CN101570744B

CN101570744B - 高抗草甘膦的epsp合酶及其编码序列和用途

Info

Publication number: CN101570744B
Application number: CN 200810036732
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 陆伟; 燕永亮; 沙纪莹; 平淑珍; 张维; 陈明
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Longping Biotechnology Hainan Co ltd
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2008-04-28
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2028-04-28
Also published as: CN101570744A

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种新的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(简称为“EPSP合酶”)，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或具有基于SEQ ID NO：2经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的氨基酸序列。本发明还公开了编码EPSP合酶的多核苷酸和经重组技术产生这种EPSP合酶的方法。本发明还公开了这种EPSP合酶的用途。

Description

高抗草甘膦的EPSP合酶及其编码序列和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及从固氮斯氏假单胞菌A1501中分离的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白产物；本发明还涉及此多核苷酸和多肽的用途和制备；具体地说，本发明的多肽是一种具有抗草甘膦抗性的酶。

背景技术

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡。

应用化学诱变细菌产生的aroA突变体，抗药性机理研究确证了aroA基因是草甘膦作用靶标EPSP合酶的编码基因。近年来一些国家已经选育了一些转基因抗草甘膦品种。

中国在转基因抗草甘膦作物方面的研究也已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。并且，已有的一些抗草甘膦相关基因及其相关转基因植物还存在种种不利于商品化的缺陷，例如，抗性不高，抗性不稳定等。

因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从固氮斯氏假单胞菌A1501中分离的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)基因及其蛋白产物，以及它们的用途和制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种分离的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶多肽，该多肽选自下组：

(a)SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抗草甘膦抗性和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶活性的多肽。

在另一优选例中，所述的多肽来源于固氮斯氏假单胞菌。

在本发明的第二方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

在另一优选例中，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

在另一优选例中，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-1323位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-1320位的序列。

在本发明的第三方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。

在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体；或其基因组中整合有所述的多核苷酸。

在本发明的第五方面，提供一种所述的多肽的制备方法，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出所述的多肽。

在本发明的第六方面，提供所述的多肽或其编码基因的用途，用于改变植物抗草甘膦抗性。

在另一优选例中，所述的多肽或其编码基因用于制备具有草甘膦抗性的植物。

在本发明的第七方面，提供一种制备具有抗草甘膦抗性的植物的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体中含有所述多肽的编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述多肽的编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了EPSP合酶基因在含有不同草甘膦浓度的M9液体培养基中的抗性情况。

图2显示了A15-EPSPS基因功能鉴定的流程示意图。

图3显示A15-EPSPS与HTG7-EPSPS一致性比较。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，从固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)的基因组中找到一种新的5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP合酶)。本发明人通过实验证实了所述EPSP合酶具有非常高的草甘膦抗性，并且转入植物后，可导致植物草甘膦抗性的显著提高。在此基础上完成了本发明。

在本发明中，术语“EPSPS”、“EPSP合酶”、“EPSP合成酶”、“EPSP多肽”、“A15-EPSPS”、或“5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶”可互换使用，都指具有5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的EPSP合酶。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的EPSP合酶或多肽”是指EPSP多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化EPSP合酶。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括EPSP合酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然EPSP合酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“EPSP多肽”指具有EPSP合酶活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与EPSP合酶相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括EPSP合酶的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与EPSP合酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗EPSP合酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含EPSP合酶多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了EPSP合酶多肽的可溶性片段。通常，该片段具有EPSP合酶多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供EPSP合酶多肽的类似物。这些类似物与天然EPSP合酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到。

在本发明中，“EPSP合酶保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码所述的EPSP合酶多肽，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码EPSP合酶的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码EPSP合成酶的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的EPSPS核苷酸全长序列或其片段通常可以用人工合成、PCR扩增法、或重组法的方法获得。例如可根据SEQ ID NO：1的序列进行全序列合成。

