DE69532333T3 - Pestizid-proteine und stämme - Google Patents

Pestizid-proteine und stämme Download PDF

Info

Publication number
DE69532333T3
DE69532333T3 DE69532333T DE69532333T DE69532333T3 DE 69532333 T3 DE69532333 T3 DE 69532333T3 DE 69532333 T DE69532333 T DE 69532333T DE 69532333 T DE69532333 T DE 69532333T DE 69532333 T3 DE69532333 T3 DE 69532333T3
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
plant
protein
dna molecule
seq
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69532333T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69532333T2 (de
DE69532333D1 (de
Inventor
Gregory Warren
Michael Koziel
Martha MULLINS
Gordon Nye
Brian Carr
Nalini Desai
Kristy Kostichka
Nicholas DUCK
Juan Estruch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Participations AG
Original Assignee
Syngenta Participations AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26979445&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69532333(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Syngenta Participations AG filed Critical Syngenta Participations AG
Application granted granted Critical
Publication of DE69532333D1 publication Critical patent/DE69532333D1/de
Publication of DE69532333T2 publication Critical patent/DE69532333T2/de
Publication of DE69532333T3 publication Critical patent/DE69532333T3/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen zum Bekämpfen von Pflanzenschädlingen und Nichtpflanzenschädlingen. Insbesondere werden neue pestizide Proteine beschrieben, die aus dem vegetativen Wachstumsstadium von Bacillus isoliert werden können. Es werden Bacillus-Stämme, -proteine und -gene, die für die Proteine codieren, bereitgestellt. Die erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen können in verschiedenen Systemen zum Bekämpfen von Pflanzenschädlingen und Nichtpflanzenschädlingen verwendet werden.
  • Schadinsekten stellen einen wichtigen Faktor beim Verlust der wichtigsten Agrarmarktprodukte der Welt dar. Für die Bekämpfung oder Vernichtung von landwirtschaftlich wichtigen Schädlingen wurden in großem Ausmaß chemische Breitspektrumpestizide eingesetzt. Es besteht jedoch ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung von wirksamen alternativen Pestiziden.
  • Mikrobielle Pestizide haben als Alternativen zur chemischen Schädlingsbekämpfung eine wichtige Rolle gespielt. Das am häufigsten eingesetzte mikrobielle Produkt beruht auf dem Bakterium Bacillus thuringiensis (Bt). Bei Bt handelt es sich um einen grampositiven sporenbildenden Bacillus, der während der Sporulation ein insektizides Kristallprotein (ICP) produziert.
  • Von zahlreichen Bt-Varietäten ist bekannt, dass sie mehr als 25 unterschiedliche, jedoch miteinander verwandte ICPs produzieren. Die meisten von Bt produzierten ICPs sind für die Larven von bestimmten Insekten der Gattungen Lepidoptera, Diptera und Coleoptera toxisch. Im Allgemeinen wird, wenn ein ICP von einem anfälligen Insekt aufgenommen wird, der Kristall solubilisiert und durch die Darmproteasen des Insekts in ein toxisches Molekül umgewandelt. Keine der gegen Coleoptera-Larven, wie Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) oder Gemeiner Mehlkäfer (Tenebrio molitor) wirksamen ICPs weisen eine nennenswerte Wirkung auf Mitglieder der Gattung Diabrotica, insbesondere Diabrotica virgifera virgifera, den Westlichen Maiswurzelbohrer (Western Corn Rootworm, WCRW), oder gegen Diabrotica longicornis barberi, den Nördlichen Maiswurzelbohrer, auf.
  • Bacillus cereus (Bc) ist mit Bt eng verwandt. Ein wesentliches unterscheidendes Merkmal ist das Fehlen eines parasporalen Kristalls bei Bc. Bei Bc handelt es sich um ein weit verbreitetes Bakterium, das häufig im Boden auftritt und aus verschiedenen Nahrungsmitteln und Arzneistoffen isoliert worden ist. Dem Organismus wurde eine Rolle beim Verderb von Nahrungsmitteln zugewiesen.
  • Obwohl Bt bei der Bekämpfung von Schadinsekten sehr nützlich ist, besteht ein Bedarf darin, die Anzahl der möglichen biologischen Bekämpfungsmittel zu erhöhen.
  • Mit der vorliegenden Erfindung werden Zusammensetzungen und Verfahren für die Bekämpfung von Pflanzenschädlingen bereitgestellt. Insbesondere werden neue pestizide Proteine bereitgestellt, die während des vegetativen Wachstums von Bacillus-Stämmen produziert werden. Die Proteine eignen sich als pestizide Mittel.
  • Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung einen im Wesentlichen aufgereinigten Bacillus-Stamm, der während des vegetativen Wachstums ein pestizides Protein produziert, wobei es sich bei dem Bacillus nicht um B. sphaericus SSII-1 handelt. Bevorzugt sind Bacillus thuringiensis-Stämme mit den Eintragsnummern NRRL B-21225 und NRRL B-21439.
  • Der allgemeine Stand der Technik der Erfindung betrifft weiterhin ein insektenspezifisches Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp., jedoch vorzugsweise eines Bacillus thuringiensis- und B. cereus-Stamms, isoliert werden kann, sowie Bestandteile dieses Proteins, wobei es sich bei dem Protein nicht um das moskitozide Toxin aus B. sphaericus SSII-1 handelt. Vorzugsweise ist das insektenspezifische Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung für Coleoptera- oder Lepidoptera-Insekten toxisch und weist ein Molekulargewicht von ungefähr 30 kDa oder mehr, vorzugsweise von ungefähr 60 bis ungefähr 100 kDa und stärker bevorzugt von ungefähr 80 kDa auf.
  • Genauer gesagt weist das insektenspezifische Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung ein insektizides Wirkungsspektrum auf, zu dem eine Wirksamkeit gegen Agrotis- und/oder Spodoptera-Arten zählt, jedoch vorzugsweise eine Wirksamkeit gegen die Ypsiloneule [Agrotis ipsilon; Black Cutworm, BCW] und/oder gegen den Heerwurm [Spodoptera frugiperda] und/oder gegen die Zuckerrübeneule [Spodoptera exigua] und/oder gegen die Amerikanische Tabakknospeneule und/oder gegen den Amerikanischen Baumwollkapselwurm [Helicoverpa zea].
  • Das insektenspezifische Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung kann vorzugsweise aus einem Bacillus spp-Stamm, ausgewählt aus den Eintragsnummern NRRL B-21225 und NRRL B-21439, isoliert werden.
  • Bevorzugt wird ein insektenspezifisches Protein, wobei das Protein die Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5, aufweist, einschließlich Proteine, die dazu strukturell und/oder funktionell homolog sind.
  • Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung umfasst ein insektenspezifisches Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung, wobei die Sequenzen, die das Sekretionssignal darstellen, entfernt oder inaktiviert worden sind.
  • Der allgemeine Stand der Technik der vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin multimere pestizide Proteine, die mehr als eine Polypeptidkette umfassen und wobei mindestens eine der Polypeptidketten ein insektenspezifisches Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung darstellt und mindestens eine der Polypeptidketten ein Hilfsprotein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung, das die pestizide Wirksamkeit des insektenspezifischen Proteins aktiviert oder verstärkt, darstellt.
  • Die multimeren pestiziden Proteine des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung weisen vorzugsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa bis ungefähr 200 kDa auf.
  • Der allgemeine Stand der Technik der vorliegenden Erfindung betrifft weiterhin Fusionsproteine, die mehrere Proteindomänen umfassen, die mindestens ein insektenspezifisches Protein des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung beinhalten, die, wenn sie von Ribosomen translatiert werden, zu einem Fusionsprotein mit mindestens den kombinierten Eigenschaften des insektenspezifischen Proteins des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung und gegebenenfalls der anderen in der Fusion verwendeten Komponenten führen.
  • Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung bedeutet eine wesentliche Sequenzhomologie eine enge Strukturverwandschaft zwischen Sequenzen von Aminosäuren. So zum Beispiel können im Wesentlichen homologe Proteine zu 40% homolog sein, vorzugsweise zu 50% und am meisten bevorzugt zu 60% oder zu 80% oder mehr homolog sein. Homologie beinhaltet auch ein Verhältnis, in dem eine oder mehrere Untersequenzen von Aminosäuren fehlen, oder Untersequenzen mit zusätzlichen Aminosäuren dazwischen vorkommen.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, das für ein insektenspezifisches Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp. isoliert werden kann und Komponenten davon codiert, wobei es sich bei dem Protein nicht um das moskitozide Toxin aus B. spaericus SSII-1 handelt. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, wobei das insektizide Wirkungsspektrum eine Wirkung gegen Agrotis- und/oder Spodoptera-Arten, jedoch vorzugsweise eine Wirksamkeit gegen die Ypsiloneule [Agrotis ipsilon; Black Cutworm, BCW] und/oder gegen den Heerwurm [Spodoptera frugiperda] und/oder gegen die Zuckerrübeneule [Spodoptera exigua] und/oder gegen die Amerikanische Tabakknospeneule und/oder gegen den Amerikanischen Baumwollkapselwurm [Helicoverpa zea] beinhaltet.
  • Bevorzugt ist ein DNA-Molekül, wobei das Molekül eine Nukleotidsquenz wie in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 4 umfasst, einschließlich DNA-Moleküle, die strukturell und/oder funktionell dazu homolog sind.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein insektenspezifisches Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp. isoliert werden kann, und Komponenten davon, codiert, wobei es sich bei dem Protein nicht um das moskitozide Toxin aus B. sphaericus SSII-1 handelt, wobei die Nukleotidsequenz für die Expression in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze optimiert worden ist.
  • Bevorzugt wird ein DNA-Molekül, wobei das Molekül eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 30 umfasst, einschließlich DNA-Moleküle, die strukturell und/oder funktionell homolog dazu sind.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein multimeres pestizides Protein codiert, das mehr als eine Polypeptidkette umfasst und wobei mindestens eine der Polypeptidketten ein insektenspezifisches Protein der Erfindung darstellt und mindestens eine der Polypeptidketten ein Hilfsprotein gemäß der Erfindung, das die pestizide Wirksamkeit des insektenspezifischen Proteins aktiviert oder verstärkt, darstellt.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein codiert, das mehrere Proteindomänen umfasst, einschließlich mindestens ein insektenspezifisches Protein der Erfindung, das durch leserastergerechte Genfusionen produziert wird, die, wenn sie von Ribosomen translatiert werden, zu einem Fusionsprotein mit mindestens den kombinierten Eigenschaften des insektenspezifischen Proteins der Erfindung und gegebenenfalls der anderen in der Fusion verwendeten Komponenten führen.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Fusionsprotein codiert, das ein insektenspezifisches Protein der Erfindung in Fusion mit einer Signalsequenz, vorzugsweise einer Sekretionssignalsequenz oder einer Zielsteuerungssequenz, die das Transgenprodukt an ein bestimmtes Organell oder Zellkompartiment adressiert, umfasst, wobei die Signalsequenz in Bezug auf die Empfänger-DNA heterologen Ursprungs ist.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, das für die Expression in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze optimiert worden ist, codiert.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein optimiertes DNA-Molekül, wobei die Sequenzen, die für das Sekretionssignal codieren, von seinem 5'-Ende entfernt worden sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung bedeutet eine wesentliche Sequenzhomologie eine enge Strukturverwandschaft zwischen Sequenzen von Nukleotiden. So zum Beispiel können im Wesentlichen homologe DNA-Moleküle zu 60% homolog sein, vorzugsweise zu 80% und am meisten bevorzugt zu 90% oder zu 95% oder mehr homolog sein. Homologie beinhaltet auch ein Verhältnis, in dem eine oder mehrere Untersequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren fehlen, oder Untersequenzen mit zusätzlichen Nukleotiden oder Aminosäuren dazwischen vorkommen.
  • Ebenfalls umfasst von der vorliegenden Erfindung sind DNA-Moleküle, die an ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül wie oben definiert, jedoch vorzugsweise an eine Oligonukleotidsonde, die aus dem DNA-Molekül erhältlich ist, umfassend einen ununterbrochenen Abschnitt der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden, unter mäßig stringenten Bedingungen hybridisieren, und wobei diese Moleküle eine insektenspezifische Wirksamkeit aufweisen, sowie die von den DNA-Molekülen codierten insektenspezifischen Proteine.
  • Bevorzugt werden DNA-Moleküle, bei denen die Hybridisierung bei 65°C in einem Puffer, der 7% SDS und 0,5 M Natriumphosphat umfasst, stattfindet.
  • Besonders bevorzugt wird ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein codiert und das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Folgendes umfasst:
    • a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nukleotidsequenz, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, umfasst; und
    • b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonukleotidsonde gemäß Anspruch 107, erhältlich von einem DNA-Molekül, umfassend eine Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 definiert; und
    • c) Isolieren der hybridisierten DNA.
  • Der allgemeine Stand der Technik der Erfindung betrifft weiterhin ein insektenspezifisches Protein, wobei das Protein von einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül codiert wird.
  • Ebenfalls umfasst von der Erfindung ist eine Expressionskassette, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül in operativer Verknüpfung mit Expressionssequenzen einschließlich den für die Expression der assoziierten DNA-Konstrukte in einem Wirtsorganismus, vorzugsweise einem Mikroorganismus oder einer Pflanze, erforderlichen Transkriptions- und Translationsregulationssignalen, und gegebenenfalls weiteren Regulationssequenzen.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Vektormolekül, umfassend eine erfindungsgemäße Expressionskassette.
  • Die erfindungsgemäße Expressionskassette und/oder das erfindungsgemäße Vektormolekül sind vorzugsweise Bestandteil des Pflanzengenoms.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Wirtsorganismus, vorzugsweise einen Wirtsorganismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren, Protozoen, Nematoden und Algen, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül, eine Expressionskassette, umfassend das DNA-Molekül oder ein Vektormolekül, umfassend die Expressionskassette, vorzugsweise stabil in das Genom des Wirtsorganismus integriert.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine transgene Pflanze, jedoch vorzugsweise eine Maispflanze, einschließlich Teile sowie Nachkommen und Samen davon, die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül umfasst/umfassen, eine Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder ein Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, und zwar vorzugsweise stabil in das pflanzliche Genom eingebaut.
  • Bevorzugt wird eine transgene Pflanze einschließlich Teile sowie Nachkommen und Samen davon, die stabil mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einem Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, transformiert worden ist/sind.
  • Ebenfalls bevorzugt ist eine transgene Pflanze, einschließlich Teile sowie Nachkommen und Samen davon, die ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein exprimiert/exprimieren.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin eine erfindungsgemäße transgene Pflanze, vorzugsweise eine Maispflanze, wie oben definiert, die weiterhin ein zweites unterschiedliches Insektenbekämpfungsprinzip, jedoch vorzugsweise ein Bto-Endotoxin, exprimiert. Die Pflanze ist vorzugsweise eine Hybridpflanze.
  • Teile von transgenen Pflanzen sollen im Zusammenhang mit der Erfindung zum Beispiel Pflanzenzellen, Protoplasten, Gewebe, Kallus, Embryonen sowie auch Blüten, Stängel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die aus transgenen Pflanzen oder ihrer zuvor mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül transformierten Nachkommen stammen, umfassen und bestehen daher zumindest teilweise aus transgenen Zellen, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin pflanzliches Vermehrungsmaterial einer erfindungsgemäßen Pflanze, das mit einer das Saatgut schützenden Beschichtung behandelt ist.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin einen Mikroorganismus, der mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einem Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, transformiert worden ist, wobei es sich bei dem Mikroorganismus vorzugsweise um einen Mikroorganismus handelt, der sich auf Pflanzen vermehrt, stärker bevorzugt um ein wurzelkolonisierendes Bakterium.
  • Eine weitere Ausführungsform des Stands der Technik der Erfindung betrifft ein verkapseltes insektenspezifisches Protein, das einen Mikroorganismus umfasst, der ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein umfasst.
  • Der allgemeine Stand der Technik der Erfindung betrifft auch eine entomozide Zusammensetzung, umfassend einen erfindungsgemäßen Wirtsorganismus, jedoch vorzugsweise einen aufgereinigten Bacillus-Stamm, in einer insektizid wirksamen Menge, gemeinsam mit einem geeigneten Träger.
  • Der allgemeine Stand der Technik der Erfindung betrifft weiterhin eine entomozide Zusammensetzung, die ein erfindungsgemäßes isoliertes Protein allein oder in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Wirtsorganismus und/oder ein verkapseltes erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein in einer insektizid wirksamen Menge, gemeinsam mit einem geeigneten Träger, umfasst.
  • Eine weitere Ausführungsform des Stands der Technik der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten eines aufgereinigten erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteins, wobei das Verfahren umfasst, dass man eine Lösung, die das insektenspezifische Protein umfasst, auf eine NAD-Säule aufträgt und gebundenes Protein eluiert.
  • Ebenfalls umfasst vom allgemeinen Stand der Technik der Erfindung ist ein Verfahren zum Identifizieren von Insektenaktivität eines erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteins, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    Züchten eines Bacillus-Stamms in einer Kultur;
    Gewinnen des Überstands von der Kultur;
    Insektenlarven eine Nahrung mit dem Überstand aufnehmen lassen; und
    Bestimmen der Mortalität.
  • Ein weiterer Aspekt des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren eines erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteins, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    Züchten eines Bacillus-Stamms in einer Kultur;
    Gewinnen des Überstands von der Kultur; und
    Isolieren des insektenspezifischen Proteins aus dem Überstand.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Isolieren eines DNA-Moleküls, das eine Nukleotidsequenz, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, das die insektizide Aktivität des erfindungsgemäßen Proteins aufweist, umfasst, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
    Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nukleotidsequenz, die für ein insektenspezifisches Protein codiert, umfasst; und
    Hybridisieren des DNA-Moleküls mit aus einer Bacillus-Art gewonnener DNA; und
    Isolieren der hybridisierten DNA.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Erweiterung des Zielinsektenspektrums durch Verwendung eines erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteins in Kombination mit mindestens einem zweiten insektiziden Protein, das sich von dem erfindungsgemäßen insektenspezifischen Protein unterscheidet, jedoch vorzugsweise mit einem insektiziden Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bt-o-Endotoxinen, Proteasehemmern, Lectinen, alpha-Amylasen und Peroxidasen.
  • Bevorzugt wird ein Verfahren zur Erweiterung des Zielinsektenspektrums bei einer Pflanze durch Exprimieren eines erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteins in Kombination mit mindestens einem zweiten insektiziden Protein, das sich von dem erfindungsgemäßen insektenspezifischen Protein unterscheidet, jedoch vorzugsweise mit einem insektiziden Protein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bt-o-Endotoxinen, Proteasehemmern, Lectinen, a-Amylasen und Peroxidasen, in der Pflanze.
  • Ebenfalls umfasst ist ein Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen durch ein Schadinsekt, jedoch vorzugsweise durch Spodoptera- und/oder Agrotis-Arten, und stärker bevorzugt durch ein Schadinsekt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ypsiloneule [Agrotis ipsilon; Black Cutworm, BCW], Heerwurm [Spodoptera frugiperda], Zuckerrübeneule [Spodoptera exigua], Amerikanischer Tabakknospeneule und Amerikanischem Baumwollkapselwurm [Helicoverpa zea], verursachten Schaden, bei dem man eine erfindungsgemäße entomozide Zusammensetzung oder ein erfindungsgemäßes Toxinprotein auf die Pflanze oder die Kulturfläche der Pflanze ausbringt.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen durch ein Schadinsekt, jedoch vorzugsweise durch Spodoptera- und/oder Agrotis-Arten, und stärker bevorzugt durch ein Schadinsekt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ypsiloneule [Agrotis ipsilon; Black Cutworm, BCW], Heerwurm [Spodoptera frugiperda], Zuckerrübeneule [Spodoptera exigua], Amerikanischer Tabakknospeneule und Amerikanischem Baumwollkapselwurm [Helicoverpa zea], verursachten Schaden, bei dem man eine transgene Pflanze, die ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein exprimiert, in einem Gebiet, in dem das Schadinsekt vorkommen kann, anpflanzt.
  • Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Erzeugung eines Wirtsorganismus, der ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül stabil in sein Genom integriert umfasst und vorzugsweise ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein exprimiert, bei dem man den Wirtsorganismus mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einem Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, transformiert.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen einer transgenen Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein erfindungsgemäßes DNA-Molekül stabil in das Pflanzengenom integriert umfasst und vorzugsweise ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein exprimiert, bei dem man die Pflanze bzw. Pflanzenzelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einem Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, transformiert.
  • Der allgemeine Stand der Technik der Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Herstellen einer entomoziden Zusammensetzung, bei dem man einen isolierten Bacillus-Stamm und/oder einen Wirtsorganismus und/oder ein isoliertes Proteinmolekül und/oder ein verkapseltes Protein gemäß der Erfindung in einer insektizid wirksamen Menge mit einem geeigneten Träger vermischt.
  • Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen von transgenen Nachkommen einer transgenen Elternpflanze, die ein DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein erfindungsgemäßes insektenspezifisches Protein codiert, stabil in das Pflanzengenom eingebaut umfasst, bei dem man die Elternpflanze mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül, einer Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einem Vektormolekül, das die Expressionskassette umfasst, transformiert und das pestizide Merkmal unter Einsatz von bekannten Pflanzenzüchtungstechniken auf die Nachkommen der transgenen Elternpflanze überträgt.
