CN100352919C

CN100352919C - 抗草甘磷的i型5－烯醇丙酮酸莽草酸－3－磷酸合酶(epsps)

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Publication number: CN100352919C
Application number: CNB2004800098432A
Authority: CN
Inventors: M·F·阿利布海; C·卡雅各布; 冯寄嘉; G·R·赫克; 祁幼林; S·弗拉辛斯基; W·C·斯塔林斯
Original assignee: Monsanto Technology LLC
Current assignee: Monsanto Technology LLC
Priority date: 2003-02-18
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2024-02-17
Also published as: EP1594961B1; CN1774503A; BRPI0407592B1; US7723575B2; CA2516221C; AU2004213818A1; BRPI0407592A; US20060143727A1; US20100197499A1; WO2004074443A2; AU2004213818B2; AR043207A1; EP1594961A2; AR087673A2; CA2516221A1; MXPA05008725A; CN101173273B; US8436159B2; CN101173273A; ZA200506582B

Abstract

本文公开的组合物和方法提供了编码草甘磷抗性EPSPS蛋白的新型DNA分子和含有这种新蛋白的植物。表达该新型EPSPS蛋白的植物自身耐受草甘磷的除草效应。

Description

抗草甘磷的I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)

[0001]本申请要求2003年2月18日提交的美国临时申请60/448,438的权益，它的整个内容通过引用结合到本文中。

发明领域

[0002]本发明涉及植物分子生物学和植物遗传工程学用于抗除草剂，更详细地说，涉及修饰以抗草甘磷的I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。使用植物遗传工程学方法修饰I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶DNA和其编码的蛋白，并将这些分子转入农艺学重要的植物中。更具体地说，本发明包含抗草甘磷的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶的DNA和蛋白组合物，以及含有这些组合物的植物。

发明背景

[0003]N-膦酰甲基甘氨酸，也称为草甘磷，是熟知的除草剂，对植物物种具有广谱活性。草甘磷是Roundup(Monsanto Co.，StLouis，MO)的有效成分，是一种在环境中具有安全使用长久历史和所需短半衰期的除草剂。当施用在植物表面时，草甘磷在植物中系统性地移动。草甘磷能毒害植物是因为它抑制了莽草酸途径，此途径提供了合成芳香族氨基酸的前体。草甘磷抑制在植物和某些细菌中发现的I型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。在植物中草甘磷的抗性可以通过表达与草甘磷具有较低亲和力的修饰I型EPSPS而获得，存在草甘磷时此酶也仍然保持其催化活性(美国专利4,535,060和美国专利6,040,497)。“耐受”或“抗性”是指试剂对生长和发育的效果降低，特别是产生了耐受除草剂、具体地说是草甘磷的植物毒害效应的植物。

[0004]现已经从天然抗草甘磷的细菌中分离得到了酶如II型EPSPS酶，当将此酶在植物中作为转基因表达时，给植物提供了草甘磷抗性(美国专利5,633,435和美国专利5,094,945)。能在植物组织中降解草甘磷的酶(美国专利5,465,175)也能够赋予植物对草甘磷的抗性。包含表达草甘磷抗性酶或降解酶的必要遗传元件的DNA构建物，在植物中产生了有用的嵌合转基因。这类转基因可以用于产生耐受草甘磷的转基因农作物，因此允许草甘磷有效用于除草而对农作物产生的危害最小。例如，已经将草甘磷抗性遗传工程导入了玉米(美国专利5,554,798)、小麦(Zhou等，Plant Cell Rep.15：159-163，1995)、大豆(WO 9200377)和油菜(WO 9204449)。耐受草甘磷的转基因和耐受其他除草剂的转基因，例如bar基因(Sh.Bar)，可以包括在DNA构建物中以用作植物转化的选择标记(本发明pMON81519；Toki等，PlantPhysiol.，100：1503-1507，1992；Thompson等，EMBO J.6：25 19-2523，1987；phosphinothricin acetyltransferase DeBlock等，EMBO J.，6：2513-2522，1987，glufosinate herbicide)，也可以用作选择标记或计分标记(scorable marker)，并且当标记基因与其他农艺学有用性状连接时可以提供有用的表型以选择转基因植物。

[0005]耐除草剂农作物的开发已经成为农业生物技术的主要突破，为农场主提供了新的杂草防除方法。一种成功被设计为耐受抑制剂除草剂的酶是I型EPSPS。已经分离抗草甘磷的I型EPSPS变体(Pro-Ser，美国专利4,769,061；Gly-Ala，美国专利4,971,908；Gly-Ala，Gly-Asp，美国专利5,310,667；Gly-Ala、Ala-Thr，美国专利5,8866,775)。然而，许多EPSPS变体不能表现对草甘磷有足够高的K_i，或者对磷酸烯醇丙酮酸(PEP)的K_m太高而不能有效的作为草甘磷抗性酶在植物中使用(Padgette等，“Herbicide-resistant Crops”中，4章53-83页，Stephen Duke编，Lewis Pub，CRC Press Boca Raton，Fl1996)。然而，有效地与异源启动子连接的一类I型EPSPS变体，T102I/P106S(TIPS)，显示出为转基因玉米植物提供草甘磷抗性(美国专利6,040,497)。现也已经从杂草牛筋草(Eleusine indica)中分离到了耐受草甘磷的EPSPS[WO 01/66704]。

[0006]在植物分子生物学领域内需要可提供阳性选择标记表型的各种基因。具体地说，草甘磷耐受可在植物中广泛地用作阳性选择标记，并且用在农作物生产中是很有价值的表型。当使用不同的阳性选择标记基因时，扩展了现有的转基因性状与新开发性状的堆积和组合。标记基因提供了不同的表型如抗生素或除草剂耐受，或者通过DNA检测方法可区别的分子区别。通过多重抗生素或除草剂耐受分析，或通过DNA检测方法检测新型DNA分子的存在，可以筛选叠加性状的转基因植物。本发明提供了抗草甘磷变体I型EPSP合酶的DNA和蛋白组合物。本发明也提供了用于植物的DNA构建物和展示草甘磷抗性的转基因植物。

发明概述

[0007]本发明一方面提供了分离的修饰EPSPS DNA分子，它编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。本发明的另一方面是包含启动子的DNA构建物，此启动子在植物细胞中有功能，有效与修饰EPSPS DNA分子连接，该修饰EPSPS DNA分子编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。本发明的又一方面提供了包含DNA构建物的转基因植物，其中此转基因植物耐受草甘磷除草剂。

[0008]本发明的另一方面是一个制备能育转基因植物的方法，包括提供具有修饰EPSPS基因的植物表达盒，该修饰EPSPS基因编码的耐受草甘磷的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；在允许植物表达盒能被受体植物细胞摄取的条件下，将受体植物细胞与植物表达盒接触；选择包含植物表达盒的受体细胞；从选择的受体植物细胞再生植物；鉴定能育的耐受草甘磷的转基因植物。

[0009]本发明的另一方面是能育的草甘磷耐受的转基因植物，它包含具有修饰植物EPSPS基因的植物表达盒，该修饰植物EPSPS基因编码的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸；将此转基因植物与其他植物杂交，以提供耐受草甘磷的子代。

[0010]本发明的另一方面提供了在农作物田地中杂草防除的方法，其中农作物田地用有效量的含草甘磷除草剂处理，并且农作物植物包含具有修饰EPSPS基因的植物表达盒，该修饰EPSPS基因编码的EPSPS蛋白在102位具有异亮氨酸或亮氨酸，在106位具有选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。

附图简述

图1.玉米EPSPS的多核苷酸和多肽序列。

图2.I型植物和细菌EPSP合酶的多肽的对比。

图3.pMON70461(野生型EPSPS)的DNA构建图。

图4.DNA引物序列。

图5.pMON58452(ZmTIPT变体)的DNA构建图。

图6.pMON30167(CP4 EPSPS)的DNA构建图。

图7.pMON70472(ZmTIPT变体)的DNA构建图。

图8.pMON70475(ZmTIPA变体)的DNA构建图。

图9.pMON70467(ZmPT变体)的DNA构建图。

图10.pMON81519(ZmTIPT变体)的DNA构建图。

图11.pMON81548(LsTIPA变体)的DNA构建图。

图12.pMON58491(AtTIPA变体)的DNA构建图。

发明详述

[0011]本发明部分基于构建草甘磷抗性EPSPS，并利用DNA构建物中编码EPSPS的DNA分子，为在其组织中表达草甘磷抗性EPSPS的转基因植物提供除草剂抗性。提供随后的叙述以更好的定义本发明，并指导本领域中普通技术人员实施本发明。除非另有说明，否则术语按照相关领域内普通技术人员的常规用法理解。分子生物学普通术语的定义也可以发现于Rieger等，Glossary of Genetics：Classical and Molecular，5th edition，Springer-Verlag：New York，(1991)；and Lewin，Genes V，Oxford University Press：New York，(1994)。使用37 CFR§1.822所设定的DNA碱基命名法。“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。使用标准一字母和三字母命名氨基酸残基。

[0012]本发明的方法包括设计给予所引入植物耐受草甘磷性状的EPSPS蛋白。编码除草剂耐受相关蛋白的多核苷酸分子为本领域所知，包括但不限于编码耐受草甘磷的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，在美国专利5,627,061、5,633,435和6,040,497中描述；Padgette等，Herbicide Resistant Crops，Lewis Publishers，53-85，1996；和Penaloza-Vazquez等，Plant Cell Reports 14：482-487，1995；和aroA(美国专利5,094,945)的多核苷酸分子。

[0013]“草甘磷”是指N-膦酰甲基甘氨酸和它的盐。草甘磷是Roundup除草剂(Monsanto Co.)的活性成分。除非另有说明，用“草甘磷”处理植物是指用Roundup和Roundup Ultra除草剂制剂处理。作为N-膦酰甲基甘氨酸及其盐的草甘磷(不是配制的Roundup除草剂)是合成培养基组分，用于选择耐受草甘磷的细菌和植物，或者是在体内生化试验中用于测定酶抗性。草甘磷的商业制剂实例包括但不限于由Monsanto公司销售的ROUNDUP、ROUNDUPULTRA、ROUNDUPULTRAMAX、ROUNDUPCT、ROUNDUPEXTRA、ROUNDUPBIACTIVE、ROUNDUPBIOFORCE、RODEO、POLARIS、SPARK和ACCORD除草剂，所有这些除草剂包含草甘磷的异丙基铵盐；由Monsanto公司销售的ROUNDUPDRY和RIVAL除草剂，包含草甘磷的铵盐；由Monsanto公司销售的ROUNDUPGEOFORCE除草剂，包含草甘磷的钠盐；由Zeneca有限公司销售的TOUCHDOWN除草剂，包含草甘磷的三甲基锍盐。

[0014]通过植物基因工程方法，可通过将导致产生高水平野生型EPSPS的DNA分子插入到植物基因组，从而产生耐受草甘磷的植物(美国专利4,940,835；Shah等，Science 233：478-481，1986)。通过表达与草甘磷具有较低亲和力、因此存在草甘磷时仍保持酶催化活性的EPSPS变体，如aroA P-S(美国专利5,094,945)、CP4 EPSPS(美国专利5,633,435)、玉米TIPS(美国专利6,040,497)、101/192和101/144变体(美国专利5,866,775和美国专利6,225,112，Howe等，Mol.Breeding 10：153-164，2002)，也能获得草甘磷抗性。例如，已经通过遗传工程将草甘磷抗性导入了玉米(美国专利5,554,798和6,040,497)、小麦(Zhou等，Plant Cell Rep.15：159-163，1995)、大豆(WO9200377)、棉花(WO 0234946)和油菜(WO 9204449)。

[0015]现已经分离到了野生型EPSPS酶的变体，它的草甘磷抗性是EPSPS氨基酸编码序列发生改变的结果(Kishore等，Annu.Rev.Biochem.57：627-663，1988；Schulz等，Arch.Microbiol.137：121-123，1984；Sost等，FEBS Lett.173：238-241，1984；Kishore等，“Biotechnologyfor Crop Protection”ACS Symposium Series No.379.eds.Hedlin等，37-48，1988)。这些变体通常比野生型EPSPS酶对草甘磷具有更高的K_i，这就赋予耐受草甘磷的表型，但是这些变体同样对PEP具有高K_m的特征，以至使得酶动力学效率较低。例如，来源于大肠杆菌的天然EPSPS对PEP的表观K_m和草甘磷的表观K_i为10μM和0.5μM，而在96位发生丙氨酸置换甘氨酸的单个氨基酸置换的抗草甘磷酶分离物，这些值就分别为220μM和4.0μM。美国专利6,040,497报告，已知为TIPS突变体(在氨基酸102位异亮氨酸置换苏氨酸，在氨基酸106位丝氨酸置换脯氨酸)的EPSPS变体包含2个突变，当引入玉米EPSPS的多肽序列时就赋予酶草甘磷抗性。包含这种突变酶的转基因植物是耐受草甘磷的。也可以在其它来源的编码草甘磷敏感酶的基因中进行同一突变，以产生草甘磷抗性酶。体外DNA分子的定点诱变清楚地表现出可用于在基因组DNA序列中引入具体改变，其它发展中的方法也可以提供原位定点诱变方法(美国专利公开号20020151072)。这些方法可以在内源性宿主细胞EPSPS基因的前后产生DNA编码序列，这些编码序列编码了本发明的草甘磷抗性EPSPS变体。