对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用人工合成的EPSP合酶核苷酸全长序列或其片段作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段和衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或EPSP合酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列来表达或生产重组的EPSP合酶多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码EPSP合酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，EPSP合酶的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含EPSP合酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得抗草甘膦抗性提高的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

另一方面，本发明还包括对EPSP合酶DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。较佳地，指那些能与EPSP合酶基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制EPSP合酶的分子，也包括那些并不影响EPSP合酶功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EPSP合酶基因产物结合的抗体。

本发明还涉及定量和定位检测EPSP合酶水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。

一种检测检测样品中是否存在EPSP合酶的方法是利用EPSP合酶的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与EPSP合酶特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在EPSP合酶。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于基因的表达分析。用EPSP合酶特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测EPSP合酶的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列的多肽，其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为1323个碱基，其开放读框位于1-1320位，编码全长为440个氨基酸的EPSP合酶(SEQ ID NO：2)。本发明的该EPSP合酶简称为“A15-EPSPS”。

本发明的A15-EPSPS具有如下主要特点：

A)草甘膦抗性功能明确；

B)结构新，在核酸水平上与已见报道的EPSP合酶编码基因无明显相同性，在氨基酸水平上与其他EPSP合酶的同源性也很低。

本发明的EPSP合酶为改变植物的抗草甘膦抗性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以通过将EPSP合酶的编码基因导入，改变现有优良农作物品种的抗草甘膦抗性，可获得抗草甘膦的小麦、水稻或其它农作物品种，解决农业生产中存在的实际问题。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1固氮斯氏假单胞菌A1501 EPSP合酶基因的克隆

1、在固氮斯氏假单胞菌A1501的全基因组测序完成的基础上，经基因组注释，推测PST2339含有EPSP合酶基因，利用美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的ORF Finder程序寻找合适的ORF，长度约为1.3Kb，定名为aroA-A15，为A15-EPSPS编码基因。

1)设计如下引物：

aroA-A15(R)gggAAGCTTTCATGAGGCGCCCTCCGCCT(SEQ ID NO：3)；

HindIII

aroA-A15(F)gggCATATGCATTCCAATGACCT(SEQ ID NO：4)。

NdeI

以固氮斯氏假单胞菌A1501(参见科学通报，第50卷，第1期，2005年1月，97-99页)的基因组DNA为模板，以上述引物为引物，进行PCR反应。

2)PCR反应体系如下：

3)PCR反应程序如下(30个循环)：

94℃预变性DNA 5min

94℃变性 30s

50℃退火 30s

72℃延伸 120S/90S

30个循环后

72℃补充延伸 10min

10℃ 结束

2、PCR产物片段克隆

用Promega pGEM-T Vector Systems对PCR产物进行克隆，连接产物(aroA-A15-T)转化E.coli JM109中，在含Amp^r(50μg/ml)/IPTG/X-gal的LB平板上选择白斑，碱解法提取质粒，用NdeI和HindIII双酶切分析插入片段的大小。

1)连接反应

按以下所示体积进行连接反应：

轻轻混匀，16℃过夜连接。

2)重组子的筛选与鉴定

用碱裂解法提取质粒DNA，然后进行酶切分析。

3、重组子的测序

测序工作由重大工程开放实验室测序部完成，分析软件为DNAman，CExpress和美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blast程序。

测序结果，aroA-A15基因具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，具有SEQID NO：2所示的氨基酸序列。

进一步分析显示，A15-EPSPS属于II型EPSP合酶，与已报道的具有草甘膦抗性的II型EPSP合酶氨基酸序列比较，结果显示该序列与HTG7-EPSP(GenBank：AAT76791)合酶(序列见图3)一致性最高，为67.48％。与其它抗草甘膦的II型EPSP合酶的一致性均低于46％。

实施例2 A15-EPSP合酶基因的表达

用NdeI和HindIII从载体pGEM-T载体上切下aroA-A15基因片段，连接到经过同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上，构建了N-端带有His·Tag和T7·Tag的融合蛋白表达载体，转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，进行诱导表达研究，使其在大肠杆菌中能够过量表达。