  • Ebenfalls umfasst von der Erfindung ist eine Oligonukleotidsonde, die spezifisch mit einer Nukleotidsequenz, die für ein während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp. isolierbares insektenspezifisches Protein codiert, und Bestandteilen davon zu hybridisieren vermag, wobei es sich bei dem Protein nicht um das moskitozide Toxin aus B. sphaericus 8811-1 handelt, wobei die Sonde einen durchgehenden Abschnitt der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden umfasst, sowie die Verwendung der Oligonukleotidsonde zum Screenen von einem beliebigen Bacillus-Stamm oder anderen Organismen, um zu bestimmen, ob das insektenspezifische Protein auf natürliche Weise vorhanden ist oder ob ein bestimmter transformierter Organismus das Gen beinhaltet.
  • Die vorliegende Erfindung nimmt zur Kenntnis, dass pestizide Proteine während des vegetativen Wachstums von Bacillus-Stämmen produziert werden, sie werden im Folgenden als VIPs bezeichnet.
  • Die vorliegenden VIPs treten nach der Sporulation nicht in großen Mengen auf und werden insbesondere während des Wachstums in der log-Phase vor der stationären Phase exprimiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird vegetatives Wachstum als der Zeitraum vor dem Sporulationsbeginn definiert. Gene, die für solche VIPs codieren, können isoliert, kloniert und in verschiedene Abgabevehikel für die Verwendung in Schädlingsbekämpfungsprogrammen hineintransformiert werden.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung zählen zu den Schädlingen, jedoch ohne Einschränkung, Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden, Milben, Zecken, Protozoa-Pathogene, tierparasitäre Leberegel und dergleichen. Zu den Schadinsekten zählen Insekten, ausgewählt aus den Ordnungen Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera usw., insbesondere Coleoptera und Lepidoptera.
  • In den Tabellen 1–10 ist eine Aufzählung von Schädlingen, die mit Hauptkulturpflanzen assoziiert sind, sowie Schädlingen, die im Human- und Veterinärbereich wichtig sind, angeführt. Diese Schädlinge sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung umfasst. TABELLE 1
    Lepidoptera (Falter)
    Mais
    Ostrinia nubilalis, Maiszünsler
    Agrotis ipsilon, Ypsiloneule
    Helicoverpazea, Amerikanischer
    Bauwollkapselwurm
    Spodoptera frugiperda, Heerwurm
    Diatraea grandiosella, Southwestern Corn Borer
    Elasmopalpus lignosellus, Kleiner Maisstängelbohrer
    Diatraea saccharalis, Amerikanischer
    Zuckerrohrbohrer
    Sorghum
    Chilo partellus, Sorghumbohrer
    Spodoptera frugiperda, Heerwurm
    Helicoverpa zea, Amerikanischer
    Bauwollkapselwurm
    Elasmopalpus lignosellus, Kleiner Maisstängelbohrer
    Feltia subterranea, Granulate Cutworm
    Weizen
    Pseudaletia unipunctata, Amerikanische Reiseule
    Spodoptera frugiperda, Heerwurm
    Elasmopalpus lignosellus, Kleiner Maisstängelbohrer
    Agrotis orthogonia, Pale Western Cutworm
    Elasmopalpus lignosellus, Kleiner Maisstängelbohrer
    Sonnenblume
    Suleima helianthana, Sunflower Bud Moth
    Homoeosoma electellum, Amerikanische
    Sonnenblumenmotte
    Baumwolle
    Heliothis virescens, Amerikanische
    Tabakknospeneule
    Helicoverpa zea, Amerikanischer
    Baumwollkapselwurm
    Spodoptera exigua, Zuckerrübeneule
    Pectinophora gossypiella, Roter Baumwollkapselwurm
    Reis
    Diatraea saccharalis, Amerikanischer
    Zuckerrohrbohrer
    Spodoptera frugiperda, Heerwurm
    Helicoverpa zea, Amerikanischer
    Baumwollkapselwurm
    Sojabohne
    Pseudoplusia includens, Soybean Looper
    Anticarsia gemmatalis Velvetbean Caterpillar
    Plathypena scabra Green Cloverworm
    Ostrinia nubilalis Maiszünsler
    Agrotis ipsilon Ypsiloneule
    Lepidoptera (Falter)
    Sojabohne
    Spodoptera exigua, Zuckerrübeneule
    Heliothis virescens, Amerikanische
    Tabakknospeneule
    Helicoverpa zea, Amerikanischer
    Baumwollkapselwurm
    Gerste
    Ostrinia nubilalis, Maiszünsler
    Agrotis ipsilon, Ypsiloneule
    TABELLE 2
    Coleoptera (Käfer)
    Mais
    Diabrotica virgifera Westlicher Maiswurzelbohrer
    virgifera,
    Diabrotica longicornis Nördlicher Maiswurzelbohrer
    barberi,
    Diabrotica undecimpunctata Südlicher Maiswurzelbohrer
    howardi,
    Melanotus spp., Drahtwürmer
    Cyclocephala borealis, Northern Masked Chafer
    (Weiße Larve)
    Cyclocephala immaculata, Southern Masked Chafer
    (Weiße Larve)
    Popillia japonica, Japankäfer
    Chaetocnema pulicaria, Hopfenerdfloh
    Sphenophorus maidis, Maize Billbug
    Sorghum
    Phyllophaga crinita Weiße Larve
    Elendes, Conoderus und Drahtwürmer
    Aeolus spp.
    Oulema melanopus, Rothalsiges
    Getreidehähnchen
    Chaetocnema pulicaria, Hopfenerdfloh
    Sphenophorus maidis, Maize Billbug
    Weizen
    Oulema melanopus, Rothalsiges
    Getreidehähnchen
    Hypera punctata, Kleeblattnager
    Diabrotica undecimpunctata Südlicher Maiswurzelbohrer
    howardi,
    Sonnenblume
    Zygogramma exclamationis Sonnenblumenkäfer
    Bothyrus gibbosus, Carrot Beetle
    Baumwolle,
    Anthonomus grandis, Mexikanischer
    Baumwollkapselkäfer
    Reis
    Colaspis Brunnea, Grape Colaspis
    Lissorhopturs oryzophilus, Amerikanischer
    Reisrüsselkäfer
    Sitophilus oryzae Reisrüssler
    Sojabohne
    Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer
    TABELLE 3
    Homoptera (Weiße-Fliege-Arten, Blattläuse usw.)
    Mais
    Rhopalosiphum maidis, Grüne Maisblattlaus
    Anuraphis maidiradicis, Corn Root Aphid
    Sorghum
    Rhopalosiphum maidis, Grüne Maisblattlaus
    Sipha flava Yellow Sugarcane Aphid
    Weizen
    Russische Getreideblattlaus
    Schizaphis graminum, Grüne Getreideblattlaus
    Macrosiphum avenae, Kleine Getreideblattlaus
    Baumwolle
    Aphis gossypii, Grüne Baumwollblattlaus
    Pseudatomoscelis seriatus, Cotton Fleahopper
    Trialeurodes abutilonea, Bandedwinged Whitefly
    Reis
    Nephotettix nigropictus, Grüne Reiszikade
    Sojabohne
    Myzus persicae, Grüne Pfirsichblattlaus
    Empoasca fabae, Amerikanische
    Kartoffelzikade
    Gerste
    Schizaphis graminum, Grüne Getreideblattlaus
    Raps
    Brevicoryne brassicae, Mehlige Kohlblattlaus
    TABELLE 4
    Hemiptera (Schnabelkerfe)
    Mais
    Blissus leucopterus Chinchbug
    leucopterus,
    Sorghum
    Blissus leucopterus Chinchbug
    leucopterus,
    Baumwolle
    Lygus lineolaris, Tarnished Plantbug
    Reis
    Blissus leucopterus Chinchbug
    leucopterus,
    Acrosternum hilare, Green Stink Bug
    Sojabohne
    Acrosternum hilare, Green Stink Bug
    Gerste
    Blissus leucopterus Chinchbug
    leucopterus,
    Acrosternum hilare, Green Stink Bug
    Euschistus servus, Brown Stink Bug
    TABELLE 5
    Orthoptera (Heuschrecken, Grillen und Schaben)
    Mais
    Melanoplus femurrubrum, Redlegged Grasshopper
    Melanoplus sanguinipes, Migratory Grasshopper
    Weizen
    Melanoplus femurrubrum, Redlegged Grasshopper
    Melanoplus differentialis, Differential Grasshopper
    Melanoplus sanguinipes, Migratory Grasshopper
    Baumwolle
    Melanoplus femurrubrum, Redlegged Grasshopper
    Melanoplus differentialis, Differential Grasshopper
    Sojabohne
    Melanoplus femurrubrum, Redlegged Grasshopper
    Melanoplus differentialis, Differential Grasshopper
    Gebäude/Haushalt
    Periplaneta americana, Amerikanische Schabe
    Blatella germanica, Deutsche Schabe
    Blatta orientalis, Orientalische Schabe
    TABELLE 6
    Diptera (Fliegen und Mücken)
    Mais
    Hylemya platura, Bohnenfliege
    Agromyza parvicornis, Corn Blotch Leafminer
    Sorghum Amerikanische
    Contarinia sorghicola, Hirsegallmücke
    Weizen
    Mayetiola destructor, Hessenfliege
    Sitodiplosis mosellana, Orangerote Weizengallmücke
    Meromyza americana, Wheat Stem Maggot
    Hylemya coarctata, Brachfliege
    Sonnenblume
    Neolasioptera Sunflower Seed Midge
    murtfeldtiana,
    Sojabohne
    Hylemya platura, Bohnenfliege
    Gerste
    Hylemya platura Bohnenfliege,
    Mayetiola destructor, Hessenfliege
    Menschen und Tiere befallende Insekten und Krankheitsüberträger
    Aedes aegypti, Gelbfiebermücke
    Aedis albopictus, Forest Day Mosquito
    Phlebotomus papatasii, Sandfliege
    Musca domestica, Gemeine Stubenfliege
    Tabanus atratus, Black Horse Fly
    Cochliomyia hominivorax, Neuwelt-Schraubenwurmfliege
    TABELLE 7
    Thysanoptera (Thrips)
    Mais
    Anaphothrips obscurus, Grass Thrips
    Weizen
    Frankliniella fusca, Tabakblasenfuß
    Baumwolle
    Thrips tabaci, Tabakthrips
    Frankliniella fusca, Tabakblasenfuß
    Sojabohne
    Sericothrips variabilis, Soybean Thrips
    Thrips tabaci Tabakthrips
    TABELLE 8
    Hymenoptera (Blattwespen, Ameisen, Wespen usw.)
    Mais
    Solenopsis milesta, Thief Ant
    Weizen
    Cephus cinctus, Amerikanische
    Weizenhalmwespe
    TABELLE 9
    Weitere Ordnungen und Repräsentative Arten
    Dermaptera (Ohrwürmer)
    Forficula auricularia, Gemeiner Ohrwurm
    Isoptera (Termiten)
    Reticulitermes flavipes, Gelbfüßige Bodentermite
    Mallophaga (Haarlinge und Federlinge)
    Cuclotogaster heterographa Hühnerkopflaus
    Bovicola bovis, Rinderhaarling
    Anoplura (Echte Tierläuse)
    Pediculus humanus, Menschenlaus
    Siphonaptera (Flöhe)
    Ctenocephalides felis, Katzenfloh
    TABELLE 10
    Acari (Milben und Zecken)
    Mais
    Tetranychus urticae, Gemeine Spinnmilbe
    Sorghum
    Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilbe
    Tetranychusurticae, Gemeine Spinnmilbe
    Weizen
    Aceria tulipae, Tulpengallmilbe
    Baumwolle
    Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilbe
    Tetranychus urticae, Gemeine Spinnmilbe
    Sojabohne
    Tetranychus turkestani, Erdbeerspinnmilbe
    Tetranychus urticae, Gemeine Spinnmilbe
    Gerste
    Petrobia latens, Braune Weizenmilbe
    Wichtige Acari an Menschen und Tieren
    Demacentor variabilis, Amerikanische Hundezecke
    Argas persicus, Persische Lederzecke
    Dermatophagoides farinae, Amerikanische Milbe
    Dermatophagoides Europäische Milbe
    pteronyssinus,
  • Nun, da erkannt worden ist, dass pestizide Proteine aus der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus isoliert werden können, können andere Stämme mittels Standardtechniken isoliert und auf Wirksamkeit gegen bestimmte Pflanzenschädlinge und Nichtpflanzenschädlinge geprüft werden. Im Allgemeinen können Bacillus-Stämme nach fachbekannten Verfahren aus einer beliebigen Umweltprobe, darunter Boden, Pflanzen, Insekten, Staub von Getreideförderern und anderem Probenmaterial usw. isoliert werden; siehe z. B. Travers et al. (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53: 1263–1266; Saleh et al. (1969) Can. J. Microbiol. 15: 1101–1104; DeLucca et al. (1981) Can. J. Microbiol. 27: 865–870; und Norris, et al. (1981) „The genera Bacillus and Sporolactobacillus”, in Starr et al., (Hrsg.), The Prokaryotes: A Handbook an Habitats, Isolation, Identification of Bacteria, Bd. II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Nach dem Isolieren können die Stämme während des vegetativen Wachstums auf pestizide Wirksamkeit geprüft werden. Auf diese Weise können neue pestizide Proteine und Stämme identifiziert werden.
  • Zu Bacillus-Mikroorganismen, die in der Erfindung Verwendung finden, zählen Bacillus cereus und Bacillus thuringiensis sowie die in Tabelle 11 aufgezählten Bacillus-Arten.
  • TABELLE 11
  • Aufzählung von Bacillus-Arten
  • Morphologische Gruppe 1
    • B. megaterium
    • B. cereus*
    • B. cereus var. mycoides
    • B. thuringiensis*
    • B. licheniformis
    • B. subtilis*
    • B. pumilus
    • B. firmus*
    • B. coagulans
  • Morphologische Gruppe 2
    • B. polymyxa
    • B. macerans
    • B. circulans
    • B. stearothermophilus
    • B. alvei*
    • B. laterosporus*
    • B. brevis
    • B. pulvifaciens
    • B. popilliae*
    • B. lentimorbus*
    • B. larvae*
  • Morphologische Gruppe 3
    • B. sphaericus*
    • B. pasteurii
  • Nichtzugeordnete Stämme
  • Untergruppe A
    • B. apiarus*
    • B. filicolonicus
    • B. thiaminolyticus
    • B. alcalophilus
  • Untergruppe B
    • B. cirroflagellosus
    • B. chitinosporus
    • B. lentus
  • Untergruppe C
    • B. badius
    • B. aneurinolyticus
    • B. macroides
    • B. freundenreichii
  • Untergruppe D
    • B. pantothenticus
    • B. epiphytus
  • Untergruppe E1
    • B. aminovorans
    • * = Diese Bacillus-Stämme sind bereits in Assoziation mit Insekten gefunden worden; Gruppierung gemäß Parry, J. M. et al. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, London
    • B. globisporus
    • B. insolitus
    • B. psychrophilus
  • Untergruppe E2
    • B. psychrosaccharolyticus
    • B. macquariensis
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können die während des vegetativen Wachstums produzierten pestiziden Proteine aus Bacillus isoliert werden. In einer Ausführungsform können während des vegetativen Wachstums produzierte insektizide Proteine isoliert werden. Verfahren zur Isolation von Proteinen sind fachbekannt. Im Allgemeinen können Proteine durch traditionelle Chromatographie, darunter Gelfiltrationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie und Immunaffinitätschromatographie, durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie, wie Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Ionenaustausch-Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Größenausschluss-Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Hochleistungs-Chromatofokusierung, Hydrophobinteraktionschromatographie usw., durch elektrophoretische Trennung, wie eindimensionale Geleelektrophorese, zweidimensionale Gelelektrophorese usw. gereinigt werden. Solche Verfahren sind fachbekannt; siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Band 1 und 2, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, NY (1988). Außerdem können Antikörper gegen im Wesentlichen reine Proteinpräparate erzeugt werden; siehe zum Beispiel Radka et al. (1983) J. Immunol. 128: 2804; und Radka et al. (1984) Immunogenetios 19: 63. Zum Reinigen von Protein mit pestiziden Eigenschaften kann jede beliebige Kombination von Verfahren eingesetzt werden. Während der Formulierung der Vorschrift wird die pestizide Wirksamkeit nach jedem Reinigungsschritt bestimmt.
  • Durch solche Reinigungsschritte wird man zu einer im Wesentlichen gereinigten Proteinfraktion gelangen. Unter „im Wesentlichen gereinigt” oder „im Wesentlichen rein” soll Protein verstanden werden, das im Wesentlichen von irgendeiner Verbindung, die normalerweise mit dem Protein in seinem natürlichen Zustand assoziiert ist, frei ist. „Im Wesentlichen reine” Proteinpräparate können aufgrund des Fehlens von anderen nachweisbaren Proteinbanden nach SDS-PAGE aufgrund von visueller Betrachtung oder Densitometrie-Scanning beurteilt werden. Als Alternative kann die Abwesenheit von anderen aminoterminalen Sequenzen oder N-terminalen Resten in einem gereinigten Präparat das Reinheitsniveau angeben. Die Reinheit kann durch erneutes Chromatographieren von „reinen” Präparaten, die die Abwesenheit von anderen Peaks durch Ionenaustausch, Umkehrphase oder Kapillarelektrophorese zeigen, überprüft werden. Die Begriffe „im Wesentlichen rein” oder „im Wesentlichen gereinigt” sollen künstliche oder synthetische Mischungen der Proteine mit anderen Verbindungen nicht ausschließen. Außerdem sollen die Begriffe nicht das Vorhandensein von kleineren Verunreinigungen, die die biologische Wirksamkeit des Proteins nicht stören und die zum Beispiel aufgrund von unvollständiger Reinigung vorliegen können, ausschließen.
  • Sobald gereinigtes Protein isoliert worden ist, kann das Protein bzw. können die Polypeptide, aus denen es besteht, nach fachbekannten standardmäßigen Verfahren charakterisiert und sequenziert werden. So kann zum Beispiel das gereinigte Protein bzw. können die Polypeptide, aus denen es besteht, abgebaut werden, zum Beispiel mit Bromcyan oder mit Proteasen wie Papain, Chymotrypsin, Trypsin, Lysyl-C-Endopeptidase usw. (Oike et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 9751–9758; Liu et al. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209–215). Die entstandenen Peptide werden getrennt, vorzugsweise mittels HPLC, oder durch Auftrennung von Gelen und Elektroblotting auf PVDF-Membranen und einer Aminosäuresequenzierung unterzogen. Zu diesem Zweck werden die Peptide vorzugsweise mit automatischen Sequenzern analysiert. Es ist bekannt, dass N-terminale, C-terminale oder interne Aminosäuresequenzen bestimmt werden können. Aus der Aminosäuresequenz des gereinigten Proteins kann eine Nukleotidsequenz synthetisiert werden, die als Sonde zur Unterstützung beim Isolieren des Gens, das für das pestizide Protein codiert, verwendet werden kann.
  • Es ist bekannt, dass pestizide Proteine oligomer sein können und dass ihr Molekulargewicht, die Anzahl ihrer Protomere, Peptidbestandteile, ihre Wirksamkeit gegen bestimmte Schädlinge und andere Eigenschaften unterschiedlich sein können. Mit den im vorliegenden Text beschriebenen Verfahren können jedoch Proteine mit Wirksamkeit gegen verschiedene Schädlinge isoliert und charakterisiert werden.
  • Sobald das gereinigte Protein isoliert und charakterisiert worden ist, ist bekannt, dass es auf verschiedene Art und Weise verändert werden kann, darunter mit Aminosäuresubstitutianen, Delektionen, Verkürzungen und Insertionen. Verfahren für solche Vorgangsweisen sind allgemein fachbekannt. So können zum Beispiel Aminosäuresequenzvarianten der pestiziden Proteine mittels Mutationen in der DNA erzeugt werden. Solche Varianten werden die gewünschte pestizide Wirksamkeit aufweisen. Es ist klar, dass Mutationen, die in der für die Variante codierenden DNA erfolgen, die Sequenz nicht aus dem Leseraster entfernen dürfen und vorzugsweise keine komplementären Regionen, die zu einer sekundären mRNA-Struktur führen könnten, erzeugen werden; siehe EP-Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 75,444 .
  • Auf diese Weise umfasst der allgemeine Stand der Technik der vorliegenden Erfindung die pestiziden Proteine sowie Bestandteile und Fragmente davon. Es ist bekannt, dass Protomer-, Polypeptid- oder Fragmentbestandteile der Proteine erzeugt werden können, bei denen eine pestizide Wirksamkeit erhalten bleibt. Zu diesen Fragmenten zählen verkürzte Sequenzen sowie N-terminale, C-terminale, interne und intern deletierte Aminosäuresequenzen der Proteine.
  • Von den meisten Deletionen, Insertionen und Substitutionen der Proteinsequenz wird nicht erwartet, dass sie zu radikalen Veränderungen der Eigenschaften des pestiziden Proteins führen werden. Ist es jedoch schwierig, die präzise Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor Durchführung derselben vorherzusagen, so ist dem Fachmann klar, dass die Wirkung mit routinemäßigen Screening-Assays ausgewertet werden wird.
  • Die im vorliegenden Text beschriebenen Proteine oder anderen Polypeptidbestandteile können allein oder in Kombination eingesetzt werden. Das heißt, dass mehrere Proteine für die Bekämpfung von unterschiedlichen Schadinsekten verwendet werden können.
  • Bei manchen Proteinen handelt es sich um einzelne Polypeptidketten, während viele Proteine aus mehr als einer Polypeptidkette bestehen, d. h. oligomer sind. Außerdem sind manche VIPs als Oligomere pestizid wirksam. In diesen Fällen werden zusätzliche Protomere eingesetzt, um die pestizide Wirksamkeit zu verstärken oder um pestizide Proteine zu aktivieren. Diese Protomere, die verstärken oder aktivieren, werden als Hilfsproteine bezeichnet. Hilfsproteine aktivieren oder verstärken ein pestizides Protein durch Interaktion mit dem pestiziden Protein unter Bildung eines oligomeren Proteins mit einer erhöhten pestiziden Wirksamkeit im Vergleich zu derjenigen, die bei Abwesenheit des Hilfsproteins beobachtet wird.
  • Überraschenderweise konnte unter den pestiziden Proteinen des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung innerhalb des Umfangs des allgemeinen Stands der vorliegenden Erfindung eine neue Klasse von insektenspezifischen Proteinen identifiziert werden. Diese Proteine, die in der vorliegenden Anmeldung VIP3 genannt werden, sind aus Stämmen von Bacillus spp. erhältlich, jedoch vorzugsweise aus Bacillus-thuringiensis-Stämmen und am stärksten bevorzugt aus den Bacillus-thuringiensis-Stämmen AB88 und AB424. Diese VIPs liegen hauptsächlich in den Überständen von Bacillus-Kulturen vor und machen mindestens 75% insgesamt des Stamms AB88 aus. Die VIP3-Proteine sind weiterhin durch ihr einzigartiges insektizides Wirksamkeitsspektrum gekennzeichnet, zu dem eine Wirksamkeit gegen Agrotis- und/oder Spodoptera-Arten, jedoch insbesondere eine Aktivität gegen die Ypsiloneule [BCW] und/oder gegen den Heerwurm und/oder gegen die Zuckerrübeneule und/oder gegen die Amerikanische Tabakknospeneule und/oder gegen den Amerikanischen Baumwollkapselwurm, zählt.
  • Bei der Ypsiloneule handelt es sich um ein agronomisch wichtiges Insekt, das gegenüber δ-Endotoxinen ziemlich resistent ist. Von Macintosh et al. (1990) J. Invertebr. Pathol. 56, 258–266 wird berichtet, dass die δ-Endotoxine CryIA(b) und CryIA(c) insektizide Eigenschaften gegen BCW aufweisen, und zwar mit LC50-Werten von mehr als 80 μg bzw. 18 μg/ml Nahrung. Die erfindungsgemäßen insektiziden vip3A-Proteine führen bei Zugabe in einer Proteinmenge von mindestens 10- bis 500-, vorzugsweise 50- bis 350- und stärker bevorzugt 200- bis 300-mal weniger als die für die Erzielung von nur 50% Mortalität erforderliche Menge an CryIA-Proteinen zu einer Mortalität von > 50%. Insbesondere bevorzugt im Rahmen des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung sind insektizide vip3A-Proteine, die, wenn sie in einer Proteinmenge von mindestens 260-mal weniger als die für die Erzielung von nur 50% Mortalität erforderliche CryIA-Proteinmenge zugegeben werden, zu einer Mortalität von 100% führen.
  • Die insektiziden vip3-Proteine gemäß dem allgemeinen Stand der Technik der Erfindung liegen in erster Linie in den Überständen der Kulturen vor und sind daher als sezernierte Proteine zu klassifizieren. In der N-terminalen Sequenz enthalten sie vorzugsweise mehrere positiv geladene Reste und im Anschluss daran eine hydrophobe Core-Region und werden während des Exports nicht N-terminal prozessiert.
  • Wie die anderen pestiziden Proteine, die innerhalb des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung erwähnt wurden, können die VIP3-Proteine in Wachstumsstadien vor der Sporulation nachgewiesen werden, was einen weiteren deutlichen Unterschied zu anderen Proteinen, die zur Familie der δ-Endotoxine gehören, darstellt. Vorzugsweise beginnt die Expression des insektenspezifischen Proteins während der mittleren log-Phase und erstreckt sich über die Sporulation. Aufgrund des spezifischen Expressionsmusters in Kombination mit der hohen Stabilität der VIP3-Proteine finden sich die VIP3-Proteine in großen Mengen in den Überständen von sporulierenden Kulturen. Besonders bevorzugt sind die VIP3-Proteine, die in SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 5 identifiziert sind, und die entsprechenden DNA-Moleküle, die Nukleotidsequenzen umfassen, die für diese Proteine codieren, jedoch insbesondere die DNA-Moleküle, die die in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 und SEQ ID NO: 4 angegebenen Nukleotidsequenzen umfassen.