[0016]本发明提供了在I型EPSPS中的氨基酸置换，其表现的草甘磷抗性提高超过了任何先前所描述的修饰I型EPSPS。本发明具体涉及某些草甘磷抗性的I型EPSPS双变体，但其仍然保持着PEP底物结合活性的功能水平。在草甘磷抗性I型EPSPS的新型双变体的发展中，有必要构建许多单变体以用作试验对照，并且用于证明，对于获得草甘磷抗性酶，并且此酶仍然保持足够水平的底物结合活性，以作为天然I型EPSPS的功能取代物，双变体是有必要的。

[0017]EPSPS酶在植物叶绿体中行使功能，因此，叶绿体转运肽(CTP)被改造入DNA分子中以编码CTP与EPSPS N末端的融合物，产生嵌合分子。嵌合的多核苷酸编码序列包含2个或更多框内连接的开放可读框，其编码嵌合蛋白例如叶绿体转运肽和EPSPS酶。嵌合基因是指多个异源遗传元件有效连接而组成基因。CTP指导草甘磷抗性酶进入植物叶绿体。在天然的植物EPSPS基因中，叶绿体转运肽区域包含在天然的编码序列中(例如，CTP2，Klee等，Mol.Gen.Genet.210：47-442，1987)。CTP在叶绿体膜上从EPSPS酶上裂解下来，产生“成熟的EPSPS或EPSPS酶”，其指除去叶绿体转运蛋白后剩余处理蛋白产物的多肽序列。

[0018]在转基因植物表达盒的构建中可以用异源CTP取代天然的CTP。许多叶绿体定位蛋白，包括EPSPS，是从核基因表达为前体，并且通过在输入步骤中去除的叶绿体转运肽(CTP)定向到叶绿体中。其它这种叶绿体蛋白的实例包括：核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(rubisco)的小亚基(SSU)、铁氧还蛋白、铁氧还蛋白氧化还原酶、集光复合体蛋白I和蛋白II以及硫氧还蛋白。现已在体内和体外证明，通过使用与CTP融合的蛋白质，非叶绿体蛋白也可以定向到叶绿体，并且CTP序列足以将蛋白定向到叶绿体。已经表明，整合适合的叶绿体转运肽，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)EPSPS CTP(Klee等，Mol.Gen.Genet.210：437-442(1987))和矮牵牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6873-6877(1986)，能将异源EPSPS蛋白定向到转基因植物中的叶绿体。通过表达包含氨基末端CTP和抗草甘磷EPSPS酶的融合蛋白，产生耐受草甘磷的植物为本领域技术人员所熟知(美国专利5,627,061、美国专利5,633,435、美国专利5,312,910、欧洲专利0218571、欧洲专利189707、欧洲专利508909和欧洲专利924299)。本领域技术人员将认识到，利用具体CTP的功能将抗草甘磷的EPSPS酶输入到植物细胞叶绿体，可以制备各种嵌合体构建物。

[0019]可在本发明DNA多核苷酸结构中进行修饰和变化，并且仍然获得转录mRNA的DNA分子，此mRNA编码本发明的修饰的功能EPSPS蛋白。本文公开的氨基酸置换为蛋白提供了改善的特征，例如EPSP合酶的草甘磷抗性增强。氨基酸置换或氨基酸变换优选为在蛋白中一个或多个位点用一个氨基酸残基置换另一个氨基酸残基。置换、缺失、插入或其任何组合都可以结合形成最终的构建物。本发明涉及I型EPSPS蛋白中的氨基酸置换，提供新的蛋白特征如草甘磷抗性。

[0020]现已知遗传密码是间并的。氨基酸和它们的RNA密码子列在下表1中。

表1氨基酸和编码它们的RNA密码子

氨基酸密码子

全称；3字母代码；1字母代码

丙氨酸；Ala；A GCA GCC GCG GCU

半胱氨酸；Cys；C UGC UGU

天冬氨酸；Asp；D GAC GAU

谷氨酸；Glu；E GAA GAG

苯丙氨酸；Phe；F UUC UUU

甘氨酸；Gly；G GGA GGC GGG GGU

组氨酸；His；H CAC CAU

异亮氨酸；Ile；I AUA AUC AUU

赖氨酸；Lys；K AAA AAG

亮氨酸；Leu；L UUA UUG CUA CUC CUG CUU

甲硫氨酸；Met；M AUG

天冬酰胺；Asn；N AAC AAU

脯氨酸；Pro；P CCA CCC CCG CCU

谷氨酰胺；Gln；Q CAA CAG

精氨酸；Arg；R AGA AGG CGA CGC CGG CGU

丝氨酸；Ser；S AGC AGU UCAUCC UCG UCU

苏氨酸；Thr；T ACA ACC ACG ACU

缬氨酸；Val；V GUA GUC GUG GUU

色氨酸；Trp；W UGG

酪氨酸；Tyr；；Y UAC UAU

[0021]密码子以RNA碱基方式描述，例如腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶，mRNA直接翻译为多肽。可以理解的是，当设计用于构建物中的DNA多核苷酸时，将用DNA碱基置换，如胸腺嘧啶代替尿嘧啶。密码子是指规定具体氨基酸的三核苷酸序列。密码子选择或“密码子偏好”是指在生物体编码序列中编码氨基酸的密码子的使用频率。当选择替代密码子用于人工DNA序列时，可以参考密码子选择表。密码子序列提供了编码序列，此编码序列指编码蛋白、多肽或肽序列的连续顺序核酸三联体区域。术语“编码DNA”是指编码任何本文讨论蛋白的染色体DNA、质粒DNA、cDNA或人工DNA多核苷酸。“质粒”是指一段环状、染色体外、能自我复制的DNA片断。

[0022]术语“内源”是指来源于生物体或细胞内的物质。“外源的”是指来源于生物体或细胞外的物质。这典型用于在产生转化或转基因宿主细胞和植物中使用的核苷酸分子。

[0023]术语“基因组”，当它应用于细菌时，包括细菌宿主细胞内部的染色体和质粒。因此，引入细菌宿主细胞的本发明编码核苷酸可以整合在染色体中或位于质粒中。当术语“基因组”应用于植物细胞时，不仅包括在细胞核内发现的染色体，还包含在亚细胞组件内发现的细胞器DNA。术语“基因”是指多核苷酸，其包括染色体DNA、质粒DNA、cDNA、人工DNA多核苷酸或其它可以转录为RNA分子的DNA，其中RNA可以编码肽、多肽或蛋白，还包括编码序列两侧的涉及调控本发明mRNA或多肽表达的遗传元件。基因的“片断”是全长多核酸分子的一部分，具有能够转录为RNA、翻译为肽或在DNA检测方法中作为探针或引物的最小长度。

[0024]因此，引入植物宿主细胞的本发明多核苷酸可以是染色体整合的或位于质粒的。通过位于编码序列N端的叶绿体转运肽，可以将本发明的修饰EPSPS酶定向到叶绿体。或者，编码修饰EPSPS的基因可以选择性的整合入叶绿体基因组中，因此不需要叶绿体转运肽。

[0025]“异源DNA”序列是指来源于外源或外来物种、或来自于同一来源但从最初形式修饰而来的多核苷酸序列。“同源DNA”是指与受体细胞同一来源的DNA。

[0026]“杂交”是指核酸链与互补链通过碱基配对而结合的能力。当两个核酸链中的互补序列相互结合时，就产生杂交。本发明的核苷酸探针和引物在严格条件下与靶DNA序列杂交。任何常规的核苷酸杂交或扩增方法可以用于鉴定样品中是否存在来源于转基因事件的DNA。通过用异源DNA即包含目标转基因的核苷酸构建物转化植物细胞；再生由转基因插入植物细胞基因组而导致的植物群体，并选择特征为插入具体基因组位置的具体植物，就产生了转基因“事件”。术语“事件”指包含异源DNA的原始转化体植物和转化体的子代。术语“事件”也包括一种事件和另一种植物有性异型杂交产生的子代，其中子代包括了异源DNA。在某些条件下核酸分子或片断也可以和其它核酸特异性杂交。如本文所使用的，假如两种核酸分子可以形成反向平行的双链核酸构造，两种分子就称为可相互特异性杂交。假如两种核酸分子展现出完全的互补性，一种核酸分子称为另一种核酸分子的“互补链”。如本文所使用的，当分子的每个核苷酸与其它分子的核苷酸互补时，分子称为展现了“完全互补性”。假如两种分子能相互杂交，其稳定性足以在至少常规的“低严格性”条件下允许他们相互保持退火，这两个分子称为“最低互补”。相似地，假如两种分子能相互杂交，其稳定性足以在至少常规的“高严格性”条件下允许他们相互保持退火，这两个分子称为“互补”。Sambrook等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，2nd.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York(1989)，本文以下称为Sambrook等，(1989)，和Haymes等，Nucleic AcidHybridization，A Practical Approach，IRL Press，Washington，DC(1985)中描述了常规的严格条件。只要偏差不能完全排除分子形成双链结构的能力，允许不同于完全互补的偏差。为了将核苷酸分子用作引物或探针，仅仅需要在序列中具有足够的互补性，在使用的具体溶剂和盐浓度下能够形成稳定的双链结构。

[0027]本文使用的基本同源染色体序列是在高严格性条件下能与待比较核苷酸序列的互补序列特异性杂交的核苷酸序列。术语“严格条件”功能性定义为通过Sambrook等，1989，9.52-9.55中所述的特异性杂交方法，核苷酸探针与靶核苷酸(如与目标具体核酸序列)杂交。也参见Sambrook等，1989，9.47-9.52，9.56-9.58；Kanehisa，(Nucl.Acids Res.12：203-213，1984)；和Wetmur and Davidson，(J.Mol.Biol.31：349-370，1988)。可以使用本发明核苷酸序列选择性与DNA片断的互补段形成双链的能力。依靠预想的应用，人们希望运用各种杂交条件以获得探针与靶序列不同程度的选择性。对于要求高选择性的应用，人们典型地希望运用相对严格的条件形成杂交体，例如人们选择相对低盐和/或高温条件，如在约50℃至约70℃的温度下约0.02M至约0.15 M NaCl的条件。例如，严格条件是用高严格性洗涤缓冲液(0.2X SSC，0.1％SDS，65℃)洗涤杂交滤纸至少两次。合适的促进DNA杂交的严格条件，例如在约45℃下6.0 x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃下用2.0 x SSC洗涤，为本领域技术人员所熟知，或可以发现于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。例如，洗涤步骤中盐浓度可以选自50℃下约2.0 xSSC的低严格性至50℃下约0.2 x SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可以从低严格性条件的室温(约22℃)增加到高严格性条件的约65℃。温度和盐浓度都可以变化，或者温度或盐浓度中一个变化时，另一个可以维持不变。这种选择性条件容忍很少的，假如有的话，探针和模板或目标链之间的错配。通过杂交检测DNA分子为本领域技术人员所熟知，并且美国专利4,965,188和美国专利5,176,995中的指导是杂交分析方法的示例。

[0028]“一致性”是指两种多核苷酸或蛋白序列之间的相似程度。通过合适的计算机程序可以对两个序列进行对比。CLUSTALWv1.6(Thompson等，Nucl.Acids Res.，22：4673-4680，1994)是广泛使用和接受的用于进行序列对比的计算机程序。碱基或氨基酸匹配的数目除以碱基或氨基酸的总数，并乘以100就得到了百分比一致性。例如，假如两种具有580个碱基对的序列有145个碱基匹配，它们就将有25％的一致性。假如两个对照序列的长度不同，则匹配数目除以两种长度中较短的。例如，假如具有200个和400个氨基酸的蛋白之间有100个氨基酸匹配，就短序列而言它们具有50％的一致性。假如较短序列的长度小于150碱基或50个氨基酸，则匹配数除以150(对碱基而言)或50(对氨基酸而言)，并乘以100就获得了百分比一致性。

