RO119835B1 - Proteină cu efect pesticid şi moleculă adn, care codifică pentru această proteină - Google Patents

Proteină cu efect pesticid şi moleculă adn, care codifică pentru această proteină Download PDF

Info

Publication number
RO119835B1
RO119835B1 RO97-00618A RO9700618A RO119835B1 RO 119835 B1 RO119835 B1 RO 119835B1 RO 9700618 A RO9700618 A RO 9700618A RO 119835 B1 RO119835 B1 RO 119835B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
protein
seq
plant
dna molecule
pesticide
Prior art date
Application number
RO97-00618A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory Wayne Warren
Michael Gene Koziel
Martha Alice Mullins
Gordon James Nye
Brian Carr
Nalini Manoj Desai
Kristy Kostichka
Nicholas Brendan Duck
Juan Jose Estruch
Original Assignee
Ciba-Geigy A.G.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26979445&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RO119835(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Ciba-Geigy A.G. filed Critical Ciba-Geigy A.G.
Publication of RO119835B1 publication Critical patent/RO119835B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal peptides, i.e. delta-endotoxins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Invenţia se referă la o proteină pesticidă, care este codificată de o moleculă ADN şi prezintă aplicabilitate în domeniul agriculturii. Molecula ADN, care codifică proteina pesticidă, poate fi izolată în timpul fazei de creştere a Bacillus spp, sau variante sau fragmente ale proteinei care păstrează activitatea pesticidă; molecula ADN este definită prin SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 ŞI SEQ ID NO: 7. Proteina poate fi izolată din mediul lichid de cultură şi este codificată de către o secvenţă de nucleotide, care hibridează într-o secvenţă de nucleotide, având SEQ ID NO: 1, 3 sau 4, la temperatura de 65° C, într-o soluţie tampon, conţinând 7% SDS şi 0,5 M fosfat de potasiu; respectiva proteină reacţionează, încrucişat, cu anticorpii generaţi împotriva proteinelor, având SEQ ID NO: 2 sau 5. ŕ

Description

Prezenta invenție se referă la o proteină cu efect pesticid și la o moleculă ADN care codifică pentru această proteină.
Prezenta invenție se referă, de asemenea, la gene și produse genetice care codifică proteina, la metode și compoziții pentru controlul dăunătorilor plantelor sau la alte tipuri de dăunători.
Insectele dăunătoare constituie un factor major al pierderilor înregistrate în cazul culturilor agricole importante din punct de vedere comercial. Pentru controlul și eradicarea dăunătorilor care prezintă importanță din punct de vedere agricol, au fost utilizate extensiv pesticide chimice cu spectru larg. Există totuși un interes substanțial pentru dezvoltarea de pesticide alternative eficiente.
Pesticidele microbiene au jucat un rol important ca alternative la controlul chimic al dăunătorilor. Produsul microbian utilizat pe scara cea mai extinsă se bazează pe bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). Bt este un Bacillus gram-pozitiv formator de spori care produce, în timpul sporulării, o proteină cristalină insecticidă (ICP).
Sunt cunoscute numeroase varietăți de Bt care produc mai mult de 25 de proteine cristaline insecticide diferite, dar înrudite. Majoritatea proteinelor cristaline insecticide obținute din Bt sunt toxice pentru larvele anumitor insecte din ordinele Lepidoptere, Diptera și Coleoptera. în general, atunci când o proteină cristalină insecticidă este ingerată de către o insectă susceptibilă, cristalul este dizolvat și transformat într-o grupă chimică toxică de către proteazele intestinale ale insectei. Nici una dintre proteinele cristaline insecticide active împotriva larvelor de coleoptere precum gândacul de Colorado al cartofului (Leptinotarsa decemlineata) sau viermele galben al mălaiului (Tenebrio molitor) nu a demonstrat efecte semnificative asupra membrilor din genul Diabrotica, în particular Diabrotica virgifera virgifera, viermele vestic al rădăcinii porumbului (WCRW) sau Diabrotica longicomis barberi, viermele nordic al rădăcinii porumbului.
Bacillus cereus (Bc) este înrudit îndeaproape cu Bt. O caracteristică distinctivă majoră o constituie absența unui cristal parasporic în Bc. Bc este o bacterie foarte răspândită care se găsește de obicei în sol și care a fost izolată dintr-o varietate de alimente și medicamente. Acest organism este implicat în deteriorarea alimentelor.
Deși Bt a fost foarte util pentru controlul insectelor dăunătoare, există necesitatea măririi numărului de agenți potențiali de control biologic.
Invenția de față se referă la o proteină pesticidă care are o masă moleculară de circa 60 până la circa 100 kDa și are secvența de aminoacizi dată în SEQ ID NO: 2 sau SEQ ID NO: 5; ea poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus thuringiensis AB88 depus sub numărul de acces NRRL B-21225, sau Bacillus thuringiensis AB424 depus sub numărul de acces NRRL B-21439.
Invenția de față se referă, de asemenea, la o moleculă ADN care codifică proteina pesticidă și care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp. sau variante sau fragmente ale proteinei care păstrează activitatea pesticidă, respectiva proteină putând fi izolată din mediul lichid de cultură și este codificată de către o secvență de nucleotide care hibridizează într-o secvență de nucleotide având SEQ ID NO: 1, 3 sau 4 la temperatura de 65°C într-o soluție tampon conținând 7% SDS și 0,5 M fosfat de potasiu; respectiva proteină reacționează încrucișat cu aticorpii generați împotriva proteinelor având SEQ ID NO: 2 sau 5.
Molecula ADN, conform invenției de față, codifică o proteină definită prin SEQ ID NO:
1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 și SEQ ID NO: 7, ea având în conținut o secvență de nucleotide data în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4
RO 119835 Β1 sau SEQ ID NO: 6, molecula ADN fiind în întregime sau parțial optimizată pentru exprimarea 1 într-o plantă prin utilizarea codonilor preferați de planta respectivă sau într-un microorganism, prin utilizarea codonilor preferați de gazda respectivă. 3
Procedeul de obținere a moleculei ADN, conform invenției, constă în:
(a) obținerea unei molecule ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică 5 o proteină pesticidă; și (b) hibridizarea respectivei molecule ADN cu o probă oligonucleotidă care poate fi 7 obținută dintr-o moleculă ADN definită în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 sau
SEQ ID NO: 6; și 9 (c) izolarea respectivului ADN hibridizat.
în cadrul prezentei invenții sunt prezentate compoziții și metode pentru controlul dău- 11 nătorilor plantelor. în particular, sunt prezentate noi proteine pesticide care sunt produse în timpul creșterii vegetative a tulpinilor de Bacillus. Proteinele sunt utile ca agenți pesticizi. 13 Mai specific, prezenta invenție se referă la o tulpină substanțial purificată de Bacillus care produce o proteină pesticidă în timpul creșterii vegetative, unde respectivul Bacillus nu 15 este B. sphaericus SSII-1. Sunt preferate tulpinile de Bacillus thuringiensis având depozitele cu numerele de acces NRRL B-21225 și NRRL B-21439. 17
Invenția se referă în plus la o proteină specifică pentru o anumită insectă, care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp, dar de preferință, a unei tulpini 19 de Bacillus thuringiensis și 8. cereus, și la componentele acesteia, unde respectiva proteină nu este toxina care ucide țânțari, provenind de la 8. sphaericus SSII-1. Proteina specifică 21 pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, este de preferință toxică pentru insectele din ordinele Coleoptera sau Lepidoptere și are o masă moleculară de circa 30 kDa sau 23 mai mare, de preferință de circa 60 până la circa 100 kDa, și mai preferabil de circa 80 kDa.
Mai particular, proteina specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, 25 are un spectru de activitate insecticidă care include o activitate împotriva speciilor Agrotis și/sau Spodoptera, dar, de preferință, o activitate împotriva omizii negre {Agrotis ipsilon; 27 BCW) și/sau viermelui militar de toamnă {Spodoptera frugiperda) și/sau viermelui militar al sfeclei {Spodoptera exigua) și/sau viermelui mugurilor de tutun și/sau viermelui știuletelui de 29 porumb {Helicoverpa zea).
Proteina specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, poate fi, de 31 preferință, izolată dintr-o tulpină de Bacillus spp selectată dintre cele cu depozitele având numerele de acces NRRL B-21225 și NRRL B-21439. 33
Este preferată o proteină specifică pentru o anumită insectă, unde respectiva proteină are secvența selectată din grupul constând din SEQ ID NO:2 și SEQ ID NO:5, inclu- 35 zând orice proteine care sunt omoloage structural și/sau funcțional acestora.
Un alt aspect preferat al invenției constă într-o proteină specifică pentru o anumită 37 insectă, corespunzătoare invenției, la care secvențele reprezentând semnalul de secreție au fost îndepărtate sau inactivate. 39
Prezenta invenție se referă în plus la proteine pesticide multimerice, care conțin mai mult de un lanț polipeptidic și din care cel puțin unul dintre respectivele lanțuri polipeptidice 41 reprezintă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, și cel puțin unul dintre respectivele lanțuri polipeptidice reprezintă o proteină auxiliară corespunză- 43 toare invenției, care activează sau ameliorează activitatea pesticidă a respectivei proteine specifice pentru o anumită insectă. 45
Proteinele pesticide multimerice corespunzătoare invenției au, de preferință, o masă moleculară de circa 50 kDâpână la circa 200 kDa. 47
RO 119835 Β1
Prezenta invenție se referă în plus la proteine de fuziune conținând mai multe domenii proteice incluzând cel puțin o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, care, atunci când sunt translatate cu ajutorul ribozomilor, produc o proteină de fuziune care are cel puțin atributele combinate ale proteinei specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, și, opțional, ale celorlalte componente utilizate în fuziune.
în sensul utilizat în prezentul document, omologia substanțială a secvenței se referă la o relație structurală strânsă între secvențele de aminoacizi. De exemplu, proteinele substanțial omoloage pot fi omoloage în proporție de 40%, preferabil în proporție de 50% și cel mai preferabil în proporție de 60% sau 80% sau mai mult. Omologia include, de asemenea, o relație în care una sau mai multe subsecvențe de aminoacizi lipsesc, sau în care sunt interdispersate subsecvențe adiționale de aminoacizi.
Un alt aspect al prezentei invenții se referă la o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp. și componente ale acesteia, unde respectiva proteină nu este toxina care ucide țânțari, provenind de la B. sphaericus SSII-1. în particular, prezenta invenție se referă la o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă al cărei spectru de activitate insecticidă include o activitate împotriva speciilor Agrotis și/sau Spodoptera, dar de preferință o activitate împotriva omizii negre (Agrotis ipsilon; BCW) și/sau viermelui militar de toamnă (Spodoptera frugiperda) și/sau viermelui militar al sfeclei (Spodoptera exigua) și/sau viermelui mugurilor de tutun și/sau viermelui știuletelui de porumb (Helicoverpa zea).
Este preferată o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide dată ca SEQ ID NO:1 sau SEQ ID NO:4, incluzând orice molecule de ADN care sunt omoloage structural și/sau funcțional cu aceasta.
O altă materializare a prezentei invenții se referă la o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp. și componente ale acesteia, unde respectiva proteină nu este toxina care ucide țânțari, provenind de la B. sphaericus SSII-1, secvența de nucleotide respectivă fiind optimizată pentru exprimare într-un microorganism sau într-o plantă.
Este preferată o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide dată ca SEQ ID NO.3, incluzând orice molecule de ADN care sunt omoloage structural și/sau funcțional cu aceasta.
Invenția se mai referă și la o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide care codifică o proteină pesticidă multimerică, respectiva proteină conținând mai mult de un lanț polipeptidic și cel puțin unul dintre respectivele lanțuri polipeptidice reprezintă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, și cel puțin unul dintre respectivele lanțuri polipeptidice reprezintă o proteină auxiliară corespunzătoare invenției, care activează sau ameliorează activitatea pesticidă a respectivei proteine specifice pentru o anumită insectă.
O altă materializare a invenției se referă la o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide care codifică o proteină de fuziune conținând mai multe domenii proteice incluzând cel puțin o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, produsă prin fuziune genetică în cadru și care, atunci când este translatată cu ajutorul ribozomilor, produce o proteină de fuziune care are cel puțin atributele combinate ale proteinei specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, și, opțional, ale celorlalte componente utilizate în fuziune.
RO 119835 Β1
Invenția se mai referă la o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide 1 care codifică o proteină de fuziune conținând o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, fuzionată cu o secvență semnal, de preferință o secvență semnal 3 de secreție sau o secvență de direcționare care dirijează produsul transgenic către o organită specifică sau un compartiment celular specific, secvență semnal care este de origine 5 heteroloagă relativ la ADN-ul receptor.
Prezenta invenție mai cuprinde o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleo- 7 tide care codifică o proteină de fuziune corespunzătoare invenției, care a fost optimizată pentru exprimare într-un microorganism sau într-o plantă. 9
Invenția se mai referă la o moleculă de ADN optimizată, la care secvența care codifică semnalul de secreție a fost îndepărtat de la capătul său 5’. 11 în sensul utilizat în prezentul document, omologia substanțială a secvenței se referă la o relație structurală strânsă între secvențele de nucleotide. De exemplu, moleculele de 13 ADN substanțial omoloage pot fi omoloage în proporție de 60%, preferabil în proporție de 80% și cel mai preferabil în proporție de 90% sau 95% sau mai mult. Omologia include, de 15 asemenea, o relație în care una sau mai multe subsecvențe de nucleotide sau aminoacizi lipsesc, sau în care sunt interdispersate subsecvențe adiționale de nucleotide sau 17 aminoacizi.
Sunt cuprinse, de asemenea, în prezenta invenție molecule de ADN care hibridizează 19 într-o moleculă de ADN corespunzătoare invenției așa cum a fost aceasta definită anterior, dar de preferință într-o probă de oligonucleotidă care poate fi obținută din respectiva 21 moleculă de ADN, conținând o porțiune contiguă a secvenței de codificare pentru respectiva proteină specifică pentru o anumită insectă, având o lungime de cel puțin 10 nucleotide, sub 23 condiții moderat stringente, molecule care prezintă o activitate specifică pentru o anumită insectă șim de asemeneam proteinele specifice pentru o anumită insectă fiind codificate de 25 către respectivele molecule de ADN.
Sunt preferate moleculele de ADN la care apare hibridizarea, la temperatura de 65°C,27 într-o soluție tampon conținând 7% SDS și 0,5 M fosfat de sodiu.
Este preferată în mod special o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide29 care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, care poate fi obținută printr-un procedeu constând din:31 (a) obținerea unei molecule de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă; și33 (b) hibridizarea respectivei molecule de ADN cu o probă de oligonucleotidă obținută dintr-o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide dată în SEQ ID NO:1, SEQ ID 35 NO:3 sau SEQ ID NO.4; și (c) izolarea respectivului ADN hibridizat.37
De asemenea, în invenție este cuprinsă o casetă de exprimare conținând o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, legată în mod operabil la secvențe de exprimare 39 incluzând semnalele de reglare transcripțional și translațional necesare pentru exprimarea construcțiilor ADN asociate într-un organism gazdă, de preferință un microorganism sau o 41 plantă și, opțional, secvențe de reglare adiționale.
Invenția se mai referă la o moleculă vector conținând o casetă de exprimare cores- 43 punzătoare invenției.
Caseta de exprimare și/sau molecula vector, corespunzătoare invenției, fac parte, 45 de preferință, din genomul plantei.
RO 119835 Β1
Un alt aspect al invenției se referă la un organism gazdă, de preferință un organism gazdă selectat din grupul constând din celule de plante și insecte, bacterii, fermenți, baculoviruși, protozoare, nematode și alge, conținând o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare, de preferință încorporată în mod stabil în genomul organismului gazdă.
Invenția se mai referă la o plantă transgenică, dar de preferință o plantă de porumb, incluzând părți ca și descendenți și semințe ale acesteia, conținând o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare, de preferință încorporată în mod stabil în genomul plantei.
Este preferată o plantă transgenică incluzând părți, ca și descendenți și semințe ale acesteia, care a fost transformată în mod stabil cu o moleculă de aDN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare.
Este preferată, de asemenea, o plantă transgenică, incluzând părți ca și descendenți și semințe ale acesteia, care exprimă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției.
Invenția se mai referă la o plantă transgenică, de preferință o plantă de porumb, corespunzătoare invenției așa cum s-a definit anterior, care exprimă în plus un principiu secundar distinct de control al insectelor, dar preferabil o δ-endotoxină de Bt. Respectiva plantă este, de preferință, o plantă hibridă.
Prin părți ale plantelor transgenice trebuie să se înțeleagă în cadrul acestei invenții, de exemplu, celule de plante, protoplaste, țesuturi, calus, embrioni, ca și flori, tulpini, fructe, frunze, rădăcini provenind de la plantele transgenice sau de la descendenții acestora, transformate anterior cu o moleculă de ADN corespunzătoare invenției și deci constând cel puțin în parte din celule transgenice, constituind de asemenea un obiect al prezentei invenții.
Invenția se mai referă la materialul de propagare a plantelor pentru o plantă corespunzătoare invenției, material care este tratat cu o acoperire pentru protejarea semințelor.
Invenția cuprinde, de asemenea, un microorganism transformat cu o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare, unde respectivul microorganism este, de preferință, un microorganism care se înmulțește pe plante și, mai preferabil, o bacterie care colonizează rădăcina.
Un alt aspect al invenției se referă la o proteină încapsulată specifică pentru o anumită insectă, care constă dintr-un microorganism conținând o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției.
Invenția se referă, de asemenea, la o compoziție insecticidă conținând un organism gazdă corespunzător invenției, dar preferabil o tulpină de Bacillus purificată, într-o cantitate eficientă ca insecticid, împreună cu un vehicul adecvat.
Invenția se mai referă la o compoziție insecticidă conținând o moleculă de proteină izolată corespunzătoare invenției, singură sau în combinație cu un organism gazdă corespunzător invenției și/sau o proteină încapsulată specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, într-o cantitate eficientă ca insecticid, împreună cu un vehicul adecvat.
Un alt aspect al invenției se referă la o metodă de obținere a unei proteine purificate specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, metoda respectivă constând din aplicarea unei soluții conținând respectiva proteină specifică pentru o anumită insectă într-o coloană NAD și eluția proteinei legate.
RO 119835 Β1
Este descrisă, de asemenea, o metodă pentru identificarea activității asupra insec- 1 telor a unei proteine specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare prezentei invenții, metoda respectivă constând din: 3
- creșterea unei tulpini de Bacillus într-o cultură;
- obținerea supernatantului din respectiva cultură;5
- lăsarea larvelor de insecte să se hrănească conform unui regim bazat pe superna- tantul respectiv; și7
- determinarea mortalității.
Un alt aspect al invenției se referă la o metodă pentru izolarea unei proteine specifice 9 pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, metoda respectivă constând din:
- creșterea unei tulpini de Bacillus într-o cultură;11
- obținerea supernatantului din respectiva cultură;
- izolarea respectivei proteine specifice pentru o anumită insectă din supernatantul 13 respectiv.
Invenția se referă, de asemenea, la o metodă pentru izolarea unei molecule de ADN 15 conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă, proteină care prezintă activitatea insecticidă a proteinelor corespunzătoare invenției, 17 metoda respectivă constând din:
- obținerea unei molecule de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică19 o proteină specifică pentru o anumită insectă;
- hibridizarea respectivei molecule de ADN cu ADN obținut dintr-o specie de Bacillus',21
Și
- izolarea respectivului ADN hibridizat.23
Invenția se mai referă la o metodă de lărgire a domeniului de insecte țintă prin utilizarea unei proteine specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, în combi- 25 nație cu cel puțin o proteină insecticidă secundară care este diferită de proteina specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, dar preferabil cu o proteină insecticidă 27 selectată din grupul constând din δ-endotoxine de Bt, inhibitori de protează, lectine, aamilaze și peroxidaze. 29
Este preferată o metodă pentru lărgirea domeniului de insecte țintă pentru o plantă prin exprimarea în planta respectivă a proteine specifice pentru o anumită insectă, corespun- 31 zătoare invenției, în combinație cu cel puțin o proteină insecticidă secundară care este diferită de proteina specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, dar prefe- 33 rabil cu o proteină insecticidă selectată din grupul constând din δ-endotoxine de Bt, inhibitori de protează, lectine, α-amilaze și peroxidaze. 35
De asemenea, este prezentată o metodă de protejare a plantelor împotriva distrugerilor cauzate de către o insectă dăunătoare, dar, preferabil, de speciile Spodoptera și/sau 37 Agrotis, și, mai preferabil, de către o insectă dăunătoare selectată din grupul constând din omida neagră (Agrotis ipsilon; BCW), viermele militar de toamnă (Spodoptera frugiperda), 39 viermele militar al sfeclei (Spodoptera exigua), viermele mugurilor de tutun și viermele știuletelui de porumb (Helicoverpa zea), constând din aplicarea pe plantă sau în zona de creștere 41 a plantei respective a unei compoziții insecticide sau a unei proteine toxină corespunzătoare invenției. 43
Invenția se mai referă la o metodă de protejare a plantelor împotriva distrugerilor cauzate de către o insectă dăunătoare, dar, preferabil, de speciile Spodoptera și/sau Agrotis, 45 și, mai preferabil, de către o insectă dăunătoar selectată din grupul constând din omida neagră (Agrotis ipsilon, BCW), viermele militar de toamnă (Spodoptera frugiperda), viermele 47
RO 119835 Β1 militar al sfeclei (Spodoptera exigua), viermele mugurilor de tutun și viermele știuletelui de porumb (Helicoverpa zea), constând din plantarea unei plante transgenice care exprimă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, în zona în care poate apare respectiva insectă dăunătoare.
Invenția cuprinde, de asemenea, o metodă de producere a unui organism gazdă care conține integrată stabil în genomul său o moleculă de ADN corespunzătoare invenției și, de preferință, exprimă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, metodă care constă din transformarea respectivului organism gazdă cu o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare.
Un alt aspect al invenției îl constituie o metodă de producere a unei plante transgenice sau celule transgenice de plantă care conține integrată stabil în genomul plantei o moleculă de ADN corespunzătoare invenției și, de preferință, exprimă o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, metodă care constă în transformarea plantei respective sau celulei respective de plantă cu o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare.
Invenția se referă, de asemenea, la o metodă de producere a unei compoziții insecticide conținând un amestec de tulpină de Bacillus și/sau un organism gazdă și/sau o moleculă de proteină izolată, și/sau o proteină încapsulată corespunzătoare invenției într-o cantitate eficientă ca insecticid, împreună cu un vehicul adecvat.
Invenția se referă, de asemenea, la o metodă de producere a descendenților transgenici ai unei plante părinte transgenice conținând încorporată stabil în genomul plantei o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, metodă care constă în transformarea respectivei plante părinte cu o moleculă de ADN corespunzătoare invenției, o casetă de exprimare conținând respectiva moleculă de ADN sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare și transferarea liniei pesticide la descendenții respectivei plante părinte aplicând tehnici cunoscute de reproducere a plantelor.
De asemenea, este inclusă în prezenta invenție o probă de oligonucleotidă capabilă să hibridizeze în mod specific într-o secvență de nucleotide care codifică o proteină specifică pentru o anumită insectă, care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp., și componente ale acesteia, unde respectiva proteină nu este toxina care ucide țânțari provenind de la B. sphaericus SSII-1, în care respectiva probă conține o porțiune contiguă din secvența de codificare pentru respectiva proteină specifică pentru o anumită insectă, având o lungime de cel puțin 10 nucleotide, precum și utilizarea respectivei probă de oligonucleotidă pentru selectarea oricărei tulpini de Bacillus sau altui organism pentru a determina dacă proteina specifică pentru o anumită insectă este prezentă în mod natural sau dacă un organism particular transformat include gena respectivă.
Prezenta invenție recunoaște că proteinele pesticide sunt produse în timpul fazei de creștere vegetativă a tulpinilor de Bacillus.
Prezentele proteine insecticide vegetative nu sunt abundente după sporulare și sunt exprimate în special în timpul fazei de creștere logaritmică, înainte de faza staționară. Pentru scopurile prezentei invenții, creșterea vegetativă este definită ca perioada de timp dinainte de începerea sporulării. Genele care codifică astfel de proteine insecticide vegetative pot fi izolate, donate și transformate în diferite vehicule de livrare pentru utilizare în cadrul programelor de contTol al dăunătorilor.
RO 119835 Β1
Pentru scopurile prezentei invenții, dăunătorii includ, dar nu sunt limitați la, insecte, 1 fungi, bacterii, nematode, căpușe, muște, protozoare patogene, gălbeze care parazitează ficatul animalelor și altele asemenea. Insectele dăunătoare includ insecte selectate din ordi- 3 nele Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptere, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichopteraetc., 5 în particular Coleoptera și Lepidoptere.
Tabelele nr. 1... 10 prezintă o listă de dăunători asociați cu culturile majore de plante 7 și dăunători de importanță umană și veterinară. Astfel de dăunători sunt incluși în domeniul prezentei invenții. 9
Tabelul 1
Lepidoptera (fluturi și molii)11
Porumb13
Ostrinia nubilalis (sfredelul european al porumbului)
Agrotis ipsilon (omida neagră)15
Helicoverpa zea (viermele știuletelui de porumb)
Spodoptera frugiperda (viermele militar de toamnă)17
Diatraea grandiosella (sfredelul sud-vestic al porumbului)
Elasmopalpus lignosellus (sfredelul tulpinii inferioare a porumbului)19
Diatraea saccharalis (sfredelul trestiei de zahăr)
Sorg21
Chilo partellus (sfredelul sorgului)
Spodoptera frugiperda (viermele militar de toamnă)23
Helicoverpa zea (viermele știuletelui de porumb)
Elasmopalpus lignosellus (sfredelul tulpinii inferioare a porumbului)25
Feltia subterranea (omida granulată)
Grâu27
Pseudaletia unipunctata (viermele militar)
Spodoptera frugiperda (viermele militar de toamnă)29
Elasmopalpus lignosellus (sfredelul tulpinii inferioare a porumbului)
Agrotis orthogonia (omida vestică incoloră)31
Elasmopalpus lignosellus (sfredelul tulpinii inferioare a porumbului)
Floarea soarelui33
Suleima helianthana (molia bobocului de floarea soarelui)
Homoeosoma electellum (molia florii soarelui)35
Bumbac
Heliothis virescens (viermele rotund al bumbacului)37
Helicoverpa zea (viermele știuletelui de porumb)
Spodoptera exigua (viermele militar al sfeclei)39
Pectinophora gossypiella (viermele rotund de culoare roz)
Orez41
Diatraea saccharalis (sfredelul trestiei de zahăr)
Spodoptera frugiperda (viermele militar de toamnă)43
Helicoverpa zea (viermele știuletelui de porumb)—
RO 119835 Β1
Soia
Pseudoplusia includens (maieza soiei)
Anticarsia gemmatalis (omida fasolei)
Plathypena scabra (viermele verde de trifoi) Ostrinia nubilalis (sfredelul european al porumbului) Agrotis ipsilon (omida neagră)
Spodoptera exigua (viermele militar al sfeclei) Heliothis virescens (viermele rotund al bumbacului) Helicoverpa zea (viermele știuletelui de porumb)
Orz
Ostrinia nubilalis (sfredelul european al porumbului) Agrotis ipsilon (omida neagră)
Tabelul 2
Coleoptera (gândaci)
Porumb
Diabrotica virgifera virgifera (viermele vestic al rădăcinilor de porumb) Diabrotica longicornis berberi (viermele nordic al rădăcinilor de porumb) Diabrotica undecimpunctata howardi(viermele sudic al rădăcinilor de porumb) Melanotus spp. (viermi filiformi)
Cyclocephala borealis (cărăbușul mascat nordic - viermele alb) Cyclocephala immaculata (cărăbușul mascat sudic - viermele alb) Popillia japonica (gândacul japonez)
Chaetocnema pulicaria (puricele de porumb)
Sphenophorus maidis (gărgărița porumbului)
Sorg
Phyllophaga crinita (viermele alb)
Eleodes, Conoderus și Aeolus spp. (viermi filiformi)
Oulema melanopus (gândacul frunzelor de cereale)
Chaetocnema pulicaria (puricele de porumb)
Sphenophorus maidis (gărgărița porumbului)
Grâu
Oulema melanopus (gândacul frunzelor de cereale)
Hypera punctata (gărgărița frunzelor de trifoi)
Diabrotica undecimpunctata howardi(viermele sudic al rădăcinilor de porumb)
Floarea soarelui
Zygogramma exclamationis (gândacul florii soarelui)
Bothyrus gibbosus (gândacul morcovului)
Bumbac
Anthonomus grandis (gărgărița rotundă)
Orez
Colaspis brunnea (gândacul strugurilor)
Lissorhoptrus oryzophilus (gărgărița de apă a orezului)
Sitophilus oryzae (gărgărița orezului)
Soia
Epilachna varivestis (gândacul fasolei mexicane)
RO 119835 Β1
Tabelul 31
Homoptera (cicate, pureci, păduchi de plante etc.)
Porumb
Rhopalosiphum maidis (păduchele frunzei de porumb)5
Anuraphis maidiradicis (păduchele rădăcinii de porumb)
Sorg
Rhopalosiphum maidis (păduchele frunzei de porumb)9
Sipha flava (păduchele galben al trestiei de zahăr)
Grâu11
Afida rusească a grâului
Schizaphis graminum (gândacul verde)13
Macrosiphum avenae (păduchele englez al grâului)
Bumbac15
Aphis gossypii (păduchele bumbacului)
Pseudatomoscelis seriatus (puricele bumbacului)17
Trialeurodes abutilonea (musculița albă cu aripi dungate)
Orez19
Nephotettix nigropictus (puricele frunzei de orez)
Soia21
Myzus persicae (păduchele verde al piersicului)
Empoasca fabae (puricele frunzei de cartof)23
Orz
Schizaphis graminum (gândacul verde)25
Rapiță
Brevicoryne brassicae (păduchele verzei)27
Tabelul 429
Hemiptera (ploșnițe)
Porumb
Blissus leucopterus leucopterus (ploșnița cerealelor)33
Sorg
Blissus leucopterus leucopterus (ploșnița cerealelor)35
Bumbac
Lygus lineolaris (ploșnița plantelor)37
Orez
Blissus leucopterus leucopterus (ploșnița cerealelor)39
Acrosternum hilare (ploșnița verde urât mirositoare)
Soia41
Acrosternum hilare (ploșnița verde urât mirositoare)
Orz43
Blissus leucopterus leucopterus (ploșnița cerealelor)
Acrosternum hilare (ploșnița verde urât mirositoare)45
Euschistus servus (ploșnița maro urât mirositoare)
RO 119835 Β1
Tabelul 5
Orthoptera (lăcuste, greieri și gândaci de bucătărie)
Porumb
Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)
Melanoplus sanguinipes (lăcusta migratoare)
Grâu
Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)
Melanoplus differentialis (lăcusta diferențiată)
Melanoplus sanguinipes (lăcusta migratoare)
Bumbac
Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)
Melanoplus differentialis (lăcusta diferențiată)
Soia
Melanoplus femurrubrum (lăcusta cu picioare roșii)
Melanoplus differentialis (lăcusta diferențiată)
Dăunători casnic/structurali
Periplaneta americana (gândacul de bucătărie american)
Blattella germanica (gândacul de bucătărie german)
Blatta orientalis (gândacul de bucătărie oriental)
Tabelul 6
Diptera (muște și țânțari)
Porumb
Hylemya platura (musca semănăturilor)
Agromyza parvicornis (viermele pătat al frunzelor de porumb)
Sorg
Contarinia sorghicola (musculița sorgului)
Grâu
Mayetiola destructor (musca de Hessa)
Sitodiplosis mosellana (musculița grâului)
Meromyza americana (musculița tulpinii de grâu)
Hylemya coarctata (musca bulbului de gâu)
Floarea soarelui
Neolasioptera murtfeldtiana (musculița semințelor de floarea soarelui)
Soia
Hylemya platura (musca semănăturilor)
Orz
Hylemya platura (musca semănăturilor)
Mayetiola destructor (musca de Hessa)
Insecte care atacă oameni și animale și sunt purtătoare de boli
Aedes aegypti (țânțarul febrei galbene)
Aedes albopictus (țânțarul diurn de pădure)
Phlebotomus papatasii (musca de nisip)
Musca domestica (musca domestică)
Tabanus atratus (musca neagră a cailor)
Cochliomyia hominivorax (musca-vierme)
RO 119835 Β1
Tabelul 7 1
Thysanoptera (tripși)
Porumb3
Anaphothrips obscurus (tripsul de iarbă)
Grâu5
Frankliniella fusca (tripsul tutunului)
Bumbac7
Thrips tabaci (tripsul cepei)
Frankliniella fusca (tripsul tutunului)9
Soia
Sericothrips variabilis (tripsul soiei)11
Thrips tabaci (tripsul cepei)
Tabelul 8
Hymenoptera (viespi fierăstrău, furnici, viespi etc.)15
Porumb17
Solenopsis milesta (furnica hoață)
Grâu19
Cephus cinctus (viespea grâului)
Tabelul 9
Alte ordine și specii reprezentative23
Dermaptera (urechelnițe)25
Forficula auricularia (urechelnița europeană)
Isoptera (termite)27
Reticulitermes flavipes (termita subterană estică)
Mallophaga (păduchi care mestecă)29
Cuclotogaster heterographa (păduchele găinilor)
Bovicola bovis (păduchelor vitelor)31
Anoplura (păduchi care sug)
Pediculus humanus (păduchele uman)33
Siphonaptera (purici)
Ctenocephalides felis (puricele pisicilor)35
Tabelul 1037
Acarieni (căpușe și muște)
Porumb39
Tetranychus urticae (păianjenul cu două pete)
Sorg41
Tetranychus cinnabarinus (păianjenul stacojiu)
Tetranychus urticae (păianjenul cu două pete)43
Grâu
Aceria tulipae (păianjenul grâului) 45
Bumbac
Tetranychus cinnabarinus (păianjenul stacojiu) 47
Tetranychus urticae (păianjenul cu două pete)
RO 119835 Β1
Soia
Tetranychus turkestani (păianjenul căpșunilor)
Tetranychus urticae (păianjenul cu două pete)
Orz
Petrobia latens (păianjenul maro al grâului)
Acarieni prezentând importanță pentru oameni și animale
Demacentor variabilis (căpușa americană a câinilor)
Argas persicus (căpușa păsărilor de curte)
Dermatophagoides farinae (păianjenul de casă american)
Dermatophagoides pteronyssinus (păianjenul de casă european)
După recunoașterea faptului că proteinele pesticide pot fi izolate din faza de creștere vegetativă a Bacillus, pot fi izolate și alte tulpini prin tehnici standard și li se poate testa activitatea împotriva dăunătorilor plantelor și alte tipuri de dăunători. în general, tulpinile de Bacillus pot fi izolate din orice eșantion din mediu, incluzând sol, plante, insecte, praf din silozurile de cereale și alte eșantioane de material, etc., prin metode cunoscute în tehnică, vezi, de exemplu, Travers și col., (1987) Appl. Environ. Microbiol. 53:1263-1266; Saleh et al. (1969) Can. J. Microbiol. 15:1101-1104; DeLucca etal. (1981) Can. J. Microbiol. 27:865870; și Norris și col. (1981) „The genera Bacillus and Sporolactobacillus în Starr și col. (editori), The Prokaryotes: A Handbookon Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, Voi. II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. După izolare, tulpinile pot fi testate pentru activitate pesticidă în timpul creșterii vegetative. Astfel, pot fi identificate noi proteine și tulpini pesticide.
Astfel de microorganisme Bacillus, care își găsesc utilizare în prezenta invenție, includ Bacillus cereus și Bacillus thuringiensis, ca și speciile de Bacillus listate în Tabelul 11.
Tabelul 11
Lista speciilor de Bacillus
Grupa morfologică 1
B. megaterium
B. cereus*
B. cereus var. mycoides
B. thuringiensis*
B. licheniformis
B. subtilis*
B. pumilus
B. firmus*
B. coagulans
Grupa morfologică 2
B. polymyxa
B. macerans
B. circulans
B. stearothermophikfs--14
RO 119835 Β1
B. alvei* 1
Β. laterosporus*
Β. brevis 3
Β. pulvifaciens
Β. popilliae* 5
Β. lentimorbus*
Β. larvae*7
Grupa morfologică 39
β. sphaericus*
B. pasteurii11
Tulpini nerepartizate în grupe13
Subgrupa A fi. apiarus*15 fi. filicolonicus
B. thiaminolyticus17 fi. alcalophilus
Subgrupa B fi. cirroflagellosus21 fi. chitinosporus
B. lentus23
Subgrupa C25 fi. badius
B. aneurinolyticus27
8. macroides
B. freundenreichii29
Subgrupa D31 fi. pantothenticus
B. epiphytus33
Subgrupa E135 fi. aminovorans
B. globisporus37 fi. insolitus
B. psychrophilus39
Subgrupa E241 fi. psychrosaccharolyticus
B. macquariensis43 = tulpinile de Bacillus găsite anterior asociate cu insecte45
RO 119835 Β1
Grupare conform Parry, J.M. și col. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe
Medical Publications, Londra.
Conform prezentei invenții, proteinele pesticide produse în timpul creșterii vegetative pot fi izolate din Bacillus. într-una dintre materializări, pot fi izolate proteinele insecticide produse în timpul creșterii vegetative. Metodele pentru izolarea proteinelor sunt cunoscute în stadiul tehnicii. în general, proteinele pot fi purificate prin tehnici convenționale de cromatografie, incluzând filtrarea în gel, schimbul de ioni și cromatografia cu imuno-afinitate, prin cromatografie în lichid de înaltă performanță, cum ar fi cromatografie în lichid de înaltă performanță cu fază inversă, cromatografie în lichid de înaltă performanță cu schimbare de ioni, cromatografie în lichid de înaltă performanță cu excludere dimensională, cromatofocalizare de înaltă performanță și cromatografia cu interacțiune hidrofobă etc., prin separare electroforetică, cum ar fi electroforeză în gel unidimensională, electroforeză în gel bidimensională etc. Astfel de metode sunt cunoscute în stadiul tehnicii. Vezi, de exemplu, Current Protocols in Molecular Biology, Volumele 1 și 2, Ausubel et al. (editori), John Wiley & Sons, NY (1988). Pe lângă aceasta, pot fi preparați anticorpi împotriva preparărilor substanțial pure ale proteinei. Vezi, de exemplu, Radka et al. (1983) J. Immunol. 128:2804; și Radka et al. (1984) Immunogenetics 19:63. Orice combinație de metode poate fi utilizată pentru a purifica proteina având proprietăți pesticide. După cum este formulat protocolul, activitatea pesticidă este determinată după fiecare etapă de purificare.
Astfel de etape de purificare vor avea ca rezultat obținerea unei fracțiuni de proteină substanțial purificată. Prin termenii „substanțial purificată sau „substanțial pură se înțelege o proteină care este substanțial liberă de orice compus care este asociat în mod normal cu proteina în starea naturală a acesteia. Preparările „substanțial pure ale proteinei pot fi testate prin absența altor benzi de proteine detectabile la aplicarea SDS-PAGE, prin detectare vizuală sau prin scanare densitometrică. Alternativ, absența altor secvențe aminoterminale sau reziduuri N-terminale într-o preparare purificată poate indica nivelul de puritate. Puritatea poate fi verificată prin recromatografia preparării „pure, demonstrând absența altor vârfuri prin schimbare de ioni, fază inversă sau electroforeză capilară. Nu se intenționează ca termenii „substanțial pură sau „substanțial purificată să excludă amestecurile artificiale sau sintetice de proteine cu alte componente. De asemenea, nu se intenționează ca termenii respectivi să excludă prezența de impurități minore, care nu interferează cu activitatea biologică a proteinei și care pot fi prezente, de exemplu, datorită purificării incomplete.
O dată ce proteina purificată este izolată, proteina, sau polipeptidele din care este compusă, pot fi caracterizate și secvențializate prin metode standard cunoscute în stadiul tehnicii. De exemplu, proteina purificată sau polipeptidele din care este compusă pot fi fragmentate cu bromură de cian, sau cu proteaze cum ar fi papaina, chimotripsina, tripsina, lisilC endopeptidaza etc. (Oike și col. (1982) J. Biol. Chem. 257:9751-9758; Liu și (1983) Int. J. Pept. Protein Res.21:209-215). Peptidele rezultate sunt separate, de preferință, prin HPLC, sau prin dizolvarea în geluri și electroabsorbția pe membrane PVDF, și supuse secvențializării aminoacizilor. Pentru realizarea acestei sarcini, peptidele sunt, de preferință, analizate cu secvențializatoare automate. Se știe că pot fi determinate secvențele de aminoacizi de la terminalul N, de la terminalul C sau interne. Din secvența de aminoacizi a proteinei purificate, poate fi sintetizată o secvență de nucleotide care poate fi utilizată ca o probă pentru a ajuta izolarea genei care codifică proteina pesticidă.
Se cunoaște că proteinele pesticide pot fi oligomerice și vor varia în ceea ce privește masa moleculară, numărul de protomeri, peptidele componente, activitatea împotriva unor dăunători particulari, și alte caracteristici. Totuși, prin metodele menționate aici, pot fi izolate și caracterizate proteine active împotriva unei varietăți de dăunători.
RO 119835 Β1
O dată ce proteina purificată a fost izolată și caracterizată, se cunoaște că aceasta 1 poate fi modificată în numeroase moduri, incluzând substituții, deleții, trunchieri și inserări de aminoacizi. Metodele pentru astfel de manipulări sunt în general cunoscute în stadiul teh- 3 nicii. De exemplu, variante de secvențe de aminoacizi ale proteinelor pesticide pot fi preparate prin mutații în ADN. Astfel de variante vor poseda activitatea pesticidă dorită. Evident, 5 mutațiile care vor fi efectuate în ADN-ul care codifică varianta nu trebuie să plaseze secvența în afara cadrului de citire și, de preferință, nu vor crea regiuni complementare care 7 ar putea produce structuri ARNm secundare. Vezi EP 75444.
în acest fel, prezenta invenție cuprinde proteinele pesticide ca și componentele și 9 fragmentele acestora. Aceasta înseamnă că se recunoaște posibilitatea producerii de componente promotori, polipeptide sau fragmente de proteină care să păstreze activitatea 11 pesticidă. Aceste fragmente includ secvențe trunchiate, ca și secvențe de aminoacizi Nterminale, C-terminale, interne sau șterse intern, ale proteinelor. 13
Este de așteptat ca cele mai multe deleții, inserții și substituții ale secvenței proteinei să nu producă modificări radicale în caracteristicile proteinei pesticide. Totuși, atunci când 15 este dificil de previzionat efectul exact al substituției, deleției sau inserției înaintea efectuării acesteia, un specialist în domeniu va aprecia că efectul va fi evaluat prin teste de selecție 17 de rutină.
Proteinele sau alte componente polipeptide descrise aici pot fi utilizate singure sau 19 în combinații. Aceasta înseamnă că mai multe proteine pot fi utilizate pentru a controla diferite insecte dăunătoare. 21
Unele proteine constau dintr-un singur lanț de polipeptide, în timp ce multe proteine constau din mai multe lanțuri polipeptidice, adică sunt oligomerice. în plus, unele proteine 23 insecticide vegetative sunt active din punct de vedere pesticid ca oligomeri. în aceste situații, sunt utilizați promotori suplimentari pentru a ameliora activitatea pesticidă sau pentru a 25 activa proteinele pesticide. Acești promotori care ameliorează sau activează vor fi considerați ca proteine auxiliare. Proteinele auxiliare activează sau ameliorează o proteină pesticidă 27 interacționând cu proteina pesticidă pentru a forma o proteină oligomerică având o activitate pesticidă crescută în comparație cu cea observată în absența proteinei auxiliare. 29
Printre proteinele pesticide corespunzătoare invenției poate fi identificată în mod surprinzător o nouă clasă de proteine specifice pentru o anumită insectă, în domeniul prezentei 31 invenții. Proteinele respective, care sunt desemnate în acest document ca VIP3, pot fi obținute de la tulpini de Bacillus spp, dar, preferabil, de la tulpini de Bacillus thuringiensis și, mai 33 preferabil, de la tulpinile AB88 și AB424 de Bacillus thuringiensis. Respectivele VIP sunt prezente în cea mai mare parte în supernatanții culturilor de Bacillus, constituind cel puțin 35 75% din total pentru tulpina AB88. Proteinele VIP3 sunt caracterizate în continuare prin spectrul lor unic de activitate insecticidă, care include activitatea împotriva speciilor Agrotis 37 și/sau Spodoptera, dar, de preferință, o activitate împotriva omizii negre [BCW] și/sau viermelui militar de toamnă și/sau viermelui militar al sfeclei și/sau viermelui mugurilor de 39 tutun și/sau viermele știuletelui de porumb.
Omida neagră este o insectă importantă din punct de vedere agronomic, destul de 41 rezistentă la δ-endotoxine. Macintosh și col. (1990) J. Invertebr. Pathol. 56, 258-266 raportează că δ-endotoxinele CrylA(b) și CrylA(c) posedă proprietăți insecticide împotriva BCW 43 având un indice LC50 mai mare de 80 pg și respectiv 18 mg/ml de dietă. Proteinele insecticide VIP3 corespunzătoare invenției asigură o mortalitate mai mare de 50% atunci când 45 sunt adăugate într-o cantitate de proteină de cel puțin 10 până la 500, de preferință, 50 până la 350 și mai preferabil 200 până la 300 de ori mai mică decât cantitatea de proteine CrylA 47
RO 119835 Β1 necesară pentru a obține o mortalitate de numai 50%. Preferate în mod special în cadrul prezentei invenții sunt proteinele insecticide VIP3 care asigură o mortalitate de 100% atunci când sunt adăugate într-o cantitate de proteină de cel puțin 260 de ori mai mică decât cantitatea de proteine CrylA necesară pentru a obține o mortalitate de numai 50%.
Proteinele insecticide VIP3 corespunzătoare invenției sunt prezente în cea mai mare parte în supernatanții culturilor și trebuie deci clasificate ca proteine secretate. Acestea conțin, de preferință, în secvența N-terminală un număr de reziduuri încărcate pozitiv urmate de o regiune cu miez hidrofob și nu sunt procesate la terminalul N în timpul exportului.
Ca și celelalte proteine pesticide raportate aici în domeniul invenției, proteinele VIP3 pot fi detectate în stadiile de creștere înainte de sporulare, ceea ce stabilește încă o distincție clară față de alte proteine care aparțin familiei δ-endotoxinelor. De preferință, exprimarea proteinei specifice pentru o anumită insectă începe în timpul fazei logaritmice medii și continuă în timpul sporulării. Datorită modelului specific de exprimare în combinație cu stabilitatea ridicată a proteinelor VIP3, mari cantități de proteine VIP3 pot fi găsite în supernatanții culturilor care sporulează. Preferate în mod special sunt proteinele VIP3 identificate cu SEQ ID NO:2 și SEQ ID NO:5 și moleculele de ADN corespunzătoare conținând secvențele de nucleotide care codifică proteinele respective, dar în special acele molecule de ADN conținând secvențele de nucleotide date ca SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 și SEQ ID NO: 4.
Proteinele pesticide corespunzătoare invenției pot fi utilizate în combinație cu endotoxine Bt sau alte proteine insecticide pentru a lărgi domeniul de insecte țintă. Pe lângă aceasta, utilizarea proteinelor insecticide vegetative corespunzătoare prezentei invenții în combinație cu δ-endotoxine Bt sau cu alte principii insecticide de natură distinctă are o utilitate particulară pentru prevenirea și/sau controlul rezistenței insectelor. Alte principii insecticide includ inhibitori de protează (de ambele tipuri, serină și cisteină), lectine, aamilaze și peroxidaze. într-o materializare preferată, exprimarea proteinelor insecticide vegetative într-o plantă transgenică este însoțită de exprimarea uneia sau mai multor δ-endotoxine Bt. Această co-exprimare a mai multor principii insecticide în aceeași plantă transgenică poate fi obținută prin ingineria genetică a unei plante pentru a conține și exprima toate genele necesare. Alternativ, o plantă, Părinte 1, poate fi modificată genetic pentru exprimarea proteinei insecticide vegetative. O a doua plantă, Părinte 2, poate fi modificată genetic pentru exprimarea δ-endotoxinei Bt. Prin încrucișarea Părintelui 1 cu Părintele 2, sunt obținute plante descendente care exprimă toate genele introduse în Părinții 1 și 2. δEndotoxinele Bt preferate în mod particular sunt cele descrise în EP-A 0618976, încorporat aici prin referință.
Un număr substanțial de proteine citotoxice, chiar dacă nu toate, au o acțiune binară. Toxinele binare constau în mod tipic din două domenii proteice, unul denumit domeniul A și celălalt denumit domeniul B (vezi Sourcebook ofBacterial Protein Toxins, J.E. Alouf și J.H. Freer, editori (1991) Academic Press). Domeniul A posedă o puternică activitate citotoxică. Domeniul B se leagă la un receptor de pe suprafața exterioară a celulei înainte de a fi internalizat. Tipic, domeniul A citotoxic trebuie să fie escortat către citoplasmă de un domeniu de translocare. Deseori domeniile A și B sunt polipeptide separate sau protomeri separați, care sunt asociați printr-o interacțiune proteină-proteină sau printr-o punte di-sulfură. Totuși, toxina poate fi o singură polipeptidă care este prelucrată proteolitic în interiorul celulei obținându-se două domenii, ca în cazul endotoxinei A de Pseudomonas. în concluzie, toxinele binare au în mod tipic trei domenii importante, un domeniu citotoxic A, un domeniu de legare la receptor B și un domeniu de translocare. Domeniile A și B sunt adesea asociate prin domenii de interacțiune proteină-proteină.
RO 119835 Β1
Domeniile de legare la receptor corespunzătoare prezentei invenții sunt utile pentru 1 livrarea oricărei proteine, toxine, enzime, factor de transcripție, acid nucleic, substanță chimică sau alt factor către insectele țintă care au un receptor recunoscut de către domeniul 3 de legare la receptor al toxinelor binare descrise în prezenta invenție. Similar, deoarece toxinele binare au domenii de translocare care penetrează membranele fosfolipidice bistra- 5 tificate și conduc citotoxinele prin aceste membrane, astfel de domenii de translocare pot fi utile și pentru escortarea oricărei proteine, toxine, enzime, factor de transcripție, acid nu- 7 cleic, substanță chimică sau alt factor printr-un strat dublu de fosfolipide, cum ar fi membrana plasmatică sau o membrană veziculară. Domeniul de translocare poate el însuși să 9 perforeze membrane, având astfel proprietăți toxice sau insecticide. Pe lângă aceasta, toate toxinele binare au domenii citotoxice; un astfel de domeniu citotoxic poate fi util ca proteină 11 letală, fie ca atare, fie când este livrat prin orice mijloace în orice celulă sau celule țintă.
în fine, datorită faptului că toxinele binare constând din două polipeptide formează 13 deseori un complex, este probabil că există regiuni de interacțiune proteină-proteină între componentele toxinelor binare corespunzătoare invenției. Aceste domenii de interacțiune 15 proteină-proteină pot fi utile în formarea de asociații între orice combinație de toxine, enzime, factori de transcripție, acizi nucleici, anticorpi, grupe de legătură celulară, sau orice alte 17 substanțe chimice, factori, proteine sau domenii proteice.
Toxine, enzime, factori de transcripție, anticorpi, grupe de legătură celulară, sau alte 19 domenii proteice pot fi fuzionate în proteine pesticide sau auxiliare prin producerea fuziunii genetice în cadru care, la translatarea cu ajutorul ribozomilor, va produce o proteină de 21 fuziune având atributele combinate ale proteinei insecticide vegetative și ale celeilalte componente utilizate pentru fuziune. Pe lângă aceasta, dacă domeniul proteic fuzionat cu 23 proteina insecticidă vegetativă are o afinitate pentru altă proteină, acid nucleic, carbohidrat, lipidă sau altă substanță chimică sau factor, atunci se poate forma un complex cu trei corn- 25 ponente. Acest complex va avea atributele tuturor componentelor sale. Un raționament similar poate fi utilizat pentru a produce complexe cu patru sau mai multe componente. Aceste 27 complexe sunt utile ca toxine insecticide, substanțe farmaceutice, reactivi de laborator și reactivi pentru diagnosticare etc. Exemple de aplicații în care astfel de complexe sunt 29 utilizate în mod curent sunt toxine de fuziune pentru terapia cancerului potențial, reactivi pentru teste ELISA și analize imunoblot. 31
O strategie de modificare a proteinelor pesticide și auxiliare este de a fuziona la proteină un capăt S având 15 aminoacizi fără a distruge domeniul sau domeniile de legare 33 la celula insectei, domeniile de translocare sau domeniile de interacțiune proteină-proteină ale proteinei. Capătul S are o afinitate înaltă (1^ = 10'9 M) față de o S-proteină ribonuclează, 35 care, atunci când este legată la capătul S, formează o ribonuclează activă (Vezi F.M. Richards și H.W. Wyckoff (1971) în „The Enzymes, Voi. IV (Boyer, P.D., editor), pag. 647- 37
806, Academic Press, New York). Fuziunea poate fi realizată pe o astfel de cale, încât să distrugă sau să elimine activitatea citotoxică a proteinei pesticide sau auxiliare, înlocuind 39 astfel activitatea citotoxică a proteinei insecticide vegetative cu o nouă activitate citotoxică a ribonucleazei. Toxina finală va fi constituită din S-proteină, o proteină pesticidă și o pro- 41 teină auxiliară, unde fie proteina pesticidă fie cea auxiliară este produsă ca o fuziune translațională cu capătul S. Strategii similare pot fi utilizate pentru a fuziona alte citotoxine poten- 43 țiale cu proteine pesticide sau auxiliare incluzând (dar fără a se limita la acestea) proteine de inactivare a ribozomilor, hormoni de insecte, receptori de hormoni, factori de transcripție, 45 proteaze, fosfataze, exotoxina A de Pseudomonas sau orice altă proteină sau factor chimic care este letal atunci când este introdus în celule. Similar, pot fi livrate în celule proteine care 47 nu sunt letale, dar pot altera biochimia sau fiziologia celulară.
RO 119835 Β1
Spectrul de toxicitate față de diferite specii poate fi modificat fuzionând la proteinele pesticide sau auxiliare, domenii care recunosc receptorii de la suprafața celulară a altor specii. Astfel de domenii pot include (fără a se limita la acestea) anticorpi, transferină, hormoni, sau secvențe de peptide izolate din biblioteci selectabile prin afinitate, afișate pe fagi. De asemenea, pentru a modifica spectrul toxicității pot fi utilizate secvențe de peptide care sunt legate la nutrienți, vitamine, hormoni sau alte substanțe chimice care sunt transportate în interiorul celulei.
Proteinele pesticide corespunzătoare prezentei invenții sunt acele proteine care conferă o proprietate pesticidă specifică. Astfel de proteine pot varia în ceea ce privește masa moleculară, având componente polipeptide cu o masă moleculară de 30 kDa sau mai mare, preferabil de circa 50 kDa sau mai mare.
Este posibil ca proteina pesticidă să fie o componentă a unei proteine multimerice pesticide. O astfel de proteină pesticidă poate varia în ceea ce privește masa moleculară, având o masă moleculară de cel puțin 50 kDa și până la cel puțin 200 kDa, de preferință, de circa 100 kDa până la 150 kDa.
Pentru scopurile invenției, termenul „proteină insecticidă vegetativă - Vegetative Insecticida! Protein - VIP“ cuprinde acele proteine produse în timpul creșterii vegetative care, singure sau în combinație, pot fi utilizate pentru activitatea pesticidă. Acestea includ proteine pesticide, proteine auxiliare și acele proteine care prezintă activitate numai în prezența unei proteine auxiliare, sau componentele polipeptide ale acestor proteine.
Se cunoaște că există metode alternative disponibile pentru a obține secvențele de nucleotide și aminoacizi ale proteinelor corespunzătoare prezentei invenții. De exemplu, pentru a obține secvența de nucleotide care codifică proteina pesticidă, clone cosmid, care exprimă proteina pesticidă, pot fi izolate dintr-o bibliotecă genomică. Din clonele cosmid active mai mari pot fi obținute subclone mai mici, cărora li se testează activitatea. în acest fel, pot fi secvențializate clone care exprimă o proteină pesticidă activă, pentru a determina secvența de nucleotide a genei. Se poate deduce apoi o secvență de aminoacizi pentru proteină. Pentru metodele moleculare generale, vezi, de exemplu, Molecular cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Voi. 1-3, Sambrook etal., (editori) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), și referințele citate aici.
Prezenta invenție cuprinde, de asemenea, secvențe de nucleotide de la alte organisme decât Bacillus, secvențe de nucleotide care pot fi izolate prin hibridizare cu secvențele de nucleotide de Bacillus corespunzătoare invenției. Proteinele codificate de către astfel de secvențe de nucleotide pot fi testate în ceea ce privește activitatea pesticidă. Invenția cuprinde, de asemenea, proteinele codificate de către secvențele de nucleotide. în plus, invenția cuprinde proteinele obținute de la alte organisme decât Bacillus, proteine care reacționează imunologic cu anticorpii generați împotriva proteinelor corespunzătoare invenției. Și aceste proteine izolate pot fi testate pentru activitate pesticidă prin metodele descrise aici sau alte metode cunoscute în stadiul tehnicii.
O dată ce secvențele de nucleotide care codifică proteinele pesticide corespunzătoare invenției au fost izolate, acestea pot fi manipulate și utilizate pentru a exprima proteina într-o varietate de gazde incluzând alte organisme, inclusiv microorganisme și plante.
Genele pesticide corespunzătoare invenției pot fi optimizate pentru o exprimare îmbunătățită în plante. Vezi, de exemplu, EP-A 0618976; EP-A 0359472; EP-A 0385962; WO
91/16432; Perlak și col.(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; și Murray și col.(1989) Nucleic Acîds Research 17:477-498. în acest fel, genele pot fi sintetizate utilizând
RO 119835 Β1 codoni preferați de plante. Codonul preferat pentru o gazdă particulară este codonul singular 1 care codifică cel mai frecvent aminoacidul respectiv în acea gazdă. Codonul preferat de porumb, de exemplu, pentru un aminoacid particular poate fi derivat din secvențe de gene 3 cunoscute de porumb. Utilizarea codonului de porumb pentru 28 de gene de la plantele de porumb se găsește în Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research 17:477-498, descriere 5 care este încorporată aici prin referință. Pot fi realizate, de asemenea, gene sintetice pe baza distribuției de codoni utilizați de o gazdă particulară pentru un anumit aminoacid. 7 în această manieră, secvențele de nucleotide pot fi optimizate pentru exprimare în orice plantă. Se cunoaște că toată sau oricare parte a unei secvențe de gene poate fi optimi- 9 zată sau sintetică. Aceasta înseamnă că pot fi utilizate, de asemenea, secvențe sintetice sau parțial optimizate. 11 într-o manieră similară, secvențele de nucleotide pot fi optimizate pentru exprimare în orice microorganism. Pentru utilizarea codonilor preferați de Bacillus, vezi, de exemplu, 13 US 5024837 și Johansen și col. (1988) Gene 65:293-304.
Metodologiile pentru construcția casetelor de exprimare în plante, ca și cele de intro- 15 ducere a ADN-ului străin în plante sunt descrise în stadiul tehnicii. Astfel de casete de exprimare pot include promotori, terminatori, amelioratori, secvențe lider, introni și alte secvențe 17 de reglare legate operațional la secvența de codificare a proteinei pesticide. Se cunoaște că promotorii și terminatorii genelor VIP pot fi utilizați în casete de exprimare. 19 în general, pentru introducerea de ADN străin în plante au fost utilizați vectori plasmid Ti pentru livrarea de ADN străin, ca și pentru absorbția directă de ADN, lipozomi, electro- 21 porație, micro-injectare și utilizarea de microproiectile. Astfel de metode au fost publicate în stadiul tehnicii. Vezi, de exemplu, Guerche și col., (1987) Plant Science 52:111-116; 23
Neuhause și col., (1987) Theor. Appl. Genet. 75:30-36; Klein și col., (1987) Nature 327:7073; Howell și col., (1980) Science 208:1265; Horsch și col., (1985) Science 227:1229-1231;25
DeBlock și col., (1989) Plant Physiology 91:694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach și Weissbach, editori) Academic Press, Inc. (1988); și Methods in Plant27
Molecular Biology (Schuler și Zielinski, editori) Academic Press, Inc. (1989), vezi, de asemenea, cererea de brevet US 08/008.374, încorporat aici prin referință. Vezi, de29 asemenea, EP-A 0193259 și EP-A 0451878. Se va înțelege că metoda de transformare va depinde de celula de plantă care trebuie transformată.31
Se mai cunoaște că pentru îmbunătățirea exprimării se pot modifica și componentele casetei de exprimare. De exemplu, pot fi utilizate secvențe trunchiate, substituții de nucleo- 33 tide și alte modificări. Vezi, de exemplu, Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328; Murray și col.(1989) Nucleic Acids Research 17:477-498; și WO 91/16432. 35
Construcția poate include, de asemenea, orice alți regulatori necesari, cum ar fi terminatori, (Guerineau et al., (1991), Mol. Gen. Genet., 226:141-144; Proudfoot, (1991), 37
Cell, 64:671-674; Sanfacon et al., (1990), Gene, 91:151-158; Ballas și col., (1989) Nucleic Acids Res., 17:7891-7903; Joshi și col. (1987), Nucleic Acids Re., 15:9627-9639); secvențe 39 de consens translațional în plantă (Joshi, C.P., (1987), Nucleic Acids Research, 15:66436653), introni (Luehrsen și Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet., 225:81-93) și alții asemenea, 41 legați operațional la secvența de nucleotide. Poate fi benefică includerea în construcția casetei de exprimare a unei secvențe lider 5’. Astfel de secvențe lider pot acționa pentru 43 îmbunătățirea translației. Liderii translaționali sunt cunoscuți în stadiul tehnicii și includ:
Lideri picornavirus, de exemplu lider EMCV (regiunea non-codificatoare 5’ a encefalo- 45 miocarditei) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T.R. și Moss, B. (1989) PNAS USA 86:6126-6130);
RO 119835 Β1
Lideri potivirus, de exemplu lider TEV (Tobacco Etch Virus - virusul gravor al tutunului) (Allison și col., (1986); și lider MDMV (Maize Dwarf Mosaic Virus - virusul mozaic pitic al porumbului); Virology, 154:9-20) și
Proteina cu lanț greu de legare a imunoglobulinei umane (BiP), (Macejak, D.G., și
Sarnow, P., (1991), Nature, 353:90-94;
Liderul netranslatat de la proteina de acoperire ARNm a virusului mozaic alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling, S.A., și Gehrke, L., (1987), Nature, 325:622-625;
Liderul virus mozaic al tutunului (TMV), (Gallie, D.R. etal., (1989), Molecular Biology of RNA, paginile 237-256; și
Liderul virus pătat clorotic al porumbului (MCMV) (Lommel, S.A. și col., (1991), Virology, 81:382-385. Vezi, de asemenea, Della-Cioppa și col., (1987), Plant Physiology, 84:965-968.
în caseta de exprimare poate fi utilizat un terminator de plantă. Vezi, Rosenberg și col., (1987), Gene, 56:125; Guerineau și col., (1991), Mol. Gen. Genet., 226:141-144; Proudfoot, (1991), Cell, 64:671-674; Sanfacon, și col. (1991), Genes Dev., 5:141-149; Mogen et al., (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al., (1990), Gene, 91:151-158; Ballas, și col. (1989), Nucleic AcidsRes., 17:7891-7903; Joshi, și col. (1987), Nucleic Acids Res., 15:9627-9639.
Pentru exprimarea specifică unui țesut, secvențele de nucleotide corespunzătoare invenției pot fi legate operațional la promotori specifici țesutului, vezi, de exemplu, EP-A 0618976, încorporat aici prin referință.
în domeniul prezentei invenții sunt cuprinse și plantele transgenice, în particular plante transgenice fertile, transformate prin procedeele menționate anterior și descendenții lor asexuați și/sau sexuați care conțin și preferabil exprimă proteina pesticidă corespunzătoare invenției. Preferate în mod special sunt plantele hibride.
Planta transgenică corespunzătoare invenției poate fi o plantă dicotiledonată sau o plantă monocotiledonată. Sunt preferate plantele monocotiledonate din familia Graminaceae incluzând plantele Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale și Setaria.
Preferate în mod special sunt plantele transgenice de porumb, grâu, orz, sorg, secară, ovăz, gazon și orez.
Dintre plantele dicotiledonate sunt preferate aici în mod special plantele de soia, bumbac, tutun, sfeclă de zahăr, rapiță și floarea-soarelui.
Expresia „descendența trebuie înțeleasă ca referindu-se la descendenții plantelor transgenice generați atât pe cale asexuată, cât și pe cale sexuată. Această definiție este, de asemenea, destinată să includă toți mutanții și variantele care se pot obține prin procedee cunoscute, cum ar fi, de exemplu, fuziunea celulară sau selecția mutanților și care încă mai prezintă proprietățile caracteristice ale plantei părinte transformate inițial, împreună cu toți produșii de încrucișare și fuziune ai materialului plantei transformate.
Un alt obiect al prezentei invenții îl constituie materialul de proliferare al plantelor transgenice.
Materialul de proliferare al plantelor transgenice este definit relativ la prezenta invenție ca orice material provenit din plantă care poate fi propagat pe cale sexuată sau pe cale asexuată, in vivo sau in vitro. Preferate în mod particular în domeniul prezentei invenții sunt protoplastele, celulele, călușul, țesuturile, organele, semințele, embrionii, polenul, celulele ou, zigoții, împreună cu orice alt material de propagare obținut de la plantele transgenice.
RO 119835 Β1
Părțile de plantă, cum ar fi, de exemplu flori, tulpini, fructe, frunze, rădăcini provenind 1 de la plante transgenice sau de la descendenții acestora transformați anterior prin procedee corespunzătoare invenției și deci constituite cel puțin în parte din celule transgenice, 3 reprezintă, de asemenea, un obiect al prezentei invenții.
înainte ca materialul de propagare al plantei (fruct, tubercul, grăunte, sămânță), dar 5 în special sămânța, să fie vândut sub formă de produs comercial, acesta este de obicei tratat cu un înveliș de protecție conținând erbicide, insecticide, fungicide, bactericide, nematicide, 7 moluscicide sau amestecuri ale mai multor astfel de preparate, dacă se dorește împreună cu vehicule, surfactanți sau adjuvanți pentru promovarea aplicării utilizați de obicei în tehnica 9 formulărilor pentru a asigura protecția împotriva distrugerilor cauzate de dăunători bacterieni, fungici sau animali. 11 în vederea tratării semințelor, învelișul protector poate fi aplicat pe acestea fie prin impregnarea tuberculilor sau a grăunțelor cu o compoziție lichidă, fie prin acoperirea 13 acestora cu o compoziție combinată umedă sau uscată. Pe lângă acestea, în cazuri speciale, este posibilă aplicarea altor metode de aplicare pe plante, de exemplu tratarea directă 15 a mugurilor sau fructelor.
Sămânța plantei corespunzătoare invenției, conținând o moleculă de ADN care 17 conține o secvență de nucleotide care codifică o proteină pesticidă corespunzătoare invenției, poate fi tratată cu un înveliș protector conținând un compus pentru tratarea semințelor, 19 cum arfi, de exemplu, captan, carboxin, thiram (TMTD®), metalaxil (Apron®) și pirimifos-metil (Actellic®) și alți compuși care sunt utilizați în mod comun în tratamentul semințelor. Preferate 21 în cadrul invenției sunt învelișurile protectoare pentru semințe care conțin o compoziție insecticidă corespunzătoare invenției singură sau în combinație cu unul din învelișurile 23 protectoare pentru semințe utilizate de obicei pentru tratarea semințelor.
Astfel, un alt obiect al prezentei invenții este de asigura material de propagare a plan- 25 telor pentru plantele cultivate, dar în special semințe de plante care sunt tratate cu un înveliș de protecție a semințelor așa cum a fost definit mai sus. 27
Se cunoaște că genele care codifică proteinele pesticide pot fi utilizate pentru a transforma organismele insectelor patogene. Astfel de organisme includ baculoviruși, fungi, 29 protozoare, bacterii și nematode.
Tulpinile de Bacillus corespunzătoare invenției pot fi utilizate pentru protejarea 31 culturilor și produselor agricole împotriva dăunătorilor. Alternativ, o genă care codifică pesticidul poate fi introdusă prin intermediul unui vector adecvat într-o gazdă microbiană, iar 33 respectiva gazdă poate fi aplicată mediului sau plantelor sau animalelor. Pot fi selectate gazde microorganisme despre care se cunoaște că ocupă „fitosfera (filoplanul, filosfera, 35 rizosfera și/sau rizoplanul) uneia sau mai multor culturi de interes. Aceste microorganisme sunt selectate astfel încât să fie capabile să concureze cu succes în mediul particular cu 37 microorganismele sălbatice, să asigure o menținere și exprimare stabilă a genei care exprimă pesticidul de tip polipeptidă, și, de dorit, să asigure o protecție îmbunătățită a 39 pesticidului față de degradarea și inactivarea datorate mediului.
Astfel de microorganisme includ bacterii, alge și fungi. De un interes particular se 41 bucură microorganismele, cum ar fi bacterii, de exemplu Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, 43 Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc și Alcaligenes; fungi, în particular fermenți, de exemplu Saccharomyces, Cryptococcus, 45 Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula și Aureobasidium. De interes particular sunt__ speciile bacteriene din fitosfera, cum ar fi Pseudomonas syringae, Pseudomonas 47
RO 119835 Β1 fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacterxylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonascampestris, Rhizobium melioti, Alcaligenesenthropus, Clavibacter xyli și Azotobacter vinlandii; și specii de fermenți din fitosferă, cum ar fi Rhodorotula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporoboiomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae și Aureobasidium pollulans. Un interes particular îl prezintă micoorganismele pigmentate.
Sunt disponibile un număr de căi pentru introducerea unei gene care exprimă proteina pesticidă în microorganismul gazdă în condiții care să permită o păstrare și exprimare stabilă a genei. De exemplu, pot fi construite casete de exprimare care includ construcția ADN de interes legată operațional cu semnalele de reglare transcripțională și translațională pentru exprimarea construcției ADN, și o secvență ADN omoloagă cu o secvență din organismul gazdă, prin care va apare integrarea, și/sau un sistem de replicare care este funcțional în gazdă, prin care va apare integrarea sau păstrarea stabilă.
Semnalele de reglare transcripțională și translațională includ, dar nu sunt limitate la aceștia, promotor, situl de start al inițierii transcripționale, operatori, activatori, amelioratori, alte elemente regulatoare, situri de legare a ribozomilor, un codon de inițiere, semnale de terminare, și altele asemenea, vezi, de exemplu, US 5039523; US 4853331; EP 0480762A2; Sambrook și col., supra: Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis și col., (editori) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Advanced Bacteria! Genetics, Davis și col., (editori) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1980); și referințele citate în aceste lucrări.
Celulele gazdă adecvate, unde celulele conținând pesticid vor fi tratate pentru a prelungi activitatea toxinei în celulă atunci când celula tratată este aplicată mediului în care trăiesc dăunătorii țintă, pot include atât procariote, cât și eucariote, fiind în mod normal limitate la acele celule care nu produc substanțe toxice pentru organismele superioare, cum ar fi mamifere. Totuși, pot fi utilizate organisme care produc substanțe toxice pentru organismele superioare, atunci când toxina este instabilă sau nivelul de aplicare este suficient de redus pentru a evita orice posibilitate de toxicitate pentru o gazdă mamifer. Ca gazde, de un interes particular vor fi procariotele și eucariotele inferioare, cum ar fi fungii. Printre procariotele ilustrative, atât gram-negative cât și gram-pozitive, se numără Enterobacteriaceae, cum ar fi Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella și Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, cum ar fi Rhizobium; Spirillaceae, cum ar fi fotobacteriile, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, cum ar fi Pseudomonas și Acetobacter, Azotobacteraceae și Nitrobacteraceae. Printre eucariote se numără fungii, cum ar fi Phycomycetes și Ascomycetes, care includ drojdia, cum ar fi Saccharomyces și Schizosaccharomyces, și fermenți Basidiomycetes, precum Rhodorotula, Aureobasidium, Sporoboiomyces și alții asemenea.
Caracteristicile de interes particular pentru selectarea unei celule gazdă în scop de producție includ ușurința introducerii genei proteinei în gazdă, disponibilitatea sistemului de exprimare, eficiența exprimării, stabilitatea proteinei în gazdă, și prezența capabilităților genetice auxiliare. Caracteristicile de interes pentru utilizare ca microcapsulă pesticidă includ calități protectoare pentru pesticid, cum ar fi o membrană celulară groasă, pigmentarea și împachetarea intracelulară sau formarea de corpuri de incluziune; afinitatea pentru frunze; lipsa toxicității pentru mamifere; atractivitatea privind ingerarea de către dăunători; ușurința distrugerii și fixării fără afectarea toxinei; și alte astfel de caracteristici. Alte considerente includ ușurința formulării și manipulării, considerente economice, stabilitatea la depozitare și altele asemenea.
RO 119835 Β1
Printre organismele gazdă prezentând un interes particular se numără fermenți, cum 1 ar fi Rhodorotula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp., și Sporobolomyces sp.; organisme din filoplan, cum ar fi Pseudomonas sp., Erwinia sp., și Flavobacterium sp.; sau alte 3 asemenea organisme, cum sunt Escherichia, Lactobacillus sp., Bacillus sp., și altele asemenea. Printre organismele specifice se numără Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas 5 fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis și altele asemenea. 7
Genele VIP pot fi introduse în microorganisme care se multiplică în plante (epifite) pentru a livra proteinele VIP către dăunătorii țintă potențiali. Epifitele pot fi de exemplu 9 bacterii gram-pozitive sau gram-negative.
Bacteriile care colonizează rădăcinile, de exemplu, pot fi izolate din plantele de 11 interes prin metode cunoscute în stadiul tehnicii. în mod specific, o tulpină de Bacillus cereus care colonizează rădăcinile poate fi izolată din rădăcinile unei plante (de exemplu vezi J. 13
Handelsman, S. Raffel, E. Meșter, L. Wunderlich și C. Grâu, Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718, (1990)). VIP1 și/sau VIP2 și/sau VIP3 pot fi introduse în Bacillus cereus care 15 colonizează rădăcinile, prin metode standard cunoscute în stadiul tehnicii.
De asemenea, VIP3 sau alte VIP-uri corespunzătoare invenției pot fi introduse în 17 Bacillus care colonizează rădăcinile prin metoda electro-transformării. Specific, VlP-urile pot fi donate într-un vector de transport, de exemplu pHT3101 (D. Lereclus et al., FEMS 19 Microbiol. Letts., 60:211-218 (1989)) așa cum se descrie în Exemplul 10. Vectorul de transport pHT3101 conținând secvența de codificare pentru proteina insecticidă vegetativă 21 particulară poate fi apoi transformat în Bacillus colonizator al rădăcinilor prin metoda electroporației (D. Lereclus et al., 1989 FEMS Microbiol. Letts., 60:211-218). 23
Sistemele de exprimare pot fi proiectate astfel încât proteinele VIP să fie secretate în afara citoplasmei bacteriei gram-negative, de exemplu E. coli. Avantajele de a avea 25 proteine VIP secretate sunt (1) se evită potențialele efecte toxice ale proteinelor VIP exprimate în citoplasmă, (2) se poate crește nivelul de proteină VIP exprimată și (3) poate ajuta 27 la purificarea eficientă a proteinei VIP.
Se poate face ca proteinele VIP să fie secretate în E. coli, de exemplu, prin fuzio- 29 narea unei peptide semnal adecvate de E. coli cu capătul amino-terminal al peptidei semnal VIP sau înlocuirea peptidei semnal VIP cu peptidă semnal de la E. coli. Peptidele semnal 31 recunoscute de către E. coli pot fi găsite în proteine cunoscute deja ca fiind secretate în E. coli, de exemplu proteina OmpA (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, Y. Masui și M. 33 Inouye, EMBO J., 3:2437-2442 (1984)). OmpA este o proteină majoră a E. coli în afara membranei și astfel peptidă sa semnal este considerată eficientă în procesul de translocare. 35 De asemenea, peptidă semnal a OmpA nu trebuie să fie modificată înaintea procesării, cum ar putea fi cazul pentru alte peptide semnal, de exemplu peptidă semnal a lipoproteinelor (G. 37
Duffaud, P. March și M. Inouye, Methods in Enzymology, 153:492 (1987).
Specific, situri de restricție Bam-HI unice pot fi introduse la capetele amino-terminal 39 și carboxi-terminal ale secvenței de codificare a VIP utilizând metode standard cunoscute în stadiul tehnicii. Aceste fragmente Bam-HI pot fi donate, în cadru, în vector plN-lll-ompA1, 41
A2 sau A3 (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui și M. Inouye, EMBO
J., 3:2437-2442 (1984)) creând astfel gena de fuziune ompA: VIP care este secretată în spa- 43 țiul periplasmic. Celelalte situri de restricție din poli-linkerul vectorului pIN-lll-ompA pot fi eliminate prin metode standard cunoscute în stadiul tehnicii, astfel încât secvența de amino- 45 acizi de codificare de la capătul amino-terminal al VIP este direct după situl de scindare al peptidei semnal a ompA. Astfel, secvența VIP secretată în E. coli va fi identică cu secvența 47
VIP nativă.
RO 119835 Β1
Atunci când peptida semnal nativă a VIP nu este necesară pentru plierea corespunzătoare a proteinei mature, astfel de secvențe semnal pot fi îndepărtate și înlocuite cu secvența semnal a ompA. Situri de restricție BamHI unice pot fi introduse la capetele amino-terminal ale secvențelor care codifică proteina direct după secvențele de codificare a peptidei semnal a VIP și la secvențele de codificare a capetelor carboxi-terminal ale VIP. Aceste fragmente BamHI pot fi apoi donate în vectori pIN-lll-ompA așa cum s-a descris mai sus.
Metode generale pentru utilizarea tulpinilor corespunzătoare invenției în controlul dăunătorilor sau pentru ingineria genetică a altor organisme ca agenzi pesticizi sunt cunoscute în stadiul tehnicii, vezi, de exemplu, US 5039523 și EP 0480762A2.
Proteinele insecticide vegetative pot fi fermentate într-o gazdă bacteriană și bacteria rezultată este prelucrată și utilizată ca spray pesticid în aceeași manieră în care au fost utilizate ca sprayuri insecticide tulpinile de Bacillus thuringiensis. în cazul proteinelor insecticide vegetative care sunt secretate de Bacillus, semnalul de secreție este îndepărtat sau mutat utilizând proceduri cunoscute în stadiul tehnicii. Astfel de mutații și/sau deleții previn secreția proteinelor VIP în mediul de creștere în timpul procesului de fermentare. Proteinele insecticide vegetative sunt reținute în interiorul celulei și celulele sunt apoi prelucrate pentru a se obține proteinele insecticide vegetative încapsulate. Orice microorganism potrivit poate fi utilizat în acest scop. Pseudomonas a fost utilizat pentru a exprima endotoxine de Bacillus thuringiensis ca proteine încapsulate, celulele rezultate fiind prelucrate și pulverizate ca insecticide. (H. Gaertner și col. 1993, în Advanced Engineering Pesticides, L. Kim, editor).
Diferite tulpini de Bacillus thuringiensis au fost utilizate în acest fel. Astfel de tulpini Bt produc proteine endotoxine ca și proteine insecticide vegetative. Alternativ, astfel de tulpini pot produce numai proteine insecticide vegetative. S-a arătat că o tulpină de Bacillus subtilis având deficiențe de sporulare produce nivele ridicate de endotoxină CrylllA de la Bacillus thuringiensis (Agaisse, H. și Lereclus, D., „Expression in Bacillus subtilis ofthe Bacillus thuringiensis CrylllA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factorandisincreasedin a spoOA mutant, J. Bacteriol., 176:4734-4741 (1994)). Un mutant spoOA similar poate fi preparat în Bacillus thuringiensis și utilizat pentru a produce proteine insecticide vegetative încapsulate care nu sunt secretate în mediu, ci sunt reținute în celulă.
Pentru a păstra proteinele insecticide vegetative în interiorul celulelor de Bacillus, peptida semnal poate fi dezactivată, astfel încât să nu mai funcționeze ca semnal de secreție.
Alternativ, peptidele semnal ale proteinelor insecticide vegetative corespunzătoare invenției pot fi eliminate din secvență, făcându-le astfel să nu fie recunoscute ca proteine de secreție în Bacillus. Specific, un sit de start metionină poate fi plasat înaintea secvenței proproteină utilizând metode cunoscute în stadiul tehnicii.
Genele VIP pot fi introduse în microorganisme care se multiplică pe plante (epifite) pentru a livra proteinele VIP către potențialii dăunători țintă. Epifitele pot fi, de exemplu, bacterii gram-pozitive sau gram-negative.
Tulpinile de Bacillus corespunzătoare invenției sau microorganismele care au fost modificate genetic pentru a conține gena și proteina pesticidă pot fi utilizate pentru protejarea culturilor și produselor agricole împotriva dăunătorilor. într-unul din aspectele invenției, celulele întregi, adică nelizate, ale unui organism producător de toxină (pesticid) sunt tratate cu reactivi care prelungesc activitatea toxinei produse în celulă atunci când celula este aplicată mediului dăunătorilor țintă. ~~
RO 119835 Β1
Alternativ, pesticidele sunt produse prin introducerea unei gene heteroloage într-o 1 gazdă celulară. Exprimarea genei heteroloage conduce, direct sau indirect, la producerea și păstrarea intracelulară a pesticidului. Aceste celule sunt apoi tratate în condiții care prelun- 3 gesc activitatea toxinei produse în celulă atunci când celula este aplicată mediului dăunătorilor țintă. Produsul rezultat păstrează toxicitatea toxinei. Aceste pesticide încapsulate 5 natural pot fi apoi formulate conform tehnicilor convenționale pentru aplicarea în mediul care găzduiește un dăunător țintă, de exemplu în sol, apă, sau pe frunzișul plantelor, vezi, de 7 exemplu, EP-A 0192319 și referințele citate în documentul respectiv.
Ingredientele active corespunzătoare prezentei invenții sunt aplicate în mod normal 9 sub formă de compoziții și pot fi aplicate pe zonele cultivate sau plantele care trebuie tratate, simultan sau succesiv cu alți compuși. Acești compuși pot fi atât fertilizanți, cât și donori de 11 micronutrienți sau alte preparate care influențează creșterea plantelor. Aceștia pot fi, de asemenea, erbicide, insecticide, fungicide, bactericide, nematicide, moluscicide selective sau 13 mai multe astfel de preparate împreună, dacă se dorește, cu vehicule, surfactanți sau adjuvanți de promovare a aplicării acceptabili din punct de vedere agronomic, utilizați în mod 15 obișnuit în tehnica formulărilor. Vehiculele și adjuvanții potriviți pot fi sub formă solidă sau lichidă și corespund substanțelor utilizate în mod comun în tehnologia formulărilor, de 17 exemplu substanțe minerale naturale sau regenerate, solvenți, dispersanți, agenți de umectare, agenți de mărire a aderenței, lianți sau fertilizanți. 19
Metodele preferate de aplicare a unui ingredient activ corespunzător prezentei invenții sau a unei compoziții agrochimice corespunzătoare invenției, care conține cel puțin 21 una din proteinele specifice pentru o anumită insectă produse de tulpinile bacteriene corespunzătoare prezentei invenții sunt aplicarea pe frunze, acoperirea semințelor și aplicarea 23 în sol. Numărul de aplicări și rata de aplicare depind de intensitatea infestării cu dăunători.
Prezenta invenție furnizează deci o compoziție insecticidă conținând ca ingredient 25 activ cel puțin una din noile proteine specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, și/sau un microorganism conținând cel puțin o moleculă de ADN conținând o 27 secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, dar în special o tulpină recombinantă de Bacillus spp., cum ar fi 29 Baccilus cereus sau Bacillus thuringiensis, conținând cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în 31 formă recombinantă, sau un derivat sau mutant al acesteia, împreună cu un adjuvant agricol cum arfi un vehicul, diluant, surfactant sau adjuvant pentru promovarea aplicării. Compoziția 33 poate conține, de asemenea, un compus activ biologic suplimentar. Compusul respectiv poate fi atât un fertilizant, cât și un donor de micronutrienți sau de alte preparate care 35 influențează creșterea plantelor. Acesta poate fi, de asemenea, un erbicid, insecticid, fungicid, bactericid, nematicid, moluscicid selectiv sau sau un amestec de mai multe astfel de 37 preparate împreună, dacă se dorește, cu vehicule, surfactanți sau adjuvanți de promovare a aplicării acceptabili din punct de vedere agronomic, utilizați în mod obișnuit în tehnica 39 formulărilor. Vehiculele și adjuvanții potriviți pot fi sub formă solidă sau lichidă și corespund substanțelor utilizate în mod comun în tehnologia formulărilor, de exemplu substanțe mine- 41 rale naturale sau regenerate, solvenți, dispersanți, agenți de umectare, agenți de mărire a aderenței, lianți sau fertilizanți. 43
Compoziția poate conține între 0,1 și 99% din masă ingredient activ, între 1 și 99,9% din masă un adjuvant solid sau lichid, și între 0 și 25% din masă un surfactant. Ingredientul 45 activ conținând cel puțin una din noile proteine specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, sau un microorganism recombinant conținând cel puțin o moleculă de ADN 47
RO 119835 Β1 conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, dar în special o tulpină recombinantă de Bacillus spp., cum ar fi Baccilus cereus sau Bacillus thuringiensis, conținând cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, sau un derivat sau mutant al acesteia, sau compoziția care conține respectivul ingredient activ, poate fi administrat către plantele sau culturile care trebuie protejate împreună cu anumite alte insecticide sau substanțe chimice (1993 Crop Protection Chemicals Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Canada) fără a-și pierde eficacitatea. Acesta este compatibil cu cea mai mare parte a celorlalte materiale utilizate în mod comun pentru pulverizare în scop agricol, dar nu trebuie utilizat în soluții pentru pulverizare extrem de alcaline. Acesta poate fi administrat ca praf, suspensie, pulbere umectabilă sau orice altă formă potrivită pentru aplicarea agricolă.
Invenția furnizează, de asemenea, metode pentru controlul sau inhibarea insectelor dăunătoare prin aplicarea unui ingredient activ conținând cel puțin una din noile proteine specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției, sau un microorganism recombinant conținând cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, sau o compoziție conținând respectivul ingredient activ către (a) un mediu în care poate apare insecta dăunătoare, (b) o plantă sau parte de plantă în scopul protejării respectivei plante sau părți a plantei de distrugerile cauzate de o insectă dăunătoare, sau (c) semințe în scopul protejării plantei care se dezvoltă din semințele respective de distrugerile cauzate de o insectă dăunătoare.
O metodă preferată de aplicare în zona de protecție a plantelor este aplicarea pe frunzișul plantelor (aplicare foliară), numărul de aplicări și rata de aplicare depinzând de planta care trebuie protejată și de riscul de infestare cu dăunătorul în chestiune. Totuși, ingredientul activ poate, de asemenea, să penetreze plantele prin rădăcini (acțiune sistemică) dacă locul de înrădăcinare a plantelor este impregnat cu o compoziție lichidă sau dacă ingredientul activ este încorporat sub formă solidă în locul de înrădăcinare a plantei, de exemplu în sol, de exemplu sub formă granulară (aplicare în sol). în orezarii, astfel de granule pot fi aplicate în cantități bine determinate în câmpurile inundate cultivate cu orez.
Compozițiile corespunzătoare invenției sunt, de asemenea, adecvate pentru protejarea materialului de propagare a plantelor, de exemplu semințe, cum ar fi fruct, tubercul sau grăunță, sau butași de plante, de insectele dăunătoare. Materialul de propagare poate fi tratat cu compoziția înainte de plantare: semințele, de exemplu, pot fi îmbrăcate înainte de a fi semănate. Ingredientul activ corespunzător invenției poate fi aplicat, de asemenea, pe grăunțe (acoperire), fie prin impregnarea grăunțelor cu o compoziție lichidă, fie prin acoperirea acestora cu o formulare solidă. Compoziția poate fi aplicată, de asemenea, la locul de plantare atunci când se efectuează plantarea materialului de propagare a plantei, de exemplu în brazda de însămânțare, în timpul însămânțării. Invenția se referă, de asemenea, la aceste metode de tratare a materialului de propagare a plantelor și la materialul de propagare a plantelor astfel tratat.
Compozițiile corespunzătoare invenției, conținând ca ingredient activ un microorganism recombinant conținând cel puțin una din noile gene de toxine în formă recombinantă, dar în special o tulpină recombinantă de Bacillus spp., cum ar fi Baccilus cereus sau Bacillus thuringiensis, conținând cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, sau un derivat sau mutant al acesteia, pot fi aplicate prin orice metodă cunoscută de tratare a
RO 119835 Β1 semințelor sau solului cu tulpini bacteriene. De exemplu, vezi US 4863866. Tulpinile sunt 1 eficiente pentru biocontrol chiar dacă microorganismul nu este viu. Este preferată, totuși, aplicarea microorganismului viu. 3
Culturile țintă care pot fi protejate în domeniul prezentei invenții costau, de exemplu, din următoarele specii de plante: 5 cereale (grâu, orz, secară, ovăz, orez, sorg și culturi înrudite), sfeclă (sfeclă de zahăr și sfeclă furajeră), nutrețuri (golomăt, păiuș și altele asemenea), fructe sub formă de drupe, 7 cu pulpă moale și moi (mere, pere, prune, piersici, migdale, cireșe, căpșuni, zmeură și mure), plante leguminoase (fasole, linte, mazăre, soia); plante oleaginoase (rapiță, muștar, 9 mac, măsline, floarea soarelui, cocos, ricin, arbore de cacao, alune de pământ); plante cucurbitacee (dovlecei, castraveți, pepeni); plante fibroase (bumbac, in, cânepă, iută); citrice 11 (portocale, lămâi, grefuri, mandarine); legume (spanac, lăptuci, sparanghel, varză și alte legume din familia Brassicae, ceapă, tomate, cartofi, ardei); lauracee (avocado, morcovi, 13 arbore de scorțișoară, camfor); copaci foioși și conifere (de exemplu tei, tisă, stejar, anin, plop, mesteacăn, brad, zadă, pin), sau plante cum ar fi porumbul, tutunul, nucul, arborele 15 de cafea, trestia de zahăr, ceaiul, vița de vie, hameiul, bananierul și arborele de cauciuc, ca și plantele ornamentale (inclusiv compozite). 17
O tulpină de Bacillus spp recombinant, cum ar fi tulpinile de Bacillus cereus sau Bacillus thuringiensis, conținând cel puțin o moleculă de ADN care conține o secvență de 19 nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă este aplicată în mod normal sub forma unei compoziții insecticide și poate fi aplicată 21 către zonele de cultură sau plantele care trebuie tratate, simultan sau în succesiune cu alți compuși activi biologic. Acești compuși pot fi atât fertilizanți cât și donori de micronutrienți 23 sau alte preparate care influențează creșterea plantelor. Aceștia pot fi, de asemenea, erbicide, insecticide, fungicide, bactericide, nematicide, moluscicide selective sau amestecuri 25 de mai multe astfel de preparate, împreună, dacă se dorește, cu vehicule, surfactanți sau adjuvanți de promovare a aplicării acceptabili din punct de vedere agronomic, utilizați în mod 27 obișnuit în tehnica formulărilor.
Ingredientul activ corespunzător invenției poate fi utilizat sub formă nemodificată sau 29 împreună cu orice vehicul potrivit, acceptabil din punct de vedere agronomic. Astfel de vehicule sunt adjuvanți utilizați în mod convențional în tehnica formulărilor agricole, care sunt for- 31 mulați într-o manieră cunoscută pentru a se obține concentrate emulsionabile, paste de acoperire, soluții pentru pulverizare directă sau pentru diluare, emulsii diluate, pulberi umecta- 33 bile, pulberi solubile, prafuri, granulate, și, de asemenea, încapsulări, de exemplu în substanțe polimerice. Ca și natura compoziției, metoda de aplicare, cum ar fi pulverizarea, 35 atomizarea, prăfuirea, împrăștierea sau turnarea, este aleasă conform obiectivului urmărit și circumstanțele relevante. Ratele de aplicare avantajoase sunt în mod normal între circa 37 50 g și circa 5 kg de ingredient activ (i.a.) la hectar („ha“, aproximativ 2,471 acri), preferabil între circa 100 g și circa 2 kg i.a./ha. Ratele de aplicare importante sunt între circa 200 g și 39 circa 1 kg i.a./ha și 200 g până la 500 g i.a./ha.
Pentru îmbrăcarea semințelor, ratele de aplicare avantajoase sunt între 0,5 g și 41 1000 g i.a. la 100 kg de semințe, preferabil 3 g până la 100 g i.a. la 100 kg de semințe sau 10 g până la 50 g i.a. la 100 kg de semințe. 43
Vehiculele și adjuvanții potriviți pot fi sub formă solidă sau lichidă și corespund substanțelor utilizate în mod comun în tehnologia formulărilor, de exemplu substanțe minerale 45 naturale sau regenerate, solvenți, dispersanți, agenți de umectare, agenți de mărire a aderenței, lianți sau fertilizanți. Formulările, adică preparatele, compozițiile sau amestecurile 47
RO 119835 Β1 conținând tulpina de Bacillus spp recombinant, cum ar fi tulpinile de Bacillus cereus sau Bacillus thuringiensis conținând cel puțin o moleculă de ADN care conține o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă ca ingredient activ, sau combinații ale acesteia cu alte ingrediente active și, dacă este cazul, un adjuvant solid sau lichid, sunt preparate într-o manieră cunoscută, de exemplu prin amestecarea omogenă și/sau măcinarea ingredientelor active împreună cu materiale de umplutură, de exemplu solvenți, vehicule solide, și în unele cazuri compuși tensioactivi (surfactanți).
Solvenții adecvați sunt: hidrocarburi aromatice, preferabil fracțiunile conținând 8 până la 12 atomi de carbon, de exemplu amestecuri de xilene sau naftalene substituite, ftalați cum ar fi dibutil ftalat sau dioctil ftalat, hidrocarburi alifatice precum ciclohexan sau parafine, alcooli și glicoli și eterii și esterii acestora, cum ar fi etanol, etilen glicol monometil sau monoetil eter, cetone precum ciclohexanona, solvenți polari tari cum ar fi N-metil-2-pirolidona, dimetilsulfoxidul sau dimetilformamida, ca și uleiuri vegetale sau uleiuri vegetale epoxidate, cum ar fi ulei de cocos epoxidat sau ulei de soia; sau apă.
Vehiculele solide utilizate, de exemplu pentru prafuri și pulberi dispersabile, sunt în mod normal materiale de umplutură minerale naturale, cum ar fi calcit, talc, caolin, montmorillonită sau attapulgită. în scopul îmbunătățirii proprietăților fizice este, de asemenea, posibil să se adauge acid silicic înalt dispersat sau polimeri absorbanți înalt dispersați. Vehiculele granulate absorbante adecvate sunt de tip poros, de exemplu piatră ponce, cărămizi sparte, sepiolită sau bentonită, iar vehiculele non-absorbante adecvate sunt materiale precum calcit sau nisip. în plus, poate fi utilizat un mare număr de materiale pre-granulate de natură anorganică sau organică, de exemplu în special dolomită sau reziduuri vegetale pulverizate.
în funcție de natura ingredientelor active care trebuie introduse în compoziție, compușii tensioactivi adecvați sunt surfactanți non-ionici, cationici și/sau anionici având bune proprietăți de emulsionare, dispersare și umectare. Termenul „surfactanți va fi înțeles, de asemenea, ca referindu-se și la amestecuri de surfactanți. Surfactanții anionici adecvați pot fi atât săpunuri solubile în apă, cât și compuși tensio-activi sintetici solubili în apă. Săpunurile potrivite sunt săruri ale metalelor alcaline, săruri ale metalelor alcalino-pământoase sau săruri de amoniu cu acizi grași superiori (C10-C22) nesubstituiți sau substituiți, de exemplu sărurile de sodiu sau potasiu ale acidului oleic sau stearic, sau ale amestecurilor de acizi grași naturali care pot fi obținute, de exemplu, din ulei de cocos sau oleomargarină. Alți surfactanți adecvați sunt, de asemenea, sărurile de metiltaurină ale acizilor grași, ca și fosfolipidele modificate sau nemodificate.
Mai frecvent, totuși, sunt utilizați așa-numiți surfactanți sintetici, în special sulfonați grași, sulfați grași, derivați grași de benzimidazol sau alchilarilsulfonați. Sulfonații sau sulfații grași sunt uzual sub formă de săruri ale metalelor alcaline, săruri ale metalelor alcalino-pământoase sau săruri de amoniu nesubstituite sau substituite și conțin în general un radical alchil C8-C22 care include, de asemenea, grupa alchil a radicalilor acil, de exemplu sarea de sodiu sau calciu a acidului lignosulfonic, sub formă de dodecilsulfat sau sub formă de amestec de sulfați ai alcoolilor grași obținuți din acizi grași naturali. Acești compuși conțin, de asemenea, sărurile esterilor acidului sulfuric și acizi sulfonici ai produșilor de adiție alcool gras/oxid de etilenă. Derivații sulfonați de benzimidazol conțin, de preferință, două grupe acid sulfonic și un radical acid gras conținând între 8 și 22 atomi de carbon. Exemple de alchilarilsulfonați sunt sărurile de sodiu, calciu sau trietanolamină ale acidului dodecilbenzensulfonic, acidului dibutilnaftalensulfonic sau ale unui produs de condensare acid
RO 119835 Β1 naftalensulfonic/formaldehidă. Sunt potriviți, de asemenea, fosfații corespunzători, de 1 exemplu sărurile esterului acidului fosforic sau un produs de adiție a p-nonilfenolului cu 4 până la 14 moli de oxid de etilenă. 3
Surfactanții non-ionici sunt, de preferință, derivați cu poliglicoleterai alcoolilor alifatici sau cicloalifatici, sau acizi grași și alchilfenoli saturați sau nesaturați, derivații respectivi conți- 5 nând 3 până la 30 grupe glicol eter și 8 până la 20 de atomi de carbon în partea de hidrocarbură (alifatică) și 6 până la 18 atomi de carbon în partea alchil a alchilfenolilor. 7
Alți surfactanți non-ionici adecvați sunt produșii de adiție solubili în apă ai oxidului de polietilenă cu polipropilen glicol, etilendiaminopolipropilen glicol și alchilpolipropilen glicol 9 conținând 1 până la 10 atomi de carbon în lanțul alchil, produși de adiție care conțin 20 până la 250 de grupe etilen glicol eter și 10 până la 100 de grupe propilen glicol eter. Acești 11 compuși conțin uzual 1 până la 5 unități etilen glicol pentru fiecare unitate propilen glicol. Exemple reprezentative de surfactanți non-ionici sunt nonilfenolpolietoxietanoli, poliglicol 13 eteri cu ulei de ricin, produși de adiție polipropilenă/oxid de polietilenă, tributilfenoxipolietoxietanol, polietilen glicol și octilfenoxipolietoxietanol. De asemenea, sunt potriviți ca surfactanți 15 non-ionici esterii cu acizi grași ai polioxietilen sorbitanului, cum ar fi trioleatul de polioxietilen sorbitan. 17
Surfactanții cationici sunt, de preferință, săruri cuaternare de amoniu care conțin, ca N-substituenți, cel puțin un radical alchil C8-C22 și, ca substituenți suplimentari, alchil inferior 19 nesubstituit sau substituit, radicali benzii sau hidroxil-alchil inferior. Sărurile sunt, de preferință, sub formă de halogenuri, metilsulfați sau etilsulfați, de exemplu clorură de stearil- 21 trimetilamoniu sau bromură de benzildi-(2-cloroetil)etilamoniu.
Surfactanții utilizați de obicei în tehnica formulărilor sunt descriși, de exemplu, în 23 „McCutcheon’sDetergentsandEmulsifiersAnnuar, MC Publishing Corp. Ridgewood, N.J., 1971; Dr. Helmut Stache, „Tensid Taschenbuch“ (Handbook of Surfactants), Cari Hanser 25 Verlag, MunchenA/iena.
O altă caracteristică preferată în mod particular a compozițiilor insecticide corespun- 27 zătoare prezentei invenții o constituie persistența ingredientului activ la aplicarea acestuia pe plante sau sol. Cauzele posibile de pierdere a activității includ inactivarea datorată luminii 29 ultraviolete, căldurii, exsudaților din frunze și acidității. De exemplu, la valori mari alepH-ului, în particular în prezența unui reducător, cristalele de δ-endotoxină sunt solubilizate și astfel 31 devin mai susceptibile de a fi inactivate pe cale proteolitică. pH-ul ridicat al frunzelor poate fi, de asemenea, important, în particular acolo unde suprafața frunzei poate avea un pH în 33 gama 8-10. Formularea unei compoziții insecticide corespunzătoare prezentei invenții poate rezolva aceste probleme fie prin includerea de aditivi care ajută la prevenirea pierderii de 35 ingredient activ, fie prin încapsularea materialului în așa fel, încât ingredientul activ să fie protejat împotriva inactivării. încapsularea poate fi realizată pe cale chimică (McGuire și 37 Shasha, J. Econ. Entomol., 85:1425-1433, 1992) sau pe cale biologică (Barnes și Cummings, 1986; EP-A 0 192 319). încapsularea chimică implică un proces în care ingre- 39 dientul activ este acoperit cu un polimer, în timp ce încapsularea biologică implică exprimarea genelor δ-endotoxinei într-un microb. Pentru încapsularea biologică, microbul intact 41 care conține cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă este utilizat ca 43 ingredient activ în formulare. Adăugarea de substanțe de protecție UV poate reduce efectiv deteriorările provocate de radiație. Inactivarea datorată căldurii poate fi, de asemenea, 45 controlată prin includerea unui aditiv corespunzător.
RO 119835 Β1 în prezenta invenție sunt preferate compozițiile conținând microorganisme vii cu rol de ingrediente active, fie sub formă de celule vegetative, fie mai preferabil sub formă de spori, dacă este posibil. Formulările adecvate pot consta, de exemplu, din geluri polimerice care sunt reticulate cu cationi polivalenți și conțin aceste microorganisme. Acestea sunt descrise, de exemplu, de către D.R. Fravel și col. în Phytopathology, Voi. 75, nr. 7, 774-777, 1985 pentru alginat ca material polimeric. Se cunosc, de asemenea, din această publicație materialele care pot fi utilizate ca vehicul. Aceste formulări sunt de regulă preparate prin amestecarea soluțiilor de polimeri formatori de gel, naturali sau sintetici, de exemplu alginați, și a soluțiilor apoase de săruri ale ionilor de metale polivalente, astfel încât să se formeze picături individuale, fiind posibilă punerea în suspensie a microorganismelor într-una din cele două sau în ambele soluții de reacție. Formarea gelului începe prin amestecarea sub formă de picături. Este posibilă uscarea ulterioară a acestor particule de gel. Acest procedeu este denumit gelificare ionotropică. în funcție de gradul de uscare, se formează particule compacte și dure de polimeri care sunt reticulate structural prin cationi polivalenți și conțin microorganisme și un vehicul care este prezent predominant sub formă distribuită uniform. Dimensiunea particulelor poate fi de până la 5 mm.
Compozițiile bazate pe polizaharide parțial reticulate care, pe lângă microorganisme, de exemplu, pot conține, de asemenea, acid silicic fin divizat ca vehicul, reticularea având loc, de exemplu, prin ioni de Ca++, sunt descrise în EP-A1-0097571. Compozițiile au o activitate în apă nu mai mare de 0,3. W.J. Cornick și col. descrie într-un articol de revistă (New Directions in Biologica! Control: Altematives for Suppressing Agricultural Pests and Diseases, paginile 345-372, Alan R. Liss, Inc. (1990)] diverse sisteme de formulare, fiind menționate granulele utilizând vermiculită ca vehicul și perlele de alginat compact preparate prin procedeul de gelificare ionotropică. Astfel de compoziții sunt, de asemenea, descrise de către D.R. Fravel în Pesticide Formulations and Application Systems: volumul 11, ASTM STP1112 American Society forTesting and Materials, Philadelphia, 1992, paginile 173 până la 179 și pot fi utilizate pentru a formula microorganismele recombinante corespunzătoare prezentei invenții.
Compozițiile insecticide corespunzătoare invenției conțin uzual între circa 0,1 și circa 99%, preferabil circa 0,1 până la circa 95% și cel mai preferabil între circa 3 și circa 90% ingredient activ, între circa 1 și circa 99,9%, preferabil între circa 1 și circa 99% și cel mai preferabil între circa 5 și circa 95% dintr-un adjuvant solid sau lichid, și între circa 0 și circa 25%, preferabil între circa 0,1 și circa 25%, și cel mai preferabil între circa 0,1 și circa 20% dintr-un surfactant.
într-o materializare preferată a invenției, compozițiile insecticide conțin uzual 0,1 până la 99%, preferabil 0,1 până la 95% dintr-o tulpină de Bacillus spp recombinant, cum ar fi tulpinile de Bacillus cereus sau Bacillus thuringiensis care conțin cel puțin o moleculă de ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică noile proteine specifice pentru o anumită insectă în formă recombinantă, sau combinații ale acestora cu alte ingrediente active, 1 până la 99,9% dintr-un adjuvant solid sau lichid, și 0 până la 25%, preferabil 0,1 până la 20%, dintr-un surfactant.
Chiar dacă produsele comerciale sunt formulate, de preferință, sub formă concentrată, utilizatorul final va folosi în mod normal formulări diluate având o concentrație substanțial mai redusă. Compozițiile insecticide pot conține, de asemenea, și alte ingrediente, cum ar fi stabilizatori, antispumanți, regulatori de viscozitate, lianți, agenți de mărire a aderenței, ca și fertilizanți sau alte ingrediente active, în scopul obținerii de efecte speciale.
RO 119835 Β1
Produsele conform invenției de față au următoarele avantaje:
- proteinele sunt utile ca noi agenți pesticizi, ele au efecte semnificative asupra membrilor din genul Diabrotica, în particular Diabrotica virgifera virgifera, viermele vestic al rădăcinii porumbului (WCRW) sau Diabrotica longicornis barberi, viermele nordic al rădăcinii porumbului;
- genele care codifică astfel de proteine insecticide vegetative pot fi izolate, donate și transformate în diferite vehicule de livrare pentru utilizare în cadrul programelor de control al dăunătorilor;
- molecula ADN poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp. sau variante sau fragmente ale proteinei care păstrează activitatea pesticidă, respectiva proteină putând fi izolată din mediul lichid de cultură;
- proteinele obținute lărgesc domeniul de insecte țintă prin utilizarea unei proteine specifice pentru o anumită insectă, în combinație cu cel puțin o proteină insecticidă secundară care este diferită de proteina specifică pentru o anumită insectă.
Se dau mai jos exemple de realizare a invenției care nu trebuie considerate ca limitând invenția, dacă nu se specifică altfel.
A fost dezvoltată o nomenclatură standard bazată pe identitatea de secvență a proteinelor cuprinse în prezenta invenție. Numele genelor și proteinelor pentru exemplele detaliate care urmează, precum și relațiile acestor cu numele utilizate în cererea de brevet US 314594/08 sunt prezentate mai jos.
Numele și nomenclatura standard a genei/proteinei Numele genei/proteinei în cererea de brevet US Descrierea proteinei
VIP3A(a) - VIP din tulpina AB88 descris în SEQ ID NO:1 din prezenta cerere
VIP3A(b) - VIP din tulpina AB424 descris în SEQ ID NO:4 din prezenta cerere
Partea experimentală
Exemple de compoziții
Ingredientul activ utilizat în următoarele exemple de compoziții este o tulpină AB78 de Bacillus cereus având depozitul cu numărul de acces NRRL B-21058; tulpini de Bacillus thuringiensis având depozitele cu numerele de acces NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, și NRRL B-21439; și tulpini de Bacillus spp având depozitele cu numerele de acces NRRL B-21228, NRRL B-21229, și NRRL B-21230. Toate tulpinile menționate sunt izolate natural și conțin proteinele specifice pentru o anumită insectă, corespunzătoare invenției.
Alternativ, proteine izolate specifice pentru o anumită insectă sunt utilizate ca ingredient activ singure sau în combinație cu tulpinile de Bacillus menționate mai sus.
A1. Pulberi umectabile
a) b) c)
spori de Bacillus thuringiensis 25% 50% 75%
lignosulfonat de sodiu 5% 5% -
laurilsulfat de sodiu 3% - 5%
diisobutilnaftalensulfonat de sodiu - 6% 10%
octilfenol polietilen glicol eter (7-8 moli de oxid de etilenă) - 2% -
acid silicic înalt dispersat 5% 10% 10%
caolin 62% 27% -
RO 119835 Β1
Sporii sunt amestecați intim cu adjuvanții și amestecul este măcinat fin într-o moară adecvată, obținându-se pulberi umectabile care pot fi diluate cu apă pentru a se obține suspensii având concentrațiile dorite.
A2. Concentrate emulsionabile
spori de Bacillus thuringiensis 10%
octilfenol polietilen glicol eter (4-5 moli de oxid de etilenă) 3%
dodecilbenzensulfonat de calciu 3%
ulei de ricin poliglicol eter (36 moli de oxid de etilenă) 4%
ciclohexanonă 30%
amestec de xilene 50%
Emulsii de orice concentrație dorită pot fi obținute din acest concentrat prin diluare cu apă.
A3. Prafuri
a) b)
spori de Bacillus thuringiensis 5% 8%
talc 95% -
caolin - 92%
Prafuri gata de utilizare sunt obținute prin amestecarea ingredientului activ cu vehicule și măcinarea amestecului într-o moară corespunzătoare.
A4. Extrudate granulate
spori de Bacillus thuringiensis 10%
lignosulfonat de sodiu 2%
carboximetilceluloză 1%
caolin 87%
Ingredientul activ sau combinația de ingrediente active este amestecată cu adjuvanții și amestecul este apoi umezit cu apă. Amestecul este extrudat, granulat și uscat în curent de aer.
A5. Granule acoperite
spori de Bacillus thuringiensis 3%
polietilen glicol (masă moleculară 200) 3%
caolin 94%
Ingredientul activ sau combinația de ingrediente active este aplicată uniform într-un mixer pe caolinul umezit cu polietilen glicol. în acest fel se obțin granule acoperite lipsite de praf.
A6. Concentrat pentru suspensii
spori de Bacillus thuringiensis 40%
etilen glicol 10%
nonilfenol polietilen glicol eter (15 moli de oxid de etilenă) 6%
lignosulfonat de sodiu 10%
carboximetilceluloză 1%
soluție apoasă de formaldehidă 37% 0,2%
ulei siliconic sub formă de soluție apoasă 75% 0,8%
apă 32%
I
RO 119835 Β1
Ingredientul activ sau combinația de ingrediente active este amestecată intim cu 1 adjuvanții, obținându-se un concentrat pentru suspensii din care se pot obține suspensii de orice concentrație dorită, prin diluare cu apă. 3
Exemplul 1. Cultură bacteriană
O subcultură de tulpină Bc AB78 a fost utilizată pentru a inocula următorul mediu de 5 cultură, cunoscut ca bulion TB:
Triptonă 12 g/i 7
Extract de drojdie 24 g/l
Glicerol 4 ml/l 9
KH2PO4 2,1 g/i
k2hpo4 14,7 g/i 11
pH 7,4
Fosfatul de potasiu a fost adăugat în bulionul autoclavat după răcire. Flacoanele au fost incubate la temperatura de 30’C într-un agitator rotativ la 250 rpm timp de 24...36 h, 15 ceea ce reprezintă o fază de creștere timpurie până la medie logaritmică.
în timpul creșterii vegetative, uzual 24...36 h, după începerea culturii, care reprezintă 17 o fază de creștere timpurie până la medie logaritmică, bacteriile AB78 au fost centrifugate din supernatantul culturii. Supernatantul culturii conținând proteina activă a fost utilizat în 19 bioteste.
Exemplul 2. Bioteste pe insecte 21
A fost testată tulpina AB78 de B. cereus împotriva a diverse insecte, așa cum se descrie în continuare. 23
Viermele vestic, nordic și sudic al rădăcinii de porumb, Diabrotica virgifera virgifera,
D. longcomis barberi și respectiv D. undecimpunctata howardi: au fost realizate diluții din 25 supernatant de cultură AB78 crescută 24-36 h, care au fost amestecate cu dietă artificială topită (Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293), lăsată apoi să se soli- 27 difice. Dieta solidificată a fost tăiată și plasată pe platouri. Larvele neonate au fost plasate peste dietă și păstrate la temperatura de 30’C. Mortalitatea a fost înregistrată după șase zile. 29 Biotest cu clone de E. coli: celule de E. coli au fost crescute peste noapte în bulion conținând 100 pg/ml ampicilină, la temperatura de 37*C. 10 ml de cultură au fost sonicizați 31 de trei ori, câte 20 de secunde de fiecare dată. S-au adăugat 500 pl de cultură sonicizată în dieta topită a viermelui vestic al rădăcinii de porumb. 33
Gândacul de Colorado al cartofului, Leptinotarsa decemlineata: diluții în Triton X-100 (pentru a se obține o concentrație finală de 0,1% TX-100) au fost realizate din supernatant 35 de cultură AB78 crescută timp de 24...36 h. în aceste diluții au fost introduse bucăți de frunze de cartof având suprafața de 5 cm2, care au fost apoi uscate în aer și plasate pe 37 hârtie de filtru umezită, în platouri de plastic. Larvele neonate au fost plasate pe bucățile de frunze și păstrate la temperatura de 30’C. Mortalitatea a fost înregistrată după 3-5 zile. 39 Vierbele galben al mălaiului, Tenebrio molitor. au fost realizate diluții din supernatant de cultură AB78 crescută 24...36 h, care au fost amestecate cu dietă artificială topită 41 (Bioserv #F9240), lăsată apoi să se solidifice. Dieta solidificată a fost tăiată și plasată pe platouri. Larvele neonate au fost plasate peste dietă și păstrate la temperatura de 30’C. 43
Mortalitatea a fost înregistrată după 6...8 zile.
Sfredelul european al porumbului, omida neagră, viermele mugurelul de tutun, 45 viermele cornului de tutun și viermele militar al sfeclei: Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon,
Heliothis virescens, Manduca sexta și respectiv Spodoptera exigua: diluții în TX-100 (pentru 47 a obține o concentrație finală de 0,1% TX-100) au fost realizate din supernatant de cultură
RO 119835 Β1
AB78 crescută timp de 24-36 h. 100 pl au fost turnați cu pipeta pe o suprafață de 18 cm2 de dietă artificială solidificată (Bioserv #F9240) care a fost apoi lăsată să se usuce în aer. Larvele neonate au fost plasate pe suprafața dietei și păstrate la temperatura de 30’C. Mortalitatea a fost înregistrată după 3-6 zile.
Țânțarul nordic de casă, Culex pipiens: diluții au fost realizate din supernatant de cultură AB78 crescută timp de 24...36 h. 100 μΙ au fost turnați cu pipeta în 10 ml de apă într-un pahar de plastic de 30 ml. în apă au fost introduse larve aflate în al treilea stadiu instar, care au fost menținute la temperatura camerei. Mortalitatea a fost înregistrată după 24...48 h. Spectrul activității insecticide al AB78 este prezentat în Tabelul 14.
Tabelul 14
Activitatea supernatantului din cultura de AB78 împotriva diferitelor specii de insecte
Speciile de insecte testate până în prezent Ordinul Activitate
Viermele vestic al rădăcinii porumbului (Diabrotica virgifera virgifera) Col +++
Viermele nordic al rădăcinii porumbului (Diabrotica longicornis barberi) Col +++
Viermele sudic al rădăcinii porumbului (Diabrotica undecimpunctata howardi) Col -
Gândacul de Colorado al cartofului (Leptinotarsa decemlineata) Col
Viermele galben al mălaiului (Tenebrio molitor) Col
Sfredelul european al porumbului (Ostrinia nubilalis) Lep
Viermele rotund al bumbacului (Heliothis virescens) Lep
Viermele cornului de tutun (Manduca sexta) Lep
Viermele militar al sfeclei (Spodoptera exigua) Lep
Omida neagră (Agrotis ipsilon) Lep
Țânțarul nordic de casă (Culex pipiens) Dip -
Tulpinile AB78 ale B. cereus, nou descoperite, au prezentat un spectru al activității insecticide semnificativ diferit în comparație cu cel al δ-endotoxinelor de Bt, cunoscute ca active împotriva coleopterelor. în particular, AB78 a demonstrat o activitate mai selectivă împotriva insectelor decât tulpinile de Bt cunoscute ca active împotriva coleopterelor prin aceea că a fost activă în mod specific împotriva Diabrotica spp. Mai specific, această tulpină a fost cea mai activă împotriva D. virgifera virgifera și D. longicornis barberi dar nu și împotriva D. undecimpunctata howardi.
Un număr de tulpini de Bacillus au fost biotestate în privința activității în timpul creșterii vegetative (Tabelul 15) împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului. Rezultatele demonstrează că AB78 este unică prin aceea că activitatea sa împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului nu reprezintă un fenomen general.
Tabelul 15
Activitatea supernatantului din culturile diferiților Bacillus spp. împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului
Tulpina de Bacillus Procent de mortalitate a WCRW
B. cereus AB78 (Bat. 1) 100
B. cereus AB78 (Bat. 2) 100
B. cereus (Carolina Bio.) 12
B. cereus ATCC 11950 12
B. cereus ATCC 14579 8
B. mycoides (Carolina Bio.) 30
B. popilliae 28
B. thuringiensis HD135 41
B. thuringiensis HD191 9
B. thuringiensis GC91 4
B. thuringiensis isrealensis 24
Control apă 4
RO 119835 Β1
Activitatea specifică a AB78 împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului este 1 prezentată în Tabelul 16.
Tabelul.16 3
Activitatea supernatantului de cultură AB78 împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului neonat 5
Concentrația supernatantului de cultură (μΙ/ml) Procent de mortalitate a WCRW
100 100
25 87
10 80
5 40
2,5 20
1 6
0 0
Valoarea LCS0 calculată a fost de 6,2 μΙ de supernatant de cultură pentru un mililitru 15 de dietă a viermelui vestic al rădăcinii porumbului.
Sedimentul celular a fost, de asemenea, biotestat și nu a prezentat activitate 17 împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului. Astfel, prezența activității numai în supernatant indică faptul că această proteină insecticidă vegetativă este o exotoxină. 19
Exemplul 3. donarea în cosmide a întregului ADN al tulpinii AB78 de B. cereus
Gena VIP1A(a) a fost donată din ADN-ul complet, preparat din tulpina AB78 după 21 cum urmează:
1. Se crește bacteria în 10 ml L-bulion până a doua zi. (Se utilizează un tub de centri- 23 fugare de 50 ml steril).
2. Se adaugă 25 ml de L-bulion proaspăt și ampicilină (30 pg/ml). 25
3. Se cresc celulele timp de 2-6 ore la temperatura de 30’C cu agitare.
4. Se centrifughează celulele într-un tub de polipropilenă de 50 ml, cu capac porto- 27 caliu, într-o centrifugă IEC clinică de masă, la 3/4 din viteză.
5. Se repune în suspensie granula celulară în 10 ml TES (TES = 50 mM TRIS pH 29 8,0, 100 mM EDTA, 15 mM NaCI).
6. Se adaugă 30 mg de lizozimă și se incubează timp de 2 ore la temperatura de 31 37’C.
7. Se adaugă 200 μΙ SDS 20% și 400 μΙ proteinază K stoc (20 mg/ml). Se incubează 33 la temperatura de 37’C.
8. Se adaugă 200 μΙ proteinază K. Se incubează timp de o oră la temperatura de 35 55’C. Se adaugă 5 ml TES pentru a se obține un volum final de 15 ml.
9. Se extrage de două ori cu fenol (10 ml fenol, centrifugare la temperatura camerei 37 la 3/4 din viteză într-o centrifugă IEC clinică de masă). Se transferă supernatantul (faza superioară) într-un tub curat, utilizând o pipetă cu orificiu larg.39
10. Se extrage o dată cu un amestec 1:1 (volumic) de fenol:cloroform / alcool isoamilic (raport 24:1).41
11. Se precipită ADN-ul cu un volum egal de isopropanol rece; se centrifughează pentru obținerea sedimentului de ADN.43
12. Se repune în suspensie sedimentul în 5 ml TE.
13. Se precipită ADN-ul cu 0,5 ml NaOAc 3M pH 5,2 și 11 ml 95% etanol. Se 45 plasează la temperatura de -20’C timp de două ore.
14. Se agață ADN-ul din tub cu o buclă de plastic, se transferă într-un tub de micro- 47 centrifugă, se centrifughează, se înlătură excesul de etanol, se usucă in vacuo.
RO 119835 Β1
15. Se repune în suspensie în 0,5 ml TE, se incubează timp de 90 de minute la temperatura de 65“C pentru a ușura trecerea ADN-ului înapoi în soluție.
16. Se determină concentrația utilizând proceduri standard. donarea în cosmide a AB78
Toate procedurile, dacă nu se indică altfel, au fost realizate conform Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, Cat. No. 251301.
în general, etapele au fost următoarele:
A. Digerarea parțială a ADN-ului de AB78 cu Sau 3A.
B. Prepararea vectorului ADN.
C. Ligarea și împachetarea ADN-ului.
D. Titrarea bibliotecii de cosmide.
1. Se începe o cultură de celule HB101 prin plasarea a 50 ml dintr-o cultură crescută peste noapte în 5 ml de TB cu 0,2% maltoză. Se incubează 3,5 ore la temperatura de 37°C.
2. Se centrifughează celulele și se repun în suspensie în 0,5 ml MgSO410 mM.
3. Se adaugă împreună:
100 I celule
100 I amestec de împachetare diluat
100 I MgSO410 mM
I TB.
4. Se lasă la temperatura camerei timp de 30 min pentru absorbție, fără agitare.
5. Se adaugă 1 ml TB și se amestecă ușor. Se incubează timp de 30 min la temperatura de 37°C.
6. Se plasează 2001 pe platouri L-amp. Se incubează până a doua zi la temperatura de 37’C.
Au fost alese la întâmplare cel puțin 400 de clone cosmide, care au fost selectate după activitatea împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului, așa cum s-a descris în Exemplul nr. 2. S-a utilizat pentru hibridizări Southern ADN-ul provenind de la 5 clone active și 5 clone inactive. Rezultatele au demonstrat că hibridizarea utilizând proba de oligonucleotide descrisă mai sus s-a corelat cu activitatea împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului (Tabelul nr. 18).
Clonele cosmide P3-12 și P5-4 au fost depuse la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) primind numerele de acces NRRL B-21061 și respectiv NRRL B-21059.
Tabelul 18
Activitatea clonelor cosmide AB78 împotriva viermelui vestic al rădăcinii porumbului
Clona Mortalitate procentuală medie (N=4)
Clone care hibridizează cu proba
P1-73 47
P1-83 64
P2-2 69
P3-12 85
P5-4 97
Clone care nu hibridizează cu proba
P1-2 5
P3-8 4
P3-9 12
P3-18 0
P4-6 9
RO 119835 Β1
Exemplul 4. Purificarea proteinelor insecticide vegetative de la tulpina AB88 1
O cultură bacteriană lichidă a fost crescută până a doua zi (timp de 12 h) la temperatura de 30°C în mediu TB. Celulele au fost centrifugate la 5000 χ g timp de 20 de minute și 3 supernatantul a fost separat. Proteinele prezente în supernatant au fost precipitate cu sulfat de amoniu (saturație 70%), centrifugate [la 5000 χ g timp de 15 minute] și a fost păstrat 5 sedimentul. Sedimentul a fost repus în suspensie în volumul original de 20 mM Tris pH 7,5 și dializat până a doua zi cu aceeași soluție tampon la temperatura de 4’C. Dializatul de 7 AB88 a avut o turbiditate superioară celei a materialului comparabil provenit de la AB78. Dializatul a fost titrat până la un pH de 4,5 utilizând 20 mM citrat de sodiu (pH 2,5) și, după 9 min de incubație la temperatura camerei, soluția a fost centrifugată la 3000 χ g timp de 10 min. Sedimentul proteic a fost redizolvat în 20 mM Bis-Tris-Propan, pH 9,0. 11
Proteinele AB88 au fost separate prin câteva metode diferite după clarificare, incluzând focalizarea izoelectrică (Rotofor, BioRad, Hercules, CA), precipitarea la pH 4,5, cro- 13 matografia cu schimbare de ioni, cromatografia cu excludere dimensională și ultra-filtrarea.
Proteinele au fost separate pe o coloană schimbătoare de anioni Poros HQ/N 15 (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA) utilizând un gradient linear de la 0 la 500 mM NaCI în 20 mM Bis-Tris-Propan pH 9,0 la o rată de curgere de 4 ml/min. Proteina insecticidă a fost 17 eluată la o concentrație de 250 mM NaCI.
Proteina activă împotriva sfredelului european al porumbului (ECB) a rămas în gra- 19 nula obținută prin precipitarea la pH 4,5 a dializatului. La efectuarea IEF preparativă a dializatului utilizând amfoliți cu pH 3-10, a fost găsită activitate insecticidă împotriva ECB în 21 toate fracțiunile având o valoare pH de 7 sau mai mare. Analiza SDS-PAGE a acestor fracții a arătat benzi corespunzătoare unor proteine având masa moleculară de circa 60 kDa și 23 circa 80 kDa. Benzile de 60 kDa și 80 kDa au fost separate prin HPLC schimbătoare de anioni pe o coloană Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). Secvența N-termi- 25 nală a fost obținută din două fracții conținând proteine cu mase moleculare ușor diferite, dar ambele apropiate de circa 60 kDa. Secvențele obținute au fost similare între ele și cu câteva 27 δ-endotoxine.
Atunci când sedimentul activ împotriva ECB, obținut la pH 4,5, a fost separat în conți- 29 nuare prin schimbare de anioni pe o coloană Poros-Q, s-a găsit activitate numai în fracțiile conținând o bandă majoră la circa 60 kDa. 31
Proteina activă împotriva omizii negre a rămas, de asemenea, în sediment atunci când dializatul de AB88 a fost adus lapH 4,5. La efectuarea IEF preparativă utilizând amfoliți 33 cu pH 3-10, nu a fost găsită activitate în fracțiunile IEF active împotriva ECB; în schimb, activitatea a fost mai puternică într-o fracțiune cu pH 4,5-5,0. Componentele sale majore au 35 mase moleculare de circa 35 și circa 80 kDa.
Granula cu pH 4,5 a fost separată prin HPLC schimbătoare de anioni pentru a se 37 obține fracțiunile conținând numai materialul cu 35 kDa și fracțiunile conținând ambele benzi de 35 kDa și de 80 kDa. 39
Exemplul 5. Caracterizarea proteinelor insecticide vegetative de la AB88
Fracțiunile conținând diferite proteine vegetative active împotriva lepidopterelor au 41 fost generate așa cum se descrie în Exemplul 4. Fracțiunile având activitate insecticidă au fost separate în geluri SDS-poliacrilamidă 8 până la 16% și transferate pe membrane PVDF 43 [LeGendre etal., (1989), în: A Practicai Guide to Protein and Peptide Purification forMicrosequencing, ed. Matsudaria PENTRU (Academic Press Inc., New York). Analizele biologice 45 ale fracțiilor au demonstrat că diferite proteine insecticide vegetative au fost responsabile_________ pentru activitatea împotriva diferitelor specii de lepidoptere. 47
RO 119835 Β1
Activitatea împotriva Agrotis ipsilon este datorată unei proteine de 80 kDa și/sau unei proteine de 35 kDa, fiecare livrată singură, sau în combinație. Aceste proteine nu sunt înrudite cu nici o δ-endotoxină de la Bt, fapt evidențiat prin lipsa omologiei de secvență cu secvențele cunoscute de δ-endotoxine Bt. Proteina insecticidă VIP3A(a) de la tulpina AB88 este prezentă cel mai mult (cel puțin 75% din total) în supernatanții culturilor de AB88.
De asemenea, aceste proteine nu se găsesc în cristalul δ-endotoxinei de AB88. Secvențele N-terminale ale proteinelor δ-endotoxine majore au fost comparate cu secvențele N-terminale ale proteinelor insecticide vegetative de 80 kDa și de 35 kDa și nu s-a găsit omologie de secvență. Secvența N-terminală a proteinei insecticide VIP3A(a) posedă un număr de reziduuri încărcate pozitiv (de la Asn2 la Asn7) urmate de o regiune centrală hidrofobă (de la Thr8 la Ile34). Spre deosebire de majoritatea proteinelor de secreție cunoscute, proteina insecticidă VIP3A(a) de la tulpina AB88 nu este prelucrată N-terminal în timpul exportului.
Activitatea împotriva Ostrinia nubilalis este datorată unei proteine insecticide vegetative de 60 kDa, iar activitatea împotriva Spodoptera frugiperda este datorată unei proteine insecticide vegetative de dimensiune necunoscută.
Tulpina AB88 a Bacillus thuringiensis a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, SUA, primind numărul de acces NRRL B-21225.
Exemplul 6. Izolarea și activitatea biologică a tulpinii Bacillus thuringiensis AB424
O tulpină de B. thuringiensis, desemnată ca AB424, a fost izolată dintr-un eșantion de con de pin acoperit cu mușchi, prin metode standard, cunoscute în stadiul tehnicii. O subcultură de AB424 a fost crescută și preparată pentru biotestare așa cum se descrie în exemplul 1.
Activitatea biologică a fost evaluată așa cum se descrie în exemplul 2. Rezultatele au fost după cum urmează:
Insecta testată Procentul mortalității
Ostrinia nubilalis 100
Agrotis ipsilon 100
Dibrotica virgifera virgifera 0
Tulpina AB424 a fost depusă la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, SUA, primind numărul de acces NRRL B-21439.
Exemplul 7. donarea genelor VIP3A(a) și VIP3A(b) care codifică proteinele active împotriva omizii negre
ADN-ul total obținut de la tulpinile AB88 și AB424 izolate a fost izolat [Ausubel et al. (1988), în: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, NY)J, digerat cu enzime de restricție Xbal [bibliotecă de fragmente Xbal de ADN de AB88, fracționate la dimensiuni între 4,0 și 5,0 Kb] și respectiv EcoRI (bibliotecă de fragmente EcoRI de ADN de AB424, fracționate la dimensiuni între 4,5 și 6,0 Kb), ligatat într-un vector pBluescript linearizat în prealabil cu aceleași enzime și defosforilat, și apoi transformat în tulpina DH5a de E. coti. Clonele recombinante au fost dispuse pe filtre de nitroceluloză care au fost apoi marcate cu o oligonucleotidă având lungimea de 33 de baze, marcată cu 32P, corespunzătoare celor 11 aminoacizi N-terminali ai proteinei de 80 kDa activă împotriva Agrotis ipsilon (omida neagră). Hibridizarea a fost efectuată la temperatura de 42°C în 2 x SSC/0,1% SDS (1 x SSC = 0,15 M NaCI/0,015 M citrat de sodiu, pH 7,4) timp de 5 min și de două ori la
RO 119835 Β1 temperatura de 50*C în 1 χ SSC/0,1% SDS timp de 10 min. Au fost găsite patru clone po- 1 zitive din 400. Biotestele pe insecte ale clonelor recombinante pozitive au demonstrat o toxicitate pentru larvele de omidă neagră comparabilă cu cea a supernatanților de AB88 și 3
AB424.
Plasmida pCIB7104 conține un fragment Xbal de ADN al AB88 cu dimensiunea de 5 4,5 Kb. Au fost construite subclone pentru a defini regiunea de codare a proteinei insecticide. 7
PCIB7105 de E. coli a fost construit prin donarea fragmentului Xbal-Accl de pCIB7104 având dimensiunea de 3,5 Kb în pBluescript. 9
Plasmida pCIB7106 conține un fragment EcoRI de ADN al AB424 având dimensiunea de 5,0 Kb. Acest fragment a fost în continuare digerat cu Hincll pentru a se obține 11 un insert EcoRI-Hincll de 2,8 Kb (pCIB7107), care încă mai codează o proteină insecticidă funcțională. 13
Secvența de nucleotide a pCIB7104, o clonă recombinantă pozitivă a AB88, și cea a pCIB7107, o clonă recombinantă pozitivă a AB424, au fost determinate prin metoda 15 terminației dideoxi a lui Sânger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:5463-5467 (1977), utilizând PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kits și PRISM 17 Sequenase® Terminator Double-Stranded DNA Sequencing Kit și prin analiza cu un secvențializator automat ABI 373. 19
Clona pCIB7104 conține gena VIP3A(a) a cărei regiune de codare este descrisă în SEQ ID NO:1. iar secvența proteinei codate este descrisă în SEQ ID NO:2. O versiune 21 sintetică a regiunii de codare, destinată unei înalte exprimări în porumb, este dată în SEQ ID NO:3. în SEQ ID NO:6 este descrisă o fuziune între secvențele sintetică și nativă. Pot fi 23 proiectate oricâte gene sintetice pe baza secvenței de aminoacizi date în SEQ ID NO:2.
Clona pCIB7107 conține gena VIP3A(b) a cărei regiune de codare este descrisă în 25 SEQ ID NO:4, iar secvența proteinei codate este descrisă în SEQ ID NO:5. Atât pCIB7104 cât și pCIB7107 au fost depuse la Agricultural Research Service Patent Culture Collection 27 (NRRL) primind numerele de acces NRRL B-21422 și respectiv NRRL B-21423.
Gena VIP3A(a) conține un cadru deschis de citire (ORF - Open Reading Frame) care 29 se întinde între nucleotidele 732 și 3105. ORF codifică o peptidă având 791 aminoacizi corespunzând unei mase moleculare de 88.500 daltoni. O secvență Shine-Dalgarno (SD) 31 este localizată cu 6 baze înainte primei metionine și secvența sa identifică o SD puternică pentru Bacillus. 33
Gena VIP3A(b) este identică în proporție de 98% cu VIP3A(a).
La testarea fragmentelor de ADN total izolat din celule de B. thuringiensis AB88 cu 35 un fragment de 33 de baze care acoperă regiunea N-terminală a proteinei insecticide VIP3A, au putut fi observate benzi singulare în diferite digerări de restricție. Acest rezultat a fost 37 confirmat prin utilizarea de probe mai mari care acoperă regiunea de codare a genei. O căutare în baza de date GenBank a arătat că nu există omologie cu proteinele cunoscute. 39
Exemplul 8. Exprimarea proteinelor insecticide VIP3A
Timpul necesar pentru exprimarea proteinei insecticide VIP3A(a) a fost analizat prin 41 metoda Western blot. Au fost prelevate eșantioane din culturile de Bacillus thuringiensis AB88 pe durata creșterii și sporulării. Proteina insecticidă VIP3A(a) poate fi detectată în 43 supernatanții culturilor de AB88 în timpul fazei logaritmice, deja la 15 ore după inițierea culturii. Nivelul maxim este atins în timpul stadiilor timpurii ale fazei staționare și rămâne 45 ridicat în timpul și după sporulare. Rezultate similare au fost obținute la utilizarea supernatanților de culturi de Bacillus cereus AB424. Nivelele de proteină insecticidă VIP3A(a) 47
RO 119835 Β1 reflectă exprimarea genei VIP3A(a), determinată prin metoda Northern blot. Inițierea sporulării a fost determinată prin observare microscopică directă și prin analiza prezenței de δendotoxine în sedimentele celulare. Proteinele de tip Cry-I pot fi detectate târziu în faza staționară, în timpul și după sporulare.
Exemplul 9. Identificarea noilor gene de tip VIP3 prin hibridizare
Pentru a identifica speciile de Bacillus care conțin gene înrudite cu VIP3A(a) din AB88 izolat, o colecție de Bacillus izolați a fost selectată prin hibridizare. Culturile a 463 de tulpini Bacillus au fost crescute în godeuri de microtitrare până la sporulare. S-a utilizat o pipetă de inoculare cu 96 de vârfuri pentru a transfera culturile în platouri de 150 mm conținând L-agar. Platourile inoculate au fost păstrate timp de 10 h la temperatura de 30“C, apoi la 4’C până a doua zi. Coloniile au fost trecute pe filtre de nailon și testate cu un fragment Hindi11 cu dimensiunea de 1,2 Kb derivat din VIP3A(a). Hibridizarea a fost realizată până a doua zi la temperatura de 62°C utilizând condițiile de hibridizare din Maniatis et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual (1982). Filtrele au fost spălate cu 2 x SSC/0,1% SDS la temperatura de 62”C și radiografiate.
Dintre cele 463 tulpini de Bacillus supuse selecției, 60 conțin gene similare VIP3 care pot fi detectate prin hibridizare. Caracterizarea ulterioară a câtorva dintre acestea (AB6 și AB426) a arătat că supernatanții acestora conțin o proteină insecticidă activă împotriva omizii negre, similară proteinei VIP3 care este activă împotriva omizii negre.
Exemplul 10. Caracterizarea tulpinii M2194 a B. thuringiensis care conține o genă criptică de tip VIP3
S-a arătat că o tulpină de B. thuringiensis, desemnată ca M2194, conține gene de tip VIP3, prin hibridizare în colonie, așa cum se descrie în exemplul 8. Gena de tip VIP3 a M2194 este considerată criptică deoarece nu a putut fi detectată exprimare în timpul fazei de creștere bacteriană nici prin imunobloting utilizând anticorpi policlonali generați împotriva proteinei VIP3A(a) izolată din AB88, nici prin biotestul descris în exemplul 2.
Antiserul împotriva proteinei insecticide VIP3A(a) purificate a fost produs în iepuri. Proteina legată la nitroceluloză (50 pg) a fost dizolvată în DMSO și emulsionată cu adjuvant Freund complet (Difco). Au fost administrate lunar injecții subcutanate la doi iepuri, timp de trei luni. S-a recoltat sânge la 10 zile după a doua și a treia injecție și s-a separat serul din eșantionul de sânge [Harlowef al. (1988) în: Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, NY)].
Gena de tip VIP3 a M2194 a fost donată în pKS urmând protocolul descris în exemplul 3, creând astfel pCIB7108. E. coli conținând pCIB7108 care conține gena de tip VIP3 a M2194 au fost active împotriva omizii negre, ceea ce demonstrează că gena codează o proteină funcțională cu activitate insecticidă. Plasmida pCIB7108 a fost depusă la Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) primind numărul de acces NRRL B-21438.
Exemplul 11. Activitatea insecticidă a proteinelor VIP3A
Spectrul de activitate al proteinelor insecticide VIP3A a fost determinat calitativ în biotestele pe insecte în care larvele au fost hrănite cu E. coli recombinant purtând genele VIP*A. în aceste teste, celulele conținând genele VIP3A(a) și VIP3A(b) au fost găsite ca insecticide împotriva Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens și Helicoverpa zea. în aceleași condiții experimentale, extractele bacteriene conținând proteine VIP3A nu au demonstrat nici o activitate împotriva Ostrinia nubilalis.
RO 119835 Β1
Efectul proteinelor insecticide VIP*A împotriva larvelor de Agrotis ipsilon 1
Tratament Mortalitate (%)
mediu TB 5
supernatant de AB88 100
Tratament Mortalitate (%)
supernatant de AB424 100
soluție tampon 7
E. coli pKS 10
E. co//pCIB7104 (AB88) 100
E. co//pCIB7105 (AB88) 100
E. coli pCIB7106 (AB424) 100
E. co//pCIB7107 (AB424) 100
Efectul proteinelor insecticide VIP3A împotriva larvelor de insecte lepidoptere
Tratament Insectă Mortalitate (%)
E. coli pKS BCW 10
FAW 5
BAW 10
TBW 8
CEW 10
ECB 5
E. co//pCIB7105
E. co//pCIB7107 BCW 100
FAW 100
BAW 100
TBW 100
CEW 50
ECB 10
BCW = omida neagră; FAW = viermele militar de toamnă; BAW = viermele militar al sfeclei; TBW = viermele mugurilor de tutun; CEW = viermele știuletelui de porumb; ECB = sfredelul european al porumbului.
Exemplul 12. Izolarea și activitatea biologică a altor Bacillus sp.
Au fost izolate și alte specii de Bacillus care produc proteine cu activitate insecticidă în timpul creșterii vegetative. Aceste tulpini au fost izolate din eșantioane de mediu prin metodologii standard. Tulpinile izolate au fost pregătite pentru biotestare și testate așa cum se descrie în exemplele 1 și respectiv 2. Tulpinile izolate care produc proteine insecticide în timpul creșterii vegetative, care au prezentat activitate împotriva Agrotis ipsilon, sunt listate în tabelul de mai jos. Nu s-a observat o corelare între prezența cristalului de δ-endotoxină și producerea de proteină insecticidă vegetativă.
Bacillus izolat Prezența cristalului de δ-endotoxină Mortalitate procentuală
AB6 + 100
AB53 - 80
AB88 + 100
AB195 60
AB211 70
AB217 83
AB272 80
AB279 70
AB289 + 100
AB292 + 80
AB294 - 100
AB300 - 80
AB359 - 100
RO 119835 Β1
Tulpinile izolate AB289, AB294 și AB359 au fost depuse la Agricultural Research
Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North
University Street, Peoria, lllinois 61604, SUA, primind numerele de acces NRRL B-21227,
NRRL B-21229 și respectiv NRRL B-21226.
Bacillus izolați care produc proteine insecticide în timpul creșterii vegetative, cu activitate împotriva Diabrotica virgifera virgifera sunt listați în tabelul de mai jos.
Bacillus izolat Prezența cristalului de δ-endotoxină Mortalitate procentuală
AB52 - 50
AB59 - 71
AB68 + 60
AB78 - 100
AB122 - 57
AB218 - 64
AB256 - 64
Tulpinile izolate AB59 și AB256 au fost depuse la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, SUA, primind numerele de acces NRRL B-21228 și respectiv NRRL B-21230.
Următoarele depozite au fost făcute la Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, lllinois 61604, SUA:
Denumirea tulpinii Numărul depozitului Data depozitului
1. E. coli PL2 NRRL B-21221 9 martie 1994
2. E. coli PL2 NRRL B-21221 N 2 septembrie 1994
3. E. coli pCIB6022 NRRL B-21222 9 martie 1994
4. E. coli pCIB6023 NRRL B-21223 9 martie 1994
5. E. coli pCIB6023 NRRL B-21223N 2 septembrie 1994
6. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP NRRL B-21224 9 martie 1994
7. Bacillus thuringiensis AB88 NRRL B-21225 9 martie 1994
8. Bacillus thuringiensis AB359 NRRL B-21226 9 martie 1994
9. Bacillus thuringiensis AB289 NRRL B-21227 9 martie 1994
10. Bacillus sp. AB59 NRRL B-21228 9 martie 1994
11. Bacillus sp. AB294 NRRL B-21229 9 martie 1994
12. Bacillus sp. AB256 NRRL B-21230 9 martie 1994
13. E. coli P5-4 NRRL B-21059 18 martie 1993
14. E. C0//P3-12 NRRL B-21061 18 martie 1993
15. Bacillus cereus AB78 NRRL B-21058 18 martie 1993
16. Bacillus thuringiensis AB6 NRRL B-21060 18 martie 1993
17. E. coli pCIB6202 NRRL B-21321 2 septembrie 1994
18. E. co//pCIB7100 NRRL B-21322 2 septembrie 1994
19. E. coli pCIB7101 NRRL B-21323 2 septembrie 1994
20. E. co//pCIB7102 NRRL B-21324 2 septembrie 1994
21. E. co//pCIB7103 NRRL B-21325 2 septembrie 1994
22. E. co//pCIB7104 NRRL B-21422 24 martie 1995
23. E. co//pCIB7107 NRRL B-21423 24 martie 1995
24. E. co//pCIB7108 NRRL B-21438 5 mai 1995
25. Bacillus thuringiensis AB424 NRRL B-21439 5 mai 1995
RO 119835 Β1
Lista de secvențe (1) INFORMAȚII GENERALE:
(A) NUME: SYNGENTA PARTICIPATIONS AG (B) STRADĂ:
(C) ORAȘ: Basel (E) ȚARĂ: Elveția (F) COD POȘTAL (ZIP): 4002 (G) TELEFON:
(H) FAX: +41 61 323 50 44 (I) TELEX:
(ii) TITLUL INVENȚIEI: Noi proteine și tulpini pesticide (iii) NUMĂRUL DE SECVENȚE: 7 (iv) FORMA UTILIZABILĂ PE CALCULATOR:
(A) TIPUL DE SUPORT: disc flexibil (dischetă) (B) CALCULATOR: compatibil IBM PC (C) SISTEM DE OPERARE: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAM: Patentln Release #1.0, Version #1.30B (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 1 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 2378 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) ÎNFĂȘURARE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) 2g (iii) IPOTETICĂ: NU (ix) CARACTERISTICI:
(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 9..2375 33 (D) ALTE INFORMAȚII: /notă = „Secvență nativă de ADN care codează proteina VIP3A(a) din AB88 conținută în pCIB7104“ 35 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 1
AGATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA50
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro 1510
AGT TTT ATT GAT TAT TTT AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC98
Ser Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile
RO 119835 Β1
15 20 25 30 Ât
AAA GAG ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT AGA GGT GGT GAT CTA 146 hS
Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu
35 40 45
ACC CTA GAG GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG TTA CTA AAT GAT ATT TCT 194
Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp ile Ser
50 55 60
GGT AAA TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG 242
Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin
70 75
GGA Gly AAC Asn 80 TTA Leu AAT Asn ACA Thr GAA Glu TTA Leu 85 TCT Ser AAG Lys GAA Glu ATA Ile TTA Leu 90 AAA Lys ATT Ile GCA Ala AAT Asn 290
GAA CAA AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA 338
Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile
95 100 105 110
AAT ACG ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT 386
Asn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser
115 120 125
GAT GTA ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAA ATA GAA TAC TTA 434
Asp Val Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu
130 135 140
AGT AAA CAA TTG CAA GAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA 482
Ser Lys Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val
145 150 155
AAT GTA CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CAA 530
Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin
160 165 170
AGG ATT AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACA 578
Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr
175 180 185 190
GAA ACT AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CTT 626
RO 119835 Β1
Glu Thr Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Giy Ser Pro Ala Asp Ile Leu 1
1 95 200 205 3
GAT GAG TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT 674
Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala I.ys Ser Val Thr Lys Asn 5
210 215 220
GAT GTG GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG 722 7
Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met 9
225 230 235
GTA GGA AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA 770 11
Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu 13
240 245 250
TTA ATT ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT 818 15
Leu Ile Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn 17
255 260 265 270
GTT TAT AAC TTC TTA ATT GTA TTA ACA GCT CTG CAA GCC CAA GCT TTT 866 19
Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe 21
275 280 285
CTT ACT TTA ACA ACA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT 914 23
Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp 25
290 295 300
TAT ACT TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT 962 27
Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe
305 310 315 29
AGA GTA AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT 1010 31
Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn
320 325 330 33
TAT GCA AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA 1058 35
Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu
335 340 345 350 37
GCT AAA CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA 1106 39
Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser
355 360 365
RO 119835 Β1
ATT Ile ACA Thr GTA Val TTA Leu 370 AAA Lys GTA Val TAT Tyr GAG Glu GCT Ala 375 AAG Lys CTA Leu AAA Lys CAA Gin AAT Asn 380 TAT Tyr CAA Gin 1154
GTC GAT AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGT GAT ATG GAT AAA 1202
Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys
385 390 395
TTA TTG TGC CCA GAT CAA TCT GAA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA 1250
Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile
400 405 410
GTA TTT CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA 1298
Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys
415 420 425 430
ATG AAA ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT 1346
Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser
435 440 445
ACA GGA GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG 1394
Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala
450 455 460
GAG TAT AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA 1442
Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu
465 470 475
GGT GTC ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC 1490
Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu
480 485 490
CAA GCT GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT 1538
Gin Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr
495 500 505 510
TTA AGA GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA 1586
Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys
515 520 525
TTG ATC GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG 1634
Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly
530 535 540
RO 119835 Β1
TCC Ser ATA Ile GAA Glu 545 GAG Glu GAC Asp AAT Asn TTA Leu GAG Glu 550 CCG Pro TGG Trp AAA Lys GCA Ala AAT Asn 555 AAT Asn AAG Lys AAT Asn 1682
GCG TAT GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT 1730
Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr
560 565 570
GTT CAT AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA 1778
Val His Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys
575 580 585 590
CCG AAA ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT 1826
Pro Lys Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser
595 600 605
ATT CAT TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA 1874
Ile His Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr
610 615 620
AAT AAT AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA 1922
Asn Asn Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr
625 630 635
GGA ACT GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA 1970
Gly Thr Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly
640 645 650
GAT GAA GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT 2018
Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser
655 660 665 670
GAA AAG TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT 2066
Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser
675 680 685
ACG GGA TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA 2114
Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly
690 695 700
GGA CGA GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT 2162
Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr
RO 119835 Β1
705 710 715
TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA 2210
Tyr Arg Val Tyr Phe? Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg
720 725 730
AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA 2258
Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys
735 740 745 750
GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTT TAT 2306
Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr
755 760 765
ATA GAG CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT 2354
Ile Glu Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His
770 775 780
TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG TAA 2378
Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785
(2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 2 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 789 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO; 2
Met 1 Asn Lys Asn Asn 5 Thr Lys Leu Ser Thr 10 Arg Ala Leu Pro Ser 15 Phe
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Me t I le Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
RO 119835 Β1
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys 1
50 5 5 60 3
l.eu Asp Gly Va 1 Asn Gly So r l.eu Asn Asp l.eu 1 le Ala Gin Gly Asn
6 5 70 75 80 5
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin 7
85 90 95
As n Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr 9
100 105 110 11
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 13
115 120 125
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys 15
130 135 140 17
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160 19
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile 21
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 23
180 185 190 25
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu 27
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val 29
210 215 220 31
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
225 230 235 240 33
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile 35
245 250 255
Thr Lys Glu As n Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 37
260 265 270 39
Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe Leu Thr 41
275 280 285
RO 119835 Β1
1 Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
3 290 295 300
Se r Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu l.ys Glu Glu Phe Arg Val
5 30 5 310 315 320
7 Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Se r Asn Pro Asn Tyr Ala
q 325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met I le Val Glu Ala Lys
11 340 345 350
13 Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
355 360 365
15
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
17 370 375 380
19 Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
21 Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
405 410 415
23
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
25 420 425 430
27 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
29
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
31 450 455 460
33 Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
35
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
37 485 490 495
39 Asp Glu Asn Se r Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
41
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
RO 119835 Β1
515
520
525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser I le 3
530 535 540 5
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 55 5 560 7
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His 9
565 570 575 11
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590 13
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His 15
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 17
610 615 620 19
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 21
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu 23
645 650 655 25
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys 27
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly 29
675 680 685 31
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700 33
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Se r Phe Ser Thr Tyr Arg 35
705 710 715 720
Val Tyr Phe Se r Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser 37
725 730 735 39
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Se r Gly Ala Lys Asp Val 41
740 745 750
RO 119835 Β1
Ser Glu Mol 755 Phe Thr Thr Lys Phe 760 Glu Lys Asp Asn Phe 765 Tyr I le Glu
l,nu Ser G) n G1 y Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Va) Hi s Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser I le Lys
5 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 3 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 2403 perechi de baze (B) TIP: acid nucleici (C) ÎNFĂȘURARE: simplă| (D) TOPOLOGIE: liniară( (ii) TIPUL MOLECULEI: alt acid nucleic (A) DESCRIERE: /dese = „ADN sintetic (iii) IPOTETICĂ: NU (ix) CARACTERISTICI:
(A) NUME/CHEIE: misejeatureI (B) LOCALIZARE: 11 ..2389j (D) ALTE INFORMAȚII:/notă = „secvență optimizată de ADN de porumb careH codifică VIP3A(a)“ ’ț (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 3
GGATCCACCA ATGAACATGA ACAAGAACAA CACCAAGCTG AGCACCCGCG CCCTGCCGAG
CTTCATCGAC TACTTCAACG GCATCTAGGG CTTCGCCACC GGCATCAAGG ACATCATGAA
CATGATCTTC AAGACCGACA CCGGCGGCGA CCTGACCCTG GACGAGATCC TGAAGAACCA
GCAGCTGCTG AACGACATCA GCGGCAAGCT GGACGGCGTG AACGGCAGCC TGAACGACCT
GATCGCCCAG GGCAACCTGA ACACCGAGCT GAGCAAGGAG ATCCTTAAGA TCGCCAACGA
GCAGAACCAG GTGCTGAACG ACGTGAACAA CAAGCTGGAC GCCATCAACA CCATGCTGCG
CGTGTACCTG CCGAAGATCA CCAGCATGCT GAGCGACGTG ATGAAGCAGA ACTACGCCCT
GAGCCTGCAG ATCGAGTACC TGAGCAAGCA GCTGCAGGAG ATCAGCGACA AGCTGGACAT
CATCAACGTG AACGTCCTGA TCAACAGCAC CCTGACCGAG ATCACCCCGG CCTACCAGCG
120
180
240
300
360
420
480
540
RO 119835 Β1
CATCAAGTAC GTGAACGAGA AGTTCGAAGA GCTGACCTTC GCCACCGAGA CCAGCAGCAA
600
GGTGAAGAAG GACGGCAGCC CGGCCGACAT CCTGGACGAG CTGACCGAGC TGACCGAGCT
660
GGCCAAGAGC GTGACCAAGA ACGACGTGGA CGGCTTCGAG TTCTACCTGA ACACCTTCCA
720
CGACGTGATG GTGGGCAACA ACCTGTTCGG CCGCAGCGCC CTGAAGACCG CCAGCGAGCT
780
GATCACCAAG GAGAACGTGA AGACCAGCGG CAGCGAGGTG GGCAACGTGT ACAACTTCCT
840
GATCGTGCTG ACCGCCCTGC AGGCCCAGGC CTTCCTGACC CTGACCACCT GTCGCAAGCT
900
GCTGGGCCTG GCCGACATCG ACTACACCAG CATCATGAAC GAGCACTTGA ACAAGGAGAA
960
GGAGGAGTTC CGCGTGAACA TCCTGCCGAC CCTGAGCAAC ACCTTCAGCA ACCCGAACTA
1020
CGCCAAGGTG AAGGGCAGCG ACGAGGACGC CAAGATGATC GTGGAGGCTG AGCCGGGCCA
1080
CGCGTTGATC GGCAACGAGA TCAGCAACGA CAGCATCACC GTGCTGAAGG TGTACGAGGC
1140
CAAGCTGAAG CAGAACTACC AGGTGGACAA GGACAGCTTG AGCGAGGTGA TCTACGGCGA
1200
CATGGACAAG CTGCTGTGTC CGGACCAGAG CGAGCAAATC TACTACACCA ACAACATCGT
1260
GTTCCCGAAC GAGTACGTGA TCACCAAGAT CGACTTCACC AAGAAGATGA AGACCCTGCG
1320
CTACGAGGTG ACCGCCAACT TCTACGACAG CAGCACCGGC GAGATCGACC TGAACAAGAA
1380
GAAGGTGGAG AGCAGCGAGG CCGAGTACCG CACCCTGAGC GCGAACGACG ACGGCGTCTA
1440
CATGCCACTG GGCGTGATCA GCGAGACCTT CCTGACCCCG ATCAACGGCT TTGGCCTGCA
1500
GGCCGACGAG AACAGCCGCC TGATCACCCT GACCTGTAAG AGCTACCTGC GCGAGCTGCT
1560
GCTAGCCACC GACCTGAGCA ACAAGGAGAC CAAGCTGATC GTGCCACCGA GCGGCTTCAT
1620
CAGCAACATC GTGGAGAACG GCAGCATCGA GGAGGACAAC CTGGAGCCGT GGAAGGCCAA
1680
CAACAAGAAC GCCTACGTGG ACCACACCGG CGGCGTGAAC GGCACCAAGG CCCTGTACGT
1740
GCACAAGGAC GGCGGCATCA GCCAGTTCAT CGGCGACAAG CTGAAGCCGA AGACCGAGTA
1800
CGTGATCCAG TACACCGTGA AGGGCAAGCC ATCGATTCAC CTGAAGGACG AGAACACCGG
1860
CTACATCCAC TACGAGGACA CCAACAACAA CCTGGAGGAC TACCAGACCA TCAACAAGCG
1920
CTTCACCACC GGCACCGACC TGAAGGGCGT GTACCTGATC CTGAAGAGCCC AGAACGGCGA
1980
CGAGGCCTGG GGCGACAACT TCATCATCCT GGAGATCAGC CCGAGCGAGA AGCTGCTGAG
2040
CCCGGAGCTG ATCAACACCA ACAACTGGAC CAGCACCGGC AGCACCAACA TCAGCGGCAA
2100
CACCCTGACC CTGTACCAGG GCGGCCGCGG CATCCTGAAG CAGAACCTGC AGCTGGACAG
2160
CTTCAGCACC TACCGCGTGT ACTTCAGCGT GAGCGGCGAC GCCAACGTGC GCATCCGCAA
2220
CAGCCGCGAG GTGCTGTTCG AGAAGAGGTA CATGAGCGGC GCCAAGGACG TGAGCGAGAT
2280
GTTCACCACC AAGTTCGAGA AGGACAACTT CTACATCGAG CTGAGCCAGG GCAACAACCT
2340
RO 119835 Β1
GTACGGCGGC CCGATCGTGC ACTTCTACGA CGTGAGCATC AAGTTAACGT AGAGCTCAGA 2400
TCT
2403 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 4 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 2612 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) ÎNFĂȘURARE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETICĂ: NU (ix) CARACTERISTICI:
(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 118..2484 (D) ALTE INFORMAȚII: /notă - „Secvență nativă de ADN care codifică proteina VIP3A(b) din AB424 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI; SEQ ID NO: 4
ATTGAAATTG ATAAAAAGTT ATGAGTGTTT AATAATCAGT AATTACCAAT AAAGAATTAA
GAATACAAGT TTACAAGAAA TAAGTGTTAC AAAAAATAGC TGAAAAGGAA GATGAAC
117
ATG Met 790 AAC Asn AAG Lys AAT Asn AAT Asn ACT Thr 795 AAA Lys TTA Leu AGC Ser ACA Thr AGA Arg 800 GCC Ala TTA Leu CCA Pro AGT Ser TTT Phe 805 165
ATT GAT TAT TTC AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC AAA GAC 213
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
810 815 820
ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACA GGT GGT GAT CTA ACC CTA 261
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
825 830 835
GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG CTA CTA AAT GAT ATT TCT GGT AAA 309
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp I le Se r Gly Lys
840 845 850
TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT gat CTT ATC GCA CAG GGA AAC 357
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn
855 860 865
TTA AAT ACA GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA ΛΛΛ ATT GCA AAT GAA CAA 405
RO 119835 Β1
Leu 870 Asn Thr Glu Leu Ser 8 75 Lys Glu Ile Leu Lys 880 Ile Ala As n Glu Glu 8 85
AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA AAT ACG 453
Asn Gin Val Leu Λ3Π Asp val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
890 895 900
ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT GAT GTA 501
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Se r Asp Val
905 910 915
ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAA ATA GAA TAC TTA AGT AAA 549
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
920 925 930
CAA TTG CAA GAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA AAT GTA 597
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
935 940 945
CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CAA AGG ATT 645
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile
950 955 960 965
AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACA GAA ACT 693
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
970 975 980
AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CGT GAT GAG 741
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Arg Asp Glu
985 990 995
TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT GAT GTG 789
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
1000 1005 1010
GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG GTA GGA 837
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly
1015 1020 1025
AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA TTA ATT 885
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
1030 1035 1040 1045
ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT GTT TAT 933
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Se r Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
1050 1055 1060
AAC ttc CTA ATT GTA TTA ACA GCT CTG CAA GCA AAA GCT TTT CTT ACT 981
RO 119835 Β1
1 Asii Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Lys Ala Phe Leu Thr
3 1065 1070 1075
ΤΤΛ ACA CCA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT TAT ACT 1029
5 Leu Thr Pro Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp I le Asp Tyr Thr
108 0 10 8! r> 1 090
7 TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT AGA GTA 1077
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
9 10 95 1100 11 05
11 AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA 1125
As η Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
13 1110 1115 1120 1125
AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA GCT AAA 1173
15 Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Me t Ile Val Glu Ala Lys
1130 1135 1140
17
CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA ATT ACA 1221
19 Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
1145 1150 1155
21 GTA TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA GTC GAT 1269
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
23 1160 1165 1170
AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGC GAT ATG GAT AAA TTA TTG 1317
25 Ly s Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
1175 1180 1185
27
TGC CCA GAT CAA TCT GGA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA GTA TTT 1365
29 Cy s Pro Asp Gin Ser Gly Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
1190 1195 1200 1205
31 CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA ATG AAA 1413
Pro Asn G1U Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
33 1210 1215 1220
35 ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT ACA GGA 1461
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
1225 1230 1235
37
GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG GAG TAT 1509
39 Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
1240 1245 1250
41
AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA GGT GTC 1557
RO 119835 Β1
Arg Thr Leu Ser Al a Asn Asp Asp Gly Val Tyr Me t Pro Leu Gly Val 1
1 255 1 260 1265 3
ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC CAA GCT 1605
Ile Ser Glu Thr Ph e Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Le u Gin Ala 5
1270 1275 1280 1285
GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT TTA AGA 1653 7
Asp Glu Asn Ser Ar g Leu Ile Thr Leu Thr Cy s Lys Ser Tyr Leu Arg
1290 1295 1300 9
GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA TTG ATC 1701 11
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Ly s Glu Thr Lys Leu Ile
1305 1310 1315
13
GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG TCC ATA 1749
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Se r Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile 15
1320 1325 1330
GAA GAG GAC AAT TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT GCG TAT 1797 17
Glu Glu Asp Asn Leu Glu P ro Trp Ly 3 Ala Asn Asn Lys As n Ala Tyr
1335 1340 1345 19
GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT GTT CAT 1845 21
Val Asp His Thr Gly Gly val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
1350 1355 1360 1365
AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA CCG AAA 1893
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys 25
1370 1375 1380
ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT ATT CAT 1941 27
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys pro Ser Ile His
1385 1390 1395 29
TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA AAT AAT 1989
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn 31
1400 1405 1410
33
AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA GGA ACT 2037
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr QC
1415 1420 1425 00
GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA GAT GAA 2085 37
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu
1430 1435 1440 1445 39
GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT GAA AAG 2133
RO 119835 Β1
AJ a Trp Gly Asp Asn 1 4 5C Phe ) Ile Ile Leu Glu 1 45i T] e Ser Pro Se r Glu 1 4 6i Lys )
TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT ACG GGA 2181
Leu Leu S o r Pro G 1 u l.ou r 1 e Asn Th r Asn Asn Trp Thr Se r Th r G1 y
146: 1 14 70 14 7! j
TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA GGA CGA 2229
Ser Thr As n Ho Ser Gly Λ s n Th r Le u Thr Le u Tyr G 1 n G1 y Gly Arg
1480 148. 5 1490
GGG ATT CTA ΑΛΛ CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT TAT AGA 2277
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
14 95 1500 1505
GTG TAT ttc TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA AAT TCT 2325
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg I le Arg Asn Ser
1510 1515 1520 1525
AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA GAT GTT 2373
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
1530 1535 1540
TAT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTC TAT ATA GAG 2421
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
1545 1550 1555
CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT TTT TAC 2469
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val Hi s Phe Tyr
1560 1565 1570
GAT GTC TCT ATT AAG TAAGATCGGG ATCTAATATT AACAGTTTTT AGAAGCTAAT
Asp Val Ser Ile Lys
1575
TCTTGTATAA TGTCCTTGAT TATGGAAAAA CACAATTTTG TTTGCTAAGA TGTATATATA
GCTCACTCAT TAAAAGGCAA TCAAGCTT
2524
2584
2612 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 5 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 789 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină
RO 119835 Β1 (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 5
Me t 1 Asn Lys Asn Asn 5 Thr Lys Leu Ser Thr 1 0 Arg Ala Leu Pro Ser 1 5 Phe 3
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly I le Tyr Gly Phe Ala T h r Gly Ile Lys Asp 5
2 0 2 5 3 0 7
Ile Me t Asn Me t Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Le u Thr Leu
35 4 0 45 9
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu As n Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60 11
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Le u Ile Ala Gin Gly Asn 13
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys ile Ala Asn Glu Glu 15
85 90 95 17
Asn Gin val Leu Asn Asp Val As n Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110 19
Me t Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val 21
115 120 125
Me t Lys Gin As n Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Le u Ser Lys 23
130 135 140
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn. Val 25
14 5 150 155 1 60 27
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile
165 170 175 29
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr 31
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Al a Asp I le Arg Asp Glu 33
195 20 0 205 35
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Al a Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp Val
2 10 2 15 220 37
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu As n Thr Phe His Asp Val Me t Val Gly
225 230 235 2 40 39
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu I le 41
245 250 255
RO 119835 Β1
1 3 Th r Asn Lys Phe G 1 u Leu Asn 260 Ile val Va 1 Lys Leu Thr Thr Ser Al a Gly 2 65 Leu Ser Gin Glu Ala Val Lys Gly Ala Asn 270 Phe Va 1 Leu Tyr Thr
5 2 75 28 0 2 85
l.eu Th r P ro Cy s Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
7 290 295 3 0 0
9 Se r Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 3 10 315 320
11 Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser As n Thr Phe Ser Asn Pro As n Tyr Ala
325 330 335
13
Ly s Val Lys Gly Ser Asp Glu As p Ala Lys Me t Ile Val Glu Ala Lys
15 340 34 5 350
Pro Gly His Al a Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Se r Ile Thr
17 355 360 365
19 Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
3 7 0 375 3 8 0
21 Lys As p Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Ly s Leu Leu
385 390 395 4 00
23
Cy s Pro Asp Gin Ser Gly GȚ.n Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
25 4 05 4 10 4 15
27 Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys Me t Lys
420 425 430
29 Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Se r Thr Gly
4 35 44 0 4 45
31 Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
4 50 4 55 4 60
33
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp As p Gly Val Tyr Met Pro Le u Gly Val
35 465 4 70 475 4 80
O 7 Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Le u Gin Ala
37 4 85 4 90 4 95
39 Asp Glu Asn Ser Arg Leu I le Thr Leu Thr Cy s Lys Ser Tyr Leu Arg
50 0 505 510
41
Glu Leu Leu Le u Ala Thr Asp Le u Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu I le
RO 119835 Β1
15
520
525
Va 1 Pro 5 3 0 Pro Ser Gly Phe Ile 5 3 5 Ser Asn I le Val Glu 54 0 Asn Gly Ser Ile 3
Glu Glu Asp As n Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr 5
54 5 550 555 5 60 7
Va 1 Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Ly s Ala Leu Tyr Val His 9
5 65 5 70 5 7 5
Ly s As p Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly As p Lys Leu Ly s Pro Lys 11
58 0 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Se r Ile His 13
5 95 600 605 15
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620 17
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 19
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly val Tyr Leu ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu 21
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe I le Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys 23
660 665 670 25
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn As n Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685 27
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg 29
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 31
705 7 10 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg I le Arg Asn Ser 33
725 730 735 35
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
74 0 745 750 37
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 7 65 39
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr 41
770 775 780
RO 119835 Β1
Asp Val Ser Ile Lys
8 5 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 6 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 2444 perechi de baze (B) TIP: acid nucleic (C) ÎNFĂȘURARE: simplă (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: ADN (genomic) (iii) IPOTETICĂ: NU (ix) CARACTERISTICI:
(A) NUME/CHEIE: CDS (B) LOCALIZARE: 17..2444 (D) ALTE INFORMAȚII: /produs = „fuziune 3A(a) sintetic:nativ“ (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 6
GGATCCACCA ATGAAC ATG AAC AAG AAC AAC ACC AAG CTG AGC ACC CGC 49
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg
5 10
GCC Ala CTG Leu CCG Pro AGC Ser 15 TTC Phe ATC Ile GAC Asp TAC Tyr TTC Phe 20 AAC Asn GGC Gly ATC Ile TAC Tyr GGC Gly 25 TTC Phe GCC Ala 97
ACC GGC ATC AAG GAC ATC ATG AAC ATG ATC TTC AAG ACC GAC ACC GGC 145
Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly
30 35 40
GGC GAC CTG ACC CTG GAC GAG ATC CTG AAG AAC CAG CAG CTG CTG AAC 193
Gly Asp Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys As n Gin Gin Leu Leu Asn
45 50 55
GAC ATC AGC GGC AAG CTG GAC GGC GTG AAC GGC AGC CTG AAC GAC CTG 241
Asp Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu
60 65 70 75
ATC GCC CAG GGC AAC CTG AAC ACC GAG CTG AGC AAG GAG ATC CTT AAG 289
Ile Ala Gin Gly Asn Leu Asn Th r Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys
80 85 90
ATC GCC AAC GAG CAG AAC CAG GTG CTG AAC GAC GTG AAC AAC AAG CTG 337
RO 119835 Β1
Ile Ala Asn Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu 1
95 100 105
GAC GCC ATC AAC ACC ATG CTG CGC GTG TAC CTG CCG AAG ATC ACC AGC 385 3
Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser 5
110 115 120
ATG CTG AGC GAC GTG ATG AAG CAG AAC TAC GCC CTG AGC CTG CAG ATC 433 7
Me t Leu Ser Asp Val Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile
125 130 135 9
GAG TAC CTG AGC AAG CAG CTG CAG GAG ATC AGC GAC AAG CTG GAC ATC 481 11
Glu Tyr Leu Ser Lys Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile
140 145 150 155 13
ATC AAC GTG AAC GTC CTG ATC AAC AGC ACC CTG ACC GAG ATC ACC CCG 529
Ile Asn Val Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro 15
160 165 170
GCC TAC CAG CGC ATC AAG TAC GTG AAC GAG AAG TTC GAA GAG CTG ACC 577 17
Ala Tyr Gin Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr
175 180 185 19
TTC GCC ACC GAG ACC AGC AGC AAG GTG AAG AAG GAC GGC AGC CCG GCC 625 21
Phe Ala Thr Glu Thr Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala
190 195 200 23
GAC Asp ATC Ile 205 CTG Leu GAC Asp GAG Glu CTG Leu ACC Thr 210 GAG Glu CTG Leu ACC Thr GAG Glu CTG Leu 215 GCC Ala AAG Lys AGC Ser GTG Val 673
ACC AAG AAC GAC GTG GAC GGC TTC GAG TTC TAC CTG AAC ACC TTA CAC 721
Thr Lys Asn Asp val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His
220 225 230 235
GAC GTG ATG GTG GGC AAC AAC CTG TTC GGC CGC AGC GCC CTG AAG ACC 769
As p Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Le u Lys Thr
240 245 250
GCC AGC GAG CTG ATC ACC AAG GAG AAC GTG AAG ACC AGC GGC AGC GAG 817
Ala Ser Glu Leu Ile Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu
255 260 265
GTG GGC AAC GTG TAC AAC TTC CTG ATC GTG CTG ACC GCC CTG CAG GCC 865
Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Le u Gin Ala
270 275 280
CAG GCC TTC CTG ACC CTG ACC ACC TGT CGC AAG CTG CTG GGC CTG GCC 913
RO 119835 Β1
Gin Ala 285 Phe Leu Thr Leu Thr 290 Thr Cy 3 Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala
GAC ATC GAC TAC ACC AGC ATC ATG AAC GAG CAC TTG AAC AAG GAG AAG 961
Asp lle Asp Ty r Th r Ser 1 1 e Met Asn Glu Hi s Leu Asn Lys Gl u Lys
300 305 310 315
GAG GAG TTC CGC GTG AAC ATC CTG CCG ACC CTG AGC AAC ACC TTC AGC 1009
Glu Glu Phe Arg val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser
32 0 325 330
AAC CCG AAC TAC GCC AAG GTG AAG GGC AGC GAC GAG GAC GCC AAG ATG 1057
Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser As p Glu Asp Ala Lys Met
335 340 345
ATC GTG GAG GCT AAG CCG GGC CAC GCG TTG ATC GGC TTC GAG ATC AGC 1105
Ile Val Glu Ala Lys Pro Gly Hi s Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser
350 355 360
AAC GAC AGC ATC ACC GTG CTG AAG GTG TAC GAG GCC AAG CTG AAG CAG 1153
Asn Asp Ser Ile Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin
365 370 375
AAC TAC CAG GTG GAC AAG GAC AGC TTG AGC GAG GTG ATC TAC GGC GAC 1201
Asn Tyr Gin Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp
380 385 390 395
ATG GAC AAG CTG CTG TGT CCG GAC CAG AGC GAG CAA ATC TAC TAC ACC 1249
Met Asp Ly s Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr
400 405 410
AAC AAC ATC GTG TTC CCG AAC GAG TAC GTG ATC ACC AAG ATC GAC TTC 1297
Asn Asn Ile Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe
415 420 425
ACC AAG AAG ATG AAG ACC CTG CGC TAC GAG GTG ACC GCC AAC TTC TAC 1345
Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr
430 435 4 4 0
GAC AGC AGC ACC GGC GAG ATC GAC CTG AAC AAG AAG AAG GTG GAG AGC 1393
Asp Ser Ser Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser
445 450 455
AGC GAG GCC GAG TAC CGC ACC CTG AGC GCG AAC GAC GAC GGC GTC TAC 1441
Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly val Tyr
460 465 470 475
ATG CCA CTG GGC GTG ATC AGC GAG ACC TTC CTG ACC CCG ATC AAC GGC 1489
RO 119835 Β1
Met Pro Leu Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly 1
480 485 4 90 3
τ τ τ GGC CTG CAG GCC GAC GAG AAC AGC CGC CTG ATC ACC CTG ACC TGT 15 3 7
Phe Gly Leu Gin Ala A sp Glu Asn Ser A rg Leu Ile Thr Leu Thr Cys 5
4 95 500 505
AAG AGC TAC CTG CGC GAG CTG CTG CTA GCC ACC GAC CTG AGC AAC AAG 1585 7
Ly s Ser Tyr Leu Ar g Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys
510 515 520 9
GAG ACC AAG CTG ATC GTG CCA CCG AGC GGC TTC ATC AGC AAC ATC GTG 1633 11
Glu Thr Lys Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser As n Ile Val
525 530 535 13
GAG AAC GGC AGC ATC GAG GAG GAC AAC CTG GAG CCG TGG AAG GCC AAC 1681
Glu Asn Gly Ser Ile Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn 15
540 545 550 555
AAC As n AAG Lys AAC Asn GCC Ala TAC Tyr 560 GTG Val GAC Asp CAC Hi s ACC Thr GGC Gly 56! GGC Gly GTG Val AAC Asn GGC Gly ACC Thr 571 AAG Lys 3 1729 19
GCC CTG TAC GTG CAC AAG GAC GGC GGC ATC AGC CAG TTC ATC GGC GAC 1777 21
Ala Leu Tyr Val Hi s Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp
575 580 585 23
AAG CTG AAG CCG AAG ACC GAG TAC GTG ATC CAG TAC ACC GTG AAG GGC 1825
Lys Leu Lys Pro Lys Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly 25
590 595 600
27
AAG CCA TCG ATT CAC CTG AAG GAC GAG AAC ACC GGC TAC ATC CAC TAC 1873
Lys Pro Ser Ile Hi s Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr 29
605 610 615
GAG GAC ACC AAC AAC AAC CTG GAG GAC TAC CAG ACC ATC AAC AAG CGC 1921 31
Glu Asp Thr Asn Asn Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg
620 625 630 635 33
TTC ACC ACC GGC ACC GAC CTG AAG GGC GTG TAC CTG ATC CTG AAG AGC 1969 ας
Phe Thr Thr Gly Thr Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser O\J
640 645 650
37
CAG AAC GGC GAC GAG GCC TGG GGC GAC AAC TTC ATC ATC CTG GAG ATC 2017
Gin Asn Gly Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu I le 39
655 660 665
AGC CCG AGC GAG AAG CTG CTG AGC CCG GAG CTG ATC AAC ACC AAC AAC 2065 41
RO 119835 Β1
Ser Pro Ser 670 Glu Lys Leu Leu Ser 675 Pro Glu Leu Ile Asn 680 Thr Asn Asn
TGG ACC AGC ACC GGC AGC ACC AAC A'I'C AGC GGC AAC ACC CTG ACC CTG 2113
Trp Thr Ser Th r Gly Se r Thr As n Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu
685 690 695
TAC CAG GGC GGC CGG GGC, ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT 2161
Tyr Gin Gly Gly Arg Gly I le Leu Lys Gin As n Leu Gin Leu Asp Ser
700 7 0 5 710 7 15
TTT TCA ACT TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA 2209
Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val
7 20 725 730
AGG ATT AGA AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC 2257
Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser
735 740 745
GGT GCT AAA GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT 2305
Gly Ala Ly 3 Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp
750 755 760
AAC TTT TAT ATA GAG CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT 2353
Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro
765 770 775
ATT GTA CAT TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG NAA GAT CGG GAT CTA ATA 2401
Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys Xaa Asp Arg Asp Leu Ile
780 785 790 795
TTA ACA GTT TTT AAA AGC NAA TTC TTG TAT AAT GTC CTT GAT T 2444
Leu Thr Val Phe Lys Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu Asp
800 805 (2) INFORMAȚII PENTRU SEQ ID NO: 7 (i) CARACTERISTICILE SECVENȚEI:
(A) LUNGIME: 809 aminoacizi (B) TIP: aminoacid (D) TOPOLOGIE: liniară (ii) TIPUL MOLECULEI: proteină (xi) DESCRIEREA SECVENȚEI: SEQ ID NO: 7
RO 119835 Β1
Me t 1 Asn Lys Asn Asn 5 Thr Ly s Leu Ser Thr 10 Arg A 1 a Leu Pro Ser 1 5 Phe 1
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp 3
2 0 2 5 3 0
Ile Me L Asn Me t. I 1 e Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Th r Leu 5
3 5 4 0 45 7
As p Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp I le Ser Gly Lys
50 55 60 9
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn 11
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Ly s Ile Ala Asn Glu Gin 13
85 90 95
15
As n Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110 17
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Ly s Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 12 0 125 19
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys 21
130 135 14 0
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Ly s Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val 23
145 150 155 1 60
25
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg I le
165 170 175 27
Ly s Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190 29
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser P ro Al a Asp Ile Leu Asp Glu 31
1 95 200 2 05
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys As n Asp Val 33
210 2 15 220
35
Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe Hi s Asp Val Me t Val Gly
225 230 235 2 40 37
As n Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu Ile
2 4 5 250 2 55 39
Thr Lys Glu Asn Va 1 Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr 41
260 265 270
RO 119835 Β1
1 Asii Phe I, e 11 T 1 e Va t Leu Thr Ala Le u Gin A l a G 1 n A 1 a Phe I. e u Thr
Q 2 7 5 2 8 0 2 8 5
0 L ο 11 T h r T h r Cys A r g L y s Leu Leu Gly l.e u Λ1 a A s p I le Asp T y r Thr
5 2 9 0 2 9 5 3 0 0
Ser 1 le Met As n c; i u H 1 s Leu As n Lys G 1 u lys Glu G 1 u Phe Arg Val
7 3 0 3 3 1 0 3 1 5 3 20
9 As n Ue L e u Pro '1' fi r Leu Ser Asn T h r Phe Ser Asn Pro Asn T y r Ala
3 25 3 30 335
11 Lys Val Ly s Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu Ala Lys
34 0 3 4 5 350
13
Pro Gly H i s Al a Leu Ile Gly Ph e Glu Ile Ser Asn Asp Ser Ile Thr
15 3 55 360 365
Va 1 L e u Ly s Va 1 Tyr Glu Ala Lys Le u Lys Gin Asn Tyr Gin Va 1 Asp
17 3 7 0 3 75 3 8 0
19 Ly s Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Me t Asp Lys Leu Leu
38 5 3 90 395 400
21 Cy s Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn Asn Ile Val Phe
4 0 5 4 10 4 15
23
Pro As n Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Ly s Me t Lys
25 420 4 2 5 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Al a Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
27 435 44 0 4 45
29 Glu Ile Asp Le u Asn Ly s Lys Ly s Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
4 5 0 4 55 4 60
31 Ar g Thr Leu Ser Ala Asn Asp As p Gly Val Tyr Me t Pro Leu Gly Val
465 4 70 4 75 4 80
33
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
35 4 8 5 4 90 4 95
As p Glu Asn Se r Arg Leu I le Th r Leu Thr C y s Lys Ser Tyr Leu Arg
37 500 5 0 5 510
39 G1U Leu Leu Le u Ala Thr Asp Le u Ser Asn Ly s Glu Thr Lys Leu Ile
5 15 520 525
41 Va 1 Pro Pro Ser Gly Phe Ile Se r Asn T 1. e Va 1 G 1 u Asn Gly Ser I Le
RO 119835 Β1
G 1 u 5 4 5 G 1 u Asp Asn Le u G 1 u 5 5 0 Pro Trp Ly a Ala Asn 5 5 5 A s n Lys Asn A 1 a Tyr 5 60 3
Va 1 Asp His Thr Gly G 1 y Val Asn G 1 y Thr Lys A 1 a I. e u Tyr Va 1 H i s 5
5 6 5 5 70 5 7 5
Lys Asp Gly Gly Ile Ser G In Phe Ile Gly Asp Ly 3 Leu Lys Pro Lys 7
58 0 58 5 590 9
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Th r Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
5 95 60 0 605 11
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
6 10 6 15 62 0 13
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr 15
62 5 630 635 6 4 0
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asp Glu 17
6 4 5 650 655
Al a Trp Gly Asp Asn Phe I le Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys 19
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu I le As n Thr Asn As n Trp Thr Ser Thr Gly 21
6 75 68 0 685 23
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 7 0 0 25
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg 27
705 710 7 15 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser 29
7 2 5 730 7 35
Ar g Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val 31
74 0 7 4 5 75 0
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu 33
755 760 7 65 35
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
7 7 0 7 75 7 8 0 37
Asp Val Ser Ile Lys Xaa Asp Arg Asp Leu Ile Leu Thr Va 1 Phe Lys 39
785 7 90 7 95 8 00
Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu Asp

Claims (32)

  1. Revendicări
    1. Moleculă ADN care codifică o proteină pesticidă și care poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus spp. sau variante sau fragmente ale proteinei care păstrează activitatea pesticidă, caracterizată prin aceea că poate fi izolată din mediul de cultură lichid, și este codificată de către o secvență de nucleotide care hibridizează într-o secvență de nucleotide având SEQ ID NO: 1,3 sau 4, la temperatura de 65’C, într-o soluție tampon conținând 7% SDS și 0,5 M fosfat de potasiu, sau respectiva proteină reacționează încrucișat cu aticorpii generați împotriva proteinelor având SEQ ID NO: 2 sau 5.
  2. 2. Moleculă ADN conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta codifică o proteină definită prin SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 și SEQ ID NO: 7.
  3. 3. Moleculă ADN, conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că are secvența de nucleotide dată în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 sau SEQ ID NO: 6.
  4. 4. Moleculă ADN, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta conține o secvență de nucleotide care a fost în întregime sau parțial optimizată pentru exprimarea într-o plantă prin utilizarea codonilor preferați de planta respectivă.
  5. 5. Moleculă ADN, conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că are secvența de nucleotide dată în SEQ ID NO: 3 sau SEQ ID NO: 6.
  6. 6. Moleculă ADN, conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că aceasta conține o secvență de nucleotide care a fost în întregime sau parțial optimizată pentru exprimarea într-un microorganism prin utilizarea codonilor preferați de gazda respectivă.
  7. 7. Procedeu de obținere a moleculei ADN definită în revendicarea 1, caracterizat prin aceea că prevede:
    (d) obținerea unei molecule ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică o proteină pesticidă; și (e) hibridizarea respectivei molecule ADN cu o probă oligonucleotidă care poate fi obținută dintr-o moleculă ADN definită în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 sau SEQ ID NO: 6; și (f) izolarea respectivului ADN hibridizat.
  8. 8. Casetă de exprimare caracterizată prin aceea că aceasta conține o moleculă ADN corespunzătoare oricăreia dintre revendicările 1 până la 7, legată operațional la secvențele de exprimare în plantă incluzând semnalele de reglare transcripțională și traslațională necesare pentru exprimarea construcției ADN asociate într-un organism gazdă și, opțional, alte secvențe de reglare.
  9. 9. Casetă de exprimare, conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că organismul gazdă este o plantă.
  10. 10. Moleculă vector, caracterizată prin aceea că aceasta conține o casetă de exprimare corespunzătoare revendicării 8.
  11. 11. Proteină pesticidă, caracterizată prin aceea că este codificată de o moleculă ADN corespunzătoare revendicării 1.
  12. 12. Proteină pesticidă, conform revendicării 11, caracterizată prin aceea că are o masă moleculară de circa 60 până la circa 100 kDa.
  13. 13. Proteină pesticidă, conform revendicării 12, caracterizată prin aceea că are secvența de aminoacizi dată în SEQ ID NO: 2 sau SEQ ID NO: 5.
  14. 14. Proteină pesticidă, conform revendicării 11, caracterizată prin aceea că poate fi izolată în timpul fazei de creștere vegetativă a Bacillus thuringiensis AB88 depus sub numărul de acces NRRL B-21225, sau Bacillus thuringiensis AB424 depus sub numărul de acces NRRL B-21439.
    RO 119835 Β1
  15. 15. Organism gazdă, caracterizat prin aceea că include o moleculă ADN corespun- 1 zătoare oricăreia dintre revendicările 1 până la 7, o casetă de exprimare conținând molecula
    ADN respectivă, sau o moleculă vector conținând respectiva casetă de exprimare, preferabil 3 încorporată stabil în genomul organismului gazdă.
  16. 16. Organism gazdă, conform revendicării 15, caracterizat prin aceea că este 5 selectat din grupul constând din celule de plante și insecte, bacterii, fermenți, baculoviruși, protozoare, nematode și alge.7
  17. 17. Organism gazdă, conform revendicării 15, care este un microorganism transformat cu o casetă de exprimare corespunzătoare oricăreia dintre revendicările 8 sau 9 9 sau o moleculă vector corespunzătoare revendicării 10, caracterizat prin aceea că este, de preferință, un microorganism care se înmulțește pe plante.11
  18. 18. Organism gazdă, conform revendicării 17, caracterizat prin aceea că microorganismul este o bacterie care colonizează rădăcini sau o tulpină de Pseudomonas.13
  19. 19. Organism gazdă, conform revendicării 17, caracterizat prin aceea că microorganismul este Bacillus thuringiensis AB88 depus sub numărul de acces NRRL B-21225, sau 15 Bacillus thuringiensis AB424 depus sub numărul de acces NRRL B-21439.
  20. 20. Plantă transgenică, incluzând părțile, descendenții și semințele acesteia, caracte-17 rizată prin aceea că este transformată stabil cu o moleculă ADN corespunzătoare oricăreia dintre revendicările 1 până la 7 sau o casetă de exprimare corespunzătoare revendicării 9.19
  21. 21. Plantă conform revendicării 20, caracterizată prin aceea că exprimă o proteină pesticidă corespunzătoare revendicării 11.21
  22. 22. Plantă conform revendicării 21, caracterizată prin aceea că exprimă în plus un al doilea agent distinct de control al insectelor, cum ar fi o Bt δ-endotoxină.23
  23. 23. Plantă conform revendicărilor 20 până la 22, caracterizată prin aceea că este selectată din grupul constând din porumb, sorg, grâu, floarea soarelui, bumbac, orez, soia, 25 orz și rapiță.
  24. 24. Plantă conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că este o plantă de 27 porumb.
  25. 25. Plantă conform revendicării 23, caracterizată prin aceea că este o plantă de 29 bumbac.
  26. 26. Plantă conform revendicărilor 20 până la 25, caracterizată prin aceea că este 31 o plantă hibridă.
  27. 27. Sămânță a unei plante, conform revendicărilor 20 până la 25, caracterizată prin 33 aceea că este tratată cu o acoperire de protecție a seminței.
  28. 28. Metodă pentru izolarea unei molecule ADN conform revendicării 1, caracterizată 35 prin aceea că aceasta constă în:
    (a) obținerea unei molecule ADN conținând o secvență de nucleotide care codifică 37 o proteină pesticidă;
    (b) hibridizarea respectivei molecule ADN cu o probă oligonucleotidă care poate fi 39 obținută dintr-o moleculă ADN definită în SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 sau
    SEQ ID NO: 6; și 41 (c) izolarea ADN-ului hibridizat.
  29. 29. Metodă de lărgire a domeniului de insecte țintă, carcaterizată prin aceea că o 43 casetă de exprimare corespunzătoare revendicării 8 este exprimată în plantă împreună cu cel puțin o proteină insecticidă secundară, care este diferită de proteina pesticidă codificată 45 de către respectiva casetă de exprimare.
    RO 119835 Β1
    1
  30. 30. Metodă conform revendicării 29, caracterizată prin aceea că proteina insecticidă secundară este selectată din grupul constând din Btδ-endotoxine, inhibitori de protează, lec3 tine, α-amilaze și peroxidaze.
  31. 31. Metodă de protecție a plantelor împotriva distrugerilor cauzate de o insectă dău-
    5 nătoare, caracterizată prin aceea că aceasta constă în plantarea unei plante transgenice pentru o moleculă ADN ce codifică o proteină pesticidă care hibridizează în condiții moderat
    7 stringente la o probă de oligonucleotide obținută dintr-o moleculă de ADN definită prin SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 sau SEQ ID NO: 6 corespunzătoare revendicării 1
    9 și exprimarea proteinei pesticide.
  32. 32. Metodă de producere a unei plante sau celule de plantă care exprimă o proteină
    11 pesticidă, caracterizată prin aceea că aceasta constă din transformarea plantei sau celulei de plantă respective cu o casetă de exprimare corespunzătoare revendicării 9 sau cu o 13 moleculă vector corespunzătoare revendicării 10.
RO97-00618A 1994-09-28 1995-09-27 Proteină cu efect pesticid şi moleculă adn, care codifică pentru această proteină RO119835B1 (ro)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31459494A 1994-09-28 1994-09-28
US08/463,483 US5849870A (en) 1993-03-25 1995-06-05 Pesticidal proteins and strains
PCT/EP1995/003826 WO1996010083A1 (en) 1994-09-28 1995-09-27 Novel pesticidal proteins and strains

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO119835B1 true RO119835B1 (ro) 2005-04-29

Family

ID=26979445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO97-00618A RO119835B1 (ro) 1994-09-28 1995-09-27 Proteină cu efect pesticid şi moleculă adn, care codifică pentru această proteină

Country Status (24)

Country Link
US (9) US5849870A (ro)
EP (3) EP1382611A3 (ro)
JP (1) JPH10506532A (ro)
KR (1) KR100419438B1 (ro)
CN (1) CN1255539C (ro)
AT (1) ATE256743T1 (ro)
AU (1) AU692934B2 (ro)
BG (1) BG101384A (ro)
BR (1) BR9509099A (ro)
CA (1) CA2199049C (ro)
CZ (1) CZ290801B6 (ro)
DE (1) DE69532333T3 (ro)
DK (1) DK0792363T4 (ro)
ES (1) ES2213162T5 (ro)
HU (1) HU222264B1 (ro)
IL (2) IL115382A (ro)
MX (1) MX228013B (ro)
PH (2) PH11995051386B1 (ro)
PT (1) PT792363E (ro)
RO (1) RO119835B1 (ro)
RU (1) RU2196824C2 (ro)
SI (1) SI0792363T2 (ro)
TR (1) TR199501182A2 (ro)
WO (1) WO1996010083A1 (ro)

Families Citing this family (136)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406690B1 (en) * 1995-04-17 2002-06-18 Minrav Industries Ltd. Bacillus firmus CNCM I-1582 or Bacillus cereus CNCM I-1562 for controlling nematodes
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
GB9611777D0 (en) * 1996-06-06 1996-08-07 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6369213B1 (en) 1996-07-01 2002-04-09 Mycogen Corporation Toxins active against pests
CA2259142A1 (en) * 1996-07-01 1998-01-08 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis toxins active against noctuidae pests
US6242669B1 (en) * 1996-10-30 2001-06-05 Mycogen Corporation Pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6204435B1 (en) 1996-10-30 2001-03-20 Mycogen Corporation Pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US6603063B1 (en) 1999-05-07 2003-08-05 Mycogen Corp. Plants and cells transformed with a nucleic acid from Bacillus thuringiensis strain KB59A4-6 encoding a novel SUP toxin
US7129212B2 (en) * 1996-10-30 2006-10-31 Mycogen Corporation Polynucleotides, pesticidal proteins, and novel methods of using them
US6002068A (en) * 1996-12-19 1999-12-14 Novartis Finance Corporation Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence
JP2001522238A (ja) * 1997-03-31 2001-11-13 アボツト・ラボラトリーズ 胃腸管の疾患の検出に有用な試薬および方法
AU727218B2 (en) 1997-04-03 2000-12-07 Syngenta Participations Ag Plant pest control
US6103228A (en) * 1997-05-09 2000-08-15 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
CZ302152B6 (cs) * 1997-05-09 2010-11-18 Agraquest, Inc. Nový kmen Bacillus pro kontrolu onemocnení rostlin a napadení brouky rodu Diabrotica
JP2002510201A (ja) * 1997-06-04 2002-04-02 ノバルティス アクチェンゲゼルシャフト 殺有害生物剤スクリーニング系
US6001637A (en) * 1997-08-22 1999-12-14 Agraquest, Inc. Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations
US5906818A (en) 1997-08-22 1999-05-25 Agraquest, Inc. Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm
US6015553A (en) * 1997-08-22 2000-01-18 Agraquest, Inc. Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests
US6027723A (en) * 1997-08-22 2000-02-22 Agraquest, Inc. Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm
GB9725556D0 (en) * 1997-12-03 1998-02-04 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US6972350B1 (en) * 1998-07-15 2005-12-06 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Pest-resistant plants comprising a construct encoding a vacuole targeting sequence and avidin or streptavidin
AR020141A1 (es) * 1998-08-10 2002-04-10 Mycogen Corp Toxinas y genes pesticidas de cepas de bacillus laterosporus
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
AUPP841199A0 (en) * 1999-02-02 1999-02-25 Pinnock, Professor Dudley Edwin Control of mange
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
MXPA01009695A (es) 1999-03-30 2002-03-27 Agraquest Inc Una cepa de bacillus pumilus para controlar enfermedades vegetales.
GB9909796D0 (en) * 1999-04-28 1999-06-23 Plant Bioscience Ltd Pesticidal fumes
US6706860B2 (en) 2000-05-18 2004-03-16 Bayer Bioscience N.V. Toxins
US7091399B2 (en) * 2000-05-18 2006-08-15 Bayer Bioscience N.V. Transgenic plants expressing insecticidal proteins and methods of producing the same
JP2004511788A (ja) * 2000-10-13 2004-04-15 アイアールエム　エルエルシー 高スループット処理システム及び使用方法
EP1988099B1 (en) * 2001-01-09 2012-11-14 Bayer CropScience NV Bacillus thuringiensis insecticidal proteins
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US7711002B2 (en) * 2001-06-26 2010-05-04 Link Us All, Llc Transcoding SMS-based streamed messages to SIP-based IP signals in wireless and wireline networks
US20030110840A1 (en) * 2001-07-24 2003-06-19 Arriaga Edgar A. Systems and methods for detecting a particle
ATE495184T1 (de) 2001-11-07 2011-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
US6589524B1 (en) 2002-02-07 2003-07-08 Ecomicrobials, Llc Strains of Bacillus for biological control of pathogenic fungi
ATE469171T1 (de) * 2002-03-22 2010-06-15 Bayer Bioscience Nv Neue insektizide proteine von bazillus thuringiensis
CN100497378C (zh) 2002-03-22 2009-06-10 拜尔生物科学公司 新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质
WO2004003148A2 (en) * 2002-06-26 2004-01-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes encoding proteins with pesticidal activity
US7462760B2 (en) * 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
US7205454B2 (en) 2002-07-31 2007-04-17 Bayer Bioscience N.V. Corn root preferential promoters and uses thereof
GB0225129D0 (en) 2002-10-29 2002-12-11 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20040220268A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Yoe-Sik Bae Compound that directly stimulates phospholipase C activity
US7718415B1 (en) * 2003-09-23 2010-05-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Acetyl esterase producing strains and methods of using same
CN1886513A (zh) * 2003-12-01 2006-12-27 先正达公司 昆虫抗性棉花植株及对其进行探测的方法
US20080040827A1 (en) 2003-12-16 2008-02-14 Judith Donovan Secreted Insecticidal Protein and Gene Compositions from Bacillus Thuringiensis and Uses Therefor
AU2006221823B2 (en) 2005-03-11 2011-06-09 Syngenta Limited Rodent pest control
WO2006096905A1 (en) 2005-03-14 2006-09-21 Microbial Products Pty Ltd Control of sucking lice
AU2006225065B2 (en) * 2005-03-14 2012-08-16 Ectotec Pty Ltd Control of sucking lice
US8173871B2 (en) 2005-07-08 2012-05-08 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Bacterial proteins with pesticidal activity
BRPI0615649A2 (pt) * 2005-08-31 2011-05-24 Monsanto Technology Llc método para aumentar o acúmulo de uma proteìna inseticida em uma célula hospedeira, para produzir uma célula vegetal resistente a uma praga de inseto, para controlar infestação e para proteger uma cultura, composição inseticida, produto de mercadoria, planta transgênica ou célula vegetal, sequência de nucleotìdeo, proteìna inseticida, progênie ou semente de planta, vetor, célula hospedeira e cassete de expressão
WO2007147096A2 (en) 2006-06-15 2007-12-21 Athenix Corporation A family of pesticidal proteins and methods for their use
CL2007002135A1 (es) * 2006-07-21 2008-03-14 Pioneer Hi Bred Int Acido nucleico de bacillus thuringiensis que codifican polipeptidos con actividad plaguicida; construccion de adn y celula huesped que lo comprenden; metodo de proteccion de una planta contra una plaga; polipeptidos y metodo de produccion; y composic
US20080300210A1 (en) * 2007-05-16 2008-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of Controlling Insects and Virus Transmission
CN101970647A (zh) * 2007-12-11 2011-02-09 先正达参股股份有限公司 条件性毒性的工程化酶原
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use
US8110608B2 (en) 2008-06-05 2012-02-07 Ecolab Usa Inc. Solid form sodium lauryl sulfate (SLS) pesticide composition
EP2949659A1 (en) 2008-07-02 2015-12-02 Athenix Corporation AXMI-115, AXMI-113, AXMI-005, AXMI-163 and AXMI-184: insecticidal proteins and methods for their use
US20100199383A1 (en) * 2008-09-18 2010-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Coleopteran Activity
US20100077507A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
CN102388143A (zh) * 2008-12-23 2012-03-21 阿森尼克斯公司 AXMI-150 δ-内毒素基因及其使用方法
BRPI1008674A2 (pt) 2009-02-19 2015-08-25 Pioneer Hi Bred Int Métodos de redução do desenvolvimento de pragas resistentes.
US8318900B2 (en) 2009-02-27 2012-11-27 Athenix Corp. Pesticidal proteins and methods for their use
EP2666866A3 (en) 2009-03-06 2014-03-05 Athenix Corporation Methods and compositions for controlling plant pests
CN102421792B (zh) 2009-03-11 2015-11-25 阿森尼克斯公司 Axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045: 来自苏云金芽孢杆菌的杀虫蛋白及其用法
ES2609332T3 (es) * 2009-07-02 2017-04-19 Athenix Corporation Gen pesticida AXMI-205 y métodos para su uso
MX354219B (es) 2009-07-31 2018-02-19 Athenix Corp Familia de genes plaguicidas axmi-192 y metodos para su uso.
RU2613778C2 (ru) 2009-10-02 2017-03-21 Зингента Партисипейшнс Аг Инсектицидные белки
EA201290560A1 (ru) 2009-12-23 2014-05-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Растения, устойчивые к гербицидам - ингибиторам hppd
AR079972A1 (es) 2009-12-23 2012-03-07 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
CA2785225C (en) 2009-12-23 2019-01-22 Bayer Intellectual Property Gmbh Plants tolerant to hppd inhibitor herbicides.
ES2668198T3 (es) 2009-12-23 2018-05-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD
BR112012015697A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
US8968757B2 (en) 2010-10-12 2015-03-03 Ecolab Usa Inc. Highly wettable, water dispersible, granules including two pesticides
BR112013015515A2 (pt) 2010-12-28 2018-04-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada da planta, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga de lepidóptero, método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de dna, método para proteger uma planta contra uma praga
CN103459601A (zh) 2011-02-11 2013-12-18 先锋国际良种公司 具有对抗玉米根虫的活性的合成杀昆虫蛋白
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
WO2012130684A1 (en) 2011-03-25 2012-10-04 Bayer Cropscience Ag Use of n-(1,2,5-oxadiazol-3-yl)benzamides for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides
AU2012234449B2 (en) 2011-03-25 2016-05-12 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of N-(tetrazol-4-yl)- or N-(triazol-3-yl)arylcarboxamides or their salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to hppd inhibitor herbicides
US9090906B2 (en) 2011-03-30 2015-07-28 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant Bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
AR085939A1 (es) * 2011-04-05 2013-11-06 Athenix Corp Gen insecticida variante axmi115 y metodos para utilizarlo
WO2012151145A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacterial mrna screen strategy for novel pesticide-encoding nucleic acid molecule discovery
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
CN103173370B (zh) * 2011-12-06 2015-02-18 高小文 芽胞杆菌Gxw4-2培育及其防治害虫方法
AU2013219927B2 (en) 2012-02-16 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
CA2866239C (en) 2012-03-08 2020-07-28 Athenix Corp. Bacillus thuringiensis toxin gene axmi335 and methods for its use
WO2013134651A1 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of ndr1
CN102633884B (zh) * 2012-04-21 2013-07-31 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US9758793B2 (en) 2012-08-30 2017-09-12 Athenix Corp. AXMI-234 and AXMI-235 delta-endotoxin genes and methods for their use
US9783820B2 (en) 2012-10-15 2017-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods and compositions to enhance activity of Cry endotoxins
CN103039494A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
US9458374B2 (en) * 2012-12-18 2016-10-04 Schlumberger Technology Corporation Cystine proteases for bacterial control
US9783817B2 (en) 2013-03-04 2017-10-10 Arkansas State University Methods of expressing and detecting activity of expansin in plant cells
AU2014225732B2 (en) 2013-03-07 2020-03-19 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Toxin genes and methods for their use
US9573980B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
EP3030072B1 (en) 2013-08-08 2020-03-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
CN104651377A (zh) 2013-11-25 2015-05-27 浙江大学 新型的杀虫蛋白
MX2016010187A (es) * 2014-02-07 2017-07-11 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
CA2950947A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Dow Agrosciences Llc Vegetative insecticidal proteins useful for control of insect pests
US20160010062A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Isolated Spodoptera Frugiperda Multiple Nucleopolyhedroviruses and Methods for Killing Insects
BR122023020910A2 (pt) 2014-09-17 2024-01-30 Spogen Biotech Inc Método para fornecimento de proteínas ou peptídeos a um animal
JP6975039B2 (ja) 2014-09-17 2021-12-01 バイエル クロップサイエンス エルピーBayer Cropscience Lp 組換えバチルス細胞および殺菌剤を含む組成物
CN107074917B (zh) 2014-10-16 2022-05-24 先锋国际良种公司 具有改进的活性谱的杀昆虫多肽及其用途
EP3207126A4 (en) 2014-10-16 2018-04-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
EA038931B9 (ru) 2014-11-20 2022-02-18 Йиссум Рисерч Дивелопмент Компани Оф Зе Хебрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд. Композиции и способы получения полипептидов с модифицированным профилем гликозилирования в клетках растений
CA2970788A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US20160304898A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 AgBiome, Inc. Pesticidal Genes and Methods of Use
BR112017022852A2 (pt) 2015-04-22 2018-07-17 Agbiome Inc polipeptídeo recombinante com atividade pesticida, composição, molécula de ácido nucleico recombinante, ácido nucleico recombinante, célula hospedeira, construto de dna, vetor, método para controlar uma população de pragas, método para produzir um polipeptídeo, planta, semente transgênica, método para proteger uma planta e método para aumentar o rendimento em uma planta
CN116333064A (zh) * 2015-05-19 2023-06-27 先锋国际良种公司 杀昆虫蛋白及其使用方法
MA46313A (fr) 2015-06-03 2021-04-28 Agbiome Inc Gènes pesticides et leurs procédés d'utilisation
MX2017017146A (es) * 2015-06-22 2018-02-23 Agbiome Inc Genes pesticidas y metodos de uso.
US10100330B2 (en) * 2015-07-30 2018-10-16 Monsanto Technology Llc Insect inhibitory proteins
WO2017112538A2 (en) 2015-12-22 2017-06-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US11781151B2 (en) 2016-04-14 2023-10-10 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal CRY1B variants having improved activity spectrum and uses thereof
CN109072249B (zh) 2016-04-19 2023-08-18 先锋国际良种公司 具有改善的活性谱的多肽的杀昆虫组合及其用途
MX2019002608A (es) 2016-09-06 2019-06-06 Agbiome Inc Genes pesticidas y metodos de uso.
CA3043493A1 (en) 2016-11-23 2018-05-31 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Axmi669 and axmi991 toxin genes and methods for their use
US10793610B2 (en) 2017-01-30 2020-10-06 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
BR112019021380A2 (pt) 2017-04-11 2020-05-05 Agbiome Inc genes pesticidas e métodos de uso
WO2018217333A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
US20190040411A1 (en) 2017-08-03 2019-02-07 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests
BR112020012477A2 (pt) 2017-12-19 2020-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. polipeptídeo recombinante; polipeptídeo inseticida recombinante; composição agrícola; construto de dna; célula hospedeira; planta transgênica; método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de inseto ou população de praga; método para controlar a infestação de praga; e método para melhorar o rendimento de uma cultura
US10907173B2 (en) 2017-12-22 2021-02-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2019204584A1 (en) 2018-04-20 2019-10-24 AgBiome, Inc. Pesticidal proteins and methods of use
WO2022115524A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
BR112023023044A2 (pt) 2021-05-06 2024-01-23 Agbiome Inc Genes pesticidas e métodos de uso
US20220387581A1 (en) 2021-06-03 2022-12-08 Mazen Animal Health Inc. Oral administration of coronavirus spike protein for altering cytokine levels and providing passive immunity to newborn pigs
CA3239251A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Rebekah Deter Kelly Pesticidal genes and methods of use
WO2024044596A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024129674A1 (en) 2022-12-13 2024-06-20 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024137438A2 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Insect toxin genes and methods for their use
WO2024137446A1 (en) 2022-12-19 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods of identifying and evaluating genes for insect control
WO2024137445A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods of identifying and evaluating genes for insect control

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3651215A (en) * 1968-08-12 1972-03-21 Juro Morita Bacterial mosouito larva-killing agent
US3632747A (en) * 1968-08-20 1972-01-04 Juro Morita Bacterial fly-larva-killing agent
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4886664A (en) 1982-06-18 1989-12-12 Rhone-Poulenc, S.A. Low-water-activity inocula for biological control
EP0192319B1 (en) 1985-01-22 1992-07-15 Mycogen Corporation Cellular encapsulation of biological pesticides
DE3541893A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-11 Basf Ag Verfahren zur herstellung sporenfreier, konzentrierter protein-praeparate von mueckentoxischem bacillus thuringiensis serovar. israelensis sowie mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens bzw. verfahren zur gewinnung des mikroorganismus
US5024837A (en) * 1987-05-06 1991-06-18 Donovan William P Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use
US4996155A (en) * 1988-03-04 1991-02-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
US5011685A (en) * 1988-04-06 1991-04-30 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Baculovirus proteins and viral pesticides containing same
GB8910624D0 (en) * 1989-05-09 1989-06-21 Ici Plc Bacterial strains
TR26973A (tr) * 1990-04-16 1994-09-12 Ecogen Inc Bacillus thuringiensis cryie geni ve lepidoptera takimindan böceklere karsi zehirli protein.
WO1991016432A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
GB9023735D0 (en) * 1990-11-01 1990-12-12 Ici Plc Bacterial strain
US5277905A (en) * 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
CA2059897A1 (en) * 1991-02-25 1992-08-26 Kenneth E. Narva Bacillus thuringiensis genes encoding novel coleopteran-active protein toxins
US5262158A (en) * 1991-04-30 1993-11-16 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarida
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5384924A (en) * 1992-08-03 1995-01-31 Mallinckrodt Medical, Inc. Warming blanket having multiple inlets
EP1471145A2 (en) * 1993-03-25 2004-10-27 Syngenta Participations AG Pesticipal proteins and strains
GB9324529D0 (en) * 1993-11-30 1994-01-19 Univ Singapore Biological control agents

Also Published As

Publication number Publication date
TR199501182A2 (tr) 1996-06-21
US5872212A (en) 1999-02-16
HUT77449A (hu) 1998-04-28
IL115382A (en) 2010-06-16
MX228013B (es) 2005-05-25
PT792363E (pt) 2004-05-31
IL115382A0 (en) 1995-12-31
US5889174A (en) 1999-03-30
RU2196824C2 (ru) 2003-01-20
CA2199049C (en) 2012-03-13
AU3743395A (en) 1996-04-19
SI0792363T2 (sl) 2013-01-31
DE69532333D1 (de) 2004-01-29
US5770696A (en) 1998-06-23
HU222264B1 (hu) 2003-05-28
BR9509099A (pt) 1997-09-30
EP1382611A2 (en) 2004-01-21
DE69532333T3 (de) 2013-03-14
EP1754789A3 (en) 2009-11-11
MX9702212A (es) 1997-06-28
EP0792363B1 (en) 2003-12-17
JPH10506532A (ja) 1998-06-30
CN1255539C (zh) 2006-05-10
PH12002000307B1 (en) 2004-01-21
AU692934B2 (en) 1998-06-18
US5866326A (en) 1999-02-02
PH11995051386B1 (en) 2002-09-18
KR100419438B1 (ko) 2004-07-05
US5849870A (en) 1998-12-15
SI0792363T1 (en) 2004-04-30
CA2199049A1 (en) 1996-04-04
IL146109A0 (en) 2002-07-25
DK0792363T4 (da) 2013-01-07
BG101384A (en) 1997-10-31
EP0792363A1 (en) 1997-09-03
EP1754789A2 (en) 2007-02-21
EP1382611A3 (en) 2004-03-31
CZ90897A3 (cs) 2000-02-16
DE69532333T2 (de) 2004-10-07
ES2213162T5 (es) 2013-02-12
ATE256743T1 (de) 2004-01-15
EP0792363B2 (en) 2012-09-26
CN1160420A (zh) 1997-09-24
CZ290801B6 (cs) 2002-10-16
WO1996010083A1 (en) 1996-04-04
US5840868A (en) 1998-11-24
US6066783A (en) 2000-05-23
US5990383A (en) 1999-11-23
US5888801A (en) 1999-03-30
ES2213162T3 (es) 2004-08-16
DK0792363T3 (da) 2004-04-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2213162T3 (es) Nuevas proteinas y cepas pesticidas.
RU2738424C2 (ru) Пестицидные гены и способы их применения
ES2235162T3 (es) Cepas y proteinas plaguicidas.
JP6731408B2 (ja) 新規の昆虫抑制タンパク質
CN105407709B (zh) 具有广谱活性的杀昆虫多肽及其用途
JPH09500275A (ja) バシルスチューリンゲンシス単離体及び毒素
KR20180091096A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
KR20190045293A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
RU2608500C2 (ru) Комбинированное применение vip3ab и cry1ab для регулирования устойчивых насекомых
RU2742467C2 (ru) Пестицидные гены и способы применения
KR20170101247A (ko) 살충 유전자 및 사용 방법
MX2011004154A (es) Proteinas derivadas de genes cry de bacillus thuringiensis.
TW496896B (en) An insect-specific protein or a protein enhancing the activity of an insect-specific protein, DNA molecule encoding same, and methods for producing sames