DE69132697T2 - Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen - Google Patents

Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen

Info

Publication number
DE69132697T2
DE69132697T2 DE69132697T DE69132697T DE69132697T2 DE 69132697 T2 DE69132697 T2 DE 69132697T2 DE 69132697 T DE69132697 T DE 69132697T DE 69132697 T DE69132697 T DE 69132697T DE 69132697 T2 DE69132697 T2 DE 69132697T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
bacillus thuringiensis
nematode
toxin
nematodes
active
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
DE69132697T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69132697D1 (de
Inventor
Theresa Galasan
Leslie Ann Hickle
Kenneth E. Narva
Jewel M. Payne
George E. Schwab
August J. Sick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Mycogen Corp
Original Assignee
Mycogen Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US07/557,246 external-priority patent/US5281530A/en
Priority claimed from US07/558,738 external-priority patent/US5151363A/en
Priority claimed from US07/669,126 external-priority patent/US5236843A/en
Priority claimed from US07/675,772 external-priority patent/US5262399A/en
Application filed by Mycogen Corp filed Critical Mycogen Corp
Publication of DE69132697D1 publication Critical patent/DE69132697D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69132697T2 publication Critical patent/DE69132697T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46N-acyl derivatives
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A01AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01NPRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50Isolated enzymes; Isolated proteins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00Antiparasitic agents