2.1NdeI和HindIII酶切消化aroA-A15-T

1)用NdeI和HindIII酶消化载体aroA-A15-T，定容至20μl，37℃，3小时。

2)将酶切产物在0.8％的凝胶中电泳，有5.3kb和1.3kb两条带。

2.2新基因片段的回收

按照试剂盒QIAEX II的说明书进行。

1)用解剖刀将1.3DNA目的带从琼脂糖胶上切下；

2)对所切的目的带称重；

3)加QIAEX II后振荡30Sec；

4)50℃，10min，溶解胶，束缚DNA。每2min振荡混合一次，让QIAEXII重悬，检查混合物的颜色是否为黄色；

5)离心30sec，去上清；

6)用500μl QX1缓冲液洗沉淀振荡重悬，30Sec离心去上清；

7)用500μl PE缓冲液洗沉淀2次振荡重悬沉淀，样品离心30Sec，仔细除去沉淀残存的上清；

8)10-15min吹干至到沉淀变白；

9)洗脱DNA时，加入pH8.0水，振荡重悬，温浴；

10)离心30sec，吸上清到一干净的管中，上清中含纯的DNA；

11)重复9-10步骤。

2.3表达载体的构建

1)pET-28a(+)表达载体的NdeI和HindIII酶切，去磷酸化及回收(方法同上)；

2)将经酶切的载体和片段连接，获得连接产物pET-A15-EPSPS。

2.4电转感受态细胞的制备

方法同《分子克隆》实验指南(第二版)。

2.5表达载体的转化及筛选

将连接产物转化E.coli BL21(DE3)表达宿主菌的感受态细胞，吸取150μl，涂在含20mmol/L草甘膦的M9固体培养基上，在低浓度IPTG诱导情况下，37℃培养48小时。

2.6转化子的鉴定

挑取在含有20mmol/L草甘膦的M9固体培养基上能生长的单菌落，接种于含100μg/mL Kan^r的LB平板筛选阳性克隆，小量提取质粒并酶切鉴定。

实施例3在不同草甘膦浓度M9固体和液体培养基中的抗性验证

观察BL21(DE3)和pET28a转化的BL21(DE3)(简写为pET28a)，固氮斯氏假单胞菌A1501，以及pET-A15-EPSPS转化的BL21(DE3)(简写为A15-EPSPS)、pET-G2-EPSPS转化的BL21(DE3)(简写为G2-EPSPS)在不同草甘膦浓度(0至300mM)的M9培养基中生长情况。

EPSP合酶基因在不同草甘膦浓度M9固体培养基中的抗性如表1所示，可见A15-EPSPS可耐受高浓度的草甘膦。A15-EPSPS组在300mM草甘膦浓度的培养基上还能良好地生长，而G2-EPSPS(GenBank：ABM21481)组在200mM草甘膦浓度的培养基上即不能生长。因此，A15-EPSPS对于草甘膦的耐受性显著优于G2-EPSPS。

表1

20mM

50mM

100mM

150mM

200mM

300mM

BL21(DE3)

-

pET28a

-

A1501

+

-

A15-EPSPS

+

G2-EPSPS

+

-

EPSP合酶在含有不同草甘膦浓度的M9液体培养基中的抗性如图1所示。

此外，还验证了EPSP合酶变异体的草甘膦抗性，具体是采用常规定点突变技术将对应于A15-EPSPS氨基酸序列中第6位Leu变为Ile；第130位Asn突变为Ser、Asp或Gly。然后将该经过突变的A15-EPSPS编码序列同前述方法连接入pET28a并转化的BL21(DE3)，测试携带变异的EPSP合酶基因的菌株在不同草甘膦浓度M9固体培养基中的抗性，结果其也能在300mM草甘膦浓度的培养基上生长，可见发生上述变异的A15-EPSPS与非变异的A15-EPSPS功能相同。

