-
TECHNISCHES
GEBIET DER ERFINDUNG
-
Gegenstand
dieser Erfindung sind Verfahren und Zusammensetzungen zur Kontrolle
von Populationen von Hymenoptera-Insektenschädlingen in der Formicidae-Familie
(Ameisen-Familie) unter Verwendung eines neuen Toxins von Bacillus
thuringiensis („BT") und die Herstellung.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere wirksame Verfahren zur
Kontrolle von Populationen verschiedener Feuerameisen der Familie
Solenopsis unter Verwendung eines BT-Toxins, das bei der Abtötung von
Feuerameisen wirksam ist und ein neuer BT-Stamm, der ein derartiges
Toxin produziert.
-
HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
-
Ohne
den Rahmen der Erfindung einzuschränken, wird ihr Hintergrund
in Verbindung mit den Verwendungszwecken der Toxine von Bacillus
thuringiensis als Biozide, wie zum Beispiel gegen Feuerameisen beschrieben.
Die importierte Feuerameise, Solenopsis invicta, ist eine eingeführte Spezies,
die um die 1930er Jahre aus Südamerika
in Mobile, Alabama, ankam. Die importierte Feuerameise hat sich
rasch über
die südlichen
Teile der USA ausgebreitet und breitet sich weiterhin in Bereiche
von Nordamerika mit mildem Klima und ausreichender Feuchtigkeit
und Nahrung aus.
-
Die
importierte Feuerameise ist ein landwirtschaftlich und medizinisch
wichtiger Schädling,
der für Haustiere,
die Tierwelt und Menschen schädlich
ist. Feuerameisen bedrohen insbesondere obligate auf dem Erdboden
lebende Spezies und Jungtiere aller Spezies. Es wird angenommen,
dass die importierte Feuerameise für den Rückgang mehrerer nativer Spezies
verantwortlich zu machen ist. Die Proliferation der importierten
Feuerameise blieb aufgrund der Abwesenheit von Prädatoren,
Pathogenen und Parasiten, die ihre Zahlen in ihrer nativen Umgebung
kontrollieren, unkontrolliert. Die Feuerameise verursacht in der
Regel schmerzhafte Stiche bei Menschen und schwerwiegendere Reaktionen
können
bei Allergikern auftreten. Hohe Feuerameisendichten sind für die Beschädigung von
Straßen,
Weiden und elektrischen und mechanischen Ausrüstungen verantwortlich gewesen.
Das Auftreten vor kurzem von Kolonien mit mehreren Königinnen
hat die Kontrolle der Feuerameisen-Populationen noch schwieriger
gemacht. Eine wirksame Verbindung und ein Verfahren zur Kontrolle
der Feuerameisenpopulationen, die für Verwender und Verbraucher
sicher ist, wird dringend benötigt.
-
Versuche
in der Vergangenheit zur Kontrolle der Feuerameise haben die hoch
toxischen Chlorkohlenwasserstoffe Heptachlor, Dieldrin und Mirex
eingeschlossen. Die EPA hat die Verwendung dieser hoch toxischen,
wenn auch relativ wirksamen Verbindungen für alle, außer außergewöhnliche Applikationen, verboten. Zu
am häufigsten
verwendeten modernen Kontrollverfahren gehören die Chemikalien Hydramethylnon,
A vermectin und der synthetische Insektenwachstumsregler Fenoxycarb.
Diese Verbindungen müssen
regelmäßig erneut
appliziert werden und waren nicht zu einem signifikanten Impakt
auf schwere Infestationen mit Feuerameisen oder zur Kontrolle der
weiteren Ausbreitung fähig.
Die Suche nach Kontrollverfahren wird nunmehr in den Bereichen der
Freisetzung steriler Insekten und der Einführung von natürlichen
Feinden, die beide nur potenzielle Lösungen mit ungewissen Resultaten
darstellen, durchgeführt.
-
Bacillus
thuringiensis („BT") ist die Gattung
und Spezies einer großen
Anzahl von Stämmen
grampositiver, Sporen bildender Bakterien, die unter bestimmten
Bedingungen einen Parasporen-Kristall bilden, der aus insektizidem
Protein-Toxin besteht (Bulla, et al., Crit. Rev. Microbiol., 8:
147–204,
(1980); Höfte
und Whiteley, Microbiol Rev (1989) 53: 242, (1989). Das Toxin selbst
ist ein Glycoproteinprodukt aus cry-Genen („Cry" wird zur Bezeichnung des Proteins, „cry" hingegen zur Bezeichnung
des Gens verwendet), wie von Höfte
(id.) beschrieben wurde. Da die Wirkungen der verschiedenen Cry-Proteine durch Bindung
an einzigartige Rezeptoren vermittelt werden, ist die Spezifität der Spezies
eines bestimmten BT-Toxins in der Regel recht eingeschränkt, wie
durch die von Höfte
(id.) vorgeschlagene Originalklassifikation beispielhaft vorgeschlagen
wurde: CryI (Lepidoptera-spezifisch); CryII (Lepidoptera- und Diptera-spezifisch);
CryIII (Coleoptera-spezifisch) und CryIV (Diptera-spezifisch). Die
BT-Toxine wirken im Bürstensaum
der Epithelzellen des Mitteldarms von Insekten und obwohl sie hoch
insektizid für
bestimmte Insekten sind, sind sie gegenüber anderen Organismen, denen
es an den Toxin bindenden Rezeptoren mangelt, nicht toxisch (Gill,
S. S. et al. Ann. Rev. Entomol (1992) 37: 615).
-
Das
im Verlauf der letzten 30 Jahre gezeigte große Interesse an BT-Toxinen
hat zur Isolation von mehr als 100 verschiedenen BT-Kristallprotein-Genen
und der Entwicklung von Bioinsektiziden zur Kontrolle von Insektenspezies
in den Ordnungen Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hymenoptera,
Homoptera, Orthoptera und Mallophaga und gegen Nematoden, Milben
und Protozoen geführt
(Schnepf et al.. Microbiol. Mol. Biol. Rev. (1998) 62(3): 775).
Das BT-Toxin in verschiedenen Formen trägt nun für 90% des weltweiten Verkaufs
von nicht chemischen Insektiziden Rechnung.
-
Die
US-Patenturkunden Nr. 5260058, 5268297, 5596071 und 5824792 offenbaren
Verfahren und Zusammensetzungen zur Kontrolle von Pharao-Ameisen
(Monomorium pharaonis) unter Verwendung von Toxin enthaltenden Bakterienzellen
von verschiedenen BT-Stämmen.
-
Obwohl
diese Toxine angeblich gegen alle Hymenoptera und alle Ameisen wirksam
sind, wurden keine Tests über
die Pharao-Ameise hinausgehend durchgeführt. Die erfindungsgemäßen Protoxine
waren überdies viel
größer (120–140 kD)
als die hierin beschriebenen.
-
Sekar,
V. et al.: PNAS, Vol. 84, Nr. 20, 1987, Seiten 7036–7040 offenbaren
das molekulare Klonieren und die Charakterisierung des Insektiziden
Kristallprotein-Gens von Bacillus thuringiensis var. tenebrionis.