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Die regelmäßige Anwendung von Chemikalien zur Bekämpfung unerwünschter Organismen kann wirkstoffresistente Stämme selektionieren. Dies trat bei vielen Spezies wirtschaftlich bedeutsamer Insekten ein und trat auch bei Nematoden von Schafen, Ziegen und Pferden ein. Die Entwicklung von Wirkstoffresistenz erfordert eine andauernde Suche nach neuen Bekämpfungsmitteln mit neuen Wirkungsweisen.
  • In jüngerer Zeit konzentrierte sich die akzeptierte Methodik zur Bekämpfung von Nematoden auf den Wirkstoff Benzimidazol und dessen Verwandte. Die Anwendung dieser Wirkstoffe im großen Maßstab führte zu vielfachem Auftreten von Resistenz bei Nematodenpopulationen (Prichard, R. K. et al. [1980] "The problem of anthelmintic resistance in nematodes", Austr. Vet. J. 56 : 239-251; Coles, G. C. [1986] "Anthelmintic resistance in sheep", in Veterinarv Clinics of North America: Food Animal Practice, Bd. 2 : 423-432 [Herd, R. P., Hrsg.] W. B. Saunders, New York). Es gibt mehr als 100.000 beschriebene Spezies von Nematoden.
  • Das Bakterium Bacillus thuringiensis (B.t.) produziert ein δ-Endotoxin-Polypeptid, von dem gezeigt wurde, daß es Aktivität gegenüber einer rapid wachsenden Zahl von Insektenspezies besitzt. Zu den früheren Beobachtungen von Toxizität gegenüber lediglich Lepidoptera-Insekten kamen Beschreibungen von B.t.-Isoiaten mit Toxizität gegenüber Diptera- und Coleoptera-Insekten hinzu. Diese Toxine werden als kristalline Einschlüsse innerhalb des Organismus abgeschieden. Viele B.t.-Stämme produzieren kristalline Einschlüsse ohne nachgewiesene Toxizität gegenüber irgendeinem getesteten Insekt.
  • Es wurde eine kleine Anzahl Forschungsartikel über die Wirkungen von δ- Endotoxinen von B. thuringiensis-Spezies auf die Lebensfähigkeit von Nematoden- Eier publiziert. Bottjer, Bone und Gill (Experimental Parasitology 60 : 239-244, 1985) berichteten, daß B.t. kurstaki und B.t. israelensis in vitro für Eier des Nematoden Trichostrongylus colubriformis toxisch waren. Darüber hinaus wurden 28 andere B.t.- Stämme mit stark variierenden Toxizitäten getestet. Der wirksamste besaß LD&sub5;&sub0;- Werte im Nanogrammbereich. Ignoffo und Dropkin (Ignoffo, C. M. und Dropkin, V. H. [1977], J. Kans. Entomol. Soc. 50 : 394-398) berichteten, daß das thermostabile Toxin von Bacillus thuringiensis (β-Exotoxin) Aktivität gegenüber einem freilebenden Nematoden, Panagrellus redivivus (Goodey), einem pflanzenparasitischen Nematoden, Meloidogyne incognita (Chitwood), und einem sich von Pilzen ernährenden Nematoden, ADhelenchus avena (Bastien), besaß. β-Exotoxin ist ein allgemeines cytotoxisches Agens mit geringer oder keiner Spezifität. H. Ciordia und W. E. Bizzell (Jour. of Parasitology 47 : 41 [Abstract] 1961) gaben auch einen vorläufigen Bericht über die Wirkungen von B. thuringiensis auf einige Rinder-Nematoden.
  • Saugwürmer gehören zur Subklasse Digenea, Klasse Trematoda im Stamm Platyhelminthen. Diese Digenea-Vertreter haben alle einen Zwischenwirt und werden ausschließlich in Vertebraten, einschließlich des Menschen, gefunden. Familien, welche Vertreter von beträchtlicher veterinärmedizinischer Bedeutung aufweisen, sind die Fasciolidae, Dicrocoeliidae, Paramphistomatidae und Schistosomatidae. Die ausgewachsenen Trematoden-Saugwürmer treten hauptsächlich in den Gallengängen, im Verdauungstrakt und Gefäßsystem auf. Die Eier verlassen den letzten Wirt in Abhängigkeit von der bevorzugten Stelle, gewöhnlich im Kot oder Urin, und die Larvenstadien entwickeln sich in einem Mollusken-Zwüschenwirt.
  • In Abhängigkeit von der Anzahl und dem Entwicklungsstadium der Parasiten und der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Bakterien (Clostridium novvi) können mehrere klinische Syndrome mit einer Leberegel (Fasciola sp.)-Infektion assoziiert sein. Die akute Trematödenerkrankung tritt- während der Invasion der Leber durch kürzlich aufgenommene Metacercarien auf. Schafen können infolge einer fokalen Lebernekrose und umfangreicher subkutaner Hämorrhagie sehr schnell sterben.
  • Die antheimintische Medikation in den Vereinigten Staaten besteht gegenwärtig hauptsächlich aus Albendazol, welches nur in wenigen Staaten erhältlich ist, in denen Fasciola hepatica ein ernsthaftes Problem darstellt. Eine spezielle Ausnahmegenehmigung ist erforderlich, um Schafe mit Albendazol anderswo in den Vereinigten Staaten zu behandeln. Andere effektive Trematozide - Diamphenethid, Nitroxynil, Oxyclozanid, Rafoxanid und Triclabendazol - sind in den Vereinigten Staaten nicht erhältlich.
