CZ90897A3 - Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují - Google Patents

Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují Download PDF

Info

Publication number
CZ90897A3
CZ90897A3 CZ1997908A CZ90897A CZ90897A3 CZ 90897 A3 CZ90897 A3 CZ 90897A3 CZ 1997908 A CZ1997908 A CZ 1997908A CZ 90897 A CZ90897 A CZ 90897A CZ 90897 A3 CZ90897 A3 CZ 90897A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
protein
seq
insect
bacillus
plant
Prior art date
Application number
CZ1997908A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ290801B6 (cs
Inventor
Gregory Wayne Warren
Michael Gene Koziel
Martha Alice Mullins
Gordon James Nye
Brian Carr
Nalini Manoj Desai
Kristy Kostichka
Nicholas Brendan Duck
Juan Jose Estruch
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26979445&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ90897(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ90897A3 publication Critical patent/CZ90897A3/cs
Publication of CZ290801B6 publication Critical patent/CZ290801B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C07K14/325—Bacillus thuringiensis crystal protein (delta-endotoxin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8285—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for nematode resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/075—Bacillus thuringiensis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/82—Proteins from microorganisms
    • Y10S530/825—Bacteria

Description

Oblast techniky
Vynález se týká způsobů a prostředků pro kontrolu škůdců rostlin a škůdců na jiných materiálech než rostlinách. Konkrétně jsou popsány nové pesticidní proteiny, které lze izolovat z bakterií rodu Bacillus ve stádiu vegetativního růstu. Popsány jsou kmeny rodu Bacillus, proteiny a geny, které tyto proteiny kódují. Způsoby a prostředky podle vynálezu lze použít v řadě systému pro kontrolu škůdců rostlin a škůdců na jiných materiálech než rostlinách.
Dosavadní stav techniky
Škůdci rostlin jsou hlavním faktorem způsobujícím ztráty světově komerčně významných zemědělských plodin. Používá se rozsáhlá řada chemických pesticidů pro kontrolu nebo hubení škůdců, kteří mají v zemědělství význam. Existuje' však velký zájem na vyvinutí účinných alternativních pesticidů.
Jako alternativy k chemické kontrole škůdců hrají významnou roli mikrobiální pesticidy. Nejrozsáhleji používaný mikrobiální produkt je založen na bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Bacillus thuringiensis je gram-pozitivním druhem rodu Bacillus vytvářejícím spory, který produkuje během sporulace insekticidní krystalický protein (ICP).
Je známá řada variet Bacillus thuringiensis, které produkují více než 25 různých, avšak podobných insekticidních krystalických proteinů. Většina insekticidních krystalických proteinů produkovaných Bacillus thuringiensis je toxická pro larvy některých druhů hmyzu z řádů Lepidoptera (motýli), Diptera (dvoukřídlí) a Coleoptera (brouci). Obecně se v případě, že je insekticidní krystalický protein pozřen citlivým hmyzem, krystal solubilizuje a je přeměněn na toxický zbytek proteasami ve střevě hmyzu. Žádný z insekticidních krystalických proteinů účinných proti larvám brouků, jako je mandelinka bramborová (Leptinotarsa decemlineata) nebo potemník moučný (Tenebrio molitor), nevykazoval podstatné účinky na členy rodu Diabrotica, zejména na Diabrotica virgifera virgifera nebo Diabrotica longicornis barberi.
Bacillus cereus (Bc) je blízce příbuzný Bacillus thuringiensis. Hlavním odlišným znakem mezi těmito druhy je nepřítomnost parasporálního krystalu u Bacillus cereus. Bacillus cereus je široce rozšířenou bakterií, která se běžně nachází v půdě a byla izolována z řady potravin a léčiv. Tento organismus se podílí na kažení potravin.
Ačkoli je Bacillus thuringiensis velmi užitečný při kontrole hmyzích škůdců, existuje potřeba rozšířit počet potenciálních biologických kontrolních činidel.
Podstata vynálezu
Vynález popisuje prostředky a způsoby pro kontrolu škůdců rostlin. Popisují se zejména nové pesticidní proteiny, které jsou produkovány během vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus. Tyto proteiny jsou vhodné jako pesticidní činidla.
Konkrétněji se vynález týká v podstatě purifikovaného kmene rodu Bacillus, který produkuje v průběhu vegetativního růstu pesticidní protein, přičemž uvedeným kmenem rodu Bacillus není Bacillus sphaericus SSII-1. Výhodný je kmen Bacillus cereus s přírůstkovým číslem č. NRRL B-21058 a kmen Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem č. NRRL B-21060. Výhodné jsou rovněž kmeny rodu Bacillus vybrané ze skupiny zarhnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228,
NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.
Vynález se dále týká pro hmyz specifického proteinu, izolovatelného z Bacillus spp., výhodně však z kmene Bacillus thuringiensis nebo Bacillus cereus, během fáze vegetativního růstu, a jeho složek, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. Pro hmyz specifický protein podle vynálezu je výhodně toxický pro hmyz z řádů Coleoptera (brouci) nebo Lepidoptera (motýli) a má molekulovou hmotnost přibližně 30 kDa nebo větší, výhodně přibližně 60 až přibližně 100 kDa a ještě výhodněji přibližně 80 kDa.
Pro hmyz specifický protein podle vynálezu vykazuje zejména spektrum insekticidní účinnosti, které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
Pro hmyz specifický protein podle vynálezu lze výhodně izolovat například z kmene Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058 nebo z kmene Bacillus thuringiensis s přírůstkovým číslem NRRL B-21060.
Pro hmyz specifický protein podle vynálezu lze rovněž výhodně izolovat z kmene Bacillus spp vybraného ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.
Vynález zejména zahrnuje pro hmyz specifické proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 5 a SEQ ID č. 7, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dále jsou výhodné pro hmyz specifické proteiny, které mají sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID
č. 20, SEQ ID č. 21, SEQ ID č. 29, SEQ ID č. 32 a SEQ ID č.
2, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Zejména výhodné jsou pro hmyz specifické proteiny, které mají sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 29 a SEQ ID č. 32, včetně všech proteinů, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dalším výhodným provedením vynálezu je pro hmyz specifický protein podle vynálezu, ze kterého byly odstraněny nebo ve kterém byly inaktivovány sekvence představující sekreční signál.
Vynález dále zahrnuje pomocné proteiny, které zvyšují pro hmyz specifickou účinnost pro hmyz specifického proteinu. Uvedené pomocné proteiny mají výhodně molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa a lze je izolovat například z kmene Bacillus cereus, zejména však z kmene Bacillus cereus AB78, ve fázi vegetativního růstu.
Výhodné provedení vynálezu se týká pomocného proteinu, ze kterého byly odstraněny nebo ve kterém byly inaktivovány sekvence představující sekreční signál.
Vynález se dále týká pesticidních proteinů z více jednotek (multimerních pesticidních proteinů), které obsahují více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Multimerní pesticidní proteiny podle vynálezu mají výhodně molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa až přibližně 200 kDa.
Vynález zejména zahrnuje multimerní pesticidní proteiny, které obsahují pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Vynález se dále týká fúzních proteinů, které obsahují několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu, vytvořených genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.
Konkrétní provedení vynálezu se týká fúzního proteinu, který obsahuje ribonukleasový S-protein, pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu.
Další konkrétní provedení vynálezu se týká fúzního proteinu, který obsahuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, kterýžto uvedený fúzní protein má na svém N-konci buď tento pro hmyz specifický protein nebo tento pomocný protein.
Výhodný je fúzní protein, který obsahuje pro hmyz specifický protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 5 a pomocný protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 2, přičemž vzniká protein uvedený v sekvenci SEQ ID č. 23, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologické.
Výhodný je rovněž fúzní protein, který obsahuje pro hmyz specifický protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 35 a pomocný protein jak je uveden v sekvenci SEQ ID č. 27, přičemž vzniká protein uvedený v sekvenci SEQ ID č. 50, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologickě.
Vynález se dále týká fúzních proteinů, které obsahují pro hmyz specifický protein podle vynálezu nebo/a pomocný protein podle vynálezu fúzovaný k signální sekvenci, výhodně sekreční signální sekvenci nebo sekvenci způsobující cílení (targeting sequence), která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky, kterážto signální sekvence je heterologního původu vzhledem k proteinu, ke kterému je fúzována.
Zejména výhodný je v rámci vynálezu fúzní protein, který má sekvenci uvedenou v sekvenci SEQ ID č. 43 nebo SEQ ID č. 46, včetně všech proteinů, které jsou s ním strukturně nebo/a funkčně homologickě.
Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi aminokyselin. Podstatně homologickě proteiny mohou být například homologickě ze 4 0 %, výhodně z 50 % a nejvýhodněji homologické z 60 % nebo 80 % nebo více. Homologickě jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí aminokyselin nebo jsou do nich vloženy subsekvence dalších aminokyselin.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1. Zejména se vynález týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, kde spektrum insekticidní účinnosti zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 4 nebo SEQ ID č. 6, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Výhodné jsou rovněž molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 1, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódujíc! pomocný protein podle vynálezu, který zvyšuje pro hmyz specifickou účinnost pro hmyz specifického proteinu.
Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto nukleotidová sekvence byla optimalizována pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
Výhodné jsou molekuly DNA, které obsahuji nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 17 nebo SEQ ID č. 18, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Výhodné jsou rovněž molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 27 nebo SEQ ID č. 30, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující multimerní pesticidní protein, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický protein podle vynálezu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Výhodně jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1 nebo SEQ ID č. 19, včetně všech nukleotidových sekvencí, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Dalším provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující několik proteinových domén včetně alespoň jednoho pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu, vytvořenou genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze které se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu nebo/a pomocného proteinu podle vynálezu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.
Výhodným provedením vynálezu jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu a pomocný protein podle vynálezu, přičemž uvedený fúzní protein má na svém N-konci bud' tento pro hmyz specifický protein nebo tento pomocný protein. Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Vynález se dále týká molekul DNA, které obsahují nuk1eotidovou sekvenci kódující fúzní protein obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu nebo/a pomocný protein podle vynálezu fúzovaný k signální sekvenci, výhodně sekreční signální sekvenci nebo sekvenci způsobující cílení (targeting sequence), která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky, kterážto signální sekvence je heterologního původu vzhledem k DNA, ke které je fúzována.
Vynález dále zahrnuje molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující fúzní protein nebo multimerní protein podle vynálezu, které byly optimalizované pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
Výhodné jsou optimalizované molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 42, SEQ ID č. 45 nebo SEQ ID č. 49, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Vynález se dále týká optimalizovaných molekul DNA, z jejichž 5'-konce byly odstraněny sekvence kódující sekreční signál, zejména však optimalizovaných molekul DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 35 nebo SEQ ID č. 39, včetně všech molekul DNA, které jsou s nimi strukturně nebo/a funkčně homologické.
Jak je tento termín používán v této přihlášce, označuje podstatná sekvenční homologie blízkou strukturní podobnost mezi sekvencemi nukleotidů. Podstatně homologické molekuly DNA mohou být například homologické ze 60 %, výhodně z 80 % a nejvýhodněji homologické z 90 % nebo 95 % nebo více. Homologické jsou rovněž podobné sekvence, ve kterých chybí jedna nebo několik subsekvencí nukleotidů nebo aminokyselin nebo jsou do nich vloženy subsekvence dalších nukleotidů nebo aminokyselin.
Vynález rovněž zahrnuje molekuly DNA, které hybridizují s molekulami DNA podle vynálezu, jak jsou definovány výše, výhodně však s oligonukleotidovou sondou, kterou lze získat z uvedených molekul DNA, která obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů, za mírně přísných podmínek, a kteréžto molekuly vykazují pro hmyz specifickou účinnost a rovněž jsou jimi kódovány pro hmyz specifické proteiny.
Výhodné jsou molekuly DNA, u kterých dochází k hybridizací při teplotě 65 °C v pufru obsahujícím 7 % SDS (dodecylsulfátu sodného) a fosforečnan sodný v 0,5M koncentraci.
Zejména výhodné jsou molekuly DNA, které obsahují nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein podle vynálezu, které lze získat způsobem který zahrnuje:
(a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizací uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou popsanou níže, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30 nebo SEQ ID č. 31, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
Vynález se dále týká pro hmyz specifických proteinů, které jsou kódovány molekulami DNA podle vynálezu.
Vynález rovněž zahrnuje expresívní kazetu, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu operabilně spojenou s expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, výhodně mikroorganismu nebo rostlině, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
Vynález se dále týká vektorové molekuly obsahující expresívní kazetu podle vynálezu.
Expresívní kazeta nebo/a vektorová molekula podle vynálezu výhodně tvoří součást genomu rostliny.
Dalším provedením vynálezu je hostitelský organismus, výhodně organismus vybraný ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresívní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresívní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně však rostliny kukuřice, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu, expresívní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresívní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
Výhodná je transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která byla stabilně transformována molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.
Výhodná je rovněž transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález se dále týká transgenické rostliny, výhodně rostliny kukuřice, podle vynálezu, jak je definována výše, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, výhodně však δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis. Uvedenou rostlinou je výhodně hybridní rostlina.
V rámci rozsahu vynálezu se rozumí, že mezi části transgenických rostlin patři například rostlinné buňky, protoplasty, tkáně, kalus, embrya jakož i květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných molekulou DNA podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň z části tvořeny transgenickými buňkami. Tyto části jsou rovněž předmětem vynálezu.
Vynález se dále týká rostlinného propagačního materiálu rostlin podle vynálezu, který je ošetřen obalem chránícím semena.
Vynález dále zahrnuje mikroorganismus transformovaný molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu, přičemž je tímto mikroorganismem výhodně mikroorganismus, který se množí na rostlinách a výhodněji bakterie kolonizující kořeny.
Vynález se dále týká enkapsulovaného pro hmyz specifického proteinu. Toto provedení zahrnuje mikroorganismus obsahující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález se rovněž týká insekticidního prostředku obsahujícího hostitelský organismus podle vynálezu, výhodně však purifikovaný kmen rodu Bacillus, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
Vynález dále zahrnuje insekticidní prostředek obsahující izolovanou molekulu proteinu podle vynálezu, samotnou nebo v kombinaci s hostitelským organismem podle vynálezu nebo/a enkapsulovaný pro hmyz specifický protein podle vynálezu, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
Vynález se dále týká způsobu získání purifikovaného pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje nanesení roztoku obsahujícího uvedený pro hmyz specifický protein na NAD-kolonu a eluci navázaného proteinu .
Vynález zahrnuje rovněž způsob identifikace účinnosti pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu na hmyz, kterýžto způsob zahrnuje:
pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supernatantu z uvedené kultury, poskytnutí potravy s uvedeným supernatantem larvám hmyzu, a vyhodnocení mortality.
Dalším provedením vynálezu je způsob izolace pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuj e:
pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, získání supernatantu z uvedené kultury, a izolaci uvedeného pro hmyz specifického proteinu z uvedeného supernatantu.
Vynález rovněž zahrnuje způsob izolace molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein vykazující insekticidní účinnost proteinů podle vynálezu, kterýžto způsob zahrnuje:
získáni molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, hybridizaci uvedené molekuly DNA s DNA získanou z druhu rodu
Bacillus, a izolaci uvedené hybridizované DNA.
Vynález se dále týká způsobu zvýšení rozsahu cílového hmyzu použitím pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu v kombinaci s alespoň jedním dalším insekticidním proteinem, který se liší od tohoto pro hmyz specifického proteinu podle vynálezu, výhodně však s insekticidním proteinem vybraným ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacilus thuringiensis, inhibitory proteas, lektiny, α-amylasy a peroxidasy.
Vynález rovněž zahrnuje způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně však druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem vybraným ze skupiny zahrnující Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, při kterém se aplikuje na rostlinu nebo na plochu, na které tato rostlina roste, insekticidní prostředek nebo toxinový protein podle vynálezu.
Vynález se dále týká způsobu ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, výhodně však druhem rodu Spodoptera nebo/a Agrotis, a výhodněji hmyzím škůdcem vybraným ze skupiny zahrnující Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea, který spočívá v tom, že se v oblasti, kde se může vyskytnout uvedený hmyzí škůdce, pěstuje transgenická rostlina exprimující pro hmyz specifický protein podle vynálezu.
Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření hostitelského organismu, který obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do svého genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedený hostitelský organismus transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.
Vynález se dále týká způsobu vytvoření transgenické rostliny nebo rostlinné buňky, která obsahuje molekulu DNA podle vynálezu stabilně integrovanou do rostlinného genomu a výhodně exprimuje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedená rostlina respektive rostlinná buňka transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresívní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresívní kazetu.
Vynález se rovněž týká způsobu přípravy insekticidního prostředku, který spočívá v tom, že se smíchá izolovaný kmen rodu Bacillus nebo/a hostitelský organismus nebo/a izolovaná molekula proteinu nebo/a enkapsulovaný protein podle vynálezu v insekticidně účinném množství s vhodným nosičem.
Vynález rovněž zahrnuje způsob vytvoření transgenického potomstva transgenické rodičovské rostliny, které obsahuje, stabilně začleněnou do rostlinného genomu, molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pro hmyz specifický protein podle vynálezu, který spočívá v tom, že se uvedená rodičovská rostlina transformuje molekulou DNA podle vynálezu, expresivní kazetou obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulou obsahující uvedenou expresivní kazetu a pesticidní znak se přenese na potomstvo uvedené transgenické rodičovské rostliny za použití známých postupů množení rostlin.
Vynález rovněž zahrnuje oligonukleotidovou sondu schopnou specificky hybridizovat s nukleotidovou sekvencí kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, kterážto sonda obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů, a použití uvedené oligonukleotidové sondy pro screening libovolného kmene rodu Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen pro hmyz specifický protein nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje tento gen.
Podle vynálezu bylo zjištěno, že v průběhu vegetativního růstu kmenů rodu Bacillus jsou produkovány pesticidní proteiny. Vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že existuje takováto skupina proteinů, zahrnuje vynález všechny vegetativní insekticidní proteiny, dále označované VIP, s výjimkou toxinu usmrcujíciho komáry z Bacillus sphaericus.
Vegetativní insekticidní proteiny podle vynálezu nejsou přítomné ve velkém množství po sporulaci a jsou zejména exprimovány během logaritmické fáze růstu před stacionární fází. Pro účely vynálezu je vegetativní růst definován jako období před nastoupením sporulace. Geny kódující takové vegetativní insekticidní proteiny lze izolovat, klonovat a transformovat do různých nosičů pro použití v programech pro kontrolu škůdců.
Pro účely vynálezu mezi škůdce patří hmyz, houby, bakterie, háďátka, roztoči, klíštzata, patogenní prvoci, motolice parazitující na zvířatech a podobně, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet. Mezi hmyzí škůdce patří hmyz vybraný z řádů Coleoptera (brouci), Diptera (dvoukřídlí), Hymenoptera (blanokřídlí), Lepidoptera (motýli), Mallophaga (všenky), Homoptera (stejnokřídlí), Hemiptera, Orthroptera (rovnokřídlí) , Thysanoptera (třásnokřídlí) , Dermaptera (škvoři), Isoptera (všekazi), Anoplura (vši), Siphonaptera,
Trichoptera (chrostíci) Lepidoptera (motýli).
atd., zejména Coleoptera (brouci)
Tabulky 1 až 10 uvádějí seznam škůdců na hlavních plodinách a škůdců s lékařským a veterinárním významem. Tito škůdci patří do rozsahu vynálezu.
Tabulka 1
Lepidoptera (motýli a můry)
Kukuřice
Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon Helicoverpa zea Spodoptera frugiperda Diatraea grandiosella
- 17 Pokračování Tabulky 1
Kukuřice
Elasmopalpus lignosellus Diatraea saccharalis
Čirok
Chilo partellus Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea Elasmopalpus lignosellus Feltia subterranea
Pšenice
Pseudaletia unipunctata Spodoptera frugiperda Elasmopalpus lignosellus Agrotis orthogonia Elasmopalpus lignosellus
Slunečnice
Suleima helianthana Homoeosoma electellum
Bavlník
Heliothis virescens Helicoverpa zea Spodoptera exigua Pectinophora gossypiella
Rýže
Diatraea saccharalis Spodoptera frugiperda Helicoverpa zea
Sój a
Pseudoplusia includens Anticarsia gemmatalis Plathypena scabra
Pokračování Tabulky 1
Sója
Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon Spodoptera exigua Heliothis virescens Helicoverpa zea
Ječmen
Ostrinia nubilalis Agrotis ipsilon
Tabulka 2
Coleoptera (brouci)
Kukuřice
Diabrotica virgifera virgifera Diabrotica longicornis barberi Diabrotica undecimpunctata howardi Melanotus spp.
Cyclocephala borealis Cyclocephala immaculata Popilia japonica Chaetocnema pulicaria Sphenophorus maidis
Čirok
Phyllophaga crinita
Eleodes, Conoderus a Aeolus spp.
Oulema melanopus
Chaetocnema pulicaria Sphenophorus maidis
Pšenice
Oulema melanopus Hypera punctata
Pokračování Tabulky 2
Pšenice
Diabrotica undecimpunctata howardi
Slunečnice
Zygogramma exclamationis Bothyrus gibbosus
Bavlník
Anthonomus grandis
Rýže
Colaspis brunnea Lissorhoptrus oryzophiius Sitophilus oryzae
Sój a
Epilachna varivestis
Tabulka 3
Homoptera (melice, mšice apod.)
Kukuřice
Rhopalosiphum maidis Anuraphis maidiradicis
Čirok
Rhopalosiphum maidis Sipha flava
Pšenice
Diuraphis noxia Schizaphis graminum Macrosiphum avenae
Bavlník
Aphis gossypii Pseudatomoscelis seriatus
Pokračování Tabulky 3
Bavlník
Trialeurodes abutilonea
Rýže
Nephotettis nigropictus
Sój a
Myzus persicae Empoasca fabae
Ječmen
Schizaphis graminum
Řepka olejka
Brevicoryne brassicae
Tabulka 4
Hemiptera (ploštice)
Kukuřice
Blissus leucopterus leucopterus
Čirok
Blissus leucopterus leucopterus
Bavlník
Lygus lineolaris
Rýže
Blissus leucopterus leucopterus Acrosternum hilare
Sój a
Acrosternum hilare
Ječmen
Blissus leucopterus leucopterus Acrosternum hilare
Pokračování Tabulky 4
Ječmen
Euschistus servus
Tabulka 5
Orthoptera (kobylky, cvrčci a švábi)
Kukuřice
Melanoplus
Melanoplus
Pšenice
Melanoplus
Melanoplus
Melanoplus
Bavlník
Melanoplus
Melanoplus
Sója
Melanoplus
Melanoplus femurrubrum sanguinipes femurrubrum differentialis sanguinipes femurrubrum differentialis femurrubrum differentialis
Stavby a domácnosti
Periplaneta americana Blattella germanica Blatta orientalis
Tabulka 6
Diptera (mouchy a komáři)
Kukuřice
Hylemya platura Agromyza parvicornis
Pokračování Tabulky 6
Čirok
Contarinia sorghicola
Pšenice
Mayetiola destructor Sitodiplosis mosellana Meromyza americana Hylemya coarctata
Slunečnice
Neolasioptera murtfeldtiana
Só j a
Hylemya platura
Ječmen
Hylemya platura Mayetiola destructor
Hmyz napadající člověka a zvířata a přenašeči nemocí Aedes aegypti Aedes albopictus Phlebotomus papatasii Musea domestica Tabanus atratus Cochliomyia hominivorax
Tabulka 7
Thysanoptera (třásněnky)
Kukuřice
Anaphothrips obscurus
Pšenice
Frankliniella fusca
Pokračování Tabulky 7
Bavlník
Thrips tabaci Frankliniella fusca
Sój a
Sericothrips variabilis Thrips tabaci
Tabulka 8
Hymenoptera (pilatky, mravenci, vosy atd
Kukuřice
Solenopsis milesta
Pšenice
Cephus cinctus
Tabulka 9
Další řády a reprezentativní druhy
Dermatoptera (škvoři)
Forficula auricularia
Isoptera (termiti)
Reticulitermes flavipes
Mallophaga (všenky)
Cuclotogaster heterographa Bovicola bovis
Anoplura (vši)
Pediculus humanus
Siphonaptera (blechy)
Ctenocephalides felis
Tabulka 10
Acari (roztoči a kliščata)
Kukuřice
Tetranychus urticae
Čirok
Tetranychus cinnabarinus Tetranychus urticae
Pšenice
Aceria tulipae
Bavlník
Tetranychus
Tetranychus cinnabarinus urticae
Só j a
Tetranychus
Tetranychus turkestani urticae
Ječmen
Petrobia latens
Důležití roztoči škodící člověku a zvířatům
Demacentor variabilis
Argas persicus
Dermatophagoides farinae
Dermatophagoides pteronyssinus
Nyní, když bylo zjištěno, že lze izolovat pesticidní proteiny z druhů rodu Bacillus ve fázi vegetativního růstu, lze za použiti standardních postupů izolovat jiné kmeny a testovat jejich účinnost proti konkrétním škůdcům rostlin a škůdcům na jiných materiálech než rostlinách. Obecně lze kmeny rodu Bacillus izolovat ze vzorku libovolného materiálu, ve kterém žijí, včetně půdy, rostlin, hmyzu, prachu ze zrnového dopravníku, a vzorků jiných materiálů, za použití způsobů známých v oboru, viz například Travers a kol. (1987)
Appl. Environ. Microbiol. 53 : 1263 1266; Saleh a kol.
(1969) Can J. Microbiol. 15 : 1101 - 1104; DeLucca a kol.
(1981) Can J. Microbiol. 27 : 865 - 870; a Norris a kol.
(1981) The genera Bacillus and Sporolactobacillus v Starr a
kol. (editoři), The Prokaryotes: A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria, svazek II, Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Po izolaci je možné u kmenů testovat pesticidní účinnost v průběhu vegetativního růstu. Tímto způsobem lze identifikovat nové pesticidní proteiny a kmeny.
Mezi mikroorganismy rodu Bacillus, které nacházejí uplatnění ve vynálezu, patří Bacillus cereus a Bacillus thuringiensis, jakož i druhy rodu Bacillus uvedené v tabulce 11.
Tabulka 11
Seznam druhů rodu Bacillus
Morfologická skupina 1 B. megaterium B. cereus*
B. cereus var. mycoides B. thuringiensis*
B. licheniformis B. subtilis*
B. pumilus B. firmus*
B. coagulans
Morfologická skupina 2 B. polymyxa B. macerans
B. circulans
Pokračováni Tabulky 11
Morfologická skupina 2
B. stearothermophilus B. alvei*
B. laterosporus*
B. brevis B. pulvifaciens B. popilliae*
B. lentimorbus*
B. larvae*
Morfologická skupina 3 B. sphaericus*
B. pasteurii
Nezařazené kmeny
Podskupina A
B. apiarus*
B. filicolonicus B. thiaminolyticus B. alcalophilus
Podskupina B
B. cirroflagellosus B. chitinosporus B. lentus
Podskupina C
B. badius
B. aneurinolyticus
B. macroides
B. freundenreichii
Podskupina D
B. pantothenticus B. epiphytus
Pokračování Tabulky 11
Podskupina El
B. aminovorans
B. globisporus
B. insolitus
B. psychrophilus
Podskupina E2
B. psychrosaccharolyticus
B. macquariensis
Legenda k tabulce 11:
* o těchto kmenech rodu Bacillus bylo dříve zjištěno, že souvisí s hmyzem
Rozdělení do skupin je provedeno podle práce Parry, J. M. a kol. (1983) Color Atlas of Bacillus species, Wolfe Medical Publications, Londýn
Podle vynálezu lze z druhů rodu Bacillus izolovat pesticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Podle jednoho provedení lze izolovat insekticidní proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu. Způsoby izolace proteinů jsou v oboru známé. Obecně lze proteiny purifikovat pomocí běžných chromatografiekých postupů, včetně gelové filtrace, iontové výměny a imunoafinitní chromatografie, pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie, jako je vysoceúčinná kapalinová chromatografie s obrácenými fázemi, vysoceúčinná kapalinová chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací vysoceúčinná kapalinová chromatografie, vysoceúčinný chromatofokusing a hydrofobní interakční chromatografie atd., pomocí elektroforetického rozdělení, jako je jednorozměrná gelová elektroforéza, dvourozměrná gelová elektroforéza atd. Tyto způsoby jsou známé v oboru, viz například Current Protocols in Molecular Biology, svazky a 2, Ausubel a kol. (editoři) , John Wiley and Sons, New York (1988). Dále lze připravit protilátky proti v podstatě čistým připraveným proteinům, viz například Radka a kol. (1983) J. Immunol. 128: 2804, a Radka a kol. (1984) Immunogenetics 19: 63. Pro purifikací proteinu vykazujícího pesticidní vlastnosti lze použít libovolnou kombinaci způsobů. Při vytváření postupu se po každém purifikačním stupni stanovuje pesticidní účinnost.
Těmito purifikačními stupni se získá v podstatě purifikovaná proteinová frakce. Termín v podstatě purifikovaný nebo v podstatě čistý označuje protein, který v podstatě neobsahuje žádnou sloučeninu normálně doprovázející protein v jeho přírodním stavu. Skutečnost, že je připravený protein v podstatě čistý lze stanovit z nepřítomnosti jiných detekovatelných proteinových pásů po elektroforéze v SDS-polyakrylamidovém gelu, což se určí vizuálně nebo denzitometricky. Alternativně může být stupeň čistoty indikován nepřítomností jiných amino-koncových sekvencí nebo N-koncových zbytků v purifikované látce. Čistotu lze ověřit novou chromatografií čistých proteinů, kterou se zjistí nepřítomnost jiných píků při iontoměničové elektroforéze, elektroforéze s obrácenými fázemi nebo kapilární elektroforéze. Termíny v podstatě čistý nebo v podstatě purifikovaný nejsou míněny tak, že by vylučovaly umělé nebo syntetické směsi proteinů s jinými sloučeninami. Tyto termíny rovněž nejsou míněny tak, že by vylučovaly přítomnost malého množství nečistot, které nejsou na překážku biologické účinnosti proteinu, a které mohou být přítomny například v důsledku neúplné purifikace.
Jakmile je izolován purifikovaný protein, je možné tento protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, charakterizovat a sekvenovat pomocí standardních způsobů známých v oboru. Purifikovaný protein, nebo polypeptidy, které jej tvoří, lze například fragmentovat pomocí bromkyanu, nebo proteasami jako je papain, chymotrypsin, trypsin, lysyl-C-endopeptidasa atd. (Oike a kol. (1982) J. Biol. Chem. 257: 9751 - 9758, Liu a kol. (1983) Int. J. Pept. Protein Res. 21: 209 - 215) . Výsledné peptidy se oddělí, výhodně pomocí vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), nebo roztavením gelů a elektroblotováním na póly(vinylidenfluoridové) membrány (PVDF-membrány), a podrobí se sekvenování aminokyselin, při kterém se peptidy výhodně analyzují pomocí automatických sekvenátorů. Lze stanovit N-koncové, C-koncové nebo vnitřní aminokyselinové sekvence. Z aminokyselinové sekvence purifikovaného proteinu lze syntetizovat nukleotidovou sekvenci, kterou lze použít jako sondu při izolaci genu kódujícího pesticidní protein.
Pesticidní proteiny mohou být oligomerní a lišit se v molekulové hmotnosti, počtu protomerů, peptidech které je tvoří, účinnosti proti konkrétním škůdcům a dalších vlastnostech. Pomocí zde popsaných způsobů lze však izolovat a charakterizovat proteiny účinné proti řadě škůdců.
Jakmile je purifikovaný protein izolován a charakterizován, je možno jej měnit různými způsoby, včetně substitucí, delecí, zkracování a inzercí aminokyselin. Způsoby takových manipulací jsou obecně známé v oboru. Například lze připravit obměny pesticidních proteinů v aminokyselinově sekvenci pomocí mutací DNA. Takové obměny (varianty) vykazují požadovanou pesticidní účinnost. Mutace prováděné v DNA kódující variantu samozřejmě nesmí umístit sekvenci mimo čtecí rámec a výhodně nevytvářejí komplementární oblasti, které by mohly produkovat sekundární strukturu mRNA, viz evropská patentová přihláška zveřejněná pod číslem 75 444.
Vynález tedy zahrnuje pesticidní proteiny, jakož i jejich složky a fragmenty. Mohou být tedy vytvořeny složkové protomery, polypeptidy nebo fragmenty proteinů, které si zachovávají pesticidní účinnost. Mezi tyto fragmenty patří zkrácené sekvence, jakož i N-koncové, C-koncové, vnitřní a vnitřně deletované aminokyselinové sekvence proteinů.
Očekává se, že většina delecí, inzercí a substitucí sekvence proteinů nezpůsobuje zásadní změny v charakteristice pesticidního proteinu. Pokud je však složité předvídat přesný vliv substituce, delece nebo inzerce před jejím provedením, je odborníkovi známé, že se vliv vyhodnotí pomocí běžných vyhledávacích testů.
Proteiny nebo jiné složkové polypeptidy, jak jsou zde popsány, lze použít samotné nebo v kombinaci. To znamená, že je možné použít několik proteinů pro kontrolu různých hmyzích škůdců.
Některé proteiny jsou tvořeny jediným polypeptidovým řetězcem, zatímco mnohé proteiny jsou tvořeny více než jedním polypeptidovým řetězcem, jsou tedy oligomerní. Kromě toho jsou některé vegetativní insekticidní proteiny (VIP) pesticidně účinné jako oligomery. V těchto případech se používají další protomery pro zvýšení pesticidní účinnosti nebo aktivaci pesticidních proteinů. Ty protomery, které se používají pro zvýšení nebo aktivaci, jsou označovány jako pomocné proteiny. Pomocné proteiny aktivují nebo zvyšují účinnost pesticidního proteinu pomocí interakce s pesticidním proteinem za vzniku oligomerního proteinu se zvýšenou pesticidní účinností ve srovnání s účinností pozorovanou za nepřítomnosti pomocného proteinu.
Pomocné proteiny aktivují nebo zvyšují účinnost pesticidních proteinů jako je protein VIP 1 z AB78. Jako příklad takových pomocných proteinů lze uvést, aniž by se však na něj vynález jakkoli omezoval, protein VIP2 z AB78. Jak je demonstrováno v příkladech provedení vynálezu, mohou pomocné proteiny aktivovat řadu pesticidních proteinů. Podle jednoho provedení vynálezu lze tedy rodičovskou rostlinu 1 transformovat pomocným proteinem. Tuto rodičovskou rostlinu 1 lze křížit s řadou rodičovských rostlin 2 transformovaných jedním nebo několika pesticidními proteiny, jejichž pesticidní účinnosti jsou aktivovány uvedeným pomocným proteinem.
V rámci rozsahu vynálezu lze mezi pesticidními proteiny podle vynálezu překvapivě identifikovat novou skupinu proteinů specifických pro hmyz. Tyto proteiny, které jsou označovány v tomto textu jako VIP3, lze získat z kmenů Bacillus spp, avšak výhodně z kmenů Bacillus thuringiensis a nejvýhodněji z kmenů Bacillus thuringiensis AB88 a AB424. Tyto uvedené vegetativní insekticidní proteiny jsou přítomné hlavně v supernatantech kultur rodu Bacillus, přičemž tvoří alespoň 75 % z celkového množství v případě kmene AB88. Proteiny VIP3 se dále vyznačují svým ojedinělým spektrem insekticidní účinnosti, která zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, avšak zejména proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
Agrotis ipsilon je agronomicky významným druhem hmyzu, který je značně rezistentní vůči δ-endotoxinům. Macintosh a kol. (1990), J. Invertebr. Pahtol. 56, 258 - 266, uvádějí, že δ-endotoxiny CrylA(b) a CrylA(c) vykazují insekticidní vlastnosti vůči Agrotis ipsilon s hodnotami LCS0 více než 80 μ$ respektive 18 μ$ / ml potravy. Pomocí insekticidních proteinů vip3A podle vynálezu se dosáhne více než 50% mortality při přidání proteinu v množství, které je alespoň desetkrát až pětsetkrát, výhodně padesátkrát až třistapadesátkrát a nejvýhodněji dvěstěkrát až třistakrát nižší než množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality. Zejména výhodné v rámci vynálezu jsou insekticidní proteiny vip3A, kterými se dosáhne 100% mortality při přidání proteinu v množství alespoň dvěstěšedesátkrát nižším než je množství proteinů CrylA nutné pro dosažení právě 50% mortality.
Insekticidní proteiny vip3 podle vynálezu jsou přítomné hlavně v supernatantech kultur a je tudíž potřeba klasifikovat je jako sekretované proteiny. Výhodně obsahují v
N-koncové sekvenci řadu kladně nabitých zbytků následovaných hydrofobní základní oblastí a nejsou v průběhu exportu upravovány na N-konci.
Stejně jako jiné pesticidní proteiny spadající do rozsahu vynálezu lze proteiny VIP3 detekovat v růstových stádiích před sporulací, což představuje další jasnou odlišnost od jiných proteinů, které patří do skupiny δ-endotoxinů. Výhodně začíná exprese proteinu specifického pro hmyz v průběhu střední logaritmické fáze (mid-log fáze) a pokračuje během sporulace. V důsledku specifického typu exprese v kombinaci s vysokou stabilitou proteinů VIP3 lze v supernatantech sporulujících kultur nalézt velká množství proteinů VIP3. Zejména výhodné jsou proteiny VIP3 uvedené v sekvencích SEQ ID č. 23 a SEQ ID č. 32 a odpovídající molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny, avšak zejména ty molekuly DNA, které obsahují nukleotidové sekvence uvedené v sekvencích SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30 a SEQ ID č. 31.
Pesticidní proteiny podle vynálezu lze použít v kombinaci s endotoxiny Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními proteiny pro zvýšení rozsahu cílového hmyzu. Dále má použití vegetativních insekticidních proteinů podle vynálezu v kombinaci s δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis nebo jinými insekticidními látkami odlišné povahy výrazný význam pro prevenci nebo/a řízení rezistence hmyzu. Mezi jiné insekticidní látky patří inhibitory proteas (jak serinového tak cysteinového typu, lektiny, cc-amylasy a peroxidasy. Podle jednoho výhodného provedení je exprese vegetativních insekticidních proteinů v transgenické rostlině doprovázena expresí jednoho nebo několika δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Této společné exprese (koexprese) více než jedné insekticidní látky v jediné transgenické rostlině lze dosáhnout modifikací rostliny pomocí genetického inženýrství tak, že obsahuje a exprimuje všechny nutné geny. Alternativně lze rodičovskou rostlinu 1 geneticky modifikovat tak, že exprimuje vegetativní insekticidní proteiny a druhou rostlinu, rodičovskou rostlinu 2 geneticky modifikova tak, že exprimuje δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis. Křížením rodičovské rostliny 1 s rodičovskou rostlinou 2 se získají dceřinné rostliny (potomstvo), které exprimují všechny geny introdukované do rodičovských rostlin 1 a 2. Zejména výhodnými δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis jsou látky popsané v EP-A 0618976.
Podstatná část cytotoxických proteinů, ačkoli ne všechny, působí binárně. Binární toxiny jsou typicky tvořeny dvěma proteinovými doménami, z nichž se jedna označuje jako doména A a druhá jako doména B (viz Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, J. E. Alouf a J. H. Freer, editoři, (1991) Academie Press). Doména A vykazuje silnou cytotoxickou účinnost. Doména B se váže na receptor na vnějším povrchu buňky před přenesením dovnitř buňky (internalizaci). Typicky musí být cytotoxická doména A převáděna do cytoplazmy pomocí translokační domény. Často jsou doména A a doména B oddělenými polypeptidy nebo protomery, které jsou spojeny interakcí protein-protein nebo disulfidickou vazbou. Toxinem však může být i jediný polypeptid, který je v buňce proteolyticky upraven na dvě domény, jako je tomu v případě exotoxinu A z Pseudomonas. Lze shrnout, že binární toxiny mají typicky tři významné domény, cytotoxickou doménu A, doménu B vázající se na receptor a translokační doménu. Doména A a doména B jsou často spojeny doménami tvořícími interakce protein-protein.
Domény vázající se na receptor podle vynálezu jsou vhodné pro transport libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru do cílového hmyzu, který má receptor rozpoznávaný doménou vázající se na receptor z binárních toxinů zde popsaných. Jelikož mají binární toxiny translokační domény, které penetruji fosfolipidové dvouvrstevné membrány a převádějí cytotoxiny přes tyto membrány, mohou být tyto translokační domény podobně vhodné při převádění libovolného proteinu, toxinu, enzymu, transkripčního faktoru, nukleové kyseliny, chemikálie nebo libovolného jiného faktoru přes fosfolipidovou dvouvrstvu jako je plazmatická membrána nebo vesikulární membrána. Samotná translokační doména může perforovat membrány a tím vykazovat toxické nebo insekticidní vlasnosti. Všechny binární toxiny mají dále cytotoxické domény. Taková cytotoxická doména může být použitelná jako letální protein, buďto samotná nebo při dodáni do libovolné cílové buňky nebo cílových buněk libovolným způsobem.
Konečně jeilkož binární toxiny složené ze dvou polypeptidů často tvoří komplex, je pravděpodobné, že jsou ve složkách binárních toxinů podle vynálezu oblasti tvořící interakce protein-protein. Tyto domény tvořící interakce protein-protein mohou být vhodné pro vytváření spojení mezi libovolnými kombinacemi toxinů, enzymů, transkripčních fatkorů, nukleových kyselin, protilátek, zbytků vázajících se na buňky nebo libovolných jiných chemikálii, faktorů, proteinů nebo proteinových domén.
Toxiny, enzymy, transkripční faktory, protilátky, zbytky vázající se na buňku nebo jiné proteinové domény lze fúzovat k pesticidním nebo pomocným proteinům za vzniku genetických fúzí ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein který kombinuje vlastnosti vegetativního insekticidního proteinu a dalších složek použitých při fúzi. Dále pokud vykazuje proteinová doména fúzovaná k vegetativnímu insekticidnímu proteinu afinitu k dalšímu proteinu, nukleové kyselině, glycidu, lipidu nebo jiné chemikálii nebo faktoru, lze vytvořit třísložkový komlex. Tento komplex bude mít vlastnosti všech jeho složek. Podobnou úvahu lze použít pro přípravu čtyřnebo vícesložkových komplexů. Tyto komplexy jsou vhodné jako insekticidní toxiny, léčiva, laboratorní činidla a diagnostická činidla atd. Takovéto komplexy se v současné době používají například jako fúzní toxiny pro potenciální terapie rakoviny, jako činidla v ELISA-testech a immunoblotačních analýzách.
Jednou ze strategii obměňování pesticidních nebo pomocných proteinů je fúzování S-zbytku (S-tag) o délce 15 aminokyselin k proteinu bez zničení domény nebo domén vázajících se na buňku hmyzu, translokačních domén nebo domén vytvářejících interakce protein-protein přítomných v tomto proteinu. S-zbytek vykazuje vysokou afinitu (Kd = 10'9 M) k ribonukleasovému S-proteinu, ze kterého se, je-li navázán na S-zbytek, vytváří aktivní ribonukleasa. (viz F. B. Richards a H. W. Wyckoff (1971) v The Enzymes, svazek IV (Boyer, P. D., editor) , str. 647 - 806, Academie Press, New York) . Fúzi lze provést takovým způsobem, že se zničí nebo odstraní cytotoxická účinnost pesticidního nebo pomocného proteinu, čímž se nahradí cytotoxická účinnost vegetativního insekticidního proteinu novou cytotoxickou ribonukleasovou účinností. Výsledný toxin bude tvořen S-proteinem, pesticidním proteinem a pomocným proteinem, kde je buď pesticidní protein nebo pomocný protein produkován jako translačni fúze s S-zbytkem. Podobných strategií lze použít pro fúzování jiných potenciálních cytotoxinů k pesticidním nebo pomocným proteinům, včetně, aniž by se však jednalo o omezující výčet, proteinů inaktivujících ribozomy, hormonů hmyzu, receptorů hormonů, transkripčnich faktorů, proteas, fosfatas, exotoxinu A z Pseudomonas, nebo libovolných jiných proteinů nebo chemických faktorů, které jsou letální při dodání do buněk. Podobně lze do buněk dodávat proteiny, které nejsou letální, mohou však měnit buněčnou biochemii nebo fyziologii.
Spektrum toxicity pro různé druhy lze měnit tak, že se k pesticidním nebo pomocným proteinům fúzují domény, které rozpoznávají receptory na povrchu buněk jiných druhů. Mezi takovéto domény mohou patřit, aniž by se však jednalo o vyčerpávající výčet, protilátky, transferrin, hormony nebo peptidové sekvence izolované z fágem vytvářených afinitně selektovatelných knihoven (phage displayed affinity selectable libraries). Pro změnu spektra toxicity lze použít rovněž peptidové sekvence, které jsou navázány na živiny, vitaminy, hormony nebo jiné chemikálie, které jsou transportovány do buněk. Podobně lze pro změnu spektra účinnosti VIP1 a VIP2 použít libovolný jiný protein nebo chemikálii, který (která) se váže na receptor na povrchu buňky nebo membránu a může být přenesen (a) dovnitř buňky (internalizován(a)).
Pesticidními proteiny podle vynálezu jsou proteiny, které poskytují specifickou pesticidní vlastnost. Takovéto polypeptidy se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž jejich složkové polypeptidy mají molekulovou hmotnost nejméně 30 kDa nebo větší, výhodné přibližně 50 kDa nebo větší.
Pomocné proteiny podle vynálezu se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně přibližně 15 kDa nebo větší, výhodně přibližně 20 kDa nebo větší, a ještě výhodněji přibližně 30 kDa nebo větší. Pomocné proteiny jako takové se mohou skládat ze složkových polypeptidů.
Je možné, že pesticidní protein a pomocný protein jsou složkami multimerního pesticidního proteinu. Takovéto pesticidní proteiny, které obsahují pomocné proteiny jako jeden nebo několik ze svých složkových polypeptidů, se mohou lišit molekulovou hmotností, přičemž mají molekulovou hmotnost nejméně 50 kDa až do nejméně 200 kDa, výhodně přibližně 100 kDa až 150 kDa.
- 37 Pomocný protein lze použít v kombinaci s pesticidními proteiny podle vynálezu pro zvýšení účinnosti nebo aktivaci pesticidního proteinu. Pro stanovení, zda pomocný protein ovlivní účinnost, je možné pesticidní protein exprimovat samotný nebo v kombinaci s pomocným proteinem a jednotlivé účinnosti srovnat v požerových testech pesticidní účinnosti.
Při vyhledávání potenciální pesticidní účinnosti u kmenů může být výhodné testovat účinnost kmene samotného a v kombinaci s pomocným proteinem. V některých případech se kombinací pomocného proteinu s přirozenými proteiny kmenů dosáhne pesticidní účinnosti i tehdy, kdy za nepřítomnosti pomocného proteinu žádná účinnost není pozorována.
Pomocný protein je možné modifikovat, jak je popsáno výše, pomocí různých způsobů známých v oboru. Pro účely vynálezu tudíž termín vegetativní insekticidní protein (VIP) zahrnuje proteiny produkované v průběhu vegetativního růstu, které lze použít buďto samotné nebo v kombinaci k dosažení pesticidní účinnosti. Zahrnuje tedy pesticidní proteiny, pomocné proteiny a proteiny, které vykazují účinnost pouze za přítomnosti pomocného proteinu nebo polypeptidové složky těchto proteinů.
Je třeba vzít v úvahu, že pro získání nukleotidových a aminokyselinových sekvencí proteinů podle vynálezu jsou k dispozici i alternativní způsoby. Pro získání nukleotidové sekvence kódující pesticidní protein lze například izolovat z genomové knihovny kosmidové klony, které exprimuji pesticidní protein. Z větších účinných kosmidových klonů lze připravit menší subklony a testovat jejich účinnost. Tímto způsobem lze sekvenovat pro stanovení nukleotidové sekvence genu klony, které exprimuji účinný pesticidní protein. Poté lze odvodit aminokyselinovou sekvenci proteinu. Obecné metody molekulární biologie jsou uvedené například v Molecular Cloning, A Laboratory Manual, druhé vydání, svazky 1 - 3, Sambrook a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, New York (1989) a v publikacích citovaných v této práci.
Vynález rovněž zahrnuje nukleotidové sekvence z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, kteréžto nukleotidové sekvence jsou izolovatelné hybridizaci s nukleotidovými sekvencemi z kmenů Bacillus podle vynálezu. U proteinů kódovaných takovými nukleotidovými sekvencemi lze testovat jejich pesticidní účinnost. Vynález rovněž zahrnuje proteiny kódované těmito nukleotidovými sekvencemi. Vynález dále zahrnuje proteiny získané z organismů jiných než jsou druhy rodu Bacillus, kteréžto proteiny cross-reaguj £ s protilátkami vytvořenými proti proteinům podle vynálezu. U izolovaných proteinů lze opět testovat jejich pesticidní účinnost pomocí zde popsaných způsobů nebo jiných způsobů známých v oboru.
Jakmile se izolují nukleotidové sekvence kódující pesticidní proteiny podle vynálezu, lze s nimi manipulovat a použít je pro expresi proteinu v řadě hostitelů, včetně jiných organismů, včetně mikroorganismů a rostlin.
Pesticidní geny podle vynálezu lze optimalizovat pro zvýšenou expresi v rostlinách, viz například EP-A 0618976, EP-A 0359472, EP-A 0385962, WO 91/16432, Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324 - 3328, a Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Tímto způsobem lze syntetizovat geny používající kodónů preferovaných rostlinami. Preferovaným kodónem pro konkrétního hostitele je jediný kodón, který nej častěji kóduje v tomto hostiteli danou aminokyselinu. Například kodón preferovaný kukuřicí pro konkrétní aminokyselinu lze odvodit ze známých genových sekvenci kukuřice. Použití kodónů kukuřicí pro 28 genů z rostlin kukuřice se nachází v práci Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498. Lze rovněž vytvořit syntetické geny na základě distribuce kodónů, kterou konkrétní hostitel používá pro konkrétní aminokyselinu.
Tímto způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolné rostlině. Je třeba vzít v úvahu, že je možně, aby byla optimalizovaná nebo syntetická celá genová sekvence nebo libovolná její část. To znamená, že je možné použít rovněž syntetické nebo částečně optimalizované sekvence.
Podobným způsobem lze optimalizovat nukleotidové sekvence pro expresi v libovolném mikroorganismu. Preferované použití kodónů pro rod Bacillus je uvedeno například v patentu Spojených Států Amerických č. 5 024 837 a v práci Johansen a kol. (1988) Gene 65: 293 - 304.
Metody konstrukce expresívních kazet pro rostliny, jakož i zavedení cizí DNA do rostlin jsou popsány v oboru. Takovéto expresívní kazety mohou obsahovat promotory, terminátory, zesilovače, vedoucí sekvence, introny a jiné regulační sekvence operabilně spojené s kódující sekvencí pesticidního proteinu. Dále je třeba vzít v úvahu, že je možné použít v expresívních kazetách promotory nebo terminátory genů VIP.
Obecně se pro introdukci cizí DNA do rostlin používají vektory na bázi Ti-plazmidu, jakož i přímý příjem DNA, lipozómy, elektroporace, mikroinjekce a vstřelování mikročástic. Takové způsoby jsou popsány v oboru, viz například Guerche a kol., (1987) Plant Science 52: 111 - 116; Neuhause a kol., (1987) Theor. Appl. Genet. 75: 30 - 36; Klein a kol. (1987) Nátuře 327: 70 - 73; Howell a kol., (1980) Science 208: 1265; Horsch a kol., (1985) Science 227: 1229 - 1231; DeBlock a kol., (1989) Plant Physiology 91: 694 - 701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach a Weissbach, editoři) Academie Press, Inc. (1988); a Methods in Plant Molecular Biology (Schuler a Zielinsku, editoři) Academie Press, Inc. (1989), viz rovněž patentová přihláška Spojených
Států Amerických č. 08/008 374, a rovněž EP-A 0193259 a
EP-A 0451878. Je samozřejmé, že způsob transformace závisí na rostlinné buňce, která má být transformována.
Dále je možné složky expresivní kazety modifikovat pro zvýšení exprese. Lze například použít zkrácené sekvence, provést substituce nukleotidů nebo jiné modifikace, viz například Perlak a kol. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3324 - 3328; Murray a kol. (1989) Nucleic Acids Research 17: 477 - 498; a WO 91/16432.
Konstrukt může rovněž obsahovat libovolné jiné nutné regulátory, jako jsou terminátory (Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet., 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671 - 674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev. , 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1272 ; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891 - 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627 - 9639); rostlinné konvenční sekvence pro translaci (Joshi, C.P., (1987), Nucleic Acids Research, 15: 6643 - 6653), introny (Luehrsen a Walbot, (1991), Mol. Gen. Genet. , 225: 81 - 93) a podobně, operabilně spojené s nukleotidovou sekvencí. Může být výhodné zařadit do konstruktu expresivní kazety 5'-vedoucí sekvenci. Takové vedoucí sekvence mohou působit tak, že zvyšují translaci. Translační vedoucí sekvence jsou v oboru známé a patří mezi ně:
vedoucí sekvence picornavirů, sekvence EMCV (5'-nekódující oblast (Elroy-Stein, 0., Fuerst, T.R., a Moss 86 : 6126 - 6130) ;
například vedoucí encefalomyocarditis)
B. (1989) PNAS USA vedoucí sekvence potyvirů, například vedoucí sekvence TEV (viru skvrnitosti tabáku Tobacco Etch Virus) (Allison a kol., (1986); vedoucí sekvence MDMV (viru zakrslé mozaiky kukuřice), Virology, 154: 9 - 20); a protein vázající těžký řetězec lidského imunoglobulinu (BiP) (Macejak, D. G.z a Sarnow, P., (1991), Nátuře 353:
- 94;
nepřekládaná vedoucí sekvence z mRNA obalového proteinu viru mozaiky vojtěšky (AMV RNA 4), (Jobling, S. A., a Gehrke, L., (1987), Nátuře, 325: 622 - 625;
vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV), (Gallie, D. R. a kol., (1989), Molecular Biology of RNA, str. 237 - 256; a vedoucí sekvence viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) (Lommel , S. A. a kol., (1991), Virology, 81: 382 - 385, viz rovněž Della-Cioppa a kol., (1987), Plant Physioloq-y, 84: 965 - 968.
V expresívní kazetě lze použít rostlinný terminátor, viz například Rosenberg a kol., (1987), Gene, 56: 125; Guerineau a kol., (1991), Mol. Gen. Genet. , 226: 141 - 144; Proudfoot, (1991), Cell, 64: 671 - 674; Sanfacon a kol., (1991), Genes Dev., 5: 141 - 149; Mogen a kol., (1990), Plant Cell, 2: 1261 - 1272; Munroe a kol., (1990), Gene, 91: 151 - 158; Ballas a kol., (1989), Nucleic Acids Res., 17: 7891 - 7903; Joshi a kol., (1987), Nucleic Acid Res., 15: 9627 - 9639.
Pro tkáňově specifickou expresi lze nukleotidové sekvence podle vynálezu operabilně spojit s tkáňově specifickými promotory, viz například EP-A 0618976.
Do rozsahu vynálezu dále spadají transgenické rostliny, zejména transgenické fertilní rostliny transformované pomocí výše popsaných postupů a jejich asexuální nebo/a sexuální potomstvo, které obsahují a výhodně rovněž exprimují pesticidní protein podle vynálezu. Zejména výhodné jsou hybridní rostliny.
Transgenickými rostlinami podle vynálezu mohou být dvouděložné nebo jednoděložné rostliny. Výhodné jsou jednodšložné rostliny z čeledi Graminaceae, včetně rostlin rodů Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum,
Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
Zejména výhodná je transgenická kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, žito, oves, drnové trávy a rýže.
Z dvouděložných rostlin je zejména výhodná sója, bavlník, tabák, cukrová řepa, řepka olejka a slunečnice.
Rozumí se, že termín potomstvo zahrnuje jak asexuálně tak sexuálně vytvořené potomstvo transgenických rostlin. Rozumí se, že tato definice rovněž zahrnuje všechny mutanty a varianty získatelné pomocí známých způsobů, jako je například buněčná fúze nebo selekce mutantů, které stále vykazují charakteristické vlastnosti původně transformované rodičovské rostliny, spolu se všemi produkty křížení a fúzí transformovaného rostlinného materiálu.
Další předmět vynálezu se týká proliferačního materiálu transgenických rostlin.
Proliferační materiál transgenických rostlin je podle vynálezu definován jako jakýkoli rostlinný materiál, který lze množit sexuálně nebo asexuálně in vivo nebo in vitro. Zejména výhodné jsou v rámci rozsahu vynálezu protoplasty, buňky, kalus, tkáně, orgány, semena, embrya, pyl, vaječné buňky, zygoty, spolu s libovolným jiným propagačním materiálem získaným z transgenických rostlin.
Předmětem vynálezu jsou rovněž části rostlin, jako jsou například květy, stonky, plody, listy a kořeny, které pocházejí z transgenických rostlin nebo jejich potomstva, dříve transformovaných pomocí způsobů podle vynálezu, a které jsou tudíž alespoň z části tvořeny transgenickými buňkami.
Předtím než se rostlinný propagační materiál (plody, hlízy, zrna, semena), ale zejména semena, prodává jako komerční produkt, opatřuje se obvykle ochranným obalem, který obsahuje herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika těchto přípravků, pokud je to žádoucí spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními látkami nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými v oboru, pro poskytnutí ochrany proti poškození způsobenému bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci.
Pro ochranu semen je možné ochranný obal aplikovat na semena buďto impregnací hlíz nebo zrn kapalnou formulací nebo jejich obalením smíchanou vlhkou nebo suchou formulací. Kromě toho jsou ve speciálních případech možné jiné způsoby aplikace na rostliny, například se může provádět ošetření směrované na květy nebo plody.
Semeno rostliny podle vynálezu, které obsahuje molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pesticidní protein podle vynálezu, lze ošetřit obalem chránícím semena obsahujícím sloučeninu na ošetření rostlin, jako je například captan, carboxin, thiram (TMTD), methalaxyl (Apron) a pirimifos-methyl (Actellic) a jině sloučeniny, které se běžně používají na ošetření semen. V rámci rozsahu vynálezu jsou výhodné obaly chránící semena obsahující insekticidní prostředek podle vynálezu, a to buď samotný nebo v kombinaci s jedním z obalů chránících semena běžně používaných k ošetření semen.
Dalším předmětem vynálezu je tedy rostlinný propagační materiál kultivovaných rostlin, avšak zejména semeno rostlin, ošetřené obalem chránícím semena, jak je definován výše.
Geny kódující pesticidní proteiny lze použit pro transformaci organismů patogenních pro hmyz. Mezi takové organismy patří Baculoviry, houby, prvoci, bakterie a háďatka.
Kmeny Bacillus podle vynálezu lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Alternativně lze gen kódující pesticid introdukovat pomocí vhodného vektoru do mikrobiálního hostitele, a tohoto hostitele aplikovat na prostředí, rostliny nebo zvířata. Je možné vybrat jako hostitele mikroorganismy, o kterých je známo, že obsazují fytosféru (fyloplán, fylosféru, rhizosféru nebo/a rhizoplán) jedné nebo několika plodin, které jsou předmětem zájmu. Tyto mikroorganismy se vybírají tak, aby byly schopné úspěšně soutěžit v konkrétním prostředí s mikroorganismy divokého typu, aby v nich byl stabilně udržován a exprimován gen exprimující polypeptidový pesticid, a s výhodou aby zajišťovaly zlepšenou ochranu pesticidu před degradací a inaktivaci způsobenou prostředím.
Mezi takového mikroorganismy patři bakterie, řasy a houby. Zejména zajímavými mikroorganismy jsou bakterie, například Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc a Alcaligenes, houby, zejména kvasinky, například Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Zvláště zajímavé jsou takové fytosférní druhy bakterii, jako je Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli a Azotobacter vinlandii, a fytosférní druhy kvasinek, jako je Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, a Aureobasidium pollulans. Obzvláště zajímavé jsou pigmentované mikroorganismy.
Je dostupná řada způsobů introdukce genu exprimujícího pesticidní protein do mikroorganismu jako hostitele za podmínek, které umožňují stabilní udržení a expresi genu. Je například možné zkonstruovat expresívní kazety, které obsahují DNA-konstrukty, které jsou předmětem zájmu, operabilně spojené s transkripčními a translačními regulačními signály pro expresi DNA-konstruktů, a DNA-sekvenci homologickou se sekvencí v hostitelském organismu, jejímž prostřednictvím dojde k integraci, nebo/a replikační systém, který je funkční v hostiteli, jehož prostřednictvím dojde k integraci nebo stabilnímu udržení.
Mezi transkripčni a translační regulační signály patří, aniž by se tím však jejich rozsah jakkoli omezoval, promotor, místo iniciace transkripce, operátory, aktivátory, enhancery, další regulační elementy, místa vázající se na ribozomy, iniciační kodon, terminační signály a podobně, viz například patent Spojených Států Amerických ě. 5 039 523, patent Spojených Států Amerických č. 4 853 331, EPO 0480762A2, Sambrook a kol., viz výše; Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Maniatis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1982) ; Advanced Bacterial Genetics, Davis a kol. (editoři), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1980), a v nich citovaně odkazy.
Mezi vhodné hostitelské buňky, v případě že se buňky obsahující pesticid budou ošetřovat pro prodloužení účinnosti toxinu v buňce když se poté ošetřené buňky aplikují na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni, mohou patřit buďto prokaryotní nebo eukaryotní hostitelské buňky, normálně s omezením na ty buňky, které neprodukují látky toxické pro vyšší organismy, jako jsou savci. Je však možné použít organismy produkující látky toxické pro vyšší organismy v případě, že toxin je nestabilní nebo aplikační množství dostačně nízké, aby bylo možné vyhnout se možnosti toxicity pro savčího hostitele. Jako hostitelé jsou zejména zajímaví prokaryotní hostitelé a nižší eukaryotni hostitelé, jako jsou houby. Mezi ilustrativní příklady prokaryotních hostitelů patří jak Gram-negativní tak
Gram-pozitivní hostitelé, a patří mezi ně Enterobacteriaceae, jako je Escherichia, Próteus; Bacillaceae; Spirillaceae, jako je
Erwinina, Shigella, Salmonella, a Rhizobiaceae, jako je Rhizobium; fotobakterium, Zymomonas, Serratia,
Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, jako je Pseudomonas a Acetobacter; Azotobacteraceae a Nitrobacteraceae. Mezi eukaryotni hostitele patři houby, jako jsou Phycomycetes a Ascomycetes, mezi které patří kvasinky, jako jsou Saccharomyces a Schizosaccharromyces, a kvasinky z třídy Basidiomycetes, jako je Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces a podobně.
Mezi zejména zajímavé charakteristiky při výběru hostitelské buňky pro účely produkce patří snadnost introdukce genu pro protein do hostitele, dostupnost systémů exprese, účinnost exprese, stabilita proteinu v hostiteli, a přítomnost pomocných genetických schopnosti. Mezi charakteristiky zajímavé při použití jako pesticidních mikrokapslí patří ochranné vlastnosti pro pesticid, jako jsou silné buněčné stěny, pigmentace a intracelulární packaging nebo vytváření inkluzních tělísek; afinita k listům; nepřítomnost toxicity pro savce; atraktivita pro požer škůdci; snadnost usmrcení a fixace bez poškození toxinu; a podobně. Dále je třeba brát v úvahu snadnost formulace a manipulace, ekonomická hlediska, stabilitu při skladováni a podobně.
