DE69132697T2 - Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-Stämmen - Google Patents
Gegen Nematodes aktive Bacillus thuringiensis-Mikroben, und Gene kodierend für Nematode-aktive Toxine kloniert von Bacillus thuringiensis-StämmenInfo
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Description
- Die regelmäßige Anwendung von Chemikalien zur Bekämpfung unerwünschter Organismen kann wirkstoffresistente Stämme selektionieren. Dies trat bei vielen Spezies wirtschaftlich bedeutsamer Insekten ein und trat auch bei Nematoden von Schafen, Ziegen und Pferden ein. Die Entwicklung von Wirkstoffresistenz erfordert eine andauernde Suche nach neuen Bekämpfungsmitteln mit neuen Wirkungsweisen.
- In jüngerer Zeit konzentrierte sich die akzeptierte Methodik zur Bekämpfung von Nematoden auf den Wirkstoff Benzimidazol und dessen Verwandte. Die Anwendung dieser Wirkstoffe im großen Maßstab führte zu vielfachem Auftreten von Resistenz bei Nematodenpopulationen (Prichard, R. K. et al. [1980] "The problem of anthelmintic resistance in nematodes", Austr. Vet. J. 56 : 239-251; Coles, G. C. [1986] "Anthelmintic resistance in sheep", in Veterinarv Clinics of North America: Food Animal Practice, Bd. 2 : 423-432 [Herd, R. P., Hrsg.] W. B. Saunders, New York). Es gibt mehr als 100.000 beschriebene Spezies von Nematoden.
- Das Bakterium Bacillus thuringiensis (B.t.) produziert ein δ-Endotoxin-Polypeptid, von dem gezeigt wurde, daß es Aktivität gegenüber einer rapid wachsenden Zahl von Insektenspezies besitzt. Zu den früheren Beobachtungen von Toxizität gegenüber lediglich Lepidoptera-Insekten kamen Beschreibungen von B.t.-Isoiaten mit Toxizität gegenüber Diptera- und Coleoptera-Insekten hinzu. Diese Toxine werden als kristalline Einschlüsse innerhalb des Organismus abgeschieden. Viele B.t.-Stämme produzieren kristalline Einschlüsse ohne nachgewiesene Toxizität gegenüber irgendeinem getesteten Insekt.
- Es wurde eine kleine Anzahl Forschungsartikel über die Wirkungen von δ- Endotoxinen von B. thuringiensis-Spezies auf die Lebensfähigkeit von Nematoden- Eier publiziert. Bottjer, Bone und Gill (Experimental Parasitology 60 : 239-244, 1985) berichteten, daß B.t. kurstaki und B.t. israelensis in vitro für Eier des Nematoden Trichostrongylus colubriformis toxisch waren. Darüber hinaus wurden 28 andere B.t.- Stämme mit stark variierenden Toxizitäten getestet. Der wirksamste besaß LD&sub5;&sub0;- Werte im Nanogrammbereich. Ignoffo und Dropkin (Ignoffo, C. M. und Dropkin, V. H. [1977], J. Kans. Entomol. Soc. 50 : 394-398) berichteten, daß das thermostabile Toxin von Bacillus thuringiensis (β-Exotoxin) Aktivität gegenüber einem freilebenden Nematoden, Panagrellus redivivus (Goodey), einem pflanzenparasitischen Nematoden, Meloidogyne incognita (Chitwood), und einem sich von Pilzen ernährenden Nematoden, ADhelenchus avena (Bastien), besaß. β-Exotoxin ist ein allgemeines cytotoxisches Agens mit geringer oder keiner Spezifität. H. Ciordia und W. E. Bizzell (Jour. of Parasitology 47 : 41 [Abstract] 1961) gaben auch einen vorläufigen Bericht über die Wirkungen von B. thuringiensis auf einige Rinder-Nematoden.
