用される。これらの適量形式は、
澱粉、乳糖、滑石、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴ
ム等のような適当な微粉砕増量剤、充填剤、崩壊剤及び
/又は結合剤に活性成分を密接均一に混合することによ
って調製される。このような適当な単位適量処方剤は、
処置される宿主動物の種類、感染程度及び種類、宿主重
量のような因子に応じて、活性薬剤の全重量及び含有量
が大幅に変わる。

【００２６】動物飼料経由で活性化合物を投与する時
は、これを餌によく分散させるか、トップドレッシング
として使用するか、又はペレットの形にして、これを最
終飼料に添加するか、又は任意に別個に摂取させる。そ
の代わりに、毒素化合物を非経口的に、例えば反すう胃
内、筋肉内、気管内、又は皮下注射によって動物に投与
でき、その場合活性成分は液体担体賦形剤に溶解又は分
散される。非経口投与には、活性成分を好ましくは落花
生油、綿実油等のような植物油種の受け入れられる賦形
剤と適当に混和する。ゾルケタール、グリセロール、ホ
ルマルを使用する有機調製剤や水性非経口処方剤のよう
な他の非経口賦形剤も使用される。活性化合物は投与の
ため非経口処方剤に溶解又は懸濁される。このような処
方剤は一般に0.005ないし5重量%の活性化合物を含有す
る。

【００２７】動物飼料の一成分として毒素を投与する
か、又は飲み水に溶解又は懸濁させるかすると、活性化
合物が不活性担体又は増量剤中に密接に分散された組成
物類が提供される。不活性担体とは、活性薬剤と反応し
ないもの、及び動物に安全に投与できるものを意味して
いる。飼料投与用担体が動物飼料の一成分である(又は
ありうる)ような担体であるのが好ましい。

【００２８】適当な組成物は、活性成分を比較的多量に
存在させた飼料プレミックス又は補充物を包含し、これ
らは動物への直接給餌に適したもの、又は飼料への直接
添加又は中間的な希釈又は配合段階後の添加に適したも
のである。このような組成物に適した典型的な担体又は
増量剤は、例えば蒸留酒製造業者の乾燥穀類、コーンミ
ール、カンキツ類穀粉、発酵残留物、粉砕かき殼、小麦
くず、糖蜜ソリュブル、トウモロコシ穂軸粉、食用豆粉
飼料、大豆かす、粉砕石灰石等を包含する。

【００２９】哺乳類の消化管内の殺線虫及び殺吸虫活性
のほか、B.t.分離体からの胞子は動物の消化管を通過し
て糞便中で増殖し、それによって糞便中で孵化、増殖す
る幼虫の追加的防除を提供する。

【００３０】本発明の新規なB.t.分離体からの遺伝子
は、欧州特許出願第0 200 344号の手順に従って、植物
の植物領域を占有し、そこで生存、繁殖できるような微
生物中に導入することができる。線虫や吸虫を宿した動
物が、このような植物を摂取すると、毒素が動物ホスト
中で利用可能となり、線虫や吸虫の出没を防除する。

【００３１】本発明の毒素遺伝子又は遺伝子断片は、広
範囲の微生物ホストへ導入できる。毒素遺伝子の発現
は、直接又は間接に殺虫剤の細胞内生産と保持をもたら
す。適当なホスト、例えばシュードモナスの場合、微生
物は線虫類の発生位置に施用されると、そこで増殖し、
線虫に摂取される。その結果、望んでいない線虫を防除
できる。その代わりに、毒素遺伝子をもった微生物を、
細胞内でつくられる毒素の活性を持続させるような条件
下に処理できる。次に処理細胞を目標害虫環境に施用で
きる。生ずる生成物はB.t.毒素の毒性を保持している。

【００３２】遺伝子の安定な維持及び発現を可能とする
ような条件下に、毒素発現するB.t.遺伝子を微生物ホス
トに導入するには、広範囲の方法が利用できる。毒素遺
伝子発現用の転写翻訳調節信号とその調節制御下の毒素
遺伝子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列
と相同のＤＮＡ配列、また組込みや安定な保持が起こる
ための、ホスト内で機能的な複製系などを含んだＤＮＡ
構造体を用意することができる。

【００３３】転写開始信号はプロモータと転写開始出発
位置を包含しよう。ある場合には、毒素の調節的発現を
提供して、毒素の発現が環境への放出後にのみ生ずるよ
うにするのが望ましいこともある。これはオペレータ、
又はアクチベータやエンハンサに結合する領域、によっ
て達成でき、これらは微生物の物理的又は化学的環境の
変化によって誘発できる。例えば、温度感受性調節領域
を使用すると、生物は毒素を発現せずに実験室で生育で
き、環境へ放出されると発現が始まる。他の手法は、実
験室で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用
し、一方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするも
のを使用できる。翻訳開始には、リボソーム結合位置と
開始コドンが存在しよう。

【００３４】メッセンジャーＲＮＡの安定性を強化する
配列を使用すると共に、特に活性プロモータを使用して
メッセンジャーの発現を強化するために種々の操作を使
用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン、終結領
域、及び任意にポリアデニル化信号を包含しよう。

【００３５】転写の方向、すなわちコーディング又はセ
ンス配列の5'から3'への方向で、構造体は転写調節領域
(これがある場合)とプロモータ（制御領域はプロモータ
の5'又は3'のいずれかにある)、リボゾーム結合位置、
開始コドン、開始コドンと同調する開放読取り枠をもっ
た構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列
(使用する場合)、及び終結領域を包含しよう。二本鎖と
してのこの配列はそれ自体微生物ホストの形質転換に使
用できるが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴って
おり、この第二のＤＮＡ配列をホストへのＤＮＡ導入中
に毒素発現構造体に結合させることができる。

【００３６】マーカーとは、変更又は形質転換されたホ
ストの選定を行なうための構造遺伝子のことである。マ
ーカーは通常、選択的利点を提供するもので、例えば抗
生物質や重金属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要
求ホストに原栄養性を与える相補性等を提供する。変更
されたホストが選定されるだけでなく、野外で競合的で
あるように、相補性を使用するのが好ましい。構造体の
開発に、またホストの変更に、一つ以上のマーカーを使
用できる。野外で他の野性型微生物に対する競合的利点
を提供することによって、生物を更に変更できる。例え
ば、金属キレート剤、例えばシデロフォア類の発現用遺
伝子を、毒素発現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入
できる。この方法で、シデロフォアの強化された発現が
毒素生産ホストに競合的利点を提供するため、ホストは
野性型微生物と効果的に競合し、環境中で安定した生態
的地位を占めるようになる。

【００３７】機能的な複製系が存在しない場合、構造体
はホスト内の配列と相同な、少なくとも50塩基対(bp)、
好ましくは約100 bp、及び通常約1,000 bpまでの配列を
包含しよう。こうして合法的な組換えの可能性が強化さ
れるため、遺伝子はホストへ組み込まれ、ホストによっ
て安定に保持される。毒素遺伝子が相補性を提供する遺
伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接している
のが望ましい。従って、毒素遺伝子が失われる場合、生
ずる生物は相補性遺伝子及び/又は競合的利点を提供す
る遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の構造体を
保持している遺伝子と環境中で競合できなくなる。

【００３８】細菌、バクテリオファージ、シアノバクテ
リア、藻類、カビ等のような広範囲の微生物ホストから
多数の転写調節領域が入手できる。種々の転写調節領域
は、trp遺伝子、lac遺伝子、gal遺伝子、ラムダ左及び
右プロモータ、Tacプロモータ、及びホスト中で機能的
な場合は毒素遺伝子と関連して天然に生ずるプロモータ
を包含する。例として合衆国特許第4,332,898号、第4,3
42,832号、及び第4,356,270号を参照のこと。終結領域
は、普通は転写開始領域と関連する終結領域か、又は異
なる転写開始領域(二つの領域がホスト内で適合的で機
能的である限りにおいて)でありうる。

【００３９】安定なエピゾーム保持又は組込みを所望す
る場合は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミ
ドが使用されよう。複製系は染色体、ホストや別のホス
ト内に通常存在するエピゾーム要素、又はホスト内で安
定なウイルスの複製系から誘導される。pBR322、pACYC1
84、RSF1010、pRO1614等のような多数のプラスミドが入
手できる。例として、オルソン(Olson)ら、(1982年) J.
Bacteriol. 150巻6069頁、及びバグダサリアン(Bagdasa
rian)ら、(1981年) Gene 16巻237頁、並びに合衆国特許
第4,356,270号、第4,362,817号、及び第4,371,625号を
参照のこと。

【００４０】B.t.遺伝子は開始領域の調節制御下にある
ように、転写翻訳開始領域と転写翻訳終結領域との間に
導入できる。この構造体はプラスミドに含有され、プラ
スミドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以
上を包含でき、その場合一つの複製系はプラスミドの開
発中にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終
ホストでの機能発揮に必要である。更に、すでに述べた
一つ以上のマーカーが存在できる。組込みを望む場合
は、プラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが
望ましい。

【００４１】形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生
物が存在する時は、それらに対して所望生物を選定でき
るように、慣用の方法に従って選定手法を使用して単離
できる。次に形質転換体を殺線虫又は殺吸虫活性のため
に試験できる。

【００４２】B.t.毒素遺伝子が適当なベクターを経て微
生物ホストへ導入されて、このホストが生きている状態
で環境へ施用される場合に、あるホスト微生物を使用す
ることが必須である。微生物ホストは、一つ以上の重要
作物の「植物領域」(葉面、葉領域、根領域、及び/又は根
表面)を占有することが知られたものを選択する。これ
らの微生物は、特定環境（作物及び他の昆虫生息地）中
で野性型微生物と順調に競合できるように選ばれ、ポリ
ペプチド殺虫剤を発現させる遺伝子の安定な維持と発現
を提供し、望ましくは殺虫剤に対して環境的劣化と不活
性化からの改良された保護を提供する。