实施例4新基因的功能鉴定

pET-A15-EPSPS转化大肠杆菌EPSPS缺陷型菌株ER2799(购自NEB公司)，涂布在Kan^r50μg/ml LB固体平板上，用牙签点取所有的转化子到草甘膦20mmol/L M9固体培养基上，观察生长情况，操作过程如图2。

结果发现，pET-A15-EPSPS转化后，在功能上与EPSP合酶缺陷型菌株ER2799互补，能在限制性培养基M9固体平板上生长；而菌株ER2799及质粒pET28a转化BL21都不能在M9固体平板上很好生长。说明此基因具有完整的EPSP合酶的功能。

实施例5EPSP合酶基因的诱导表达及SDS-PAGE分析

选择筛选获得的含有阳性重组质粒pET-A15-EPSPS的克隆，挑取单菌落接种于3mL含Kan^r100μg/mL LB液体培养基中，于37℃活化过夜后，按1∶100稀释加入到6mL含Kan^r100μg/mL LB液体培养基中，振荡培养至OD₆₀₀值为0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mmol/L，继续于37℃摇床培养2h，并以IPTG诱导的pET28a(+)空载体和未经IPTG诱导的pET-A15-EPSPS为对照。重组质粒pET-A15-EPSPS同时以相同的诱导条件于30℃培养。

离心收集菌体后加入100μL上样缓冲液，煮沸10min，12000×g离心10min，取上清，置4℃备用。

将诱导产物经12％的SDS-PAGE电泳分析，用考马斯亮蓝R-250染色，脱色至背景清晰为止。

SDS-PAGE电泳操作如下：

1)样品处理：样品中加入等量上样缓冲液，沸水浴2-5分钟，待用；

2)制备凝胶：

a分离胶(12％)

ddH₂O 1.6ml

分离胶缓冲液 2ml

凝胶贮液 1.3ml

10％过硫酸铵 50μl

10％SDS 50μl

TEMED 2μl

b浓缩胶(5％)

ddH₂O 1.4ml

浓缩胶缓冲液 0.25ml

凝胶贮液 0.33ml

10％过硫酸铵 20μl

10％SDS 20μl

TEMED 2μl

3)加样：向分离胶各加样孔中分别加入已处理好的样品10μl；

4)电泳：20mA电泳；

5)染色：考马斯亮蓝染色液4小时，脱色液脱色，观察结果。

结果表明目的蛋白在大肠杆菌中已表达，大小约为48kDa。

经分析，表达获得的蛋白是N-端带有His·Tag和T7·Tag的A15-EPSPS融合蛋白。

可采用常规去tag的方法去除His·Tag和T7·Tag，获得A15-EPSPS蛋白。

实施例6可溶性分析

选择筛选获得的含有阳性重组质粒pET-A15-EPSPS的克隆，挑取单菌落接种于3mL含Kan^r100μg/mL LB液体培养基中，于37℃活化过夜后，按1∶100稀释接种到2管含Kan^r100μg/mL 20mL LB液体培养基中，振荡培养至OD600值为0.6，加入IPTG至终浓度为0.75mmol/L，同时在37℃和30℃摇床培养6小时。

离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心，吸取上清，沉淀用无菌水溶解，SDS-PAGE电泳分析表达蛋白的溶解性。电泳结果显示目的蛋白主要存在于上清液中，因此该蛋白为可溶性蛋白。

实施例7酶底物动力学参数测定

酶底物动力学参数测定参照Ming He et al.，Biochimica et Biophysica acta1568(2001)1-6。

7.1酶活检测相关溶液

10mM无机磷标准液：称取约2g KH₂PO₄于80℃烘箱烘干2小时以上，在干燥器中冷却至室温，准确称取1.361g以Milli-Q水溶解并定容至1L，分装成1ml于-20℃保存备用。

