ES2668222T3 - Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD - Google Patents

Abstract

Un gen quimérico que comprende una secuencia codificante enlazada operativamente a un promotor expresable en plantas siendo el último un elemento regulador heterólogo a la secuencia codificante, caracterizado porque la secuencia codificante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387 o una proteína con una identidad entre secuencias de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, que muestra las propiedades de catalizar la conversión de para-hidroxifenilpiruvato a homogentisato y ser menos sensible a un herbicida inhibidor de HPPD que el HPPD endógeno de la planta hospedadora.

Description

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DESCRIPCION

Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de la HPPD Introducción

La presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que codifican una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (EC 1.13.11.27, abreviada en el presente documento HPPD) obtenidas a partir de bacterias que pertenecen al género Kordia, así como un gen quimérico que comprende dicha secuencia de ácidos nucleicos y al uso de dichas secuencias de ácidos nucleicos, proteínas o genes quiméricos para obtener plantas que son tolerantes a herbicidas inhibidores de las HPPD.

Antecedentes

Las HPPD son unas enzimas que catalizan la reacción en la que un para-hidroxifenilpiruvato (abreviado en el presente documento como HPP), un producto de degradación de la tirosina, se transforma en un homogentisato (abreviado en el presente documento como HG), el precursor en plantas de tocoferol y plastoquinona (Crouch N.P. y col. (1997) Tetrahedron, 53, 20, 6993-7010, Fritze y col., (2004), Plant Physiology 134:1388-1400). El tocoferol actúa como un antioxidante asociado a la membrana. La plastoquinona, en primer lugar actúa como un transportador de electrones entre el PSII y el complejo de citocromo b6/f y en segundo lugar es un cofactor rédox para la fitoeno desaturasa, que está implicada en la biosíntesis de carotenoides.

Hasta el momento actual, se anotaron más de 700 secuencias de ácidos nucleicos procedentes de diversos organismos presentes en la base de datos del NCBI como que codificaban una proteína putativa que tenía un dominio de HPPD e incluían la secuencia descrita bajo el número de acceso A9DQF2 que se da en la base de datos UniProtKB/TrEMBL así como bajo el número de acceso ZP02161490 que se da en la base de datos de proteínas del NCBI. Sin embargo, para la mayor parte de éstas, incluyendo la secuencia que corresponde al número de acceso A9DQF2/

ZP02161490, no se ha demostrado que esa proteína podría tener una actividad enzimática de HPPD o bien en un ensayo in vitro o en un enfoque in planta, ni que dicha proteína de HPPD pueda conferir a los herbicidas inhibidores de las HPPD una tolerancia a herbicidas, cuando se exprese en una planta. Se han descrito en el estado de la técnica varias proteínas de HPPD y sus secuencias primarias, en particular las proteínas de HPPD de bacterias tales como Pseudomonas (Rüetschi y col., Eur. J. Biochem., 205, 459-466, 1992, documento

WO 96/38567), de plantas tales como Arabidopsis (documento WO 96/38567, Genebank AF047834), zanahoria (documento Wo 96/38567, Genebank 87257), Avena sativa (documento WO 02/046387), trigo (documento WO 02/046387), Brachiaria platyphylla (documento WO 02/046387), Cenchrus echinatus (documento WO 02/046387), Lolium rigidum (documento WO 02/046387), Festuca arundinacea (documento wO 02/046387), Setaria faberi (documento WO 02/046387), Eleusine indica (documento WO 02/046387), sorgo (documento Wo 02/046387), Coccicoides (Genebank COITRP), de Coptis japonica (documento WO 06/132270), Chlamydomonas reinhardtii (documento de patente española ES 2275365), o de mamíferos tales como un ratón o un cerdo.

La mayor parte de las plantas sintetizan tirosina a través de arrogenato (Abou-Zeid y col. (1995), Applied Env Microb 41: 1298-1302; Bonner y col., (1995), Plant Cell Physiol. 36, 1013-1022; Byng y col., (1981), Phytochemistry 6: 12891292; Connely y Conn (1986), Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines y col., (1982), Planta 156: 233-240). En estas plantas, el HPP deriva solamente de la degradación de tirosina. Por otro lado, en organismos tales como la levadura Saccharomyces cerevisiae o la bacteria Escherichia coli, el HPP es un precursor de la tirosina y se sintetiza por la acción de una enzima, la prefenato deshidrogenasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada PDH), que convierte al prefenato en HPP (Lingens y col., (1967) European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar y Morrisson (1982), Bioch Biophys Acta 701: 204-211). En estos organismos, la producción de HPP está por lo tanto conectada directamente con la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos (ruta de shikimato) y no con la ruta de degradación de la tirosina.

La inhibición de una HPPD conduce a un desacoplamiento de la fotosíntesis, a una deficiencia en cuanto a pigmentos accesorios que cosechan luz y, lo más importante, a la destrucción de clorofila por radiación UV y de especies con oxígeno reactivas (blanqueo) debido a la falta de protección frente a la luz que es normalmente proporcionada por los carotenoides (Norris y col. (1995), Plant Cell 7: 2139-2149). El blanqueo de tejidos activos fotosintéticamente conduce a una inhibición del crecimiento y a una muerte de las plantas.

Algunas moléculas que inhiben a las HPPD, y que se unen específicamente a la enzima con el fin de inhibir la transformación del HPP en homogentisato, han demostrado ser unos herbicidas selectivos muy eficaces.

En el momento actual, la mayor parte de los herbicidas inhibidores de las HPPD que están disponibles pertenecen a una de estas cuatro familias químicas:

1) las tricetonas, por ejemplo sulcotriona [es decir 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], mesotriona [es decir 2-[4-(metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclohexanodiona]; tembotriona [es decir 2-[2-cloro-4-

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(metilsulfonil)-3-[(2,2,2-trifluoroetoxi)metil]benzoil]-1,3-cidohexanodiona]; tefuriltriona [es decir 2-[2-cloro-4- (metilsulfonil)-3-[[(tetrahidro-2-furanil)metoxi]metil]benzoil]-1,3-cidohexanodiona]]; biciclopirona [es decir 4- hidroxi-3-[[2-[(2-metoxietoxi)metil]-6-(trifluorometil)-3-piridinil]-carbonil]bicido[3.2.1]oct-3-en-2-ona]; benzobiciclona [es decir 3-(2-cloro-4-mesilbenzoil)-2-feniltiobiciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona]

2) los dicetonitrilos, por ejemplo 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona y 2- ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1-metilciclopropil)propano-1,3-diona;

3) los isoxazoles, por ejemplo isoxaflutol [es decir (5-ciclopropil-4-isoxazolilH2-(metilsulfonil)-4- (trifluorometil)fenil]metanona]. En las plantas, el isoxaflutol se metaboliza rápidamente en DKN, que es un compuesto dicetonitrilo que exhibe la propiedad inhibidora de las HPPD; y

4) los pirazolinatos, por ejemplo topramezona [es decir [3-(4,5-dihidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil](5- hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)metanona], y pirasulfotol [(5-hidroxi-1,3-dimetilpirazol-4-il-(2-mesil-4- trifluorometilfenil)-metanona]; pirazofeno [2-[4-(2,4-diclorobenzoil)-1,3-dimetilpirazol-5-iloxi]acetofenona].

Estos herbicidas inhibidores de las HPPD se pueden usar contra malezas herbáceas y/o de hoja ancha en presencia de plantas cultivadas, que presentan una tolerancia metabólica, tales como las de maíz (Zea mays), en las que ellos son degradados rápidamente (Schulz y col., (1993). FEBS letters, 318, 162-166; Mitchell y col., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 120-128; Garcia y col., (2000) Biochem., 39, 7501-7507; Pallett y col., (2001) Pest Management Science, Vol 57, 133-142). Con el fin de ampliar el alcance de estos herbicidas inhibidores de las HPDD, se han desarrollado varios esfuerzos con el fin de conferir a plantas, particularmente a plantas sin tolerancia metabólica o con una tolerancia metabólica de bajo rendimiento, un nivel de tolerancia que sea aceptable en condiciones agronómicas en el campo.

Junto con el intento de evitar la producción de homogentisato mediada por una HPPD (documento US 6.812.010), se ha realizado una sobreexpresión de la enzima sensible, de manera tal que se produzcan unas cantidades de la enzima diana en la planta que sean suficientes en relación con el herbicida (documento WO96/38567). Una sobreexpresión de una HPPD dio como resultado una mejor tolerancia antes del brote para el derivado de dicetonitrilo (DKN) del isoxaflutol (IFT), pero la tolerancia no era suficiente para tener una tolerancia a un tratamiento después del brote (Matringe y col., (2005), Pest Management Science 61: 269-276).

Una tercera estrategia consistió en mutar a la HPPD con el fin de obtener una enzima diana que, mientras que retiene sus propiedades de catalizar la transformación de HPP en homogentisato, es menos sensible a los inhibidores de las HPPD que lo es la HPPD nativa antes de la mutación.

Esta estrategia se ha aplicado con éxito para la producción de plantas tolerantes a la 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2- metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona y a la 2-ciano-1-[4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1- metilciclopropil)propano-1,3-diona (documento EP496630), que son dos herbicidas inhibidores de las HPPD que pertenecen a la familia de los dicetonitrilos (documento wO 99/24585). Las Pro215Leu, Gly336Glu, Gly336Ile y más particularmente Gly336Trp (las posiciones del aminoácido mutado se indican con referencia a la HPPD de Pseudomonas) se identificaron como unas mutaciones que son responsables de una tolerancia aumentada a un tratamiento antes del brote con estos herbicidas de dicetonitrilo, sin causar una alteración de la actividad de la enzima.

Más recientemente, se ha mostrado que la introducción de un gen de HPPD de Pseudomonas en el genoma de plastidios de tabaco y soja es más eficaz que una transformación nuclear, confiriendo incluso tolerancia a la aplicación de isoxaflutol después del brote (Dufourmantel y col., 2007, Plant Biotechnol J.5(1):118-33).

En el documento WO 04/024928, los autores de la invención han buscado aumentar la biosíntesis de prenilquinona (por ejemplo, síntesis de plastoquinonas y tocoferoles) en las células de plantas por aumento del flujo del precursor de HPP dentro de las células de estas plantas. Esto se ha realizado conectando la síntesis de dicho precursor con la ruta de “shikimato” por sobreexpresión de una enzima PDH. Han observado también que la transformación de plantas con un gen que codifica una enzima PDH hace posible aumentar la tolerancia de dichas plantas a agentes inhibidores de las HPPD.

En la solicitud de patente WO 2009/144079, se describen una secuencia de ácido nucleico que codifica una hidroxifenilpiruvato dioxigenasa (HPPD) mutada en la posición 336 de la proteína de HPPD de Pseudomonas fluorescens y su uso para obtener plantas que son tolerantes a herbicidas inhibidores de las HPPD.

En el documento WO 2002/046387, se han identificado varios dominios de proteínas de HPPD que se originan a partir de plantas que pueden ser relevantes para conferir tolerancia a diversos herbicidas inhibidores de las HPPD pero no se han mostrado datos in planta ni bioquímicos que confirmen el impacto de las funciones de los dominios que se acaban de describir.

En el documento WO 2008/150473, se dio como ejemplo la combinación de dos distintos mecanismos de tolerancia - un gen de Avena sativa modificado que codifica una enzima HPPD mutante y un CYP450 de monooxigenasa de maíz (gen de nsf1) con el fin de obtener una tolerancia mejorada a herbicidas inhibidores de las HPPD, pero no se han descrito datos que demuestren los efectos sinérgicos basados en la combinación de ambas proteínas.

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A pesar de estos éxitos obtenidos para el desarrollo de plantas que muestran tolerancia para diversos herbicidas inhibidores de las HPPD que se han descrito más arriba, todavía es necesario desarrollar y/o mejorar la tolerancia de plantas a unos agentes inhibidores de las HPPD más nuevos o a varios diferentes, particularmente a unos agentes inhibidores de las HPPD que pertenecen a las clases de las tricetonas (por ejemplo sulcotriona, mesotriona, tembotriona, benzobiciclona y biciclopirona) y de los pirazolinatos (por ejemplo, topramezona y pirasulfotol).

Descripción

La presente invención se refiere por lo tanto a la generación de plantas transgénicas que contienen un gen que codifica una proteína de HPPD obtenible u obtenida a partir de un organismo que pertenece al género de Kordia, y variantes o mutantes del mismo, más especialmente a un gen procedente de un organismo que pertenece a la especie Kordia algicida y variantes o mutantes del mismo, que codifica una enzima HPPD que muestra las propiedades de catalizar la conversión de un para-hidroxifenilpiruvato en un homogentisato y cuyas plantas son menos sensibles a agentes inhibidores de las HPPD que unas plantas que contienen dicho transgén que codifica una HPPD. Los genes procedentes de Kordia que codifican proteínas de HPPD fueron seleccionados como excelentes candidatos tolerantes a agentes inhibidores de las HPPD debido a sus altas divergencias en la composición de aminoácidos en unas posiciones relevantes para la tolerancia a los agentes inhibidores de las HPPD, tal como se determina de manera experimental y estructural en la proteína de HPPD en comparación con la proteína de HPPD de Arabidopsis sensible que se tomó como la molécula de referencia sensible a los agentes inhibidores de las HPPD.

En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de HPPD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de su secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4, 5, 6 o 7, preferentemente de la SEQ ID NO. 6. La divulgación se refiere a una proteína de HPPD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de su secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al

menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la

SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las sEq ID NO. 4, 5, 6, 7, preferentemente de la SEQ ID NO. 6, y en que cualquiera de los aminoácidos desde la posición 195 hasta la posición 387 de la SEQ ID NO. 4 puede ser corregido por cualquier aminoácido presente en la naturaleza, preferentemente puede ser cualquier sustitución conservativa. La divulgación se refiere además a una proteína de HPPD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de su secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al

menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la

SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las sEq ID NO. 4, 5, 6, 7, preferentemente de la SEQ ID NO. 6, y que tiene uno o más de los siguientes aminoácidos en la posición definida por su número (que se refiere al número de la SEQ ID NO. 4) dado entre paréntesis, es decir His(193), Ser(236), Asn(251), Gln(275), His(276), Tyr(305), Gln(340), Phe(353), Glu(355), Gly(366), y Asn(369). La divulgación se refiere además a una proteína de HppD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de su secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4, 5, 6, 7, preferentemente de la SEQ ID NO. 6, y en las respectivas posiciones dadas en la segunda columna de la Tabla (i) los aminoácidos originalmente presentes pueden ser sustituidos por cualesquiera de los aminoácidos enumerados en la columna 3 de la Tabla (i).

Aminoácido en SEQ ID

NO.4

Val

Ile

Ile

Phe

Leu

Lys

Met

Tabla (i):

Posición en SEQ

ID NO.4

195

219

220 222 234 237 239

Sustituciones Thr, Cys, Ala, Gly

Phe, Tyr, Leu, Val, Ala, Gln, Glu, Asp, Gly, Thr, Ser, Met, Arg, Lys Ala, Trp, Leu, Ser, Arg, Lys, His, Asp, Glu, Pro, Gly, Asn Val, Ile, Ala, Leu, Trp, Met, Gln, His Met, Val

Ala, Val, Leu, Met, Ile, Arg, Gln, Tyr Leu, Val, Ile, Ala

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(continuación)

Aminoácido en SEQ ID NO.4

Posición en SEQ ID NO.4 Sustituciones

Ser

240 Ala, Thr, Val, Arg, Lys, Glu, Leu, Ile, Met, His

Ala

372 Glu, Gln, Ser, Val, Phe, Thr

Leu

373 Arg

La divulgación se refiere además a una proteína de HPPD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 a 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4, 5, 6, 7, preferentemente de la SEQ ID NO. 6, y en las respectivas posiciones dadas en la segunda columna de la Tabla (ii) los aminoácidos originalmente presentes pueden ser sustituidos por cualesquiera de los aminoácidos enumerados en la columna 3 de la Tabla (ii).

Tabla (ii):

Amino ácido en SEQ ID

NO.4

Ser

Val

Pro

Leu

Leu

Val

Gly

Posición en SEQ ID NO.4 221 238 249 299 329

367

368

Sustituciones

Glu, Thr, Tyr, Phe, His, Gln, Asn, Gly, Leu, Met, Val, Arg, Ile Ala, Thr

Ala, Val, Thr, Asn, Ile,

Met, Ile, Asn Met

Cualquiera excepto Pro Ala, Pro, Val, Thr, Met

La divulgación se refiere además a una proteína de HPPD denominada en el presente documento “la proteína de HPPD de la presente invención” o “la proteína de HPPD de Kordia”, que es una proteína de HPPD con una identidad de su secuencia de aminoácidos de al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %; al menos 97 %; al menos 98 %, o al menos 99 % con respecto a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 a 387, particularmente con respecto a la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4, 5, 6, 7, preferentemente SEQ ID NO. 6, y en las respectivas posiciones dadas en la segunda columna de la Tabla (iii) los aminoácidos originalmente presentes pueden ser sustituidos por cualesquiera de los aminoácidos enumerados en la columna 3 de la Tabla (iii).

Tabla (iii)

Amino ácido en SEQ ID NO.4

Posición en SEQ ID NO.4 Sustituciones

Ser

221 Glu, Thr, Arg, Tyr

Val

238 Ala

Pro

249 Ala, Val, Thr

Leu

299 Met

Leu

329 Met

Val

367 Ile, Ala, Val, Leu, Lys

Gly

368 Ala

La invención usa una proteína con aminoácidos sustituidos, suprimidos o añadidos en comparación con la secuencia de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, tales como una proteína de fusión con un péptido de tránsito, o una proteína con cambios de aminoácidos en la secuencia de la SEQ ID NO. 4 que retiene la función enzimática de una proteína de HPPD, y que todavía confiere una tolerancia a las HPPD cuando se expresa en plantas, preferentemente una tolerancia a las HPPD de rango comparable con la conferida por la proteína de la SEQ ID NO. 4. Esto incluye proteínas variantes o mutantes derivadas de la proteína de la SEQ ID NO. 4, tales como cualquiera de las proteínas de las SEQ ID NO. 5, 6 o 7, particularmente aquella mutante o variante que es menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora a un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas o pirazolinatos, preferentemente aquella mutante

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o variante que confiere una tolerancia a herbicidas agronómicamente relevante a una planta hospedadora que la expresa cuando un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas y/o pirazolinatos, particularmente cualquiera tomado de mesotriona, tembotriona, isoxaflutol o biciclopirona es aplicado sobre dichas plantas, más particularmente cuando es aplicado después del brote. Esto incluye también una proteína que comprende una porción activa de la secuencia de la SEQ ID NO. 4, cuya porción confiere una tolerancia a agentes inhibidores de las HPPD cuando se expresa en plantas. Esto incluye una proteína con sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de la SEQ ID NO. 4, tal como una proteína con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4 hasta 7. Esto incluye proteínas aisladas como se definen a continuación, y también unas proteínas, tales como la proteína de la SEQ ID NO. 4, en las que ciertos aminoácidos han sido reemplazados por unos similares aminoácidos como se definen a continuación, preferentemente sustituciones conservativas de aminoácidos. También están incluidas en el presente contexto como proteínas de HPPD de la presente invención unas proteínas de HPPD que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, pero en las que 1-20, 1-15, 1-10 o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 aminoácidos han sido suprimidos o han sido sustituidos por otros aminoácidos, particularmente una proteína tal que retiene la actividad enzimática de las HPPD y que confiere tolerancia a herbicidas inhibidores de las HPPD cuando es expresada en una planta hospedadora. Están incluidas en el presente contexto unas proteínas de HPPD codificadas por unas secuencias de ADN homologas a las secuencias de ADN de la invención como se describen a continuación, o unas proteínas de HPPD codificadas por una secuencia de ADN que se hibrida con al menos una porción (de al menos 20-30 nucleótidos) del ADN de la SEQ ID NO. 1, o que es obtenible usando un cebador basado en SEQ ID NO. 1, o unas proteínas de HPPD con identidad entre secuencias de al menos 75 % con la SEQ ID NO. 4, que son codificadas por una secuencia de ADN hallada en la secuencia del genoma de un microorganismo, tal como una bacteria, tal como un microorganismo del género de Kordia. Está incluida en el presente contexto como una proteína de HPPD de la presente invención una proteína de HPPD de Kordia que confiere una tolerancia a herbicidas a unas plantas cuando es expresada en tales plantas, en las que dicha tolerancia es a un agente inhibidor de las HPPD tal como mesotriona, tembotriona, isoxaflutol o biciclopirona, particularmente dicha proteína de HPPD es una proteína de HPPD de Kordia algicida, tal como una proteína que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387. Esto incluye las proteínas de HPPD mutantes o variantes tal como se describen a continuación.

La presente divulgación incluye y proporciona un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una proteína sustancialmente purificada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 7, o secuencias derivadas de la misma de acuerdo con un reemplazo de aminoácidos tal como se describe en una o más de las Tablas (i), (ii) o (iii) anteriores.

Un aspecto adicional de la divulgación concierne a anticuerpos, moléculas monocatenarias de unión a antígenos, u otras proteínas que se unen específicamente a una o más de las moléculas de proteínas o péptidos de la invención y sus compuestos homólogos, fusiones o fragmentos. En una realización particularmente preferida, el anticuerpo se une específicamente a una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos que se expone en las SEQ ID NO: 4-7 o un fragmento de la misma, o secuencias derivadas de la misma de acuerdo con un reemplazo de aminoácidos tal como se describe en una o más de las Tablas (i), (ii) o (iii) anteriores.

En otra divulgación el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos que se exponen en las SEQ ID NO: 4-7, o un fragmento de la misma, o secuencias derivadas de la misma de acuerdo con un reemplazo de aminoácidos tal como se describe en una o más de las Tablas (i), (ii) o (iii) anteriores.

En otra divulgación, el anticuerpo se une específicamente a una proteína de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias de aminoácidos que se exponen en las SEQ ID NO: 4-7, o un fragmento de la misma, o secuencias derivadas de la misma de acuerdo con un reemplazo de aminoácidos tal como se describe en una o más de las Tablas (i), (ii) o (iii) anteriores.

También se incluyen en el presente documento como ADN de HPPD unas secuencias de ADN que codifican una proteína de HPPd de la invención cuyas secuencias de ADN han sido adaptadas para la expresión en microorganismos o plantas, tal como por reemplazo de codones nativos por unos codones más preferidos en una célula hospedadora, o en las que ciertos sitios de restricción han sido añadidos o retirados para conseguir facilidad de clonación, o una secuencia de ADN con un cierto número de nucleótidos añadidos, reemplazados o suprimidos. Esto incluye también secuencias de ADN aisladas y ADN o ácidos nucleicos variantes, mutantes o sintéticos, como se describen más adelante. En una realización particular, el ADN de HPPD de Kordia de la presente invención se expresa en plantas bajo el control de un promotor que permite la expresión de genes exógenos en plantas. En una realización particular adicional, junto al extremo N-terminal de la enzima de HPPD expresada de esta manera está situado un péptido de señal, tal como un péptido de tránsito, preferentemente un péptido de tránsito de plastidio, tal como un péptido de tránsito de cloroplastos con aproximadamente 120 aminoácidos (desde aproximadamente 30 hasta aproximadamente 120 aminoácidos) de manera sumamente preferible un doble péptido de tránsito, tal como un péptido de tránsito optimizado cuya primera parte se origina de girasol (Helianthus annuus) y cuya segunda parte se origina de Zea mays (maíz) (que ha sido descrito en la patente US 5.188.642) o un péptido de tránsito de plastidio que se origina de la de la subunidad pequeña de ribulosa biscarboxilasa/oxigenasa de plantas (RuBisCO ssu, acrónimo de ribulose biscarboxilase / oxigenase small subunit), que cuando sea apropiado incluye unos pocos

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aminoácidos de la parte N-terminal de la RuBisCO ssu madura (documento EP 189 707).

En una realización particular adicional, la presente invención incluye un ADN que codifica una proteína de HPPD de la presente invención que deriva o es obtenible a partir de la SEQ ID NO. 1 y está optimizado para la expresión en E. coli, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 2 desde la posición de nucleótido 25 hasta la posición de nucleótido 1.182 (que incluye las posiciones definidas).

En una realización particular adicional, la presente invención incluye un ADN que codifica una proteína de HPPD de la presente invención que deriva de la sEq ID NO. 1 y está optimizado para la expresión en plantas, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 3 desde la posición de nucleótido 400 hasta la posición de nucleótido 1.557 (que incluye las posiciones definidas).

En una realización particular adicional, la HPPD de la invención, tal como la HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, o la HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO. 4 hasta 7, es menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora a un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas o pirazolinatos, o a un herbicida inhibidor de las HPPD, seleccionado de isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, sulcotriona, pirasulfotol, topramezona, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3fenil)- propano-1,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Ch fenil)-propano-1,3-diona, biciclopirona,

benzobiciclona, tefuriltriona y pirazoxifeno.

En una divulgación particular adicional, la presente invención incluye un ADN que codifica una proteína de HPPD de la presente invención que deriva de la SEQ ID NO. 1 y está optimizado para la expresión en E. coli, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 2 desde la posición de nucleótido 25 hasta la posición de nucleótido 1.182 (que incluye las posiciones definidas) que codifica una HPPD menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora a al menos una herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas o pirazolinatos, preferentemente a tembotriona, mesotriona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, dicetonitrilo, pirasulfotol, topramezona, sulcotriona, pirazolato y benzofenap.

En una realización particular adicional, la presente invención incluye un ADN que codifica una proteína de HPPD de la presente invención que está optimizado para la expresión en plantas, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID No. 3 desde la posición de nucleótido 400 hasta la posición de nucleótido 1.557 (que incluye las posiciones definidas), que codifica una HPPD menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora a al menos un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas o pirazolinatos, preferentemente a tembotriona, mesotriona, biciclopirona, tefuriltriona, isoxaflutol, dicetonitrilo, pirasulfotol, topramezona, sulcotriona, pirazolato y benzofenap.

En una realización particular adicional, la presente invención se refiere a plantas, partes de plantas, células de plantas y progenies de estas plantas que comprenden un ADN que codifica una proteína de HPPd de la invención, que está optimizado para la expresión en E. coli, o está optimizado para la expresión en plantas, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 2 desde la posición de nucleótido 25 hasta la posición de nucleótido 1.182 (que incluye las posiciones definidas) o de la SEQ ID NO. 3 desde la posición de nucleótido 400 hasta la posición de nucleótido 1.557 (que incluye las posiciones definidas) que codifica una HPPD menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora. Tales plantas incluyen, pero no se limitan a, plantas cultivadas en el campo, frutos y hortalizas tales como canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocotón, manzana, pera, fresa, plátano, melón, patata, zanahoria, lechuga, col, cebolla, especies de soja, caña de azúcar, guisantes, judías, álamo, uva, frutos cítricos, alfalfa, centeno, avena, hierbas de césped y forrajeras, lino y colza de semilla oleaginosa, y plantas productoras de nueces.

En una realización más particular, la presente invención se refiere a plantas, partes de plantas, células de plantas y progenies de estas plantas que comprenden cualesquiera de los ADN que codifican una HPPD de la invención que está optimizada para la expresión en E. coli, u optimizada para la expresión en plantas, tal como un ADN optimizado en codones, por ejemplo un ADN que comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 2 desde la posición de nucleótido 25 hasta la posición de nucleótido 1.182 (que incluye las posiciones definidas) o de la SEQ ID NO. 3 desde la posición de nucleótido 400 hasta la posición de nucleótido 1.557 (que incluye las posiciones definidas) que codifica una HPPD menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora, y en las que las plantas están seleccionadas del grupo que consiste en canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodón, maíz, trigo, cebada, arroz, patata, especies de soja, caña de azúcar, guisantes, judías, álamo, uva, alfalfa, centeno, avena, hierbas de césped y forrajeras, lino y colza de semilla oleaginosa, y plantas productoras de nueces, incluso de manera más preferible tales plantas están seleccionadas del grupo que consiste en especies de soja, arroz, remolacha azucarera, trigo, algodón, canola, colza de semilla oleaginosa o maíz.

En otra realización particular, la proteína de HPPD de la invención comprende la secuencia de la SEQ ID NO. 7 y es menos sensible a un agente inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas (que se denominan agentes inhibidores de las HPPD tricetonas), tales como tembotriona, sulcotriona mesotriona, biciclopirona, tefuriltriona, particularmente tembotriona, o de la clase de los dicetonitrilos (isoxaflutol) o de la clase de los pirazolinatos (que se

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denominan agentes inhibidores de las HPPD pirazolinatos), tales como pirasulfotol, pirazolato, topramezona, benzofenap en comparación con la HPPD no mutada endógena de una planta, particularmente la planta hospedadora en la que dicha HPPD de la invención es expresada o ha de ser expresada.

