CN114262369B

CN114262369B - ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用

Info

Publication number: CN114262369B
Application number: CN202111561009.6A
Authority: CN
Inventors: 徐明良; 朱芒; 钟涛; 郭晨煜; 张晓辉; 刘玉琳; 房正
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: WO2023109729A1; CN114262369A

Abstract

本发明公开了ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用。具体地公开了ZmDi19和ZmPR10基因及其编码的蛋白质在调控植物抗病性中的应用、以及培育抗病植物尤其是抗灰斑病植物的方法。实验证明，过表达ZmDi19和/或ZmPR10基因的玉米转基因株系中，转基因植株的病情指数显著降低，转基因植株的抗病性显著增强，说明基因ZmDi19和ZmPR10具有抗灰斑病功能，均正调控玉米灰斑病抗病性。本发明为调控玉米灰斑病抗病性提供了良好的基因资源，对于玉米的抗灰斑病育种具有重大的应用价值，对于保证玉米的高产稳产具有重要的意义。

Description

ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用。

背景技术

玉米病害是玉米产量和质量的重要影响因素，其中玉米灰斑病(gray leaf spot，GLS)是由玉蜀黍尾孢菌(Cercospora zeae-maydis)和玉米尾胞菌(Cercospora zeina)引起的一种常见的玉米真菌性病害，该病使叶片损伤和凋萎导致光合组织丧失功能，最终引起产量的损失。近年来，灰斑病已经成为我国玉米生产上主要的叶部病害之一，具有传染迅速、危害严重的特点，难于控制，严重制约着我国玉米的生产。

目前，灰斑病的防治主要有化学防治、耕作管理和抗病品种培育。其中化学防治和耕作管理均会增加生产成本，而且化学杀真菌剂会对生态环境造成严重的污染，不利于农业绿色发展和可持续发展的需求。最经济有效的防治方法是培育抗病品种，选用抗灰斑病的品种是防治灰斑病的根本措施。因此，筛选抗灰斑病的种质资源，挖掘抗病基因，解析抗灰斑病的遗传基础，结合生物技术进行抗病分子设计育种，可以从根本上防控玉米灰斑病的危害，促进商业化玉米育种进程，对于保证玉米的品质和高产稳产具有重要的意义，在玉米分子育种领域有着广泛的应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何调控植物抗病性(如提高或降低植物的灰斑病抗性)。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质的应用，所述应用可为下述任一种：

D1)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；

D2)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

D3)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在培育抗病植物中的应用；

D4)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在制备培育抗病植物的产品中的应用；

D5)蛋白质或调控所述蛋白质活性和/或含量的物质在植物育种中的应用；

所述蛋白质可为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.11的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的分别与SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.11所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

其中，氨基酸序列是SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6的蛋白质名称为ZmDi19；氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质名称为ZmPR10。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.6或SEQ ID No.11所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码本发明所述蛋白质且具有本发明所述蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质。

上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。

所述调控基因表达的物质具体可为下述B1)-B3)中任一所述的生物材料。

上述应用中，所述蛋白质可来源于玉米(Zea mays)。

本发明还提供了与所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用可为下述任一种：

E1)与所述蛋白质相关的生物材料在调控植物抗病性中的应用；

E2)与所述蛋白质相关的生物材料在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

E3)与所述蛋白质相关的生物材料在培育抗病植物中的应用；

E4)与所述蛋白质相关的生物材料在制备培育抗病植物的产品中的应用；

E5)与所述蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用；

所述生物材料可为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为下述任一种：

C1)核苷酸序列是SEQ ID No.1的DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.3的第448-1137位的cDNA分子；

C3)核苷酸序列是SEQ ID No.5的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.5的第13-618位的cDNA分子；

C4)核苷酸序列是SEQ ID No.7的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.7的第1517-2065位的cDNA分子；

C5)核苷酸序列是SEQ ID No.10的DNA分子；

C6)核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.12的cDNA分子。

具体地，SEQ ID No.1所示的DNA分子为ZmDi19基因，所述ZmDi19基因存在三个转录本：

第一个转录本对应的cDNA核苷酸序列为SEQ ID No.3；SEQ ID No.3的第448-1137位为编码序列，编码氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

