Hintergrund der Erfindung
-
Die regelmäßige Anwendung von Chemikalien zur Bekämpfung
unerwünschter Organismen kann wirkstoffresistente Stämme selektionieren. Dies trat bei
vielen Spezies wirtschaftlich bedeutsamer Insekten ein und trat auch bei Nematoden
von Schafen, Ziegen und Pferden ein. Die Entwicklung von Wirkstoffresistenz
erfordert eine andauernde Suche nach neuen Bekämpfungsmitteln mit neuen
Wirkungsweisen.
-
In jüngerer Zeit konzentrierte sich die akzeptierte Methodik zur Bekämpfung
von Nematoden auf den Wirkstoff Benzimidazol und dessen Verwandte. Die
Anwendung dieser Wirkstoffe im großen Maßstab führte zu vielfachem Auftreten von
Resistenz bei Nematodenpopulationen (Prichard, R. K. et al. [1980] "The problem of
anthelmintic resistance in nematodes", Austr. Vet. J. 56 : 239-251; Coles, G. C. [1986]
"Anthelmintic resistance in sheep", in Veterinarv Clinics of North America: Food
Animal Practice, Bd. 2 : 423-432 [Herd, R. P., Hrsg.] W. B. Saunders, New York). Es
gibt mehr als 100.000 beschriebene Spezies von Nematoden.
-
Das Bakterium Bacillus thuringiensis (B.t.) produziert ein
δ-Endotoxin-Polypeptid, von dem gezeigt wurde, daß es Aktivität gegenüber einer rapid wachsenden
Zahl von Insektenspezies besitzt. Zu den früheren Beobachtungen von Toxizität
gegenüber lediglich Lepidoptera-Insekten kamen Beschreibungen von B.t.-Isoiaten
mit Toxizität gegenüber Diptera- und Coleoptera-Insekten hinzu. Diese Toxine
werden als kristalline Einschlüsse innerhalb des Organismus abgeschieden. Viele
B.t.-Stämme produzieren kristalline Einschlüsse ohne nachgewiesene Toxizität
gegenüber irgendeinem getesteten Insekt.
-
Es wurde eine kleine Anzahl Forschungsartikel über die Wirkungen von δ-
Endotoxinen von B. thuringiensis-Spezies auf die Lebensfähigkeit von Nematoden-
Eier publiziert. Bottjer, Bone und Gill (Experimental Parasitology 60 : 239-244, 1985)
berichteten, daß B.t. kurstaki und B.t. israelensis in vitro für Eier des Nematoden
Trichostrongylus colubriformis toxisch waren. Darüber hinaus wurden 28 andere B.t.-
Stämme mit stark variierenden Toxizitäten getestet. Der wirksamste besaß LD&sub5;&sub0;-
Werte im Nanogrammbereich. Ignoffo und Dropkin (Ignoffo, C. M. und Dropkin, V. H.
[1977], J. Kans. Entomol. Soc. 50 : 394-398) berichteten, daß das thermostabile Toxin
von Bacillus thuringiensis (β-Exotoxin) Aktivität gegenüber einem freilebenden
Nematoden, Panagrellus redivivus (Goodey), einem pflanzenparasitischen
Nematoden, Meloidogyne incognita (Chitwood), und einem sich von Pilzen ernährenden
Nematoden, ADhelenchus avena (Bastien), besaß. β-Exotoxin ist ein allgemeines
cytotoxisches Agens mit geringer oder keiner Spezifität. H. Ciordia und W. E. Bizzell
(Jour. of Parasitology 47 : 41 [Abstract] 1961) gaben auch einen vorläufigen Bericht
über die Wirkungen von B. thuringiensis auf einige Rinder-Nematoden.