-
Unter
Verwendung eines synthetischen 27-Basen-Oligonukleotids, das einer
Strecke von neun N-terminalen Aminosäuren eines tryptischen Fragments
von gereinigtem Kristallprotein, var. tenebrionis, als eine Sonde
entspricht, wurden rekombinante Kolonien mittels Hybridisierung
in situ auf die Anwesenheit des Kristallprotein-Gens durchsucht.
-
Ein
offener Leserahmen mit 1932-Basenpaaren mit einer Kodierungskapazität von 73
119 Da wurde mittels der Nukleotidsequenzierungsanalyse des klonierten
Kristallproteins identifiziert.
-
US-A-
5338 544 beschreibt ein Cry-II-B-Protein, das als Insektizid gegen
Lepidoptera-Insektizid-Zusammensetzungen wirkt, umfassend das Cry
II B-Protein und Verfahren zur Verwendung davon.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Es
wird erfindungsgemäß ein isoliertes
oder rekombinantes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt,
das eine Nukleotidsequenz umfasst, kodierend ein Protein, das für Formicidae
toxisch ist, das eine Aminosäuresequenz
umfasst, die über
die gesamte Länge
von Resten 58 bis 644 von SEQ ID NO: 2 mindestens 99% homolog ist
oder das ein 67-kD-Cry-Toxin-Protein von Bacillus thuringiensis
kodiert, das für
Formicidae toxisch ist, das sich von einer als NRRL Nr. B-30356
hinterlegten biologisch reinen Kultur von Bacillus thuringiensis herleitet.
-
Es
wurde erfindungsgemäß auch eine
rekombinante Expression der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz in einer
Wirtszelle bereitgestellt, die die genannte Nukleotidsequenz funktionsfähig verknüpft an Kontrollsequenzen
umfasst.
-
Es
wird erfindungsgemäß weiter
eine Wirtszelle bereitgestellt, die das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül enthält.
-
Es
ist erfindungsgemäß auch ein
Verfahren zur Bereitstellung eines für Formicidae toxischen Proteins eingeschlossen,
welches die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszellen fördert, um
auf diese Weise das genannte Protein zu produzieren.
-
Es
ist erfindungsgemäß auch ein
gereinigtes Protein eingeschlossen, das für Formicidae toxisch ist, umfassend
eine Aminosäuresequenz,
die über
ihre gesamte Länge
von Resten 58 bis 644 von SEQ ID NO: 2 mindestens 99% homolog ist
oder umfassend ein 67-kD-Cry-Toxin-Protein,
das von einer als NRRL Nr. B-30356 hinterlegten biologisch reinen
Kultur von Bacillus thuringiensis produziert wird.
-
Es
ist erfindungsgemäß auch eine
Köder-Formulierung
für Formicidae
eingeschlossen, umfassend:
- (a) das erfindungsgemäße Protein
- (b) ein Attraktant, umfassend eine Nahrungsquelle für Formicidae.
-
Gegenstand
der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Reduktion einer Formicidae-Population und/oder Abtöten von
Formicidae unter Verwendung des erfindungsgemäßen Proteins, des erfindungsgemäßen Köders oder
der erfindungsgemäßen Wirtszelle.
-
Vor
dieser Erfindung wurde über
keine BT-Toxine berichtet, von denen bekannt war, dass sie bei der Kontrolle
von Feuerameisen wirksam sind, noch sind irgendwelche BT-Toxine
für diese
Indikation gewerblich erhältlich.
Es besteht folglich ein Bedarf an einer Biozid-Zusammensetzung,
die bei der Kontrolle von Populationen der Feuerameise wirksam ist,
aber dennoch für
Organismen, bei denen es sich nicht um Insekten handelt, nicht toxisch
ist. Ein solches Biozid würde
eine breite Applizierbarkeit aufweisen, einschließlich in
landwirtschaftlichen, häuslichen, ökologischen
und biomedizinischen Bereichen. Aus diesem Grund wäre ein BT-Toxin,
das bei der Abtötung
von Feuerameisen wirksam ist, besonders erwünscht.
-
Feuerameisen
sind Omnivore, obwohl ein großer
Anteil ihrer Ernährung
Invertebraten umfasst, welche von den Feuerameisen gestochen und
getötet
werden. Sie ernähren
sich auch von toten Tieren und Pflanzengeweben, Samen, sich entwickelndem
und reifem Obst und werden vom Nektar und Saftfluss angelockt. Sie werden
von Zuckern, bestimmten Aminosäuren,
Ionen in Lösung
und einigen Ölen
angelockt, die mehrfach ungesättigte
Fettsäuren
in diesen Nahrungsquellen enthalten.
-
Arbeiterameisen
können
nur flüssige
Nahrungsmittel konsumieren und fast die Hälfte der Ressourcen, die in
das Nest zurückgeschleppt
werden, liegen in der Form von Flüssigkeiten vor. Von den nahrungssuchenden
Arbeiterameisen konsumierte und gelagerte Flüssigkeiten werden über Trophallaxe
anderen Arbeiterameisen verfüttert.
Sobald die Arbeiterameise wieder in die Kolonie zurückkehrt,
werden die Öle
langsam an Ammen und von den Ammen an die Larven weitergegeben.
Lösliche
Zucker zusätzlich
zu etwas löslichem
Protein und Aminosäuregemischen
sind stark anlockend und fördern
Trophallaxe unter Arbeiterameisen. Beides verdünnt die Lösung und reduziert die Geschwindigkeit
der Bewegung dieser Nährstoffe
an die Larven.
-
ungelöste Feststoffe,
größer als
0,88 Mikron, werden aus der Flüssigkeit
im Pharynx der Arbeiter-Feuerameise ausgesiebt und können von
den Arbeiterameisen nicht aufgenommen werden. Die Feststoffe akkumulieren
sich in der Bukkalregion als Pellets und werden später ausgestoßen, um
Larven im vierten Instar-Stadium zu füttern, die dazu in der Lage
sind, Partikel einer Größe von 45
Mikron zu konsumieren. Da von den maturen Larven, nicht aber von
den Arbeiterameisen, feste Nahrung verwendet werden kann, bewegen
sich die Feststoffe aus dem Feld an diese Larven schneller und direkter
als flüssige
Nahrungsmittel. Nach der Verarbeitung durch die Larven im vierten
Instar kann zuvor feste Nahrung von der Königin und den jungen Larven über Trophallaxe
verwertet werden. Da es erwünscht
ist, dass Arbeiterameisen Gifte zurück zur Kolonie transportieren
und das Gift durch die gesamte Kolonie verteilen, können Erwägungen über die
beliebtesten Nahrungsmittel von Feuerameisen zusammen mit der physikalischen
Größe des Giftes
die Wirksamkeit der Behandlungsmodalitäten beeinflussen.