Mezi zejména zajímavé hostitelské organismy patří kvasinky, jako jsou Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. a Sporobolomyces sp., fyloplánové organismy jako jsou Pseudomonas sp., Erwinia sp. a Flavobacterium sp., nebo jiné organismy jako jsou Escherichia, Lactobacillus sp. , Bacillus sp. , a podobně. Mezi konkrétní organismy patří Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli,
Bacillus subtilis a podobně.
Geny VIP lze introdukovat do mikroorganismů, které se množí na rostlinách (epifytů) pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například Gram-pozitivní nebo Gram-negativní bakterie.
Z rostliny, která je předmětem zájmu, lze například izolovat pomocí způsobů známých v oboru bakterie kolonizující kořeny. Konkrétně lze z kořenů rostliny izolovat kmen Bacillus cereus kolonizující kořeny (například viz J. Handelsman, S. Raffel, E. Mester, L. Wunderlich a C. Grau, Appl. Environ. Microbiol. 56: 713 - 718, (1990)). VIP1 nebo/a VIP2 nebo/a VIP3 lze introdukovat do Bacillus cereus kolonizujícího kořeny pomocí standardních způsobů známých v oboru.
Konkrétně lze VIP1 nebo/a VIP2 získaný z kmene Bacillus cereus AB78 introdukovat do Bacillus cereus kolonizujícího kořeny pomocí konjugace za použití standardních metod (J. Gonzales, B. Brown a B. Carlton, Proč. Nati. Acad. Sci. 79: 6951 - 6955 (1982)) .
VIP1 nebo/a VIP2 nebo/a VIP3 nebo jiné VIP podle vynálezu lze rovněž introdukovat do mikroorganismu rodu Bacillus kolonizujícího kořeny pomoci elektrotransformace. Konkrétně lze VIP klonovat do kyvadlového vektoru (shuttle vector), například pHT3101 (D. Lereclus a kol., FEMS Microbiol. Letts., 60: 211 - 218 (1989)), jak je popsáno v příkladu 10. Kyvadlový vektor pHT3101 obsahující kódující sekvenci konkrétního VIP lze poté transformovat do mikroorganismu rodu Bacillus kolonizujícího kořeny pomocí elektroporace (D. Lereclus a kol. 1989, FEMS Microbiol. Letts. , 60: 211 - 218).
Expresívní systémy lze vytvořit tak, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány vně cytoplazmy například Gram-negativní bakterie Escherichia coli. Výhody toho, že jsou vegetativní insekticidní proteiny sekretovány, jsou následující:
(1) zamezí se tím potenciálním toxickým účinkům exprimovaných vegetativních insekticidních proteinů v cytoplazmě, (2) může se zvýšit množství exprimovaného vegetativního insekticidního proteinu, a (3) může se usnadnit účinná purifikace vegetativního insekticidního proteinu.
Vegetativní insekticidní proteiny lze upravit tak, aby byly sekretovány Escherichia coli, například fúzí vhodného signálního peptidu Escherichia coli na N-konec signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu nebo nahrazením signálního peptidu vegetativního insekticidního proteinu signálním peptidem Escherichia coli. Signální peptidy rozpoznávané Escherichia coli lze nalézt v proteinech, o kterých je již známo, že jsou sekretovány Escherichia coli, jako je například protein OmpA (J. Ghrayeb, H. Kimura, M, Takahara, Y. Masui a M. Inouye, EMBO J. , 3: 2437 - 2442 (1984)). OmpA je hlavním proteinem vnější membrány Escherichia coli a má se tedy za to, že je jeho signální peptid účinný v translokačním procesu. Signální peptid proteinu OmpA rovněž nemusí být modifikován před úpravou (processingem), jak tomu může být v případě jiných signálních peptidů, například lipoproteinového signálního peptidu (G. Duffaud, P. March a M. Inouye, Methods in EnzymolodV, 153: 492 (1987)).
Specificky lze na N-konce a C-konce kódujících sekvencí VIP za použití standardních způsobů známých v oboru zavést jedinečná restrikční místa BamHI. Tyto BamHI-fragmenty lze klonovat, ve čtecím rámci, do vektoru pIN-III-ompAl, A2 nebo A3 (J. Ghrayeb, H. Kimura, M. Takahara, H. Hsiung, Y. Masui a
M. Inouye, ΕΜΒΟ J. , 3: 2437 - 2442 (1984)), čímž se vytvoří fúzní gen ompA:VIP, který je sekretován do periplazmického prostoru. Další restrikční místa v polylinkeru pIN-III-ompA lze eliminovat pomocí standardních způsobů známých v oboru, takže sekvence kódující N-koncovou aminokyselinu vegetativního insekticidního proteinu následuje přímo po místu štěpení signálního peptidu ompA. Sekretovaná sekvence vegetativního insekticidního proteinu v Escherichia coli je tedy poté identická s nativní sekvencí vegetativního insekticidního proteinu.
Pokud není nativní signální peptid vegetativního insekticidního proteinu nutný pro vytvoření správné struktury (folding) maturovaného proteinu, lze takové signální sekvence odstranit a nahradit signální sekvencí ompA. Jedinečná restrikční místa BamHI lze zavést na N-konci kódující sekvence proproteinu bezprostředně za sekvenci kódující signální peptid VIP a na C-konci sekvence kódující VIP. Tyto BamHI-fragmenty lze poté klonovat do vektorů pIN-III-ompA jak je popsáno výše.
Obecné způsoby pro použití kmenů podle vynálezu k pesticidní kontrole nebo vytváření jiných organismů jako pesticidních činidel jsou známy v oboru, viz například patent Spojených Států Amerických č. 5 039 523 a EP 0480762A2.
Vegetativní insekticidní proteiny lze fermentovat v bakteriálním hostiteli a výslednou bakterii zpracovat a použít jako mikrobiální postřik stejným způsobem jakým se používají jako insekticidní postřiky kmeny Bacillus thuringiensis. V případě vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů, sekretovaných z mikroorganismů rodu Bacillus, se sekreční signál odstraní nebo mutuje za použití postupů známých v oboru. Takovéto mutace nebo/a delece zabraňují sekreci vegetativního insekticidního proteinu nebo vegetativních insekticidních proteinů do růstového média během procesu fermentace.
Vegetativní insekticidní proteiny jsou uchovávány v buňce a buňky se poté zpracují za vzniku enkapsulovaných vegetativních insekticidních proteinů. Pro tento účel lze použít libovolných vhodných mikroorganismů. Pro expresi endotoxinů Bacillus thuringiensis jako enkapsulovaných proteinů se v současné době používají mikroorganismy rodu Pseudomonas, přičemž se výsledné buňky zpracuji a použijí k postřiku jako insekticidy (H. Gaertner a kol. 1993, v Idvanced Engineered Pesticides, editor L. Kim).
Tímto způsobem se používají různé kmeny Bacillus thuringiensis. Takovéto kmeny Bacillus thuringiensis produkují endotoxinový proteiny (nebo proteiny), jakož i vegetativní insekticidní proteiny. Alternativně mohou takové kmeny produkovat pouze vegetativní insekticidní proteiny. U nesporulujícího kmenu Bacillus subtilis bylo zjištěno, že produkuje vysoká množství endotoxinů CrylIIA z Bacillus thuringiensis (Agaisse, H. a Lereclus, D., Expression in Bacillus subtilis of the Bacillus thuringiensis CrylIIA toxin gene is not dependent on a sporulation-specific sigma factor and is increased in a spoOA mutant, J. Bacteriol., 176: 4734 - 4741 (1994)) . Podobný spoOA mutant lze připravit v případě Bacillus thuringiensis a použit jej pro produkci enkapsulovaných vegetativních insekticidních proteinů, které nejsou sekretovány do média ale jsou uchovávány v buňce.
Pro uchování vegetativních insekticidních proteinů v buňce mikroorganismu Bacillus lze signální peptid změnit tak, že již nepůsobí jako sekreční signál. Konkrétně předpokládaný signální peptid pro VIP1 zahrnuje prvních 31 aminokyselin proteinu s předpokládaným konvenčním místem štěpení, Ala-X-Ala, na C-konci této sekvence (G. von Heijne, J. Mol. Biol. 184: 99 - 105 (1989)) a předpokládaný signální peptid pro VIP2 zahrnuje prvních 40 aminokyselin proteinu s předpokládaným místem štěpení za Ala40. Místa štěpení bud' ve VIP1 nebo VIP2 lze mutovat pomocí způsobů známých v oboru pro nahrazení konvenční sekvence místa štěpení alternativními aminokyselinami, které nejsou rozpoznávány signálními peptidasami.
Alternativně lze signální peptidy VIP1, VIP2 nebo/a jiných VIP podle vynálezu eliminovat ze sekvence, čímž se způsobí, že nejsou rozpoznatelné jako sekreční proteiny v mikroorganismech rodu Bacillus. Konkrétně lze za použití způsobů známých v oboru před proproteinovou sekvenci ve VIP1, začínající Asp32, nebo proproteinovou sekvenci ve VIP2, začínající Glu41, zařadit methioninové iniciační místo.
Geny pro vegetativní insekticidní proteiny lze introdukovat do mikroorganismů, které se rozmnožují na rostlinách (epifytů), pro dodání vegetativních insekticidních proteinů potenciálním škůdcům, kteří mají být kontrolováni. Epifyty mohou být například Gram-pozitivní nebo Gram-negativní bakterie.
Kmeny rodu Bacillus podle vynálezu, nebo mikroorganismy, které byly geneticky změněny tak, aby obsahovaly pesticidní gen a protein, lze použít na ochranu zemědělských plodin a produktů před škůdci. Podle jednoho provedení vynálezu se celé, t.j. nelyžované, buňky organismu produkujícího toxin (pesticid) ošetří činidly, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni.
Alternativně se pesticidy produkují pomocí introdukce heterologního genu do buněčného hostitele. Exprese heterologního genu způsobuje přímo nebo nepřímo intracelulární produkci a uchovávání pesticidu. Tyto buňky se poté ošetří za podmínek, které prodlužují účinnost toxinu produkovaného v buňce když je buňka aplikována na životní prostředí škůdce nebo škůdců, kteří mají být kontrolováni. Výsledný produkt si uchovává toxicitu toxinu. Takové přirozeně enkapsulované pesticidy lze poté formulovat podle běžných technik pro aplikaci na prostředí obsahující škůdce, který má být kontrolován, například půdu, vodu, a listy rostlin, viz například EPA 0192319, a odkazy tam citované.
Účinné látky podle vynálezu se normálně aplikují ve formě prostředků, a lze je aplikovat na stanoviště plodiny nebo na rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s jinými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňuji růst rostlin. Může jit rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.
Výhodnými způsoby aplikace účinné látky podle vynálezu nebo agrochemického prostředku podle vynálezu, který obsahuje alespoň jeden z pro hmyz specifických proteinů produkovaných bakteriálními kmeny podle vynálezu, jsou aplikace na listy, obalování semen a půdní aplikace. Počet dávek a aplikační dávka závisí na intenzitě zamoření odpovídajícím škůdcem.
Vynález se tedy dále týká insekticidního prostředku, který obsahuje jako účinnou látku alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo/a rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu
DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, spolu se zemědělskou nosnou nebo pomocnou látkou, jako je nosič, ředidlo, povrchově aktivní látka nebo pomocná látka zlepšující aplikaci. Tento prostředek může rovněž obsahovat další biologicky účinnou sloučeninu. Uvedenými sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími zemědělsky přijatelnými nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků. Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá.
Prostředek může obsahovat od 0,1 do 99 % hmot. účinné látky, od 1 do 99,9 % hmot. pevné nebo kapalné nosné nebo pomocné látky a od 0 do 25 % hmot. povrchově aktivní látky. Účinnou látku, která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, lze na rostliny nebo plodiny, které mají být chráněny, aplikovat spolu s určitými jinými insekticidy nebo chemikáliemi (1993 Crop Protection Chemicals
Reference, Chemical and Pharmaceutical Press, Kanada) bez ztráty účinnosti. Tyto látky a prostředky jsou kompatibilní s většinou jiných materiálů běžně používaných pro postřiky v zemědělství, neměly by však být používány v extrémně alkalických postřikových roztocích. Lze je aplikovat ve formě poprašů, suspenzí, smáčitelných prášků nebo v libovolné jiné formě vhodné pro použití v zemědělství.
Vynález dále popisuje způsoby kontroly nebo inhibice hmyzích škůdců, při kterých se aplikuje účinná látka, která obsahuje alespoň jeden z nových pro hmyz specifických proteinů podle vynálezu nebo rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo prostředek obsahující uvedenou účinnou látku, na (a) prostředí, ve kterém se může hmyzí škůdce vyskytovat, (b) rostlinu nebo část rostliny za účelem ochrany uvedené rostliny nebo části rostliny před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem, nebo (c) semeno za účelem ochrany rostliny, které se z uvedeného semena vyvine, před poškozením způsobeným hmyzím škůdcem.
Výhodným způsobem aplikace v oboru ochrany rostlin je aplikace na listy rostlin (listová aplikace), přičemž počet dávek a aplikační dávka závisí na rostlině, která má být chráněna, a riziku napadení daným škůdcem. Účinná látka se však může dostat do rostliny rovněž kořeny (systémové působení), pokud se na stanoviště rostliny aplikuje kapalná formulace nebo pokud se účinná látka zapracuje v pevné formě na stanoviště rostliny, například do půdy, například ve formě granuli (půdní aplikace). Při záplavovém pěstování rýže lze takovéto granule aplikovat v odměřených množstvích na zaplavené rýžové pole.
Prostředky podle vynálezu jsou rovněž vhodné na ochranu rostlinného rozmnožovacího materiálu, například semen, jako jsou plody, hlízy nebo zrna, nebo rostlinných řízků, proti živočišným škůdcům. Rozmnožovací materiál lze tímto prostředkem ošetřit před vysetím či vysázením, například semena lze obalovat před setím. Účinnou látku podle vynálezu lze rovněž aplikovat na zrní (obalování, moření), a to tak, že se na zrní buď aplikuje kapalný prostředek nebo se obalí pevným prostředkem. Prostředek lze rovněž aplikovat na místo setí nebo sázení ve chvíli setí nebo sázení rozmnožovacího materiálu, například do secí brázdy během setí. Vynález rovněž zahrnuje tyto způsoby ošetření rostlinného rozmnožovacího materiálu a rostlinný rozmnožovací materiál, který byl takto ošetřen.
Prostředky podle vynálezu, které obsahují jako účinnou látku rekombinantní mikroorganismus obsahující alespoň jeden z nových toxinových genů v rekombinantní formě, zejména však rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jejich derivát nebo mutant, lze aplikovat libovolným známým způsobem pro ošetření semen nebo půdy bakteriálními kmeny, viz například patent Spojených Států Amerických ě. 4 863 866. Tyto kmeny poskytují účinnou biologickou ochranu dokonce i v případě, že mikroorganismus není živý. Výhodná je však aplikace živých mikroorganismů.
Mezi cílové plodiny, které mají být chráněny, patří v rámci vynálezu například následující druhy rostlin:
obiloviny (pšenice, ječmen, žito, oves, rýže, čirok a příbuzné plodiny), řepa (cukrová řepa a krmná řepa), trávy používané jako pícniny (srha říznačka, kostřavy a podobně), ovocné plodiny rodící jádrové, peckové a měkké ovoce (jabloně, hrušně, švestky, broskvoně, mandloně, třešně, jahodník, maliník a ostružinik), luskoviny (fazol, čočka, hrách, sója), olejniny (řepka olejka, hořčice, mák, olivy, slunečnice, kokosovník, skočec, kakaovník, podzemnice olejná), tykvovité rostliny (okurky, dýně, melouny), přadné rostliny (bavlník, len, konopí, jutovník), rostliny produkující citrusové plody (pomeranče, citrony, grepy, mandarinky), zeleniny (špenát, hlávkový salát, chřest, zelí a jiné zeleniny z čeledi Brassicaceae, cibule, rajčata, brambory, paprika), vavřínovíté rostliny (avokado, mrkev, skořicovník, kafrovník), opadavé stromy a konifery (například lípy, tisy, duby, olše, topoly, břízy, jedle, modříny, borovice), a rostliny jako je kukuřice, tabák, ořešák, kávovník, cukrová třtina, čajovník, vinná réva, chmel, banánovník a kaučukovník, jakož i okrasné rostliny, včetně hvězdnicovitých (složnokvětých).
Rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, se obvykle aplikuje ve formě insekticidních prostředků, přičemž aplikaci lze provádět na pěstební plochu nebo rostlinu, která má být ošetřena, současně nebo postupně s dalšími biologicky účinnými sloučeninami. Těmito sloučeninami mohou být hnojivá nebo látky dodávající mikroprvky nebo jiné přípravky, které ovlivňují růst rostlin. Může jít rovněž o selektivní herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematocidy, moluskocidy nebo směsi několika z těchto přípravků, v případě potřeby spolu s dalšími nosiči, povrchově aktivními činidly nebo pomocnými látkami zlepšujícími aplikaci, běžně používanými při vytváření prostředků.
Účinnou látku podle vynálezu lze použít v nemodifikované formě nebo spolu s libovolným vhodným zemědělsky přijatelným nosičem. Takovýmito nosiči jsou nosné a pomocné látky obvykle používané při vytváření zemědělských prostředků, a účinné látky podle vynálezu se tedy formulují známým způsobem do formy emulgovatelných koncentrátů, roztíratelných past, roztoků pro přímý postřik nebo ředitelných roztoků, zředěných emulzí, smáčitelných prášků, rozpustných prášků, poprašů a granulí, a rovněž se mohou enkapsulovat, například do polymerních látek. Způsoby aplikace, jako postřik, zmlžování, poprašování, rozmetání nebo zalévání se, stejně jako typ prostředku, volí podle požadovaných výsledků a převládajících podmínek. Výhodné aplikační dávky se normálně pohybují od přibližně 50 g do přibližně 5 kg účinné látky na hektar, výhodně od přibližně 100 g do přibližně 2 kg účinné látky na hektar. Významné jsou aplikační dávky v rozmezí od přibližně 200 g do přibližně 1 kg účinné látky na hektar a od 200 g do 500 g účinné látky na hektar.
V případě obalování (moření) semen činí výhodné aplikační dávky 0,5 g až 1000 g účinné látky na 100 kg semen, výhodně 3 g až 100 g účinné látky na 100 kg semen nebo 10 g až 50 g účinné látky na 100 kg semen.
Vhodné nosiče a pomocné látky mohou být pevné nebo kapalné a jsou jimi látky běžně používané při vytváření prostředků, například přírodní nebo regenerované minerální látky, rozpouštědla, dispergátory, smáčedla, látky způsobující lepivost, pojidla nebo hnojivá. Formulace, t.j. insekticidní prostředky, přípravky nebo směsi obsahující rekombinantní kmen Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, obsahující alespoň jednu molekulu DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, jako účinnou látku, nebo jeho kombinaci s jinými účinnými látkami, a popřípadě pevnou nebo kapalnou nosnou nebo pomocnou látku, se připraví známým způsobem, npaříklad homogenním mícháním nebo/a mletím účinných látek s aditivy, například rozpouš58 tědly, pevnými nosnými látkami a v některých případech povrchově aktivními sloučeninami (povrchově aktivními činidly, surfaktanty).
Jako rozpouštědla jsou vhodné následující látky: aromatické uhlovodíky, výhodně frakce obsahující 8 až 12 atomů uhlíku, například směsi xylenů nebo substituované naftaleny, ftaláty, jako je dibutylftalát nebo dioktylftalát, alifatické uhlovodíky, jako je cyklohexan nebo parafiny, alkoholy a glykoly a jejich ethery a estery, jako je ethanol, monomethyl- nebo monoethylether ethylenglykolu, ketony, jako je cyklohexanon, silně polární rozpouštědla, jako je N-methyl-2-pyrrolidon, dimethylsulfoxid nebo dimethylformamid, jakož i rostlinné oleje nebo epoxidované rostlinné oleje, jako je epoxidovaný kokosový olej nebo sojový olej, nebo voda.
Pevnými nosiči používanými například pro popraše a dispergovatelné prášky, jsou přírodní minerální plnidla, jako je kalcit, mastek, kaolin, montmorilonit nebo atapulgit. Pro zlepšení fyzikálních vlastností lze rovněž přidávat vysokodisperzní kyselinu křemičitou nebo vysokodisperzní absorbující polymery. Vhodnými granulovanými adsorpčními nosiči jsou porézní typy materiálů, například pemza, cihlová drť, sepiolit nebo bentonit, a vhodnými nesorpčními nosiči jsou materiály jako je kalcit nebo písek. Kromě toho lze použít rovněž rozsáhlou řadu předem granulovaných materiálů anorganické nebo organické povahy, například zejména dolomit nebo rozmělněné rostlinné zbytky.
která je aktivními anionická emulgační, že termín povrchově
V závislosti na povaze účinné látky, začleňována do prostředku, jsou vhodnými povrchově sloučeninami neionogenní, kationická nebo/a povrchově aktivní činidla, která vykazují dobré dispergační a smáčivé vlastnosti. Rozumí se, povrchově aktivní činidlo zahrnuje též směsi aktivních činidel.
Vhodnými anionickými povrchově aktivními činidly mohou být jak ve vodě rozpustná mýdla tak ve vodě rozpustné syntetické povrchově aktivní sloučeniny. Vhodnými mýdly jsou soli alkalických kovů, soli kovů alkalických zemin nebo nesubstituované nebo substituované amoniové soli vyšších mastných kyselin (obsahujících 10 až 22 atomů uhlíku), například sodné nebo draselné soli olejové nebo stearové kyseliny, nebo přírodních směsí mastných kyselin, které lze získat například z kokosového oleje nebo lojového oleje. Dalšími vhodnými povrchově aktivními činidly jsou rovněž soli mastných kyselin a methyltaurinu, jakož i modifikované a nemodifikované fosfolipidy.
například sem lignosulfonové,
Častěji se však používají tak zvané syntetické povrchově aktivní látky, zejména mastné sulfonáty, mastné sulfáty, sulfonované benzimidazolderiváty nebo alkylarylsulfonáty. Mastné sulfonáty nebo sulfáty jsou zpravidla ve formě solí s alkalickými kovy, solí s kovy alkalických zemin nebo nesubstituovaných nebo substituovaných amoniových solí, a obecně obsahují alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, který zahrnuje rovněž alkylovou část acylových zbytků, patří sodná nebo vápenatá sůl kyseliny dodecylsulfátů nebo směsí mastných alkoholsulfátů získaných z přírodních mastných kyselin. Mezi tyto sloučeniny patří rovněž soli esterů kyseliny sírové a suífonové kyseliny adičních produktů mastných alkoholů s ethylenoxidem. Sulfonované benzimidazolderiváty výhodné obsahují dvě sulfonylové skupiny a jeden zbytek mastné kyseliny obsahující přibližně 8 až 22 atomů uhlíku. Mezi příklady alkylarylsulfonátů patří například sůl sodíku, vápníku nebo triethanolaminu a dodecylbenzensulfonové kyseliny, dibutylnaftalensulfonové kyseliny nebo kondenzačního produktu kyseliny naftalensulfonové a formaldehydu. Vhodné jsou rovněž odpovídající fosfáty, například soli esterů kyseliny fosforečné a aduktů p-nonylfenolu se až 14 mol ethylenoxidu.
Neionogenními povrchově aktivními látkami jsou výhodně polyglykoletherderiváty alifatických nebo cykloalifatických alkoholů, nasycených nebo nenasycených mastných kyselin a alkylfenolů, kteréžto deriváty obsahují 3 až 30 glykoletherových skupin a 8 až 20 atomů uhlíku v (alifatickém) uhlovodíkovém zbytku a 6 až 18 atomů uhlíku v alkylovém zbytku alkylfenolů.
Dalšími vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami jsou ve vodě rozpustné adiční produkty polyethylenoxidu s polypropylenglykolem, ethylendiaminopolypropylenglykolem a alkylpolypropylenglykolem s 1 až 10 atomy uhlíku v alkylovém řetězci, obsahující 20 až 250 ethylenglykoletherových skupin a 10 až 100 propylenglykoletherových skupin. Tyto sloučeniny obsahují obvykle na jednotku propylenglykolu 1 až 5 jednotek ethylenglykolu. Jako reprezentativní příklady neionogenních povrchově aktivních látek je možno uvést nonylfenolpolyethoxyethanoly, polyglykolethery ricinového oleje, adiční produkty polypropylenu a polyethylenoxidu, tributylfenoxypolyethoxyethanol, polyethylenglykol a oktylfenoxypolyethoxyethanol. Vhodnými neionogenními povrchově aktivními látkami sjou kyselin a polyoxyethylensorbitanu, sorbitan-trioleát.
rovněž estery mastných jako je polyoxyethylenKationickými povrchově aktivními látkami jsou výhodně kvarterní amoniové soli, které jako substituent dusíkového atomu obsahují alespoň jeden alkylový zbytek s 8 až 22 atomy uhlíku, a jako další substituenty nižší, nesubstituované nebo halogenované, alkylové skupiny, benzylové skupiny, nebo nižší hydroxyalkylové skupiny. Tyto soli jsou výhodně ve formě halogenidů, methylsulfátů nebo ethylsulfátů, jako je například stearyltrimethylamoniumchlorid nebo benzyldi(261
-chlorethyl)ethylamoniumbromid.
Povrchově aktivní látky běžně používané při vytváření prostředků, jsou popsány například v publikacích McCutcheonď Detergents and Emulsifiers Annual, MC Publishing Corp., Ridgewood, New Jersey, 1979, a Dr. Helmut Stache Tensid Taschenbuch, Carl Hanser Verlag, Mnichov/Vídeň.
Další zejména výhodnou vlastností insekticidního prostředku podle vynálezu je stálost účinné látky pokud je aplikován na rostliny a půdu. Mezi možné příčiny ztráty účinnosti patří inaktivace ultrafialovým světlem, teplem, listovými exudáty a pH. Například při vysokém pH, zejména za přítomnosti redukčního činidla, krystaly δ-endotoxinů solubilizují a tím se stávají přístupnější proteolytické inaktivaci. Významné může být i vysoké pH listů, zejména pokud může mít povrch listů pH v rozmezí 8 - 10. U formulací insekticidního prostředku podle vynálezu je možné se s těmito problémy vypořádat buďto přidáním aditiv napomáhajících zabránění ztráty účinné látky nebo enkapsulací materiálu takovým způsobem, že je účinná látka chráněna proti inaktivaci. Enkapsulací lze provést chemicky (McGuire a Shasha, J Econ Entomol 85: 1425 - 1433, 1992) nebo biologicky (Barnes a Cummings, 1986; EP-A 0 192 319) . Mezi způsoby chemické enkapsulace patří postupy, při kterých je účinná látka obalena polymerem, zatímco biologická enkapsulace zahrnuje expresi genů δ-endotoxinů v mikrobech. V případě biologické enkapsulace se jako účinná složka formulace použije nepoškozený mikrob, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě. Přidáním činidel chránících proti účinkům UV-záření se může účinně snížit poškození zářením. Inaktivaci teplem lze rovněž kontrolovat přidáním vhodného aditiva.
Výhodné jsou v rámci vynálezu formulace, které obsahují jako účinnou složku živé mikroorganismy, buď ve fromě vegetativní buňky nebo výhodněji ve formě spor, pokud jsou v daném případě dostupné. Vhodné formulace mohou být tvořeny například polymerními gely, které jsou zesítěné polyvalentními kationty a obsahují uvedené mikroorganismy, jak popsali například D. R. Fravel a kol. v Phytopathology, svazek 75, č. 7, 774 - 777, 1985 za použití alginátu jako polymerního materiálu. Z této publikace je rovněž známo, že lze používat společně více nosných materiálů. Uvedené formulace se zpravidla připravují mícháním roztoků v přírodě se vyskytujících nebo syntetických polymerů tvořících gely, například alginátů, a vodných roztoků solí polyvalentních iontů kovů tak, že se vytvoří jednotlivé kapičky, přičemž mikroorganismy mohou být suspendovány v jednom ze dvou uvedených reakčních roztoků nebo v obou těchto roztocích. Tvorba gelu začíná při míchání ve formě kapiček. Tyto částice gelu lze následně vysušit. Tento proces se nazývá ionotropní gelovatění. V závislosti na stupni vysušení se vytvoří kompaktní a tvrdé částice polymerů, které jsou strukturně zesítěny polyvalentními kationty a které obsahují mikroorganismy a nosič v převážně rovnoměrném rozmístění. Velikost částic může být až do 5 mm.
EP-A1-0 097 571 popisuje prostředky na bázi částečně zesítěných polysacharidů které, kromě toho že obsahují mikroorganismy, mohou obsahovat rovněž například jemně zrnitou kyselinu křemičitou jako nosný materiál a zesítění lze provést například ionty Ca++. Tyto prostředky vykazují vodní aktivitu nepřesahující hodnotu 0,3. Cornick a kol. popisují v shrnujícím článku (New Directions in Biological Control: Alternatives for Supressing Agricultural Pests and Diseases, str. 345 - 372, Alan R. Liss, lne. (1990)) různé formulační systémy, přičemž jsou zmíněny granule s vermikulitem jako nosičem a kompaktní alginátové kuličky připravené způsobem ionotropního gelovatění. Takové prostředky popsal rovněž D. R. Fravel v Pesticide Formulatíons and
Application Systems: 11. svazek, ASTM STP 1112 American
Society for Testing and Materials, Philadelphia, 1992, str.
173 - 179 a lze je použít pro formulaci rekombinantních mikroorganismů podle vynálezu.
Insekticidní prostředky podle vynálezu obsahují obvykle od přibližně 0,1 do přibližně 99 %, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 95 % a nejvýhodněji přibližně 3 až přibližně 90 % účinné látky, přibližně 1 až přibližně 99,9 %, výhodně přibližně 1 až přibjližně 99 % a nejvýhodneji přibližně 5 až přibližně 95 % pevného nebo kapalného aditiva, a přibližně 0 až přibližně 25 %, výhodně přibližně 0,1 až přibližně 25 % a nejvýhodněji přibližně 0,1 až přibližně 20 % povrchově aktivního činidla.
Podle výhodného provedení vynálezu obsahují insekticidní prostředky obvykle 0,1 až 9 9 %, výhodně 0,1 až 95 % rekombinantního kmene Bacillus spp, jako je kmen Bacillus cereus nebo Bacillus thuringiensis, který obsahuje alespoň jednu molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje nové pro hmyz specifické proteiny v rekombinantní formě, nebo jeho kombinace s jinými účinnými látkami, 1 až 99,9 % pevného nebo kapalného aditiva, a 0 až 25 %, výhodně 0,1 až 20 % povrchově aktivního činidla.
Zatímco komerční produkty se obvykle vyrábějí jako koncentráty, konečný spotřebitel obvykle používá zředěné formulace s podstatně nižší koncentrací. Insekticidní prostředky mohou obsahovat také další složky, jako stabilizátory, činidla proti pěnění, látky regulující viskozitu, pojidla, činidla způsobující lepivost, jakož i hnojivá nebo jiné účinné látky pro dosažení speciálních efektů.
Podle jednoho provedení vynálezu byl izolován mikroorganismus Bacillus cereus, který je schopen usmrcovat Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotiaca longicornis barberi. Nový kmen Bacillus cereus AB78 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent
Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center,
1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21058.
Z tohoto kmene Bacillus cereus byl v podstatě purifikován frakční protein. Tato purifikace proteinu byla ověřena pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu a biologické účinnosti. Protein má molekulovou hmotnost přibližně 60 až přibližně 100 kDa, zejména přibližně 70 až přibližně 90 kDa, obzvláště přibližně 80 kDa a je označován VIP.
Sekvenováním od konce s volnou aminoskupinou bylo zjištěno, že N-koncovou aminokyselinovou sekvencí je NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID č. 8), kde zbytek Asx představuje buďto Asp nebo Asn. Celá aminokyselinová sekvence je uvedená v SEQ ID č. 7. DNA-sekvence, která kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 7 je uvedena v SEQ ID č. 6.
Byla vytvořena oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyseliny 3-9 NH2-konce. Sonda byla syntetizována na bázi použiti kodónů genu pro δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis (Bt) . Nukleotidová sekvence oligonukleotidové sondy použité pro Southernovu hybridizaci byla následuj ící:
5-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9) kde N představuje libovolnou bázi.
Kromě toho, zde popsaná DNA-sonda pro gen Bc AB78 VIP1 umožňuje screening libovolného kmene Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen gen VIP1 (nebo příbuzný gen) , nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje gen VIP1.
Pro lepší pochopení vynálezu obecně popsaného výše slouží následující podrobné příklady, které jsou uvedeny pouze pro ilustraci a vynález se jimi v žádném směru neomezuje, pokud není uvedeno jinak.
Byla vytvořena standardní nomenklatura založená na sekvenční identitě proteinů spadajících do rozsahu vynálezu. Níže jsou uvedena označení genů a proteinů používaná v následujících příkladech a jejich vztah k označením používaným v související základní přihlášce US 314594/08.
označení genu nebo proteinu podle standardní nomenklatury označení genu nebo proteinu v základní přihlášce US 314594/08 popis proteinu
VIPlA(a) VI PÍ VIPÍ z kmene AB78 uvede v sekvenci SEQ ID č. 5
VIP2A(a) VIP2 VIP2 z kmene AB78 uvede v sekvenci SEQ ID č. 2
VIPlA(b) homolog VIP1 VIP1 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis uvedený v sekvenci SEQ ID č. 21
VIP2A(b) homolog VIP2 VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis uvedený v sekvenci SEQ ID č. 20
VIP3A(a) VIP z kmene AB88 uvedený sekvenci SEQ ID č. 28 té přihlášky
VIP3A(b) VIP z kmene AB424 uvede v sekvenci SEQ ID č. 3 této přihlášky
Příklady provedeni vynalezu
Příklady formulací
Účinnými látkami používanými v následujících příkladech formulací jsou kmen Bacillus cereus s přírůstkovým číslem NRRL B-21058, kmeny Bacillus thuringiensis s přírůstkovými čísly NRRL B-21060, NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227 a NRRL B-21439, a kmeny Bacillus spp s přírůstkovými čísly NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230. Všechny uvedené kmeny jsou kmeny izolovanými z přírody, které obsahují pro hmyz specifické proteiny podle vynálezu.
Alternativně se používají jako účinné látky izolované pro hmyz specifické proteiny samotné nebo v kombinaci s výše uvedenými kmeny rodu Bacillus.
Al. Smáčitelné prášky spory Bacillus thuringiensis lignosulfonát sodný laurylsulfát sodný diisobutylnaftalensulfonát sodný oktylfenolpolyethylenglykolether (7-8 mol ethylenoxidu) vysokodisperzní kyselina křemičitá kaolin
Spory se důkladné promíchají rozemele ve vhodném mlýnu, čímž se které lze ředit vodou na suspenz koncentrací.
a) b) c) % 50 % 75 % % 5 % % - 5 % % 10 % %
% 10 % 10 % % 27 % s aditivy a směs se dobře získají smáčitelné prášky, e libovolných požadovaných
- 67 spory Bacillus thuringiensis 10 % oktylfenolpolyethyienglykolether (4-5 mol ethylenoxidu) 3 % dodecylbenzensulfonát vápenatý 3 % polyglykolether ricinového oleje (35 mol ethylenoxidu) 4 % cyklohexanon 30 % směs xylenů 50 %
A2 .
Emulgovatelný koncentrát
Z tohoto koncentrátu lze naředěním vodou libovolné požadované koncentrace.
získat emulze
A3 . Popraše spory Bacillus thuringiensis mastek kaolin
a) b) % 8 % %
%
Popraše vhodné k okamžitému použití se získají smícháním účinné látky s nosiči a rozemletím směsi ve vhodném mlýnu.
A4 . Vytlačované granule spory Bacillus thuringiensis 10 % lignosulfonát sodný 2 % karboxymethylcelulosa 1 % kaolin 87 %
Účinná látka nebo kombinace se smíchá a rozemele s aditivy, a směs se poté navlhčí vodou. Tato směs se vytlačuje, granuluje a poté se vysuší v proudu vzduchu.
A5 . Obalované granule spory Bacillus thuringiensis 3 % polyethylenglykol o molekulové hmotnosti 200 3 % kaolin 94 %
Účinná látka nebo kombinace se v míchačce rovnoměrně nanese na kaolin navlhčený polyethylenglykolem. Tímto způsobem se získá neprášící obalovaný granulát.
A6 . Suspenzní koncentrát spory Bacillus thuringiensis 40 % ethylenglykol 10 % nonylfenolpolyethylenglykolether (15 mol ethylenoxidu) 6 % lignosulfonát sodný 10 % karboxymethylcelulosa 1 %
37% vodný roztok formaldehydu 0,2 % silikonový olej ve formě 75% vodného roztoku 0,8 % voda 32 %
Účinná látka nebo kombinace se důkladně promíchá s aditivy, čímž se získá suspenzní koncentrát, ze kterého lze naředěním vodou připravit suspenze libovolné požadované koncentrace.
Příklad 1
Izolace a charakterizace AB78
Kmen Bacillus cereus AB78 byl izolován jako mikroorganismus kontaminující destičky v laboratoři na mediu T3 (na litr: 3 g tryptonu, 2 g tryptosy, 1,5 g kvasničného extraktu, 0,05 M fosforečnanu sodného (pH 6,8) a 0,005 g chloridu man69 ganatého; Travers, R. S., 1983) . Během logaritmické fáze růstu vykazuje AB78 podstatnou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Byla rovněž zjištěna antibiotická aktivita proti Gram-pozitivnímu Bacillus spp. (tabulka 12).
Tabulka 12
Antibiotická aktivita supernatantu kultury AB78
zóna inhibice (v cm)
Testovaná bakterie AB78 Streptomycin
Escherichia coli 0,0 3,0
Bacillus megaterium 1,1 2,2
Bacillus mycoides 1,3 2,1
Bacillus cereus CB 1,0 2,0
Bacillus cereus 11950 1,3 2,1
Bacillus cereus 14579 1,0 2,4
Bacillus cereus AB78 0,0 2,2
Bacillus thuringiensis var. israelensis 1,1 2,2
Bacillus thuringiensis var. tenebrionis 0,9 2,3
Morfologické charakteristiky AB78 jsou následující:
Vegetativní vlákna jsou rovná, dlouhá 3,1 - 5,0 mm a široká 0,5 - 2,0 mm. Buňky mají zakulaceně konce, jsou jednotlivé v krátkých řetězcích. Na buňku se vytváří jediná subterminální válcovitě-oválná endospora. Nevytváří se parasporální krystal. Kolonie jsou neprůhledné, nepravidelně zoubkované, lalokovíté a ploché. Nevytváří pigmenty. Buňky jsou pohyblivé. Jsou přítomné bičíky.
Růstové charakteristiky AB78 jsou následující:
Mikroorganismus je fakultativně anaerobní s optimální teplotou pro růst 21 - 30 °C. Roste při teplotě 15, 20, 25, a 37 °C. Neroste při teplotě přes 40 °C. Rostě v 5 - 7% chloridu sodném.
Tabulka 13 obsahuje biochemické údaje o AB78.
Tabulka 13
Biochemické charakteristiky kmene Bacillus cereus AB78
kyselina z L-arabinosy - zpětná oxidace methylenové
plyn z L-arabinosy - modři +
kyselina z D-xylosy - redukce nitrátu +
plyn z D-xyloxy - redukce N03 na NO2 +
kyselina z D-glukosy + VP +
plyn z D-glukosy - rozklad H202 +
kyselina z laktosy - indol -
plyn z laktosy - rozklad tyrosinu +
kyselina ze sacharosy - dihydroxyaceton -
plyn ze sacharosy - lakmusové mléko kyselé -
kyselina z D-manitolu - lakmusové mléko koagulované -
plyn z D-manitolu - lakmusové mléko alkalické -
využití propionátu + lakmusové mléko peptonizované -
využití citrátu + lakmusové mléko redukované -
hydrolýza hippurátu s hydrolýza kaseinu +
redukce methylenové modři + hydrolýza škrobu +
produkce lecithinasy s zkapalnění želatiny +
Legenda k tabulce 13:
s = slabá reakce
Příklad 2
Kultivace bakterií
Subkultura kmene Bacillus cereus AB78 byla použita k inokulaci následujícího media, známého jako TB-vývar ('TB broth):
trypton 12 g / 1 kvasničný extrakt 24 g / 1 glyceroí 4 ml / 1
KH2PO4 2,1 g / 1
K2HPO4 14,7 g / 1 pH 7,4
K autoklávovanému vývaru se po ochlazení přidá fosforečnan draselný. Baňky se inkubuji při teplotě 30 °C na rotační třepačce při 250 otáčkách za minutu po dobu 24 hodin až 36 hodin, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu.
Výše uvedený postup lze za použití procedur známých v oboru snadno upravit do rozsahu potřebného pro velké fermentory.
V průběhu vegetativního růstu, obvykle 24 - 36 hodin po započetí kultivace, tedy do počáteční až střední logaritmické fáze růstu, byly bakterie AB78 centrifugovány ze supernatantu kultury. Supernatant kultury obsahující aktivní protein byl použit v biologických testech.
- 72 Příklad 3
Biologické testy na hmyzu
Kmen Bacillus cereus AB78 byl testován proti různým druhům hmyzu jak je popsáno níže.
Diabrotica virgifera virgifera, Diabrotica longicornis barberi respektive Diabrotica undecempunctata howardi: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supernatant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Marrone a kol. (1985) J. of Economic Entomology 78: 290 - 293) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do misek. Čerstvě vylihlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6 dnů.
Biologické testy s klony Escherichia coli: buňky Escherichia coli se nechají růst přes noc ve vývaru obsahujícím 100 /xg/ml ampicillinu při teplotě 37 °C. 10 ml kultury se sonikuje třikrát po dobu vždy 2 0 sekund. 500 μΐ sonikované kultury se přidá k roztavené potravě pro Diabrotica virgifera virgifera.
Leptinotarsa decemlineata: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 - 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. Kousky listů bramboru o ploše 5 cm2 se ponoří do těchto roztoků, usuší se proudem vzduchu a umístí se na navlhčený filtrační papír v umělohmotových miskách. Čerstvě vylihlé larvy se umístí na kousky listů a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-5 dnů.
Tenebrio molitor: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci, zředěný supernatant se smíchá s roztavenou umělou potravou (Bioserv
č. F9240) a nechá se ztuhnout. Ztuhlá potrava se nařeže a umístí se do umělohmotových misek. Čerstvě vylíhlé larvy se umístí na potravu a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 6-8 dnů.
Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Heliothis virescens, Maduca sexta respektive Spodoptera exigua: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 pěstované po dobu 24 - 36 hodin v přípravku Triton X-100 tak, že konečná koncentrace činí 0,1 % TX-100. 100 μΐ se pipetuje na povrch 18 cm2 ztuhlé umělé potravy (Bioserv č. F9240) a nechá se uschnout na vzduchu. Čerstvě vylíhlé larvy se poté umístí na povrch potravy a udržuje se teplota 30 °C. Mortalita se stanoví po uplynutí 3-6 dnů.
Culex pipiens: připraví se ředění supernatantu kultury AB78 po 24- až 36-hodinové kultivaci. 100 μΐ se pipetuje do 10 ml vody v umělohmotové nádobě o objemu 30 ml. Do vody se přidají larvy ve stádiu třetího instaru a teplota se udržuje na teplotě místnosti. Mortalita se stanoví po uplynutí 24 - 48 dnů.
Spektrum insekticidní aktivity AB78 je uvedeno v tabulce 14
Tabulka 14
Účinnost supernatantu kultury AB78 proti různým hmyzím škůdcům
testovaný druh hmyzu řád účinnost
Diabrotica virgifera virgifera Coleoptera + + +
Diabrotica longicornis barberi Coleoptera +++
Diabrotica undecimpunctata howardi Coleoptera -
Leptinotarsa decemlineata Coleoptera -
Tenebrio molitor Coleoptera -
Ostrinia nubilalis Lepidoptera -
Heliothis virescens Lepidoptera -
Manduca sexta Lepidoptera -
Spodoptera exigua Lepidoptera -
Agrotis ipsilon Lepidoptera -
Culex pipiens Diptera -
Nově nalezený kmen Bacillus cereus AB78 vykazuje podstatně odlišné spektrum insekticidní účinnosti ve srovnání se známými δ-endotoxiny z Bacillus thuringiensis účinnými proti broukům. AB78 zejména vykazuje selektivnější účinnost proti broukům než známé kmeny Bacillus thuringiensis účinné proti broukům, jelikož je specificky účinný proti Diabrotica spp. Přesněji, je nejúčinnější proti Diabrotica virgifera virgifera a Diabrotica longicornis barberi, ale nikoli proti Diabrotica undecimpunctata howardi.
U řady kmenů Bacillus byla biologicky testována jejich účinnost v průběhu vegetativního růstu proti Diabrotica virgifera virgifera - viz tabulka 15. Výsledky svědčí o tom,
- 75 že AB78 je jedinečný svou účinností proti Diabrotica virgifera virgifera, která není obecným jevem.
Tabulka 15
Účinnost supernatantů kultur různých kmenů Bacillus spp. proti Diabrotica virgifera virgifera kmen Bacillus procento mortality Diabrotica virgifera virgifera
Bacillus cereus AB78 (Bat.l) 100
Bacillus cereus AB78 (Bat.2) 100
Bacillus cereus (Carolina Bio.) 12
Bacillus cereus ATCC 11950 12
Bacillus cereus ATCC 14579 8
Bacillus mycoides (Carolina Bio.) 30
Bacillus popilliae 28
Bacillus thuringiensis HD135 41
Bacillus thuringiensis HD191 9
Bacillus thuringiensis GC91 4
Bacillus thuringiensis isrealensis 24
voda (kontrola) 4
Specifická účinnost AB78 proti Diabrotica virgifera virgifera je uvedena v tabulce 16.
Tabulka 16
Účinnost supernatantu kultury AB78 proti čerstvě narozeným larvám Diabrotica virgifera virgifera
koncentrace supernatantu kultury (μΐ / ml) procento mortality Diabrotica virgifera virgifera
100 100
25 87
10 80
5 40
2,5 20
1 6
0 0
Bylo vypočítáno, že hodnota LC50 činí 6,2 μΐ supernatantu kultury na ml potravy Diabrotica virgifera virgifera.
Byly prováděny rovněž biologické testy buněčné pelety a nebyla zjištěna žádná účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Přítomnost účinnosti pouze v supernatantu tedy svědčí o tom, že tento vegetativní insekticidní protein je exotoxinem.
Příklad 4
Izolace a purifikace proteinů aktivních proti druhům rodu Diabrotica z AB78
Nasyceni kultivačního media prostého buněk a zbytků buněk se upraví na 70 % přidáním 472 g / 1 pevného síranu amonného. Rozpuštěni se provede při teplotě místnosti, následuje ochlazení v ledové lázni a centrifugace při 10000 g po dobu 30 minut, čímž se získá peleta vysrážených proteinů. Supernatant se odstraní a peleta se rozpustí v jedné desetině původního objemu 20mM TRIS-HCl při pH 7,5. Rozpuštěná peleta se odsolí buďto dialýzou v 20mM TRIS-HC1 při pH 7,5 nebo tak, že se nechá projít odsolovací kolonou.
Odsolený materiál se titruje na pH 3,5 za použití 20mM natirum-citrátu o pH 2,5. Po třicetiminutové inkubaci při teplotě místnosti se roztok centrifuguje při 3000 g po dobu 10 minut. Supernatant v této době obsahuje největší množství účinného proteinu.
Po neutralizaci pH na hodnotu 7,0 se supernatant nanese na anexovou kolonu Mono-Q ekvilibrovanou s 20mM TRIS o pH 7,5, s rychlostí průtoku 300 ml / min. Kolona se promývá postupným a lineárním gradientem za použití 400mM chloridu sodného v 2 0mM TRIS o pH 7,5.
Pro stanovení účinných frakcí se použijí biologické testy jednotlivých frakcí z kolony a elektroforéza v SDS-polyakrylamidovém gelu. Analýzou pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se zjistí, že biologicky účinný protein má složky o molekulové hmotnosti v rozmezí přibližně 80 kDa a 50 kDa.
Příklad 5
Analýza sekvence proteinu účinného proti druhům rodu Diabrotica
Protein o molekulové hmotnosti 80 kDa izolovaný pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu se přenese na póly(vinylidenfluoridovou) membránu a podrobí se N-koncovému sekvenování prováděnému pomocí opakovaných Edmanových cyklů na sekvenátoru ABI 470 pulsed-liquid sequencer. Přenos se provádí v lOmM CAPS-pufru s 10 % methanolu o pH 11,0 následujícím způsobem:
Po dobu 5 minut se provádí inkubace gelu po elektroforéze v přenosovém pufru. Póly(vinylidenfluoridová) membrána ProBlott se krátce namočí 100% methanolem a poté se ekvilibruje v přenosovém pufru. Materiál se vrstevnatě uspořádá mezi pěnovými houbami a čtverečky filtračního papíru s uspořádáním katoda-gel-membrána-anoda.
Po dobu 1 hodiny se provádí přenos s konstantním napětím 70 V.
Po přenosu se membrána promyje vodou a barví se po dobu 2 minut 0,25% modří Coomassie Blue R-250 v 50% methanolu.
Odbarvení se provede několikerým promytím směsí obsahující 50 % methanolu, 40 % vody a 10 % kyseliny octové.
Po odbarvení se membrána usuší proudem vzduchu a poté se vyříznou pásy pro sekvenační analýzu. Pro dosažení maximální účinnosti a výtěžku se použije BlottCartridge a příslušné cykly. Provede se analýza údajů za použití softwaru model 610 Sequence Analysis pro identifikaci a kvantifikaci aminokyselin derivovaných fenylthiohydantoinem, v každém sekvenačním cyklu.
Bylo zjištěno, že N-koncová sekvence je následující:
NH2-Lys-Arg-Glu-Ile-Asp-Glu-Asp-Thr-Asp-Thr-Asx-Gly-Asp-Ser-Ile-Pro- (SEQ ID č. 8), kde Asx znamená Asp nebo Asn. Úplná aminokyselinová sekvence složky o molekulové hmotnosti 80 kDa je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 7. DNA-sekvence, která kóduje sekvenci SEQ ID č. 7 je uvedena v SEQ ID č. 6.
Příklad 6
Konstrukce DNA-sondy
Připraví se oligonukleotidová sonda pro oblast genu kódující aminokyseliny 3 - 9 N-koncové sekvence (příklad 5).
Sonda se syntetizuje na základě znalosti použití kodónů genu δ-endotoxinu z Bacillus thuringiensis (Bt) . Jako sonda v
Southernových hybridizacích se použije nukleotidová sekvence
5'-GAA ATT GAT CAA GAT ACN GAT-3' (SEQ ID č. 9)
Oligonukleotid se syntetizuje za použití standardních postupů a zařízení.
Příklad 7
Stanovení izoelektríckého bodu proteinu účinného proti druhům rodu Diabrotica
Purifikovaný protein ze stupně 5 purifikačního postupu se analyzuje na 3 - 9 pí izoelektrickém fokusačním gelu za použití elektroforézního systému Phastgel (Pharmacia). Standardní postupy ovládání jednotky se použijí jak při
separaci přibližně tak při vyvíjení obarvení stříbrem. 4,9. Hodnota pí činí
Příklad 8
Údaje o (PCR) analýze AB78 pomocí polymerasové řetězové reakce
Pro ověření, že kmen Bacillus cereus AB78 neobsahuje
žádné geny insekticidních krystalických proteinů Bacillus thuringiensis nebo Bacillus sphaericus byla použita analýza pomocí polymerasové řetězové reakce (viz například patentová přihláška Spojených Států Amerických č. 08/008 006, a Carozzí a kol. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 57 (11) : 3057 až 3061). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 17.
Tabulka 17
Primery genů insekticidních krystalických proteinů Bacillus testované pomocí polymerasové řetězové reakce proti
DNA z AB78
testované primery produkován produkt
2 sady specifické pro CrylIIA negativní
CrylIIB negativní
2 sady specifické pro CrylA negativní
CrylA(a) negativní
specifický pro CrylA(b) negativní
CrylB negativní
specifický pro CrylC negativní
specifický pro CrylE negativní
2 sady specifické pro Bacillus sphaericus negativní
2 sady specifické pro CrylV negativní
kontrola Bacillus (PI-PLC) pozitivní
Příklad 9
Klonování celkové DNA z kmene Bacillus cereus AB78 pomocí kosmidů
Gen VIPlA(a) byl klonován z celkové DNA připravené z kmene AB78 následujícím způsobem:
Izolace DNA z A.B78 se provede následovně:
1. Bakterie se nechají růst přes noc v 10 ml media L-broth (za použití sterilní centrifugační zkumavky o objemu 50 ml).
2. Přidá se 25 ml čerstvého media L-broth a 30 gg / ml ampicillinu.
3. Buňky se nechají růst po dobu 2-6 hodin na třepačce při teplotě 30 °C.
4. Buňky se odstředí v polypropylenové kyvetě s oranžovým uzávěrem o objemu 50 ml ve stolní klinické centrifuze IEC při 3/4 rychlosti.
5. Peleta buněk se resuspenduje v 10 ml TES (TES = 50mM TRIS o pH 8,0, lOOmM kyselina ethylendiamintetraoctová, 15mM chlorid sodný).
6. Přidá se 30 mg lysozymu a provede se inkubace po dobu 2 hodin při teplotě 37 °C.
7. Přidá se 200 μΐ 20% SDS (dodecylsulf átu sodného) a 400 μΐ zásobního roztoku Proteinasy K (20 mg / ml) a provádí se inkubace při teplotě 37 °C.
8. Přidá se 200 μΐ čerstvé Proteinasy K a provádí se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 55 °C. Přidá se 5 ml TES pro dosažení konečného objemu 15 ml.
9. Provede se dvakrát fenolová extrakce (10 ml fenolu, centrifugace se provádí při teplotě místnosti při 3/4 rychlosti ve stolní klinické centrifuze IEC). Supernatant (vrchní část) se přenese do čisté zkumavky pomocí pipety s velkým průměrem.
10. Provede se jednou extrakce směsí, kterou tvoří v objemovém poměru 1 : 1 fenol a chloroform s isoamyl82 alkoholem (v poměru 24 : 1).
11. DNA se vysráží stejným objemem studeného isopropanolu.
Provede se centrifugace, kterou se vytvoří peleta DNA.
12. Peleta se resuspenduje v 5 ml TE.
13. DNA se vysráží 0,5 ml 3M octanu sodného o pH 5,2 a ml 95% ethanolu. Směs se umístí na 2 hodiny do -20 °C.
. DNA se vyjme ze zkumavky umělohmotovým očkem, přenese se do kyvety pro mikrocentrifugaci, odstředí se, odpipetuje se nadbytek ethanolu, a vysuší se ve vakuu.
15. DNA se resuspenduje v 0,5 ml TE. Provede se inkubace po dobu 90 minut při teplotě 65 °C, pro usnadnění převedení DNA zpět do roztoku.
16. Za použití standardních postupů se stanoví koncentrace.
Klonování AB78 pomocí kosmidů:
Všechny postupy, pokud není uvedeno jinak, se provádějí podle instrukčního manuálu firmy Stratagene (Stratagene Protocol, Supercos 1 Instruction Manual, kat. č. 251301).
Obecně se provedou následující kroky:
A. DNA AB78 se částečně rozštěpí Sau 3A.
B. Připraví se vektorová DNA.
C. Provede se ligace a packaging (sbalení) DNA.
D. Vytvoří se kosmidová knihovna:
1. Vytvoří se kultura buněk HB101 tak, že se umístí ml kultury pěstované přes noc do 5 ml TB s
0,2 % maltosy. Kultura se inkubuje po dobu 3,5 hodiny při teplotě 37 °C.
2. Buňky se odstředí a resuspenduj í v 0,5 ml lOmM síranu hořečnatého.
. Smíchá se :
100 ml buněk,
100 ml naředšné směsi se sbalenou DNA,
100 ml lOmM síranu hořečnatého, ml TB.
4. Provede se adsorbce při teplotě místnosti po dobu 30 minut, přičemž se směs nemíchá.
5. Přidá se 1 ml TB a směs se mírně míchá. Provádí se inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C.
6. 200 ml se nanese na destičky L-amp. Provádí se inkubace při teplotě 37 °C přes noc.
Alespoň 400 kosmidových klonů bylo náhodně vybráno a byla u nich zkoumána účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera jak je popsáno v příkladu 3. DNA z 5 účinných klonů a 5 neúčinných klonů byla použita pro Southernovy hybridizace. Výsledky svědčí o tom, že hybridizace za použití výše popsané oligonukleotidové sondy je v korelaci s účinností proti Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 18) .
Kosmidové klony P3-12 a P5-4 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL) a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21061 respektive NRRL B-21059.
Tabulka 18
Účinnost kosmidových klonů AB7 8 proti Diabrotica virgifera virgifera
klon průměrné procento mortality (N=4)
klony které hybridizují se sondou
Pl-73 47
Pl-83 64
P2-2 69
P3-12 85
P5-4 97
klony které nehybridizují se sondou
Pl-2 5
P3-8 4
P3-9 12
P3-18 0
P4-6 9
Příklad 10
Identifikace oblasti o velikosti 6 kb účinné proti Diabrotica virgifera virgifera
DNA z P3-12 byla částečně rozštěpena pomocí restrikčního enzymu Sau 3A a ligována do vektoru pUC19 pro Escherichia coli, jímž byla transformována Escherichia coli. DNA-sonda specifická pro protein VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 80 kDa byla syntetizována amplifikaci části DNA P3-12 pomocí polymerasové řetězové reakce (PCR). Za použití částečné aminokyselinové sekvence proteinu o molekulové hmotnosti 80 kDa byly syntetizovány oligonukleotidy MK113 a MK117, které hybridizují s částmi VIPlA(a). Kolonovou hybridizací se sondou vytvořenou pomocí polymerasové řetězové reakce byly identifikovány plazmidové subklony a testována jejich účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Jeden z těchto klonů, PL2, hybridizuje s fragmentem vytvořeným pomocí polymerasové řetězové reakce, a je v dříve popsaném testu účinný proti Diabrotica virgifera virgifera.
Restrikční fragment Cla I o velikosti 6 kb z pL2 byl klonován do místa Srna I kyvadlového vektoru (shuttle vector) pHT 3101 pro Escherichia coli - Bacillus (Lereclus, D. a kol., FEMS Microbiology Letters 60: 211 - 218 (1989)), čímž byl získán pCIB6201. Tento konstrukt propůjčuje účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera jak kmenům Bacillus tak Escherichia coli, v libovolné orientaci. pCIB6022 obsahuje stejný fragment Cla I o veliksoti 6 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene), produkuje ekvivalentní protein VIPlA(a) (stanoveno pomocí western blottingu) a je rovněž účinný proti Diabrotica virgifera virgifera.
Nukleotidová sekvence pCIB6022 byla určena pomocí postupu využívájícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467 (1977), za použití sekvenačních souprav PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru ABI 373. Sekvence je uvedena jako SEQ ID č. 1. Fragment o velikosti 6 kb kóduje jak VIPlA(a) tak VIP2A(a) , jak je zřejmé z otevřených čtecích rámců popsaných v sekvenci SEQ ID č. 1. Sekvence kódující VIP2A(a) je dále uvedena v SEQ ID č. 4. Vzájemný vztah VIPlA(a) a VIP2A(a) v rámci fragmentu o velikosti 6 kb nacházejícího se v pCIB6022 je uveden v tabulce 19. pCIB6022 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21222.
Příklad 11
Funkční štěpení oblasti DNA VIPlA(a)
Pro ověření, že je otevřený čtecí rámec (ORF) VIPlA(a) nutný pro insekticidní účinnost, byla v genu vytvořena mutace měnící translační rámec. Restrikční enzym Bgl II poznává jedinečné místo umístěné 857 bp v kódující oblasti VIPlA(a). pCIB6201 byl rozštěpen Bgl II a jednovlákné konce doplněny DNA-polymerasou (Klenow fragmentem) a dNTP. Plazmid byl zpětně ligován a transformován do Escherichia coli. Výsledný plazmid, pCIB6203, obsahuje čtyři nukleotidové inzerce v kódující oblasti VIPlA(a). pCIB6203 nedodává insekticidní účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, což potvrzuje, že VIPlA(a) je nezbytnou složkou účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera.
Pro další definování oblasti nutné pro kódování VIPlA(a) byly zkonstruovány subklony VIPlA(a) a VIP2A(a) (pomocný protein) a byla testována jejich schopnost doplnit mutaci v pCIB6203. pCIB6023 obsahuje fragment Xba I - EcoRV o velikosti 3,7 kb ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene). Analýza pomocí western blottingu svědčí o tom, že pCIB6023 produkuje protein VIPlA(a) o stejné velikosti a ve stejném množství jako klony PL2 a pCIB6022. pCIB6023 obsahuje celý gen kódující protein o molekulové hmotnosti 80 kDa. pCIB6023 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria,
Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21223N. pCIB6206 obsahuje fragment Xba I - Cla I o velikosti 4,3 kb z pCIB6022 ve vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene). pCIB6206 byl rovněž uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21321.
pCIB6023, pCIB6206 a pCIB6203 nevykazují při odděleném testování detekovatelnou účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Avšak směs buněk obsahujících pCIB6203 (mutovaný VIPlA(a) plus VIP2A(a)) a buněk obsahujících pCIB6023 (pouze VIPlA(a)) vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Podobně vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera směs buněk obsahujících pCIB6206 a buněk obsahujících pCIB6203.
Pro další definování možností VIP2A(a) byl zkonstruován pCIB6024, který obsahuje celou oblast kódující VIP2A(a), ale postrádá většinu oblasti kódující VIPlA(a). pCIB6024 byl zkonstruován gelovou purifikací restrikčního fragmentu Cla I - Sca I o velikosti 2,2 kb z pCIB6022, doplněním jednovlákných konců DNA-polymerasou (Klenow fragmentem) a dNTP a ligací tohoto fragmentu do vektoru pBluescript SK(+) (Stratagene) rozštěpeného enzymem Eco RV. Buňky obsahující pCIB6024 nevykazují žádnou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Směs buněk obsahujících pCIB6024 a buněk obsahujících pCIB6023 však vykazuje vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera (viz tabulka 19).
pCIB6023 a pCIB6206 tedy musí produkovat funkční produkt genu VIPlA(a), zatímco pCIB6203 a pCIB6204 musí produkovat funkční produkt genu VIP2A(a). Tyto výsledky svědčí o tom, že je pro dodání maximální účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera nutný genový produkt (nebo produkty) z oblasti VIP2A(a), v kombinaci s VIPlA(a) (viz tabulka 19).
Tabulka 19
Charakterizace pCIB6022 účinnost proti Dw
X S Rl 8 RV C
VlP2A(a.V........ J1 j.....H||^ I YLglA(u)-..........-J_[
pCIB6022 pCIB6203 pCIB6023 pCIB6206 pCIB6024 +++
Funkční komplementace vegetativních insekticidních proteinů (VIP) účinnost proti Dw pCIB6203 _J pCIB6023 +++
J pCIB6203 J pCIB6206 +++ pCIB6023 pCIB6024 +++
Legenda k tabulce 19 :
Dvv = Diabrotica virgifera virgifera
Oblasti v rámečcích představují rozsah VIPlA(a) a VIP2A(a). Bílý rámeček označuje oblast VIP1 kódující peptid o molekulové hmotnosti 80 kDa pozorovaný u Bacillus. Tmavý rámeček představuje N-koncový propeptid VIPlA(a) předpovezený analýzou DNA-sekvence. Vytečkovaný rámeček představuje oblast kódující VIP2A(a). Velké X znázorňuje umístění mutace měnící čtecí rámec (posunové mutace) zavedené do VIPlA(a). Šipky představují konstrukty transkribované beta-galaktosidásovým promotorem. Restrikční místa: C - Cla I; X - Xba I; S - Sca I; RI - Eco RI; B - Bgl II; RV - Eco RV.
Příklad 12
Tvorba protilátek proti AB78
Ve 2 Lewisových krysách byla vyvolána tvorba protilátek jednak za účelem umožnit budoucí tvorbu hybridomových buněčných linií, jednak rovněž vytvořit dostatečné množství séra pro omezený screening genomové DNA-knihovny. Dalším faktorem bylo velmi omezené dostupné množství antigenu a skutečnost, že jej bylo možné produkovat v čisté formě pouze pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu a následného elektrotransferu na nitrocelulosu.
Vzhledem k omezené dostupnosti antigenu na nitrocelulose byla nitrocelulosa emulgována v dimethylsulfoxidu a injikována do zadních tlapek zvířat pro vyvolání produkce B-buněk v podkolenních mízních uzlinách bezprostředně proti proudu krve. Pomocí western-anylýzy při prvním produkčním odběru krve bylo zjištěno, že je produkováno silně reagující sérum. Pomocí několika následných injekcí a odběrů krve bylo vytvořeno dostatečné množství séra pro provedení všech požadovaných screeningů.
Poté byla u jedné z krys vyvolána tvorba hybridomu. Podkolenní mízní uzlina byla vyříznuta, macerována, a výsledné buňky fúzovány s myším myelomem P3x63Ag8.653. Následující vyhledávací test buněk byl proveden jak je popsáno níže. Čtyři původní jamky, které vykazovaly nejvyšší reakci na emulgovaný antigen, byly vybrány pro přenesení ke klonování v omezeném zředění. Dalších 10 jamek bylo vybráno pro expanzi a kryoprezervaci.
Postup emulgace AB78 na nitrocelulose v dimethylsulfoxidu pro screening pomocí ELISA-testu:
Po elektrotransferu vzorků AB78 rozdělených elektroforézou v polyakrylamidovém gelu na nitrocelulosu se použije pro vizualizaci veškerého přeneseného proteinu reverzibilní Ponceau S. Pás odpovídající toxinu AB78, dříve identifikovanému a sekvenovanému od N-konce, se identifikuje a vyřízne z nitrocelulosy. Každý pás má rozměry přibližně 1 mm x 5 mm za účelem minimalizace množství emulgované nitrocelulosy. Jediný pás se umístí do mikrocentrifugační kyvety s 250 μΐ dimethylsulfoxidu a maceruje se za použití umělohmotového tloučku (Kontes, Vineland, New Jersey, USA) . Pro usnadnění emulgace se směs s dimethylsulfoxidem zahřívá po dobu 2 až 3 minut na teplotu 37 °C až 45 °C. Po zahřátí může být nutná určitá další macerace, všechnu nitrocelulosu je však třeba emulgovat. Jakmile je vzorek AB78 emulgován, umístí se na led. Při přípravě k nanesení na mikrotitrační desky s emulgovaným antigenem se vzorek musí naředit v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku v následujících poměrech: 1 : 5, 1 : 10, 1 : 15, 1 : 20, 1 : 30, 1 : 50, 1 : 100, a 0. Antigen pro nanesení na desky musí být připraven čerstvý bezprostředně před použitím.
Protokol ELISA-testu:
1. Nanese se AB78 v dimethylsulfoxidu naředěný v borátem pufrovaném fyziologickém roztoku. Provede se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.
2. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.
3. Provádí se blokování (1 % BSA a 0,05 % povrchově aktivního činidla Tween 20 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátovým pufrem) po dobu 30 minut při teplotě místnosti.
4. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.
5. Přidá se krysí sérum a provede se inkubace po dobu 1,5 hodiny při teplotě 37 °C.
6. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.
7. Přidá se kozí protikrysí v koncentraci 2 gg / ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.
8. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.
9. Přidá se králičí protikozí alkalická fosfatasa v koncentraci 2 μg / ml v ředidle pro ELISA-test. Provede se inkubace po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C.
10. Desky se 3x omyjí lx omývacím pufrem pro ELISA-test.
11. Přidá se substrát a provede se inkubace po dobu 30 minut při teplotě místnosti.
12. Test se zastaví po 30 minutách 3N hydroxidem sodným.
Příprava antiséra proti VIP2A(a)
Částečně purifikovaný supernatant kultury AB78 se rozdělí nekontinuální elektroforesou v SDS-polyakrylamidovém gelu (Novex) podle pokynů výrobce. Rozdělené proteiny se elektroforeticky přenesou na nitrocelulosu (S&S č. 21640), jak popsali Towbin a kol. (1979) . Nitrocelulosa se obarví pomocí Ponceau S a identifikuje se pás VIP2A(a). Pás VIP2A(a) se vyřízne a emulguje v dimethylsulfoxidu bezprostředně před injekcí. Králík se nejprve imunizuje emulgovaným VIP2A(a) smíchaným v poměru přibližně 1 : 1 s Freundovými kompletním adjuvantem intramuskulámí injekcí na čtyřech různých místech. Následné imunizace se provádějí v čtyřtýdenních intervalech a jsou identické jako první imunizace, s tím rozdílem, že se použije Freundovo nekompletní adjuvans. První sérum získané pro imunizaci reagovalo s proteinem VIP2A(a). Analýzou supernatantu kultury AB78 pomocí western blottingu za použití tohoto antiséra se identifikuje převážně protein VIP2A(a) o plné délce.
Příklad 13
Aktivace insekticidní účinnosti neúčinných kmenů Bacillus thuringiensis pomocí klonů VIP AB78
Přidání pCIB6203 spolu se supernatantem kultury rostoucí po dobu 24 hodin (počáteční až střední logaritmická fáze) z kmene Bacillus thuringiensis GC91 způsobuje 100% mortalitu u Diabrotica virgifera virgifera. Tkni pCIB6203 ani GC91 není samotný účinný proti Diabrotica virgifera virgifera. Údaje jsou uvedeny níže:
testovaný materiál procento mortality Diabrotica
pCIB6203 0
GC91 16
pCIB6203 + GC91 100
kontrola 0
Příklad 14
Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus cereus AB81
Druhý kmen Bacillus cereus, označený AB81, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomoci standardních postupů. Subkultura AB81 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:
testované druhy hmyzu procento mortality
Ostrinia nubilalis 0
Agrotis ipsilon 0
Diabrotica virgifera virgifera 55
Přiklad 15
Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus thuringiensis AB6
Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB6, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB6 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu.
Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v přikladu 3. Výsledky jsou následující:
testované druhy hmyzu procento mortality
Ostrinia nubilalis 0
Agrotis ipsilon 100
Agrotis ipsilon (autoklávovaný 0
vzorek)
Diabrotica virgifera virgifera 0
Sníženi insekticidní účinnosti supernatantu kultury na nepodstatné hodnoty pomocí autoklávování svědčí o tom, že účinnou látkou není β-exotoxin.
Kmen AB6 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21060.
Příklad 16
Izolace a biologická charakterizace kmene Bacillus thuringiensis AB88
Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB88, byl izolován ze vzorků prachu z obilního zásobníku pomocí standardních postupů. Subkultura AB88 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2. Polovina vzorku byla autoklávována po dobu 15 minut pro testování přítomnosti β-exotoxinu. Biologická účinnost proti řadě druhů hmyzu byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:
testované druhy hmyzu řád procento mortality v případě supernatantu kultury
neautoklávova- ného autoklávová- ného
Agrotis ipsilon Lepidoptera 100 5
Ostrinia nubilalis Lepidoptera 100 0
Spodoptera frugiperda Lepidoptera 100 4
Helicoverpa zea Lepidoptera 100 12
Heliothís virescens Lepidoptera 100 12
Leptinotarsa decemlineata Coleoptera 0 0
Diabrotica virgifera virgifera Coleoptera 0 5
Snížení insekticidní účinnosti supernatantu kultury na nepodstatné hodnoty pomocí autoklávování svědčí o tom, že účinnou látkou není β-exotoxin.
Krystaly δ-endotoxinu byly purifikovány z kmene AB88 za použití standardních postupů. Při biologických testech proti Agrotis ipsilon nebyla u čistých krystalů pozorována žádná účinnost.
Příklad 17
Purifikace vegetativních insekticidních proteinů z kmene AB88
Kapalná kultura bakterií byla nechána růst přes noc při teplotě 30 °C v TB-mediu. Buňky byly odcentrifugovány při
5000 g za 20 minut a byl odebrán supernatant. Proteiny přítomné v supernatantu byly vysráženy síranem amonným (70% nasycení) , centrifugovány při 5000 g po dobu 15 minut a byla odebrána peleta. Tato peleta byla resuspendována v původním dialyzovánan přes noc proti 4 °C. Dialyzát AB88 byl materiál z AB78
Dialyzát objemu 2 0mM Tris o pH 7,5 a stejnému pufru při teplotě zakalenější než srovnatelný byl titrován na pH 4,5 za použití 20mM natrium-citrátu o pH 2,5 a po 30-minutové inkubaci při teplotě místnosti byl roztok centrifugován při 3000 g po dobu 10 minut. Proteinová rozpuštěna ve 20mM Bis-Tris-propanu o peleta pH 9,0 byla znovu
Po vyčeření byly separovány proteiny AB88 pomocí několika různých metod, včetně izoelektrické fokusace (Rotofor, BioRad, Hercules, Kalifornie, UDSA), precipitace při pH 4,5, chromatografie na iontoměničích, vytěsňovací chromatografie a ultrafiltrace.
Proteiny byly separovány na anexové koloně Poros HQ/N (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA) za použití lineárního gradientu od 0 do 500mM chloridu sodného ve 20mM Bis-Tris-propanu o pH 9,0 s rychlostí průtoku 4 ml za minutu. Insekticidní protein se vymýval při 250mM koncentraci chloridu sodného.
Protein účinný proti Ostrinia nubilalis zůstal v peletě získané pomocí precipitace dialyzátu při pH 4,5. Po provedení preparativní izoelektrické fokusace dialyzátu za použiti amfolytů pH 3-10 byla nalezena insekticidní účinnost proti Ostrinia nubilalis ve všech frakcích s pH 7 nebo vyšším. Pomocí. elektroforézy těchto frakcí v SDS-polyakrylamidovém gelu byly nalezeny pásy proteinů o molekulové hmotnosti přibližně 60 kDa a přibližně 80 kDa. Pásy 60 kDa a 80 kDa byly odděleny pomoci anexové vysoceúčinné kapalinové chromatografie na koloně Poros-Q (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA, USA) . N-koncová sekvence byla získána ze dvou
- 97 frakcí obsahujících proteiny které se mírně lišily molekulovou hmotností, oba však měly velikost přibližně 60 kDa.
Získané sekvence si byly navzájem podobné a rovněž byly podobné některým δ-endotoxinům.
anexová frakce 23 (menší anexová frakce 28 (větší xEPFVSAxxxQxxx (SEQ ID č. 10) xEYENVEPFVSAx (SEQ ID č. 11)
Pokud byla peleta účinná proti získaná precipitací dialyzátu při pH 4,5 anexové kolony Poros-Q, byla účinnost frakcích s hlavním pásem o molekulové 60 kDa.
Ostrinia nubilalis dále dělena pomoci nalezena pouze ve hmotnosti přibližně
Protein účinný proti Agrotis ipsilon rovněž zůstával v peletě při okyselení dialyzátu AB88 na pH 4,5. Při preparativní isoelektrické fokusaci za použití amfolytů pH 3-10 nebyla účinnost zjištěna ve frakcích účinných proti Ostrinia nubilalis, místo toho byla nejvyšší ve frakci o pH 4,5 - 5,0. Její hlavní složky měly molekulovou hmotnost přibližně 35 kDa a přibližně 80 kDa.
Peleta s pH 4,5 byla rozdělena pomoci anexové vysoceúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), čímž byly získány frakce obsahující pouze materiál o molekulové hmotnosti 35 kDa a frakce obsahující jak pásy o molekulové hmotnosti 35 kDa tak 80 kDa.
Přiklad 18
Charakterizace vegetativních insekticiních proteinů AB88
Frakce obsahující vegetativní proteiny účinné proti různým druhům motýlů byly vytvořeny jak je popsáno v příkladu
17. Frakce vykazující insekticidní účinnost byly rozděleny v až 16% SDS-polyakrylamidových gelech a přeneseny na póly(vinylidenfluoridové) membrány (LeGendre a kol. (1989) v »
A Practical Guide to Protein and Peptide Purification for
Microsequencing, ed. Matsudaria PT (Academie Press lne., New
York, USA) . Biologická analýza frakci svědčí o tom, že za účinnost proti různým druhům z řádu motýlů jsou zodpovědné různé vegetativní insekticidní proteiny (VIP).
Účinnost proti Agrotis ipsilon je způsobena proteinem o molekulové hmotnosti 80 kDa nebo/a proteinem o molekulové hmotnosti 35 kDa, podanými buď jednotlivě nebo v kombinaci. Tyto proteiny nejsou příbuzné žádným δ-endotoxinům z Bacillus thuringiensis, což dokazuje neexistence sekvenční homologie se známými sekvencemi δ-endotoxinů z Bacillus thuringiensis. Insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 je přítomen hlavně (alespoň 75 % z celkového množství) v supernatanech kultur AB8 8 .
Tyto proteiny se rovněž nenacházejí v δ-endotoxinovém krystalu AB88. N-koncové sekvence hlavních δ-endotoxinových proteinů byly srovnány s N-koncovými sekvencemi vegetativních insekticidních proteinů o molekulové hmotnosti 80 kDa a 35 kDa a nevykazují žádnou sekvenční homologii. N-koncová sekvence insekticidního proteinu vip3A(a) obsahuje řadu kladně nabitých zbytků (od Asn2 do Asn7) následovaných hydrofobní základní oblastí (od Thr8 do Ile34). Na rozdíl od většiny známých sekrečních proteinů není insekticidní protein vip3A(a) z kmene AB88 v průběhu exportu upravován na N-konci.
Výsledky jsou shrnuty níže:
N-koncové sekvence vegetativních N-koncová sekvence hlavních insekticidních proteinů z Agrotis δ-endotoxinových proteinů
130 kDa
MDNNPNINE (SEQ ID č. 14) kDa 80 kDa
MNKNNTKLPTRALP (SEQ ID č. 12) MDNNPNINE (SEQ ID č. 15)
60kDa
MNVLNSGRTTI (SEQ ID č. 16) kDa
ALSENTGKDGGYIVP (SEQ ID č. 13)
Účinnost proti Ostrinia nubilalis je způsobena vegetativním insekticidním proteinem o molekulové hmotnosti 60 kDa a účinnost proti Spodoptera frugiperda je způsobena vegetativním insekticidním proteinem neznámé velikosti.
Kmen Bacillus thuringiensis AB88 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21225.
Příklad 18A
Izolace a biologická účinnost kmene Bacillus thuringiensis AB424
Kmen Bacillus thuringiensis, označený AB424, byl izolován z mechem porostlé borové šišky pomocí standardních postupů známých v oboru. Subkultura AB424 byla pěstována a připravena pro biologický test jak je popsáno v příkladu 2.
Biologická účinnost byla stanovena jak je popsáno v příkladu 3. Výsledky jsou následující:
- 100
100
——- ~
< -σ
0 i— X,
£· C3>
M S O
Zj 73- 2 W κ
— i— 3^
o O □
in
o
testované druhy hmyzu procento mortality
Ostrinia nubilalis 100
Agrotis ipsilon 100
Diabrotica virgifera virgifera 0
Kmen AB424 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Ilinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo NRRL B-21439.
Příklad 18B
Klonování genů VIP3A(a) a VIP3A(b), které kódují proteinů účinné proti Agrotis ipsilon
Celková DNA z izolátů AB88 a AB424 byla izolována (Ausubel a kol. (1988), v: Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, USA)), rozštěpena restrikčními enzymy Xbal (knihovna Xbal-fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,0 až 5,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB88) respektive EcoRI (knihovna EcoRI- fragmentů velikostně frakcionovaných na 4,5 až 6,0 kb z DNA Bacillus thuringiensis AB424), ligována do vektoru pBluescript předem linearizovaného stejnými enzymy a defosforylovaného, a transformována do kmene Escherichia coli DH5cc. Rekombinantní klony byly blotovány na nitrocelulosové filtry, které byly následně analyzovány za použití sondy, kterou byl 32P-značený oligonukleotid o délce 33 bází odpovídající 11 N-koncovým aminokyselinám proteinu o molekulové hmotnosti 80 kDa účinného proti Agrotis ipsilon. Hybridizace byla prováděna při teplotě 42 °C v 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného
101 (lx SSC = 0,15M chlorid sodný a 0,015M natrium-citrát, pH 7,4) po dobu 5 minut a dvakrát při teplotě 50 °C v lx SSC s 0,1 % dodecylsulfátu sodného po dobu 10 minut. Čtyři ze 400 rekombinantních klonů byly pozitivní. V biologických testech na hmyzu vykazovaly pozitivní rekombinanty srovnatelnou toxicitu pro larvy Agrotis ipsilon jako supernatanty AB88 nebo AB424.
Plazmid pCIB7104 obsahuje Xbal-fragment z DNA AB88 o velikosti 4,5 kb. Byly zkonstruovány subklony pro stanovení oblasti kódující insekticidní protein.
Escherichia coli pCIB7105 byl zkonstruován klonováním fragmentu Xbal-AccI o velikosti 3,5 kb z pCIB7104 do vektoru pBluescript.
Plazmid pCIB7106 obsahoval EcorI-fragment o velikosti 5,0 kb z DNA AB424. Tento fragment byl dále rozštěpen HincII za vzniku inzertu EcoRI-HincII o velikosti 2,8 kb (pCIB7107), který stále kódoval funkční insekticidní protein.
Nukleotidová sekvence pCIB7104, pozitivního rekombinantního klonu z AB88, a pCIB7107, pozitivního rekombinantního klonu z AB424, byla stanovena pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 - 5467 (1977), za použití sekvenaóních souprav PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenační soupravy PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analyzována na automatickém sekvenátoru ABI 373.
Klon pCIB7104 oblast je uvedena jehož kódující 28. Sekvence
29. Syntetická obsahuje gen VIP3A(a) , v sekvenci SEQ ID č. kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č.
verze kódující oblasti vytvořená tak, aby byla vysoce exprimována v kukuřici, je uvedena v SEQ ID č. 30. Na základě aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID č. 29 lze vytvořit
102 libovolný počet syntetických genů.
Klon pCIB7107 obsahuje gen VIP3A(b), jehož kódující oblast je uvedena v sekvenci SEQ ID č. 31. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SEQ ID č. 32.
Jak pCIB7104 tak pCIB7107 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21422 respektive B-21423.
Gen VIP3A(a) obsahuje otevřený čtecí rámec (ORF), který sahá od nukleotidu 732 do nukletidu 3105. Tento otevřený čtecí rámec kóduje peptid o délce 791 aminokyselin, s molekulovou hmotností odpovídající 88500 daltonům. Shine-Dalgarnova sekvence (SD) je umístěna 6 bází před prvním methioninem a její sekvence svědčí o tom, že se jedná o silnou Shine-Dalgarnovu sekvenci pro Bacillus.
Gen VIP3A(b) je z 98 % identický s VIP3A(a).
Při zkoumání blotů celkové DNA izolované z buněk Bacillus thuringiensis AB88 pomocí sondy, kterou je fragment o velikosti 33 bází odpovídající N-koncové oblasti insekticidního proteinu VIP3A, lze ve vzorcích štěpených různými restrikčními enzymy pozorovat jediné pásy. Tento výsledek byl potvrzen za použití větších sond odpovídajících kódující oblasti genu. Rešerší v databázi GenBank nebyla zjištěna žádná homologie se známými proteiny.
Příklad 18C
Exprese insekticidních proteinů VIP3A
Časový průběh exprese insekticidního proteinu VIP3A(a) byl analyzován pomocí western blottingu. Vzorky kultur Bacillus thuringiensis AB88 byly odebírány během celé růstové křivky a sporulace. Insekticidní protein VIP3A(a) lze
103 detekovat v supernatantech kultur AB88 během logaritmické fáze, již 15 hodin po založení kultury. Jeho obsah dosahuje maximální hodnoty během počátečních stádií stacionární fáze a zůstává vysoký během sporulace a po ní. Podobných výsledků bylo dosaženo při použití supernatantů kultur Bacillus cereus AB424. Hladiny insekticidního proteinu VIP3A(a) odrážejí expresi genu VIP3A(a), jak se stanoví northern blottingem. Počátek sporulace byl stanoven přímým mikroskopickým pozorováním a analýzou přítomnosti δ-endotoxinů v buněčných peletách. Proteiny typu Cry-I lze detekovat v pozdních stádiích stacionární fáze, během sporulace a po ní.
Příklad 18D
Identifikace nových genů podobných VIP3 pomocí hybridizace
Pro identifikaci kmenů Bacillus obsahujících geny příbuzné VIP3A(a) z izolátu AB88 byla pomocí hybridizace zkoumána sada izolátů Bacillus. Kultury 463 kmenů rodu Bacillus byly pěstovány v mikrotitračních jamkách až do sporulace. Pro přenesení kultur na 150 mm desky obsahující L-agar bylo použito zařízení s 96 hroty. Inokulované desky byly uchovávány při teplotě 30 °C po dobu 10 hodin a poté při teplotě 4 °C přes noc. Kolonie byly přeneseny na nylonové filtry a analyzovány sondou, kterou byl HindiII-fragment o velikosti 1,2 kb získaný z VIP3A(a). Hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 62 hybridizačních podmínek, které uvádějí
Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) . Filtry byly promyty 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného (SDS) při teplotě 62 °C a exponovány na film citlivý na rentgenové záření.
°C za Maniatis použití a kol.
Ze zkoumaných 463 kmenů rodu Bacillus obsahovalo 60 kmenů geny podobné VIP3, které bylo možné detekovat hybridizaci. Další charakterizací některých z nich (AB6 a
104
AB426) se zjistilo, že jejich supernatanty obsahují insekticidní proteiny podobné proteinu VIP3, účinné proti
Agrotis ipsilon.
Příklad 18E
Charakterizace kmene Bacillus thuringiensis M2194 obsahujícího kryptický gen podobný VIP3 kmenu Bacillus thuringiensis, označeném M2194, bylo zjištěno, že obsahuje gen (nebo geny) podobné VIP3, pomocí kolonové hybridizace jak je popsána v příkladu 18C. Má se za to, že gen z M2194 podobný VIP3 je kryptický, jelikož během růstových fází bakterie nelze detekovat žádnou expresi, af už pomocí imunoblotační analýzy za použití polyklonálních protilátek vytvořených proti proteinu VIP3A(a) izolovanému z AB88 nebo pomocí biologického testu, jak je popsán v příkladu 3 .
Antisérum proti purifikovanému insekticidními proteinu VIP3A(a) bylo vytvořeno v králících. 50 yg proteinu navázaného na nitrocelulosu bylo rozpuštěno v dimethylsulfoxidu a emulgováno s Freundovým kompletním adjuvans (Difco). Dvěma králíkům byly dávány subkutánní inejkce každý měsíc po dobu 3 měsíců. Byla jim odebrána krev 10 dnů po druhé a třetí injekci a ze vzorku krve bylo získáno sérum (Harlow a kol. (1988) v: Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview, New York, USA)).
Gen z M2194 podobný VIP3 byl klonován do pKS za použití postupu popsaného v příkladu 9, čímž byl získán pCIB7108. Escherichia coli obsahující pCIB7108, který obsahuje gen VIP3 z M2194, byla účinná proti Agrotis ipsilon, což svědčí o tom, že tento gen kóduje funkční protein s insekticidní účinností. Plazmid pCIB7108 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service Patent Culture
105
Collection (NRRL), a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo
NRRL B-21438.
Příklad 18F
Insekticidní účinnost proteinů VIP3A
Spektrum účinnosti insekticidních proteinů VIP3A bylo kvalitativně stanoveno v biologických testech na hmyzu, ve kterých larvy pozřely rekombinantní Escherichia coli nesoucí geny VIP*A. V těchto testech byly buňky nesoucí geny VIP3A(a) a VIP3A(b) insekticidní pro Agrotis ipsilon, Spodoptera frugiperda, Spodoptera exigua, Heliothis virescens a Helicoverpa zea. Za stejných pokusných podmínek nevykazovaly bakteriální extrakty obsahující proteiny VIP3A žádnou účinnost proti Ostrinia nubilalis.
Účinek insekticidních proteinů VIP*A na larvy Agrotis ipsilon materiál použitý pro test mortalita (v %)
TB-medium 5
supernatant AB88 100
supernatant AB424 100
pufr 7
Escherichia coli pKS 10
Escherichia coli pCIB7104 (AB88) 100
Escherichia coli pCIB7105 (AB88) 100
Escherichia coli pCIB7106 (AB424) 100
Escherichia coli pCIB7107 (AB424) 100
106
Účinek insekticidních proteinů VIP3A na larvy hmyzu z řádu motýlů
materiál použitý pro test hmyz mortalita (%)
Escherichia coli pKS AI 10
SF 5
SE 10
HV 8
HZ 10
ON 5
Escherichia coli pCIB7105
Escherichia coli pCIB7107 AI 100
SF 100
SE 100
HV 100
HZ 50
ON 10
Legenda:
AI = Agrotis ipsilon, SF - Spodoptera frugiperda,
SE = Spodoptera exigua, HV = Heliothis virescens,
HZ = Helicoverpa zea, ON = Ostrinia nubilalis
Přiklad 19
Izolace a biologická účinnost jiných druhů Bacillus sp.
Byly izolovány další druhy rodu Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu proteiny s insekticidní účinností. Tyto kmeny byly izolovány ze vzorků jejich životního prostředí pomocí standardních postupů. Byly
107 připraveny izoláty pro biologické testy a byly testovány jak je popsáno v příkladech 2 respektive 3. Izoláty, které produkovaly v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné v biologickém testu proti Agrotis ipsilon jsou uvedeny v tabulce níže. Nebyla pozorována žádná korelace mezi přítomností krystalu δ-endotoxinu a produkcí vegetativního insekticidního proteinu.
izolát Bacillus přítomnost krystalu δ-endotoxinu procento mortality
AB6 + 100
AB53 - 80
AB88 + 100
AB195 - 60
AB211 - 70
AB217 - 83
AB272 - 80
AB279 - 70
AB289 + 100
AB292 + 80
AB294 - 100
AB300 - 80
AB359 - 100
Izoláty AB289, AB294 a AB359 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21227, NRRL B-21229
108 respektive NRRL B-21226.
Izoláty Bacillus, které produkují v průběhu vegetativního růstu insekticidní proteiny účinné proti Diabrotica virgifera virgifera jsou uvedeny v tabulce níže
izolát Bacillus přítomnost krystalu δ-endotoxinů procento mortality
AB52 - 50
AB59 - 71
AB68 + 60
AB78 - 100
AB122 - 57
AB218 - 64
AB256 - 64
Izoláty AB59 a AB256 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla NRRL B-21228 respektive B-21230.
Příklad 20
Identifikace nových genů podobných VIP1/VIP2 pomocí hybridizace
Pro identifikaci kmenů obsahujících geny příbuzné genům nacházejícím se v oblasti VIP1A(a)/VIP2A(a) v AB78 byla pomocí hybridizace zkoumána sada izolátů Bacillus. Nezávislé
109 kultury 463 kmenů rodu Bacillus byly pěstovány v jamkách mikrotitračních desek s 96 jamkami (celkem 5 desek) až do sporulace kultur. Z celkového počtu testovaných kmenů bylo 288 zařazeno jako Bacillus thuringiensis a 175 bylo zařazeno mezi jiné druhy rodu Bacillus, na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti krystalů δ-endotoxinů. Pro každou mikrotitrační desku bylo použito zařízení s 96 hroty pro přenos přibližně 10 μΐ kultury spor na dvě 150 mm desky obsahující L-agar. Na inokulovaných deskách byl umožněn růst při teplotě 30 °C po dobu 4-8 hodin a poté byly ochlazeny na teplotu 4 °C. Kolonie byly přeneseny na nylonové filtry a buňky byly lyžovány pomocí standardních způsobů známých v oboru. Filtry byly hybridizovány s DNA-sondou vytvořenou z DNA-fragmentů obsahujících DNA-sekvence jak VIPlA(a) tak VIP2A(a). Hybridizace byla prováděna přes noc při teplotě 65 °C za použití hybridizačních podmínek, které uvádějí Church a Gilbert (Church, G. M. a W. Gilbert, PNAS, 81: 1991 - 1995 (1984)) . Filtry byly promyty 2x SSC s 0,1 % dodecylsulf átu sodného (SDS) při teplotě 65 °C a exponovány na film citlivý na rentgenové záření.
Ze zkoumaných 463 kmenů rodu Bacillus bylo u 55 kmenů zjištěno, že hybridizuji s VIP1A(a)/VIP2A(a)-sondou. Z 22 z těchto kmenů byla izolována DNA a byla analyzována pomocí Southernova blottingu za použití DNA VIP1A(a)/VIP2A(a) jako sond. Tyto kmeny byly rozděleny do 8 skupin na základě toho, jak u nich proběhl Southernův blotting. Každá z těchto skupin se tím, jak u ní proběhl Southernův blotting, lišila od AB78. U jedné skupiny byl výsledek Southernova blottingu identický s výsledky získanými pro homology VIP1A(a)/VIP2A(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (viz níže). U každého z těctho 22 kmenů byla testována jeho účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Bylo zjištěno, že tři kmeny, AB433, AB434 a AB435, jsou účinné proti Diabrotica virgifera virgifera. Analýzou pomocí western blottingu za použití antiséra proti VIP2A(a) bylo zjištěno, že kmeny AB6, AB433,
110
AB434, AB435, AB444 a AB445 produkují protein (nebo proteiny) stejné velikosti jako je VIP2A(a).
Za zmínku stojí mezi identifikovanými kmeny kmen Bacillus thuringiensis AB6 (NRRL B-21060), který produkoval vegetativní insekticidní protein účinný proti Agrotis ipsilon, jak je popsáno v příkladu 15. Analýza pomocí western blottingu za použití polyklonálního antiséra proti VIP2A(a) a polyklonálního antiséra proti VIPlA(a) svědčí o tom, že AB6 produkuje proteiny podobné proteinům VIP2A(a) a VIPlA(a). AB6 tedy může obsahovat vegetativní insekticidní proteiny podobné VIPlA(a) a VIP2A(a), avšak s odlišným spektrem insekticidní účinnosti.
Příklad 21
Klonováni homologů VIP1A(a)/VIP2A(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis
U několika dříve charakterizovaných kmenů rodu Bacillus bylo pomocí Southernova blottingu testována přítomnost DNA podobné VIP1A(a)/VIP2A(a). U DNA z kmenů Bacillus AB78, AB88, GC91, HD-1 a ATCC 10876 bylo testováno, zda jsou přítomné sekvence podobné VIP1A (a)/VIP2A (a) . DNA z: kmenů Bacillus thuringiensis GC91 a HD-1 a kmene Bacillus cereus ATCC 10876 nehybridizovala s DNA VIP2A(a)/VIP1A(a), což svědčí o tom, že tyto kmeny neobsahující DNA-sekvence podobné genům VIP1A(a)/VIP2A(a). Podobně DNA z insekticidniho kmene AB88 (příklad 16) nehybridizovala s oblasti DNA VIP1A(a)/VIP2A(a), což naznačuje, že účinnost VIP produkovaná tímto kmenem není důsledkem homologů VIP1A(a)/VIP2A(a). Naproti tomu, Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) obsahoval sekvence, které hybridizovaly s oblastí VIP1A(a)/VIP2A(a). Další analýzy potvrdily, že Bacillus thuringiensis var. tenebrionis obsahuje sekvence podobné VIP1A(a)/VIP2A(a).
111
Pro charakterizaci homologů VIP2A(a) a VIPlA(a) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis byly klonovány geny kódující tyto proteiny. Pomocí Southernova blottingu byl identifikován restrikční fragment o velikosti 9,5 kb získaný pomocí Eco RI, o kterém bylo pravděpodobné, že obsahuje kódující oblasti homologů. Genomová DNA byla rozštěpena Eco RI a fragmenty DNA o délce přibližně 9,5 kb byly purifikovány v gelu. Tato DNA byla ligována do vektoru pBluescript SK( + ) rozštěpeného Eco RI a byla transformována do Escherichia coli pro vytvoření plazmidové knihovny. U přibližně 10000 kolonií bylo pomocí kolonové hybridizace zjišťováno, zda obsahují sekvence homologické s VIP2A(a). Bylo identifikováno 28 pozitivních kolonií. Všech 28 klonů je identických a obsahují homology VIP1A(a)/VIP2A(a). Klon pCIB7100 byl uložen v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a bylo mu přiděleno přírůstkové číslo B-21322. Z pCIB7100 bylo zkonstruováno několik subklonů. Xba I-fragment o velikosti 3,8 kb z pCIB7100 byl klonován do vektoru pBluescript SK(+) pro získání pCIB7101. Hind III-fragment o velikosti 1,8 kb a Hind III-fragment o velikosti 1,4 kb z pCIB7100 byly klonovány do vektoru pBluescript SK(+) pro získání pCIB7102 respektive pCIB7103. Subklony pCIB7101, pCIB7102 a pCIB7103 byly uloženy v patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, a byla jim přidělena přírůstková čísla B-21323, B-21324 respektive B-21325.
DNA-sekvence oblasti pCIB7100 obsahující homology VIP2A(a)/VIPlA(a) byla určena pomocí postupu využívajícího dideoxyribonukleotidů jako terminátorů reakce, který popsali Sanger a kol., 1977, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74: 5463 až 5467. Reakce byly provedeny za použití sekvenačních souprav
112
PRISM Ready Reaction Dye Deoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit a sekvenačních souprav PRISM Sequenase Terminátor Double-Stranded DNA Sequencing Kit, a analýza byla provedena na automatickém sekvenátoru ABI 373. Jako primery pro stanovení DNA-sekvence v určitých oblastech byly použity na zakázku vyrobené oligonukleotidy. DNA-sekvence této oblasti je uvedena v SEQ ID č. 19.
Oblast o velikosti 4 kb uvedená v SEQ ID č. 19 obsahuje dva otevřené čtecí rámce, které kódují proteiny vykazující vysoký stupeň podobnosti s proteiny VIPlA(a) a VIP2A(a) z kmene AB78. Aminokyselinová sekvence homologu VIP2A(a), označeného za použití standardizované nomenklatury jako VIP2A(b) , je uvedena v SEQ ID č. 20 a aminokyselinová sekvence homologu VIPlA(a), označeného za použití standardizované nomenklatury jako VIPlA(b), je uvedena v SEQ ID č. 21. Protein VIP2A(b) vykazuje 91% aminokyselinovou identitu (totožnost) s VIP2A(a) z AB78. Srovnání aminokyselinových sekvencí těchto dvou proteinů VIP2 je uvedeno v tabulce 20. Protein VIPlA(b) vykazuje 77% aminokyselinovou identitu s VIPlA(a) z AB78. Srovnání těchto dvou proteinů VIP2 je uvedeno v tabulce 21. Srovnání uvedené v tabulce 21 svědčí o podobnosti mezi VIPlA(b) a VIPlA(a) z AB78. Toto srovnání svědčí o tom, že tyto dva proteiny VIP1 vykazují vyšší aminokyselinovou identitu v N-koncové oblasti než v C-koncové oblasti. Ve skutečnosti vykazují N-koncové dvě třetiny (do aminokyseliny 618 sekvence VIPlA(b) uvedené v tabulce 21) těchto proteinů 91% identitu, zatímco C-koncová třetina (od aminokyseliny 619 do 833 VIPlA(b)) vykazuje pouze 35% identitu.
Analýza pomocí western blottingu svědčí o tom, že Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) produkuje jak proteiny podobné VIPlA(a) tak proteiny podobné VI2A(a). Zdá se však, že tyto proteiny nevykazují účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Biologický test účinnosti
113 proti Diabrotica virgifera virgifera byl prováděn bud' za použití supernatantu 24 hodin staré kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (Btt) nebo klonu Escherichia coli pCIB7100 (který obsahuje celou oblast homologů VIP1A(a)/VIP2A(a)). V žádném z těchto případů nebyla zjištěna žádná účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera.
Vzhledem k podobnosti mezi proteiny VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a AB78 byla testována schopnost VIP2A(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis nahradit VIP2A(a) z AB78. Buňky obsahující pCIB6206 (který produkuje protein VIPlA(a) z AB78, ale neprodukuje protein VIP2A(a)) byly smíchány se supernatantem kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a byla testována jejich účinnosti proti Diabrotica virgifera virgifera. Zatímco ani supernatant kultury Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, ani buňky obsahující pCIB6206 nevykazovaly účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, vykazovala směs Bacillus thuringiensis var. tenebrionis a pCIB6206 vysokou účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera. Kromě toho bylo v dalším biologické testu zjištěno, že klon Btt pCIB7100, který obsahuje geny VIP1A(b)/VIP2A(b) v Escherichia coli, rovněž poskytuje účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera, pokud je smíchán s pCIB6206. Protein VIP2A(b) produkovaný Bacillus thuringiensis var. tenebrionis je tedy funkčně ekvivalentní s proteinem VIP2A(a) produkovaným AB78 .
Tímto byla demonstrována možnost identifikovat nové kmeny s insekticidní účinnosti za použití DNA vegetativních insekticidních proteinů jako hybridizačních sond. Dále, kmeny rodu Bacillus, které obsahují sekvence podobné VIPlA(a)/ /VIP2A(a) a produkují protein podobný VIP1A(a)/VIP2A(a), vykazují toxicitu vůči různým hmyzím škůdcům. Za použití podobných způsobů lze identifikovat mnoho dalších příslušníků rodiny VIP1/VIP2. Dále lze za použití podobných způsobů
114 identifikovat homology jiných variant vegetativních insekticidních proteinů (například vegetativních insekticidních proteinů z AB88).
Tabulka 20
Srovnání aminokyselinových sekvencí VIP2 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis - Btt (VIP2A(b)) a z AB78 (VIP2A(a))
Btt 1 MQRMEGKLFWSKTIQWTRIVLESIVYSITLLNNWIKADQLNINSQSK 50 SEQ ID Č . 20 I . I I I I I I I : I I I · I I I I I : I I I I I I i : I I . I I ! I I I I I : ί I I I I I I I I
AB78 1 MKRMEGKLFMVSKKDQWTKTVLLSTVFSISLLNNEVIK-EQLNINSQSK 50 SEQ ID Č . 2
YTNLQNLKIPDNAEDFKEDKGKAKEWGKEKGEEWRPPATEKGEt'4NNELDN 100 IIIIIIIII - I..II i II I I : I I I I I I I I I I I : . I I I I I · I I I I I I I
YTMLQNIKITDKVEDEKEDKEKAKEWGKEKEKEWKLTATEKGKMNIIELDN 100
101 KNDIKTNYKEITFSMAGSCEDEIKDLEEIDKIFDKANLSSS1ITYKNVEP 150 lili I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I I I : I í I · I I I · I I I I I I I i I I
101 KNDIXIWKEITFSMAGSEEDEIKDLKEIDKMFDKTNLSNSIITYKNVEP 150
151 ATIGFNKSLTEGNTINSDAI^QFKEQFLGKDMKFDSYLDTHLTAQQVSSK 200 . I I I I I ί I I I I I I I I I I I ί I I I I I ί I I I :·' I : I I I I I I I I I I I I I I I i ί I
151 TTIGFNKSLTEGNTINSDAMAQFKEQFLDRDIKFDSYLDTHLTAQQVSSK 200
201 KRVILKVTVPSGKGSTTPTKAGVILNNNEYFMLIDNGYVLHVDKVSKWK 250 . I I I I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I - I I I I I I I I I I : : I I I I I I I I I I
201 ERVIIXVTWSGKGSTTPTKAGVIIJsINSEYRMLIDNGYMVHVDKVSKWK 250
251 KGMECLQVEGTLKKSLDFKNDINAEAHSWGMKIYEDWAW^LTASQREALD 300 I I : I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I : I I - I I I I i ! I
251 KGVECLQIEGTLKKSLDFKNDINAEAHSWGMKNYEEWAKDLTDSQREAin 300
115
301 GY.ARQDYKEINNYLRNQGGSGNEKl.DAQLKNISD.ALGKKPIPENITVYRW 350 i I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I i I I I I I i I I I I I I I I I I I I I
301 GYARQDYKEINNhOLRNQGGSGNEKLDAQIKNISDALGKKPIPENITVYRW 350
351 CQ4PEFGYQISDPLPSLKDFEEQFLNTIKEDKGYMSTSLSSERLAAFGSR 400
I I i II I I I I I I I I I I I I 1 I II II II I I I I I I I I II I I I I I i I I I I 1 I I I I
351 CGMPEFGYQISDPLPSLKDFEEQFLNTIKEDKGYMSTSLSSERLAAFGSR 400
401 KIILRLQVPKGSTGAYLSAIGGFASEKEILLDKDSKYKIDKATEVIIKGV 450 I I : I ! I II I I I I I I I I I I I II I I i I í I II II I II I I I I I 1 I - I I I I I I I I 401 KIILRLQVPKGSTGAYLSAIGGFAEEKEILLDKDSKYHIDKVTEVIIKGV 450
451 KRYWDATLLTN 462 I ! I II Η I I I I I
451 KRYWDATLLTN 462
Tabulka 21
Srovnání aminokyselinových sekvencí VIP1 z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis - Btt (VIPlA(b)) a z AB78 (VIPlA(a))
Btt 1 MKNMKKKLASWTCMLLAPMFLNGNVNAVNADSKINQISTTQENQQKEMD 50 SEQ ID Č . 21 IIII I I I I II I I ! I I II I I I II I II I I I I I I I · I I I I I I I . I i IIIII
Ab78 1 MKNMKKKLASWGCTLLAPMFLNGNWAWADSKTNQISTTQKNQQKEMD 50 SEQ ID č.5
RKGLLGYYFKGKDFNNLTMFAPTRDNTLMYDQQTANALLDKKQQEYQSIR 100
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
RKGLLGYYFKGKDFSNLTMFAPTRDSTLIYDQQTANKLLDKKQQEYQSIR 100
101 WIGLIQRKETGDFTFNLSKDEQAIIEIDGKIISNKGKEKQWHLEKEKLV 150
II I I II . II I I I I I I I I I - I I I I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I
101 WIGLIQSKETGDFTFNLSEDEQAIIEINGKIISNKGKEKQWHLEKGKLV 150
151 PIKIEYQSDTKFNIDSKTFKELKLFKIDSQNQSQQVQ...LRNPEFNKKE 197
116
151 PIKIEYQSDTKFNIDSKTFKELKLFKIDSQNQPQQV<2QDELRNPEF14KKE 200
198 SQEFLAKASKTNLFKQKMKRDIDEDTDTDGDSIPDLWEENGYTIQI4KVAV 247 I I I I I I I : I I · I I I · I I I I I : I I I I I I I I IIIIIIIIIIIIIIIII::II
201 SQEFLAKPSKINLFTQKMKREIDEDTDTDGDSIPDLWEENGYTIQNRIAV 250
248 KWDDSLASKGYTKFVSNPLDSHTVGDPYTDYEKAARDLDLSNAKETFNPL 297
IIIIIIIIIIIIIII I I I I : I I I I I i I ! I I I I I I I II I I I I I II I I I I i I
251 KWDDSLASKGYTKFVSNPLESHTVGDPYTDYEKAARDLDLSNAKETFNPL 300
298 VAAFPSVNVSMEKVILSPNENLSNSVESHSSTNWSYTNTEGASIEAGGG? 347
I IIII II II I ! 1 I I II I II I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I : I I I II
301 VAAFPSVNVSMEKVILSPNENLSNSVESHSSTNWSYTNTEGASVEAGIG? 350
348 LGLSFGVSVTYQHSETVAQEWGTSTGNTSQFNTASAGYLNANVRYNNVGT 397 I : I I I I I I - I I I I I I I I I I I I I I I I i I I I I I I I I I II I I l.l I I I I I I I I
351 KGISFGVSVNYQHSETVAQEWGTSTGNTSQFNTASAGYLNANVRYNNVGT 400
398 GAIYDVKPTTSFVLNNNTIATITAKSNSTALRISPGDSYPEIGENMAIT 447
II I I I I I I I IIIIIII:IIIIIIII I I I I I I · I I I I : I I I . I : I : I I I I
401 GAIYDVKPTTSFVLNNDTIATITAKSNSTALNISPGESYPKKGQNGIAIT 450
448 SMDDFNSHPITLNKQQVNQLINNKPIMLETDQTDGVYKIRDTHGNIVTGG 497 I I I I I I I I IIIIII·II:·I:II I I:II I I : I I I I I I I I : I I I I I I I I I I 451 SMDDFNSHPITLNKKQVDNLLNNKPMMLETNQTDGVYKIKDTHGNIVTGG 500
98 EWNGVTQQIKAKTASIIVDDGKQVAEKRVAAKDYGHPEDKTPPLTLKDTL 547 IIIIIIIIIII I I I I II I I I .. I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I I I I . I 501 EWNGVIQQIKAKTASIIVDDGERVAEKRVAAKDYENPEDKTPSLTLKD.AL 550
548 KLSYPDEIKETNGLLYYDDKPIYESSVMTYLDENTAKEVKKQINDTTGKF 597
III I II II I I : I I I I I : I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I . I I : I I I I I I I
551 KLSYPDEIKEIEGLLYYKNKPIYESSVMTYLDENlAKEVrKQLNDTTGKF 600
117
598 KDVNHLYDVKLTPKMNFTIKMASLYDGAENNHNSLGTWYLTYNVAGGNTG 647 I I I · I I I I I II I I I I I · I II : - I I I · I I . I . I I : I . I I I . I I I . I
.... 601 KDVSHLYDVKLTPKMNVTIKLSILYDNAESNDNSIGKWTNTNIVSGGNNG 650
648 KRQYRSAHSCAHVALSSEAKKKLNQNANYYLSt4YMKADSTTEPTIEVAGE 697 1:11.1·:. I::.I . . : I . . I I I ·I :I I : I : I I I . : . . I : . . I . : . I |
651 KKQYSSNNPDANLTLNTDAQEKLNKNRDYYISLYMKSEKNTQCEITIDGE 700
698 KSAITSKKVKLNNQNYQRVDILVKNSERNPMDKIYIRGNGTTNVYGDDVT 747 : I I . I . I . : I . : I I . I : I I : . . I . . I I : . . : . I : . I : . . . : : | | : .
701 IYPITTKTVNVNKDNYKRLDIIAHNIKSNPISSLHIKIWEITLFWDDIS 750
748 IPEVSAINPASLSDEEIQEIFKDSTIEYGNPSFVADAVTFK......... 788 ί . : I . . I . I . . I . I . I I . : I : . . | . . : : . : : . . . . : .
751 ITDVASIKPENLTDSEIKQIYSRYGIKLEDGILIDKKGGIHYGEFINEAS 800
789 .N1KPLQNYVKEYEIYHK.......SHRYEKKTVFDIMGVHYEYSIAREQ 830
I I . I I I I I I . . i . : . . I . . | . . . : : . ...
801 FNIEPLQNYVTKYKVTYSSELGQNVSDTLESDKIYKDGTIKFDFTKYSKN 850
831 KKA 833
851 EQG 853
Příklad 22
Fúze proteinů VIP pro vytvoření jediného polypeptidu
Proteiny VIP se mohou v přírodě vyskytovat jako jednotlivé polypeptidy nebo jako dva nebo více interagujících polypeptidu. Pokud je účinný vegetativní insekticidní protein složen ze dvou nebo více interagujících proteinových řetězců, lze tyto proteinové řetězce produkovat jako jediný polypeptidový řetězec z genu vzniklého fúzí dvou (nebo více) oblastí kódujících VIP. Geny kódující tyto dva řetězce se fúzují spojením kódujících oblastí těchto genů za vytvoření
118 jediného otevřeného čtecího rámce kódujícího oba polypeptidy VIP. Složené polypeptidy lze fúzovat tak, že N-konec fúzního proteinu tvoří menší polypeptid nebo je lze fúzovat tak, že N-konec fúzního proteinu tvoří větší z polypeptidů. Mezi tyto dvě polypeptidové domény lze popřípadě zařadit linker. Takové linkery jsou v oboru známé. Linker může být popřípadě vytvořen tak, aby obsahoval taková místa štěpená proteasami, že jakmile je jediný fúzní polypeptid pozřen cílovým hmyzem, je rozštěpen v oblasti linkeru, čímž se uvolní dvě polypeptidové složky účinné molekuly VIP.
VIPlA(a) a VIP2A(a) z kmene Bacillus cereus AB78 se fúzují pro vytvoření jediného polypeptidů fúzováním jejich kódujících oblastí. Výsledná DNA obsahuje sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22. Sekvence kódovaného proteinu je uvedena v SIQ ID č. 23. Podobným způsobem lze produkovat jiné fúzní proteiny.
Fúze genů kódujících VIPlA(a) a VIP2A(a) se provede za použití standardních postupů molekulární biologie. Nukleotidy deletované mezi kódujícími oblastmi VIPlA(a) a VIP2A(a) se delterují za použití známých postupů mutageneze nebo se alternativně kódující oblasti fúzují za použití polymerasově řetězové reakce (PCR).
Fúzované polypeptidy VIP mohou být exprimovány v jiných organismech za použití syntetického genu, nebo částečně syntetického genu, optimalizovaného pro expresi v alternativním hostiteli. Například pro expresi výše popsaného fúzovaného polypeptidů VIP v kukuřici se připraví syntetický gen za použití kodónů preferovaných kukuřicí pro každou aminokyselinu, viz například EP-A 0618976. Syntetické DNA-sekvence vytvořené podle těchto způsobů jsou uvedeny v SEQ ID č. 17 (pro kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 100 kDa), SEQ ID č. 18 (pro kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIPlA(a) o molekulové hmotnosti 80 kDa) a SEQ ID č. 24 (pro
119 kukuřici optimalizovaná verze kódující sekvence VIP2A(a)).
Syntetické geny VIP1 a VIP2 optimalizované pro expresi v kukuřici lze fúzovat za použití polymerasové řetězové reakce, nebo lze syntetické geny vytvořit tak, že budou fúzovány na běžném restrikčnim místě. Alternativně lze syntetický fúzní gen vytvořit tak, aby kódoval jediný polypeptid obsahující domény jak VIP1 tak VIP2 .
Přidání peptidového linkeru mezi domény VIP1 a VIP2 fúzního proteinu lze provést mutagenezí pomoci polymerasové řetězové reakce (PCR-mutagenezí), použitím syntetického DNA-linkeru kódujícího linkerový peptid, nebo za použití jiných způsobů známých v oboru.
Fúzované polypeptidy VIP mohou obsahovat jednu nebo několik vazebných domén (domén vázajících se na receptor). Pokud se při fúzi použije více než jedna vazebná doména, je za použití takového fúzního produktu kontrolováno více cílových druhů hmyzu. Další vazebné domény lze získat za použití jiných vegetativních insekticidních proteinů, a to buď celých nebo jejich částí, endotoxinů z Bacillus thuringiensis nebo jejich částí, nebo jiných proteinů schopných vazby na cílového škůdce nebo příslušných vazebných domén získaných z takto se vázajících proteinů.
Jedním z příkladů fúzního konstruktu obsahujícího DNA-sekvenci optimalizovanou pro kukuřici, která kóduje fúzní produkt kterým je jediný polypeptidový řetězec obsahující na N-konci VIP2A(a) a na C-konci VIPlA(a), je pCIB5531. Mezi dvě kódující oblasti byla vložena DNA-sekvence kódující linker s peptidovou sekvencí PSTPPTPSPSTPPTPS (SEQ ID č. 47). Sekvence kódující linker a odpovídající klonovací místa je 5'- CCC GGG CCT TCT ACT CCC CCA ACT CCC TCT CCT AGC ACG CCT CCG ACA CCT AGC GAT ATC GGA TCC -3' (SEQ ID č. 48). Byly syntetizovány oligonukleotidy představující jak horní tak dolní řetězec a po hybridizaci a fosforylaci za použití standardních postupů
120 byly klonovány do vektoru pUC. Terminační kodón (stop kodón) ve VIP2A(a) byl odstraněn za použití polymerasové řetězové reakce a nahrazen restrikčním místem BglII s místem Smál. Translační fúzní produkt byl vytvořen ligaci fragmentu Bam Hl/Pst I z genu VIP2A(a) z pCIB5522 (viz příklad 24), fragmentu získaného polymerasovou řetězovou reakcí obsahujícího Pstl-koncový fragment genu VIP2A(a) (identického jako byl použit pro konstrukci pCIB5522), syntetického linkeru s konci, které ligují s tupým místem na 5'-konci a s BamHI na 3'-konci, a modifikovaného santetického genu VIPlA(a) z pCIB5526 popsaného níže (viz SEQ ID č. 35). Fúzní produkt byl vytvořen ligaci čtyř částí, čímž vznikl plazmid obsahující gen VIP2A(a) bez kodónu ukončujícícho translaci (terminačního kodónu), spolu s linkerem a kódující oblasti VIPlA(a) bez sekrečního signálu pro Bacillus. DNA-sekvence tohoto konstruktu je uvedena v SEQ ID č. 49 a kóduje fúzní protein uvedený v SEQ ID č. 50. Fúzní produkt tvořený jediným polypeptidem, kde je VIPlA(a) na N-konci a VIP2A(a) na C-konci lze vytvořit podobným způsobem. Dále lze kterýkoli z těchto genů nebo oba tyto geny napojit za vzniku translační fúze, za použití nebo bez použití linkeru, buď na 5'-konec nebo na 3'-konec jiných molekul, jako jsou geny kódující toxiny nebo reportérové geny.
Příklad 23
Cílení VIP2 do rostlinných organel
Je známo, že v rostlinách existují různé mechanismy cílení genových produktů a do určité míry byly charakterizovány sekvence řídící fungování těchto mechanismů. Například cílení genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí, která se nachází na N-konci různých proteinů. Tento signál se odštěpuje během importu do chloroplastu za vzniku maturovaného proteinu (například Comai
121 a kol., J. Biol. Chem. 263: 15104 - 15109 (1988)). Tyto signální sekvence lze fúzovat k heterologním genovým produktům, jako je VIP2, pro vyvolání importu těchto produktů do chloroplastu (van den Broeck a kol., Nátuře 313: 358 - 363 (1985)). DNA kódující příslušné signální sekvence lze izolovat z 5'-konce cDNA kódujících protein RUBISCO, protein CAB, enzym EPSP-synthasu, protein GS2 a mnoho dalších proteinů, o kterých je známo, že jsou lokalizovány do chloroplastů.
Jiné genové produkty jsou lokalizovány do jiných organel, jako jsou mitochondrie a peroxisomy (například Unger a kol., Plant Molec. Biol. 13: 411 - 418 (1989)). S cDNA kódujícími tyto produkty lze rovněž manipulovat pro dosažení cílení heterologních genových produktů, jako je VIP2, do těchto organel. Mezi příklady takových sekvencí patří nukleárně kódované ATPasy a specifické isoformy aspartát-b -aminotransferasy pro mitochondrie. Podobně cílení do celulárních proteinových tělísek popsali Rogers a kol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512 - 6516 (1985)).
Fúzí příslušných sekvencí způsobujících cílení, jak jsou popsány výše, s kódujícími sekvencemi jež jsou předmětem zájmu, jako je VIP2, je možné řídit transgenický produkt do libovolné organely nebo kompartmentu buňky. Pro cílení do chloroplastu se například chloroplastová signální sekvence z genu RUBISCO, genu CAB, genu EPSP-synthasy nebo genu GS2 fúzuje ve stejném čtecím rámci s N-koncovým kodónem ATG transgenu. Vybraná signální sekvence by měla obsahovat známé místo štěpení a při konstruování fúzního produktu je třeba počítat s jakýmikoli aminokyselinami za místem štěpení, které jsou pro štěpení nutné. V některých případech lze tento požadavek splnit přidáním malého počtu aminokyselin mezi místo štěpení a startovací kodón ATG, nebo alternativně nahrazením některých aminokyselin v kódující sekvenci. U fúzních produktů zkonstruovaných pro import do chloroplastu
122 lze testovat účinnost příjmu chloroplastem pomocí in vitro translace in vitro transkribovaných konstruktů s následujícím příjmem do chloroplastů in vitro za použití postupů, které popsali Bartlett a kol. v: Edelmann a kol. (editoři) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier, str. 1081 - 1091 (1982), a Wasmann a kol., Mol. Gen. Genet. 205: 446 - 453 (1986). Tyto postupy konstruování jsou v oboru dobře známé a lze je rovněž použít pro mitochondrie a peroxisomy.
Výše popsané mechanismy cílení v buňce lze použít nejen ve spojení s jejich příbuznými promotory, ale rovněž ve spojení s heterologními promotory, pro dosažení specifického cílení v buňce za regulace transkripce promotorem který vykazuje model exprese odlišující se od modelu vykazovaného promotorem od kterého je získán signál způsobující cílení.
V nativním genu VIP2 z mikroorganismů Bacillus je přítomná DNA-sekvence kódující sekreční signál. Tento signál není přítomen v maturovaném proteinu, který má N-koncovou sekvenci LKITDKVEDF (aminokyselinové zbytky 57 až 66 v SEQ ID č. 2) . Je možné pomocí genového inženýrství modifikovat VIP2 tak, aby byl vylučován z rostlinné buňky nebo aby byl cílen do subcelulárních organel, jako je endoplazmatické retikulum, vakuola, mitochondrie a plastidy včetně chloroplastů. Hybridní proteiny připravené fúzí sekrečního signálu s markerovým genem byly úspěšně cíleny do sekreční dráhy (Itirriaga G. a kol., The Plant Cell, 1: 381 - 390 (1989), Denecke a kol. The Plant Cell. 2: 51 - 59 (1990)). Byly identifikovány N-koncové sekvence, které jsou které jsou zodpovědné za cílení do endoplazmatického retikula, do apoplastu a za extracelulární sekreci z aleuronových buněk (Koehler a Ho, Plant Cell 2: 769 - 783 (1990)).
Pro zadržení proteinu v endoplazmatickém retikulu nebo vakuole je nutná přítomnost dalších signálů. Pro zadržení proteinu v endoplazmatickém retikulu je nutná peptidová sekvence KDEL/HDEL na C-konci tohoto proteinu (jak shrnul
123
Pelham, Annual Review Cell Biol., 5: 1-23 (1989)). Signály pro zadržení proteinů ve vakuole byly rovněž charakterizovány. Signály způsobující cílení do vakuoly mohou být přítomné bud' na N-koncové části (Holwerda a kol., The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992), Nakamura a kol., Plant Physiol., 101: 1-5 (1993)), C-koncové části nebo ve vnitřní sekvenci cíleného proteinu (Tague a kol., The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992), Saalbach a kol., The Plant Cell, 3: 695 - 708 (1991)). Kromě toho jsou za cíleni genových produktů do vakuoly zodpovědné N-koncové sekvence ve spojení s C-koncovými sekvencemi (Shinshi a kol., Plant Molec. Biol., 14: 357 - 368 (1990)). Podobně mohou být proteiny cíleny do mitochondrií nebo plastidů za použití fúzí se specifickými C-koncovými signálním peptidy (Heijne a kol., Eur. J. Biochem., 180: 535 - 545 (1989), Archer a Keegstra, Plant Molecular Biology, 23 : 1105 - 1115 (1993) ) .
Pro cílení VIP2, buďto pro sekreci nebo do různých subcelulárních organel, může být na 5'-konec nebo 3'-konec genu, jak je potřeba, zařazena DNA-sekvence kódující známý signální peptid (nebo peptidy) optimalizovaná pro kukuřici. Pro sekreci VIP2 z buňky lze na 5'-konec buďto úplné sekvence genu VIP2 nebo zkrácené sekvence kódující maturovaný protein nebo genu zkráceného až k nukleotidu 286 nebo kódujícího protein počínaje aminokyselinovým zbytkem 94 (methioninem) přidat DNA-sekvenci kódující eukaryotický sekreční signál MGWSWIFLFLLSGAAGVHCL (SEQ ID č. 25) z PCT-přihlášky č. IB95/00497 nebo libovolný jiný sekreční signál popsaný v literatuře (Itirriaga a kol., The Plant Cell, 1: 381 - 390 (1989), Denecke a kol., The Plant Cell, 2: 51 - 59 (1990)). Pro cíleni VIP2 tak, aby byl zadržen v endoplazmat ickém retikulu, lze na 3'-konec genu, kromě sekrečního signálu, přidat DNA-sekvenci kódující signální peptid pro endoplazmatické retikulum KDEL/HDEL. Pro cílení do vakuoly lze umístit vedle sekrečního signálu DNA-sekvenci kódující signální peptid SSSSFADSNPIRVTDRAAST (SEQ ID č. 3, Holwerda a kol.,
124
The Plant Cell, 4: 307 - 318 (1992)) nebo vložit na 3'-konec genu sekvenci kódující karboxylový signální peptid, jak ji popsali Dombrowski a kol., The Plant Cell, 5: 587 - 596 (1993) nebo její funkční variantu. Podobně lze VIP2 modifikovat tak, aby byl cílen buď do mitochondrií nebo plastidů, včetně chloroplastů, tím, že se do popsané sekvence VIP2 vloží sekvence kódující požadované signály způsobující cílení. Bakteriální sekreční signál přítomný ve VIP2 může být ve výsledném konstruktu zachován nebo z něj může být odstraněn.
Jedním z příkladů konstruktu, který obsahuje eukaryotický sekreční signál fúzovaný s kódující sekvencí VIP, je pCIB5528. Byly syntetizovány oligonukleotidy odpovídající jak hornímu tak dolnímu řetězci sekvencí kódujících sekreční signál uvedený v SEQ ID č. 25, mající sekvenci 5'-GGATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC CTG TTC CTG CTG AGC GGC GCC GCG GGC GTG CAC TGC CTGCAG-3' (SEQ ID č. 41). Po hybridizací se 5'-konec sekrečního signálu podobá lepivým koncům odpovídajícím restrikčním místům BamHI a Pstl. Oligonukleotid byl hybridizován a fosforylován a ligován do pCIB5527 (konstruování je popsáno v příkladu 23A), který byl rozštěpen BamHI a Pstl za použití standardních postupů. Výsledná kódující sekvence optimalizovaná pro kukuřici je uvedena v SEQ ID č. 42 a kóduje protein uvedený v SEQ ID č. 43. Kódovaný protein obsahuje eukaryotický sekreční signál místo sekrečního signálu mikroorganismu Bacillus.
Jedním z příkladů konstruktu, který obsahuje signál způsobující cílení do vakuoly fúzovaný s kódující sekvencí VIP, je pCIB5533. Byly syntetizovány oligonukleotidy odpovídající jak hornímu tak dolnímu řetězci sekvencí kódujících peptid způsobující cílení do vakuoly uvedený v SEQ ID č. 3, mající sekvenci 5'-CCG CGG GCG TGC ACT GCC TCA GCA GCA GCA GCT TCG CCG ACA GCA ACC CCA TCC GCG TGA CCG ACC GCG CCG CCA GCA CCC TCG AG-3' (SEQ ID č. 44) . Po hybridizací se 5'-konec
125 signálu způsobujícího cílení do vakuoly podobá lepivým koncům odpovídajícím restrikčnim místům SacII a Pstl. Oligonukleotid byl hybridizován a fosforylován a ligován do pCIB5528 (konstruování je popsáno výše), který byl rozštěpen SacII a Pstl za použití standardních postupů. Výsledná kódující sekvence optimalizovaná pro kukuřici je uvedena v SEQ ID č. 4 5 a kóduje protein uvedený v SEQ ID č. 46. Kódovaný protein obsahuje kromě eukaryotickěho sekrečního signálu peptid způsobující cílení do vakuoly.
Gen VIP1 lze pomocí podobných postupů rovněž upravit tak, aby byl sekretován nebo cílen do subcelulárních organel.
Příklad 23A
Odstranění sekrečního signálu mikroorganismu Bacillus z VIPlA(a) a VIP2A(a)
VIPlA(a) a VIP2A(a) jsou sekretovány během růstu kmene AB78. Povaha peptidových sekvencí, které působí jako sekreční signály, byla popsána v literatuře (Simonen a Palva, Microbiological reviews, str. 109 - 137 (1993)). Na základě informací z výše uvedené publikace byl v obou genech identifikován předpokládaný sekreční signál. Ve VIPlA(a) je tento signál tvořen aminokyselinami 1-33 (viz SEQ ID č. 5). K odštěpení sekrečního signálu pravděpodobně dochází za serinem, který je aminokyselinou 33. Jako sekreční signál ve VIP2A(a) byly identifikovány aminokyseliny 1-49 (viz SEQ ID č. 2). Analýzou N-koncového peptidů sekretovaného maturovaného proteinu VIP2A(a) bylo zjištěno, že N-koncová sekvence je LKITDKVEDFKEDK. Tato sekvence začíná aminokyselinou 57 v SEQ ID č. 2. Geny kódující tyto proteiny byly modifikovány tak, že byly odstraněny sekreční signály mikroorganismu Bacillus.
Byla zkonstruována kódující oblast VIPlA(a) optimalizo126 váná pro kukuřici, z jejíhož 5'-konce byly odstraněny sekvence kódující prvních 33 aminokyselin, t.j. sekreční signál. Tato modifikace byla provedena pomocí polymerasově řetězové reakce za použití dopředného primeru který obsahoval sekvenci 5'-GGA TCC ACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC-3' (SEQ ID č. 33), který hybridizuje s genem optimalizovaným pro kukuřici (SEQ ID č. 26) v nukleotidové poloze 100, a přidával restrikční místo BamHI a konvenční eukaryotické místo počátku translace včetně startovacího kodónu. Zpětný primer, který obsahoval sekvenci 5'-AAG CTT CAG CTC CTT G-3' (SEQ ID č. 34), hybridizuje s komplementárním vláknem v nukleotidové poloze 507. Byl získán amplifikační produkt o velikosti 527 bp, který obsahuje restrikční místa BamHI na 5'-konci a místo HindlII na 3'-konci. Amplifikační produkt byl klonován do T-vektoru (popsaného níže v příkladu 24) a sekvenován pro zajištění správné DNA-sekvence. Poté byl restrikčním štěpením získán fragment BamHI/HindlII, který byl použit pro nahrazení fragmentu BamHI/HindlII genu VIPlA(a) optimalizovaného pro kukuřici, klonovaného do kořeny preferované promotorové kazety. Získaný konstrukt byl označen pCIB5526. Kódující oblast VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici, ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, je uvedena jako SEQ ID č. 35. Kódovaný protein je uveden jako SEQ ID č. 36 .
Gen který kóduje upravenou formu VIP2A(a), tedy kódující oblast ze které byl odstraněn sekreční signál, byla zkonstruována podobným způsobem jako je popsán výše pro zkonstruování upravené formy VIPlA(a). Modifikace byla provedena pomocí polymerasové řetězové reakce za použití dopředného primeru 5'-GGA TCC ACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC AC-3' (SEQ ID č. 37) . Tento primer hybridizuje s genem VIP2A(a) optimalizovaným pro kukuřici (SEQ ID č. 27) v nukleotidové poloze 150. V nukleotidové poloze 15 tohoto primeru byla provedena tichá mutace pro získání restrikčního místa Pstl. Zpětný primer má sekvenci 5'-AAG CTT CCA CTC CTT
127
CTC-3' (SEQ ID č. 38). Byl získán produkt o velikosti 259 bp s restrikčním místem HindlII na 3'-konci. Amplifikační produkt byl klonován do T-vektoru, sekvenován a ligován do kořeny preferované promotorové kazety obsahující VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici, kterážto kazeta byla rozštěpena BamHI/HindlII. Získaný konstrukt byl označen pCIB5527. Kódující oblast VIP2A(a) optimalizovaná pro kukuřici, ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, je uvedena jako SEQ ID č. 39. Kódovaný protein je uveden jako SEQ ID č. 40.
Příklad 24
Konstrukce a klonování genů VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizovaných pro kukuřici
Konstruování: Geny optimalizované pro kukuřici byly sestaveny pomocí reverzní translace nativních proteinových sekvencí VIPlA(a) a VIP2A(a) za použití kodónů, které jsou v kukuřici nej častěji používány (Murray a kol., Nucleic Acid Research, 17: 477 - 498 (1989)) . Pro usnadnění klonování byla DNA-sekvence dále modifikována začleněním jedinečných restrikčních míst ve vzdálenostech každých 200 - 360 nukleotidů. VIPlA(a) byl zkonstruován tak, aby byl klonován v 11 takových fragmentech a VIP2A(a) byl klonován v 5 fragmentech. Po klonování sousedící fragmenty spojeny jednotlivých fragmentů byly za použití restrikčních míst společných oběma fragmentům, za vzniku kompletního genu. Pro klonování každého fragmentu byly zkonstruovány oligonukleotidy o délce 50 - 85 nukleotidů představující jak horní tak dolní řetězec DNA. Horní oligonukleotid prvního páru oligonukleotidů byl zkonstruován tak, že měl na 3'-konci jednořetězcovou oblast o délce 15 bp, která byla homologická s podobnou jednořetězcovou oblastí dolního řetězce následujícího páru oligonukleotidů, pro řízení orientace a pořadí
128 různých párů oligonukleotidů v daném fragmentu. Oligonukleotidy byly rovněž zkonstruovány tak, že v případě, že jsou všechny oligonukleotidy představující fragment hybridizovány, jsou na koncích jednořetězcové oblasti odpovídající konkrétním restrikčním místům, která mají být vytvořena. Struktura každého oligomeru byla zkoumána pokud jde o stabilní sekundární struktury, jako jsou vlásenkové smyčky, za použití programu OLIGO firmy NBI lne. Kdekoli to bylo nutně, byly nukleotidy změněny pro snížení stability sekundární struktury aniž by došlo ke změně aminokyselinové sekvence proteinu. Na místo kodónu startujícího translaci v genu byla vložena rostlinná konvenční sekvence místa vázajícího se na ribozomy, TAAACAATG (Joshi a kol., Nucleic Acid Res., 15: 6643 - 6653 (1987)) nebo eukaryotická konvenční sekvence místa vázajícího se na ribozomy, CCACCATG (Kozák, Nucleic Acid Research, 12: 857 - 872 (1984)).
Klonování: Oligonukleotidy byly syntetizovány firmou IDT lne. , a byly dodány ve formě lyofilizovaných prášků. Byly resuspendovány ve 200 μΜ koncentraci. Ke 30 μΐ každého oligonukleotidu byl přidán formamid na konečnou koncentraci 25 - 50 % a vzorek byl vařen po dobu 2 minut před separací na předem připraveném 10% polyakrylamid/močovinovém gelu získaném od firmy Novex. Po elektroforéze byl oligomer detekován za použití ultrafialového světla pomocí umístění gelu na desku pro chromatografií na tenké vrstvě obsahující fluorescenční indikátor a osvícení ultrafialovým světlem. Oblast obsahující DNA o správné velikosti byla vyříznuta a extrahována z polyakrylamidu inkubací rozkouskovaného fragmentu gelu přes noc v pufru obsahujícím 0,4M chlorid lithný a 0,lmM kyselinu ethylendiamintetraoctovou. DNA byla separována ze zbytků gelu centrifugací přes filtr Millipore UFMC. Extrahovaná DNA byla vysrážena ethanolem pomocí přidání dvou objemu absolutního alkoholu. Po centrifugaci byl precipitát resuspendován v dH2O v koncentraci 2,5 μιηοΐ. Fragmenty byly klonovány buďto hybridizaci oligonukleotidů a
129 ligací s vhodným vektorem nebo amplifikací hybridizovaného fragmentu za použití ekvimolární směsi všech oligonukleotidu pro konkrétní fragment jako matrice a koncově specifických primerů pro polymerasovou řetězovou reakci.
Klonování pomocí hybridizace a licrace: Homologické dvouřetězcové páry oligonukleotidu byly získány smícháním 5 μΐ horního a dolního oligomeru pro každý pár oligonukleotidů s pufrem obsahujícím lx polynukleotid-kinasový pufr (PNK-pufr) (70mM Tris-HCl o pH 7,6, lOmM chlorid hořečnatý, 5mM dithiothreitol (DTT)), 50mM chlorid draselný a 5 % formamidu, na konečný objem 50 μΐ. Oligonukleotidy byly vařeny po dobu 10 minut a pomalu ochlazeny na teplotu 37 °C nebo na teplotu místnosti. 10 μΐ bylo odebráno pro analýzu na 4% agarose v pufračním systému TAE (Metaphore, FMC) . Každý z hybridizovaných párů oligonukleotidů byl kinasován přidáním ATP na konečnou koncentraci 1 mmol, BSA na konečnou koncentraci 100 μg na ml, 200 jednotek polynukleotid-kinasy a 1 μΐ lOx PNK-pufru, v objemu 10 μΐ. Po hybridizací a fosforylaci byla reakční směs inkubována při teplotě 37 °C po dobu 2 hodin přes noc. 10 μΐ každého párů oligonukleotidů pro konkrétní fragment bylo smícháno na konečný objem 50 μΐ. Páry oligonukleotidů byly hybridizovány zahřátím na teplotu 80 °C na dobu 10 minut a poté pomalým ochlazením na 37 °C. 2 μΐ oligonukleotidů byly smíchány s přibližně 100 ng příslušného vektoru a ligovány za oužití pufru obsahujícího 50mM Tris-HCl o pH 7,8, lOmM chlorid hořečnatý, lOmM dithiothreitol a 1 mM ATP. Reakční směs byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 2 hodin až přes noc a transformována do kmene Escherichia coli DH5a, nanesen na L-desky obsahující ampicillin v 100 μρ/ιηΐ za použití standardních postupů.
Pozitivní klony byly dále charakterizovány a jejich struktura potvrzena za použití miniscreeningu pomocí polymerasové řetězové reakce, podrobně popsaného v EP-A 0618976, přičemž byly jako primery použity univerzální primery Reverse a M13-20. Pozitivní klony byly identifikovány pomocí který byl koncentraci
130 rozštěpení DNA příslušnými enzymy a následným sekvenováním.
Rekombinantní klony, které obsahovaly očekávanou DNA-sekvenci, byly poté vybrány pro další práci.
Amplifikace pomocí polymerasové řetězové reakce a klonování do T-vektoru: Amplifikace pomocí polymerasové řetězové reakce byla prováděna za použití směsi všech oligomerů, které představovaly horní a dolní řetězec konkrétního fragmentu (konečná koncentrace 5 mmol každého z nich) jako matrice, specifických koncových primerů pro konkrétní fragment (konečná koncentrace 2 /imol) , 200μΜ každého z dATP, dTTP, dCTP a dGTP, lOmM Tris-HCl o pH 8,3, 50mM chloridu draselného, l,5mM chloridu hořečnatého, 0,01% želatiny a 5 jednotek Taq-polymerasy v konečném objemu 50 μΐ. Amplifikační reakce byla prováděna v přístroji Perkin Elmer thermocycler 9600 inkubací při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty (1 cyklus) , s následujícími 20 cykly 95 °C po dobu 45 sekund, 50 °C po dobu 45 sekund a 72 °C po dobu 3 0 sekund. Nakonec byla před analýzou produktu reakční směs inkubována po dobu 5 minut při teplotě 72 °C. 10 μΐ reakčni směsi bylo analyzováno na 2,5% agarosovém gelu Nusieve (FMC) v pufračním systému TAE. Fragment o správné velikosti byl purifikován v gelu a použit pro klonování do klonovaciho vektoru pro polymerasovou řetězovou reakci nebo T-vektoru. Zkonstruování T-vektoru bylo provedeno jak popsali Marchuk a kol., Nucleic Acid Research, 19: 1154 (1991) . Jako rodičovský vektor byl použit pBluescriptsk+ (Stratagene, Kalifornie, USA). Transformace a identifikace správného klonu byla prováděna jak je popsáno výše.
Fragmenty VIPlA(a) č. 1, 3, 4, 5, 6, 8a9a fragmetny VIP2A(a) č. 2 a 4 byly získány klonováním amplifikačních produktů polymerasové řetězové reakce, zatímco fragmenty VIPlA(a) č. 2, 7, 10 a 11 a fragmenty VIP2A(a) č. 1, 3 a 5 byly získány pomocí hybridizace a ligace.
Jakmile byly získány fragmenty s požadovanou sekvencí,
131 byl sestaven kompletní gen klonováním sousedících fragmentů dohromady. Kompletní gen byl znovu sekvenován a byla testována jeho účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera před přenosem do expresívních vektorů pro rostliny obsahujících kořeny preferovaný promotor (popsaný v patentové přihlášce Spojených Států Amerických č. 08/017 209) a actin-promotor z rýže.
Jedním z takových expresívních vektorů pro rostliny je pCIB5521. Kódující oblast VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici (SEQ ID č. 26) byla klonována do expresívního vektoru pro rostliny, obsahujícího kořeny preferovaný promotor na 5-konci genu, s PEP-karboxylasovým intronem č. 9 následovaným 35S-terminátorem na 3'-konci. Tento plazmid rovněž obsahuje sekvence rezistence vůči ampicillinu z plazmidu pUC 19. Dalším expresívním vektorem pro rostliny je pCIB5522, který obsahuje kódující oblast VIP2A(a) optimalizovanou pro kukuřici (SEQ ID č. 27), fúzovanou s kořeny preferovaným promotorem na 5'-konci genu, s PEP-karboxylasovým intronem č. 9 následovaným 35S-terminátorem na 3'-konci.
Příklad 25
NAD-afinitní chromatografie
Byla použita purifikační strategie založená na afinitě VIP2 k substrátu NAD (nikotinamidadenindinukleotidu). Supernatant ze směsi, jejíž pH bylo upraveno natrium-citrátovým pufrem na hodnotu 3,5, popsaný v příkladu 4, byl dialyzován ve 20mM TRIS (tris(hydroxymethyl)aminomethanu) o pH 7,5 přes noc. Neutralizovaný supernatant byl přidán ke stejnému objemu promyté NAD-agarosy a inkubován za mírného třepání při teplotě 4 °C přes noc. Pryskyřice a proteinový roztok byly vneseny do polypropylenové kolony o objemu 10 ml a bylo umožněno, aby proteinový roztok vytekl. Kolona byla promyta
132
20mM TRIS o pH 7,5 v objemu rovnajícím se pětinásobku objemu kolony, 20mM TRIS o pH 7,5 se lOOmM chloridem sodným v objemu rovnajícím se dvou- až pětinásobku objemu kolony a poté 20mM TRIS o pH 7,5 v objemu rovnajícím se dvou- až pětinásobku objemu kolony. Proteiny VIP byly vymyty 2 0mM TRIS o pH 7,5 doplněným 5mM NAD. Byly odebrány promývací kapaliny o objemu rovnajícím se přibližně trojnásobku objemu kolony a byly zahuštěny na přístroji Centricon -10. Výtěžek typicky činí přibližně 7 - 15 gg proteinu na ml pryskyřice.
Při analýze purifikovaných proteinů pomocí elektroforézy v SDS-polyakrylamidovém gelu s následujícím obarvením stříbrem byly viditelné dva polypeptidy, jeden o molekulové hmotnosti přibližně 80000 a druhý o molekulové hmotnosti přibližně 45000. N-koncovým sekvenováním bylo zjištěno, že protein o molekulové hmotnosti 80000 odpovídá proteolyticky upravené formě VIPlA(a) a protein o molekulové hmotnosti 45000 odpovídá proteolyticky upravené formě VIP2A(a). Společná purifikace VIPlA(a) s VIP2A(a) svědčí o tom, že tyto dva proteiny pravděpodobně tvoří komplex a obsahují oblasti tvořící interakce protein-protein. Proteiny VIPlA(a) a VIP2A(a) purifikované tímto způsobem byly biologicky účinné proti Diabrotica virgifera virgifera.
Příklad 26
Exprese VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizovaných pro kukuřici
U kmenů Escherichia coli obsahujících různé plazmidy, které obsahují geny VIP, byla zkoumána exprese vegetativních insekticidních proteinů. Kmeny Escherichia coli obsahující jednotlivé plazmidy byly pěstovány přes noc v L-vývaru a exprimovaný protein byl extrahován z kultury jak je popsáno výše v příkladu 3. Exprimovaně proteiny byly zkoumány pomocí western blottingu za použití protilátek vytvořených pomocí standardních způsobů známých v oboru, podobných jako jsou
133 popsány výše v příkladu 12. Byla rovněž testována insekticidní účinnost exprimovaných proteinů proti Diabrotica virgifera virgifera, podle způsobu popsaného výše v příkladu
3. Výsledky testů exprese v Escherichia coli jsou uvedeny níže.
Exprese vegetativních insekticidních proteinů v Escherichia coli
extrakt kmene Escherichia coli obsahujícího uvedený plazmid test č. 1 test č. 2 % mortality detekován protein
kontrola 0 0 ne
pCIB5521 (VIPlA(a) optimalizovaný pro kukuřici) 47 27 ano
pCIB5522 (VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici) 7 7 ano
pCIB6024 (nativní VIP2A(a)) 13 13 ano
pCIB6206 (nativní VIPlA(a) ) 27 40 ano
kombinované extrakty pCIB5521 + pCIB5522 87 47
kombinované extrakty pCIB5521 + pCIB6024 93 100
kombinované extrakty pCIB5522 + pCIB6206 100 100
kombinované extrakty pCIB6024 + pCIB6206 100 100
DNA z těchto plazmidů byla použita pro dočasnou expresi vegetativních insekticidních proteinů pomocí expresívního systému pro protoplasty kukuřice. Protoplasty byly izolovány ze suspenzních kultur kukuřičné linie 2717 Line 6 pomocí rozštěpení buněčných stěn za použití enzymů Cellulase RS a
134
Macerase R10 v příslušném pufru. Protoplasty byly izolovány na sítech a centrifugací. Protoplasty byly transformovány pomocí standardního způsobu přímého přenosu genů za použití přibližně 75 μg plazmidové DNA a polyethylenglykolu PEG-40. Ošetřené protoplasty byly inkubovány přes noc ve tmě při teplotě místnosti. Pomocí western blottingu byla na protoplastových explantátech provedena analýza exprese vegetativních insekticidních proteinů a insekticidní účinnost proti Diabrotica virgifera virgifera byla analyzována jak je popsáno výše v případě exprese v Escherichia coli. Výsledky testů exprese v kukuřičných protoplastech jsou uvedeny níže.
Exprese vegetativních insekticidních proteinů v rostlinných protoplastech
testovaný extrakt test č. 1 test č. 2 % mortality detekován protein
kontrola bez DNA 27 10 ne
pCIB5521 (p) (VIPlA(a) optimalizovaný pro kukuřici) 20 (0) 30 ano
pCIB5522 (p) (VIP2A(a) optimalizovaný pro kukuřici) 20 (0) 20 ano
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB5522 (p) 87 (82) 90
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB5522 (e) 100 -
kombinované extrakty pCIB5522 (p) + pCIB5521 (p) 53 (36)
kombinované extrakty pCIB5521 (p) + pCIB6024 (e) 100 -
135
testovaný extrakt test č. 1 test č. 2 detekován