La actividad enzimática de las proteínas de HPPD puede ser medida por cualquier procedimiento que haga posible ya sea medir la disminución en la cantidad de los substratos de HPP o de O2, o medir la acumulación de cualquiera de los productos derivados de la reacción enzimática, es decir homogentisato o CO2. En particular, la actividad de HPPD puede ser medida por medio del procedimiento descrito en las citas de Garcia y col. (1997), Biochem. J. 325, 761-769 o Garcia y col. (1999), Plant Physiol. 119, 1507-1516, que son incorporadas en el presente contexto por su referencia.

De acuerdo con la invención, un agente inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas (o que se denomina agente inhibidor de las HPPD tricetona) significa un agente inhibidor de las HPPD que tiene un esqueleto de tricetona. Como un ejemplo de dichos agentes inhibidores de las HPPD tricetona, se pueden citar las moléculas sulcotriona [es decir 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)-benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], mesotriona [es decir 2-[4- (metilsulfonil)-2-nitrobenzoil]-1,3-ciclohexanodiona], y tembotriona [es decir 2-[2-cloro-4-(metilsulfonil)-3-[(2,2,2- trifluoroetoxi)metil]benzoil]-1,3-ciclohexanodiona], tefuriltriona [es decir 2-{2-cloro-4-mesil-3-[(RS)-tetrahidro-2- furilmetoximetil]-benzoil}ciclohexano-1,3-diona], biciclopirona [es decir 4-hidroxi-3-{2-[(2-metoxietoxi)metil]-6- (trifluorometil)-3-piridilcarbonil}biciclo[3.2.1]oct-3-en-2-ona], benzobiciclona [es decir 3-(2-cloro-4-mesilbenzoil)-2- feniltiobiciclo[3.2.1]oct-2-en-4-ona].

De acuerdo con la invención, un agente inhibidor de las HPPD de la clase de los pirazolinatos (o agente inhibidor de las HPPD pirazolinato) significa un agente inhibidor de las HPPD que tiene un radical pirazol. Como un ejemplo de tales agentes inhibidores de las HPPD pirazolinatos, se pueden citar las moléculas topramezona [es decir [3-(4,5- dihidro-3-isoxazolil)-2-metil-4-(metilsulfonil)fenil]-(5-hidroxi-1-metil-1H-pirazol-4-il)metanona] y pirasulfotol [(5-hidroxi- 1,3-dimetilpirazol-4-il-(2-mesil-4-trifluorometilfenil)metanona].

La presente invención se refiere también a una secuencia de ácido nucleico, particularmente un ADN aislado, preferentemente un gen quimérico expresable en plantas, que codifica la HPPd de Kordia de la invención y secuencias adaptadas de la misma.

La presente invención se refiere también a una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima HPPD de la presente invención que retiene sus propiedades de catalizar la conversión de para-hidroxifenilpiruvato en homogentisato y que es menos sensible a los agentes inhibidores de las HPPD de la clase de las tricetonas tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos tales como pirasulfotol y topramezona, tefuriltriona, biciclopirona, benzobiciclona que la HPPD endógena no mutada de la planta, y cuya secuencia codificada de aminoácidos muestra una identidad entre secuencias con la SEQ ID NO. 4 de al menos 75 %, 80 %, particularmente de al menos 85 %, preferentemente de al menos 90 %, de manera más preferible de al menos 95 %, incluso de manera más preferible de al menos 98 % y de manera sumamente preferible de al menos 99 %.

En una realización más particular, la secuencia de ácido nucleico de la invención codifica una enzima HPPD que es menos sensible a un agente inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona, mesotriona, biciclopirona y tefuriltriona, de la clase de los isoxazoles tales como isoxaflutol de la clase de los pirazolinatos (que se denominan inhibidores de las HPPD pirazolinatos), tales como pirasulfotol, pirazolato, topramezona, benzofenap, o de la clase de las dicetonas tales como dicetonitrilo, que la HPPD endógena de la planta hospedadora.

De acuerdo con la presente invención, se entiende que una "secuencia de ácido nucleico" es una secuencia de nucleótidos que puede ser del tipo de ADN o de ARN, preferentemente del tipo de ADN, y en particular de doble hebra, ya sea de origen natural o sintético, en particular una secuencia de ADN en la que los codones que codifican la HPPD de acuerdo con la invención han sido optimizados de acuerdo con el organismo hospedador en el que ella ha de ser expresada (por ejemplo, reemplazando unos codones por aquellos codones que son más preferidos o sumamente preferidos en tablas de trato con codones de dicho organismo hospedador o el grupo al que dicho organismo hospedador pertenece, en comparación con el organismo original o de fuente).

Un “ácido nucleico/ADN/proteína aislado/a”, como se usa en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico/ADN/proteína que no es de origen natural (tal como un aDn artificial o sintético con una secuencia de nucleótidos que es diferente que la del ADN que se presenta en la naturaleza, o una proteína modificada) o que ya no se encuentra en el entorno natural en el que originalmente estaba presente, por ejemplo una secuencia que codifica un ADN, asociada con un elemento regulador heterólogo (tal como una secuencia codificante bacteriana conectada operativamente a un promotor expresable en una planta) en un gen quimérico, un ADN transferido dentro de otra célula hospedadora, tal como una célula de planta transgénica.

A la vista de una realización particular de la invención y de la solución buscada, es decir una HPPD que es menos sensible a un inhibidor de las HPPD de tricetona, isoxazol o pirazolinato, la medición del nivel de tolerancia se analiza usando el procedimiento extensamente descrito en el documento WO 2009/14407 tal como se describe a continuación, usando un inhibidor de las HPPD de tricetona, isoxazol o pirazolinato, particularmente un agente inhibidor de las HPPD seleccionado de tembotriona, mesotriona, pirasulfotol, topramezona sulcotriona, biciclopirona, dicetonitrilo, benzofenap, pirazolato y tefuriltriona.

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La terminología de un ADN o una proteína “que comprende” una cierta secuencia “X”, como se usa a lo largo del texto, se refiere a un ADN o una proteína que incluye o que contiene al menos la secuencia “X”, de manera tal que otras secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden estar incluidas junto a los extremos 5' (o N-terminal) y/o 3' (o C-terminal), por ejemplo (la secuencia de nucleótidos de) una proteína marcadora seleccionable, (la secuencia de nucleótidos de) un péptido de tránsito, y/o una secuencia líder en 5' o una secuencia de remolque en 3'. Similarmente, debería entenderse que el uso del término “comprender”, “que comprende” o “comprende” a lo largo del texto y las reivindicaciones de esta solicitud implica la inclusión de una señalada parte entera o etapa o de un señalado conjunto de partes enteras o etapas, pero no la exclusión de cualquier otra parte entera o etapa o conjunto de partes enteras o etapas. Las regiones codificantes que codifican una HPPD comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica unas proteínas con las secuencias de aminoácidos que se exponen en las SEQ ID NO 4, 5, 6 y 7, tales como las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO 1, 2 y 3.

Sin embargo, resultará evidente que las variantes de estas secuencias de nucleótidos, incluyendo inserciones, supresiones y sustituciones de las mismas, se pueden usar también con el mismo efecto. Igualmente, se pueden usar unas secuencias homólogas a las secuencias de nucleótidos mencionadas, procedentes de especies diferentes de Kordia algicida.

Las variantes de la secuencia de nucleótidos que se ha descrito tendrán una identidad entre secuencias que será preferentemente de al menos aproximadamente 70 %, 80 %, 85 % o 90 % o al menos 95 % con unas secuencias de nucleótidos identificadas que codifican unas enzimas HPPD tales como las identificadas en la lista de secuencias.

Una proteína que tiene “sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos” que una proteína como se describe como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína que tiene una identidad entre secuencias de al menos 90 %, particularmente de al menos 95 %, preferentemente de al menos 97 % con una proteína de acuerdo con la invención, en la que el porcentaje de identidad entre secuencias se determina usando la matriz de calificación blosum62 en el programa GAP del paquete de Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU.) versión 10.0 (se usaron defectos de GCG). "Identidad entre secuencias", tal como se usa a lo largo de esta solicitud, cuando se refiere a proteínas, se refiere al porcentaje de aminoácidos idénticos cuando se usa este análisis especificado. La "identidad de secuencias", como se usa en el presente documento, cuando se refiere a secuencias de ADN, se determina usando la matriz de calificación nwsgapdna en el programa GAP del paquete de Wisconsin de GCG (Madison, Wisconsin, EE.UU.) versión 10.0 (se usaron defectos de GCG).

Para la finalidad de la presente invención, la “identidad de secuencias” de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos relacionadas, expresada como un porcentaje, se refiere al número de posiciones en las dos secuencias, alineadas de una manera óptima, que tienen restos idénticos (x 100) dividido por el número de posiciones que se han comparado. Un hueco, es decir una posición en una alineación en la que un resto está presente en una secuencia pero no en la otra, se considera una posición con restos no idénticos. La alineación de las dos secuencias se realiza por el algoritmo de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch 1970). La anterior alineación de secuencias asistida por ordenador, se puede realizar convenientemente usando un programa de software clásico, tal como el GAP que es parte del paquete de Wisconsin Package Versión 10.1 (de Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, EE.UU.) usando la matriz de calificación por defecto con una penalización por creación de un hueco de 50 y una penalización por prolongación de un hueco de 3.

Las secuencias de nucleótidos homologas a las secuencias de nucleótidos que codifican una enzima HPPD de acuerdo con la invención pueden identificarse por un análisis in silico de datos de secuencias genómicas.

Una secuencia de nucleótidos homóloga puede identificarse y aislarse también por hibridación en condiciones rigurosas usando como sondas unas secuencias de nucleótidos identificadas que codifican unas enzimas HPPD de acuerdo con la invención o partes de las mismas. Dichas partes deberán tener preferentemente una secuencia de nucleótidos que comprenda al menos 40 nucleótidos consecutivos procedentes de la región codificante de secuencias de genes que codifican las HPPD de acuerdo con la invención, procedentes preferentemente de la región codificante de las SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3. Sin embargo, las sondas pueden comprenden regiones más largas de secuencias de nucleótidos que derivan de los ácidos nucleicos que codifican las HPPD, tal como aproximadamente 50, 60, 75, 100, 200 o 500 nucleótidos consecutivos procedentes de cualquiera de los genes de HPPD que se han mencionado. Preferentemente, la sonda debería comprender una secuencia de nucleótidos que codifique una región conservada en alto grado, que puede ser identificada por alineación de las diferentes proteínas de HPPD.

“Condiciones de hibridación rigurosas” como se usa en el presente documento significa que una hibridación se realizará generalmente si hay una identidad entre secuencias de al menos 95 % y preferentemente al menos de 97 % entre la sonda y la secuencia diana. Los ejemplos de condiciones rigurosas de hibridación son una incubación durante una noche en una solución que comprende 5xSSC (150 mM de NaCl, 15 mM citrato de trisodio), 50 mM de fosfato de sodio (de pH 7,6), 5x solución de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano y 20 pg/ml de un ADN vehículo cortado y desnaturalizado tal como un ADN de esperma de salmón, seguido por un lavado del soporte de hibridación en 0,1xSSC a aproximadamente 65 °C, preferentemente dos veces durante aproximadamente 10 minutos. Otras condiciones de hibridación y de lavado son bien conocidas y se dan como ejemplo en la cita de Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual [Clonación molecular, un manual de laboratorio], Segunda edición, Cold Spring Harbor, NY (1989), particularmente el capítulo 11.

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Dichas secuencias variantes se pueden obtener también mediante una amplificación de ADN usando unos oligonucleótidos específicos para genes de HPPD que codifican enzimas como cebadores, tales como, pero sin limitarse a, unos oligonucleótidos que comprenden desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos seleccionados de las secuencias de nucleótidos de las SEQ ID NO 1, 2, 3, o su complemento.

La invención comprende también unas enzimas de HPPD variantes que son unas secuencias de aminoácidos similares a la secuencia de aminoácidos de HPPD de las SEQ ID NO. 4 en la que uno o más aminoácidos se han introducido, suprimido o sustituido. En el presente contexto, las variantes de una secuencia de aminoácidos se refieren a aquellos polipéptidos, enzimas o proteínas que tienen una actividad catalítica similar a la de las secuencias de aminoácidos que en el presente documento se describen, a pesar de cualesquiera sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos que se realicen en ellas. Preferentemente, la secuencia variante de aminoácidos tiene una identidad entre secuencias de al menos aproximadamente 80 %, o de 85 o 90 % o 95 % con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO. 4. También preferentemente, un polipéptido que comprende la secuencia variante de aminoácidos tiene la actividad enzimática de las HPPD. Unos procedimientos para determinar la actividad enzimática de las HPPD son bien conocidos en la técnica e incluyen unos ensayos que se describen extensamente en el documento WO 2009/144079 o en el documento WO 2002/046387.

Las sustituciones comprenden unas alteraciones de aminoácidos en las que un aminoácido se reemplaza por un diferente resto de aminoácido de origen natural o uno no convencional. Dichas sustituciones se pueden clasificar como “conservativas” cuando un resto de aminoácido contenido en una proteína de HPPD de la presente invención se reemplaza por otro aminoácido presente en la naturaleza que tiene un carácter similar, por ejemplo Gly^Ala, Val^Ile^-Leu, Asp^-Glu, Lys^Arg, Asn^Gln o Phe^-Trp^Tyr. Las sustituciones comprendidas por la presente invención pueden también ser “no conservativas”, cuando un resto de aminoácido que está presente en una proteína de HPPD de la presente invención es sustituido por un aminoácido que tiene propiedades diferentes, tal como un aminoácido de origen natural procedente de un grupo diferente (por ejemplo por sustitución de un aminoácido cargado o hidrófobo por alanina). Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de restos únicos, pero pueden ser también de restos múltiples, ya sea arracimados o dispersados. Las supresiones de aminoácidos serán habitualmente del orden de aproximadamente 1-10 restos de aminoácidos, mientras que las inserciones pueden ser de cualquier longitud. Las supresiones e inserciones se pueden hacer en el extremo N-terminal, en el extremo C- terminal, o pueden ser supresiones o inserciones internas. Generalmente, unas inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán menores que unas fusiones en los terminales de amino o de carboxi y del orden de 1 a 4 restos de aminoácidos. “Aminoácidos similares”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a unos aminoácidos que tienen unas similares cadenas de aminoácidos, es decir unos aminoácidos que tienen cadenas laterales polares, no polares o prácticamente neutras. “aminoácidos no similares”, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a unos aminoácidos que tienen diferentes cadenas laterales de aminoácidos, por ejemplo un aminoácido con una cadena lateral polar no es similar a un aminoácido con una cadena lateral no polar. Las cadenas laterales polares tienden habitualmente a estar presentes sobre la superficie de una proteína cuando ellas pueden interactuar con el entorno acuoso hallado en células (aminoácidos “hidrófilos”). Por otra parte, los aminoácidos “no polares” tienden a residir dentro del centro de la proteína en donde ellos pueden interactuar con vecinos no polares similares (aminoácidos “hidrófobos”). Los ejemplos de aminoácidos que tienen cadenas laterales polares son arginina, asparagina, aspartato, cisteína, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina (todos ellos hidrófilos, excepto la cisteína que es hidrófoba). Los ejemplos de aminoácidos que tienen cadenas laterales polares son alanina, glicina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina y triptófano (todos ellos hidrófobos, excepto la glicina que es neutra).

También se comprenden por la presente invención unos anticuerpos que reconocen específicamente a una enzima HPPD de acuerdo con la invención.

La invención se refiere también al uso, en un procedimiento para transformar plantas, de un ácido nucleico que codifica una HPPD de acuerdo con la invención como un gen marcador o como una secuencia codificante que hace posible conferir a la planta una tolerancia a herbicidas que son agentes inhibidores de las HPPD, y al uso de los agentes inhibidores de las HPPD en plantas que comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD de acuerdo con la invención. En una realización de la presente invención, en dicho uso los agentes inhibidores de las HPPD son tricetonas o pirazolinatos, preferentemente tembotriona, mesotriona o sulcotriona, biciclopirona y tefuriltriona. Desde luego, se entiende que esta secuencia puede usarse también en combinación con (un) marcador o marcadores de genes y/o secuencia o secuencias distintos que codifica o codifican una o más proteínas con propiedades agrícolas útiles.

En la producción comercial de plantas cultivadas, es deseable, dentro de una administración confiable de plaguicidas, eliminar plantas indeseadas (es decir “malezas”) desde un campo de plantas cultivadas. Un tratamiento ideal sería uno que se podría aplicar a un campo completo, pero que eliminaría solamente las plantas indeseadas mientras que dejaría sin afectar a las plantas cultivadas. Uno de dichos sistemas de tratamiento podría implicar el uso de plantas cultivadas que son tolerantes a un herbicida de manera tal que cuando el herbicida es rociado sobre un campo de plantas cultivadas tolerantes a herbicidas, las plantas cultivadas continuarán prosperando mientras que unas malezas no tolerantes a herbicidas fueron aniquiladas o dañadas gravemente. Idealmente, dichos sistemas de tratamiento aprovecharán las ventajas de propiedades herbicidas variables de manera tal que una represión de

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malezas podría proporcionar la mejor combinación posible de flexibilidad y economía. Por ejemplo, unos herbicidas individuales tienen diferentes longevidades en el campo, y algunos herbicidas persisten y son eficaces durante un período de tiempo relativamente largo después de que ellos hayan sido aplicados a un campo, mientras que otros herbicidas son descompuestos rápidamente para dar otros compuestos distintos y/o no activos. Un sistema de tratamiento ideal podría permitir el uso de diferentes herbicidas de manera tal que los criadores podrían seleccionar a medida de los deseos la elección de herbicidas para una situación particular.

Mientras que un cierto número de plantas cultivadas tolerantes a herbicidas están actualmente disponibles comercialmente, un tema que ha surgido para muchos/as herbicidas comerciales y combinaciones de herbicidas y plantas cultivadas, consiste en que los herbicidas individuales tienen típicamente un espectro incompleto de actividades contra especies de malezas corrientes. Para la mayor parte de los herbicidas individuales que han estado usándose desde hace algún tiempo, unas poblaciones de especies de malezas y biotipos resistentes a herbicidas han resultado más prevalecientes (véase por ejemplo, Tranel y Wright (2002) Weed Science 50: 700-712; Owen y Zelaya (2005) Pest Manag. Sci. 61: 301-311). Se han descrito unas plantas transgénicas que son resistentes a más de un herbicida (véase por ejemplo, el documento W02005/012515). Sin embargo, se están demandando continuamente unas mejoras en cualquiera de los aspectos de la producción de plantas cultivadas, opciones de represión de malezas, prolongación de la represión de malezas residuales, y un mejoramiento en el rendimiento de plantas cultivadas.

La proteína o el gen de HPPD de la invención se combina ventajosamente en plantas con otros genes que codifican proteínas o ARN que confieren útiles propiedades agronómicas a dichas plantas. Entre los genes que codifican proteínas o ARN que confieren útiles propiedades agronómicas a las plantas transformadas, se puede hacer mención de las secuencias de ADN que codifican unas proteínas que confieren tolerancia a uno o más herbicidas que, de acuerdo con su estructura química, difieren de los herbicidas inhibidores de las HPPD, y de otros que confieren tolerancia a ciertos insectos, de los que confieren tolerancia a ciertas enfermedades, ADN que codifican ARN que proporcionan represión de nematodos o insectos.

Dichos genes se describen en particular en las solicitudes de patentes PCT publicadas WO 91/02071 y WO95/06128.

Entre las secuencias de ADN que codifican unas proteínas que confieren tolerancia a ciertos herbicidas en las células de plantas y las plantas transformadas, se puede hacer mención de un gen de bar o PAT o del gen de Streptomyces coelicolor que se ha descrito en el documento WO2009/152359 que confiere tolerancia a herbicidas, un gen que codifica una apropiada EPSPS (acrónimo de Enol Pyruvyl Shikimate Phosphate Syntase, enolpiruvilshikimato fosfato sintasa) que confiere tolerancia a herbicidas que tienen una EPSPS como una diana, tales como glifosato y sus sales (documentos US 4.535.060, US 4.769.061, US 5.094.945, US 4.940.835, US 5.188.642, US 4.971.908, US 5.145.783, US 5.310.667, US 5.312.910, US 5.627.061, US 5.633.435), o un gen que codifica una glifosato oxidorreductasa (documento US 5.463.175).

Entre las secuencias de ADN que codifican una apropiada EPSPS que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen una EPSPS como una diana, se hará mención más particularmente del gen que codifica una EPSPS de planta, en particular una EPSPS de maíz, particularmente una EPSPS de maíz que comprende dos mutaciones, particularmente una mutación en la posición de aminoácido 102 y una mutación en la posición de aminoácido 106 (documento WO 2004/074443), y que se describe en la solicitud de patente US 6566587, que se denomina en lo sucesivo en el presente documento EPSPS doble mutante de maíz o 2mEPSPS, o del gen que codifica una EPSPS aislada a partir de Agrobacterium y que se describe por las SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3 de la patente US 5.633.435, que se denomina también CP4.

Entre las secuencias de ADN que codifican una apropiada EPSPS que confiere tolerancia a los herbicidas que tienen una EPSPS como una diana, se hará mención más particularmente del gen que codifica una EPSPS GRG23 procedente de Arthrobacter globiformis, pero también las mutantes GRG23 ACE1, GRG23 ACE2, o GRG23 ACE3, particularmente las mutantes o variantes de GRG23 tal como se describen en el documento WO2008/100353, tales como GRG23(ace3)R173K de la SEQ ID NO. 29 en el documento WO2008/100353.

En el caso de las secuencias de ADN que codifican una EPSPS, y más particularmente que codifican los anteriores genes, la secuencia que codifica estas enzimas es precedida ventajosamente por una secuencia que codifica un péptido de tránsito, en particular el “péptido de tránsito optimizado” que se describe en el documento de patente US 5.510.471 o 5.633.448.

En el documento WO 2007/024782, se describen unas plantas que son tolerantes a glifosato y al menos a un agente inhibidor de ALS (acetolactato sintasa). Más específicamente, se describen unas plantas que contienen genes que codifican a polipéptido GAT (Glifosato - N-Acetil Transferasa) y un polipéptido que confiere resistencia a agentes inhibidores de ALS.

En el documento US 6.855.533, se describieron plantas transgénicas de tabaco que contienen genes mutados de Arabidopsis ALS/AHAS.

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En el documento de patente US 6.153.401, se describen unas plantas que contienen genes que codifican 2,4-D monooxigenasas que confieren tolerancia al 2,4-D (ácido 2,4-didorofenoxiacético) por metabolización.

En los documentos US 2008/0119361 y US 2008/0120739, se describen unas plantas que contienen genes que codifican dicamba monooxigenasas que confieren tolerancia a dicamba (ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) por metabolización.

Todos los rasgos de tolerancia a herbicidas, que antes se mencionan, pueden ser combinados con los que desarrollan una tolerancia a las HPPD que son materia objeto de la presente invención.

Entre las secuencias de ADN que codifican unas proteínas que conciernen a propiedades de tolerancia a insectos, se hará mención más particularmente a las proteínas Bt ampliamente descritas en la bibliografía y bien conocidas para los expertos en la técnica. Se hará mención también a unas proteínas extraídas a partir de bacterias tales como Photorhabdus (documentos WO 97/17432 & WO 98/08932).

Entre dichas secuencias de ADN que codifican proteínas de interés que confieren nuevas propiedades de tolerancia a insectos, se hará mención más particularmente a las proteínas Bt Cry o VIP, ampliamente descritas en la bibliografía y bien conocidas por los expertos en la técnica. Éstas incluyen la proteína Cry1F o híbridos derivados de una proteína Cry1F (por ejemplo, las proteínas híbridas Cry1A-Cry1F que se describen en los documentos US 6.326.169; US 6.281.016; US 6.218.188, o fragmentos tóxicos de las mismas), las proteínas del tipo Cry1A o fragmentos tóxicos de las mismas, preferentemente la proteína Cry1Ac o híbridos derivados de la proteína Cry1Ac (por ejemplo, la proteína híbrida Cry1Ab-Cry1Ac que se describe en el documento US 5.880.275) o la proteína Cry1Ab o Bt2 o fragmentos insecticidas de la misma tal como se describen en el documento EP451878, las proteínas Cry2Ae, Cry2Af o Cry2Ag tal como se describen en el documento WO02/057664 o fragmentos tóxicos de la misma, la proteína Cry1A.105 que se describe en el documento WO 2007/140256 (SEQ ID NO. 7) o un fragmento tóxico de la misma, la proteína VIP3Aa19 con el número de acceso al NCBI ABG20428, la proteína VIP3Aa20 con el número de acceso al NCBI ABG20429 (SEQ ID NO. 2 en el documento WO 2007/142840), las proteínas VIP3A producidas durante los sucesos en algodón COT202 o COT203 (documentos WO 2005/054479 y WO 2005/054480, respectivamente), las proteínas Cry que se describen en el documento WO01/47952, la proteína VIP3Aa o un fragmento tóxico de la misma, tal como se describen tal como se describen en la cita de Estruch y col. (1996), Proc Natl Acad Sci USA. 28;93(11):5389-94 y en el documento US 6.291.156, las proteínas insecticidas procedentes de Xenorhabdus (as que se describen en el documento WO98/50427), de Serratia (particularmente procedentes de S. entomophila) o de cepas de Photorhabdus especies, tales como las proteínas Tc procedentes de Photorhabdus tal como se describen en el documento WO98/08932 (por ejemplo, en las citas de Watercamp y col., 2001, Appl Environ Microbiol. 67(11):5017-24; y de Ffrench-Constant y Bowen, 2000, Cell Mol Life Sci.; 57(5):828-33). También se incluyen en el presente contexto cualesquiera variantes o mutantes de cualquiera de estas proteínas que difieren en algunos (1-10, preferentemente 1-5) aminoácidos con respecto de cualquiera de las anteriores secuencias, particularmente la secuencia de su fragmento tóxico, o que están fusionadas con un péptido de tránsito, tales como un péptido de tránsito de plastidio, u otra/o proteína o péptido.

La presente invención se refiere también a un gen quimérico (o casete de expresión) que comprende una secuencia codificante así como los elementos reguladores heterólogos en las posiciones 5' y/o 3', al menos en la posición 5', que son capaces de funcionar dentro de un organismo hospedador, en particular de células de plantas o plantas, con la secuencia codificante que contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD como se ha definido previamente.

En una realización particular, la presente invención se refiere a un gen quimérico como se ha descrito previamente, en el que el organismo hospedador se selecciona entre bacterias, levaduras, Pichia, hongos, baculovirus, células in vitro, protoplastos, células de plantas, plantas, partes de plantas, y semillas de estas plantas.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a un gen quimérico como se ha descrito previamente, en que el gen quimérico contiene, en la posición 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD de acuerdo con la invención, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito de planta, estando dispuesta esta secuencia entre la región de promotor y la secuencia que codifica la HPPD de acuerdo con la invención de manera tal que se permite la expresión de una proteína de fusión de péptido de tránsito/HPPD.

En una adicional realización particular, la presente invención se refiere al uso de herbicidas inhibidores de las HPPD en plantas, partes de plantas o semillas de plantas que comprenden un gen tolerante a las HPPD de acuerdo con la invención, o al uso de herbicidas inhibidores de las HPPD en una tierra en la que dichas plantas, partes de plantas o semillas han de crecer o se han de sembrar, ya sea a solas o en combinación con uno o más otros herbicidas conocidos que actúan de una manera diferente de la de los inhibidores de las HPPD. En una realización más particular, el herbicida inhibidor de las HPPD que se emplea es seleccionado del grupo que consiste en tricetonas (que se denominan agentes inhibidores de las HPPD tricetonas), tales como tembotriona, sulcotriona, mesotriona, biciclopirona, tefuriltriona, particularmente tembotriona, en la clase de las dicetonas tales como dicetonitrilos de la clase de los isoxazoles tales como isoxaflutol o en la clase de los pirazolinatos (que se denominan agentes inhibidores de las HPPD pirazolinatos), tales como pirasulfotol, pirazolato, topramezona, benzofenap; incluso más específicamente, la presente invención se refiere a la aplicación de tembotriona, mesotriona, dicetonitrilo,

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biciclopirona, tefuriltriona, benzofenap, pirasulfotol, pirazolato y sulcotriona a dichas plantas, partes de plantas o semillas de plantas que son tolerantes a agentes inhibidores de las HPPD.