  • Die pestiziden Proteine des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung können in Kombination mit Bt-Endotoxinen von anderen insektiziden Proteinen verwendet werden, um den Zielinsektenbereich zu erweitern. Außerdem ist die Verwendung der VIPs der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Bt-δ-Endotoxinen oder anderen insektiziden Wirkprinzipien unterschiedlicher Art besonders für die Vorbeugung und/oder für Kulturmaßnahmen gegen Insektenresistenz nützlich. Zu andere insektiziden Wirkprinzipien zählen Proteasehemmer (sowohl des Serin- als auch des Cysteintyps), Lectine, a-Amylase und Peroxidase. In einer bevorzugten Ausführungsform geht die Expression von VIPs in einer transgenen Pflanze mit der Expression von einem oder mehreren Bt-δ-Endotoxinen einher. Diese Coexpression von mehr als einem insektiziden Wirkprinzip in derselben transgenen Pflanze kann dadurch erzielt werden, dass man eine Pflanze gentechnisch so verändert, dass sie alle erforderlichen Gene enthält und exprimiert. Als Alternative kann eine Pflanze, Elter 1, gentechnisch für die Expression von VIPs verändert werden. Eine zweite Pflanze, Elter 2, kann gentechnisch für die Expression von Bt-δ-Endotoxin verändert werden. Durch Kreuzen von Elter 1 mit Elter 2 gelangt man zu Nachkommenpflanzen, die alle in Elter 1 und Elter 2 eingeführten Gene exprimieren. Besonders bevorzugte Bt-δ-Endotoxine sind diejenigen, die in der Schrift EP-A 0618976 beschrieben sind, die hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil aufgenommen wird.
  • Eine beträchtliche Anzahl von cytotoxischen Proteinen, jedoch nicht alle, weisen eine binäre Wirkung auf. Binäre Toxine bestehen typischerweise aus zwei Proteindomänen, eine mit der Bezeichnung A-Domäne und die andere mit der Bezeichnung B-Domäne (siehe Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, J. E. Alouf und J. H. Freer, Hrsg. (1991) Academic Press). Die A-Domäne weist eine starke cytotoxische Wirksamkeit auf. Die B-Domäne bindet an einen äußeren Zelloberflächenrezeptor und wird dann internalisiert. Typischerweise muss die cytotoxische A-Domäne von einer Translokationsdomäne in das Cytoplasma begleitet werden. Häufig handelt es sich bei der A-Domäne und der B-Domäne um getrennte Polypeptide oder Protomere, die durch eine Protein-Protein-Wechselwirkung oder eine Disulfidbrücke miteinander assoziiert werden. Es kann sich jedoch bei dem Toxin auch um ein einzelnes Polypeptid handeln, das innerhalb der Zelle proteolytisch zu zwei Domänen prozessiert wird, wie dies bei dem Pseudomonas-Exotoxin A der Fall ist. Kurz gesagt weisen binäre Toxine typischerweise drei wichtige Domänen auf, nämlich eine cytotoxische A-Domäne, eine B-Rezeptorbindungsdomäne und eine Translokationsdomäne. Die A-Domäne und die B-Domäne sind häufig miteinander durch Domänen, die Protein-Protein-Wechselwirkungen eingehen, vereinigt.
  • Die Rezeptorbindungsdomänen der vorliegenden Erfindung eignen sich für die Abgabe eines beliebigen Proteins, Toxins, Enzyms, Transkriptionsfaktors, einer beliebigen Nukleinsäure, Chemikalie oder eines beliebigen sonstigen Faktors an Zielinsekten, die über einen Rezeptor verfügen, der von der Rezeptorbindungsdomäne der im vorliegenden Patent beschriebenen binären Toxine erkannt wird. Auf ähnliche Art und Weise können, da binäre Toxine Translokationsdomänen aufweisen, die Phospolipiddoppelschicht-Membranen durchdringen und Cytotoxine durch solche Membranen hindurch begleiten, solche Translokationsdomänen bei der Begleitung eines beliebigen Proteins, Toxins, Enzyms, Transkriptionsfaktors, einer beliebigen Nukleinsäure, Chemikalie oder eines beliebigen sonstigen Faktors durch eine Phospholipiddoppelschicht, wie die Plasmamembran oder eine Vesikelmembran, hindurch nützlich sein. Die Translokationsdomäne selbst kann Membranen perforieren und weist dadurch toxische oder insektizide Eigenschaften auf. Außerdem weisen alle binären Toxine cytotoxische Domänen auf; solch eine cytotoxische Domäne kann sich als letales Protein eignen, und zwar entweder allein oder bei Abgabe an (eine) beliebige Zielzelle(n) auf beliebige Art und Weise.
  • Schließlich ist es, da aus zwei Polypeptiden bestehende binäre Toxine häufig einen Komplex bilden, wahrscheinlich, dass innerhalb der Komponenten der erfindungsgemäßen binären Toxine Regionen mit Protein-Protein-Wechselwirkung vorliegen. Diese Domänen mit Protein-Protein-Wechselwirkung können bei der Bildung von Assoziationen zwischen einer beliebigen Kombination von Toxinen, Enzymen, Transkriptionsfaktoren, Nukleinsäuren, Antikörpern, zellbindenden Gruppierungen oder beliebigen sonstigen Chemikalien, Faktoren, Proteinen oder Proteindomänen nützlich sein.
  • Toxine, Enzyme, Transkriptionsfaktoren, Antikörper, Zellbindungsgruppierungen und andere Proteindomänen können mit pestiziden Proteinen oder mit Hilfsproteinen dadurch fusioniert werden, dass man leserastergerechte Genfusionen erzeugt, die, wenn sie von den Ribosomen translatiert werden, ein Fusionsprotein mit den kombinierten Eigenschaften des VIP und der anderen in der Fusion verwendeten Komponente ergeben. Außerdem kann, wenn die mit dem VIP fusionierte Proteindomäne eine Affinität für ein anderes Protein, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein Lipid oder eine andere Chemikalie bzw. einen anderen Faktor aufweist, ein aus drei Komponenten bestehender Komplex gebildet werden. Dieser Komplex wird alle Eigenschaften von all seinen Komponenten aufweisen. Eine ähnliche Denkweise kann für die Herstellung von Komplexen mit vier oder mehr Komponenten verwendet werden. Diese Komplexe eignen sich als insektizide Toxine, Pharmazeutika, Laborreagentien, Diagnostika usw. Beispiele für die derzeitige Verwendung von solchen Komplexen sind Fusionstoxine für mögliche Krebstherapien, Reagentien in ELISA-Assays und in der Immunblot-Analyse.
  • Eine Strategie für die Veränderung von pestiziden Proteinen oder Hilfsproteinen ist die Fusionierung eines 15 Aminosäuren großen „S-Tags” an das Protein, ohne die Insektenzellbindungsdomäne(n), die Translokationsdomänen oder die Domänen mit Protein-Protein-Wechselwirkung der Proteine zu zerstören. Der S-Tag weist eine hohe Affinität (Kd = 10–9 M) für ein Ribonuklease-S-Protein auf, das, wenn es an den S-Tag bindet, eine aktive Ribonuklease bildet (siehe F. M. Richards und H. W. Wyckoff (1971) in „The Enzymes”, Bd. IV (Boyer, p. o. Hrsg.). S. 647–806. Academic Press, New York). Die Fusion kann derartig erfolgen, dass die cytotoxische Aktivität des pestiziden Proteins oder des Hilfsproteins zerstört oder entfernt wird, wobei die cytotoxische Aktivität des VIP durch eine neue cytotoxische Ribonukleaseaktivität ersetzt wird. Das schlußendlich erhaltene Toxin würde aus dem S-Protein, einem pestiziden Protein und einem Hilfsprotein bestehen, wobei entweder das pestizide Protein oder das Hilfsprotein als Translationsfusion mit dem S-Tag entsteht. Ähnliche Strategien können eingesetzt werden, um andere potentielle Cytotoxine mit pestiziden Proteinen oder mit Hilfsproteinen zu fusionieren, darunter (jedoch nicht ausschließlich) ribosomeninaktivierende Proteine, Insektenhormone, Hormonrezeptoren, Transkriptionsfaktoren, Proteasen, Phosphatasen, Pseudomonas-Exotoxin A oder ein beliebiges sonstiges Protein oder ein beliebiger sonstiger chemischer Faktor, das/der bei Abgabe in Zellen letal ist. Auf ähnliche Weise können Proteine, die nicht letal sind, jedoch im Anschluss an die Zellbiochemie oder -physiologie letal sein könnten, in Zellen abgegeben werden.
  • Das Spektrum der Toxizität gegenüber verschiedenen Arten kann dadurch verändert werden, dass man Domänen mit pestiziden Proteinen oder Hilfsproteinen, die Zelloberflächenrezeptoren von anderen Arten erkennen, fusioniert. Solche Domänen könnten (jedoch ohne Einschränkung) Antikörper, Transferrin, Hormone oder Peptidsequenzen, die aus auf Phagen präsentierten, mittels Affinität selektierbaren Bibliotheken isoliert werden, beinhalten. Zur Veränderung des Toxizitätsspektrums könnten auch Peptidsequenzen verwendet werden, die an Nährstoffe, Vitamine, Hormone oder andere Chemikalien, die in Zellen transportiert werden, gebunden sind.
  • Bei den pestiziden Proteinen des allgemeinen Stands der Technik der vorliegenden Erfindung handelt es sich um Proteine, die eine bestimmte pestizide Eigenschaft vermitteln. Solche Proteine können sich in Bezug auf das Molekulargewicht unterscheiden und Polypeptidkomponenten mit mindestens einem Molekulargewicht von 30 kDa oder mehr, vorzugsweise ungefähr 50 kDa oder mehr, aufweisen.
  • Bei dem pestiziden Protein kann es sich um eine Komponente eines multimeren pestiziden Proteins handeln. Solch ein pestizides Protein kann sich bezüglich des Molekulargewichts unterscheiden und mindestens ein Molekulargewicht von 50 kDa bis zu mindestens 200 kDa, vorzugsweise ungefähr 100 kDa bis 150 kDa, aufweisen.
  • Für die Zwecke der Erfindung umfasst der Begriff „vegetatives insektizides Protein” (VIP) diejenigen Proteine, die während des vegetativen Wachstums produziert werden und die allein oder in Kombination für eine pestizide Wirksamkeit verwendet werden können. Dazu zählen pestizide Proteine, Hilfsproteine und Proteine, die eine Wirksamkeit nur in Gegenwart des Hilfsproteins aufweisen, oder die Polypeptidkomponenten dieser Proteine.
  • Es ist bekannt, dass andere Verfahren verfügbar sind, um zu den Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der vorliegenden Proteine zu gelangen. Um zum Beispiel zu der Nukleotidsequenz, die für das pestizide Protein codiert, zu gelangen, können Cosmidklone, die das pestizide Protein exprimieren, aus einer Genombibliothek isoliert werden. Aus größeren aktiven Cosmidklonen können kleinere Unterklone hergestellt und auf Wirksamkeit geprüft werden. Auf diese Weise können Klone, die ein aktives pestizides Protein exprimieren, sequenziert werden, um die Nukleotidsequenz des Gens zu bestimmen. Dann kann eine Aminosäuresequenz für das Protein abgeleitet werden. Für allgemeine molekularbiologische Verfahren siehe zum Beispiel Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Band 1–3, Sambrook et al. (Hrsg.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) und die darin angeführten Literaturangaben.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleotidsequenzen aus Organismen, bei denen es sich nicht um Bacillus handelt, wobei die Nukleotidsequenzen durch Hybridisieren mit den erfindungsgemäßen Bacillus-Nukleotidsequenzen isoliert werden können. Proteine, die von solchen Nukleotidsequenzen codiert werden, können auf pestizide Wirksamkeit geprüft werden. Die Erfindung umfasst auch die von den Nukleotidsequenzen codierten Proteine. Weiterhin umfasst die Erfindung Proteine, die von Organismen stammen, bei denen es sich nicht um Bacillus handelt, wobei zwischen dem Protein und gegen die erfindungsgemäßen Proteine erzeugten Antikörpern eine Kreuzreaktion erfolgt. Wiederum können die isolierten Proteine nach den hier beschriebenen Verfahren oder nach anderen, gut fachbekannten Verfahren auf pestizide Wirksamkeit im Assay getestet werden.
  • Sobald die Nukleotidsequenzen, die für die erfindungsgemäßen pestiziden Proteine codieren, isoliert worden sind, können sie gentechnisch bearbeitet und zum Exprimieren des Proteins in verschiedenen Wirten, darunter anderen Organismen, darunter auch Mikroorganismen und Pflanzen, eingesetzt werden.
  • Die erfindungsgemäßen pestiziden Gene können für eine verstärkte Expression in Pflanzen optimiert werden; siehe zum Beispiel EP-A 0618976 ; EP-A 0359472 ; EP-A 0385962 ; WO 91/16432 ; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477–498. Auf diese Weise können unter Verwendung von in Pflanzen bevorzugten Codons die Gene synthetisiert werden. Ein bevorzugtes Codon für einen bestimmten Wirt ist dasjenige einzelne Codon, das am häufigsten für diese Aminosäure in diesem Wirt codiert. Das in Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure kann zum Beispiel von einer bekannten Gensequenz des Maises abgeleitet werden. Die Codon Usage des Maises für 28 Gene aus Maispflanzen findet sich bei Murray et al. (1989), Nucleic Acids Research 17: 477–498, das hiermit durch Bezugnahme als Bestandteil aufgenommen wird. Synthetische Gene können auch auf Grundlage der Verteilung von Codons, die ein bestimmter Wirt für eine bestimmte Aminosäure verwendet, hergestellt werden.
  • Auf diese Weise können die Nukleotidsequenzen für die Expression in einer beliebigen Pflanze optimiert werden. Es ist bekannt, dass die gesamte Gensequenz oder ein beliebiger Teil der Gensequenz optimiert oder synthetisch sein kann. Das heißt, dass synthetische oder teilweise optimierte Sequenzen ebenfalls verwendet werden können.
  • Auf ähnliche Weise können die Nukleotidsequenzen für die Expression in einem beliebigen Mikroorganismus optimiert werden. Für die in Bacillus bevorzugte Codon Usage siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,024,837 und Johansen et al. (1988) Gene 65: 293–304.
  • Methoden für die Konstruktion von Pflanzenexpressionskassetten sowie die Einführung von Fremd-DNA in Pflanzen sind in der Fachwelt beschrieben. Zu solchen Expressionskassetten können Promoter, Terminatoren, Enhancer, Leitsequenzen, Introns und andere regulatorische Sequenzen, die mit der Codiersequenz des pestiziden Proteins operativ verknüpft sind, zählen. Es ist auch bekannt, dass Promoter oder Terminatoren der VIP-Gene in Expressionskassetten verwendet werden können.
  • Im Allgemeinen wurden für das Einführen von Fremd-DNA in Pflanzen Ti-Plasmidvektoren für die Abgabe der Fremd-DNA, aber auch direkte DNA-Aufnahme, Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion und die Verwendung von Mikroprojektilen verwendet. Diese Verfahren sind in der Fachwelt publiziert worden; siehe zum Beispiel Guerche et al., (1987) Plant Science 52: 111–116; Neuhause et al., (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30–36; Klein et al., (1987) Nature 327: 70–73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al., (1985) Science 227: 1229–1231; DeBlock et al., (1989) Plant Physiology 91: 694–701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach und Weissbach, Hrsg.) Academic Press, Inc. (1988); und Methods in Plant Molecular Biology (Schuler und Zielinski, Hrsg.) Academic Press, Inc. (1989); siehe auch die US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 08/008,374, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist; siehe auch EP-A 0193259 und EP-A 0451878 . Das Transformationsverfahren wird von der zu transformierenden Pflanzenzelle abhängig sein.
  • Es ist auch bekannt, dass die Komponenten der Expressionskassette modifiziert werden können, um die Expression zu verstärken. So zum Beispiel können verkürzte Sequenzen, Nukleotidsubstitutionen oder andere Modifikationen eingesetzt werden; siehe zum Beispiel Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3324–3328; Murray et al., (1989) Nucleic Acids Research 17: 477–498 und WO 91/16432 .
  • Das Konstrukt kann auch beliebige andere erforderliche Regulatoren wie Terminatoren (Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141–144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671–674; Sanfacon et al. (1991), Genes Dev., 5: 141–149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2: 1261–1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91: 151–158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891–7903; Joshi et al., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627–9639); Pflanzentranslationskonsensussequenzen (Joshi, C. P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6643–6653), Introns (Luehrsen und Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225: 81–93) und dergleichen in operativer Verknüpfung mit der Nukleotidsequenz beinhalten. Es kann von Vorteil sein, in dem Expressionskassettenkonstrukt 5'-Leitsequenzen mit zu verwenden. Die Wirkung solcher Leitsequenzen kann darin bestehen, dass sie die Translation verstärken. Translationsleitsequenzen sind in der Fachwelt bekannt; dazu zählen:
    Picornavirus-Leitsequenzen, zum Beispiel die EMCV-Leitsequenz (Encephalomyocarditis-5'-Nichtcodierregion) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. und Moss, B. (1989) PNAS USA 86: 6126–6130);
    Potyvirus-Leitsequenzen, zum Beispiel die TEV-Leitsequenz (Tabakätzvirus) (Allison et al., (1986); die MDMV-Leitsequenz (Maisverzwergungsmosaikvirus); Virology, 154: 9–20) und
    das Bindungsprotein (BiP) der schweren Ketten von Human-Immunglobulin, (Macejak, D. G. und Sarnow, P. (1991), Nature, 353: 90–94;
    die nichttranslatierte Leitsequenz der Hüllprotein-mRNA des Luzernemosaikvirus (AMV-RNA 4), (Jobling, S. A. und Gehrke, L., (1987), Nature, 325: 622–625;
    die Tabakmosaikvirus-Leitsequenz (TMV), (Gallie, D. R. et al., (1989), Molecular Biology of RNA, Seiten 237–256; und die Leitsequenz des MCMV (Maize Chlorotic Mottle Virus) (Lommel, S. A. et al., (1991), Virology, 81: 382–385; siehe auch Della-Cioppa et al., (1987), Plant Physiology, 84: 965–968.
  • In der Expressionskassette kann ein Pflanzenterminator eingesetzt werden; siehe Rosenberg et al., (1987), Gene, 56: 125; Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141–144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671–674; Sanfacon et al., (1991), Genes Dev., 5: 141–149; Morgen et al., (1990), Plant Cell, 2: 1261–1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91: 151–158; Ballas et al., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891–7903; Joshi et al., (1987); Nucleic Acid Res., 15: 9627–9639.
  • Für die gewebespezifische Expression können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen operativ mit gewebespezifischen Promotern verknüpft werden; siehe zum Beispiel die Schrift EP-A 0618976 , die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Ebenfalls umfasst vom Umfang der vorliegenden Erfindung sind transgene Pflanzen, insbesondere transgene fruchtbare Pflanzen, die mit den obengenannten Verfahren transformiert worden sind, sowie ihre geschlechtlichen und/oder ungeschlechtlichen Nachkommen, die das erfindungsgemäße pestizide Protein umfassen und vorzugsweise auch exprimieren. Besonders bevorzugt werden Hybridpflanzen.
  • Bei der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze kann es sich um eine zweikeimblättrige oder einkeimblättrige Pflanze handeln. Bevorzugt sind einkeimblättrige Pflanzen der Familie Graminaceae, einschließlich Lolium-, Zea-, Triticum-, Triticale-, Sorghum-, Saccharum-, Bromus-, Oryzae-, Avena-, Hordeum-, Secale- und Setaria-Pflanzen.
  • Besonders bevorzugt sind transgener Mais, transgener Weizen transgene Gerste, transgenes Sorghum, transgener Roggen, transgener Hafer, transgene Rasengräser und transgener Reis.
  • Unter den zweikeimblättrigen Pflanzen sind hier Sojabohne, Baumwolle, Tabak, Zuckerrübe, Raps und Sonnenblume besonders bevorzugt.
  • Unter dem Begriff „Nachkommen” sollen sowohl „ungeschlechtlich” als auch „geschlechtlich” erzeugte Nachkommen von transgenen Pflanzen verstanden werden. Diese Definition ist auch so zu verstehen, dass sie alle Mutanten und Varianten, die mittels bekannter Verfahren, wie zum Beispiel Zellfusion oder Selektion von Mutanten, erhältlich sind und die noch die charakteristischen Eigenschaften der ursprünglich transformierten Elternpflanze aufweisen, sowie alle Kreuzungs- und Fusionsprodukte des transformierten Pflanzenmaterials beinhaltet.
  • Ein weiterer Erfindungsgegenstand betrifft das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen.
  • Das Vermehrungsmaterial von transgenen Pflanzen ist in Bezug auf die Erfindung als jegliches Pflanzenmaterial definiert, das geschlechtlich oder ungeschlechtlich in vivo oder in vitro vermehrt werden kann. Besonders bevorzugt im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Kalli, Gewebe, Organe, Samen, Embryonen, Pollen, Eizellen, Zygoten, sowie beliebiges sonstiges Vermehrungsmaterial, das von transgenen Pflanzen stammt.
  • Pflanzenteile, wie zum Beispiel Blüten, Stängel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die aus transgenen Pflanzen oder ihren Nachkommen, die zuvor mit dem erfindungsgemäßen Verfahren transformiert worden sind, stammen und daher mindestens teilweise aus transgenen Zellen bestehen, sind ebenfalls ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
  • Bevor das pflanzliche Vermehrungsmaterial [Früchte, Knollen, Körner, Samen], jedoch insbesondere Saatgut, als Handelsprodukt verkauft wird, wird es üblicherweise mit einer schützenden Beschichtung, die Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Mischungen von mehreren dieser Produkte umfasst, falls erwünscht gemeinsam mit weiteren Trägern, Tensiden oder anwendungsfördernden Hilfsmitteln, die üblicherweise in der Formulierungstechnik verwendet werden, behandelt, um einen Schutz gegen Schädigung durch Schadbakterien, Schadpilze oder tierische Schädlinge zu gewährleisten.
  • Um das Saatgut zu behandeln, kann die Schutzbeschichtung auf die Samen entweder durch Imprägnieren der Knollen oder Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch deren Beschichten mit einer nassen oder trockenen Kombinationsformulierung appliziert werden. Weiterhin sind in Spezialfällen andere Verfahren für die Applikation auf Pflanzen möglich, zum Beispiel eine auf die Knospen oder die Frucht gerichtete Behandlung.
  • Das erfindungsgemäße Pflanzensaatgut, das ein DNA-Molekül umfasst, welches eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein erfindungsgemäßes pestizides Protein codiert, kann mit einer saatgutschützenden Beschichtung behandelt werden, die eine Saatgutbehandlungsverbindung enthält, wie zum Beispiel Captan, Carboxin, Thiram (TMTD®), Methalaxyl (Apron®) und Pirimiphos-Methyl (Actellic®) und anderen, die üblicherweise in der Saatgutbehandlung eingesetzt werden. Bevorzugt im Zusammenhang mit der Erfindung sind saatgutschützende Beschichtungen, die eine entomozide erfindungsgemäße Zusammensetzung allein oder in Kombination mit einer der üblicherweise in der Saatgutbehandlung eingesetzten saatgutschützenden Beschichtung umfassen.
  • Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung von Pflanzenvermehrungsmaterial für Kulturpflanzen, jedoch insbesondere Pflanzensaatgut, das mit einer saatgutschützenden Beschichtung wie oben definiert behandelt ist.
  • Es ist bekannt, dass man mit den Genen, die für die pestiziden Proteine codieren, insektenpathogene Organismen transformieren kann. Zu solchen Organismen zählen Baculoviren, Pilze, Protozoen, Bakterien und Nematoden.
  • Die erfindungsgemäßen Bacillus-Stämme können für das Schützen von landwirtschaftlichen Kulturen und Agrarprodukten gegen Schädlinge verwendet werden. Alternativ dazu kann ein Gen, das für das Pestizid codiert, über einen geeigneten Vektor in einen Mikroorganismenwirt eingeführt werden, und der Wirt kann auf die Umwelt oder auf Pflanzen oder Tiere appliziert werden. Es können Wirtsmikroorganismen ausgewählt werden, von denen bekannt ist, dass sie die „Phytosphäre” (Phylloplane, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizoplane) von einer oder mehreren interessierenden Kulturen bewohnen. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, dass sie fähig sind, in der jeweiligen Umwelt erfolgreich mit den Wildtypmikroorganismen konkurrieren können, ein stabiles Aufrechterhalten und eine stabile Expression des Gens, das das Polypeptidpestizid exprimiert, gewährleisten und wünschenswerterweise einen verbesserten Schutz des Pestizids gegenüber umweltbedingtem Abbau und umweltbedingter Aktivierung gewährleisten.