% mortality protein
kombinované extrakty pCIB5522 (p) + pCIB6206 (e) 100
pCIB6024 (e) (nativní VIP2A(a)) 0 ano
pCIB6206 (e) (nativní VIPlA(a)) 20 ano
pCIB5521 + pCIB5522 (plazmidy dodané kotransformací) 100 100 ano
Legenda :
(ρ) = extrakt protoplastové kultury transformované uvedeným plazmidem (e) = extrakt kmene Escherichia coli obsahujícího uvedený plazmid
Údaje o expresi získané jak s Escherichia coli tak s kukuřičnými protoplasty svědčí o tom, že geny VIPlA(a) a VIP2A(a) optimalizované pro kukuřici tvoří stejný protein jako nativní geny VIPlA(a) respektive VIP2A(a), a že proteiny kódované geny optimalizovanými pro kukuřici jsou funkčně ekvivalentní s proteiny, které jsou kódované nativními geny.
Všechny publikace a patentové přihlášky uvedené v tomto popisu určují úroveň odborníka v oboru, kterého se tento vynález týká. Obsah všech citovaných publikací a patentových přihlášek se považuje za odkazem začleněný do této přihlášky.
V patentové sbírce kultur Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA byly uloženy následující kultury:
136
označení kmene číslo uložení datum uložení
1. Escherichia coli PL2 NRRL B-21221 9. března 199
2. Escherichia coli PL2 NRRL B-21221N 2. září 1994
3. Escherichia coli pCIB6022 NRRL B-21222 9. března 199
4. Escherichia coli pCIB6023 NRRL B-21223 9. března 199
5. Escherichia coli pCIB6022 NRRL B-21223N 2. září 1994
6. Bacillus thuringiensis HD73-78VIP NRRL B-21224 9. března 199
7. Bacillus thuringiensis AB88 NRRL B-21225 9. března 199
8. Bacillus thuringiensis AB359 NRRL B-21226 9. března 199
9. Bacillus thuringiensis AB289 NRRL B-21227 9. března 199
10. Bacillus sp. AB59 NRRL B-21228 9. března 199
11. Bacillus sp. AB294 NRRL B-21229 9. března 199
12. Bacillus sp. AB256 NRRL B-21230 9. března 199
13. Escherichia coli P5-4 NRRL B-21059 18. března 199
14. Escherichia coli P3-12 NRRL B-21061 18. března 199
15. Bacillus cereus AB78 NRRL B-21058 18. března 199
16. Bacillus thuringiensis AB6 NRRL B-21060 18. března 199
17. Escherichia coli pCIB6202 NRRL B-21321 2. září 1994
18. Escherichia coli pCIB7100 NRRL B-21322 2. září 1994
19. Escherichia coli pCIB7101 NRRL B-21323 2. září 1994
20. Escherichia coli pCIB7102 NRRL B-21324 2. září 1994
21. Escherichia coli pCIB7103 NRRL B-21325 2. září 1994
22. Escherichia coli pCIB7104 NRRL B-21422 24. března 199
23. Escherichia coli pCIB7107 NRRL B-21423 24. března 199
24. Escherichia coli pCIB7108 NRRL B-21438 5. května 199
25. Bacillus thuringiensis AB424 NRRL B-21439 5. května 199
Ačkoli byl vynález v příkladech výše popsán detailně z důvodů ilustrace a jasnosti, je zřejmé, že je možné provést určité změny a modifikace v rámci připojených nároků.
137
Zobrazení sekvencí
Informace o sekvenci SEQ ID č. 1:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 6049 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1082..2467 (D) další informace: produkt = VIP-2A(a) (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: různá vlastnost (B) lokace: 2475..5126 (D) další informace: poznámka = kódující sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 100 kDa. Tato kódující sekvence se opakuje v SEQ ID č. 4a translatuje se odděleně.
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 1:
ATCGATACAA TGTTGTTTTA CTTAGACCGG TAGTCTCTGT AATTTGTTTA ATGCTATATT 60
CTTTACTTTG ATACATTTTA ATAGCCATTT CAACCTTATC AGTATGTTTT TGTGGTCTTC 120
CTCCTTTTTT TCCACGAGCT CTAGCTGCGT TT.AATCCTGT TTTGGTACGT TCGCTAATAA 180
TATCTCTTTC TAATTCTGCA ATACTTGCCA TCATTCGAAA GAAGAATTTC CCCATAGCAT 240
TAGAGGTATC AATGTTGTCA TGAATAGAAA TAAAATCTAC A.CCTAGCTCT TTGAATTTTT 300
CACTTAACTC AATTAGGTGT TTTGTAGAGC GAGAAATTCG ATCAAGTTTG TAAACAACTA 360
138
TCTTATCGCC TTTACGTAAT ACTTTTAGCA ACTCTTCGAG TTGAGGGCGC TCTTTTTTTA 420
TTCCTGTTAT TTTCTCCTGA TATAGCCTTT CTAGACCATA TTGTTGCAAA GCATCTATTT 480
GCATATCGAG ATTTTGTTCT TCTGTGCTGA CACGAGCATA ACCAAAAATC AAATTGGTTT 540
CACTTCCTAT CTAAA.TATAT CTATTAAAAT AGCACGAAAA ACCTTATTAA ATTAAAATAA 600
GGAACTTTGT TTTTY^OSTaT GGA.TTTTGGT ACTCAATATG GATGAGTTTT TAACGCTTTT 660
GTTAAAAAAC AAACAAGTGC CA.TAAACGGT CGTTTTTGGG ATGACATAAT AAATAATCTG 720
TTTGATTAAC CTAACCTTGT ATCCTTACAG CCCAGTTTTA TTTGTACTTC AACTGACTGA 780
ATATGAAAAC AACATGAAGG TTTCATAAAA TTTATATA-TT TTCCATAACG GATGCTCTAT 840
CTTTAGGTTA TAGTTAAATT ATAAGAAAAA AACAAACGGA GGGAGTGAAA AAAAGGATCT 900
TCTCTATAAT TTTACAGGCT CTTTAATAAG AAGGGGGGAG ATTAGATAA.T AAATATGAAT 960
ATCTATCTAT AATTGTTTGC TTCTACAATA ACTTATCTAA CTTTCATATA CAAGAACAAA 1020
ACAGACTAAA TCCAGATTGT ATATTCATTT TCAGTTGTTC CTTTATAAAA TAATTTCATA 1080
A ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA 1126
Met Lys Arg Met Glu Gly Lvs Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu
5 ~ 10 15
CAA. GTA Gin Val GTT Val ACT AAA ACT GTA TTG CTT AGT ACA GTT TTC TCT ATA TCT 1174
Thr Lys 20 Thr Val Leu Leu Ser 25 Thr Val Phe Ser Ile 30 Ser
TTA TTA AAT AAT GAA GTG ATA AAA GCT GAA. CAA. TTA AAT ATA AAT TCT 1222
Leu Leu Asn Asn Glu Val Ile Lvs Ala Glu Gin Leu A.sn Ile Asn Ser
35 40 45
CAA AGT AAA TAT ACT AAC TTG CAA AAT CTA AAA ATC ACT GAC AAG GTA 1270
Gin Ser Lys Tyn Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr A.sp Lys Val
50 55 60
GAG G4T TTT AAA GAA GA.T AAG GAA AAA. GCG AAA GAA mr r~* i GGG AAA GAA 1318
Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu
65 70 75
AAA GAA AAA GAG TGG AAA CTA ACT GCT ACT GAA AAA GGA AAA ATG AAT 1366
Lvs Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn
80 85 90 95
AAT TTT TTA GAT AAT AAA AAT GAT ATA AAG ACA AAT TAT AAA GAA ATT 1414
Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile
100 105 110
139
ACT TTT Thr Phe TCT ATG GCA GGC TCA TTT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA AAA 1462
Ser Mec 115 Ala Gly Ser Phe Glu 120 Asp Glu Ile Lys Asp 125 Leu Lys
GAA ATT GAT AAG ATG TTT GAT AAA ACC AAT CTA TCA AAT TCT ATT ATC 1510
Glu Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile
130 135 140
ACC TAT AAA. AAT GTG GAA CCG ACA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA 1558
Thr Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu
145 150 155
ACA GAA GGT AAT ACG ATT AAT TCT GAT GCA ATG GCA CAG TTT AAA GAA . 1606
Thr Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu
160 165 170 175
CAA TTT TTA GAT AGG GAT ATT AAG TTT GAT AGT TAT CTA GAT ACG CAT 1654
C-ln Phe Leu A.sp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His
180 185 190
TTA ACT GCT CAA CAA GTT TCC AGT AAA GAA AGA GTT ATT TTG AAG GTT 1702
Leu Thr Ale Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val
195 200 205
ACG GTT CCG AGT GGG AAA GGT TCT ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC 1750
Thr Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val
210 215 220
ATT TTA AAT AAT AGT GAA TAC AAA ATG CTC ATT GAT AAT GGG TAT ATG 1798
Ile Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met
225 230 235
GTC CAT GTA GAT AAG GTA TCA AAA GTG GTG AAA AAA GGG GTG GAG TGC 1846
Vel His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys
240 245 250 255
TTA CAA ATT GAA GGG ACT TTA AAA AAG AGT CTT GAC TTT AAA AAT GAT 1894
Leu Gin Ile Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp
260 265 270
ATA AAT GCT GAA GCG CAT AGC TGG GGT ATG AAG AAT TAT GAA GAG TGG 1942
Ile Asn Ala Glu Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp
275 280 285
GCT AAA GAT TTA ACC GAT TCG CAA AGG GAA GCT TTA GAT GGG TAT GCT 1990
Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala
290 295 300
AGG CAA GAT TAT AAA GAA ATC AAT AAT TAT TTA AGA AAT CAA GGC GGA 2038
Arg Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly
305 310 315
AGT GGA AAT GAA AAA CTA GAT GCT CAA ATA AAA AAT ATT TCT GAT GCT 2086
Ser Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala
320 325 330 335
140
TTA Leu GGG Gly .AAG Lys .AAA Lys CCA ATA CCG GAA AAT ATT ACT GTG TAT AGA TGG Trp 350 TGT Cys 2134
Pro 340 Ile Pro Glu Asn Ile 345 Thr Val Tyr Arg
GGC ATG CCG GAA TTT GGT TAT CAA ATT AGT GAT CCG TTA CCT TCT TTA 2182
Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu
355 360 365
AAA GAT TTT GAA GAA CAA TTT TTA AAT ACA ATC AAA GAA GAC AAA GGA 2230
Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly
370 375 380
TAT ATG AGT ACA AGC TTA TCG AGT GAA CGT CTT GCA GCT TTT GGA TCT 2278
Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala řla Phe Gly Ser
385 390 395
AGA AAA ATT ATA TTA CGA TTA CAA GTT CCG AAA GGA AGT ACG GGT GCG 2326
Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala
400 405 410 415
TAT TTA AGT GCC ATT GGT GGA TTT GCA AGT GAA AAA GAG ATC CTA CTT 2374
Tyr Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu
420 425 430
GAT AAA GAT AGT AAA TAT CAT ATT GAT AAA GTA ACA GAG GTA ATT JTT 2422
Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile
435 440 445
AAA GGT GTT AAG CGA TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT 2467
Lys Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
450 455 460
TAAGGAGATG AAAAATATGA AGAAAAAGTT AGCAAGTGTT GTAACGTGTA CGTTATTAGC 2527
TCCTATGTTT TTGAATGGAA ATGTGAATGC TGTTTACGCA GACAGCAAAA CAAATCAAAT 2587
TTCTACAA.CA CAGAAAAATC AACAGAAAGA GATGGACCGA AAAGGATTAC TTGGGTATTA 2647
TTTCAAAGGA AAAGATTTTA GTAATCTTAC TATGTTTGCA CCGACACGTG ATAGTACTCT 2707
TATTTATGAT CAACAAACAG CAAATAAACT ATTAGATAAA AAACAAC.AAG AATATCAGTC 2767
TATTCGTTGG ATTGGTTTGA TTCAGAGTAA AGAAACGGGA GATTTCACAT TTAACTTATC 2827
TGAGGATGAA CAGGCAATTA TAGAAATCAA TGGGAAAATT ATTTCTAATA AAGGGAAAGA 2887
flPAGCAAGTT GTCCATTTAG AAAAAGGAAA ATTAGTTCCA ATCAAAATAG AGTATCAATC 2947
AGATACAAAA TTTAATATTG ACAGTAAAAC ATTTAAAGAA CTTAAATTAT TTAAAATAGA 3007
TAGTCAAAAC CAACCCCAGC AAGTCCAGCA AGATGAACTG AGAAATCCTG AATTTAACAA 3067
GAAAGAATCA CAGGAATTCT TAGCGAAACC ATCGAAAATA AATCTTTTCA CTCAAAAAAT 3127
GAAALGGGAA ATTGATGAAG ACACGGATAC GGATGGGGAC TCTATTCCTG ACCTTTGGGA 3187
141
AGAAAATGGG TATACGATTC ACAATAGAAT CGCTGTAAAG TGGGACGATT CTCTAGCAAG 3247
TAAAGS3TAT ACGAAATTTG TTTCAAATCC ACTAGAAAGT CACACAGTTG GTGATCCTTA 3307
TACAGATTAT GAAAAGGCAG CAAGAGATCT AGATTTGTCA AATGCAAAGG AAACGTTTAA 3367
CCCATTGGTA GCTGCTTTTC CAAGTGTGAA TGTTAGTATG GAAAAGGTGA TATTATCACC 3427
AAATGAAAAT TTATCCAATA GTGTAGAGTC TCATTCATCC ACGAATTGGT CTTATACAAA 3487
TACAGAAGGT GCTTCTGTTG AAGCGGGGAT TGGACCAAAA GGTATTTCGT TCGGAGTTAG 3547
CGTAAACTAT CAACACTCTG AAACAGTTGC ACAAGAATGG GGAACATCTA CAGGAAATAC 3607
TTCGCAATTC .AATACGGCTT CAGCGGGATA TTTAAATGCA AATGTTCGAT ATAACAATGT 3667
AGGAACTGGT GCCATCTACG ATGTAAAACC TACAACAAGT TTTGTATTAA ATAACGATAC 3727
TATCGCAACT ATTACGGCGA aatctaattc TACAGCCTTA AATATATCTC CTGGAGAAAG 3787
TTACCCGAAA AAAGGACAAA ATGGAATCGC AATAACATCA ATGGATGATT TTAATTCCCA 3847
TCCGATTACA TTAAATAAAA AACAAGTAGA TAATCTGCTA AATAATAAAC CTATGATGTT 3907
GSAAACAAAu CAAACAGATG gtgtttataa GATAAAAGAT ACACATGGAA ATATAGTAAC 3967
TGGCGGAGAA TGGAATGGTG TCATACAACA AATCAAGGCT AAAACAGCGT CTATTATTGT 4027
GGATGATGGG GAACGTGTAG CAGAAAAACG TGTAGCGGCA AAAGATTATG AAAA.TCCAGA 4087
AGATAAAACA CCGTCTTTAA CTTTAAAAGA TGCCCTGAAG CTTTCATATC CAGATGAAAT 4147
.AAAAGAAATA GAGGGATTAT TATATTATAA AAACAAACCG ATATACGAAT CGAGCGTTAT 4207
GACTTACTTA GATGAAAATA CAGCAAAAGA AGTGACCAAA CAATTAAATG ATACCACTGG 4267
GAAATTTAAA GATGTAAGTC ATTTATATGA TGTAAAACTG ACTCCAAAAA TGAATGTTAC 4327
AATCAAATTG TCTATACTTT ATGATAATGC TGAGTCTAAT GATAACTCAA TTGGTAAATG 4387
GACAAACACA AATATTGTTT CAGGTGGAAA TAACGGAAAA AAACAA.TATT CTTCTAATAA 4447
TCCGGATGCT AATTTGACAT TAAATACAGA TGCTCAAGAA AAATTAAATA. AAAATCGTGA 4507
CTATTATATA AGTTTATATA TGAAGTCAGA .AAAAAACACA CAATGTGAGA TTACTATAGA 4567
TGGGGAGATT TATCCGATCA CTACAAAAAC AGTGAATGTG A4TAAAGACA ATTACAAAAG 4627
ATTAGATATT ATAGCTCATA ATATAAAAAG TAATCCAATT TCTTCACTTC ATATTAAAAC 4687
GAATGATGAA ATAACTTTAT TTTGGGATGA TATTTCTATA ACAGATGTAG CATCAATAAA 4747
ACCGGAAAAT TTAACAGATT CAGAAATTAA ACAGATTTAT AGTAGGTATG GTATTAAGTT 4807
142
AGAAGATGGA ATCCTTATTG ATAAAAAAGG TGGGATTCAT TATGGTGAAT TTATTAATGA 4867
AGCTAGTTTT AATATTGAAC CATTGCAAAA TTATGTGACC AAATATGAAG TTACTTATAG 4927
TAGTGAGTTA GGACCAAACG TGAGTGACAC ACTTGAAAGT GATAAAATTT ACAAGGATGG 4987
GACAATTAAA TTTGATTTTA CCAAATATAG TAAAAATGAA CAAGGATTAT TTTATGACAG 5047
TGGATTAAAT TGGGACTTTA AAATTAATGC TATTACTTAT GATGGTAAAG AGATGAATGT 5107
TTTTCATAGA TATAATAAAT AGTTATTATA TCTATGAAGC TGGTGCTAAA GATAGTGTAA 5167
AAGTTAATAT ACTGTAGGAT TGT.AATAAAA GTAATGGAAT TGATATCGTA CTTTGGAGTG 5227
GGGGATACTT TGTAAATAGT TCTATCAGAA ACATTAGACT AAGAAAAGTT ACTACCCCCA 5287
CTTGAAAATG AAGATTCAAC TGATTACAAA CAACCTGTTA AATATTATAA GGTTTTAACA 5347
AAATATTAAA CTCTTTATGT TAATACTGTA ATATAAAGAG TTTAATTGTA TTCAAATGAA 5407
GCTTTCCCAC AAAATTAGAC TGATTATCTA ATGAAATAAT CAGTCTAATT TTGTAGAACA 5467
GGTCTGGTAT TATTGTACGT GGTCACTAAA AGATATCTAA TATTATTGGG CAAGGCGTTC 5527
CATGATTGAA TCCTCGAATG TCTTGCCCTT TTCATTTATT TAAGAAGGAT TGTGGAGAAA 5587
TTATGGTTTA GATAATGAAG AAAGACTTCA CTTCTAATTT TTGATGTTAA ATAAATCAAA 5647
ATTTGGCGAT TCACATTGTT TAATCCACTG ATAAAACATA CTGGAGTGTT CTTAAAAAAT 5707
CAGCTTTTTT CTTTATAAAA TTTTGGTTAG CGTACGAAAT TCGTGTTTTG TTGGTGGGAC 5767
CCCATGCCCA TCAACTTAAG AGTAAATTAG TAATGAACTT TCGTTCATCT GGATT.AAAAT 5827
AACCTCAAAT TAGGACATGT TTTTAAAAAT AAGCAGACCA AATAAGCCTA GAATAGGT.AT 5887
CATTTTTAAA AATTATGCTG CTTTCTTTTG TTTTCCAAAT CCATTATACT CATAAGCAAC 5947
ACCCATAATG TCAAAGACTG TTTTTGTCTC ATATCGATAA GCTTGATATC GAATTCCTGC 6007
AGCCCGGGGG ATCCACTAGT TCTAGAGCGG CCGCCACCGC GG 6049
Informace o sekvenci SEQ ID č. 2:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) (B) (D) délka: 462 aminokyselin typ: aminokyselinová topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
143
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 2 :
Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu Gin
1 5 10 15
Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser lle Ser Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Glu Val lle Lys Ala Glu Gin Leu Asn lle Asn Ser Gin
35 40 45
Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val Glu
50 55 60
Asp Phe Lys Glu A.sp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn
85 90 95
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp lle Lys Thr Asn Tyr Lys Glu lle Thr
100 105 110
Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu lle Lys Asd Leu Lys Glu
115 120 125
lle Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser lle lle Thr
130 135 140
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr lle Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
14 5 150 155 160
Glu Gly Asn Thr lle Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin
165 170 175
Phe Leu Asp Arg Asp lle Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
180 185 190
Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val lle Leu Lys Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val lle
210 215 220
Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu lle Asp Asn Gly Tyr Met Val
225 2 30 235 240
His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu
245 250 255
Gin lle Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp lle
260 265 270
Asn Ala Glu Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala
275 280 285
144
Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg
290 295 300
Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu
325 330 335
Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly
340 345 350
Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys
355 360 365
Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr
370 375 380
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Set Arg
385 390 395 400
Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr
405 410 415
Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp
420 425 430
Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Aso Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys
435 440 445
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
450 455 460
Informace o sekvenci SEQ ID č. 3:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 20 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..20 (D) další informace: poznámka = signální
145 peptid pro cílení do vakuoly (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 3:
Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro lle Arg Val Thr Asp Arg 15 10 15
Ala Ala Ser Thr 20
Informace o sekvenci SEQ ID č. 4:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: DNA (genomová)
(iii) hypotetická: není
(iv) anti-sense: není
(vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS (B) lokace: 1..2652 (D) další informace: produkt - protein VIPlA(a) o velikosti 100 kDa, poznámka = = Tato sekvence je identická s části SEQ ID č. 1 mezi nukleotidy 2475 a 5126 včetně.
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 4:
ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr Leu 465 470 475
146
TTA GCT CCT ATG Met TTT TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC 96
Leu Ala 480 Pro Phe Leu Asn Gly Asn 485 Val Asn Ala 490 Val Tyr Ala Asp
AGC AAA ACA AAT CAA ATT TCT ACA ACA CAG AAA AAT CAA CAG AAA GAG 144
Ser Lys Thr Asn Gin Ile Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin Lys Glu
495 500 505 510
ATG GAC CGA AAA GGA TTA CTT GGG TAT TAT TTC AAA GGA AAA GAT TTT 192
Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe
515 520 525
AGT AAT CTT ACT ATG TTT GCA CCG ACA CGT GAT AGT ACT CTT ATT TAT 240
Ser Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu Ile Tyr
530 535 540
GAT CAA CAA ACA GCA AAT AAA CTA TTA GAT AAA AAA CAA CAA CAA TAT 288
Asp Gin Gin Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr
545 550 555
CAG TCT ATT CGT TGG ATT GGT TTG ATT CA.G AGT AAA CAA ACG GGA CAT 336
Gin Ser Ile Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp
560 565 570
TTC ACA TTT AAC TTA TCT GAG GAT GAA CAG GCA ATT ATA GAA ATC AAT 384
Phe Thr Phe Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu Ile .Asn
575 580 585 590
GGG AAA ATT ATT TCT AAT AAA GGG AAA GAA AAG CAA GTT GTC CAT TTA 432
Gly Lys Ile Ile Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val His Leu
595 600 605
GAA AAA GGA AAA TTA GTT CCA ATC AAA ATA GAG TAT CAA TCA GAT ACA 480
Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Thr
610 615 620
AAA TTT AAT ATT GAC AGT AAA ACA TTT AAA GAA CTT AAA TTA TTT AAA 528
Lys Phe Asn Ile Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys
625 630 635
ATA GAT AGT CAA AAC CAA CCC CAG CAA GTC CAG CAA CAT GAA CTG ACA 576
Ile Asp Ser Gin Asn Gin Pro Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu Leu Arg
640 645 650
AAT CCT GAA TTT AAC AAG AAA GAA TCA CAG GAA TTC TTA GCG .AAA CCA 624
Asn Pro Glu Phe .Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Pro
655 660 665 670
TCG AAA ATA AAT CTT TTC ACT CAA AAA ATG AAA AGG CAA ATT CAT CAA 672
Ser Lys Ile Asn Leu Phe Thr Gin Lys Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu
675 680 685
GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT 720
Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn
690
695
700
147
GGG TAT ACG ATT CAA AAT AGA ATC GCT GTA .AAG TGG GAC GAT TCT CTA 768
Gly Tyr Thr 705 Ile Gin Asn Arg Ile 710 Ala Val Lys Trp Asp Asp 715 Ser Leu
GCA AGT AAA GGG TAT ACG .AAA TTT GTT TCA AAT CCA CTA G.AA AGT CAC 816
Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His
720 725 730
ACA GTT GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT GAA . AAG GCA GCA AGA GAT CTA 864
T.nr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp ' Leu
735 740 745 750
GAT TTG TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTT AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT 912
Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe
755 760 765
CCA AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA 960
Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu
770 775 780
AAT TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT 1008
Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr
785 790 795
ACA AAT ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA GCG GGG ATT GGA CCA AAA GGT 1056
Thr Asn Thr Glu Gly AJLa Ser Val Glu Ala Gly Ile Gly Pro Lys Gly
800 805 810
ATT TCG TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT CAA CAC TCT GAA ACA GTT GCA 1104
Ile Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ala
815 820 825 830
CAA GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT ACT TCG CAA TTC AAT ACG GCT 1152
Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala
835 840 845
TCA GCG GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT CGA TAT AAC AAT GTA GGA ACT 1200
Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr
850 855 860
GGT GCC ATC TAC GAT GTA AAA CCT ACA ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC 1248
Gly A2_a Ile Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn
865 870 875
GA.T ACT ATC GCA ACT ATT ACG GCG AAA TCT AAT TCT ACA GCC TTA AAT 1296
Aso Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn
880 885 890
ATA TCT CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA AAA GGA CAA AAT GGA ATC GCA 1344
Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala
895 900 905 910
ATA ACA TCA ATG GAT GAT TTT AAT TCC CAT CCG ATT ACA TTA AAT AAA 1392
Ile Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys
915 920 925
148
AAA CAA GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA 1440
lys Gin Val Asp 930 Asn Leu Leu Asn Asn 935 Lys Pro Met Met Leu 940 Glu Thr
AAG CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAG ATA AAA GAT ACA CAT GGA AAT ATA 1488
Asn Gin Thr 945 Asp Gly Val Tyr Lys 950 lle Lys Asp Thr His 955 Gly Asn lle
GTA ACT GGC GGA GAA TGG AAT GGT GTC ATA CAA CAA ATC AAG GCT AAA 1536
Val Thr 960 Gly Gly Glu Trp Asn 965 Gly Val lle Gin Gin 970 lle Lys Ala Lys
ACA GCG TCT ATT ATT GTG GAT GAT GGG GAA CGT GTA GCA GAA AAA CGT 1584
Thr Ala 975 Ser lle lle Val 980 Asp Asp Gly Glu Arg 985 Val Ala Glu Lys Arg 990
GTA GCG GCA .AAA GAT TAT GAA AAT CCA GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA 1632
Val Ala Ala Lys Asp Tyr 995 Glu Asn Pro Glu Asp 1000 Lys Thr Pro Ser Leu 1005
ACT TTA .AAA GAT GCC CTG AAG CTT TCA TAT CGA GAT GAA ATA AAA GAA 1680
Thr Leu Lys Asp Ala Leu 1010 Lys Leu Ser Tyr 1015 Pro Asp Glu lle Lys 1020 Glu
ATA GAG GGA TTA TTA TAT TAT AAA AAC AAA CCG ATA TAC GAA TCG AGC 1728
lle Glu Gly Leu 1025 Leu Tyr Tyr Lys Asn 1030 Lys Pro lle Tyr Glu 1035 Ser Ser
GTT ATG ACT TAC TTA GAT GAA AAT ACA GCA AAA GAA GTG ACC AAA GAA 1776
Val Met Thr 1040 Tyr Leu Asp Glu Asn 1045 Thr Ala Lys Glu Val 1050 Thr Lys Gin
TTA AAT GAT ACC ACT GGG AAA TTT AAA GAT GTA AGT CAT TTA TAT GAT 1824
Leu Asn 1055 Asp Thr Thr Gly Lys 1060 Pne Lys Asp Val Ser 1065 His Leu Tyr Asd 1070
GTA AAA CTG ACT CCA AAA ATG AAT GTT AGA ATC AAA TTG TCT ATA. CTT 1872
Val Lys Leu Thr Pro Lys 1075 Met Asn Val Thr lle 1080 Lys Leu Ser lle Leu 1085
TAT GAT AAT GCT GAG TCT AAT GAT AAC TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC 1920
Tyr Asp Asn Ala 109C Glu Ser ) Asn Asp Asn 1095 Ser lle Gly Lys Trp noc Thr ) Asn
ACA AAT ATT GTT TCA GGT GGA AAT AAC GGA AAA AAA CAA TAT TCT TCT 1968
Thr Asn lle 1105 Val I Ser Gly Gly Asn nic Asn 1 Gly Lys Lys Gin 1115 Tyr I Ser Ser
AAT AAT CCG GAT GCT .AAT TTG ACA TTA AAT AGA GAT GCT CAA GAA, AAA 2016
Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys
1120 1125 1130
149
TTA AAT ΑΛΑ AAT CGT GAC TAT Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr TAT ATA AGT TTA TAT ATG AAG TCA G~A 2064
Tyr lle Ser Leu Tyr 1145 Met Lys Ser Glu 1150
1135 1140
AAA AAC ACA CAA TGT GAG ATT ACT ATA GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC 2112
Lys Asn Thr Gin Cys Glu lle Thr lle Asp Gly Glu lle Tyr Pro lle
1155 1160 1165
ACT ACA ΑΛΑ ACA GTG AAT GTG AAT A*\A GAC AAT TAC AAA AGA TTA GAT 2160
Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp
1170 1175 1180
ATT ATA GCT CAT AAT ATA AAA AGT AAT CCA ATT TCT TCA CTT CAT ATT 2208
lle lle Ala His Asn lle Lys Ser Asn Pro lle Ser Ser Leu His lle
1185 1190 1195
AAA ACG A4T GAT GAA ATA ACT TTA TTT TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA 2256
Lys Thr Asn Asp Glu lle Thr Leu Phe Trp Asp Asp lle Ser lle Thr
1200 1205 1210
GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA 2304
Asp Val 1215 Ala Ser lle Lys Pro 1220 Glu Asn Leu Thr Asp 1225 Ser Glu lle Lys 1230
CAG ATT TAT AGT AGG TAT GGT ATT AAG TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT 2352
Gin lle Tyr Ser Arg Tyr Gly 1235 lle Lys Leu Glu Asp 1240 Gly lle Leu lle 1245
GAT AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT 2400
.Asp Lys Lys Gly Gly lle His 1250 Tyr Gly Glu 1255 Phe lle Asn Glu Ala 1260 Ser
TTT .AAT ATT GAA CCA TTG CAA AAT TAT GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT 2448
Phe Asn lle Glu 1265 Pro Leu Gin Asn Tyr 1270 Val Thr Lys Tyr Glu Val 1275 Thr
TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT 2496
Tyr Ser Ser Glu 1280 Leu Gly Pro Asn 1285 Val Ser Asp Thr Leu 1290 Glu Set Asp
AAA ATT TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT 2544
Lys lle 1295 Tyr Lys Asp Gly Thr 1300 lle Lys Phe Asp Phe 1305 Thr Lys Tyr Ser 1310
AAA AAT GAA CAA GGA TTA TTT TAT GAC AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT 2592
Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe 1315 Tyr Asp Ser 1320 Gly Leu 1 Asn Trp Asp 1325 Phe 1
A.AA ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT 2640
Lys lle Asn Ala 1330 lle Thr Tyr Asp Gly 1335 Lys Glu Met Asn Val Phe 1340 His
AGA TAT AAT AAA TAG Arg Tyr Asn Lys
1345
2655
150
Informace o sekvenci SEQ ID č. 5:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 884 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 5:
Met 1 Lys tón Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys Thr 15 Leu
5 10
Leu Ada Pro Met Phe Leu Asn Gly tón Val Asn Ala Val Tyr Ala Asp
20 25 30
Ser Lys Thr A.sn Gin Ile Ser Thr Thr Gin Lys Arsn Gin Gin Lys Glu
35 40 45
Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe
50 55 60
Ser Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asp Gin Gin Thr Ala Asn Lys Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr
85 90 95
Gin Ser Ile Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp
100 105 110
Phe Thr Phe Asn Leu Ser Glu Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu Ile Asn
115 120 125
Gly Lys Ile Ile Ser tón Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val His Leu
130 135 140
Glu Lys Gly Lys Leu Val Pro Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser Asp Thr
145 150 155 160
Lys Phe Asn Ile Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys
165 170 175
Ile Asp Ser Gin Asn Gin Pro Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu Leu Arg
180 185 190
Asn Pro Glu Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu .Ala Lys Pro
195 200 205
Ser Lys Ile Asn Leu Phe Thr Gin Lys Met Lys Arg Glu Ile Asp Glu
210 215 220
151
Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn
225 230 235 240
Gly Tyr Thr Ile Gin Asn Arg Ile Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu
245 250 255
Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His
260 265 270
Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu
275 280 285
Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe
290 295 300
Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu
305 310 315 320
Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr
325 330 335
Thr .Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly Ile Gly Pro Lys Gly
340 345 350
Ile Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ala
355 360 365
Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala
370 375 380
Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr
385 390 395 400
Gly Ala Ile Tyr A.sp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn
405 410 415
Asp Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn
420 425 430
Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly Gin Asn Gly Ile Ala
435 440 445
Ile Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys
450 455 460
Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr
465 470 475 480
Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile Lys Asp Thr His Gly Asn Ile
485 4 90 495
Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val Ile Gin Gin Ile Lys Ala Lys
500 505 510
Thr Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly Glu Arg Val Ala Glu Lys Arg 515 520 525
152
Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu
530 535 540
Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu lle Lys Glu
54 5 550 555 560
lle Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser
565 570 575
Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu val Thr Lys Gin
580 585 590
Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val Ser His Leu Tyr Asp
595 600 605
Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr lle Lys Leu Ser lle Leu
610 615 620
Tyr Asp Asn Ala Glu Ser Asn Asp Asn Ser lle Gly Lys Trp Thr Asn
625 630 635 640
Thr Asn lle Val Ser Gly Gly Asn A.sn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser
645 650 655
Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys
660 665 670
Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr lle Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu
675 680 685
Lys Asn Thr Gin Cys Glu lle Thr lle A.sp Gly Glu lle Tyr Pro lle
690 695 700
Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp
705 710 715 720
lle lle Ala His Asn lle Lys Ser Asn Pro lle Ser Ser Leu His lle
725 730 735
Lys Thr Asn Asp Glu lle Thr Leu Phe Trp Asp Asp lle Ser lle Thr
740 745 750
Asp Val Ala Ser lle Lys Pro Glu Asn Leu Thr Asp Ser Glu lle Lys
755 760 765
Gin lle Tyr Ser Arg Tyr Gly lle Lys Leu Glu Asp Gly lle Leu lle
770 775 780
Asp Lys Lys Gly Gly lle His Tyr Gly Glu Phe lle Asn Glu Ala Ser
785 790 795 800
Phe Asn lle Glu Pro Leu Gin Asn Tyr Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr
805 810 815
Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp 820 825 830
153
Lys Lys Ile Tyr 835 Asn Glu 850 Lys Asp Gly Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Trp Tyr Asp Ser Phe
Gin Gly Leu Phe 855 840 Gly Leu 860 84 5 Asn
Tyr Asp Ser
Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His
865 870 875 880
Arg Tyr Asn Lys
Informace o sekvenci SEQ ID č. 6:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2004 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: DNA (genomová)
(lil) hypotetická: není
(iv) anti-sense: není
(vi) původní zdroj: (A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21
(ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: CDS
(B) lokace: 1 . .2001
(D) další informace: produkt = protein
VIPlA(a) o velikosti 80 kDa, poznámka
= Tato sekvence je identická se sekvenc
SEQ ID č. 1 mezi nukleotidy 3126 a 5126 včetně.
154 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 6:
ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA GAC ACG GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT 48
Met 885 Lys Arg Glu lle Asp 890 Glu Asp Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle
895 900
CCT GAC CTT TGG GAA GAA AAT GGG TAT ACG ATT CAA AAT AGA ATC GCT 96
Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr lle Gin Asn Arg lle Ala
905 910 915
GTA AAG TGG GAC GAT TCT CTA GCA AGT AAA GGG TAT ACG AAA TTT GTT 144
Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val
920 925 930
TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC ACA GTT GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT 192
Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr
935 940 945
GAA AAG GCA GCA AGA GAT CTA GAT TTG TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTT 240
Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe
950 955 960
AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT CCA AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA. AAG 288
Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys
965 970 975 980
GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA AAT TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT GAT 336
Val lle Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His
985 990 995
TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT ACA AAT ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA 384
Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu
1000 1005 1010
GCG GGG ATT GGA CCA AAA GGT ATT TCG TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT 432
Ala Gly lle Gly Pro Lys Gly lle Ser Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr
1015 1020 1025
CAA CAC TCT GAA AGA GTT GCA CAA GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT 480
Gin His Ser Glu Thr Val Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly .Asn
1030 1035 1040
ACT TCG CAA TTC AAT ACG GCT TCA GCG GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT 528
Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala A.sn Val
1045 1050 1055 1060
CGA TAT AAC AAT GTA GGA ACT GGT GCC ATC TAC GAT GTA AAA CCT ACA 576
Arg Tyr Asn Asn Val 1065 Gly Thr Gly Ala lle 107C Tyr 1 A^p Val Lys Pro Thr 1075
ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC GAT ACT ATC GGA ACT ATT ACG GCG .AAA
Thr Ser Phe Val 1080 Leu Asn Asn Asp Thr 1085 lle AGa Thr lle Thr 1090 Ala Lys 1
155
TCT AAT Ser Asn TCT ACA GCC TTA AAT ATA TCT CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA Ser Thr Ala Leu Asn Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys 672
1095 1100 1105
AAA GGA CAA AAT GGA ATC GCA ATA ACA TCA ATG GAT GAT TTT AAT TCC 720
Lys Gly Gin Asn 1110 Gly Ile Ala Ile Thr Ser 1115 Met Asp Asp Phe Asn Ser 1120
CAT CCG ATT ACA TTA AAT AAA AAA CAA GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT 768
His Pro 1125 Ile Thr Leu Asn Lys Lys Gin Val 1130 Asp Asn Leu Leu Asn Asn 1135 1140
AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA AAC CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAG ATA 816
Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile 1145 1150 * 1155
AAA GAT ACA CAT GGA AAT ATA GTA ACT GGC GGA G.AA TGG AAT GGT GTC 864
Lys Asp Thr His Gly Asn Ile Val Thr Gly 1160 1165 Gly Glu Trp Asn Gly Val 1170
ATA CAA CAA ATC AAG GCT AAA ACA GCG TCT ATT ATT GTG GAT GAT GGG 912
Ile Gin Gin Ile 1175 Lys Ala Lys Thr Ala Ser 1180 Ile Ile Val Asp Aso Gly 1185
GAA CGT GTA GCA GAA AAA CGT GTA GCG GCA AAA GAT TAT GAA AAT CCA 960
Glu Arg Val Ala 1190 Glu Lys Arg Val Ala Ala 1195 Lys Asp Tyr Glu Asn Pro 1200
GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA ACT TTA AAA GAT GCC CTG AAG CTT TCA 1008
Glu Asp 1205 Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys 1210 Asp Ala Leu Lys Leu Ser 1215 1220
TAT CCA GAT GAA ATA AAA GAA ATA GAG GGA TTA TTA TAT TAT AAA AAC 1056
Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu Ile Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn 1225 1230 1235
AAA CCG ATA TAC GAA TCG AGC GTT ATG ACT TAC TTA GAT GAA AAT ACA 1104
Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr 1240 1245 Tyr Leu Asp Glu Asn Thr 1250
GCA AAA GAA GTG ACC AAA CAA TTA AAT GAT ACC ACT GGG AAA TTT AAA 1152
Ala Lys Glu Val 1255 Thr Lys Gin Leu Asn Asp 1260 Thr Thr Gly Lys Phe Lys 1265
GAT GTA AGT CAT TTA TAT GAT GTA AAA CTG ACT CCA AAA ATG AAT GTT 1200
Asp Val 127C Ser His ) Leu Tyr Asp Val Lys Leu 1275 Thr Pro Lys Met Asn Val 1280
ACA ATC AAA TTG TCT ATA CTT TAT GAT AAT GCT GAG TCT AAT GAT AAC 1248
Thr Ile 1285 Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp Asn 1290 Ala Glu Ser Asn Asp Asn 1295 * 1300
TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC ACA AAT ATT GTT TCA GGT GGA AAT AAC 1296
Ser Ile Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn Ile 1305 1310 Val Ser Gly Gly Asn Asn 1315
156
GGA AAA AAA Gly Lys Lys CAA TAT Gin Tyr 1320 TCT TCT AAT AAT CCG GAT GCT AAT TTG ACA TTA Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu 1344
1325 1330
AAT ACA GAT GCT CAA GAA AAA TTA AAT AAA AAT CGT GAC TAT TAT ATA 1392
Asn Thr Asp Ala Gin 1335 Glu Lys Leu Asn Lys Asn 1340 Arg Asp Tyr Tyr Ile 1345
AGT TTA TAT ATG AAG TCA GAA AAA AAC ACA CAA TGT GAG ATT ACT ATA 1440
Ser Leu Tyr 1350 Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gin 1355 Cys Glu Ile Thr Ile 1360
GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC ACT ACA AAA ACA GTG AAT GTG AAT AAA 1488
Asp Gly Glu 1365 Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys 1370 1375 1380
GAC AAT TAC AAA AGA TTA GAT ATT ATA GCT CAT AAT ATA AAA AGT AAT 1536
Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp Ile Ile Ala His 1385 1390 Asn Ile Lys Ser Asn 1395
CCA ATT TCT TCA CTT CAT ATT AAA ACG AAT GAT GA« ΛΤΑ ACT TTA TTT 1584
Pro Ile Ser Ser Leu 1400 His Ile Lys Thr Asn Asp 1405 Glu Ile Thr Leu Phe 1410
TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA GAT GTA GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT 1632
Trp Asp Asp Ile Ser 1415 Ile Thr Asp Val Ala Ser 1420 Ile Lys Pro Glu Asn 1425
TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA CAG ATT TAT AGT AGG' TAT GGT ATT AAG 1680
Leu Thr Asp 1430 Ser Glu Ile Lys Gin Ile Tyr Ser 1435 Arg Tyr Gly Ile Lys 1440
TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT GAT AAA AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT 1728
Leu Glu Asp 1445 Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly 1450 1455 1460
GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT TTT AAT ATT GAA CCA TTG CCA AAT TAT 1776
Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu 1465 1470 Pro Leu Pro Asn Tyr 1475
GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT TAT AGT AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG 1824
Val Thr Lys Tyr Glu 1480 Val Thr Tyr Ser Ser Glu 1485 Leu Gly Pro Asn Val 1490
AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT AAA ATT TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA 1872
Ser Asp Thr 1495 Leu Glu i Ser Asp Lys Ile Tyr Lys 1500 Asp Gly Thr Ile Lys 1505
TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT AAA AAT GAA CAA GGA TTA TTT TAT GAC 1920
Phe .Asp Phe 1510 Thr Lys Tyr Ser Lys Asn Glu Gin 1515 Gly Leu Phe Tyr Asp 1520
AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT AAA ATT AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT 1968
Ser Gly Leu 1525 Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala 1530 1535 Ile Thr Tyr Asp Gly 1540
157
AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT AGA TAT AAT AAA TAG Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys
1545 1550
2004
Informace o sekvenci SEQ ID č. 7:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 667 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 7:
Mec 1 Lys Arg Glu Ile 5 Asp Glu Asp Thr Asp 10 Thr Asp Gly Asp Ser 15 Ile
Pro Asp Leu Trp 20 Glu Glu Asn Gly Tyr 25 Thr Ile Gin Asn Arg 30 Ile Ala
Val Lys Trp 35 Asp Asp Ser Leu Ala 40 Ser Lys Gly Tyr Thr 45 Lys Phe Val
Ser Asn 50 Pro Leu Glu Ser His 55 Thr Val Gly Asp Pro 60 Tyr Thr Asp Tyr
Glu 65 Lys Ala Ala Arg Asp 70 Leu Asp Leu Ser Asn 75 Ala Lys Glu Thr Phe 80
Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys
90 95
Val Ile Leu Ser 100 Pro Asn Glu Asn Leu 105 Ser Asn Ser Val Glu 110 Ser His
Ser Ser Thr 115 A.sn Trp Ser Tyr Thr 120 Asn Thr Glu Gly Ala 125 Ser Val Glu
Ala Gly 130 Ile Gly Pro Lys Gly 135 Ile Ser Phe Gly Val 140 Ser Val Asn Tyr
Gin 145 His Ser Glu Thr Val 150 Ala Gin Glu Trp Gly 155 Thr Ser Thr Gly Asn 160
Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val 165 170 175
158
Are Tyr Asn .Asn Val 180 Gly Thr Gly Ala 185 lle Tyr Asp Val Lys 190 Pro Thr
Thr Ser Phe Val Leu A.sn Asn Asp Thr lle Ala Thr lle Thr Ala Lys
195 200 205
Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn lle Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys
210 215 220
Lys Gly Gin Asn Gly lle A2La lle Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser
225 230 235 240
His Pro lle Thr Leu Asn Lys Lys Gin Val Asp Asn Leu Leu Asn Asn
245 250 255
Lys Pro Met Met Leu Glu Thr Asn Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys lle
260 265 270
Lys Asp Thr His Gly Asn lle Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val
275 280 285
lle Gin Gin lle Lys Ala Lys Thr Ala Ser lle lle Val Asp Asp Gly
290 295 300
Glu ~rg Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala Lys Asp Tyr Glu Asn Pro
305 310 315 320
Glu Asp Lys Thr Pro Ser Leu Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser
325 330 335
Tyr Pro Asp Glu lle Lys Glu lle Glu Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn
340 345 350
Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr
355 360 365
Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys
370 375 380
Asp Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val
385 390 395 400
Thr lle Lys Leu Ser lle Leu Tyr Asp Asn AGa Glu Ser Asn Asp Asn
405 410 415
Ser lle Gly Lys Trp Thr Asn Thr Asn lle Val Ser Gly Gly Asn Asn
420 425 430
Gly Lys Lys Gin Tyr Ser Ser Asn Asn Pro A.sp Ala Asn Leu Thr Leu
435 440 445
Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr lle
450 455 460
Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gin Cys Glu lle Thr. lle
465 470 475 480
159
ASp Gly Glu Ile Tyr Pro 485 Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys
4 90 4 95
Asp A.sn Tyr Lys Arg Leu Asp Ile Ile Ala His Asn Ile Lys Ser Asn
500 505 510
Pro Ile Ser Ser Leu His Ile Lys Thr Asn Asp Glu Ile Thr Leu Phe
515 520 525
Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Val Ala Ser Ile Lys Pro Glu A.sn
530 535 540
Leu Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys
545 550 555 560
Leu Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His Tyr Gly
565 570 575
Glu Phe Ile Asn Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu Pro Leu Pro Asn Tyr
580 585 590
Val Thr Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser Glu Leu Gly Pro Asn Val
595 600 605
Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr Ile Lys
610 615 620
Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys A.sn Glu Gin Gly Leu Phe Tyr Asp
625 630 635 640
Ser Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly
64 5 650 655
Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys
660 665
Informace o sekvenci SEQ 1 ID č . 8 :
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 16 aminokyselin
(B) typ >: aminokyselinová
(C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ií) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není
160 (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus cereus (B) kmen: AB78 (C) konkrétní izolát: NRRL B-21058 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..16 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence proteinu purifikovaného z kmene AB78 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 8:
Lys Arg Glu lle Asp Glu Asp Thr Asp Thr Asx Gly A.sp Ser lle Pro 1 5 10 * 15
Informace o sekvenci SEQ ID č. 9:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 21 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: DNA (genomová)
(iii) hypotetická: není
(iv) anti-sense: není
(ix) vlastnosti: (A) jméno / klíč : různá vl
(B) lokace: 1..21 (D) další informace: poznámka = oligonukleoti dová sonda na bázi aminokyselin 3 až 9 v SEQ ID č. 8, s využitím znalosti použití kodónů Bacillus thuringiensis
161 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 9:
GAAATTGATC AAGATACNGA T 21
Informace o sekvenci SEQ ID č. 10:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis (B) kmen: AB88 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..14 (D) další informace: poznámka = N-koncová aminokyselinová sekvence proteinu známého jako anexová frakce 23 (menší) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 10:
Xaa Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa Xaa Xaa Gin Xaa Xaa Xaa 1 5 10
Informace o sekvenci SEQ ID č. 11:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 13 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová
162 (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 11:
Xaa Glu Tyr Glu Asn Val Glu Pro Phe Val Ser Ala Xaa 1 5 10
Informace o sekvenci SEQ ID č. 12:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 14 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 12:
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Pro Thr Arg Ala Leu Pro 15 10
Informace o sekvenci SEQ ID č. 13:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 15 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis
163 (B) kmen: ΑΒ88 (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..15 (D) další informace: poznámka = N-koncová ami nokyselinová sekvence VIP o velikosti 35 kDa účinného proti Agrotis ipsilon (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 13:
Ada Leu Ser Glu A.sn Thr Gly Lys A.sp Gly Gly Tyr Ile Val Pro 15 10 15
Informace o sekvenci SEQ ID č. 14:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: N-koncová (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 14:
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu 1 5
Informace o sekvenci SEQ ID č. 15:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 9 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není
164 (v) typ fragmentu: N-koncový (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..9 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence δ-endotoxinu o velikosti 80 kDa (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 15:
Met Asp Asn Asn Pro Asn Ile Asn Glu
5
Informace o sekvenci SEQ ID č. 16:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 11 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (v) typ fragmentu: N-koncový (vi) původní zdroj:
(A) organismus: Bacillus thuringiensis (ix) vlastnosti:
(A) jméno / klíč: peptid (B) lokace: 1..11 (D) další informace: poznámka = N-koncová sek vence δ-endotoxinu o velikosti 60 kDa (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 16:
Met Asn Val Leu Asn Ser Gly Arg Thr Thr Ile 15 10
165
Informace o sekvenci
SEQ ID č.
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..2652 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 100 kDa z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 17:
ATGAAGAACA TGAAGAAGAA GCTGGCCAGC GTGGTGACCT GCACCCTGCT GGCCCCCATG 60
TTCCTGAACG GCAACGTGAA CGCCGTGTAC GCCGACAGCA AGACCAACCA GATCAGCACC 120
ACCCAGAAGA ACCAGCAGAA GGAGATGGAC CGCAAGGGCC TGCTGGGCTA CTACTTCAAG 180
GGCAAGGACT TCAGCAACCT GACCATGTTC GCCCCCACGC GTGACAGCAC CCTGATCTAC 240
GACCAGCAGA CCGCCAACAA GCTGCTGGAC AAGAAGCAGC AGGAGTACCA GAGCATCCGC 300
TGGATCGGCC TGATCCAGAG CAAGGAGACC GGCGACTTCA CCTTCAACCT GAGCGAGGAC 360
GAGCAGGCCA TCATCGAGAT CAACGGCAAG ATCATCAGCA ACAAGGGCAA GGAGAAGCAG 420
GTGGTGCACC TGGAGAAGGG CAAGCTGGTG CCCATCAAGA TCGAGTACCA GAGCGACACC 480
AAGTTCAACA TCGACAGCAA GACCTTCAAG GAGCTGAAGC TTTTCAAGAT CGACAGCCAG 540
AACCAGCCCC AGCAGGTGCA GCAGGACGAG CTGCGCAACC CCGAGTTCAA CAAGAAGGAG 600
AGCCAGGAGT TCCTGGCCAA GCCCAGCAAG ATCAACCTGT TCACCCAGCA GATGAAGCGC 660
GAGATCGACG AGGACACCGA CACCGACGGC GACAGCATCC CCGACCTGTG GGAGGAGAAC 720
166
GGCTACACCA TCCAGAACCG CATCGCCGTG AAGTGGGACG ACAGCCTGGC TAGCAAGGGC 780
TACACCAAGT TCGTGAGCAA CCCCCTGGAG AGCCACACCG TGGGCGACCC CTACACCGAC 840
TACGAGAAGG CCGCCCGCGA CCTGGACCTG AGCAACGCCA AGGAGACCTT CAACCCCCTG 900
GTGGCCGCCT TCCCCAGCGT GAACGTGAGC ATGGAGAAGG TGATCCTGAG CCCCAACGAG 960
AACCTGAGCA ACAGCGTGGA GAGCGACTCG AGCACCAACT GGAGCTACAC CAACACCGAG 1020
G<<.GCCAu^,G TGGAGGCCGG CATCGGTCCC AAGGGCATCA GCTTCGGCGT GAGCGTGAAC 1080
TACCAGCACA GCGAGACCGT GGCCCAGGAG TGGGGCACCA GCACCGGCAA CACCAGCCAG 1140
TTCAACACCG CCAGCGCCGG CTACCTGAAC GCCAACGTGC GCTACAACAA CGTGGGCACC 1200
GGCGCCATCT ACGACGTGAA GCCCACCACC AGCTTCGTGC TGAACAACGA CACCATCGCC 1260
ACCATCACCG CCAAGTCGAA TTCCACCGCC CTGAACATCA GCCCCGGCGA GAGCTACCCC 1320
AAGAAGGGCC AGAACGGCAT CGCCATCACC AGCATGGACG ACTTCAACAG CCACCCCATC 1380
ACCCTGAACA AGAAGCAGGT GGACAACCTG CTGAACAACA AGCCCATGAT GCTGGAGACC 1440
AACCAGACCG ACGGCGTCTA CAAGATCAAG GACACCCACG GCAACATCGT GACCGGCGGC 1500
GAGTGGAACG GCGTGATCCA GCAGATCAAG GCCAAGACCG CCAGCATCAT CGTCGACGAC 1560
GGCGAGCGCG TGGCCGAGAA GCGCGTGGCC GCCAAGGACT ACGAGAACCC CGAGGACAAG 1620
ACCCCCAGCC TGACCCTGAA GGACGCCCTG AAGCTGAGCT ACCCCGACGA GATCAAGGAG 1680
ATCGAGGGCC TGCTGTACTA CAAGAACAAG CCCATCTACG AGAGCAGCGT GATGACCTAT 1740
CTAGACGAGA ACACCGCCAA GGAGGTGACC AAGCAGCTGA ACGACACCAC CGGCAAGTTC 1800
λ τ.Γ'ί— λ η i 'jr. GCCACCTGTA CGACGTGAAG CTGACCCCCA AGATGAACGT GACCATCAAG 1860
CTGAGCATCC TGTACGACAA CGCCGAGAGC AACGACAACA GCATCGGCAA GTGGACCAAC 1920
ACCAACATCG TGAGCGGCGG CAACAACGGC AAGAAGCAGT ACAGCAGCAA CAACCCCGAC 1980
GCCAACCTGA CCCTGAACAC CGACGCCCAG GAGAAGCTGA ACAAGAACCG CGACTACTAC 2040
ATCAGCCTGT ACATGAAGAG CGAGAAGAAC ACCCAGTGCG AGATCACCAT CGACGGCGAG 2100
ATATACCCCA TCACCACCAA GACCGTGAAC GTGAACAAGG ACAACTACAA GCGCCTGGAC 2160
ATCATCGCCC ACAACATCAA GAGCAACCCC ATCAGCAGCC TGCACATCAA GACCAACGAC 2220
GAGATCACCC TGTTCTGGGA CGACATATCG ATTACCGACG TCGCCAGCAT CAAGCCCGAG 2280
AACCTGACCG ACAGCGAGAT CAAGCAGATA TACAGTCGCT ACGGCATCAA GCTGGAGGAC 2340
GGCATCCTGA TCGACAAGAA GGGCGGCATC CACTACGGCG AGTTCATCAA CGAGGCCAGC 2400
167
TTCAACATCG AGCCCCTGCA GAACTACGTG ACCAAGTACG AGGTGACCTA CAGCAGCGAG 2460
CTGGGCCCCA ACGTGAGCGA CACCCTGGAG AGCGACAAGA TTTACAAGGA CGGCACCATC 2520
AAGTTCGACT TCACCAAGTA CAGCAAGAAC GAGCAGGGCC TGTTCTACGA CAGCGGCCTG 2580
AACTGGGACT TCAAGATCAA CGCCATCACC TACGACGGCA AGGAGATGAA CGTGTTCCAC 2640
CGCTACAACA AGTAG 2655
Informace o sekvenci SEQ ID č . 18:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2004 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (iv) anti-sense: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..2004 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIPlA(a) o velikosti 80 kDa z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 18:
ATGAAGCGCG AGATCGACGA GGACACCGAC ACCG.AoGGCG ACAGCATCCC CGACCTGTGG 60
GAGGAGAACG GCTACACCAT CCAGAACCGC ATCGCCGTGA AGTGGGACGA CAGCCTGGCT 120
AGCAAGGGCT ACACC.AAGTT CGTGAGCAAC CCCCTGGAGA GCCACACCGT GGGCGACCCC 180
TACACCGACT ACGAGAAGGC CGCCCGCGAC CTGGACCTGA GCAACGCCAA GGAGACCTTC 240
AACCCCCTGG TGGCCGCCTT CCCCAGCGTG AACGTGAGCA TGGAGAAGGT GATCCTGAGC 300
CCCAACGAGA ACCTGAGCAA CAGCGTGGAG AGCCACTCGA GCACCAACTG GAGCTACACC 360
AACACCGAGG GCGCCAGCGT GGAGGCCGGC ATCGGTCCCA AGGGCATCAG CTTCGGCGTG 420
AGCGTGAACT ACCAGCACAG CGAGACCGTG GCCCAGGAGT GGGGCACCAG CACCGGCAAC 480
ACCAGCCAGT TCAACACCGC CAGCGCCGGC TACCTGAACG CCAACGTGCG CTACAACAAC 540
168
GTGGGCACCG GCGCCATCTA CGACGTGAAG CCCACCACCA GCTTCGTGCT GAACAACGAC 600
ACCATCGCCA CCATCACCGC CAAGTCGAAT TCCACCGCCC TGAACATCAG CCCCGGCGAG 660
AGCTACCCCA AGAAGGGCCA GAACGGCATC GCCATCACCA GCATGGACGA CTTCAACAGC 720
CACCCCATCA CCCTGAACAA GAAGCAGGTG GACAACCTGC TGAACAACAA GCCCATGATG 780
CTGGAGACCA ACCAGACCGA CGGCGTCTAC AAGATCAAGG ACACCCACGG CAACATCGTG 840
ACCGGCGGCG AGTGGAACGG CGTGATCCAG CAGATCAAGG CCAAGACCGC CAGCATCATC 900
GTCGACGACG GCGAGCGCGT GGCCGAGAAG CGCGTGGCCG CCAAGGACTA CGAGAACCCC 960
GAGGACAAGA CCCCCAGCCT GACCCTGAAG GACGCCCTGA AGCTGAGCTA CCCCGACGAG 1020
ATCAAGGAGA TCGAGGGCCT GCTGTACTAC AAGAACAAGC CCATCTACGA GAGCAGCGTG 1080
ATGACCTATC TAGACGAGAA CACCGCCAAG GAGGTGACCA AGCAGCTGAA CGACACCACC 1140
GGCAAGTTCA AGGACGTGAG CCACCTGTAC GACGTGAAGC TGACCCCCAA GATGAACGTG 1200
ACCATCA4GC TGAGCATCCT GTACGACAAC GCCGAGAGCA ACGACAACAG CATCGGCAAG 1260
TGGACCA^CA CCAACATCGT GAGCGGCGGC AACAACGGCA AGAAGCAGTA CAGCAGCAAC 1320
AACCCCGACG CCAACCTGAC CCTGAACACC GACGCCCAGG AGAAGCTGAA CAAGAACCGC 1380
GACTACTACA TCAGCCTGTA CATGAAGAGC GAGAAGAACA CCCAGTGCGA GATCACCATC 1440
GACGGCGAGA TATACCCCAT CACCACCAAG ACCGTGAACG TGAACAAGGA CAACTACAAG 1500
CGCCTGGACA TCATCGCCCA CAACATCAAG AGCAACCCCA TCAGCAGCCT GCACATCAAG 1560
ACCAACGACG AGATCACCCT GTTCTGGGAC GACATATCGA TTACCGACGT CGCCAGCATC 1620
AAGCCCGAGA ACCTGACCGA CAGCGAGATC AAGCAGATAT ACAGTCGCTA CGGCATCAAG 1680
CTGGAGGACG GCATCCTGAT CGACAAGAAG GGCGGCATCC ACTACGGCGA GTTCATCAAC 1740
GAGGCCAGCT TCAACATCGA GCCCCTGCAG AACTACGTGA CCAAGTACGA GGTGACCTAC 1800
AGCAGCGAGC TGGGCCCCAA CGTGAGCGAC ACCCTGGAGA GCGACAAGAT TTACAAGGAC 1860
GGCACCATCA AGTTCGACTT CACCAAGTAC AGCAAGAACG AGCAGGGCCT GTTCTACGAC 1920
AGCGGCCTGA ACTGGGACTT CAAGATCAAC GCCATCACCT ACGACGGCAA GGAGATGAAC 1980
GTGTTCCACC GCTACAACAA GTAG 2004
Informace o sekvenci SEQ ID č. 19:
(i) charakteristiky sekvence:
169 (A) délka: 4074 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace :1..1386 (D) další informace: produkt = VIP2A(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1394..3895 (D) další informace: produkt = VIPlA(b) z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..4074 (D) další informace: poznámka = klonovaná
DNA-sekvence z Bacillus thuringiensis var. tenebrionis, která obsahuje gen jak pro VIPlA(b) takVIP2A(b) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 19:
ATG Met CAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT GTG GTG TCA AAA ACA TTA CAA Gin
Gin Arg Met 670 Glu Gly Lys Leu 675 Phe Val Val Ser Lys 680 Thr Leu
GTA GTT ACT AGA ACT GTA TTG CTT AGT ACA GTT TAC TCT ATA ACT TTA
Val Val Thr Arg Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Tyr Ser Ile Thr Leu
685 690 695
TTA AAT AAT GTA GTG ATA AAA GCT GAC CAA TTA AAT ATA AAT TCT C.AA
Leu Asn Asn Val Val Ile Lys Ala Asp Gin Leu Asn Ile Asn Ser Gin
700 705 710 715
AGT AAA TAT ACT AAC TTG CAA AAT CTA AAA ATC CCT GAT AAT GCA GAG
Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys Ile Pro Asp Asn Ala Glu
170
720 725 730
-GAT TTT AAA GAA GAT AAG GGG AAA GCG AAA GAA TGG GGG AAA GAG AAA 240
Asp Phe Lys Glu Asp Lys Gly Lys 735 Ala 740 Lys Glu Trp Gly Lys 745 Glu Lys
LtGG GAA GAG TGG AGG CCT CCT GCT ACT GAG AAA GGA GAA ATG AAT AAT 288
Gly Glu Glu Trp Arg Pro Pro Ada Thr Glu Lys Gly Glu Met Asn Asn
750 755 760
TTT TTA GAT AAT AAA AAT GAT ATA AAG ACC AAT TAT AAA GAA ATT ACT 336
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr
765 770 775
rpi-pcp TCT ATG GCA GGT TCA TGT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA GAA GAA 384
Phe Ser Met Ala Gly Ser Cys Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Glu Glu
780 785 790 795
ATT GAT AAG ATC TTT GAT AAA GCC AAT CTC TCG AGT TCT ATT ATC ACC 432
Ile .Asp Lys Ile Phe Asp Lys Ala Asn Leu Ser Ser Ser Ile Ile Thr
800 805 810
TAT AAA. AAT GTG GAA. CGA GGA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA ACA 480
Tyr Lys A.sn Val Glu Pro Ala Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
815 820 825
GAA GGT AAT ACG ATT AAT TCT GAT GCA ATG GCA CAG TTT AAA GAA CAA 528
Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser .Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin
830 835 840
TTT TTA GGT AAG GAT ATG AAG TTT GAT AGT TAT CTA GAT ACT CAT TTA 576
Phe Leu Gly Lys Asp Met Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
845 850 855
ACT GCT CAA GAA GTT TCC AGT AAA AAA AGA GTT ATT TTG AAG GTT ACG 624
Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Lys Arg Val Ile Leu Lys Val Thr
8 60 865 870 875
GTT CCG AGT GGG AAA GGT TCT ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC ATT 672
Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val Ile
880 885 890
TTA AAC AAT AAT GAA TAC AAA ATG CTC ATT GAT AAT GGG TAT GTG CTC 720
Leu Asn A.sn Asn Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Val Leu
895 900 905
CAT GTA GAT AAG GTA TCA AAA GTA GTA AAA AAA GGG ATG GAG TGC TTA 768
Hrs Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Met Glu Cys Leu
910 915 920
CAA. GTT G.AA. GGG ACT TTA AAA AAG AGT CTC GAC TTT AAA AAT GAT ATA 816
Gin Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile
925 930 935
AAT GCT G.AA GCG CAT AGC TGG GGG ATG AAA ATT TAT GAA GAC TGG GCT 864
171
Asn 940 Ala Glu Ala His Ser 945 Trp Gly Met Lys lle 950 Tyr Glu Asp Trp Ala 955
AAA AAT TTA ACC GCT TCG CAA AGG GAA GCT TTA GAT GGG TAT GCT AGG
Lys Asn Leu Thr Ala 960 Ser Gin Arg Glu Ala 965 Leu Asp Gly Tyr Ala 970 Arg
CAA GAT TAT AAA GAA. ATC AAT AAT TAT TTG CGC AAT CAA GGC GGG AGT
Gin Asp Tyr Lys Glu lle Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser
975 980 985
GGA AAT GAA AAG CTG GAT GCC GAA TTA AAA AAT ATT TCT GAT GCT TTA 1008
Gly A.sn Glu Lys 990 Leu Asp Ala Gin 995 Leu Lys Asn lle Ser Asp Ala 1000 Leu
GGG AAG AAA CCC ATA CCA GAA AAT ATT ACC GTG TAT AGA TGG TGT GGC 1056
Gly Lys Lys Pro lle Pro Glu A.sn lle Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly
1005 1010 1015
ATG CCG GAA TTT GGT TAT CAA ATT AGT GAT CCG TTA CCT TCT TTA AAA . 1104
Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin lle Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys
1020 1025 1030 1035
GAT TTT GAA GAA CAA TTT TTA AAT ACA ATT AAA GAA GAC AAA GGG TAT 1152
Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr lle Lys Glu Asp Lys Gly Tyr
1040 1045 1050
ATG AGT ACA. AGC TTA TCG AGT GAA CGT CTT GCA GCT TTT GGA TCT AGA 1200
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg
1055 1060 1065
AAA ATT ATA TTA CGC TTA CAA. GTT CCG AAA GGA AGT ACG GGG GCG TAT 1248
Lys lle lle Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr
1070 1075 1080
TTA AGT GCC ATT GGT GGA TTT GCA AGT GAA AAA GAG ATC CTA CTT GAT 1296
Leu Ser Ala lle Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu lle Leu Leu Asp
1085 1090 1095
AAA GAT AGT AAA TAT CAT ATT GAT AAA GCA ACA GAG GTA ATC ATT AAA 1344
Lys Asp Ser Lys Tyr His lle Asp Lys Ala Thr Glu Val lle lle Lys
1100 1105 1110 1115
GGT GTT AAG CGA TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT 1386
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr A.sn
1120 1125
TAAGGAG ATG AAA AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACC TGT 1435
Met Lys Asn Met Lys Lys Lys Leu Ala Ser Val Val Thr Cys
1 5 10
ATG TTA TTA GCT CCT ATG TTT TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT AAC 1483
Met Leu Leu Ala Pro Met Phe Leu Asn Gly Asn Val Asn Ala Val Asn
15 20 25 30
172
GCG GAT AGT AAA ΑΤΑ ΑΛΤ CAG ATT TCT ACA ACG CAG GAA AAC CAA CAG 1531
Ala Asp Ser Lys lle Asn Gin 35 lle Ser Thr Thr Gin Glu Asn Gin Gin
40 45
AAA GAG ATG GAC CGA AAG GGA TTA TTG GGA TAT TAT TTC AAA GGA AAA 1579
Lys Glu Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys
50 55 60
GAT TTT AAT AAT CTT ACT ATG TTT GCA CCG ACA CGT GAT AAT ACC CTT 1627
Asp Phe Asn Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu
65 70 75
ATG TAT GAC CAA CAA ACA GCG AAT GCA TTA TTA GAT AAA AAA CAA CAA 1675
Met Tyr Asp Gin Gin Thr Ala Asn Ala Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin
80 85 90
GAA. TAT CAG TCC ATT CGT TGG ATT GGT TTG ATT CAG CGT AAA GAA ACG 1723
Glu Tyr Gin Ser lle Arg Trp lle Gly Leu lle Gin Arg Lys Glu Thr
95 100 105 110
GGC GAT TTC ACA TTT AAC TTA TCA AAG GAT GAA CAG GCA ATT ATA GAA 1771
Gly Asp Phe Thr Phe A.sn Leu Ser Lys Asp Glu Gin Ala lle lle Glu
115 120 125
ATC GAT GGG AAA ATC ATT TCT AAT AAA GGG AAA GAA AAG CAA GTT GTC 1819
lle Asp Gly Lys lle lle Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val
130 135 140
CAT TTA GAA AAA GAA. AAA TTA GTT CCA ATC AAA ATA GAG TAT CAA TCA 1867
His Leu Glu Lys Glu Lys Leu Val Pro lle Lys lle Glu Tyr Gin Ser
145 150 155
GAT ACG AAA TTT AAT ATT GAT AGT AAA ACA TTT AAA GAA CTT AAA TTA 1915
Asp Thr Lys Phe A.sn lle A.sp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu
160 165 170
TTT AAA ATA GAT AGT CAA AAC CAA TCT CAA CAA GTT CAA CTG AGA AAC 1963
Phe Lys lle A.sp Ser Gin Asn Gin Ser Gin Gin Val Gin Leu Arg Asn
175 180 185 190
CCT GAA TTT AAC AAA AAA GAA TCA CAG GAA TTT TTA GCA AAA GCA TCA 2011
Pro Glu Phe A.sn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Ala Ser
195 200 205
AAA ACA AAC CTT TTT AAG CAA AAA ATG AAA AGA GAT ATT GAT GAA GAT 2059
Lys Thr Asn Leu Phe Lys Gin Lys Met Lys Arg Asp lle Asp Glu Asp
210 215 220
ACG GAT ACA GA.T GGA GAC TCC ATT CCT GAT CTT TGG GAA GAA AAT GGG 2107
Thr Asp Thr Asp Gly Asp Ser lle Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly
225 230 235
TAC ACG ATT CAA AA.T AAA GTT GCT GTC AAA TGG GAT GAT TCG CTA GCA 2155
Tyr Thr lle Gin Asn Lys Val Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala
240 245 250
173
AGT AAG GGA . TAT ACA . AAA . TTT GTT 1 TCG í AAT CCA TTA . GAC AGC CAC ACA. 2203
Ser Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Asp Ser His Thr
255 260 265 270
GTT GGC GAT CCC TAT ACT GAT TAT GAA AAG GCC GCA AGG GAT TTA GAT 2251
Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp
275 280 285
TTA TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTC AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT CCA 2299
Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ma Ma Phe Pro
290 295 300
AGT GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA AAT 2347
Ser Val Asn Val Ser Met Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn
305 310 315
TTA TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT ACG 2395
Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr
320 325 330
AAT ACA GAA GGA. GCT TCC ATT GAA GCT GGT GGC GGT CCA TTA. GGC CTT 2443
Asn Thr Glu Gly Ala Ser Ile Glu Ala Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu
335 340 345 350
TCT «piperi GGC GTG AGT GTT ACT TAT CAA CAC TCT GAA ACA GTT GCA CAA 2491
Ser Phe Gly Val Ser Val Thr Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ma Gin
355 360 365
GAA TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT ACT TCA CAA TTC AAT ACG GCT TCA 2539
Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Aia Ser
370 375 380
GCG GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT CGG TAT AAC AAT GTA GGG ACT GGT 2587
Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly
385 390 395
GCC ATC TAT GAT GTA AAA CCT ACA ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC AAT 2635
Ala Ile Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu .Asn .Mn Asn
400 405 410
ACC ATC GCA ACG ATT ACA GCA AAA TCA AAT TCA ACA GCT TTA CGT ATA 2683
Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ma Leu .Arg Ile
415 420 425 430
TCT CCG GGG GAT AGT TAT CCA GAA ATA GGA GAA AAC GCT ATT GCG ATT 2731
Ser Pro Gly Asp Ser Tyr Pro Glu Ile Gly Glu Asn Ma Ile Aia Ile
435 440 445
ACA TCT ATG GAT GAT TTT AAT TCT CAT CCA ATT ACA TTA .AAT AAA CAA. 2779
Thr Ser Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys Gin
450 455 4 60
CAG GTA AAT CAA TTG ATA AAT AAT AAG CCA ATT ATG CTA GAG ACA GAC 2827
Gin Val Asn Gin Leu Ile Asn Asn Lys Pro Ile Met Leu Glu Thr Asp
174
465 470 475
CAA ACA GAT GGT GTT TAT AAA ATA AGA GAT ACA CAT GGA AAT ATT GTA 2875
Gin Thr Asp Gly Val Tyr Lys Ile Arg Asp Thr His Gly Asn Ile Val
480 485 490
ACT GGT GGA GAA TGG AAT GGT GTA ACA CAA CAA ATT AAA GCA AAA ACA 2923
Thr Gly Gly Glu Trp Asn Gly Val Thr Gin Gin Ile Lys Ala Lys Thr
495 500 505 510
GCG TCT ATT ATT GTG GAT GAC GGG AAA CAG GTA GCA GAA AAA CGT GTG 2971
Ala Ser Ile Ile Val Asp Asp Gly Lys Gin Val Ala Glu Lys Arg Val
515 520 525
GCG AA4 GAT TAT GGT CAT CCA GAA GAT AAA AGA CCA CCT TTA ACT 3019
Ala Ala Lys Asp Tyr Gly His Pro Glu Asp Lys Thr Pro Pro Leu Thr
530 535 540
TTA AAA GAT ACC CTG AAG CTT TCA TAC CCA GAT GAA ATA AAA GAA ACT 3067
Leu Lys Asp Thr Leu Lys Leu Ser Tyr Pro .Asp Glu Ile Lys Glu Thr
545 550 555
AAT GGA TTG TTG TAC TAT GAT GAC AAA CCA ATC TAT GAA TCG AGT GTC 3115
Asn Gly Leu Leu Tyr Tyr Asp A.sp Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Val
560 565 570
ATG ACT TAT CTG GAT GAA AAT ACG GGA AAA GAA GTC AAA AAA GAA ATA 3163
Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Val Lys Lys Gin Ile
575 580 585 590
.AAT GAT ACA ACC GGA AAA TTT AAG GAT GTA AAT CAC TTA TAT GAT GTA 3211
Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val A.sn His Leu Tyr Asp Val
595 600 605
AAA CTG ACT CGA .AAA ATG AAT TTT ACG ATT AAA ATG GCT TCC TTG TAT 3259
Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Phe Thr Ile Lys Met Ala Ser Leu Tyr
610 615 620
GAT GGG GCT GAA AAT AAT CAT AAC TCT TTA GGA ACC TGG TAT TTA ACA 3307
Asp Glv Ala Glu Asn A.sn His Asn Ser Leu Gly Thr Trp Tyr Leu Thr
625 630 635
TAT AAT GTT GCT GGT GGA AAT ACT GGG AAG AGA CAA TAT CGT TCA GCT 3355
Tvr Asn Val .Ala Gly Gly Asn Thr Gly Lys Arg Gin Tyr Arg Ser Ala
640 645 650
CAT TCT TGT GCA CAT GTA GCT CTA TCT TCA GAA GCG AAA AAG AAA CTA 3403
His Ser Cys Ala His Val Ala Leu Ser Ser Glu Ala Lys Lys Lys Leu
655 660 665 670
AAT CAA AAT GCG AAT TAC TAT CTT AGC ATG TAT ATG AAG GCT GAT TCT 3451
Asn Gin Asn .Ala Asn Tyr Tyr Leu Ser Met Tyr Met Lys Ala Asp Ser
675 680 685
ACT ACG GAA CCT ACA ATA GAA GTA GCT GGG GAA AAA TCT GCA .ATA ACA 3499
175
Thr Thr Glu Pro 690 Thr Ile Glu Val Ala 695 Gly Glu Lys Ser Ala 700 Ile Thr
AGT AAA AAA GTA AAA TTA AAT AAT CAA AAT TAT CAA AGA GTT GAT ATT 3547
Ser Lys Lys 705 Val Lys Leu Asn Asn 710 Gin Asn Tyr Gin Arg 715 Val Asp Ile
TTA GTG AAA AAT TCT GAA AGA AAT CCA ATG GAT AAA ATA TAT ATA AGA 3595
Leu Val 720 Lys Asn Ser Glu Arg 725 Asn Pro Met Asp Lys 730 Ile Tyr Ile Arg
GGA AAT GGC ACG ACA AAT GTT TAT GGG GAT GAT GTT ACT ATC CCA GAG 3643
Gly 735 Asn Gly Thr Thr Asn 740 Val Tyr Gly Asp Asp 745 Val Thr Ile Pro Glu 750
GTA TCA GCT ATA AAT CCG GCT AGT CTA TCA GAT GAA GAA ATT CAA GAA 3691
Val Ser Ala Ile Asn 755 Pro Ada Ser Leu Ser 760 Asp Glu Glu Ile Gin 765 Glu
ATA TTT AAA GAC TCA ACT ATT GAA TAT GGA AAT CCT AGT TTC GTT GCT 3739
Ile Phe Lys Asp 770 Ser Thr Ile Glu Tyr 775 Gly Asn Pro Ser Phe 780 Val íla
GAT GCC GTA ACA TTT AAA. AAT ATA AAA CCT TTA CAA AAT TAT GTA AAG 3787
Asp Ala Val 785 Thr Phe Lys Asn Ile 790 Lys Pro Leu Gin Asn 795 Tyr Val Lys
GAA TAT GAA ATA TAT CAT AAA TCT CAT CGA TAT GAA AAG AAA ACG GTC 3835
Glu Tyr 800 Glu Ile Tyr His Lys 805 Ser His Arg Tyr Glu 810 Lys Lys Thr Val
TTT GAT ATC ATG GGT GTT CAT TAT GAG TAT AGT ATA GCT AGG GAA CAA 3883
Phe 815 Asp Ile Met Gly Val 820 His Tyr Glu Tyr Ser 825 Ile Ala Arg Glu Gin 830
AAG AAA GCC GCA TAATTTTAAA AATAAAACTC GTTAGAGTTT ATTTAGCATG 3935
Lys Lys Ala Ala
GTATTTTTAA GAATAATCAA TATGTTGAAC CGTTTGTAGC TGTTTTGGAA GGGAATTTCA 3995
TTTTATTTGG TCTCTTAAGT TGATGGGCAT GGGATATGTT CAGCATCCAA GCGTTTNGGG 4055
GGTTANAAAA TCCAATTTT 4074