[0029]“内含子”是指为基因一部分、不能翻译为蛋白的遗传元件，即使它能转录为RNA，内含子序列将从成熟的信使RNA上“剪去”。

[0030]“分离的”核酸基本与其它通常与此核酸相关的核酸序列分离，例如与该核苷酸天然产生细胞的染色体或染色体外DNA分离。当核苷酸分子包含存在于其它生物体基因组中的转基因或部分转基因时，该核苷酸分子是分离的核苷酸分子。这个术语同样也包括了生物化学纯化的、基本除去污染核酸或其它细胞成分的核酸。术语“转基因”是指转化入细胞或生物体内的任何非天然细胞或生物体的多核苷酸分子。“转基因”也包括通过定向重组或定点突变插入非自然多核苷酸分子修饰的天然植物基因的构成部分。

[0031]“分离的”、“纯化的”、“同源的”多肽。如果多肽与其天然伴随的细胞组分(核酸、脂质、糖和其它多肽)或化学合成的或重组的组分分离，该多肽是分离的。当多肽分子在另一种生物体中转基因表达时，该多肽分子是分离的多肽分子。当样品至少60％(重量)由单体多肽组成，优选为90％或更多，更优选为95％或更多，最优选为超过99％，该多肽是分离的。例如通过蛋白样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，并随后染色聚丙烯酰胺凝胶而显像单一多肽条带；或通过高效液相或其它常规方法，可以显示蛋白纯度或均一性。可通过任何本领域已知的方法，如Guide to Protein Purification，Deutscher编，Meth.Enzymol.185，Academic Press，San Diego，1990；和Scopes，Protein Purification：Principles and Practice，Springer Verlag，New York，1982中所描述的方法纯化蛋白。

[0032]术语“天然的”通常是指自然产生的(“野生型”)多核苷酸或多肽。然而，在本发明的上下文中，已修饰天然的分离的多核苷酸或多肽以提供具有特殊表型的突变多肽，例如在天然草甘磷敏感EPSPS中进行氨基酸置换以提供抗草甘磷的EPSPS。以该方法修饰的多核苷酸对于天然发现的与天然未修饰多核苷酸相连的遗传元件是非天然的。

[0033]使用熟知的方法，技术人员可以容易地生产基因和蛋白的核酸和氨基酸序列变体，提供修饰基因产物。例如，本发明的“变体”DNA分子是在EPSPS编码序列中包含改变的DNA分子，例如包含天然EPSPS编码序列中一个或多个核苷酸被删除、插入和/或置换的变化，从而变体EPSPS基因编码的修饰蛋白保留EPSPS活性并抗草甘磷除草剂。例如，通过标准DNA诱变技术或通过化学合成变体DNA分子或其部分，可以产生变体DNA分子。例如，在Beaucage等，Tetra.Letts.22：1859-1862(1981)和Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.103：3185-(1981)中讨论了化学合成核酸的方法。例如可在自动寡核苷酸合成仪上进行核苷酸的化学合成。这种变体优选不改变核酸的蛋白编码区域的读码框。本发明也包含了蛋白的片断，此片断缺乏全长蛋白至少一个残基，但基本保持蛋白活性。

[0034]当将第一种核酸分子与第二种核酸分子放置为功能相关时，第一种核酸分子“有效连接”至第二种核酸分子。例如，假如启动子影响了蛋白编码序列的转录或表达，启动子有效连接到蛋白编码序列。通常，有效接连的DNA分子是连续的，需要连接两个蛋白编码区域时是在读框内的。

[0035]术语“植物”包含任何高等植物和其子代，包括单子叶植物(例如玉米、稻、小麦、大麦等)、双子叶植物(如大豆、棉花、油菜、西红柿、马铃薯、拟南芥、烟草等)、裸子植物(松树、杉树、雪松等)，并包括植物部分，包括植物的生殖单位(如种子、球茎、块茎、果实、花等)或植物能够从其再生的其它部分或组织。

[0036]“多聚腺苷酸信号”或“polyA信号”是指位于编码区3’端的核苷酸序列，其能使腺苷酸添加到从编码区转录而来的mRNA的3’端上。

[0037]“聚合酶链式反应(PCR)”是指DNA扩增方法，这种方法利用酶技术产生了一段核苷酸序列(扩增子)的多个拷贝。通过在两个扩增引物之间穿梭DNA多聚酶，可以制备DNA分子的拷贝。这种扩增方法基于温度变化至变性、然后再退火扩增引物(DNA引物分子)、随后延伸合成扩增引物两侧之间区域中新DNA链的多次循环。可以通过任何本领域已知的各种核苷酸扩增方法，包括聚合酶链式反应(PCR)，来进行核苷酸的扩增。各种扩增方法为本领域所已知，尤其描述于美国专利4,683,195和4,683,202以及PCR Protocols：AGuide to Methods and Applicatiohs，Innis等编，Academic Press，SanDiego，1990中。PCR扩增方法已经发展到可以扩增最多22kb的基因组DNA和最多42kb的噬菌体DNA(Cheng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5695-5699，1994)。这些方法和其它本领域已知的DNA扩增的方法可以用于本发明的实施。

[0038]术语“启动子”或“启动子区域”是指作为调控元件发挥功能的多核苷酸分子，常发现于编码序列的上游(5’)，通过在适当位置提供RNA聚合酶和/或转录起始所必需的其它因子的识别位点，从而控制信使RNA(mRNA)的产生，控制编码序列的表达。如本文考虑的，启动子或启动子区域包括启动子的变体，它们来源于连接至各种调节序列、随机或受控诱变以及插入或复制增强子序列。本文公开的启动子区域和其生物学功能相同的同等物，当作为合适的重组DNA构建物引入宿主时，负责驱动其控制下的编码序列的转录，这通过产生mRNA的能力得到证实。

[0039]“重组”核苷酸可以通过组合两种核酸序列的分离片断而制备，例如通过化学合成或通过基因工程技术对多核苷酸的分离片断进行操作。术语“重组DNA构建物”是指诸如质粒、粘粒、病毒、自主复制序列、噬菌体、线状或环状单链或双链DNA或RNA核酸序列，其源于任何来源，能进行基因组整合或自主复制，包含一种或多种DNA序列功能有效相连的DNA分子。这种重组DNA构建物能够将5’调控序列或启动子区和所选基因产物的DNA序列引入细胞，这样DNA序列被转录为功能mRNA并被翻译和表达。为了抑制具体目标靶RNA的表达，重组DNA构建物可以构建为能够表达反义RNA或稳定的双链反义RNA。

[0040]“抗性”是指酶在毒素存在时可以行使功能，例如天然存在的抗草甘磷II型EPSP合酶对草甘磷的抗性，或者具有催化活性的修饰EPSPS酶在通常破坏野生型EPSPS催化活性的除草剂浓度下其催化活性不受影响，例如本发明的修饰I型EPSP合酶。抗除草剂的酶也可具有解除除草剂毒性的功能，例如，膦丝菌素乙酰转移酶和草甘磷氧化还原酶。

[0041]“选择标记”是指编码蛋白的多核酸分子，该蛋白赋予的表型易于鉴定包含此核苷酸的细胞。选择标记包括赋予抗生素(如氨苄西林、卡那霉素)抗性、补充营养缺陷(如尿嘧啶、组氨酸、亮氨酸)、或给予视觉可辨认特征(如颜色变化或荧光)的基因。有用的显性选择标记基因包括编码抗生素抗性的基因(如新霉素磷酸转移酶，npt)和编码除草剂抗性的基因(如膦丝菌素乙酰转移酶、II型EPSP合酶、修饰I型EPSP合酶)。例如在Vasil，Cell Culture and Somatic CellGenetics of Plants，Vols. 1-1 11，Laboratory Procedures and TheirApplications Academic Press，New York(1984)中描述了选择抗除草剂转化体的有用策略。

[0042]在本发明中使用的“人工多核苷酸”是依据本发明方法所设计的DNA序列，作为分离的DNA分子产生，用于在宿主细胞中表达蛋白的DNA构建物，或者为了克隆入合适的构建物的目的，或其它本领域技术人员已知用途。对于这些目的可以使用计算机程序，包括但不限于Sequence Analysis Software Package的″BestFit″或″Gap″程序(Genetics Computer Group(GCG)，Inc.，University ofWisconsin Biotechnology Center，Madison，WI 537 11)。人工多核苷酸可以通过一种或多种本领域已知的方法制备，包括但不限于重叠PCR。本文所使用的人工多核苷酸是非天然存在的，能够从本质上与其它编码相同或几乎相同蛋白的多核苷酸区分。

植物中修饰的I型EPSPS编码序列的表达

[0043]制备包含在植物中表达EPSPS所必须的各种遗传元件的DNA构建物。“DNA构建物”是指有效相互连接形成重组DNA分子的异源遗传元件，并且可包含在宿主细胞中表达DNA多核苷酸分子的遗传元件和在宿主细胞中维持构建物的遗传元件。植物表达盒包含了可操作连接的遗传元件，当此遗传元件被转移入植物细胞时，提供了想要的基因产物的表达。“植物表达盒”是指包含了调控元件的嵌合DNA段，此调控元件有效连接以在植物中表达转基因产物。启动子、前导序列、内含子、转运肽编码多核苷酸、3’转录终止区都是遗传元件，可被植物分子生物学领域的技术人员有效连接以提供本发明抗草甘磷的I型EPSPS的期望表达水平或功能。DNA构建物可以包含一个或多个表达本发明DNA分子或其它农作物基因工程中有用DNA分子的植物表达盒。

[0044]各种在植物组织如叶、茎、根和块茎中有具有特异性活性的启动子可以用来表达本发明的EPSPS多核苷酸分子。块茎-特异性启动子的实例包括但不限于I型和II型patatin启动子(Bevan等，EMBO J.8：1899-1906，1986；Koster-Topfer等，Mol Gen Genet.219：390-396，1989；Mignery等，Gene.62：27-44，1988；Jefferson等，PlantMol.Biol.14：995-1006，1990)，其为马铃薯块茎ADPGPP基因启动子，大亚基和小亚基；蔗糖合酶启动子(Salanoubat and Belliard，Gene.60：47-56，1987；Salanoubat and Belliard，Gene 84：181-185，1989)；以及用于包括22kd蛋白复合物和蛋白酶抑制因子的主要根茎蛋白的启动子(Hannapel，Plant Physiol.101：703-704，1993)。叶-特异性启动子的实例包括但不限于核酮糖二磷酸羧化酶(RBCS或RuBISCO)启动子(参见例如Matsuoka等，Plant J.6：311-319，1994)；集光叶绿体a/b结合蛋白基因启动子(参见例如Shiina等，Plant Physiol.115：477-483，1997；Casal等，Plant Physiol.116：1533-1538，1998)；拟南芥myb相关基因启动子(Atmyb5)(Li等，FEBS Lett.379：117-121，1996)。根-特异性启动子的实例包括但不限于酸性壳多糖酶基因启动子(Samac等，PlantMol.Biol.25：587-596，1994)；已被鉴定的CaMV35S启动子的根特异性亚域(Lam等，Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)86：7890-7894，1989)；在根中显示出高活性的来源于发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)的ORF13启动子(Hansen等，Mol.Gen.Genet.254：337-343(1997)；烟草根-特异性基因TobRB7的启动子(Yamamoto等，Plant Cell 3：371-382，1991)；和Conkling等报道的根细胞特异性启动子(Conkling等，PlantPhysiol.93：1203-1211，1990)。

[0045]另外一类有用的植物组织-特异性启动子是分生组织(根尖和苗端)启动子。例如，可使用“SHOOTMERISTEMLESS”和“SCARECROW”启动子，它们在正在发育的芽或根顶端分生组织中有活性(Di Laurenzio等，Cell 86：423-433，1996；Long，Nature 379：66-69，1996)。有用启动子的另一个实例是控制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶HMG2基因表达的启动子，上述的酶表达限于分生组织和花(气孔分泌区、成熟的花粉粒、雌蕊脉管组织和受精卵)组织(参见例如Enjuto等，Plant Cell.7：517-527，1995)。有用启动子的再另一个实例是控制来源于玉米和其它物种、显示分生组织特异性表达的knl相关基因表达的启动子(例如见Granger等，Plant Mol.Biol.31：373-378，1996；Kerstetter等，Plant Cell 6：1877-1887，1994；Hake等，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.350：45-51，1995)。分生组织启动子的另一个实例是拟南芥KNAT1启动子。在苗端中，KNAT1的转录主要集中在芽顶端组织中；在芽分生组织中KNAT1的表达在花转移时期降低，并且限于花序柄皮质(例如见Lincoln等，Plant Cell 6：1859-1876，1994)。

[0046]合适的种子-特异性启动子可以来源于以下基因：来源于玉米的MAC1(Sheridan等，Genetics 142：1009-1020，1996)；来源于玉米的Cat3(GenBank No.L05934，Abler等，Plant Mol.Biol.22：10131-1038，1993)；来源于拟南芥的viviparous-1(Genbank No.U93215)；来源于拟南芥的Atimycl(Urao等，Plant Mol.Biol.32：571-57，1996；Conceicao等，Plant 5：493-505，1994)；来源于甘蓝型油菜(Brassica napus)的napA(GenBank No.J02798)；来源于甘蓝型油菜的napin基因家族(Sjodahl等，Planta 197：264-271，1995)和其它(Chen等，Proc.Natl.AcadSci.83：8560-8564，1986)。