第二个转录本对应的cDNA核苷酸序列为SEQ ID No.5；SEQ ID No.5的第13-618位为编码序列，编码氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白质；

第三个转录本对应的cDNA核苷酸序列为SEQ ID No.7；SEQ ID No.7的第1517-2065位为编码序列，编码氨基酸序列是SEQ ID No.6的蛋白质；

SEQ ID No.10所示的核苷酸序列为ZmPR10基因，所述ZmPR10基因存在一个转录本，所述ZmPR10基因的编码序列为SEQ ID No.12，编码氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质。

本发明所述的基因可以为任意能够编码所述蛋白质的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

所述核酸分子还包括与SEQ ID No.3的第448-1137位、SEQ ID No.5的第13-618位、SEQ ID No.7的第1517-2065位和SEQ ID No.12所示的核苷酸序列一致性为95％以上且来源相同种属的核酸分子。

本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。

本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pBCXUN载体或pBUE411载体。

可用现有的植物表达载体构建含有ZmDi19和/或ZmPR10基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用ZmDi19和/或ZmPR10基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的ZmDi19和/或ZmPR10基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得灰斑病抗性提高的转基因细胞系及转基因植株。携带ZmDi19和/或ZmPR10基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。具体可为农杆菌EHA105。

所述重组载体具体可为重组载体pBCXUN-ZmDi19、重组载体pBUE411-sgRNA或重组载体pBCXUN-ZmPR10。

所述重组载体pBCXUN-ZmDi19是在pBCXUN载体的XcmI酶切位点插入了核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第448-1137位的DNA片段后得到的重组质粒。

所述重组载体(基因编辑载体)pBUE411-sgRNA是在pBUE411载体的BsaI酶切位点插入序列表的SEQ ID No.8所示的双链DNA分子后得到的重组质粒。基因编辑载体pBUE411-sgRNA表达一个sgRNA，其中sgRNA的靶序列结合区如序列表的SEQ ID No.9所示。基因编辑载体中具有Cas9基因，并表达得到Cas9蛋白。构建的基因编辑载体pBUE411-sgRNA用于对ZmDi19基因进行基因敲除。

所述重组载体pBCXUN-ZmPR10是在pBCXUN载体的XcmI酶切位点插入了核苷酸序列是SEQ ID No.12所示的DNA分子后得到的重组质粒。

所述重组微生物具体可为重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmDi 19、重组农杆菌EHA105/pBUE411-sgRNA或重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmPR10。

所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmDi 19含有SEQ ID No.3的第448-1137位所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmDi 19是将所述重组载体pBCXUN-ZmDi19导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

所述重组农杆菌EHA105/pBUE411-sgRNA含有SEQ ID No.8所示的DNA分子和Cas9基因，表达核苷酸序列是SEQ ID No.9的sgRNA和Cas9蛋白。所述重组农杆菌EHA105/pBUE411-sgRNA是将所述重组载体pBUE411-sgRNA导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmPR10含有SEQ ID No.12所示的DNA分子，表达氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质。所述重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmPR10是将所述重组载体pBCXUN-ZmPR10导入根癌农杆菌EHA105得到的重组菌。

本发明还提供了一种培育抗病植物的方法，所述方法包括提高目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗病性高于所述目的植物的抗病植物。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量实现。

上述方法中，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物实现。

上述方法中，所述蛋白质的编码基因可为下述任一种：

F1)编码序列是SEQ ID No.3的第448-1137位的cDNA分子；

F2)编码序列是SEQ ID No.5的第13-618位的cDNA分子；

F3)编码序列是SEQ ID No.7的第1517-2065位的cDNA分子；

F4)编码序列是SEQ ID No.12的cDNA分子。

具体地，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量可通过将SEQ IDNo.3的第448-1137位所示的DNA分子、SEQ ID No.5的第13-618位所示的DNA分子、SEQ IDNo.7的第1517-2065位的DNA分子和/或SEQ ID No.12所示的DNA分子导入所述目的植物实现。