【００４３】広範囲の重要作物の葉面(植物の葉の表面)
と根の領域(植物の根の周囲の土壌)に生息する多数の微
生物が知られている。これらの微生物は細菌、藻類及び
カビを包含している。特に興味あるものは、細菌、例え
ばシュードモナス(Pseudomo-nas)、エルウィニア(Erwin
ia)、セラティア(Serratia)、クレブシェラ(Klebsiel-l
a)、キサントモナス(Xanthomonas)、ストレプトミセス
(Streptomyces)、リゾビウム(Rhizobium)、ロードシュ
ードモナス(Rhodopseudomonas)、メチロフィリウス(Met
hylophilius)、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、
アセトバクター(Acetobacter)、乳酸杆菌(Lactobacillu
s)、アースロバクター(Arthrobacter)、アゾトバクター
(Azotobacter)、リューコノストック(Leuconost-oc)、
及びアルカリゲネス(Alcaligenes)属の細菌；カビ類、
特に酵母、例えばサッカロミセス(Saccharomyces)、ク
リプトコッカス(Cryptococcus)、クルイベロミセス(Klu
yveromyces)、スポロボロミセス(Sporobolomyces)、ロ
ードトルラ(Rhodotorula)、及びオーレオバシジウム(Au
reobasidium)属などの微生物である。特に重要なもの
は、シュードモナス・シリンガエ(Pseudomonas syringa
e)、シュードモナス・フルオレッセンス、セラティア・
マルケスケンス(Serratia marcescens)、アセトバクタ
ー・キシリヌム(Acetobacter xylinum)、アグロバクテ
リウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefacien
s)、ロードシュードモナス・スフェロイデス(Rhodopseu
domonas spheroides)、キサントモナス・カンペストリ
ス(Xanthomonascampestris)、リゾビウム・メリオチ(Rh
izobium melioti)、アルカリゲネス・エントロフス(Alc
aligenes entrophus)、及びアゾトバクター・ヴィンラ
ンディ(Azotobacter vinlandii)のような植物領域の細
菌種；及びロードトルラ・ルブラ(Rhodotorula rubr
a)、R.グルチニス(R. glutinis)、R.マリーナ(R. marin
a)、R.オーランティアカ(R.aurantiaca)、クリプトコッ
カス・アルビダス(Cryptococcus albidus)、C.ジフルエ
ンス(C. diffluens)、C.ローレンティ(C. laurentii)、
サッカロミセス・ロゼイ(S. rosei)、S.プレトリエンシ
ス(S. pretoriensis)、S.セレビシエ(S. cerevisiae)、
スポロボロミセス・ロゼウス(Sporobolomyces roseu
s)、S.オドルス(S. odorus)、クルイベロミセス・ヴェ
ローナエ(Kluyveromyces veronae)及びオーレオバシジ
ウム・ポルランス(Aureobasidium pollulans)のような
植物領域の酵母種である。特に重要なのは有色素微生物
である。

【００４４】処理細胞を目標害虫環境に施用する時に細
胞内毒素の活性を持続させるために、殺線虫剤又は殺吸
虫剤含有細胞を処理するのに適したホスト細胞は、原核
生物か真核生物を包含するが、通常、哺乳類のような高
等動物に有毒な物質を生じない細胞に限定される。しか
し、毒素が不安定か、哺乳類ホストへの毒性の可能性を
回避するのに十分な低い施用水準である場合には、高等
生物に有毒な物質をつくる生物も使用できる。ホストと
して特に興味あるものは、原核生物と、カビのような低
級真核生物である。グラム陰性・陽性双方の原核生物の
例はエシェリキア(Escherichia)、エルウィニア(Erwini
a)、シゲラ(Shigella)、サルモネラ(Salmonella)及びプ
ロテウス(Proteus)のような腸内細菌科(Enterobacteria
ceae)；バシラス科(Bacillaceae)；リゾビウム(Rhizobi
um)のようなリゾビウム科(Rhizobiaceae)；発光細菌、
ジモモナス(Zymomonas)、セラティア(Serratia)、アエ
ロモナス(Aeromonas)、ビブリオ(Vibrio)、デスルホビ
ブリオ(Desulfovibrio)、スピリルム(Spirillum)のよう
ならせん菌科；乳酸かん菌科;シュードモナス(Pseudomo
nas)及びアセトバクター(Acetobacter)のようなシュー
ドモナス科；アゾトバクター科及びニトロバクター科を
包含する。真核生物には藻菌類(Phycomycetes)と子のう
菌類(Ascomycetes)のようなカビがあり、これはサッカ
ロミセス(Saccharomyces)とシゾサッカロミセス(Schizo
saccharomyces)のような酵母、ロードトルラ(Rhodotoru
la)、オーレオバシジウム(Aureobasidium)、スポロボロ
ミセス(Sporobolomyces)のような担子菌類(Basidiomyce
tes)酵母を包含する。

【００４５】生産目的のためにホスト細胞を選択する上
で特に重要な特性は、B.t.遺伝子のホストへの導入の容
易さ、発現系の入手性、発現効率、ホスト中の殺線虫剤
又は殺吸虫剤の安定性、及び補助的遺伝能力の存在を包
含する。殺線虫剤又は殺吸虫剤ミクロカプセルとして使
用するのに重要な特性は厚い細胞壁、色素形成、及び細
胞内パッケージング又は封入体の形成のような殺虫剤保
護性；葉親和性；対哺乳類毒性の欠如；害虫に摂取させ
るための誘引力；毒素に損害を与えない殺菌固定の容易
さ等を包含する。他の考慮としては、処方と取扱いの容
易さ、経済性、保存安定性等がある。

【００４６】特に重要なホスト生物は、ロードトルラ
種、オーレオバシジウム種、サッカロミセス種、スポロ
ボロミセス種のような酵母；シュードモナス種、エルウ
ィニア種、及びフラボバクテリウム種のような葉面に生
息する生物；又はエシェリキア、乳酸杆菌種、バシラス
種等の他の生物を包含する。特定的な生物は、シュード
モナス・アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、シュ
ードモナス・フルオレッセンス(P.fluorescens)、サッ
カロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、
バシラス・スリンギエンシス、大腸菌、枯草菌(B.subti
lis)等を包含する。

【００４７】細胞は通常、無傷であって、処理時に胞子
型よりも実質的に増殖型にあるが、ある場合には胞子も
使用できる。

【００４８】微生物細胞、例えばB.t.毒素遺伝子又は遺
伝子断片を含有する微生物の処理は、毒素の性状に悪影
響を及ぼさないか、又は毒素を保護する細胞能力を消滅
させない限り、化学的又は物理的手段によるか、又は化
学的及び物理的手段の組合わせによる。化学的試薬の例
はハロゲン化剤、特に原子番号17-80のハロゲンであ
る。もっと特定的には、ヨウ素を温和な条件下に、所望
の結果を達成するのに十分な時間に使用できる。他の適
当な手法は、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの
ようなアルデヒド類；塩化ゼフィランと塩化セチルピリ
ジニウムのような抗感染剤；イソプロピルアルコールと
エタノールのようなアルコール類；ブアン固定剤、及び
ヘリー固定剤［フマソン(Humason)、グレッチェン・エ
ル(Gretchen, L.)「動物組織手法」ダブリュー・エッチ
・フリーマン社、1967年、を参照］のような種々の組織
学的固定剤等での処理；又はホスト動物に細胞を投与す
る時に細胞中につくられる毒素の活性を保存し、持続さ
せるような物理的処理（加熱）と化学薬剤処理との組合
わせを包含する。物理的手段の例は、ガンマ放射線とＸ
線のような短波長放射線、凍結、UV照射、凍結乾燥等で
ある。

【００４９】一般に細胞は、環境条件に対する耐性を強
化するような、強化された構造安定性をもつであろう。
殺虫剤がプロ型の場合は、目標害虫病原体による殺虫剤
のプロ型から成熟型への加工を抑制しないように、不活
性化方法を選定すべきである。例えばホルムアルデヒド
はタンパクを架橋し、プロ型ポリペプチド殺虫剤の加工
を抑制しうる。不活性化ないし殺菌方法は、毒素の少な
くとも実質量の生物学的利用率又は生物活性を保持す
る。

【００５０】B.t.毒素遺伝子を含有する細胞ホストは任
意慣用の栄養培地で生育できるが、ＤＮＡ構造体は選択
的利点を提供するため、細胞の全量又は実質的全量がB.
t.遺伝子を保持するように選択培地となる。次にこれら
の細胞を慣用方法に従って取り入れる。その代わりに、
細胞を取り入れる前に処理することもできる。

【００５１】B.t.細胞を種々の方法で処方できる。これ
らを無機鉱物(フィロ珪酸塩、炭酸塩、硫酸塩、燐酸塩
等)又は植物材料(粉末トウモロコシ穂軸、もみ殻、クル
ミ殻等)と混合することにより、水和剤、粒剤又は粉剤
として使用できる。処方剤は展粘着助剤、安定化剤、そ
の他殺虫添加物、又は表面活性剤を包含できる。液体処
方剤は水性基盤又は非水性基盤のもので、フォーム、ゲ
ル、懸濁液、乳剤等として使用できる。成分は流動剤、
表面活性剤、乳化剤、分散剤又は重合体を包含できる。

【００５２】毒素濃度は特定処方剤の性質、特に濃縮液
か直接使用されるかによって、広範囲にわたる。毒素は
少なくとも1重量%で存在し、100重量%でありうる。乾燥
処方剤は約1-95重量%の毒素をもつが、液体処方剤は一
般に約1-60重量%の固体を液相中にもつであろう。処方
剤は概してmg当たり約10²ないし約10⁴個の細胞をもつで
あろう。これらの処方剤はヘクタール当たり約50 mg(液
体又は乾燥)ないし1 kg以上の率で投与されよう。

【００５３】処方剤は線虫類又は吸虫類の環境、例えば
植物、土壌、又は水に噴霧、散布、散水等によって施用
できる。

【００５４】その代わりに、幾つかの植物寄生線虫類は
強制寄生虫であるから、殺線虫B.t.毒素をコードした遺
伝子は、線虫耐性植物を生じさせるために植物へ工学処
理できる。植物細胞を工学処理する方法は、十分に確立
されている［ネスター・イー・ダブリュー(Nester, E.
W.)、ゴードン・エム・ピー(Gordon, M.P.)、アマジノ
・アール・エム(Amasino, R.M.)、及びヤノフスキ・エ
ム・エフ(Yanofsky, M.F.)Ann. Rev. Physiol. 35巻387
-399頁、1984年を参照］。

【００５５】この技術で周知のように、タンパクのアミ
ノ酸配列は、DNAのヌクレオチド配列によって決定され
る。遺伝暗号の重剰性のため、すなわちタンパクをつく
るのに使用されるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上
の暗号化ヌクレオチドトリプレット(コドン)を使用でき
るため、一つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチ
ド配列がコードできる。このため、遺伝暗号を次のよう
に描くことができる。

【００５６】 フェニルアラニン(Phe) TTK ヒスチジン(His) CAK ロイシン(Leu) XTY グルタミン(Gln) CAJ イソロイシン(Ile) ATM アスパラギン(Asn) AAK メチオニン(Met) ATG リジン(Lys) AAJ バリン(Val) GTL アスパラギン酸(Asp) GAK セリン(Ser) QRS グルタミン酸(Glu) GAJ プロリン(Pro) CCL システイン(Cys) TGK スレオニン(Thr) ACL トリプトファン(Trp) TGG アラニン(Ala) GCL アルギニン(Arg) WGZ チロシン(Tyr) TAK グリシン(Gly) GGL 終結信号 TAJ

【００５７】解読法：各三文字のデオキシヌクレオチド
の三つ組は、左側に5'末端、右側に3'末端をもつ伝令Ｒ
ＮＡのトリヌクレオチドに対応する。本明細書に記載の
ＤＮＡはすべて、ウラシルにはチミンを置き換えた、m
ＲＮＡの配列に対応する配列のＤＮＡ鎖のものである。
文字はデオキシヌクレオチド配列を形成するプリン又は
ピリミジン塩基を示す。 A=アデニン G=グアニン C=シトシン T=チミン YがAまたはGの場合は、X=T又はC. YがCまたはTの場合は、X=C. XがCの場合は、Y=A, G, C又はT. XがTの場合は、Y=A又はG. ZがA又はGの場合は、W=C又はA. ZがC又はTの場合は、W=C. WがCの場合は、Z=A, G, C又はT. WがAの場合は、Z=A又はG. SがA, G, C又はTの場合は、QR=TC.又はその代わりにSが
T又はCの場合は、QR=AG.J=A又はG K=T又はC L=A, T, C又はG. M=A, C又はT.