-
Gegenstand
der Erfindung ist die Bereitstellung eines BT-Proteins, das aktiv
gegen Mitglieder der Formicidae-Familie, insbesondere die importierte
Feuerameise, Solenopsis invicta, und verwandte Spezies ist. Gegenstand
der Erfindung ist im Allgemeinen die Bereitstellung von BT-Präparationen,
die bei der Reduktion der Populationen von Feuerameisen und verwandten
Spezies wirksam sind. Gegenstand der Erfindung ist weiter die Bereitstellung
neuer Stämme
von B. thuringiensis, die Toxine produzieren, die gegen Feuerameisen
und verwandte Spezies wirksam sind. Wirksamkeit ist definiert als
die Fähigkeit,
die Ameisenzahlen in einer lokalen Feuerameisen-Population, in der Regel einer Gemeinschaft
in einem Erdhaufentyp, durch Abtöten
immaturer und/oder maturer Individuen in der Population, die dem
Toxin ausgesetzt sind, zu reduzieren. Die Exposition kann die Form
der Aufnahme des gegenständlichen
Toxins entweder direkt in einer Köder-Formulierung oder wie in
einer Nahrungsquelle exprimiert oder über Trophallaxe annehmen.
-
Gegenstand
dieser Erfindung ist die Bereitstellung biologisch reiner Kulturen
einer isolierten BT-Bakterienzelle, welche die identifizierenden
Merkmale des Stammes UTD-001 (NRRL Nr. B-30356) aufweist.
-
In
einer alternativen Ausführungsform
wird erfindungsgemäß weiter
rekombinante DNA bereitgestellt, die sich aus dem BT-Stamm herleitet,
der die identifizierenden Merkmale von UTD-001 aufweist und BT-Cry-Toxin-Proteine
kodiert. Diese Merkmale schließen
ein Wildtyp-Cry-Protoxin-Protein von ca. 73 kD ein, das nach der
proteolytischen Verarbeitung zu einem Toxin von ca. 67 kD aktiviert
wird, eine toxische Aktivität gegen
Feuerameisen, eine Aktivität
zwischen pH 5–7,
ein weitgehend wie in 2 gezeigtes SDS-PAGE-Profil und
ein weitgehend wie in 3 gezeigtes arbiträr geprimtes
PCR-Produktprofil aufweist.
-
Die
BT-Cry-Toxine kodierende DNA kann isoliert und als rekombinante
DNA mittels Verfahren kloniert werden, die im Stand der Technik,
wie zum Beispiel im Standard-Klonierungs-Handbuch
von Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2. Auflage 1989)
bekannt sind. Das cry-Gen aus UTD-001 wurde kloniert, und die erfindungsgemäßen Sequenzen
sind wie folgt identifiziert:
-
-
Gegenstand
der Erfindung ist weiter die Bereitstellung von Vektoren zum Klonieren
und zur Expression rekombinanter DNA, kodierend BT-Cry-Protoxine
oder -Toxine, die für
Feuerameisen toxisch sind. Gemäß den im
Stand der Technik gezeigten Verfahren können die Vektoren zur Expression
des Cry-Protoxin- oder -Toxin-Proteins in verschiedenen Wirtsorganismen
gegebenenfalls angepasst werden. Es wird erfindungsgemäß die Verwendung
dieser Expressionsvektoren zur Herstellung neuer Wirtsorganismen,
die manipuliert sind, um die kodierten Proteine entweder transient,
nach der Induktion, oder konstitutiv zu exprimieren, in Erwägung gezogen.
Wirtsorganismen schließen
die ein, die lediglich als Fabriken für die Herstellung großer Toxinmengen verwendet
werden, die dann gereinigt und zu einem Köder formuliert werden. Als
Alternative schließen
Wirtsorganismen Organismen ein, die manipuliert wurden, um sowohl
das Protein zu exprimieren als auch als eine Nahrungsquelle für Feuerameisen
zu dienen. Wirtsorganismen können
prokaryotische Zellen und eukaryotische Zellen sowie Organismen,
wie zum Beispiel Hefe, Fungi, Pflanzen oder Tiere, einschließen.
-
Gegenstand
der Erfindung ist weiter die Bereitstellung gereinigter Cry-Protoxine
und -Toxine und Zusammensetzungen dieser Proteine, die gegen Formicidae
und besonders Solenopsis aktiv sind. Das hierin offenbarte Cry-Protoxin
ist gekennzeichnet durch ein Molekulargewicht von ca. 73 kD mittels
SDS-PAGE und 72,9 kD mittels Berechnung aus dem konzeptuell translatierten
Protein. Das Protoxin wird vermutlich am Rest 55 (zwischen EA) durch
Papain und am Rest 57 (zwischen LD) durch Trypsin gespalten, um
ein aktives Protein zu produzieren. Folglich wird das Protoxin durch
proteolytischen Aufschluss zu einem Toxin von ca. 67 kD reduziert.
Es wird jedoch erwartet, dass dieser Spaltungsort einigermaßen flexibel
ist, was in kleinen Variationen hinsichtlich der Größe des aktiven
Toxins resultiert. Das erfindungsgemäße neue Cry-Toxin kann auch
als ein Cry3A-ähnliches
Toxin basierend auf seiner engen Homologie zum Cry3A-Toxin von Btt
beschrieben werden.
-
Das
Cry-Toxin ist für
Formicidae, einschließlich
Solenopsis invicta, S. richteri, S. xyloni, S. geminatam, S. geminata
(anderweitig bekannt als Atta geminata Fabricius oder S. geminata
Mayr, S. japonica (anderweitig bekannt als S. fugax var. japonica),
S. saevissima, S. orbuloides, S. punctaticeps, eine Varietät der Solenopsis-Spezies,
die durch eine Zahl identifiziert ist und die verwandte Feuerameisen-Spezies
toxisch. Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung von Verfahren
zur Reduktion der Ameisen-Populationen durch Zusammensetzungen,
enthaltend von BT-Stämmen
mit den identifizierenden Merkmalen von UTD-001 produziertes Cry-Toxin
oder -Protoxin.
-
KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
-
Ein
vollständigeres
Verständnis
des erfindungsgemäßen Verfahrens
und Apparates kann durch Bezugnahme auf die folgende ,Ausführliche
Beschreibung' erhalten
werden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Beispielen
betrachtet wird, worin:
-
1 ein
mit Coomassie-Blau gefärbtes
SDS-PAGE-Gel der cytoplasmatischen Proteine darstellt, die aus UTD-001
und einer Kontrollspezies, B. thuringiensis, subsp. tenebrionis
(Btt) isoliert wurden. Das linke Panel stellt Proteine aus vegetativen
Zellen dar, wohingegen das rechte Panel aus Sporen bildenden Zellen
besteht. Die Muster weisen eindeutig darauf hin, dass der UTD-001-Stamm
ein Cry-Toxin von ca. der gleichen Größe (ca. 67 kD) wie das Cry3A-Protein
von Btt aufweist. Die Größenmarker
des Molekulargewichts (kD) sind auch angezeigt;
-
2 ein
mit Ethidiumbromid gefärbtes
Agarosegel von arbiträr
geprimten PCR-Produkten von UTD-001 und der Kontrollspezies von
Btt darstellt. Der arbiträre
Primer stellte ACGCGCCCT dar. Die Pfeile lassen Banden erkennen,
die im Btt-Stamm vorliegen, die im UTD-001-Stamm hingegen abwesend
sind. Die Größenmarker
M (100-bp-Ladder) sind auf der rechten Seite angezeigt;
-
3 einen
Assay eines Feuerameisen-Toxins, worin gereinigtes, mit Papain behandeltes
Toxin mit einem gereinigten Toxin, Rohsporen- und Kristalltoxin
und Kontrollen verglichen wird, zeigt;
-
4A und 4B die
SDS-PAGE-Profile des aktivierten Toxins (4A) und
Rohsporen- und Kristalltoxin (4B) darstellen.