  • Zu diesen Mikroorganismen zählen Bakterien, Algen und Pilze. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen wie Bakterien, z. B. Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes; Pilze, insbesondere Hefe, z. B. Saccharomyces, Crypotcoccus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind Phytosphärenbakterienarten wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melloti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandir sowie Phytosphärenhefearten wie Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollutans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
  • Es gibt mehrere Wege, um ein Gen, das das pestizide Protein exprimiert, in den Wirtsmikroorganismus unter Bedingungen, die eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens gestatten, einzuführen. So zum Beispiel können Expressionskassetten konstruiert werden, die die interessierenden DNA-Konstrukte in operativer Verknüpfung mit den Transkriptions- und Translationsregulationssignalen für die Expression der DNA-Konstrukte und eine DNA-Sequenz mit Homologie zu einer Sequenz in dem Wirtsorganismus, wodurch Integration stattfinden wird, und/oder ein in dem Wirt funktionsfähiges Replikationssystem, wodurch Integration oder stabile Aufrechterhaltung stattfinden wird, beinhalten.
  • Zu den Transkriptions- und Translationsregulationssignalen zählen, jedoch ohne Einschränkung, Promoter, Transkriptionsinitiationsstartstelle, Operatoren, Aktivatoren, Enhancer, sonstige regulatorische Elemente, Ribosomenbindungsstellen, ein Initiationscodon, Terminationssignale und dergleichen; siehe zum Beispiel US-Patent 5,039,523 ; US-Patent Nr. 4,853,331 ; EPO 0480762 A2 ; Sambrook et al. supra; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis et al., (Hrsg.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harobor, NY (1982); Advanced Bacterial Genetics, Davis et al. (Hrsg.) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); und die darin genannten Literaturstellen.
  • Zu geeigneten Wirtszellen, wobei die pestizidhaltigen Zellen behandelt werden werden, um die Aktivität des Toxins in der Zelle zu verlängern, wenn die dann behandelte Zelle auf die Umwelt des Zielschädlings bzw. der Zielschädlinge ausgebracht wird, können entweder Prokaryonten oder Eukaryonten zählen, die üblicherweise auf diejenigen Zellen beschränkt sind, die keine Substanzen mit Toxizität für höhere Organismen wie Säugetiere produzieren. Es könnten jedoch Organismen eingesetzt werden, die Substanzen mit Toxizität für höhere Organismen produzieren, wobei das Toxin unstabil ist oder die Aufwandmenge so niedrig ist, dass jegliche Möglichkeit einer Toxizität für einen Säugetierwirt vermieden wird. Als Wirte sind die Prokaryonten und die niederen Eukaryonten, wie Pilze, von besonderem Interesse. Zu beispielhaften Prokaryonten, sowohl gramnegativen als auch grampositiven, zählen Enterobacteriaceae, wie Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus, Bacillaceae; Rhizobiceae, wie zum Beispiel Rhizobium, Spirillaceae, wie zum Beispiel Photobakterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, wie zum Beispiel Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae. Unter den Eukaryonten befinden sich Pilze, wie zum Beispiel Phycomycetes und Ascomycetes, darunter Hefe, wie ein Saccharomyces und Schizosaccharomyces; und Basidiomycetes-Hefe, wie Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dergleichen.
  • Zu den besonders interessierenden Eigenschaften beim Auswählen einer Wirtszelle für Produktionszwecke zählen die Leichtigkeit, mit der das Proteingen in den Wirt eingeführt wird, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Expressionseffizienz, die Stabilität des Proteins in dem Wirt sowie das Vorliegen von unterstützenden genetischen Fähigkeiten. Zu den interessierenden Eigenschaften für die Verwendung als Pestizidmikrokapsel zählen die schützenden Eigenschaften für das Pestizid, wie dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Verpackung oder Bildung von Einschlusskörpern; Blattaffinität; mangelnde Säugetiertoxizität; Attraktivität, um von den Schädlingen aufgenommen zu werden; Leichtigkeit des Abtötens und Fixierens, ohne das Toxin zu schädigen, und dergleichen. Zu weiteren Aspekten zählen die Leichtigkeit der Formulierung und Handhabung, Wirtschaftlichkeit, Lagerstabilität und dergleichen.
  • Zu besonders interessanten Wirtsorganismen zählen Hefe, wie Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp.; Organismen der Phylloplane, wie Pseudomonas sp., Erwinia sp. und Flavobacterium sp.; oder andere Organismen wie Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp. und dergleichen. Zu spezifischen Organismen zählen Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergleichen.
  • VIP-Gene können in Mikroorganismen eingeführt werden, die sich auf Pflanzen vermehren (Epiphyten), um VIP-Proteine an mögliche Zielschädlinge abzugeben. Bei den Epiphyten kann es sich zum Beispiel um grampositive oder gramnegative Bakterien handeln.
  • So können zum Beispiel aus der interessierenden Pflanze wurzelkolonisierende Bakterien nach fachbekannten Verfahren isoliert werden. Insbesondere konnte ein Bacillus-cereus-Stamm, der Wurzeln kolonisiert, aus den Wurzeln einer Pflanze isoliert werden (siehe zum Beispiel J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L. Wunderlich und C. Grau, Appl. Environ. Micorbiol. 56: 713–718, (1990)). VIP1 und/oder VIP2 und/oder VIP3 konnten in einen wurzelkolonisierenden Bacillus cereus nach fachbekannten Standardverfahren eingeführt werden.
  • Außerdem können VIP3 oder andere erfindungsgemäße VIPs in den wurzelkolonisierenden Bacillus mittels Elektrotransformation eingeführt werden. Insbesondere können VIPs in einen Shuttle-Vektor, zum Beispiel pHT3101, wie in Beispiel 10 beschrieben, kloniert werden (D. Lereclus et al., FEMS Microbiol. Letts., 60: 211–218 (1989)). Der Shuttle-Vektor pHT3101, der die Codiersequenz für das bestimmte VIP enthält, kann dann mittels Elektroporation in den wurzelkolonisierenden Bacillus hineintransformiert werden (D. Lereclus et al., 1989, FEMS Microbiol. Letts. 60: 211–218).
  • Es können Expressionssysteme entwickelt werden, so dass die VIP-Proteine außerhalb des Zytoplasmas von gramnegativen Bakterien, zum Beispiel E. coli, sezerniert werden. Die Vorteile der Sekretion von VIP-Proteinen sind folgende: (1) es werden potentielle toxische Auswirkungen der innerhalb des Zytoplasmas exprimierten VIP-Proteine vermieden, und (2) es kann dadurch das VIP-Proteinexpressionsniveau erhöht werden und (3) es kann dadurch die schlagkräftige Aufreinigung des VIP-Proteins unterstützt werden.
  • VIP-Proteine können zum Beispiel dadurch erfolgreich in E. coli sezerniert werden, dass man ein entsprechendes E. coli-Signalpeptid mit dem aminoterminalen Ende des VIP-Signalpeptids fusioniert oder dadurch, dass man das VIP-Signalpeptid durch das E. coli-Signalpeptid ersetzt. Von E. coli erkannte Signalpeptide finden sich in Proteinen, von denen bereits bekannt ist, dass sie in E. coli sezerniert werden, zum Beispiel im OmpA-Protein (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, Y. Masul und M. Inouye, EMBO J., 3: 2437–2442 (1984)). Bei OmpA handelt es sich um ein wichtiges Protein der äußeren Membran von E. coli, und man nimmt daher an, dass sein Signalpeptid beim Translokationsvorgang wirksam ist. Außerdem muss das OmpA-Signalpeptid vor der Prozessierung nicht modifiziert werden, wie dies bei anderen Signalpeptiden, zum Beispiel beim Lipoproteinsignalpeptid, der Fall sein kann (G. Duffaud, P. March und M. Inouye, Methods in Enzymology, 153: 492 (1987)).
  • Spezifisch können einmal vorkommende BamHI-Restriktionsstellen nach fachbekannten Standardmethoden am aminoterminalen und am carboxyterminalen Ende der VIP-Codiersequenzen eingeführt werden. Diese BamHI-Fragmente können leserastergerecht in den Vektor pIN-III-ompA1, pIN-III-ompA2 oder pIN-III-ompA3 kloniert werden (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui und M. Inouye, EMBO J., 3: 2437–2442 (1984)), wodurch man ein ompA:VIP-Fusionsgen erzeugt, das in den periplasmatischen Raum sezerniert wird. Die anderen Restriktionsstellen im Polylinker von pIN-III-ompA können nach fachbekannten Standardverfahren entfernt werden, so dass die aminoterminale VIP-Aminosäurecodiersequenz direkt nach der ompA-Signalpeptidspaltstelle zu liegen kommt. So wäre die sezernierte VIP-Sequenz in E. coli mit der nativen VIP-Sequenz identisch.
  • Ist das native VIP-Signalpeptid für die korrekte Faltung des reifen Proteins nicht erforderlich, so können solche Signalsequenzen entfernt und durch die ompA-Signalsequenz ersetzt werden. Einmal vorkommende BamHI-Restriktionsstellen können an den aminoterminalen Enden der Proproteincodiersequenzen direkt nach den Signalpeptidcodiersequenzen von VIP und an den carboxyterminalen Enden der VIP-Codiersequenz eingeführt werden. Diese BamHI-Fragmente können dann wie oben beschrieben in die pIN-III-ompA-Vektoren geklont werden.
  • Allgemeine Verfahren für den Einsatz der erfindungsgemäßen Stämme in der Pestizidkontrolle oder bei der gentechnischen Bearbeitung von anderen Organismen als pestizide Mittel sind in der Fachwelt bekannt; siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,039,523 und EP 0480762 A2 .
  • Die VIPs können in einem Wirtsbakterium fermentiert werden und die entstandenen Bakterien können weiter verarbeitet und auf ähnliche Weise als Mikroorganismen-Spray eingesetzt werden, wie Bacillus-thuringiensis-Stämme als Insektizid-Sprays verwendet worden sind. Bei einem VIP bzw. VIPs, das/die aus Bacillus sezerniert wird/werden, wird das Sekretionssignal nach fachbekannten Vorgehensweisen entfernt oder mutiert. Solche Mutationen und/oder Deletionen verhindern die Sekretion des VIP-Proteins bzw. der VIP-Proteine während des Fermentationsvorgangs in das Wachstumsmedium. Die VIPs bleiben innerhalb der Zelle, und die Zellen werden dann weiter verarbeitet, wodurch man die verkapselten VIPs erhält. Jeder geeignete Mikroorganismus kann für diesen Zweck verwendet werden. Für die Expression von Bacillus-thuringiensis-Endotoxinen als verkapselte Proteine wurde Pseudomonas verwendet, und die entstandenen Zellen wurden weiter verarbeitet und als Insektizid versprüht (H. Gaertner et al. 1993, in Advanced Engineered Pesticides, L. Kim Hrsg.).
  • Auf diese Weise werden verschiedene Stämme von Bacillus thuringiensis verwendet. Solche Bt-Stämme produzieren Endotoxinprotein(e) sowie VIPs. Alternativ dazu können solche Stämme auch nur VIPs produzieren. Es wurde gezeigt, dass ein sporulationsdefizienter Stamm von Bacillus subtilis hohe Mengen des CryIIIA-Endotoxins aus Bacillus thuringiensis produziert (Agaisse, H. und Lereclus, D., „Expression in Bacillus subitilis of the Bacillus thuringiensis CryIIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant”, J. Bacteriol., 176: 4734–4741 (1994)). Eine ähnliche spoOA-Mutante kann in Bacillus thuringiensis erzeugt und für die Produktion von verkapselten VIPs, die nicht in das Medium sezerniert werden, sondern innerhalb der Zelle verbleiben, verwendet werden.
  • Damit die VIPs innerhalb der Bacillus-Zelle verbleiben, kann das Signalpeptid „entwaffnet” werden, so dass es nicht mehr als Sekretionssignal funktionsfähig ist.
  • Alternativ dazu können die Signalpeptide von erfindungsgemäßen VIPs aus der Sequenz entfernt werden, wodurch sie als Sekretionsproteine in Bacillus nicht erkennungsfähig werden. Spezifisch kann mit fachbekannten Methoden der Gentechnik eine Methioninstartstelle vor die Proproteinsequenz gestellt werden.
  • Die VIP-Gene können in Mikroorganismen eingeführt werden, die sich auf Pflanzen vermehren (Epiphyten), um die VIP-Proteine an mögliche Zielschädlinge abzugeben. Epiphyten können zum Beispiel grampositive oder gramnegative Bakterien sein.
  • Die erfindungsgemäßen Bacillus-Stämme oder die Mikroorganismen, die genetisch so verändert wurden, dass sie das pestizide Gen und Protein enthalten, können zum Schützen von landwirtschaftlichen Kulturen und Agrarprodukten gegen Schädlinge verwendet werden. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden ganze, das heißt nicht lysierte, Zellen eines Toxin-(Pestizid)-produzierenden Organismus mit Mitteln behandelt werden, die die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins verlängern, wenn die Zelle auf die Umwelt des Zielschädlings bzw. der Zielschädlinge ausgebracht wird.
  • Alternativ dazu werden die Pestizide dadurch hergestellt, dass man ein heterologes Gen in eine Wirtszelle einführt. Die Expression des heterologen Gens führt direkt oder indirekt zu der intrazellulären Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Diese Zellen werden dann unter Bedingungen behandelt, die die Aktivität des in der Zelle produzierten Toxins verlängern, wenn die Zelle auf die Umwelt des Zielschädlings bzw. von Zielschädlingen ausgebracht wird. Bei dem erhaltenen Produkt bleibt die Toxizität des Toxins erhalten. Diese natürlich verkapselten Pestizide können dann gemäß traditionellen Techniken für die Ausbringung in eine Umwelt, die den Wirt für einen Zielschädling darstellt, zum Beispiel Boden, Wasser und das Blattwerk von Pflanzen, formuliert werden; siehe zum Beispiel EPA 0192319 und die darin genannten Literaturstellen.
  • Die Wirkstoffe der vorliegenden Erfindung werden üblicherweise in Form von Zusammensetzungen ausgebracht und können gleichzeitig oder nacheinander mit anderen Verbindungen auf die zu behandelnde Kulturfläche oder Pflanze ausgebracht werden. Bei diesen Verbindungen kann es sich sowohl um Düngemittel als auch um Mikronährstoffspender oder um andere Präparate, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, handeln. Es kann sich auch um selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Mischungen von mehreren dieser Präparate handeln, falls erwünscht gemeinsam mit weiteren landwirtschaftlich annehmbaren Trägern, Tensiden oder applikationsfördernden Hilfsmitteln, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden. Geeignete Träger und Hilfsmittel können fest oder flüssig sein und entsprechen den Substanzen, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden, zum Beispiel natürlichen oder regenerierten mineralischen Stoffen, Lösungsmitteln, Dispergiermitteln, Netzmitteln, Haftmitteln, Bindemitteln oder Düngemitteln.
  • Bevorzugte Verfahren zum Ausbringen eines Wirkstoffs der vorliegenden Erfindung oder einer agrarchemischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die mindestens eines der insektenspezifischen Proteine enthält, das von den Bakterienstämmen der vorliegenden Erfindung produziert wird, sind die Blattanwendung, die Saatgutbeschichtung und die Bodenanwendung. Die Anzahl der Anwendungen und die Aufwandmenge hängen von dem Befallsdruck des entsprechenden Schädlings ab.
  • Der allgemeine Stand der Technik der vorliegenden Erfindung stellt daher weiterhin eine entomozide Zusammensetzung bereit, die als Wirkstoff mindestens eines der neuen insektenspezifischen Proteine gemäß dem allgemeinen Stand der Technik der Erfindung und/oder einen rekombinanten Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, jedoch insbesondere einen rekombinanten Bacillus spp.-Stamm, wie Bacillus cereus oder Bacillus thuringiensis, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, umfasst, gemeinsam mit einem landwirtschaftlichen Hilfsstoff wie einem Träger, Verdünnungsmittel, Tensid oder anwendungsfördernden Hilfsmittel. Die Zusammensetzung kann auch eine weitere biologisch wirksame Verbindung enthalten. Bei der Verbindung kann es sich sowohl um Düngemittel als auch um Mikronährstoffspender oder um andere Präparate, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, handeln. Es kann sich auch um selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Mischungen von mehreren dieser Präparate handeln, falls erwünscht gemeinsam mit weiteren landwirtschaftlich annehmbaren Trägern, Tensiden oder applikationsfördernden Hilfsmitteln, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden. Geeignete Träger und Hilfsmittel können fest oder flüssig sein und entsprechen den Substanzen, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden, zum Beispiel natürlichen oder regenerierten mineralischen Stoffen, Lösungsmitteln, Dispergiermitteln, Netzmitteln, Haftmitteln, Bindemitteln oder Düngemitteln.
  • Die Zusammensetzung kann 0,1 bis 99 Gew.-% Wirkstoff, 1 bis 99,9 Gew.-% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25 Gew.-% eines Tensids umfassen. Der Wirkstoff, der mindestens eines der neuen insektenspezifischen Proteine gemäß dem allgemeinen Stand der Technik der Erfindung und/oder einen rekombinanten Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, jedoch insbesondere einen rekombinanten Bacillus spp.-Stamm, wie Bacillus cereus oder Bacillus thuringiensis, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, umfasst, oder die Zusammensetzung, die den Wirkstoff enthält, kann auf die zu schützenden Pflanzen oder Kulturen gemeinsam mit bestimmten anderen Insektiziden oder Chemikalien ausgebracht werden (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada), ohne dass die Wirksamkeit verloren geht. Er ist mit den meisten anderen üblicherweise verwendeten landwirtschaftlichen Spritzmitteln verträglich, sollte jedoch nicht in stark basischen Spritzlösungen verwendet werden. Er kann als Staub, Suspension, Spritzpulver oder als beliebige andere Substanzform, die sich für die landwirtschaftliche Anwendung eignet, ausgebracht werden.
  • Die Erfindung stellt weiterhin Verfahren für die Bekämpfung oder Hemmung von Schadinsekten bereit, und zwar dadurch, dass man einen Wirkstoff, der mindestens eines der neuen erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteine oder einen rekombinanten Mikroorganismus umfasst, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, oder eine Zusammensetzung, die den Wirkstoff umfasst, auf (a) eine Umwelt, in der das Schadinsekt vorkommen kann, (b) eine Pflanze oder einen Pflanzenteil, um die Pflanze oder den Pflanzenteil vor durch ein Schadinsekt verursachtem Schaden zu schützen, oder (c) Saatgut, um eine Pflanze, die sich aus dem Saatgut entwickelt, vor durch ein Schadinsekt verursachtem Schaden zu schützen, ausbringt.
  • Ein bevorzugtes Ausbringungsverfahren auf dem Gebiet des Pflanzenschutzes ist die Ausbringung auf das Blattwerk der Pflanzen (Blattanwendung), wobei die Anzahl der Anwendungen und die Aufwandmenge von der zu schützenden Pflanze und von dem Befallsdruck des jeweiligen Schädlings abhängen. Der Wirkstoff kann jedoch auch durch die Wurzeln in die Pflanze eindringen (systemische Wirkung), wenn der Standort der Pflanzen mit einer flüssigen Formulierung getränkt wird oder wenn der Wirkstoff in fester Form in den Standort der Pflanzen, zum Beispiel in den Boden, eingearbeitet wird, zum Beispiel in Granulatform (Bodenanwendung). Bei Wasserreiskulturen können solche Granulate in dosierten Mengen auf das unter Wasser stehende Reisfeld ausgebracht werden.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eignen sich auch zum Schützen von pflanzlichem Vermehrungsmaterial, zum Beispiel Saatgut, wie Früchten, Knollen oder Körnern, oder Ablegern, gegen Schadinsekten. Das Vermehrungsmaterial kann mit der Formulierung vor dem Pflanzen behandelt werden: so zum Beispiel kann Saatgut vor dem Säen gebeizt werden. Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann auch auf Körner appliziert werden (Beschichtung), und zwar entweder durch Imprägnieren der Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten mit einer festen Formulierung. Die Formulierung kann auch auf den Pflanzort ausgebracht werden, wenn das Vermehrungsmaterial gepflanzt wird, zum Beispiel während des Säens in die Saatfurche. Die Erfindung betrifft auch diese Verfahren zur Behandlung von pflanzlichem Vermehrungsmaterial und das so behandelte pflanzliche Vermehrungsmaterial.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, die als Wirkstoff einen rekombinanten Mikroorganismus umfassen, der mindestens eines der neuen Toxingene in rekombinanter Form enthält, jedoch insbesondere einen rekombinanten Bacillus-spp.-Stamm, wie Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis-Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, oder ein Derivat oder eine Mutante davon, können nach einem beliebigen Verfahren, das für die Behandlung von Saatgut oder des Bodens mit Bakterienstämmen bekannt ist, ausgebracht werden. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,863,866 . Diese Stämme sind auch dann, wenn der Mikroorganismus nicht lebend ist, für die biologische Bekämpfung wirksam. Die Ausbringung des lebenden Mikroorganismus wird jedoch bevorzugt.
  • Zu Zielkulturen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu schützen sind, zählen zum Beispiel die folgenden Pflanzenarten:
    Getreide (Weizen, Gerste, Roggen, Hafer, Reis, Sorghum und verwandte Kulturen), Rübe (Zuckerrübe und Futterrübe), Futtergräser (Knaulgras, Schwingel und dergleichen), Steinfrüchte, Kernfrüchte und Beerenfrüchte (Äpfel, Birnen, Pflaumen, Pfirsiche, Mandeln, Kirschen, Erdbeeren, Himbeeren und Brombeeren), Leguminosen (Bohnen, Linsen, Erbsen, Sojabohnen), Ölpflanzen (Raps, Senf, Mohn, Oliven, Sonnenblumen, Kokosnüsse, Rizinuspflanzen, Kakaobohnen, Erdnüsse), Cucurbitaceen (Gurke, Kürbisse, Melonen), Faserpflanzen (Baumwolle, Flachs, Hanf, Jute), Citrusfrüchte (Orangen, Zitronen, Grapefruits, Mandarinen), Gemüse (Spinat, Salat, Spargel, Kohl und andere Brassicae, Zwiebeln, Tomaten, Kartoffeln, Paprika), Lorbeergewächse (Avocados, Karotten, Zimt, Kampfer), Laubbäume und Koniferen (z. B. Linden, Eiben, Eichen, Erlen, Pappeln, Birken, Tannen (Firs), Lärchen, Föhren (Pines)) oder Pflanzen wie Mais, Tabak, Nüsse, Kaffee, Zuckerrohr, Tee, Reben, Hopfen, Bananen und Naturgummipflanzen sowie Tierpflanzen (einschließlich Korbblütler).
  • Ein rekombinanter Bacillus spp.-Stamm, wie Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis-Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das die Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, wird üblicherweise in Form von entomoziden Zusammensetzungen ausgebracht und kann auf die zu behandelnde Kulturfläche oder Pflanze gleichzeitig oder nacheinander zusammen mit weiteren biologisch wirksamen Verbindungen ausgebracht werden. Bei diesen Verbindungen kann es sich sowohl um Düngemittel als auch um Mikronährstoffspender oder um andere Präparate, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, handeln. Es kann sich auch um selektive Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluskizide oder Mischungen von mehreren dieser Präparate handeln, falls erwünscht gemeinsam mit weiteren Trägern, Tensiden oder applikationsfördernden Hilfsmitteln, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden.
  • Der erfindungsgemäße Wirkstoff kann in unmodifizierter Form oder gemeinsam mit einem geeigneten landwirtschaftlich annehmbaren Träger verwendet werden. Bei solchen Trägern handelt es sich um Hilfsstoffe, die üblicherweise in der landwirtschaftlichen Formulierungstechnik eingesetzt werden, und sie werden daher auf bekannte Weise zu Emulsionskonzentraten, beschichtungsfähigen Pasten, direkt versprühbaren oder verdünnbaren Lösungen, verdünnten Emulsionen, Spritzpulvern, löslichen Pulvern, Stäuben, Granulaten und auch Verkapselungen, zum Beispiel in polymeren Materialien, formuliert. Die Art der Zusammensetzungen sowie die Ausbringungsverfahren, wie Verspritzen, Versprühen, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen, werden entsprechend der Zielsetzung und den vorherrschenden Umständen gewählt. Vorteilhafte Aufwandmengen sind üblicherweise ungefähr 50 g bis ungefähr 5 kg Wirkstoff (a. i.) pro Hektar („ha”, ungefähr 2,471 acres), vorzugsweise ungefähr 100 g bis ungefähr 2 kg a. i./ha. Wichtige Aufwandmengen sind ungefähr 200 g bis ungefähr 1 kg a. i./ha und 200 g bis 500 g a. i./ha. Für die Saatgutbeizung sind vorteilhafte Aufwandmengen 0,5 g bis 1000 g a. i. pro 100 kg Saatgut, vorzugsweise 3 g bis 100 g a. i. pro 100 kg Saatgut oder 10 g bis 50 g a. i. pro 100 kg Saatgut.