  • Es besteht Bedarf dafür, wirksamere Mittel zur Bekämpfung der vielen Nematoden und Trematoden zu haben, welche eine beträchtliche Schädigung von anfälligen Wirten verursachen. Vorteilhafterweise würden solche Mittel von biologischen Agentien Gebrauch machen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den neuen Bacillus thuringiensis-Stamm PS80JJ1, der ein biologisch aktives Toxin produziert. Es wurcle gezeigt, daß dieses Toxin Aktivität gegenüber Nematoden besitzt. Ein speziell erläutertes Beispiel ist die Aktivität gegenüber Panagrellus redivivus (auch als Bierdeckel-Nematode bekannt), ein häufiger freilebender Nematode, der relativ leicht im Labor zu halten ist. Er wird oft als Indikator (Modell) von Nematoden-Aktivität verwendet. Die Toxine der vorliegenden Erfindung können auch zur Bekämpfung von Trematoden, einschließlich des Leberegels Fasciola hepatica, eingesetzt werden.
  • Das B.t.-Isolat gemäß der vorliegenden Erfindung kann gezüchtet werden und das produzierte δ-Endotoxin nach Standardverfahren und wie hier näher beschrieben gewonnen werden. Das gewonnene Toxin oder das B.t.-Isolat selbst können nach Standardverfahren formuliert werden, die mit dem Anwendung von nematoziden oder trematoziden Produkten verbunden sind.
  • Ein Gen, welches für das Toxin kodiert, kann ebenfalls von B.t. PS80JJ1 erhalten werden.
  • Eine Subkultur des neuen Bacillus thuringiensis-Isolats wurde am 17.7.90 in der permanenten Sammlung des Northern Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18679.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Das neue Toxin zeigt Aktivität gegenüber den getesteten Nematoden. Die Gruppe von Erkrankungen, die allgemein als Helminthiasis bezeichnet wird, beruht auf einer Infektion eines tierischen Wirts durch parasitische Würmer, die als Helminthen bekannt sind. Helminthiasis ist ein weit verbreitetes und ernsthaftes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren wie Schweinen, Schafen, Pferden, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Von den Helminthen verursacht die Gruppe von Würmern, die als Nematoden bezeichnet wird, umfangreiche und oft schwerwiegende Infektionen bei verschiedenen Tierspezies. Die häufigsten Gattungen von Nematoden, welche die oben genannten Tiere infrzieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, Caenorhabditis und Parascaris. Bestimmte Vertreter davon, wie z. B. Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen primär den Darmtrakt an, während andere, wie z. B. Dicytocaulus, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und Organen des Körpers lokalisiert sein.
  • Das Toxin der vorliegenden Erfindung eignet sich als Nematozid zur Bekämpfung von Boden-Nematoden und Pflanzenparasiten, die aus den Gattungen Bursaphalenchus, Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Melodiogyne, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus oder Tylenchus ausgewählt sind.
  • Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um Leberegel zu bekämpfen, welche Vertebraten parasitieren können. Konkret kann die Erfindung eingesetzt werden, um Trematoden bei Menschen, Vieh, Haustieren und anderen Tieren zu gekämpfen. Der Begriff "Vieh", wie hier verwendet, kann beispielsweise Schafe, Rinder, Schweine und Ziegen einschließen. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um heranwachsende und ausgewachsene Trematoden zu bekämpfen. Die Bekämpfungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Weidebehandlung (für Vertebraten- und Zwischenwirte), Liposomen oder andere Träger zur Abgabe der Toxine an die Leber oder Gallengänge, und Behandlung von freilebenden Formen der Trematoden in den gastrointestinalen Trakten von Vertebraten-Wirten. Das hier beschriebene trematozide B.t.-Toxin kann allein oder abwechselnd oder in Kombination mit anderen Trematoziden, wie z. B. Albendazol, eingesetzt werden.
  • Das B.t.-Isolat der Erfindung, wie hier beschrieben, weist Aktivität gegenüber Leberegeln auf. Es steht zu erwarten, daß diese Isolate gegen andere Trematoden, wie sie hier offenbart sind, aktiv sein werden.