Das Protoxin von 73 kD und das Toxin von 67 kD sind beide in 4B ersichtlich. Die
Molekulargewichts-Marker (kD) sind auch angezeigt;
-
5 das
Klonieren des Cry-Toxin-Gens aus einem PCR-Produkt von UTD-001 von
1,8 kb in den TA-Klonierungsvektor pCR2.1 (INVITROGENTM)
zur Produktion des pCCRY3-Plasmids erläutert. Bei den verwendeten
Primern handelte es sich um Forward: ATGAATCCGAACAATCGAAG und Reverse:
TTAATTCACTGGAATAAATTC;
-
6 die
Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) des Cry-Protoxins von UTD-001 darstellt;
und
-
7 die
Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) des Cry-Protoxins von UTD-001 darstellt. Der aktive Toxinanteil
befindet sich im Fettdruck. Der Pfeil zeigt vermutliche Spaltungsorte
für das
Protoxin an.
-
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER DERZEIT
BEVORZUGTEN BEISPIELHAFTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
-
Der
erfindungsgemäße Gegenstand
wird nun hierin nachstehend unter Bezugnahme auf die begleitenden
Zeichnungen ausführlicher
beschrieben, worin die erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsformen
gezeigt sind. Dieser erfindungsgemäße Gegenstand kann jedoch in
vielen verschiedenen Formen verkörpert
werden und darf nicht als einschränkend für die hierin dargelegten Ausführungsformen
ausgelegt werden; diese Ausführungsformen
sind vielmehr dazu bereitgestellt, damit diese Offenbarung gründlich und
vollständig ist
und dem Fachmann den erfindungsgemäßen Rahmen vollständig vermitteln
wird.
-
ABKÜRZUNGEN
UND DEFINITIONEN
-
Die
folgenden Abkürzungen
und Definitionen werden in dieser Anmeldung durchweg verwendet:
BT – Bacillus
thuringiensis (B. thuringiensis); Btt – Bacillus thuringiensis subsp.
tenebrionis; Cry-Toxin – sich
aus dem Parasporen bildenden kristallinen Protein herleitendes Toxin;
cry – das
Cry-Toxin kodierende Gen; EDTA – Dinatriumethylendiamintetraacetat,
Dihydrat; kD – Kilo-Dalton;
LB – Luria-Bouillon;
LC50 – letale
Konzentration, die in einer 50%igen Mortalität resultiert; PMSF – Phenylmethansulfonylfluorid
und SDS-PAGE – Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
-
Der
Begriff „x
% Homologie" betrifft
das Ausmaß,
in dem zwei Nukleinsäure-
oder Proteinsequenzen, die wie mithilfe des BLAST-Homologie-Alignments
bestimmt, wie von T. A. Tatusova und T. L. Madden (1999), „Blast
2 sequences – a
new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS MICROBIOL
LETT. 174: 247–250,
beschrieben, und unter Verwendung der folgenden Parameter: Program
(blastn) oder (blastp), wie angemessen; Matrix (OBLOSUM62), Reward
für ein
Match (1); Penalty für
ein Mismatch (–2);
Open Gap (5) und Extension-Gap (2) Penalties; Gap x-Drop-off (50);
Expect (10); Word Size (11); Filter (Off), identisch sind. Ein Beispiel
eines Webbasierten Alignment-Programms für zwei Sequenzen unter Verwendung
dieser Parameter ist unter http://www.ncbi.nml.nih.gov/gorf/b12.html
zu finden. Eine hohe Stringenz wird als Einschluss eines endgültigen Waschschrittes
von 0,2 × SSC
bei einer Temperatur von 60°C
definiert.
-
Der
Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein neues BT-Isolat
und Gene davon, die ein neues Toxin kodieren, das gegen Formicidae
und besonders Solenopsis aktiv ist.
-
Das
neue BT-Isolat, das hierin als Bacillus thuringiensis UTD-001 bekannt
ist, wie auch Protoxine und Toxine aus diesem Isolat, können zur
Kontrolle von Schädlingen,
wie zum Beispiel der Feuerameisen, Carpenter Ameisen, der Argentinischen
Ameisen und Pharao-Ameisen
verwendet werden.
-
Das
BT-Toxin-Gen aus dem Isolat von UTD-001 wurde kloniert und sequenziert
und wird in 6 (SEQ ID NO: 1 und 2) dargestellt.
Die Kodierungsregion erstreckt sich vom Nukleotid 1 bis zum Ende
(1936). Das Protein in 7 stellt 644 Aminosäuren dar
und schließt
eine Proregion aus Aminosäuren
1 bis 55 oder 57 und eine aktive Region aus Aminosäuren 56
oder 58 bis zum Ende ein. Der pI des Protoxins beträgt 5,67. Das
cry-Gen ist 98% homolog mit dem cry3A-Gen von Btt, das relativ zu
diesem Zeitpunkt am nächsten
zu sein scheint.
-
Das
hierin offenbarte neue Toxin ist gegen Ameisen, insbesondere gegen
Feuerameisen aktiv. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung des Fachmanns mit einem Solenopsis-aktiven Toxin, Verfahren
zur Verwendung des Toxins und Gens, das das Toxin kodiert. Das Gen
oder Genfragment, das das Solenopsis-aktive Toxin kodiert, kann
kloniert werden, und das Genfragment, kodierend das Toxin-Gen kann über einen
rekombinanten DNA-Vektor an geeignete Wirte transferiert werden.
-
Da
die Cry-Toxine im Allgemeinen eine sehr breite Reihe von Spezies-Spezifität aufweisen,
wird erwartet, dass die erfindungsgemäßen Cry-Toxine Aktivität gegen
andere Hymenoptera aufweisen. Studien zur Spezies-Spezifität werden
zur Bestätigung
dieser Prädiktion
durchgeführt.
-
Rekombinante
Wirte zur Verwendung als Ameisen-Futterquellen, die die erfindungsgemäßen Cry-Toxine
umfassen, können
eine weite Varietät
von Mikroben- oder
Pflanzenwirten einschließen.