-
Saugwürmer gehören zur Subklasse Digenea, Klasse Trematoda im Stamm
Platyhelminthen. Diese Digenea-Vertreter haben alle einen Zwischenwirt und werden
ausschließlich in Vertebraten, einschließlich des Menschen, gefunden. Familien,
welche Vertreter von beträchtlicher veterinärmedizinischer Bedeutung aufweisen,
sind die Fasciolidae, Dicrocoeliidae, Paramphistomatidae und Schistosomatidae. Die
ausgewachsenen Trematoden-Saugwürmer treten hauptsächlich in den
Gallengängen, im Verdauungstrakt und Gefäßsystem auf. Die Eier verlassen den
letzten Wirt in Abhängigkeit von der bevorzugten Stelle, gewöhnlich im Kot oder Urin,
und die Larvenstadien entwickeln sich in einem Mollusken-Zwüschenwirt.
-
In Abhängigkeit von der Anzahl und dem Entwicklungsstadium der Parasiten
und der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Bakterien (Clostridium novvi)
können mehrere klinische Syndrome mit einer Leberegel (Fasciola sp.)-Infektion
assoziiert sein. Die akute Trematödenerkrankung tritt- während der Invasion der
Leber durch kürzlich aufgenommene Metacercarien auf. Schafen können infolge
einer fokalen Lebernekrose und umfangreicher subkutaner Hämorrhagie sehr schnell
sterben.
-
Die antheimintische Medikation in den Vereinigten Staaten besteht
gegenwärtig hauptsächlich aus Albendazol, welches nur in wenigen Staaten
erhältlich ist, in denen Fasciola hepatica ein ernsthaftes Problem darstellt. Eine
spezielle Ausnahmegenehmigung ist erforderlich, um Schafe mit Albendazol
anderswo in den Vereinigten Staaten zu behandeln. Andere effektive Trematozide
- Diamphenethid, Nitroxynil, Oxyclozanid, Rafoxanid und Triclabendazol - sind in den
Vereinigten Staaten nicht erhältlich.
-
Es besteht Bedarf dafür, wirksamere Mittel zur Bekämpfung der vielen
Nematoden und Trematoden zu haben, welche eine beträchtliche Schädigung von
anfälligen Wirten verursachen. Vorteilhafterweise würden solche Mittel von
biologischen Agentien Gebrauch machen.
Zusammenfassung der Erfindung
-
Die vorliegende Erfindung betrifft den neuen Bacillus thuringiensis-Stamm
PS80JJ1, der ein biologisch aktives Toxin produziert. Es wurcle gezeigt, daß dieses
Toxin Aktivität gegenüber Nematoden besitzt. Ein speziell erläutertes Beispiel ist die
Aktivität gegenüber Panagrellus redivivus (auch als Bierdeckel-Nematode bekannt),
ein häufiger freilebender Nematode, der relativ leicht im Labor zu halten ist. Er wird
oft als Indikator (Modell) von Nematoden-Aktivität verwendet. Die Toxine der
vorliegenden Erfindung können auch zur Bekämpfung von Trematoden,
einschließlich des Leberegels Fasciola hepatica, eingesetzt werden.
-
Das B.t.-Isolat gemäß der vorliegenden Erfindung kann gezüchtet werden und
das produzierte δ-Endotoxin nach Standardverfahren und wie hier näher
beschrieben gewonnen werden. Das gewonnene Toxin oder das B.t.-Isolat selbst
können nach Standardverfahren formuliert werden, die mit dem Anwendung von
nematoziden oder trematoziden Produkten verbunden sind.
-
Ein Gen, welches für das Toxin kodiert, kann ebenfalls von B.t. PS80JJ1
erhalten werden.
-
Eine Subkultur des neuen Bacillus thuringiensis-Isolats wurde am 17.7.90 in
der permanenten Sammlung des Northern Research Laboratory, U.S. Department of
Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL
B-18679.
Beschreibung der Erfindung
-
Das neue Toxin zeigt Aktivität gegenüber den getesteten Nematoden. Die
Gruppe von Erkrankungen, die allgemein als Helminthiasis bezeichnet wird, beruht
auf einer Infektion eines tierischen Wirts durch parasitische Würmer, die als
Helminthen bekannt sind. Helminthiasis ist ein weit verbreitetes und ernsthaftes
wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren wie Schweinen, Schafen,
Pferden, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Von den Helminthen
verursacht die Gruppe von Würmern, die als Nematoden bezeichnet wird,
umfangreiche und oft schwerwiegende Infektionen bei verschiedenen Tierspezies.