  • Das B.t.-Toxin der Erfindung kann bei Verwendung als Anthelmintikum bei Säugern und im Boden zur Bekämpfung von Pflanzen-Nematoden in einer Dosierungseinheitsform, wie z. B. einer Kapsel, einem Bolus oder einer Tablette, oral verabreicht werden oder als Beizflüssigkeit. Die Beize ist normalerweise eine Lösung, Suspension oder Dispersion des aktiven Bestandteils, gewöhnlich in Wasser, zusammen mit einem Suspendiermittel wie Bentonit und einem Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Exzipienten. Im allgemeinen enthalten die Beizen auch ein Antischaummittel. Beizformulierungen enthalten gewöhnlich etwa 0,001 bis 0,5 Gew.-% der aktiven Verbindung. Bevorzugte Beizformulierungen können 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthalten, die Kapseln und Boli umfassen den aktiven Bestandteil in Mischung mit einem Trägervehikel, wie z. B. Stärke, Talkum, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat.
  • Ist es erwünscht, das Toxin in einer trockenen festen Dosierungseinheitsform zu verabreichen, werden gewöhnlich Kapseln, Boli oder Tabletten, welche die gewünschte Menge an aktiver Verbindung enthalten, eingesetzt. Diese Dosierungsformen werden hergestellt durch innige und gleichmäßige Mischung des aktiven Bestandteils mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllmitteln, Desintegrationsmitteln und/oder Bindemitteln, wie z. B. Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, Pflanzengummis und dgl. Solche Dosierungseinheitsformulierungen können bezüglich ihres Gesamtgewichts und Gehalts an aktivem Agens in Abhängigkeit von den Faktoren wie der Art des zu behandelnden Wirtslebewesens, der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirts in großem Umfang variiert werden.
  • Falls die aktive Verbindung über ein Tierfutter verabreicht werden soll, ist sie innig in dem Futter dispergiert oder wird als Dressing oder in Form von Pellets eingesetzt, welche dann dem fertigen Futter zugesetzt oder gegebenenfalls separat gefüttert werden können. Alternativ können die Toxin-Verbindungen Tieren parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intraruminale, intramuskuläre, intratracheale oder subkutane Injektion, in welchem Fall der aktive Bestandteil in einem flüssigen Trägervehikel gelöst oder dispergiert ist. Zur parenteralen Verabreichung ist das aktive Material geeigneterweise mit einem annehmbaren Vehikel, vorzugsweise vom Pflanzenöl-Typ, wie z. B. Erdnußöl, Baumwollsamenöl und dgl., gemischt. Andere parenterale Vehikel, wie z. B. organische Präparationen unter Verwendung von Solketal, Glycerin, Formal und wäßrige parenterale Formulierungen, werden ebenfalls verwendet. Die aktive(n) Verbindung oder Verbindungen wird/werden zur Verabreichung in der parenteralen Formulierung gelöst oder suspendiert; solche Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,005 bis 5 Gew.-% der aktiven Verbindung.
  • Wird das Toxin als Komponente des Futters der Tiere verabreicht oder in dem Trinkwasser gelöst oder suspendiert, werden Zusammensetzungen bereitgestellt, in denen die aktive Verbindung innig in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel dispergiert ist. Mit einem inertem Träger ist ein Träger gemeint, der nicht mit dem aktiven Agens reagieren wird und der Tieren sicher verabreicht werden kann. Vorzugsweise ist ein Träger für die Verabreichung im Futter einer, der ein Bestandteil der Ration des Tieres ist oder sein kann.
  • Geeignete Zusammensetzungen umfassen Futtervormischungen oder -ergänzungen, worin der aktive Bestandteil in relativ großen Mengen vorhanden ist und welche sich für die direkte Fütterung des Tiers oder für den Zusatz zum Futter, entweder direkt oder nach einem Verdünnungs- oder Mischzwischenschritt, eignen. Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die sich für solche Zusammensetzungen eignen, schließen beispielsweise Trockenschlempe; Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, feine Weizenkleie, lösliche Melassebestandteile, Maiskolbenmehl, eßbares Bohnenmahlgut, Sojaschrot, zerstoßenen Kalkstein und dgl. ein.
  • Neben der Entfaltung von nematozider und trematozider Aktivität im Verdauungstrakt von Säugern werden Sporen des B.t.-Isolats den Verdauungstrakt der Tiere passieren, im Kot keimen und sich vermehren und dadurch für eine zusätzliche Bekämpfung von Larven sorgen, welche dort auschlüpfen und sich vermehren.
  • Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granula oder Stäube, durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, z. B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (pulverisierten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittei beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agentien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