Die Expression des Toxin-Gens führt,
direkt oder indirekt, zur Produktion des Pestizid-Toxins. Ein wichtiges
Merkmal dieser erfindungsgemäßen Ausführungsform
besteht darin, dass das produzierte Toxin im Wirt keinen Kristall
bilden sollte, so wie dies in BT die Norm ist, weil Feuerameisen
während
des Fressens große
Partikel, wie zum Beispiel den Kristall, ausfiltrieren. Deshalb
darf der Wirt keinen Kristall produzieren, der größer als
die Partikelgröße ist,
die Feuerameisen während
des Fressvorgangs ausschließen
(z. B. 0,88 Mikron). Selbstverständlich kann
das cry-Gen zur Herstellung der aktiven, löslichen Form des Toxins von
67 kD, das um das Problem des Größenausschlusses
herumsteuert, manipuliert werden.
-
Mit
geeigneten mikrobiellen Wirten, wie z. B. Pseudomonas, können die
Mikroben auf den Situs des Schädlings
appliziert werden, wo sie proliferieren und aufgenommen werden.
Das Ergebnis ist eine wirksame Kontrolle der Feuerameise. Die folgenden
Faktoren könnten
bei der Auswahl einer Wirtszelle zur erfindungsgemäßen Produktion
des Toxins von Bacillus thuringiensis in Betracht gezogen werden:
Gen-Wirt-Kompatibilität, Leichtigkeit
der Wirtstransformation; Verfügbarkeit
von Expressionssystemen; Effizienz der Expression; Stabilität des Toxins
im Wirt; das Vorliegen unterstützender
genetischer Fähigkeiten
und ob der Wirt als eine direkte Nahrungsquelle für das Zielinsekt
funktionieren bzw. lediglich als eine Toxinquelle funktionieren
soll. Andere Faktoren, die berücksichtigt
werden können,
schließen
die folgenden ein: Pathogenität
des Wirts für Tiere
und Menschen; Leichtigkeit der Formulierung und Handhabung, Wirtschaftlichkeit,
Lagerungsstabilität und
dergleichen. Wirte für
Mikroorganismus-Nahrungsquellen werden ausgewählt, von denen bekannt ist, dass
sie die „Phytosphäre" (Phylloplane, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder
Rhizoplane) von einer oder mehr Nutzpflanze(n) von Interesse besiedeln.
Im Allgemeinen sollte der Organismus eine stabile Aufrechterhaltung
und die Expression des Gens zum verbesserten Schutz des Toxins aus
dem Abbau und der Inaktivierung in der Umwelt bereitstellen.
-
Es
ist bekannt, dass eine große
Anzahl an Mikroorganismen auf der Phylloplane (der Oberfläche der Pflanzenblätter) und/oder
der Rhizosphäre
(dem die Pflanzenwurzeln umgebenden Boden) einer weiten Varietät von wichtigen
Nutzpflanzen leben und eine bekannte Nahrungsquelle für die Feuerameise
darstellen. Diese Mikroorganismen schließen Bakterien, Algen und Fungi
ein. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen, wie zum Beispiel
Bakterien, zum Beispiel die Gattungen Pseudomonas, Erwinia, Serratia,
Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas,
Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter,
Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes; Fungi, insbesondere Hefe,
z. B. die Gattungen Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces,
Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium.
-
Andere
Organismen, die von Feuerameisen als Nahrungsquelle verwendet werden
können,
gehören in
der Phytosphäre
lebende Bakterienspezies, wie zum Beispiel: Pseudomonas syringae,
P. fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium
tumefaciens, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris,
Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus und Azotobacter vinlandii;
und in der Phytosphäre
lebende Hefe-Spezies, wie zum Beispiel Rhodotorula rubra, R. glutinis,
R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C.
laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae,
Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium
pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
-
Die
erfindungsgemäßen BT-Stämme können unter
Verwendung von Medien aus dem Stand der Technik und Fermentationsverfahren
kultiviert werden, bestimmte spezifische Bedingungen sind jedoch
hierin offenbart, die in den Stand der Technik fallen. Nach Abschluss
eines Fermentationszyklus können
die Bakterien geerntet werden, indem zuerst die BT-Sporen und die
Parasporen-Kristalle von der Fermentationsbouillon durch im Stand
der Technik bekannte Mittel getrennt werden. Die rückgewonnenen
BT-Sporen und -Kristalle können
durch das Zufügen
von Tensiden, Dispergiermitteln, inerten Trägern und anderen Komponenten
zur Förderung
der Handhabung und Applikation für
bestimmte Zielschädlinge
zu einem anfeuchtbaren Pulver, flüssigen Konzentrat, Granulaten
oder anderen Formulierungen formuliert werden.
-
Im
Stand der Technik nicht allgemein bekannt und hierin spezifisch
anerkannt ist die Tatsache, dass Feuerameisen spezifisch große Gegenstände, wie
zum Beispiel Bakteriensporen und Kristalle aus der Mundhöhle wegfiltrieren
und den Eintritt dieser großen
Gegenstände
in das Verdauungssystem verhindern. Deshalb ist es bei der Herstellung
von festen Ködern
für die
Feuerameise wichtig, dass die Partikelgröße auf 0,88 Mikron oder weniger
beschränkt
ist, um der Feuerameise die wirksame Aufnahme des Giftes zu erlauben,
die Partikelgröße ist jedoch
für andere
Hymenoptera-Insekten weniger relevant. Als Alternative können die BT-Sporen
und -Protoxin-Kristalle mindestens teilweise gereinigt und teilweise
in einer Flüssigkeit
aufgelöst oder
die Kristallgröße durch
Zermahlen oder genetische Modifikation reduziert oder das Toxin
als lösliche,
aktive Proteine zum Umgehen des Größenausschlussmechanismus der
Feuerameisen-Abwehr exprimiert werden.
-
Nach
vollständiger
oder teilweiser Reinigung kann das erfindungsgemäße Pestizid-Toxin in einer
Konzentration für
die Flüssigkeitsmenge
oder zum Auflösen
benötigten
Flüssigkeit
bereitgestellt werden. Die Konzentration des Toxins wird von der
Beschaffenheit der bestimmten Formulierung abhängig sehr weitgehend variieren.
Das Pestizid kann den Feuerameisen in einer Konzentration von ca.
1% (w/v) angeboten werden, wenn es jedoch in einer trockenen Form
mit einem Attraktant bereitgestellt wird, kann sie bei 100 Gew.-%
vorliegen. Das Attraktant kann sogar das Toxin selbst oder ein Blotting-Mittel
oder -Pulver sein, auf dem das Toxin bereitgestellt wird. Trockenformulierungen
werden zum Beispiel von ca. 1–95
Gew.-% des Pestizids aufweisen, wohingegen die Flüssigformulierungen
im Allgemeinen von ca. 1–60
Gew.-% der Feststoffe in der Flüssigphase vorliegen.
Die Formulierungen können
in der Umgebung des/der Hymenoptera-Schädlings/Schädlinge, z. B. Pflanzen, Erde
oder Wasser durch Sprühen,
Verstäuben,
Berieseln, Köder
oder dergleichen appliziert werden.