- Saugwürmer gehören zur Subklasse Digenea, Klasse Trematoda im Stamm Platyhelminthen. Diese Digenea-Vertreter haben alle einen Zwischenwirt und werden ausschließlich in Vertebraten, einschließlich des Menschen, gefunden. Familien, welche Vertreter von beträchtlicher veterinärmedizinischer Bedeutung aufweisen, sind die Fasciolidae, Dicrocoeliidae, Paramphistomatidae und Schistosomatidae. Die ausgewachsenen Trematoden-Saugwürmer treten hauptsächlich in den Gallengängen, im Verdauungstrakt und Gefäßsystem auf. Die Eier verlassen den letzten Wirt in Abhängigkeit von der bevorzugten Stelle, gewöhnlich im Kot oder Urin, und die Larvenstadien entwickeln sich in einem Mollusken-Zwüschenwirt.
- In Abhängigkeit von der Anzahl und dem Entwicklungsstadium der Parasiten und der Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter Bakterien (Clostridium novvi) können mehrere klinische Syndrome mit einer Leberegel (Fasciola sp.)-Infektion assoziiert sein. Die akute Trematödenerkrankung tritt- während der Invasion der Leber durch kürzlich aufgenommene Metacercarien auf. Schafen können infolge einer fokalen Lebernekrose und umfangreicher subkutaner Hämorrhagie sehr schnell sterben.
- Die antheimintische Medikation in den Vereinigten Staaten besteht gegenwärtig hauptsächlich aus Albendazol, welches nur in wenigen Staaten erhältlich ist, in denen Fasciola hepatica ein ernsthaftes Problem darstellt. Eine spezielle Ausnahmegenehmigung ist erforderlich, um Schafe mit Albendazol anderswo in den Vereinigten Staaten zu behandeln. Andere effektive Trematozide - Diamphenethid, Nitroxynil, Oxyclozanid, Rafoxanid und Triclabendazol - sind in den Vereinigten Staaten nicht erhältlich.
- Es besteht Bedarf dafür, wirksamere Mittel zur Bekämpfung der vielen Nematoden und Trematoden zu haben, welche eine beträchtliche Schädigung von anfälligen Wirten verursachen. Vorteilhafterweise würden solche Mittel von biologischen Agentien Gebrauch machen.
- Die vorliegende Erfindung betrifft den neuen Bacillus thuringiensis-Stamm PS80JJ1, der ein biologisch aktives Toxin produziert. Es wurcle gezeigt, daß dieses Toxin Aktivität gegenüber Nematoden besitzt. Ein speziell erläutertes Beispiel ist die Aktivität gegenüber Panagrellus redivivus (auch als Bierdeckel-Nematode bekannt), ein häufiger freilebender Nematode, der relativ leicht im Labor zu halten ist. Er wird oft als Indikator (Modell) von Nematoden-Aktivität verwendet. Die Toxine der vorliegenden Erfindung können auch zur Bekämpfung von Trematoden, einschließlich des Leberegels Fasciola hepatica, eingesetzt werden.
- Das B.t.-Isolat gemäß der vorliegenden Erfindung kann gezüchtet werden und das produzierte δ-Endotoxin nach Standardverfahren und wie hier näher beschrieben gewonnen werden. Das gewonnene Toxin oder das B.t.-Isolat selbst können nach Standardverfahren formuliert werden, die mit dem Anwendung von nematoziden oder trematoziden Produkten verbunden sind.
- Ein Gen, welches für das Toxin kodiert, kann ebenfalls von B.t. PS80JJ1 erhalten werden.
- Eine Subkultur des neuen Bacillus thuringiensis-Isolats wurde am 17.7.90 in der permanenten Sammlung des Northern Research Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, USA, hinterlegt. Die Hinterlegungsnummer ist NRRL B-18679.