  • Die Toxinkonzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Toxin wird in mindestens 1 Gew.-% vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen werden etwa 1-95 Gew.-% des Toxins enthalten, während die flüssigen Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Die Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
  • Die Formulierungen können in der Umwelt der Nematoden oder Trematoden, z. B. Pflanzen, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
  • Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.
  • BEISPIEL 1 - Kultivierung von B.t.-Isolaten
  • Eine Subkultur des B.t.-Isolats kann zur Animpfung des folgenden Mediums, eines Mediums mit Pepton, Glucose und Salzen, verwendet werden.
  • Bacto-Pepton 7,5 g/l
  • Glucose 1,0 g/l
  • KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
  • K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
  • Salzlösung 5,0 mI/l
  • CaCl&sub2; Lösung 5,0 ml/l
  • Salzlösung (100 ml)
  • MgSO&sub4;.7H&sub2;O 2,46 g
  • MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,04 g
  • ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0,28 g
  • FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,40 g
  • CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
  • CaCl&sub2;.2H&sub2;O 3,66 g
  • pH 7,2
  • Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden filtersterilisiert und zur autoklavierten und gekochten Bouillon zum Animpfungszeitpunkt zugegeben. Die Kolben werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM 64 h lang inkubiert.
  • Das obige Verfahren kann ohne weiteres nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren auf große Fermenter maßstäblich übertragen werden.
  • Die bei der obigen Fermentation erhaltenen B.t.-Sporen und -Kristalle können nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig verwendetes Verfahren besteht darin, die geemtete Fermentationsbouillon Trennungstechniken, z. B. Zentrifugation, zu unterwerfen.
  • BEISPIEL 2 - Reinigung und Aminosäureseauenzierung
  • Das neue Isolat kann wie in Beispiel 1 beschrieben oder unter Einsatz anderer, im Stand der Technik wohlbekannter Standardmedien und -fermentationstechniken kultiviert werden. Die Toxinproteineinschlüsse können mittels standardmäßiger Sedimentationszentrifugation geerntet werden. Die gewonnenen Proteineinschlüsse können mittels isopyknischer Natriumbromidgradienten (28-38%)-Zentrifugation partiell gereinigt werden (Pfannenstiel, M. A., E. J. Ross, V. C. Kramer und K. W. Nickerson [1984], FEMS Microbiol. Lett. 21 : 39). Danach können die individuellen Toxinproteine durch Solubilisierung des kristallinen Proteinkomplexes in einem alkalischen Puffer und Fraktionierung der individuellen Proteine mittels DEAE- Sepharose CL-6B (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)-Chromatographie durch schrittweise Zugaben zunehmender Konzentrationen eines NaCl-enthaltenden Puffers (Reichenberg, D., in Ion Exchangers in Oraanic and Biochemistry [C. Calmon and T. R. E. Kressman, Hrsg.], Interscience, New York, 1957) aufgetrennt werden. Fraktionen, welche ein für den Nematoden Caenorhabditis elegans (CE) toxisches Protein enthalten, können mittels Western Blot-Techniken (Towbin, H., T. Staehelin, und K. Gordon [1979], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350) an eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, MA) gebunden werden und die N-termirralen Aminosäuren mit der Standard-Edman-Reaktion mit einem automatischen Gasphasen-Sequenator bestimmt werden (Hunkapiller, M. W., R. M. Hewick, W. L. Dreyer und L. E. Hood [1983], Meth. Enzymol. 91 : 399).
  • BEISPIEL 3 - Aktivität gegenüber Panagrellus redivivus
  • Würmer werden in einem Röhrchen gesammelt und etwa 15 Minuten lang absitzen gelassen und das Wasser wird dekantiert und drei- oder viermal durch frisches Wasser ersetzt, bis das Wasser klar bleibt. 250 ul gespülte Nematoden (20 bis 30 Würmer) und 100 ul einer Sporen/Kristallsuspension von B.t. PS80JJ1 werden zu 650 ul Wasser in jeder Vertiefung eines Tabletts zugegeben. Die Nematoden werden gezählt und die Zahlen registriert. Nach 4 Tagen werden die lebenden Würmer gezählt. Es wurde eine 99%ige Sterblichkeit berechnet.
  • Die ungefähren Molekülmassen der Alkali-löslichen Proteine in PS80JJ1 waren 37, 47, 90 und 130 kDa.