  • Geeignete Träger und Hilfsmittel können fest oder flüssig sein und sind Materialien, die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzt werden, zum Beispiel natürliche oder regenerierende mineralische Materialien, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Netzmittel, Haftmittel, Bindemittel oder Düngemittel. Die Formulierungen, d. h. die entomoziden Zusammensetzungen, Präparate oder Mischungen, die den rekombinanten Bacillus spp.-Stamm, wie Bacillus cereus- oder Bacillus thuringiensis-Stamm, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, als Wirkstoff, oder Kombinationen davon mit anderen Wirkstoffen, und gegebenenfalls ein festes oder flüssiges Hilfsmittel enthalten, werden auf bekannte Weise hergestellt, z. B. durch homogenes Vermischen und/oder Vermahlen der Wirkstoffe mit Streckmitteln, z. B. Lösungsmitteln, festen Trägern und in manchen Fällen oberflächenaktiven Verbindungen (Tensiden).
  • Geeignete Lösungsmittel sind: aromatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise die Fraktionen, die 8 bis 12 Kohlenstoffatome enthalten, z. B. Xylolmischungen oder substituierte Naphthaline, Phthalate wie Dibutylphthalat oder Dioctylphthalat, aliphatische Kohlenwasserstoffe wie Cyclohexan oder Paraffine, Alkohole und Glykole sowie ihre Ether und Ester, wie Ethanol, Ethylenglykolmonomethyl- oder -monoethylether, Ketone wie Cyclohexanon, stark polare Lösungsmittel wie N-Methyl-2-pyrrolidon, Dimethylsulfoxid oder Dimethylformamid, sowie pflanzliche öle oder epoxidierte pflanzliche Öle, wie epoxidiertes Kokosöl oder Sojaöl; oder Wasser.
  • Bei den z. B. für Stäube und dispergierbare Pulver verwendeten festen Träger handelt es sich üblicherweise um natürliche mineralische Füllstoffe wie Calcit, Talk, Kaolin, Montmorillonit oder Attapulgit. Um die physikalischen Eigenschaften zu verbessern, kann man auch hochdisperse Kieselsäure oder hochdisperse absorptionsfähige Polymere zugeben. Geeignete granulatförmige adsorptionsfähige Träger sind poröse Typen, zum Beispiel Bimsstein, Ziegelgrus, Sepiolit oder Bentonit, und geeignete nichtsorptionsfähige Träger sind Materialien wie Calcit oder Sand. Außerdem kann eine Vielzahl von vorgranulierten Materialien anorganischer oder organischer Natur verwendet werden, z. B. insbesondere Dolomit oder pulverförmige Pflanzenreste.
  • Je nach der Art der zu formulierenden Wirkstoffe handelt es sich bei den geeigneten oberflächenaktiven Verbindungen um nichtionische, kationische und/oder anionische Tenside mit guten Emulgier-, Dispergier- und Netzeigenschaften. Unter dem Begriff „Tenside” sollen auch Tensidmischungen verstanden werden. Geeignete anionische Tenside können sowohl wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische oberflächenaktive Verbindungen sein. Geeignete Seifen sind die Alkalimetallsalze, Erdalkalimetallsalze oder unsubstituierte oder substituierte Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C10-C22), z. B. die Natrium- oder Kaliumsalze der Ölsäure oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuremischungen, die zum Beispiel aus Kokosöl oder Talgöl erhältlich sind. Weitere geeignete Tenside sind auch die Fettsäuremethyltaurinsalze, sowie modifizierte und unmodifizierte Phospholipide.
  • Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, insbesondere Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylarylsulfonate. Die Fettsulfonate oder -sulfate liegen üblicherweise in Form von Alkalimetallsalzen, Erdalkalimetallsalzen oder unsubstituierten oder substituierten Ammoniumsalzen vor und enthalten im Allgemeinen einen C8-C22-Alkylrest, was auch die Alkylgruppe von Acylresten beinhaltet, zum Beispiel in Form des Natrium- oder Calciumsalzes der Ligninsulfonsäure, oder von Dodecylsulfat, oder einer Mischung aus aus natürlichen Fettsäuren erhaltenen Fettalkoholsulfaten. Diese Verbindungen umfassen auch die Salze der Schwefelsäureester und Sulfonsäuren von Fettalkohol-Ethylenoxid-Additionsprodukten. Die sulfonierten Benzimidazolderivate enthalten vorzugsweise zwei Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit ungefähr 8 bis 22 Kohlenstoffatomen. Beispiele für Alkylarylsulfonate sind die Natrium-, Calcium- oder Triethanolaminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, Dibutylnaphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfonsäure-Formaldehyd-Kondensats. Ebenfalls geeignet sind entsprechende Phosphate, z. B. Salze der Phosphorsäureester eines Additionsprodukts von p-Nonylphenol und 4 bis 14 mol Ethylenoxid. Bei den nichtionischen Tensiden handelt es sich vorzugsweise um Polyglykoletherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen oder gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, wobei diese Derivate 3 bis 30 Glykolethergruppen und 8 bis 20 Kohlenstoffatome im (aliphatischen) Kohlenwasserstoffrest und 6 bis 18 Kohlenstoffatome im Alkylrest der Alkylphenole enthalten.
  • Weitere geeignete nichtionische Tenside sind die wasserlöslichen Additionsprodukte von Polyethylenoxid und Polypropylenglykol, Ethylendiaminopolypropylenglykol und Alkylpolypropylenglykol mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, wobei diese Additionsprodukte 20 bis 250 Ethylenglykolethergruppen und 10 bis 100 Propylenglykolethergruppen enthalten. Diese Verbindungen enthalten üblicherweise 1 bis 5 Ethylenglykoleinheiten pro Propylenglykoleinheit. Repräsentative Beispiele für nichtionische Tenside sind Nonylphenolpolyethoxyethanole, Rizinusölpolyglykolether, Polypropylen-Polyethylenoxidadditionsprodukte, Tributylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylenglykol und Octylphenoxypolyethoxyethanol. Fettsäureester von Polyoxyethylensorbitan, wie Polyoxyethylensorbitantrioleat, sind ebenfalls geeignete nichtionische Tenside.
  • Kationische Tenside sind vorzugsweise quartäre Ammoniumsalze, die als N-Substituenten mindestens einen C8-C22-Alkylrest und als weitere Substituenten niedere unsubstituierte oder halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder Hydroxy-Niederalkylreste enthalten. Die Salze liegen vorzugsweise in Form von Halogeniden, Methylsulfaten oder Ethylsulfaten vor, z. B. Stearyltrimethylammoniumchlorid oder Benzyldi-(2-chlorethyl)ethylammoniumbromid.
  • Die üblicherweise in der Formulierungstechnik eingesetzten Tenside sind z. B. in „McCutcheon's Detergents and Emulsifiers Annual”, MC Publishing Corp. Ridgewood, N. J., 1979; Dr. Helmut Stache, „Tensid Taschenbuch”, Carl Hanser Verlag, München-Wien, beschrieben.
  • Eine weitere besonders bevorzugte Eigenschaft einer entomoziden Zusammensetzung des allgemeinen Stands der Technik der vorliegenden Erfindung ist die Persistenz des Wirkstoffs bei Ausbringung auf Pflanzen und den Boden. Zu möglichen Gründen für einen Wirksamkeitsverlust zählen die Inaktivierung durch Ultraviolettlicht, Hitze, Blattexudate und pH-Wert. So zum Beispiel werden bei einem hohen pH-Wert insbesondere in Gegenwart eines Reduktionsmittels δ-Endotoxinkristalle solubilisiert und werden daher stärker für proteolytische Inaktivierung anfällig. Ein hoher Blatt-pH-Wert kann ebenfalls wichtig sein, insbesondere dann, wenn die Blattoberfläche einen pH im Bereich von 8–10 aufweist. Die Formulierung einer entomoziden Zusammensetzung des allgemeinen Stands der Technik der vorliegenden Erfindung kann diesen Problemen entweder dadurch begegnen, dass Zusatzstoffe mitverarbeitet werden, um dem Verlust des Wirkstoffs entgegenzuwirken, oder dass das Material so verkapselt wird, dass der Wirkstoff gegen Inaktivierung geschützt wird. Die Verkapselung kann chemisch (McGuire und Shasha, J. Econ. Entomol. 85: 1425–1433, 1992) oder biologisch (Barnes und Cummings, 1986; EP-A 0 192 319 ) erfolgen. Die chemische Verkapselung umfasst ein Verfahren, bei dem der Wirkstoff mit einem Polymer beschichtet wird, während die biologische Verkapselung die Expression der δ-Endotoxingene in einem Mikroorganismus beinhaltet. Fr die biologische Verkapselung wird der intakte Mikroorganismus, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, als Wirkstoff in der Formulierung verwendet. Das Hinzufügen von UV-Schutzmitteln kann gegebenenfalls strahlungsbedingte Schäden wirksam verringern. Einer Inaktivierung aufgrund von Hitze könnte ebenfalls durch Mitverwendung eines entsprechenden Zusatzstoffs entgegengewirkt werden.
  • Bevorzugt in Zusammenhang mit der vorliegenden Anmeldung sind Formulierungen, die lebende Mikroorganismen als Wirkstoff umfassen, und zwar entweder in Form der vegetativen Zelle oder stärker bevorzugt in Form von Sporen, falls solche verfügbar sind. Geeignete Formulierungen können zum Beispiel aus Polymergelen bestehen, die mit mehrwertigen Kationen vernetzt sind und die diese Mikroorganismen umfassen. Dies ist zum Beispiel von D. R. Fravel et al. in Phytopathology, Band 75, Nr. 7, 774–777, 1985 für Alginat als Polymermaterial beschrieben. Aus jener Veröffentlichung ist auch bekannt, dass gleichzeitig Trägermaterialien verwendet werden können. Diese Formulierungen werden üblicherweise dadurch hergestellt, dass man Lösungen von natürlich vorkommenden oder synthetischen gelbildenden Polymeren, zum Beispiel Alginaten, und wässrigen Salzlösungen von mehrwertigen Metallionen vermischt, so dass einzelne Tröpfchen gebildet werden, wobei die Mikroorganismen in einer der beiden oder in beiden Reaktionslösungen suspendiert sein können. Die Gelbildung beginnt mit dem Vermischen in Tropfenform. Ein anschließendes Trocknen dieser Gelpartikel ist möglich. Dieses Verfahren wird als ionotrope Gelbildung bezeichnet. Je nach dem Trocknungsgrad werden kompakte harte Polymerpartikel, die strukturmäßig über mehrwertige Kationen vernetzt sind und die die Mikroorganismen und einen vorhandenen Träger hauptsächlich einheitlich verteilt umfassen, gebildet. Die Größe der Partikel kann bis zu 5 mm betragen.
  • Zusammensetzungen auf Basis von teilweise vernetzten Polysacchariden, die zusätzlich zu einem Mikroorganismus zum Beispiel auch feinteilige Kieselsäure als Trägermaterial umfassen können, wobei die Vernetzung zum Beispiel durch Ca++-Ionen stattfinden kann, sind in EP-A1-0 097571 beschrieben. Die Zusammensetzungen weisen eine Wasseraktivität von maximal 0,3 auf. W. J. Cornick et al. beschreiben in einem Übersichtsartikel [New Directions in Biological Control: Alternatives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, Seiten 345–372, Alan R. Liss, Inc. (1990)] verschiedene Formulierungssysteme, wobei Granulate mit Vermiculit als Träger und kompakte Alginat-Beads, die durch das ionotrope Gelbildungsverfahren hergestellt werden, erwähnt werden. Solche Zusammensetzungen sind auch von D. R. Fravel in Pesticide Formulations and Application Systems: 11. Band, ASTM STP 1112 American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, Seiten 173 bis 179 beschrieben und können für die Formulierung der erfindungsgemäßen rekombinanten Mikroorganismen eingesetzt werden.
  • Die entomoziden Zusammensetzungen des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung enthalten üblicherweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 99%, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 95%, und am stärksten bevorzugt ungefähr 3 bis ungefähr 90% Wirkstoff, ungefähr 1 bis ungefähr 99,9%, vorzugsweise ungefähr 1 bis ungefähr 99% und am stärksten bevorzugt ungefähr 5 bis ungefähr 95% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und ungefähr 0 bis ungefähr 25%, vorzugsweise ungefähr 0,1 bis ungefähr 25% und am meisten bevorzugt ungefähr 0,1 bis ungefähr 20% eines Tensids.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des allgemeinen Stands der Technik der Erfindung enthalten die entomoziden Zusammensetzungen üblicherweise 0,1 bis 99%, vorzugsweise 0,1 bis 95%, eines rekombinanten Bacillus spp.-Stamms, wie eines Bacillus cereus-Stamms oder eines Bacillus thuringiensis-Stamms, der mindestens ein DNA-Molekül enthält, das eine Nukleotidsequenz, die für die neuen insektenspezifischen Proteine codiert, in rekombinanter Form umfasst, oder eine Kombination davon mit anderen Wirkstoffen, 1 bis 99,9% eines festen oder flüssigen Hilfsstoffs und 0 bis 25%, vorzugsweise 0,1 bis 20%, eines Tensids.
  • Während Handelsprodukte vorzugsweise als Konzentrate formuliert werden, wird der Endverbraucher üblicherweise verdünnte Formulierungen mit einer wesentlich niedrigeren Konzentration verwenden. Die entomoziden Zusammensetzungen können auch noch weitere Bestandteile wie Stabilisatoren, Schaumhemmer, Viskositätsregulatoren, Bindemittel, Haftmittel sowie Düngemittel oder sonstige Wirkstoffe enthalten, um spezifische Effekte zu erzielen.
  • Die Erfindung, die nun allgemein beschrieben wurde, wird nun durch Bezugnahme auf die folgenden detaillierten Beispiele, die für Erläuterungszwecke bereitgestellt werden und, falls nicht anders erwähnt, nicht als erfindungsbegrenzend gelten sollen, besser verstanden werden.
  • Es wurde eine Standardnomenklatur entwickelt, die auf der Sequenzidentität der von der vorliegenden Erfindung umfassten Proteine beruht. Die Gen- und Proteinbezeichnungen für die detaillierten Beispiele, die nun folgen, und ihr Verhältnis zu den in der Hauptanmeldung [US-Anmeldung mit der Seriennr. 314594/08] verwendeten Bezeichnungen sind im Folgenden angegeben.
    Gen- bzw. Proteinbezeichnung gemäß Standardnomenklatur Gen- bzw. Proteinbezeichnung in der Hauptanmeldung Beschreibung des Proteins
    VIP3A(a) - VIP aus Stamm AB88 gemäß SEQ ID NO: 1 der vorliegenden Anmeldung
    VIP3A(b) - VIP aus Stamm AB424 gemäß SEQ ID NO: 4 der vorliegenden Anmeldung
  • VERSUCHSTEIL
  • Formulierungsbeispiele
  • Bei dem in den folgenden Formulierungsbeispielen verwendeten Wirkstoff handelt es sich um Bacillus cereus-Stamm AB78 mit der Eintragsnummer NRRL B-21058; um Bacillus thuringiensis-Stämme mit den Eintragsnummern NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 und NRRL 321439; und um Bacillus spp.-Stämme mit den Eintragsnummern NRRL B-21228, NRRL B-21229 und NRRL B-21230. Alle erwähnten Stämme sind natürliche Isolate, die die erfindungsgemäßen insektenspezifischen Proteine umfassen.
  • Alternativ dazu werden die isolierten insektenspezifischen Proteine als Wirkstoff verwendet, und zwar entweder allein oder in Kombination mit den oben erwähnten Bacillus-Stämmen.
    A1. Spritzpulver
    a) b) c)
    Bacillus thuringiensis-Sporen 25% 50% 75%
    Natriumligninsulfonat 5% 5% -
    Natriumlaurylsulfat 3% - 5%
    Natriumdiisobutylnaphthalinsulfonat - 6% 10%
    Octylphenolpolyethylenglykolether (7–8 mol Ethylenoxid) - 2% -
    hochdispergierte Kieselsäure 5% 10% 10%
    Kaolin 62% 27% -
  • Die Sporen werden gründlich mit den Hilfsstoffen vermischt und die Mischung wird gründlich in einer geeigneten Mühle gemahlen, wodurch man Spritzpulver erhält, die mit Wasser auf Suspensionen der gewünschten Konzentrationen verdünnt werden können.
    A2. Emulsionskonzentrat
    Bacillus thuringiensis-Sporen 10%
    Octylphenolpolyethylenglykolether (4–5 mol Ethylenoxid) 3%
    Calciumdodecylbenzolsulfonat 3%
    Rizinusölpolyglykolether (36 mol Ethylenoxid) 4%
    Cyclohexanon 30%
    Xylolmischung 50%
  • Emulsionen jeder beliebigen Konzentration können aus diesem Konzentrat durch Verdünnen mit Wasser erhalten werden.
    A3. Stäubemittel
    a) b)
    Bacillus thuringiensis-Sporen 5% 8%
    Talk 95% -
    Kaolin - 92%
  • Gebrauchsfertige Stäubemittel werden dadurch erhalten, dass man den Wirkstoff mit den Trägern vermischt und die Mischung in einer geeigneten Mühle vermahlt.
    A4. Extrusionsgranulat
    Bacillus thuringiensis-Sporen 10%
    Natriumligninsulfonat 2%
    Carboxymethylcellulose 1%
    Kaolin 87%
  • Der Wirkstoff oder die Kombination wird mit den Hilfsstoffen vermischt und vermahlen und die Mischung wird anschließend mit Wasser befeuchtet. Die Mischung wird extrudiert, granuliert und dann im Luftstrom getrocknet.
    A5. Beschichtetes Granulat
    Bacillus thuringiensis-Sporen 3%
    Polyethylenglykol (Molekulargewicht 200) 3%
    Kaolin 94%
  • Der Wirkstoff oder die Kombination wird in einem Mischer einheitlich auf das mit Polyethylenglykol befeuchtete Kaolin aufgetragen. Auf diese Weise erhält man nichtstaubende beschichtete Granulate.
    A6. Suspensionskonzentrat
    Bacillus thuringiensis-Sporen 40%
    Ethylenglykol 10%
    Nonylphenolpolyethylenglykolether (15 mol Ethylenoxid) 6%
    Natriumligninsulfonat 10%
    Carboxymethylcellulose 1%
    37%ige wässrige Formaldehydlösung 0,2%
    Silikonöl in Form einer 75%igen wässrigen Lösung 0,8%
    Wasser 32%
  • Der Wirkstoff oder die Kombination wird innig mit den Hilfsstoffen vermischt, wodurch man zu einem Suspensionskonzentrat gelangt, aus dem durch Verdünnen mit Wasser Suspensionen jeder beliebigen Konzentration erhalten werden können.
  • BEISPIEL 1. BAKTERIENKULTUR
  • Das folgende Medium, das unter der Bezeichnung TB-Bouillon bekannt ist, wurde mit einer Subkultur des Bc-Stamms AB78 inokuliert.
    Trypton 12 g/l
    Hefeextrakt 24 g/l
    Glycerin 4 ml/l
    KH2PO4 2,1 g/l
    K2HPO4 14,7 g/l
    pH 7,4
  • Das Kaliumphosphat wurde zu der autoklavierten Bouillon nach dem Abkühlen hinzugefügt. Die Kolben wurden bei 30°C Rotationsschüttler bei 250 U/min inkubiert, und zwar für 24 h–36 h, was eine frühe bis mittlere log-Wachstumsphase darstellt.
  • Unter Einsatz von gut fachbekannten Vorgehensweisen kann die oben genannte Vorgehensweise leicht durch ein Scale-Up an große Fermente angepasst werden.
  • Während des vegetativen Wachstums, üblicherweise 24–36 h nach Beginn der Kultur, was eine frühe bis mittlere log-Wachstumsphase darstellt, wurden die AB78-Bakterien von dem Kulturüberstand abzentrifugiert. Der Kulturüberstand, der das aktive Protein enthielt, wurde in Bioassays eingesetzt.
  • BEISPIEL 2. INSEKTEN-BIOASSAYS
  • Der B. cereus-Stamm AB78 wurde wie unten beschrieben gegen verschiedene Insekten geprüft.
  • Westlicher, Nördlicher und Südlicher Maiswurzelbohrer, Diabrotica virgifera virgifera, D. longcornis barberi bzw. D. undecempunctata howardi: Es wurden Verdünnungen von 24–36 h lang kultiviertem AB78-Kulturüberstand hergestellt, mit geschmolzener Kunstnahrung (Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290–293) vermischt und verfestigen gelassen. Die verfestigte Nahrung wurde zerschnitten und in Schälchen gegeben. Frisch geschlüpfte Larven wurden auf die Nahrung gesetzt und bei 30°C aufbewahrt. Die Mortalität wurde nach 6 Tagen bestimmt.
  • E. coli-Klon-Bioassay: E. coli-Zellen wurden in Kultur, die 100 μg/ml Ampicilin enthielt, bei 37°C über Nacht herangezogen. 10 ml Kultur wurden dreimal ultraschallbehandelt, und zwar jeweils 20 s lang. 500 μl der ultraschallbehandelten Kultur wurde zu geschmolzener Nahrung des Westlichen Maiswurzelbohrers hinzugefügt.
  • Kartoffelkäfer, Leptinotarsa decemlineata: Mit 24–36 h lang herangezogenem AB78-Kulturüberstand wurden Verdünnungen mit Triton X-100 (auf eine Endkonzentration von 0,1% TX-100) hergestellt. Fünf cm2 große Kartoffelblattstücke wurden in diese Lösungen eingetaucht, an der Luft getrocknet und auf befeuchtetes Filterpapier in Plastikschälchen gegeben. Frisch geschlüpfte Larven wurden auf die Blattstücke gesetzt und bei 30°C aufbewahrt. Die Mortalität wurde nach 3–5 Tagen bestimmt.
  • Gemeiner Mehlkäfer, Tenebrio molitor. Es wurden Verdünnungen von 24–36 h lang herangezogenem AB78-Kulturüberstand hergestellt, mit geschmolzener Kunstnahrung (Bioserv #F9240) vermischt und verfestigen gelassen. Die verfestigte Nahrung wurde zerschnitten und in Plastikschälchen gegeben. Frisch geschlüpfte Larven wurden auf die Nahrung gesetzt und bei 30°C aufbewahrt. Die Mortalität wurde nach 6–8 Tagen bestimmt.
  • Maiszünsler, Ypsiloneule, Amerikanische Tabakknospeneule, Tobacco Hornworm und Zuckerrübeneule; Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Manduca sexta bzw. Spodoptera exigua: Mit 24–36 h lang herangezogenem AB78-Kulturüberstand wurden Verdünnungen mit TX-100 (auf eine Endkonzentration von 0,1% TX-100) hergestellt. 100 μl wurden auf die Oberfläche von 18 cm2 verfestigtem Kunstfutter (Bioserv #F9240) pipettiert und an der Luft trocknen gelassen. Frisch geschlüpfte Larven wurden dann auf die Oberfläche der Nahrung gesetzt und bei 30°C aufbewahrt. Die Mortalität wurde nach 3–6 Tagen bestimmt.
  • Hausstechmücke, Culex pipiens: Mit 24–36 h lang herangezogenem AB78-Kulturüberstand wurden Verdünnungen hergestellt. 100 μl wurden in 10 ml Wasser in einer 30-ml-Plastikschale pipettiert. Larven des dritten Larvenstadiums wurden in das Wasser gegeben und bei Raumtemperatur aufbewahrt. Die Mortalität wurde nach 24–48 Stunden bestimmt. Das Spektrum der entomoziden Aktivität von AB78 ist in Tabelle 14 angegeben. TABELLE 14
    Aktivität von AB78-Kulturüberstand gegen verschiedene Insektenarten
    Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt geprüfte Insektenarten Ordnung Aktivität
    Westlicher Maiswurzelbohrer (Diabrotica virgifera virgifera) Col +++
    Bis zum gegenwärtigen Zeitpunkt geprüfte Insektenarten Ordnung Aktivität
    Nördlicher Maiswurzelbohrer (Diabrotica longicornis barberi) Col +++
    Südlicher Maiswurzelbohrer (Diabrotica undecimpunctata howardii) Col -
    Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata) Col -
    Gemeiner Mehlkäfer (Tenebrio molitor) Col -
    Maiszünsler (Ostrinia nubilalis) Lep -
    Amerikanische Tabakknospeneule (Heliothis virescens) Lep -
    Tobacco Hornworm (Manduca sexta) Lep -
    Zuckerrübeneule (Spodoptera exigua) Lep -
    Ypsiloneule (Agrotis ipsilon) Lep -
    Hausstechmücke (Culex pipiens) Dip -
  • Der neu entdeckte B. cereus-Stamm AB78 wies im Vergleich zu bekannten gegen Coleopteren wirksamen δ-Endotoxinen aus Bt. ein signifikant unterschiedliches Insektizidwirkungsspektrum auf. Insbesondere wies AB78 eine selektivere Wirksamkeit gegen Käfer als bekannte gegen Coleopteren wirksame Bt-Stämme auf, und zwar insofern, als er spezifisch gegen Diabrotica spp. wirksam war. Genauer gesagt war er am stärksten gegen D. virgifera virgifera und D. longicornis barberi, jedoch nicht gegen D. undecimpuntata howardi wirksam.
  • Mit verschiedenen Bacillus-Stämmen wurde ein Bioassay für Wirksamkeit während des vegetativen Wachstums (Tabelle 15) gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass AB78 insofern einzigartig ist, als eine Wirksamkeit gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer eine Erscheinung ist, die nicht allgemein auftritt. TABELLE 15
    Wirksamkeit von Kulturüberständen von verschiedenen Bacillus spp. gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer (WCRW)
    Baccillus-Stamm WCRW-Mortalität in Prozent
    B. cereus AB78 (Bat. 1) 100
    B. cereus AB78 (Bat. 2) 100
    B. cereus (Carolina Bio.) 12
    B. cereus ATCC 11950 12
    B. cereus ATCC 14579 8
    B. mycoides (Carolina Bio.) 30
    B. popilliae 28
    B. thuringiensis HD 135 41
    B. thuringiensis HD191 9
    B. thuringiensis GC91 4
    B. thuringiensis isrealensis 24
    Wasserkontrolle 4
  • Die spezifische Wirksamkeit von AB78 gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer ist in Tabelle 16 dargestellt. TABELLE 16
    Wirksamkeit von AB78-Kulturüberstand gegen den Westlichen Maiswurzelbohrer (frisch geschlüpft)
    Konzentration des Kulturüberstands (μl/ml) WCRW-Mortalität in Prozent
    100 100
    25 87
    10 80
    5 40
    2,5 20
    1 6
    0 0
  • Der LC50-Wert wurde als 6,2 μl Kulturüberstand pro ml WCRW-Nahrung berechnet.
  • Mit dem Zell-Pellet wurde ebenfalls ein Bioassay durchgeführt und es wurde keine Wirksamkeit gegen den WCRW beobachtet. Das Vorhandensein einer Wirksamkeit ausschließlich im Überstand zeigt, dass es sich bei diesem VIP um ein Exotoxin handelt.
  • BEISPIEL 3. COSMID-KLONIERUNG VON GESAMT-DNA AUS B. CEREUS-STAMM AB78
  • Das VIP1A(a)-Gen wurde aus Gesamt-DNA, die aus Stamm AB78 präpariert wurde, kloniert, und zwar folgendermaßen:
    Die AB78-DNA wurde folgendermaßen isoliert:
    • 1. Bakterien über Nacht in 10 ml L-Bouillon heranziehen (steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen verwenden)
    • 2. Mit 25 ml frischer L-Bouillon und Ampicillin (30 μg/ml) versetzen.
    • 3. Zellen unter Schütteln 2–6 h bei 30°C heranziehen.
    • 4. Zellen in 50-ml-Polypropylenröhrchen mit orangem Verschluss in IEC-Labor-Klinikzentrifuge bei 3/4 der Geschwindigkeit zentrifugieren.
    • 5. Zell-Pellet in 10 ml TES (TES = 50 mM TRIS pH 8,0, 100 mM EDTA, 15 mM NaCl) resuspendieren.
    • 6. Mit 30 mg Lysozym versetzen und 2 h bei 37°C inkubieren.
    • 7. Mit 200 μl 20% SDS und 400 μl Proteinase-K-Vorratslösung (20 mg/ml) versetzen. Bei 37°C inkubieren.
    • 8. Mit 200 μl frischer Proteinase K versetzen. 1 h bei 55°C inkubieren. Mit 5 ml TES auf 15 ml Endvolumen versetzen.
    • 9. Zweimal mit Phenol extrahieren (10 ml Phenol, bei Raumtemperatur bei 3/4 der Geschwindigkeit in einer IEC-Klinik-Tischzentrifuge zentrifugieren).
    Überstand (obere Phase) mit weiter Pipette in ein sauberes Röhrchen überführen.
    • 10. Einmal mit 1:1 (Volumen) Phenol:Chloroform/Isoamylalkohol (Verhältnis 24:1) extrahieren.
    • 11. DNA mit gleichem Volumen kaltem Isopropanol fällen; Zentrifugieren, um die DNA zu pelletieren.
    • 12. Pellet in 5 ml TE resuspendieren.
    • 13. DNA mit 0,5 ml 3 M NaOAc pH 5,2 und 11 ml 95% Ethanol fällen. 2 h bei –20°C aufbewahren.
    • 14. DNA aus dem Röhrchen mit Plastiköse herausziehen, in Mikrozentrifugenröhrchen überführen, zentrifugieren, überschüssiges Ethanol abpipettieren, im Vakuum trocknen.
    • 15. In 0,5 ml TE resuspendieren. 90 min bei 65°C inkubieren, um die Wiederauflösung der DNA zu unterstützen.
    • 16. Konzentration mit standardmäßigen Vorgehensweisen bestimmen.
  • Cosmidklonierung von AB78
  • Alle Vorgehensweisen erfolgten, falls nicht anders erwähnt, gemäß der Stratagene-Vorschrift, Superoos 1 Handbuch, Kat. Nr. 251301.
  • Im Allgemeinen lauteten die Schritte folgendermaßen:
    • A. Teilweiser Verdau der AB78-DNA mit Sau3A.
    • B. Vektor-DNA-Präparation
    • C. Ligation und Verpackung der DNA
    • D. Titration der Cosmidbibliothek
    • 1. HB101-Zellkultur dadurch beginnen, dass 50 ml einer Übernachtkultur in 5 ml TB mit 0,2% Maltose gegeben werden. 3,5 h bei 37°C inkubieren.
    • 2. Zellen abzentrifugieren und in 0,5 ml 10 mM MgSO4 resuspendieren.
    • 3. Folgendes zusammengeben: 100 l Zellen 100 l verdünnte Verpackungsmischung 100 l 10 mM MgSO4 30 l TB
    • 4. Bei Raumtemperatur 30 Minuten ohne Schütteln adsorbieren lassen.
    • 5. Mit 1 ml TB versetzen und vorsichtig vermischen. 30 Minuten bei 37°C inkubieren.
    • 6. 200 l auf L-amp-Platten ausplattieren. Über Nacht bei 37°C inkubieren.
  • Es wurden mindestens 400 Cosmidklone zufallsmäßig ausgewählt und wie in Beispiel 2 beschrieben auf Wirksamkeit gegen den Westlichen Maiswurzelwurm gescreent. Die DNA aus 5 Klonen mit Wirksamkeit und 5 Klonen ohne Wirksamkeit wurden in Southern-Hybridisierungen eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die Hybridisierung mit der oben beschriebenen Oligonukleotidsonde mit Wirksamkeit gegen den Westlichen Maiswurzelwurm korreliert (Tabelle 18).
  • Die Cosmidklone P3-12 und P5-4 wurden bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) hinterlegt und es wurden ihnen die Eintragsnummern NRRL B-21061 bzw. NRRL B-21059 gegeben. TABELLE 18
    Wirksamkeit von AB78-Cosmidklonen gegen den Westlichen Maiswurzelwurm
    Klon Mittlere Mortalität in Prozent (N = 4)
    Klone, die mit der Sonde hybridisieren
    P1-73 47
    P1-83 64
    P2-2 69
    P3-12 85
    P5-4 97
    Klone, die mit der Sonde nicht hybridisieren
    P1-2 5
    P3-8 4
    P3-9 12
    P3-18 0
    P4-6 9
  • BEISPIEL 4. AUFREINIGUNG VON VIPs AUS STAMM AB88:
  • Eine Bakterien-Flüssigkultur wurde über Nacht [12 h lang] bei 30°C in TB-Medium gezüchtet. Die Zellen wurden 20 Minuten bei 5000 × g abzentrifugiert und der Überstand wurde aufbewahrt. Die in dem Überstand vorhandenen Proteine wurden mit Ammoniumsulfat (70% Sättigung) gefällt, zentrifugiert [15 Minuten bei 5000 × g] und das Pellet wurde aufbewahrt. Das Pellet wurde im ursprünglichen Volumen von 20 mM Tris pH 7,5 resuspendiert und über Nacht bei 4°C gegen denselben Puffer dialysiert. Das AB88-Dialysat war trüber als vergleichbares Material aus AB78. Das Dialysat wurde dann mit 20 mM Natriumcitrat (pH 2,5) auf pH 4,5 titriert und die Lösung wurde nach 30-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur 10 min bei 3000 × g zentrifugiert. Das Proteinpellet wurde in 20 mM Bis-Tris-Propan pH 9,0 gelöst.
  • Die AB88-Proteine wurden nach dem Klären nach mehreren unterschiedlichen Methoden getrennt, darunter isoelektrische Fokussierung (Rotofor, BioRad, Hercules, CA), Fällung bei pH 4,5, Ionenaustauschchromatographie, Größenausschlusschromatographie und Ultrafiltration. Die Proteine wurde auf einer Anionenaustauschsäule des Typs Poros HQ/N (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 500 mM NaCl in 20 mM Bis-Tris-Propan pH 9,0 bei einer Durchflussrate von 4 ml/min aufgetrennt. Das insektizide Protein eluierte bei 250 mM NaCl.
  • Das Protein mit Wirksamkeit gegen den Maiszünsler (ECB) blieb in dem Pellet, das durch Fällung des Dialysats bei pH 4,5 erhalten wurde. Bei Durchführung einer präparativen IEF mit dem Dialysat mit Ampholyten von pH 3–10 wurde eine ECB-Insektizidwirksamkeit in allen Fraktionen mit pH 7 oder darüber beobachtet. Die SDS-PAGE-Analyse dieser Fraktionen zeigte Proteinbanden mit einem MG von ~60 kDa und ~80 kDa. Die Banden mit 60 kDa und 80 kDa wurden durch Anionenaustausch-HPLC an einer Säule des Typs Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) getrennt. Die N-terminale Sequenz wurde von zwei Fraktionen erhalten, die Proteine mit leicht unterschiedlichen Molekulargewichten enthielten, wobei jedoch beide eine Größe von ungefähr 60 kDa aufwiesen. Die erhaltenen Sequenzen waren zueinander und zu manchen δ-Endotoxinen ähnlich.
  • Als das Pellet mit ECB-Wirkung, das bei pH 4,5 erhalten worden war, durch Anionenaustausch auf einer Säule des Typs Poros-Q weiter aufgetrennt wurde, erwies sich, dass die Wirksamkeit nur in den Fraktionen auftrat, die eine Hauptbande mit ~60 kDa enthielten.
  • Das Protein mit Aktivität gegen die Ypsiloneule verblieb auch dann in dem Pellet, wenn der pH-Wert des AB88-Dialysats auf 4,5 erniedrigt wurde. Bei der präparativen IEF mit Ampholyten von pH 3–10 wurde in den IEF-Fraktionen mit ECB-Wirksamkeit keine Aktivität gefunden; stattdessen war sie in den Fraktionen mit pH 4,5–5,0 am höchsten. Ihre Hauptkomponenten weisen Molekulargewichte von ~35 und ~80 kDa auf.
  • Das bei pH 4,5 erhaltene Pellet wurde mittels Anionenaustausch-HPLC aufgetrennt, wodurch man Fraktionen erhielt, die nur das Material mit 35 kDa enthielten, und Fraktionen, die sowohl 35-kDa-Banden als auch 80-kDa-Banden enthielten.
  • BEISPIEL 5. CHARAKTERISIERUNG VON AB88-VIP
  • Fraktionen, die die verschiedenen vegetativen Proteine mit Lepidopterenwirksamkeit enthielten, wurden wie in Beispiel 4 beschrieben hergestellt. Die Fraktionen mit insektizider Wirksamkeit wurden in 8- bis 16%igen SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen [LeGendre et al., (1989) in: A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for Microsequencing, Hrsg. Matsudaria PT (Academic Press Inc., New York). Die biologische Analyse der Fraktionen zeigte, dass für die Wirksamkeit gegen unterschiedliche Lepidopterenarten unterschiedliche VIPs verantwortlich waren.
  • Die Wirksamkeit gegen Agrotis ipsilon beruht auf einem Protein mit 80 kDa und/oder einem Protein mit 35 kDa, entweder bei alleiniger Abgabe oder bei kombinierter Abgabe. Diese Proteine sind mit keinem der Bt-δ-Endotoxine verwandt, wie dies durch einen Mangel an Sequenzhomologie mit bekannten Bt-δ-Endotoxinsequenzen nachweisbar war. Das insektizide vip3A(a)-Protein aus Stamm AB88 liegt größtenteils (mindestens 75% des Gesamtwerts) in den Überständen der AB88-Kulturen vor.
  • Außerdem treten diese Proteine nicht in dem AB88-δ-Endotoxinkristall auf. Die N-terminalen Sequenzen der wichtigsten δ-Endotoxinproteine wurden mit den N-terminalen Sequenzen des VIPs mit 80 kDa und mit 35 kDa verglichen und es wurde keine Sequenzhomologie beobachtet. Die N-terminale Sequenz des insektiziden vip3A(a)-Proteins weist mehrere positiv gelandene Reste auf (von Asn2 bis Asn7), woran sich eine hydrophobe Core-Region (von Thr8 bis Ile34) anschließt. Im Gegensatz zu den meisten der bekannten Sekretionsproteine wird das insektizide vip3A(a)-Protein aus Stamm AB88 während des Exports nicht N-terminal prozessiert.
  • Die Wirksamkeit gegen Ostrinia nubilalis beruht auf einem VIP mit 60 kDa und die Wirksamkeit gegen Spodoptera frugiperda auf einem VIP mit unbekannter Größe.
  • Der Bacillus thuringiensis-Stamm AB88 wurde beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Region Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illiois 61604, USA hinterlegt und erhielt die Eintragsnummer NRRL B-21225.
  • BEISPIEL 6. ISOLATION UND BIOLOGISCHE WIRKSAMKEIT VON B. THURINGIENSIS AB424
  • Ein B. thuringiensis-Stamm mit der Bezeichnung AB424 wurde mit Hilfe von fachbekannten Standardmethoden aus einem moosbewachsenen Foehrenzapfen (Pine Cone) isoliert. Eine Subkultur von AB424 wurde wie in Beispiel 1 beschrieben gezüchtet und für den Bioassay vorbereitet.
  • Die biologische Wirksamkeit wurde wie in Beispiel 2 beschrieben ausgewertet. Die Ergebnisse lauten folgendermaßen:
    Prüf-Insektenart Mortalität in Prozent
    Ostrinia nubilalis 100
    Agrotis ipsilon 100
    Diabrotica virgifera virgifera 0
  • Der Stamm AB424 wurde bei der Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illiois 61604, USA hinterlegt und erhielt die Eintragsnummer NRRL B-21439.
  • BEISPIEL 7. KLONIERUNG DES VIP3A(a)- UND DES VIP3A(b)-GENS, DIE FÜR PROTEINE MIT WIRKSAMKEIT GEGEN DIE YPSILONEULE CODIEREN
  • Es wurde Gesamt-DNA aus den Isolaten AB88 und AB424 isoliert [Ausubel et al. (1988), in: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)] und mit den Restriktionsenzymen XbaI [Bibliothek von 4,0 bis 5,0 Kb großen größenfraktionierten XbaI-Fragmenten von B. thuringiensis-AB88-DNA] bzw. EcoRI [Bibliothek von 4,5 bis 6,0 Kb großen größenfraktionierten EcoRI-Fragmenten von B. thuringiensis AB424-DNA] verdaut, in den zuvor mit denselben Enzymen linearisierten und dephosphorylierten Vektor pBluescript ligiert und in den E. coli-Stamm DH5α hineintransformiert. Die rekombinanten Klone wurden auf Nitrocellulosefilter geblottet, die anschließend mit einem 32P-markierten, 33 Basen langen Oligonukleotid, das den 11-N-terminalen Aminosäuren des 80 kDa großen Proteins mit Wirksamkeit gegen Agrotis ipsilon (Ypsiloneule) entsprach, als Sonde in Kontakt gebracht wurden. Die Hybridisierung erfolgte 5 min lang bei 42°C in 2 × SSC/0,1% SDS (1 × SSC = 0,15 m NaCl/0,015 M Natriumcitrat, pH 7,4) und dann 10 min lang zweimal bei 50°C in 1 × SSC/0,1 SDS. Vier von 400 rekombinanten Klonen waren positiv. Insekten-Bioassays der positiven Rekombinanten wiesen eine Toxizität gegen Larven der Ypsiloneule auf, die mit derjenigen der Überstände von AB88 oder AB424 vergleichbar war.
  • Das Plasmid pCIB7104 enthält ein 4,5 Kb großes XbaI-Fragment der AB88-DNA. Es wurden Subklone konstruiert, um die Codierregion des insektiziden Proteins zu definieren.
  • E. coli pCIB7105 wurde dadurch konstruiert, dass man das 3,5 Kb große XbaI-AccI-Fragment von pCIB7104 in pBluescript hineinklonierte.
  • Das Plasmid pCIB7106 enthielt ein 5,0 Kb großes EcoRI-Fragment der AB424-DNA. Dieses Fragment wurde mit HincII weiter verdaut, wodurch man ein 2,8 kB großes EcoRI-HincII-Insert erhielt (pCIB7107), das noch für ein funktionelles insektizides Protein codierte.
  • Die Nukleotidsequenz von pCIB7104, einem positiven rekombinanten Klon von AB88, und von pCIB7107, einem positiven rekombinanten Klon von AB424, wurde mit dem Didesoxyabbruchverfahren nach Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463–5467 (1977) unter Verwendung der PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit und des PRISM Sequenase® Terminator Double-Stranded DNA Sequencing Kit bestimmt und mit einem automatischen Sequencer des Typs ABI 373 analysiert.
  • Der Klon pCIB7104 enthält das VIP3A(a)-Gen, dessen Codierregion in SEQ ID NO: 1 beschrieben ist, und die codierte Proteinsequenz ist in SEQ ID NO: 2 beschrieben. Eine synthetische Version der Codierregion, die dahingehend entwickelt wurde, dass sie stark in Mais exprimiert wird, ist in SEQ ID NO: 3 angegeben. Eine Fusion zwischen synthetischen und nativen Sequenzen ist in SEQ ID NO: 6 angegeben. Auf Grundlage der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz können beliebig viele synthetische Gene entwickelt werden.
  • Der Klon pCIB7107 enthält das VIP3A(b)-Gen, dessen Codierregion in SEQ ID NO: 4 beschrieben ist und das codierte Protein ist in SEQ ID NO: 5 beschrieben. Sowohl pCIB7104 als auch pCIB7107 wurden bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) hinterlegt und erhielten die Eintragsnummern NRRL B-21422 bzw. B-21423.
  • Das VIP3A(a)-Gen enthält ein offenes Leseraster (ORF), das sich von Nukleotid 732 bis 3105 erstreckt. Dieses ORF codiert für ein Peptid mit 791 Aminosäuren, was einer Molekülmasse von 88.500 Dalton entspricht. 6 Basen vor dem ersten Methionin befindet sich eine Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz und ihre Sequenz gibt eine starke SD für Bacillus an.
  • Das VIP3A(b)-Gen ist zu 98% mit VIP3A(a) identisch.
  • Wenn Blots von aus AB88-B.-thuringiensis-Zellen isolierter Gesamt-DNA mit einem 33 Basen großen Fragment, das die N-terminale Region des insektiziden VIP3A-Proteins überspannt, als Sonde in Kontakt gebracht wurden, konnten in den unterschiedlichen Restriktionsverdauen einzelne Banden beobachtet werden. Dieses Ergebnis wurde mit größeren Sonden, die die Codierregion des Gens überspannten, bestätigt. Eine Suche in der GenBank-Datenbank ergab keine Homologie mit bekannten Proteinen.
  • BEISPIEL 8. EXPRESSION DER INSEKTIZIDEN VIP3A-PROTEINE
  • Der Zeitverlauf der Expression des insektiziden VIP3A(a)-Proteins wurde mittels Western-Blot analysiert. Im Verlauf der Wachstumskurve und der Sporulation wurden Stichproben der Kulturen von Bacillus thuringiensis AB88 entnommen. Das insektizide VIP3A(a)-Protein kann in den Überständen der AB88-Kulturen während der logarithmischen Phase, nur 15 h nach Beginn der Kultur, nachgewiesen werden. Es erreichte während der frühen Stadien der stationären Phase sein Maximum und lag während und nach der Sporulation noch immer auf hohem Niveau. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn Überstände von Kulturen von Bacillus cereus AB424 verwendet wurden. Die Mengen an insektizidem VIP3A(a)-Protein entsprachen gemäß Bestimmung mittels Northern-Blot der Expression des VIP3A(a)-Gens. Der Beginn der Sporulation wurde durch direkte mikroskopische Beobachtungen sowie durch Analysieren des Vorhandenseins von δ-Endotoxinen in Zell-Pellets bestimmt. Proteine des Cry-I-Typs konnten spät während der stationären Phase, während und nach der Sporulation nachgewiesen werden.
  • BEISPIEL 9. IDENTIFIZIEREN VON NEUEN VIP3-ARTIGEN GENEN MITTELS HYBRIDISIERUNG
  • Um Bacillus zu identifizieren, der Gene mit Verwandtschaft zu VIP3A(a) aus Isolat AB88 enthielt, wurde eine Sammlung von Bacillus-Isolaten mittels Hybridisierung gescreent. Es wurden Kulturen von 463 Bacillus-Stämmen in Mikrotiternäpfchen gezüchtet, bis sie sporulierten. Zum Übertragen der Kulturen auf 150-mm-Platten, die L-Agar enthielten, verwendete man einen Kolonienstempel mit 96 Stiften. Die inokulierten Platten wurden 10 Stunden bei 30°C und dann über Nacht bei 4°C aufbewahrt. Die Kolonien wurden auf Nylonfilter geblottet und mit einem 1,2 Kb großen HindII-Fragment von VIP3A(a) als Sonde in Kontakt gebracht. Die Hybridiserung erfolgte über Nacht bei 62°C unter den Hybridisierungsbedingungen von Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982). Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS bei 62°C gewaschen und einem Röntgenfilm ausgesetzt.
  • Von den 463 gescreenten Bacillus-Stämmen enthielten 60 VIP3-artige Gene, die mittels Hybridisierung nachgewiesen werden konnten. Eine genauere Charakterisierung von einigen davon (AB6 und AB426) zeigte, dass ihre Überstände ein für BCW insektizides Protein enthalten, das dem VIP3-Protein mit Wirksamkeit gegen die Ypsiloneule ähnlich ist.
  • BEISPIEL 10. CHARAKTERISIERUNG EINES B. thuringiensis-STAMMS M2194, DER EIN KRYPTISCHES VIP3-ARTIGES GEN ENTHÄLT
  • Durch Koloniehybridisierung wie in Beispiel 8 beschrieben wurde gezeigt, dass ein B. thuringiensis-Stamm mit der Bezeichnung M2194 (ein) VIP3-artige(s) Gen(e) enthält. Das VIP3-artige Gen aus M2194 gilt deshalb als kryptisch, da weder durch Immunblot-Analyse mit polyklonalen Antikörpern gegen das aus AB88 isolierte VIP3A(a)-Protein noch durch Bioassay wie in Beispiel 2 beschrieben während allen bakteriellen Wachstumsphasen eine Expression nachgewiesen werden kann. Es wurde Antiserum gegen aufgereinigtes insektizides VIP3A(a)-Protein in Kaninchen hergestellt. An Nitrocellulose gebundenes Protein (50 μg) wurde in DMSO gelöst und mit komplettem Freund'schem Adjuvans (Difco) emulgiert. Zwei Kaninchen wurden drei Monate lang jeden Monat subkutan Injektionen verabreicht. 10 Tage nach der zweiten und dritten Injektion wurde Blut entnommen und aus der Blutprobe wurde Serum gewonnen [Harlow et al. (1988) in: Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY)].
  • Das VIP3-artige Gen aus M2194 wurde mit dem folgenden, in Beispiel 3 beschriebenen, Protokoll in pKS kloniert, wodurch man pCIB7108 erhielt. E. coli, die pCIB7108 mit dem VIP3-Gen aus M2194 enthielten, wiesen eine Wirksamkeit gegen die Ypsiloneule auf, was anzeigt, dass das Gen für ein funktionsfähiges Protein mit insektizider Wirksamkeit codiert. Das Plasmid pCIB7108 wurde bei der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) hinterlegt und erhielt die Eingangsnummer NRRL B-21438.
  • BEISPIEL 11. INSEKTIZIDE WIRKSAMKEIT DER VIP3A-PROTEINE
  • Das Wirksamkeitsspektrum der insektiziden VIP3A-Proteine wurde in Insekten-Bioassays, in denen Larven das rekombinante E. coli mit den VIP*A-Genen als Nahrung verabreicht wurde, qualitativ bestimmt. In diesen Assays waren Zellen mit dem VIP3A(a)- und dem VIP3A(b)-Gen gegenüber Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virscens und Helicoverpa zea insektizid. Unter denselben Versuchsbedingungen wiesen Bakterienextrakte, die VIP3A-Proteine enthielten, keinerlei Wirksamkeit gegen Ostrinia nubilalis auf.
    Auswirkung von insektiziden VIP*A-Proteinen auf Larven von Agrotis ipsilon
    Behandlung Mortalität (%)
    TB-Medium 5
    AB88-Überstand 100
    AB424-Überstand 100
    Puffer 7
    E. coli pKS 10
    E. coli pCIB7104 (AB88) 100
    E. coli pCIB7105 (AB88) 100
    E. coli pCIB7106 (AB424) 100
    E. coli pCIB7107 (AB424) 100
    Auswirkung von insektiziden VIP3A-Proteinen auf Larven von Lepidoptereninsekten
    Behandlung Insekt Mortalität (%)
    E. coli pKS BCW 10
    FAW 5
    BAW 10
    TBW 8
    CEW 10
    ECB 5
    E. coli pCIB7105
    E. coli pCIB7107 BCW 100
    FAW 100
    BAW 100
    TBW 100
    CEW 50
    ECB 10
    BCW = Ypsiloneule; FAW = Heerwurm; BAW = Zuckerrübeneule; TBW = Amerikanische Tabakknospeneule; CEW = Amerikanischer Baumwollkapselwurm; ECB = Maiszünsler
  • BEISPIEL 12. ISOLATION UND BIOLOGISCHE WIRKSAMKEIT VON WEITEREN BACILLUS SP.
  • Es wurden weitere Bacillus-Arten isoliert, die während des vegetativen Wachstums Proteine mit insektizider Wirksamkeit produzieren. Diese Stämme wurden mittels Standardmethoden aus Umweltproben isoliert. Es wurden wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben Isolate für den Bioassay hergestellt und im Assay geprüft. Die Isolate, die während des vegetativen Wachstums insektizide Proteine produzierten, die im Bioassay eine Aktivität gegen Agrotis ypsilon aufwiesen, sind in der Tabelle unten angeführt. Zwischen dem Vorhandensein eines δ-Endotoxinkristalls und der vegetativen Produktion eines insektiziden Proteins wurde keine Korrelation beobachtet.
    Bacillus-Isolat Vorhandensein eines δ-Endotoxinkristalls Mortalität in Prozent
    AB6 + 100
    AB53 - 80
    AB88 + 100
    AB195 - 60
    AB211 - 70
    AB217 - 83
    AB272 - 80
    AB279 - 70
    AB289 + 100
    AB292 + 80
    AB294 - 100
    AB300 - 80
    AB359 - 100
  • Die Isolate AB289, AB294 und AB359 wurden beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria II 61604, USA hinterlegt und erhielten die Eingangsnummern NRRL B-21227, NRRL B-21229 bzw. NRRL B-21226.
  • Bacillus-Isolate, die während des vegetativen Wachstums insektizide Proteine mit Wirksamkeit gegen Diabrotica virgifera virgifera produzieren, sind in der Tabelle unten angeführt.
    Bacillus-Isolat Vorhandensein eines δ-Endotoxinkristalls Mortalität in Prozent
    AB52 - 50
    AB59 - 71
    AB68 + 60
    AB78 - 100
    AB122 - 57
    AB218 - 64
    AB256 - 64
  • Die Isolate AB59 und AB256 wurden beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA hinterlegt und erhielten die Eingangsnummern NRRL B-21228 bzw. NRRL B-21230.
  • Die folgenden Hinterlegungen erfolgten beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria Illinois 61604, USA:
    Stammbezeichnung Hinterlegungsnummer Hinterlegungsdatum
    1. E. coli PL2 NRRL B-21221 9. März 1994
    2. E. coli PL2 NRRL B-21221N 2. September 1994
    3. E. coli pCI36022 NRRL B-21222 9. März 1994
    4. E. coli pCI36023 NRRL B-21223 9. März 1994
    5. E. coli pCI36023 NRRL B-21223N 2. September 1994
    6. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP NRRL B-21224 9. März 1994
    7. Bacillus thuringiensis AB88 NRRL B-21225 9. März 1994
    8. Bacillus thuringiensis AB359 NRRL B-21226 9. März 1994
    9. Bacillus thuringiensis AB289 NRRL B-21227 9. März, 1994
    10. Bacillus sp. AB59 NRRL B-21228 9. März 1994
    11. Bacillus sp. AB294 NRRL B-21229 9. März 1994
    12. Bacillus sp. AB256 NRRL B-21230 9. März 1994
    13. E. coli P5-4 NRRL B-21059 18. März 1993
    14. E. coli P3-12 NRRL B-21061 18. März 1993
    15. Bacillus cereus AB78 NRRL B-21058 18. März 1993
    16. Bacillus thuringiensis AB6 NRRL B-21060 18. März 1993
    17. E. coli pCIB6202 NRRL B-21321 2. September 1994
    18. E. coli pCIB7100 NRRL B-21322 2. September 1994
    19. E. coli pCIB7101 NRRL B-21323 2. September 1994
    20. E. coli pCIB7102 NRRL B-21324 2. September 1994
    21. E. coli pCIB7103 NRRL B-21325 2. September 1994
    22. E. coli pCIB7104 NRRL B-21422 24. März 1995
    23. E. coli pCIB7107 NRRL B-21423 24. März 1995
    24. E. coli pCIB7108 NRRL B-21438 5. Mai 1995
    25.Bacillus thuringiensis AB424 NRRL B-21439 5. Mai 1995
    SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01030001
    Figure 01040001
    Figure 01050001
    Figure 01060001
    Figure 01070001
    Figure 01080001
    Figure 01090001
    Figure 01100001
    Figure 01110001
    Figure 01120001
    Figure 01130001
    Figure 01140001
    Figure 01150001
    Figure 01160001
    Figure 01170001
    Figure 01180001
    Figure 01190001
    Figure 01200001
    Figure 01210001
    Figure 01220001
    Figure 01230001
    Figure 01240001
    Figure 01250001
    Figure 01260001
    Figure 01270001
    Figure 01280001
    Figure 01290001
    Figure 01300001