Die häufigsten Gattungen von Nematoden, welche die oben genannten Tiere
infrzieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia,
Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus,
Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris,
Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, Caenorhabditis und Parascaris. Bestimmte
Vertreter davon, wie z. B. Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen
primär den Darmtrakt an, während andere, wie z. B. Dicytocaulus, in den Lungen
gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und
Organen des Körpers lokalisiert sein.
-
Das Toxin der vorliegenden Erfindung eignet sich als Nematozid zur
Bekämpfung von Boden-Nematoden und Pflanzenparasiten, die aus den Gattungen
Bursaphalenchus, Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus,
Heterodera, Melodiogyne, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus oder Tylenchus
ausgewählt sind.
-
Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können
auch eingesetzt werden, um Leberegel zu bekämpfen, welche Vertebraten
parasitieren können. Konkret kann die Erfindung eingesetzt werden, um Trematoden
bei Menschen, Vieh, Haustieren und anderen Tieren zu gekämpfen. Der Begriff
"Vieh", wie hier verwendet, kann beispielsweise Schafe, Rinder, Schweine und
Ziegen einschließen. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden
Erfindung können eingesetzt werden, um heranwachsende und ausgewachsene
Trematoden zu bekämpfen. Die Bekämpfungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht
beschränkt auf, Weidebehandlung (für Vertebraten- und Zwischenwirte), Liposomen
oder andere Träger zur Abgabe der Toxine an die Leber oder Gallengänge, und
Behandlung von freilebenden Formen der Trematoden in den gastrointestinalen
Trakten von Vertebraten-Wirten. Das hier beschriebene trematozide B.t.-Toxin kann
allein oder abwechselnd oder in Kombination mit anderen Trematoziden, wie z. B.
Albendazol, eingesetzt werden.
-
Das B.t.-Isolat der Erfindung, wie hier beschrieben, weist Aktivität gegenüber
Leberegeln auf. Es steht zu erwarten, daß diese Isolate gegen andere Trematoden,
wie sie hier offenbart sind, aktiv sein werden.
-
Das B.t.-Toxin der Erfindung kann bei Verwendung als Anthelmintikum bei
Säugern und im Boden zur Bekämpfung von Pflanzen-Nematoden in einer
Dosierungseinheitsform, wie z. B. einer Kapsel, einem Bolus oder einer Tablette, oral
verabreicht werden oder als Beizflüssigkeit. Die Beize ist normalerweise eine
Lösung, Suspension oder Dispersion des aktiven Bestandteils, gewöhnlich in
Wasser, zusammen mit einem Suspendiermittel wie Bentonit und einem
Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Exzipienten. Im allgemeinen enthalten die
Beizen auch ein Antischaummittel. Beizformulierungen enthalten gewöhnlich etwa
0,001 bis 0,5 Gew.-% der aktiven Verbindung. Bevorzugte Beizformulierungen
können 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthalten, die Kapseln und Boli umfassen den aktiven
Bestandteil in Mischung mit einem Trägervehikel, wie z. B. Stärke, Talkum,
Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat.
-
Ist es erwünscht, das Toxin in einer trockenen festen Dosierungseinheitsform
zu verabreichen, werden gewöhnlich Kapseln, Boli oder Tabletten, welche die
gewünschte Menge an aktiver Verbindung enthalten, eingesetzt. Diese
Dosierungsformen werden hergestellt durch innige und gleichmäßige Mischung des
aktiven Bestandteils mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllmitteln,
Desintegrationsmitteln und/oder Bindemitteln, wie z. B. Stärke, Lactose, Talkum,
Magnesiumstearat, Pflanzengummis und dgl. Solche
Dosierungseinheitsformulierungen können bezüglich ihres Gesamtgewichts und Gehalts an aktivem Agens in
Abhängigkeit von den Faktoren wie der Art des zu behandelnden Wirtslebewesens,
der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirts in großem Umfang
variiert werden.