Como una secuencia reguladora que funciona como un promotor en células de plantas y en plantas, se puede hacer uso de cualquier secuencia de promotor de un gen que sea expresado de modo natural en plantas, en particular de un promotor que sea expresado especialmente en las hojas de plantas, tal como por ejemplo de promotores “constitutivos” de origen bacteriano, vírico o vegetal, o de promotores “dependientes de la luz”, tales como el de un gen de la subunidad pequeña de ribulosa biscarboxilasa/oxigenasa de plantas (RuBisCO) o de cualquier apropiado gen conocido expresable por promotores, que se pueda usar. Entre los promotores de origen vegetal, se hará mención a los promotores de histona como se describen en el documento EP 0 507 698 A1, el promotor de actina de arroz (documento US 5.641.876), o un promotor de ubiquitina vegetal (documento US 5.510.474). Entre los promotores de un gen de virus vegetal, se hará mención a los del virus del mosaico de la coliflor (CaMV 19S o 35S, Sanders y col. (1987), Nucleic Acids Res. 15(4):1543-58.), los del circovirus (documento de patente australiana AU 689 311) o los del virus de mosaico de vena de Cassava (CsVMV, US 7.053.205).

En una realización de la presente invención, se puede usar una secuencia de promotor específica para particulares regiones o tejidos de plantas con el fin de expresar las proteínas de HPPD de la invención, tales como promotores específicos para semillas (Datla, R. y col., 1997, Biotechnology Ann. Rev. 3, 269-296), especialmente el promotor de napina (documento EP 255 378 A1), el promotor de faseolina, el promotor de glutenina, el promotor de heliantinina (documento WO 92/17580), el promotor de albúmina (documento WO 98/45460), el promotor de oleosina (documento WO 98/45461), el promotor de SAT1 o el promotor de SAT3 (documento PCT/US98/06978). Se puede hacer uso también de un promotor inducible escogido ventajosamente entre los promotores de fenilalanina amoníaco liasa (PAL), de la HMG-CoA reductasa (HMG), de quitinasa, de glucanasa, del inhibidor de proteinasa (PI), de genes de la familia PR1, de nopalina sintasa (nos) y de vspB (documento US 5 670 349, Tabla 3), el promotor de HMG2 (documento US 5 670 349), el promotor de beta-galactosidasa de manzana (ABG1) y el promotor de aminociclopropano carboxilato sintasa de manzana (ACC sintasa) (documento WO 98/45445).

De acuerdo con la invención, se puede hacer uso también, en combinación con el promotor, de otras secuencias reguladoras, que están situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como unos activadores de la transcripción (“intensificadores”), por ejemplo el activador de la traducción del virus del mosaico del tabaco (TMV), que se describe en la solicitud WO 87/07644, o del virus de la corrosión del tabaco (TEV) que se ha descrito por Carrington & Freed 1990, J. Virol. 64: 1590-1597, por ejemplo, o intrones tales como el intrón adh1 de maíz o el intrón 1 de actina de arroz.

En una divulgación particular adicional el gen de la invención está presente en plantas en múltiples, preferentemente dos copias, controlada cada una de estas por un promotor expresable de plantas diferente.

En una realización particular adicional, el gen quimérico de la invención puede combinarse con cualquier gen quimérico adicional que codifica para una proteína de HPPD, preferentemente aquellos genes diferentes se controlan por diferentes elementos reguladores estando activos en plantas.

En una divulgación particular adicional el gen quimérico de la invención puede combinarse con un gen de monooxigenasa de maíz CYP450 (gen nsf1) estando bajo el control de un promotor expresable en plantas idéntico o diferente.

Como una secuencia terminadora de regulación o de poliadenilación se puede hacer uso de cualquier correspondiente secuencia de origen bacteriano, tal como por ejemplo la del terminador nos de Agrobacterium tumefaciens, de origen vírico, tal como por ejemplo la del terminador de CaMV 35S, o de origen vegetal, tal como por ejemplo la de un terminador de histona tal como se describe en la solicitud de patente publicada EP 0 633 317 A1.

El término “gen” como se usa en el presente documento se refiere a una región que codifica un ADN flanqueada por secuencias reguladoras en 5' y/o 3', que permiten que sea transcrito un ARN que puede ser traducido en una proteína, que comprende típicamente al menos una región de promotor. Un “gen quimérico”, cuando se refiere a un ADN que codifica una HPPD de la presente invención, se refiere a una secuencia de un ADN que codifica una HPPD que tiene unas secuencias reguladoras en 5' y/o 3' diferentes de las secuencias reguladoras en 5' y/o 3' bacterianas presentes en la naturaleza que impulsan la expresión de la proteína de HPPD en su célula hospedadora natural (que también se citan como “promotor heterólogo” o “secuencias reguladoras heterólogas”).

Las expresiones “ADN/proteína que comprende la secuencia X” y "ADN/proteína con la secuencia que comprende secuencia X", como se usan en el presente documento, se refieren a un ADN o a una proteína que incluye o que contiene al menos la secuencia X en su secuencia de nucleótidos o de aminoácidos, de manera tal que otras secuencias de nucleótidos o de aminoácidos pueden ser incluidas junto al extremo 5' (o N-terminal) y/o 3' (o C- terminal), por ejemplo, un péptido de tránsito o de señal N-terminal. El término “que comprende”, tal como se usa en el presente contexto, es una modalidad de lenguaje de extremo abierto en el significado de “incluir”, lo que significa que otros elementos distintos de los citados específicamente pueden también estar presentes. El término “que consiste en”, tal como se usa en el presente contexto, es una modalidad de lenguaje de extremo cerrado, es decir que solamente están presentes los elementos que se citan específicamente. El término “ADN que codifica una

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proteína que comprende la secuencia X”, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a un ADN que comprende una secuencia codificante, que después de una transcripción y traducción, da como resultado una proteína que contiene al menos una secuencia de aminoácidos X. Un ADN que codifica una proteína no necesita ser un ADN presente en la naturaleza y puede ser un ADN semisintético, plenamente sintético o artificial y puede incluir intrones y regiones flanqueadoras en 5' y/o 3'. El término “secuencia de nucleótidos” tal como se usa en el presente documento, se refiere a la secuencia de una molécula de ADN o ARN, que puede estar en la forma de una sola hebra (monocatenaria) o de doble hebra (bicatenaria).

Las proteínas de HPPD de acuerdo con la invención pueden ser equipadas con un péptido de señal de acuerdo con procesos bien conocidos en la técnica, véase, p. ej., la solicitud de patente PCT publicada WO 96/10083, o pueden ser reemplazadas por otros péptidos, tales como un péptido de tránsito de cloroplastos (por ejemplo, Van Den Broeck y col., 1985, Nature 313, 358, o un péptido de tránsito de cloroplastos modificado del documento de patente US 5.510.471) que causa un transporte de la proteína a los cloroplastos, por un péptido de señal secretora o por un péptido que dirige a la proteína a la diana de otros plastidios, mitocondrios, de los ER, u otros orgánulos, o pueden ser reemplazadas por un aminoácido metionina o por un dipéptido de metionin-alanina. Unas secuencias de señal para la dirección hacia orgánulos intracelulares o para la secreción fuera de la célula de planta o hacia la pared de la célula, se hallan en proteínas dirigidas a dianas o segregadas de modo natural, preferentemente las descritas por Klosgen y col. (1989, Mol. Gen. Genet. 217, 155-161), Klosgen y Weil (1991, Mol. Gen. Genet. 225, 297-304), Neuhaus & Rogers (1998, Plant Mol. Biol. 38, 127-144), Bih y col. (1999, J. Biol. Chem. 274, 22884-22894), Morris y col. (1999, Biochem. Biophys. Res. Commun. 255, 328-333), Hesse y col. (1989, EMBO J. 8 2453-2461), Tavladoraki y col. (1998, FEBS Lett. 426, 62-66), Terashima y col. (1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52, 516-523), Park y col. (1997, J. Biol. Chem. 272, 6876-6881), Shcherban y col. (1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 92459249), todas cuyas citas son incorporadas en el presente contexto por su referencia, particularmente las secuencias de péptidos de señal procedentes de proteínas dirigidas a dianas o segregadas de maíz, algodón, soja o arroz. Una secuencia de ADN que codifica dicho péptido de señal de planta puede ser introducida en el gen quimérico que codifica la proteína de HPPD para la expresión en plantas.

A menos que se señale otra cosa distinta en los ejemplos, todos los procesos para producir y manipular un ADN recombinante se llevan a cabo por los procedimientos clásicos descritos en Sambrook y col., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989), y en los volúmenes 1 y 2 de Ausubel y col. (1994) Current Protocols en Molecular Biology [Protocolos actuales en biología molecular], Current Protocols, USA. Materiales y procedimientos clásicos para el trabajo en biología molecular se describen en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R.R.D. Croy, publicado conjuntamente por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) y Blackwell Scientific Publications (UK). Procesos para la tecnología de PCR (acrónimo de Polymerase Chain Reaction = reacción en cadena de la polimerasa) se pueden hallar en “PCR protocols: a guide to methods and aplications” [Protocolos de PCR: una guía para procedimientos y aplicaciones], compilado por M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky y T.J. White (Academic Press, Inc., 1990).

Los términos “tolerancia”, “tolerante” o “menos sensible” se usan intercambiablemente y significan los niveles relativos de tolerancia inherente de la HPPD escrutada de acuerdo con un fenotipo indicador visible de la cepa o de la planta transformada con un ácido nucleico que comprende el gen que codifica la respectiva proteína de HPPD en la presencia de diferentes concentraciones de los diversos agentes inhibidores de las HPPD. Unas respuestas a dosis y unos desplazamientos relativos en las respuestas a dosis asociadas con estos fenotipos indicadores (formación de color pardo, inhibición del crecimiento, blanqueo, efecto herbicida, etc.) se expresan convenientemente en términos, por ejemplo, de valores de la GR50 (concentración para una reducción de 50 % del crecimiento) o de la MIC (concentración inhibidora mínima) en que unos aumentos en los valores corresponden a unos aumentos en la tolerancia inherente de la HPPD expresada, de la manera normal basada en un daño causado a plantas, síntomas de blanqueo meristemático, etc., en una gama de diferentes concentraciones de herbicidas. Estos datos pueden ser expresados en términos de, por ejemplo, valores de GR50 derivados de las curvas de dosis/respuesta que tienen “una dosis” representada gráficamente en el eje de las x y “un porcentaje de destrucción”, “un efecto herbicida”, “números de plantas verdes que brotan”, etc., representados en el eje de las y, en que unos valores de GR50 aumentados corresponden a unos niveles aumentados de tolerancia inherente de la HPPD expresada. Los herbicidas pueden ser aplicados de manera apropiada antes del brote o después del brote.

De manera similar, el nivel de tolerancia del ácido nucleico o del gen que codifica una proteína de HPPD de acuerdo con la invención o la proteína de HPPD de la invención es escrutado mediante una transgénesis, una regeneración, una crianza y un ensayo por rociada de una planta de ensayo tal como una de tabaco, o una planta cultivada tal como una de soja o algodón, y de acuerdo con estos resultados, dichas plantas son al menos 2-4 veces más tolerantes a agentes inhibidores de la HPPD, tales como tembotriona, mesotriona, dicetonitrilo y/o biciclopirona, que unas plantas que no contienen ningún gen exógeno que codifique una proteína de HPPD, o que unas plantas que contienen un gen que codifica un ADN de HPPD de Arabidopsis thaliana, bajo el control del mismo promotor que el del ADN de HPPD de la invención.

Se entiende que un “organismo hospedador” u “hospedador” es cualquier organismo heterólogo unicelular o multicelular dentro del que se puede introducir un ácido nucleico o un gen quimérico de acuerdo con la invención con la finalidad de producir una HPPD de acuerdo con la invención Estos organismos son, en particular, bacterias, por ejemplo de E. coli, levaduras, en particular de los géneros Saccharomyces o Kluyveromyces, Pichia, hongos, en particular Aspergillus, un baculovirus o, preferentemente, células de plantas y plantas.

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Se entiende que una “célula de planta”, de acuerdo con la invención, es cualquier célula que deriva de, o se halla en, una planta, y que es capaz de formar, o es parte de, tejidos no diferenciados, tales como callos, tejidos diferenciados tales como embriones, partes de plantas, plantas o semillas. Esto incluye protoplastos y polen, células de plantas cultivadas o protoplastos que han crecido in vitro, y células de plantas que se pueden regenerar para dar una planta completa.

Se entiende que una “planta”, de acuerdo con la invención, es cualquier organismo multicelular diferenciado que es capaz de fotosíntesis, en particular un organismo monocotiledóneo o dicotiledóneo, más especialmente plantas cultivadas que están destinadas o no están destinadas a la nutrición de animales o seres humanos, tales como maíz o maíz en grano, trigo, plantas de Brassica spp. tales como de Brassica napus o Brassica júncea, especies de soja, arroz, caña de azúcar, raíz de remolacha, tabaco, algodón, plantas de hortalizas tales como las de pepino, puerro, zanahoria, tomate, lechuga, pimientos, melón, sandía, etc. El término “plantas transgénicas”, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a plantas que comprenden un gen ajeno o heterólogo introducido establemente en su genoma.

En una realización, la invención se refiere a la transformación de plantas. Cualquier secuencia de promotor de un gen que es expresado de modo natural en plantas, o cualquier híbrido o combinación de elementos promotores de genes expresados de modo natural en plantas, incluyendo promotores de Agrobacterium o de virus de plantas, o cualquier promotor que sea apropiado para controlar la transcripción de un gen de tolerancia a herbicidas en plantas, se puede usar como la secuencia de promotor en las plantas de la invención (denominado “promotor expresable en plantas” en el presente contexto). Los ejemplos de dichos promotores expresados en plantas se han descrito anteriormente. En una realización de la presente invención, dichos promotores expresables en plantas están conectados operativamente a una secuencia codificante que codifica una proteína de HPPD de la invención para formar un gen quimérico de HPPD de la presente invención.

De acuerdo con la divulgación es también posible usar, en combinación con la secuencia reguladora de promotor, otras secuencias reguladoras que están situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como secuencias de intrones, o activadores de la transcripción (intensificadores). Los ejemplos de dichas apropiadas secuencias reguladoras se han descrito anteriormente.

Cualquier correspondiente secuencia de origen bacteriano o vírico, tal como el terminador nos procedente de Agrobacterium tumefaciens, o de origen vegetal, tal como un terminador de histona tal como se describe en el documento de solicitud EP 0 633 317 A1, se puede usar como secuencia reguladora de terminación de la transcripción (y de la poliadenilación).

En una realización particular de la invención, una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito se emplea en 5' (corriente arriba) de la secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD exógena de acuerdo con la invención, estando dispuesta esta secuencia de péptido de tránsito entre la región de promotor y la secuencia que codifica la HPPD exógena, de manera tal que se permite la expresión de una proteína de fusión del péptido de tránsito y de la HPPD, tal como la proteína de las sEq ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7. El péptido de tránsito hace posible dirigir a las HPPD dentro de los plastidios, más especialmente de los cloroplastos, siendo disociada la proteína de fusión entre el péptido de tránsito y la proteína de HPPD de la invención cuando esta última entra en el plastidio. El péptido de tránsito puede ser un único péptido, tal como un péptido de tránsito de EPSPS (que se describe en el documento de patente US 5.188.642) o un péptido de tránsito de la subunidad pequeña de ribulosa biscarboxilasa/oxigenasa de plantas (RuBisCO ssu) que, cuando sea apropiado, incluye unos pocos aminoácidos de la parte N-terminal de la RuBisCO ssu madura (documento EP 189 707 A1), o bien puede ser una fusión de varios péptidos de tránsito tales como un péptido de tránsito que comprende un primer péptido de tránsito de una planta que está fusionado con una parte de la secuencia N-terminal de una proteína madura que tiene una localización en plastidio, siendo esta parte a su vez fusionada con un segundo péptido de tránsito de una planta, tal como se describe en el documento de patente EP 508 909 A1, y, más especialmente, el péptido de tránsito optimizado que comprende un péptido de tránsito de la RuBisCO ssu de girasol fusionado con 22 aminoácidos del extremo N- terminal de la RuBisCO ssu de maíz, a su vez fusionado con el péptido de tránsito de la RuBisCO ssu de maíz, tal como se describe, con su secuencia codificante, en el documento de patente EP 508 909 A1. La presente invención se refiere también a la proteína de fusión de un péptido de tránsito y una HPPD y a un ácido nucleico o un gen quimérico expresable en plantas que codifica dicha proteína de fusión, en que los dos elementos de esta proteína de fusión son tal como se han descrito anteriormente.

La presente invención se refiere también a un vector de clonación, de transformación y/o de expresión, cuyo vector contiene al menos un gen quimérico tal como se ha definido anteriormente. Además del anterior gen quimérico, este vector puede contener un origen de replicación.

Este vector puede ser un plásmido o una porción de un plásmido, un cósmido, o un bacteriófago o un virus que ha sido transformado por introducción del gen quimérico de acuerdo con la invención. Unos vectores de transformación son bien conocidos para la persona experta y han sido ampliamente descritos en la bibliografía. El vector de transformación que se puede usar, en particular, para transformar células de plantas o plantas puede ser un virus, que se puede emplear para transformar células de plantas o plantas y que adicionalmente contiene sus propios elementos de replicación y expresión. De acuerdo con la invención, el vector para transformar células de plantas o

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plantas, es preferentemente un plásmido tal como un plásmido Ti desarmado de Agrobacterium.

La presente divulgación se refiere también a los organismos anfitriones, en particular a las células de plantas, semillas o plantas que comprenden un gen quimérico el cual comprende a su vez una secuencia que codifica una proteína de HPPD de la invención, tal como una proteína que codifica la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO 4, 5, 6 o 7, tal como se ha definido anteriormente, y al uso de las plantas o semillas de la invención en un campo para hacer crecer una planta cultivada y cosechar un producto vegetal, por ejemplo especies de soja, granos de arroz, trigo, cebada o maíz o cápsulas de algodón, en que, en una realización, dicho uso implica la aplicación de un herbicida inhibidor de las HPPD a dichas plantas para reprimir malezas. En una realización de la presente invención, en dicho uso, los agentes inhibidores de las HPPD son tricetonas o pirazolinatos, preferentemente tembotriona, mesotriona, topramezona o sulcotriona, biciclopirona, pirasulfotol, pirazolato, benzofenap y tefuriltriona, particularmente tembotriona.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un organismo hospedador, en particular a una célula de planta, una semilla o una planta, que está caracterizado porque contiene al menos un gen quimérico de la HPPD tal como se ha descrito previamente, o al menos una secuencia de ácido nucleico de HPPD tal como anteriormente se ha descrito.

En una realización particular, la presente invención se refiere a una célula de planta o una planta, que está caracterizada porque ella contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de HPPD de la presente invención, que retiene sus propiedades de catalizar la conversión de un para-hidroxifenilpiruvato en un homogentisato y que hace a la planta más tolerante, que las plantas de la misma especie que no comprenden dicha proteína de HPPD de la presente invención, particularmente a tricetonas, o a pirazolinatos, preferentemente tembotriona, mesotriona, topramezona o sulcotriona, biciclopirona, pirasulfotol, pirazolato, benzofenap y tefuriltriona, particularmente tembotriona, y tales plantas que contienen la HPPD de la invención tienen una tolerancia agronómicamente aceptable a un herbicida inhibidor de las HPPD, particularmente a tricetonas, o a pirazolinatos, preferentemente tembotriona, mesotriona, topramezona o sulcotriona, biciclopirona, pirasulfotol, pirazolato, benzofenap y tefuriltriona, particularmente tembotriona.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a una célula de planta o a una planta caracterizada porque ella contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD de la presente invención, que retiene sus propiedades de catalizar la conversión de un para-hidroxifenilpiruvato en un homogentisato y que es menos sensible a un agente inhibidor de las HPPD que la HPPD endógena de la planta hospedadora, tal como la HPPD procedente de Arabidopsis thaliana, particularmente la HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO. 11 (desde la posición de aminoácido 126 hasta la posición de aminoácido 568), o que comprende la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO.11 o SEQ ID NO. 12 (desde la posición de aminoácido 134 hasta la posición de aminoácido 575).

En una realización particular, la presente invención se refiere a una célula de planta hospedadora, a una semilla de planta hospedadora o a una planta hospedadora, caracterizada porque ella contiene al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD de la invención tal como se ha definido en el presente contexto, en que la HPPD de la invención es menos sensible que la HPPD endógena de la planta hospedadora a un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de los/las isoxazoles, dicetonitrilos, tricetonas o pirazolinatos, más especialmente isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, sulcotriona, pirasulfotol, biciclopirona, tefuriltriona, topramezona, 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3fenil)propano-1,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Cl2 fenil)propano- 1,3-diona, incluso más particularmente tembotriona, mesotriona, dicetonitrilo, biciclopirona, topramezona, pirazolato, benzofenap, sulcotriona, tefuriltriona, y pirasulfotol, de manera sumamente particular tembotriona, mesotriona y biciclopirona.

En otra realización particular, la presente invención se refiere a una célula de planta o a una planta, caracterizada porque ella contiene al menos una secuencia del ácido nucleico que codifica una HPPD de la invención como se ha descrito previamente, y además un gen quimérico que comprende un promotor expresable en plantas tal como se ha descrito más arriba, conectado operativamente a una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima PDH (prefenato deshidrogenasa) (documento US 2005/0257283).

La presente invención se refiere también a las plantas que contienen células transformadas, en particular a las plantas que son regeneradas a partir de las células transformadas, y a plantas de progenie o semillas de las mismas, que comprenden el gen quimérico de HPPD de la invención. La regeneración se puede obtener por cualquier procedimiento apropiado, siendo el procedimiento dependiente de la naturaleza de la especie, tal como se ha descrito, por ejemplo, en las referencias anteriores. Se pueden citar las siguientes patentes y solicitudes de patentes, en particular, con respecto a los procedimientos para transformar células de plantas y regenerar plantas:

documentos US 4.459.355, US 4.536.475, US 5.464.763, US 5.177.010, US 5.187.073,

EP 267.159 A1, EP 604 662 A1, EP 672 752 A1, US 4.945.050, US 5.036.006,

US 5.100.792, US 5.371.014, US 5.478.744, US 5.179.022, US 5.565.346,

US 5.484.956, US 5.508.468, US 5.538.877, US 5.554.798, US 5.489.520,

US 5.510.318, US 5.204.253, US 5.405.765, EP 442 174 A1, EP 486 233 A1,

EP 486 234 A1, EP 539 563 A1, EP 674 725 A1, WO 91/02071 y WO 95/06128.

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La presente invención se refiere también a las plantas transgénicas o a partes de las mismas, que derivan cultivando y/o cruzando las anteriores plantas transgénicas, y a las semillas de las plantas transgénicas, que comprenden el gen quimérico de HPPD de la invención.

La presente divulgación se refiere también a los productos finales tales como la harina o el aceite, que se obtienen a partir de las plantas, de partes de las mismas o de las semillas de la invención.

Las plantas transformadas que se pueden obtener de acuerdo con la invención pueden ser del tipo monocotiledóneo, tales como las de trigo, cebada, caña de azúcar, arroz, cebolla, y maíz o grano de maíz, o del tipo dicotiledóneo, tales como tabaco, especies de soja, alfalfa, Brassica spp., plantas tales como colza de semilla oleaginosa, algodón, remolacha azucarera, trébol, hortalizas, etc.

La divulgación se refiere a un procedimiento para transformar organismos anfitriones, en particular células de plantas o plantas, por integración en dichos organismos de al menos una secuencia de ácido nucleico o de un gen quimérico tal como se ha definido previamente, en el que es posible obtener la transformación por cualesquiera medios conocidos apropiados, cuyos medios se describen ampliamente en la bibliografía especialista y, en particular, en las referencias citadas en la presente solicitud, por ejemplo por uso del vector de acuerdo con la invención.

Un procedimiento de transformación de acuerdo con la presente invención comprende bombardear células, protoplastos o tejidos con partículas sólidas o líquidas a las cuales se ha añadido un aDn, o que contienen un ADN. Otro procedimiento de transformación comprende usar, como el medio para transferir a la planta, un gen quimérico que es introducido en un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes. Se pueden usar otros procedimientos tales como una microoinyección o electroporación, o dirigir de otro modo la transferencia del gen usando PEG. La persona experta puede seleccionar cualquier procedimiento apropiado para transformar el organismo hospedador que se ha de elegir, en particular la célula de planta o la planta, tal como por ejemplo, la tecnología para la transformación de soja ha sido descrita extensamente en los ejemplos 1 hasta 3 divulgados en el documento EP 1186666 A1, incorporado en el presente contexto por su referencia. Para el arroz, se podrían realizar una transformación mediada por Agrobacterium (Hiei y col., 1994 Plant J 6:271-282, y Hiei y col., 1997 Plant Mol Biol. 35:205-21, incorporadas en el presente contexto por su referencia), una electroporación (documentos US 5.641.664 y US 5.679.558, incorporados en el presente contexto por su referencia), o un bombardeo (Christou y col., 1991, Biotechnology 9:957 incorporada en el presente contexto por su referencia). Una apropiada tecnología para la transformación de plantas monocotiledóneas, y particularmente de arroz, se describe en el documento WO 92/09696, incorporado en el presente contexto por su referencia. Para el algodón, se han descrito una transformación mediada por Agrobacterium (Gould J.H. y Magallanes-Cedeno M., 1998 Plant Molecular Biology reporter, 16:1-10 y Zapata C., 1999, Theoretical Applied Genetics, 98(2):1432-2242 incorporadas en el presente contexto por su referencia), transformación mediada por polibreno y/o por tratamiento (Sawahel W.A., 2001, - Plant Molecular Biology reporter, 19:377a-377f).

En una realización particular de la invención, la HPPD de la invención se dirige hacia una diana dentro del cloroplasto. Esto se puede hacer fusionando una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito con la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de HPPD de la invención para obtener un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión tal como se ha descrito previamente.

Alternativamente, la HPPD de la invención se puede expresar directamente en los plastidios tales como los cloroplastos, usando una transformación del plastidio, tal como el genoma de cloroplastos. Un procedimiento apropiado comprende el bombardeo de células o tejidos vegetales con partículas sólidas revestidas con el ADN o con partículas líquidas que comprenden el ADN, y la integración del gen introducido que codifica la proteína de la invención por recombinación homóloga. Unos apropiados vectores y sistemas de selección son conocidos para la persona experta en la técnica. Un ejemplo de medios y procedimientos que se pueden usar para dicha integración en el genoma de cloroplastos de plantas de tabaco se da en el documento WO 06/108830, cuyo contenido es incorporado por la presente por su referencia.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para obtener una planta tolerante a un agente inhibidor de las HPPD, caracterizado porque la planta es transformada con un gen quimérico de HPPD de la invención, como se ha descrito previamente.

Por lo tanto, la presente invención se refiere también a un procedimiento para obtener una planta tolerante a un agente inhibidor de las HPPD, caracterizado porque la planta contiene un gen quimérico de HPPD de la invención que comprende una secuencia codificante así como un elemento regulador heterólogo en la posición 5' y opcionalmente en la posición 3', que son capaces de funcionar en un organismo hospedador, caracterizado porque la secuencia codificante comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que define un gen que codifica una HPPD de la invención como se ha descrito previamente.

En una realización de la presente invención, el agente inhibidor de las HPPD en el anterior procedimiento es un herbicida del tipo de tricetona o pirazolinato, preferentemente tembotriona, mesotriona, biciclopirona, tefuriltriona, pirasulfotol, pirazolato, dicetonitrilo, benzofenap o sulcotriona, particularmente tembotriona.

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De acuerdo con la presente invención, se proporciona también un procedimiento para obtener una planta tolerante a un agente inhibidor de las HPPD tal como se ha descrito más arriba, caracterizado porque se obtiene una planta que comprende un primer transgén, que es un gen quimérico de HPPD de la invención, y un segundo transgén, que es un gen quimérico que comprende un promotor expresable en plantas, conectado operativamente a un ácido nucleico que codifica una enzima PDH (prefenato deshidrogenasa). Una planta que comprende dichos dos transgenes se puede obtener transformando una planta con un transgén, y luego volviendo a transformar esta planta transgénica con el segundo transgén, o transformando una planta con los dos transgenes simultáneamente (en el mismo ADN o vector o en 2 diferentes ADN o vectores de transformación), o cruzando una planta que comprende el primer transgén con una planta que comprende el segundo transgén, como se conoce bien en la técnica.

La divulgación se refiere también a un procedimiento para retirar selectivamente malezas o impedir la germinación de malezas en un campo en el que se han de plantar plantas o en el que se han de sembrar semillas, o en un cultivo de plantas, por aplicación de un agente inhibidor de las HPPD a dicho campo o cultivo de plantas, en particular un herbicida inhibidor de las HPPD tal como se ha definido con anterioridad, cuyo procedimiento está caracterizado porque este herbicida inhibidor de las HPPD es aplicado a plantas que han sido transformadas de acuerdo con la invención, ya sea antes de sembrar la planta cultivada (lo que se denomina en lo sucesivo aplicación antes de plantar), antes del brote de la planta cultivada (lo que se denomina en lo sucesivo aplicación antes del brote), o después del brote de la planta cultivada (lo que se denomina en lo sucesivo aplicación después del brote).