Informace o sekvenci SEQ ID č. 20:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 462 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
176
(xi) zná zornění ) se kve: nce SEC ! ID Č . 20 :
Met Gin Arg Met Glu Gly ' Lys Leu i Phe Val . Val . Ser ' Lys Thr Leu 1 Gin
Ί 1 3 10 15
Vel Vsi Thr Arg Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Tyr Ser Ile Thr Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Val Val Ile Lys Ala Asp Gin Leu Asn Ile Asn Ser Gin
35 40 45
Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin A.sn Leu Lys Ile Pro Asp Asn Ala Glu
50 55 60
Asp Phe Lys Glu Asp Lys Gly Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys
65 70 75 80
Gly Glu Glu Trp Arg Pro Pro AJ_a Thr Glu Lys Gly Glu Met Asn Asn
85 90 95
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr
100 105 110
Phe Ser Μθέ A_la Gly Ser Cys Glu Asp Glu Ile Lys 'Asp Leu Glu Glu
115 120 125
Ile Asp Lys Ile Phe Asp Lys Ala A.sn Leu Ser Ser Ser Ile Ile Thr
130 135 140
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Ala Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
145 150 155 160
Glu Gly A.sn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin
165 170 175
Phe Leu Gly Lys Asp Met Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
180 185 190
Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Lys Arg Val Ile Leu Lys Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val Ile
210 215 220
Leu Asn Asn Asn Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Val Leu
225 230 235 240
His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Met Glu Cys Leu
245 250 255
Gin Val Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile
260 265 270
Asn Ala Glu Ala His Ser Trp ' Gly 1 Met Lys Ile Tyr Glu Asp Trp . Ala
275 280 285
177
Lys Asn Leu Thr Ala 290 Ser Gin Axg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg
295 300
Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ada Gin Leu Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu
325 330 335
Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly
340 345 350
Mec Pro Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys
355 360 365
Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr
370 375 380
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg
385 390 395 400
Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr
405 410 415
Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp
420 425 430
Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Ala Thr Glu Val Ile ile Lys
435 440 445
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ada Thr Leu Leu Thr AxSn
450 455 460
Informace o sekvenci SEQ ID č . 21 :
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 834 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
(xi( ) znázornění sekvence SEQ ID Č . 21:
Met d Lys Asn Met Lys Lys 5 Lys Leu Ada Ser 10 Val Val Thr Cys Met 15 Leu
Leu Ala Pro Met Phe Leu 20 Asn Gly Asn 25 Val Asn Ala Val Asn 30 Ada Asp
Ser Lys Ile Asn Gin Ile 35 Ser Thr Thr 40 Gin Glu Asn Gin 45 Gin Lys Glu
178
MSC Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe
50 55 60
Asn Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Asn Thr Leu Met Tyr
65 70 75 80
Asp Gin Gin Thr Ala Asn Ala Leu Leu Asp Lys Lys Gin Gin Glu Tyr
85 90 95
Gin Ser lle Arg Trp lle Gly Leu lle Gin Arg Lys Glu Thr Gly Asp
100 105 110
Phe Thr Phe Asn Leu Ser Lys Asp Glu Gin Ala lle lle Glu lle Asp
115 120 125
Gly Lys lle lle Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val His Leu
130 135 140
Glu Lys Glu Lys Leu Val Pro lle Lys lle Glu Tyr Gin Ser Asp Thr
145 150 155 160
Lys Phe Asn lle Asd Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys
165 170 175
lle Asp Ser Gin Asn Gin Ser Gin Gin Val Gin Leu Arg Asn Pro Glu
180 185 190
Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala Lys Ala Ser Lys Thr
195 200 205
Asn Leu Phe Lys Gin Lys Met Lys Arg Asp lle Asp Glu Asp Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Gly Asp Ser lle Pro .Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly Tyr Thr
225 230 235 240
lle Gin Asn Lys Val Ala Val Lys Trp Asp Asp Ser Leu Ala Ser Lys
24 5 250 255
Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser A.sn Pro Leu Asp Ser His Thr Val Gly
260 265 270
A.sp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser
275 280 285
Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro Ser Val
290 295 300
Asn Val Ser Met Glu Lys Val lle Leu Ser Pro Asn Glu Asn Leu Ser
305 310 315 320
Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp Ser Tyr Thr Asn Thr
325 330 335
Glu Gly Ala Ser lle Glu Ala Gly Gly Gly Pro Leu Gly Leu Ser Phe
179
340 345 350
Gly Val Ser Val Thr Tyr Gin His Ser Glu Thr Val Ala Gin Glu Trp
355 360 365
Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser Ala Gly
370 375 380
Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr Gly Ala Ile
385 390 395 400
Tyr Asp Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asn Thr Ile
405 410 415
Ala Thr Ile Thr Ala Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Arg Ile Ser Pro
420 425 430
Gly Asp Ser Tyr Pro Glu Ile Gly Glu Asn Ala Ile Ala Ile Thr Ser
435 440 445
Met Asp Asp Phe Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn Lys Gin Gin Val
450 455 4 60
Asn Gin Leu Ile Asn Asn Lys Pro Ile Met Leu Glu Thr A^p Gin Thr
4 65 470 475 480
Asp Gly Val Tyr Lys Ile Arg Asp Thr His Gly Asn Ile Val Thr Gly
485 490 495
Gly Glu Trp Asn Gly Val Thr Gin Gin Ile Lys Ala Lys Thr Ala Ser
500 505 510
Ile Ile Val Asp Asp Gly Lys Gin Val Ala Glu Lys Arg Val Ala Ala
515 520 525
Lys Asp Tyr Gly His Pro Glu Asp Lys Thr Pro Pro Leu Thr Leu Lys
530 535 540
Asp Thr Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu Ile Lys Glu Thr Asn Gly
545 550 555 560
Leu Leu Tyr Tyr Asp Asp Lys Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Val Met Thr
565 570 575
Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys Glu Val Lys Lys Gin Ile Asn Asp
580 585 590
Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp Val Asn His Leu Tyr Asp Val Lys Leu
595 600 605
Thr Pro Lys Met Asn Phe Thr Ile Lys Met Ala Ser Leu Tyr Asp Gly
610 615 620
Ala Glu Asn Asn His Asn Ser Leu Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Tyr Asn
625 630 635 640
180
Val Ala Gly Gly Asn Thr Gly Lys Arg Gin Tyr Arg Ser Ala His Ser
645 650 655
Cys Ada His Val 660 Ala Leu Ser Ser Glu 665 Ala Lys Lys Lys Leu 670 Asn Gin
Asn Ala Asn Tyr Tyr Leu Ser Met Tyr Met Lys Ala Asp Ser Thr Thr
675 680 685
Glu Pro Thr Ile Glu Val Ala Gly Glu Lys Ser Ala Ile Thr Ser Lys
690 695 700
Lys Val Lys Leu Asn Asn Gin Asn Tyr Gin Arg Val Asp Ile Leu Val
705 710 715 720
Lys Asn Ser Glu Aurg A.sn Pro Met Asp Lys Ile Tyr Ile Arg Gly Asn
725 730 735
Gly Thr Thr Asn Val Tyr Gly Asp Asp Val Thr Ile Pro Glu Val Ser
740 745 750
Ala Ile A.sn Pro Ada Ser Leu Ser Alsp Glu Glu Ile Gin Glu Ile Phe
755 760 765
Lys A.so Ser Thr Ile Glu Tyr Gly A.sn Pro Ser Phe Val Ala Asp Ala
770 775 780
Val mh— Phe Lys Asn Ile Lys Pro Leu Gin A.sn Tyr Val Lys Glu Tyr
785 790 795 800
Glu Ile Tyr His Lys Ser His Arg Tyr Glu Lys Lys Thr Val Phe Asp
805 810 815
Ile Met Gly Val His Tyr Glu Tyr Ser Ile Ala Arg Glu Gin Lys Lys
820 825 830
Ada Ala
Informace o sekvenci SEQ ID Č . 22 :
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 4041 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 1..4038
181 (D) další informace: produkt = fúzní produkt
VIPlA(a)/VIP2A(a) (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 22:
ATG AAA AGA ATG GAG GGA AAG TTG TTT ATG GTG TCA AAA AAA TTA CAA 48
Met 835 Lys Arg Met Glu Gly 840 Lys Leu Phe Met Val 845 Ser Lys Lys Leu Gin 850
GTA GTT ACT AAA ACT GTA TTG CTT AGT ACA GTT TTC TCT ATA TCT TTA 96
Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser lle Ser Leu
855 860 865
TTA AAT AAT GAA GTG ATA AAA GCT GAA CAA TTA AAT ATA AAT TCT CAA 144
Leu Asn Asn Glu Val lle Lys Ala Glu Gin Leu Asn lle Asn Ser Gin
870 875 880
AGT AAA TAT ACT AAC TTG CAA AAT CTA AAA ATC ACT GAC AAG GTA GAG 192
Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val Glu
885 890 895
GAT TTT AAA GAA GAT AAG GAA AAA GCG AAA GAA TGG GGG AAA GAA AAA 240
Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ma Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys
900 905 910
GAA AAA GAG TGG AAA CTA ACT GCT ACT GAA AAA GGA AAA ATG AAT AAT 288
Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Mst Asn Asn
915 920 925 930
TTT TTA GAT AAT AAA AAT GAT ATA .AAG ACA AAT TAT AAA GAA ATT ACT 336
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp lle Lys Thr Asn Tyr Lys Glu lle Thr
935 940 94 5
TTT TCT ATG GCA GGC TCA TTT GAA GAT GAA ATA AAA GAT TTA AAA GAA 384
Phe Ser Met Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu lle Lys Asp Leu Lys Glu
950 955 960
ATT GAT AAG ATG TTT GAT AAA ACC AAT CTA TCA AAT TCT ATT ATC ACC 432
lle Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser lle lle Thr
965 970 975
TAT AAA AAT GTG GAA CCG ACA ACA ATT GGA TTT AAT AAA TCT TTA ACA '480
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr lle Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
980 985 990
GAA GGT AAT ACG ATT AAT TCT GAT GCA ATG GCA CAG TTT AAA GAA CAA 528
Glu Gly Asn Thr lle Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin
995 1000 1005 1010
TTT TTA GAT AGG GAT ATT AAG TTT GAT AGT TAT CTA GAT ACG CAT TTA 576
Phe Leu Asp Arg Asp lle Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
1015 1020 1025
ACT GCT CAA CAA GTT TCC AGT AAA GAA AGA GTT ATT TTG AAG GTT ACG 624
Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val lle Leu Lys Val Thr
182
1030 1035 1040
GTT CCG AGT GGG AAA GGT Gly TCT Ser ACT ACT CCA ACA AAA GCA GGT GTC Ala Gly Val 1055 ATT Ile 672
Val Pro Ser Gly Lys 1045 Thr Thr 1050 Pro Thr Lys
TTA AAT AAT AGT GAA TAC AAA ATG CTC ATT GAT AAT GGG TAT ATG GTC 720
Leu Asn Asn Ser Glu 1060 Tyr Lys Met Leu 1065 Ile Asp Asn Gly Tyr Met 1070 Val
CAT GTA GAT AAG GTA TCA AAA GTG GTG AAA AAA GTG GAG TGC TTA 768
His Val 1075 A.sp Lys Val Ser Lys 1080 Val Val Lys Lys Gly 1085 Val Glu Cys Leu 1090
CAA ATT GAA GGG ACT TTA AAA AAG AGT CTT GAC TTT AAA AAT GAT ATA 816
Gin Ile Glu Gly Thr Leu 1095 Lys Lys Ser Leu A.sp 1100 Phe Lys Asn Asp Ile 1105
AAT GCT GAA GCG CAT AGC TGG GGT ATG AAG AAT TAT GAA GAG TGG GCT 864
.Asn Ala Glu .Ala His 1110 Ser Trp Gly Met Lys 1115 Asn Tyr Glu Glu Trp 1120 Ala
AAA GAT TTA ACC GAT TCG CAA AGG GAA GCT TTA GAT GGG TAT GCT AGG 912
Lys Asp Leu Thr Asp 1125 Ser Gin Arg Glu 1130 Ala Leu Asp Gly Tyr Ala 1135 Arg
CAA GAT TAT AAA GAA ATC AAT AAT TAT TTA AGA AAT CAA GGC GGA AGT 960
Gin Asp Tyr Lys Glu 1140 Ile .Asn Asn Tyr 1145 Leu Arg Asn Gin Gly Gly 1150 Ser
GGA AAT GAA AM CTA GAT GCT CAA ATA AAA AAT ATT TCT GAT GCT TTA 1008
Gly Asn 1155 Glu Lys Leu Asp Ala 1160 Gin Ile Lys Asn Ile 1165 Ser Asp Ala Leu 1170
GGG AAG AAA CCA ATA CCG GAA AAT ATT ACT GTG TAT AGA TGG TGT GGC 1056
Gly Lys Lys Pro Ile Pro 1175 Glu Asn Ile Thr Val 1180 Tyr Arg Trp Cys Gly 1185
ATG CCG GAA TTT GGT TAT CAA ATT AGT GAT CCG TTA CCT TCT TTA AAA 1104
Met Pro Glu Phe Gly 1190 Tyr Gin Ile Ser Asp 1195 Pro Leu Pro Ser Leu 1200 Lys
GAT TTT GAA GAA CAA TTT TTA AAT ACA ATC AAA GAA GAC AAA GGA TAT 1152
Asp Phe Glu Glu Gin 1205 Phe Leu Asn Thr 1210 Ile Lys Glu Asp Lys Gly 1215 Tyr
ATG AGT ACA AGC TTA TCG AGT GAA CGT CTT GCA GCT TTT GGA TCT AGA 1200
Met Ser 122C Thr Ser Leu 1 Ser Ser 1225 Glu Arg > Leu Ala Ala 123C Phe Gly Ser 1 Arg
AAA ATT ATA TTA CGA TTA CAA GTT CCG AAA GGA AGT ACG GGT GCG TAT 1248
Lys 1235 Ile ) Ile Leu Arg Leu 124C Gin 1 Val Pro Lys Gly 1245 Ser ) Thr Gly Ala Tyr 1250
TTA AGT GCC ATT GGT GGA TTT GCA AGT GAA AAA GAG ATC CTA CTT GAT 1296
183
Leu Ser Ala Ile Gly Gly 1255 Phe Ala Ser Glu Lys 1260 Glu Ile Leu Leu Asp 1265
AAA GAT AGT AAA TAT CAT ATT GAT AAA GTA ACA GAG GTA ATT ATT AAA 1344
Lys Asp Ser Lys Tyr 1270 His Ile Asp Lys Val 1275 Thr Glu Val Ile Ile 1280 Lys
GGT GTT AAG CGA TAT GTA GTG GAT GCA ACA TTA TTA ACA AAT ATG AAA 1392
Gly Val Lys Arg 1285 Tyr Val Val Asp Ala 1290 Thr Leu Leu Thr Asn 1295 Met Lys
AAT ATG AAG AAA AAG TTA GCA AGT GTT GTA ACG TGT ACG TTA TTA GCT 1440
Asn Met Lys 1300 Lys Lys Leu Ala Ser 1305 Val Val Thr Cys Thr 1310 Leu Leu Ma
CCT ATG TTT TTG AAT GGA AAT GTG AAT GCT GTT TAC GCA GAC AGC AAA 1488
Pro Met 1315 Phe Leu Asn Gly Asn 1320 Val Asn Ala Val Tyr 1325 Ala Asp Ser Lys 1330
ACA AAT CAA ATT TCT ACA ACA CAG AAA AAT CAA CAG ΆΆΑ GAG ATG GAC 1536
Thr Asn Gin Ile Ser Thr 1335 Thr Gin Lys Asn Gin 1340 Gin Lys Glu Met Asp 1345
CGA AAA GGA TTA CTT GGG TAT TAT TTC AAA GGA AAA GAT TTT AGT AAT 1584
Arg Lys Gly Leu Leu 1350 Gly Tyr Tyr Phe Lys 1355 Gly Lys Asp Phe Ser 1360 Asn
CTT ACT ATG TTT GCA CCG ACA CGT GAT AGT ACT CTT ATT TAT GAT GA\ 1632
Leu Thr Met Phe 1365 Ala Pro Thr Arg 137C Asp ) Ser Thr Leu Ile Tyr 1375 Asp Gin
CAA ACA GCA AAT AAA CTA TTA GAT AAA AAA CAA CAA GAA TAT CAG TCT 1680
Gin Thr 138C Ala ) Asn Lys Leu Leu Asp 1385 Lys Lys Gin Gin 139C Glu ) Tyr Gin Ser
ATT CGT TGG ATT GGT TTG ATT CAG AGT AAA GAA ACG GGA GAT TTC ACA 1728
Ile 1395 Arg Trp Ile Gly Leu 140C Ile ) Gin Ser Lys Glu 1405 Thr Gly Asp Phe Thr 1410
TTT AAC TTA TCT GAG GAT GAA CAG GCA ATT ATA GAA ATC AAT GGG AAA 1776
Phe Asn Leu Ser Glu 1415 Asp Glu Gin Ala Ile 142C Ile 1 Glu Ile Asn Gly 1425 Lys
ATT ATT TCT AAT AAA GGG AAA GAA AAG CAA GTT GTC CAT TTA GAA AAA 1824
Ile Ile Ser Asn 143C Lys 1 Gly Lys Glu Lys 1435 Gin Val Val His Leu 144C Glu 1 Lys
GGA AAA TTA GTT CCA ATC AAA ATA GAG TAT CAA TCA GAT ACA AAA TTT 1872
Gly Lys Leu 1445 Val 1 Pro Ile Lys Ile 1450 Glu 1 Tyr Gin Ser Asp 1455 Thr > Lys Phe
AAT ATT GAC AGT AAA ACA TTT AAA GAA CTT AAA TTA TTT AAA ATA GAT 1920
Asn Ile Asp Ser Lys Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu Phe Lys Ile Asp
1460 1465 1470
184
AGT CAA AAC Ser Gin Asn 1475 CAA CCC CAG CAA GTC Gin Pro Gin Gin Val 1480 CAG CAA GAT GAA CTG AGA AAT CCT 1968
Gin Gin Asp Glu 1485 Leu Arg Asn Pro 1490
GAA TTT AAC AAG AAA GAA TCA CAG GAA TTC TTA GCG AAA CCA TCG AAA 2016
Glu Phe Asn Lys Lys Glu Ser Gin 1495 Glu Phe Leu Ala 1500 Lys Pro Ser Lys 1505
ATA AAT CTT TTC ACT CAA AAA ATG AAA AGG GAA ATT GAT GAA GAC ACG 2064
Ile Asn Leu Phe Thr Gin Lys Met 1510 Lys Arg 1515 Glu Ile Asp Glu Asp 1520 Thr
GAT ACG GAT GGG GAC TCT ATT CCT GAC CTT TGG GAA ' GAA AAT GGG TAT 2112
Asp Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp 1525 * 1530 Leu Trp Glu Glu Asn 1535 Gly Tyr
ACG ATT CAA AAT AGA ATC GCT GTA AAG TGG GAC GAT TCT CTA GGA AGT 2160
Thr Ile Gin 1540 Asn Arg Ile Ala Val 1545 Lys Trp Asp Asp Ser 1550 Leu Ala Ser
AAA GGG TAT ACG AAA TTT GTT TCA AAT CCA CTA GAA AGT CAC ACA GTT 2208
Lys Gly Tyr 1555 Thr Lys Phe Val Ser 1560 Asn Pro Leu Glu 1565 Ser His Thr Val 1570
GGT GAT CCT TAT ACA GAT TAT GAA AAG GCA GCA. AGA GAT CTA GAT TTG 2256
Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu 1575 Lys Ala Ala Arg 1580 Asp Leu Asp Leu 1585
TCA AAT GCA AAG GAA ACG TTT AAC CCA TTG GTA GCT GCT TTT CCA AGT 2304
Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn 1590 Pro Leu 1595 Val Ala Ala Phe Pro 1600 Ser
GTG AAT GTT AGT ATG GAA AAG GTG ATA TTA TCA CCA AAT GAA AAT TTA 2352
Val Asn Val 1605 Ser Met Glu Lys Val Ile i 1610 Leu Ser Pro Asn 1611 Glu Asn Leu
TCC AAT AGT GTA GAG TCT CAT TCA TCC ACG AAT TGG TCT TAT ACA AAT 2400
Ser Asn Ser 1620 Val Glu Ser His Ser 1625 Ser Thr Asn Trp 163C Ser 1 Tyr Thr Asn
ACA GAA GGT GCT TCT GTT GAA GCG GGG ATT GGA CCA AAA GGT ATT TCG 2448
Thr Glu Gly 1635 Ala Ser Val Glu Ala 1640 Gly Ile Gly Pro 1645 Lys Gly Ile Ser 1650
TTC GGA GTT AGC GTA AAC TAT CAA CAC TCT GAA ACA GTT GCA GAA GAA 2496
Phe Gly Val Ser Val Asn Tyr Gin 1655 His Ser 1660 Glu Thr 1 Val Ala Gin 1665 Glu
TGG GGA ACA TCT ACA GGA AAT ACT TCG C.AA TTC AAT ACG GCT TCA GCG 2544
Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr 1670 Ser 1675 Gin Phe Asn Thr Ala 1680 Ser Ala
GGA TAT TTA AAT GCA AAT GTT CGA TAT AAC AAT GTA GGA ACT GGT GCC 2592
Gly Tyr Leu 1685 Asn Ala Asn Val Arg 1690 Tyr Asn Asn Val Gly 1695 Thr Gly Ala
185
ATC TAC GAT GTA AAA CCT ACA ACA AGT TTT GTA TTA AAT AAC GAT ACT 2640
Ile Tyr Asp 1700 Val Lys Pro Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asp Thr
1705 1710
ATC GCA ACT ATT ACG GCG AAA TCT AAT TCT ACA GCC TTA AAT ATA TCT 2688
Ile Ala Thr 1715 Ile Thr Ala Lys Ser Asn 1720 Ser Thr Ala Leu 1725 Asn Ile Ser 1730
CCT GGA GAA AGT TAC CCG AAA AAA GGA CAA AAT GGA ATC GCA ATA ACA 2736
Pro Gly Glu Ser Tyr Pro Lys Lys Gly 1735 Gin Asn Gly Ile 1740 Ala Ile Thr 1745
TCA ATG GAT GAT TTT AAT TCC CAT CCG A.TT ACA TTA AAT AAA AAA CAA 2784
Ser Mer A.sp A.sp Phe 1750 Asn Ser His Pro Ile Thr Leu Asn 1755 Lys Lys 1760 Gin
GTA GAT AAT CTG CTA AAT AAT AAA CCT ATG ATG TTG GAA ACA AAC CAA 2832
Val Asp Asn Leu 1765 Leu Asn Asn Lys Pro 1770 Met Met Leu Glu Thr 1775 Asn Gin
ACA GAT GGT GTT TAT AAG ATA AAA GAT ACA CAT GGA AAT ATA GTA ACT 2880
Thr Asp Gly 1780 Val Tyr Lys Ile Lys Asp 1785 Thr His Gly Asn 1790 Ile Val Thr
GGC GGA GAA TGG AAT GGT GTC ATA CAA CAA ATC AAG GCT AAA ACA GCG 2928
Gly Gly Glu 1795 Trp Asn Gly Val Ile Gin 1800 Gin Ile Lys Ala 1805 ' Lys Thr Ala 1810
TCT A.TT ATT GTG GAT GAT GGG GAA CGT GTA GCA GAA AAA CGT GTA GCG 2976
Ser Ile Ile Val Asp A.sp Gly Glu Arg 1815 Val Ala Glu Lys 1820 Arg Val Ala 1825
GCA AAA GAT TAT GAA AAT CCA GAA GAT AAA ACA CCG TCT TTA ACT TTA 3024
.Ala Lys Asp Tyr Glu 1830 Asn Pro Glu Asp Lys Thr Pro Ser 1835 Leu Thr 1840 Leu
AAA GAT GCC CTG AAG CTT TCA TAT CCA GAT GAA ATA AAA GAA ATA GAG 3072
Lys Asp Ala Leu 1845 Lys Leu Ser Tyr Pro 1850 Asp Glu Ile Lys Glu 1855 Ile Glu
GGA TTA TTA TAT TAT AAA AAC AAA CCG ATA TAC GAA TCG AGC GTT ATG 3120
Gly Leu Leu 1860 Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro 1865 Ile Tyr Glu Ser 1870 Ser Val Met
ACT TAC TTA GAT GAA AAT ACA GCA AAA GAA GTG ACC AAA CAA TTA AAT 3168
Thr 1875 Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala Lys 1880 Glu Val Thr Lys 1885 Gin Leu Asn 1890
GAT ACC ACT GGG AAA TTT AAA GAT GTA AGT CAT TTA TAT GAT GTA AAA 3216
Asp Thr Thr Gly Lys 1895 Phe Lys Asp Val > Ser His Leu Tyr 1900 Asp Val 1905 Lys >
CTG ACT CCA MA ATG AAT GTT ACA ATC AAA TTG TCT ATA CTT TAT GAT 3264
Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp
186
1910 1915 1920
AAT Asn GCT Ada GAG TCT Glu Ser 1925 AAT GAT A.sn .Asp AAC Asn TCA ATT GGT AAA TGG ACA AAC ACA AAT 3312
Ser Ile 1930 Gly Lys Trp Thr Asn Thr 1935 Asn
ATT GTT TCA GGT GGA AAT AAC GGA AAA AAA CAA TAT TCT TCT AAT AAT 3360
Ile Val Ser Gly 1940 Gly Asn Asn Gly Lys 1945 Lys Gin Tyr Ser Ser Asn 1950 Asn
CCG GA.T GCT AAT TTG ACA TTA AAT ACA GAT GCT CAA GAA AAA TTA AAT 3408
Pro Asp 1955 .Ala A.sn Leu Thr Leu 1960 Asn Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu 1965 Asn 1970
.AAA AAT CGT GAC TAT TAT ATA. AGT TTA TAT ATG AAG TCA GAA AAA AAC 3456
Lys .Asn Arg .Asp Tvr Tyr 1975 Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn 1980 1985
AGA CAA. TGT GAG ATT ACT ATA. GAT GGG GAG ATT TAT CCG ATC ACT ACA 3504
Thr Gin Cys Glu Ile Thr 1990 Ile Asp Gly Glu 1995 Ile Tyr Pro Ile Thr 2000 Thr
AAA ACA GTG AA.T GTG .AAT AAA GAC AAT TAC AAA AGA TTA GAT ATT ATA 3552
Lys Thr Val Asn 2005 Val A.sn Lys Asp Asn 2010 Tyr Lys Arg Leu .Asp Ile 2015 Ile
GCT CAT AA.T .ATA. AAA AGT AAT CCA ATT TCT TGA CTT CAT ATT AAA ACG 3600
Ala His .Asn Ile 2020 Lys Ser Asn Pro Ile 2025 Ser Ser Leu His Ile Lys 2030 Thr
AA.T GAT GAA ATA ACT TTA TTT TGG GAT GAT ATT TCT ATA ACA GAT GTA 3648
Asn Asp 2035 Glu Ile Thr Leu Phe 2040 Trp Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp 2045 Val 2050
GCA TCA ATA AAA CCG GAA AAT TTA ACA GAT TCA GAA ATT AAA CAG ATT 3696
Ala Ser Ile Lys Pro Glu 2055 Asn Leu Thr ASP 206C Ser Glu Ile Lys Gin ) 2065 Ile
TAT AGT AGG TAT GGT ATT AAG TTA GAA GAT GGA ATC CTT ATT GAT AAA 3744
Tyr Ser Arg Tyr 20VC Gly Ile ) Lys Leu Glu Asp 2075 Gly Ile Leu Ile Asp 2080 Lys
AAA GGT GGG ATT CAT TAT GGT GAA TTT ATT AAT GAA GCT AGT TTT AAT 3792
Lys Gly Gly Ile 2085 His Tyr Gly Glu Phe 2090 Ile Asn Glu Ala Ser Phe 2095 Asn
ATT GAA CGA TTG CAA AAT TAT GTG ACC AAA TAT GAA GTT ACT TAT AGT 3840
Ile Glu 2100 Pro Leu 1 Gin Asn Tyr 2105 Val Thr > Lys Tyr Glu Val Thr Tyr 2110 Ser
AGT GAG TTA GGA CCA AAC GTG AGT GAC ACA CTT GAA AGT GAT AAA ATT 3888
Ser 2115 Glu Leu Gly Pro A.sn 2120 Val Ser A.sp Thr Leu Glu Ser Asp Lys 2125 Ile 2130
TAC AAG GAT GGG ACA ATT AAA TTT GAT TTT ACC AAA TAT AGT AAA AAT 3936
187
Tyr Lys Asp Gly Thr Ile 2135 Lys Phe Asp Phe Thr 2140 Lys Tyr Ser Lys Asn 2145
G.AA CAA GGA TTA TTT TAT GAC AGT GGA TTA AAT TGG GAC TTT AAA ATT 3984
Glu Gin Gly Leu Phe 2150 Tyr Asp Ser Gly Leu 2155 Asn Trp Asp Phe Lys 2160 Ile
AAT GCT ATT ACT TAT GAT GGT AAA GAG ATG AAT GTT TTT CAT AGA TAT 4032
Asn Ala Ile 2165 Thr Tyr Asp Gly Lys 217C Glu 1 Met Asn Val Phe 2175 His Arg Tyr
AAT AAA TAG 4041
Asn Lys
2180
Informace o sekvenci SEQ ID č. 23:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1346 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
1 (xi) znázc arnění sekvence SEQ ID č. : 23 :
Met 1 Lys Arg Met Glu Gly 5 Lys Leu Phe Met 10 Val Ser Lys Lys Leu Gin 15
Val Val Thr Lys 20 Thr Val Leu Leu Ser Thr 25 Val Phe Ser Ile Ser Leu 30
Leu Asn Asn Glu 35 Val Ile Lys Ala Glu Gin 40 Leu Asn Ile Asn Ser Gin 45
Ser Lys 50 Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys 55 Ile Thr 60 Asp Lys Val Glu
Asp 65 Phe Lys Glu Asp Lys 70 Glu Lys Ala Lys Glu 75 Trp Gly Lys Glu Lys 80
Glu Lys Glu Trp Lys Leu 85 Thr Ala Thr Glu 90 Lys Gly Lys Met Asn Asn 95
Phe Leu Asp Asn 100 Lys Asn Asp Ile Lys Thr 105 Asn Tyr Lys Glu Ile Thr 110
Phe Ser Met Ala 115 Gly Ser Phe Glu Asp Glu 120 Ile Lys Asp Leu Lys Glu 125
Ile Asp Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr
130 135 140
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
188
145 150 155 160
Glu Gly Asn Thr lle Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin 165 170 175
Phe Leu Asp Arg 180 Asp lle Lys Phe Asp 185 Ser Tyr Leu Asp Thr 190 His Leu
Thr Ala Gin 195 Gin Val Ser Ser Lys 200 Glu Arg Val lle Leu 205 Lys Val Thr
Val Pro 210 Ser Gly Lys Gly Ser 215 Thr Thr Pro Thr Lys 220 Ala Gly Val lle
Leu 225 Asn Asn Ser Glu Tyr 230 Lys Met Leu lle Asd 235 Asn Gly Tyr Met Val 240
His Val Asp Lys Val 245 Ser Lys Val Val Lys 250 Lys Gly Val Glu Cys 255 Leu
Gin lle Glu Gly 260 Thr Leu Lys Lys Ser 265 Leu Asp Phe Lys Asn 270 Asp lle
Asn Ala Glu 275 AiLa His Ser Trp Gly 280 Met Lys Asn Tyr Glu 285 Glu Trp Ala
Lys Asp 290 Leu Thr .Asp Ser Gin 295 Arg Glu Ala Leu A.sp 300 Gly Tyr Ala Arg
Gin 305 Asp Tyr Lys Glu lle 310 Asn .Asn Tyr Leu Arg 315 Asn Gin Gly Gly Ser 320
Gly Asn Glu Lys Leu 325 Asp Ala Gin lle Lys 330 Asn lle Ser Asp Ala 335 Leu
Gly Lys Lys Pro 340 lle Pro Glu Asn lle 345 Thr Val Tyr Arg Trp 350 Cys Gly
Met Pro Glu 355 Phe Gly Tyr Gin lle 360 Ser Asp Pro Leu Pro 365 Ser Leu Lys
Asp Phe 370 Glu Glu Gin Phe Leu 375 A.sn Thr lle Lys Glu 380 Asp Lys Gly Tyr
Met 385 Ser Thr Ser Leu Ser 390 Ser Glu Arg Leu Ala 395 Ala Phe Gly Ser Arg 400
Lys lle lle Leu Arg 405 Leu Gin Val Pro Lys 410 Gly Ser Thr Gly Ala 415 Tyr
Leu Ser Ala lle 420 Gly Gly Phe Ala Ser 425 Glu Lys Glu lle Leu 430 Leu Asp
Lys Asp Ser 435 Lys Tyr His lle Asp 440 Lys Val Thr Glu Val 445 ne lle Lys
189
Gly Val 4 50 Lys Arg Tyr Val Val 455 Asp Ala Thr Leu Leu 460 Thr Asn Met Lys
Asn 465 Met Lys Lys Lys Leu 470 Ala Ser Val Val Thr 475 Cys Thr Leu Leu Ala 480
Pro Met Phe Leu Asn 485 Gly Asn Val Asn Ala 4 90 Val Tyr Ala Asp Ser 495 Lys
Thr Asn Gin Ile 500 Ser Thr Thr Gin Lys 505 Asn Gin Gin Lys Glu 510 Met Asp
Arg Lys Gly 515 Leu Leu Gly Tyr Tyr 520 Phe Lys Gly Lys Asp 525 Phe Ser Asn
Leu Thr 530 Met Phe Ala Pro Thr 535 Arg Asp Ser Thr Leu 540 Ile Tyr Asp Gin
Gin 545 Thr Ala Asn Lys Leu 550 Leu Asp Lys Lys Gin 555 Gin Glu Tyr Gin Ser 560
Ile Arg Trp Ile Gly Leu Ile Gin Ser Lys Glu Thr Gly Asp Phe Thr
565 570 575
Phe Asn Leu Ser 580 Glu Asp Glu Gin Ala 585 Ile Ile Glu Ile A.sn 590 Gly Lys
Ile Ile Ser 595 Asn Lys Gly Lys Glu 600 Lys Gin Val Val His 605 Leu Glu Lys
Gly Lys 610 Leu Val Pro Ile Lys 615 Ile Glu Tyr Gin Ser 620 Asp Thr Lys Phe
Asn 625 Ile Asp Ser Lys Thr 630 Phe Lys Glu Leu Lys 635 Leu Phe Lys Ile Asp 640
Ser Gin Asn Gin Pro 645 Gin Gin Val Gin Gin 650 Asp Glu Leu Arg Asn 655 Pro
Glu Phe Asn Lys 660 Lys Glu Ser Gin Glu 665 Phe Leu Ala Lys Pro 670 Ser Lys
Ile Asn Leu 675 Phe Thr Gin Lys Met 680 Lys Arg Glu Ile Asp 685 Glu Asp Thr
Asp Thr 690 Asp Gly Asp Ser Ile 695 Pro Asp Leu Trp Glu 700 Glu Asn Gly Tyr
Thr 705 Ile Gin Asn Arg Ile 710 Ala Val Lys Trp Asp 715 Asp Ser Leu Ala Ser 720
Lys Gly Tyr Thr Lys Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val 725 730 735
190
Gly Asp Pro Tyr 740 Thr Asp Tyr Glu Lys 745 Ala Ala Arg Asp Leu 750 Asp Leu
Ser Asn Ala 755 Lys Glu Thr Phe Asn 760 Pro Leu Val Ala Ala 765 Phe Pro Ser
Val Asn 770 Val Ser Met Glu Lys 775 Val lle Leu Ser Pro 780 Asn Glu Asn Leu
Ser 785 Asn Ser Val Glu Ser 790 His Ser Ser Thr Asn 795 Trp Ser Tyr Thr Asn 800
Thr Glu Gly Ala Ser 805 Val Glu Ala Gly lle 810 Gly Pro Lys Gly lle 815 Ser
Phe Gly Val Ser 820 Val Asn Tyr Gin His 825 Ser Glu Thr Val Ala 830 Gin Glu
Trp Gly Thr 835 Ser Thr Gly Asn Thr 840 Ser Gin Phe Asn Thr 845 Ala Ser Ala
Gly Tyr 850 Leu Asn Ala Asn Val 855 Arg Tyr Asn Asn Val 860 Gly Thr Gly Ala
lle 865 Tyr Asp Val Lys Pro 870 Thr Thr Ser Phe Val 875 Leu Asn .Asn Asp Thr 880
lle AJa Thr lle Thr 885 Ala Lys Ser Asn Ser 890 Thr Ala Leu A.sn lle 895 Ser
Pro Gly Glu Ser 900 Tyr Pro Lys Lys Gly 905 Gin Asn Gly lle Ala 910 lle Thr
Ser Met Asp 915 Asp Phe Asn Ser His 920 Pro lle Thr Leu Asn 925 Lys Lys Gin
Val Asp 930 Asn Leu Leu Asn Asn 935 Lys Pro Met Met Leu 940 Glu Thr Asn Gin
Thr 945 Asp Gly Val Tyr Lys 950 lle Lys Asp Thr His 955 Gly Asn lle Val Thr 960
Gly Gly Glu Trp Asn 965 Gly Val lle Gin Gin 970 lle Lys A2La Lys Thr 975 Ala
Ser lle lle Val 980 Asp Asp Gly Glu A_rg 985 Val Ala Glu Lys Arg 990 Val Ala
Ala Lys Asp 995 Tyr Glu Asn Pro Glu 1000 Asp Lys Thr Pro Ser 1005 Leu Thr Leu
Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu lle Lys Glu lle Glu
1010 1015 1020
Gly Leu Leu Tyr Tyr Lys Asn Lys Pro lle Tyr Glu Ser Ser Val Met
191
1025 1030 1035 1040
Thr Tyr Leu Asp Glu A.sn Thr Ala Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn
1045 1050 1055
Asp Thr Thr Gly Lys Phe 1060 Lys Asp Val Ser His Leu Tyr 1065 Asp Val Lys 1070
Leu Thr Pro Lys 1075 Met Asn Val Thr Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp 1080 1085
Asn Ada Glu Ser 1090 A.sn Asp Asn Ser Ile Gly Lys Trp Thr 1095 1100 Asn Thr Asn
Ile Vel 1105 Ser Gly Gly Asn Asn Gly Lys Lys Gin Tyr Ser 1110 1115 Ser Asn Asn 1120
Pro Asp Ada A.sn Leu Thr 1125 Leu Asn Thr Asp Ala Gin Glu 1130 Lys Leu Asn 1135
Lys Asn Arg Asp Tyr Tyr 1140 Ile Ser Leu Tyr Met Lys Ser 1145 Glu Lys Asn 1150
Thr Gin Cys Glu 1155 Ile Thr Ile Asp Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr 1160 ” 1165
Lys Thr Val Asn 1170 Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu 1175 * 1180 Asp Ile Ile
Ala His 1185 Asn Ile Lys Ser Asn Pro Ile Ser Ser Leu His 1190 1195 Ile Lys Thr 1200
.Asn .Asp Glu Ile Thr Leu 1205 Phe Trp Asp Asp Ile Ser Ile 1210 Thr Asp Val 1215
Ada Ser Ile Lys 122C Pro Glu ) Asn Leu Thr Asp Ser Glu Ile 1225 Lys Gin Ile 1230
Tyr Ser Arg Tyr 1235 Gly Ile Lys Leu Glu Asp Gly Ile Leu 1240 1245 Ile Asp Lys
Lys Gly 125C Gly Ile 1 His Tyr Gly Glu Phe Ile Asn Glu Ala 1255 1260 Ser Phe Asn
Ile 1265 Glu 1 Pro Leu Gin Asn 1270 Tyr Val Thr Lys Tyr Glu Val 1275 Thr Tyr Ser 1280
Ser Glu Leu Gly Pro A.sn 1285 Val Ser Asp Thr Leu Glu Ser 1290 Asp Lys Ile 1295
Tyr Lys Asp Gly 1300 Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr 1305 Ser Lys Asn 1310
clu Gin Gly Leu 1315 Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn Trp Asp 1320 1325 Phe Lys Ile
192
Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr
1330 1335 1340
Asn Lys 1345
Informace o sekvenci SEQ ID č. 24:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1399 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost (B) lokace: 1..1386 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence proteinu VIP2A(a) z AB78 optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 24:
ATGAAGCGCA TGGAGGGCAA GCTGTTCATG GTGAGCAAGA AGCTCCAGGT GGTGACCAAG 60
ACCGTGCTGC TGAGCACCGT GTTCAGCATC AGCCTGCTGA ACAACGAGGT GATCAAGGCC 120
GAGCAGCTGA ACATCAACAG CCAGAGCAAG TACACCAACC TCCAGAACCT GAAGATCACC 180
GACAAGGTGG AGGACTTCAA GGAGGACAAG GAGAAGGCCA AGGAGTGGGG CAAGGAGAAG 240
GAGAAGGAGT GGAAGCTTAC CGCCACCGAG AAGGGCAAGA TGAACAACTT CCTGGACAAC 300
aagaacgaca TCAAGACCAA CTACAAGGAG ATCACCTTCA GCATGGCCGG CAGCTTCGAG 360
GACGAGATCA AGGACCTGAA GGAGATCGAC AAGATGTTCG ACAAGACCAA CCTGAGCAAC 420
AGCATCATCA CCTACAAGAA CGTGGAGCCC ACCACCATCG GCTTCAACAA GAGCCTGACC 480
GAGGGCAACA CCATCAACAG CGACGCCATG GCCCAGTTCA AGGAGCAGTT CCTGGACCGC 540
GACATCAAGT TCGACAGCTA CCTGGACACC CACCTGACCG CCCAGCAGGT GAGCAGCAAG 600
GAGCGCGTGA TCCTGAAGGT GACCGTCCCC AGCGGCAAGG GCAGCACCAC CCCCACCAAG 660
GCCGGCGTGA TCCTGAACAA CAGCGAGTAC AAGATGCTGA TCGACAACGG CTACATGGTG 720
CACGTGGACA AGGTGAGCAA GGTGGTGAAG AAGGGCGTGG AGTGCCTCCA GATCGAGGGC 780
ACCCTGAAGA AGAGTCTAGA CTTCAAGAAC GACATCAACG CCGAGGCCCA CAGCTGGGGC 840
193
ATGAAGAACT ACGAGGAGTG GGCCAAGGAC CTGACCGACA GCCAGCGCGA GGCCCTGGAC 900
GGCTACGCCC GCCAGGACTA CAAGGAGATC AACAACTACC TGCGCAACCA GGGCGGCAGC 960
GGCAACGAGA AGCTGGACGC CCAGATCAAG AACATCAGCG ACGCCCTGGG CAAGAAGCCC 1020
ATCCCCGAGA ACATCACCGT GTACCGCTGG TGCGGCATGC CCGAGTTCGG CTACCAGATC 1080
AGCGACCCCC TGCCCAGCCT GAAGGACTTC GAGGAGCAGT TCCTGAACAC CATCAAGGAG 1140
GACAAGGGCT ACATGAGCAC CAGCCTGAGC AGCGAGCGCC TGGCCGCCTT CGGCAGCCGC 1200
AAGATCATCC TGCGCCTGCA GGTGCCCAAG GGCAGCACCG GCGCCTACCT GAGCGCCATC 1260
GGCGGCTTCG CCAGCGAGAA GGAGATCCTG CTGGACAAGG ACAGCAAGTA CCACATCGAC 1320
AAGGTGACCG AGGTGATCAT CAAGGGCGTG AAGCGCTACG TGGTGGACGC CACCCTGCTG 1380
ACCAACTAGA TCTGAGCTC 1399
Informace o sekvenci SEQ ID č. 25:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 19 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: peptid (B) lokace: 1..19 (D) další informace: poznámka = sekreční signální peptid pro sekreci VIP2 z buňky (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 25:
Gly Trp Ser Trp lle Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ada Ala Gly Val 1 5 10 15
His Cys Leu
Informace o sekvenci SEQ ID č. 26:
(i) charakteristiky sekvence:
194 (A) délka: 2655 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A) popis: syntetická DNA
hypotetická: není
vlastnosti:
(A) jméno/klíč: různá vlastnost
(B) lokace : 1..2655
(D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIPlA(a) optimalizovaná pro kuku- rici
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 26:
ATGAAGAACA TGAAGAAGAA GCTGGCCAGC GTGGTGACCT GCACCCTGCT GGCCCCCATG 60
TTCCTGAACG GCAACGTGAA CGCCGTGTAC GCCGACAGCA AGACCAACCA GATCAGCACC 120
ACCCAGAAGA ACCAGCAGAA GGAGATGGAC CGCAAGGGCC TGCTGGGCTA CTACTTCAAG 180
GGCAAGGACT TCAGCAACCT GACCATGTTC GCCCCCACGC gtgacagcac CCTGATCTAC 240
GACCAGCAGA CCGCCAACAA GCTGCTGGAC AAGAAGCAGC AGGAGTACCA GAGCATCCGC 300
TGGATCGGCC TGATCCAGAG CAAGGAGACC GGCGACTTCA CCTTCAACCT GAGCGAGGAC 360
GAGGAGGCCA TCATCGAGAT CAACGGCAAG ATCATCAGCA ACAAGGGCAA GGAGAAGCAG 420
GTGGTGCACC TGGAGAAGGG CAAGCTGGTG CCCATCAAGA TCGAGTACCA GAGCGACACC 480
AAGTTCAACA TCGACAGCAA GACCTTCAAG GAGCTGAAGC TTTTCAAGAT CGACAGCCAG 540
AACCAGCCCC AGCAGGTGCA GCAGGACGAG CTGCGCAACC CCGAGTTCAA CAAGAAGGAG 600
AGCCAGGAGT TCCTGGCCAA GCCCAGCAAG ATCAACCTGT TCACCCAGCA GATGAAGCGC 660
GAGATCGACG AGGACACCGA CACCGACGGC GACAGCATCC CCGACCTGTG GGAGGAGAAC. 720
GGCTACACCA TCCAGAACCG CATCGCCGTG AAGTGGGACG ACAGCCTGGC TAGCAAGGGC 780
TACACCAAGT TCGTGAGCAA CCCCCTGGAG AGCCACACCG TGGGCGACCC CTACACCGAC 840
TACGAGAAGG CCGCCCGCGA CCTGGACCTG AGCAACGCCA AGGAGACCTT CAACCCCCTG 900
195
GTGGCCGCCT TCCCCAGCGT GAACGTGAGC ATGGAGAAGG TGATCCTGAG CCCCAACGAG 960
AACCTGAGCA ACAGCGTGGA GAGCCACTCG AGCACCAACT GGAGCTACAC CAACACCGAG 1020
GGCGCCAGCG TGGAGGCCGG CATCGGTCCC AAGGGCATCA GCTTCGGCGT GAGCGTGAAC 1080
TACCAGCACA GCGAGACCGT GGCCCAGGAG TGGGGCACCA GCACCGGCAA CACCAGCCAG 1140
TTC.AACACCG CCAGCGCCGG CTACCTGAAC GCCAACGTGC GCTACAACAA CGTGGGCACC 1200
GGCGCCATCT ACGACGTGAA GCCCACCACC AGCTTCGTGC TGAACAACGA CACCATCGCC 1260
ACCATCACCG CCAAGTCGAA TTCCACCGCC CTGAACATCA GCCCCGGCGA GAGCTACCCC 1320
AAGAAGGGCC AGAACGGCAT CGCCATCACC AGCATGGACG ACTTCAACAG CCACCCCATC 1380
ACCCTGAACA AGAAGCAGGT GGACAACCTG CTGAACAACA AGCCCATGAT GCTGGAGACC 1440
AACCAGACCG ACGGCGTCTA CAAGATCAAG GACACCCACG GCAACATCGT GACGGGCGGC 1500
GAGTGGAACG GCGTGATCCA GCAGATCAAG GCCAAGACCG CCAGCATCAT CGTCGACGAC 1560
GGCGAGCGCG TGGCCGAGAA GCGCGTGGCC GCCAAGGACT ACGAGAACCC CGAGGACAAG 1620
ACCCCCAGCC TGACCCTGAA GGACGCCCTG AAGCTGAGCT ACCCCGACGA GATCAAGGAG 1680
ATCGAGGGCT TGCTGTACTA CAAGAACAAG CCCATCTACG AGAGCAGCGT GATGACCTAT 1740
CTAGACGAGA ACACCGCCAA GGAGGTGACC AAGCAGCTGA ACGACACCAC CGGCAAGTTC 1800
AAGGACGTGA GCCACCTGTA CGACGTGAAG CTGACCCCCA AGATGAACGT GACGATCAAG 1860
CTGAGCATCC TGTACGACAA CGCCGAGAGC AACGACAACA GCATCGGCAA GTGGACGAAC 1920
ACCAACATCG TGAGCGGCGG CAACAACGGC AAGAAGCAGT ACAGGAGCAA GAACCCCGAC 1980
GCCAACCTGA CCCTGAACAC CGACGCCCAG GAGAAGCTGA ACAAGAACCG CGACTACTAC 2040
ATCAGCCTGT ACATGAAGAG CGAGAAGAAC ACCCAGTGCG AGATCACCAT CGACGGCGAG 2100
ATATACCCCA TCACCACCAA GACCGTGAAC GTGAACAAGG ACAACTACAA GCGCCTGGAC 2150
ATCATCGCCC ACAACATCAA GAGCAACCCC ATCAGCAGCC TGCACATCAA GACCAACGAC 2220
GAGATCACCC TGTTCTGGGA CGACATATCG ATTACCGACG TCGCCAGCAT GAAGCCCGAG 2280
AACCTGACCG ACAGCGAGAT CAAGCAGATA TACAGTCGCT ACGGCATCAA GCTGGAGGAC 2340
GGCATCCTGA TCGACAAGAA AGGCGGCATC CACTACGGCG AGTTCATCAA CGAGGCGAGC 2400
TTCAACATCG AGCCCCTGCA GAACTACGTG ACCAAGTACG AGGTGACCTA CAGCAGCGAG 2460
CTGGGCCCCA ACGTGAGCGA CACCCTGGAG AGCGACAAGA TTTACAAGGA CGGCACCATC 2520
AAGTTCGACT TCACCAAGTA CAGCAAGAAC GAGCAGGGCC TGTTCTACGA GAGCGGCCTG 2580
196
AACTGGGACT TCAAGATCAA CGCCATCACC TACGACGGCA AGGAGATGAA CGTGTTCCAC 2640
CGCTACAACA AGTAG 2655
Informace o sekvenci SEQ ID č. 27:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1389 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina
(A) popis: syntetická DNA
hypotetická: není
vlastnosti:
(A) jměno/klíč: různá vlastnost
(B) lokace : 1..1389
(D) další informace: poznámka = DNA-sekvence
kódující VIP2A(a) říci optimalizovaná pro kuku-
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 27:
ATGAAGCGCA TGGAGGGCAA GCTGTTCATG GTGAGCAAGA AGCTCCAGGT GGTGACCAAG 60
ACCGTGCTGC TGAGCACCGT GTTCAGCATC AGCCTGCTGA ACAACGAGGT GATCAAGGCC 120
GAGCAGCTGA ACATCAACAG CCAGAGCAAG TACACCAACC TCCAGAACCT GAAGATCACC 180
GACAAGGTGG AGGACTTCAA GGAGGACAAG GAGAAGGCCA AGGAGTGGGG CAAGGAGAAG 240
GAGAAGGAGT GGAAGCTTAC CGCCACCGAG AAGGGCAAGA TGAACAACTT CCTGGACAAC 300
AAGAACGACA TCAAGACCAA CTACAAGGAG ATCACCTTCA GCATAGCCGG CAGCTTCGAG 360
GACGAGATCA AGGACCTGAA GGAGATCGAC AAGATGTTCG ACAAGACCAA CCTGAGCAAC 420
AGCATCATCA CCTACAAGAA CGTGGAGCCC ACCACCATCG GCTTCAACAA GAGCCTGACC 480
GAGGGCAACA CCATCAACAG CGACGCCATG GCCCAGTTCA AGGAGCAGTT CCTGGACCGC 540
GACA.TCAAGT TCGACAGCTA CCTGGACACC CACCTGACCG CCCAGCAGGT GAGCAGCAAG 600
GAGCGCGTGA TCCTGAAGGT GACCGTCCCC AGCGGCAAGG GCAGCACCAC CCCCACCAAG 660
197
GCCGGCGTGA TCCTGAACAA cagcgagtac AAGATGCTGA TCGACAACGG CTACATGGTG 720
CACGTGGACA AGGTGAGCAA ggtggtgaag AAGGGCGTGG AGTGCCTCCA GATCGAGGGC 780
ACCCTGAAGA AGAGTCTAGA cttcaagaac GACATCAACG CCGAGGCCCA CAGCTGGGGC 840
ATGAAGAACT ACGAGGAGTG ggccaaggac CTGACCGACA GCCAGCGCGA GGCCCTGGAC 900
GGCTACGCCC GCCAGGACTA caaggagatc AACAACTACC TGCGCAACCA GGGCGGCAGC 960
GGCAACGAGA AGCTGGACGC ccagatcaag AACATCAGCG ACGCCCTGGG CAAGAAGCCC 1020
ATCCCCGAGA ACATCACCGT gtaccgctgg TGCGGCATGC CCGAGTTCGG CTACCAGATC 1080
AGCGACCCCC TGCCCAGCCT gaaggacttc GAGGAGCAGT TCCTGAACAC CATCAAGGAG 1140
GACAAGGGCT ACATGAGCAC CAGCCTGAGC AGCGAGCGCC TGGCCGCCTT CGGCAGCCGC 1200
AAGATCATCC TGCGCCTGCA GGTGCCCAAG GGCAGCACTG GTGCCTACCT GAGCGCCATC 1260
GGCGGCTTCG CCAGCGAGAA GGAGATCCTG CTGGATAAGG ACAGCAAGTA CCACATCGAC 1320
AAGGTGACCG aggtgatcat CAAGGGCGTG .AAGCGCTACG TGGTGGACGC CACCCTGCTG 1380
ACCAACTAG 1389
Informace o sekvenci SEQ ID č. 28:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2378 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..2375 (D) další informace: poznámka = nativní DNAsekvence kódující protein VIP3A(a) z AB88 jak je obsažena v pCIB7104
198 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 28:
AGATGAAC ATG AAC AAG AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA 50
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro
10
AGT TTT ATT GAT TAT TTT AAT Asn GGC ATT Gly Ile TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC 98
Ser Phe 15 Ile Asp Tyr Phe 20 Tyr Gly 25 Phe Ala Thr Gly Ile 30
AAA GAC ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACA GGT GGT GAT CTA 146
Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu
35 40 45
ACC CTA GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG TTA CTA AAT GAT ATT TCT 194
Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser
50 55 60
GGT AAA TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG 242
Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin
65 70 75
GGA AAC TTA AAT ACA GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT 290
Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn
80 85 90
GAA CAA AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA 338
Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile
95 100 105 110
AAT ACG ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT 386
Mn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser
115 120 125
GAT GTA ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CAA ATA GAA TAC TTA 434
Asp Val Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu
130 135 140
AGT AAA CAA TTG CAA eAG ATT TCT GAT AAG TTG GAT ATT ATT AAT GTA 482
Ser Lys Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val
145 150 155
AAT GTA CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CAA 530
Asn Val Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin
160 165 170
AGG ATT AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GAA TTA ACT TTT GCT ACA 578
Arg Ile Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr
175 180 185 190
GAA ACT AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CTT 626
Glu Thr Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu
195 200 205
199
GAT Asp GAG TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA AAT 674
Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn
210 215 220
GAT GTG GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG 722
Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met
225 230 235
GTA GGA AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA 770
Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu
240 245 250
TTA ATT ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT 818
Leu Ile Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn
255 260 265 270
GTT TAT AAC TTC TTA ATT GTA TTA ACA GCT CTG CAA GCC CAA GCT TTT 866
Val Tyr Asn Phe Leu Ile Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe
275 280 285
CTT ACT TTA ACA ACA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT 914
Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp
290 295 300
TAT ACT TCT ATT ATG AAT GAA CAT TTA AAT AAG GAA AAA GAG GAA TTT 962
Tyr Thr Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe
305 310 315
AGA GTA AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT 1010
Arg Val Asn Ile Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn
320 325 330
TAT GCA AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA 1058
Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met Ile Val Glu
335 340 345 350
GCT AAA CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA 1106
Ala Lys Pro Gly His Ala Leu Ile Gly Phe Glu Ile Ser Asn Asp Ser
355 360 365
ATT Ile ACA Thr GTA TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA 1154
Val Leu Lys Val. 370 Tyr Glu Ala 375 Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin 380
GTC GAT AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGT GAT ATG GAT AAA 1202
Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val Ile Tyr Gly Asp Met Asp Lys
385 390 395
TTA TTG TGC CCA GAT CAA TCT GAA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA 1250
Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin Ile Tyr Tyr Thr Asn A.sn Ile
400 405 410
GTA TTT CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA 1298
Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr Lys Ile Asp Phe Thr Lys Lys
415 420 425 430
- 200 -
ATG AAA ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT 1346
Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser
435 440 445
ACA GGA GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG 1394
Thr Gly Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala
450 455 460
GAG TAT AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA 1442
Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu
465 470 475
GGT GTC ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT CTC 1490
Gly Val Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu
480 485 490
CAA GCT GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT 1538
Gin Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr
495 500 505 510
TTA AGA GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA 1586
Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys
515 520 525
TTG ATC GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG A4C GoG 1634
Leu Ile Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly
530 535 540
TCC ATA GAA GAG GAC AAT TTA GAG CCG TGG AAA GCA AAT AAT AAG AAT 1682
Ser Ile Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn
545 550 555
GCG TAT GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT 1730
Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr
560 565 570
GTT CAT AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA 1778
Val His Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys
575 580 585 590
CCG AAA ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT 1826
Pro Lys Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser
595 600 605
ATT CAT TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA 1874
Ile His Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr
610 615 620
AAT AAT AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA 1922
Asn Asn Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr
625 630 635
201
GGA ACT Gly Thr GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA 1970
Mp Leu Lys Gly Val Tyr Leu 645 Ile Leu Lys 650 Ser Gin Asn Gly
640
GAT GAA GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT 2018
Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser
655 660 665 670
GAA AAG TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT 2066
Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser
675 680 685
ACG GGA TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA 2114
Thr Gly Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly
690 695 700
GGA CGA GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT 2162
Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr
705 710 715
TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA 2210
Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg
720 725 730
AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA 2258
Asn Ser Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys
735 740 745 750
GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTT TAT 2306
Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr
755 760 765
ATA GAG CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT 2354
Ile Glu Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His
770 775 780
TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG TAA 2378
Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys
785
Informace o sekvenci SEQ ID č. 29:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
202 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 29:
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe .5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
25 30 .
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu 35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys 50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly ?sn 65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin 85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr 100 105 110
Met Leu Arg 115 Val Tyr Leu Pro Lys 120 Ile Thr Ser Met Leu 125 Ser Asp Val
Met Lys 130 Gin Asn Tyr Ala Leu 135 Ser Leu Gin Ile Glu 140 Tyr Leu Ser Lys
Gin 145 Leu Gin Glu Ile Ser 150 Asp Lys Leu Asp Ile 155 Ile Asn Val Asn Val 160
Leu Ile Asn Ser Thr 165 Leu Thr Glu Ile Thr 170 Pro Ala Tyr Gin Arg 175 Ile
Lys Tyr Val Asn 180 Glu Lys Phe Glu Glu 185 Leu Thr Phe Ala Thr 190 Glu Thr
Ser Ser Lys 195 Val Lys Lys Asp Gly 200 Ser Pro Ala Asp Ile 205 Leu Asp Glu
Leu Thr 210 Glu Leu Thr Glu Leu 215 Ala Lys Ser Val Thr 220 Lys Asn Asp Val
Asp 225 Gly Phe Glu Phe Tyr 230 Leu Asn Thr Phe His 235 Asp Val Met Val Gly 240
Asn Asn Leu Phe Gly Arg 245 Ser Ala Leu Lys 250 Thr Ala Ser Glu Leu 255 Ile
Thr Lys Glu Asn 260 Val Lys Thr Ser Gly 265 Ser Glu Val Gly Asn 270 Val Tyr
203
Asn Phe Leu 275 lle Val Leu Thr Ala 280 Leu Gin Ala Gin Ala 285 Phe Leu Thr
Leu Thr 290 Thr Cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala Asp 300 lle Asp Tyr Thr
Ser 305 lle Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315 Glu Glu Phe Arg Val 320
Asn lle Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser Asn Pro Asn Tyr 335 Ala
Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met lle Val Glu 350 Ala Lys
Pro Gly His 355 Ala Leu lle Gly Phe 360 Glu lle Ser Asn Asp 365 Ser lle Thr
Val Leu 370 Lys Val Tyr Glu Ala 375 Lys Leu Lys Gin Asn 380 Tyr Gin Val Asp
Lvs 385 Asp Ser Leu Ser Glu 390 Val lle Tyr Gly Asp 395 Met Asp Lys Leu Leu 400
Cys Pro Asp Gin Ser 405 Glu Gin lle Tyr Tyr 410 Thr Asn Asn lle Val 415 Phe
Pro Asn Glu Tyr 420 Val lle Thr Lys lle 425 Asp Phe Thr Lys Lys 430 Met Lys
Thr Leu Arg 435 Tyr Glu Val Thr Ala 440 Asn Phe Tyr Asp Ser 445 Ser Thr Gly
Glu lle 450 Asp Leu Asn Lys Lys 455 Lys Val Glu Ser Ser 460 Glu Ala Glu Tyr
Arg 4 65 Thr Leu Ser Ala Asn 470 Asp Asp Gly Val Tyr 475 Met Pro Leu Gly Val 480
lle Ser Glu Thr Phe 485 Leu Thr Pro lle Asn 490 Gly Phe Gly Leu Gin 495 Ala
Asp Glu Asn Ser 500 Arg Leu lle Thr Leu 505 Thr Cys Lys Ser Tyr 510 Leu Arg
Glu Leu Leu 515 Leu Ala Thr Asp Leu 520 Ser Asn Lys Glu Thr 525 Lys Leu lle
Val Pro 530 Pro Ser Gly Phe lle 535 Ser Asn lle Val Glu 540 Asn Gly Ser lle
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn řsn Lys Asn Ala Tyr
545
550
555
560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ma Leu Tyr Val His 565 570 575
204
Lys Asp Gly Gly lle Ser Gin Phe lle Gly Asp Lys Leu Lys Pro 590 Lys
580 585
Thr Glu Tyr Val lle Gin 595 Tyr Thr Val 600 Lys Gly Lys Pro 605 Ser lle His
Leu Lys 610 Asp Glu Asn Thr Gly Tyr lle 615 His Tyr Glu 620 Asp Thr Asn Asn
Asn Leu 625 Glu Asp Tyr Gin 630 Thr lle Asn Lys Arg Phe 635 Thr Thr Gly Thr 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr 645 Leu lle Leu Lys 650 Ser Gin Asn Gly Asp 655 Glu
Ala Trp Gly Asp Asn Phe 660 lle lle Leu 665 Glu lle Ser Pro Ser Glu 670 Lys
Leu Leu Ser Pro Glu Leu 675 lle Asn Thr 680 Asn Asn Trp Thr 685 Ser Thr Gly
Ser Thr 690 Asn lle Ser Gly Asn Thr Leu 695 Thr Leu Tyr 700 Gin Gly Gly Arg
Gly lle 705 Leu Lys Gin Asn 710 Leu Gin Leu Asp Ser Phe 715 Ser Thr Tyr Arg 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser 725 Gly Asp Ada Asn 730 Val Arg lle Arg Asn 735 Ser
Arg Glu Val Leu Phe Glu 740 Lys Arg Tyr 745 Met Ser Gly Ala Lys Asp 750 Val
Ser Glu Met Phe Thr Thr 755 Lys Phe Glu 760 Lys Asp Asn Phe 765 Tyr lle Glu
Leu Ser 770 Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly 775 Pro lle 780 Val His Phe Tyr
Asp Val Ser lle Lys 785
Informace o sekvenci SEQ ID č. 30:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2403 párů hází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
205 (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/kl£č: různá vlastnost (B) lokace: 11..2389 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP3A(a) optimalizovaná pro kukuřici (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 30:
GGATCCACCA ATGAACATGA ACAAGAACAA CACCAAGCTG AGCACCCGCG CCCTGCCGAG 60
CTTCATCGAC TACTTCAACG GCATCTACGG CTTCGCCACC GGCATCAAGG ACATCATGAA 120
CATGATCTTC AAGACCGACA CCGGCGGCGA CCTGACCCTG GACGAGATCC TGAAGAACCA 180
GCAGCTGCTG AACGACATCA GCGGCAAGCT GGACGGCGTG AACGGCAGCC TGAACGACCT 240
GATCGCCCAG GGCAACCTGA ACACCGAGCT GAGCAAGGAG ATCCTTAAGA TCGCCAACGA 300
GCAGAACCAG GTGCTGAACG ACGTGAACAA CAAGCTGGAC GCCATCAACA CCATGCTGCG 360
CGTGTACCTG CCGAAGATCA CCAGCATGCT GAGCGACGTG ATGAAGCAGA ACTACGCCCT 420
GAGCCTGCAG ATCGAGTACC TGAGCAAGCA GCTGCAGGAG ATCAGCGACA AGCTGGACAT 480
CATCAACGTG AACGTCCTGA TCAACAGCAC CCTGACCGAG ATCACCCCGG CCTACCAGCG 540
CATCAAGTAC GTGAACGAGA AGTTCGAAGA GCTGACCTTC GCCACCGAGA CCAGCAGCAA 600
GGTGAAGAAG GACGGCAGCC CGGCCGACAT CCTGGACGAG CTGACCGAGC TGACCGAGCT 660
GGCCAAGAGC GTGACCAAGA ACGACGTGGA CGGCTTCGAG TTCTACCTGA ACACCTTCCA 720
CGACGTGATG GTGGGCAAČA ACCTGTTCGG CCGCAGCGCC CTGAAGACCG CCAGCGAGCT 780
GATCACCAAG GAGAACGTGA AGACCAGCGG CAGCGAGGTG GGCAACGTGT ACAACTTCCT 840
GATCGTGCTG ACCGCCCTGC AGGCCCAGGC CTTCCTGACC CTGACCACCT GTCGCAAGCT 900
GCTGGGCCTG GCCGACATCG ACTACACCAG CATCATGAAC GAGCACTTGA ACAAGGAGAA 960
206
GGAGGAGTTC CGCGTGAACA TCCTGCCGAC CCTGAGCAAC ACCTTCAGCA ACCCGAACTA 1020
CGCCAAGGTG AAGGGCAGCG ACGAGGACGC CAAGATGATC GTGGAGGCTA AGCCGGGCCA 1080
CGCGTTGATC GGCTTCGAGA TCAGCAACGA CAGCATCACC GTGCTGAAGG TGTACGAGGC 1140
CAAGCTGAAG CAGAACTACC AGGTGGACAA GGACAGCTTG AGCGAGGTGA TCTACGGCGA 1200
CATGGACAAG CTGCTGTGTC CGGACCAGAG CGAGCAAATC TACTACACCA ACAACATCGT 1260
GTTCCCGAAC GAGTACGTGA TCACCAAGAT CGACTTCACC AAGAAGATGA AGACCCTGCG 1320
CTACGAGGTG ACCGCCAACT TCTACGACAG CAGCACCGGC GAGATCGACC TGAACAAGAA 1380
GAAGGTGGAG AGCAGCGAGG CCGAGTACCG CACCCTGAGC GCGAACGACG ACGGCGTCTA 1440
CATGCCACTG GGCGTGATCA GCGAGACCTT CCTGACCCCG ATCAACGGCT TTGGCCTGCA 1500
GGCCGACGAG AACAGCCGCC TGATCACCCT GACCTGTAAG AGCTACCTGC GCGAGCTGCT 1560
GCTAGCCACC GACCTGAGCA ACAAGGAGAC CAAGCTGATC GTGCCACCGA GCGGCTTCAT 1620
CAGCAACATC GTGGAGAACG GCAGCATCGA GGAGGACAAC CTGGAGCCGT GGAAGGCCAA 1680
CAACAAGAAC GCCTACGTGG ACCACACCGG CGGCGTGAAC GGCACCAAGG CCCTGTACGT 1740
GCACAAGGAC GGCGGCATCA GCCAGTTCAT CGGCGACAAG CTGAAGCCGA AGACCGAGTA 1800
CGTGATCCAG TACACCGTGA AGGGCAAGCC ATCGATTCAC CTGAAGGACG AGAACACCGG 1860
CTACATCCAC TACGAGGACA CCAACAACAA CCTGGAGGAC TACCAGACCA TCAACAAGCG 1920
CTTCACCACC GGCACCGACC TGAAGGGCGT GTACCTGATC CTGAAGAGCC AGAACGGCGA 1980
CGAGGCCTGG GGCGACAACT TCATCATCCT GGAGATCAGC CCGAGCGAGA AGCTGCTGAG 2040
CCCGGAGCTG ATCAACACCA ACAACTGGAC CAGCACCGGC AGCACCAACA TCAGCGGCAA 2100
CACCCTGACC CTGTACCAGG GCGGCCGCGG CATCCTGAAG CAGAACCTGC AGCTGGACAG 2160
CTTCAGCACC TACCGCGTGT ACTTCAGCGT GAGCGGCGAC GCCAACGTGC GCATCCGCAA 2220
CAGCCGCGAG GTGCTGTTCG AGAAGAGGTA CATGAGCGGC GCCAAGGACG TGAGCGAGAT 2280
GTTCACCACC AAGTTCGAGA AGGACAACTT CTACATCGAG CTGAGCCAGG GCAACAACCT 2340
GTACGGCGGC CCGATCGTGC ACTTCTACGA CGTGAGCATC AAGTTAACGT AGAGCTCAGA 2400
TCT
2403
207
Informace o sekvenci SEQ ID č. 31:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2612 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: DNA (genomová) (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jměno/klič: CDS (B) lokace: 118..2484 (D) další informace: poznámka = nativní DNAsekvence kódující VIP3A(b) z AB424 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 31:
ATTGAAATTG ATAAAAAGTT ATGAGTGTTT AATAATCAGT AATTACCAAT AAAGAATTAA 60
GAATACAAGT TTACAAGAAA TAAGTGTTAC AAAAAATAGC TGAAAAGGAA GATGAAC 117
ATG AAC AAG Met Asn Lys 790 AAT AAT ACT AAA TTA AGC ACA AGA GCC TTA CCA AGT TTT Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe 165
Asn Asn
795 800 805
ATT GAT TAT TTC AAT GGC ATT TAT GGA TTT GCC ACT GGT ATC AAA GAC 213
lle Asp Tyr Phe Asn Gly lle Tyr Gly Phe Ala Thr Gly lle Lys Asp
810 815 820
ATT ATG AAC ATG ATT TTT AAA ACG GAT ACA GGT GGT GAT CTA ACC CTA 261
lle Met Asn Met lle Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
825 830 835
GAC GAA ATT TTA AAG AAT CAG CAG CTA CTA AAT GAT ATT TCT GGT AAA 309
Asp Glu lle Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp lle Ser Gly Lys
840 845 850
TTG GAT GGG GTG AAT GGA AGC TTA AAT GAT CTT ATC GCA CAG GGA AAC 357
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu lle Ala Gin Gly Asn
855 860 865
TTA AAT ACA GAA TTA TCT AAG GAA ATA TTA AAA ATT GCA AAT GAA CAA 405
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu lle Leu Lys lle Ala Asn Glu Gin
870 875 880 885
AAT CAA GTT TTA AAT GAT GTT AAT AAC AAA CTC GAT GCG ATA AAT ACG 453
208
Asn Gin Val Leu Asn 890 Asp Val Asn Asn Lys 895 Leu Asp Ala Ile Asn 900 Thr
ATG CTT CGG GTA TAT CTA CCT AAA ATT ACC TCT ATG TTG AGT GAT GTA 501
Met Leu Arg Val 905 Tyr Leu Pro Lys Ile 910 Thr Ser Met Leu Ser 915 Asp Val
ATG AAA CAA AAT TAT GCG CTA AGT CTG CM ATA GAA TAC TTA AGT AM 549
Met Lys Gin 920 Asn Tyr Ala Leu Ser 925 Leu Gin Ile Glu Tyr 930 Leu Ser Lys
CAA TTG CAA GAG ATT TCT GAT MG TTG GAT ATT ATT MT GTA MT GTA 597
Gin Leu 935 Gin Glu Ile Ser Asp 940 Lys Leu Asp Ile Ile 945 A.sn Val Asn Val
CTT ATT AAC TCT ACA CTT ACT GAA ATT ACA CCT GCG TAT CM AGG ATT 645
Leu 950 Ile Asn Ser Thr Leu 955 Thr Glu Ile Thr Pro 960 Ala Tyr Gin Arg Ile 965
AAA TAT GTG AAC GAA AAA TTT GAG GM TTA ACT TTT GCT ACA GM ACT 693
Lys Tyr Val Asn Glu 970 Lys Phe Glu Glu Leu 975 Thr Phe Ala Thr Glu 980 Thr
AGT TCA AAA GTA AAA AAG GAT GGC TCT CCT GCA GAT ATT CGT GAT GAG 741
Ser Ser Lys Val 985 Lys Lys Asp Gly Ser 990 Pro Ala Asp Ile Arg 995 Asp Glu
TTA ACT GAG TTA ACT GAA CTA GCG AAA AGT GTA ACA AAA MT GAT GTG 789
Leu Thr Glu 100C Leu 1 Thr Glu Leu Ala 1005 Lys Ser Val Thr Lys 101C Asn 1 Asp Val
GAT GGT TTT GAA TTT TAC CTT AAT ACA TTC CAC GAT GTA ATG GTA GGA 837
Asp Gly 1015 Phe Glu Phe Tyr Leu 1020 Asn Thr Phe His Asp 1025 Val Met Val Gly
AAT AAT TTA TTC GGG CGT TCA GCT TTA AAA ACT GCA TCG GAA TTA ATT 885
Asn 1030 Asn 1 Leu Phe Gly Arg 1035 Ser Ala Leu Lys Thr 1040 Ala Ser Glu Leu Ile 1045
ACT AAA GAA AAT GTG AAA ACA AGT GGC AGT GAG GTC GGA AAT GTT TAT 933
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
1050 1055 1060
AAC TTC Asn Phe CTA ATT GTA TTA ACA Thr GCT Ala CTG CAA GCA AAA GCT TTT CTT ACT 981
Leu Ile Val 1065 Leu Leu Gin 1070 Ala Lys Ma Phe Leu 1075 Thr
TTA ACA CCA TGC CGA AAA TTA TTA GGC TTA GCA GAT ATT GAT TAT ACT 1029
Leu Thr Pro Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp Ile Asp Tyr Thr
1080 1085 1090
TCT ATT ATG MT GAA CAT TTA MT MG GM AM GAG GM TTT AGA GTA 1077
Ser Ile Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
1095 1100 1105
209
AAC ATC CTC CCT ACA CTT TCT AAT ACT TTT TCT AAT CCT AAT TAT GCA 1125
Asn Ile Leu Pro 1110 Thr Leu Ser 1115 Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
1120 1125
AAA GTT AAA GGA AGT GAT GAA GAT GCA AAG ATG ATT GTG GAA GCT AAA 1173
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu 1130 Asp Ala Lys Met Ile 1135 Val Glu Ala Lys 1140
CCA GGA CAT GCA TTG ATT GGG TTT GAA ATT AGT AAT GAT TCA ATT ACA 1221
Pro Gly His Ala Leu 1145 Ile Gly Phe Glu Ile 1150 Ser Asn Asp Ser Ile Thr 1155
GTA TTA AAA GTA TAT GAG GCT AAG CTA AAA CAA AAT TAT CAA GTC GAT 1269
Val Leu Lys Val 1160 Tyr Glu Ala Lys Leu Lys 1165 Gin Asn Tyr Gin Val Asp 1170
AAG GAT TCC TTA TCG GAA GTT ATT TAT GGC GAT ATG GAT AAA TTA TTG 1317
Lys Asp Ser Leu 1175 Ser Glu Val Ile Tyr Gly 1180 Asp Met Asp Lys Leu Leu 1185
TGC CCA GAT CAA TCT GGA CAA ATC TAT TAT ACA AAT AAC ATA GTA TTT 1365
Cys Pro Asp Gin 1190 Ser Gly Gin 1195 Ile Tyr Tyr Thr Asn 1200 Asn Ile Val Phe 1205
CCA AAT GAA TAT GTA ATT ACT AAA ATT GAT TTC ACT AAA AAA ATG AAA 1413
Pro Asn Glu Tyr Val Ile Thr 1210 Lys Ile Asp Phe Thr 1215 Lys Lys Met Lys 1220
ACT TTA AGA TAT GAG GTA ACA GCG AAT TTT TAT GAT TCT TCT ACA GGA 1461
Thr Leu Arg Tyr Glu 1225 Val Thr Ala Asn Phe 1230 Tyr Asp Ser Ser Thr Gly 1235
GAA ATT GAC TTA AAT AAG AAA AAA GTA GAA TCA AGT GAA GCG GAG TAT 1509
Glu Ile Asp Leu 1240 Asn Lys Lys Lys Val Glu 1245 Ser Ser Glu Ala Glu Tyr 1250
AGA ACG TTA AGT GCT AAT GAT GAT GGG GTG TAT ATG CCG TTA GGT GTC 1557
Arg Thr Leu Ser 1255 Ala Asn Asp 126C Asp Gly Val 1 Tyr Met 1265 Pro Leu Gly Val
ATC AGT GAA ACA TTT TTG ACT CCG ATT AAT GGG TTT GGC CTC CAA GCT 1605
Ile Ser Glu Thr 1270 Phe Leu Thr 1275 Pro Ile Asn Gly Phe 1280 Gly Leu Gin Ala 1285
GAT GAA AAT TCA AGA TTA ATT ACT TTA ACA TGT AAA TCA TAT TTA AGA 1653
Asp Glu Asn Ser Arg 1290 Leu Ile Thr Leu Thr 1295 Cys Lys Ser Tyr Leu Arg 1300
GAA CTA CTG CTA GCA ACA GAC TTA AGC AAT AAA GAA ACT AAA TTG ATC 1701
Glu Leu Leu Leu 1305 Ala Thr Asp Leu Ser Asn 1310 Lys Glu Thr Lys Leu Ile 1315
GTC CCG CCA AGT GGT TTT ATT AGC AAT ATT GTA GAG AAC GGG TCC ATA 1749
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
1320 1325 1330
210
GAA Glu GAG Glu 133 GAC Asp 5 AAT Asn TTA GAG Leu Glu CCG TGG Pro Trp 1340 AAA GCA AAT Lys Ala Asn AAT AAG Asn Lys 1345 AAT Asn GCG TAT Ala Tyr 1797
GTA GAT CAT ACA GGC GGA GTG AAT GGA ACT AAA GCT TTA TAT GTT CAT 1845
Val Asp 1350 His Thr Gly Gly Val Asn 1355 Gly Thr Lys Ala Leu 1360 Tyr Val His 1365
AAG GAC GGA GGA ATT TCA CAA TTT ATT GGA GAT AAG TTA AAA CCG AAA 1893
Lys Asp Gly Gly Ile Ser 1370 Gin Phe Ile Gly Asp 1375 Lys Leu Lys Pro Lys 1380
ACT GAG TAT GTA ATC CAA TAT ACT GTT AAA GGA AAA CCT TCT ATT CAT 1941
Thr Glu Tyr Val Ile Gin 1385 Tyr Thr Val Lys Gly 1390 Lys Pro Ser Ile His 1395
TTA AAA GAT GAA AAT ACT GGA TAT ATT CAT TAT GAA GAT ACA AAT AAT 1989
Leu Lys Asp Glu 1400 Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr 1405 Glu Asp Thr 1410 Asn Asn
AAT TTA GAA GAT TAT CAA ACT ATT AAT AAA CGT TTT ACT ACA GGA ACT 2037
.Asn Leu Glu 1415 Asp Tyr Gin Thr Ile 1420 Asn Lys Arg Phe Thr 1425 Thr Gly Thr
GAT TTA AAG GGA GTG TAT TTA ATT TTA AAA AGT CAA AAT GGA GAT GAA 2085
.Asp Leu 1430 Lys Gly Val Tyr Leu Ile 1435 Leu Lys Ser Gin Asn 1440 Gly Asp Glu 1445
GCT TGG GGA GAT AAC TTT ATT ATT TTG GAA ATT AGT CCT TCT GAA AAG 2133
.Ala Trp Gly Asp Asn Phe 1450 Ile Ile Leu Glu Ile 1455 Ser Pro Ser Glu Lys 1460
TTA TTA AGT CCA GAA TTA ATT AAT ACA AAT AAT TGG ACG AGT ACG GGA 2181
Leu Leu Ser Pro Glu Leu 1465 Ile Asn Thr Asn Asn 1470 Trp Thr Ser Thr Gly 1475
TCA ACT AAT ATT AGC GGT AAT ACA CTC ACT CTT TAT CAG GGA GGA CGA 2229
Ser Thr Asn 148C Ile 1 Ser Gly Asn Thr 1485 Leu Thr Leu Tyr Gin 149C Gly 1 Gly Arg
GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT TTT TCA ACT TAT AGA 2277
Gly Ile 1495 Leu 1 Lys Gin Asn Leu Gin 1500 Leu Asp Ser Phe Ser 1505 Thr Tyr Arg
GTG TAT TTC TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA AGG ATT AGA AAT TCT 2325
Val 1510 Tyr 1 Phe Ser Val Ser 1515 Gly Asp Ala Asn Val 1520 Arg Ile Arg Asn Ser 1525
AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC GGT GCT AAA GAT GTT 2373
Arg Glu Val Leu Phe Glu 1530 Lys Arg Tyr Met Ser 1535 Gly Ala Lys Asp Val 1540
TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT AAC TTC TAT ATA GAG 2421
Ser Glu Mec Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
211
1545 1550 1555
CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT ATT GTA CAT TTT TAC Leu Ser Gin Gly .Asn A.sn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
1560 1565 1570
GAT GTC TCT ATT AAG TAAGATCGGG ATCTAATATT AACAGTTTTT AGAAGCTAAT Asp Val Ser Ile Lys
1575
TCTTGTATAA TGTCCTTGAT TATGGAAAAA CACAATTTTG TTTGCTAAGA TGTATATATA
GCTCACTCAT TAAAAGGCAA TCAAGCTT
Informace o sekvenci SEQ ID č. 32:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 789 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 32:
2469
2524
2584
2612
Met 1 .Asn Lys Asn Asn 5 Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala 10 Leu Pro Ser 15 Phe
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr A.sp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu Ile Ala Gin Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin
85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
212
Leu lle Asn Ser Thr 165 Leu Thr Glu lle Thr 170 Pro Ala Tyr Gin Arg 175 lle
Lys Tyr Val Asn 180 Glu Lys Phe Glu Glu 185 Leu Thr Phe Ada Thr 190 Glu Thr
Ser Ser Lys 195 Val Lys Lys Asp Gly 200 Ser Pro Ala Asp lle 205 Arg Asp Glu
Leu Thr 210 Glu Leu Thr Glu Leu 215 Ada Lys Ser Val Thr 220 Lys Asn Asp Val
Asp 225 Gly Phe Glu Phe Tyr 230 Leu Asn Thr Phe His 235 Asp Val Met Val Gly 240
Asn Asn Leu Phe Gly 245 Arg Ser Ada Leu Lys 250 Thr Ada Ser Glu Leu 255 lle
Thr Lys Glu Asn 260 Val Lys Thr Ser Gly 265 Ser Glu Val Gly Asn 270 Val Tyr
Asn Phe Leu 275 lle Val Leu Thr Ada 280 Leu Gin Ala Lys Ada 285 Phe Leu Thr
Leu Thr 290 Pro Cys Arg Lys Leu 295 Leu Gly Leu Ala Asp 300 lle Asp Tyr Thr
Ser 305 lle Met Asn Glu His 310 Leu Asn Lys Glu Lys 315 Glu Glu Phe Arg Val 320
Asn lle Leu Pro Thr 325 Leu Ser Asn Thr Phe 330 Ser Asn Pro Asn Tyr 335 Ala
Lys Val Lys Gly 340 Ser Asp Glu Asp Ala 345 Lys Met lle Val Glu 350 Ada Lys
Pro Gly His 355 Ada Leu lle Gly Phe 360 Glu lle Ser Asn Asp 365 Ser lle Thr
Val Leu 370 Lys Val Tyr Glu Ada 375 Lys Leu Lys Gin Asn 380 Tyr Gin Val Asp
Lys 385 Asp Ser Leu Ser Glu 390 Val lle Tyr Gly Asp 395 Met Asp Lys Leu Leu 400
Cys Pro Asp Gin Ser 405 Gly Gin lle Tyr Tyr 410 Thr Asn Asn lle Val 415 Phe
Pro Asn Glu Tyr 420 Val lle Thr Lys lle 425 Asp Phe Thr Lys Lys 430 Met Lys
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
213
Glu Ile Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
Ile Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro Ile Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu Ile Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu Ile
515 520 525
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Asn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lvs
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Aso Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lvs
660 665 670
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
214
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys
785
nformac e o se kvenci SEQ ID Č . 33 :
(i ) ch, arakter ist: iky sekven ce:
(A) dél ka: 30 párů b ází
(B) typ : nukleová ky selina
(C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: dopředný primer použitý pro vytvoření pCIB5526 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 33:
GGATCCACCA TGAAGACCAA CCAGATCAGC 30
Informace o sekvenci SEQ ID č. 34:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 15 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: zpětný primer použitý pro vytvoření pCIB5526 (iii) hypotetická: není
215 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 34:
AAGCTTCAGC TCCTT
Informace o sekvenci SEQ ID č. 35:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2576 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..2564 (D) další informace: poznámka = sekvence kódující VIPlA(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5526 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 35:
GATCCACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC ACC ACC CAG AAG AAC CAG CAG 50
Met Lys Thr Asn Gin Ile Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin
825 830 835
AAG GAG ATG GAC CGC AAG GGC CTG CTG GGC TAC TAC TTC AAG GGC AAG
Lys Glu Met Asp Arg 840 Lys Gly Leu Leu Gly 845 Tyr Tyr Phe Lys Gly 850 Lys
GAC TTC AGC AAC CTG ACC ATG TTC GCC CCC ACG CGT GAC AGC ACC CTG
Asp Phe Ser Asn 855 Leu Thr Met Phe Ala 860 Pro Thr Arg Asp Ser 865 Thr Leu
ATC TAC GAC CAG CAG ACC GCC AAC AAG CTG CTG GAC AAG AAG CAG GAG
Ile Tyr Asp 870 Gin Gin Thr Ala Asn 875 Lys Leu Leu Asp Lys 880 Lys Gin Gin
GAG TAC CAG AGC ATC CGC TGG ATC GGC CTG ATC CAG AGC AAG GAG ACC
Glu Tyr 885 Gin Ser Ile Arg Trp 890 Ile Gly Leu Ile Gin 895 Ser Lys Glu Thr
216
GGC Gly 900 GAC Asp TTC Phe ACC Thr TTC Phe AAC Asn 905 CTG Leu AGC GAG Ser Glu GAC GAG CAG GCC ATC ATC GAG Asp Glu Gin Ala Ile Ile Glu 910 915 290
ATC AAC GGC AAG ATC ATC AGC AAC AAG GGC AAG GAG AAG CAG GTG GTG 338
Ile Asn Gly Lys Ile 920 Ile Ser Asn Lys Gly Lys Glu Lys Gin Val Val 925 930
CAC CTG GAG AAG GGC AAG CTG GTG CCC ATC AAG ATC GAG TAC CAG AGC 386
His Leu Glu Lys 935 Gly Lys Leu Val Pro 940 Ile Lys Ile Glu Tyr Gin Ser 94 5
GAC ACC AAG TTC AAC ATC GAC AGC AAG ACC TTC AAG GAG CTG AAG CTT 4 34
Asp Thr Lys 950 Phe Asn Ile Asp Ser Lys 955 Thr Phe Lys Glu Leu Lys Leu 960
TTC AAG ATC GAC AGC CAG AAC CAG CCC CAG CAG GTG CAG CAG GAC GAG 482
Phe Lys 965 Ile Asp Ser Gin Asn 970 Gin Pro Gin Gin Val Gin Gin Asp Glu 975
CTG CGC AAC CCC GAG TTC AAC AAG AAG GAG AGC CAG GAG TTC CTG GCC 530
Leu 980 Arg Asn Pro Glu Phe 985 Asn Lys Lys Glu Ser Gin Glu Phe Leu Ala 990 995
AAG ccc AGC AAG ATC AAC CTG TTC ACC CAG CAG ATG AAG CGC GAG ATC 578
Lys Pro Ser Lys Ile Asn 1000 Leu Phe Thr Gin Gin Met Lys Arg Glu Ile 1005 1010
GAC GAG GAC ACC GAC ACC GAC GGC GAC AGC ATC CCC GAC CTG TGG GAG 626
Asp Glu Asp Thr Asp 1015 Thr Asp Gly Asp Ser Ile Pro Asp Leu Trp Glu 1020 * 1025
GAG AAC GGC TAC ACC ATC CAG AAC CGC ATC GCC GTG AAG TGG GAC GAC 674
Glu Asn Gly 103C Tyr ) Thr Ile Gin Asn Arg 1035 Ile Ala Val Lys Trp Asp Asp 1040
AGC CTG GCT AGC AAG GGC TAC ACC AAG TTC GTG AGC AAC CCC CTG GAG 722
Ser Leu 1045 Ala Ser Lys Gly Tyr 105C Thr Lys 1 Phe Val Ser Asn Pro Leu Glu 1055
AGu CAC ACC GTG GGC GAC CCC TAC ACC GAC TAC GAG AAG GCC GCC CGC 770
Ser 1060 His Thr Val Gly Asp 1065 Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu Lys Ala Ala Arg 1070 1075
GAC CTG GAC CTG AGC AAC GCC AAG GAG ACC TTC AAC CCC CTG GTG GCC 818
Asp Leu Asp Leu Ser 1080 Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn Pro Leu Val Ala 1085 1090
GCC TTC CCC AGC GTG AAC GTG AGC ATG GAG AAG GTG ATC CTG AGC CCC 866
Ala Phe Pro Ser 1095 Val Asn Val Ser Met 1100 Glu Lys Val Ile Leu Ser Pro 1105
AAC GAG AAC CTG AGC AAC AGC GTG GAG AGC CAC TCG AGC ACC AAC TGG 914
Asn Glu Asn Leu Ser Asn Ser Val Glu Ser His Ser Ser Thr Asn Trp
1110 1115 1120
217