Claims (5)

1. Bacillus thuringiensis-Stamm PS80JJ1, NRRL B-18679.
2. Toxin von etwa 130 kD mit Aktivität gegen Nematoden, welches aus dem Stamm nach Anspruch 1 erhältlich ist.
3. Verfahren zur Bekämpfung von Nematoden, welches das Kontaktieren der Nematoden mit einem Toxin nach Anspruch 2 umfaßt.
4. Verfahren zur Bekämpfung von Trematoden, welches umfaßt, daß einem Wirt, der einen Trematoden beherbergt, oder dem Trematoden direkt oder dem Aufenthaltsort des Trematoden ein Toxin nach Anspruch 2 verabreicht wird.
5. Nukleotidmolekül, kodierend für das Toxin nach Anspruch 2.
DE69132697T 1990-06-11 1991-06-04 Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen Expired - Fee Related DE69132697T2 (de)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US53581090A 1990-06-11 1990-06-11
US07/557,246 US5281530A (en) 1987-08-12 1990-07-24 Genes encoding nematode-active toxins cloned from bacillus thuringiensis isolate PS17
US07/558,738 US5151363A (en) 1990-07-27 1990-07-27 Isolates of Bacillus thuringiensis that are active against nematodes
US56554490A 1990-08-10 1990-08-10
US07/669,126 US5236843A (en) 1987-08-12 1991-03-14 Gene encoding a nematode-active toxin cloned from a Bacillus thuringiensis isolate
US07/675,772 US5262399A (en) 1987-08-12 1991-03-27 Compositions and methods for the control of flukes
US69301891A 1991-05-03 1991-05-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69132697D1 DE69132697D1 (de) 2001-09-27
DE69132697T2 true DE69132697T2 (de) 2002-06-13