La presente divulgación se refiere también a un procedimiento para cultivar las plantas que han sido transformadas con un gen quimérico de acuerdo con la invención, cuyo procedimiento comprende plantar semillas que comprenden un gen quimérico de la invención, en una zona de un campo que es apropiada para cultivar dichas plantas, y aplicar, si están presentes malezas, una dosis, que es tóxica para las malezas, de un herbicida cuya diana es la HPPd antes definida a dicha zona de dicho campo, sin afectar significativamente a dichas semillas transformadas ni a dichas plantas transformadas, y luego cosechar las plantas cultivadas o las partes de plantas, cuando éstas alcanzan la etapa deseada de madurez y, cuando sea apropiado, separar las semillas con respecto de las plantas cosechadas.

En los procedimientos anteriores, el herbicida cuya diana es la enzima de HPPD se puede aplicar de acuerdo con la invención, ya sea antes de sembrar la planta cultivada, antes de que la planta cultivada brote o después de que la planta cultivada brote.

La presente divulgación se refiere también a un procedimiento para obtener un aceite, particularmente un aceite de soja spp, maíz o algodón, o una harina, que comprende hacer crecer una planta cultivada, particularmente una planta cultivada de soja spp, expresar una proteína de HPPD de la invención, opcionalmente tratar dicha planta cultivada con un herbicida inhibidor de las HPPD, cosechar los granos y moler los granos para producir una harina y extraer el aceite. También las semillas o los granos, ya sea enteras/os, rotas/os o trituradas/os, que comprenden el gen quimérico de la invención, son parte de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención se refiere a un procedimiento para obtener un aceite o una harina, que comprende hacer crecer una planta transformada tal como se ha descrito previamente, opcionalmente tratar dicha planta con un herbicida inhibidor de las HPPD, cosechar los granos y moler estos granos para producir una harina y extraer el aceite.

Se proporcionan adicionalmente en la presente invención los anteriores procedimientos que implican a un herbicida inhibidor de las HPPD seleccionado de isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, pirasulfotol, sulcotriona, biciclopirona, tefuriltriona, topramezona, 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-metilsulfonil-4-trifluorometilfenil)-propano-1,3-diona y 2-ciano-1- [4-(metilsulfonil)-2-trifluorometilfenil]-3-(1-metilciclopropil)-propano-1,3-diona.

También se proporcionan en el presente documento los anteriores procedimientos de la invención que implican a un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona.

Dentro del significado de la presente invención, se entiende que un “herbicida” es una sustancia activa como herbicida por si misma o tal sustancia que está combinada con un aditivo que altera su eficacia tal como, por ejemplo, un agente que aumenta su actividad (un agente sinérgico) o que limita su actividad (un antídoto). Desde luego, se ha de entender que, para su aplicación en la práctica, los anteriores herbicidas son combinados, de una manera que es de por sí conocida, con los agentes coadyuvantes de formulación que habitualmente se emplean en la química agrícola.

Unos herbicidas inhibidores de las HPPD tales como los de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionada de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, tienen una actividad herbicida sobresaliente contra un amplio espectro de plantas dañinas anuales monocotiledóneas y dicotiledóneas económicamente importantes. Las sustancias activas también actúan eficientemente sobre plantas dañinas perennes que producen vástagos a partir de rizomas, cepellones, tallos leñosos u otros órganos perennes, y que son difíciles de controlar.

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La presente divulgación por lo tanto se refiere también a un procedimiento de reprimir plantas indeseadas o para regular el crecimiento de las plantas en cultivos de plantas que comprenden una HPPD de acuerdo con la invención, en el que uno o más herbicidas inhibidores de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, se aplica(n) a las plantas (por ejemplo plantas dañinas tales como malezas o plantas cultivadas indeseadas monocotiledóneas o dicotiledóneas), a las semillas (por ejemplo granos, semillas o propágulos vegetativos tales como tubérculos o partes de vástagos con pimpollos) o a la zona en la que crecen las plantas (por ejemplo la zona sometida a cultivación). En este contexto, un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, se puede aplicar por ejemplo antes de plantar (si fuese apropiado también por incorporación dentro de la tierra), antes del brote o después del brote. Los ejemplos de representantes individuales de las malezas monocotiledóneas y dicotiledóneas que se pueden reprimir con un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionada de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, se mencionan a continuación, sin que esta mención esté pensada como una limitación a ciertas especies solamente:

Plantas dañinas monocotiledóneas de los géneros: Aegilops, Agropyron, Agrostis, Alopecurus, Apera, Avena, Brachiaria, Bromus, Cenchrus, Commelina, Cynodon, Cyperus, Dactyloctenium, Digitaria, Echinochloa, Eleocharis, Eleusine, Eragrostis, Eriochloa, Festuca, Fimbristylis, Heteranthera, Imperata, Ischaemum, Leptochloa, Lolium, Monochoria, Panicum, Paspalum, Phalaris, Phleum, Poa, Rottboellia, Sagittaria, Scirpus, Setaria, Sorghum.

Malezas dicotiledóneas de los géneros: Abutilon, Amaranthus, Ambrosia, Anoda, Anthemis, Aphanes, Artemisia, Atriplex, Bellis, Bidens, Capsella, Carduus, Cassia, Centaurea, Chenopodium, Cirsium, Convolvulus, Datura, Desmodium, Emex, Erysimum, Euphorbia, Galeopsis, Galinsoga, Galium, Hibiscus, Ipomoea, Kochia, Lamium, Lepidium, Lindernia, Matricaria, Mentha, Mercurialis, Mullugo, Myosotis, Papaver, Pharbitis, Plantago, Polygonum, Portulaca, Ranunculus, Raphanus, Rorippa, Rotala, Rumex, Salsola, Senecio, Sesbania, Sida, Sinapis, Solanum, Sonchus, Sphenoclea, Stellaria, Taraxacum, Thlaspi, Trifolium, Urtica, Veronica, Viola, Xanthium.

En plantas cultivadas transgénicas de acuerdo con la invención, que comprenden una proteína de HPPD, un ADN o un gen quimérico de acuerdo con la invención y que también pueden mostrar una o más adicionales resistencias a herbicidas contra herbicidas que difieren de los herbicidas inhibidores de las HPPD, se prefiere el uso de un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, en plantas cultivadas transgénicas económicamente importantes de plantas útiles y ornamentales, por ejemplo de cereales tales como trigo, cebada, centeno, avena, sorgo y mijo, arroz y maíz o bien plantas cultivadas de remolacha azucarera, algodón, especies de soja, colza de semilla oleaginosa, patata, tomate, guisantes y otras hortalizas.

En lo que se refiere a unas propiedades de las plantas, distintas de la tolerancia a herbicidas inhibidores de las HPPD tal como se describen en la presente invención, unas vías convencionales para la producción de nuevas plantas, que en comparación con las plantas existentes presentan propiedades modificadas, consisten por ejemplo en procedimientos tradicionales de cultivación y procreación y en la generación de mutantes. Alternativamente, se pueden generar nuevas plantas con propiedades modificadas con la ayuda de procedimientos recombinantes (véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-0221044 A1 y EP-A-0131624 A1). Se han descrito, por ejemplo, en varios casos las siguientes:

- modificaciones recombinantes de plantas cultivadas, para las finalidades de modificar el almidón sintetizado en las plantas (por ejemplo, los documentos WO 92/11376, WO 92/14827 y WO 91/19806),

- plantas cultivadas transgénicas, que son resistentes a ciertos herbicidas del tipo de glufosinato (compárense, por ejemplo los documentos EP-A-0242236, EP-A-0242246) o del tipo de glifosato (documento wO 92/00377) o del tipo de las sulfonil-ureas (documentos EP-A-0257993 y Us-A-5013659),

- plantas cultivadas transgénicas, por ejemplo de maíz, algodón o especies de soja, que son capaces de producir toxinas de Bacillus thuringiensis (toxinas de Bt), o híbridos o mutantes de las mismas, que hacen a las plantas resistentes contra determinadas plagas (documento EP-A-0193259),

- plantas cultivadas transgénicas con una composición modificada de ácidos grasos (documento WO 91/13972),

- plantas cultivadas modificadas genéticamente con nuevas sustancias constitutivas o metabolitos secundarios, por ejemplo nuevas fitoalexinas, que estableen una resistencia aumentada contra las enfermedades (documentos EPA 309862, EPA 0464461),

- plantas modificadas genéticamente con una fotorrespiración reducida, que presentan más altos rendimientos de cosechas y una más alta tolerancia frente al estrés, (documento EPA 0305398),

- plantas cultivadas transgénicas, que producen proteínas importantes farmacéutica o diagnósticamente (en inglés “molecular pharming“ = farmacología molecular),

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- plantas cultivadas transgénicas, que se distinguen por más altos rendimientos de cosechas o por una mejor calidad,

- plantas cultivadas transgénicas, que se distinguen por una combinación de nuevas propiedades tal como una combinación de las nuevas propiedades arriba mencionadas (en inglés “gene stacking“ = amontonamiento de genes).

Un gran número de técnicas de biología molecular, por medio de las cuales se pueden generar nuevas plantas transgénicas con propiedades modificadas, son conocidas en principio; véanse por ejemplo las citas de I. Potrykus y G. Spangenberg (coordinadres de edición) Gene Transfer to Plants, Springer Lab Manual (1995), editorial Springer Berlín, Heidelberg, o de Christou, "Trends in Plant Science" 1 (1996) 423-431).

Para llevar a cabo tales manipulaciones recombinantes, es posible introducir en plásmidos unas moléculas de ácidos nucleicos, que permitan una mutagénesis o una modificación de las secuencias por recombinación de secuencias de ADN. Con la ayuda de procedimientos clásicos, se pueden llevar a cabo por ejemplo sustituciones de bases, se pueden eliminar secuencias parciales o se pueden añadir secuencias naturales o sintéticas. Para la unión de los fragmentos de ADN unos con otros, es posible adosar adaptadores o conectores a los fragmentos; véanse, por ejemplo, las citas de Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; o de Winnacker "Gene und Klone", VCH Weinheim 2a edición de 1996.

La generación de células de plantas con una actividad disminuida de un producto génico se puede conseguir por ejemplo mediante la expresión de al menos un correspondiente ARN antisentido, de un ARN del mismo sentido para conseguir un efecto de supresión conjunta, o de una combinación de ARN tanto de antisentido como del mismo sentido que forma una molécula de ARN silenciosa de doble hebra (ARNi), o mediante la expresión de al menos una ribozima correspondientemente construida, que disocia específicamente a transcritos del producto génico antes mencionado. Para hacer esto, es posible en primer lugar usar unas moléculas de ADN, que comprenden la totalidad de la secuencia codificante de un producto génico, inclusive cualesquiera secuencias flanqueadoras que puedan estar presentes, o también moléculas de ADN, que comprenden solamente partes de la secuencia codificante, siendo necesario que estas partes sean lo suficientemente largas como para establecer en las células un efecto antisentido. Es posible también usar unas secuencias de ADN que tienen un alto grado de homología con respecto a las secuencias codificantes de un producto génico, pero que no son totalmente idénticas.

Cuando se expresan moléculas de ácidos nucleicos en plantas, la proteína obtenida puede estar localizada en cualquier compartimiento de la célula vegetal. Sin embargo, con el fin de conseguir la localización en un compartimiento particular, es posible por ejemplo enlazar la región codificante con unas secuencias de ADN, que garantizan la localización en un compartimiento específico. Tales secuencias son conocidas para un experto en la técnica (véanse, por ejemplo, las citas de Braun y col., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; de Wolter y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; y de Sonnewald y col., Plant J. 1 (1991) 95-106). Sin embargo, las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser expresadas también en los orgánulos de las células de plantas.

Las células de plantas transgénicas se pueden regenerar de acuerdo con técnicas conocidas para dar plantas intactas. En principio, las plantas transgénicas pueden ser plantas de cualquier especie de plantas, incluyendo plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas.

Así, se pueden obtener unas plantas transgénicas que - además del gen quimérico de HPPD de la invención - tienen propiedades modificadas como el resultado de una sobreexpresión, supresión o inhibición de genes o secuencias de genes homólogos/as (= naturales) o de una expresión de genes o secuencias de genes heterólogos (= extraños).

En las plantas, células de plantas o semillas de la invención, se prefiere emplear el herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona en plantas cultivadas transgénicas que son también resistentes a agentes reguladores del crecimiento tales como, por ejemplo, dicamba, o contra herbicidas que inhiben a esenciales enzimas vegetales, por ejemplo acetolactato sintasas (ALS), EPSP sintasas, glutamina sintasas (GS) o hidroxifenilpiruvato dioxigenasas (HPPD), o contra herbicidas tomados del conjunto que consiste en las sulfonilureas, glifosato, glufosinato o benzoilisoxazoles y sustancias activas análogas.

La invención por lo tanto se refiere también al uso de herbicidas aplicados a estas plantas tolerantes a las HPPD de acuerdo con la invención para reprimir plantas dañinas (es decir malezas) que también se extiende a plantas cultivadas transgénicas que comprenden una segunda o más resistencia o resistencias a herbicidas además de la resistencia contra herbicidas inhibidores de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, de la clase de los isoxazoles tales como isoxaflutol o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona.

Los herbicidas inhibidores de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona,

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se pueden emplear en las formulaciones habituales en la forma de polvos humectables, concentrados emulsionables, soluciones atomizables, polvos para espolvorear o granulados.

Los herbicidas inhibidores de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionados de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona. Los ejemplos de posibles formulaciones son polvos humectables (WP), polvos solubles en agua (SP), concentrados solubles en agua, concentrados emulsionables (EC), emulsiones (EW), tales como emulsiones de los tipos de aceite en agua y de agua en aceite, soluciones atomizables, concentrados para suspensión (SC), dispersiones sobre la base de aceites o de agua, soluciones miscibles con aceites, suspensiones para encapsular (CS), polvos para espolvorear (DP), productos desinfectantes de semillas, granulados para la aplicación por esparcimiento y sobre el suelo, granulados (GR) en forma de microgranulados, de granulados formados por atomización, granulados revestidos y granulados formados por adsorción, granulados dispersables en agua (WG), granulados solubles en agua (SG), formulaciones ULV (de volumen ultra-bajo), microcápsulas y ceras.

Estos tipos individuales de formulaciones son conocidos en principio y se describen, por ejemplo, en las obras de: Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie", tomo 7, editorial C. Hanser, Múnich, 4a edición de 1986; Wade van Valkenburg, "Pesticide Formulations", Marcel Dekker, N.Y., 1973; K. Martens, "Spray Drying Handbook", 3a edición de 1979, G. Goodwin Ltd, Londres.

Los agentes auxiliares requeridos para formulaciones, tales como materiales inertes, agentes tensioactivos, disolventes y otros materiales aditivos, son asimismo conocidos y se describen, por ejemplo, en las obras de: Watkins, "Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers", 2a edición, Darland Books, Caldwell N.J.; H.v. Olphen "Introduction to Clay Colloid Chemistry", 2a edición, J. Wiley & Sons, N.Y.; C. Marsden, "Solvents Guide", 2a edición, Interscience, N.Y. 1963; "Detergents and Emulsifiers Annual" de McCutcheon, MC Publ. Corp., Ridgewood N.J.; Sisley y Wood, "Encyclopedia of Surface Active Agents", Chem. Publ. Co. Inc., N.Y. 1964; Schonfeldt, "Grenzflachenaktive Áthylenoxidaddukte", Wiss. Verlagsgesell., Stuttgart 1976; Winnacker-Küchler, "Chemische Technologie", tomo 7, editorial C. Hanser Munich, 4a edición de 1986.

Sobre la base de estas formulaciones, es posible también preparar combinaciones con otras sustancias activas como plaguicidas, tales como por ejemplo insecticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas, y con antídotos, agentes fertilizantes y/o reguladores del crecimiento, por ejemplo en forma de una formulación acabada o tal como una mezcla en tanque.

Los polvos humectables son unas formulaciones dispersables uniformemente en agua y que, junto a la sustancia activa, comprenden también agentes tensioactivos de tipos iónicos y/o no iónicos (agentes humectantes, agentes dispersantes), por ejemplo alquil-fenoles poli(oxietilados), alcoholes grasos poli(oxietilados), aminas grasas poli(oxietiladas), (alcohol graso)-poliglicol-éter-sulfatos, alcano-sulfonatos, alquil-benceno-sulfonatos, un lignosulfonato de sodio, un 2,2'-dinaftilmetano-6,6'-disulfonato de sodio, un dibutilnaftaleno-sulfonato de sodio o también un oleoil-metil-taurato de sodio, junto a una sustancia diluyente o inerte. Para preparar los polvos humectables, las sustancias activas como herbicidas se muelen finamente, por ejemplo en equipos usuales tales como molinos de martillos, molinos de soplido y molinos de chorros de aire y, simultáneamente o a continuación, se mezclan con los agentes auxiliares para formulaciones.

Los concentrados emulsionables se preparan por disolución de la sustancia activa en un disolvente orgánico, por ejemplo butanol, ciclohexanona, dimetil-formamida, xileno o también compuestos aromáticos o hidrocarburos de punto de ebullición más alto o mezclas de los disolventes orgánicos, con adición de uno o varios agentes tensioactivos de tipos iónicos y/o no iónicos (agentes emulsionantes). Los ejemplos de agentes emulsionantes que se pueden usar son: alquil-aril-sulfonatos de calcio tales como dodecil-benceno-sulfonato de Ca, o emulsionantes no iónicos, tales como ésteres de poliglicoles con ácidos grasos, alquil-aril-poliglicol éteres, (alcohol graso) poliglicol éteres, condensados de óxido de propileno y óxido de etileno, alquil poliéteres, ésteres de sorbitán tales como, por ejemplo, ésteres con ácidos grasos de sorbitán, o poli(oxietilen)-ésteres de sorbitán, tales como, por ejemplo, poli(oxietilen)-ésteres con ácidos grasos de sorbitán.

Los polvos para espolvorear se obtienen mediante molienda de la sustancia activa con materiales sólidos finamente divididos, por ejemplo, talco, arcillas naturales tales como caolín, bentonita y pirofilita, o tierra de diatomeas.

Los concentrados para suspensión pueden estar basados en agua o en aceites. Ellos se pueden preparar por ejemplo por molienda en húmedo mediante molinos de perlas disponibles comercialmente, si fuese apropiado con adición de agentes tensioactivos, tal como ya se han enumerado por ejemplo, más arriba en los casos de los otros tipos de formulaciones.

Las emulsiones, por ejemplo las emulsiones del tipo de aceite en agua (EW), pueden prepararse por ejemplo mediante agitadores, molinos de coloides y/o mezcladores estáticos mediando uso de disolventes orgánicos acuosos y si fuese apropiado, de agentes tensioactivos, tal como ellos se han mencionado ya por ejemplo, más arriba para los otros tipos de formulaciones.

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Los granulados se pueden preparar o bien por proyección de la sustancia activa sobre un material inerte granulado, capaz de adsorción, o por aplicación de concentrados de sustancias activas sobre la superficie de materiales de soporte, tales como arena, caolinitas, o un material inerte granulado con la ayuda de agentes adhesivos, por ejemplo un poli(alcohol vinilo), un poli(acrilato de sodio) o también aceites minerales. También se pueden granular sustancias activas apropiadas del modo que es usual para la producción de granallas de agentes fertilizantes, si se desea en mezcla con agentes fertilizantes.

Los granulados dispersables en agua se preparan por regla general por procedimientos usuales, tales como desecación por atomización, granulación en lecho fluidizado, granulación en bandejas, mezcladura con agitadores de alta velocidad y extrusión sin ningún material inerte sólido.

Para preparar granulados en disco, granulados en lecho fluidizado, granulados en extrusor y granulados por atomización, véanse, por ejemplo, los procedimientos en “Spray-Drying Handbook” 3a edición de 1979, G. Goodwin Ltd., Londres; J.E. Browning, “Agglomeration”, Chemical and Engineering 1967, páginas 147 y siguientes; “Perry's Chemical Engineer's Handbook”, 5a edición, McGraw-Hill, Nueva York 1973, páginas 8-57.

Para más detalles acerca de la formulación de agentes para la protección de plantas cultivadas, véanse, por ejemplo, las obras de G.C. Klingman, “Weed Control as a Science”, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York, 1961, páginas 81-96 y de J.D. Freyer, S.A. Evans, “Weed Control Handbook”, 5a edición, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1968, páginas 101-103.

Por regla general, las formulaciones agroquímicas comprenden de 0,1 a 99 % en peso, en particular de 0,1 a 95 % en peso, de compuestos conformes al invento. En polvos humectables, la concentración de una sustancia activa es por ejemplo, de aproximadamente 10 a 90 % en peso, el resto hasta 100 % en peso se compone de los usuales constituyentes de formulaciones. En el caso de los concentrados emulsionables, la concentración de una sustancia activa puede ser de aproximadamente 1 a 90, preferentemente de 5 a 80 % en peso. Las formulaciones en forma de polvos para espolvorear contienen de 1 a 30 % en peso de una sustancia activa, preferentemente en la mayor parte de los casos de 5 a 20 % en peso de una sustancia activa, y las soluciones atomizables comprenden de aproximadamente 0,05 a 80, preferentemente de 2 a 50 % en peso de una sustancia activa. En el caso de granulados dispersables en agua, el contenido de una sustancia activa depende en parte de si el compuesto activo se presenta en forma líquida o sólida, y de cuáles sean los agentes auxiliares de granulación, materiales de carga y relleno y similares, que se usen. En el caso de los granulados dispersables en agua, por ejemplo, el contenido de una sustancia activa está situado entre 1 y 95 % en peso, preferentemente entre 10 y 80 % en peso.

Además, las mencionadas formulaciones de sustancias activas comprenden, si fuese apropiado, los agentes auxiliares que son convencionales en cada caso, tales como agentes adhesivos, humectantes, dispersantes, emulsionantes, penetrantes, conservantes, protectores frente a las heladas y disolventes, materiales de carga y relleno, materiales de soporte y colorantes, antiespumantes, inhibidores de la evaporación y agentes reguladores de pH y viscosidad.

Sobre la base de estas formulaciones, es también posible preparar combinaciones de un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona con otras sustancias activas como plaguicidas, tales como, por ejemplo, insecticidas, acaricidas, herbicidas, fungicidas, y con antídotos, agentes fertilizantes y/o reguladores del crecimiento, por ejemplo en forma de una formulación acabada o tal como una mezcla en tanque, que se ha de aplicar a las plantas tolerantes a las HPPD de acuerdo con la invención.

Las sustancias activas que pueden ser aplicadas a plantas tolerantes a las HPPD de acuerdo con la presente invención en combinación con un herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona en formulaciones mixtas o en una mezcla en depósito, son, por ejemplo, sustancias activas conocidas, que se basan en la inhibición de, por ejemplo, acetolactato sintasa, acetil-CoA carboxilasa, celulosa sintasa, enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa, glutamina sintetasa, p-hidroxifenilpiruvato dioxigenasa, fitoeno desaturasa, fotosistema I, fotosistema II, protoporfirinógeno oxidasa, tal como se describen por ejemplo, en Weed Research 26 (1986) 441-445, o en el manual "The Pesticide Manual", 14a edición, The British Crop Protection Council and the Royal Soc. of Chemistry, 2003 y la bibliografía allí citada. Conocidos agentes herbicidas o reguladores del crecimiento de las plantas, que se pueden combinar con los compuestos conformes al invento, son, por ejemplo, las siguientes sustancias activas (los compuestos son designados o bien por el nombre común de acuerdo con la International Organization for Standardization (ISO) o por el nombre químico, si fuese apropiado junto con el número de código) y comprenden siempre todas las formas de uso, tales como ácidos, sales, ésteres e isómeros tales como estereoisómeros e isómeros ópticos. En este contexto se mencionan a modo de ejemplo una forma de uso y en parte también varias formas de uso:

acetocloro; acibenzolar, acibenbenzolar-S-metilo, acifluorfeno, acifluorfeno-sodio, aclonifeno, alacloro, alidocloro,

aloxidim, aloxidim-sodio, ametrina, amicarbazona, amidocloro, amidosulfurón, aminociclopiracloro, aminopiralida,

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amitrol, sulfamato de amonio, ancimidol, anilofos, asulam, atrazina, azafenidina, azimsulfurón, aziprotrina, BAH- 043, BAS-140H, BAS-693H, BAS-714H, BAS-762H, BAS-776H, BAS-800H, beflubutamida, benazolina, benazolin-etilo, bencarbazona, benfluralina, benfuresato, bensulida, bensulfurón-metilo, bentazona, benzofendizona, benzobiciclona, benzofenap, benzofluoro, benzoilprop, bifenox, bilanafos, bilanafos-sodio, bispiribac, bispiribac-sodio, bromadlo, bromobutida, bromofenoxima, bromoxinilo, bromurón, buminafos, busoxinona, butacloro, butafenacilo, butamifos, butenacloro, butralina, butroxidim, butilato, cafenstrol, carbetamida, carfentrazona, carfentrazona-etilo, clometoxifeno, cloramben, clorazifop, clorazifop-butilo, clorobromurón, clorobufam, clorfenac, clorfenac-sodio, clorfenprop, cloroflurenol, cloroflurenol-metilo, cloridazona, clorimurón, clorimurón-etilo, cloromequat-cloruro, cloronitrofeno, cloroftalim, clortal-dimetilo, clorotolurón, clorosulfurón, cinidon, cinidon-etilo, cinmetilina, cinosulfurón, cletodim, clodinafop, clodinafop- propargilo, clofencet, clomazona, clomeprop, cloprop, clopiralida, cloransulam, cloransulam-metilo, cumilurón, cianamida, cianazina, ciclanilida, cicloato, ciclosulfamurón, cicloxidim, ciclurón, cihalofop, cihalofop-butilo, ciperquat, ciprazina, ciprazol, 2,4-D, 2,4-DB, daimurón/dimron, dalapon, daminozida, dazomet, n-decanol, desmedifam, desmetrina, detosil-pirazolato (DTP), di-alato, dicamba, diclobenilo, diclorprop, diclorprop-P, diclofop, diclofop-metilo, diclofop-P-metilo, diclosulam, dietatilo, dietatilo-etilo, difenoxurón, difenzoquat, diflufenican, diflufenzopir, diflufenzopir-sodio, dimefurón, dikegulac-sodio, dimefurón, dimepiperato, dimetacloro, dimetametrina, dimetenamida, dimetenamida-P, dimetipina, dimetrasulfurón, dinitramina, dinoseb, dinoterb, difenamida, dipropetrina, diquat, diquat-dibromuro, ditiopir, diurón, DNOC, eglinazin-etilo, endotal, EPTC, esprocarb, etalfluralina, etametsulfurón-metilo, etefon, etidimurón, etiozina, etofumesato, etoxifeno, etoxifeno- etilo, etoxisulfurón, etobenzanida, F-5331, es decir N-[2-cloro-4-fluoro-5-[4-(3-fluoro-propil)-4,5-dihidro-5-oxo-1H- tetrazol-1-il]-fenil]-etano-sulfonamida, fenoprop, fenoxaprop, fenoxaprop-P, fenoxaprop-etilo, fenoxaprop-P-etilo, fentrazamida, fenurón, flamprop, flamprop-M-isopropilo, flamprop-M-metilo, flazasulfurón, florasulam, fluazifop, fluazifop-P, fluazifop-butilo, fluazifop-P-butilo, fluazolato, flucarbazona, flucarbazona-sodio, flucetosulfurón, flucloralina, flufenacet (tiafluamida), flufenpir, flufenpir-etilo, flumetralina, flumetsulam, flumiclorac, flumiclorac- pentilo, flumioxazina, flumipropina, fluometurón, fluorodifeno, fluoroglicofeno, fluoroglicofeno-etilo, flupoxam, flupropacilo, flupropanato, flupirsulfurón, flupirsulfurón-metil-sodio, flurenol, flurenol-butilo, fluridona,