- Das neue Toxin zeigt Aktivität gegenüber den getesteten Nematoden. Die Gruppe von Erkrankungen, die allgemein als Helminthiasis bezeichnet wird, beruht auf einer Infektion eines tierischen Wirts durch parasitische Würmer, die als Helminthen bekannt sind. Helminthiasis ist ein weit verbreitetes und ernsthaftes wirtschaftliches Problem bei domestizierten Tieren wie Schweinen, Schafen, Pferden, Rindern, Ziegen, Hunden, Katzen und Geflügel. Von den Helminthen verursacht die Gruppe von Würmern, die als Nematoden bezeichnet wird, umfangreiche und oft schwerwiegende Infektionen bei verschiedenen Tierspezies. Die häufigsten Gattungen von Nematoden, welche die oben genannten Tiere infrzieren, sind Haemonchus, Trichostrongylus, Ostertagia, Nematodirus, Cooperia, Ascaris, Bunostomum, Oesophagostomum, Chabertia, Trichuris, Strongylus, Trichonema, Dictyocaulus, Capillaria, Heterakis, Toxocara, Ascaridia, Oxyuris, Ancylostoma, Uncinaria, Toxascaris, Caenorhabditis und Parascaris. Bestimmte Vertreter davon, wie z. B. Nematodirus, Cooperia und Oesophagostomum, greifen primär den Darmtrakt an, während andere, wie z. B. Dicytocaulus, in den Lungen gefunden werden. Noch andere Parasiten können in anderen Geweben und Organen des Körpers lokalisiert sein.
- Das Toxin der vorliegenden Erfindung eignet sich als Nematozid zur Bekämpfung von Boden-Nematoden und Pflanzenparasiten, die aus den Gattungen Bursaphalenchus, Criconemella, Ditylenchus, Globodera, Helicotylenchus, Heterodera, Melodiogyne, Pratylenchus, Radolpholus, Rotelynchus oder Tylenchus ausgewählt sind.
- Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können auch eingesetzt werden, um Leberegel zu bekämpfen, welche Vertebraten parasitieren können. Konkret kann die Erfindung eingesetzt werden, um Trematoden bei Menschen, Vieh, Haustieren und anderen Tieren zu gekämpfen. Der Begriff "Vieh", wie hier verwendet, kann beispielsweise Schafe, Rinder, Schweine und Ziegen einschließen. Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eingesetzt werden, um heranwachsende und ausgewachsene Trematoden zu bekämpfen. Die Bekämpfungsverfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Weidebehandlung (für Vertebraten- und Zwischenwirte), Liposomen oder andere Träger zur Abgabe der Toxine an die Leber oder Gallengänge, und Behandlung von freilebenden Formen der Trematoden in den gastrointestinalen Trakten von Vertebraten-Wirten. Das hier beschriebene trematozide B.t.-Toxin kann allein oder abwechselnd oder in Kombination mit anderen Trematoziden, wie z. B. Albendazol, eingesetzt werden.
- Das B.t.-Isolat der Erfindung, wie hier beschrieben, weist Aktivität gegenüber Leberegeln auf. Es steht zu erwarten, daß diese Isolate gegen andere Trematoden, wie sie hier offenbart sind, aktiv sein werden.
- Das B.t.-Toxin der Erfindung kann bei Verwendung als Anthelmintikum bei Säugern und im Boden zur Bekämpfung von Pflanzen-Nematoden in einer Dosierungseinheitsform, wie z. B. einer Kapsel, einem Bolus oder einer Tablette, oral verabreicht werden oder als Beizflüssigkeit. Die Beize ist normalerweise eine Lösung, Suspension oder Dispersion des aktiven Bestandteils, gewöhnlich in Wasser, zusammen mit einem Suspendiermittel wie Bentonit und einem Benetzungsmittel oder einem ähnlichen Exzipienten. Im allgemeinen enthalten die Beizen auch ein Antischaummittel. Beizformulierungen enthalten gewöhnlich etwa 0,001 bis 0,5 Gew.-% der aktiven Verbindung. Bevorzugte Beizformulierungen können 0,01 bis 0,1 Gew.-% enthalten, die Kapseln und Boli umfassen den aktiven Bestandteil in Mischung mit einem Trägervehikel, wie z. B. Stärke, Talkum, Magnesiumstearat oder Dicalciumphosphat.