AGC TAC ACC AAC ACC GAG GGC GCC AGC GTG GAG GCC GGC ATC GGT CCC Pro 962
Ser Tyr Thr Asn Thr Glu Gly Ala Ser Val Glu Ala Gly lle Gly
1125 1130 1135
AAG GGC ATC AGC TTC GGC GTG AGC GTG .AAC TAC CAG CAC AGC GAG ACC 1010
Lys Gly lle Ser Phe 1140 Gly Val Ser Val 1145 Asn Tyr Gin His Ser 1150 Glu Thr 1155
GTG GCC CAG GAG TGG GGC ACo AGC ACC GGC AAC ACC AGC CAG TTC AAC 1058
Val Ala Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr 1160 Gly Asn Thr Ser Gin 1165 Phe Asn 1170
ACC GCC AGC GCC GGC TAC CTG AAC GCC AAC GTG CGC TAC AAC AAC GTG 1106
Thr AGa Ser Ala Gly 1175 Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr A.sn Asn 1180 1185 Val
GGC ACC GGC GCC ATC TAC GAC GTG AAG CCC ACC ACC AGC TTC GTG CTG 1154
Gly Thr Gly ALLa lle 1190 Tyr Asp Val Lys 1195 Pro Thr Thr Ser Phe 1200 Val Leu
AAC AAC GAC ACC ATC GCC ACC ATC ACC GCC AAG TCG AAT TCC ACC GCC 1202
Asn Asn Asp Thr lle 1205 Ala Thr lle Thr 1210 Ala Lys Ser Asn Ser 1215 Thr Ala
CTG AAC ATC AGC CCC GGC GAG AGC TAC CCC AAG AAG GGC CAG AAC GGC 1250
Leu Asn lle Ser Pro 1220 Gly Glu Ser Tyr 1225 Pro Lys Lys Gly Gin 1230 Asn Gly 1235
ATC GCC ATC ACC AGC ATG GAC GAC TTC AAC AGC CAC CCC ATC ACC CTG 1298
lle Ala lle Thr Ser Met Asp Asp Phe 1240 Asn Ser His Pro lle 1245 Thr Leu 1250
AAC AAG AAG GAG GTG GAC AAC CTG CTG AAC AAC AAG CCC ATG ATG CTG 134 6
Asn Lys Lys Gin Val 1255 Asp Asn Leu Leu Asn Asn Lys Pro Met Met 1260 1265 Leu
GAG ACC AAC CAG ACC GAC GGC GTC TAC AAG ATC AAG GAC ACC CAC GGC 1394
Glu Thr Asn Gin Thr 1270 Asp Gly Val Tyr 1275 Lys lle Lys Asp Thr 1280 His Gly
AAC ATC GTG ACG GGC GGC GAG TGG AAC GGC GTG ATC CAG CAG ATC AAG 1442
Asn lle Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn 1285 1290 Gly Val lle Gin Gin 1295 lle Lys
GGC AAG ACC GCC AGC ATC ATC GTC GAC GAC GGC GAG CGC GTG GCC GAG 1490
Ala 1300 Lys Thr Ala Ser 1 lle lle Val Asp 1305 Asp Gly Glu Arg Val 1310 Ala Glu 1315
AAG CGC GTG GCC GCC AAG GAC TAC GAG AAC CCC GAG GAC AAG ACC CCC 1538
Lys Arg Val Ala Ala 1320 Lys Asp Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Lys 1325 Thr 1330 Pro
AGC CTG ACC CTG AAG GAC GCC CTG AAG CTG AGC TAC CCC GAC GAG ATC 1586
Ser Leu Thr Leu Lys Asp Ala Leu Lys Leu Ser Tyr Pro Asp Glu lle
1335 1340 1345
218
AAG Lys GAG Glu ATC GAG GGC Ile Glu Gly 1350 TTG Leu CTG Leu TAC TAC AAG AAC AAG CCC ATC TAC GAG 1634
Tyr Tyr Lys 1355 Asn Lys Pro Ile 1360 Tyr Glu
AGC AGC GTG ATG ACC TAT CTA GAC GAG AAC ACC GCC AAG GAG GTG ACC 1682
Ser Ser Val Met Thr 1365 Tyr Leu Asp Glu Asn 1370 Thr Ala Lys Glu 1375 Val Thr
AAG CAG CTG AAC GAC ACC ACC GGC AAG TTC AAG GAC GTG AGC CAC CTG 1730
Lys Gin 1380 Leu Asn Asp Thr Thr 1385 Gly Lys Phe Lys Asp 1390 Val Ser His Leu 1395
TAC GAC GTG AAG CTG ACC CCC AAG ATG AAC GTG ACC ATC AAG CTG AGC 1778
Tyr Asp Val Lys Leu Thr 1400 Pro Lys Met Asn Val Thr 1405 Ile Lys Leu Ser 1410
ATC CTG TAC GAC AAC GCC GAG AGC AAC GAC AAC AGC ATC GGC MG TGG 1826
Ile Leu Tyr Asp Asn 1415 Ala Glu Ser Asn Asp 1420 Asn Ser Ile Gly Lys 1425 Trp
ACC AAC ACC AAC ATC GTG AGC GGC GGC AAC AAC GGC MG AAG CAG TAC 1874
Thr Asn Thr Asn Ile 1430 Val Ser Gly Gly Asn 1435 Asn Gly Lys Lys 1440 Gin Tyr
AGC AGC AAC AAC CCC GAC GCC AAC CTG ACC CTG AAC ACC GAC GCC CAG 1922
Ser Ser Asn Asn Pro 1445 Asp Ala Asn Leu Thr 1450 Leu Asn Thr Asp 1455 Ala Gin
GAG AAG CTG AAC AAG AAC CGC GAC TAC TAC ATC AGC CTG TAC ATG AAG 1970
Glu Lys 1460 Leu Asn Lys Asn Arg 1465 Asp Tyr Tyr Ile Ser 1470 Leu Tyr Met Lys 1475
AGC GAG AAG AAC ACC CAG TGC GAG ATC ACC ATC GAC GGC GAG ATA TAC 2018
Ser Glu Lys Asn Thr Gin 1480 Cys Glu Ile Thr Ile Asp 1485 Gly Glu Ile Tyr 1490
CCC ATC ACC ACC AAG ACC GTG AAC GTG AAC AAG GAC AAC TAC AAG CGC 2066
Pro Ile Thr Thr Lys 1495 Thr Val Asn Val Asn 1500 Lys Asp Asn Tyr Lys 1505 Arg
CTG GAC ATC ATC GCC CAC AAC ATC AAG AGC AAC CCC ATC AGC AGC CTG 2114
Leu Asp Ile Ile Ala 1510 His Asn Ile Lys Ser 1515 Asn Pro Ile Ser 1520 Ser Leu
CAC ATC AAG ACC AAC GAC GAG ATC ACC CTG TTC TGG GAC GAC ATA TCG 2162
His Ile 1525 Lys Thr Asn Asp Glu 153C Ile Thr Leu 1 Phe Trp Asp Asp 1535 Ile Ser
ATT ACC GAC GTC GCC AGC ATC AAG CCC GAG AAC CTG ACC GAC AGC G4G 2210
Ile 154C Thr 1 Asp Val Ala Ser 1545 Ile 1 Lys Pro Glu Asn Leu 1550 Thr Asp Ser Glu 1555
ATC AAG CAG ATA TAC AGT CGC TAC GGC ATC AAG CTG GAG GAC GGC ATC 2258
Ile Lys Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys Leu Glu Asp Gly Ile
1560 1565 1570
219
CTG ATC GAC AAG AAA GGC GGC ATC lle CAC TAC GGC GAG TTC ATC AAC GAG His Tyr Gly Glu Phe lle Asn Glu 2306
Leu lle Asp Lys Lys Gly Gly 1575
1580 1585
GCC AGC TTC AAC ATC GAG CCC CTG CAG AAC TAC GTG ACC AAG TAC GAG 2354
Ala Ser Phe Asn lle Glu Pro 1590 Leu Gin Asn 1595 Tyr Val Thr Lys Tvr Glu 1600
GTG ACC TAC AGC AGC GAG CTG GGC CCC AAC GTG AGC GAC ACC CTG GAG 2402
Val Thr 160; Tyr Ser Ser Glu Leu Gly 1610 Pro Asn Val Ser Asp Thr Leu Glu 1615
AGC GAC .AAG ATT TAC AAG GAC GGC ACC ATC AAG TTC GAC TTC ACC AAG 2450
Ser 162C ř.sp ) Lys lle Tyr Lys Asp 1625 Gly Thr lle Lys Phe Asp Phe Thr Lys 1630 1635
TAC AGC .AAG AAC GAG CAG GGC CTG TTC TAC GAC AGC GGC CTG AAC TGG 2498
Tyr Ser Lys Asn Glu Gin Gly 1640 Leu Phe Tyr 1643 Asp Ser Gly Leu Asn Trp » 1650
GAC TTC AAG ATC AAC GCC ATC ACC TAC GAC GGC AAG GAG ATG AAC GTG 2546
Asp Phe Lys lle Asn Ada lle Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val
1655 1660 1665
TTC CAC CGC TAC AAC AAG TAGATCTGAG CT 2576
Phe His Arg Tyr Asn Lys
1670
Informace o sekvenci SEQ ID č. 36:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 852 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 36:
Met Lvs Thr Asn Gin lle Ser Thr Thr Gin Lys Asn Gin Gin Lys Glu
1 5 10 15
Met Asp Arg Lys Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Lys Gly Lys Asp Phe
20 25 30
Ssr Asn Leu Thr Met Phe Ala Pro Thr Arg Asp Ser Thr Leu lle Tyr
35 40 45
220
Asp Gin 50 Gin Thr Ala Asn Lys 55 Leu Leu Asp Lys Lys 60 Gin Gin Glu Tyr
Gin 65 Ser Ile Arg Trp Ile 70 Gly Leu Ile Gin Ser 75 Lys Glu Thr Gly Asp 80
Phe Thr Phe Asn Leu 85 Ser Glu Asp Glu Gin 90 Ala Ile Ile Glu Ile 95 Asn
Gly Lys Ile Ile 100 Ser Asn Lys Gly Lys 105 Glu Lys Gin Val Val 110 His Leu
Glu Lys Gly 115 Lys Leu Val Pro Ile 120 Lys Ile Glu Tyr Gin 125 Ser Asp Thr
Lys Phe 130 Asn Ile Asp Ser Lys 135 Thr Phe Lys Glu Leu 140 Lys Leu Phe Lys
Ile 14 5 Asp Ser Gin Asn Gin 150 Pro Gin Gin Val Gin 155 Gin Asp Glu Leu Arg 160
Asn Pro Glu Phe Asn 165 Lys Lys Glu Ser Gin 170 Glu Phe Leu Ala Lys 175 Pro
Ser Lys Ile Asn 180 Leu Phe Thr Gin Gin 185 Met Lys Arg Glu Ile 190 Asp Glu
Asp Thr Asp 195 Thr Asp Gly Asp Ser 200 Ile Pro Asp Leu Trp 205 Glu Glu Asn
Gly Tyr 210 Thr Ile Gin Asn Arg 215 Ile Ala Val Lys Trp 220 Asp Asp Ser Leu
Ala 225 Ser Lys Gly Tyr Thr 230 Lys Phe Val Ser Asn 235 Pro Leu Glu Ser His 240
Thr Val Gly Asp Pro 245 Tyr Thr Asp Tyr Glu 250 Lys Ala Ala Arg Asp 255 Leu
Asp Leu Ser Asn 260 Ala Lys Glu Thr Phe 265 Asn Pro Leu Val Ala 270 Ala Phe
Pro Ser Val 275 Asn Val Ser Met Glu 280 Lys Val Ile Leu Ser 285 Pro Asn Glu
Asn Leu 290 Ser Asn Ser Val Glu 295 Ser His Ser Ser Thr 300 Asn Trp Ser Tyr
Thr 305 A.sn Thr Glu Gly Ala 310 Ser Val Glu Ala Gly 315 Ile Gly Pro Lys Gly 320
Ile Ser Phe Gly Val 325 Ser Val Asn Tyr Gin 330 His Ser Glu Thr Val 335 Ala
Gin Glu Trp Gly Thr Ser Thr Gly Asn Thr Ser Gin Phe Asn Thr Ala
340 345 350
Ser Ala Gly Tyr Leu Asn Ala Asn Val Arg Tyr Asn Asn Val Gly Thr 355 360 365
221
Gly Ala 370 Ile Tyr Asp Val Lys 375 Pro Thr Thr Ser Phe 380 Val Leu Asn Asn
Asp 385 Thr Ile Ala Thr Ile 390 Thr Ala Lys Ser Asn 395 Ser Thr Ala Leu Asn 400
Ile Ser Pro Gly Glu 405 Ser Tyr Pro Lys Lys 410 Gly Gin Asn Gly Ile 415 Ala
Ile Thr Ser Met 420 Asp Asp Phe Asn Ser 425 His Pro Ile Thr Leu 430 Asn Lys
Lys Gin Val 435 Asp Asn Leu Leu Asn 440 Asn Lys Pro Met Met 445 Leu Glu Thr
Asn Gin 450 Thr Asp Gly Val Tyr 455 Lys Ile Lys Asp Thr 460 His Gly Asn Ile
Val 4 65 Thr Gly Gly Glu Trp 470 Asn Gly Val Ile Gin 475 Gin Ile Lys Ala Lys 480
Thr Ala Ser Ile Ile 485 Val Asp Asp Gly Glu 490 Arg Val Ala Glu Lvs 495 Arg
Val Ala Ala Lys 500 Asp Tyr Glu Asn Pro 505 Glu Asp Lys Thr Pro 510 Ser Leu
Thr Leu Lys 515 Asp ALLa Leu Lys Leu 520 Ser Tyr Pro Asp Glu 525 Ile Lys Glu
Ile Glu 530 Gly Leu Leu Tyr Tyr 535 Lys Asn Lys Pro Ile 540 Tyr Glu Ser Ser
Val 545 Met Thr Tyr Leu Asp 550 Glu Asn Thr AILa Lys 555 Glu Val Thr Lys Gin 560
Leu Asn Asp Thr Thr 565 Gly Lys Phe Lys Asp 570 Val Ser His Leu Tyr 575 Asp
Val Lys Leu Thr 580 Pro Lys Met Asn Val 585 Thr Ile Lys Leu Ser 590 Ilé Leu
Tyr Asp Asn 595 Ala Glu Ser Asn Asp 600 Asn Ser Ile Gly Lys 605 Trp Thr Asn
Thr Asn 610 Ile Val Ser Gly Gly 615 Asn Asn Gly Lys Lys 620 Gin Tyr Ser Ser
Asn 625 Asn Pro Asp Ala Asn 630 Leu Thr Leu Asn Thr 635 Asp Ala Gin Glu Lys 640
Leu Asn Lys Asn Arg 645 Asp Tyr Tyr Ile Ser 650 Leu Tyr Met Lys Ser 655 Glu
Lys Asn Thr Gin 660 Cys Glu Ile Thr Ile 665 Asp Gly Glu Ile Tyr 670 Pro Ile
Thr Thr Lys Thr Val Asn Val Asn Lys Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp
675 680 685
222
Ile Ile 690 Ala His Asn Ile Lys 695 Ser Asn Pro Ile Ser 700 Ser Leu His Ile
Lys 705 Thr Asn Asp Glu Ile 710 Thr Leu Phe Trp Asp 715 Asp Ile Ser Ile Thr 720
Asp Val Ala Ser Ile 725 Lys Pro Glu Asn Leu 730 Thr Asp Ser Glu Ile 735 Lys
Gin Ile Tyr Ser 740 Arg Tyr Gly Ile Lys 745 Leu Glu Asp Gly Ile 750 Leu Ile
Asp Lys Lys 755 Gly Gly Ile His Tyr 760 Gly Glu Phe Ile Asn 765 Glu Ala Ser
Phe Asn 770 Ile Glu Pro Leu Gin 775 Asn Tyr Val Thr Lys 780 Tyr Glu Val Thr
Tyr 785 Ser Ser Glu Leu Gly 790 Pro Asn Val Ser Asp 795 Thr Leu Glu Ser Aso 80*0
Lys Ile Tyr Lys Asp 80*5 Gly Thr Ile Lys Phe 810 Asp Phe Thr Lys Tyr 815 Ser
Lys Asn Glu Gin 820 Gly Leu Phe Tyr Asp 825 Ser Gly Leu Asn Trp 830 Asp Phe
Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His
835 840 845
Arg Tyr Asn Lys 850
Informace o sekvenci SEQ ID č. 37:
(i) charakteristiky sekvence: (A) délka: 32 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: dopředný primer použitý pro vytvoření pCIB5527 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 37:
GGATCCACCA TGCTGCAGAA CCTGAAGATC AC
223
Informace <
(i) (ii) (iii) (xi)
AAGCTTCCAC
Informace c (i) (ii) (iii) (ix) ) sekvenci SEQ ID č. 38:
charakteristiky sekvence ·.
(A) délka: 18 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: zpětný primer použitý pro vytvoření pCIB5527 hypotetická: není znázornění sekvence SEQ ID č. 38:
TCCTTCTC 18 sekvenci SEQ ID č. 39:
charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1241 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA hypotetická: není vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9..1238 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5527
224 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 39:
GATCCACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC ACC GAC AAG GTG GAG GAC TTC 50
Met Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe
855 860 865
AAG GAG GAC AAG GAG AAG GCC AAG GAG TGG GGC AAG GAG AAG GAG AAG 98
Lys Glu Asp Lys Glu 870 Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys
875 880
GAG TGG AAG CTT ACC GCC ACC GAG AAG GGC AAG ATG AAC AAC TTC CTG 146
Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu
885 890 895
GAC AAC AAG AAC GAC ATC AAG ACC AAC TAC AAG GAG ATC ACC mm/“' ul AGC 194
Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Ser
900 905 910
ATA GCC GGC AGC TTC GAG GAC GAG ATC AAG GAC CTG AAG GAG ATC GAC 242
Ile .Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp
915 920 925 930
AAG ATG TTC GAC A4G ACC AAC CTG AGC AAC AGC ATC ATC ACC TAC AAG 290
Lys Met Phe Asp Lys Thr A.sn Leu Ser A.sn Ser Ile Ile Thr Tyr Lys
935 940 945
AAC GTG GAG CCC ACC ACC ATC GGC TTC AAC AAG AGC CTG ACC GAG GGC 338
Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr Glu Gly
950 955 960
AAC ACC ATC AAC AGC GAC GCC ATG GCC CAG TTC AAG GAG CAG TTC CTG 386
A.sn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin Phe Leu
965 970 975
GAC CGC GAC ATC A4G TTC GAC AGC TAC CTG GAC ACC CAC CTG ACC GCC 434
A.sp Arg Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu Thr Ala
980 985 990
CAG CAG GTG AGC AGC AAG GAG CGC GTG ATC CTG AAG GTG ACC GTC CCC 482
Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val Thr Val Pro
995 1000 1005 1010
AGC GGC AAG GGC AGC ACC ACC CCC ACC AAG GCC GGC GTG ATC CTG AAC 530
Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val Ile Leu Asn
1015 1020 1025
AAC AGC GAG TAC AAG ATG CTG ATC GAC AAC GGC TAC ATG GTG CAC GTG 578
Asn Ser Glu Tyr Lys . Met Leu Ile Asp Asr. Gly Tyr i Met Val His Val
1030 1035 1040
225
GAC Asp AAG GTG AGC AAG Lys GTG Val GTG AAG AAG GGC GTG GAG TGC CTC CAG ATC 626
Lys Val Ser 1045 Val Lys Lys 1050 Gly Val Glu Cys Leu 1055 Gin Ile
GAG GGC ACC CTG AAG AAG AGT CTA GAC TTC AAG AAC GAC ATC AAC GCC 674
Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile Asn Ma
1060 1065 1070
GAG GCC CAC AGC TGG GGC ATG AAG AAC TAC GAG GAG TGG GCC AAG GAC 722
Glu Ala His Ser Trp Gly Mec Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp
1075 1080 1085 1090
CTG ACC GAC AGC GAG CGC GAG GCC CTG GAC GGC TAC GCC CGC CAG GAC 770
Leu Thr Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp
1091 1100 1105
TAC AAG GAG ATC AAC AAC TAC CTG CGC AAC CAG GGC GGC AGC GGC AAC 818
Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn
1110 1115 1120
GAG AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC ATC AGC GAC GCC CTG GGC AAG 866
Glu Lys Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys
1125 1130 1135
AAG CCC ATC CCC GAG AAC ATC ACC GTG TAC CGC TGG TGC GGC ATG CCC 914
Lys Pro Ile Pro Glu A.sn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro
1140 1145 1150
GAG TTC GGC TAC CAG ATC AGC GAC CCC CTG CCC AGC CTG AAG GAC TTC 962
Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe
1155 1160 1165 1170
GAG GAG GAG TTC CTG AAC ACC ATC AAG GAG GAC AAG GGC TAC ATG AGC 1010
Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser
1175 1180 1185
ACC AGC CTG AGC AGC GAG CGC CTG GCC GCC TTC GGC AGC CGC AAG ATC 1058
Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile
1190 1195 1200
ATC CTG CGC CTG CAG GTG CCC AAG GGC AGC ACT GGT GCC TAC CTG AGC 1106
Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser
1205 1210 1215
GCC ATC GGC GGC TTC GCC AGC GAG AAG GAG ATC CTG CTG GAT AAG GAC 1154
Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp
1220 1225 1230
AGC AAG TAC CAC ATC GAC AAG GTG ACC GAG GTG ATC ATC AAG GGC GTG 1202
Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys Gly Val
1235 1240 1245 1250
AAG CGC TAC GTG GTG GAC GCC ACC CTG CTG ACC AAC TAG 1241
Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
1255 1260
226
Informace o sekvenci SEQ ID č. 40:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 410 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein
(xi: ) znázornění sekvence SEQ ID č. 40 :
Met Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu
1 5 10 15
Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp
20 25 30
Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu Asp Asn
35 40 45
Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Ser Ile Ala
50 55 60
Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Lys Met
65 70 75 80
Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Val
85 90 95
Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr Glu Gly Asn Thr
100 105 110
Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin Phe Leu Asp Arg
115 120 125
Asp Ile Lys Phe A.sp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu Thr Ala Gin Gin
130 135 140
Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val Thr Val Pro Ser Gly
145 150 155 160
Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val Ile Leu Asn Asn Ser
165 170 175
Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met Val His Val Asp Lys
180 185 190
Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu Gin Ile Glu Gly
195 200 205
Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys A.sn Asp Ile Asn Ala Glu Ala
210 215 220
227
His 225 Ser Trp Gly Met Lys Asn 230 Tyr Glu Glu Trp 235 Ala Lys Asp Leu Thr 240
Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp Tyr Lys
245 250 255
Glu lle Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys
260 265 270
Leu Asp Ala Gin lle Lys Asn lle Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro
275 280 285
lle Pro Glu Asn lle Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe
290 295 300
Gly Tyr Gin lle Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu
305 310 315 320
Gin Phe Leu Asn Thr lle Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser
325 330 335
Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys lle lle Leu
340 345 350
Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala lle
355 360 365
Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu lle Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys
370 375 380
Tyr His lle Asp Lys Val Thr Glu Val lle lle Lys Gly Val Lys Arg
385 390 395 400
Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
405 410
Informace o sekvenci SEQ ID č. 41:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 72 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotid kódující eukaryotický sekreční signál použitý pro zkonstruování
228 pCIB5527 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 41:
GGATCCACCA TGGGCTGGAG CTGGATCTTC CTGTTCCTGC TGAGCGGCGC CGCGGGCGTG 60
CACTGCCTGC AG 72
Informace o sekvenci SEQ ID č. 42:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1241 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9 . .1238 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus a do které byl zařazen eukaryotický sekreční signál, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5528 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 42:
GATCCACC ATG CTG CAG AAC CTG AAG ATC ACC GAC AAG GTG GAG GAC TTC 50
Met Leu Gin Asn Leu Lys lle Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe
415 420
AAG Lys 425 GAG Glu GAC Asp AAG Lys GAG AAG GCC AAG GAG TGG GGC AAG GAG AAG GAG AAG 98
Glu Lys Ala Lys 430 Glu Trp Gly 435 Lys Glu Lys Glu Lys 440
GAG TGG AAG CTT ACC GCC ACC GAG AAG GGC AAG ATG AAC AAC TTC CTG 146
Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu
445 450 455
229
194
GAC AAC AAG AAC GAC ATC AAG ACC AAC TAC AAG GAG ATC ACC TTC AGC
Asp Asn Lys Asn 4 60 Asp Ile Lys Thr Asn 4 65 Tyr Lys Glu Ile Thr 470 Phe Ser
ATA GCC GGC AGC TTC GAG GAC GAG ATC AAG GAC CTG AAG GAG ATC GAC
Ile Ala Gly 475 Ser Phe Glu Asp Glu 480 Ile Lys Asp Leu Lys 485 Glu Ile Asp
AAG ATG TTC GAC AAG ACC AAC CTG AGC AAC AGC ATC ATC ACC TAC AAG
Lys Met 490 Phe Asp Lys Thr Asn 4 95 Leu Ser Asn Ser Ile 500 Ile Thr Tyr Lys
AAC GTG GAG CCC ACC ACC ATC GGC TTC AAC AAG AGC CTG ACC GAG GGC
Asn 505 Val Glu Pro Thr Thr 510 Ile Gly Phe Asn Lys 515 Ser Leu Thr Glu Gly 520
AAC ACC ATC AAC AGC GAC GCC ATG GCC CAG TTC AAG GAG CAG TTC CTG
Asn Thr Ile Asn Ser 525 Asp Ala Met Ala Gin 530 Phe Lys Glu Gin Phe 535 Leu
GAC CGC GAC ATC AAG TTC GAC AGC TAC CTG GAC ACC CAC CTG ACC GCC
Asp Arg Asp Ile 540 Lys Phe Asp Ser Tyr 545 Leu Asp Thr His Leu 550 Thr Ala
242
290
338
386
434
CAG CAG GTG AGC AGC AAG GAG CGC GTG ATC CTG AAG GTG ACC GTC CCC
Gin Gin Val 555 Ser Ser Lys Glu Arg 560 Val Ile Leu Lys Val 565 Thr Val Pro
AGC GGC AAG GGC AGC ACC ACC CCC ACC AAG GCC GGC GTG ATC CTG AAC
Ser Gly 570 Lys Gly Ser Thr Thr 575 Pro Thr Lys Ala Gly 580 Val Ile Leu Asn
AAC AGC GAG TAC AAG ATG CTG ATC GAC AAC GGC TAC ATG GTG CAC GTG
Asn 585 Ser Glu Tyr Lys Met 590 Leu Ile Asp Asn Gly 595 Tyr Met Val His Val 600
GAC AAG GTG AGC AAG GTG GTG AAG AAG GGC GTG GAG TGC CTC CAG ATC
Asp Lys Val Ser Lys 605 Val Val Lys Lys Gly 610 Val Glu Cys Leu Gin 615 Ile
GAG GGC ACC CTG AAG AAG AGT CTA GAC TTC AAG AAC GAC ATC AAC GCC
Glu Gly Thr Leu 620 Lys Lys Ser Leu Asp 625 Phe Lys Asn Asp Ile 630 Asn Ala
GAG GCC CAC AGC TGG GGC ATG AAG AAC TAC GAG GAG TGG GCC AAG GAC
Glu Ala His 635 Ser Trp Gly Met Lys 640 Asn Tyr Glu Glu Trp 645 Ala Lys Asp
CTG ACC GAC AGC CAG CGC GAG GCC CTG GAC GGC TAC GCC CGC CAG GAC
Leu Thr 650 Asp Ser Gin Arg Glu 655 Ala Leu Asp Gly Tyr 660 Ala Arg Gin Asp
TAC AAG GAG ATC AAC AAC TAC CTG CGC AAC CAG GGC GGC AGC GGC AAC
Tyr 665 Lys Glu Ile Asn Asn 670 Tyr Leu Arg Asn Gin 675 Gly Gly Ser Gly Asn 680
482
530
578
626
674
722
770
818
230
866
GAG AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC ATC AGC GAC GCC CTG GGC AAG Lys
Glu Lys Leu Asp Ala 685 Gin Ile Lys Asn Ile 690 Ser Asp Ala Leu Gly 695
AAG CCC ATC CCC GAG AAC ATC ACC GTG TAC CGC TGG TGC GGC ATG CCC
Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro
700 705 710
GAG TTC GGC TAC CAG ATC AGC GAC CCC CTG CCC AGC CTG AAG GAC TTC
Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe
715 720 725
GAG GAG CAG TTC CTG AAC ACC ATC AAG GAG GAC AAG GGC TAC ATG AGC
Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser
730 735 740
ACC AGC CTG AGC AGC GAG CGC CTG GCC GCC TTC GGC AGC CGC AAG ATC
Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile
745 750 755 760
ATC CTG CGC CTG CAG GTG CCC AAG GGC AGC ACT GGT GCC TAC CTG AGC
Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser
7 65 770 775
GCC ATC GGC GGC TTC GCC AGC GAG AAG GAG ATC CTG CTG GAT AAG GAC
Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp
780 785 790
AGC AAG TAC CAC ATC GAC AAG GTG ACC GAG GTG ATC ATC AAG GGC GTG
Ser Lys Tyr His Ile Asp Lys Val Thr Glu Val Ile Ile Lys Gly Val
795 800 805
AAG CGC TAC GTG GTG GAC GCC ACC CTG CTG ACC AAC TAG
Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn
810 815 820
914
962
1010
1058
1106
1154
1202
1241
Informace o sekvenci SEQ ID č. 43:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 410 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 43:
Met Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu 15 10 15
231
Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp
20 25 30
Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu Asp Asn
35 40 45
Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Ser Ile Ala
50 55 60
Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu Ile Asp Lys Met
65 70 75 80
PhS Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Val
85 90 95
Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr Glu Gly Asn Thr
100 105 110
Ile A.sn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin Phe Leu Asp Arg
115 120 125
Asp Ile Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu Thr Ala Gin Gin
130 135 140
Val Ser Ser Lys Glu Arg Val Ile Leu Lys Val Thr Val Pro Ser Gly
14 5 150 155 160
Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys AJ.a Gly Val Ile Leu Asn Asn Ser
165 170 175
Glu Tyr Lys Met Leu Ile Asp Asn Gly Tyr Met Val His Val Asp Lys
180 185 190
Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu Gin Ile Glu Gly
195 200 205
Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp Ile Asn Ala Glu Ala
210 215 220
His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr
225 230 235 240
Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg Gin Asp Tyr Lys
245 250 255
Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn Glu Lys
260 265 270
Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro
275 280 285
Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe 290 295 300
232
Gly 305 Tyr Gin Ile Ser Asp 310 Pro Leu Pro Ser Leu 315 Lys Asp Phe Glu Glu 320
Gin Phe Leu Asn Thr 325 Ile Lys Glu Asp Lys 330 Gly Tyr Met Ser Thr 335 Ser
Leu Ser Ser Glu 340 Arg Leu Ala Ala Phe 345 Gly Ser Arg Lys Ile 350 Ile Leu
Arg Leu Gin 355 Val Pro Lys Gly Ser 360 Thr Gly Ala Tyr Leu 365 Ser Ala Ile
Gly Gly 370 Phe Ala Ser Glu Lys 375 Glu Ile Leu Leu Asp 380 Lys Asp Ser Lys
Tyr 385 His Ile Asp Lys Val 390 Thr Glu Val Ile Ile 395 Lys Gly Val Lys Arg 400
Tyr Val Val Asp Ala 405 Thr Leu Leu Thr Asn 410
Informace o sekvenci SEQ ID č. 44:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 86 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: oligonukleotid kódující peptid způsobující cílení do vakuoly, použitý pro zkonstruování pCIB5533 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 44:
CCGCGGGCGT GCACTGCCTC AGCAGCAGCA GCTTCGCCGA CAGCAACCCC ATCCGCGTGA 60
CCGACCGCGC CGCCAGCACC CTGCAG 86
Informace o sekvenci SEQ ID č. 45:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 1358 párů bází (B) typ: nukleová kyselina
233 (C) počet řetězců: jednořetězcové (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 9 . .1355 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující VIP2A(a) ze které byl odstraněn sekreční signál mikroorganismu Bacillus a do které byl zařazen signál způsobující cílení do vakuoly, optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5533 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 45:
GATCCACC ATG GGC TGG AGC TGG ATC TTC CTG TTC CTG CTG AGC GGC GCC 50
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala 415 420
GCG GGC GTG Val CAC TGC CTC AGC AGC AGC AGC TTC GCC GAC AGC AAC CCC 98
Ala 425 Gly His Cys Leu 430 Ser Ser Ser Ser Phe 435 Ada Asp Ser Asn Pro 440
ATC CGC GTG ACC GAC CGS GCC GCC AGC ACC CTG CAG AAC CTG AAG ATC 146
Ile Arg Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Gin Asn Leu Lys Ile
445 450 455
ACC GAC AAG GTG GAG GAC TTC AAG CAG CAC AAG GAG AAG GCC AAG GAG 194
Thr Asp Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu
4 60 4 65 470
TGG GGC AAG GAG AAG GAG AAG GAG TGG AAG CTT ACC GCC ACC GAG AAG 242
Trp Gly Lys Glu Lys Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys
475 480 485
GGC AAG ATG AAC AAC TTC CTG GAC AAC AAG AAC GAC ATC AAG ACC AAC 290
Gly Lys Met Asn Asn Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn
4 90 495 500
TAC AAG GAG ATC ACC TTC AGC ATA GCC GGC AGC TTC GAG GAC GAG ATC 338
Tyr Lys Glu Ile Thr Phe Ser Ile Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile
505 510 515 520
AAG GAC CTG AAG GAG ATC CAC AAG ATG TTC GAC AAG ACC AAC CTG AGC 386
234
Lys Asp Leu Lys Glu 525 Ile Asp Lys Met Phe 530 Asp Lys Thr Asn Leu 535 Ser
ΆΑΟ AGC ATC ATC ACC TAC AAG AAC GTG GAG CCC ACC ACC ATC GGC TTC 434
Asn Ser Ile Ile 540 Thr Tyr Lys Asn Val 545 Glu Pro Thr Thr Ile 550 Gly Phe
AAO AAG AGC CTG ACC GAG GGC AAC ACC ATC AAC AGC GAC GCC ATG GCC 482
Asn Lys Ser 555 Leu Thr Glu Gly Asn 560 Thr Ile Asn Ser Asp 565 Ala Met Ala
CAG TTC AAG GAG CAG TTC CTG GAC CGC GAC ATC AAG TTC GAC AGC TAC 530
Gin Phe 570 Lys Glu Gin Phe Leu 575 Asp Arg Asp Ile Lys 580 Phe Asp Ser Tyr
CTG GAC ACC CAC CTG ACC GCC CAG CAG GTG AGC AGC AAG GAG CGC GTG 578
Leu 585 Asp Thr His Leu Thr 590 Ala Gin Gin Val Ser 595 Ser Lys Glu Arg Val 600
ATC CTG AAG GTG ACC GTC CCC AGC GGC AAG GGC AGC ACC ACC CCC ACC 626
Ile Leu Lys Val Thr 605 Val Pro Ser Gly Lys 610 Gly Ser Thr Thr Pro 615 Thr
AAS GCC GGC GTG ATC CTG AAC AAC AGC GAG TAC AAG ATG CTG ATC GAC 674
Lys Ala Gly Val 620 Ile Leu Asn Asn Ser 625 Glu Tyr Lys Met Leu 630 Ile Asp
AAO GGC TAC ATG GTG CAC GTG GAC AAG GTG AGC AAG GTG GTG AAG AAG 722
Asn Gly Tyr 635 Met Val His Val Asp 640 Lys Val Ser Lys Val 645 Val Lys Lys
GGC GTG GAG TGC CTC CAG ATC GAG GGC ACC CTG AAG AAG AGT CTA GAC 770
Gly Val 650 Glu Cys Leu Gin Ile 655 Glu Gly Thr Leu Lys 660 Lys Ser Leu Asp
TTC AAG AAC GAC ATC AAC GCC GAG GCC CAC AGC TGG GGC ATG AAG AAC 818
Phe Lys Asn Asp Ile Asn Ala Glu Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn
665 670 675 680
TAC GAG Tyr Glu GAG TGG GCC Glu Trp Ala 685 AAG Lys GAC CTG ACC Asp Leu Thr GAC AGC CAG CGC GAG GCC CTG 866
Asp 690 Ser Gin Arg Glu Ala 695 Leu
GAC GGC TAC GCC CGC CAG GAC TAC AAG GAG ATC AAC AAC TAC CTG CGC 914
Asp Gly Tyr Ais Arg Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg
700 705 710
AAC CAG Asn Gin GGC Gly 715 GGC Gly AGC GGC AAC GAG AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC 962
Ser Gly Asn Glu 720 Lys Leu Asp Ala Gin 725 Ile Lys Asn
ATC AGC GAC GCC CTG GGC AAG AAG CCC ATC CCC GAG AAC ATC ACC GTG 1010
Ile Ser Asp Ala Leu Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu Asn Ile Thr Val
730 735 740
235
TAC Tyr 745 CGC hzg TGG Trp TGC Cys GGC ATG CCC GAG TTC GGC TAC CAG ATC AGC GAC CCC 1058
Gly Met 750 Pro Glu Phe Gly Tyr 755 Gin Ile Ser Asp Pro 760
CTG CCC AGC CTG AAG GAC TTC GAG GAG CAG TTC CTG AAC ACC ATC AAG 1106
Leu Pro Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr Ile Lys
765 770 775
GAG GAC AAG GGC TAC ATG AGC ACC AGC CTG AGC AGC GAG CGC CTG GCC 1154
Glu Asp Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala
780 785 790
GCC TTC GGC AGC CGC AAG ATC ATC CTG CGC CTG CAG GTG CCC AAG GGC 1202
Ala Phe Gly Ser Arg Lys Ile Ile Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly
795 800 805
AGC ACT GGT GCC TAC CTG AGC GCC ATC GGC GGC TTC GCC AGC GAG AAG 1250
Ser Thr Gly Ala Tyr Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys
810 815 820
GAG ATC CTG CTG GAT AAG GAC AGC AAG TAC CAC ATC GAC .AAG GTG ACC 1298
Glu Ile Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His Ile .Asp Lys Val Thr
825 830 835 840
GAe GTG ATC ATC AAG oíoC GTG AAG CGC TAC GTG GTG GAC GCC ACC CTG 1346
Glu Val Ile Ile Lys Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ada Thr Leu
845 850 855
CTG ACC AAC TAG
Leu Thr Asn
Informace o sekvenci SEQ ID č. 46:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 449 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: protein (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 46:
Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly
1 5 10 15
Val His Cys Leu Ser Ser Ser Ser Phe Ala Asp Ser Asn Pro Ile Arg
20 25 30
Val Thr Asp Arg Ala Ala Ser Thr Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp
40 45
Lys Val Glu Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly 50 55 60
236
Lys 65 Glu Lys Glu Lys Glu 70 Trp Lys Leu Thr Ala 75 Thr Glu Lys Gly Lys 80
Met Asn Asn Phe Leu 85 Asp Asn Lys Asn Asp 90 Ile Lys Thr Asn Tyr 95 Lys
Glu Ile Thr Phe 100 Ser Ile Ala Gly Ser 105 Phe Glu Asp Glu Ile 110 Lys Asp
Leu Lys Glu 115 Ile Asp Lys Met Phe 120 Asp Lys Thr Asn Leu 125 Ser Asn Ser
Ile Ile 130 Thr Tyr Lys Asn Val 135 Glu Pro Thr Thr Ile 140 Gly Phe Asn Lys
Ser 145 Leu Thr Glu Gly Asn 150 Thr Ile Asn Ser Asp 155 Ala Met Ala Gin Phe 160
Lys Glu Gin Phe Leu 165 Asp Arg A.sp Ile Lys 170 Phe Asp Ser Tyr Leu 175 Asp
Thr His Leu Thr 180 Ala Gin Gin Val Ser 185 Ser Lys Glu Arg Val 190 Ile Leu
Lys Val Thr 195 Val Pro Ser Gly Lys 200 Gly Ser Thr Thr Pro 205 Thr Lys Ada
Gly Val 210 Ile Leu Asn Asn Ser 215 Glu Tyr Lys Met Leu 220 Ile Asp Asn Gly
Tyr 225 Met Val His Val Asp 230 Lys Val Ser Lys Val 235 Val Lys Lys Gly Val 240
Glu Cys Leu Gin Ile 245 Glu Gly Thr Leu Lys 250 Lys Ser Leu Asp Phe 255 Lys
Asn Asp Ile Asn 260 Ala Glu Ala His Ser 265 Trp Gly Met Lys Asn 270 Tyr Glu
Glu Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin Arg Glu Tkla Leu Asp Gly
275 280 285
Tyr Ala 290 Arg Gin Asp Tyr Lys 295 Glu Ile Asn Asn Tyr 300 Leu Arg Asn Gin
Gly Gly 305 Ser Gly Asn Glu 310 Lys Leu Asp Ala Gin 315 Ile Lys Asn Ile Ser 320
Asp Ala Leu Gly Lys 325 Lys Pro Ile Pro Glu 330 Asn Ile Thr Val Tyr 335 Arg
Trp Cys Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin Ile Ser Asp Pro Leu Pro
340 345 350
237
Ser Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr lle Lys Glu Asp
355 360 365
Lys Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe
370 375 380
Gly Ser Arg Lys lle lle Leu Arg Leu Gin Val Pro Lys Gly Ser Thr
385 390 395 400
Gly Ala Tyr Leu Ser Ala lle Gly Gly Phe Ala Ser Glu Lys Glu lle
405 410 415
Leu Leu Asp Lys Asp Ser Lys Tyr His lle Asp Lys Val Thr Glu Val
420 425 430
lle lle Lys Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr
435 440 445
Asn
Informace o sekvenci SEQ ID č. 47:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 16 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: peptid (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klič: peptid (B) lokace 1. . 16 (D) další informace: poznámka = linkerovy peptid pro fúzi VIPlA(a) a VIP2A(a) použitý pro zkonstruováni pCIB5533 (xi) znázorněni sekvence SEQ ID č. 47:
Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser 15 10 15
238
Informace o sekvenci SEQ ID č. 48:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 66 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: DNA kódující linkerový peptid použi tá pro zkonstruování pCIB5533 (iii) hypotetická: není (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 48:
CCCGGGCCTT CTACTCCCCC AACTCCCTCT CCTAGCACGC CTCCGACACC TAGCGATATC 60
GGATCC 66
Informace o sekvenci SEQ ID č. 49:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 4031 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární (ii) typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) popis: syntetická DNA (iii) hypotetická: není (ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS (B) lokace: 6..4019 (D) další informace: poznámka = DNA-sekvence kódující fúzní protein VIP2A(a) - VIPlA(a) optimalizovaná pro kukuřici, jak je obsažena v pCIB5531
239 (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 49:
GATCC ATG AAG CGC ATG GAG GGC AAG CTG TTC ATG GTG AGC AAG AAG 47
Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys
4 50 455 4 60
CTC CAG GTG GTG ACC AAG ACC GTG CTG : CTG ; AGC ACC GTG TTC AGC ATC 95
Leu Gin 465 Val Val Thr Lys Thr 470 Val Leu Leu Ser Thr 475 Val Phe Ser lle
AGC CTG CTG AAC AAC GAG GTG ATC AAG GCC GAG CAG CTG AAC ATC AAC 143
Ser 480 Leu Leu Asn Asn Glu 485 Val lle Lys Ala Glu 4 90 Gin Leu Asn lle .Asn 495
AGC CAG AGC AAG TAC ACC AAC CTC CAG AAC CTG AAG ATC ACC GAC AAG 191
Ser Gin Ser Lys Tyr 500 Thr Asn Leu Gin Asn 505 Leu Lys lle Thr Asp 510 Lys
GTG GAG GAC TTC AAG GAG GAC AAG GAG AAG GCC AAG GAG TGG GGC AAG 239
Val Glu Asp Phe 515 Lys Glu Asp Lys Glu 520 Lys Ala Lys Glu Trp 525 Gly Lys
GAG AAG GAG AAG GAG TGG AAG CTT ACC GCC ACC GAG AAG GGC AAG ATG 287
Glu Lys Glu 530 Lys Glu Trp Lys Leu 535 Thr Ala Thr Glu Lys 540 Gly Lys Met
AAC AAC TTC CTG GAC AAC AAG AAC GAC ATC AAG ACC AAC TAC AAG GAG 335
Asn Asn 545 Phe Leu Asp Asn Lys 550 Asn Asp lle Lys Thr 555 Asn Tyr Lys Glu
ATC ACC TTC AGC ATA GCC OKtC AGC TTC GAG GAC GAG ATC AAG GAC CTG 383
lle 560 Thr Phe Ser lle Ala 565 Gly Ser Phe Glu Asp 570 Glu lle Lys Asp Leu 575
AAG GAG ATC GAC AAG ATG TTC GAC AAG ACC AAC CTG AGC AAC AGC ATC 431
Lys Glu lle Asp Lys 580 Met Phe Aap Lys Thr 585 Asn Leu Ser A^n Ser 590 lle
ATC ACC TAC AAG AAC GTG GAG CCC ACC ACC ATC GGC TTC AAC AAG AGC 479
lle Thr Tyr Lys 595 Asn Val Glu Pro Thr 600 Thr lle Gly Phe Asn 605 Lys Ser
CTG ACC GAG GGC AAC ACC ATC AAC AGC GAC GCC ATG GCC CAG TTC AAG 527
Leu Thr Glu 610 Gly Asn Thr lle A.sn 615 Ser Asp Ala Met Ala 620 Gin Phe Lys
GAG CAG TTC CTG GAC CGC GAC ATC AAG TTC GAC AGC TAC CTG GAC ACC 575
Glu Gin 625 Phe Leu Asp .Arg Asp 630 lle Lys Phe Asp Ser 635 Tyr Leu Asp Thr
CAC CTG ACC GCC CAG CAG GTG AGC AGC AAG GAG CGC GTG ATC CTG AAG 623
His 640 Leu Thr Ala Gin Gin 645 Val Ser Ser Lys Glu 650 Arg Val lle Leu Lys 655
GTG ACC GTC CCC AGC GGC AAG GGC AGC ACC ACC CCC . ACC AAG GCC GGC 671
Val Thr Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly
660 665 670
240
GTG : ATC : CTG ; AAC AAC AGC GAG TAC AAG ; ATG 1 CTG ATC GAC AAC GGC : TAC 719
Val Ile Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys 675 680 Met Leu Ile Asp Asn 685 Gly Tyr
ATG GTG CAC GTG GAC AAG GTG AGC AAG GTG GTG AAG AAG GGC GTG GAG 767
Met Val His 690 Val Asp Lys Val Ser Lys 695 Val Val Lys Lys 700 Gly Val Glu
TGC CTC CAG ATC GAG GGC ACC CTG AAG AAG AGT CTA GAC TTC AAG MC 815
Cys Leu 705 Gin Ile Glu Gly Thr Leu Lys 710 Lys Ser Leu 715 Asp Phe Lys Asn
GAC ATC AAC GCC GAG GCC CAC AGC TGG GGC ATG AAG AAC TAC GAG GAG 863
Asp 720 Ile Asn Ala Glu Ala His Ser Trp 725 Gly Met Lys 730 Asn Tyr Glu Glu 735
TGG GCC AAG GAC CTG ACC GAC AGC CAG CGC GAG GCC CTG GAC GGC TAC 911
Trp Ala Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin 740 Arg 745 Glu Ala Leu Asp Gly 750 Tyr
GCC CGC CAG GAC TAC AAG GAG ATC AAC AAC TAC CTG CGC AAC CAG GGC 959
Ala Arg Gin Asp Tyr Lys Glu Ile Asn 755 760 Asn Tyr Leu Arg Asn 765 Gin Gly
GGC AGC GGC AAC GAG AAG CTG GAC GCC CAG ATC AAG AAC ATC AGC GAC 1007
Gly Ser Gly 770 Asn Glu Lys Leu Asp Ala 775 Gin Ile Lys Asn 780 Ile Ser Asp
GCC CTG GGC AAG AAG CCC ATC CCC GAG AAC ATC ACC GTG TAC CGC TGG 1055
Ala Leu 785 Gly Lys Lys Pro Ile Pro Glu 790 Asn Ile Thr 795 Val Tyr Arg Trp
TGC GGC ATG CCC GAG TTC GGC TAC CAG ATC AGC GAC CCC CTG CCC AGC 1103
Cys 800 Gly Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin 805 Ile Ser Asp 810 Pro Leu Pro Ser 815
CTG AAG GAC TTC GAG GAG CAG TTC CTG AAC ACC ATC AAG GAG GAC AAG 1151
Leu Lys Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu 820 Asn 825 Thr Ile Lys Glu Asp 830 Lys
GGC TAC ATG AGC ACC AGC CTG AGC AGC GAG CGC CTG GCC GCC TTC GGC 1199
Gly Tyr Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser 835 840 Glu Arg Leu Ala Ala 845 Phe Gly
AGC CGC AAG ATC ATC CTG CGC CTG CAG GTG CCC AAG GGC AGC ACŤ GGT 1247
Ser Arg Lys 850 Ile Ile Leu Arg Leu Gin 855 Val Pro Lys Gly 860 Ser Thr Gly
GCC TAC CTG AGC GCC ATC GGC GGC TTC GCC AGC GAG AAG GAG ATC CTG 1295
Ala Tyr 865 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Phe 870 Ala Ser Glu 875 Lys Glu Ile Leu
CTG GAT AAG GAC AGC AAG TAC CAC ATC < GAC . AAG GTG ACC GAG ’ GTG , ATC 1343
Leu Asp Lys . Asp Ser Lys Tyr His Ile . Asp Lys Val Thr Glu Val Ile
880 885 890 895
241
1391
ATC AAG Ile Lys GGC GTG Gly Val AAG CGC TAC GTG GTG GAC GCC ACC CTG CTG ACC Thr 910 AAC Asn
Lys 900 Arg Tyr Val Val Asp 905 Ala Thr Leu Leu
TCC CGG GGG CCT TCT ACT CCC CCA ACT CCC TCT CCT AGC ACG CCT CCG
Ser Arg Gly Pro 915 Ser Thr Pro Pro Thr 920 Pro Ser Pro Ser Thr 925 Pro Pro
ACA CCT AGC GAT ATC GGA TCC ACC ATG AAG ACC AAC CAG ATC AGC ACC
Thr Pro Ser Asp 930 Ile Gly Ser Thr 935 Met Lys Thr Asn Gin 940 Ile Ser Thr
ACC CAG AAG AAC CAG CAG AAG GAG ATG GAC CGC AAG GGC CTG CTG GGC
Thr Gin 945 Lys Asn Gin Gin Lys 950 Glu Met Asp Arg Lys 955 Gly Leu Leu Gly
TAC TAC TTC AAG GGC AAG GAC TTC AGC A4C CTG ACC ATG TTC GCC CCC
Tyr Tyr 960 Phe Lys Gly Lys 965 Asp Phe Ser Asn Leu 970 Thr Met Phe Ala Pro 975
ACG CGT GAC AGC ACC CTG ATC TAC GAC CAG CAG ACC GCC AAC AAG CTG
Thr Arg Asp Ser Thr 980 Leu Ile Tyr Asp Gin 985 Gin Thr Ala Asn Lys 990 Leu
CTG GAC AAG AAG CAG CAG GAG TAC CAG AGC ATC CGC TGG ATC GGC CTG
Leu Asp Lys Lys 995 Gin Gin Glu Tyr Gin Ser 1000 Ile Arg Trp Ile Gly 1005 Leu
ATC CAG AGC AAG GAG ACC GGC GAC TTC ACC TTC AAC CTG AGC GAG GAC
Ile Gin Ser Lys 1010 Glu Thr Gly Asp Phe 1015 Thr Phe Asn Leu Ser 1020 Glu Asp
GAG CAG GCC ATC ATC GAG ATC AAC GGC AAG ATC ATC AGC AAC A3G GGC
Glu Gin Ala Ile 1025 Ile Glu Ile Asn 1030 Gly Lys Ile Ile Ser 1035 Asn Lys Gly
AAG GAG AAG CAG GTG GTG CAC CTG GAG AAG GGC AAG CTG GTG CCC ATC
Lys Glu 1040 Lys Gin Val Val His 1045 Leu Glu Lys Gly Lys 1050 Leu Val Pro Ile 1055
ΑΑΞ ATC GAG TAC CAG AGC GAC ACC AAG TTC AAC ATC GAC AGC AAG ACC
Lys Ile Glu Tyr Gin Ser 1060 Asp Thr Lys Phe Asn 1065 Ile Asp Ser Lys 107C Thr 1
TTC AAG GAG CTG AAG CTT TTC AAG ATC GAC AGC CAG AAC CAG CCC CAG
Phe Lys Glu Leu Lys 1075 Leu Phe Lys Ile 108C Asp ) Ser Gin Asn Gin 1085 Pro Gin
CAG GTG CAG CAG GAC GAG CTG CGC AAC CCC GAG TTC AAC AAG AAG GAG
Gin Val Gin Gin 1090 Asp Glu Leu Arg 1095 Asn Pro Glu Phe Asn 110C Lys 1 Lys Glu
AGC CAG GAG TTC CTG GCC AAG CCC AGC AAG ATC AAC CTG TTC ACC CAG
Ser Gin 1105 Glu Phe ) Leu Ala Lys nic Pro 1 Ser Lys Ile Asn 1115 Leu 1 Phe Thr Gin
1439
1487
1535
1583
1631
1679
1727
1775
1823
1871
1919
1967
2015
242
2063
CAG ATG Gin Met 1120 AAG CGC GAG Lys Arg Glu ATC GAC GAG GAC ACC GAC ACC GAC GGC GAC AGC Ile Asp Glu Asp Thr A*sp Thr Asp Gly Asp Ser
1125 1130 1135
ATC CCC GAC CTG TGG GAG GAG AAC GGC TAC ACC ATC CAG AAC CGC ATC
Ile Pro Asp Leu Trp Glu Glu Asn Gly 1140 Tyr Thr Ile 1145 Gin Asn Arg Ile 1150
GCC GTG AAG TGG GAC GAC AGC CTG GCT AGC AAG GGC TAC ACC AAG TTC
Ala Val Lys Trp Asp 1155 Asp Ser Leu Ala Ser Lys Gly 1160 Tyr Thr Lys Phe 1165
GTG AGC AAC CCC CTG GAG AGC CAC ACC GTG GGC GAC CCC TAC ACC GAC
Val Ser Asn Pro Leu 1170 Glu Ser His Thr 1175 Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp 1180
TAC GAG AAG GCC GCC CGC GAC CTG GAC CTG AGC AAC GCC AAG GAG ACC
Tyr Glu Lys Ala Ala 1185 Arg Asp Leu Asp 1190 Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr 1195
TTC AAC CCC CTG GTG GCC GCC TTC CCC AGC GTG AAC GTG AGC ATG GAG
Phe A.sn 1200 Pro Leu Val Ala Ala Phe Pro 1205 Ser Val Asn 1210 Val Ser Met Glu 1215
AAG GTG ATC CTG AGC CCC AAC GAG AAC CTG AGC AAC AGC GTG GAG AGC
Lys Val Ile Leu Ser Pro Asn Glu Asn 1220 Leu Ser Asn 1225 Ser Val Glu Ser 1230
CAC TCG AGC ACC AA.C TGG AGC TAC ACC AAC ACC GAG GGC GCC AGC GTG
His Ser Ser Thr Asn 1235 Trp Ser Tyr Thr Asn Thr Glu 1240 Gly Ala Ser Val 1245
GAG GCC GGC ATC GGT CCC AAG GGC ATC AGC TTC GGC GTG AGC GTG AAC
Glu Ala Gly Ile Gly 1250 Pro Lys Gly Ile 1255 Ser Phe Gly Val Ser Val Asn 1260
TAC CAG CAC AGC GAG ACC GTG GCC CAG GAG TGG GGC ACC AGC ACC GGC
Tyr Gin 1265 His Ser Glu 1 Thr Val Ala Gin 1270 Glu Trp Gly 1275 Thr Ser Thr Gly
AAC ACC AGC CAG TTC AAC ACC GCC AGC GCC GGC TAC CTG AAC GCC AAC
Asn Thr 1280 Ser Gin Phe Asn Thr Ala Ser 1285 Ala Gly Tyr 1290 Leu Asn Ala Asn ' 1295
GTG CGC TAC AAC AAC GTG GGC ACC GGC GCC ATC TAC GAC GTG AAG CCC
Val Arg Tyr Asn Asn 1300 Val Gly Thr Gly Ala Ile Tyr Asp Val Lys Pro 1305 1310
ACC ACC AGC TTC GTG CTG AAC AAC GAC ACC ATC GCC ACC ATC ACC GCC
Thr Thr Ser Phe Val Leu Asn Asn Asp Thr Ile Ala Thr Ile Thr Ala
1315 1320 1325
2111
2159
2207
2255
2303
2351
2399
2447
2495
2543
2591
2639
AAG TCG AAT TCC ACC GCC CTG AAC ATC AGC CCC GGC GAG AGC TAC CCC Lys Ser Asn Ser Thr Ala Leu Asn Ile Ser Pro Gly Glu Ser Tyr Pro
1330 1335 1340
2687
243
AAG AAG GGC CAG Lys Lys Gly Gin 1345 AAC GGC ATC GCC ATC ACC AGC ATG GAC GAC TTC AAC 2735
Asn Gly Ile Ala 1350 Ile Thr Ser Met Asp Asp 1355 Phe Asn
AGC CAC CCC ATC ACC CTG AAC AAG AAG CAG GTG GAC AAC CTG CTG AAC 2783
Ser His Pro Ile 1360 Thr Leu Asn Lys 1365 Lys Gin Val Asp Asn Leu 1370 Leu Asn 1375
AAC AAG CCC ATG ATG CTG GAG ACC AAC CAG ACC GAC GGC GTC TAC AAG 2831
Asn Lys Pro Met Met Leu Glu Thr 1380 Asn Gin Thr 1385 Asp Gly Val Tyr Lys 1390
ATC AAG GAC ACC CAC GGC AAC ATC GTG ACG GGC GGC GAG TGG AAC GGC 287S
Ile Lys Asp Thr His 1395 Gly Asn Ile Val Thr Gly Gly Glu Trp Asn 1400 1405 Gly
GTG ATC CAG CAG ATC AAG GCC AAG ACC GCC AGC ATC ATC GTC GAC GAC 2927
Vel Ile Gin Gin 1410 Ile Lys Ala Lys Thr 1415 Ma Ser Ile Ile Val 1420 Asp Mp
GGC GAG CGC GTG GCC GAG AAG CGC GTG GCC GCC AAG GAC TAC GAG AAC 2975
Gly Glu Arg Val 1425 Ala Glu Lys Arg 1430 Val Ala Ala Lys Mp Tyr 1435 Glu Mn
CCC GAG GAC AAG ACC CCC AGC CTG ACC CTG AAG GAC GCC CTG AAG CTG 3023
Pro Glu Asp Lys 1440 Thr Pro Ser Leu 1445 Thr Leu Lys Asp Ala Leu 1450 Lys Leu 1455
AGC TAC CCC GAC GAG ATC AAG GAG ATC GAG GGC TTG CTG TAC TAC AAG 3071
Ser Tyr Pro Asp Glu 14 6C Ile Lys Glu ) Ile Glu Gly 1465 Leu Leu Tyr Tyr 147C Lys )
AAC AAG CCC ATC TAC GAG AGC AGC GTG ATG ACC TAT CTA GAC GAG AAC 3119
Asn Lys Pro Ile Tyr 1475 Glu Ser Ser Val 148C Met Thr ) Tyr Leu Mp 1485 Glu Mn
ACC GCC AAG GAG GTG ACC AAG CAG CTG AAC GAC ACC ACC GGC AAG TTC 3167
Thr Ala Lys Glu 1490 Val Thr Lys Gin 1495 Leu Asn Asp Thr Thr Gly 1500 Lys Phe
AAG GAC GTG AGC CAC CTG TAC GAC GTG AAG CTG ACC CCC AAG ATG AAC 3215
Lys Asp Val Ser 1505 His Leu Tyr Asp 1510 Val Lys Leu Thr Pro Lys 1515 Met Mn
GTG ACC ATC AAG CTG AGC ATC CTG TAC GAC AAC GCC GAG AGC AAC GAC 3263
Val Thr Ile Lys 1520 Leu Ser Ile Leu 1525 Tyr Mp Mn 1530 Ala Glu Ser Asn Asp 1535
AAC AGC ATC GGC AAG TGG ACC AAC ACC AAC ATC GTG AGC GGC GGC AAC 3311
Asn Ser Ile Gly Lys 1540 Trp Thr Asn Thr Asn Ile 1545 Val Ser Gly Gly 1550 Mn
244
AAC GGC AAG AAG CAG TAC Lys Gin Tyr 1555 AGC AGC AAC AAC CCC GAC GCC AAC CTG ACC 3359
Asn Gly Lys Ser Ser Asn Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr
1560 1565
CTG AAC ACC GAC GCC CAG GAG AAG CTG AAC AAG AAC CGC GAC TAC TAC 3407
Leu Asn Thr Asp Ala Gin 1570 Glu Lys Leu Asn Lys 1575 Asn Arg Asp Tyr 1580 Tyr
ATC AGC CTG TAC ATG AAG AGC GAG AAG AAC ACC CAG TGC GAG ATC ACC 3455
Ile Ser Leu 1585 Tyr Met Lys Ser Glu 1590 Lys Asn Thr Gin Cys Glu Ile 1595 Thr
ATC GAC GGC GAG ATA TAC CCC ATC ACC ACC AAG ACC GTG AAC GTG AAC 3503
Ile Asp 1600 Gly Glu Ile Tyr Pro 1605 Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn Val 1610 Asn 1615
AAG GAC AAC TAC AAG CGC CTG GAC ATC ATC GCC CAC AAC ATC AAG AGC 3551
Lys Asp Asn Tyr Lys Arg 1620 Leu Asp Ile Ile Ala 1625 His Asn Ile Lys Ser 1630
AAC CCC ATC AGC AGC CTG CAC ATC AAG ACC AAC GAC GAG ATC ACC CTG 3599
Asn Pro Ile Ser Ser Leu 1635 His Ile Lys Thr Asn 1640 Asp Glu Ile Thr 1645 Leu
TTC TGG GAC GAC ATA TCG ATT ACC GAC GTC GCC AGC ATC AAG CCC GAG 3647
Phe Trp Asp Asp Ile Ser 1650 Ile Thr Asp Val Ala 1655 Ser Ile Lys Pro 1660 Glu
AAC CTG ACC GAC AGC GAG ATC AAG CAG ATA TAC AGT CGC TAC GGC ATC 3695
Asn Leu Thr 1665 Asp Ser Glu Ile Lys 1670 Gin Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly 1675 Ile
AAG CTG GAG GAC GGC ATC CTG ATC GAC AAG AAA GGC GGC ATC CAC TAC 3743
Lys Leu 1680 Glu Asp Gly Ile Leu 1685 Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His 1690 Tyr 1695
GGC GAG TTC ATC AAC GAG GCC AGC TTC AAC ATC GAG CCC CTG CAG AAC 3791
Gly Glu Phe Ile Asn Glu 1700 Ala Ser Phe Asn Ile 1705 Glu Pro Leu Gin Asn 1710
TAC GTG ACC AAG TAC GAG GTG ACC TAC AGC AGC GAG CTG GGC CCC AAC 3839
Tyr Val Thr Lys Tyr Glu 1715 Val Thr Tyr Ser Ser 1720 Glu Leu Gly Pro 1725 Asn
GTG AGC GAC ACC CTG GAG AGC GAC AAG ATT TAC AAG GAC GGC ACC ATC 3887
Val Ser Asp 173C Thr Leu Glu 1 Ser Asp 1735 Lys Ile Tyr Lys Asp Gly Thr 1740 Ile
AAG TTC GAC TTC ACC AAG TAC AGC AAG AAC GAG CAG GGC CTG TTC TAC 3935
Lys Phe 1745 Asp Phe Thr Lys Tyr 1750 Ser Lys Asn Glu Gin Gly Leu Phe 1755 Tyr
GAC AGC GGC CTG AAC TGG GAC TTC AAG ATC AAC GCC ATC ACC TAC GAC 3983
Asp 1760 Ser Gly Leu Asn Trp 1765 Asp Phe Lys Ile Asn 1770 Ala Ile Thr Tyr Asp 1775
245
GGC AAG GAG ATG AAC GTG TTC CAC CGC TAC AAC AAG TAGATCTGAG Gly Lys Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys 4029
1780 1785
CT 4031
Informace o sekvenci SEQ ID č. 50:
(i) charakteristiky sekvence: (A) délka: 1338 aminokyselin (B) typ: aminokyselinová (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: protein
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 50:
Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu Phe Met Val Ser Lys Lys Leu Gin
1 5 10 15
Val Val Thr Lys Thr Val Leu Leu Ser Thr Val Phe Ser Ile Ser Leu
20 25 30
Leu Asn Asn Glu Val Ile Lys Ala Glu Gin Leu Asn Ile Asn Ser Gin
35 40 45
Ser Lys Tyr Thr Asn Leu Gin Asn Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu
50 55 60
Asp Phe Lys Glu Asp Lys Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys Glu Lys
65 70 75 80
Glu Lys Glu Trp Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly Lys Met Asn Asn
85 90 95
Phe Leu Asp Asn Lys Asn Asp Ile Lys Thr Asn Tyr Lys Glu Ile Thr
100 105 110
Phe Ser Ile Ala Gly Ser Phe Glu Asp Glu Ile Lys Asp Leu Lys Glu
115 120 125
Ile Asd Lys Met Phe Asp Lys Thr Asn Leu Ser Asn Ser Ile Ile Thr
130 135 140
Tyr Lys Asn Val Glu Pro Thr Thr Ile Gly Phe Asn Lys Ser Leu Thr
145 150 155 160
Glu Gly Asn Thr Ile Asn Ser Asp Ala Met Ala Gin Phe Lys Glu Gin
165 170 175
246
Phe Leu Asp Arg Asp lle Lys Phe Asp Ser Tyr Leu Asp Thr His Leu
180 185 190
Thr Ala Gin Gin Val Ser Ser Lys Glu Arg Val lle Leu Lys Val Thr
195 200 205
Val Pro Ser Gly Lys Gly Ser Thr Thr Pro Thr Lys Ala Gly Val lle
210 215 220
Leu Asn Asn Ser Glu Tyr Lys Met Leu lle Asp Asn Gly Tyr Met Val
225 230 235 240
His Val Asp Lys Val Ser Lys Val Val Lys Lys Gly Val Glu Cys Leu
245 250 255
Gin lle Glu Gly Thr Leu Lys Lys Ser Leu Asp Phe Lys Asn Asp lle
260 265 270
Asn Ala Glu Ala His Ser Trp Gly Met Lys Asn Tyr Glu Glu Trp Ala
275 280 285
Lys Asp Leu Thr Asp Ser Gin Arg Glu Ala Leu Asp Gly Tyr Ala Arg
290 295 300
Gin Asp Tyr Lys Glu lle Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser
305 310 315 320
Gly Asn Glu Lys Leu Asp Ala Gin lle Lys Asn lle Ser Asp Ala Leu 325 330 335
Gly Lys Lys Pro lle Pro Glu Asn lle Thr Val Tyr Arg Trp Cys Gly 340 345 350
Met Pro Glu Phe Gly Tyr Gin lle Ser Asp Pro Leu Pro Ser Leu Lys 355 360 365
Asp Phe Glu Glu Gin Phe Leu Asn Thr lle Lys Glu Asp Lys Gly Tyr 370 375 380
Met Ser Thr Ser Leu Ser Ser Glu Arg Leu Ala Ala Phe Gly Ser Arg 385 390 395 400
Lys lle lle Leu Arg 405 Leu Gin Val Pro Lys 410 Gly Ser Thr Gly Ala 415 Tyr
Leu Ser Ala lle 420 Gly Gly Phe Ala Ser 425 Glu Lys Glu lle Leu 430 Leu Asp
Lys Asp Ser Lys Tyr His lle Asp Lys Val Thr Glu Val lle lle Lys
435 440 445
Gly Val Lys Arg Tyr Val Val Asp Ala Thr Leu Leu Thr Asn Ser Arg 450 455 460
247
Gly 465 Pro Ser Thr Pro Pro 470 Thr Pro Ser Pro Ser 475 Thr Pro Pro Thr Pro 480
Ser Asp Ile Gly Ser 485 Thr Met Lys Thr Asn 490 Gin Ile Ser Thr Thr 4 95 Gin
Lys Asn Gin Gin 500 Lys Glu Met Asp Arg 505 Lys Gly Leu Leu Gly 510 Tyr Tyr
Phe Lys Gly 515 Lys Asp Phe Ser Asn 520 Leu Thr Met Phe Ala 525 Pro Thr Arg
Asp Ser 530 Thr Leu Ile Tyr Asp 535 Gin Gin Thr Ala Asn 540 Lys Leu Leu Asp
Lys 545 Lys Gin Gin Glu Tyr 550 Gin Ser Ile Arg Trp 555 Ile Gly Leu Ile Gin 560
Ser Lys Glu Thr Gly 565 Asp Phe Thr Phe Asn 570 Leu Ser Glu Asp Glu 575 Gin
Ala Ile Ile Glu 580 Ile Asn Gly Lys Ile 585 Ile Ser Asn Lys Gly 590 Lys Glu
Lys Gin Val 595 Val His Leu Glu Lys 600 Gly Lys Leu Val Pro 605 Ile Lys Ile
Glu Tyr 610 Gin Ser Asp Thr Lys 615 Phe Asn Ile Asp Ser 620 Lys Thr Phe Lys
Glu 625 Leu Lys Leu Phe Lys 630 Ile Asp Ser Gin Asn 635 Gin Pro Gin Gin Val 640
Gin Gin Asp Glu Leu 645 Arg Asn Pro Glu Phe 650 Asn Lys Lys Glu Ser 655 Gin
Glu Phe Leu Ada 660 Lys Pro Ser Lys Ile 665 Asn Leu Phe Thr Gin 670 Gin Met
Lys Arg Glu 675 Ile Asp Glu Asp Thr 680 Asp Thr Asp Gly Asp 685 Ser Ile Pro
A.sp Leu 690 Trp Glu Glu Asn Gly 695 Tyr Thr Ile Gin Asn 700 Arg Ile Ala Val
Lys 705 Trp Asp Asp Ser Leu 710 Ala Ser Lys Gly Tyr 715 Thr Lys Phe Val Ser 720
Asn Pro Leu Glu Ser His Thr Val Gly Asp Pro Tyr Thr Asp Tyr Glu
725 730 735
Lys Ala Ala Arg Asp Leu Asp Leu Ser Asn Ala Lys Glu Thr Phe Asn 740 745 750
248
Pro Leu Val 755 Ala Ala Phe Pro Ser 760 Val Asn Val Ser Met 765 Glu Lys Val
Ile Leu 770 Ser Pro Asn Glu Asn 775 Leu Ser Asn Ser Val 780 Glu Ser His Ser
Ser 785 Thr Asn Trp Ser Tyr 790 Thr Asn Thr Glu Gly 795 Ala Ser Val Glu Ala 800
Gly Ile Gly Pro Lys 805 Gly Ile Ser Phe Gly 810 Val Ser Val Asn Tyr 815 Gin
His Ser Glu Thr 820 Val Ala Gin Glu Trp 825 Gly Thr Ser Thr Gly 830 Asn Thr
Ser Gin Phe 835 Asn Thr Ala Ser Ala 840 Gly Tyr Leu Asn Ala 845 Asn Val Arg
Tyr Asn 850 Asn Val Gly Thr Gly 855 Ala Ile Tyr Asp Val 860 Lys Pro Thr Thr
Ser 865 Phe Val Leu Asn Asn 870 Asp Thr Ile Ala Thr 875 Ile Thr Ala Lys Ser 880
Asn Ser Thr Ala Leu 885 Asn Ile Ser Pro Gly 890 Glu Ser Tyr Pro Lys 895 Lys
Gly Gin Asn Gly 900 Ile Ala Ile Thr Ser 905 Met Asp Asp Phe Asn 910 Ser His
Pro Ile Thr 915 Leu Asn Lys Lys Gin 920 Val Asp Asn Leu Leu 925 Asn Asn Lys
Pro Met 930 Met Leu Glu Thr Asn 935 Gin Thr Asp Gly Val 940 Tyr Lys Ile Lys
Asp 945 Thr His Gly Asn Ile 950 Val Thr Gly Gly Glu 955 Trp Asn Gly Val Ile 960
Gin Gin Ile Lys Ala 965 Lys Thr Ala Ser Ile 970 Ile Val Asp Asp Gly 975 Glu
Arg Val Ala Glu 980 Lys Arg Val Ala Ala 985 Lys Asp Tyr Glu Asn 990 Pro Glu
Asp Lys Thr 995 Pro Ser Leu Thr Leu 1000 Lys Asp Ala Leu Lys 1005 Leu Ser Tyr
Pro Asp 1010 Glu Ile Lys Glu Ile 1015 Glu Gly Leu Leu Tyr 1020 Tyr Lys Asn Lys
Pro Ile Tyr Glu Ser Ser Val . Met Thr Tyr Leu Asp Glu Asn Thr Ala
1025
1030
1035
Lys Glu Val Thr Lys Gin Leu Asn Asp Thr Thr Gly Lys Phe Lys Asp 1045 1050 1055
1040
249
Val Ser His Leu Tyr Asp Val Lys Leu Thr Pro Lys Met Asn Val Thr
1060 1065 1070
Ile Lys Leu Ser Ile Leu Tyr Asp Asn Ala Glu Ser 1075 1080 Asn Asp Asn Ser 1085
Ile Gly Lys 1090 Trp Thr Asn Thr Asn 1095 Ile Val Ser Gly Gly Asn Asn Gly 1100
Lys Lys Gin 1105 Tyr Ser Ser Asn Asn 1110 Pro Asp Ala Asn 1115 Leu Thr Leu Asn 1120
Thr Asp Ala Gin Glu Lys Leu Asn 1125 Lys Asn Arg Asp 1130 Tyr Tyr Ile Ser 1135
Leu Tyr Met Lys Ser Glu Lys Asn 1140 Thr Gin Cys Glu 1145 Ile Thr Ile Asp 1150
Gly Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys Thr Val Asn 1155 1160 Val Asn Lys Asp 1165
Asn Tyr Lys 1170 Arg Leu Asp Ile Ile 1175 Ala His Asn Ile Lys Ser Asn Pro 1180
Ile Ser Ser 1185 Leu His Ile Lys Thr 1190 Asn Asp Glu Ile 1195 Thr Leu Phe Trp 1200
Asp Asp Ile Ser Ile Thr Asp Val 1205 Ala Ser Ile Lys 1210 Pro Glu Asn Leu 1215
Thr Asp Ser Glu Ile Lys Gin Ile 1220 Tyr Ser Arg Tyr 1225 Gly Ile Lys Leu 1230
Glu Asp Gly Ile Leu Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile 1235 1240 His Tyr Gly Glu 1245
Phe Ile Asn 1250 Glu Ala Ser Phe Asn 1255 Ile Glu Pro Leu 1260 Gin Asn Tyr Val 1
Thr Lys Tyr 1265 Glu Val Thr Tyr Ser 1270 Ser Glu Leu Gly 1275 Pro Asn Val Ser 1280
Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys Ile 1285 Tyr Lys Asp Gly 1290 Thr Ile Lys Phe 1295
Asp Phe Thr Lys Tyr Ser Lys Asn 1300 Glu Gin Gly Leu 1305 Phe Tyr Asp Ser 1310
Gly Leu Asn Trp Asp Phe Lys Ile Asn Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys
1315 1320 1325
Glu Met Asn Val Phe His Arg Tyr Asn Lys 1330 1335
250
Informace o sekvenci SEQ ID č. 51:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 2444 párů bází (B) typ: nukleová kyselina (C) počet řetězců: jednořetězcová (D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: DNA (genomová)
(iii) hypotetická: není
(ix) vlastnosti:
(A) jméno/klíč: CDS
(B) lokace: 17.. 2444
(D) další informace: produkt =
syntetický:nativní (xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 51:
GGATCCACCA ATGAAC ATG AAC AAG AAC AAC ACC AAG CTG AGC ACC CGC 49
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg
10
GCC CTG CCG AGC TTC ATC GAC TAC TTC AAC GGC ATC TAC GGC TTC GCC 97
Ala Leu Pro Ser 15 Phe Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala
20 25
ACC GGC ATC AAG GAC ATC ATG AAC ATG ATC TTC AAG ACC GAC ACC GGC 145
Thr Gly Ile Lys Asp Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly
30 35 40
GGC GAC CTG ACC CTG GAC GAG ATC CTG AAG AAC CAG CAG CTG CTG AAC 193
Gly Asp Leu Thr Leu Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn
45 50 55
GAC ATC AGC GGC AAG CTG GAC GGC GTG AAC GGC AGC CTG AAC GAC CTG 241
Asp Ile Ser Gly Lys Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn Asp Leu
6*0 65 70 75
ATC GCC CAG GGC AAC CTG AAC ACC GAG CTG AGC AAG GAG ATC CTT AAG 289
Ile Ala Gin Gly Asn Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys
80 85 90
ATC GCC AAC GAG CAG AAC CAG GTG CTG AAC GAC GTG AAC AAC AAG CTG 337
Ile Ala Asn Glu Gin Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu
95 100 105
GAC GCC ATC AAC ACC ATG CTG CGC GTG TAC CTG CCG AAG ATC ACC AGC 385
Asp Ala Ile Asn Thr Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser
110 115 120
251
ATG Met CTG AGC GAC GTG ATG AAG CAG AAC TAC GCC CTG AGC CTG CAG ATC 433
Leu Ser 125 Asp Val Met Lys 130 Gin Asn Tyr Ala Leu 135 Ser Leu Gin lle
GAG TAC CTG AGC AAG CAG CTG CAG GAG ATC AGC GAC AAG CTG GAC ATC 481
Glu Tyr Leu Ser Lys Gin Leu Gin Glu lle Ser Asp Lys Leu Asp lle
140 145 150 155
ATC AAC GTG AAC GTC CTG ATC AAC AGC ACC CTG ACC GAG ATC ACC CCG 529
lle Asn Val Asn Val Leu lle Asn Ser Thr Leu Thr Glu lle Thr Pro
160 165 170
GCC TAC CAG CGC ATC AAG TAC GTG AAC GAG AAG TTC GAA GAG CTG ACC 577
Ala Tyr Gin Arg lle Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr
175 180 185
TTC GCC ACC GAG ACC AGC AGC AAG GTG AAG AAG GAC GGC AGC CCG GCC 625
Phe Ala Thr Glu Thr Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala
190 195 200
GAC ATC CTG GAC GAG CTG ACC GAG CTG ACC GAG CTG GCC AAG AGC GTG 673
Asp lle Leu Asp Glu Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val
205 210 215
ACC AAG AAC GAC GTG GAC GGC TTC GAG TTC TAC CTG AAC ACC TTC CAC 721
Thr Lys Asn Asp Val Asp Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His
220 225 230 235
GAC GTG ATG GTG GGC AAC AAC CTG TTC GGC CGC AGC GCC CTG AAG ACC 769
Asp Val Met Val Gly Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr
240 245 250
GCC AGC GAG CTG ATC ACC AAG GAG AAC GTG AAG ACC AGC GGC AGC GAG 817
Ala Ser Glu Leu lle Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu
255 260 265
GTG GGC AAC GTG TAC AAC TTC CTG ATC GTG CTG ACC GCC CTG CAG GCC 865
Val Gly Asn Val Tyr Asn Phe Leu lle Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala
270 275 280
CAG GCC TTC CTG ACC CTG ACC ACC TGT CGC AAG CTG CTG GGC CTG GCC 913
Gin Ala Phe Leu Thr Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala
285 290 295
GAC A.TC GAC TAC ACC AGC ATC ATG AAC GAG CAC TTG AAC AAG GAG AAG 961
Asp lle Asp Tyr Thr Ser lle Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys
300 305 310 315
GAG GAG TTC CGC GTG AAC ATC CTG CCG ACC CTG AGC AAC ACC TTC AGC 1009
Glu Glu Phe Arg Val Asn lle Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser
320 325 330
AAC CCG AAC TAC GCC AAG GTG AAG GGC AGC GAC GAG GAC GCC AAG . ATG 1057
Asn Pro Asn Tyr Ala Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu . Asp . Ala Lys Met
335 340 345
252
ATC GTG GAG GCT AAG CCG GGC CAC GCG TTG ATC GGC TTC GAG ATC AGC lle Val Glu Ala Lys Pro Gly His Ala Leu lle Gly Phe Glu lle Ser 1105
350 355 360
AAC GAC AGC ATC : ACC : GTG i CTG . AAG GTG TAC GAG GCC AAG CTG AAG CAG 1153
Asn Asp Ser lle Thr Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin
365 370 375
AAC TAC CAG GTG GAC AAG GAC AGC TTG AGC GAG GTG ATC TAC GGC GAC 1201
Asn Tyr Gin Val Asp Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lle Tyr Gly Asp
380 385 390 395
ATG GAC AAG CTG CTG TGT CCG GAC CAG AGC GAG CAA ATC TAC TAC ACC 1249
Met Asp Lys Leu Leu Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin lle Tyr Tyr Thr
400 405 410
AAC AAC ATC GTG TTC CCG AAC GAG TAC GTG ATC ACC AAG ATC GAC TTC 1297
Asn Asn lle Val Phe Pro Asn Glu Tyr Val lle Thr Lys lle Asp Phe
415 420 425
ACC AAG AAG ATG AAG ACC CTG CGC TAC GAG GTG ACC GCC AAC TTC TAC 1345
Thr Lys Lys Met Lys Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr
430 435 440
GAC AGC AGC ACC GGC GAG ATC GAC CTG AAC AAG AAG AAG GTG GAG AGC 1393
Asp Ser Ser Thr Gly Glu lle Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser
445 450 455
AGC GAG GCC GAG TAC CGC ACC CTG AGC GCG AAC GAC GAC GGC GTC TAC 1441
Ser Glu Ala Glu Tyr Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr
460 465 470 475
ATG CCA CTG GGC GTG ATC AGC GAG ACC TTC CTG ACC CCG ATC AAC GGC 1489
Met Pro Leu Gly Val lle Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lle Asn Gly
480 485 490
TTT GGC CTG CAG GCC GAC GAG AAC AGC CGC CTG ATC ACC CTG ACC TGT 1537
Phe Gly Leu Gin Ala Asp Glu Asn Ser Arg Leu lle Thr Leu Thr Cys
495 500 505
AAG AGC TAC CTG CGC GAG CTG CTG CTA GCC ACC GAC CTG AGC AAC AAG 1585
Lys Ser Tyr Leu Arg Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys
510 515 520
GAG ACC AAG CTG ATC GTG CCA CCG AGC GGC TTC ATC AGC AAC ATC GTG 1633
Glu Thr Lys Leu lle Val Pro Pro Ser Gly Phe lle Ser Asn lle Val
525 530 535
GAG AAC GGC AGC ATC GAG GAG GAC AAC CTG GAG CCG TGG AAG GCC AAC 1681
Glu Asn Gly Ser lle Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn
540 545 550 555
AAC AAG AAC GCC TAC GTG GAC CAC ACC GGC GGC GTG AAC GGC ACC AAG 1729
Asn Lys Asn Ala Tyr Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys
560 565 570
GCC CTG TAC GTG CAC AAG GAC GGC GGC ATC AGC CAG TTC ATC GGC GAC 1777
Ala Leu Tyr ' Val His Lys . Asp Gly Gly lle Ser Gin Phe lle Gly Asp
575 580 585
253
AAG Lys CTG AAG CCG Leu Lys Pro 590 AAG ACC GAG Lys Thr Glu TAC Tyr 595 GTG ATC CAG TAC ACC GTG AAG GGC 1825
Val Ile Gin Tyr Thr Val 600 Lys Gly
AAG CCA TCG ATT CAC CTG AAG GAC GAG AAC ACC GGC TAC ATC CAC TAC 1873
Lys Pro Ser Ile His Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr
605 610 615
GAG GAC ACC AAC AAC AAC CTG GAG GAC TAC CAG ACC ATC AAC AAG CGC 1921
Glu Asp Thr Asn Asn Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg
620 625 630 635
TTC Phe ACC ACC Thr Thr GGC ACC Gly Thr 640 GAC CTG AAG GGC GTG TAC CTG ATC CTG AAG AGC Lys Ser 650 1969
Asp Leu Lys Gly Val 645 Tyr Leu Ile Leu
CAG AAC GGC GAC GAG GCC TGG GGC GAC AAC TTC ATC ATC CTG GAG ATC 2017
Gin Asn Gly Asp Glu Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile
655 660 665
AGC CCG AGC GAG AAG CTG CTG AGC CCG GAG CTG ATC AAC ACC AAC .AAC 2065
Ser Pro Ser Glu Lys Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn
670 675 680
TGG ACC AGC ACC Trp Thr Ser Thr 685 GGC Gly AGC ACC AAC ATC AGC GGC AAC ACC CTG ACC CTG 2113
Ser Thr 690 Asn Ile Ser Gly Asn 695 Thr Leu Thr Leu
TAC CAG GGC GGC CGG GGG ATT CTA AAA CAA AAC CTT CAA TTA GAT AGT 2161
Tyr Gin Gly Gly Arg Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser
700 705 710 715
TTT TCA ACT TAT AGA GTG TAT TTT TCT GTG TCC GGA GAT GCT AAT GTA 2209
Phe Ser Thr Tyr Arg Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val
720 725 730
AGG ATT AGA AAT TCT AGG GAA GTG TTA TTT GAA AAA AGA TAT ATG AGC 2257
Arg Ile Arg Asn Ser Arg Glu Val. Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser
735 740 745
GGT GCT AAA GAT GTT TCT GAA ATG TTC ACT ACA AAA TTT GAG AAA GAT 2305
Gly Ala Lys Asp Val Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp
750 755 760
AAC TTT TAT ATA GAG CTT TCT CAA GGG AAT AAT TTA TAT GGT GGT CCT 2353
Asn Phe Tyr Ile Glu Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro
765 770 775
ATT GTA CAT TTT TAC GAT GTC TCT ATT AAG NAA GAT CGG GAT CTA ATA 2401
Ile Val His Phe Tyr Asp Val Ser Ile Lys Xaa Asp Arg Asp Leu Ile
780 785 790 795
1 TTA ACA GTT TTT AAA AGC NAA TTC TTG TAT AAT GTC CTT GAT T 2444
Leu Thr Val Phe Lys Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu A*sp
800 805
254
Informace o sekvenci SEQ ID č. 52:
(i) charakteristiky sekvence:
(A) délka: 809 aminokyselin
(B) typ: aminokyselinová
(D) topologie: lineární
(ii) typ molekuly: protein
(xi) znázornění sekvence SEQ ID č. 52 :
Met Asn Lys Asn Asn Thr Lys Leu Ser Thr Arg Ala Leu Pro Ser Phe
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Phe Asn Gly Ile Tyr Gly Phe Ala Thr Gly Ile Lys Asp
20 25 30
Ile Met Asn Met Ile Phe Lys Thr Asp Thr Gly Gly Asp Leu Thr Leu
35 40 45
Asp Glu Ile Leu Lys Asn Gin Gin Leu Leu Asn Asp Ile Ser Gly Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Gly Ser Leu Asn A<p Leu Ile Ala Gin Gly Asn
65 70 75 80
Leu Asn Thr Glu Leu Ser Lys Glu Ile Leu Lys Ile Ala Asn Glu Gin
85 90 95
Asn Gin Val Leu Asn Asp Val Asn Asn Lys Leu Asp Ala Ile Asn Thr
100 105 110
Met Leu Arg Val Tyr Leu Pro Lys Ile Thr Ser Met Leu Ser Asp Val
115 120 125
Met Lys Gin Asn Tyr Ala Leu Ser Leu Gin Ile Glu Tyr Leu Ser Lys
130 135 140
Gin Leu Gin Glu Ile Ser Asp Lys Leu Asp Ile Ile Asn Val Asn Val
145 150 155 160
Leu Ile Asn Ser Thr Leu Thr Glu Ile Thr Pro Ala Tyr Gin Arg Ile
165 170 175
Lys Tyr Val Asn Glu Lys Phe Glu Glu Leu Thr Phe Ala Thr Glu Thr
180 185 190
Ser Ser Lys Val Lys Lys Asp Gly Ser Pro Ala Asp Ile Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Thr Glu Leu Thr Glu Leu Ala Lys Ser Val Thr Lys Asn Asp ' Val
210 215 220
255
Asp 225 Gly Phe Glu Phe Tyr Leu Asn Thr Phe His Asp Val Met Val Gly 240
230 235
Asn Asn Leu Phe Gly Arg Ser Ala Leu Lys Thr Ala Ser Glu Leu lle
245 250 255
Thr Lys Glu Asn Val Lys Thr Ser Gly Ser Glu Val Gly Asn Val Tyr
260 265 270
Asn Phe Leu lle Val Leu Thr Ala Leu Gin Ala Gin Ala Phe Leu Thr
275 280 285
Leu Thr Thr Cys Arg Lys Leu Leu Gly Leu Ala Asp lle Asp Tyr Thr
290 295 300
Ser lle Met Asn Glu His Leu Asn Lys Glu Lys Glu Glu Phe Arg Val
305 310 315 320
Asn lle Leu Pro Thr Leu Ser Asn Thr Phe Ser Asn Pro Asn Tyr Ala
325 330 335
Lys Val Lys Gly Ser Asp Glu Asp Ala Lys Met lle Val Glu Ala Lys
340 345 350
Pro Gly His Ala Leu Lle Gly Phe Glu lle Ser Asn Asp Ser lle Thr
355 360 365
Val Leu Lys Val Tyr Glu Ala Lys Leu Lys Gin Asn Tyr Gin Val Asp
370 375 380
Lys Asp Ser Leu Ser Glu Val lle Tyr Gly Asp Met Asp Lys Leu Leu
385 390 395 400
Cys Pro Asp Gin Ser Glu Gin lle Tyr Tyr Thr Asn Asn lle Val Phe
405 410 415
Pro Asn Glu Tyr Val lle Thr Lys lle Asp Phe Thr Lys Lys Met Lys
420 425 430
Thr Leu Arg Tyr Glu Val Thr Ala Asn Phe Tyr Asp Ser Ser Thr Gly
435 440 445
Glu lle Asp Leu Asn Lys Lys Lys Val Glu Ser Ser Glu Ala Glu Tyr
450 455 460
Arg Thr Leu Ser Ala Asn Asp Asp Gly Val Tyr Met Pro Leu Gly Val
465 470 475 480
lle Ser Glu Thr Phe Leu Thr Pro lle Asn Gly Phe Gly Leu Gin Ala
485 490 495
Asp Glu Asn Ser Arg Leu lle Thr Leu Thr Cys Lys Ser Tyr Leu Arg
500 505 510
Glu Leu Leu Leu Ala Thr Asp Leu Ser Asn Lys Glu Thr Lys Leu lle 515 520 525
256
Val Pro Pro Ser Gly Phe Ile Ser Asn Ile Val Glu Asn Gly Ser Ile
530 535 540
Glu Glu Asp Asn Leu Glu Pro Trp Lys Ala Asn Asn Lys Mn Ala Tyr
545 550 555 560
Val Asp His Thr Gly Gly Val Asn Gly Thr Lys Ala Leu Tyr Val His
565 570 575
Lys Asp Gly Gly Ile Ser Gin Phe Ile Gly Asp Lys Leu Lys Pro Lys
580 585 590
Thr Glu Tyr Val Ile Gin Tyr Thr Val Lys Gly Lys Pro Ser Ile His
595 600 605
Leu Lys Asp Glu Asn Thr Gly Tyr Ile His Tyr Glu Asp Thr Asn Asn
610 615 620
Asn Leu Glu Asp Tyr Gin Thr Ile Asn Lys Arg Phe Thr Thr Gly Thr
625 630 635 640
Asp Leu Lys Gly Val Tyr Leu Ile Leu Lys Ser Gin Asn Gly Asd Glu
645 650 655
Ala Trp Gly Asp Asn Phe Ile Ile Leu Glu Ile Ser Pro Ser Glu Lys
660 665 67C
Leu Leu Ser Pro Glu Leu Ile Asn Thr Asn Asn Trp Thr Ser Thr Gly
675 680 685
Ser Thr Asn Ile Ser Gly Asn Thr Leu Thr Leu Tyr Gin Gly Gly Arg
690 695 700
Gly Ile Leu Lys Gin Asn Leu Gin Leu Asp Ser Phe Ser Thr Tyr Arg
705 710 715 720
Val Tyr Phe Ser Val Ser Gly Asp Ala Asn Val Arg Ile Arg Asn Ser
725 730 735
Arg Glu Val Leu Phe Glu Lys Arg Tyr Met Ser Gly Ala Lys Asp Val
740 745 750
Ser Glu Met Phe Thr Thr Lys Phe Glu Lys Asp Asn Phe Tyr Ile Glu
755 760 765
Leu Ser Gin Gly Asn Asn Leu Tyr Gly Gly Pro Ile Val His Phe Tyr
770 775 780
Asp Val Ser Ile Lys Xaa Asp Arg Asp Leu Ile Leu Thr Val Phe Lvs
785 790 795 300
Ser Xaa Phe Leu Tyr Asn Val Leu Asp