Family

ID=27569832

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69132697T Expired - Fee Related DE69132697T2 (de) 1990-06-11 1991-06-04 Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen

Country Status (10)

Country Link
EP (2) EP1143004A3 (de)
JP (3) JPH04229170A (de)
AT (1) ATE204605T1 (de)
AU (1) AU656726B2 (de)
CA (1) CA2042868A1 (de)
DE (1) DE69132697T2 (de)
DK (1) DK0462721T3 (de)
ES (1) ES2161685T3 (de)
HU (1) HUT62928A (de)
PL (1) PL290626A1 (de)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5831011A (en) * 1990-07-27 1998-11-03 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis genes encoding nematode-active toxins
CA2059898C (en) * 1991-02-21 2004-10-19 Gregory A. Bradfisch Biologically active bacillus thuringiensis isolates and gene encoding a coleopteran-active toxin
CA2108248A1 (en) * 1991-04-30 1992-10-31 Jewel M Payne Novel bacillus thuringiensis isolates for controlling acarides
BR9206032A (pt) 1991-05-22 1994-12-27 Mycogen Corp Novos isolados de bacillus thuringiensis ativos contra pragas de himenópteros e genes codificando as toxinas ativas para himenópteros
US5596071A (en) * 1991-05-22 1997-01-21 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins active against hymenopteran pests
US5616495A (en) * 1991-05-22 1997-04-01 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding hymenopteran-active toxins
TW261517B (de) * 1991-11-29 1995-11-01 Mitsubishi Shozi Kk
CA2132456A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Bert M. Zuckerman Nematocidal bacillus thuringiensis biopesticide
US5262159A (en) * 1992-08-24 1993-11-16 Mycogen Corporation Use of Bacillus thuringiensis isolates for controlling pests in the family aphididae
US6268181B1 (en) 1992-11-05 2001-07-31 Valent Biosciences, Corporation Methods for producing a potentiator of Bacillus pesticidal activity
US6406691B1 (en) 1992-11-05 2002-06-18 Valent Biosciences Corp. Potentiator of Bacillus pesticidal activity
US6277624B1 (en) 1992-11-05 2001-08-21 Valent Biosciences, Inc. Mutants which produce a potentiator of Bacillus pesticidal activity
WO1994016079A2 (en) * 1992-12-31 1994-07-21 Mycogen Corporation Novel bacillus thuringiensis toxins active against corn rootworm larvae
US5356623A (en) * 1993-03-17 1994-10-18 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryET1 toxin gene and protein toxic to lepidopteran insects
WO1994023036A1 (en) * 1993-03-26 1994-10-13 Mycogen Corporation Materials and methods for the control of wireworms
US5322687A (en) * 1993-07-29 1994-06-21 Ecogen Inc. Bacillus thuringiensis cryet4 and cryet5 toxin genes and proteins toxic to lepidopteran insects
US5670365A (en) * 1995-10-06 1997-09-23 Mycogen Corporation Identification of, and uses for, nematicidal bacillus thuringiensis genes, toxins, and isolates
US6372480B1 (en) 1996-04-19 2002-04-16 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6677148B1 (en) 1996-04-19 2004-01-13 Mycogen Corporation Pesticidal proteins
US6083499A (en) * 1996-04-19 2000-07-04 Mycogen Corporation Pesticidal toxins
AR012067A1 (es) * 1997-03-13 2000-09-27 Mycogen Corp Metodo para controlar una plaga vegetal con una toxina de bacillus thuringiensis, cultivo biologicamente puro, secuencia de polinucleotido quecodifica una toxina pesticida y toxina pesticida de un b.t. aislado
US5874288A (en) 1997-07-31 1999-02-23 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins with improved activity
US5973231A (en) 1998-05-12 1999-10-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates, toxins, and genes for controlling certain coleopteran pests
WO2007058027A1 (ja) 2005-11-18 2007-05-24 Idemitsu Kosan Co., Ltd. バチルス・チューリンゲンシスを含む有害菌の防除剤
WO2007062064A2 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Regents Of The University Of California, San Diego Methods and compositions for controlling parasitic infections with bt crystal proteins
US8809268B2 (en) 2008-10-29 2014-08-19 The Regents Of The University Of California Combination therapy to combat helminth resistance
MX2011008955A (es) 2009-02-27 2011-09-30 Athenix Corp Proteinas pesticidas y metodos de uso de las mismas.
ES2378040B1 (es) * 2010-03-31 2013-02-18 Probelte, S.A Un preparado biológico bionematicida y estimulador del crecimiento vegetal y cultivos puros de las cepas denominadas n11, sr11 y alo1, contenidas en el mismo.
US11692016B2 (en) 2012-03-09 2023-07-04 Vestaron Corporation High gene expression yeast strain
WO2013134734A2 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
CL2013000307A1 (es) * 2013-01-30 2014-04-04 Bio Insumos Nativa Ltda Composicion bionematicida que comprende al menos dos cepas de bacillus o los productos de fermentacion de las mismas, y un vehiculo agronomicamente aceptable; formulacion que comprende la composicion; cepa de bacilo nematicida
CN105112340B (zh) * 2015-09-15 2018-08-28 沈阳农业大学 一种具有诱导抗性活性的细菌菌株及其培养方法和应用
US11447531B2 (en) 2016-10-21 2022-09-20 Vestaron Corporation Cleavable peptides and insecticidal and nematicidal proteins comprising same
WO2018119336A1 (en) * 2016-12-22 2018-06-28 Athenix Corp. Use of cry14 for the control of nematode pests