-
Falls die aktive Verbindung über ein Tierfutter verabreicht werden soll, ist sie
innig in dem Futter dispergiert oder wird als Dressing oder in Form von Pellets
eingesetzt, welche dann dem fertigen Futter zugesetzt oder gegebenenfalls separat
gefüttert werden können. Alternativ können die Toxin-Verbindungen Tieren
parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intraruminale, intramuskuläre,
intratracheale oder subkutane Injektion, in welchem Fall der aktive Bestandteil in
einem flüssigen Trägervehikel gelöst oder dispergiert ist. Zur parenteralen
Verabreichung ist das aktive Material geeigneterweise mit einem annehmbaren Vehikel,
vorzugsweise vom Pflanzenöl-Typ, wie z. B. Erdnußöl, Baumwollsamenöl und dgl.,
gemischt. Andere parenterale Vehikel, wie z. B. organische Präparationen unter
Verwendung von Solketal, Glycerin, Formal und wäßrige parenterale
Formulierungen, werden ebenfalls verwendet. Die aktive(n) Verbindung oder Verbindungen
wird/werden zur Verabreichung in der parenteralen Formulierung gelöst oder
suspendiert; solche Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,005 bis 5 Gew.-%
der aktiven Verbindung.
-
Wird das Toxin als Komponente des Futters der Tiere verabreicht oder in dem
Trinkwasser gelöst oder suspendiert, werden Zusammensetzungen bereitgestellt, in
denen die aktive Verbindung innig in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel
dispergiert ist. Mit einem inertem Träger ist ein Träger gemeint, der nicht mit dem
aktiven Agens reagieren wird und der Tieren sicher verabreicht werden kann.
Vorzugsweise ist ein Träger für die Verabreichung im Futter einer, der ein
Bestandteil der Ration des Tieres ist oder sein kann.
-
Geeignete Zusammensetzungen umfassen Futtervormischungen oder
-ergänzungen, worin der aktive Bestandteil in relativ großen Mengen vorhanden ist
und welche sich für die direkte Fütterung des Tiers oder für den Zusatz zum Futter,
entweder direkt oder nach einem Verdünnungs- oder Mischzwischenschritt, eignen.
Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die sich für solche Zusammensetzungen
eignen, schließen beispielsweise Trockenschlempe; Maismehl, Citrusmehl,
Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, feine Weizenkleie, lösliche
Melassebestandteile, Maiskolbenmehl, eßbares Bohnenmahlgut, Sojaschrot,
zerstoßenen Kalkstein und dgl. ein.
-
Neben der Entfaltung von nematozider und trematozider Aktivität im
Verdauungstrakt von Säugern werden Sporen des B.t.-Isolats den Verdauungstrakt
der Tiere passieren, im Kot keimen und sich vermehren und dadurch für eine
zusätzliche Bekämpfung von Larven sorgen, welche dort auschlüpfen und sich
vermehren.
-
Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als
benetzbare Pulver, Granula oder Stäube, durch Mischen mit verschiedenen inerten
Materialien, z. B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten,
Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (pulverisierten Maiskolben,
Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können
Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder
oberflächenaktive Mittei beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger
oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare
Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische
Agentien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere
beinhalten.
-
Die Toxinkonzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der
Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist
oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Toxin wird in mindestens 1 Gew.-%
vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen
werden etwa 1-95 Gew.-% des Toxins enthalten, während die flüssigen
Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase
enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4;
Zellen/mg enthalten. Die Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder
trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
-
Die Formulierungen können in der Umwelt der Nematoden oder Trematoden,
z. B. Pflanzen, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder
dgl. ausgebracht werden.
-
Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten
Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als
beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und
alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn
nicht anders angegeben.
BEISPIEL 1 - Kultivierung von B.t.-Isolaten
-
Eine Subkultur des B.t.-Isolats kann zur Animpfung des folgenden Mediums, eines
Mediums mit Pepton, Glucose und Salzen, verwendet werden.