Claims (62)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Pro hmyz specifický sekretovaný protein, izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1.
  2. 2. Pro hmyz specifický sekretovaný protein podle nároku 1 a jeho složky, kterýžto protein
    a) je izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a
    b) vykazuje specifické spektrum insekticidní účinnosti, které zahrnuje účinnost proti druhům rodu Agrotis nebo/a Spodoptera, výhodně však účinnost proti Agrotis ipsilon nebo/a Spodoptera frugiperda nebo/a Spodoptera exigua nebo/a Heliothis virescens nebo/a Helicoverpa zea.
  3. 3. Pro hmyz specifický sekretovaný protein podle nároku
    1 a jeho složky, kterýžto protein obsahuje v N-koncové sekvenci řadu kladně nabitých zbytků následovaných hydrofobní základní oblastí a není v průběhu exportu upravován na N-konci.
  4. 4. Pro hmyz specifický protein podle nároku 1, kde uvedený Bacillus je vybrán ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL· B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.
  5. 5. Pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 4, který má molekulovou hmotnost přibližně 30 kDa nebo větší, výhodně přibližně 60 až přibližně 100 kDa a ještě výhodněji přibližně 80 kDa.
    • · · · · · · · • · · · · · · · · · • · « · · · · ·· ·· ·» ·* • ·· • · • · • · · · · ·
    - 258
  6. 6. Pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 5, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 29, SEQ ID č. 32 a SEQ ID č. 52, včetně jeho homologů.
  7. 7. Pro hmyz specifický protein podle nároku 1, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 2, SEQ ID č. 20 a SEQ ID č. 21.
  8. 8. Multimerní pesticidní protein, který obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec a kde alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pro hmyz specifický sekretovaný protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu a alespoň jedním z těchto polypeptidových řetězců je pomocný protein, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
  9. 9. Multimerní pesticidní protein podle nároku 8, který obsahuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 nebo 6 a pomocný protein, který aktivuje nebo zvyšuje pesticidní účinnost uvedeného pro hmyz specifického proteinu.
  10. 10. Fúzní protein, který obsahuje několik proteinových domén včetně alespoň jednoho sekretovaného pro hmyz specifického proteinu izolovatelného z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu nebo/a pomocného proteinu, vytvořený genetickými fúzemi ve stejném čtecím rámci, ze kterých se při translaci na ribozomech vytváří fúzní protein alespoň s kombinovanými vlastnostmi pro hmyz specifického proteinu nebo/a pomocného proteinu a popřípadě dalších složek použitých při fúzi.
  11. 11. Fúzní protein podle nároku ribonukleasový S-protein, sekretovaný
    10, pro který obsahuje hmyz specifický • ·
    - 259 protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu a pomocný protein.
  12. 12. Fúzní protein podle nároku 10, který má na svém N-konci buď uvedený pro hmyz specifický protein nebo uvedený pomocný protein.
  13. 13. Fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 12, kde pro hmyz specifickým proteinem je protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 nebo 6.
  14. 14. Multimerní protein podle libovolného z nároků 8 nebo 9 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 13, kde uvedený pomocný protein má molekulovou hmotnost přibližně 50 kDa a lze jej získat z Bacillus cereus.
  15. 15. Multimerní protein podle libovolného z nároků 8 nebo 9 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 12, kde jak uvedený pomocný protein tak uvedený pro hmyz specifický protein lze získat z kmene AB78.
  16. 16. Insekticidní protein podle libovolného z nároků 1 až 7, multimerní protein podle libovolného z nároků 8 až 9 a 14 až 15 nebo fúzní protein podle libovolného z nároků 10 až 15, ve kterém byly sekvence představující sekreční signál
    a) odstraněny nebo inaktivovány,
    b) nahrazeny sekrečním signálem heterologního původu,
    c) nahrazeny sekvencí způsobující cílení, která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky.
  17. 17. Fúzní protein podle nároku 15, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 23 a SEQ ID č. 50, včetně jeho homologů.
    • »·
    - 260 -
  18. 18. Insekticidní sekretovaný protein izolovatelný z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, ve kterém byly sekvence představující sekreční signál
    a) odstraněny nebo inaktivovány,
    b) nahrazeny sekrečním signálem heterologního původu,
    c) nahrazeny sekvencí způsobující cílení, která směruje transgenický produkt do konkrétní organely nebo kompartmentu buňky.
  19. 19. Insekticidní protein podle nároku 18, který má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující sekvence SEQ ID č. 36, SEQ ID č. 40, SEQ ID č. 43 a SEQ ID č. 46.
  20. 20. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 1 až 19.
  21. 21. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, včetně jejích homologů.
  22. 22. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 1, SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26 nebo SEQ ID č. 27, včetně jejích homologů.
  23. 23. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 22 nebo SEQ ID č. 49, včetně jejích homologů.
  24. 24. Molekula DNA podle nároku 20, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 35, SEQ ID č. 39, SEQ ID č. 42 nebo SEQ ID č. 45, včetně jejích homologů.
  25. 25. Molekula DNA podle libovolného z nároků 20 až 24, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která byla zcela nebo • ·· • · ·
    - 261 • · · · · · ···· ·· ·· ·· zčásti optimalizována pro expresi v mikroorganismu nebo rostlině.
  26. 26. Molekula DNA podle nároku 25, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 24, SEQ ID č. 26, SEQ ID č. 27, SEQ ID č. 35, SEQ ID č. 39, SEQ ID č. 42 nebo SEQ ID č. 45, včetně jejích homologů.
  27. 27. Molekula DNA podle nároku 25, která obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 30 nebo SEQ ID č. 51, včetně jejích homologů.
  28. 28. Molekula DNA, která hybridizuje s molekulou DNA podle libovolného z nároků 20 až 27 za mírně přísných podmínek, a která vykazuje pro hmyz specifickou účinnost.
  29. 29. Pro hmyz specifický protein, který je kódován molekulou DNA podle nároku 28.
  30. 30. Expresívní kazeta, která obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, operabilně spojenou s rostlinnými expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
  31. 31. Expresívní kazeta, která obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, operabilně spojenou s rostlinnými expresívními sekvencemi včetně regulačních signálů pro transkripci a translaci, nutných pro expresi asociovaných DNA-konstruktů v hostitelském organismu, a popřípadě dalšími regulačními sekvencemi.
  32. 32. Expresívní kazeta podle nároků 30 a 31, kde je uvedeným hostitelským organismem rostlina.
    • ·· • · · • · ·
    - 262
  33. 33. Vektorová molekula obsahující expresivní kazetu podle nároků 30 až 32.
  34. 34. Expresivní kazeta podle nároků 30 až 32 nebo vektorová molekula podle nároku 33, která tvoří součást genomu rostliny.
  35. 35. Hostitelský organismus, který obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
  36. 36. Hostitelský organismus, který obsahuje molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu tohoto hostitelského organismu.
  37. 37. Hostitelský organismus podle nároku 36, který je vybrán ze skupiny zahrnující buňky rostlin a hmyzu, bakterie, kvasinky, baculoviry, prvoky, hlísty a řasy.
  38. 38. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje stabilně začleněnou do jejího genomu molekulu DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
  39. 39. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která obsahuje stabilně začleněnou do jejího genomu molekulu DNA podle libovolného z nároků 20, 21, 25, 27 a 28, expresivní kazetu obsahující uvedenou molekulu DNA nebo vektorovou molekulu obsahující uvedenou expresivní • ·· • · · • · • · ··· ·· · * ··· · · « · · · · · · · · · ···· ·· #· ** ·· *·
    - 263 kazetu, výhodně stabilně začleněnou do genomu této rostliny.
  40. 40. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29.
  41. 41. Transgenická rostlina, včetně jejích částí jakož i potomstva a semen, která exprimuje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5, 6, 9 a 13.
  42. 42. Transgenická rostlina podle nároku 40 nebo 41, která dále exprimuje druhou odlišnou látku kontrolující hmyz, výhodně δ-endotoxin z Bacillus thuringiensis.
  43. 43. Rostlinný propagační materiál rostliny podle libovolného z nároků 37 až 42, který je ošetřen obalem chránícím semena.
  44. 44. Transgenická rostlina podle libovolného z nároků 37 až 42, kterou je dvouděložná nebo jednoděložná rostlina.
  45. 45. Transgenická rostlina podle nároku 44, kterou je rostlina vybraná ze skupiny zahrnující rostliny rodů Lolium, Zea, Triticum, Triticale, Sorghum, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale a Setaria.
  46. 46. Hostitelský organismus podle nároků 35 až 37, kterým je mikroorganismus, který se množí na rostlinách, jako je bakterie kolonizující kořeny.
  47. 47. Kmen rodu Bacillus, který produkuje během vegetativního růstu pesticidní protein, kterým je Bacillus vybraný ze skupiny zahrnující kmeny s přírůstkovými čísly NRRL B-21224, NRRL B-21225, NRRL B-21226, NRRL B-21227, NRRL
    B-21228, NRRL B-21229, NRRL B-21230 a NRRL B-21439.
    - 264
  48. 48. Insekticidní prostředek, vyznačuj ící se t í m , že obsahuje kmen rodu Bacillus podle nároku 47 nebo hostitelský organismus podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, v insekticidně účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
  49. 49. Insekticidní prostředek, vyznačuj ící se t £ m, že obsahuje izolovanou molekulu proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, samotnou nebo v kombinaci s kmenem rodu Bacillus podle nároku 47 nebo hostitelským organismem podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, v insekticidnš účinném množství, spolu s vhodným nosičem.
  50. 50. Způsob identifikace účinnosti pro hmyz specifického proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29 na hmyz, vyznačující se t ím , že zahrnuje (a) pěstování kmene rodu Bacillus v kultuře, (b) získání supernatantu z uvedené kultury, (c) poskytnutí potravy s uvedeným supernatantem larvám hmyzu, a (d) stanovení mortality.
  51. 51. Způsob izolace pro hmyz specifického proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, vyznačuj ící se t í m , že zahrnuje (a) pěstování kmene rodu Bacillus exprimujícího uvedený pro hmyz specifický protein v kultuře, (b) získání supernatantu z uvedené kultury, a (c) izolaci uvedeného pro hmyz specifického proteinu z uvedeného supernatantu.
  52. 52. Způsob izolace molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein vykazující insekticidní účinnost proteinů podle libovolného z nároků Iažl9a29, vyznačující se tím,
    - 265 * ·· • ·· že zahrnuje (a) získáni molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s DNA získanou z druhu rodu Bacillus, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
  53. 53. Způsob zvýšení rozsahu cílového hmyzu u hostitelského organismu, vyznačující se tím, že se k němu použije první pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29 v kombinaci s alespoň jedním druhým insekticidním proteinem, který se liší od uvedeného prvního pro hmyz specifického proteinu.
  54. 54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se t i m , že uvedený druhý insekticidní protein je vybrán ze skupiny zahrnující δ-endotoxiny z Bacilus thuringiensis, inhibitory proteas, lektiny, α-amylasy a peroxidasy.
  55. 55. Způsob ochrany rostlin proti poškození způsobenému hmyzím škůdcem, vyznačující se tím, že se na rostlinu nebo na plochu, na které tato rostlina roste, aplikuje, nebo že se v této rostlině exprimuje, insekticidní protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29.
  56. 56. Způsob vytvoření hostitelského organismu podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46, vyznačující se tím, že se uvedený hostitelský organismus transformuje molekulou DNA podle libovolného z nároků 20 až 28, expresívní kazetou podle libovolného z nároků 30 až 32 a 34 nebo vektorovou molekulou podle libovolného z nároků 33 až 35.
  57. 57. Způsob přípravy insekticidního prostředku podle libovolného z nároků 48 nebo 49, vyznačuj ící • ·· t ·9 · · ·· · ♦ · · · · · · · « ··· · · ··» · · · · · · · ·»···« «· ·* ·· ··
    - 266 tím, že se smíchá kmen rodu Bacillus podle nároku 47 nebo/a hostitelský organismus podle libovolného z nároků 35 až 37 a 46 nebo/a izolovaná molekula proteinu podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, v insekticidně účinném množství, s vhodným nosičem.
  58. 58. Způsob vytvoření transgenického potomstva transgenické rodičovské rostliny, které obsahuje, stabilně začleněnou do rostlinného genomu, molekulu DNA obsahující nukleotidovou sekvenci která kóduje pro hmyz specifický protein podle libovolného z nároků 1 až 19 a 29, vyznačující se tím, že se uvedená rodičovská rostlina transformuje expresivní kazetou podle libovolného z nároků 30 až 32 a 34 nebo vektorovou molekulou podle libovolného z nároků 33 až 35 a pesticidní znak se přenese na potomstvo uvedené transgenické rodičovské rostliny za použití známých postupů množení rostlin.
  59. 59. Oligonukleotidová sonda schopná specificky hybridizovat s nukleotidovou sekvencí kódující pro hmyz specifický protein, který lze izolovat z Bacillus spp. během fáze vegetativního růstu, a jeho složky, přičemž uvedeným proteinem není toxin usmrcující komáry z Bacillus sphaericus SSII-1, vyznačující se tím , že obsahuje souvislou část kódující sekvence uvedeného pro hmyz specifického proteinu o délce alespoň 10 nukleotidů.
  60. 60. Použití oligonukleotidové sondy pro screening libovolného kmene rodu Bacillus nebo jiných organismů pro stanovení, zda je v nich přirozeně přítomen pro hmyz specifický protein nebo zda konkrétní transformovaný organismus obsahuje tento gen.
  61. 61. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 1 až 6, kterou * ·· • ··
    267 lze získat způsobem který zahrnuje (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou podle nároku 60, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 19, SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
  62. 62. Molekula DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein podle libovolného z nároků 2, 3, 5 a 6, kterou lze získat způsobem který zahrnuje (a) získání molekuly DNA, která obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující pro hmyz specifický protein, (b) hybridizaci uvedené molekuly DNA s oligonukleotidovou sondou podle nároku 60, získanou z molekuly DNA obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID č. 28, SEQ ID č. 30, SEQ ID č. 31 nebo SEQ ID č. 51, a (c) izolaci uvedené hybridizované DNA.
CZ1997908A 1994-09-28 1995-09-27 Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují CZ290801B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31459494A 1994-09-28 1994-09-28
US08/463,483 US5849870A (en) 1993-03-25 1995-06-05 Pesticidal proteins and strains