-
BEISPIEL 1: ISOLIERUNG
DER STÄMME
VON BACILLUS THURINGIENSIS
-
Eine
Erdprobe von 1 g wurde mit 10 ml LB gepuffert mit 0,25 M Natriumacetat,
pH 6,8, gemischt und unter kräftigem
Rühren
(ca. 200 U/min) über
Nacht bei 30°C
inkubiert. Ein Aliquot der Probe von 1,5 ml wurde entfernt und bei
80°C unter
Rühren
in einem 50 ml fassenden konischen Röhrchen 3 Minuten einem Hitzeschock
ausgesetzt. Danach wurden Aliquote von 10, 20 und 100 μl entfernt
und auf LB-Medium über
Nacht bei 30°C
ausplattiert. Am folgenden Tag wurden Kolonien ausgewählt und
auf GYS-Platten ausplattiert und über Nacht bei 30°C inkubiert.
Das GYS-Medium wird wie folgt hergestellt:
-
-
Die
Isolate wurden zur Bestimmung, ob kristalline Einschlüsse herbeigeführt wurden,
mikroskopisch untersucht. Einschlüsse wurden durch Färbung mit
Malachitgrün/Gram-Safranin wie folgt
sichtbar gemacht: Die Zellen wurden auf einem Objektträger getrocknet
und 15 Minuten mit einer 5%igen wässrigen Malachitgrün-Lösung über siedendem
H2O gefärbt.
Der Objektträger
wurde gespült
und 5–6
Minuten mit Gram-Safranin-Lösung
gefärbt
(die Stammlösung
ist eine 2,5%ige Lösung
aus Safranin 0 (SIGMATM) in 100 ml EtOH;
die Gebrauchslösung
stellt eine Verdünnung
von 1:10 der Stammlösung
in H2O dar). Der Objektträger wird
abgespült
und getrocknet. Die Sporen färben
sich grün/blau
an, während
sich Kristalle und vegetative Zellen rot anfärben.
-
Es
wurden Isolate, die Kristalle zu bilden schienen, bemerkt, die in
LB über
Nacht bei 30°C
gezüchtet wurden
und erneut auf GYS-Platten ausgestrichen wurden, um axenische Kulturen
zu erhalten. Die Kulturen wurden wieder durch Färben mit Gram-Safranin untersucht,
um Isolate zu identifizieren, die Kristalle und Sporen bilden. Solche
Kulturen wurden 5 Tage in 7 ml flüssigem GYS gezüchtet, zum
Nachweis der Kristall-/Sporenbildung wieder gefärbt und zentrifugiert und 3-mal
mit 50 ml Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM KCl und 10 mM EDTA gewaschen. Die
Pellets wurden lyophilisiert und zum späteren Gebrauch gewogen.
-
BEISPIEL 2: CRY-TOXINPRÄPARATION
-
Zur
Präparation
von Toxin wird 1 ml der Kultur 1 Minute in einer Tischmikrozentrifuge
zentrifugiert, in 200 μl
Puffer zur Solubilisierung des Proteins resuspendiert und 10 Minuten
gekocht. Die hergestellte Probe wird auf ein 12%iges SDS-PAGE-Gel
geladen und eine Elektrophorese durchgeführt. Das Gesamtproteinprofil für jede Probe
wurde durch Färbung
des Gels mit Coomassie-Blau gefärbt.
Sowohl vegetative als auch Sporen bildende Zellen werden auf diese
Weise analysiert, und ein Beispiel wird in 1 gezeigt.
Es wird angemerkt, dass zur Herstellung der Gesamtproteinextrakte
das Protoxin vollkommen in die 67-kD-Form gespalten wurde, weil
keine Protease-Inhibitoren
verwendet wurden. In Präparationen,
in denen die Spaltung unvollständig
ist, können
gegebenenfalls Dubletten zu sehen sein, und in Präparationen,
in denen die Protease-Aktivität
vollkommen verhindert wird, ist eine einzelne 73-kD-Bande zu sehen.
-
Isolate,
die Cry-Toxin-Proteinprofile von Interesse, wie durch SDS-PAGE bestimmt,
enthalten, werden zum Bioassay ausgewählt. Die Isolate werden in
1-Liter-Chargenkulturen enthaltend GYS-Bouillon gezüchtet. Nach
der abgeschlossenen Sporenbildung der Kultur, die durch Färbung mit
Malachitgrün
bestimmt wurde, werden die Kulturen zentrifugiert und die Parasporen-Kristalle
werden unter Verwendung mehrerer Beschallungsrunden und Pufferwechsel
zentrifugiert. Die gewaschenen Kristalle werden weiter durch Zentrifugation auf
einem Saccharosegradienten von 30–80% gereinigt. Die gereinigten
Kristalle werden in einem Natriumcarbonat-Puffer solubilisiert und
das Protoxin unter Verwendung von Papain oder Trypsin in aktiviertes
Toxin umgewandelt. Das aktivierte Toxin wird mithilfe der HPLC oder
FPLC gereinigt.
-
Das
gereinigte aktive Toxin wird in einem Insekten-Bioassay durch Zufügen variierender
Konzentrationen zur Insekten-Nahrung wie vorstehend beschrieben
verwendet. Auf diese Weise wurde ein als UTD-001 bezeichneter, gegen
die Feuerameise wirksamer BT-Stamm identifiziert. Der Stamm UTD-001
war wie vorstehend beschrieben durch seine Bandierungsmuster des
Gesamtproteins gekennzeichnet. Das Bandierungsmuster des Proteins
war ähnlich,
aber nicht identisch mit dem Bandierungsmuster des Proteins einer
Kontroll-Spezies – Btt,
wie in 1 gezeigt.
-
Es
ist bekannt, dass Btt gegen bestimmte Käfer wirksam ist und ein Cry3A-Toxin
enthält.
Das Cry3A-Toxin wird als ein ca. 73-kD-Protoxin exprimiert, das
durch proteolytische Spaltung zu einem 67-kD-Toxin aktiviert wird.
Der Durchschnittsfachmann sollte zur Kenntnis nehmen, dass das Btt-Toxin
Toxizitätseigenschaften,
wie in 3 erläutert,
zum Beispiel Crys-ähnliche
Toxine aufweist. Die weitere Charakterisierung des UTD-Stammes wurde
durch arbiträre
Primer-PCR (2), eines leistungsfähigen Verfahrens
zur Identifikation von BT-Serovaren
und Stämmen
durchgeführt,
Brousseau, C., et al., (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59: 114–119. Die
Profile sind wiederum ähnlich,
aber nicht mit dem Kontrollstamm Btt identisch. Im Btt-Stamm liegen
insbesondere drei Banden (durch Pfeile angezeigt) vor, die im UTD-001-Stamm
nicht vorhanden sind.