0.045％MG储液：准确称取盐酸孔雀绿0.045g，加Milli-Q水溶解并定容至100ml。

4.2％AM溶液：准确称取钼酸铵((NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O)4.2g，加4N HCl溶解并定容至100ml。

20％Triton溶液：称取2g Triton-100溶液，加Milli-Q水溶解并定容至10ml。

MAT溶液：将上述MG和AM溶液按3∶1(v/v)混合，磁力搅拌30min以上，定性滤纸过滤后加入Triton溶液至终浓度0.2％。

34％SC溶液：准确称取34g柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，加Milli-Q水溶解并定容至100ml。

0.5M HEPES缓冲液：准确称取1.191g HEPES，加Milli-Q水溶解，以10NNaOH调pH值至7.0，定容至10ml。

1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液：准确称取1.236g(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O，加Milli-Q水溶解并定容至1L，定性滤纸过滤后备用。

10mM PEP溶液：准确称取100mg PEP(C₃H₄NaO₆P·H₂O)溶于4.81mlMilli-Q水中，分装成1ml于-20℃保存备用。

10mM S3P溶液：10mg S3P溶于3.93ml milli-Q水中。

7.2EPSPS酶动力学分析

制作无机磷标准曲线

10mM无机磷标准液按1∶10稀释，分别取0、1、2、3…20μl于1.5ml Eppendorf离心管中，加入milli-Q水至100μl混匀，加入MAT溶液0.8ml混匀，计时三分钟后加入34％SC溶液100μl迅速混匀，室温静置20min后测定OD₆₆₀值。重复三次。以无机磷浓度为横坐标，OD₆₆₀值为纵坐标作图得到无机磷标准曲线(Lanzetta et al.，Anal.Biochem.100，(1979)95-97)。

7.3酶活测定

蛋白定量：酶粗提物蛋白定量采用考马斯亮蓝G-250染色法(Bradford法)。

酶活力测定：在冰上于1.5ml Eppendorf离心管中加入以下溶液：12μl去离子水，10mM PEP溶液2μl，10mM S₃P溶液2μl，0.5M HEPES溶液2μl，1mM(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O溶液2μl混匀，于28℃温浴5min后各管样品间隔2s加入1μl粗酶液并计时，2min后再间隔2s依次加入200μl MAT溶液，显色3min后再间隔2s依次加入20μl 34％SC溶液迅速混匀，室温显色20min后测定OD₆₆₀值。对照除不加酶液外，其余同样品管。样品管与对照管的OD₆₆₀值相减后，对照无机磷标准曲线即可求得反应释放出的无机磷摩尔量，再除以反应时间和酶蛋白量就得到该酶的酶活力(U/mg)。

半抑制剂量(IC₅₀)测定：上述反应液中添加0、10^-3、10^-2、10^-1、1、10、100、500mM草甘膦，所得酶比活力数据以草甘膦浓度为X轴，采用对数坐标，以反应速度V(U/mg)为Y轴作图。

Km(PEP)测定：将S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度(0.05、0.067、0.1、0.2、0.5、1.0mM)下按上述反应体系测定酶反应速度，所测数值按V-v/[S](Eadic-Hofstee)法作图(沈同等，生物化学(上)，1990，p244-256)。

Ki(草甘膦)测定：在不同草甘膦浓度(0、10、50、100μM)下测定PEP浓度为66.7、100、200、500μM时EPSPS的酶反应速度。采用双对数作图，得到1/V-1/[S]直线，再将各直线的斜率作为纵坐标，草甘膦浓度作为横坐标得到一条新的直线，该直线与X轴的交点即为Ki(草甘膦)值。

采用上述方法，分别测定了A15-EPSPS和G2-EPSPS(GenBank：ABM21481)，酶底物动力学常数，获得的酶底物动力学常数如表2。

表2

实施例8：构建抗草甘膦的转基因烟草

将前述获得的A15-EPSPS基因连接入pCAMBIA2301载体(购自CAMBIA公司)，再将重组载体转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。