【００５８】上記は、B.t.毒素の新規なアミノ酸配列
が、このタンパクの同じアミノ酸配列をコードした同等
なヌクレオチド配列によって調製できることを示す。従
って、本発明はこのような同等なヌクレオチド配列を包
含する。更に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構
造を変更しないならば、確認された構造及び機能のタン
パクが、このような変更によって構築できることが示さ
れた［カイザー・イー・ティー（Kaiser, E.T.）及びケ
ズディ・エフ・ジェイ（Kezdy, F.J.）（1984年）Scien
ce 223巻249-255頁]。このように、本発明はタンパクの
二次構造を変更しないような本明細書に記載のアミノ酸
配列の突然変異株、又は構造が変更される場合、生物活
性がある程度保持されるような突然変異株を包含する。
更に、本発明は、発明遺伝子をコード化した毒素の全部
又は一部をもった生物の突然変異種も包含する。このよ
うな微生物の突然変異種は、当業者に周知の手法によっ
てつくることができる。例えば、UV照射を用いてホスト
生物の変異株をつくることができる。同様に、このよう
な変異株は胞子非形成ホスト細胞を包含し、これもこの
技術に周知の手順によって調製できる。

【００５９】プラスミドの調製とホスト生物の形質転換
に使用される種々の方法はこの技術で周知である。これ
らの手順はすべて、マニアチス・ティー(Maniatis,
T.)、フリッシュ・イー・エフ(Fritsch, E.F.)及びサム
ブロック・ジェイ(Sambrook, J.)(1982年)、「分子クロ
ーニング：実験マニュアル」(コールド・スプリング・ハ
ーバー研究所、ニューヨーク州）に記述されている。こ
のように、微生物細胞からＤＮＡを抽出し、制限酵素で
の消化を行ない、ＤＮＡ断片を電気泳動にかけ、プラス
ミドのテーリングとアニーリングを行ない、ＤＮＡを挿
入、再結合し、細胞を形質転換し、プラスミドＤＮＡを
調製し、タンパクを電気泳動にかけ、ＤＮＡの配列を決
定するのは、遺伝子工学の当業者の技術範囲にある。

【００６０】本明細書で明らかにされている制限酵素
は、ベセスダ研究所（メリーランド州ゲイサーズバー
グ）、ニューイングランド・バイオラブ（マサチューセ
ッツ州ビバリー）、及びベーリンガー・マンハイム（イ
ンディアナ州インディアナポリス）から購入できる。酵
素は、供給側から提供される指示に従って使用される。

【００６１】

【実施例】以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順
を例示した実施例である。これらの例は限定的に考えら
れてはならない。他に注意がなければ、百分率はすべて
重量、溶媒混合物割合はすべて容量による。

【００６２】実施例１ B.t.分離体類の培養 B.t.分離体の二次培養基を使用して次の培地、すなわち
ペプトン・ブドウ糖・塩培地に接種した。 バクト・ペプトン 7.5 g/l ブドウ糖 1.0 g/l KH₂PO₄ 3.4 g/l K₂HPO₄ 4.35 g/l 塩溶液 5.0 ml/l CaCl₂溶液 5.0 ml/l 塩溶液(100 ml) MgSO₄・7H₂O 2.46 g MnSO₄・H₂O 0.04 g ZnSO₄・7H₂0 0.28 g FeSO₄・7H₂O 0.40 g CaCl₂溶液(100 ml) CaCl₂・2H₂O 3.66 g pH 7.2 塩溶液とCaCl₂溶液を濾過滅菌し、オートクレーブ処理
し調理したブロスに、接種時に添加する。200 rpmで操
作される回転振とう機で、フラスコを30℃、64時間培養
する。上の手順は、この技術で周知の手順により、大発
酵装置まで容易に規模拡大できる。上の発酵で得られる
B.t.胞子及び結晶は、この技術で周知の手順により単離
できる。しばしば用いられる手順は、取り入れた発酵液
を分離手順、例えば遠心分離にかけることである。

【００６３】実施例２ 精製及びアミノ酸配列決定 本発明の毒素タンパクの給源として使用できるバシラス
・スリンギエンシス（B.t.）分離体は、例えばB.t.PS1
7、B.t.PS52A1、B.t.PS33F2、B.t.PS63B、B.t.PS69D1、
B.t.PS80JJ1、B.t.PS158D5、B.t.PS167P、B.t.PS169E、
B.t.PS177F1、B.t.PS177G、B.t.PS204G4、及びB.t.PS20
4G6でありうる。分離体を実施例１に記述されたとおり
に、又はこの技術で知られたその他の標準的な培地及び
発酵手法を用いて培養できる。毒素タンパク封入体は標
準的な沈降遠心分離によって取り入れられる。回収され
たタンパク封入体は、臭化ナトリウム（28-38％）密度
勾配平衡遠心によって部分的に精製できる。［ファネン
スチール・エム・エイ(Pfannenstiel, M.A.)、イー・ジ
ェイ・ロス(E.J. Ross)、ヴィー・シー・クレーマー(V.
C. Kramer)、及びケイ・ダブリュー・ニッカーソン(K.
W. Nickerson)(1984年)ＦＥＭＳ Microbiol. Lett. 21
巻39頁］。次に、個々の毒素タンパクは、結晶性タンパ
ク錯体をアルカリ緩衝液に可溶化し、DEAE-セファロー
スCL-6B（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイ
ス）クロマトグラフィにより、NaCl含有緩衝液の濃度を
増大させる段階的増量によって個々のタンパクを分画す
ることによって分割できる［レイチェンバーグ・ディー
(Reichenberg, D.)、「有機・生化学におけるイオン交換
体」［シー・カルモン(C. Calmon)及びティー・アール
・イー・クレスマン(T.R.E. Kresman)編、インターサイ
エンス社、ニューヨーク州、1957年］。線虫カエノルハ
ブジチス・エレガンス（CE）に対して有毒なタンパクを
含有するフラクションは、ウエスタン・ブロット手法
［トウビン・エッチ(Towbin,H.)、ティー・ステーヘリ
ン(T. Staehelin)及びケイ・ゴードン(K. Gordon)(1979
年)、Proc.Natl. Acad. Sci. USA 76巻4350頁］によっ
てPVDF膜（ミリポア社、マサチューセッツ州ベドフォー
ド）に結合され、N末端アミノ酸は自動化気相配列決定
装置での標準的なエドマン反応によって決定された［ハ
ンカピラー・エム・ダブリュー(Hunkapiller, M.W.)、
アール・エム・ヘウィック(R.M. Hewick)、ダブリュー
・エル・ドライヤー(W.L. Dreyer)、及びエル・イー・
フッド(L.E.Hood)(1983年)、Meth. Enzymol. 91巻399
頁］。得られた配列は以下を包含する。 PS17a ＡＩＬＮＥＬＹＰＳＶＰＹＮＶ PS17b ＡＩＬＮＥＬＹＰＳＶＰＹＮＶ PS33F2 ＡＴＬＮＥＶＹＰＶＮ PS52A1 ＭＩＩＤＳＫＴＴＬＰＲＨＳＬＩＮＴ PS63B ＱＬＱＡＱＰＬＩＰＹＮＶＬＡ PS69D1 ＭＩＬＧＮＧＫＴＬＰＫＨＩＲＬＡＨＩＦＡＴＱＮＳ

【００６４】更に、内部アミノ酸配列データはPS63Bか
ら誘導された。毒素タンパクは本質的に既述のとおりに
［クリーブランド・ディー・ダブリュー(Cleveland, D.
W.)、エス・ジー・フィッシャー(S.G. Fischer)、エム
・ダブリュー・カーシュナー(M.W. Kirschner)、及びユ
ウ・ケイ・レムリ(1977年) J. Biol. Chem. 252巻1102
頁]スタフィロコッカス・オーレウスV8プロテアーゼ
（シグマケミカル社、ミズーリ州セントルイス）で部分
的に消化された。消化された材料をPVDF膜でブロット処
理し、約28 kDa限界ペプチドを上記のようにN-末端配列
決定用に選定した。得られた配列は次のものであった。 63B(2) ＶＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫ これらの配列データからオリゴヌクレオチドプローブ
が、他のB.t.毒素遺伝子の入手可能な配列から組立てら
れたコドン頻度表を用いて設計された。プローブは、ア
プライド・バイオシステムズ社のＤＮＡ合成機で合成さ
れた。

【００６５】実施例３ 新規な毒素遺伝子のクローニン
グと大腸菌への形質転換 Ａ．B.t.PS17 B.t.PS17細胞を低光学密度（ＯＤ₆₀₀＝1.0）に生育さ
せ、細胞を遠心分離によって回収して、全細胞ＤＮＡを
調製した。20％庶糖と50 mg/mlリゾチームを含有するTE
S緩衝液（30 mMトリス-Cl、10 mM エチレンジアミン四
酢酸[EDTA]、50 mMNaCl、pH＝8.0）中で細胞をプロトプ
ラスト化させた。プロトプラストを4％の最終濃度まで
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)添加によって溶菌化し
た。細胞材料を最終濃度100 mMの中性塩化カリウム中、
4℃で一夜沈殿させた。上澄み液をフェノール/クロロホ
ルム（1:1）で2回抽出した。ＤＮＡをエタノール中で沈
殿させ、塩化セシウム／臭化エチジウム勾配上の密度平
衡バンディングによって精製した。