- Ist es erwünscht, das Toxin in einer trockenen festen Dosierungseinheitsform zu verabreichen, werden gewöhnlich Kapseln, Boli oder Tabletten, welche die gewünschte Menge an aktiver Verbindung enthalten, eingesetzt. Diese Dosierungsformen werden hergestellt durch innige und gleichmäßige Mischung des aktiven Bestandteils mit geeigneten feinteiligen Verdünnungsmitteln, Füllmitteln, Desintegrationsmitteln und/oder Bindemitteln, wie z. B. Stärke, Lactose, Talkum, Magnesiumstearat, Pflanzengummis und dgl. Solche Dosierungseinheitsformulierungen können bezüglich ihres Gesamtgewichts und Gehalts an aktivem Agens in Abhängigkeit von den Faktoren wie der Art des zu behandelnden Wirtslebewesens, der Schwere und Art der Infektion und dem Gewicht des Wirts in großem Umfang variiert werden.
- Falls die aktive Verbindung über ein Tierfutter verabreicht werden soll, ist sie innig in dem Futter dispergiert oder wird als Dressing oder in Form von Pellets eingesetzt, welche dann dem fertigen Futter zugesetzt oder gegebenenfalls separat gefüttert werden können. Alternativ können die Toxin-Verbindungen Tieren parenteral verabreicht werden, beispielsweise durch intraruminale, intramuskuläre, intratracheale oder subkutane Injektion, in welchem Fall der aktive Bestandteil in einem flüssigen Trägervehikel gelöst oder dispergiert ist. Zur parenteralen Verabreichung ist das aktive Material geeigneterweise mit einem annehmbaren Vehikel, vorzugsweise vom Pflanzenöl-Typ, wie z. B. Erdnußöl, Baumwollsamenöl und dgl., gemischt. Andere parenterale Vehikel, wie z. B. organische Präparationen unter Verwendung von Solketal, Glycerin, Formal und wäßrige parenterale Formulierungen, werden ebenfalls verwendet. Die aktive(n) Verbindung oder Verbindungen wird/werden zur Verabreichung in der parenteralen Formulierung gelöst oder suspendiert; solche Formulierungen enthalten im allgemeinen 0,005 bis 5 Gew.-% der aktiven Verbindung.
- Wird das Toxin als Komponente des Futters der Tiere verabreicht oder in dem Trinkwasser gelöst oder suspendiert, werden Zusammensetzungen bereitgestellt, in denen die aktive Verbindung innig in einem inerten Träger oder Verdünnungsmittel dispergiert ist. Mit einem inertem Träger ist ein Träger gemeint, der nicht mit dem aktiven Agens reagieren wird und der Tieren sicher verabreicht werden kann. Vorzugsweise ist ein Träger für die Verabreichung im Futter einer, der ein Bestandteil der Ration des Tieres ist oder sein kann.
- Geeignete Zusammensetzungen umfassen Futtervormischungen oder -ergänzungen, worin der aktive Bestandteil in relativ großen Mengen vorhanden ist und welche sich für die direkte Fütterung des Tiers oder für den Zusatz zum Futter, entweder direkt oder nach einem Verdünnungs- oder Mischzwischenschritt, eignen. Typische Träger oder Verdünnungsmittel, die sich für solche Zusammensetzungen eignen, schließen beispielsweise Trockenschlempe; Maismehl, Citrusmehl, Fermentationsrückstände, gemahlene Austernschalen, feine Weizenkleie, lösliche Melassebestandteile, Maiskolbenmehl, eßbares Bohnenmahlgut, Sojaschrot, zerstoßenen Kalkstein und dgl. ein.