选取农杆菌阳性克隆，制成菌液。取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm²见方的小叶片，置于农杆菌菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；把经浸染的叶片放于MS培养基上培养约48小时；然后将叶片转到愈伤培养基上，25-28℃光照下培养；半月后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基上进行生根培养；待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着着的固体培养基，移入土壤中，刚开始几天用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，转移至在含10mM的草甘膦的固体培养基中筛选草甘膦抗性的植株。

抗性植株经Southern、Northern杂交以及Westhern blot验证为转基因的抗性植株。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>高抗草甘膦的EPSP合酶及其编码序列和用途

<130>075002

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1323

<212>DNA

<213>固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<220>

<221>外显子

<222>(1)..(1320)

<400>1

atg cat tcc aat gac ctc gtt ttc ctc gcc aac cct ggc ggc agc ctg 48

Met His Ser Asn Asp Leu Val Phe Leu Ala Asn Pro Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

acc ggc cat ctg cgt gtc cca ggc gac aaa tcc att tcg cat cgt tcg 96

Thr Gly His Leu Arg Val Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser

20 25 30

atc atg ctg ggt tcc ctg gcg gaa ggg acc acc gaa gtc gag ggt ttt 144

Ile Met Leu Gly Ser Leu Ala Glu Gly Thr Thr Glu Val Glu Gly Phe

35 40 45

ctc gaa ggt gaa gac gcc ctc gcc acg att cag gcg ttc cgt gac atg 192

Leu Glu Gly Glu Asp Ala Leu Ala Thr Ile Gln Ala Phe Arg Asp Met

50 55 60

ggt gtg gtc atc gaa ggc ccg cag cag ggg cgg gtg acc gtc cat ggc 240

Gly Val Val Ile Glu Gly Pro Gln Gln Gly Arg Val Thr Val His Gly

65 70 75 80

gtt ggc ctg cat ggt ctg aag ccg ccg cct ggc ccg atc tat ctg ggt 288

Val Gly Leu His Gly Leu Lys Pro Pro Pro Gly Pro Ile Tyr Leu Gly

85 90 95

aac tcc ggc acc tcc atg cgc ctg ttg tcc ggc ttg ctc gcg gcg cag 336

Asn Ser Gly Thr Ser Met Arg Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ala Ala Gln

100 105 110

ccg ttc gat acc acc ctt act ggc gat gcc tcg ctg tcc aag cgc ccg 384

Pro Phe Asp Thr Thr Leu Thr Gly Asp Ala Ser Leu Ser Lys Arg Pro

115 120 125

atg aat cgc gtc gcc aag ccg ctg cgc gag atg ggc gcg gtc atc gag 432

Met Asn Arg Val Ala Lys Pro Leu Arg Glu Met Gly Ala Val Ile Glu

130 135 140

acg gct gcc gaa ggt cgt ccg ccg ctg acc att cgt ggc ggc cag cgt 480

Thr Ala Ala Glu Gly Arg Pro Pro Leu Thr Ile Arg Gly Gly Gln Arg

145 150 155 160

ctg tcc ggt atg cac tac gac atg ccg atg gcc agc gca cag gtc aaa 528

Leu Ser Gly Met His Tyr Asp Met Pro Met Ala Ser Ala Gln Val Lys

165 170 175

tcc tgt ctg ctg ctg gcc ggc ctg tat gcc gcc gac cag acc tcc atc 576

Ser Cys Leu Leu Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ala Asp Gln Thr Ser Ile

180 185 190

acc gag cct gca ccg act cgt gat cac acc gag cgg atg ctg cgc ggt 624

Thr Glu Pro Ala Pro Thr Arg Asp His Thr Glu Arg Met Leu Arg Gly

195 200 205

ttc ggc tac ccg gta acg gtc gaa gga cgc acc gcg atc gtc gag ccg 672

Phe Gly Tyr Pro Val Thr Val Glu Gly Arg Thr Ala Ile Val Glu Pro

210 215 220

ggg cac aag ctg cgt ggc acc cat atc gag gtg ccg gcg gat atc tcc 720

Gly His Lys Leu Arg Gly Thr His Ile Glu Val Pro Ala Asp Ile Ser

225 230 235 240

tcg gcg gcc ttc ttc atg gtt gcg gcc agc att gca ccg ggc tcg gag 768

Ser Ala Ala Phe Phe Met Val Ala Ala Ser Ile Ala Pro Gly Ser Glu

245 250 255

atc gtg ctc gag cat gta ggg gtc aac ccg acg cgt acc ggt gtg atc 816

Ile Val Leu Glu His Val Gly Val Asn Pro Thr Arg Thr Gly Val Ile

260 265 270

gac atc ctc aag ctg atg ggc ggc gat atc acg ctg gag aac ctt cgc 864

Asp Ile Leu Lys Leu Met Gly Gly Asp Ile Thr Leu Glu Asn Leu Arg

275 280 285

gag gtg ggc ggc gag cct gcc gcc gat atc cgc gtg cgt ggt gcg cag 912

Glu Val Gly Gly Glu Pro Ala Ala Asp Ile Arg Val Arg Gly Ala Gln

290 295 300

ctc aag ggt atc gac att ccc gaa gac ctg gtg ccg ctg gcc atc gac 960

Leu Lys Gly Ile Asp Ile Pro Glu Asp Leu Val Pro Leu Ala Ile Asp

305 310 315 320

gag ttt cct gtg ctc ttc gtt gcc gcg gca tgc gcc cag ggc cgc acc 1008

Glu Phe Pro Val Leu Phe Val Ala Ala Ala Cys Ala Gln Gly Arg Thr

325 330 335

acc ttg cgc ggt gcc gag gag ctg cgc gtc aag gag tcg gat cgt atc 1056

Thr Leu Arg Gly Ala Glu Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp Arg Ile

340 345 350

cag gtc atg gcc gac ggg ctg cag acg ctg ggt atc aag gcg gaa ccg 1104

Gln Val Met Ala Asp Gly Leu Gln Thr Leu Gly Ile Lys Ala Glu Pro

355 360 365

aca ccc gat ggc atc gtc atc gag ggt ggc atg atc ggt tcc ggt gaa 1152

Thr Pro Asp Gly Ile Val Ile Glu Gly Gly Met Ile Gly Ser Gly Glu

370 375 380

gtc tgg gcc cac ggt gat cat cgt atc gcc atg tcg ttc agc gtc gct 1200

Val Trp Ala His Gly Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ser Val Ala

385 390 395 400

gcg ctg cgc gcc agc ggt ccg atc cgc atc cac gat tgc gcg aac gtg 1248

Ala Leu Arg Ala Ser Gly Pro Ile Arg Ile His Asp Cys Ala Asn Val

405 410 415

gcg acc tcg ttc ccc aat ttc ctg gac ctg gct cag cgg gct ggg atg 1296

Ala Thr Ser Phe Pro Asn Phe Leu Asp Leu Ala Gln Arg Ala Gly Met

420 425 430

cag gtt cag gcg gag ggc gcc tca tga 1323

Gln Val Gln Ala Glu Gly Ala Ser

435 440

<210>2

<211>440

<212>PRT

<213>固氮斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)

<400>2

Met His Ser Asn Asp Leu Val Phe Leu Ala Asn Pro Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Thr Gly His Leu Arg Val Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His Arg Ser

20 25 30

Ile Met Leu Gly Ser Leu Ala Glu Gly Thr Thr Glu Val Glu Gly Phe

35 40 45

Leu Glu Gly Glu Asp Ala Leu Ala Thr Ile Gln Ala Phe Arg Asp Met

50 55 60

Gly Val Val Ile Glu Gly Pro Gln Gln Gly Arg Val Thr Val His Gly

65 70 75 80

Val Gly Leu His Gly Leu Lys Pro Pro Pro Gly Pro Ile Tyr Leu Gly

85 90 95

Asn Ser Gly Thr Ser Met Arg Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ala Ala Gln

100 105 110

Pro Phe Asp Thr Thr Leu Thr Gly Asp Ala Ser Leu Ser Lys Arg Pro

115 120 125

Met Asn Arg Val Ala Lys Pro Leu Arg Glu Met Gly Ala Val Ile Glu

130 135 140

Thr Ala Ala Glu Gly Arg Pro Pro Leu Thr Ile Arg Gly Gly Gln Arg

145 150 155 160

Leu Ser Gly Met His Tyr Asp Met Pro Met Ala Ser Ala Gln Val Lys

165 170 175

Ser Cys Leu Leu Leu Ala Gly Leu Tyr Ala Ala Asp Gln Thr Ser Ile

180 185 190

Thr Glu Pro Ala Pro Thr Arg Asp His Thr Glu Arg Met Leu Arg Gly

195 200 205

Phe Gly Tyr Pro Val Thr Val Glu Gly Arg Thr Ala Ile Val Glu Pro

210 215 220

Gly His Lys Leu Arg Gly Thr His Ile Glu Val Pro Ala Asp Ile Ser

225 230 235 240

Ser Ala Ala Phe Phe Met Val Ala Ala Ser Ile Ala Pro Gly Ser Glu

245 250 255

Ile Val Leu Glu His Val Gly Val Asn Pro Thr Arg Thr Gly Val Ile

260 265 270

Asp Ile Leu Lys Leu Met Gly Gly Asp Ile Thr Leu Glu Asn Leu Arg

275 280 285

Glu Val Gly Gly Glu Pro Ala Ala Asp Ile Arg Val Arg Gly Ala Gln

290 295 300

Leu Lys Gly Ile Asp Ile Pro Glu Asp Leu Val Pro Leu Ala Ile Asp

305 310 315 320

Glu Phe Pro Val Leu Phe Val Ala Ala Ala Cys Ala Gln Gly Arg Thr

325 330 335

Thr Leu Arg Gly Ala Glu Glu Leu Arg Val Lys Glu Ser Asp Arg Ile

340 345 350

Gln Val Met Ala Asp Gly Leu Gln Thr Leu Gly Ile Lys Ala Glu Pro

355 360 365

Thr Pro Asp Gly Ile Val Ile Glu Gly Gly Met Ile Gly Ser Gly Glu

370 375 380

Val Trp Ala His Gly Asp His Arg Ile Ala Met Ser Phe Ser Val Ala

385 390 395 400

Ala Leu Arg Ala Ser Gly Pro Ile Arg Ile His Asp Cys Ala Asn Val

405 410 415

Ala Thr Ser Phe Pro Asn Phe Leu Asp Leu Ala Gln Arg Ala Gly Met

420 425 430

Gln Val Gln Ala Glu Gly Ala Ser

435 440

<210>3

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gggaagcttt catgaggcgc cctccgcct 29

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gggcatatgc attccaatga cct 23

Claims

1.一种分离的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；

(b)SEQ ID NO:2氨基酸序列经过第6位Leu变为Ile、或第130位Asn突变为Ser、Asp或Gly而形成的，且具有草甘膦抗性的多肽。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)SEQ ID NO:1中1-1323位的序列；

(b)SEQ ID NO:1中1-1320位的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体；或其基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸。

7.一种权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出权利要求1所述的多肽。

8.权利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，用于提高植物草甘膦抗性。

9.权利要求1所述的多肽的编码基因的用途，其特征在于，用于提高植物草甘膦抗性。

10.一种制备具有草甘膦抗性的植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体中含有权利要求1所述多肽的编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使权利要求1所述多肽的编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入权利要求1所述多肽的编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。