【００６６】PS17からの全細胞ＤＮＡをEcoRIで消化さ
せ、0.8%アガロースゲル-TAE（50 mMトリス-Cl、20 mM
NaOAc、0.25 mM EDTA、pH=8.0）緩衝化ゲル上の電気泳
動によって分離した。ゲルのサザンブロットを、PS17か
らの精製された130 kDaタンパクのN末端アミノ酸配列か
ら誘導される[³²P]-放射性標識つきオリゴヌクレオチド
プローブとハイブリッド形成させた。合成されたオリゴ
ヌクレオチドの配列は（ＧＣＡＡＴＴＴＴＡＡＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡＴＣＣ）であった。結果は、PS17のハイブ
リッド化EcoRI断片が5.0kb、4.5 kb、2.7 kb及び1.8 kb
の大きさにあることを示し、それぞれ少なくとも四つの
新しい線虫活性毒素遺伝子のPS17d、PS17b、PS17a、及
びPS17eを推定的に確認した。

【００６７】Ｓau3Ａで部分消化されたPS17全細胞ＤＮ
Ａからライブラリーを構築し、電気泳動によってサイズ
分画した。ゲルの9-23 kb領域を切り出し、ＤＮＡを電
気溶離し、ELUTIP^TM-dイオン交換カラム（シュライヒャ
ー・エンド・シュエル社、ニューハンプシャー州キー
ン)を用いて濃縮した。単離されたＳau3Ａ断片をラムダ
GEM-11^TM（PROMEGA）に連結した。パッケージにしたフ
ァージをKW251大腸菌細胞（PROMEGA）上に高滴定価でプ
レートし、核酸ハイブリッド形成プローブとして上の放
射性標識つき合成オリゴヌクレオチドを用いて選定し
た。ハイブリッド化プラークを精製し、低プラーク密度
で再選定した。プローブとハイブリッド形成させた単離
精製プラークを用いて、ＤＮＡ単離用のファージ調製の
ため、液体培養基中でKW251大腸菌細胞に感染させた。
ＤＮＡを標準手順によって単離した。

【００６８】回収された組替えファージＤＮＡをＥcoRI
で消化させ、0.8％アガロース-TAEゲル上の電気泳動に
よって分離した。ゲルをサザンブロット処理し、ラムダ
ライブラリーから単離された毒素遺伝子を特性化するた
めに、オリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成
させた。二つのパターンがあり、4.5 kb（PS17b）又は
2.7 kb（PS17a）ＥcoRI断片を含有するクローンであっ
た。ファージＤＮＡの分離量をＳalＩで消化させ（挿入
ＤＮＡをラムダアームから放出させるため）、0.6％ア
ガロース-TAEゲル上の電気泳動によって分離した。大断
片（上記のように電気溶離し濃縮したもの）を、SalIで
消化させ脱ホスホリル化処理したpBClacに連結させた。
連結体をNM522コンピテント大腸菌細胞へ形質転換によ
って導入し、アンピシリン、イソプロピル-(β)-D-チオ
ガラクトシド（IPTG）及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インド
リル-(β)-D-ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上
にプレートした。所望のプラスミド類を単離するため
に、白色集落（pBClacの(β)-ガラクトシダーゼ遺伝子
中に推定挿入体をもつもの）を標準的な急速プラスミド
精製手順にかけた。2.7 kbＥcoRI断片を含有する選定プ
ラスミドをpMYC1627と名付け、また4.5 kbＥcoRI断片を
含有するプラスミドをpMYC1628と名付けた。

【００６９】毒素遺伝子は、上記の合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用いた標準的なサンガージデオキシ連鎖
終結法によって、また新しい毒素遺伝子の配列に対して
つくられたプライマーとの“ウォーキング”によって配
列決定された。

【００７０】標準的なB.t.発現法を用いて、PS17毒素遺
伝子をシャトルベクターpHT3101に二次クローン化した
［レレクルス・ディー(Lereclus, D.)ら、(1989年)ＦＥ
ＭＳMicrobiol. Lett. 60巻211-218頁]。要約すると、
分離用アガロースゲル電気泳動、電気溶離によってPS17
a及びPS17b毒素遺伝子を含有するＳalＩ断片を、それぞ
れpMYC1629及びpMYC1627から単離し、上記のように濃縮
した。これらの濃縮断片をＳalＩで切断され脱ホスホリ
ル化されたpHT3101へ連結した。連結混合物を別個に使
用して、凍結コンピテント大腸菌NM522を形質転換させ
た。各組替え大腸菌菌株からのプラスミドをアルカリ溶
菌によって調製し、アガロースゲル電気泳動によって分
析した。生ずる二次クローンのpMYC2311とpMYC2309は、
それぞれPS17aとPS17b毒素遺伝子を保持していた。標準
的なエレクトロポレーション手法（指示マニュアル、バ
イオラド社、カリフォルニア州リッチモンド）により、
これらのプラスミドを結晶非生産性のB.t.菌株HD-1 cry
B［アロンソン・エイ(Aronson, A.)、パーデュー大学、
インディアナ州ウェストラファイエット］に形質転換し
た。

【００７１】組替えB.t.菌株HD-1 cryB[pMYC2311]及び
[pMYC2309]を胞子形成まで生育させ、タンパクを野性型
B.t.タンパクについて上述されたとおりに、NaBr勾配遠
心分離によって精製した。

【００７２】Ｂ．B.t.PS52A1 600 nmで1.0の光学密度まで生育させたバシラス・スリ
ンギエンシスPS52A1細胞から全細胞ＤＮＡを調製した。
細胞を遠心分離によってペレット化し、プロトプラスト
緩衝液（0.3M庶糖、25 mM トリス-Cl[pH8.0]、25 mM ED
TA中リゾチーム20 mg/ml）中に再懸濁させた。37℃で１
時間培養後、２回の冷凍／解凍サイクルでプロトプラス
トを溶菌させた。溶菌を終了させるため、0.1M NaCl、
0.1％SDS、0.1Mトリス-Clの溶液９倍量を加えた。透明
になった溶菌液をフェノール：クロロホルム（1:1）で
２回抽出した。核酸を２倍量のエタノールで沈殿させ、
遠心分離によってペレット化した。ペレットをTE中で再
懸濁させ、RNアーゼを50μg/mlの最終濃度に添加した。
37℃で１時間培養後、フェノール：クロロホルム（1:
1）とTE-飽和クロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽出し
た。1/10量の3M NaOAcと２倍量のエタノールの添加によ
って、ＤＮＡを水相から沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離
によってペレット化し、70％エタノールで洗い、乾燥
し、TE中で再懸濁した。

【００７３】制限断片長多型性（RFLP）分析は、³²P-標
識つきオリゴヌクレオチドプローブのプローブ52A1-Cと
B.t.PS52A1ＤＮＡサザンブロットとの標準的なハイブリ
ッド形成によって行なわれた。このプローブの配列は次
のとおりである。 5' ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＴＴ ＧＡＴ ＴＣＴ ＡＡＡ ＡＣ
Ａ ＡＣＡ ＴＴＡ ＣＣＡＡＧＡ ＣＡＴ ＴＣＡ／Ｔ Ｔ
ＴＡ ＡＴＡ／Ｔ ＡＡＴ ＡＣＡ／Ｔ ＡＴＡ／ＴＡＡ
3' ハイブリッド形成帯は、約3.6 kbp ＨindIII断片と約8.
6 kbpＥcoRV断片を包含した。

【００７４】Ｓau3Ａで部分消化させたB.t.PS52A1ＤＮ
Ａから遺伝子ライブラリーを構築した。部分制限消化物
をアガロースゲル電気泳動で分画した。6.6-23 kbpの大
きさのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ゲルスライスか
ら電気溶離し、Elutip-Dイオン交換カラムでの精製後、
エタノール沈殿によって回収した。Ｓau3Ａ挿入物をＢa
mHIで消化させたラムダGem-11（プロメガ）へ連結し
た。組替えファージをパッケージし、大腸菌KW251細胞
（プロメガ）にプレートした。放射性標識つきプローブ
52A1-Cとのハイブリッド形成によってプラークを選定し
た。ハイブリッド化ファージをプラーク精製し、標準手
順（マニアティスら）によってファージＤＮＡの単離用
大腸菌KW251細胞の液体培養基の感染に使用した。二次
クローン化には、分離量のＤＮＡをＥcoRIとＳalＩで消
化させ、アガロースゲル上で電気泳動にかけた。毒素遺
伝子を含有する約3.1 kbp帯をゲルから切り出し、ゲル
スライスから電気溶離し、上のようにイオン交換クロマ
トグラフィによって精製した。精製されたＤＮＡ挿入物
をＥcoRI＋ＳalＩで消化させたpHTBlueII（pBluescript
S/K[ストラタジーン]と、レジデントB.t.プラスミドか
らの複製開始点とからなる大腸菌／Ｂ・スリンギエンシ
スシャトルベクター［ディー・レレクルスら（1989年）
ＦＥＭＳ Microbiology Letters 60巻211-218頁]）へ連
結した。連結混合物を使用して、凍結コンピテント大腸
菌NM522（ATCC 47000）に形質転換した。形質転換体を
アンピシリン、イソプロピル-(β)-D-チオガラクトシド
（IPTG）及び5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-(β)-D-
ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒天上にプレートし
た。プラスミドをアルカリ溶菌（マニアチスら）によっ
て推定組替え体から精製し、アガロースゲル上のＥcoRI
及びＳalＩ消化物の電気泳動によって分析した。所望の
プラスミド構造体pMYC2321は、殺線虫タンパクをコード
化したその他の毒素遺伝子の地図に較べて新規な毒素遺
伝子を含有する。

【００７５】プラスミドpMYC2321をエレクトロポレーシ
ョンにより、結晶非生産性B.t.菌株cryBに導入した。約
55-60 kDaの結晶タンパクの発現は、SDS-PAGE分析及び
殺線虫活性によって検証された。プラチレンクス・スク
リブネリ(Platylenchus scribneri)（植物寄生性）及び
パナグレルス・レジビブス(Panagrellus redivivus)
（自由生活性）に対するクローン化遺伝子生成物の毒性
決定のため、NaBr精製された結晶を調製した（前掲ファ
ンネンスチールら）。クローン化遺伝子生成物はこれら
の線虫類に対して活性であった。Ｃ．B.t.PS33F2

【００７６】600 nmで1.0の光学密度まで生育させたB.
t.PS33F2細胞から全細胞ＤＮＡを調製した。細胞を遠心
分離によってペレット化し、プロトプラスト緩衝液（0.
3M庶糖、25 mM トリス-Cl[pH8.0]、25 mM EDTA中リゾチ
ーム20 mg/ml）中に再懸濁させた。37℃で１時間培養
後、0.1M NaCl、0.1％SDS、0.1M トリス-Clの溶液９倍
量の添加に続いて２回の冷凍/解凍サイクルによってプ
ロトプラストを溶菌させた。透明になった溶菌液をフェ
ノール：クロロホルム（1:1）で２回抽出した。核酸を
２倍量のエタノールで沈殿させ、遠心分離によってペレ
ット化した。ペレットを10 mM トリス-Cl、1 mM EDTA
（TE）中で再懸濁させ、RNアーゼ（リボヌクレア−ゼ）
を50μg/mlの最終濃度に添加した。37℃で１時間培養
後、溶液をフェノール：クロロホルム（1:1）とTE-飽和
クロロホルムでそれぞれ１回ずつ抽出した。1/10量の3M
NaOAcと２倍量のエタノールの添加によって、ＤＮＡを
水相から沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によってペレッ
ト化し、70％エタノールで洗い、乾燥し、TE中に再懸濁
した。

【００７７】上記のように調製されたプロトプラストか
らプラスミドＤＮＡを抽出した。10mMトリス-Cl、1 mM
EDTA、0.085N NaOH、0.1％SDSの溶液（pH＝8.0）９倍量
の添加によって、プロトプラストを溶菌した。溶菌を終
了させるため、1％の最終濃度までSDSを添加した。次に
3M KOAc２分の１容量を加え、細胞材料を4℃で一夜沈殿
させた。遠心分離後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、
塩化セシウム-臭化エチジウム勾配上の密度匂配平衡遠
心によってプラスミドを精製した。

【００７８】PS33F2プラスミド及び全細胞ＤＮＡのサザ
ンブロットと、実施例２に既述されたN-末端アミノ酸配
列用に設計された³²P標識つきオリゴヌクレオチドプロ
ーブとの標準的なハイブリッド形成によってRFLP分析を
行なった。 プローブ33F2A:５’ＧＣＡ/Ｔ ＡＣＡ/Ｔ ＴＴＡ ＡＡ
Ｔ ＧＡＡ ＧＴＡ/Ｔ ＴＡＴ ３’ プローブ33F2B:５’ＡＡＴ ＧＡＡ ＧＴＡ/Ｔ ＴＡＴ
ＣＣＡ/Ｔ ＧＴＡ/Ｔ ＡＡＴ ３’ ハイブリッド形成帯は約5.85 kbpＥcoRI断片を包含し
た。プローブ33F2Aと逆PCRプライマーは、PS33F2毒素遺
伝子のクローン化用のハイブリッド形成プローブとして
使用される約1.8 kbpのＤＮＡ断片を増幅するために使
用された。逆プライマーの配列は以下のとおりであっ
た。 ５'ＧＣＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＡＴＡＡ
ＡＴＴＣＡＡＴＴＣ/Ｔ Ｔ/Ｇ Ａ/Ｇ ＴＣ Ｔ/Ａ Ａ
３'

【００７９】ＥcoRIで消化させたPS33F2プラスミドＤＮ
Ａから遺伝子ライブラリーを構築した。制限消化物をア
ガロースゲル電気泳動で分画した。ＤＮＡ断片4.3-6.6
kbpをゲルから切り出し、ゲルスライスから電気溶離
し、Elutip-Dイオン交換カラム（シュライチャー・エン
ド・シュエル社、ニューハンプシャー州キーン）上で精
製後、エタノール沈殿によって回収した。ＥcoRI挿入物
をＥcoRIで消化させたpHTBlueII（pBluescriptS/K[スト
ラタジーン]と、レジデントB.t.プラスミドからの複製
開始点とからなる大腸菌／Ｂ・スリンギエンシスシャト
ルベクター［ディー・レレクルスら(1989年）ＦＥＭＳ
Microbiology Letters 60巻211-218頁]）へ連結した。
連結混合物を使用して、凍結コンピテントNM522（ATCC
47000）に形質転換した。形質転換体をアンピシリン、
イソプロピル-(β)-D-チオガラクトシド（IPTG）及び5-
ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-(β)-D-ガラクトシド
（XGAL）を含有するLB寒天上にプレートした。上記の放
射性標識つきPCR増幅されたプローブとのハイブリッド
形成によって、集落を選定した。プラスミドをアルカリ
溶菌によって想定上の毒素遺伝子クローンから精製し、
制限消化物のアガロースゲル電気泳動によって分析し
た。所望のプラスミド構造体pMYC2316は、約5.85 kbpＥ
coRI挿入物を含有する。このＤＮＡ断片（33F2a）上に
ある毒素遺伝子は、殺線虫タンパクをコード化したその
他の毒素遺伝子のＤＮＡ配列に比べて新規である。

【００８０】プラスミドpMYC2316をエレクトロポレーシ
ョンにより、結晶非生産性の(Cry-)B.t.ホストHD-1 Cry
Bに導入した。約120-140 kDaの結晶タンパクの発現は、
SDS-PAGE分析によって検証された。プラチレンクス(Pla
tylenchus)種に対するクローン化遺伝子生成物の毒性決
定のため、NaBr勾配（前掲エム・エイ・ファンネンスチ
ールら、1984年）上で結晶を精製した。

【００８１】Ｄ．B.t.PS69D1 他の分離体について上に記述されたとおりに、全細胞Ｄ
ＮＡをB.t.PS69D1から調製した。RFLP分析は、69D1-Dと
指定された³²P標識つきオリゴヌクレオチドプローブとP
S69D1ＤＮＡのサザンブロットとの標準的なハイブリッ
ド形成によって行なわれた。69D1-Dプローブの配列は以
下のとおりである。 ５’ＡＡＡ ＣＡＴ ＡＴＴ ＡＧＡ ＴＴＡ ＧＣＡ ＣＡ
Ｔ ＡＴＴ ＴＴＴＧＣＡ ＡＣＡ ＣＡＡ ＡＡ ３’ ハイブリッド形成帯は約2.0 kbp ＨindIII断片を含有し
た。

【００８２】Ｓau3Ａで部分消化させたPS69D1ＤＮＡか
ら遺伝子ライブラリーを構築した。部分的制限消化物を
アガロースゲル電気泳動によって分画した。6.6-23 kbp
の大きさのＤＮＡ断片をゲルから切り出し、ゲルスライ
スから電気溶離し、Elutip-Dイオン交換カラムでの精製
後、エタノール沈殿によって回収した。Ｓau3Ａ挿入物
をＢamHIで消化させたラムダGem-11（プロメガ、ウィス
コンシン州マディソン）へ連結した。組替ファ−ジは大
腸菌kw251細胞上でパッケ−ジし、プレ−トにした（ウ
ィスコンシン州マディソンのプロメガ）。放射性標識つ
き69D1-Dオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によ
ってプラークを選定した。ハイブリッド化ファージをプ
ラーク精製し、標準手順［マニアティスら、(1982年)
「分子クローニング： 実験マニュアル」ニューヨーク
州コールドスプリングハーバー］によってファージＤＮ
Ａの単離用大腸菌KW251細胞の液体培養基を感染するの
に使用した。二次クローン化には、分離量のＤＮＡをＨ
indIIIで消化させ、アガロースゲル上で電気泳動にかけ
た。毒素遺伝子を含有する約2.0 kbp帯をゲルから切り
出し、ゲルスライスから電気溶離し、上のようにイオン
交換クロマトグラフィによって精製した。精製されたＤ
ＮＡ挿入物を、ＨindIIIで消化させたpHTBlueII（pBlue
scriptS/K［ストラタジーン、カリフォルニア州サンデ
ィエゴ］と、レジデントB.t.プラスミドからの複製開始
点とからなる大腸菌／B.t.シャトルベクター［ディー・
レレクルスら(1989年）ＦＥＭＳ Microbiology Letters
60巻211-218頁]）へ連結した。連結混合物を使用し
て、凍結コンピテント大腸菌NM522細胞（ATCC 47000）
に形質転換した。形質転換体を5-ブロモ-4-クロロ-3-イ
ンドリル-(β)-D-ガラクトシド（XGAL）を含有するLB寒
天上にプレートした。プラスミドをアルカリ溶菌（前掲
マニアチスら）によって推定組替え体から精製し、アガ
ロースゲル上のＨindIII消化物の電気泳動によって分析
した。所望のプラスミド構造体pMYC2317は、殺線虫タン
パクをコード化したその他の毒素遺伝子の地図に較べて
新規な毒素遺伝子を含有する。

【００８３】Ｅ．B.t.PS63B 実施例２は、標準エドマンタンパク配列決定法によって
決定されるとおりに、PS63B毒素タンパクのアミノ末端
及び内部ポリペプチド配列を示す。これらの配列から、
δ-エンドトキシンをコード化したB.t.遺伝子から組立
てられたコドン頻度表を用いて、二つのオリゴヌクレオ
チドプライマーが設計された。順プライマー（63B-A）
の配列は、遺伝子の５’末端で推定されるＤＮＡ配列と
相補的であった。 63B-A - ５' ＣＡＡ Ｔ/ＣＴＡ ＣＡＡ ＧＣＡ/Ｔ ＣＡ
Ａ ＣＣ ３’ 逆プライマー（63B-INT）の配列は、内部推定されたＤ
ＮＡ配列の逆配列と相補的であった。 63B-INT - ５' ＴＴＣ ＡＴＣ ＴＡＡ ＡＡＴ ＴＣＴ
ＴＴＧ Ａ/ＴＡＣ ３' これらのプライマーは、ＤＮＡクローニングプローブと
して使用される63B毒素遺伝子の約460 bp断片を増幅す
るために、標準的なポリメラーゼ連鎖反応（シータス・
コーポレーション）で使用された。PS63Bからの全細胞
ＤＮＡのサザンブロットを放射性標識つきＰＣＲプロー
ブとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成帯は約
4.4 kbpＸbaＩ断片、約2.0 kbpＨindIII断片、及び約6.
4 kbpＳpeＩ断片を含んでいた。

【００８４】実施例４ B.t.毒素タンパク及び遺伝子生
成物のカエノルハブジチス・エレガンスに対する活性 S-基本培地1 ml、アンピシリン0.5 mg、及びコレステロ
ール0.01 mgを含有するコーニング（コーニング・ガラ
ス・ワークス、ニューヨーク州コーニング）の24穴組織
培養基プレート中で、シンプキン及びコールズ（J. Che
m. Tech. Biotechnol. 31巻66-69頁、1981年）に記述の
とおりにカエノルハブジチス・エレガンス（CE）を培養
した。各穴は、大腸菌菌株OP-50（ウラシル栄養要求
株）の細胞約10⁸個も含有した。各穴当たり100-200個の
CEを穴に接種し、20℃で培養した。タンパク試料（野性
型B.t.又は組替えB.t.から得られたもの）を連続希釈に
よって穴に添加した。水は、対照として、またタンパク
を穴に導入するビヒクルとしての役目を果たした。

【００８５】各穴を毎日検査し、代表的な結果は以下の
とおりである。 ％致死率 μg毒素 pMYC2309 pMYC2311 PS17 100 25 50 75 32 25 50 75 10 50 25 50 1 0 0 0