flurocloridona, fluroxipir, fluroxipir-meptilo, flurprimidol, flurtamona, flutiacet, flutiacet-metilo, flutiamida, fomesafeno, foramsulfurón, forclorofenurón, fosamina, furiloxifeno, ácido giberélico, glufosinato, L-glufosinato, L- glufosinato-amonio, glufosinato-amonio, glifosato, glifosato-isopropilamonio, H-9201, halosafeno, halosulfurón, halosulfurón-metilo, haloxifop, haloxifop-P, haloxifop-etoxietilo, haloxifop-P-etoxietilo, haloxifop-metilo, haloxifop- P-metilo, hexazinona, HNPC-9908, HOK-201, HW-02, imazametabenz, imazametabenz-metilo, imazamox, imazapic, imazapir, imazaquina, imazetapir, imazosulfurón, inabenfida, indanofan, ácido indol-acético (IAA), ácido 4-indol-3-il-butírico (IBA), yodosulfurón, yodosulfurón-metil-sodio, ioxinilo, isocarbamida, isopropalina, Isoproturón, isourón, isoxabeno, isoxaclortol, isoxaflutol, isoxapirifop, KUH-043, KUH-071, karbutilato, ketospiradox, lactofeno, lenacilo, linurón, hidrazida de ácido maleico, MCPA, MCPB, MCPB-metilo, -etilo y -sodio, mecoprop, mecoprop-sodio, mecoprop-butotilo, mecoprop-P-butotilo, mecoprop-P-dimetilamonio, mecoprop-P-2- etil-hexilo, mecoprop-P-potasio, mefenacet, mefluidida, mepiquat-cloruro, mesosulfurón, mesosulfurón-metilo, metabenzotiazurón, metam, metamifop, metamitron, metazacloro, metazol, metoxifenona, metildimron, 1-metil- ciclopropeno, isotiocianato de metilo, metobenzurón, metobenzurón, metobromurón, metolacloro, S-metolacloro, metosulam, metoxurón, metribuzina, metsulfurón, metsulfurón-metilo, molinato, monalida, monocarbamida, monocarbamida dihidrógeno sulfato, monolinurón, monosulfurón, monurón, MT 128, MT-5950, es decir N-[3- cloro-4-(1-metil-etil)-fenil]-2-metil-pentanamida, NGGC-011, naproanilida, napropamida, naptalam, NC-310, es decir 4-(2,4-dicloro-benzoil)-1-metil-5-benciloxi-pirazol, neburón, nicosulfurón, nipiraclofeno, nitralina, nitrofeno, nitrofenolato-sodio (mezcla de isómeros), nitrofluorfeno, ácido nonanoico, norflurazona, orbencarb, ortosulfamurón, orizalina, oxadiargilo, oxadiazona, oxasulfurón, oxaziclomefona, oxifluorfeno, paclobutrazol, paraquat, paraquat dicloruro, ácido pelargónico (ácido nonanoico), pendimetalina, pendralina, penoxsulam, pentanocloro, pentoxazona, perfluidona, petoxamida, fenisofam, fenmedifam, fenmedifam-etilo, picloram, picolinafeno, pinoxaden, piperofos, pirifenop, pirifenop-butilo, pretilacloro, primisulfurón, primisulfurón-metilo, probenazol, profluazol, prociazina, prodiamina, prifluralina, profoxidim, prohexadiona, prohexadiona-calcio, prohidrojasmona, prometon, prometrina, propacloro, propanilo, propaquizafop, propazina, profam, propisocloro, propoxicarbazona, propoxicarbazona-sodio, propizamida, prosulfalina, prosulfocarb, prosulfurón, prinacloro, piraclonilo, piraflufeno, piraflufeno-etilo, pirasulfotol, pirazolinato (pirazolato), pirazosulfurón-etilo, pirazoxifeno, piribambenz, piribambenz-isopropilo, piribenzoxima, piributicarb, piridafol, piridato, piriftalida, piriminobac, piriminobac-metilo, pirimisulfano, piritiobac, piritiobac-sodio, piroxasulfona, piroxsulam, quinclorac, quinmerac, quinoclamina, quizalofop, quizalofop-etilo, quizalofop-P, quizalofop-P-etilo, quizalofop-P-tefurilo, rimsulfurón, saflufenacilo, secbumetona, setoxidim, sidurón, simazina, simetrina, SN-106279, sulcotriona, sulfalato (CDEC), sulfentrazona, sulfometurón, sulfometurón-metilo, sulfosato (glifosato-trimesio), sulfosulfurón, SYN-523, SYP- 249, SYP-298, SYP-300, tebutam, tebutiurón, tecnazeno, tepraloxidim, terbacilo, terbucarb, terbucloro, terbumetona, terbutilazina, terbutrina, TH-547, tenilcloro, tiafluamida, tiazaflurón, tiazopir, tidiazimina, tidiazurón, tiencarbazona, tiencarbazona-metilo, tifensulfurón, tifensulfurón-metilo, tiobencarb, tiocarbazilo, ralkoxidim, tri- alato, triasulfurón, triaziflam, triazofenamida, tribenurón, tribenurón-metilo, ácido tricloroacético (TCA), triclopir, tridifano, trietazina, trifloxisulfurón, trifloxisulfurón-sodio, trifluralina, triflusulfurón, triflusulfurón-metilo, trimeturón, trinexapac, trinexapac-etilo, tritosulfurón, tsitodef, uniconazol, uniconazol-P, vernolato, ZJ-0166, ZJ-0270, ZJ- 0543, ZJ-0862 y los siguientes compuestos

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La tasa de aplicación requerida del herbicida inhibidor de las HPPD de la clase de las tricetonas, tales como tembotriona, sulcotriona y mesotriona, o de la clase de los pirazolinatos, tales como pirasulfotol y topramezona, particularmente seleccionado de tembotriona, sulcotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y mesotriona, más particularmente tembotriona, que se ha de aplicar a unas zonas en las que están creciendo plantas tolerantes a las HPPD de acuerdo con la presente invención, varía en función de condiciones externas tales como la temperatura, la humedad, la naturaleza del herbicida usado y otras similares. Ella puede variar, por ejemplo, entre 0,001 y 1,0 y más kg/ha de sustancia activa, pero está situada preferentemente entre 0,005 y 750 g/ha.

En el caso de aplicaciones combinadas de herbicidas inhibidores de las HPPD con unos herbicidas, que difieren de los herbicidas inhibidores de las HPPD, a las plantas tolerantes a las HPPD de acuerdo con la presente invención, estas mezclas pueden causar lesiones en las plantas cultivadas, basándose en la presencia de los herbicidas no inhibidores de las HPPD. Con el fin de reducir/eliminar dichas lesiones en las plantas cultivadas, se pueden añadir apropiados antídotos. Estos antídotos, que se emplean en cantidades activas como antídotos, reducen los efectos colaterales de los herbicidas/plaguicidas usados, por ejemplo en plantas cultivadas económicamente importantes, tales como las de cereales (trigo, cebada, centeno, maíz, arroz, mijo), alfalfa, remolacha azucarera, caña de azúcar, colza de semilla oleaginosa, algodón y especies de soja, preferentemente las de maíz, algodón, remolacha azucarera, o especies de soja.

Los antídotos se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en:

A) compuestos de la fórmula (S-I)

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donde los símbolos e índices tienen los siguientes significados:

nA es un número natural de 0 a 5, preferentemente de 0 a 3;

Ra1 es halógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), nitro o haloalquilo (C1-C4);

Wa es un radical heterocíclico divalente sin sustituir o sustituido, del grupo que consiste en los hetero-

ciclos con anillos de cinco miembros, parcialmente insaturados o aromáticos con 1 a 3 heteroátomos de anillo del tipo de No O, estando presente en el anillo al menos un átomo de nitrógeno y a lo sumo un átomo de oxígeno, preferentemente un radical del grupo que consiste en

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mA es 0 o 1;

Ra2 es ORa3, SRa3 o NRa3Ra4 o un heterociclo de 3 a 7 miembros, saturado o insaturado, que tiene al

menos un átomo de nitrógeno y hasta 3 heteroátomos, preferentemente del grupo que consiste en O y S, que está unido a través del átomo de nitrógeno con el grupo carbonilo en (S-I), y que está sin sustituir o sustituido con radicales del grupo que consiste en alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4) y fenilo opcionalmente sustituido, preferentemente un radical de fórmulas ORa3, NHRa3 o N(CH3)2, en particular de fórmula ORa3;

Ra3 es hidrógeno o un radical hidrocarburo alifático sin sustituir o sustituido, que tiene preferentemente

un total de 1 a 18 átomos de carbono;

Ra4 es hidrógeno, alquilo (Ci-C6), alcoxi (Ci-C6) o fenilo sin sustituir o sustituido;

Ra5 es H, alquilo (Ci-Cb), halo-alquilo (Ci-Cb), alcoxi (Ci-C4)-alquilo (Ci-Cb), ciano o COORa9, donde

Ra9 es hidrógeno, alquilo (Ci-Cb), halo-alquilo (Ci-Cb), alcoxi (Ci-C4)-alquilo (C1-C4), hidroxi-alquilo (Ci-C6), cicloalquilo (C3-C12) o tri-alquil (Ci-C4)-sililo;

Ra6, Ra7, Ra8 son idénticos o diferentes, y son hidrógeno, alquilo (Ci-Cb), halo-alquilo (Ci-Cb), cicloalquilo (C3- C12), o fenilo sustituido o sin sustituir;

preferentemente:

a) compuestos del tipo del ácido diclorofenilpirazolin-3-carboxílico, preferentemente compuestos tales como 1-(2,4-diclorofenil)-5-(etoxicarbonil)-5-metil-2-pirazolin-3-carboxilato de etilo (Si-i), (“mefenpir-dietilo”, véase Pestic. Man.) y compuestos relacionados, como se describen en el documento WO 91/07874;

b) derivados del ácido diclorofenilpirazolcarboxílico, preferentemente compuestos tales como i-(2,4- diclorofenil)-5-metilpirazol-3-carboxilato de etilo (S1-2), 1-(2,4-diclorofenil)-5-isopropil-pirazol-3-carboxilato de etilo (S1-3), 1-(2,4-diclorofenil)-5-(1,1-dimetil-etil)pirazol-3-carboxilato de etilo (s1-4), 1-(2,4-diclorofenil)-5- fenil-pirazol-3-carboxilato de etilo (S1-5) y compuestos relacionados, tal como se describen en los documentos EP-A-333 131 y EP-A-269 806.

c) compuestos del tipo de los ácidos triazolcarboxílicos, preferentemente compuestos tales como el fenclorazol(-éster de etilo), es decir 1-(2,4-diclorofenil)-5-triclorometil-(1H)-1,2,4-triazol-3-carboxilato de etilo (S1-6) y compuestos relacionados tal como se describen en los documentos EP-A-174 562 y EP-A-346 620;

d) compuestos del tipo de los ácidos 5-bencil- o 5-fenil-2-isoxazolin-3-carboxílicos, o del ácido 5,5-difenil-2- isoxazolin-3-carboxílico, preferentemente compuestos tales como 5-(2,4-dicloro-bencil)-2-isoxazolin- carboxilato de etilo (S1-7) o 5-fenil-2-isoxazolin-3-carboxilato de etilo (S1-8) y compuestos relacionados, tal como se describen en el documento WO 91/08202, o respectivamente 5,5-difenil-2-isoxazolin-carboxilato de etilo (S1-9) (“isoxadifen-etilo”) o 5,5-difenil-2-isoxazolin-carboxilato de n-propilo (S1-10) o 5-(4-fluoro-fenil)-5- fenil-2-isoxazolin-3-carboxilato de etilo (S1-11), tal como se describen en la solicitud de patente documento WO-A-95/07B97.

B) Derivados de quinolina de la fórmula (S-II)

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donde los símbolos e índices tienen los siguientes significados:

Rb1 es halógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), nitro o halo-alquilo (C1-C4); nB es un número natural de 0 a 5, preferentemente de 0 a 3;

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Rb es ORb , SRb o NRb Rb o un heterociclo de 3 a 7 miembros,

saturado o insaturado, que tiene al menos un átomo de nitrógeno y hasta 3 heteroátomos, preferentemente del grupo que consiste en O y S, que está unido a través del átomo de nitrógeno con el grupo carbonilo en (S-II), y que está sin sustituir o sustituido con radicales del grupo que consiste en alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4) o fenilo opcionalmente sustituido, preferentemente un radical de fórmula ORb3, NHRb4 o N(CH3)2, en particular de la fórmula ORb3;

Rb3 es hidrógeno o un radical hidrocarbilo alifático sin sustituir o sustituido, que tiene preferentemente un total de 1 a 18 átomos de carbono;

Rb4 es hidrógeno, alquilo (C1-C6), alcoxi (C1-C6) o fenilo sin sustituir o sustituido;

Tb es una cadena de alcanodiilo (C1 o C2), que está sin sustituir o sustituida con uno o dos radicales (C1-C4) o

con [alcoxi (C1-C3)]-carbonilo;

preferentemente:

a) compuestos del tipo del ácido 8-quinolinoxiacético (S2), preferentemente (5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 1-metilhexilo (nombre común “cloquintocet-mexilo” (S2-1), (véase Pestic. Man.),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 1,3-dimetilbut-1-ilo) (S2-2),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 4-aliloxibutilo (S2-3),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 1 -aliloxiprop-2-ilo (S2-4),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de etilo (S2-5),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de metilo (S2-6),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de alilo (S2-7),

(5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 2-(2-propilideniminooxi)-1-etilo (S2-8), (5-cloro-8-quinolinoxi)-acetato de 2- oxo-propilo (S2-9) y compuestos relacionados, tal como se describen en los documentos EP-A-86 750, EP-A- 94 349 y EP-A-191 736 o EP-A-0 492 366, y también sus hidratos y sales tal como se describen en el documento WO-A-2002/034048.

b) compuestos del tipo del ácido (5-cloro-8-quinolinoxi)malónico, preferentemente compuestos tales como (5- cloro-8-quinolinoxi)malonato de dietilo, (5-cloro-8-quinolinoxi)malonato de dialilo, (5-cloro-8- quinolinoxi)malonato de metil etilo y compuestos relacionados, tal como se describen en el documento EP-A- 0 582 198.

C) Compuestos de fórmula (S-III)

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(S-lll)

donde los símbolos e índices tienen los siguientes significados:

1

Rc es alquilo (C1-C4), halo-alquilo (C1-C4), alquenilo (C2-C4), halo-alquenilo (C2-C4), cicloalquilo (C3-C7), preferentemente diclorometilo;

Rc2, Rc3 son idénticos o diferentes y son hidrógeno, alquilo (C1-C4), alquenilo (C2-C4), alquinilo de (C2-C4), halo-alquilo (C1-C4), halo-alquenilo (C2-C4), alquil (C1-C4)-carbamoil-alquilo (C1-C4), alquenil (C2-C4)- carbamoil-alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4)-alquilo (C1-C4), dioxolanil-alquilo (C1-C4), tiazolilo, furilo, furil-alquilo, tienilo, piperidilo, fenilo sustituido o sin sustituir, o Rc2 y Rc3 forman en común un anillo heterocíclico sustituido o sin sustituir,

preferentemente un anillo de oxazolidina, tiazolidina, piperidina, morfolina, hexahidropirimidina o benzoxazina;

preferentemente:

Compuestos activos del tipo de las dicloroacetamidas, que se usan frecuentemente como antídotos para antes del brote (antídotos activos en el suelo), tales como por ejemplo "diclormida“(véase Pestic. Man.) (= N,N-dialil-2,2-dicloro-acetamida),

"R-29148" (= 3-dicloroacetil-2,2,5-trimetil-1,3-oxazolidona de Stauffer),

"R-28725" (= 3-dicloroacetil-2,2,5-dimetil-1,3-oxazolidona de Stauffer),

"benoxacor“ (véase Pestic. Man.) (= 4-dicloroacetil-3,4-dihidro-3-metil-2H-1,4-benzoxazina).

“PPG-1292" (= N-alil-N[(1,3-dioxolan-2-il)-metil]dicloroacetamida de PPG Industries),

“DKA-24" (= N-alil-N-[(alilaminocarbonil)-metil]-dicloroacetamida de Sagro-Chem),

“AD-67" o “MON 4660" (= 3-dicloroacetil-1-oxa-3-aza-espiro[4,5]decano de Nitrokemia o Monsanto respectivamente),

“Ti-35” (= 1-dicloroacetil-azepano de TRI-Chemical RT)

"diclonona“ (diciclonona) o "BAS145138" o "LAB145138" (= 3-dicloroacetil-2,5,5-trimetil-1,3-diaza- biciclo[4.3.0]nonano de BASF) y

"furilazol“ o "MON 13900" (véase Pestic. Man.) (= (RS)-3-dicloroacetil-5-(2-furil)-2,2-dimetil-oxazolidona)

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D) N-Acilsulfonamidas de fórmula (S-IV) y sus sales

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en la que

Xd es CH o N;

Rd1 es CO-NRd5Rd6 o NHCO-Rd7;

Rd2 es halógeno, halo-alquilo (C1-C4), halo-alcoxi (C1-C4), nitro, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), alquil (C1-C4)- sulfonilo, alcoxi (Ci-C4)-carbonilo o alquil (Ci-C4)-carbonilo;

Rd3 es hidrógeno, alquilo (C1-C4), alquenilo (C2-C4) o alquinilo (C2-C4);

Rd4 es halógeno, nitro, alquilo (C1-C4), halo-alquilo (C1-C4), halo-alcoxi (C1-C4), cicloalquilo (C3-C6), fenilo, alcoxi (C1-C4), ciano, alquil (Ci-C4)-tio, alquil (Ci-C4)-sulfinilo, alquil (Ci-C4)-sulfonilo, alcoxi (Ci-C4)-carbonilo o alquil (Ci-C4)-carbonilo;

Rd5 es hidrógeno, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C6), alquenilo (C2-C6), alquinilo (C2-C6), cicloalquenilo (C5- C6), fenilo o heterociclilo de 3 a 6 miembros que contiene vd heteroátomos del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre, realizándose que los siete radicales mencionados en último término están sustituidos con vd sustituyentes, del grupo que consiste en halógeno, alcoxi (C1-C6), halo-alcoxi (C1-C6), alquil (Ci-C2)-sulfinilo, alquil (Ci-C2)-sulfonilo, cicloalquilo (C3-C6), alcoxi (Ci-C4)-carbonilo, alquil (Ci-C4)-carbonilo y fenilo y, en el caso de radicales cíclicos, también están sustituidos con alquilo (C1-C4) y halo-alquilo (C1-C4); Rd6 es hidrógeno, alquilo (C1-C6), alquenilo (C2-C6) o alquinilo (C2-C6), donde los tres radicales mencionados en último término están sustituidos con vd radicales del grupo que consiste en halógeno, hidroxi, alquilo (Ci- C4), alcoxi (C1-C4) y alquil (Ci-C4)-tio, o

RDSy Rd6 forman en común con el átomo de nitrógeno que los lleva un anillo de pirrolidinilo o piperidinilo;

Rd7 es hidrógeno, alquil (Ci-C4)-amino, di-alquil (Ci-C4)-amino, alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C6), donde los 2 radicales mencionados en último término están sustituidos con vd sustituyentes, del grupo que consiste en halógeno, alcoxi (C1-C4), halógeno-alcoxi (C1-C6) y alquil (Ci-C4)-tio y en el caso de radicales cíclicos, también están sustituidos con alquilo (C1-C4) y halo-alquilo (C1-C4); nD es 0, i o 2; mD es i o 2; vd es 0, i, 2 o 3;

de entre éstos se da la preferencia a los compuestos del tipo de las N-acil-sulfonamidas, por ejemplo de la fórmula (S-V) siguiente, que son conocidos, por ejemplo, a partir del documento WO 97/45016

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en la que

Rd7 es alquilo (C1-C6), cicloalquilo (C3-C6), en que los 2 radicales mencionados en último término están sustituidos con vd sustituyentes, del grupo que consiste en halógeno, alcoxi (C1-C4), halógeno-alcoxi (C1-C6) y alquil (Ci-C4)-tio y, en el caso de radicales cíclicos, también están sustituidos con alquilo (C1-C4) y halo- alquilo (C1-C4);

Rd4 es halógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), CF3; mD es i o 2; vd es 0, i, 2 o 3;

y también

acilsulfamoilbenzamidas, por ejemplo de la siguiente fórmula (S-VI), que son conocidas, por ejemplo, a partir del documento WO 99/16744,

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por ejemplo aquellas en que

Rd5 = ciclopropilo y (Rd4) = 2-OMe ("ciprosulfamida", S3-1), Rd5 = ciclopropilo y (Rd4) = 5-Cl-2-OMe (S3-2),

Rd5 = etilo y (Rd4) = 2-OMe (S3-3),

Rd5 = isopropilo y (Rd4) = 5-Cl-2-OMe (S3-4) y Rd5 = isopropilo y (Rd4) = 2-OMe (S3-5);

y también

compuestos del tipo de las N-acilsulfamoilfenilureas de fórmula (S-VII), que son conocidos, por ejemplo, a partir del documento EP-A-365484

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en la que

Rd8 y Rd9 independientemente uno de otro son hidrógeno, alquilo (C-i-Cs), cicloalquilo (C3-C8), alquenilo (C3- C6), alquinilo (C3-C6),

Rd4 es halógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), CF3 mo es 1 o 2;

de entre estos en particular 1-[4-(N-2-metoxibenzoilsulfamoil)fenil]-3-metilurea,

1-[4-(N-2-metoxibenzoilsulfamoil)fenil]-3,3-dimetilurea,

1-[4-(N-4,5-dimetilbenzoilsulfamoil)fenil]-3-metilurea,

1-[4-(N-naftoilsulfamoil)fenil]-3,3-dimetilurea,

G) compuestos activos de la clase de los hidroxiaromáticos y de los derivados de ácidos carboxílicos aromático- alifáticos, por ejemplo 3,4,5-triacetoxibenzoato de etilo, ácido 3,5-dimetoxi-4-hidroxibenzoico, ácido 3,5- dihidroxibenzoico, ácido 4-hidroxisalicílico, ácido 4-fluorosalicílico, 1,2-dihidro-2-oxo-6-trifluorometilpiridin-3- carboxamida, ácido 2-hidroxicinámico, 2,4-diclorocinámico, tal como se describen en los documentos WO 2004084631, WO 2005015994, WO 2006007981 y WO 2005016001;

H) compuestos activos de la clase de las 1,2-dihidroquinoxalin-2-onas, por ejemplo 1-metil-3-(2-tienil)-1,2- dihidroquinoxalin-2-ona, 1-metil-3-(2-tienil)-1,2-dihidroquinoxalin-2-tiona, clorhidrato de 1-(2-aminoetil)-3-(2-tienil)-

1,2-dihidro-quinoxalin-2-ona, 1-(2-metilsulfonilaminoetil)-3-(2-tienil)-1,2-dihidro-quinoxalin-2-ona, tal como se describen en el documento WO 2005112630,

I) compuestos activos que además de una acción herbicida contra plantas dañinas, tienen también una acción como antídoto sobre plantas cultivadas tales como arroz, tales como, por ejemplo, "dimepiperato" o "MY-93" (véase Pestic. Man.) (= piperidin-1-tio-carboxilato de S-1 -metil-1-feniletilo), que se conoce como antídoto para arroz contra daños causados por el herbicida molinato, "daimurón" o "SK 23" (véase Pestic. Man.) (= 1-(1-metil-1- feniletil)-3-p-tolilurea), que se conoce como antídoto para arroz contra daños causados por el herbicida imazosulfurón, "cumilurón" = "JC-940" (= 3-(2-clorofenilmetil)-1-(1-metil-1-feniletil)urea, véase el documento JP- A-60087254), que se conoce como antídoto para arroz contra daños causados por algunos herbicidas, "metoxifenona" o "NK 049" (= 3,3'-dimetil-4-metoxibenzofenona), que se conoce como antídoto para arroz contra daños causados por algunos herbicidas, "CSB" (= 1-bromo-4-(clorometilsulfonil)benceno) (N.° de Reg. CAS 54091-06-4 de Kumiai), que se conoce como antídoto contra daños causados por algunos herbicidas en arroz,

K) compuestos de fórmula (S-IX), como se describen en el documento WO-A-1998/38856

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en que los símbolos e índices tienen los siguientes significados:

Rk1, Rk2 independientemente uno de otro, son halógeno, alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), halo-alquilo (C1-C4), alquil (C1-C4)-amino, di-alquil (C1-C4)-amino, nitro;

Ak es COORk3 o COORk4

Rk3, Rk4 independientemente uno de otro, son hidrógeno, alquilo (C1-C4), alquenilo (C2-C6), alquinilo de (C2- C4), cianoalquilo, halo-alquilo (C1-C4), fenilo, nitrofenilo, bencilo, halobencilo, piridinilalquilo o alquilamonio, nK1 es 0 o 1

nK2, nK3 independientemente uno de otro, son 0, 1 o 2

preferentemente: (difenilmetoxi)acetato de metilo (N.° de Reg. CAS: 41858-19-9),

L) compuestos de fórmula (S-X), como se describen en el documento WO A-98/27049

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en que los símbolos e índices tienen los siguientes significados:

Xl es CH o N,

nL para el caso de que sea X = N, es un número entero de 0 a 4 y para el caso de que sea X = CH, es un número entero de 0 a 5,

Rl1 es halógeno, alquilo (C1-C4), halo-alquilo (C1-C4), alcoxi (C1-C4), halo-alcoxi (C1-C4), nitro, alquil (C1-C4)- tio, alquil (Ci-C4)-sulfonilo, alcoxi (Ci-C4)-carbonilo, fenilo opcionalmente sustituido, fenoxi opcionalmente sustituido,

Rl2 es hidrógeno o alquilo (C1-C4),

Rl3 es hidrógeno, alquilo (Ci-Ce), alquenilo (C2-C4), alquinilo (C2-C4) o arilo, en que cada uno de los radicales que contienen carbono, antes mencionados, está sin sustituir o sustituido con uno o varios, preferentemente hasta tres, radicales idénticos o diferentes tomados del conjunto que se compone de halógeno y alcoxi; o sales de los mismos,

M) compuestos activos de la clase de las 3-(5-tetrazolilcarbonil)-2-quinolonas, por ejemplo

1,2-dihidro-4-hidroxi-1-etil-3-(5-tetrazolilcarbonil)-2-quinolona (N.° de Reg. CAS.: 219479-18-2), 1,2-dihidro-4- hidroxi-1-metil-3-(5-tetrazolil-carbonil)-2-quinolona (N.° de Reg. CAS.: 95855-00-8), como se describen en el documento WO-A-1999000020,

N) Compuestos de fórmulas (S-XI) o (S-XII), como se describen en los documentos WO-A-2007023719 y WO-A- 2007023764

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en las que

Rn1 es halógeno, alquilo (C1-C4), metoxi, nitro, ciano, CF3, OCF3

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Y, Z independientemente uno de otro son O o S, nN es un número entero de 0 a 4,

Rn2 es alquilo (C1-C16), alquenilo (C2-C6), cicloalquilo (C3-C6), arilo; bencilo, halobencilo,

Rn3 es hidrógeno, alquilo (C1-C6);

O) uno o más compuestos del grupo que consiste en:

anhídrido 1,8-naftálico,

fosforoditioato de O,O-dietilo y S-2-etiltio-etilo (disulfotón), metilcarbamato de 4-clorofenilo (mefenato), fosforotioato de O,O-dietil-O-fenilo (dietolato),

ácido 4-carboxi-3,4-dihidro-2H-1-benzopirano-4-acético (CL-304415, N.° de Reg. CAS.: 31541-57-8),

1- oxa-4-azaespiro[4.5]decano-4-carboditioato de 2-propenilo (MG-838, N.° de Reg. CAS.: 133993-74-5), [(3-oxo-1H-2-benzotiopiran-4(3H)-iliden)metoxi]acetato de metilo (del documento WO-A-98/13361; N.° de Reg. CAS.: 205121-04-6),

cianometoxiimino(fenil)acetonitrilo (ciometrinilo),

1,3-dioxolan-2-ilmetoxiimino(fenil)acetonitrilo (oxabetrinilo),

O-1,3-dioxolan-2-ilmetil-oxima de 4'-cloro-2,2,2-trifluoro-acetofenona (fluxofenim),

4,6-dicloro-2-fenilpirimidina (fenclorim),

2- cloro-4-trifluorometil-1,3-tiazol-5-carboxilato de bencilo (flurazol),

2-diclorometil-2-metil-1,3-dioxolano (MG-191),

incluyendo a los estereoisómeros y a las sales habituales en la agricultura.

También es posible una mezcla con otros compuestos activos conocidos, tales como fungicidas, insecticidas, acaricidas, nematicidas, repelentes de pájaros, nutrientes de plantas y agentes mejoradores de la estructura de los suelos.

Algunos de los antídotos ya son conocidos como herbicidas y, por consiguiente, además de la acción herbicida contra plantas dañinas, también actúan protegiendo a las plantas cultivadas. Las relaciones ponderales del herbicida (mezcla) al antídoto dependen en general de la tasa de aplicación del herbicida y de la eficacia del antídoto en cuestión y pueden variar dentro de amplios límites, por ejemplo en el intervalo de 200:1 a 1:200, preferentemente de 100:1 a 1:100, en particular de 20:1 a 1:20. Los antídotos se pueden formular de una manera análoga a la de los compuestos de fórmula (I) o sus mezclas con otros herbicidas/plaguicidas y se pueden poner a disposición y utilizar como una formulación acabada o una mezcla en depósito con los herbicidas.