[0047]同样可以使用BEL1基因的卵-特异性启动子(Reiser等，Cell 83：735-742，1995，GenBank No.U39944；Ray等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5761-5765，1994)。卵和中央细胞特异性MEA(FIS1)和FIS2启动子也是有用的生殖组织特异性启动子(Luo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97：10637-10642，2000；Vielle-Calzada等，Genes Dev.13：2971-2982，1999)。

[0048]在玉米中已经鉴定了玉米花粉特异性启动子(Guerrero等，Mol.Gen.Genet.224：161-168，1990)。其它在花粉中特异性表达的基因也得到了描述(参见例如Wakeley等，Plant Mol.Biol.37：187-192，1998；Ficker等，Mol.Gen.Genet.257：132-142，1998；Kulikauskas等，Plant Mol.Biol.34：809-814，1997；Treacy等，Plant Mol.Biol.34：603-611，1997)。

[0049]现已认识到，其它可以利用的启动子描述于例如美国专利5,378,619、5,391,725、5,428,147、5,447,858、5,608,144、5,608,144、5,614,399、5,633,441、5,633,435和4,633,436中。更认识到，并不能完全定义调节序列的精确范围。不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

[0050]翻译前导序列是指位于基因启动子和编码序列之间的DNA分子。翻译前导序列存在于完全加工mRNA中翻译起始序列的上游。翻译前导序列可以影响初级转录物的加工为mRNA、mRNA稳定和翻译效率。翻译前导序列的实例包括玉米和牵牛花热休克蛋白前导序列、植物病毒外壳蛋白前导序列、植物rubisco基因前导序列等(Turner and Foster，Molecular Biotechnology 3：225，1995)。

[0051]“3’-非翻译序列”是指位于结构多核苷酸序列下游的DNA序列，包括编码多腺苷酸化的序列和其它能影响mRNA加工和基因表达的调节信号。多腺苷酸化序列在植物中的功能是使多腺苷酸添加到mRNA前体的3’末端上。多腺苷酸化序列可以来源于天然基因、来源于各种植物基因或来源于T-DNA。多腺苷酸序列的一个实例是胭脂氨酸合酶3’序列(nos 3’；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4803-4807，1983)。不同3’非翻译序列的使用由Ingelbrecht等，PlantCell1：671-680，1989示例。

[0052]本文所使用的重组DNA技术实验室操作为本领域的技术人员所熟知并且经常使用。使用标准技术进行克隆、DNA和RNA分离、扩增和纯化。通常根据厂家说明进行涉及DNA连接酶、DNA多聚酶、限制性内切酶等的酶促反应。这些技术和各种其它技术通常要依据Sambrook等(1989)执行。

[0053]通过各种本领域技术人员所熟知的常规转化技术，可以将本发明DNA构建物引入需要的植物宿主的基因组。“转化”是指将外源多核酸分子(例如DNA构建物或重组多核酸分子)引入细胞或原生质体的过程，并且该外源多核苷酸分子整合入宿主细胞基因组或细胞器基因组(例如叶绿体或线粒体)或能够进行自主复制。“转化的”或“转基因的”是指含有外源多核苷酸如DNA载体或重组多核酸分子的细胞、组织、器官或生物体。“转化的”或“转基因的”细胞或生物体也包括细胞或生物体的子代和从育种程序中产生的子代，此育种程序在杂交中运用这种“转基因”植物作为亲代并且子代展示出由于存在外源多核苷酸分子而改变的表型。

[0054]植物细胞或组织的转化方法包括但不限于土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化方法和生物射弹或基因枪介导的转化方法。用于土壤杆菌介导转化的适合植物转化载体包括来源于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)瘤诱导(Ti)质粒的成分，例如右缘(RB)区和左缘(LB)区，以及其它由Herrera-Estrella等，Nature 303：209(1983)；Bevan，Nucleic Acids Res.12：8711-8721(1984)；Klee等，Bio-Technology 3(7)：637-642(1985)公开的成分。除了来源于土壤杆菌Ti或根诱导(Ri)质粒的植物转化载体之外，还可以使用其它方法将本发明DNA构建物插入到植物细胞中。这些方法可以包括但不限于，例如使用脂质体、电穿孔、增加游离DNA摄取的化学品、通过微粒轰击增加游离DNA的传递和使用病毒或花粉的转化。

[0055]DNA构建物可以制备为整合了本发明I型EPSPS变体编码序列，以用于从宿主植物细胞质体直接指导序列表达。适合此目的和方法的这种构建物的实例为本领域所已知，并且通常描述于例如Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：8526-8530，(1990)，Svab等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：913-917(1993)和美国专利5,693,507。应注意的是，本发明I型EPSPS变体的质体转化和表达将给植物细胞提供草甘磷抗性。

[0056]适合于使用电穿孔或基因枪介导的转化，将编码本发明多肽的多核酸引入单子叶植物的质粒表达载体由以下部分组成：组成型或组织特异性启动子；提供了剪接位点以利于基因表达的内含子，如玉米Hsp 70内含子(美国专利5,593,874)；3’多腺苷酸序列，如胭脂氨酸合酶3’序列(T-nos 3′；Fraley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA80：4803-4807，1983)。该表达盒可以装配在适合生产大量DNA的高拷贝复制子上。

[0057]当获得了足够的包含编码本发明多肽的外源多核酸的细胞时，就可以培养细胞，然后再生成整个植物。“再生”是指从植物细胞(例如植物原生质体或外植体)生长到植物的过程。这种再生技术依赖于操作组织培养生长培养基中某些植物激素，典型依赖于和所需核苷酸序列一起引入的杀虫剂和/或除草剂标记。选择再生步骤的方法并不重要，对以下宿主可获得合适的方案：豆科(例如苜蓿、大豆、三叶草)、伞形科(胡萝卜、芹菜、欧洲防风)、十字花科(例如卷心菜、萝卜、油菜/油菜籽)、葫芦科(例如甜瓜和黄瓜)、禾本科(例如小麦、大麦、稻、玉米)、茄科(例如马铃薯、烟草、西红柿、胡椒)、各种花卉作物如向日葵、坚果树如杏仁、腰果、核桃和美洲山核桃。参见例如Ammirato等，Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species.Macmillan Publ.Co.(1984)；Shimamoto等，Nature 338：274-276(1989)；Fromm，UCLA Symposium on Molecular Strategies for CropImprovement，April 16-22，1990.Keystone，CO(1990)；Vasil等，Bio/Technology 8：429-434(1990)；Vasil等，Bio/Technology 10：667-674(1992)；Hayashimoto，Plant Physiol.93：857-863(1990)；和Datta等，Bio-technology 8：736-740(1990)。这种再生技术通常描述于Klee等，Ann.Rev.Plant Phys.38：467-486(1987)中。

[0058]包含外源目的多肽编码多核酸分子的转基因植物的发育和再生为本领域所熟知。如同上面所讨论的，再生的植物优选自花授粉以提供纯合的转基因植物。否则，从再生植物获得的花粉将与农艺学重要株系的种子生长植物进行杂交。相反，这些重要株系的植物的花粉用来对再生植物授粉。

[0059]可通过本发明的实施增加草甘磷抗性的植物包括但不限于刺槐、苜蓿、莳萝、苹果、杏树、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、油梨、香蕉、大麦、豆子、黑莓、蓝莓、绿花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、油菜、香瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、芹菜、樱桃、芫荽叶、柑橘、金钱橘、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、茅菜、桉树、茴香、无花果、森林树、葫芦、葡萄柚、蜜露、豆薯、猕猴桃、莴苣、韭菜、柠檬、酸橙、火炬松、芒果、甜瓜、蘑菇、坚果、燕麦、秋葵、洋葱、橙、观赏植物、木瓜、荷兰芹、豌豆、桃子、花生、梨、胡椒、柿子、松树、菠萝、车前草、洋李、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、温柏、辐射松、紫叶菊苣、萝卜、树莓、稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、红薯、路路通、红橘、茶、烟草、西红柿、草皮(turf)、藤本植物、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。

[0060]提供随后实例以更好的阐明本发明的实施，并且不应当以任何方式解释为限制本发明的范围。本领域技术人员应认识到，可对本文所述的方法和基因进行各种修饰、插入、置换、截短等等，而不脱离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1

I型EPSPS的定向诱变

[0061]编码I型EPSPS的DNA分子的诱变定向在I型EPSPS多肽序列-G-T-X₁-X₂-R-P-(SEQ ID NO：1)所定义的蛋白区域，其中X₁和X₂为任何氨基酸。本文描述的本发明提供了编码I型EPSPS的诱变，其中诱变导致在涉及酶底物和草甘磷分子结合的该I型EPSPS蛋白区域中的多肽序列-G-X₄-X₁-X₂-R-X₃-(SEQ ID NO：2)。SEQ IDNO：1中导致抗草甘磷I型EPSPS的氨基酸置换包括在X₄用氨基酸异亮氨酸(I)或亮氨酸(L)替换天然的苏氨酸(T)，在X₃用苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸或异亮氨酸替换天然的脯氨酸(P)。氨基酸102和106位根据图1所示的玉米EPSPS多肽序列指定，然而其它植物的I型EPSPS编码序列(图2)，例如牵牛花和大豆，可以用作定向诱变的模板，而保留相应苏氨酸和脯氨酸的相对位置；然而，在EPSPS多肽序列中也可以发生氨基酸位点数的轻微不同，因为不同来源的成熟EPSPSs的起始点发生了变化(美国专利No：5,866,775，图1)。这些变化为本领域技术人员所了解，并且在本发明的范围之内。同样的，原核生物I型EPSPS DNA编码序列如大肠杆菌(图2)的定向诱变可以使用诱变引物来进行，这些诱变引物设计为和这些DNA分子杂交产生本文所描述的EPSPS变体-G-X₄-X₁-X₂-R-X₃-(SEQID NO：2)。

[0062]利用植物EPSPS DNA编码序列模板作为I型EPSPS的实例，进行突变。通过DNA序列中编码氨基酸的密码子(表1)的替换，DNA编码序列的突变导致变体EPSPS蛋白分子。与野生型蛋白序列相比，具有两个氨基酸置换的变体蛋白序列被称为双变体，一个氨基酸置换的被称为单变体。所有这些变体可以根据厂家说明使用基于PCR的QuickChange^TM定向诱变试剂盒(Stratagene，La Jolla，CA，Cat.No.200518)制备。设计每种诱变引物的DNA序列，然后从Invitrogen Corp.，Custom Primers(Carlsbad，CA)定购。使用pMON70461(图3)作为模板，诱变编码EPSPS酶的玉米野生型DNA分子(SEQ IDNO：3)。pMON70461包含未修饰野生型玉米EPSPS编码序列。先前已知的T102I、P106S变体(TIPS)可以使用图4A所示的TIPSMut-1-U(SEQ ID NO：4)和TIPSMut-2-L(SEQ ID NO：5)引物对，通过PCR介导诱变方法来产生，包含在pMON70462质粒中。通过玉米野生型EPSPS DNA编码序列的诱变产生单EPSPS变体，作为对照测量双变体EPSPS的效率。下面的单EPSPS变体可以使用PCR诱变产生：T102I变体(引物I1-U(SEQ ID NO：6)和I2-L(SEQ ID NO：7)，pMON58455)、P106T变体(引物mEmut-9-U(SEQ ID NO：8)和mEmut-10-L(SEQ ID NO：9)，pMON70467，图9)、P106S变体(引物mEmut-7-U(SEQ ID NO：10)和mEmut-8-L(SEQ ID NO：11)，pMON70466)，使用包含在pMON70461中的未修饰野生型玉米EPSPS编码序列作为定向诱变的模板，产生P106L变体(引物H1-U(SEQ IDNO：12)和H2-L(SEQ ID NO：13)，pMON58451)。