【００８６】実施例５ 植物線虫プラチレンクス種に対
する活性 B.t.PS17aによってコード化された毒素は、プラチレン
クス種に対して活性があることがわかった。活性は、実
施例４でＣ・エレガンスに対して明らかにされたものと
ほぼ同水準にある

【００８７】プラチレンクス種、例えばＰ・スクリブネ
リとＰ・レジビブスは、トウモロコシ、落花生、大豆、
アルファルファ、ビーン、トマト、かんきつ類を含めた
多くの経済的に重要な作物の知られた病原体である。こ
れらの「根病変性」線虫類は、第二の経済的に最も被害
を与える属の植物寄生線虫類（メリオドギネ − すなわ
ち「根こぶ線虫」にちなむ）であり、移動性内部寄生虫
を典型的に代表している。

【００８８】ガンバーグＢ５培地（GIBCO^Rラボラトリー
ズ、ニューヨーク州グランドアイランド）中で、切り取
ったトウモロコシ根でプラチレンクス種を無菌的に生育
させた。ツァイ(Tsai）及びバン・ガンディ(van Gundy)
[J. Nematol. 22巻(3号)327-332頁］に記述されたとお
りに、第3-4齢幼虫を使用して、24穴検定プレート（コ
ーニング#25820）中で生物検定を行なった。各穴に約20
匹の線虫を入れた。計80-160匹の線虫を各処理に使用し
た。手で支えるダウンスホモジナイザーを使用して、水
溶液中にタンパク試料を懸濁させた。

【００８９】致死率は処置の３日又は７日後に肉眼で評
価された。幼虫がほぼまっすぐになっていて、先の尖っ
ていない探り針でつついても動かず、反応しないもの
は、死にかかっていると考えられた。代表的な結果は以
下のとおりである。 毒素 率（ppm） 処置後日数 致死率％ PS33F2 75 3 78 0 3 12 PS52A1 200 7 75 0 7 5

【００９０】実施例６ パナグレルス・レジビブスに対
するＢ・スリンギエンシス分離体の活性 ぜん虫を管に集め、約15分落着かせ、水を傾斜させ、水
が澄んでくるまで、３回か４回新しい水と取り替える。
250μlのリンスした線虫（20-30匹）と胞子／結晶懸濁
液100μlをトレーの各穴の中の650μlの水に添加する。
線虫類を数え、数を記録する。４日後、生きている虫を
数え、致死率を計算する。 〔生物検定結果〕 先行技術（USSN 084,653、1987年8月12日出願） B.t.菌株番号 致死率 PS17 90％ PS33F2 30％ PS52A1 100％ PS63B 92％ PS69D1 100％ 新規なB.t.菌株番号 PS80JJ1 99％ PS158D5 99％ PS167P 96％ PS169E 100％ PS177F1 96％ PS177G 100％ PS204G4 100％ PS204G6 100％ 対照 0％ 次の表は、先行技術のB.t.菌株と比較した、各々の新規
な線虫活性菌株におけるアルカリ可溶性タンパク分子の
長さを示す。 先行技術の線虫活性菌株 B.t.菌株 タンパク分子の大体の長さ（kDa） PS17 155, 145, 135 PS33F2 140, 94, 86, 68, 65, 62 PS52A1 57, 45 PS63B 84, 82, 78 PS69D1 135, 46, 32 新規な線虫活性菌株 B.t.菌株 タンパク分子の大体の長さ（kDa） PS80JJ1 130, 90, 47, 37 PS158D5 80 PS167P 120 PS169E 150, 128, 33 PS177F1 140, 116, 103, 62 PS177G 135, 125, 107, 98, 62 PS204G4 105, 98, 90, 60, 44, 37 PS204G6 23, 21

【００９１】実施例７ ファスキオラ・ヘパチカに対す
る活性 B.t.タンパクを発現する野性型B.t.分離体及び組替え微
生物が生産する毒素を、その殺吸虫活性について試験し
た。生体外培養基（37℃、5％CO₂）は、イバラ(Ibarra)
及びジェンキンズ(Jenkins)[Z. Parasitenkd. 70巻655-
661頁、1984年］の変法によった。培養基培地は、50％v
/vうさぎ血清及び2％v/vうさぎRBCを加えたRPMI（pH 7.
5）からなっていた。 〔試験化合物〕 下記の実験
で、肝臓吸虫への種々の物質の影響を試験し、比較し
た。本明細書で使用される化合物PS17は、上記のよう
に、B.t.PS17の培養基から回収精製される毒素のことで
ある。化合物PS17aは、B.t.PS17aと指定されるB.t.遺伝
子で形質転換された組替え微生物の培養基から回収精製
された毒素のことである。化合物Ｃは、陰性対照として
使用された処方剤ブランクである。ABZは、スミスクリ
ン・ビーチャム社（ネブラスカ州リンカーン）から得ら
れる薬剤アルベンダゾールのことである。化合物PS17、
PS17a、及びＣは100 ppmで培地に直接添加され、ABZは
培地添加に先立って、無水エタノール100μlに溶解され
た。 〔効力の基準〕 倒立顕微鏡を40Ｘで使用し、吸虫を未
処理対照吸虫と比較して、死亡、致死率の乱れ、又は形
態的変化によって証拠づけられる薬剤処理の効果につい
て、3-8時間に毎時間、次いで１日１回又は２回の検査
を行なった。実験的に感染させたうさぎの肝臓から取り
出した生後３週間のファスキオラ・ヘパチカを、1.6 cm
のリンボ培養基プレート穴（培地2 ml、各穴に4-6匹）
中で５日間、生体外で培養した。５日間の培養後、化合
物PS17a（100 ppm、５匹）、化合物PS17（100 ppm、６
匹）を含有する培地と未処理対照培地（４匹）に吸虫を
移した。化合物PS17a中では、18時間までに全吸虫が死
亡した。化合物PS17中では、培地対照中の生存吸虫３匹
に比べ、24時間に１匹のみ生存した（動きはにぶい）。
形態的検査のため全吸虫を固定し、染色した。死亡吸虫
の分析に起因するものを除いて、明白な形態的変化は観
察されなかった。５日の培養前期間中、吸虫は活発な状
態にあり、明らかに活発な消化機能をもって培地からRB
Cを摂取するのが見られた。

【００９２】 表１． 未成熟Ｆ・ヘパチカ（生後３週、うさぎ起源）の生存数 化合物PS17a 化合物PS17 観察時間 100 ppm 100 ppm 培地対照 0 5 6 4 5分 5 6 4 1時間 5 6 4 2時間 5 6 4 3時間 5 6 4 6時間 5 6 4 8時間 5 6 4 18時間 0 4(動きにぶい) 3 24時間 1(動きにぶい) 3

【００９３】自然感染の子牛から回収された成熟吸虫４
匹を、培地5 mlの入った25 cm²組織培養基フラスコ中
で、別個に24時間生体外培養し、次に化合物PS17a（100
ppm）、化合物PS17（100 ppm）、ABZ（10 ppm）又は未
処理培地を含有する同様なフラスコに移した（表２）。
化合物PS17a中の吸虫は、10時間と18時間のあいだに死
亡し、化合物PS17中では18時間と20時間のあいだ、また
ABZ中では64時間までに死亡した。培地対照吸虫は、混
濁と黄色の培地着色で証拠立てられるように、汚染との
関連で、72時間に死亡した。

【００９４】これらの吸虫は、試験開始に先立って５日
間、RPMI 49％ + うさぎ血清49％ +うさぎRBC2％中で培
養された。実験は24時間後に終り、形態的検査のため全
吸虫を固定した。致死に先立つ吸虫の行動は、動きの不
活発と培地表面へ口の吸盤を向けることを伴っていた。
死亡時に体は収縮し、分解に先立って弛緩する。

【００９５】 表２． 成熟吸虫生存数 化合物PS17a 化合物PS17 アルベンダ 観察時間 100 ppm 100 ppm ゾール10 ppm 培地対照 0 1 1 1 1 5分 1 1 1 1 1時間 1 1 1 1 2時間 1 1 1 1 3時間 1 1 1 1 6時間 1 1 1 1 8時間 1 1 1 1 10時間 1 1 1 1 18時間 0 1^* 1 1 20時間 0 1 1 31時間 1 1 60時間 1 1 64時間 0 1 72時間 0^** * にぶい動き ** 体が収縮し、くねっている。培地は混濁。

【００９６】実施例８ 既知の効力をもった薬剤アルベンダゾール（ABZ）及び
未処理培地対照とに対する化合物PS17とPS17aの効力を
試験するために、追加実験を行なった。試験は、1) 自
然感染の子牛から取り出された成熟吸虫、及び2) うさ
ぎ起源の生後５週間の未成熟吸虫、に対して行なった。

【００９７】〔未成熟吸虫〕 生後５週間の未成熟Ｆ・
ヘパチカを、実験的に感染させたうさぎ肝臓から取り出
し、三重試験で培養基培地（1.6 cmリンボ培養プレー
ト、穴当たり2-3匹）に入れた。次に化合物PS17a（100
ppm）、化合物PS17（100 ppm）、アルベンダゾール（AB
Z, 10 ppm）、又は未処理培地（表３）各2 mlを含有す
る同様なリンボプレートに吸虫を移した。化合物PS17a
では、７匹中全部が20時間までに死亡した。暴露後８時
間で、にぶい動きが認められた。化合物PS17では、致死
率（７匹中２匹）と生存吸虫のにぶい動きが20時間で認
められ、31時間で７匹中５匹が死亡した。48時間では、
全吸虫が死亡した。ABZ陽性対照では、７匹中１匹が20
時間で死亡し、31時間までに４匹が死亡し、残りの吸虫
は60時間までに死亡した。未処理対照培地では、31時間
に７匹中２匹、48時間に３匹、55時間に４匹、60時間に
５匹、及び72時間に７匹全部が死亡した。（注：暴露後
35時間で、幾つかの穴の表層が混濁したきた。全吸虫を
RPMI中で洗い、元の薬剤濃度で新しい培地を含有する穴
に移した。）

【００９８】〔成熟吸虫〕 肝蛭症のため廃棄処分にさ
れた子牛肝臓３個（ロウチャー・ミートパッキング社、
ルイジアナ州プラークマイン）から取り出した成熟吸虫
を、無菌食塩水で洗い、食塩水中に保持し（2-3時
間）、化合物PS17a（100 ppm）、化合物PS17（100 pp
m）、アルベンダゾール（ABZ, 10 ppm）、又は未処理培
地（表４）を含有する25 mlの組織培養フラスコ２個の
各々に４匹の吸虫を入れた。化合物PS17aでは10-11時間
に、化合物PS17では20時間に全吸虫が死亡した。ABZ中
では、48-54時間に吸虫が死亡した。対照培地では２匹
が48時間に死亡し、66時間までに全吸虫が死亡した。
（注： 31-48時間にフラスコの汚染が認められた。）

【００９９】 表３． 未成熟吸虫（うさぎ起源、生後５週間）の生存数 化合物PS17a 化合物PS17 アルベンダ 観察時間 100 ppm 100 ppm ゾール10 ppm 培地対照 W1 W2 W3 W1 W2 W3 W1 W2 W3 W1 W2 W3 0 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 5分 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 1時間 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 2時間 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 3時間 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 6時間 2 2 3 2 2 3 2 2 2 2 2 3 8時間 2^* 2^* 3^* 2 2 3 2 2 2 2 2 3 20時間 0 0 0 2^* 2^* 1^* 2 2 2 2 2 3 31時間 1^* 0 1^* 1 1 1 2 2 1 35時間 注：幾つかの穴の表層は混濁していた。培地を代え、吸虫をRPMIの みで洗った。洗った生存吸虫を、元の濃度の薬剤を加えた新し い培地に移した。 48時間 0 0 0 1 1 1 1 2 1 55時間 1 1 1 1 2 60時間 0 0 0 1^* 1^* 0 72時間 0 0 0 * 動きのにぶい吸虫。

【０１００】 表４． 成熟吸虫（牛起源）に対する効果 化合物PS17a 化合物PS17 アルベンダ 観察時間 100 ppm 100 ppm ゾール10 ppm 培地対照 フラスコ １ ２ １ ２ １ ２ １ ２ 0 4 4 4 4 4 4 4 4 5分 4 4 4 4 4 4 4 4 1時間 4 4 4 4 4 4 4 4 2時間 4 4 4 4 4 4 4 4 3時間 4 4 4 4 4 4 4 4 8時間 4 4 4 4 4 4 4 4 10-11時間 0 0 4 4 4 4 4 4 18時間 4^* 4^* 4 4 4 4 20時間 0 0 4 4 4 4 31時間 4 4 4 4 48時間 2 3 4 2 注： 31-48時間に明白なフラスコ内の汚染 54時間 0 0 3 1 66時間 0 0 * にぶい動き

【０１０１】実施例９ 廃棄処分の子牛肝臓の胆管から吸虫を回収し、無菌のRP
MI中で10-20匹ずつの群で2-3時間洗った。６穴リンブロ
組織培養基プレート（サイズ10 ml）の、処理又は未処
理培地4 mlを含有する各穴で、１匹ずつの吸虫を培養し
た。知られた殺吸虫活性をもたない処方ブランク（化合
物Ｃ）も試験した。潜在的汚染源を確認するために、2
％RBCを加えた培地対照と2％RBCなしの培地対照を包含
する追加の対照を加えた。ABZ濃度を25 ppmに高めた。
汚染源の制御のため、薬剤又は培地のみを含有する対照
穴も含まれた。

【０１０２】この実験は、１２のレプリカを包含した
（表５）。これらレプリカのうち６は処理又は未処理培
地のみの穴に対応した。化合物PS17aについては、12匹
全部が12時間までに死亡し、弱い動きが10時間の早い時
期に観察された。化合物PS17の吸虫全部は19時間又は24
時間の観察期までに死亡した。化合物Ｃの吸虫致死率
は、36-58時間に観察された。2％RBCを加えた培地と2％
RBCを加えない対照培地では、１匹が36時間に、２匹が5
8時間に、及び３匹が72時間に死亡した。１匹は、2％RB
Cを加えた培地で115時間生存した。12レプリカのうち８
匹、及び対応培地対照の６匹のうち２匹については、暴
露後24時間で、吸虫を入れた穴と吸虫を入れない穴と
も、培地を選択的に変更した。この余分の取扱い手順
で、培地の混濁と黄変から証拠づけられるように、明ら
かに汚染のため、８レプリカのうち６匹が58時間までに
死亡する結果となった。24時間で培地を変えた２レプリ
カは、汚染されなかった。６培地対照（吸虫なし）レプ
リカは、115時間の培養中、汚染されなかった。

【０１０３】 表５． 成熟ファスキオラ・ヘパチカ（牛起源）に対する生体外効力 化合物 化合物 化合物 ABZ 培地 培地 時間 PS17a PS17 Ｃ RBC RBC 100 ppm 100 ppm 100 ppm 25 ppm なし あり 1 12 12 12 12 12 12 2 12 12 12 12 12 12 3 12 12 12 12 12 12 10 12^* 12 12 12 12 12 14 0 12 12 12 12 12 19 10 12 12 12 12 24 0 12 11 12 12 36 8(5)¹ 7(4) 11(5) 11(5) 44 4(3) 5(2) 11(5) 11(5) 58^** 0(0) 2(0) 5(0) 5(0) 74 1 4 4 98 0 1 2 115 0 1 * 弱い動きのみ。 1 （24時間に培地変更を受けたレプリカ中の吸虫生存数） ** 24時間に培地変更を受けた８レプリカ中６で、恐らく追加取扱いに関連する 汚染のため、全吸虫が58時間に死亡した。24時間に変更を受けた培地対照の２レ プリカは、汚染されなかった。

【０１０４】実施例１０ 毒素遺伝子の植物への挿入 本明細書で明らかにされている新規な殺虫剤毒素をコー
ドした新規な遺伝子は、アグロバクター・ツメファシエ
ンス(Agrobacter tumefaciens)からのTiプラスミドを使
用して、植物細胞へ挿入できる。次に植物細胞を植物へ
再生させる[ザンブリスキ・ピー(Zambryski, P.)、ジョ
ース・エッチ(Joos, H.)、ジェンテロ・シー(Gentello,
C.)、リーマンス、ジェイ(Leemans, J.)、バン・モン
タギュー・エム(Van Montague, M.)、及びシェル・ジェ
イ(Schell, J.)(1983年)Cell 32巻1033-1043頁]。この
点で、特に有用なベクターはpEND4Kである[クリー・エ
ッチ・ジェイ(Klee, H.J.)、ヤノフスキー・エム・エフ
(Yanofsky, M.F.)及びネスター・イー・ダブリュー(Nes
ter, E.W.)(1985年)Bio/Technology 3巻637-642頁]。こ
のプラスミドは、植物細胞と細菌中で複製でき、パッセ
ンジャー遺伝子に対して複数のクローニング位置をもっ
ている。例えば毒素遺伝子はpEND4KのBamHI位置へ挿入
され、大腸菌中で増殖し、適当な植物細胞へ形質転換さ
れる。

【０１０５】実施例１１ 新規なB.スリンギエンシス遺
伝子のバクロウイルスへのクローニング 本発明の新規な遺伝子を、オートグラファ・カリフォル
ニカ(Autographa californica)核ポリヘドロシスウイル
ス(AcNPV)のようなバクロウイルスへクローン化でき
る。pUC8のような市販のクローニングベクターにクロー
ン化されたAcNPVゲノムを含有するプラスミドを構築で
きる。AcNPVゲノムを変更し、ポリヘドリン遺伝子のコ
ード領域が除かれて、パッセンジャー遺伝子の特異なク
ローニング位置がポリヘドリンプロモータの真後ろに置
かれるようにする。このようなベクターの例はペノック
ら[ペノック・ジー・ディー(Pennock,G.D.)、シューメ
ーカー・シー(Shoemaker, C.)及びミラー・エル・ケイ
(Miller,L.K.)（1984年）Mol.Cell Biol.4巻399-406
頁］に記述されたpGP-B6874、及びスミスら[スミス・ジ
ー・イー(Smith,G.E.)、サマーズ・エム・ディー(Summe
rs, M.D.)及びフレーザー・エム・ジェイ（1983年）Mo
l. Cell Biol.3巻2156-2165頁]に記述されたpAC380であ
る。本発明の新規なタンパク毒素をコードした遺伝子
は、コード領域から上流及び下流の適当な領域で、BamH
Iリンカーによって変更でき、AcNPVベクター類の一つの
もののパッセンジャー位置に挿入できる。

【０１０６】本明細書に記載の実施例及び態様は、例示
目的だけのものであり、これらに関する種々の変更が当
業者に示唆され、かつ本出願の精神と目的、及び添付の
特許請求の範囲内に含まれることが理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【図１】 連続して配列１即ち、PS17aのＤＮＡを明ら
かにしている。

【図２】 連続して配列１即ち、PS17aのＤＮＡを明ら
かにしている。

【図３】 連続して配列２即ち、PS17aによってコード
化された毒素のアミノ酸配列を明らかにしている。

【図４】 連続して配列２即ち、PS17aによってコード
化された毒素のアミノ酸配列を明らかにしている。

【図５】 連続して配列３即ち、PS17bのＤＮＡを明ら
かにしている。

【図６】 連続して配列３即ち、PS17bのＤＮＡを明ら
かにしている。

【図７】 連続して配列４即ち、PS17bによってコード
化された毒素のアミノ酸配列を明らかにしている。

【図８】 連続して配列４即ち、PS17bによってコード
化された毒素のアミノ酸配列を明らかにしている。

【図９】 連続して配列５即ち、PS33F2からの遺伝子の
ヌクレオチド配列である。

【図10】 連続して配列５即ち、PS33F2からの遺伝子の
ヌクレオチド配列である。

【図11】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図12】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図13】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図14】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図15】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図16】 連続して配列６即ち、PS33F2からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図17】 配列７即ち、PS52A1からの遺伝子のヌクレオ
チド配列である。

【図18】 連続して配列８即ち、PS52A1からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図19】 連続して配列８即ち、PS52A1からの遺伝子に
よって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図20】 配列９即ち、PS69D1からの遺伝子のヌクレオ
チド配列である。

【図21】 連続して配列１０即ち、PS69D1からの遺伝子
によって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

【図22】 連続して配列１０即ち、PS69D1からの遺伝子
によって発現されるタンパクのアミノ酸配列である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/711 Ａ６１Ｋ 35/74 Ａ ４Ｃ０８６ 35/74 Ａ６１Ｐ 33/00 １７１ ４Ｃ０８７ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/32 ４Ｈ０１１ Ａ６１Ｐ 33/00 １７１ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ ４Ｈ０４５ Ｃ０７Ｋ 14/32 Ｅ Ｃ１２Ｎ 1/20 1/21 (Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 ０７／５６５，５４４ (32)優先日 平成２年８月10日(1990．8．10) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／６６９，１２６ (32)優先日 平成３年３月14日(1991．3．14) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／６７５，７７２ (32)優先日 平成３年３月27日(1991．3．27) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０７／６９３，０１８ (32)優先日 平成３年５月３日(1991．5．3) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 ジュエル エム． ペイン アメリカ合衆国 92126 カリフォルニア 州 サンディエゴ ハンプヒル ドライブ 7984 (72)発明者 ジョージ イー． シュワブ アメリカ合衆国 92037 カリフォルニア 州 ロサンジェルス ジョラ プロスペク ト 316 (72)発明者 レスリー アン ヒッケル アメリカ合衆国 92115 カリフォルニア 州 サンディエゴ コーリア アベニュー 54 (72)発明者 テレサ ガラサン アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サンディエゴ サドル マウンテン コート 4520 (72)発明者 オーガスト ジェイ． シック アメリカ合衆国 92056 カリフォルニア 州 オーシャンサイド サンヘレナ ドラ イブ 3188 Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA15 CA17 2B150 AA01 AA02 AA03 AA06 AB10 AC02 AC37 DD12 4B024 AA07 BA38 CA02 DA01 DA06 4B065 AA20Y AA26X AA89X AB01 AC14 BA02 CA24 CA48 4C084 AA02 AA06 BA01 BA08 BA22 BA23 MA01 NA14 ZB382 ZC612 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 MA01 MA04 NA14 ZB39 ZC61 4C087 AA01 AA02 BC64 CA20 MA01 NA14 ZB39 ZC61 4H011 AC01 BB06 BB21 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA11 DA83 EA06 FA74