La tasa de aplicación requerida del compuesto de la fórmula (I) varía dependiendo, entre otras cosas, de condiciones externas tales como la temperatura, la humedad y el tipo del herbicida usado. Puede variar dentro amplios límites, por ejemplo entre 0,001 y 10.000 o más g/ha de la sustancia activa; sin embargo, está situada preferentemente entre 0,5 y 5.000 g/ha, de manera particularmente preferible entre 0,5 y 1.000 g/ha y de manera muy particularmente preferible entre 0,5 y 500 g/ha.

Cuando la planta transgénica de la invención contiene uno o más genes distintos para tolerancia a otros herbicidas (tal como, por ejemplo, un gen que codifica una EPSPS mutada o no mutada que confiere a la planta tolerancia a herbicidas del tipo de glifosato o un gen de pat o bar que confiere tolerancia a herbicidas del tipo de glufosinato), o cuando la planta transgénica es resistente de modo natural a otro herbicida (tal como una tolerancia a sulfonilureas), el procedimiento de acuerdo con la invención puede comprender la aplicación simultánea o escalonada cronológicamente de un agente inhibidor de las HPPD en combinación con dicho herbicida o combinación de herbicidas, por ejemplo herbicidas de los tipos de glifosato y/o glufosinato y/o sulfonilurea.

La invención se refiere también al uso del gen quimérico que codifica la HPPD de la invención como un gen marcador durante la transformación de una especie de planta, basándose en la selección de los anteriormente mencionados herbicidas inhibidores de las HPPD.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para obtener una planta resistente a un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas o pirazolinatos, caracterizado porque la planta es transformada con un gen quimérico que expresa en la planta una HPPD de la invención tal como se ha definido en el presente documento.

En una realización particular, la invención se refiere a dicho procedimiento para obtener una planta resistente a un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas o pirazolinatos, caracterizado porque la HPPD de la invención comprende la SEQ ID NO. 4 (desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387), o un ADN sintético que codifica la HPPD de la invención adaptada al trato con codones de maíz, arroz, trigo, especies de soja, caña de azúcar, cebolla, plantas de la especie Brassica, o algodón.

En otra realización particular, la invención se refiere a dicho procedimiento para obtener una planta resistente a un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas seleccionado de tembotriona, mesotriona, dicetonitrilo, isoxaflutol, sulcotriona, tefuriltriona y biciclopirona.

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En otra realización particular, la invención se refiere a dicho procedimiento para obtener una planta resistente a un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas o de pirazolinatos, caracterizado porque la planta también comprende un gen quimérico expresable en plantas que codifica una enzima PDH (prefenato deshidrogenasa), o una enzima con al menos PDH.

La divulgación se refiere también a un procedimiento para reprimir malezas en una zona o un campo, cuyo procedimiento comprende plantar en esta zona o campo unas plantas transformadas resistentes a un agente inhibidor de las HPPd del tipo de tricetonas o de pirazolinatos, que se han obtenido de acuerdo con el procedimiento que se ha descrito más arriba, o unas semillas transformadas que se originan a partir de ellas, y aplicar una dosis, que es tóxica para las malezas de dicho agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas o de pirazolinatos sin afectar de manera significativa a dichas semillas transformadas ni a dichas plantas transformadas.

La divulgación se refiere también a un procedimiento para obtener un aceite o una harina, que comprende hacer crecer una planta transformada resistente a un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas o de pirazolinatos, que se ha obtenido de acuerdo con el procedimiento antes descrito, o una semilla transformada que se origina a partir de dicha planta, tratar opcionalmente dicha planta o semilla con un agente inhibidor de las HPPd del tipo de pirazolinatos, cosechar los granos y moler los granos para producir una harina y extraer el aceite.

La invención se refiere también al uso de una HPPD de la invención tal como se ha descrito anteriormente, caracterizado porque el agente inhibidor de las HPPD es un agente inhibidor de las HPPD del tipo de tricetonas, seleccionado de tembotriona, mesotriona, topramezona, biciclopirona, tefuriltriona y sulcotriona.

La presente invención se refiere también a un organismo hospedador, en particular a células de plantas o a plantas, que contienen un gen quimérico que comprende una secuencia que codifica una HPPD de acuerdo con la invención, y que también contiene un gen que es funcional en este organismo hospedador permitiendo la sobreexpresión de una enzima prefenato deshidrogenasa (abreviada en el presente documento como PDH).

La expresión “enzima PDH” tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier enzima de PDH natural o mutada que exhiba la actividad de la PDH, de conversión del prefenato en HPP. En particular, dicha enzima de PDH se puede originar a partir de cualquier tipo de organismo. Una enzima con actividad de PDH puede ser identificada por cualquier procedimiento que haga posible o bien medir la disminución en la cantidad del substrato prefenato, o medir la acumulación de un producto derivado de la reacción enzimática, es decir HPP o uno de los cofactores NADH o NADPH.

Muchos genes que codifican enzimas PDH se describen en la bibliografía y sus secuencias se pueden identificar en el sitio web
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/. Particularmente conocido es el gen que codifica la enzima PDH de la levadura Saccharomyces cerevisiae (N° de Acceso S46037) tal como se describe en la cita de Mannhaupt y col. (1989) Gene 85, 303-311, de una bacteria del género Bacillus, en particular de la especie B. subtilis (N° de Acceso P20692) tal como se describe en la cita de Henner y col. (1986) Gene 49 (1) 147-152, de una bacteria del género Escherichia, en particular de la especie E. coli (N° de Acceso KMECTD) tal como se describe en la cita de Hudson y col. (1984) J. Mol. Biol. 180(4), 1023-1051, o de una bacteria del género Erwinia, en particular de la especie E. herbicola (N° de Acceso S29934) tal como se describe en la cita de Xia y col. (1992) J. Gen. Microbiol. 138(7), 13091316.

La invención se refiere además a un procedimiento para obtener un organismo hospedador, particularmente una célula de planta o una planta, que es resistente a un agente inhibidor de la HPPd, por integración en dicho organismo de al menos una secuencia de ácido nucleico o un gen quimérico tal como se ha definido previamente, y por transformación ulterior de ella, de manera simultánea o sucesiva, con un gen que es funcional en este organismo hospedador permitiendo la expresión de una enzima PDH (prefenato deshidrogenasa). En una realización particular, la invención se refiere a un procedimiento para obtener un organismo hospedador, particularmente una célula de planta o una planta, que es resistente a un agente inhibidor de la HPPD del tipo de tricetonas o pirazolinatos, particularmente tembotriona, mesotriona topramezona, biciclopirona, tefuriltriona o sulcotriona.

Los medios y procedimientos que se podrían usar para obtener un organismo hospedador, particularmente una célula de planta o una planta, transformado tanto con un gen que permite una sobreexpresión de una enzima HPPD, y con un gen que permite una sobreexpresión de una enzima PDH, se describen extensamente en el documento WO 04/024928. La referencia hecha en esta memoria descriptiva a cualquier publicación anterior (o información derivada de ella) o a cualquier materia que sea conocida, no se toma, ni se deberá tomar, como un reconocimiento o una admisión o cualquier forma de sugerencia de que dicha publicación anterior (o anterior) o materia conocida forma parte del conocimiento general común en el campo de la presente invención.

Figuras

FIGURA 1 Mapa del plásmido pSE420::FMP27e

FIGURA 2 Mapa del ADN-T introducido dentro de las plantas de tabaco

FIGURA 3 Mapa del ADN-T introducido en las diferentes plantas de acuerdo con los Ejemplos 5 a 13. Las abreviaturas que tienen los siguientes significados A, B, C y G, plantas de tabaco, D, E, y F, plantas de Zea mays, H. Plantas de soja, I. Plantas de arroz y J, plantas de algodón. 35S: promotor

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de CaMV35S, KanR: gen que confiere resistencia al antibiótico kanamicina, nos: promotor de nopalina sintasa, Ter: terminador, H6: secuencia que codifica una marca de His, OTP: péptido de tránsito optimizado, genes de BAR (resistentes a bialafos documento WO 8705629) y de PAT (fosfinotricina N-acetiltransferasa, documento EP 257542): que confieren tolerancia a bialafos, fosfinotricina o glufosinato, 2mEPSPS: gen que codifica la EPSPS (5-enolpiruvilshikimato sintasa) doble mutante (Thr102Ile y Pro106Ser) procedente de Zea mays (documento US 20030027312), 2mAHAS: gen que codifica la ALS (acetolactato sintasa) doble mutante procedente de Arabidopsis (Pro197Ala y Trp574Leu); documento US 5378824, HA: promotor de histona procedente del gen de Arabidopsis, TEV: virus de corrosión del tabaco, FMP27e: gen que codifica una FMP27 optimizada para la expresión en E coli con una secuencia que codifica una etiqueta His junto a su extremidad 5', FMP27t: gen que codifica una FMP27 optimizada para la expresión en plantas dicotiledóneas con una secuencia que codifica una etiqueta His junto a su extremidad 5', FMP27t- h, un gen que codifica una FMP27 optimizada para la expresión en plantas dicotiledóneas, FMP27m, un gen que codifica una FMP27 optimizada para la expresión en plantas de Zea mays, LB, borde izquierdo, RB, borde derecho.

LISTADO DE SECUENCIAS

SEQ

ID NO. 1:

SEQ

ID NO. 2:

SEQ

ID NO. 3:

SEQ

ID NO. 4:

SEQ

ID NO. 5:

SEQ

ID NO. 6:

SEQ

ID NO. 7:

SEQ

ID NO. 8:

SEQ

ID NO. 9:

SEQ

ID NO. 10:

SEQ

ID NO. 11:

SEQ

ID NO. 12:

SEQ

ID NO. 13:

SEQ

ID NO. 14:

SEQ

ID NO. 15:

SEQ

ID NO. 16:

SEQ

ID NO. 17

SEQ

ID NO. 18

SEQ

ID NO. 19

SEQ

ID NO. 20

SEQ

ID NO. 21

SEQ

ID NO. 22

SEQ

ID NO. 23

Ejemplos

Secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida

Secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para E. coli, que contiene en el extremo 5' un ácido nucleico que codifica un aminoácido alanina y 6 aminoácidos histidina.

Secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para Nicotiana tabaccum, que contiene en el extremo 5' una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito optimizado y una etiqueta His.

Secuencia de aminoácidos de la HPPD de Kordia algicida derivada de la SEQ ID NO. 1 Proteína codificada por la SEQ ID NO. 2

Secuencia de aminoácidos de la HPPD de Kordia algicida (SEQ ID NO. 4) fusionada con un OTP (péptido de tránsito optimizado (documento WO 2009/144079))

Proteína codificada por la SEQ ID NO. 3

Secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD de Arabidopsis thaliana Secuencia de aminoácidos de la HPPD de Arabidopsis thaliana

Proteína codificada por la SEQ ID NO. 8 más una adicional alanina directamente corriente abajo del inicial aminoácido metionina seguido de 6 aminoácidos histidina

Proteína de la SEQ ID NO. 9 más la secuencia de OTP situada junto al extremo N-terminal de la proteína

Proteína de la SEQ ID NO. 10 más la secuencia de OTP directamente situada junto al extremo N-

terminal de la proteína

Secuencia de cebador de Xho-OTP-for

Secuencia de cebador de NcoI-OTP-rev

Secuencia de ácido nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas dicotiledóneas

Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Zea mays Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Brassica napus Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Beta vulgaris Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Gossypium hirsutum Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Glycine max Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Hordeum vulgare Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Oryza sativa Secuencia de ácido

nucleico que codifica la HPPD de Kordia algicida optimizada para plantas de

Triticum aestivum

Los diversos aspectos de la invención serán comprendidos mejor con la ayuda de los ejemplos experimentales que siguen. Todos los procedimientos o todas las operaciones que se describen a continuación en estos ejemplos se dan por vía de ejemplo y corresponden a una elección que se hace entre los diferentes procedimientos que están disponibles para llegar al mismo resultado o a uno similar. Esta elección no tiene ningún efecto sobre la calidad del resultado y, como consecuencia, se puede usar cualquier procedimiento apropiado por la persona experta para llegar al mismo resultado o a uno similar. La mayoría de los procedimientos para manipular fragmentos de ADN se

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describen en la obra "Current Protocols en Molecular Biology" Volúmenes 1 y 2, Ausubel F.M. y col., publicado por Greene Publishing Associates y Wiley Interscience (1989) o en la obra Molecular cloning, T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook, 1982, o en Sambrook J. y Russell D., 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Tercera edición)

Ejemplo 1

Preparación de la HPPD de Kordia algicida (que se denomina FMP27e) de la SEQ ID NO. 5 y de la HPPD de Arabidopsis thaliana identificada por la SEQ ID No. 10.

La secuencia codificante de la HPPD de Arabidopsis thaliana AtHPPD (de 1335 pb (pares de bases); Genebank AF047834; documento WO 96/38567) fue clonada inicialmente dentro del vector de expresión pQE-30 (QIAGEN, Hilden, Alemania) entre los sitios de restricción de BamHI y HindIII. El vector obtenido fue denominado “pQE30- AtHPPD”.

La secuencia original de la HPPD de Kordia algicida (de 1164 pb) que codifica la proteína listada bajo el número de acceso A9DQF2 en UniProtKB/TrEMBL se modificó y sintetizó usando un optimizado trato con codones de Escherichia coli K12 (operón Eurofins MWG (Ebersberg, Alemania), software (programa lógico) de GENEius) y se clonó en un vector pBluescript modificado (operón Eurofins MWG operon, Ebersberg, Alemania). En este vector, la secuencia correspondiente al MCS (acrónimo de multiple cloning site = sitio de clonación múltiple) fue eliminada parcialmente de manera tal que quedaron solamente las secuencias correspondientes a los sitios de reconocimiento por la enzima de restricción HindIII a ambos lados del inserto.

En el extremo 5', directamente corriente abajo del ATG se introdujo una secuencia de ácido nucleico que codifica un aminoácido alanina y una secuencia de ácido nucleico que codifica una etiqueta His6 N-terminal (6x HIS, codificada por: cac cat cat cac cat cat). Corriente arriba del ATG, se añadieron dos adicionales pares de bases de citosina con el fin de obtener una secuencia correspondiente al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NcoI y corriente abajo con respecto al codón de detención se añadieron las secuencias correspondientes al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XbaI. El resultante vector “pBluescript-FMP27e” fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XbaI, la banda que no migraba en la longitud del tamaño del vector de aproximadamente 3.000 pb correspondiente al ADN fue separada sobre un gel de agarosa por electroforesis. Luego, el ADN que codifica la HPPD fue purificado usando el Kit de Extracción con Gel MinEluteTM (Qiagen, Hilden, Alemania) y clonado dentro del vector pSE420(RI)NX (véase más adelante) previamente cortado con las mismas enzimas de restricción.

El vector de clonación y expresión pSE420(RI)NX (5261 pb) está basado en el plásmido pSE420 producido por Invitrogen (Karlsruhe, Alemania). Las modificaciones de este vector incluyen la adición de un gen de nptII (neomicina fosfotransferasa; Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning: a laboratory manual (Tercera edición)) que confiere tolerancia al antibiótico kanamicina y al que le falta la mayoría de la súper-región de conector (sitio de clonación múltiple).

El plásmido posee el promotor trp-lac (trc) y el gen lacIq que proporciona el represor lac en cualquier cepa hospedadora de E. coli. El represor lac se une al operador lac (lacO) y restringe la expresión del gen diana; esta inhibición puede ser aliviada por inducción con isopropil p-D-1-tiogalactopiranosido (IPTG).

El resultante vector fue denominado “pSE420(RI)NX-FMP27e” (véase la Figura 1) y se usó para transformar células de Escherichia coli BL21 (Merck, Darmstadt, Alemania). Para la AtHPPD (HPPD de Arabidopsis thaliana) que se usó como referencia, véase el documento WO 2009/144079.

La expresión de HPPD se llevó a cabo en E. coli K-12 BL21 que contiene pQE30-AtHPPD o pSE420(RI)NX- FMP27e. Las células se dejaron crecer hasta que la DO (densidad óptica) llegó a 0,5, luego se inició la expresión desde el promotor trp-lac (trc) por inducción con 1 mM de IPTG que se une al represor lac y causa su disociación desde el operón lac. La expresión se llevó a cabo durante 15 h a 28 °C.

Para preparar el cultivo pre-iniciador, 2 ml del medio TB (100 pg*ml'1 de carbenicilina) se inocularon con 50 pl de una carga original de E. coli K-12 BL21 en glicerol. El cultivo pre-iniciador se incubó a 37 °C con agitación a 140 rpm (revoluciones por minuto) durante 15 h. 200 pl del cultivo pre-iniciador se usaron para iniciar al cultivo iniciador (5 ml de suplemento TB con 100 pg*l-1), que se incubó durante 3 h a 37°C.

Para preparar el cultivo principal, 400 ml del medio TB (100 pg*ml-1 de carbenicilina) se inocularon con 4 ml del cultivo iniciador. Este cultivo iniciador se incubó a 37 °C con agitación a 140 rpm hasta que se alcanzó una OD600 de 0,5. Luego se indujo la expresión de la proteína recombinante con 400 pl de una solución 1 M de IPTG. Las células se dejaron crecer durante una hora adicional en estas condiciones, luego la temperatura se disminuyó a 28°C y el cultivo se agitó a 140 rpm durante 15 h. Las células se cosecharon por centrifugación a 6.000 x g durante 15 min at 4 °C. Luego los sedimentos de células se almacenaron a -80 °C.

Aislamiento y purificación de His6-AtHPPD y His6-FMP27e en forma nativa Lisis de células

Las células fueron lisadas usando lisozima, una enzima que disocia los enlaces 1,4-p entre restos de ácido N- acetilmurámico y de N-acetil-D-glucosamina en un péptidoglicano que forma la pared celular de las bacterias. Las membranas celulares fueron luego rotas por la presión interna de la célula de bacteria. Además, el tampón de lisis contenía la Nucleasa Benzonase®, que es una endonucleasa que hidroliza a todas las formas de ADN y ARN sin

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dañar a las proteínas y de esta manera reduce ampliamente la viscosidad del material lisado celular. La lisis en condiciones naturales se llevó a cabo sobre hielo.

Para la purificación de proteínas marcadas con His6 se usó el Kit de Iniciación Rápida QIAexpress® Ni-NTA Fast Start, siguiendo las instrucciones del manual de los usuarios.

Purificación de proteínas marcadas con His6 por cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC)

El material lisado de células (10 ml), obtenido después de centrifugación de la masa de reacción de lisis se cargó sobre una Columna de Iniciación Rápida Ni-NTA Fast Start Column procedente del Kit QIAexpress® Ni-NTA Fast Start Kit (Qiagen, Hilden, Alemania) y la purificación se llevó a cabo de acuerdo con el manual de instrucciones. La proteína marcada con His6 fue eluída con 2,5 ml del tampón de elución.

Desalinización de las soluciones de HPPD mediante filtración en gel

Unas soluciones de HPPD, eluídas a partir de una Columna de Iniciación Rápida Ni-NTA Fast Start con 2,5 ml de un tampón de elución, fueron aplicadas a una columna Sephadex G-25 PD-10 column (GE Healthcare, Freiburg, Alemania) siguiendo las instrucciones del manual de los usuarios. Después de que la totalidad de la muestra hubo entrado en el lecho de gel, se realizó una elución con 3,5 ml de un tampón de almacenamiento.

Las soluciones de HPPD, eluídas a partir de la columna de desalinización, fueron congeladas a -80 °C en alícuotas de 1 ml.

Determinación de la concentración de la proteína de HPPD usando el ensayo de proteínas de Bradford La concentración de la proteína fue determinada usando el ensayo de Bradford normalizado (Bradford, (1976), Anal Biochem 72: 248-254).

Determinación de la pureza de las soluciones de HPPD usando una SDS-PAGE

La integridad de la proteína eluída se comprobó mediante una electroforesis en gel de proteína SDS-PAGE usando el gel NuPAGE® Novex 4-12 % Bis-Tris Gels (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), se cargaron aproximadamente 10 pg de proteína. 10 pl del Tampón de Muestra de Laemmli se añadieron a 1-10 pl de una solución de proteína y la mezcla se incubó a 90 °C durante 10 min. Después de una corta operación de centrifugación, toda la mezcla fue cargada dentro de una rendija de un gel de SDS previamente fijado en una cámara de gel XCell SureLock™ Novex Mini-Cell rellena con un Tampón de Elución NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer (diluido a partir de la solución 20 x con ddH2O). Luego se aplicó un voltaje de 150 V a la cámara de gel durante 1 h. Para la tinción de bandas de proteínas, el gel fue sumergido en una Solución de Tinción Coomassie Brilliant Blue R-250. Para desteñir al gel de polI(acrilamida), éste fue sumergido en una Solución de Destinción Coomassie Brilliant Blue R-250 hasta que las bandas de la proteína aparecieron de color azul sobre un gel de color blanco.

Ejemplo 2

Caracterización cinética y evaluación de la tolerancia a agentes inhibidores de las HPPD de las enzimas HPDD “SEQ ID NO. 5” y “SEQ ID NO. 10”.

La actividad de las HPPD fue comprobada por el ensayo espectrofotométrico clásico (procedimiento descrito extensamente en el documento WO 2009/144079).

Determinación de las propiedades cinéticas in vitro de las HPPD

Los valores de Km, Vmax y kcat para diferentes preparaciones de enzimas HPPD y los valores de Ki, K-i=Kon, y K-1=Koff para diferentes agentes inhibidores de las hPpD fueron determinados usando un ensayo de HPLC (cromatografía de fase líquida de alto rendimiento) para mediciones de la actividad de las HPPD. Las mezclas de ensayo contenían, en un volumen de 1 ml, 150 mM de un tampón de Tris-HCl a un pH de 7,8, 10 mM de ascorbato de sodio, 650 unidades de catalasa bovina (Sigma C30 (Sigma-Aldrich, Múnich, Alemania), 34 mg de proteína/ml, 23.000 unidades/mg), y apropiadas cantidades del HPP, de la enzima HPPD purificada y de los agentes inhibidores de las HPPD. Para la determinación de los valores de Km, Vmax y kcat las concentraciones de HPP en la mezcla de ensayo se hicieron variar entre 10 y 400 pM. Para la determinación de los valores de Ki, K-i=Kon, y K-1=Koff se usaron 2 mM de HPP. Todos los ensayos se comenzaron mediante la adición de una enzima HPPD a la mezcla de ensayo y se detuvieron en una serie de momentos entre 0 y 240 s (segundos) por adición de 200 pl de la mezcla de reacción a unos tubos de ensayo para reacción, que contenían 20 pl de ácido perclórico al 10 %. La proteína precipitada se sedimentó mediante una centrifugación durante 5 minutos a 10.000 xg. 100 pl del material sobrenadante se cargaron sobre una columna de Knauer (Berlín, Alemania) Eurospher 100-5 C18 de 250 x 4mm, equilibrada con 10 % de metanol y 0,1 % de ácido trifluoroacético (tampón A). La columna fue eluída, también a razón de 1,5 ml/min, usando un lavado durante 4 minutos con el tampón A, seguido por un lavado durante 3 minutos con metanol al 95 % y por un lavado durante 2 minutos adicionales con el tampón A. La elución del HGA (ácido homogentísico) y del HPP (hidroxifenilpiruvato) se vigiló a 292 nm. El HGA se eluye en aproximadamente 5 minutos y el HPP se eluye más tarde. Un conjunto patrón de concentraciones de HGA se usaron para proporcionar una curva patrón con el fin de calibrar la absorbencia a 292 nm del pico de HGA en función de la concentración de HGA.

Para las determinaciones de los valores de Km y Vmax, las velocidades iniciales de la reacción de HPPD en diferentes concentraciones del substrato se determinaron a partir de representaciones gráficas del HGA formado en función del

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tiempo y se acoplaron con la ecuación de Michaelis-Menten para enzimas unirreactivas usando la sucesión de programas lógicos ID Business Solutions Ltd. (
www.idbs.com) XLfit software suite. Para la determinación de los valores de Ki, K-i=Kon, y K_1=Koff los cursos de tiempo de la reacción de HPPD con diferentes concentraciones de los inhibidores fueron acoplados con las ecuaciones para el Mecanismo A, inhibición competitiva, para inhibidores de fijación apretada (Cha, S. (1975) Tight-binding inhibitors - I. Kinetic behaviour [inhibidores de fijación apretada - I. Comportamiento cinético]. Biochemical Pharmacology 24, 2177-2185) usando la sucesión de programas lógicos ID Business Solutions Ltd. XLfit software suite

Tabla 1

Caracterización cinética de las enzimas HPPD (de Arabidopsis thaliana “SEQ ID NO. 10” y de Kordia algicida “SEQ ID NO. 5”) y su respectiva tolerancia a los agentes inhibidores de las HPPD tembotriona y dicetonitrilo. En la Tabla 1 dada a continuación, “Km” (la constante de Michaelis-Menten) significa el parámetro cinético que se usa para caracterizar a una enzima, y es definida como la concentración del substrato que permite una velocidad semimáxima de la reacción. La Km es definida adicionalmente como la concentración del substrato con la que la velocidad de reacción alcanza la mitad de su valor máximo (Vmax/2) en que Vmax tiene el significado de ser la velocidad máxima de la reacción. Kon=K1 es igual a la constante de velocidad de asociación de la fijación entre la enzima y el substrato y Koff=K-1 es igual a la constante de velocidad de la disociación del complejo de enzima e inhibidor. Ki define a la constante de inhibición

HPP Tembotriona Dicetonitrilo

Km Vmax (pM) (pM) (/) -k i* (/> -k i*

SEQ ID NO. 10

6,3 1,2 2,3E+05 3,5E-03 0.015 6,1E+05 1,1E-02 0.018

SEQ ID NO. 5

292 13,6 4,9E+02 1,6E-02 33 1,1E+03 1,7E-02 15

En la anterior Tabla 1, puede verse con claridad que mientras que los parámetros cinéticos Km y Vmax de la HPPD de bacteria “SEQ ID NO. 5” y de la HPPD de planta “SEQ ID NO. 10” ya mostraron diferencias significativas (6,3 pM frente a 292 pM) que son incluso mayores en lo concerniente al nivel de tolerancia a tembotriona (0,015 pM frente a 33 pM) y a dicetonitrilo (0,018 pM frente a 15 pM). La HPPD de bacteria “SEQ ID NO. 5” era muchísimo más tolerante a los agentes inhibidores de las HPPD ensayados que la HPPD de planta “SEQ ID NO. 10”.

Determinación de la actividad de las HPPD en presencia de diversos agentes inhibidores de las HPPD

En este contenido, el valor de pI50 significa el valor del logaritmo de la concentración del agente inhibidor que es necesaria para inhibir el 50 % de la actividad de una enzima en concentración molar.

Los valores de pI50 para los agentes inhibidores de las HPPD se determinaron a partir de representaciones gráficas de dosis y respuesta de la actividad de una HPPD en función de la concentración del agente inhibidor, usando el ensayo descrito extensamente en el documento WO 2009/144079 en una concentración de HPP fijada en 2 mM y un período de tiempo de incubación fijado de 3 minutos usando la sucesión ID Business Solutions Ltd. XLfit software suite.

Tabla 2: Determinación del pI50 de enzimas HPPD (de Arabidopsis thaliana “SEQ ID NO. 10” y de Kordia algicida “SEQ ID NO. 5”) y sus respectivas tolerancias a los diversos agentes inhibidores de la HPPD enumerados a continuación: tembotriona, dicetonitrilo, mesotriona, biciclopirona, pirasulfotol, sulcotriona, pirazolato, tefuriltriona y benzofenap. El símbolo “>>” significa que el valor era muchísimo más alto que el indicado pero no podría ser calculado con exactitud dentro del intervalo de concentraciones del agente inhibidor ensayado (2,5x10'6, 5,0x10'6,

1,0x10-5, 2,5x10-5, 6,3x10-5, 2,5x10'4M).

SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 5

SEQ ID NO. 10 SEQ ID NO. 5

Tembotriona

Dicetonitrilo Mesotriona Biciclopirona

>>5,6

>>5,6

>>5,6

5,2

5,6

5,7 >>5,6 5,0

Pirasulfotol

Sulcotriona Pirazolato Tefuriltriona Benzofenap

5,4

>>5,6 5,4 >>5,6 >>5,6

4,9

>5,6 >5,6 5,8 >5,6

Tabla 3: Determinación del porcentaje de inhibición en presencia de 5,0x10-6 M de agentes inhibidores comparado con la actividad medida en ausencia del agente inhibidor para la HPPD originada a partir de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO. 10) y a partir de Kordia algicida (SEQ ID NO. 5).