[0063]本发明的双变体使用pMON58452(图5)作为模板制备。该pMON58452 EPSPS基因模板包含玉米EPSPS双变体T102I、P106T(TIPT)，此变体通过用诱变引物mEmut-9-U和mEmut-10-L诱变pMON70467构建。设计各种诱变引物序列，然后由Invitrogen Corp.，Custom Primers合成，并且在PCR中组合使用产生变体EPSPS编码序列。按照下列方法在50μl反应物中进行PCR：dH₂O 38μl；2 mMdNTP 1μl；10X缓冲液5μl；pMON58452 1μl(10 ng)；引物-U 2μl；引物-L 2μl；pfu Turbo酶1μl。在MJ Research PTC-200热循环仪上使用以下程序进行PCR：步骤1-94℃维持30秒；步骤2-94℃维持30秒；步骤3-55℃维持1分钟；步骤4-68℃维持14分钟；步骤5-回到步骤2，16次；步骤6-结束。PCR结束时，向每50μl PCR反应液中加入1μl限制性内切酶DpnI，混合物于37℃下温育1小时。pMON58452的脯氨酸(106)密码子在随后的步骤中被置换，产生了包含以下的其它变体：TIPG(引物P106G-U，SEQ ID NO：14和-L，SEQ ID NO：15)、TIPA(引物P106A-U，SEQ ID NO：16和-L，SEQ ID NO：17)、TIPV(引物P106V-U，SEQ ID NO：18和-L，SEQ ID NO：19)、TIPL(引物P106L-U，SEQ ID NO：20和-L，SEQ ID NO：21)、TIPI(引物P106I-U，SEQ ID NO：22和-L，SEQ ID NO：23)、TIPM(引物P106M-U，SEQ IDNO：24和-L，SEQ ID NO：25)和TIPC(引物P106C-U，SEQ ID NO：26和-L，SEQ ID NO：27)。诱变引物的DNA序列如图4A和4B中所示。使用上述的PCR条件，可以产生编码EPSPS蛋白基因的双变体。

[0064]在PCR结束时，向每50μl PCR反应液中加入1μl限制性内切酶DpnI，混合物于37℃下温育1小时。DpnI为甲基化和半甲基化特异性限制性内切酶，只能裂解包含至少一条野生型甲基化链的双链DNA质粒，而突变的质粒保持完整。经过DpnI处理之后，1μl处理过的反应混合物按照厂家说明转化感受态大肠杆菌菌株XL1-blue(Stratagene Corp，La Jolla，CA)。转化细胞置于含有终浓度0.1mg/mL羧苄青霉素的培养皿上。然后将培养皿置于37℃培养过夜。第二天挑出单菌落，接种于含有0.1mg/mL羧苄青霉素的3mL液体培养基。液体培养基置于37℃、250rpm搅拌下培养过夜。使用Qiagen′sminiprep Kit(Qiagen Corp.Cat.No.27160)从1mL液体培养物中制备质粒DNA。在50μl dH₂O中洗脱质粒。通过DNA序列分析(ABIPrism^TM 377，PE Biosystems，Foster City，CA和DNASTAR序列分析软件，DNASTAR Inc.，Madison，WI)测序各种诱变的三个独立菌落的整个编码区，证实包含希望的突变。

[0065]其它植物I型EPSPS编码序列被修饰为包含TIPA变体。分离拟南芥(Columbia)EPSPS1的EPSPS编码序列和莴苣(Lactucasativa)EPSPS编码序列用于诱变。使用RT-PCR分离AtEPSPS1和莴苣EPSPS成熟蛋白的编码序列。所有引物从Invitrogen定购。拟南芥和莴苣的叶组织在液氮中用研钵和研杵碾磨成粉末。使用Qiagene′sRNeasy mini kit(cat.#74904)，使用10mg叶粉末分离总RNA，将RNA洗入50μl水中。在50μl反应液中使用一步RT-PCR试剂盒(Invitrogen#10928-034)进行RT-PCR反应，反应液中包含：dH₂O 24μl；反应缓冲液50μl；总RNA 20μl；AtEPSPS-F引物(SEQ ID NO：28)(10μM)1μl；AtEPSPS-R(SEQ IDNO：29)(10μM)1μl；Taq 1μl。在MJ ResearchPTC-200热循环仪上使用以下程序进行RT-PCR：步骤1-40℃维持30秒；步骤2-94℃维持2分钟；步骤3-94℃维持20秒；步骤4-65℃维持30秒；步骤5-68℃维持1分钟；步骤6-回到步骤3，30次；步骤7-结束。两个PCR都在1％琼脂糖电泳凝胶上产生了约1.3kb碱基的条带。用上述方法使用引物LsEPSPS-F(SEQ ID NO：30)和LsEPSPS-R(SEQ ID NO：31)可以分离莴苣EPSPS编码序列。将RT-PCR产物克隆入PCR-II载体(Invitrogen Corp.)，并且对DNA分子进行测序。

[0066]使用基于PCR的QuickChange^TM定点诱变试剂盒(Stratagene Cat.No.200518)产生拟南芥和莴苣EPSPS TIPA变体，诱变引物AtEPSPS-TIPA-F(SEQ ID NO：32)和AtEPSPS-TIPA-R(SEQ IDNO：33)用于拟南芥EPSPS编码序列突变，LsEPSPS-TIPA-F(SEQ IDNO：34)和LsEPSPS-TIPA-R(SEQ ID NO：35)用于莴苣EPSPS编码序列突变，PCR条件如上所述。进行另两个定向诱变反应，以在5’末端改造出限制性内切酶位点Ndel，并除去莴苣EPSPS编码序列中内部的Ndel位点。然后用Ndel和Xhol消化拟南芥和莴苣EPSPS TIPA变体的DNA片断，并且克隆入pET19载体。编码变体拟南芥EPSPS和变体莴苣EPSPS的DNA分子各自如SEQ ID NO：36和SEQ IDNO：37中所示。在图11所示的pMON81548(LsTIPA变体，美国专利6,660,911的启动子)和图12所示的pMON58491(AtTIPA变体)中图解了用这些变体EPSPS编码序列构建的植物和细菌DNA构建物的实例。任何本发明变体EPSPS编码序列都可以通过替代现有编码序列插入到植物表达盒中，例如包含在pMON81519或pMON81548中的序列。

实施例2

EPSPS的纯化和酶的分析

[0067]将野生型和变体EPSPS编码序列克隆入pET-19b碱基载体(Novagen，Madison，WI)。如此创造的植物(玉米)I型EPSPS变体命名为pMON质粒成员(表2)。使用pET system manual，9th版(Novagen)中概述的方案或通过以下的方法，从大肠杆菌宿主中纯化变体EPSPS蛋白。单菌落或几毫升甘油原液接种入含有0.1mg/mL羧苄青霉素抗生素的4ml LB培养基。培养物37℃振荡培养4小时。4℃储存过夜。第二天早上将1mL过夜的培养物接种于含有0.1mg/mL羧苄青霉素的100mL新鲜LB培养基。培养物37℃下振荡培养4-5小时，然后置于4℃维持5-10分钟。然后用IPTG(最终浓度1mM)诱导培养物，30℃下振荡培养4小时或20℃下振荡培养过夜。4℃下7000rpm离心20分钟收集细胞。除去上清，在-70℃下冷冻细胞，直到进一步使用。在BugBuster试剂(Novagen)中重悬细胞沉淀，每克细胞使用5mL试剂，抽提蛋白。向细胞悬浮液中加入非特异性核酸酶(benzonase)(125单位)，然后室温下将细胞悬液在混悬器上混悬20分钟。室温下10,000rpm离心20分钟去除细胞碎片。将上清通过0.4μm注射器末端过滤器，并且转入新的试管。含有1.25mL His-Bind树脂的预填柱用10mL5mM咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris-HCL pH 7.9(1X结合缓冲液)平衡。然后将制备的细胞提取物载入柱。待细胞提取物全部排出之后，用10mL 1X结合缓冲液洗柱，再用10mL 60mM咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris-HCL pH 7.9(1X洗涤缓冲液)洗柱。用5mL 1M咪唑、0.5M NaCl和20mM Tris-HCL pH 7.9(1X洗脱缓冲液)洗脱蛋白。最后在将蛋白在50mM Tris-HCL pH 6.8缓冲液中透析。得到的蛋白溶液用Ultrafree离心装置(Biomax-10K MW cutoff，Millipore Corp，MA)浓缩至～0.1-0.4mL。蛋白在50mM Tris pH 6.8、30％甘油中稀释为10mg/mL和1mg/mL，保存在-20℃下。使用Bio-Rad蛋白测定(Bio-RadLaboratories，CA)测定蛋白浓度。牛血清白蛋白用来制作1-5μg标准曲线。将样品(10μL)加到96孔板，与200μLBio-Rad蛋白测定试剂(1份干试剂浓缩剂：4份水)混和。约5分钟后使用spectraMAX 250读板器(Molecular Devices Corporation，Sunnyvale，CA)在OD₅₉₅下对样品进行读数并与标准曲线比较。

[0068]EPSPS酶测定包含50mM K⁺-HEPES pH7.0和1mM莽草酸-3-磷酸(测定混合物)。在50μL的总体积中，通过温育测定混合物(30μL)和酶(10μL)，并改变[¹⁴C]PEP的浓度，可以测定K_m-PEP。不同时间之后，用50μL90％乙醇/0.1M乙酸pH 4.5(淬灭溶液)淬灭反应。在14000rpm下离心样品，通过HPLC分析上清测定¹⁴C-EPSP的产生。使用AX100弱阴离子交换HPLC柱(4.6×250mm，SynChropak)，用0.26M等度磷酸钾洗脱液，pH 6.5，以1mL/分钟与3 mL/分钟Ultima-Flo AP混合物混合(Packard)，通过HPLC放射分析法测定¹⁴C-PEP向¹⁴C-EPSP转化的百分率。通过每单位时间转化分数乘以底物的起始浓度计算初速度。

[0069]通过与含有和不含有草甘磷和14C-PEP(10uL，2.6mM)的测定混合液(30μL)温育，测定抑制常数。加入酶(10μL)启动反应。2分钟后用淬灭溶液淬灭测定。样品在14000rpm下离心，如上所示测定¹⁴C-PEP向¹⁴C-EPSP的转化。使用GraFit软件(Erithacus Software，UK)分析稳定状态和IC₅₀数据。使用以下算法从IC₅₀值计算K_i值：Ki＝[IC]₅₀/(1+[S]/Km)。测定结果发现¹⁴C-PEP向¹⁴C-EPSP转变≤30％。上述测定中的牛血清白蛋白(BSA)和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)从Sigma获得。磷酸烯醇式[1-¹⁴C]丙酮酸(29 mCi/mmol)从Amersham Corp.(Piscataway，NJ)获得。

[0070]克隆入pET-19b以及蛋白从其表达和测定的玉米EPSPS变体包括双变体TIPS、TIPT、TIPG、TIPC、TIPA、TIPV、TIPM、TIPL和TIPI；单变体T102I、P106S、P106T和P106L(表2)。纯化酶并测定对PEP的表观K_m(PEP-K_m)和草甘磷的抑制(K_i)。TIPS变体是熟知的，目前在商品Roundup Ready^玉米产品GA21(美国专利6,040,497)中，其动力学参数作为足以为转基因植物提供草甘磷抗性的抗草甘磷I型EPSPS酶的基线值。鉴定所有变体，其动力学参数如表2中所示。在这些变体间观察到本质的不同。令人惊讶的是，结果显示两种新变体，TIPA和TIPT，比TIPS变体更抗草甘磷，并且经证明具有相似的K_m-PEP。当这些EPSPS酶双变体适当表达于转基因植物中时，将提供了增强的草甘磷抗性。TIPG变体具有与野生型酶(WT)相似的K_m-PEP，但是只有38.6μM的K_i，并没有超过TIPS，但是当适当表达时该K_i应当足以在转基因植物中提供草甘磷抗性。变体TIPC和TIPI表现出了高水平的草甘磷抗性，但是K_m-PEP分别比野生型酶高1.7倍和2.2倍。尽管就K_m-PEP来说，TIPC和TIPI比野生型酶效率要低，但是它们表现出了高水平的草甘磷抗性，当作为转基因在植物细胞中过度表达时，这些酶应当足够提供草甘磷抗性。包括TIPV、TIPM、TIPL的其它双变体表现出很高水平的草甘磷抗性，但是对PEP具有显著更高的K_m，因此不具有足够的底物结合活性以为转基因植物提供有用的EPSPS酶活。其它双变体TIPD和TIPN对PEP的K_m分别为355和356，不能测定对草甘磷的K_i，因为这些变体的底物结合活性太低以致于没有有效的EPSPS活性。为比较目的，从土壤杆菌CP4(CP4 EPSPS)菌株中分离了天然存在的II类抗草甘磷EPSPS，其酶动力学从pMON21104(RecA启动子/G10前导序列/CP4 EPSPS/T7终止子)中表达，并且在与玉米变体EPSPS相同的条件下测定，证明具有14.4μM的K_m-PEP，对草甘磷的K_i为5100μM。