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ90897A3 true CZ90897A3 (cs) 2000-02-16
CZ290801B6 CZ290801B6 (cs) 2002-10-16

Family

ID=26979445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1997908A CZ290801B6 (cs) 1994-09-28 1995-09-27 Pesticidní kmeny rodu Bacillus, pesticidní proteiny a molekuly DNA, které je kódují

Country Status (24)

Country Link
US (9) US5849870A (cs)
EP (3) EP1382611A3 (cs)
JP (1) JPH10506532A (cs)
KR (1) KR100419438B1 (cs)
CN (1) CN1255539C (cs)
AT (1) ATE256743T1 (cs)
AU (1) AU692934B2 (cs)
BG (1) BG101384A (cs)
BR (1) BR9509099A (cs)
CA (1) CA2199049C (cs)
CZ (1) CZ290801B6 (cs)
DE (1) DE69532333T3 (cs)
DK (1) DK0792363T4 (cs)
ES (1) ES2213162T5 (cs)
HU (1) HU222264B1 (cs)
IL (2) IL115382A (cs)
MX (1) MX228013B (cs)
PH (2) PH11995051386B1 (cs)
PT (1) PT792363E (cs)
RO (1) RO119835B1 (cs)
RU (1) RU2196824C2 (cs)
SI (1) SI0792363T2 (cs)
TR (1) TR199501182A2 (cs)
WO (1) WO1996010083A1 (cs)

Families Citing this family (132)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6406690B1 (en) * 1995-04-17 2002-06-18 Minrav Industries Ltd. Bacillus firmus CNCM I-1582 or Bacillus cereus CNCM I-1562 for controlling nematodes
GB9600786D0 (en) * 1996-01-15 1996-03-20 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6677135B1 (en) * 1996-05-08 2004-01-13 Biogen, Inc. Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth
GB9611777D0 (en) * 1996-06-06 1996-08-07 Ciba Geigy Ag Method of controlling insect pests
US6369213B1 (en) 1996-07-01 2002-04-09 Mycogen Corporation Toxins active against pests
EP0909324A2 (en) * 1996-07-01 1999-04-21 Mycogen Corporation Toxins active against pests
KR20000053001A (ko) 1996-10-30 2000-08-25 칼튼 제이. 에이블 신규한 살충독소 및 이들 독소를 코드화하는 뉴클레오티드 서열
US6242669B1 (en) 1996-10-30 2001-06-05 Mycogen Corporation Pesticidal toxins and nucleotide sequences which encode these toxins
US7129212B2 (en) * 1996-10-30 2006-10-31 Mycogen Corporation Polynucleotides, pesticidal proteins, and novel methods of using them
US6603063B1 (en) 1999-05-07 2003-08-05 Mycogen Corp. Plants and cells transformed with a nucleic acid from Bacillus thuringiensis strain KB59A4-6 encoding a novel SUP toxin
US6002068A (en) * 1996-12-19 1999-12-14 Novartis Finance Corporation Methods for conferring insect resistance to a monocot using a perioxidase coding sequence
CA2284686A1 (en) * 1997-03-31 1998-10-08 Abbott Laboratories Reagents and methods useful for detecting diseases of the gastrointestinal tract
WO1998044137A2 (en) * 1997-04-03 1998-10-08 Novartis Ag Plant pest control
KR100616372B1 (ko) * 1997-05-09 2006-08-28 아그라퀘스트 인코퍼레이티드 식물병들과 옥수수 근벌레를 억제하기 위한 신규한Ｂａｃｉｌｌｕｓ 균주
US6103228A (en) 1997-05-09 2000-08-15 Agraquest, Inc. Compositions and methods for controlling plant pests
WO1998055860A1 (en) * 1997-06-04 1998-12-10 Novartis Ag Pesticide screening system
US5906818A (en) 1997-08-22 1999-05-25 Agraquest, Inc. Bacillus mycoides strain for controlling corn rootworm
US6001637A (en) * 1997-08-22 1999-12-14 Agraquest, Inc. Bacillus pumilus strain for controlling corn rootworm, nematode and armyworm infestations
US6027723A (en) * 1997-08-22 2000-02-22 Agraquest, Inc. Rhodococcus globerulus strain for controlling corn rootworm
US6015553A (en) * 1997-08-22 2000-01-18 Agraquest, Inc. Bacillus subtilis strain for controlling insect and nematode pests
GB9725556D0 (en) 1997-12-03 1998-02-04 Ciba Geigy Ag Organic compounds
CA2335093A1 (en) * 1998-07-15 2000-01-27 The Horticulture And Food Research Institute Of New Zealand Limited Chimeric polypeptides allowing expression of plant-noxious proteins
AR020141A1 (es) 1998-08-10 2002-04-10 Mycogen Corp Toxinas y genes pesticidas de cepas de bacillus laterosporus
US6468523B1 (en) 1998-11-02 2002-10-22 Monsanto Technology Llc Polypeptide compositions toxic to diabrotic insects, and methods of use
AUPP841199A0 (en) * 1999-02-02 1999-02-25 Pinnock, Professor Dudley Edwin Control of mange
HUP0200562A2 (en) 1999-03-30 2002-06-29 Agraquest Inc A strain of baccilus pumilus for controlling plant diseases
US6245551B1 (en) 1999-03-30 2001-06-12 Agraquest, Inc. Strain of Bacillus pumilus for controlling plant diseases caused by fungi
GB9909796D0 (en) 1999-04-28 1999-06-23 Plant Bioscience Ltd Pesticidal fumes
US6706860B2 (en) 2000-05-18 2004-03-16 Bayer Bioscience N.V. Toxins
US7091399B2 (en) * 2000-05-18 2006-08-15 Bayer Bioscience N.V. Transgenic plants expressing insecticidal proteins and methods of producing the same
CA2423552A1 (en) * 2000-10-13 2002-04-18 Irm Llc High throughput processing system and method of using
ES2397549T3 (es) * 2001-01-09 2013-03-07 Bayer Cropscience Nv Proteínas insecticidas de Bacillus thuringiensis
AR035799A1 (es) 2001-03-30 2004-07-14 Syngenta Participations Ag Toxinas insecticidas aisladas de bacillus thuringiensis y sus usos.
US7711002B2 (en) * 2001-06-26 2010-05-04 Link Us All, Llc Transcoding SMS-based streamed messages to SIP-based IP signals in wireless and wireline networks
US20030110840A1 (en) * 2001-07-24 2003-06-19 Arriaga Edgar A. Systems and methods for detecting a particle
ATE495184T1 (de) 2001-11-07 2011-01-15 Syngenta Participations Ag Promotoren zur regulierung der genexpression in pflanzenwurzeln
US6589524B1 (en) 2002-02-07 2003-07-08 Ecomicrobials, Llc Strains of Bacillus for biological control of pathogenic fungi
CA2911801A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 Greta Arnaut Novel bacillus thuringiensis insecticidal proteins
DK1490397T3 (da) * 2002-03-22 2010-09-13 Bayer Bioscience Nv Nye Bacillus thuringiensis-insekticide proteiner
US7462760B2 (en) * 2002-06-26 2008-12-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genes encoding plant protease-resistant pesticidal proteins and method of their use
CA2490548A1 (en) * 2002-06-26 2004-01-08 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genes encoding proteins with pesticidal activity
US7205454B2 (en) 2002-07-31 2007-04-17 Bayer Bioscience N.V. Corn root preferential promoters and uses thereof
GB0225129D0 (en) * 2002-10-29 2002-12-11 Syngenta Participations Ag Improvements in or relating to organic compounds
US20040220268A1 (en) * 2003-05-02 2004-11-04 Yoe-Sik Bae Compound that directly stimulates phospholipase C activity
US7700094B1 (en) * 2003-09-23 2010-04-20 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Acetyl esterase producing strains and methods of using same
BRPI0416472A (pt) * 2003-12-01 2007-03-06 Syngenta Participations Ag plantas de algodão resistentes a insetos e métodos de detecção das mesmas
ES2353603T3 (es) 2003-12-16 2011-03-03 Monsanto Technology Llc Proteína insecticida secretada y composiciones de genes de bacillus thuringiensis y sus usos.
EP1863849B1 (en) 2005-03-11 2011-04-27 Syngenta Limited Rodent pest control
JP2008533054A (ja) * 2005-03-14 2008-08-21 マイクロビアル プロダクツ プロプライエタリー リミテッド 吸血シラミの駆除
AU2006225065B2 (en) * 2005-03-14 2012-08-16 Ectotec Pty Ltd Control of sucking lice
US8173871B2 (en) 2005-07-08 2012-05-08 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Bacterial proteins with pesticidal activity
WO2007027776A2 (en) * 2005-08-31 2007-03-08 Monsanto Technology Llc Insecticidal compositions and methods for making insect-resistant transgenic plants
EP2455393A3 (en) 2006-06-15 2012-08-22 Athenix Corporation A family of pesticidal proteins and methods for their use
US7521235B2 (en) * 2006-07-21 2009-04-21 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Unique novel Bacillus thuringiensis gene with Lepidopteran activity
US20080300210A1 (en) * 2007-05-16 2008-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of Controlling Insects and Virus Transmission
CN101970647A (zh) * 2007-12-11 2011-02-09 先正达参股股份有限公司 条件性毒性的工程化酶原
US9133251B2 (en) 2008-02-22 2015-09-15 The Curators Of The University Of Missouri Bacillus based delivery system and methods of use
US8110608B2 (en) 2008-06-05 2012-02-07 Ecolab Usa Inc. Solid form sodium lauryl sulfate (SLS) pesticide composition
EP2297190A2 (en) 2008-07-02 2011-03-23 Athenix Corporation Axmi-115, axmi-113, axmi-005, axmi-163 and axmi-184: vip3a insecticidal proteins from bacillus thuringiensis and methods for their use
US20100199383A1 (en) * 2008-09-18 2010-08-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Coleopteran Activity
US20100077507A1 (en) * 2008-09-22 2010-03-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Novel Bacillus Thuringiensis Gene with Lepidopteran Activity
BRPI0923159A2 (pt) 2008-12-23 2018-08-28 Athenix Corp gene de delta-endotoxina axmi-150 e métodos para sua utilização.
US20100210460A1 (en) 2009-02-19 2010-08-19 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Blended refuge deployment via manipulation during hybrid seed production
EP2957638B1 (en) 2009-02-27 2018-12-12 Athenix Corporation Pesticidal proteins and methods for their use
AR075799A1 (es) 2009-03-06 2011-04-27 Athenix Corp Metodos y composiciones para controlar plagas de plantas
CA2754845A1 (en) 2009-03-11 2010-12-09 Athenix Corporation Axmi-030 insecticidal protein from bacillus thuringiensis and methods for use
ES2609332T3 (es) * 2009-07-02 2017-04-19 Athenix Corporation Gen pesticida AXMI-205 y métodos para su uso
EA035563B1 (ru) 2009-07-31 2020-07-08 Басф Агрикалчерал Солюшнс Сид Юс Ллк Молекула рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид с пестицидной активностью против чешуекрылых, жесткокрылых или нематодных вредителей, ее получение и применение
CN102596988B (zh) 2009-10-02 2016-07-13 先正达参股股份有限公司 杀虫蛋白
BR112012015690A2 (pt) 2009-12-23 2015-08-25 Bayer Intelectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inibidores de hppd.
CN102762724A (zh) 2009-12-23 2012-10-31 拜尔知识产权有限公司 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物
ES2668222T3 (es) 2009-12-23 2018-05-17 Bayer Intellectual Property Gmbh Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD
AR080353A1 (es) 2009-12-23 2012-04-04 Bayer Cropscience Ag Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las hppd
CN102770531A (zh) 2009-12-23 2012-11-07 拜尔知识产权有限公司 对hppd抑制剂型除草剂耐受的植物
US8968757B2 (en) 2010-10-12 2015-03-03 Ecolab Usa Inc. Highly wettable, water dispersible, granules including two pesticides
BR112013015515A2 (pt) 2010-12-28 2018-04-24 Pioneer Hi Bred Int molécula de ácido nucleico isolada, construto de dna, célula hospedeira, planta transgênica, semente transformada da planta, polipeptídeo isolado com atividade pesticida, composição, método para controlar uma população de praga de lepidóptero, método para matar uma praga de lepidóptero, método para produzir um polipeptídeo com atividade pesticida, planta que tem incorporado de maneira estável em seu genoma um construto de dna, método para proteger uma planta contra uma praga
WO2012109515A1 (en) 2011-02-11 2012-08-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic insecticidal proteins active against corn rootworm
US8878007B2 (en) 2011-03-10 2014-11-04 Pioneer Hi Bred International Inc Bacillus thuringiensis gene with lepidopteran activity
US9078446B2 (en) 2011-03-25 2015-07-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of N-(tetrazol-4-yl)- or N-(triazol-3-yl)arylcarboxamides or their salts for controlling unwanted plants in areas of transgenic crop plants being tolerant to HPPD inhibitor herbicides
EA201391302A1 (ru) 2011-03-25 2014-04-30 Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх Применение n-(1,2,5-оксадиазол-3-ил)бензамидов для борьбы с нежелательными растениями в районах произрастания трансгенных культурных растений, устойчивых к гербицидам - ингибиторам hppd
CA2831927C (en) 2011-03-30 2021-03-16 Universidad Nacional Autonoma De Mexico Mutant bacillus thuringiensis cry genes and methods of use
BR112013025665B8 (pt) * 2011-04-05 2022-07-05 Athenix Corp Molécula de ácido nucleico recombinante, vetor, microrganismo transgênico, polipeptídeo recombinante e seu método de produção, composição, métodos para controlar ou exterminar uma população de pragas, para proteger uma planta de uma praga, e para aumentar o rendimento em uma planta
WO2012151145A1 (en) 2011-05-02 2012-11-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Bacterial mrna screen strategy for novel pesticide-encoding nucleic acid molecule discovery
US9861105B2 (en) 2011-07-28 2018-01-09 Syngenta Participations Ag Methods and compositions for controlling nematode pests
CN103173370B (zh) * 2011-12-06 2015-02-18 高小文 芽胞杆菌Gxw4-2培育及其防治害虫方法
AU2013219927B2 (en) 2012-02-16 2018-11-08 Syngenta Participations Ag Engineered pesticidal proteins
AR090274A1 (es) 2012-03-08 2014-10-29 Athenix Corp Gen de la toxina axmi335 de bacillus thuringiensis y sus metodos de empleo
US9644213B2 (en) 2012-03-09 2017-05-09 Board Of Trustees Of Michigan State University Method of enhancing plant drought tolerance by expression of NDR1
CN102633884B (zh) * 2012-04-21 2013-07-31 中国农业科学院植物保护研究所 苏云金芽胞杆菌vip1like1、vip2like1基因组合及其应用
WO2013181647A2 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Danisco Us Inc. Compositions and methods of producing isoprene and/or industrrial bio-products using anaerobic microorganisms
US9758793B2 (en) 2012-08-30 2017-09-12 Athenix Corp. AXMI-234 and AXMI-235 delta-endotoxin genes and methods for their use
BR112015008504A2 (pt) 2012-10-15 2017-08-22 Pioneer Hi Bred Int Método para aumentar a atividade pesticida, polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, cassete de expressão, vetor, método de obtenção de uma planta, método de obtenção de uma célula de planta, composição pesticida, método para proteção de uma planta, método para proteger uma planta, método para aumentar a resistência de uma planta
CN103039494A (zh) * 2012-12-05 2013-04-17 北京大北农科技集团股份有限公司 控制害虫的方法
US9458374B2 (en) * 2012-12-18 2016-10-04 Schlumberger Technology Corporation Cystine proteases for bacterial control
US9783817B2 (en) 2013-03-04 2017-10-10 Arkansas State University Methods of expressing and detecting activity of expansin in plant cells
CN110172466A (zh) 2013-03-07 2019-08-27 巴斯夫农业解决方案种子美国有限责任公司 毒素基因及其使用方法
US9573980B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
CA3184796A1 (en) 2013-08-08 2015-02-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having broad spectrum activity and uses thereof
CN104651377A (zh) 2013-11-25 2015-05-27 浙江大学 新型的杀虫蛋白
MX2016010187A (es) * 2014-02-07 2017-07-11 Pioneer Hi Bred Int Proteinas insecticidas y metodos para su uso.
RU2016147081A (ru) 2014-06-20 2018-07-20 ДАУ АГРОСАЙЕНСИЗ ЭлЭлСи Вегетативные инсектицидные белки, применимые для контроля насекомых-вредителей
US20160010062A1 (en) * 2014-07-09 2016-01-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Isolated Spodoptera Frugiperda Multiple Nucleopolyhedroviruses and Methods for Killing Insects
IL295968A (en) 2014-09-17 2022-10-01 Spogen Biotech Inc Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
MX2017003610A (es) 2014-09-17 2017-07-13 Bayer Cropscience Lp Composiciones que comprenden celulas recombinantes de bacillus y un fungicida.
EP3207050A4 (en) 2014-10-16 2018-09-12 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
UA124757C2 (uk) 2014-10-16 2021-11-17 Піонір Хай-Бред Інтернешнл, Інк. Інсектицидний поліпептид проти лускокрилого або твердокрилого шкідника та його застосування
EP3221455B1 (en) 2014-11-20 2020-08-12 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for producing polypeptides with a modified glycosylation pattern in plant cells
CA2970788A1 (en) 2014-12-22 2016-06-30 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
US20160304898A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 AgBiome, Inc. Pesticidal Genes and Methods of Use
CN114644689A (zh) 2015-04-22 2022-06-21 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因和使用方法
CA2985198A1 (en) * 2015-05-19 2016-11-24 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal proteins and methods for their use
EP3960864A3 (en) 2015-06-03 2022-06-15 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
KR20180019668A (ko) 2015-06-22 2018-02-26 아그바이오메, 인크. 살충 유전자 및 사용 방법
JP6933641B2 (ja) * 2015-07-30 2021-09-08 モンサント テクノロジー エルエルシー 新規の昆虫阻害タンパク質
MA44159A (fr) 2015-12-22 2018-10-31 Agbiome Inc Gènes pesticides et leurs procédés d'utilisation
EP3442994A4 (en) 2016-04-14 2019-11-27 Pioneer Hi-Bred International, Inc. INSECTICIDES POLYPEPTIDES WITH IMPROVED EFFICIENCY SPECTRUM AND USES THEREOF
US11028407B2 (en) 2016-04-19 2021-06-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal combinations of polypeptides having improved activity spectrum and uses thereof
CA3035896A1 (en) 2016-09-06 2018-03-15 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
MX2019005835A (es) 2016-11-23 2019-10-30 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Genes de toxinas axmi669 y axmi991 y metodos para su uso.
US10793610B2 (en) 2017-01-30 2020-10-06 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
CN110753699A (zh) 2017-04-11 2020-02-04 农业生物群落股份有限公司 杀有害生物基因及其使用方法
BR112019024827A2 (pt) 2017-05-26 2020-06-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Construto de dna, planta transgênica ou progênie da mesma, composição e método para controlar uma população de pragas de insetos
BR112020002279A2 (pt) 2017-08-03 2020-07-28 AgBiome, Inc. genes pesticidas e métodos de uso
US10743535B2 (en) 2017-08-18 2020-08-18 H&K Solutions Llc Insecticide for flight-capable pests
EP4122947A1 (en) 2017-12-19 2023-01-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Insecticidal polypeptides and uses thereof
CN111727195A (zh) 2017-12-22 2020-09-29 农业生物群落股份有限公司 杀有害生物基因及使用方法
CN112218952A (zh) 2018-04-20 2021-01-12 农业生物群落股份有限公司 杀虫基因及使用方法
WO2022115524A2 (en) 2020-11-24 2022-06-02 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
EP4334457A1 (en) 2021-05-06 2024-03-13 Agbiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
KR20240034182A (ko) 2021-06-03 2024-03-13 마젠 애니멀 헬스 인코포레이티드 사이토카인 수준을 변경하고 갓 태어난 돼지에게 수동 면역을 제공하기 위한 코로나바이러스 스파이크 단백질의 경구 투여
WO2023107943A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use
WO2024044596A1 (en) 2022-08-23 2024-02-29 AgBiome, Inc. Pesticidal genes and methods of use

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3651215A (en) * 1968-08-12 1972-03-21 Juro Morita Bacterial mosouito larva-killing agent
US3632747A (en) * 1968-08-20 1972-01-04 Juro Morita Bacterial fly-larva-killing agent
NZ201918A (en) 1981-09-18 1987-04-30 Genentech Inc N-terminal methionyl analogues of bovine growth hormone
US4886664A (en) 1982-06-18 1989-12-12 Rhone-Poulenc, S.A. Low-water-activity inocula for biological control
DE3685968T2 (de) 1985-01-22 1993-07-01 Mycogen Corp Zellulare einkapselung biologischer pestizide.
DE3541893A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-11 Basf Ag Verfahren zur herstellung sporenfreier, konzentrierter protein-praeparate von mueckentoxischem bacillus thuringiensis serovar. israelensis sowie mikroorganismus zur durchfuehrung des verfahrens bzw. verfahren zur gewinnung des mikroorganismus
US5024837A (en) * 1987-05-06 1991-06-18 Donovan William P Coleopteran active microorganisms, related insecticide compositions and methods for their production and use
US4996155A (en) * 1988-03-04 1991-02-26 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis gene encoding a coleopteran-active toxin
US5011685A (en) * 1988-04-06 1991-04-30 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Baculovirus proteins and viral pesticides containing same
GB8910624D0 (en) * 1989-05-09 1989-06-21 Ici Plc Bacterial strains
TR26973A (tr) * 1990-04-16 1994-09-12 Ecogen Inc Bacillus thuringiensis cryie geni ve lepidoptera takimindan böceklere karsi zehirli protein.
WO1991016432A1 (en) * 1990-04-18 1991-10-31 Plant Genetic Systems N.V. Modified bacillus thuringiensis insecticidal-crystal protein genes and their expression in plant cells
GB9023735D0 (en) * 1990-11-01 1990-12-12 Ici Plc Bacterial strain
US5277905A (en) * 1991-01-16 1994-01-11 Mycogen Corporation Coleopteran-active bacillus thuringiensis isolate
CA2059897A1 (en) * 1991-02-25 1992-08-26 Kenneth E. Narva Bacillus thuringiensis genes encoding novel coleopteran-active protein toxins
US5262158A (en) * 1991-04-30 1993-11-16 Mycogen Corporation Bacillus thuringiensis isolates for controlling acarida
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US5384924A (en) * 1992-08-03 1995-01-31 Mallinckrodt Medical, Inc. Warming blanket having multiple inlets
RO117111B1 (ro) * 1993-03-25 2001-10-30 Ciba Geigy Ag Proteina pesticida si secventa de nucleotide, care o codifica
GB9324529D0 (en) * 1993-11-30 1994-01-19 Univ Singapore Biological control agents

Also Published As

Publication number Publication date
ES2213162T3 (es) 2004-08-16
DK0792363T3 (da) 2004-04-26
IL115382A0 (en) 1995-12-31
AU3743395A (en) 1996-04-19
DE69532333T3 (de) 2013-03-14
ES2213162T5 (es) 2013-02-12
EP0792363B2 (en) 2012-09-26
ATE256743T1 (de) 2004-01-15
US5840868A (en) 1998-11-24
IL115382A (en) 2010-06-16
DK0792363T4 (da) 2013-01-07
PT792363E (pt) 2004-05-31
US5770696A (en) 1998-06-23
MX228013B (es) 2005-05-25
JPH10506532A (ja) 1998-06-30
AU692934B2 (en) 1998-06-18
US5990383A (en) 1999-11-23
EP1754789A3 (en) 2009-11-11
WO1996010083A1 (en) 1996-04-04
SI0792363T1 (en) 2004-04-30
HUT77449A (hu) 1998-04-28
US5872212A (en) 1999-02-16
CA2199049A1 (en) 1996-04-04
CN1160420A (zh) 1997-09-24
BR9509099A (pt) 1997-09-30
RU2196824C2 (ru) 2003-01-20
EP1754789A2 (en) 2007-02-21
EP1382611A2 (en) 2004-01-21
US5889174A (en) 1999-03-30
KR100419438B1 (ko) 2004-07-05
US6066783A (en) 2000-05-23
PH12002000307B1 (en) 2004-01-21
EP0792363B1 (en) 2003-12-17
MX9702212A (es) 1997-06-28
IL146109A0 (en) 2002-07-25
DE69532333D1 (de) 2004-01-29
CZ290801B6 (cs) 2002-10-16
EP1382611A3 (en) 2004-03-31
EP0792363A1 (en) 1997-09-03
TR199501182A2 (tr) 1996-06-21
BG101384A (en) 1997-10-31
SI0792363T2 (sl) 2013-01-31
PH11995051386B1 (en) 2002-09-18
DE69532333T2 (de) 2004-10-07
RO119835B1 (ro) 2005-04-29
US5866326A (en) 1999-02-02
US5888801A (en) 1999-03-30
US5849870A (en) 1998-12-15
CA2199049C (en) 2012-03-13
CN1255539C (zh) 2006-05-10
HU222264B1 (hu) 2003-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2199049C (en) Novel pesticidal proteins and strains
AU684068B2 (en) Novel pesticidal proteins and strains
MX2007012147A (es) Axmi-027, axmi-036 y axmi-038, una familia de genes delta-endotoxina y metodos para su uso.
CN117051017A (zh) 新型昆虫抑制性蛋白
JP2018525987A (ja) 新規の昆虫阻害タンパク質
TW496896B (en) An insect-specific protein or a protein enhancing the activity of an insect-specific protein, DNA molecule encoding same, and methods for producing sames

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140927