Tembotriona Dicetonitrilo Mesotriona Biciclopirona

SEQ ID NO. 10

92 87 86 29

SEQ ID NO. 5

81 80 85 38

Pirasulfotol Sulcotriona Pirazolato Tefuriltriona Benzofenap

SEQ ID NO. 10

69 74 61 100 90

SEQ ID NO. 5

43 85 89 73 97

En las anteriores Tablas 2 y 3, puede verse con claridad, que la HPPD bacteriana “SEQ ID NO. 5” mostró un 5 superior nivel de tolerancia a todos los agentes inhibidores de las HPPD ensayados que la planta en todas las concentraciones de agentes inhibidores de las HPPD que el que se observó empleando la HPPD “SEQ ID NO. 10” en idénticas condiciones experimentales.

Ejemplo 3: Construcción de genes quiméricos para la evaluación de la tolerancia a herbicidas inhibidores de las HPPD en plantas de tabaco.

10 A) Construcción de los genes quiméricos

El vector pRP-RD224 (que se describe extensamente en el documento WO 2009/144079) que contiene la secuencia que codifica el OTP se usó para la fijación mediada por PCR corriente arriba de la secuencia de ácido nucleico correspondiente al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XhoI y corriente abajo de la secuencia de ácido nucleico correspondiente al sitio de reconocimiento de la enzima de restricción NcoI. El obtenido producto de 15 la PCR fue clonado en el vector pCR®-Blunt II-TOPO® (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) siguiendo las instrucciones del manual de los usuarios. El resultante vector fue denominado “pCR-TOPO-OTP”. La inserción de la correcta secuencia fue confirmada por una clásica secuenciación de ADN. El ADN correspondiente al OTP fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, separado por apropiadas electroforesis en gel y clonado previamente dentro del plásmido pRT100 (Toepfer, (1987), Nucleic Acid Res 15:5890) y correspondientemente digerido con las enzimas 20 de restricción Nco I y XhoI. El plásmido pRT100 contiene el promotor de CaMV35S y el terminador de CaMV35S. El resultante vector fue subsiguientemente digerido con las enzimas de restricción NcoI y XbaI. El vector pSE420(RI)NX-FMP27e (véase la Figura 1) fue sometido a las enzimas de restricción NcoI y XbaI con el fin de obtener el fragmento de ADN correspondiente a la “SEQ ID NO. 2”. El resultante vector fue digerido por empleo de la enzima de restricción HindIII para subclonar la casete CaMV35S::OTP::FMP27e::CaMV35-term (véase la Figura 2) 25 dentro del vector binario pBin19 (Bevan (1984), Nucleic Acid Res. 12:8711-8721.) previamente digerido con la misma enzima y desfosforilado. El resultante vector fue denominado “FMP27ebv”.

Los vectores pQE-30-AtHPPD se usaron para la fijación mediada por PCR de un sitio de restricción de NcoI y de una secuencia que codifica una etiqueta His6 N-terminal para los extremos 5' y un sitio de restricción de XbaI para los extremos 3' de AtHPPD.

30 El producto de la PCR del gen de AtHPPD fue aislado a partir de un gel de agarosa, cortado con las enzimas de restricción NcoI y XbaI, purificado con el Kit de Purificación por PCR MinElute™ (Qiagen, Hilden, Alemania) y clonado dentro del mismo vector pSE420(RI)NX cortado con las mismas enzimas de restricción.

El vector generado fue denominado “pSE420(RI)NX-AtHPPD” y fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XbaI y clonado dentro del vector previamente abierto pRT100 (Toepfer y col., (1987), Nucleic Acid Res 15:5890) que 35 contiene el promotor de CaMV35S y el terminador de CaMV35S. El vector generado fue denominado “pRT100- AtHPPD”.

El vector pCR-TOPO-OTP fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI, y la banda de ADN correspondiente al OTP fue clonada dentro del vector previamente abierto pRT100-AtHPPD con las enzimas de restricción antes mencionadas. El resultante vector fue subsiguientemente digerido con la enzima de restricción 40 HindIII y la casete de expresión de interés fue clonada dentro del vector binario pBin19 previamente abierto y desfosforilado. El resultante vector fue denominado “AtHPPDbv”.

Los vectores binarios FMP27ebv y AtHPPDbv se usaron para transformar células competentes de Agrobacterium tumefaciens (ATHV derivadas de EHA101) seleccionadas sobre medios YEB suplementados con los antibióticos kanamicina y rifampicina (que se describen extensamente en la solicitud de patente US005925808A).

45 Estas cepas de Agrobacterium que contienen los vectores binarios de interés (FMP27ebv o AtHPPDbv) se usaron para transformar discos de hojas procedentes de plantas de tabaco Nicotiana tabacum L. cv Samsun NN, que tienen aproximadamente un tamaño de 5x5 mm2, tal como se describen extensamente en la cita de Horsch y col., (1985), Science 227; 1229-1231.

Los discos de hojas fueron cultivados conjuntamente durante 2 días con células de Agrobacterium tumefaciens que contienen o bien el vector binario FMP27ebv o el AtHPPDbv. Luego los discos de hojas fueron transferidos a un medio que permitía la regeneración de vástagos durante 6 semanas en un medio Ms (de Murashige y Skoog, (1962), Physiol Plant 15(3): 473-497) suplementado con BAP (1 mg/ml; bencilaminopurina), carbenicilina 5 (250 mg/ml), cefotaxina (250 mg/ml), kanamicina (75 mg/ml) y tembotriona (10"6 M)

Los callos regenerados fueron transferidos a un medio con el fin de inducir el desarrollo de raíces durante 6 a 12 semanas: MS (1/2), suplementado con carbenicilina (250 mg/ml), cefotaxina (250 mg/ml), kanamicina (75 mg/ml), y tembotriona (10"6M). Después de 6 semanas en este medio, los vástagos transformados con células de Agrobacterium tumefaciens que contienen el vector binario AtHPPDbv, fueron transferidos al mismo medio agotado 10 con el agente inhibidor de las HPPD tembotriona.

Los resultados se resumen en la Tabla 5 siguiente.

Durante todo el experimento, las placas que contenían los discos de hoja se colocaron dentro de una cámara de crecimiento en condiciones controladas (luz durante 16 h, noche durante 8 h, 25 °C).

Enraizamiento de callos

15 Los callos de vástagos regenerados a partir de una célula transformada con una secuencia de ácido nucleico que codifica una HPPD que comprende la SEQ ID NO. 11 (Arabidopsis thaliana) o la SEQ ID NO. 7 (Kordia algicida) fueron transferidos a un medio que inducía el crecimiento de las raíces, cuyo medio fue suplementado adicionalmente con el agente inhibidor de la HPPD tembotriona durante 6 a 12 semanas. En ninguno de los sucesos que contenían la HPPD definida por la SEQ ID NO. 11 (Arabidopsis thaliana) o no contenían callos transformados, 20 se observó un crecimiento de raíces en las condiciones antes dadas. Al contrario de esto, en las condiciones idénticas, los callos que contenían la HPPD definida por la por la SEQ ID NO. 7 desarrollaron manifiestamente raíces numerosas y sanas (véase la Tabla 4, a continuación).

Tabla 4

Callos que contienen:

Sucesos seleccionados para análisis molecular % de elongación & enraizamiento en 10"6 M de tembotriona Números de sucesos enraizados en medios sin tembotriona

SEQ ID NO. 11

21 0 5

SEQ ID NO. 7

34 62 21

Regeneración de discos de hojas

25 Se cortaron discos de hojas a partir de plantas que contienen las HPPD con SEQ ID NO. 11 (Arabidopsis thaliana) o SEQ ID NO. 7 (Kordia algicida), seguido por una regeneración durante 6 semanas en condiciones clásicas de cultivo en un medio MS suplementado con BAP (1 mg/ml; bencilaminopurina), carbenicilina (250 mg/ml), cefotaxina (250 mg/ml) y que comprende además uno de los agentes inhibidores de las HPPD a continuación enumerados en las concentraciones mencionadas (tembotriona (10"°M), dicetonitrilo (510-6 M), mesotriona (10-6 M) y biciclopirona 30 (10-6 M)), con un medio que no contiene ningún agente inhibidor de las HPPD como el testigo positivo. Al final de los

experimentos se evaluó el nivel de regeneración como sigue:

“-“ significa que los discos de hojas tenían el mismo aspecto que un disco de hoja procedente de tipo silvestre plantas de tabaco en un medio suplementado con los inhibidores anteriormente mencionados.

“++++” significa que los discos de hojas tenían un aspecto similar al de los discos de hojas procedentes de las 35 plantas de tabaco de tipo silvestre en un medio sin inhibidor.

“+”, “++”, y “+++” indican que los discos de hojas regenerados fueron afectados grandemente (+), medianamente (++) y poco (+++) por la presencia de los inhibidores.

Los resultados de los experimentos se resumen en la Tabla 5.

Tabla 5: Efectos de diversos agentes inhibidores de las HPPD sobre la regeneración de un disco de hoja que se 40 origina a partir de plantas transgénicas que comprenden un gen que codifica una HPPD obtenida o bien a partir de

Arabidopsis (SEQ ID NO. 11) o a partir de Kordia algicida SEQ ID NO. 7.

Discos de hojas que contienen

Testigo Tembotriona Dicetonitrilo Mesotriona Biciclopirona

SEQ ID NO. 11

+ + + + - - - -

SEQ ID No. 7

+ + + + + + + + +

Mientras que en el caso de plantas que contienen la HPPD definida por SEQ ID NO. 7 (Kordia algicida) éstas muestran una regeneración igual o solo ligeramente reducida en comparación con este testigo sin tratar, las correspondientes plantas que contienen la HPPD definida por SEQ ID NO. 11 (Arabidopsis thaliana) no muestran 45 ninguna regeneración sino que desarrollan un fenotipo de blanqueo claramente visible en comparación con el testigo

5

10

15

20

25

30

35

sin tratar en la presencia de todos los agentes inhibidores de HPPD ensayados.

Ejemplo 4: Pruebas en invernadero para evaluar la tolerancia a herbicidas inhibidores de las HPPD de plantas del tabaco transgénicas que expresan un gen que codifica una proteína de HPPD tolerante

Preparación de linajes de plantas transgénicas que expresan enzimas HPPD o bien de Arabidopsis o de FMP27. Ensayo en invernadero en cuanto a tolerancia a herbicidas.

Respuesta a tembotriona, isoxaflutol y biciclopirona

Unas plantas de tabaco T0 que contenían o bien el gen procedente de Arabidopsis que codifica una HPPD o el gen FMP27e procedente de Kordia algicida que codifica una HPPD de FMP27, antes mencionados (Ejemplo 3), fueron transferidas al invernadero (28/20°C), para desarrollarse más y producir semillas. Estas semillas fueron cosechadas y colocadas sobre tierra (ED73 mezclada con arena y osmocote Pro) para germinar en el invernadero (28/20°C). Tres a cuatro semanas más tarde, unas plántulas fueron transferidas a macetas individuales que contenían la tierra antes mencionada. Dos semanas más tarde, unas plantas de un tamaño de 4-6 cm de diámetro fueron rociadas bien con

- tembotriona a razón de 100 g de IA/ha preparada a partir de una formulación WP20 (polvo humectable al 20 %) suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza, o

- isoxaflutol a razón de 100 g de IA/ha preparado a partir de una formulación WP20 suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza, o

- biciclopirona a razón de 100 g de IA/ha preparada a partir de una formulación WP20 suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza, o

- “formulación a ciegas” preparada a partir de una formulación WP20 sin ingrediente activo (IA) suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza, y fueron transferidas a continuación a una cámara de crecimiento con adecuadas condiciones de luz (20.000 Lux).

Siete días después de la aplicación (DAT acrónimo de Days After The application) los síntomas en plantas transformadas fueron evaluados en comparación con la respuesta observada en las plantas de tabaco de tipo silvestre rociadas al mismo tiempo y en las mismas condiciones que las plantas de tabaco que contenían los transgenes (100 % significa que las plantas presentaron el mismo fenotipo de blanqueo que las plantas de tipo silvestre, 0 % significa que las plantas tenían el mismo aspecto que las plantas de tipo silvestre tratadas con la “formulación a ciegas”, y un porcentaje intermedio representa el grado de los síntomas observados).

Tabla 6: Plantas de tabaco de tipo silvestre (A) y poblaciones de sucesos en tabaco que contienen alternativamente, las casetes de expresión que se han descrito más arriba que tienen el promotor de CaMV 35S, la secuencia que codifica un OTP y la secuencia que codifica la HPPD de Arabidopsis (B), o el promotor de CaMV35S, la secuencia que codifica un OTP, y la secuencia FMP27e que codifica la HPPD de FMP27 (C). Las comprobaciones del daño causado por herbicidas a los 7 días después de la aplicación (DAT) por rociada con 100 g de IA/ha de tembotriona o isoxaflutol suplementada/o con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. Es evidente que las plantas que contenían el gen FMP27e fueron muchísimo más tolerantes a tembotriona y isoxaflutol. Las plantas que pertenecen a las categorías (B) y (C) no han sido seleccionadas en cuanto a la presencia del respectivo transgén antes de la aplicación del herbicida.

A

De tipo silvestre

% de daño, 7 DAT, 100 g de IA/ha

Linaje

Tembotriona Isoxaflutol

WT

1 100 100

WT

2 100 100

WT

3 100 100

WT

4 100 98

WT

5 100 99

WT

6 100 99

WT

7 100 100

WT

8 100 n.d.

WT

9 100 n.d.

WT

10 100 n.d.

WT

11 100 n.d.

WT

12 100 n.d.

WT

13 100 n.d.

(continuación)

A

% de daño, 7 DAT, 100 g de IA/ha

De tipo silvestre Linaje

Tembotriona Isoxaflutol

WT |

14 | 100 n.d

B

% de daño, 7 DAT, 100 g de IA/ha

HPPD de Arabidopsis Linaje

Tembotriona Isoxaflutol

258

1 100

258

2 100

258

3 100

258

4 100

258

5 100

258

6 30

252

1 30

252

2 40

252

3 40

252

4 40

252

5 50

252

6 60

252

7 60

252

8 70

252

9 70

252

12 75

252

13 75

252

14 75

252

15 80

327

1 10

327

2 20

327

3 20

327

4 40

327

5 50

327

6 50

327

7 70

327

8 70

327

9 70

327

10 70

327

11 70

327

12 80

327

13 80

327

14 80

327

15 80

100

100

100

100

100

100

30

70

95

98

98

99

99

99

99

100

100

100

100

10

20

60

60

70

80

95

98

99

100

100

100

100

100

100

C

FMP27e

% de daño, 7 DAT, 100 g de lA/ha

Linaje Tembotriona Isoxaflutol

121

1 0 0

121

2 0 0

121

3 0 0

121

4 0 0

121

5 5 1

121

6 5 2

121

7 5 20

121

8 10 n.d.

121

9 10 n.d.

121

10 10 n.d.

121

11 10 n.d.

121

12 10 n.d.

121

13 10 n.d.

129

1 0 0

129

2 0 0

129

3 5 0

129

4 5 0

129

5 10 1

129

6 10 1

129

7 15 1

129

8 15 2

129

9 30 2

129

10 30 2

129

11 n.d. 5

129

12 n.d. 10

129

13 n.d. 10

218

1 0 0

218

2 0 0

218

3 0 0

218

4 0 0

218

5 0 0

218

6 0 0

218

7 0 0

218

8 0 0

218

9 0 0

218

10 0 1

218

11 0 1

218

12 5 1

218

13 5 2

218

14 5 3

218

15 5 5

Respuesta a biciclopirona.

Las semillas de plantas de tabaco de tipo silvestre y plantas de tabaco T1 que eran portadoras del gen FMP27e procedente de Kordia algicida que codifica una HPPD fueron sembradas en un medio MS (Murashige y Skoog 1964) suplementado con 50 g/l de kanamicina. Después de 4 semanas, las plántulas verdes enraizadas fueron transferidas 5 a tierra y dejadas crecer durante 3 semanas en el invernadero tal como se ha descrito más arriba y luego rociadas con una mezcla que contiene biciclopirona (100 g de IA/ha), sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. Las plantas fueron clasificadas en dos categorías basándose en el fenotipo desarrollado como respuesta al herbicida a los siete días después del tratamiento. La clase I fue definida como plantas que no presentaron desde ningún daño hasta daños ligeros como respuesta al tratamiento con herbicidas (daño: 0-30 %), la clase II fue definida como las 10 plantas que presentaban desde fuertes daños hasta daños similares a los observados con plantas de tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento (daño: 31-100 %). En este caso solamente las plantas que contenían al menos un ADN T fueron expuestas al tratamiento con herbicida.

En general, puede verse que las plantas que contienen un inserto de ADN-T mostraron un nivel significativo y suficiente de tolerancia a una exposición a una dosis de campo del herbicida inhibidor de HPPD biciclopirona.

15 Tabla 7:

Biciclopirona, 100 g de IA/ha 7 DAT

Transgén

Linaje Clase I Clase II % de plantas tolerantes

-

WT 0 12 0

FMP27e

121 90 138 39

FMP27e

129 47 111 30

FMP27e

218 100 56 64

Las plantas que contenían la HPPD FMP27 presentaron tolerancia al herbicida inhibidor de las HPPD biciclopirona.

Puede resumirse a partir de las tablas antes presentadas que las plantas que expresan el gen FMP27e procedente de Kordia algicida que codifica la HPPD de FMP27, obtenidas a partir de diferentes sucesos transgénicos 20 independientes son altamente tolerantes a varios herbicidas inhibidores de HPPD en dosis aplicadas en condiciones agronómicas clásicas.

Ejemplo 5: Construcción de vectores binarios para expresar diferentes variantes optimizadas de dicotiledóneas en plantas y prueba en invernadero para evaluar la tolerancia de plantas de tabaco que contienen dichas variantes.

25 Clonación en pBin19 de FMP27t (SEQ ID NO. 3), FMP27t-h (SEQ ID NO. 15)

Se diseñaron un gen con un trato con codones optimizado para la expresión en plantas dicotiledóneas que codifican la proteína de HPPD FMP27, y denominado FMP27t-h (SEQ ID NO. 15) y el mismo gen con una secuencia adicional que codifica una OTP y con una etiqueta His junto a su extremidad 5' denominado FMP27t (SEQ ID NO. 3). La secuencia correspondiente al gen FMP27t-h fue clonada usando las enzimas de restricción NcoI y XbaI en el vector 30 pRT100-OTP previamente descrito, que contiene un promotor y un terminador de CaMV35S. El resultante vector fue denominado pRT100-OTP-FMP27t-h. La secuencia correspondiente al FMP27t fue clonada en el vector pRT100 previamente descrito, usando las enzimas de restricción XhoI y XbaI, y el resultante vector fue denominado pRT100- OTP-FMP27t. Los fragmentos correspondientes a PromCaMV35S-OTP-FMP27t-h-TerCaMV35S y PromCaMV35S- OTP-HIS6-FMP27t-TerCaMV35S fueron subclonados en el vector pBIN19 (que se ha descrito más arriba) usando la 35 enzima de restricción SbfI. Los vectores binarios fueron denominados respectivamente pBin19-FMP27t-h (Figura 3C) y pBin19-FMP27t (Figura 3B) y se pueden usar, por ejemplo, para transformar plantas dicotiledóneas, tales como las plantas de tabaco que se han descrito más arriba. Se ensayan luego unas plantas transformantes que han crecido suficientemente, en cuanto a su tolerancia a herbicidas inhibidores de la HPPD, tales como tembotriona. El desarrollo de los síntomas observados como respuesta al tratamiento con herbicidas se evalúa y se compara con la 40 respuesta de plantas del tipo silvestre en las mismas condiciones.

Transformación de plantas, y selección de T0 con 100 g de IA / TBT

Como un ejemplo, unas plantas enraizadas que contienen el ADN-T PromCaMV35S-OTP-HIS6-FMP27t- TerCaMV35S, serán transferidas al invernadero en condiciones de crecimiento clásicas. Después de un período de tiempo de aclimatación de dos semanas, las plantas T0 serán tratadas con una mezcla que contiene 100 g de 45 tembotriona/ha, preparada a partir de una formulación WP20 (polvo humectable al 20%) suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. Dos semanas después del tratamiento, serán evaluados los síntomas debidos a la aplicación de los herbicidas. Las plantas son clasificadas en cuatro categorías. Las plantas tratadas evaluadas como “0” tienen el mismo aspecto que las plantas de tabaco sin tratar. Las plantas evaluadas como “1”

presentan un blanqueo provisionalmente un fenotipo de blanqueo provisionalmente ligero debido a la aplicación de los herbicidas. Las plantas evaluadas como “2” presentan unos síntomas de blanqueo permanentes desde ligeros hasta fuertes. Finalmente las plantas evaluadas como “3” tienen el mismo aspecto que unas plantas de tabaco de tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento. Los resultados se recopilan en la siguiente Tabla 8.

5 Tabla 8: Respuesta de plantas de tabaco T0 que expresan la HPPD de FMP27.

Gen

Número de transformantes obtenidos en un medio que contiene kanamicina Categorías correspondientes a la intensidad de los síntomas debidos a la aplicación de tembotriona en una tasa de 100 g de IA / ha sobre las plantas tratadas

0 1 2 3

FMP27t

42 11 4 10 4

En conclusión, varias plantas de tabaco que expresan la HPPD de FMP27 son tolerantes a tembotriona.

Ejemplo 6: Clonación de los genes FMP27e, FMP27t y FMP27m que codifican la HPPD de FMP27 en un vector para transformar plantas de Zea mays

10 FMP27e (SEQ ID NO. 2), FMP27t (SEQ ID NO. 3), FMP27m-h (SEQ ID NO. 16) a- FMP27e en pHoe6/Ac: Gen con un trato con codones optimizado para E. coli, más, junto a su extremidad 5', una secuencia que codifica un OTP y una secuencia que codifica una etiqueta His.

El vector pRT100-FMP27e que contiene el gen que codifica la HPPD de FMP27, optimizado para la expresión en E. coli bajo el control del promotor de CaMV35S, fue digerido con la enzima de restricción HindIII.

15 La casete CaMV35S::OTP::FMP27e::CaMV35S-term fue clonada ulteriormente dentro del el vector binario pHoe6/Ac (documento US 6.316.694) previamente digerido con la misma enzima de restricción y desfosforilado. El resultante vector fue denominado pHoe6/Ac/FMP27e.

b- FMP27t en pHoe6/Ac (SEQ ID NO. 3): Gen con un trato con codones optimizado para plantas dicotiledóneas, más, junto a su extremidad 5', una secuencia que codifica un OTP y una secuencia que codifica una etiqueta His.

20 FMP27t en pRT100. A versión del gen que codifica la proteína FMP27 optimizado para la expresión en Nicotiana tobaccum, que contiene además en el extremo 5' una secuencia de ácido nucleico que codifica un optimizado péptido de tránsito y una etiqueta His, fue encargada y denominada FMP27t. Corriente arriba con relación a esta secuencia se añadió la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción XhoI y corriente abajo se añadió la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI. Los ADN correspondientes al OTP y al FMP27t 25 fueron digeridos con las enzimas de restricción XhoI y XbaI, separados mediante apropiadas electroforesis en gel y clonados dentro del vector pRT100 (Toepfer, (1987), Nucleic Acid Res 15:5890) previamente digerido con las enzimas de restricción XhoI y NcoI. El plásmido pRT100 contiene el promotor de CaMV35S y el terminador de CaMV35S. El resultante vector fue denominado pRT100-FMP27t, y digerido con la enzima de restricción HindIII para separar el ADN correspondiente a la casete CaMV35S::OTP::FMP27t::CaMV35S-term con respecto del resto del 30 vector, con el fin de clonarlo dentro del vector pHoe6/Ac previamente restringido (documento US 6.316.694). El resultante vector fue denominado pHoe6/Ac/FMP27t (Figura 3).

c- FMP27m en pHoe6/Ac (SEQ ID NO. 18): Gen con un trato con codones optimizado para plantas monocotiledóneas más, junto a su extremidad 5', una secuencia que codifica un OTP. FMP27m en pRT100-OTP (NcoI-XbaI) después HindIII

35 La variante del gen optimizado para la expresión en plantas monocotiledóneas que codifican FMP27, denominada FMP27m, fue encargada, y corriente arriba del codón de iniciación se añadió un sitio de restricción de NcoI mientras que corriente abajo del codón de detención se añadió la secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción XbaI. La secuencia de ADN correspondiente a FMP27m fue digerida con las enzimas de restricción NcoI y XbaI, luego separada por electroforesis en gel, y finalmente aislada a partir del gel. El fragmento de ADN aislado fue 40 mezclado con el vector pRT100-OTP (antes mencionado) previamente digerido también con las mismas enzimas de restricción. El resultante vector fue denominado pRT100-OTP-FMP27m, que contiene la casete de expresión CaMV35S::OTP::FMP27m::CaMV35Sterm, que fue aislada usando la enzima de restricción HindIII y luego clonada ulteriormente dentro del vector pHOE6/Ac previamente abierto y desfosforilado, que contiene el gen que codifica la enzima PAT (de Phosphinothricin Acetyl Transferase = fosfinotricina acetil transferasa), que confiere resistencia al 45 herbicida glufosinato (documento US 6.316.694). El resultante plásmido fue denominado pHoe/Ac/FMP27m (Figura 3F).

Transformación de maíz:

Los plásmidos pHoe6/Ac (documento US 6.316.694), pHoe6/Ac/FMP27e, pHoe6/Ac/FMP27t y pHoe6/Ac/FMP27m se usaron para transformar un cultivo de maíz.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

El cultivo de maíz, el aislamiento de los protoplastos, la transformación y la regeneración de plantas de maíz transgénicas fértiles se realizaron de acuerdo con la patente de los EE.UU. 6284945, “Zea mays (L.) with capability of long term, highly efficient plant regeneration including fertile transgenic maize having a heterologous gene, and their preparation”. Los callos transformados fueron seleccionados sobre un medio que contiene fosfinotricina. Luego las plantas enraizadas y regeneradas se transfirieron a tierra y se dejaron crecer y producir semillas en el invernadero en condiciones clásicas (28/20°C). Las plantas adultas se hicieron crecer hasta la producción de semillas y las semillas se recogieron para una siembra ulterior, y las plantas suficientemente desarrolladas serán tratadas con los respectivos herbicidas inhibidores de las HPPD.

Ejemplo 7: Construcción de un vector que contiene el gen FMP27e que ha de ser expresado en plantas de arroz.

Un vector binario para la transformación de plantas de arroz es construido, por ejemplo, con el promotor de CaMV35 que impulsa la expresión del gen FMP27e, con un trato con codones optimizado para la expresión en bacterias E. coli y junto a su extremidad 5' se añadió una secuencia que codificaba una etiqueta His, y más corriente arriba se añadió una secuencia que codifica un OTP seguido por el terminador de CaMV35S. Adicionalmente, el vector de transformación contiene también una casete del gen de PAT en la que el gen es impulsado por un promotor de CaMV35S y seguido por terminador de CaMV35S para una selección basada en glufosinato durante el proceso de transformación (véase la Figura 3 I). El vector binario fue denominado pTMV369. Se construye similarmente un vector binario similar pero que comprende una casete de expresión que expresa el gen de Arabidopsis que codifica la enzima HPPD.

Ejemplo 8: Transformación de plantas de arroz.

La transformación de arroz se consigue usando unos procedimientos bien conocidos en la técnica. Dicho brevemente, la transformación de arroz mediada por Agrobacterium tumefaciens se realizó usando embriones inmaduros, procedentes del linaje de restaurador 6G4317. Dicho brevemente, unas panículas procedentes de plantas donantes se cosecharon a los 8-12 días después de la polinización. La lema de la semilla inmadura se eliminó. Las semillas fueron después de ello esterilizadas usando una solución basada en NaOCl y Tween. Las semillas fueron inducidas previamente con ácido acetilsalicílico. Luego unas células de Agrobacterium tumefaciens se cultivan concomitantemente con las semillas previamente inducidas en presencia de acetosiringona de 4 días a 24 °C en la oscuridad. Después de esto, los coleóptilos procedentes de embriones se retiran y se lavan y luego se colocan sobre un medio suplementado con fosfinotricina durante 3 semanas a 28 °C con un ritmo de fotoperiodo de 16 horas. Luego los callos en crecimiento fueron cortados desde los embriones, y transferidos a un medio de nueva aportación que contenía triacilina, fosfinotricina, L-prolina y sulfato de cobre (II).

Para cada linaje de callo y por cada concentración de tembotriona, 3 vástagos, aislados al azar a partir de diferentes trozos de callos, se transfirieron a MS/2 con tembotriona. Por regla general, la transferencia de los vástagos procedentes desde el medio de regeneración al MS/2 se realizó 9 semanas después de que los callos hubieran sido colocados en el medio de regeneración.

Los cultivos fueron incubados a 26,5 °C (fotoperiodo de 16 h) y la evaluación de los síntomas se realizó 2 semanas más tarde.