- Neben der Entfaltung von nematozider und trematozider Aktivität im Verdauungstrakt von Säugern werden Sporen des B.t.-Isolats den Verdauungstrakt der Tiere passieren, im Kot keimen und sich vermehren und dadurch für eine zusätzliche Bekämpfung von Larven sorgen, welche dort auschlüpfen und sich vermehren.
- Die B.t.-Zellen können auf vielfältige Weise formuliert werden. Sie können als benetzbare Pulver, Granula oder Stäube, durch Mischen mit verschiedenen inerten Materialien, z. B. anorganischen Mineralien (Phyllosilikaten, Carbonaten, Sulfaten, Phosphaten und dgl.) oder botanischen Materialien (pulverisierten Maiskolben, Reishülsen, Walnußschalen und dgl.) eingesetzt werden. Die Formulierungen können Streu-Haft-Adjuvantien, Stabilisierungsmittel, andere pestizide Additive oder oberflächenaktive Mittei beinhalten. Flüssige Formulierungen können auf wäßriger oder nicht-wäßriger Basis sein und als Schäume, Gele, Suspensionen, emulgierbare Konzentrate oder dgl. verwendet werden. Die Bestandteile können rheologische Agentien, oberflächenaktive Mittel, Emulgatoren, Dispergiermittel oder Polymere beinhalten.
- Die Toxinkonzentration wird in großem Umfang variieren, abhängig von der Natur der besonderen Formulierung, insbesondere davon, ob es ein Konzentrat ist oder zur direkten Anwendung bestimmt ist. Das Toxin wird in mindestens 1 Gew.-% vorhanden sein und kann 100 Gew.-% betragen. Die trockenen Formulierungen werden etwa 1-95 Gew.-% des Toxins enthalten, während die flüssigen Formulierungen im allgemeinen etwa 1-60 Gew.-% der Feststoffe in der flüssigen Phase enthalten werden. Die Formulierungen werden im allgemeinen etwa 10² bis etwa 10&sup4; Zellen/mg enthalten. Die Formulierungen werden mit etwa 50 mg (flüssig oder trocken) bis 1 kg oder mehr pro Hektar ausgebracht werden.
- Die Formulierungen können in der Umwelt der Nematoden oder Trematoden, z. B. Pflanzen, Boden oder Wasser, durch Sprühen, Bestäuben, Besprengen oder dgl. ausgebracht werden.
- Es folgen Beispiele, welche Verfahren, einschließlich der besten Ausführungsform, zur Ausführung der Erfindung erläutern. Diese Beispiele sind nicht als beschränkend anzusehen. Alle Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen und alle Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse sind auf das Volumen bezogen, wenn nicht anders angegeben.
- Eine Subkultur des B.t.-Isolats kann zur Animpfung des folgenden Mediums, eines Mediums mit Pepton, Glucose und Salzen, verwendet werden.
- Bacto-Pepton 7,5 g/l
- Glucose 1,0 g/l
- KH&sub2;PO&sub4; 3,4 g/l
- K&sub2;HPO&sub4; 4,35 g/l
- Salzlösung 5,0 mI/l
- CaCl&sub2; Lösung 5,0 ml/l
- Salzlösung (100 ml)
- MgSO&sub4;.7H&sub2;O 2,46 g
- MnSO&sub4;.H&sub2;O 0,04 g
- ZnSO&sub4;.7H&sub2;O 0,28 g
- FeSO&sub4;.7H&sub2;O 0,40 g
- CaCl&sub2;-Lösung (100 ml)
- CaCl&sub2;.2H&sub2;O 3,66 g
- pH 7,2
- Die Salzlösung und die CaCl&sub2;-Lösung werden filtersterilisiert und zur autoklavierten und gekochten Bouillon zum Animpfungszeitpunkt zugegeben. Die Kolben werden bei 30ºC auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM 64 h lang inkubiert.