-
Bacto-Pepton 7,5 g/l
-
Glucose 1,0 g/l
-
KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
-
K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
-
Salzlösung 5,0 mI/l
-
CaCl&sub2; Lösung 5,0 ml/l
-
Salzlösung (100 ml)
-
MgSO&sub4;.7H&sub2;O 2,46 g
-
MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,04 g
-
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0,28 g
-
FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,40 g
-
CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
-
CaCl&sub2;.2H&sub2;O 3,66 g
-
pH 7,2
-
Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden filtersterilisiert und zur
autoklavierten und gekochten Bouillon zum Animpfungszeitpunkt zugegeben. Die Kolben
werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM 64 h lang inkubiert.
-
Das obige Verfahren kann ohne weiteres nach im Stand der Technik
wohlbekannten Verfahren auf große Fermenter maßstäblich übertragen werden.
-
Die bei der obigen Fermentation erhaltenen B.t.-Sporen und -Kristalle können
nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig
verwendetes Verfahren besteht darin, die geemtete Fermentationsbouillon
Trennungstechniken, z. B. Zentrifugation, zu unterwerfen.
BEISPIEL 2 - Reinigung und Aminosäureseauenzierung
-
Das neue Isolat kann wie in Beispiel 1 beschrieben oder unter Einsatz anderer, im
Stand der Technik wohlbekannter Standardmedien und -fermentationstechniken
kultiviert werden. Die Toxinproteineinschlüsse können mittels standardmäßiger
Sedimentationszentrifugation geerntet werden. Die gewonnenen Proteineinschlüsse
können mittels isopyknischer Natriumbromidgradienten (28-38%)-Zentrifugation
partiell gereinigt werden (Pfannenstiel, M. A., E. J. Ross, V. C. Kramer und K. W.
Nickerson [1984], FEMS Microbiol. Lett. 21 : 39). Danach können die individuellen
Toxinproteine durch Solubilisierung des kristallinen Proteinkomplexes in einem
alkalischen Puffer und Fraktionierung der individuellen Proteine mittels DEAE-
Sepharose CL-6B (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)-Chromatographie durch
schrittweise Zugaben zunehmender Konzentrationen eines NaCl-enthaltenden
Puffers (Reichenberg, D., in Ion Exchangers in Oraanic and Biochemistry [C. Calmon
and T. R. E. Kressman, Hrsg.], Interscience, New York, 1957) aufgetrennt werden.
Fraktionen, welche ein für den Nematoden Caenorhabditis elegans (CE) toxisches
Protein enthalten, können mittels Western Blot-Techniken (Towbin, H., T. Staehelin,
und K. Gordon [1979], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350) an eine PVDF-Membran
(Millipore, Bedford, MA) gebunden werden und die N-termirralen Aminosäuren mit
der Standard-Edman-Reaktion mit einem automatischen Gasphasen-Sequenator
bestimmt werden (Hunkapiller, M. W., R. M. Hewick, W. L. Dreyer und L. E. Hood
[1983], Meth. Enzymol. 91 : 399).
BEISPIEL 3 - Aktivität gegenüber Panagrellus redivivus
-
Würmer werden in einem Röhrchen gesammelt und etwa 15 Minuten lang absitzen
gelassen und das Wasser wird dekantiert und drei- oder viermal durch frisches
Wasser ersetzt, bis das Wasser klar bleibt. 250 ul gespülte Nematoden (20 bis 30
Würmer) und 100 ul einer Sporen/Kristallsuspension von B.t. PS80JJ1 werden zu
650 ul Wasser in jeder Vertiefung eines Tabletts zugegeben. Die Nematoden werden
gezählt und die Zahlen registriert. Nach 4 Tagen werden die lebenden Würmer
gezählt. Es wurde eine 99%ige Sterblichkeit berechnet.
-
Die ungefähren Molekülmassen der Alkali-löslichen Proteine in PS80JJ1
waren 37, 47, 90 und 130 kDa.