表2玉米EPSPS变体的稳态参数

pMON#EPSPS变体	K_m-PEP(μM)	K_i-glyp(μM)
pMON#EPSPS变体	K_m-PEP(μM)	K_i-glyp(μM)	pMON70461 WT	27±4	0.50±0.06
PMON70462 TIPS	10.6±1.6	58.0±14	pMON70461 WT	27±4	0.50±0.06
PMON70462 TIPS	10.6±1.6	58.0±14	PMON58452 TIPT	11.2±1.8	101.3±12.7
PMON42480 TIPG	23.0±37	38.6±1.7	PMON58452 TIPT	11.2±1.8	101.3±12.7
PMON42480 TIPG	23.0±37	38.6±1.7	PMON42485 TIPC	47.0±4.0	818.2±74.4
PMON42481 TIPA	10.2±1.1	148.3±18.3	PMON42485 TIPC	47.0±4.0	818.2±74.4
PMON42481 TIPA	10.2±1.1	148.3±18.3	PMON42486 TIPI	60.3±2.8	2500±900
pMON42482 TIPV	109.3±12.9	1600±400	PMON42486 TIPI	60.3±2.8	2500±900
pMON42482 TIPV	109.3±12.9	1600±400	pMON42484 TIPM	143.3±12.6	37200±1500
pMON42483 TIPL	99.5±8.9	2100±100	pMON42484 TIPM	143.3±12.6	37200±1500
pMON42483 TIPL	99.5±8.9	2100±100	pMON58455 T102I	233.0±25.5	148.6±12.4
pMON70466 P106S	17.1±2.8	1.0±0.1	pMON58455 T102I	233.0±25.5	148.6±12.4
pMON70466 P106S	17.1±2.8	1.0±0.1	pMON70467 P106T	24.6±4.4	4.0±0.6
pMON58451 P106L	86.7±5.7	28.6±0.1	pMON70467 P106T	24.6±4.4	4.0±0.6
pMON58451 P106L	86.7±5.7	28.6±0.1	pMON21104 CP4 EPSPS	14.4±2.4	5100±0.1

实施例3

[0071]玉米双变体ZmTIPT(SEQ ID NO：38)和ZmTIPA(SEQ IDNO：39)作为CTP翻译融合体，分别制备入植物表达DNA构建物pMON70472(图7)和pMON70475(图8)。用SphI/NotI和EcoRI消化pMON30167(图6)，凝胶纯化pMON30167的NotI/EcoRI骨架DNA片段和SphI/NotI DNA片段(稻肌动蛋白P-OsActl和内含子I-Os.Actl，美国专利5,641,876)。通过用DNA引物分子ZmAroA-1(SEQ ID NO：40)和ZmAroA-2(SEQ ID NO：41)，在末端中掺入SphI和EcoRI核酸内切酶位点，可以从pMON58452中分离玉米EPSPS-TIPT DNA分子。用SphI和EcoRI消化并凝胶纯化扩增的mEPSPS-TIPT DNA片段。将两个pMON30167片段和修饰的玉米EPSPS-TIPT DNA片段进行三重连接。按照厂家说明将连接的质粒转化入大肠杆菌菌株XL1-blue，并且筛选带有正确质粒的菌落。通过使用包含在pMON70472(图7)中的DNA引物分子ZmAroA-3(SEQ ID NO：42)和ZmAroA-4(SEQID NO：43)，按照厂家说明使用Stratagene QuikChange试剂盒进行诱变，可以恢复成熟玉米EPSPS N-末端(应当时丙氨酸而不是甲硫氨酸)。

实施例4

[0072]通过土壤杆菌属介导的方法，将含有稻肌动蛋白启动子操控下的TIPT变体(pMON70472，图7)的DNA构建物转化入玉米植物细胞(LH198 x Hill)中。例如，使用含有本发明二元DNA构建物的无害土壤杆菌属菌株C58。通过三亲交配方法将DNA构建物转入土壤杆菌(Ditta等，Proc.Natl.Acad.Sci.77：7347-7351，1980)。从甘油原液或新鲜划线平皿开始液体培养土壤杆菌，并且在pH 7.0、含有适当抗生素的LB液体培养基中26℃-28℃振荡培养(大约150rpm)过夜至对数生长中期。将土壤杆菌细胞重悬于接种培养基(液体CM4C)中，调整密度在OD₆₆₀为1。新鲜分离的II型未成熟HiIIxLH198和Hill玉米胚芽与包含构建物的土壤杆菌一起接种，并在23℃下黑暗中共培养几天。然后将胚芽转入延迟培养基，在28℃下培养几天或更多天。所有后继培养物都维持在该温度。将胚芽转入含有羧苄青霉素500/0.5mM草甘磷的第一选择培养基。两个星期后，将残存的组织转入含有羧苄青霉素500/1.0mM草甘磷的第二选择培养基。每2星期再次培养残存的愈伤组织，直到可以鉴定事件。在1.0mM草甘磷上大概需要次培养3次。一旦鉴定了事件，累积组织至再生。小植株(事件)转入培养瓶中的MSOD培养基，维持2星期。通过产生事件的数量除以接种胚芽的数量测定转化率。然后将具有根的植物转入土壤。单子叶植物转化方法本领域的技术人员可以修改这些方法以提供基本相同的含有本发明DNA组分的转基因单子叶植物，或者使用其它已知能提供转基因单子叶植物的方法，如基因枪。

[0073]分子分析结果和用含ZmTIPT的DNA构建物转化的再生玉米事件的草甘磷选择结果如表3中所示。分析事件的单拷贝插入玉米基因组、生长力和雄性能育性。使用Taqman分析(ABI，FosterCity，CA)测定含有pMON70472(TIPT)植物表达盒的13个转基因事件，确定8个(61％)是单拷贝插入玉米基因组。在玉米发育V4阶段，用RoundupUltra 32 oz/acr叶敷处理事件，然后约在V7阶段再用RoundupUltra 64 oz/acre叶敷处理。记录对草甘磷具有生长(glypT)和生殖(能育的)抗性的处理植物。，8个单拷贝事件中的4个(50％)没有显示出由于在V4阶段使用草甘磷而导致的生长力损伤(％V4glypT)。在大约V7阶段，使用RoundupUltra 64 oz/acre叶敷处理，记录对草甘磷具有生长抗性和雄性能育性(％V7glypT/能育性)的事件。所有单拷贝的、并且在V4对草甘磷具有生长抗性的4个事件100％(4/4)在V7处理后也具有生长抗性和完全的雄性能育性。与商业标准抗草甘磷的EPSPS(CP4 EPSPS)相比，ZmTIPT变体的表现令人惊讶的好。含有I型EPSPS TIPT变体的DNA构建物为提供了对包含草甘磷的除草剂具有生长抗性和生殖抗性的植物。

表3包含TIPT EPSPS变体的玉米事件的抗草甘磷处理结果

DNA构建物	#事件数	单拷贝	％V4 glypT	V7 glypT/能育性
DNA构建物	#事件数	单拷贝	％V4 glypT	V7 glypT/能育性	pMON70472(ZmTIPT)pMON30167(CP4 EPSPS)	1324	61％(8/13)33％(8/24)	50％(4/8)62％(5/8)	100％(4/4)100％(5/5)

实施例5

[0074]将ZmTIPT变体构建入适合双子叶植物表达的植物表达构建物中。DNA构建物命名为pMON81519，如图10中的图解。通过前述三亲交配方法将DNA构建物和对照构建物转入土壤杆菌。转化的土壤杆菌用来将植物表达盒转入拟南芥和烟草细胞。

[0075]基本按照Bechtold N等，CR Acad Sci Paris Sciences di lavie/life sciences 316：1194-1199，(1993)所述的土壤杆菌介导方法，转化拟南芥胚。通过生长于含有10ml LB和抗生素培养基的培养管中，将含有DNA构建物的土壤杆菌菌株ABI制备为接种物。离心土壤杆菌接种物，在25ml含有0.44nM苄氨基嘌呤(每升10μl 1.0mg/LDMSO储存液)和0.22％Silwet L-77的渗透培养基((MS基本盐0.5％、Gamborg′s B-5维生素1％、蔗糖5％、MES 0.5g/L、pH 5.7)中重悬至OD₆₀₀为0.6。

[0076]通过将含有植物的盆倒转入接种物中，在真空箱中用土壤杆菌接种物真空浸润成熟的开花拟南芥植物。密封真空箱，施加真空数分钟，突然释放真空，吸于盆除去多余的接种物，用塑料圆顶覆盖盆，将盆在21℃、16小时光照和70％湿度下置于生长室。待接种物真空浸润大约2星期后，用Lawson 511授粉包覆盖每一株植物。浸润约4星期后，阻止植物获得水以允许干燥。干燥约2星期后收获种子。

[0077]通过萌发选择方法，从非转基因植物中选择浸润种子胚产生的转基因拟南芥植物。将收获的种子进行表面消毒，然后播种于高压灭菌后的选择培养基表面，此培养基包含了MS基本盐4.3g/L、Gamborg′s B-5(500 X)2.0g/L、MES 0.5g/L和8g/L植物琼脂，以及作为过滤消毒液体溶液加入的羧苄青霉素250mg/L、头孢噻肟100mg/和PPM 2ml/L和300μM草甘磷。通过以24盎司/亩喷洒草甘磷除草剂，选择pMON81519 V1事件和对照构建物pMON81517抗草甘磷的转基因拟南芥植物，生存的植物移植到单个盆中。在大约喷洒24盎司/亩16天后，对应于观察到抽薹，第二次向V1植物喷洒。第二次喷洒将确定两种构建物赋予生殖抗性的功效。观察植物对使用草甘磷的生长和生殖效应。经测定，62株植物转化有包含CP4 EPSPS(II型EPSPS)编码序列的对照构建物pMON815 17，49株植物转化有pMON81519。表4所示的结果证明：对于ZmTIPT I型EPSPS变体与II型EPSPS，显示草甘磷抗性和生育力的植物的比例大致相同。

[0078]烟草是熟知的测验转基因构建物的模型植物，并且转化方法是植物转化领域所熟知的。简要而言，将烟草叶组织切碎，置于含有适当培养基的固体预培养皿表面。在接种土壤杆菌的前一天，将10μl接种环的含有pMON81519或对照构建物的转化土壤杆菌培养物置于含有10ml YEP培养基的试管中，YEP培养基中含有适当的抗生素以维持DNA构建物的选择性。将试管置于振荡器，28℃下生长过夜。用TXD培养基调整土壤杆菌的OD₆₀₀至0.15-0.30之间。直接移取7-8ml液体土壤杆菌悬液到预培养皿上覆盖外植体组织，接种烟草叶组织外植体。允许土壤杆菌在平皿上保留15分钟。倾斜平皿，用无菌的10ml大口移液管吸出液体。将外植体在这些平皿上共培养2-3天。然后将外植体转入含有选择试剂的新鲜培养基中，培养3-4周，期间将愈伤组织转入新鲜培养基。在6-8周，应当从允许在培养基中生根的愈伤组织上切除秧苗。然后在2-3周后将生根的秧苗转入土壤。用16-24盎司/亩草甘磷处理植物，记录生长和生殖抗性的植物。表4所示的结果证明：对于ZmTIPT I型EPSPS变体与II型EPSPS，显示草甘磷抗性和生育力的植物的比例大致相同。

表4含有TIPT EPSPS变体的拟南芥和烟草事件抗草甘磷处理的结果

DNA构建物	烟草％glypT/能育性	拟南芥％glypT/能育性
DNA构建物	烟草％glypT/能育性	拟南芥％glypT/能育性	PMON81517(CP4 EPSPS)PMON81519(ZmTIPT)	56％(N＝41)49％(N＝39)	61％(N＝62)65％(N＝49)

实施例6

[0079]通过定点诱变方法或随机诱变方法对I型EPSPS进行修饰，以产生抗草甘磷的酶。本发明优选在苏氨酸102位和脯氨酸106位提供氨基酸置换。除前述本发明TIP-T、G、C、A和I变体之外，进行其它置换：在玉米EPSPS DNA编码序列中通过相应密码子的定点修饰，用亮氨酸(L、Leu)密码子代替苏氨酸102密码子，用丙氨酸(A、Ala)密码子代替脯氨酸106密码子，得到提供草甘磷抗性酶的ZmTLPA变体(SEQ ID NO：44)。在另外一个变体中，用谷氨酰胺(Q、Gln)密码子代替苏氨酸102密码子，脯氨酸106密码子更改为丙氨酸密码子，得到TQPA变体。