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1982003872A1 (en) * 1981-04-27 1982-11-11 Washington Univ B.thuringiensis crystal protein in e.coli
EP0195285A3 (de) * 1985-02-28 1987-12-16 The University Of Georgia Research Foundation, Inc. Molekulare Klonierung des Delta-Endotoxingens von Bacillus thuringiensis var. israelensis
US4948734A (en) * 1987-08-12 1990-08-14 Mycogen Corporation Novel isolates of bacillus thuringiensis having activity against nematodes
US5290914A (en) * 1988-04-28 1994-03-01 Mycogen Corporation Hybrid diphtheria-B.t. pesticidal toxins
EP0352052A3 (de) * 1988-07-18 1991-07-31 Mycogen Corporation Verwendung eines Genproduktes von Bacillus thuringiensis var. israelensis
CA2132456A1 (en) * 1992-04-03 1993-10-14 Bert M. Zuckerman Nematocidal bacillus thuringiensis biopesticide

Also Published As

Publication number Publication date
EP1143004A3 (de) 2003-01-15
EP0462721A2 (de) 1991-12-27
AU7826491A (en) 1991-12-12
ATE204605T1 (de) 2001-09-15
CA2042868A1 (en) 1991-12-12
EP0462721B1 (de) 2001-08-22
JP4446076B2 (ja) 2010-04-07
HUT62928A (en) 1993-06-28
DE69132697D1 (de) 2001-09-27
JP2007006895A (ja) 2007-01-18
ES2161685T3 (es) 2001-12-16
DK0462721T3 (da) 2001-12-10
JP2002034582A (ja) 2002-02-05
HU911934D0 (en) 1991-12-30
AU656726B2 (en) 1995-02-16
JPH04229170A (ja) 1992-08-18
EP1143004A2 (de) 2001-10-10
EP0462721A3 (en) 1992-03-04
PL290626A1 (en) 1992-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69132697T2 (de) Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen
DE3874052T2 (de) Gegen nematodes aktive bacillus thuringiensis-staemme.
US5093120A (en) Novel isolates of Bacillus thuringiensis having activity against nematodes
DE3031756C2 (de)
DE69837906T2 (de) Insektizides proteintoxin von xenorhabus
US5151363A (en) Isolates of Bacillus thuringiensis that are active against nematodes
DE68920301T2 (de) Makrolide Verbindungen.
DE69227198T2 (de) Neue gegen phtiraptera aktive bcillus thuringiensis isolate
DE3879975T2 (de) Demethylavermectine und herstellung dazu.
US5270448A (en) Isolates of Bacillus thuringiensis that are active against nematodes
DE69634258T2 (de) Identifizierung und verwendungen von nematizide bacillus thuringiensis gene, toxine und isolate
US5262399A (en) Compositions and methods for the control of flukes
DE60022224T2 (de) Bacillus thuringiensis toxin aktiv gegen formicidae (ameise)
JPH0829075B2 (ja) 或る種の鱗翅類害虫に対して改良された活性を有するバチルス・スリンギエンシスの株の製法及びそれにより製造さた新規株
DE3883408T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Avermectinen und die verwendeten Kulturen.
EP0149162A2 (de) Neue, gegen Coleoptera wirksame Varietät des Bacillus thuringiensis sowie ein insektizid wirkendes, hieraus erhältliches Präparat bzw. Toxin sowie deren Verwendung zur Bekämpfung von Coleoptera
US5322932A (en) Nematode-active toxin from a Bacillus thuringiensis isolate
EP0342633A2 (de) Bacillus thuringiensis Transformation
DE3878535T2 (de) Antiparasit-derivate.
DE69219615T2 (de) Gegen schaben aktiver bacillus thuringiensis isolate und gene, die für schabenaktive toxine kodieren
DE69220791T2 (de) Neue bacillus-thuringiensis isolate zur bekämpfung von akariden
DE69231682T2 (de) Gegen schädlinge der gattung hautflügler aktiver bacillus thuringiensisisolate und für gegen hautflügler aktive toxine kodierende gene
DE69230982T2 (de) Biologisch aktive Bacillus thuringiensis Isolate und Gene die für koleopterenaktive Toxine kodieren
DE3881147T2 (de) Verfahren zur herstellung von aglykonen von avermectin und sie enthaltende kulturen.
DE3686011T2 (de) Anthelmintisches avermectin-derivat, welches durch ein fermentatives verfahren hergestellt werden kann.

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee