CN109136243B - 改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法 - Google Patents

改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及改造禾谷类作物识别结瘤因子(Nod factors)并增加根瘤菌定殖数目的方法。本发明人首次鉴定获得一个新的水稻Myc factors受体，即MYR1基因；在此基础上，本发明揭示了一种改造禾谷类作物使之识别结瘤因子(Nod factors)并增加根瘤菌定殖数目的方法。

Description

改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法
技术领域
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及改造禾谷类作物识别结瘤因子(Nod factors)并增加根瘤菌定殖数目的方法。
背景技术
根瘤共生(Root Nodule Symbiosis，RNS)是豆科植物与根瘤菌之间形成的另一种互利互惠的共生形式。根瘤菌可以侵入植物皮层，刺激皮层细胞分裂形成膨大器官根瘤。在根瘤的厌氧微环境中，根瘤菌可以利用固氮酶将空气中的N2还原成NH4 +被植物所利用，从而减少植物对氮肥的依赖。
氮是植物生长所必需的大量元素，也是农业生产的限制因素。目前世界上超过一半的食物是通过施用化肥(尤其是氮肥)获得的，而作物40～60％(热带土壤甚至高达90％)的产量也都归因于氮肥的使用，过度使用氮肥不仅提高了生产成本，同时对环境也造成了沉重的负担。每年约有40％未被植物利用氮肥直接脱氨形成N2回归大气之中，造成了严重的能源和资源浪费；其次，氮肥代谢产生的N2O是一种重要的“温室效应”气体，其GWP(100-year Average Global-Warming Potential)是CO2的296倍。再者，随着灌溉和雨水流入江河湖海的氮肥也会造成水体富营养化等危害。因此，在农业生产上引入根瘤共生系统对减少氮肥使用和农业可持续发展都有重要意义。
世界上最重要的三大粮食作物(禾谷类作物)水稻、小麦和玉米都不能与根瘤菌共生，但是，禾谷类作物拥有common symbiosis signal pathway(CSSP)的事实为改造禾谷类作物进行根瘤共生提供了可能。目前，禾谷类作物改造主要集中在以下3个方面：1)Nodfactors受体；2)根瘤特异转录因子(如ERN、NIN等)；3)固氮酶和合适的固氮微环境，其中改造受体使其识别Nod factors是禾谷类作物改造的首要任务。
因此，本领域需要加强对禾谷类作物识别Nod factors的研究，使得禾谷类作物进行根瘤固氮成为一种可能。
发明内容
本发明的目的在于提供改造禾谷类作物识别结瘤因子(Nod factors)并增加根瘤菌定殖数目的方法。
在本发明的第一方面，提供一种改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目的方法，所述方法包括：将禾谷类作物中MYR1基因的胞外区与根瘤植物中其同源基因的胞外区替换，获得融合基因1；或将禾谷类作物中CERK1基因的胞外区与根瘤植物中其同源基因的胞外区替换，获得融合基因2；将该融合基因1和2引入禾谷类作物中，从而获得识别结瘤因子或根瘤菌定殖数目增加的禾谷类作物。
在一个优选例中，所述的根瘤植物包括：豆科植物；较佳地，包括(但不限于)：苜蓿，大豆、百脉根、豌豆、鹰嘴豆，上述的豆科作物基因组中都有MtLYK3和MtNFP的同源基因。
在另一优选例中，所述的禾谷类作物包括(但不限于)：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦，玉米，高粱，上述的禾谷类作物的基因组中都有CERK1和MYR1的同源基因。
在另一优选例中，所述的MYR1基因编码的多肽选自：
(a)如SEQ ID NO:3氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:3氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的CERK1基因编码的多肽选自：
(a)如SEQ ID NO:4氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:4氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的根瘤植物中的同源基因包括(但不限于)：蒺藜苜蓿中的LYK3基因和NFP基因，百脉根中的NFR1基因和NFR5基因，大豆中的NFR1α基因和NFR5α基因，NFR1β基因和NFR5β基因，以及豌豆的SYM10基因。
在另一优选例中，所述的LYK3基因编码的多肽选自：
(a)如SEQ ID NO:5氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:5氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的NFP基因编码的多肽选自：
(a)如SEQ ID NO:6氨基酸序列的蛋白；
(b)将SEQ ID NO:6氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或
(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。
在另一优选例中，所述的MYR1基因编码的多肽的胞外域具有SEQ ID NO:3中第1～246位序列；或
所述的CERK1基因编码的多肽的胞外域具有SEQ ID NO:4中第1～232位序列；或
所述的LYK3基因编码的多肽的胞外域具有SEQ ID NO:5中第1～224位序列；或
所述的NFP基因编码的多肽的胞外域具有SEQ ID NO:6中第1～246位序列。
在另一优选例中，将该融合基因1和2共同引入禾谷类作物中。
在另一优选例中，通过农杆菌转化法将该融合基因引入禾谷类作物中。
在本发明的另一方面，提供一种融合基因，所述的融合基因包括胞内区、跨膜区以及胞外区，其中所述的胞内区、跨膜区是禾谷类作物中MYR1基因或CERK基因的胞内区及跨膜区；所述的胞外区是根瘤植物的LYK3基因或NFP基因的胞外区。
在本发明的另一方面，提供一种融合多肽，其由所述的融合基因编码而成。
在本发明的另一方面，提供所述的融合基因或所述的融合多肽的用途，用于改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目。
在本发明的另一方面，提供禾谷类作物中的MYR1多肽的用途，用于与CERK1多肽相互作用，起始菌根共生信号途径。
在本发明的另一方面，提供一种起始禾谷类作物的菌根共生信号途径的方法，所述方法包括：使禾谷类作物中MYR1多肽与CERK1多肽相互作用，从而起始菌根共生信号途径。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、Osmyr1突变体的菌根共生水平分析。
A，OsMYR1的蛋白结构模式图。图中以不同颜色标注出信号肽(SP，黄色)、LysM结构域(LysM1，LysM2，LysM3，粉色)、跨膜结构域(TM，红色)、激酶结构域(KD，蓝色)以及移码造成的错误编码区域(紫色)。激酶结构域处的箭头代表检测OsMYR1转录水平的引物所在位置。
B，纯合突变体Osmyr1-1、Osmyr1-2和Osmyr1-3中OsMYR1的转录水平检测。OsMYR1的表达水平以内参基因CYCLOPHILIN2进行标准化，误差线代表3次技术重复的标准误。
C～E，Osmyr1突变体中菌根共生水平的统计学分析。接种R.irregularis 3周、4周和5周的EV、Osmyr1-1、Osmyr1-2和Osmyr1-3植株根经“墨水-醋酸染色法”染色后，统计arbuscule和internal hyphae的数目，“Total”代表arbuscule和internal hyphae的总和。差异显著性用t-test检测，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)。三次重复实验均获得一致结果。
F，菌根共生特异marker基因的表达分析。目标基因的表达水平以内参基因CYCLOPHILIN2进行标准化，误差线代表3次技术重复的标准误。
图2、Osmyr1与Oscerk1突变体对Myc factor CO4的响应能力检测。
无菌培养6～8天的水稻幼苗根尖用10-8M CO4处理后进行钙振荡检测。右侧括号中的数字代表产生钙振荡的细胞数与所有被检测的细胞数的比值。标尺为10min。
图3、OsMYR1与OsCERK1互作。
A，共表达BD-OsMYR1KD和AD-OsCERK1KD的酵母可在SD–LWH(-Leu/-Trp/-His)培养基上正常生长，表明OsMYR1和OsCERK1的胞内域能互作；
B，MBP-OsMYR1KD能pull down His-OsCERK1KD，而阴性对照MBP则不能；
C，BiFC验证OsMYR1和OsCERK1全长蛋白在拟南芥原生质体中相互作用。共表达OsMYR1-YN和OsCERK-YC的原生质体可检测到YFP荧光信号。OsDIP1-YN和OsRAM1-YC为阳性对照，OsCERK1-YC和AtBRI1-YN以及AtBRI1-YC和OsMYR1-YN为阴性对照。标尺为10μm；
D，水稻中OsMYR1和OsCERK1相互作用。OsCERK1抗体(αCERK1)能免疫共沉淀OsCERK1和过表达材料OsMYR1-GFP-9中的OsMYR1-GFP。
图4、OsMYR1直接结合CO4。
A，原生质体中瞬时表达的OsMYR1-FLAG能被chitin resin亲和纯化；而OsCERK1不结合chitin，也不影响OsMYR1与chitin结合；
B，缺失任何LysM结构域的OsMYR1都会丧失结合chitin的能力。OsMYR1-ΔLysM1、OsMYR1-ΔLysM2和OsMYR1-ΔLysM3分别代表缺失LysM1、LysM2和LysM3的OsMYR1；
C，CO4竞争chitin对OsMYR1的结合。随着CO4浓度逐渐升高(10-6M、10-5M和10-4M)，结合chitin的OsMYR1逐渐减少；
D，LPS不显著影响chitin结合OsMYR1；
E，OsMYR1ECD结合CO4。OsMYR1ECD能被CO4agarose beads亲和纯化，而阴性对照OsCERK1KD不能；
F，利用MST技术分别测量OsMYR1、OsCERK1对CO4和LPS的结合常数。OsMYR1与CO4的亲和力在纳摩尔(nM)级别。误差线代表3次技术重复的标准误。
图5、CO4促进OsMYR1与OsCERK1相互作用和磷酸化。
A，CO4促进OsMYR1与OsCERK1互作。共表达OsMYR1-FLAG和OsCERK1-GFP的原生质体经H2O或10-5M CO4处理10min后进行co-IP实验。CO4显著增加了OsMYR1-FLAG对OsCERK1-GFP的免疫沉淀水平；
B，OsMYR1与OsCERK1的激酶活性检测。在GST-OsMYR1KD和MBP-OsCERK1KD的体外磷酸化体系中加入γ-32P-ATP进行激酶活性测定。OsCERK1KD-T484A为突变氨基酸T484为A的OsCERK1KD蛋白，无激酶活性；MyBP是通用磷酸化底物，用作阳性对照；
C～D，CO4促进OsCERK1与OsMYR1的磷酸化。利用Phos-tag SDS-PAGE和Westernblot检测水稻茎中OsCERK1(C)和OsMYR1(D)的磷酸化水平。CO4能促进OsCERK1与OsMYR1磷酸化。*代表磷酸化形式的蛋白。
图6、嵌合受体的构建及生物学功能检测。
A～B，嵌合受体能互补苜蓿hcl-1和nfp-1突变体的根瘤缺陷表型。MtLYK3和Mt/OsCERK1都能互补hcl-1的根瘤表型，但EV和OsCERK1不能；类似地，MtNFP和Mt/OsMYR1都能互补nfp-1的根瘤表型，但EV和OsMYR1不能。图A标尺为0.5mm，图B中误差线为标准误。3次重复试验结果一致。
C，嵌合受体的构建模式图；将OsCERK1(SEQ ID NO:4中第1～232位)与OsMYR1的胞外域(SEQ ID NO:3中第1～246位)分别替换成MtLYK3(SEQ ID NO:5中第1～224位)和MtNFP的胞外域(SEQ ID NO:6中第1～246位)从而形成嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1；信号肽(SP)、LysM结构域(LysM1、LysM2和LysM3)、跨膜结构域(TM)和激酶结构域(KD)分别用黄色、粉色、红色和蓝色标注。
D，Nod factors能促近嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的磷酸化(箭头所示为磷酸化的蛋白条带)；在拟南芥原生质体中共表达的嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1经10-5MNod factor处理10min后进行Phos-tag SDS PAGE和Western blot检测；Nod factors来源于Sm1021根瘤菌。
E，Nod factors不影响OsCERK1和OsMYR1的磷酸化。
图7、转基因水稻中嵌合受体的表达水平及Nod factors诱导的细胞核钙振荡检测。
A，qPCR检测水稻转基因植株Mt/Os-1和Mt/Os-2中Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的表达水平。误差线代表3次技术重复的标准误；
B，Nod factors能诱导Mt/Os-1和Mt/Os-2产生钙振荡。标尺为10min。
图8、根瘤菌在共表达嵌合受体的转基因水稻中定殖数量增加。
A～G，带有mCherry标签的根瘤菌Sm1021侵染EV、Mt/Os-1和Mt/Os-2 2周后，根瘤菌定殖在水稻根毛(A)、侧根发生部位(B)、根内部的水稻细胞中(C～G)(箭头所示)。标尺为100μm；H，Mt/Os-1和Mt/Os-2中根瘤菌的定殖数显著多于EV。误差线代表标准误。差异显著性用T-test检测。**表示差异极显著(p<0.01)。三次重复实验均表现一致的结果。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，鉴定获得一个新的水稻Myc factors受体，即MYR1基因；在此基础上，本发明还揭示了一种改造禾谷类作物使之识别结瘤因子(Nod factors)并增加根瘤菌定殖数目的方法。
如本文所用，所述的“禾谷类作物”可以是禾本科植物或有芒植物(作物)。较佳地，所述的禾本科植物是水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦、玉米、高粱等。有芒植物是指种子壳上存在针状物植物。所述的“禾谷类作物”是带有MYR1基因的植物。
如本文所用，所述的“MYR1基因”或“MYR1多肽”是指禾谷类作物中，与水稻来源的MYR1基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。
如本文所用，所述的“CERK1基因”或“CERK1多肽”是指禾谷类作物中，与水稻来源的CERK1基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。
如本文所用，所述的“LYK3基因”或“LYK3多肽”是指根瘤植物中，与苜蓿来源的LYK3基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。
如本文所用，所述的“NFP基因”或“NFP多肽”是指根瘤植物中，与苜蓿来源的NFP基因或多肽同源的、含有基本相同的结构域、具有基本相同的功能的基因或多肽。
本发明中，将禾谷类作物中的MYR1基因与根瘤植物中的同源基因的胞外区替换，获得融合基因1；或将禾谷类作物中的CERK1基因的胞外区与根瘤植物中的同源基因的胞外区替换，获得融合基因2；将该融合基因1和2同时引入禾谷类作物中，从而获得识别结瘤因子或根瘤菌定殖数目增加的禾谷类作物。
所述的MYR1多肽、CERK1多肽的胞内区、跨膜区，以及LYK3多肽、NFP多肽的胞外区，还包括它们的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述的胞内区、跨膜区或胞外区相同的生物学功能或活性的蛋白片段，可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。所述的MYR1多肽、CERK1多肽的胞内区、跨膜区，以及LYK3多肽、NFP多肽的胞外区的生物活性片段都可以应用到本发明中。
在本发明中，术语“MYR1多肽”指具有MYR1多肽活性的SEQ ID NO:3序列的蛋白。该术语还包括具有与MYR1多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
在本发明中，术语“CERK1多肽”指具有CERK1多肽活性的SEQ ID NO:4序列的蛋白。该术语还包括具有与CERK1多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
在本发明中，术语“LYK3多肽”指具有LYK3多肽活性的SEQ ID NO:5序列的蛋白。该术语还包括具有与LYK3多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:5序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
在本发明中，术语“NFP多肽”指具有NFP多肽活性的SEQ ID NO:6序列的蛋白。该术语还包括具有与NFP多肽蛋白相同功能的、SEQ ID NO:6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。
本发明中，MYR1多肽、CERK1多肽的胞内区、跨膜区，分别与LYK3多肽、NFP多肽的胞外区，进行融合，获得融合多肽，该融合多肽使得禾谷类作物具有识别结瘤因子的能力，增加根瘤菌定殖数目。
编码所述的融合蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
应理解，虽然本发明的MYR1基因、CERK1基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻MYR1基因、CERK1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。这是因为菌根共生在植物里面非常保守，可以预期其它禾谷类作物的同源基因也具有类似的功能。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
同样地，虽然本发明的LYK3基因、NFP基因优选获自苜蓿，但是获自其它植物的与苜蓿LYK3基因、NFP基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。
包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含合适的表达载体。
宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。
在本发明的具体实施例中，本发明人利用反向遗传学法鉴定到了一个显著影响水稻菌根共生水平的类受体蛋白激酶OsMYR1。敲除OsMYR1(Osmyr1)能显著降低菌根共生和共生早期marker基因如AM1和AM3的表达水平，也能抑制水稻对Myc factor CO4的响应，如非根毛细胞产生钙振荡以及根系发育等。此外，OsMYR1能以较高亲和力直接结合CO4，这说明OsMYR1是Myc factor CO4的受体。
利用细胞生物学和生物化学等方法，本发明人发现OsMYR1能与OsCERK1相互作用，且CO4能促进OsMYR1-OsCERK1复合体形成和OsMYR1与OsCERK1的磷酸化。由于底物诱导的蛋白复合体形成和磷酸化是信号转导的重要形式，在植物和动物中都普遍存在，因此，本发明人提出了水稻对Myc factors的识别和信号转导的模型：Myc factor CO4被OsMYR1结合后，诱导OsMYR1-OsCERK1复合体的形成以及OsCERK1自磷酸化和磷酸化OsMYR1，从而起始菌根共生信号途径。这一研究成果加深了对菌根共生的认识，也为改造水稻使其识别Nodfactors提供了理论支持。
本发明人利用基因工程技术，分别将OsCERK1和OsMYR1的胞外域替换为MtLYK3和MtNFP的胞外域，从而形成嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1。本发明人发现，Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1能分别恢复hcl-1和nfp-1突变体的根瘤缺陷表形，Nod factors也能诱导Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1磷酸化。更重要的是，共表达联合受体的水稻能识别Nod factors产生钙振荡，并能显著增加根瘤菌在水稻根中的定殖数量，这说明在禾谷类作物中表达嵌合受体是改造禾谷类作物识别Nod factors的一种可行方式。本发明为改造非豆科植物(主要是禾谷类作物)进行根瘤固氮提供了重要的理论依据和实验基础。
本发明的主要优点在于：
1)本发明筛选到了一个新的水稻Myc factors受体OsMYR1，通过对OsMYR1的功能进行深入研究后，本发明人提出了水稻对Myc factors的识别和信号转导的模型：Mycfactor CO4被OsMYR1结合后，诱导OsMYR1-OsCERK1复合体的形成以及OsCERK1自磷酸化和磷酸化OsMYR1，从而起始菌根共生信号途径。这一理论研究成果提出了对菌根共生的新认识，也为改造水稻使其识别Nod factors提供了理论支持。
2)本发明人利用基因工程技术，分别将OsCERK1和OsMYR1的胞外域替换为MtLYK3和MtNFP的胞外域形成嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1。共表达嵌合受体MtLYK3/OsCERK1和MtNFP/OsMYR1的水稻能识别Nod factors，并能增加根瘤菌的定殖数量。这一发明成功地改善了水稻识别Nod factors的能力，为改造非豆科植物(主要是禾谷类作物)进行根瘤固氮提供了重要的理论依据和实验基础。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
I.材料和方法
1.实验材料
1.1.菌株和载体
大肠杆菌菌株：DH5α、BL21、Rosetta(购自Invitrogen)；
农杆菌菌株：EHA105、Arqua1(购自Invitrogen)；
酵母(Saccharomyces Cerevisiae)菌株：AH109(购自Clontech)；
基因克隆入门载体：pDONR207(购自Invitrogen)；
转基因构建载体：pK7m34GW2-8m21GW3、LjUBQpro-pK7WG2-R、pCAM1301-FLAG和pCAM1301-GFP(获至上海植物生理生态研究所)；
CRISPR/Cas9构建载体：sgRNA vector和pH-Ubi-cas9-7(获自北京大学)；
酵母双杂交载体：pDEST-GBKT7和pDEST-GADT7(购自Clontech)；
蛋白表达载体：pFastBac1(Invitrogen)
Co-IP载体：pUC19-FLAG和pUC19-GFP(获自上海植物生理生态研究所)；
BiFC载体：pSAT4-YN和pSAT4-YC(获自上海植物生理生态研究所)；
RNAi载体：pTCK303(获自中国科学院植物研究所)。
1.2.植物材料
水稻(Oryza sativa)：野生型日本晴水稻(Nipponbare)(获自上海植物生理生态研究所)；稳定转化Yellow Cameleon 3.6(YC3.6)的日本晴水稻(获自英国John Innescentre)。
基于野生型日本晴水稻，OsCERK1RNAi转基因材料，CRISPR/Cas9定点突变的OsMYR1转基因材料Osmyr1-1、Osmyr1-2和Osmyr1-3和OsCERK1转基因材料Oslyk9-1，以及YC3.6背景下共表达嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的转基因材料Mt/Os-1和Mt/Os-2为本发明人构建。
OsCERK1RNAi植株的构建：以SEQ ID NO:4中第403～517位的序列为RNAi靶点，以pTCK303为终载体构建RNAi质粒，转入野生型日本晴水稻。
Oslyk9-1突变体的构建：以SEQ ID NO:4中第129～135位的序列为sgRNA靶序列，以pH-Ubi-cas9-7为终载体构建pCRISPR-OsCERK1质粒，转入野生型日本晴水稻。
Osmyr1-1突变体的构建：以SEQ ID NO:2中第137～156位的序列为sgRNA，以pH-Ubi-cas9-7为终载体构建pCRISPR-OsMYR1-1质粒，转入野生型日本晴水稻。
Osmyr1-2和Osmyr1-3突变体的构建：以SEQ ID NO:2中第670～189位的序列为sgRNA，以pH-Ubi-cas9-7为终载体构建pCRISPR-OsMYR1-2质粒，转入野生型日本晴水稻。
OsMYR1-GFP-9的获得或构建：克隆SEQ ID NO:3中第1～624位的序列，连入pCAM1301-GFP载体，构建好的OsMYR1-GFP过表达质粒转入野生型日本晴水稻。
OsCERK1-FLAG-7的获得或构建：克隆SEQ ID NO:4中第1～624位的序列，连入pCAM1301-FALG载体，将构建好的OsMYR1-GFP过表达质粒转入野生型日本晴水稻。
Mt/Os-1和Mt/Os-2的获得或构建：将SEQ ID NO:5中第1～224位序列与SEQ IDNO:4中第238～624位序列融合成嵌合基因Mt/OsCERK1；将SEQ ID NO:6中第1～246位序列与SEQ ID NO:3中第247～624位序列融合成嵌合基因Mt/OsMYR1。将Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1同时连入pK7m34GW2-8m21GW3载体，并将构建好的质粒转入野生型日本晴水稻。
水稻种子用75％(v/v)乙醇消毒1min，25％(v/v)次氯酸钠消毒25min，无菌水冲洗5次，均匀种在1/2MS培养基上。在光照培养箱(16h光照、30℃，8h黑暗、22℃)中培养10～14天后，健康的水稻幼苗被移栽至人工气候室(12h光照、30℃，12h黑暗、22℃)。
蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)：生态型A17(获自上海植物生理生态研究所)、突变体hcl-1和nfp-1(获自法国科学研究中心)。苜蓿种子经砂纸充分打磨(看到种子表明有白色印迹)后，用10％(v/v)次氯酸钠表面消毒2～3min，无菌水冲洗5次，均匀种在1％琼脂平板上。培养皿用封口膜封口，于4℃冰箱黑暗处理2～4天后移至22℃、16h光照培养箱。
1.3.植物材料遗传杂交
YC3.6作为父本与Osmyr1-1植株杂交，获得Osmyr1-1/YC3.6植株，用于检测Osmyr1-1植株钙振荡；
YC3.6作为父本与OsCERK1RNAi植株杂交，获得OsCERK1RNAi/YC3.6，用于检测OsCERK1RNAi植株钙振荡；
YC3.6作为父本与Oslyk9-1植株杂交，获得Oslyk9-1/YC3.6植株，用于检测Oslyk9-1植株钙振荡；
2.实验方法
2.1.重组质粒的构建
分别将引物CRISPR-OsMYR1-F1/R1、CRISPR-OsMYR1-F2/R2和CRISPR-OsCERK1-F1/R1退火并连接到sgRNA vector上，转化大肠杆菌，鉴定阳性克隆并测序验证。正确的构建体与pH-Ubi-cas9-7进行LR(购自Invitrogen)重组反应，获得的重组质粒分别称为：pCRISPR-OsMYR1-1、pCRISPR-OsMYR1-2和pCRISPR-OsCERK1用于水稻稳定转化。
分别以attB1-MtLYK3-F/MtLYK3-EC-R和attB1-MtNFP-F/MtNFP-EC-R为引物，以蒺藜苜蓿A17cDNA为模版，利用高保真DNA聚合酶KOD-FX(购自Toyobo)，克隆SEQ ID NO:5中第1～224位序列和SEQ ID NO:6中第1～246位序列，分别记为MtLYK3-EC和MtNFP-EC；同时，以OsCERK1-IC-F/attB2-OsCERK1-R和OsMYR1-IC-F/attB2-OsMYR1-R为引物，以水稻日本晴cDNA为模版，利用KOD-FX，分别克隆SEQ ID NO:4中第233～624位序列和SEQ ID NO:3中第247～624位序列，记为OsCERK1-IC和OsMYR1-IC。通过融合PCR技术，将MtLYK3-EC和OsCERK1-IC融合为Mt/OsCERK1，将MtNFP-EC与OsMYR1-IC融合为Mt/OsMYR1。Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1通过BP重组反应连接至入门载体pDONR207(购自Invitrogen)，分别获得pDONR207-Mt/OsCERK1和pDONR207-Mt/OsMYR1载体。将上述载体分别与pK7m34GW2-8m21GW3进行LR重组反应，获得重组质粒pK7m34GW2-8m21GW3-Mt/OsCERK1-Mt/OsMYR1，用于水稻稳定转化。此外，分别将pDONR207-Mt/OsCERK和pDONR207-Mt/OsMYR1与载体LjUBQpro-pK7WG2-R进行LR重组反应，获得质粒pK7WG2-Mt/OsCERK1和pK7WG2-Mt/OsMYR1，用于苜蓿毛根转化。
分别以attB1-MtLYK3-F/attB2-MtLYK3-R和attB1-MtNFP-F/attB2-MtNFP-R为引物，从苜蓿cDNA模板上克隆SEQ ID NO:5序列和SEQ ID NO:6序列，记为MtLYK3和MtNFP。通过BP重组反应，将MtLYK3和MtNFP连接至入门载体pDONR207。经测序验证后，将正确的构建分别与LjUBQpro-pK7WG2-R进行LR重组反应，获得质粒pK7WG2-MtLYK3和pK7WG2-MtNFP，用于苜蓿毛根转化。分别以attB1-OsCERK1-F/attB2-OsCERK1-R和attB1-OsMYR1-F/attB2-OsMYR1-R为引物，从水稻cDNA模版上克隆SEQ ID NO:4序列和SEQ ID NO:3序列，记为OsCERK1和OsMYR1。与载体pDONR207进行BP重组反应后，获得质粒pDONR207-OsCERK1和pDONR207-OsMYR1。将该载体与LjUBQpro-pK7WG2-R进行LR重组反应，获得质粒pK7WG2-OsCERK1和pK7WG2-OsMYR1用于苜蓿毛根转化；该载体分别与pSAT4-YN和pSAT4-YC进行LR重组反应，获得载体OsCERK1-YN和OsMYR1-YC，用于原生质体瞬时转化和BiFC观察；该载体分别与pCAM1301-FLAG和pCAM1301-GFP进行LR重组反应，获得的载体OsCERK1-FLAG和OsMYR1-GFP用于水稻稳定转化。
分别以attB1-OsCERK1-KD-F/attB2-OsCERK1-R(TGA)和attB1-OsMYR1-KD-F/attB2-OsMYR1-R(TGA)为引物，从水稻cDNA模版上克隆SEQ ID NO:4中第261～624位序列和SEQ ID NO:3中第270～624位序列，记为OsCERK1KD和OsMYR1KD。将该序列分别连入载体pDEST-GBKT7和pDEST-GADT7，获得GBKT7-OsMYR1KD和GADT7-OsCERK1KD载体用于酵母双杂交。
分别以OsMYR1-EC-F/OsMYR1-EC-R为引物，从水稻cDNA模版上克隆SEQ ID NO:3中第23～246位序列，记为OsMYR1ECD。将该序列连入载体pFastBac1，获得pFastBac1-OsMYR1ECD质粒转入昆虫细胞进行的OsMYR1胞外域表达。
引物序列如表1。
表1
Figure BDA0001333808480000131
Figure BDA0001333808480000141
2.2.植物遗传转化及筛选
水稻遗传转化：取开花后7～10天的水稻日本晴种子进行表面消毒(75％酒精5min，30％次氯酸钠40min，无菌水清洗5次)，切下幼胚，于诱导培养基上诱导愈伤形成。同时，将构建好的质粒pCRISPR-OsMYR1-1、pCRISPR-OsMYR1-2、pCRISPR-OsCERK1和pK7m34GW2-8m21GW3-Mt/OsCERK-Mt/OsMYR1用电击转化法转入EHA105农杆菌菌株，28℃培养2天。挑取单菌落接种到5ml含有相应抗生素的LB培养基中，28℃振荡培养过夜。第二天按1：50比例将农杆菌接种于AB培养基中，28℃振荡培养4～5h。5000rpm离心收集菌体后，用含有20mg/L乙酰丁香酮的AAM培养基重悬菌体至OD600＝0.4。用此重悬的菌液浸泡愈伤20min，捞出愈伤，用滤纸吸干，置于共培养基上28℃暗培养3天。取出愈伤，彻底剥离根，移入S1培养基中暗培养7天。将愈伤转到S2培养基上，28℃暗培养10天，筛选抗性愈伤。将抗性愈伤转到预分化培养基中暗培养7天后，再转入分化培养基光照培养15～30天。待小苗长到2-3cm，切除此时长出来的根，转入生根培养基上发根。
苜蓿毛根转化：将蒺藜苜蓿A17、突变体hcl-1和nfp-1种子用砂纸充分打磨(看到种子表明有白色印迹)和表面消毒后，种在1％琼脂平板上萌发。同时，将构建好的质粒pK7WG2-MtLYK3、pK7WG2-MtNFP、pK7WG2-OsCERK1、pK7WG2-OsMYR1、pK7WG2-MtL/OsCERK1和pK7WG2-Mt/OsMYR1用电击转化法转入Arqual农杆菌菌株，28℃培养2天。挑取单菌落接种到5ml含有相应抗生素的TY培养基中，28℃振荡培养过夜。第二天按1：50比例将农杆菌接种于100ml含有相应抗生素的TY培养基中，振荡培养10-16h，至OD600＝0.6～0.8。4000rpm离心收集菌体后，用5ml无抗TY培养基重悬菌体备用。取出萌发12～18h的苜蓿幼苗，切掉根尖3～5mm后，浸没在上述重悬的菌液中。依次将浸泡后的幼苗转入FP培养基中，22℃竖直、光照培养。7天后，将胚根附近长出的根完全切掉，再将幼苗依次转入Mod FP培养基中。22℃竖直、光照培养3～4周。
本实施例所用培养基：
1)FP培养基：
母液：CaCl2·2H2O：40.0g/L；MgSO4·7H2O：40.0g/L；KH2PO4：30.0g/L；Na2HPO4·12H2O：45.0g/l L；FeC6H5O7：2.5g/L。
Gibson’s Trace：H3BO3：2.86g/L；MnSO4·4H2O：2.03g/L；ZnSO4·7H2O：220mg/L；CuSO4·5H2O：80mg/L；H2MoO4：80mg/L。
用上述母液配制FP培养基(1L)：CaCl2·2H2O：2.5mL；MgSO4·7H2O：3.0mL；KH2PO4：3.33mL；Na2HPO4·12H2O：3.33mL；FeC6H5O7：2.0mL；Gibson’s Trace：1.0mL；Agar 5.0g(根据实验需要加入)；ddH2O：加至1L；用NaOH调整pH至6.3-6.7。
2)Mod FP培养基
母液I：CaCl2·2H2O：132.3g/L；MgSO4·7H2O：123.2g/L；KH2PO4：95.3g/L；Na2HPO4：113.6g/L；FeC6H5O7：4.9g/L；NH4NO3：40g/L。
母液II：MnCl2·4H2O：100mg/L；CuSO4·5H2O：100mg/L；ZnCl2：100mg/L；H3BO4：100mg/L；Na2MoO4·2H2O：100mg/L。
用上述母液配制Mod FP培养基(1L)：母液I：1mL；母液II：1mL；Agar：8g(根据实验需要加入)；ddH2O：加至1L；用NaOH调整pH至6.0-6.3。
2.3.数据分析平台与软件
序列BLAST分析：NCBI在线分析平台，Rice Genome Annotation Project。
序列分析：Rice Genome Annotation Project，RAP-DB，vectorNTI 10.3软件。
结构域预测分析：Motif Scan，Pfam，SMART。
引物设计：Primer3Plus在线分析平台。
定量PRC数据分析：LinRegPCR软件，qBaseplus软件
2.4.水稻总RNA提取
为保障RNA提取质量，本实验所用枪头、离心管、试剂一律为RNase-free。
1)取约100mg植物材料，置于2mL离心管中；
2)在液氮中将植物材料充分研磨成粉末状，然后加入1mL Trizol试剂和20μLβ-巯基乙醇，立即涡旋混匀；
3)4℃、12000rpm离心15min，将上清转移至洁净的1.5mL离心管中；
4)加入200μL氯仿，剧烈混匀15sec，12000rpm离心10min；
5)小心地吸取300μL上层溶液至1.5mL RNase-free离心管中，再加入150μL氯仿，剧烈混匀15sec，12000rpm离心10min；
6)小心地吸取250μL上层溶液至1.5mL RNase-free离心管中，再加入625μL无水乙醇，剧烈混匀15sec，-20℃静置沉降30min；
7)4℃、12000rpm离心10min；
8)弃上清，加入500μL 75％乙醇，重悬沉淀，12000rpm离心10min；
9)弃上清，待沉淀完全干燥后，加入20-25μL RNase-free水溶解沉淀；
10)在RNase-free离心管中配制以下反应液：
Total RNA：20-25μL
10x DNase I buffer：5μL
Recombinant DNase I：2μL
RNase inhibitor：1μL
RNase-free H2O：加至50μL
11)37℃反应30min；
12)向反应液中加入450μL RNase-free H2O定容至500μL后，加入等体积水酚/氯仿，涡旋混匀；
13)4℃、12000rpm离心5min；
14)将上清转移至RNase-free离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠和2.5倍体积的冷异丙醇，涡旋混匀，-20℃沉降30-60min；
15)4℃、12000rpm离心5min；
16)弃上清，加入1mL 75％乙醇重悬沉淀；
17)4℃、12000rpm离心5min；
18)弃上清，待沉淀完全干燥后，加入20μL RNase-free水溶解沉淀；
19)取2μL RNA进行电泳或用分光光度法检测其质量和浓度；
20)将质量好的RNA分装，置于-80℃保存或者直接进行后续实验。
2.5.反转录及定量PCR
1)在RNase-free PCR管中配制以下反应液：
RNA：1μg
Oligo(dT)12-18primer(50μM)：1μL
RNase free H2O：加至6μL
2)70℃保温10min后立即冰上急冷10min；
3)在上述反应液中加入以下转录反应液：
5x M-MLV Buffer：4μL
dNTP mixture：4μL
RNase Inhibitor：0.5μL
RTase M-MLV(RNase H-)：1μL
RNase free H2O：加至20μL
4)42℃反应1h；
5)70℃反应15min后，取0.5μL cDNA作为模板，用跨内含子的引物，检测cDNA中是否存在gDNA污染。
6)将cDNA按5μL/管分装在PCR管中，保存于-80℃冰箱备用。
定量PCR引物序列如表2。
表2
Figure BDA0001333808480000171
II.实施例
实施例1、Osmyr1突变体的菌根共生水平分析
通过CRISPR/Cas9定点突变技术，本发明人共分离获得了3个OsMYR1纯合突变体株系Osmyr1-1、Osmyr1-2和Osmyr1-3。它们的突变情况如下(图1A)：
Osmyr1-1：缺失1个碱基，导致蛋白编码提前终止在LysM1结构域。
Osmyr1-2：缺失了1个碱基，导致OsMYR1基因在蛋白翻译过程中移码，并提前终止在胞外域。
Osmyr1-3：增加了1个碱基，导致OsMYR1基因在蛋白翻译过程中移码，并提前终止在胞内域。
定量PCR分析显示，Osmyr1-1和Osmyr1-2中OsMYR1的转录水平分别下调至0.22±0.03和0.25±0.05，而Osmyr1-3中OsMYR1的转录水平并未出现显著改变(0.93±0.20)(图1B)。
为了确认Osmyr1突变体菌根共生水平，本发明人将Osmyr1-1、Osmyr1-2、Osmyr1-3突变体和空载体对照转化植株(EV)同时接种R.irregularis，并于接种3周、4周和5周后分别统计菌根共生水平。如图1C～1E所示，Osmyr1-1、Osmyr1-2和Osmyr1-3均一致表现出菌根共生水平显著低于EV植株的表型。此外，菌根共生特异的marker基因，如AM1、AM3、AM10、AM14、AM15、HA和PT11也几乎不表达(图1F)。鉴于AM1和AM3是菌根共生早期特异表达的marker基因，因此提示OsMYR1在菌根共生早期具有重要作用。
实施例2、Osmyr1与Oscerk1突变体对Myc factor CO4的响应能力检测
根表皮细胞核受Myc factors诱导而产生的钙振荡是菌根共生信号被激活的的标志性事件。为了研究OsMYR1对Myc factors的响应，本发明人将钙离子遗传探针YC3.6(在细胞核中稳定表达YC3.6元件的转基因材料)通过遗传杂交引入到Osmyr1-1纯合突变体中，从而来观察Osmyr1-1突变体对Myc factors的钙振荡响应情况。Myc factors包含Myc-LCO和CO4/CO5，都能诱导水稻非根毛细胞产生钙振荡同时促进根的形态建成。但由于目前市场上有高纯度的CO4商业化产品，其来源更为稳定和便捷，因此本发明人以CO4为代表来研究水稻对Myc factors的响应。本发明人发现，10-8M CO4能诱导YC3.6植株42.8％的非根毛细胞产生钙振荡；而在相同条件下，Osmyr1-1/YC3.6植株中仅有4％的非根毛细胞产生钙振荡，显著低于YC3.6植株(图2)，这说明OsMYR1影响水稻对Myc factors的响应。
此外，先前研究已发现OsCERK1也在菌根共生早期发挥着关键作用，因此本发明人检测了OsCERK1RNAi植株和Oslyk9-1突变体对CO4的钙振荡响应情况。与Osmyr1-1/YC3.6植株类似，OsCERK1RNAi/YC3.6和Oslyk9-1/YC3.6植株中响应10-8M CO4而产生钙振荡的非根毛细胞分别为0％和2.5％，均显著低于YC3.6(图2)。这说明OsCERK1也影响水稻对Mycfactors的响应。
实施例3、OsMYR1与OsCERK1的蛋白互作研究
首先，本发明人利用酵母双杂(Yeast-2-hybrid，Y2H)和Pull-down技术对OsMYR1与OsCERK1之间的互作关系进行了体外检测。将OsMYR1和OsCERK1胞内域分别克隆到pGBKT7(BD-OsMYR1KD)和pGADT7(AD-OsCERK1KD)载体上，再将上述载体与pGBKT7和pGADT7空载体两两组合后转入酵母细胞，并于营养缺陷培养基SD-LWH(-Leu/-Trp/-His)上筛选培养。本发明人发现，只有共表达BD-OsMYR1KD和AD-OsCERK1KD的酵母细胞才能在营养缺陷型培养基上生长，这意味OsMYR1KD和OsCERK1KD能够在酵母细胞中相互作用(图3A)。体外Pull-down实验中，融合MBP标签的OsMYR1KD(MBP-OsMYR1KD)能有效结合His-OsCERK1KD蛋白(图3B)，进一步证明了OsMYR1和OsCERK1的胞内域能够相互作用。
其次，本发明人利用BiFC(Bimolecular Fluorescence Complementation)技术来验证OsMYR1和OsCERK1全长蛋白在植物体内的互作情况。分别将OsMYR1与OsCERK1编码区融合在BiFC载体pSAT4-YN和pSAT4-YC上，构成载体OsMYR1-YN和OsCERK1-YC，然后将OsMYR1-YN和OsCERK1-YC转入拟南芥原生质体中共表达。实验结果显示，共表达OsMYR1-YN和OsCERK1-YC的原生质体可见YFP信号，而共表达OsMYR1-YN和AtBRI1-YC或者OsCERK1-YC和AtBRI1-YN的原生质体均没有YFP信号。这说明OsMYR1与OsCERK1全长蛋白可以在植物体内互作(图3C)。
最后，本发明人利用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)方法在水稻组织中验证了OsMYR1与OsCERK1在体内互作。从过表达材料OsMYR1-GFP-9中提取植物总蛋白，利用OsCERK1多克隆抗体(αCERK1)进行免疫沉淀，并在被沉淀的蛋白组分中使用GFP抗体(αGFP)来检测OsMYR1-GFP的存在。如图3D所示，OsMYR1-GFP与OsCERK1互作。
实施例4、OsMYR1结合CO4的能力检测
CO4是由4个N-乙酰葡萄糖胺通过β-1，4糖苷键连接而成的聚合物，与chitin结构一致，只是链长不同。考虑到OsCERK1不能直接结合chitin，于是本发明人决定对OsMYR1结合chitin的能力进行检测。在拟南芥原生质体中分别瞬时表达OsMYR1-FLAG、OsCERK1-HA以及共表达OsMYR1-FLAG和OsCERK1-HA，12h后收集原生质体提取植物蛋白。将植物蛋白与chitin resin 4℃孵育2h后进行western blot检测。本发明人发现，chitin resin不能亲和纯化OsCERK1-HA；而OsMYR1-FLAG却能被chitin resin亲和纯化，这意味着OsMYR1可以结合chitin(图4A)。
OsMYR1胞外域含有3个LysM结构域，分别记为LysM1、LysM2和LysM3(图1A)。为了研究哪个LysM结构域在结合chitin resin上具有重要作用，本发明人分别用缺失了LysM1、LysM2和LysM3的OsMYR1(记为OsMYR1-ΔLysM1、OsMYR1-ΔLysM2和OsMYR1-ΔLysM3)进行上述chitin resin亲和纯化实验。结果显示，上述三种突变的蛋白均不能被chitin resin结合(图4B)。这说明LysM1、LysM2和LysM3这三个结构域对于OsMYR1结合chitin都是必需的。
既然OsMYR1能结合chitin，那么OsMYR1是否也能结合CO4？为此，本发明人在上述chitin resin亲和纯化实验体系中分别加入了CO4和脂多糖LPS(Lipopolysaccharides，革兰氏阴性菌的细胞壁主要成分)进行竞争实验。本发明人发现，随着CO4浓度的增加，结合chitin resin的OsMYR1就逐渐减少，并呈现出明显的剂量效应(图4C)，而LPS对于OsMYR1结合chitin resin的竞争效果明显弱非常多(图4D)，这暗示OsMYR1也能结合CO4，但不结合LPS。
为了进一步验证OsMYR1具有结合CO4的能力，本发明人利用昆虫表达体系成功表达了OsMYR1胞外域(OsMYR1ECD)。同时，利用化学合成法制备了交联CO4的agarose beads。Pull-down实验结果显示，OsMYR1ECD能直接结合CO4agarose beads(图4E)。
此外，本发明人还通过微量热泳动(Microscale Thermophoresis，MST)检测技术测得OsMYR1ECD与CO4的结合常数Kd＝89±44.9nM，而OsMYR1ECD几乎不结合LPS(Kd＝193±87.6μM)(图4F)。
上述结果都说明，OsMYR1是Myc factor CO4的受体。
实施例5、CO4对OsMYR1-OsCERK1复合体的影响
既然OsMYR1具有结合CO4的能力，那么CO4是否能诱导OsMYR1与OsCERK1复合体形成呢？为了检测上述猜测，本发明人分别将OsMYR1与OsCERK1编码区克隆到co-IP载体pUC19-FLAG(OsMYR1-FLAG)和pUC19-GFP(OsCERK1-GFP)上，然后转入拟南芥原生质体中瞬时表达。12h后收集原生质体并将其等分为两组，分别用H2O和10-5M CO4处理10min后进行co-IP实验。实验结果表明，OsMYR1与OsCERK1组成型互作，但是CO4明显促进了它们的相互作用(图5A)。
虽然OsMYR1具有激酶结构域，但是结构预测软件显示OsMYR1激酶结构域缺少活性环(activition loop)和许多重要的活性位点，可能无激酶活性。为了确认OsMYR1是否具有激酶活性，本发明人利用大肠杆菌蛋白表达系统，体外表达和纯化了OsMYR1激酶结构域(GST-OsMYR1KD)(SEQ ID NO:3中第270～624位)。体外磷酸化实验结果表明，OsMYR1KD没有激酶活性，但是，OsMYR1KD可以被OsCERK1KD(SEQ ID NO:4中第261～624位)磷酸化(图5B)。
鉴于OsMYR1可直接结合CO4，且CO4可以促进OsMYR1与OsCERK1互作，本发明人猜测CO4可能会调节OsMYR1与OsCERK1的磷酸化。将OsMYR1与OsCERK1的过表达材料OsMYR1-GFP-9和OsCERK1-FLAG-7无菌培养10天，然后分别将茎切成2～3mm的小段浸没在10-5M CO4中。10min后收集样品，提取植物蛋白进行Phos-tag SDS-PAGE和Western blot检测。Phos-tagSDS-PAGE凝胶中含有一种双环金属络合物phos-tag Acrylamide，该物质可在中性pH(生理pH)条件下特异结合蛋白中的磷酸基团，减慢蛋白迁移速率，从而将磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白分离开来。通过上述体内磷酸化检测实验，本发明人发现OsCERK1-FLAG在170KD处出现条带迁移(磷酸化修饰)，而CO4处理显著增加了迁移条带的积累(图5C)。类似地，OsMYR1-GFP在100～130KD区间出现条带迁移，该条带随着CO4的处理也显著增强(图5D)。这一实验说明，CO4处理可以提高水稻中OsMYR1和OsCERK1的磷酸化水平。
实施例6、嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的生物学功能检测
尽管Myc factors与Nod factors具有相似结构，OsCERK1和OsMYR1又分别与MtLYK3和MtNFP同源，但苜蓿毛根转化结果显示，OsCERK1和OsMYR1并不能互补MtLYK3和MtNFP突变体hcl-1和nfp-1的根瘤缺陷表型(图6A～6B)，这说明OsCERK1和OsMYR1不能识别Nod factors。
为了改造水稻使其具有识别Nod factor的能力，本发明人将OsCERK1与OsMYR1的胞外域分别替换成MtLYK3和MtNFP的胞外域，从而形成嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1(图6C)。本发明人发现，嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1能分别恢复hcl-1和nfp-1突变体的根瘤数至野生型水平，与MtLYK3和MtNFP的互补效果一致(图6A～6B)，这说明嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1能识别Nod factors，具有生物学功能。
此外，磷酸化实验结果显示，根瘤菌Sm1021(以苜蓿为特异宿主的根瘤菌菌株)分泌的Nod factor(10-5M)能促进嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的磷酸化，而相同的处理对OsCERK1-OsMYR1复合体的磷酸化水平并无影响(图6D～6E)，这说明嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1能识别来源于Sm1021根瘤菌的Nod factors并被其激活。
实施例7、转基因材料Mt/Os-1和Mt/Os-2对Nod factors的响应能力检测
既然嵌合受体Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1具有生物学功能，可以识别Nod factors而显著提高磷酸化水平，那么表达Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的水稻是否也能识别Nodfactors？本发明人将Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1同时克隆至载体pK7M34GW2-8M21GW3中，并以细胞核表达的钙探针YC3.6为背景进行稳定转化。本发明人从T1转基因植株中分离出了2个高表达Mt/OsCERK1和Mt/OsMYR1的独立株系Mt/Os-1和Mt/Os-2进行钙振荡检测(图7A)。结果显示，当用10-9M Nod factors处理水稻根尖时，Mt/Os-1和Mt/Os-2中分别有66.67％和52.17％的非根毛细胞产生了钙振荡；而Nod factors几乎不能诱导EV植株产生钙振荡(图7B)。这说明共表达嵌合受体的转基因水稻可以响应Nod factors而激活细胞核内钙振荡。
实施例8、转基因水稻Mt-Os中根瘤菌的定殖数量检测
共表达嵌合受体的转基因水稻能够响应Nod factors而产生钙振荡，于是本发明人决定更进一步检测根瘤菌能否更好地侵染表达嵌合受体的转基因水稻。利用带有mCherry荧光标签的根瘤菌Sm1021菌株分别接种EV、Mt/Os-1和Mt/Os-2，每个株系12～15棵苗。10～14天后，将水稻根挖出洗净，于Zeiss 880共聚焦显微镜下观察mCherry标记的根瘤菌并进行统计分析。本发明人发现，在EV、Mt/Os-1和Mt/Os-2植株的根毛、侧根发生部位以及根的边缘上都有大量根瘤菌存在(图8A～8B)，而在水稻根内部，根瘤菌主要聚集成片(称之为patch)(图8C～8E)，有些水稻细胞甚至被根瘤菌填满(图8F～8G)。对EV、Mt/Os-1和Mt/Os-2植株根内部的patch数目进行统计分析，本发明人发现Mt/Os-1和Mt/Os-2中的patch数约为EV中patch数的3倍(图8H)，这说明表达嵌合受体的转基因水稻可以显著增加根瘤菌的定殖数量。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院上海生命科学研究院
<120> 改造禾谷类作物识别结瘤因子并增加根瘤菌定殖数目的方法
<130> 172600
<160> 38
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1875
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 1
atggaacaca agggtttgtg catcctcgcc gtcgtcatcg ccttccagct cgccggcggg 60
gaggccgtca ccgatgccac tgcccgggca cgtcgcttcg cctgtaacgt gtcggcgccg 120
tgcgacacgt tcgtcgtgta ccggacgcag tcgccggggt tcctcgacct cggcaacatc 180
tcggacctgt tcggcgtgag ccgggcgctg atcgccagcg ccaacaagct gaccaccgag 240
gacggggtgc tcctgccggg gcagccgctg ctcgtgccgg tcaagtgcgg ctgcacgggc 300
gcgcgctcct tcgccaacgt cacgtacccc atccggcctc gcgacacctt cttcgggctc 360
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Arg Phe Pro Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Ile Ala Ala Asp Pro Gly Ala
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Gly Lys His Arg His Gly Ile Ile Val Ala Thr Ser Ile Ala Gly Ser
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Phe Val Ala Cys Ala Val Leu Cys Thr Ala Ile Leu Ala Tyr Arg Arg
260 265 270
Tyr Arg Lys Lys Ala Pro Val Pro Lys His Val Ser Pro Lys Leu Ser
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Met Ile Asn Gly Gly Asp Lys Leu Leu Thr Ser Val Ser Gln Phe Ile
305 310 315 320
Asp Lys Pro Ile Ile Phe Arg Glu Glu Glu Ile Met Glu Ala Thr Met
325 330 335
Asn Leu Asp Glu Gln Cys Lys Leu Gly Ser Ser Tyr Tyr Arg Ala Asn
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Leu Glu Arg Glu Val Phe Ala Val Lys Pro Ala Lys Gly Asn Val Ala
355 360 365
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370 375 380
Leu Ala Gly Ile Ser Ile Gly Ala Asp Gly Asp Tyr Ala Phe Leu Val
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Tyr Glu Phe Ala Glu Lys Gly Ser Leu Asp Lys Trp Leu Tyr Gln Lys
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Leu His Glu His Thr Gln Pro Ser Met Val His Gly Asp Val Arg Ala
450 455 460
Arg Asn Ile Leu Leu Thr Ala Gly Phe Arg Ala Lys Leu Ser Asn Phe
465 470 475 480
Ser Leu Ala Lys Pro Ala Ala Met Val Asp Ala Ala Ala Thr Ser Ser
485 490 495
Asp Val Phe Ala Phe Gly Leu Leu Leu Leu Glu Leu Leu Ser Gly Arg
500 505 510
Arg Ala Val Glu Ala Arg Val Gly Val Glu Ile Gly Met Leu Arg Thr
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Glu Ile Arg Thr Val Leu Asp Ala Gly Gly Asp Lys Arg Ala Ala Lys
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Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro Thr Leu Gly Gly Glu Tyr Gly Val Asp
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Ala Ala Leu Ser Leu Ala Gly Met Ala Arg Ala Cys Thr Glu Glu Asp
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Ala Ala Arg Arg Pro Lys Met Ala Glu Ile Ala Phe Ser Leu Ser Val
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610 615 620
<210> 5
<211> 620
<212> PRT
<213> 苜蓿
<400> 5
Met Asn Leu Lys Asn Gly Leu Leu Leu Phe Ile Leu Phe Leu Asp Cys
1 5 10 15
Val Phe Phe Lys Val Glu Ser Lys Cys Val Lys Gly Cys Asp Val Ala
20 25 30
Leu Ala Ser Tyr Tyr Ile Ile Pro Ser Ile Gln Leu Arg Asn Ile Ser
35 40 45
Asn Phe Met Gln Ser Lys Ile Val Leu Thr Asn Ser Phe Asp Val Ile
50 55 60
Met Ser Tyr Asn Arg Asp Val Val Phe Asp Lys Ser Gly Leu Ile Ser
65 70 75 80
Tyr Thr Arg Ile Asn Val Pro Phe Pro Cys Glu Cys Ile Gly Gly Glu
85 90 95
Phe Leu Gly His Val Phe Glu Tyr Thr Thr Lys Glu Gly Asp Asp Tyr
100 105 110
Asp Leu Ile Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Leu Thr Thr Val Glu Leu
115 120 125
Leu Lys Lys Phe Asn Ser Tyr Asp Pro Asn His Ile Pro Val Lys Ala
130 135 140
Lys Ile Asn Val Thr Val Ile Cys Ser Cys Gly Asn Ser Gln Ile Ser
145 150 155 160
Lys Asp Tyr Gly Leu Phe Val Thr Tyr Pro Leu Arg Ser Asp Asp Thr
165 170 175
Leu Ala Lys Ile Ala Thr Lys Ala Gly Leu Asp Glu Gly Leu Ile Gln
180 185 190
Asn Phe Asn Gln Asp Ala Asn Phe Ser Ile Gly Ser Gly Ile Val Phe
195 200 205
Ile Pro Gly Arg Asp Gln Asn Gly His Phe Phe Pro Leu Tyr Ser Arg
210 215 220
Thr Gly Ile Ala Lys Gly Ser Ala Val Gly Ile Ala Met Ala Gly Ile
225 230 235 240
Phe Gly Leu Leu Leu Phe Val Ile Tyr Ile Tyr Ala Lys Tyr Phe Gln
245 250 255
Lys Lys Glu Glu Glu Lys Thr Lys Leu Pro Gln Thr Ser Arg Ala Phe
260 265 270
Ser Thr Gln Asp Ala Ser Gly Ser Ala Glu Tyr Glu Thr Ser Gly Ser
275 280 285
Ser Gly His Ala Thr Gly Ser Ala Ala Gly Leu Thr Gly Ile Met Val
290 295 300
Ala Lys Ser Thr Glu Phe Thr Tyr Gln Glu Leu Ala Lys Ala Thr Asn
305 310 315 320
Asn Phe Ser Leu Asp Asn Lys Ile Gly Gln Gly Gly Phe Gly Ala Val
325 330 335
Tyr Tyr Ala Glu Leu Arg Gly Glu Lys Thr Ala Ile Lys Lys Met Asp
340 345 350
Val Gln Ala Ser Ser Glu Phe Leu Cys Glu Leu Lys Val Leu Thr His
355 360 365
Val His His Leu Asn Leu Val Arg Leu Ile Gly Tyr Cys Val Glu Gly
370 375 380
Ser Leu Phe Leu Val Tyr Glu His Ile Asp Asn Gly Asn Leu Gly Gln
385 390 395 400
Tyr Leu His Gly Ile Gly Thr Glu Pro Leu Pro Trp Ser Ser Arg Val
405 410 415
Gln Ile Ala Leu Asp Ser Ala Arg Gly Leu Glu Tyr Ile His Glu His
420 425 430
Thr Val Pro Val Tyr Ile His Arg Asp Val Lys Ser Ala Asn Ile Leu
435 440 445
Ile Asp Lys Asn Leu Arg Gly Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Thr Lys
450 455 460
Leu Ile Glu Val Gly Asn Ser Thr Leu His Thr Arg Leu Val Gly Thr
465 470 475 480
Phe Gly Tyr Met Pro Pro Glu Tyr Ala Gln Tyr Gly Asp Val Ser Pro
485 490 495
Lys Ile Asp Val Tyr Ala Phe Gly Val Val Leu Tyr Glu Leu Ile Thr
500 505 510
Ala Lys Asn Ala Val Leu Lys Thr Gly Glu Ser Val Ala Glu Ser Lys
515 520 525
Gly Leu Val Gln Leu Phe Glu Glu Ala Leu His Arg Met Asp Pro Leu
530 535 540
Glu Gly Leu Arg Lys Leu Val Asp Pro Arg Leu Lys Glu Asn Tyr Pro
545 550 555 560
Ile Asp Ser Val Leu Lys Met Ala Gln Leu Gly Arg Ala Cys Thr Arg
565 570 575
Asp Asn Pro Leu Leu Arg Pro Ser Met Arg Ser Ile Val Val Ala Leu
580 585 590
Met Thr Leu Ser Ser Pro Thr Glu Asp Cys Asp Asp Asp Ser Ser Tyr
595 600 605
Glu Asn Gln Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ser Thr Arg
610 615 620
<210> 6
<211> 595
<212> PRT
<213> 苜蓿
<400> 6
Met Ser Ala Phe Phe Leu Pro Ser Ser Ser His Ala Leu Phe Leu Val
1 5 10 15
Leu Met Leu Phe Phe Leu Thr Asn Ile Ser Ala Gln Pro Leu Tyr Ile
20 25 30
Ser Glu Thr Asn Phe Thr Cys Pro Val Asp Ser Pro Pro Ser Cys Glu
35 40 45
Thr Tyr Val Ala Tyr Arg Ala Gln Ser Pro Asn Phe Leu Ser Leu Ser
50 55 60
Asn Ile Ser Asp Ile Phe Asn Leu Ser Pro Leu Arg Ile Ala Lys Ala
65 70 75 80
Ser Asn Ile Glu Ala Glu Asp Lys Lys Leu Ile Pro Asp Gln Leu Leu
85 90 95
Leu Val Pro Val Thr Cys Gly Cys Thr Lys Asn His Ser Phe Ala Asn
100 105 110
Ile Thr Tyr Ser Ile Lys Gln Gly Asp Asn Phe Phe Ile Leu Ser Ile
115 120 125
Thr Ser Tyr Gln Asn Leu Thr Asn Tyr Leu Glu Phe Lys Asn Phe Asn
130 135 140
Pro Asn Leu Ser Pro Thr Leu Leu Pro Leu Asp Thr Lys Val Ser Val
145 150 155 160
Pro Leu Phe Cys Lys Cys Pro Ser Lys Asn Gln Leu Asn Lys Gly Ile
165 170 175
Lys Tyr Leu Ile Thr Tyr Val Trp Gln Asp Asn Asp Asn Val Thr Leu
180 185 190
Val Ser Ser Lys Phe Gly Ala Ser Gln Val Glu Met Leu Ala Glu Asn
195 200 205
Asn His Asn Phe Thr Ala Ser Thr Asn Arg Ser Val Leu Ile Pro Val
210 215 220
Thr Ser Leu Pro Lys Leu Asp Gln Pro Ser Ser Asn Gly Arg Lys Ser
225 230 235 240
Ser Ser Gln Asn Leu Ala Leu Ile Ile Gly Ile Ser Leu Gly Ser Ala
245 250 255
Phe Phe Ile Leu Val Leu Thr Leu Ser Leu Val Tyr Val Tyr Cys Leu
260 265 270
Lys Met Lys Arg Leu Asn Arg Ser Thr Ser Ser Ser Glu Thr Ala Asp
275 280 285
Lys Leu Leu Ser Gly Val Ser Gly Tyr Val Ser Lys Pro Thr Met Tyr
290 295 300
Glu Ile Asp Ala Ile Met Glu Gly Thr Thr Asn Leu Ser Asp Asn Cys
305 310 315 320
Lys Ile Gly Glu Ser Val Tyr Lys Ala Asn Ile Asp Gly Arg Val Leu
325 330 335
Ala Val Lys Lys Ile Lys Lys Asp Ala Ser Glu Glu Leu Lys Ile Leu
340 345 350
Gln Lys Val Asn His Gly Asn Leu Val Lys Leu Met Gly Val Ser Ser
355 360 365
Asp Asn Asp Gly Asn Cys Phe Leu Val Tyr Glu Tyr Ala Glu Asn Gly
370 375 380
Ser Leu Glu Glu Trp Leu Phe Ser Glu Ser Ser Lys Thr Ser Asn Ser
385 390 395 400
Val Val Ser Leu Thr Trp Ser Gln Arg Ile Thr Ile Ala Met Asp Val
405 410 415
Ala Ile Gly Leu Gln Tyr Met His Glu His Thr Tyr Pro Arg Ile Ile
420 425 430
His Arg Asp Ile Thr Thr Ser Asn Ile Leu Leu Gly Ser Asn Phe Lys
435 440 445
Ala Lys Ile Ala Asn Phe Gly Met Ala Arg Thr Ser Thr Asn Ser Met
450 455 460
Met Pro Lys Ile Asp Val Phe Ala Phe Gly Val Val Leu Ile Glu Leu
465 470 475 480
Leu Thr Gly Lys Lys Ala Met Thr Thr Lys Glu Asn Gly Glu Val Val
485 490 495
Ile Leu Trp Lys Asp Phe Trp Lys Ile Phe Asp Leu Glu Gly Asn Arg
500 505 510
Glu Glu Arg Leu Arg Lys Trp Met Asp Pro Lys Leu Glu Ser Phe Tyr
515 520 525
Pro Ile Asp Asn Ala Leu Ser Leu Ala Ser Leu Ala Val Asn Cys Thr
530 535 540
Ala Asp Lys Ser Leu Ser Arg Pro Thr Ile Ala Glu Ile Val Leu Cys
545 550 555 560
Leu Ser Leu Leu Asn Gln Pro Ser Ser Glu Pro Met Leu Glu Arg Ser
565 570 575
Leu Thr Ser Gly Leu Asp Ala Glu Ala Thr His Val Val Thr Ser Val
580 585 590
Ile Ala Arg
595
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 7
ggcatgtacc ggacgcagtc gccg 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 8
aaaccggcga ctgcgtccgg taca 24
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 9
ggcagtcagc ggaggaaaac gcgg 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 10
aaacccgcgt tttcctccgc tgac 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 11
gtgtgggtca ggaggtacaa cccg 24
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物
<400> 12
aaaccgggtt gtacctcctg accc 24
<210> 13
<211> 54
<212> DNA
<213> 引物
<400> 13
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgaatctc aaaaatggat tact 54
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 14
caacacctcc tgctatagct cctgcaggaa aaaaatgtcc attttg 46
<210> 15
<211> 54
<212> DNA
<213> 引物
<400> 15
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgaagcta aaaactggtc tact 54
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 16
cccgcgatgc tcgtcgccac gatgattggt tgatcaagtt ttggta 46
<210> 17
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 17
caaaatggac atttttttcc tgcaggagct atagcaggag gtgttg 46
<210> 18
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物
<400> 18
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tctcccggac attaggttga cc 52
<210> 19
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物
<400> 19
taccaaaact tgatcaacca atcatcgtgg cgacgagcat cgcggg 46
<210> 20
<211> 50
<212> DNA
<213> 引物
<400> 20
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tctagctgcc acctcgttcc 50
<210> 21
<211> 53
<212> DNA
<213> 引物
<400> 21
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tctagttgac aacagattta tga 53
<210> 22
<211> 55
<212> DNA
<213> 引物
<400> 22
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc acgagctatt acagaagtaa caaca 55
<210> 23
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物
<400> 23
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggaagct tccacctccc tc 52
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> 引物
<400> 24
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggaacac aagggtttgt gca 53
<210> 25
<211> 59
<212> DNA
<213> 引物
<400> 25
gggacaagtt tgtacaaaaa agcaggctcc atgttctata ggaggagaaa ggcaaaaca 59
<210> 26
<211> 55
<212> DNA
<213> 引物
<400> 26
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatctcccg gacattaggt tgacc 55
<210> 27
<211> 55
<212> DNA
<213> 引物
<400> 27
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catgtaccgg aggtaccgca agaag 55
<210> 28
<211> 53
<212> DNA
<213> 引物
<400> 28
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc tcatctagct gccacctcgt tcc 53
<210> 29
<211> 53
<212> DNA
<213> 引物
<400> 29
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctc catggtcacc gatgccactg ccc 53
<210> 30
<211> 52
<212> DNA
<213> 引物
<400> 30
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gccgtggcgg tgcttgcccg ct 52
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 31
agctctccta gatctgtgct g 21
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物
<400> 32
gcgatatcat agaacgagcg ac 22
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 引物
<400> 33
acgcgttcga gaggctatg 19
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 引物
<400> 34
tatctagctg ccacctcgtt c 21
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 35
cagcatagga agtgggatag tgttc 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 36
attgaagcag ggtggcctgt tttgc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 37
accgttcagt tttgatccct gtgac 25
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 引物
<400> 38
ctattgctgt cgaatctgtt caggc 25

Claims (12)

1.一种改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目的方法，其特征在于，所述方法包括：将禾谷类作物中MYR1基因的胞外区与根瘤植物中其同源基因的胞外区替换，获得融合基因1；将禾谷类作物中CERK1基因的胞外区，与根瘤植物中其同源基因的胞外区替换，获得融合基因2；将该融合基因1和2共同引入禾谷类作物中，从而获得识别结瘤因子或根瘤菌定殖数目增加的禾谷类作物；所述MYR1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQID NO: 3所示、胞外区序列为SEQ ID NO: 3中第1～246位，所述CERK1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示、胞外区序列为SEQ ID NO: 4中第1～232位；
所述的根瘤植物中的同源基因为：蒺藜苜蓿中的LYK3基因、NFP基因；所述的LYK3基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、胞外区的序列为SEQ ID NO: 5中第1～224位，所述的NFP基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、胞外区的序列为SEQ IDNO: 6中第1～246位。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的禾谷类作物包括：水稻，大麦、小麦、燕麦、黑麦，玉米或高粱。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过农杆菌转化法将该融合基因引入禾谷类作物中。
4. 一种融合基因，所述的融合基因为将禾谷类作物中MYR1基因的胞外区替换为根瘤植物中其同源基因的胞外区；所述根瘤植物中其同源基因是蒺藜苜蓿中的NFP基因；所述MYR1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示、胞外区序列为SEQ ID NO: 3中第1～246位；所述的NFP基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示、胞外区的序列为SEQ ID NO: 6中第1～246位。
5. 一种融合基因，所述的融合基因为将禾谷类作物中CERK1基因的胞外区替换为根瘤植物中其同源基因的胞外区；所述根瘤植物中其同源基因是蒺藜苜蓿中的LYK3基因；所述CERK1基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示、胞外区序列为SEQ ID NO: 4中第1～232位；所述的LYK3基因编码的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示、胞外区的序列为SEQ ID NO: 5中第1～224位。
6.一种融合多肽，其由权利要求4所述的融合基因编码而成。
7.一种融合多肽，其由权利要求5所述的融合基因编码而成。
8.权利要求4所述的融合基因的用途，用于改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目。
9.权利要求5所述的融合基因的用途，用于改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目。
10.权利要求6所述的融合多肽的用途，用于改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目。
11.权利要求7所述的融合多肽的用途，用于改造禾谷类作物使其识别结瘤因子或增加根瘤菌定殖数目。
12. 禾谷类作物中的MYR1多肽在降低水稻中菌根共生水平中的应用，其特征在于，所述应用为敲除MYR1基因，所述MYR1多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
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