-
BEISPIEL 3: REINIGUNG
UND AKTIVIERUNG VON CRY-PROTOXIN-KRISTALLEN
-
Eine
1-Liter-Kultur aus einem gegen die Feuerameise wirksamen Btt-Stamm
wird 4–6
Tage in modifiziertem GYS-Medium gezüchtet, bis die meisten Zellen
lysiert sind. Das die lysierten Zellen enthaltende Medium wird 20
Minuten bei 7500 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und
das Zellpellet in 40 ml fassende Zentrifugenröhrchen überführt. Das Zellpellet wird in
1 M NaCl (30 ml/Röhrchen)
resuspendiert und 20 Minuten bei 15 000 U/min zentrifugiert. Zwei
sich anschließende
Waschschritte werden mit destilliertem Wasser durchgeführt. Die
Zellen (2–4
Gramm) werden in zwei Röhrchen
in 68%igem RENOGRAFIN®-76 resuspendiert (20,4
ml Renografin®-76
plus einer Lösung
aus 3 ml 100 mM EDTA und 6,6 ml 2%igem Triton X-100 in destilliertem
H2O) (RENOGRAFIN®-76
ist Diatrizoat-Meglumin und Diatrizoat-Natrium, Hersteller: SQUIBB
DIAGNOSTICSTM, New Brunswick, NJ).
-
Die
Zelltrümmer
werden zum Beispiel durch Zentrifugation 2 Stunden bei 15 000 U/min
in einem JA-20- oder Sorvall SS-34-Rotor pelletiert. Der Überstand,
enthaltend die Kristalle, wird abpipettiert und in ein gesondertes
Zentrifugenröhrchen
gegeben. Der Überstand
wird unter Verwendung von 1,2-pm-Filterpapier filtriert und nach
Zufügen
von EDTA auf 3–5
mM und PMSF 0,1 mg/ml 36 Stunden unter Verwendung einer Dialysemembran
mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 12 000 bis 14 000 gegen destilliertes
Wasser dialysiert. Das dialysierte Material wird dann 15 min bei
7 500 U/min zentrifugiert, und der die Kristalle enthaltende Überstand
nass bei 4°C
gelagert.
-
Die
Protoxin-Kristalle werden in 3,3 M NaBr, pH 7,0, und 50 mM Phosphatpuffer
enthaltend 1 mM PMSF löslich
gemacht. Unlösliche
Papainperlen (SIGMATM) werden nach Anleitung
des Herstellers aktiviert und dem löslich gemachten Kristalltoxin
zur Bewirkung der Spaltung zugefügt.
Die Spaltung wird durch Zufügen
von Na-p-Tosyl-L-Lysin-Chlormethyl-Keton
(TLCK) zu 1,25 mg/ml und 0,2 Volumen Na2CO3 bei pH 10,0 gestoppt. Das gespaltene Toxin
wird mittels einer Passage über
Sephadex G-75 (AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH, INC.TM,
Piscataway, NJ) gereinigt, mit 50 mM Na2CO3, pH 10,0, enthaltend 1 mM EDTA, äquilibriert.
-
BEISPIEL 4: ALTERNATIVES
VERFAHREN ZUR REINIGUNG UND AKTIVIERUNG VON BT-TOXIN
-
Das
Toxin von Bacillus thuringiensis kann aus Cry-Toxin exprimierenden
rekombinanten Zellen isoliert werden. So wird zum Beispiel E. coli,
enthaltend das cry-Gen
hergestellt. Eine 500-ml-Kultur wird dann bis zu einer OD600 von ca. 0,8 gezüchtet. Wenn das rekombinante
Gen unter dem Einfluss des lac-Promotors kloniert wird, wird die
Expression durch Behandlung mit 0,1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) über
Nacht bei 37°C
induziert.
-
Die
Zellen werden durch Zentrifugation, zum Beispiel 10 Minuten bei
5 000 U/min in einem JA-14-Rotor pelletiert. Das Zellpellet wird
in 25 ml TES-Puffer resuspendiert (50 mM Tris, pH 8,0; 50 mM EDTA;
15% Saccharose). Die Zellen werden durch Behandlung mit Lysozym
30 Minuten bei Raumtemperatur lysiert (0,5 mg/ml Endkonzentration)
und PMSF (0,1 mM Endkonzentration), gefolgt von Beschallung, 3 × 1 Minute
auf Eis. Der Überstand
und die Oberflächentrümmer werden
verworfen, und die Zellen werden in 20 ml TTN-Puffer (20 mM Tris,
pH 8,0; 2% Triton X-100; 0,5 M NaCl) suspendiert. Die Pellets werden
zuerst mit einem Spatel, dann mit einem Dounce-Homogenisator aus
Glas suspendiert und dann 15 Minuten bei 12 000 U/min pelletiert. Dieses
Waschverfahren wird über
4 Zyklen wiederholt. Das Pellet wird dann 2 × mit 20 ml PBS : Aceton (5
: 1) wie vorstehend gewaschen, gefolgt von einem Waschschritt in
PBS (pro Liter: 8 g NaCl; 0,2 g KCl; 1,44 g Na2HPO4; 0,24 g KH2PO4) allein. Das Pellet wird schließlich in
20 ml Na2CO3-Puffer
(50 mM Na2CO3, pH
10,0; 5 mM DTT) resuspendiert und kann bei 4°C gelagert oder 4 Stunden bei
37°C zum
Löslichmachen
des Protoxins geschüttelt
werden. Die resultierende milchige Lösung wird zur Entfernung von
unlöslichem
Material pelletiert und gegebenenfalls kann zusätzliches Natriumcarbonat zugefügt werden.
-
Die
Protoxin-Präparation
kann auf einem Mini-Gel analysiert werden und sollte ein überwiegend 73-kD-Protoxin
plus einiger kleinerer (bakterieller) Proteine aufzeigen. Das Protein
kann unter Verwendung des BCA-Proteinreagenzes (PIERCETM)
nach den Empfehlungen des Herstellers vor der Behandlung mit Papain
quantifiziert werden. Protoxin wird bei 4°C gelagert. Gefrieren führt zur
Güteminderung
des Protoxins.
-
Die
Aktivierung des Protoxins kann als Alternative unter Verwendung
von Trypsin durchgeführt
werden. TPCK (SIGMATM)-Trypsin wird zum
Erhalt eines Verhältnisses
von Trypsin : Protoxin von 1 : 20 zugefügt, und das Gemisch wird 15
Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegeben, und ein Aliquot wird
auf einem Mini-Gel auf vollkommenen Aufschluss geprüft. Wenn
der Aufschluss abgeschlossen ist, wird PMSF zu 100 μM auf Eis
zugefügt.
-
Das
gespaltene Gemisch wird über
Nacht mit 100 mM NaCl, pH 9,5, gegen 20 mM Tris dialysiert. Vor der
endgültigen
Dialyse sollte die Konzentration des aktivierten Toxins zur Vermeidung
von Präzipitation
nicht mehr als 2 mg/ml betragen. Die dialysierte Präparation
wird durch ein 0,2-μm-Filter
filtriert und einer weiteren Reinigung mittels FPLC unterzogen.
Die 18%ige B-Fraktion wird anhand der FPLC unter Verwendung eines 100–1000 mM
NaCl-Gradienten wie unten beschrieben gesammelt.