- Das obige Verfahren kann ohne weiteres nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren auf große Fermenter maßstäblich übertragen werden.
- Die bei der obigen Fermentation erhaltenen B.t.-Sporen und -Kristalle können nach im Stand der Technik wohlbekannten Verfahren isoliert werden. Ein häufig verwendetes Verfahren besteht darin, die geemtete Fermentationsbouillon Trennungstechniken, z. B. Zentrifugation, zu unterwerfen.
- Das neue Isolat kann wie in Beispiel 1 beschrieben oder unter Einsatz anderer, im Stand der Technik wohlbekannter Standardmedien und -fermentationstechniken kultiviert werden. Die Toxinproteineinschlüsse können mittels standardmäßiger Sedimentationszentrifugation geerntet werden. Die gewonnenen Proteineinschlüsse können mittels isopyknischer Natriumbromidgradienten (28-38%)-Zentrifugation partiell gereinigt werden (Pfannenstiel, M. A., E. J. Ross, V. C. Kramer und K. W. Nickerson [1984], FEMS Microbiol. Lett. 21 : 39). Danach können die individuellen Toxinproteine durch Solubilisierung des kristallinen Proteinkomplexes in einem alkalischen Puffer und Fraktionierung der individuellen Proteine mittels DEAE- Sepharose CL-6B (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)-Chromatographie durch schrittweise Zugaben zunehmender Konzentrationen eines NaCl-enthaltenden Puffers (Reichenberg, D., in Ion Exchangers in Oraanic and Biochemistry [C. Calmon and T. R. E. Kressman, Hrsg.], Interscience, New York, 1957) aufgetrennt werden. Fraktionen, welche ein für den Nematoden Caenorhabditis elegans (CE) toxisches Protein enthalten, können mittels Western Blot-Techniken (Towbin, H., T. Staehelin, und K. Gordon [1979], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 4350) an eine PVDF-Membran (Millipore, Bedford, MA) gebunden werden und die N-termirralen Aminosäuren mit der Standard-Edman-Reaktion mit einem automatischen Gasphasen-Sequenator bestimmt werden (Hunkapiller, M. W., R. M. Hewick, W. L. Dreyer und L. E. Hood [1983], Meth. Enzymol. 91 : 399).
- Würmer werden in einem Röhrchen gesammelt und etwa 15 Minuten lang absitzen gelassen und das Wasser wird dekantiert und drei- oder viermal durch frisches Wasser ersetzt, bis das Wasser klar bleibt. 250 ul gespülte Nematoden (20 bis 30 Würmer) und 100 ul einer Sporen/Kristallsuspension von B.t. PS80JJ1 werden zu 650 ul Wasser in jeder Vertiefung eines Tabletts zugegeben. Die Nematoden werden gezählt und die Zahlen registriert. Nach 4 Tagen werden die lebenden Würmer gezählt. Es wurde eine 99%ige Sterblichkeit berechnet.
- Die ungefähren Molekülmassen der Alkali-löslichen Proteine in PS80JJ1 waren 37, 47, 90 und 130 kDa.
Claims (5)
1. Bacillus thuringiensis-Stamm PS80JJ1, NRRL B-18679.
2. Toxin von etwa 130 kD mit Aktivität gegen Nematoden, welches aus dem
Stamm nach Anspruch 1 erhältlich ist.
3. Verfahren zur Bekämpfung von Nematoden, welches das Kontaktieren der
Nematoden mit einem Toxin nach Anspruch 2 umfaßt.
4. Verfahren zur Bekämpfung von Trematoden, welches umfaßt, daß einem Wirt,
der einen Trematoden beherbergt, oder dem Trematoden direkt oder dem
Aufenthaltsort des Trematoden ein Toxin nach Anspruch 2 verabreicht wird.
5. Nukleotidmolekül, kodierend für das Toxin nach Anspruch 2.
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