Unas nuevas hojas en desarrollo de los vástagos transferidos han sido calificadas sobre la base del blanqueo y asignadas a categorías en 3 grupos:

a) sin blanqueo

b) con blanqueo intermedio

c) con blanqueo completo

Dentro de la categoría “blanqueo intermedio” se ha hecho una distinción entre unos vástagos que tienen nuevas hojas, que muestran solamente muy pocos síntomas de blanqueo y por lo tanto tienden a formar hojas verdes, y unos vástagos con nuevas hojas casi totalmente blanqueados.

Tabla 9:

Concentración de tembotriona.

AtHPPD FMP27e

1 |jM

N° de vástagos sin blanqueo 27 28

N° de vástagos con blanqueo intermedio

19 19

N° de vástagos completamente blanqueados

12 10

5 jM

N° de vástagos sin blanqueo 0 0

N° de vástagos con blanqueo intermedio

2 21

N° de vástagos completamente blanqueados

58 36

Respuesta a tembotriona en pruebas en invernadero.

Unas plántulas T0 enraizadas (seleccionadas ya sea sobre fosfinotricina a solas o sobre fosfinotricina suplementada con tembotriona) fueron transferidas a tierra en el invernadero. A continuación de un período de tiempo de aclimatación, las plantas que habían crecido suficientemente se trataron con los diferentes herbicidas inhibidores de 5 las HPPD. Como un ejemplo, las plantas T0 son rociadas con tembotriona del tipo de formulación WP20 (a razón de 100 g de IA/ha) suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. Siete días después de la aplicación por rociada, los síntomas debidos a la aplicación del herbicida fueron evaluados y comparados con los síntomas observados en plantas de tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento.

Las plantas fueron clasificadas en tres categorías basándose en el fenotipo desarrollado como respuesta al 10 herbicida siete días después del tratamiento. La clase I fue definida como las plantas que no presentaron ningún daño, la clase II fue definida como las plantas que presentaron unos ligeros daños provisionales como respuesta al tratamiento con herbicidas (daño: 10-40 %), la clase III fue definida como las plantas que presentaban desde fuertes daños hasta daños similares a los observados con plantas del tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento (daño: 41-100 %).

15 En general, puede observarse que incluso las plantas que contienen solamente un inserto de ADN T ya mostraron un nivel significativo y suficiente de tolerancia a una dosis en el campo expuesta del herbicida inhibidor de las HPPD tembotriona.

Tabla 10:

Tembotriona, 100 g de IA/ha 7 DAT

Transgén

Número de plantas tratadas Clase I Clase II Clase III

-

20 0 0 20

AtHPPD

23 1 13 9

FMP27e

23 2 17 4

20 En conclusión, puede observarse que las plantas de arroz que expresan la proteína FMP27 son más tolerantes a la aplicación del herbicida inhibidor de las HPPD tembotriona que las plantas de arroz del tipo silvestre.

Ejemplo 9: Construcción de vectores binarios para la transformación de soja

Un vector binario para la transformación de soja es construido, por ejemplo, con el promotor CaMV35 que impulsa la expresión del gen FMP27t-h (SEQ ID NO. 15), con un trato con codones optimizado para la expresión en plantas 25 dicotiledóneas y junto a su extremidad 5' se añadió una secuencia que codificaba un OTP, y más corriente arriba una secuencia de TEV (acrónimo de Tabaco Etch Virus = virus de corrosión de tabaco) para mejorar la estabilidad del ARNm en plantas seguida por el terminador de CaMV35S. La secuencia de nucleótidos del gen FMP27t-h se da en la SEQ ID NO. 15. Adicionalmente, el vector de transformación contiene también una casete del gen de PAT en la que el gen es impulsado por un promotor de CaMV35S y seguido por un terminador de CaMV35S para una 30 selección basada en el glufosinato durante el proceso de transformación y una casete de gen 2mEPSPS en la que el gen es impulsado por un promotor de histona procedente de Arabidopsis para conferir a las plantas transformadas una tolerancia al herbicida glifosato (véase la Figura 3 H). El vector binario fue denominado pFCO116.

Ejemplo 10: Establecimiento y selección de plantas T0 de soja

La transformación de soja se consigue usando procedimientos bien conocidos en la técnica, como el que se 35 describe usando la transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de explantes de mitades de semillas de soja, que ha sido descrita por Paz y col. (2006, Plant cell Rep. 25:206). Los transformantes fueron identificados usando isoxaflutol como marcador de selección. Se observó la aparición de vástagos verdes, y se documentó como un indicador de la tolerancia al herbicida isoxaflutol. En total, un 1 % de los vástagos transgénicos ensayados mostraron un verdeo normal comparable al de los vástagos de soja de tipo silvestre no tratados con isoxaflutol, 40 mientras que los vástagos de soja de tipo silvestre tratados con la misma cantidad de isoxaflutol fueron blanqueados enteramente. Esto indica que la presencia de la proteína FMP27 hace posible la tolerancia a los herbicidas inhibidores de las HPPD, tales como isoxaflutol. Unos vástagos verdes tolerantes fueron transferidos a medios de enraizamiento o injertados. Unas plántulas enraizadas fueron transferidas al invernadero después de un período de tiempo de aclimatación.

45 Las plantas que contenían el transgén fueron luego rociadas con herbicidas inhibidores de las HPPD, tal como por ejemplo con tembotriona como una tasa de 100 g de IA/ha. Diez días después de la aplicación se evaluaron los síntomas debidos a la aplicación de los herbicidas y se compararon con los síntomas observados en plantas de tipo silvestre en las mismas condiciones. Ocho sucesos que expresan la proteína de HPPD FMP27 han sido generados

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

a partir de los vástagos verdes citados más arriba y fueron transferidos al invernadero. A las cuatro semanas después de la aclimatación, es decir las plantas que estaban en una etapa de desarrollo de 3-4 internodos se trataron con 100 g de IA/ha de tembotriona preparada a partir de una formulación WP 20 suplementada con sulfato de amonio y con el éster metílico de aceite de colza. Diez días después de la aplicación, los síntomas causados por la aplicación del herbicida inhibidor de las HPPD fueron evaluados y comparados con los síntomas que se observaron en plantas de soja de tipo silvestre no transgénicas tratadas. Dos de los ocho sucesos no muestran ningún fenotipo de blanqueo y tenían el mismo aspecto que las plantas de soja de tipo silvestre no tratadas. Un suceso mostró ligeros síntomas transitorios de blanqueo pero se recuperó a los 14 días después de la aplicación de tembotriona. Los cinco restantes sucesos exhibieron el mismo blanqueo que la planta de soja de tipo silvestre no transgénica después del tratamiento con tembotriona. Todos estos datos confirman que la proteína de HPPD FMP27 confiere tolerancia a los herbicidas inhibidores de las HPPD, como la tembotriona, en plantas de soja.

Ejemplo 11: Construcción de vectores binarios para la transformación de algodón.

Un vector binario para la transformación de algodón es construido, por ejemplo, con el promotor de CaMV35 que impulsa la expresión del gen FMP27t-h (SEQ ID NO. 15), con un trato con codones optimizado para la expresión en plantas dicotiledóneas y en su extremidad 5' se añadió una secuencia que codifica un OTP, y más corriente arriba se añadió una secuencia de TEV (virus de corrosión de tabaco) para mejorar la estabilidad del ARNm en plantas, seguida por el terminador de CaMV35. La secuencia de nucleótidos de gen FMP27t-h está dada en SEQ ID NO. 15. Adicionalmente, el vector de transformación contiene también una casete del gen de PAT en la que el gen es impulsado por un promotor de CaMV35S y seguida por un terminador de CaMV35S para una selección basada en glufosinato durante el proceso de transformación y una casete de gen de 2mEPSPS en la que el gen es impulsado por un promotor de histona procedente de Arabidopsis para conferir a las plantas transformadas una tolerancia al herbicida glifosato (véase la Figura 3 J). El vector binario fue denominado pTSIH25

Ejemplo 12: Establecimiento y selección de plantas T0 de algodón

La transformación de algodón se consigue usando procedimientos bien conocidos en la técnica, un procedimiento especialmente preferido es el que se describe en la publicación de patente PCT WO 00/71733.

Unas plantas regeneradas son transferidas al invernadero. Después de un período de tiempo de aclimatación, las plantas que han crecido suficientemente son rociadas con herbicidas inhibidores de las HPPD tales como por ejemplo tembotriona a razón de 100 g de IA/ha, suplementada con sulfato de amonio y éster metílico de aceite de colza. A los siete días después de la aplicación por rociada, los síntomas debidos al tratamiento con los herbicidas son evaluados y comparados con los síntomas observados en plantas de algodón de tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento en las mismas condiciones.

Ejemplo 13: Construcción de vectores de transformación binarios para generar plantas tolerantes a cuatro herbicidas con distintas modalidades de acción.

Un vector binario para la transformación de plantas dicotiledóneas es construido, por ejemplo, con el promotor de CaMV35 que impulsa la expresión del gen FMP27t-h (SEQ ID NO. 15), con un trato con codones optimizado para la expresión en plantas dicotiledóneas y junto a su extremidad 5' se añadió una secuencia de un OTP, seguida por el terminador de CaMV35S. La secuencia de nucleótidos del gen FMP27t-h se da en la SEQ ID NO. 15. Adicionalmente, el vector de transformación también contiene una casete de gen de PAT en la que el gen es impulsado por un promotor de CaVM35S y seguido por un terminador de CaMV35S para conferir a la planta que expresa el gen una tolerancia a glufosinato, una casete de gen de 2mEPSPS que codifica el EPSPS doble mutante (Thr102Ile y Pro106Ser) en que el gen es impulsado por un promotor de histona procedente de Arabidopsis para conferir a las plantas transformadas una tolerancia al herbicida glufosinato, y una casete de gen de 2mAHAS de Arabidopsis thaliana que codifica una enzima ALS tolerante (acetolactato sintasa, Pro197Ala, Trp574Leu) impulsada por un promotor de CaMV35S con el fin de conferir a la planta que expresa este gen una tolerancia a herbicidas de las clases de sulfonilureas e imidazolinonas (véase la Figura 3 G).

Las casetes de genes son finalmente clonadas dentro del vector pHoe6/Ac (documento US 6.316.694), y el vector final es denominado pHoe6/FMP27t-h/PAT/EPSPS/AHAS, y es usado para transformar plantas dicotiledóneas a partir de procedimientos de la técnica anterior mediados por Agrobacterium tumefaciens. Unas plantas T0 son transferidas a tierra, y después de un período de tiempo de aclimatación, las plantas que han crecido suficientemente son rociadas sucesivamente con un herbicida de la clase de los agentes inhibidores de las HPPD, luego con glifosato, luego con glufosinato y finalmente con un herbicida de la clase de las sulfonilureas, por ejemplo.

Ejemplo 14: Generación de plantas transgénicas que muestran tolerancia a herbicidas con tres distintas modalidades de acción.

Un vector binario para la transformación de tabaco es construido, por ejemplo, con el promotor de CaMV35 que impulsa la expresión del gen FMP27t-h (SEQ ID NO. 15), con un trato con codones optimizado para la expresión en plantas dicotiledóneas y junto a su extremidad 5' se añadió una secuencia que codifica un OTP, y más corriente arriba se añadió una secuencia de TEV (virus de la corrosión del tabaco) para mejorar la estabilidad del ARNm en plantas, seguida por el terminador de CaMV35. La secuencia de nucleótidos del gen FMP27t-h está dada en SEQ ID

5

10

15

20

25

30

NO. 15. Adicionalmente, el vector de transformación contiene también una casete del gen de PAT en la que el gen es impulsado por un promotor de CaMV35S y seguida por un terminador de CaMV35S para una selección basada en glufosinato durante el proceso de transformación y una casete de gen de 2mEPSPS en la que el gen es impulsado por un promotor de histona procedente de Arabidopsis para conferir a las plantas transformadas una tolerancia al herbicida glifosato (véase la Figura 3 H). El vector binario fue denominado pFCO116. El anterior vector se usó para transformar discos de hojas obtenidos a partir de plantas de Nicotiana tobacum, de acuerdo con el Ejemplo 3.

Unas plantas transgénicas de tabaco fueron transferidas al invernadero y tratadas con glifosato en una tasa de 1.121 g de IA/ha. Se produjeron semillas a partir de dichas plantas de tabaco tolerantes y se cosecharon. Estas semillas se colocarán sobre tierra para germinar en el invernadero. De tres a cuatro semanas más tarde, 50 plántulas por suceso se transfieren a macetas individuales. Dos semanas más tarde, unas plantas con un tamaño de 4-6 cm se rocían, respectivamente, con:

- glufosinato-amonio 1.000 g de IA/ha

- glifosato 1.121 g de IA/ha

- tembotriona 100 g de IA/ha, o

- tembotriona + glifosato 100 g de IA/ha + 1.121 g de IA/ha.

Después de nueve días, se evaluaron los síntomas causados por las respectivas aplicaciones de herbicidas, tal como se recopila en la Tabla 11, siguiente.

Las plantas fueron clasificadas en tres categorías basándose en el fenotipo desarrollado como respuesta al herbicida o herbicidas respectivos siete días después del tratamiento. La clase I se definió como las plantas que no presentaron ningún daño. La clase II fue definida como las plantas que presentaron unos ligeros daños provisionales como respuesta al tratamiento con herbicidas (daño: 10-40 %). La clase III fue definida como las plantas que presentaban desde fuertes daños hasta daños similares a los observados con plantas del tipo silvestre sometidas al mismo tratamiento (daño: 41-100 %). Las plantas de tabaco no transgénicas fueron aniquiladas completamente por un tratamiento que usaba uno o más de los anteriores herbicidas.

Tabla 11:

Transgén

Linaje Glufosinato amonio 1.000 g de IA /ha 9 DAT Clase I Clase II Clase III

FMP27t-h

639 10 0 0

FMP27t-h

714 10 0 0

FMP27t-h

717 10 0 0

Transgén

Linaje Clase I Glifosato 1.121 g de IA /ha 9 DAT Clase II Clase III

FMP27t-h

639 9 0 1

FMP27t-h

714 10 0 0

FMP27t-h

717 10 0 0

Transgén

Linaje Clase I Tembotriona 100 g de IA /ha 9 DAT Clase II Clase III

FMP27t-h

639 7 3 0

FMP27t-h

714 5 1 4

FMP27t-h

717 4 2 4

Glifosato + tembotriona 1.121 g de IA /ha + 100 g de IA /ha 9 DAT

Transgén

Linaje Clase I Clase II Clase III

FMP27t-h

639 8 2 0

FMP27t-h

714 4 3 3

FMP27t-h

717 1 1 8

Todos estos datos confirman que estas plantas que codifican varios genes de tolerancia que conciernen a herbicidas inhibidores de las HPPD, glifosato y glufosinato-amonio, confieren tolerancia a cualquiera de estos herbicidas aplicados a solas o en una combinación entre sí.

5

10

15

20

25

Esta es la primera vez en que unas plantas transgénicas que contienen estos tres genes de tolerancia en un único lugar (locus) exhiben una tolerancia a herbicidas a tales herbicidas en una tasa de aplicación que es de relevancia agronómica.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer CropScience AG Bayer CropScience AG

<120> Plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de HPPD <130> BCS 09-1043-PCT <160> 23

<170> PatentIn versión 3.3

<210> 1 <211> 1164 <212> ADN <213> Kordia algicida

<400> 1

atggcagcag

aaataaaaaa cttaaaagat ttacaaaata cagaatacgg actcaaaaaa 60

ttatttgacg

aagcagaaga ctttcttcca cttttaggaa cagactacgt agaattatac 120

gtcgggaacg

ccaaacaatc ggcacatttc tacaaaacgg cttttggttt tcaatcagaa 180

gcttacgcag

gattggaaac aggattaacc gacagagttt catacgtatt aaaacaagat 240

aaaattcgct

tggtcttaac aacaccatta ggaaaaggtg gcgaaatcaa tgagcatatc 300

gatttacacg

gcgatggcgt aaaagtagta gcactttggg tagaagatgc tacaaaagcc 360

tttgaagaaa

cgaccaaaag aggcgcaaaa ccgtacatgg aaccaacaaa agaagaagat 420

gaaaacggat

atgtaattcg ctcaggaatc tatacgtacg gagaaacggt tcatgttttt 480

gtagaacgta

aaaactataa cggagtcttt ttaccaggat atcaaagatg ggaatctcac 540

tacaatccgg

agccagttgg cttaaaattc atcgatcaca tggtaggaaa tgtaggttgg 600

ggagaaatga

aagaatggtg tgaattctac gcgaaagtaa tgggatttgc gcaaattatc 660

tcctttacag

atgatgatat ttctaccgat tttactgcgt tgatgagtaa agtaatgagt 720

aatggaaatg

gtagaatcaa atttccaatc aatgaacccg cagaaggaaa aaagaaatcg 780

caaattgaag

aatatctaga cttttacaat ggttcaggag tacaacatat tgcggttgct 840

acagacaata

ttattgatac ggtttcgcaa atgcgcgaac gtggagtaga attcttatac 900

gttccagata

catattatga tgacttgtta gaacgtgttg gcgacatcga tgaagatgta 960

gaagaactca

aaaaacacgg aatcttaatt gatcgtgatg aagaaggata cttattgcag 1020

ttatttacca

aaaccattgt agacagacca acaatgttct ttgaagtcat tcagcgtaaa 1080

ggcgcacaat

catttggagt aggaaacttt aaagctttat ttgaagcgat agaaagagaa 1140

caagctgctc

gcggaacatt gtaa 1164

<210>2 <211>1185 <212> ADN

5

10

15

20

25

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Kordia algicida optimizada para E. coli, que contiene además en el extremo 5' un ácido nucleico que codifica una alanina y 6 aminoácidos histidina.

<220>

<221> misc_feature <222> (4)..(6)

<223> secuencia que codifica Ala <220>

<221> misc_feature <222> (7)..(24)

<223> secuencia que codifica una etiqueta His que contiene 6 His <400> 2

atggctcatc

atcatcacca tcatgcggcc gaaatcaaga acctgaaaga tttgcagaat 60

accgaatacg

gccttaagaa actgtttgac gaggctgagg acttcttgcc gttactgggt 120

acggattatg

tcgaactgta cgttggtaat gccaaacagt ctgctcactt ttacaagacg 180

gcgtttgggt

tccaatccga agcgtatgca ggtctggaga caggcctgac cgatcgtgtg 240

agttacgtgc

tgaaacagga taaaatccgc ttagtcttaa ctactccact gggtaaagga 300

ggtgagatta

acgaacacat tgaccttcat ggtgatggtg tgaaagtggt tgccttatgg 360

gtcgaagatg

cgacaaaagc gtttgaggag actaccaaac gcggagccaa accgtatatg 420

gaacccacca

aagaagagga cgaaaacggc tatgtcattc gcagcggcat ctatacgtat 480

ggcgaaaccg

ttcacgtgtt tgtagaacgc aagaactaca acggagtttt cttgcctggg 540

taccaacgtt

gggaaagtca ctacaatcca gaaccggtag gcctcaaatt cattgaccat 600

atggttggca

atgttgggtg gggtgaaatg aaagaatggt gcgaattcta tgcgaaagtg 660

atgggtttcg

cacagatcat ctcgtttacc gacgacgata tttcgaccga tttcactgct 720

ctgatgagca

aagttatgtc caatggcaat ggccgcatta agttcccgat taacgaacct 780

gccgaaggca

agaagaaaag ccagattgag gagtatcttg acttttacaa tggctctggt 840

gtgcaacaca

ttgcagttgc caccgataac atcatcgata ccgtgagcca gatgcgcgaa 900

cgtggtgtcg

agtttctgta tgtaccggac acgtattacg atgatctgct ggaacgggta 960

ggcgatatcg

acgaagatgt cgaagaactg aaaaaacatg ggatactcat tgatcgggat 1020

gaagagggct

atttgctcca actgtttacc aaaacgatcg tggatcgtcc gacgatgttc 1080

tttgaagtga

tacagcgcaa aggagcacag tcatttggcg tggggaactt taaagcgctg 1140

tttgaagcga

ttgagcgcga acaagcagcg cgtggtacac tgtaa 1185

<210>3 <211>1560 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de ácidos nucleicos que codifica HPPD de Kordia algicida optimizada para Nicotiana tobaccum que contiene además en el extremo 5' un ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito optimizado y una etiqueta His.

10

15

20

<220>

<221> TRANSIT_peptide <222> (1)..(375)

<223> Péptido de tránsito optimizado para cloroplastos <220>

<221> misc_feature <222> (376)..(378)

<223> secuencia que codifica una Met <220>

<221> misc_feature <222> (379)..(381)

<223> secuencia que codifica una Ala <220>

<221> misc_feature <222> (382)..(399)

<223> secuencia que codifica una etiqueta His que contiene 6 His <400>3

atggcttcta

tttcttcttc tgtggctact gtttctagga ctgctccagc tcaagctaat 60

atggtggctc

cattcacagg cttgaaatcc aatgctgctt tcccaactac taagaaggct 120

aacgatttct

ctactctccc atctaatggt ggaagggttc agtgtatgca agtttggcca 180

gcttacggaa

ataagaagtt cgagactctt tcttaccttc caccactttc tatggctcca 240

actgtgatga

tggcttcttc tgctactgct gttgctccat tccaaggatt gaagtctact 300

gcttctttgc

cagttgctag aaggtcatct cgttctcttg gaaacgtttc taacggtgga 360

aggattagat

gtgctatggc tcatcatcat caccatcacg ctgctgagat taagaacctc 420

aaggatctcc

agaatactga gtacggactc aagaaacttt ttgatgaggc tgaggatttc 480

cttccacttc

tcggaactga ttacgttgag ctttatgtgg gaaacgcaaa gcaatctgct 540

cacttctaca

agactgcttt cggatttcaa tctgaggctt acgctggact tgaaactgga 600

cttactgata

gggtttccta cgtgcttaag caggataaga ttaggcttgt gctcactact 660

ccacttggaa

agggtggaga gattaacgag cacattgatc ttcatggtga tggtgttaag 720

gttgtggctc

tttgggttga agatgctact aaggctttcg aagagactac taagagaggt 780

gcaaagcctt

atatggaacc tacaaaagaa gaggacgaga acggatacgt gattagatcc 840

ggaatctaca

cttacggtga aactgttcac gttttcgtgg agaggaagaa ctacaacgga 900

gtctttcttc

ctggatacca acgatgggag tctcattaca atccagagcc agtgggactt 960

aagttcatcg

atcacatggt gggtaatgtt ggatggggag agatgaagga atggtgcgag 1020

ttttacgcta

aggttatggg attcgctcag atcatttcct tcactgatga tgatatctcc 1080

actgatttca

ctgctcttat gtccaaggtg atgtctaatg gaaacggaag gatcaagttc 1140

cctattaacg

aaccagctga gggaaagaag aagtcccaga tcgaagagta cctcgatttc 1200

5

tacaacggat

ctggtgttca gcatattgct gtggcaactg ataacatcat cgatactgtg 1260

tctcaaatga

gagaaagggg agtggagttt ctttacgtcc cagatactta ctacgatgat 1320

ctccttgaga

gagtgggaga tattgacgag gatgtggagg aacttaagaa gcacggaatc 1380

ctcattgata

gagatgaaga gggatacctt ctccagcttt tcactaagac tatcgtggat 1440

aggccaacta

tgttcttcga agtgatccaa agaaagggtg ctcaatcttt cggagtggga 1500

aacttcaagg

ctcttttcga ggctattgag agagaacaag ctgctagagg aactctttga 1560

<210>4 <211> 387 <212> PRT <213> Kordia algicida

<400> 4

imagen13

imagen14

<210>5 <211> 394 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> codificada por SEQ ID NO. 2

10

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2)

<223> Ala

<220>

<221> MISC_FEATURE <222> (3)..(8)

5 <223> Etiqueta His hecha de 6 His

<400>5

imagen15

5

10

Gln lie lie Ser Phe Thr Asp Asp 225 230

Leu Met Ser Lys Val Met Ser Asn 245

lie Asn Glu Pro Ala Glu Gly Lys 260

Leu Asp Phe Tyr Asn Gly Ser Gly 275 280

Asp Asn lie lie Asp Thr Val Ser 290 295

Phe Leu Tyr Val Pro Asp Thr Tyr 305 310

Gly Asp lie Asp Glu Asp Val Glu 325

lie Asp Arg Asp Glu Glu Gly Tyr 340

lie Val Asp Arg Pro Thr Met Phe 355 360

Ala Gln Ser Phe Gly Val Gly Asn 370 375

Glu Arg Glu Gln Ala Ala Arg Gly 385 390

Asp lie Ser Thr Asp Phe Thr Ala 235 240

Gly Asn Gly Arg lie Lys Phe Pro 250 255

Lys Lys Ser Gln lie Glu Glu Tyr 265 270

Val Gln His lie Ala Val Ala Thr 285

Gln Met Arg Glu Arg Gly Val Glu 300

Tyr Asp Asp Leu Leu Glu Arg Val 315 320

Glu Leu Lys Lys His Gly lie Leu 330 335

Leu Leu Gln Leu Phe Thr Lys Thr 345 350

Phe Glu Val lie Gln Arg Lys Gly 365

Phe Lys Ala Leu Phe Glu Ala lie 380

Thr Leu

<210>6 <211> 512 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Secuencia de aminoácidos de HPPD de Kordia algicida (SEQ ID NO. 4) fusionada a un péptido de tránsito optimizado (documento WO 2009/144079)

<220>

<221> TRÁNSITO <222> (1)..(125)

<223> Péptido de tránsito optimizado para cloroplastos <400> 6

Met Ala Ser lie Ser Ser Ser Val Ala Thr Val Ser Arg Thr Ala Pro 15 10 15

Claims (10)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   1. Un gen quimérico que comprende una secuencia codificante enlazada operativamente a un promotor expresable en plantas siendo el último un elemento regulador heterólogo a la secuencia codificante, caracterizado porque la secuencia codificante comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387 o una proteína con una identidad entre secuencias de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 4 desde la posición de aminoácido 2 hasta la posición de aminoácido 387, que muestra las propiedades de catalizar la conversión de para-hidroxifenilpiruvato a homogentisato y ser menos sensible a un herbicida inhibidor de HPPD que el HPPD endógeno de la planta hospedadora.
2. 2. El gen quimérico de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de tránsito activo en plantas de manera que se codifica una proteína de fusión del péptido de tránsito/HPPD por dicho gen quimérico.
3. 3. Un vector que comprende al menos un gen quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
4. 4. Una célula de planta, parte de planta, planta o semilla, caracterizada porque comprende un gen quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
5. 5. La célula de planta, parte de planta, planta o semilla de la reivindicación 4, que comprende también un gen quimérico que codifica una enzima PDH (prefenato deshidrogenasa).
6. 6. La célula de planta, parte de planta, planta o semilla de la reivindicación 4 o 5 que comprende además uno o más genes quiméricos que confieren tolerancia a reguladores del crecimiento, preferentemente a 2,4-D o dicamba y/o herbicidas que inhiben la acetolactato sintasa (ALS), la EPSP sintasa (EPSPS) y/o la glutamina sintasa (GS).
7. 7. Un procedimiento de obtención de una planta tolerante a un herbicida inhibidor de HPPD, caracterizado porque se introduce un gen quimérico en dicha planta de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2.
8. 8. Un procedimiento de obtención de un aceite o una harina que comprende hacer crecer una planta de acuerdo con la reivindicación 4, 5 o 6, opcionalmente tratar dicha planta con un herbicida inhibidor de las HPPD, cosechar los granos y moler los granos para producir la harina y opcionalmente extraer el aceite.
9. 9. Uso de una proteína HPPD que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una proteína HPPD con una identidad de secuencia de al menos el 80 % a la secuencia de SEQ ID NO: 4 y cuya proteína HPPD muestra las propiedades de catalizar la conversión de para-hidroxifenilpiruvato a homogentisato para hacer a las plantas tolerantes a herbicidas inhibidores de las HPPD.
10. 10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que los herbicidas inhibidores de las HPPD se seleccionan del grupo que consiste en: isoxaflutol, tembotriona, mesotriona, sulcotriona, pirasulfotol, topramezona, 2-ciano-3- ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3fenil)propano-1,3-diona y 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3 Cl2 fenil)propano- 1,3-diona, biciclopirona, benzobiciclona, tefuriltriona, dicetonitrilo y pirazoxifeno.

    rbs2

    imagen1

    Figura 1: mapa del plásmido pSE420-FMP27e

    FMP27c

    terminador CaMV35S ! . Prornotor CaMV35S

    H útilII OTP Húxllll

    imagen2

    T-DNA:: FMP27e

    Figura 2: mapa del ADN T insertado en las plantas de tabaco

    imagen3

    imagen4

    ü

    H

    h

    CL

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    o LU

    imagen5

    imagen6

    Figura 3: mapa de los diferentes ADN Tinsertados en

    imagen7