-
BEISPIEL 5: REINIGUNG
VON CRY-TOXIN MITTELS FPLC
-
Die
FPLC-Verfahren wurden gemäß den Standardverfahren
einschließlich
der folgenden Einzelheiten durchgeführt. TYPISCHES
FPLC-PROFIL (MIT EINER HR5-SÄULE
AN PORT 3, MIT EINER 1-ml-PROBENSCHLEIFE):
| FPLC-Puffer
,A' (niedriger Salzgehalt): | 50
mM Tris, pH 10,0, 100 mM NaCl 5% Glycerol; durch ein 0,2-μm-Filter
filtrieren. |
| FPLC-Puffer
,B' (hoher Salzgehalt): | 50
mM Tris, pH 10,0, 1 M NaCl 5% Glycerol; durch ein 0,2-μm-Filter
filtrieren. |
-
BEISPIEL 6: MORTALITÄT DER FEUERAMEISE
-
Der
hierin beschriebene erfindungsgemäße Gegenstand wurde auf die
Identifizierung von BT targetiert, der bei der Abtötung von
Populationen der importieren Feuerameise wirksam ist. Es wurden
die Merkmale des BT-Toxins zusammen mit den Merkmalen des Darmmilieus
in Erwägung
gezogen, in dem das Toxin seine toxische Wirkung ausüben muss.
Einige BT-Stämme
produzieren Toxine, die bei neutralem und niedrigerem pH funktionieren
(pH-Bereich von 5–7).
Das Darmmilieu verschiedener Insekten kann durch unterschiedliche pH-Werte
gekennzeichnet sein. Der Darm der Feuerameisen ist insbesondere
ein wenig sauer. Ein gegen Feuerameisen wirksames BT-Toxin muss
im Darmmilieu der Feuerameise überleben.
-
3 ist
eine grafische Darstellung, die die Mortalität der Populationen der importierten
Feuerameise zeigt, die mit verschiedenen Konzentrationen des BT-Toxins
behandelt wurden. Das Verfahren verhält sich kurz wie folgt. Zum
Testen einer jeden Konzentration wird eine gesonderte Kolonie von
Arbeiterameisen verwendet. Die verschiedenen Konzentrationen werden
in einer 10%igen Saccharose-Lösung
in destilliertem Wasser für
alle Tests kombiniert. Vor dem Test wird den Arbeiterameisen-Kolonien 5 Tage die
Nahrung entzogen. Dann werden die 20 Arbeiterameisen für jede Wiederholung
14 Tage in 30 ml fassende Becher gegeben. Die Toxinpräparationen
werden nur die initialen 24 Stunden in Becher gegeben, danach werden
sie entfernt und durch 10% Saccharose in destillierter wässriger
Lösung
ersetzt. Die Mortalität
(%) wird am Tag 1, 2, 3, 6, 8, 10 und 14 aufgezeichnet. Die Kontrolle
besteht nur aus 10% Saccharose in destillierter wässriger
Lösung.
-
Die
LC50 wurde bisher nicht schlüssig bestimmt,
die vorläufigen
Ergebnisse von 6 Monate altem Toxin von zweifelhafter Qualität weist
jedoch darauf hin, dass die LC50 so niedrig
wie 70 ng/ml liegen könnte.
Es sind auch Studien zur Bestimmung der Spezies-Spezifität des neuen
Cry-Toxins geplant. Es werden insbesondere Bienen und Wespen auf
die Wirksamkeit des Toxins getestet.
-
BEISPIEL 7: KLONIEREN
DES CRY-GENS AUS UTD-001
-
Das
cry-Gen von Stamm UTD-001 ist auf Plasmiden mit einem ähnlichen
Größen- und
Restriktionsmuster wie dem von dem Kontrollstamm Btt (nicht gezeigt)
aufgezeigten, enthalten. Es wird daher angenommen, dass das Gen
dem Btt-Gen sehr ähnlich
sein könnte.
Folglich werden die Primer cry3A-F und cry3A-R (die sich vom cry-Gen
von Btt herleiten) zur Amplifikation eines 1,8-kb-Fragments von
UTD-001, das einen durch TAQ geschaffenen A-Überhang aufweist, verwendet.
Das Fragment wird aus einem niedrig schmelzenden Agarosegel ausgeschnitten
und in linearisiertes pCR2.1 mit einem T-Überhang zur Herstellung des pCRRY3-Plasmids
(siehe 5 – TA-Klonierungsverfahren
durch INVITROGENTM) ligiert.
-
Das
Gen wurde sequenziert und wird in 6 zusammen
mit der konzeptuell translatierten Aminosäuresequenz des Protoxins in 7 gezeigt.
Die Kodierungsregion erstreckt sich von den Nukleotiden 56 oder 58
bis zum Ende. Der vermutliche proteolytische Spaltungsort wird durch
den Pfeil angezeigt, und die Toxinsequenz ist in Fettdruck ersichtlich.
Das berechnete Molekulargewicht des Protoxins beträgt 72,9
kD, und das Toxin beträgt
ca. 67 kD, was mit den Größen, wie
mittels SDS-PAGE bestimmt, gut übereinstimmt.
-
Das
Gen weist die größte Homologie
(98%) zum Cry3A-Gen des als Kontrolle eingesetzten Btt-Stammes auf.
Die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NO: 2) wurde insbesondere mittels BLASTP unter den unter
Definitionen vorstehend beschriebenen Suchparametern durchsucht,
und es wurden Homologien zu einer Anzahl an Coleoptera-spezifischen Cry-Protoxinen
von 73–74
kD gefunden. Die engste Homologie bestand zum Cry3A(A)-Toxin (Zugriffsnummer
P07130) aus B. thuringiensis var. tenebrionis mit Homologien, die
im Bereich von 632/644 (98%) bis 572/584 (97%) Aminosäure-Identitäten aus
variierenden Btt-Isolaten lagen. Die nächst engsten Homologien ergaben
sich zum Cry3C(A)-Toxin von B. thuringiensis subsp. kurstaki (Zugriffsnummer Q45744)
bei 479/652 (73%) Aminosäure-Identitäten und
dem Cry3B(B)-Toxin (Zugriffsnummer Q06117) mit 439/650 (67%) Identitäten. Die
Nukleotidsequenz zeigte auf ähnliche
Weise 1902/1936 (98%) Nukleotid-Homologie zur Cry3A(A)-Sequenz von
Btt.
-
Da
das neue Cry-Toxin überraschend
eng verwandt mit dem Btt-Toxin war, einem Toxin, von dem bekannt
ist, dass es nur gegen Coleoptera wirksam ist, wurde das Btt-Toxin auch auf Wirksamkeit
gegen Feuerameisen getestet. Die vorläufigen Ergebnisse deuten darauf
hin, dass das Btt-Toxin gegen die Feuerameise wirksam ist, obwohl
mit geringerer Wirksamkeit als der hierin beschriebene Stamm. Folglich
wurde unerwartet eine neue Verwendung für das Btt-Toxin im Stand der
Technik entdeckt. Diese Aktivität
gegen Feuerameisen könnte
aufgrund der ungewöhnlichen
Ernährungsanforderungen
der Feuerameise, die keine großen
Feststoffe konsumieren kann, zuvor verdeckt gewesen sein.