[0080]这些玉米EPSPS变体，TLPA和TQPA使用Stratagene(Cat.No.200518)的基于PCR的QuickChange^TM定点诱变试剂盒来产生。用未修饰玉米EPSPS编码序列作为模板进行PCR产生变体。诱变的寡引物购自Invitrogen。按以下方法在50μl反应液中进行PCR：dH₂O38μl；2mM dNTP 1μl；10X缓冲液5μl；pMON70461 1μl(10ng)；ZmTLPA-1(SEQ ID NO：45)2μL；ZmTLPA-2(SEQ ID NO：46)2μL；pfu Turbo酶1μL。使用以下的程序在MJ Research PTC-200热循环仪上进行PCR：步骤1-94℃维持2分钟；步骤2-94℃维持30秒；步骤3-55℃维持30秒；步骤4-68℃维持14分钟；步骤5-回到步骤2，16次；步骤6-结束。PCR结束时，向每50μlPCR反应液中加入1μl限制性内切酶DpnI，混合物置于37℃下维持1小时。经DpnI处理后，按照厂家说明用1μl处理过的反应混合物转化感受态大肠杆菌菌株XL1-blue菌株(Stratagene)。转化细胞置于含有最终浓度0.1mg/mL羧苄青霉素的培养皿中。然后将平皿在37℃下培养过夜。第二天挑出单菌落，接种于含有0.1mg/mL羧苄青霉素的3mL液体培养基。液体培养物在37℃培养过夜，转速250rpm。使用Qiagen′sminiprep试剂盒(Cat.No.27160)从1mL液体培养物中制备质粒DNA。在50μl dH₂O中洗脱DNA。对来自各种诱变的三个独立菌落的整个编码区域进行测序，证实含有想要的突变。将变体编码序列以正确的方向插入到pET19表达载体中，以作为带有纯化标记的翻译融合物表达变体酶。

[0081]使用前述测定条件，测定了突变玉米EPSPS酶(TLPA和TQPA)的催化活性、底物结合和草甘磷抗性(Ki)。结果显示在表5中。将这些突变株与野生型(WT)未修饰的玉米EPSPS和TIPA变体进行比较。结果证明TLPA变体是抗草甘磷的，并且当在转基因植物中表达时具有足够的酶动力学，当与CTP融合或修饰为叶绿体表达时，将为转基因植物提供草甘磷抗性。包括苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸和异亮氨酸在106位的进一步氨基酸置换，期望得到草甘磷抗性酶，如与102位T-1修饰结合所观察到的。

表5 EPSPS稳定状态动力学

酶	k_cat(s^-1)	Km-PEP(μM)	k_cat/Km(μM^-1s^-1)	K_i(μM)
酶	k_cat(s^-1)	Km-PEP(μM)	k_cat/Km(μM^-1s^-1)	K_i(μM)	WT玉米	8.8±0.5	27±4	0.3	0.5±0.06
TIPA	2.1±0.1	10.2±1.1	0.2	148.3±18.3	WT玉米	8.8±0.5	27±4	0.3	0.5±0.06
TIPA	2.1±0.1	10.2±1.1	0.2	148.3±18.3	TLPA	2.4±0.1	13.1±2.5	0.2	46.8±7.6
TQPA	3.8±0.2	163.8±22.9	0.02	2200+200	TLPA	2.4±0.1	13.1±2.5	0.2	46.8±7.6

[0082]由于图解并描述了本发明的原理，对于本领域技术人员而言明显的是，可以在排列和细节上改变本发明而不背离其原理。我们要求所有的在后面权利要求范围和精神之内的改变。

[0083]在本说明书中所有引用的出版物和公开专利文件都通过引用结合到本文中，其程度如同个别出版物或专利申请具体和单独地通过引用结合到本文中。

序列表

<110>M.F.阿利布海(Alibhai，Murtaza F.)

C.卡雅各布(CaJacob，Claire A.)

冯寄嘉(Feng，Paul C.C.)

S.弗拉辛斯基(Flasinski，Stanislaw)

G.R.赫克(Heck，Gregory R.)

祁幼林(Qi，Youlin)

<120>抗草甘膦的I型5-烯醇丙酮酸-3-磷酸草莽酸合酶

<130>11899.0238.00PC00(MOBT：238P)

<140>PCT/US2004 /004636

<141>2004-02-17

<150>60/448,438

<151>2003-02-18

<160>46

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>I型EPSPS的肽模体

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(4)

<223>Xaa为任何氨基酸

<400>1

Gly Thr Xaa Xaa Arg Pro

1 5

<210>2

<211>6

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>变体EPSPS底物结合域

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(2)..(2)

<223>Xaa为异亮氨酸或亮氨酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(3)..(4)

<223>Xaa为任何氨基酸

<220>

<221>MISC_FEATURE

<222>(6)..(6)

<223>Xaa为苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、异亮氨酸

<400>2

Gly Xaa Xaa Xaa Arg Xaa

1 5

<210>3

<211>1335

<212>DNA

<213>玉米(Zea Mays)

<400>3

atggcgggtg ccgaagaaat cgtgctgcag ccgatcaagg agatctccgg caccgtcaag 60

ctgccggggt ccaagtcgct ttccaaccgg atcctcctac tcgccgccct gtccgagggg 120

acaacagtgg ttgataacct gctgaacagt gaggatgtcc actacatgct cggggccttg 180

aggactcttg gtctctctgt cgaagcggac aaagctgcca aaagagctgt agttgttggc 240

tgtggtggaa agttcccagt tgaggatgct aaagaggaag tgcagctctt cttggggaat 300

gctggaactg caatgcggcc attgacagca gctgttactg ctgctggtgg aaatgcaact 360

tacgtgcttg atggagtacc aagaatgagg gagagaccca ttggcgactt ggttgtcgga 420

ttgaagcagc ttggtgcaga tgttgattgt ttccttggca ctgactgccc acctgttcgt 480

gtcaatggaa tcggagggct acctggtggc aaggtcaagc tgtctggctc catcagcagt 540

cagtacttga gtgccttgct gatggctgct cctttggctc ttggggatgt ggagattgaa 600

atcattgata aattaatctc cattccgtac gtcgaaatga cattgagatt gatggagcgt 660

tttggtgtga aagcagagca ttctgatagc tgggacagat tctacattaa gggaggtcaa 720

aaatacaagt cccctaaaaa tgcctatgtt gaaggtgatg cctcaagcgc aagctatttc 780

ttggctggtg ctgcaattac tggagggact gtgactgtgg aaggttgtgg caccaccagt 840

ttgcagggtg atgtgaagtt tgctgaggta ctggagatga tgggagcgaa ggttacatgg 900

accgagacta gcgtaactgt tactggccca ccgcgggagc catttgggag gaaacacctc 960

aaggcgattg atgtcaacat gaacaagatg cctgatgtcg ccatgactct tgctgtggtt 1020

gccctctttg ccgatggccc gacagccatc agagacgtgg cttcctggag agtaaaggag 1080

accgagagga tggttgcgat ccggacggag ctaaccaagc tgggagcatc tgttgaggaa 1140

gggccggact actgcatcat cacgccgccg gagaagctga acgtgacggc gatcgacacg 1200

tacgacgacc acaggatggc gatggccttc tcccttgccg cctgtgccga ggtccccgtc 1260

accatccggg accctgggtg cacccggaag accttccccg actacttcga tgtgctgagc 1320

actttcgtca agaat 1335

<210>4

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>4

cttcttgggg aatgctggaa ttgcaatgcg gtcattgaca gcagctgtta c 51

<210>5

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>5

gtaacagctg ctgtcaatga ccgcattgca attccagcat tccccaagaa g 51

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>6

ggaatgctgg aattgcaatg cg 22

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>7

cgcattgcaa ttccagcatt cc 22

<210>8

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>8

gctggaactg caatgcggac attgacagca gctgttac 38

<210>9

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>9

gtaacagctg ctgtcaatgt ccgcattgca gttccagc 38

<210>10

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>10

gctggaactg caatgcggtc attgacagca gctgttac 38

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>11

gtaacagctg ctgtcaatga ccgcattgca gttccagc 38

<210>12

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>12

caatgcggct attgacagca gc 22

<210>13

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>13

gctgctgtca atagccgcat tg 22

<210>14

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>14

gcaatgcggg gattgacagc ag 22

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>15

ctgctgtcaa tccccgcatt gc 22

<210>16

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>16

gcaatgcggg cattgacagc ag 22

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>17

ctgctgtcaa tgcccgcatt gc 22

<210>18

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>18

gcaatgcggg tattgacagc ag 22

<210>19

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>19

ctgctgtcaa tacccgcatt gc 22

<210>20

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>20

gcaatgcggc tgttgacagc agctg 25

<210>21

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>21

cagctgctgt caacagccgc attgc 25

<210>22

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>22

gcaatgcgga tcttgacagc agc 23

<210>23

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>23

gctgctgtca agatccgcat tgc 23

<210>24

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>24

gcaatgcgga tgttgacagc agc 23

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>25

gctgctgtca acatccgcat tgc 23

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>26

gcaatgcggt gtttgacagc agctg 25

<210>27

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>27

cagctgctgt caaacaccgc attgc 25

<210>28

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA引物

<400>28

caacatatgg agaaagcttc ggagattgtg cttcaacc 38

<210>29

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA引物

<400>29

caactcgagt taatgctttg tgattctttc aag 33

<210>30

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA引物

<400>30

gcatgcagaa gccttccaca gcaccggag 29

<210>31

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>DNA引物

<400>31

tctagactcg agtcagtgct tagcaaacct ctgaagc 37

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>32

aatgcaggaa tcgcaatgcg tgcacttacc 30

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>33

ggtaagtgca cgcattgcga ttcctgcatt 30

<210>34

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>34

gcaggaatcg ctatgcgtgc attgactgc 29

<210>35

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>35

gcagtcaatg cacgcatagc gattcctgc 29

<210>36

<211>1340

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来源于拟南芥(Arabidopsis)的变体TIPA EPSPS

<400>36

tggagaaagc ttcggagatt gtgcttcaac ccattagaga aatctcgggt ctcattaagc 60

ttcctggctc caagtctctc tctaatcgaa ttctgcttct cgctgctcta tctgagggaa 120

ctactgtagt ggacaacttg ttgaacagtg atgacatcaa ttacatgctt gatgcgttga 180

agatattggg acttaatgtg gaaactcaca gtgaaaacaa tcgtgctgta gttgaaggat 240

gtggcggggt atttccagct tccattgatt ccaagagtga tatcgaactt tacctcggca 300

atgcaggaat cgcaatgcgt gcacttaccg ccgcagttac tgctgcaggt ggcaacgcaa 360

gttatgtcct tgatggggtg cctcggatga gagagagacc tataggggat ttggttgttg 420

gtcttaagca gcttggtgct gatgttgaat gtactcttgg cactaactgc cctcctgttc 480

gtgtcaacgc taatggtggc cttcctggtg gaaaggtgaa gctttctgga tctattagta 540

gtcagtactt gaccgctctg ctcatggcag ctcccttagc tcttggagac gtcgaaattg 600

aaattgtcga taaattgatt tctgttccgt atgttgaaat gacattgaag ttgatggaac 660

gttttggggt aagtgctgag catagtgaaa gctgggatcg tttctttgtt aagggtgggc 720

aaaaatacaa gtcgccgggt aatgcttacg tagaaggtga tgcttctagt gctagttatt 780

tcctggctgg tgctgccatt accggtgaaa ctgtcactgt tgaaggttgt ggaacgacca 840

gtttgcaggg agatgtgaaa tttgccgagg ttcttgagaa aatgggatgt aaagtgtcct 900

ggacagagaa cagtgtgact gtgacagggc cgtctagaga tgcttttgga atgagacact 960

tgcgggctat tgatgtcaac atgaacaaaa tgcctgatgt agcaatgact cttgccgtcg 1020

ttgctctctt tgccgatggt ccaaccacca ttagagatgt ggctagctgg agagtaaagg 1080

agacggaaag gatgattgcc atttgcacag agcttagaaa actgggagct acagtggaag 1140

aaggttcaga ttattgtgtg attactccgc cgaaaaaggt gaaaccggca gagattgata 1200

cctatgatga tcatagaatg gcaatggcat tctctcttgc agcttgtgct gatgttccaa 1260

tcaccatcaa tgaccccggt tgcaccagga aaaccttccc cgactacttc caagtccttg 1320

aaagaatcac aaagcattaa 1340

<210>37

<211>1347

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来源于莴苣(Lettuce)的变体TIPA EPSPS

<400>37

aagcccagca ccgctcccga ggaaatcgtg ctgcaaccga tcaaggagat cagcgggact 60

gtgaacctcc ctgggagtaa gtccctctct aataggatct tgcttctcgc ggcccttagt 120

gaagggacga ctgttgtgga caatctcttg aatagtgacg acgttcacta catgctcgga 180

gccctgcgcg ccctcggcct tcacgtcgaa gagaacggcg ccttgaagcg tgccatcgtc 240

gagggttgcg gcggtgtctt cccggttggc cgcgagtcca aggacgagat tcagctcttc 300

ttgggcaacg cgggcatcgc gatgagggcg ctgacagccg cggttaccgc agccggaggc 360

agctcgtcct acatcctaga cggcgtgcct cggatgaggg aacgtcccat cggcgatctc 420

gtcaccgggc tcaagcaact tggcgctgac gtcgattgct tcctcgggac cgactgccca 480

ccggtcaggg tcgtcggctc cggtggactt cctggcggca aggtcaagct ctccggcagt 540

atctcctctc agtatctcac cgcgttactc atggcagctc cgcttgccct cggtgacgtc 600

gagatcgaga ttatcgacaa gctgatttcg ataccctacg tggaaatgac cctgaaactc 660

atggagcggt ttggcgtgtc cgtccagcac agcgatacgt gggataggtt ccacgtgcaa 720

ggcggtcaga agtacaagtc gccgggaaac gcctacgtcg agggcgacgc gtcgagcgcc 780

tcctacttcc tcgctggcgc tgccattacg ggcgggacca tcactgtgga gggttgcgga 840

acctcgtcac tccagggtga cgtgaagttt gctgaggttc tgggccagat gggtgcccaa 900

gtcacctgga cagagaactc cgttacggtg aagggtcctc ccagagatcc gtctgggagg 960

aagcaccttc gcccggtcga tgttaatatg aacaagatgc ccgacgtggc gatgacccta 1020

gcggttgtgg ccctgtacgc tgacggcccg actgccattc gtgacgtggc gtcgtggcgg 1080

gtcaaggaga cagaacggat gatcgctatc tgcaccgagc tacggaagct gggcgctacc 1140

gtcgaggagg gtccggacta ctgcatcatt acgccacccg agaaactaaa cgtcaccgct 1200

attgacacct acgacgatca tcgaatggct atggccttct cactggcagc gtgtgccgac 1260

gttgcggtta cgatcaaaga tccaggctgt acacgcaaga cgtttcccga ctatttcgag 1320

gtgctacagc ggttcgccaa gcactga 1347

<210>38

<211>1335

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来源于玉米(Zea Mays)的变体TIPT EPSPS编码序列