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 線虫類に対して活性のあるバシラス・ス
   リンギエンシス分離体であって、 (a) バシラス・スリンギエンシス菌株PS80JJ1; (b) バシラス・スリンギエンシス菌株PS158D5; (d) バシラス・スリンギエンシス菌株PS169E; (e) バシラス・スリンギエンシス菌株PS177F1; (f) バシラス・スリンギエンシス菌株PS177G; (g) バシラス・スリンギエンシス菌株PS204G4;及び (h) バシラス・スリンギエンシス菌株PS204G6; からなる群から選ばれる分離体。
2. 【請求項２】 以下の群、すなわち (a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと命名される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
   した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
   てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
   り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
   ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
   ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
   配列をもったもの； (g) B.t.PS17dと命名される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
   られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
   配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
   限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
   ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
   られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
   配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
   限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
   ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
   ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
   t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.t.菌株PS177G、B.
   t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6の一つから得られ
   る遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、殺線
   虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれるＤ
   ＮＡ。
3. 【請求項３】 配列２、配列４、配列６、配列８、及び
   配列１０に示す配列からなる群から選ばれるアミノ酸配
   列をもった殺線虫毒素をコード化したＤＮＡ。
4. 【請求項４】 B.t.PS33F2、B.t.PS63B、B.t.PS52A1、
   B.t.PS69D1、B.t.PS17a、B.t.PS17b、B.t.PS17d、及び
   B.t.PS17eと指定された遺伝子からなる群から選ばれる
   遺伝子を含めてなる組替えＤＮＡ運搬ベクター。
5. 【請求項５】 pMYC2316、pMYC2321、pMYC2317、pMYC16
   27、pMYC1628、pMYC2309、及びPMYC2311からなる群から
   選ばれる、請求項４による組替えＤＮＡ運搬ベクター。
6. 【請求項６】 線虫に対して活性のある毒素であって、
   以下の配列、 (a) 配列２に示すアミノ酸配列、又は配列２に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分； (b) 配列４に示すアミノ酸配列、又は配列４に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分； (c) 配列６に示すアミノ酸配列、又は配列６に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分； (d) 配列８に示すアミノ酸配列、又は配列８に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分；及び (e) 配列１０に示すアミノ酸配列、又は配列１０に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分；の一つを含めてなるアミノ酸配列をも
   った毒素。
7. 【請求項７】 バシラス・スリンギエンシス殺線虫毒素
   を発現させるために形質転換されるホスト細胞であっ
   て、上記毒素が以下の群、すなわち (a) 配列２に示すアミノ酸配列、又は配列２に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分を有する毒素； (b) 配列４に示すアミノ酸配列、又は配列４に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分を有する毒素； (c) 配列６に示すアミノ酸配列、又は配列６に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分を有する毒素； (d) 配列８に示すアミノ酸配列、又は配列８に示す配列
   の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配列の
   任意の部分を有する毒素；及び (e) 配列１０に示すアミノ酸配列、又は配列１０に示す
   配列の殺線虫活性の実質的に全部を保持している上記配
   列の任意の部分を有する毒素；から選ばれる場合のホス
   ト細胞。
8. 【請求項８】 (a) NRRL B-18785の確認殺線虫特性をも
   った大腸菌（NM522)(pMYC2316）、(b) NRRL B-18770の
   確認殺線虫特性をもった大腸菌（NM522)(pMYC2321)、
   (c) NRRL B-18816の確認殺線虫特性をもった大腸菌（NM
   522)(pMYC2317)、(d) NRRL B-18651の確認特性をもった
   大腸菌（NM522)(pMYC1627)、(e) NRRL B-18652の確認特
   性をもった大腸菌（NM522)(pMYC1628)、(f) 大腸菌（NM
   522)(pMYC2311)、及び(g) 大腸菌（NM522)(pMYC2309)か
   らなる群から選ばれる、請求項７による形質転換された
   細菌ホスト。
9. 【請求項９】 少なくとも一つの細胞内殺線虫毒素を含
   めてなる実質的に不活性の組替え細胞であって、上記毒
   素が (a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
   の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
   した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
   てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
   り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
   ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
   ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
   配列をもつもの； (g) B.t.PS17dと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
   られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
   配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
   限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
   ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
   ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
   られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
   配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
   限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
   ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
   ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
   t.菌株PS167P、B.t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.
   t.菌株PS177G、B.t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6
   の一つから得られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めて
   なる場合の、殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる
   群から選ばれるＤＮＡによってコード化されたδ-エン
   ドトキシンポリペプチド毒素をコードしたバシラス・ス
   リンギエンシス毒素遺伝子の発現結果である場合の組替
   え細胞。
10. 【請求項１０】 請求項９の組替え細胞を含めてなる殺
    線虫組成物。
11. 【請求項１１】(a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示
    す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオチド配
    列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
    した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
    てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
    り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
    ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
    ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
    配列をもつもの； (g) B.t.PS17dと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
    ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
    t.菌株PS167P、B.t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.
    t.菌株PS177G、B.t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6
    の一つから得られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めて
    なる場合の、殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる
    群から選ばれるＤＮＡを含めてなる植物。
12. 【請求項１２】(a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示
    す配列、又はその断片、を含めてなるヌクレオチド配
    列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
    した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
    てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
    り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
    ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
    ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
    配列をもったもの； (g) B.t.PS17dと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
    ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
    t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.t.菌株PS177G、B.
    t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6の一つから得られ
    る遺伝子のヌクレオチド配列を含めてなる場合の、殺線
    虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる群から選ばれるＤ
    ＮＡによってコード化された毒素の線虫防除有効量に上
    記の線虫を接触させることを含めてなる線虫防除法であ
    って、上記のＤＮＡが植物その他のホスト細胞に形質転
    換された場合の線虫防除法。
13. 【請求項１３】 線虫を宿した動物の処置法であて、 (a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
    した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
    てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
    り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
    ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
    ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
    配列をもつもの； (g) B.t.PS17dと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
    ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
    t.菌株PS167P、B.t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.
    t.菌株PS177G、B.t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6
    の一つから得られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めて
    なる場合の、殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる
    群から選ばれるＤＮＡによってコード化された毒素の線
    虫防除有効量を上記の動物に投与することを含めてなる
    方法。
14. 【請求項１４】 殺線虫毒素がバシラス・スリンギエン
    シス分離体から得られるバシラス・スリンギエンシス遺
    伝子によって発現され、この遺伝子が植物の根の領域や
    葉の領域を占有し、そこで生存、繁殖できるような植物
    又は異なる微生物中に遺伝的に工学処理される、請求項
    １３による方法。
15. 【請求項１５】 吸虫を宿したホストに、又は上記吸虫
    に直接に、又は上記吸虫の場所に、野性型バシラス・ス
    リンギエンシスからの毒素、又は組替えホスト中に形質
    転換され発現せしめたバシラス・スリンギエンシスＤＮ
    Ａによってコード化された毒素の殺吸虫量を投与するこ
    とを含めてなる、吸虫の防除法。
16. 【請求項１６】 上記のバシラス・スリンギエンシス
    が、バシラス・スリンギエンシス（B.t.）PS17、B.t.PS
    33F2、B.t.PS52A1、B.t.PS63B、B.t.PS69D1、B.t.PS80J
    J1、B.t.PS158D5、B.t.菌株PS167P、B.t.PS169E、B.t.P
    S177F1、B.t.PS177G、B.t.PS204G4、及びB.t.PS204G6か
    らなる群から選ばれる、請求項１５による方法。
17. 【請求項１７】 上記のＤＮＡが、 (a) 殺線虫毒素をコードした配列１に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (b) 殺線虫毒素をコードした配列３に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (c) 殺線虫毒素をコードした配列５に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (d) 殺線虫毒素をコードした配列７に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (e) 殺線虫毒素をコードした配列９に示す配列、又はそ
    の断片、を含めてなるヌクレオチド配列； (f) B.t.PS63Bと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体から得られる、殺線虫毒素をコード
    した遺伝子のヌクレオチド配列、又はその断片、を含め
    てなるＤＮＡであって、制限断片長の多型性分析によ
    り、4.4kb ＸbaＩハイブリッド形成帯、ＱＬＱＡＱＰＬ
    ＩＰＹＮＶＬＡを包含するN-末端アミノ酸配列、及びＶ
    ＱＲＩＬＤＥＫＬＳＦＱＬＩＫを包含する内部アミノ酸
    配列をもつもの； (g) B.t.PS17dと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、5.0kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの； (h) B.t.PS17eと指定される殺線虫活性バシラス・スリ
    ンギエンシス分離体のＢ・スリンギエンシスPS17から得
    られる、殺線虫毒素をコードした遺伝子のヌクレオチド
    配列、又はその断片、を含めてなるＤＮＡであって、制
    限断片長の多型性分析により、1.8kb ＥcoRIハイブリッ
    ド形成帯をもつもの；及び (i) ＤＮＡが以下の分離体、すなわちバシラス・スリン
    ギエンシス（B.t.）菌株PS80JJ1、B.t.菌株PS158D5、B.
    t.菌株PS167P、B.t.菌株PS169E、B.t.菌株PS177F1、B.
    t.菌株PS177G、B.t.菌株PS204G4、及びB.t.菌株PS204G6
    の一つから得られる遺伝子のヌクレオチド配列を含めて
    なる場合の、殺線虫毒素をコードしたＤＮＡ；からなる
    群から選ばれる、請求項１５による方法。
18. 【請求項１８】 組替えホスト中に形質転換され発現せ
    しめられたバシラス・スリンギエンシス遺伝子によって
    コード化された毒素、又は野性型バシラス・スリンギエ
    ンシスを含み、更に殺吸虫剤の施用に適した担体を含
    む、吸虫防除用組成物。