Claims (27)

  1. DNA-Molekül, das für ein vegetatives insektizides Protein, das während der vegetativen Wachstumsphase von Bacillus spp. isolierbar ist, codiert, wobei das Protein aus flüssigen Kulturmedien isolierbar ist und wobei das Protein von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die bei 65°C in einem Puffer, der 7% SDS und 0,5 M Natriumphosphat umfasst, mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 1, 3 oder 4 hybridisiert.
  2. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das für ein Protein gemäß SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 codiert.
  3. DNA-Molekül nach Anspruch 2 mit der in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 angegebenen Nukleotidsequenz.
  4. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die durch Verwendung von von Pflanzen bevorzugten Codons ganz oder teilweise für die Expression in einer Pflanze optimiert worden ist.
  5. DNA-Molekül nach Anspruch 4 mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Nukleotidsequenz.
  6. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die durch Verwendung von vom Wirt bevorzugten Codons ganz oder teilweise für die Expression in einem Mikroorganismus optimiert worden ist.
  7. DNA-Molekül nach Anspruch 1, das durch ein Verfahren erhältlich ist, das Folgendes umfasst: a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nukleotidsequenz, die für ein vegetatives insektizides Protein codiert, umfasst; und b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonukleotidsonde, die einen durchgehenden Abschnitt der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden, erhältlich von einem in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 definierten DNA-Molekül, umfasst; und c) Isolieren der hybridisierten DNA.
  8. Expressionskassette, umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1–7 in operativer Verknüpfung mit pflanzlichen Expressionssequenzen einschließlich den für die Expression der assoziierten DNA-Konstrukte in einem Wirtsorganismus erforderlichen Transkriptions- und Translationsregulationssignalen sowie gegebenenfalls weiteren Regulationssequenzen.
  9. Expressionskassette nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Wirtsorganismus um eine Pflanze handelt.
  10. Vektormolekül, umfassend eine Expressionskassette nach Anspruch 8.
  11. Wirtsorganismus, umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, Expressionskassette, umfassend das DNA-Molekül, oder Vektormolekül, umfassend die Expressionskassette, stabil in das Genom des Wirtsorganismus integriert.
  12. Wirtsorganismus nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren, Protozoen, Nematoden und Algen.
  13. Wirtsorganismus nach Anspruch 11, bei dem es sich um einen mit einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 8 oder 9 oder mit einem Vektormolekül nach Anspruch 10 transformierten Mikroorganismus handelt, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus vorzugsweise um einen Mikroorganismus, der sich auf Pflanzen vermehrt, handelt.
  14. Wirtsorganismus nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Mikroorganismus um a. ein wurzelkolonisierendes Bakterium oder einen Pseudomonas-Stamm; b. Bacillus thuringiensis AB424, der unter der Eintragsnummer NRRL B-21439 hinterlegt ist, handelt.
  15. Transgene Pflanze einschließlich Teile sowie Nachkommen und Samen davon, umfassend ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eine Expressionskassette nach Anspruch 9, stabil in das Pflanzengenom integriert.
  16. Pflanze nach Anspruch 15, die ein Protein mit der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 5 exprimiert.
  17. Pflanze nach Anspruch 16, die weiterhin ein zweites, unterschiedliches Insektenbekämpfungsprinzip, wie ein Bt-δ-Endotoxin exprimiert.
  18. Pflanze nach einem der Ansprüche 15–17, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mais, Sorgum, Weizen, Sonnenblume, Baumwolle, Reis, Sojabohne, Gerste und Raps.
  19. Pflanze nach Anspruch 18, bei der es sich um eine Maispflanze handelt.
  20. Pflanze nach Anspruch 18, bei der es sich um eine Baumwollpflanze handelt.
  21. Pflanze nach einem der Ansprüche 15 bis 20, bei der es sich um eine Hybridpflanze handelt.
  22. Saatgut einer Pflanze nach einem der Ansprüche 15 bis 20, die ein von einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 codiertes Protein exprimiert, behandelt mit einer das Saatgut schützenden Beschichtung.
  23. Verfahren zum Isolieren eines DNA-Moleküls nach Anspruch 1, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: a) Gewinnen eines DNA-Moleküls, das eine Nukleotidsequenz, die für ein vegetatives insektizides Protein codiert, umfasst; und b) Hybridisieren des DNA-Moleküls mit einer Oligonukleotidsonde, die einen durchgehenden Abschnitt der Codiersequenz für das insektenspezifische Protein mit einer Länge von mindestens 10 Nukleotiden, erhältlich von einem in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 oder SEQ ID NO: 4 definierten DNA-Molekül, umfasst; und c) Isolieren der hybridisierten DNA.
  24. Verfahren zur Erweiterung des Zielinsektenspektrums, dadurch gekennzeichnet, dass eine Expressionskassette nach Anspruch 8 gemeinsam mit mindestens einem zweiten insektiziden Protein, das sich von dem von der Expressionskassette codierten vegetativen insektiziden Protein unterscheidet, in einer Pflanze exprimiert wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite insektizide Protein aus der Gruppe Bt-δ-Endotoxine, Proteasehemmer, Lektine, α-Amylasen und Peroxidasen ausgewählt ist.
  26. Verfahren zum Schützen von Pflanzen gegen durch ein Schadinsekt verursachten Schaden, umfassend das Pflanzen einer Pflanze nach einem der Ansprüche 15 bis 21, die für ein DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das für ein vegetatives insektizides Protein, das von einer Nukleotidsequenz nach Anspruch 1 codiert wird, codiert und dieses exprimiert, transgen ist.
  27. Verfahren zur Herstellung einer Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein vegetatives insektizides Protein exprimiert, umfassend das Transformieren der Pflanze oder Pflanzenzellen mit einer Expressionskassette nach Anspruch 9 oder mit einem Vektormolekül nach Anspruch 10.
DE69532333T 1994-09-28 1995-09-27 Pestizid-proteine und stämme Expired - Lifetime DE69532333T3 (de)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31459494A 1994-09-28 1994-09-28
US314594 1994-09-28
US08/463,483 US5849870A (en) 1993-03-25 1995-06-05 Pesticidal proteins and strains
US463483 1995-06-05
EP95935394A EP0792363B2 (de) 1994-09-28 1995-09-27 Pestizid-proteine und stämme
PCT/EP1995/003826 WO1996010083A1 (en) 1994-09-28 1995-09-27 Novel pesticidal proteins and strains