<400>38

gccggcgccg aggagatcgt gctgcagccc atcaaggaga tctccggcac cgtcaagctg 60

ccggggtcca agtcgctttc caaccggatc ctcctactcg ccgccctgtc cgaggggaca 120

acagtggttg ataacctgct gaacagtgag gatgtccact acatgctcgg ggccttgagg 180

actcttggtc tctctgtcga agcggacaaa gctgccaaaa gagctgtagt tgttggctgt 240

ggtggaaagt tcccagttga ggatgctaaa gaggaagtgc agctcttctt ggggaatgct 300

ggaattgcaa tgcggacatt gacagcagct gttactgctg ctggtggaaa tgcaacttac 360

gtgcttgatg gagtaccaag aatgagggag agacccattg gcgacttggt tgtcggattg 420

aagcagcttg gtgcagatgt tgattgtttc cttggcactg actgcccacc tgttcgtgtc 480

aatggaatcg gagggctacc tggtggcaag gtcaagctgt ctggctccat cagcagtcag 540

tacttgagtg ccttgctgat ggctgctcct ttggctcttg gggatgtgga gattgaaatc 600

attgataaat taatctccat tccgtacgtc gaaatgacat tgagattgat ggagcgtttt 660

ggtgtgaaag cagagcattc tgatagctgg gacagattct acattaaggg aggtcaaaaa 720

tacaagtccc ctaaaaatgc ctatgttgaa ggtgatgcct caagcgcaag ctatttcttg 780

gctggtgctg caattactgg agggactgtg actgtggaag gttgtggcac caccagtttg 840

cagggtgatg tgaagtttgc tgaggtactg gagatgatgg gagcgaaggt tacatggacc 900

gagactagcg taactgttac tggcccaccg cgggagccat ttgggaggaa acacctcaag 960

gcgattgatg tcaacatgaa caagatgcct gatgtcgcca tgactcttgc tgtggttgcc 1020

ctctttgccg atggcccgac agccatcaga gacgtggctt cctggagagt aaaggagacc 1080

gagaggatgg ttgcgatccg gacggagcta accaagctgg gagcatctgt tgaggaaggg 1140

ccggactact gcatcatcac gccgccggag aagctgaacg tgacggcgat cgacacgtac 1200

gacgaccaca ggatggcgat ggccttctcc cttgccgcct gtgccgaggt ccccgtcacc 1260

atccgggacc ctgggtgcac ccggaagacc ttccccgact acttcgatgt gctgagcact 1320

ttcgtcaaga attaa 1335

<210>39

<211>1308

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来源于玉米(Zea Mays)的变体TIPA EPSPS

<400>39

atcaaggaga tctccggcac cgtcaagctg ccggggtcca agtcgctttc caaccggatc 60

ctcctactcg ccgccctgtc cgaggggaca acagtggttg ataacctgct gaacagtgag 120

gatgtccact acatgctcgg ggccttgagg actcttggtc tctctgtcga agcggacaaa 180

gctgccaaaa gagctgtagt tgttggctgt ggtggaaagt tcccagttga ggatgctaaa 240

gaggaagtgc agctcttctt ggggaatgct ggaattgcaa tgcgggcatt gacagcagct 300

gttactgctg ctggtggaaa tgcaacttac gtgcttgatg gagtaccaag aatgagggag 360

agacccattg gcgacttggt tgtcggattg aagcagcttg gtgcagatgt tgattgtttc 420

cttggcactg actgcccacc tgttcgtgtc aatggaatcg gagggctacc tggtggcaag 480

gtcaagctgt ctggctccat cagcagtcag tacttgagtg ccttgctgat ggctgctcct 540

ttggctcttg gggatgtgga gattgaaatc attgataaat taatctccat tccgtacgtc 600

gaaatgacat tgagattgat ggagcgtttt ggtgtgaaag cagagcattc tgatagctgg 660

gacagattct acattaaggg aggtcaaaaa tacaagtccc ctaaaaatgc ctatgttgaa 720

ggtgatgcct caagcgcaag ctatttcttg gctggtgctg caattactgg agggactgtg 780

actgtggaag gttgtggcac caccagtttg cagggtgatg tgaagtttgc tgaggtactg 840

gagatgatgg gagcgaaggt tacatggacc gagactagcg taactgttac tggcccaccg 900

cgggagccat ttgggaggaa acacctcaag gcgattgatg tcaacatgaa caagatgcct 960

gatgtcgcca tgactcttgc tgtggttgcc ctctttgccg atggcccgac agccatcaga 1020

gacgtggctt cctggagagt aaaggagacc gagaggatgg ttgcgatccg gacggagcta 1080

accaagctgg gagcatctgt tgaggaaggg ccggactact gcatcatcac gccgccggag 1140

aagctgaacg tgacggcgat cgacacgtac gacgaccaca ggatggcgat ggccttctcc 1200

cttgccgcct gtgccgaggt ccccgtcacc atccgggacc ctgggtgcac ccggaagacc 1260

ttccccgact acttcgatgt gctgagcact ttcgtcaaga attaatga 1308

<210>40

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>40

aatagcatgc ccggcgccga ggagatcgtg ctgcagccca tcaaggagat c 51

<210>41

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>41

attgaattcg agctcattaa ttcttgacga aagtgctc 38

<210>42

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>42

gtttccacgg cgtgcatggc cggcgccgag gagatcg 37

<210>43

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>43

cgatctcctc ggcgccggcc atgcacgccg tggaaac 37

<210>44

<211>1341

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>来源于玉米(Zea Mays)的变体TLPA EPSPS

<400>44

tggcgggtgc cgaagaaatc gtgctgcagc cgatcaagga gatctccggc accgtcaagc 60

tgccggggtc caagtcgctt tccaaccgga tcctcctact cgccgccctg tccgagggga 120

caacagtggt tgataacctg ctgaacagtg aggatgtcca ctacatgctc ggggccttga 180

ggactcttgg tctctctgtc gaagcggaca aagctgccaa aagagctgta gttgttggct 240

gtggtggaaa gttcccagtt gaggatgcta aagaggaagt gcagctcttc ttggggaatg 300

ctggacttgc aatgcgggca ttgacagcag ctgttactgc tgctggtgga aatgcaactt 360

acgtgcttga tggagtacca agaatgaggg agagacccat tggcgacttg gttgtcggat 420

tgaagcagct tggtgcagat gttgattgtt tccttggcac tgactgccca cctgttcgtg 480

tcaatggaat cggagggcta cctggtggca aggtcaagct gtctggctcc atcagcagtc 540

agtacttgag tgccttgctg atggctgctc ctttggctct tggggatgtg gagattgaaa 600

tcattgataa attaatctcc attccgtacg tcgaaatgac attgagattg atggagcgtt 660

ttggtgtgaa agcagagcat tctgatagct gggacagatt ctacattaag ggaggtcaaa 720

aatacaagtc ccctaaaaat gcctatgttg aaggtgatgc ctcaagcgca agctatttct 780

tggctggtgc tgcaattact ggagggactg tgactgtgga aggttgtggc accaccagtt 840

tgcagggtga tgtgaagttt gctgaggtac tggagatgat gggagcgaag gttacatgga 900

ccgagactag cgtaactgtt actggcccac cgcgggagcc atttgggagg aaacacctca 960

aggcgattga tgtcaacatg aacaagatgc ctgatgtcgc catgactctt gctgtggttg 1020

ccctctttgc cgatggcccg acagccatca gagacgtggc ttcctggaga gtaaaggaga 1080

ccgagaggat ggttgcgatc cggacggagc taaccaagct gggagcatct gttgaggaag 1140

ggccggacta ctgcatcatc acgccgccgg agaagctgaa cgtgacggcg atcgacacgt 1200

acgacgacca caggatggcg atggccttct cccttgccgc ctgtgccgag gtccccgtca 1260

ccatccggga ccctgggtgc acccggaaga ccttccccga ctacttcgat gtgctgagca 1320

ctttcgtcaa gaattaatga c 1341

<210>45

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>45

gctggacttg caatgcgggc attgacag 28

<210>46

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变引物

<400>46

ctgtcaatgc ccgcattgca agtccagc 28

Claims

1.一种分离的DNA分子，所述DNA分子编码抗草甘磷I型EPSPS蛋白，其中所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白包含多肽序列GX₄X₁X₂RX₃，其中X₁和X₂为任何氨基酸，X₄为异亮氨酸或亮氨酸，X₃选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸。

2.权利要求1的DNA分子，其中所述DNA分子来源于植物基因组。

3.权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子来源于玉米(Zeamays)，并且修饰为编码抗草甘磷I型EPSPS蛋白，所述蛋白在102位包含异亮氨酸，在106位包含选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸的氨基酸。

4.权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子来源于拟南芥(Arabidopsis)，并且修饰为编码所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白，所述蛋白在102位包含异亮氨酸，在106位包含丙氨酸。

5.权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子来源于莴苣(Lettuce)，并且修饰为编码所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白，所述蛋白在102位包含异亮氨酸，在106位包含丙氨酸。

6.权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子来源于玉米(Zeamays)，并且修饰为编码所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白，所述蛋白在102位包含亮氨酸，在106位包含丙氨酸。

7.权利要求2的DNA分子，其中所述DNA分子选自SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQID NO：44。

8.权利要求1的DNA分子，其中所述DNA分子来源于细菌基因组。

9.一种DNA构建物，所述DNA构建物包含启动子，所述启动子在植物细胞中发挥功能且有效地与编码抗草甘磷I型EPSPS蛋白的DNA分子连接，其中所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白包含多肽序列GX₄X₁X₂RX₃，其中X₁和X₂为任何氨基酸，X₄为异亮氨酸或亮氨酸，X₃选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸。

10.权利要求9的DNA构建物，所述DNA构建物包含选自SEQID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：44的DNA分子。

11.一种制备草甘磷耐受植物的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将接受植物细胞与权利要求9的DNA构建物接触，其中所述DNA构建物掺入接受植物细胞的基因组；2)将接受植物细胞再生为植物；3)向所述植物施用有效剂量的草甘磷，其中所述植物展示出草甘磷耐受表型。

12.权利要求11的方法，其中所述DNA构建物包含选自SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQID NO：44的DNA分子。

13.一种包含权利要求9的DNA构建物的转化植物细胞。

14.权利要求13的转化植物细胞，其中DNA构建物包含选自SEQID NO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：44的EPSPS编码序列。

15.一种在草甘磷耐受农作物的田地中控制杂草的方法，所述方法包括向所述草甘磷耐受农作物的田地施用有效剂量的含草甘磷除草剂，其中所述草甘磷耐受农作物含有包含启动子的DNA构建物，所述启动子在植物细胞中发挥功能且有效与编码连接到抗草甘磷I型EPSPS蛋白的叶绿体转运肽的DNA分子连接，其中所述抗草甘磷I型EPSPS蛋白包含多肽序列GIX₁X₂RX₃，其中X₁和X₂为任何氨基酸，X₃选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸。

16.权利要求15的方法，其中所述DNA构建物包含选自SEQ IDNO：36、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：39和SEQID NO：44的DNA分子。

17.一种纯化的I型EPSPS酶，所述酶包含多肽序列GX₄X₁X₂RX₃，其中X₁和X₂为任何氨基酸，X₄为异亮氨酸或亮氨酸，X₃选自苏氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和异亮氨酸。