Publications (3)

Publication Number Publication Date
DE69532333D1 DE69532333D1 (de) 2004-01-29
DE69532333T2 DE69532333T2 (de) 2004-10-07
DE69532333T3 true DE69532333T3 (de) 2013-03-14

Family

ID=26979445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69532333T Expired - Lifetime DE69532333T3 (de) 1994-09-28 1995-09-27 Pestizid-proteine und stämme

Country Status (24)

Country Link
US (9) US5849870A (de)
EP (3) EP1754789A3 (de)
JP (1) JPH10506532A (de)
KR (1) KR100419438B1 (de)
CN (1) CN1255539C (de)
AT (1) ATE256743T1 (de)
AU (1) AU692934B2 (de)
BG (1) BG101384A (de)
BR (1) BR9509099A (de)
CA (1) CA2199049C (de)
CZ (1) CZ290801B6 (de)
DE (1) DE69532333T3 (de)
DK (1) DK0792363T4 (de)
ES (1) ES2213162T5 (de)
HU (1) HU222264B1 (de)
IL (2) IL115382A (de)
MX (1) MX228013B (de)
PH (2) PH11995051386B1 (de)
PT (1) PT792363E (de)
RO (1) RO119835B1 (de)
RU (1) RU2196824C2 (de)
SI (1) SI0792363T2 (de)
TR (1) TR199501182A2 (de)
WO (1) WO1996010083A1 (de)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406690B1 (en) * 1995-04-17 2002-06-18 Minrav Industries Ltd. Bacillus firmus CNCM I-1582 or Bacillus cereus CNCM I-1562 for controlling nematodes
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
GB9611777D0 (en) * 1996-06-06 1996-08-07 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
JP2001507208A (ja) * 1996-07-01 2001-06-05 マイコーゲン コーポレーション 害虫に対して有効な毒素
US6369213B1 (en) 1996-07-01 2002-04-09 Mycogen Corporation Toxins active against pests
US7129212B2 (en) * 1996-10-30 2006-10-31 Mycogen Corporation Polynucleotides, pesticidal proteins, and novel methods of using them
US6242669B1 (en) 1996-10-30 2001-06-05 Mycogen Corporation Pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6603063B1 (en) 1999-05-07 2003-08-05 Mycogen Corp. Plants and cells transformed with a nucleic acid from Bacillus thuringiensis strain KB59A4-6 encoding a novel SUP toxin
AU5098398A (en) * 1996-10-30 1998-05-22 Mycogen Corporation Novel pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6002068A (en) * 1996-12-19 1999-12-14 Novartis Finance Corporation Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence
JP2001522238A (ja) * 1997-03-31 2001-11-13 アボツト・ラボラトリーズ 胃腸管の疾患の検出に有用な試薬および方法
JP2001524817A (ja) * 1997-04-03 2001-12-04 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 植物病原体抑制
US6103228A (en) 1997-05-09 2000-08-15 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
TR199902765T2 (xx) * 1997-05-09 2000-07-21 Agraquest, Inc. Bitki hastal�klar�, m�s�r kurduyla m�cadelede yeni bac�llus t�r�.
JP2002510201A (ja) * 1997-06-04 2002-04-02 ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤スクリーニング系
US6001637A (en) * 1997-08-22 1999-12-14 Agraquest, Inc. Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations
US6015553A (en) * 1997-08-22 2000-01-18 Agraquest, Inc. Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests
US5906818A (en) 1997-08-22 1999-05-25 Agraquest, Inc. Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm
US6027723A (en) * 1997-08-22 2000-02-22 Agraquest, Inc. Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm
GB9725556D0 (en) * 1997-12-03 1998-02-04 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US6972350B1 (en) 1998-07-15 2005-12-06 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Pest-resistant plants comprising a construct encoding a vacuole targeting sequence and avidin or streptavidin
AR020141A1 (es) * 1998-08-10 2002-04-10 Mycogen Corp Toxinas y genes pesticidas de cepas de bacillus laterosporus
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
AUPP841199A0 (en) * 1999-02-02 1999-02-25 Pinnock, Professor Dudley Edwin Control of mange
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
BR122013028999B1 (pt) 1999-03-30 2016-12-20 Agraquest Inc “sobrenadante separado uma cultura de caldo integral da cepa de bacillus pumilus designada nrrl b-30087, composição compreendendo o mesmo, bem como método para prevenir ou tratar uma planta, raiz ou fruto de uma infecção de fungos”
GB9909796D0 (en) 1999-04-28 1999-06-23 Plant Bioscience Ltd Pesticidal fumes
US7091399B2 (en) * 2000-05-18 2006-08-15 Bayer Bioscience N.V. Transgenic plants expressing insecticidal proteins and methods of producing the same
US6706860B2 (en) 2000-05-18 2004-03-16 Bayer Bioscience N.V. Toxins
CA2423552A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Irm Llc High throughput processing system and method of using
PT1988099E (pt) * 2001-01-09 2013-01-31 Bayer Cropscience Nv Proteínas inseticidas de bacillus thuringiensis
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
WO2003003653A2 (en) * 2001-06-26 2003-01-09 Versada Networks, Inc. Transcoding sms-based streamed messages to sip-based ip signals in wireless and wireline networks
US20030110840A1 (en) * 2001-07-24 2003-06-19 Arriaga Edgar A. Systems and methods for detecting a particle
CA2462615C (en) 2001-11-07 2012-06-26 Syngenta Participations Ag Promoters for regulation of gene expression in plant roots
US6589524B1 (en) 2002-02-07 2003-07-08 Ecomicrobials, Llc Strains of Bacillus for biological control of pathogenic fungi
DK1490397T3 (da) * 2002-03-22 2010-09-13 Bayer Bioscience Nv Nye Bacillus thuringiensis-insekticide proteiner
EP2360179A1 (de) * 2002-03-22 2011-08-24 Bayer BioScience N.V. Neue insektizide Proteine von Bazillus thuringiensis
US20040091505A1 (en) * 2002-06-26 2004-05-13 E.I Du Pont De Nemours And Company Genes encoding proteins with pesticidal activity
US7462760B2 (en) * 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
US7205454B2 (en) 2002-07-31 2007-04-17 Bayer Bioscience N.V. Corn root preferential promoters and uses thereof
GB0225129D0 (en) * 2002-10-29 2002-12-11 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20040220268A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Yoe-Sik Bae Compound that directly stimulates phospholipase C activity
US7700094B1 (en) * 2003-09-23 2010-04-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Acetyl esterase producing strains and methods of using same
US7521550B2 (en) 2003-12-01 2009-04-21 Syngenta Participations Ag Insect resistant cotton plants and methods of detecting the same
EP1708561B1 (de) 2003-12-16 2010-11-10 Monsanto Technology LLC Sekretiertes protein und genzusammensetzungen aus bacillus thuringiensis und deren verwendungen
CA2599465A1 (en) 2005-03-11 2006-09-14 Syngenta Limited Antibody based rodenticide
AU2006225065B2 (en) * 2005-03-14 2012-08-16 Ectotec Pty Ltd Control of sucking lice
CN101151040A (zh) * 2005-03-14 2008-03-26 微生物产品私人有限公司 吸血虱的控制
CN101300268A (zh) 2005-07-08 2008-11-05 墨西哥国立自治大学 新的具有杀虫活性的细菌蛋白质
ATE505548T1 (de) * 2005-08-31 2011-04-15 Monsanto Technology Llc Insektizidzusammensetzungen und verfahren zur herstellung von insektenbeständigen transgenen pflanzen
EP2455392A3 (de) 2006-06-15 2012-08-22 Athenix Corporation Pestizidproteinfamilie und Verwendungsverfahren dafür
CL2007002135A1 (es) * 2006-07-21 2008-03-14 Pioneer Hi Bred Int Acido nucleico de bacillus thuringiensis que codifican polipeptidos con actividad plaguicida; construccion de adn y celula huesped que lo comprenden; metodo de proteccion de una planta contra una plaga; polipeptidos y metodo de produccion; y composic
US20080300210A1 (en) * 2007-05-16 2008-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of Controlling Insects and Virus Transmission
US20110023194A1 (en) * 2007-12-11 2011-01-27 Syngenta Participations Ag Engineering zymogen for conditional toxicity
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use
US8110608B2 (en) 2008-06-05 2012-02-07 Ecolab Usa Inc. Solid form sodium lauryl sulfate (SLS) pesticide composition
EP2949659A1 (de) 2008-07-02 2015-12-02 Athenix Corporation Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 und axmi-184: pestizidproteine und verfahren zu deren verwendung
US20100199383A1 (en) * 2008-09-18 2010-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Coleopteran Activity
US20100077507A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
AR075114A1 (es) 2008-12-23 2011-03-09 Athenix Corp Gen de delta-endotoxina axmi-150 y metodos de uso del mismo
US20100210460A1 (en) 2009-02-19 2010-08-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
EP2957638B1 (de) 2009-02-27 2018-12-12 Athenix Corporation Pestizide proteine und verfahren zu deren verwendung
BRPI1013362A2 (pt) 2009-03-06 2015-09-01 Athenix Corp Métodos e composições para controle de pestes de planta.
WO2010141141A2 (en) 2009-03-11 2010-12-09 Athenix Corporation Axmi-001, axmi-002, axmi-030, axmi-035, and axmi-045: toxin genes and methods for their use
AR078052A1 (es) * 2009-07-02 2011-10-12 Athenix Corp Gen plaguicida axmi 205 de chromobacterium y metodos para su uso
US8461415B2 (en) 2009-07-31 2013-06-11 Athenix Corp. AXMI-192 family of pesticidal genes and methods for their use
EP2482639B1 (de) 2009-10-02 2017-08-02 Syngenta Participations AG Insektizide proteine
EA201290559A1 (ru) 2009-12-23 2013-01-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
AR079972A1 (es) 2009-12-23 2012-03-07 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
WO2011076889A1 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Bayer Cropscience Ag Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides
CA2785225C (en) 2009-12-23 2019-01-22 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides.
EP2516635B1 (de) 2009-12-23 2017-11-15 Bayer Intellectual Property GmbH Hppd-inhibitorherbizid-resistente pflanzen
US8968757B2 (en) 2010-10-12 2015-03-03 Ecolab Usa Inc. Highly wettable, water dispersible, granules including two pesticides
US8822762B2 (en) 2010-12-28 2014-09-02 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
MX2013009092A (es) 2011-02-11 2013-10-17 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas sinteticas activas contra el gusano de la raiz del maiz.
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
BR112013024659A2 (pt) 2011-03-25 2018-08-07 Bayer Ip Gmbh uso de n-(1,2,5-oxadiazol-3-il) benzamidas para controlar plantas indesejadas em áreas de plantas de cultura trangênica que são tolerantes a herbicidas inibidores de hppd
EP2688406B1 (de) 2011-03-25 2015-04-22 Bayer Intellectual Property GmbH Verwendung von n-(tetrazol-4-yl)- oder n-(triazol-3-yl)arylcarboxamiden oder ihren salzen zur bekämpfung unerwünschter pflanzen in bereichen mit transgenen nutzpflanzen mit hppd-inhibitorherbizidresistenz
US9090906B2 (en) 2011-03-30 2015-07-28 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
ES2743322T3 (es) * 2011-04-05 2020-02-18 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Gen insecticida variante AXMI115 y procedimientos de uso
MX2013012709A (es) 2011-05-02 2013-12-06 Pioneer Hi Bred Int Estrategia de analisis de arnm bacteriano para descubrir nuevas moleculas de acido nucleico codificante de pesticidas.
BR122020017359B1 (pt) 2011-07-28 2021-10-13 Syngenta Participations Ag Método para controle de uma praga de nemátodos
CN103173370B (zh) * 2011-12-06 2015-02-18 高小文 芽胞杆菌Gxw4-2培育及其防治害虫方法
PT2814965T (pt) 2012-02-16 2018-05-23 Syngenta Participations Ag Proteínas pesticidas manipuladas
AR090274A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Athenix Corp Gen de la toxina axmi335 de bacillus thuringiensis y sus metodos de empleo
WO2013134651A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of ndr1
CN102633884B (zh) * 2012-04-21 2013-07-31 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US9758793B2 (en) 2012-08-30 2017-09-12 Athenix Corp. AXMI-234 and AXMI-235 delta-endotoxin genes and methods for their use
CA2887575A1 (en) 2012-10-15 2014-04-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions to enhance activity of cry endotoxins
CN103039494A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
US9458374B2 (en) * 2012-12-18 2016-10-04 Schlumberger Technology Corporation Cystine proteases for bacterial control
US9783817B2 (en) 2013-03-04 2017-10-10 Arkansas State University Methods of expressing and detecting activity of expansin in plant cells
EP3626828A3 (de) 2013-03-07 2020-07-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Toxingene und verfahren zu ihrer verwendung
US9573980B2 (en) * 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
CN108823217B (zh) 2013-08-08 2022-02-11 先锋国际良种公司 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途
CN104651377A (zh) 2013-11-25 2015-05-27 浙江大学 新型的杀虫蛋白
MX2016010187A (es) * 2014-02-07 2017-07-11 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
EP3157331A4 (de) 2014-06-20 2017-12-27 Dow AgroSciences LLC Vegetative insektizide proteine zur bekämpfung von schadinsekten
US20160010062A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Isolated Spodoptera Frugiperda Multiple Nucleopolyhedroviruses and Methods for Killing Insects
BR122023020809A2 (pt) 2014-09-17 2024-01-23 Spogen Biotech Inc. Proteína de fusão
MX2017003610A (es) * 2014-09-17 2017-07-13 Bayer Cropscience Lp Composiciones que comprenden celulas recombinantes de bacillus y un fungicida.
CA2963555A1 (en) 2014-10-16 2016-04-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
CN106852153B (zh) 2014-10-16 2023-06-06 先锋国际良种公司 具有广谱活性的杀昆虫多肽和其用途
CN107810271B (zh) 2014-11-20 2021-09-28 耶路撒冷希伯来大学伊萨姆研发公司 用于在植物细胞中生产具有改变的糖基化模式的多肽的组合物和方法
WO2016106066A2 (en) 2014-12-22 2016-06-30 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2016168289A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
MA41951A (fr) 2015-04-22 2018-02-28 Agbiome Inc Gènes insecticides et procédés d'utilisation
RU2017144238A (ru) * 2015-05-19 2019-06-19 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные белки и способы их применения
CN108271390A (zh) 2015-06-03 2018-07-10 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因和使用方法
AU2016283985B2 (en) 2015-06-22 2021-01-21 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
RU2765310C2 (ru) * 2015-07-30 2022-01-28 Монсанто Текнолоджи Ллс Новые белки, проявляющие ингибирующую активность по отношению к насекомым
RU2021110857A (ru) 2015-12-22 2021-04-26 Агбайоми, Инк. Пестицидные гены и способы использования
US11781151B2 (en) 2016-04-14 2023-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal CRY1B variants having improved activity spectrum and uses thereof
WO2017184673A1 (en) 2016-04-19 2017-10-26 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
CN110214189A (zh) 2016-09-06 2019-09-06 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因和使用方法
CA3043493A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
WO2018140859A2 (en) 2017-01-30 2018-08-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
BR112019021380A2 (pt) 2017-04-11 2020-05-05 Agbiome Inc genes pesticidas e métodos de uso
EA201992824A1 (ru) 2017-05-26 2020-05-06 Пайонир Хай-Бред Интернэшнл, Инк. Инсектицидные полипептиды, обладающие улучшенным спектром активности, и пути их применения
BR112020002279A2 (pt) 2017-08-03 2020-07-28 AgBiome, Inc. genes pesticidas e métodos de uso
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests
US11492639B2 (en) 2017-12-19 2022-11-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides and uses thereof
EP3728606A1 (de) 2017-12-22 2020-10-28 Agbiome, Inc. Pestizidgene und verfahren zur verwendung
CA3097621A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 AgBiome, Inc. Pesticidal proteins and methods of use
US11780890B2 (en) 2020-11-24 2023-10-10 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CA3214227A1 (en) 2021-05-06 2022-11-10 Rebekah Deter Kelly Pesticidal genes and methods of use
CA3222198A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Mazen Animal Health Inc. Oral administration of coronavirus spike protein for altering cytokine levels and providing passive immunity to newborn pigs
WO2023107943A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024044596A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3651215A (en) * 1968-08-12 1972-03-21 Juro Morita Bacterial mosouito larva-killing agent
US3632747A (en) * 1968-08-20 1972-01-04 Juro Morita Bacterial fly-larva-killing agent
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4886664A (en) 1982-06-18 1989-12-12 Rhone-Poulenc, S.A. Low-water-activity inocula for biological control
EP0192319B1 (de) 1985-01-22 1992-07-15 Mycogen Corporation Zellulare Einkapselung biologischer Pestizide
DE3541893A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-11 Basf Ag Verfahren zur herstellung sporenfreier, konzentrierter protein-praeparate von mueckentoxischem bacillus thuringiensis serovar. israelensis sowie mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens bzw. verfahren zur gewinnung des mikroorganismus
US5024837A (en) * 1987-05-06 1991-06-18 Donovan William P Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use
US4996155A (en) * 1988-03-04 1991-02-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
US5011685A (en) * 1988-04-06 1991-04-30 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Baculovirus proteins and viral pesticides containing same
GB8910624D0 (en) * 1989-05-09 1989-06-21 Ici Plc Bacterial strains
TR26973A (tr) * 1990-04-16 1994-09-12 Ecogen Inc Bacillus thuringiensis cryie geni ve lepidoptera takimindan böceklere karsi zehirli protein.
WO1991016432A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
GB9023735D0 (en) * 1990-11-01 1990-12-12 Ici Plc Bacterial strain
US5277905A (en) * 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
CA2059897A1 (en) * 1991-02-25 1992-08-26 Kenneth E. Narva Bacillus thuringiensis genes encoding novel coleopteran-active protein toxins
US5262158A (en) * 1991-04-30 1993-11-16 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarida
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5384924A (en) * 1992-08-03 1995-01-31 Mallinckrodt Medical, Inc. Warming blanket having multiple inlets
JPH08508164A (ja) * 1993-03-25 1996-09-03 チバ−ガイギー アクチェンゲゼルシャフト 新規な殺病害虫タンパク質および株
GB9324529D0 (en) * 1993-11-30 1994-01-19 Univ Singapore Biological control agents

Also Published As

Publication number Publication date
US5990383A (en) 1999-11-23
HUT77449A (hu) 1998-04-28
IL115382A (en) 2010-06-16
ES2213162T5 (es) 2013-02-12
SI0792363T1 (en) 2004-04-30
EP1382611A3 (de) 2004-03-31
SI0792363T2 (sl) 2013-01-31
IL115382A0 (en) 1995-12-31
EP0792363B1 (de) 2003-12-17
DE69532333T2 (de) 2004-10-07
EP1754789A3 (de) 2009-11-11
RO119835B1 (ro) 2005-04-29
US5866326A (en) 1999-02-02
US5888801A (en) 1999-03-30
CZ90897A3 (cs) 2000-02-16
CA2199049A1 (en) 1996-04-04
ATE256743T1 (de) 2004-01-15
PH11995051386B1 (en) 2002-09-18
BG101384A (en) 1997-10-31
MX9702212A (es) 1997-06-28
AU692934B2 (en) 1998-06-18
JPH10506532A (ja) 1998-06-30
CA2199049C (en) 2012-03-13
EP0792363A1 (de) 1997-09-03
PT792363E (pt) 2004-05-31
DK0792363T3 (da) 2004-04-26
CZ290801B6 (cs) 2002-10-16
ES2213162T3 (es) 2004-08-16
TR199501182A2 (tr) 1996-06-21
PH12002000307B1 (en) 2004-01-21
US6066783A (en) 2000-05-23
US5872212A (en) 1999-02-16
EP0792363B2 (de) 2012-09-26
EP1754789A2 (de) 2007-02-21
WO1996010083A1 (en) 1996-04-04
US5849870A (en) 1998-12-15
MX228013B (es) 2005-05-25
CN1160420A (zh) 1997-09-24
IL146109A0 (en) 2002-07-25
EP1382611A2 (de) 2004-01-21
US5840868A (en) 1998-11-24
US5889174A (en) 1999-03-30
KR100419438B1 (ko) 2004-07-05
HU222264B1 (hu) 2003-05-28
US5770696A (en) 1998-06-23
DK0792363T4 (da) 2013-01-07
CN1255539C (zh) 2006-05-10
AU3743395A (en) 1996-04-19
BR9509099A (pt) 1997-09-30
DE69532333D1 (de) 2004-01-29
RU2196824C2 (ru) 2003-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69532333T3 (de) Pestizid-proteine und stämme
DE69434283T2 (de) Pestizid-proteine und stämme
DE60224410T2 (de) Modifizierte cry3a toxine und die dafür kodierende nukleinsäuren
Margalith et al. Biological control by Bacillus thuringiensis subsp. israelensis
DE69333893T2 (de) Bacillus thuringiensis und dessen insektizide proteine
DE60222027T2 (de) Chimäre delta-endotoxingen protein cry1ea und cry1ca
Tokçaer Response surface optimization of Bacillus thuringiensis israelensis fermentation

Legal Events

Date Code Title Description
8363 Opposition against the patent
8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: KROHER, STROBEL RECHTS- UND PATENTANWAELTE, 80336

8328 Change in the person/name/address of the agent

Representative=s name: DR. SCHOEN & PARTNER, 80336 MUENCHEN

R102 Epo decision maintaining patent in amended form now final

Ref document number: 792363

Country of ref document: EP

R102 Epo decision maintaining patent in amended form now final

Ref document number: 792363

Country of ref document: EP

Effective date: 20120926

R082 Change of representative

Ref document number: 792363

Country of ref document: EP

Representative=s name: ,