在本发明的一个实施方案中，所述培育抗病植物的方法包括如下步骤：

(1)构建包含SEQ ID No.3的第448-1137位所示DNA分子、SEQ ID No.5的第13-618位所示DNA分子、SEQ ID No.7的第1517-2065位所示DNA分子和/或SEQ ID No.12所示DNA分子的重组载体；

(2)将步骤(1)构建的重组载体转入目的植物(如玉米)中；

(3)经筛选和鉴定获得抗病性高于所述目的植物的抗病植物。

本发明还保护一种制备抗病植物的方法，包括如下步骤：在出发植物中导入所述核酸分子，得到灰斑病抗病性增强的转基因植物。所述核酸分子具体可通过以上任一所述重组载体导入所述出发植物。携带有所述核酸分子的重组载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到出发植物中。将所述转基因植物与现有玉米品种进行杂交(包括单次杂交和多次杂交，例如连续杂交三次)，得到的转基因后代植株同样为灰斑病抗病性增强的转基因植物。所述现有玉米品种具体可为玉米自交系B73。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加目的植物中ZmDi19或ZmPR10蛋白的含量和/或活性，从而提高目的植物的灰斑病抗病性。

本文中，所述植物可为G1)、G2)或G3)：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)玉蜀黍属植物。

所述玉蜀黍属植物具体可为玉米。例如玉米自交系B73。

本文中，所述植物可为作物(农作物)。

本发明还提供了一种制备抗病性降低的植物的方法，所述方法包括降低目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性，得到抗病性低于所述目的植物的转基因植物。

进一步地，所述降低目的植物中所述蛋白质的含量和/或活性通过降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性实现。

进一步地，所述降低目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量和/或活性为利用基因突变、基因敲除、基因编辑或基因敲减技术使目的植物基因组中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活。

进一步地，所述利用基因编辑技术使植物基因组中所述蛋白质的编码基因活性下降或失活是利用CRISPR/Cas9系统进行，所述CRISPR/Cas9系统包括表达靶向所述蛋白质的编码基因的sgRNA的载体，所述sgRNA的靶序列为SEQ ID No.8。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：对目的植物基因组中的特定基因进行基因编辑(引起特定基因内部发生移码突变)，从而降低目的植物的灰斑病抗病性；所述特定基因编码ZmDi19蛋白。

所述基因编辑具体通过CRISPR技术实现。

所述基因编辑具体通过一个sgRNA和Cas9蛋白实现。其中sgRNA的靶序列结合区的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示。

所述基因编辑具体通过导入基因编辑载体实现。所述基因编辑载体具体可为如下重组质粒：在pBUE411载体的BsaI酶切位点插入SEQ ID No.8所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明所述蛋白质和/或所述生物材料也在本发明的保护范围内。

本发明还提供了所述培育抗病植物的方法在创制抗病植物和/或植物育种中的应用。

所述植物育种可为作物抗病转基因育种，具体可为玉米抗灰斑病转基因育种。

所述抗病可为抗灰斑病，所述抗病性可为灰斑病抗性。

所述调控植物抗病性可为提高植物抗病性或降低植物抗病性。

具体地，本文所述调控植物抗病性可为调控植物的灰斑病抗病性，包括提高植物的灰斑病抗病性或降低植物的灰斑病抗病性。

以上任一所述灰斑病具体可为玉米尾孢菌引起的灰斑病。

本发明中，所述抗病植物理解为不仅包含将所述ZmDi19和/或ZmPR10基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述抗逆植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

本发明提供了一种ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用。本发明通过将来源于玉米(Zea mays)的抗玉米灰斑病的基因ZmDi19和ZmPR10分别导入到受体植物(如玉米)中，得到了转基因玉米(过表达ZmDi19基因的玉米和过表达ZmPR10基因的玉米)，实验证明，与未转基因受体对照野生型玉米(玉米自交系B73)相比：过表达ZmDi19基因的玉米转基因株系中ZmDi19基因的表达量显著提高，相应的转基因植株的病情指数显著降低，转基因植株的抗病性显著增强；而利用基因编辑技术对ZmDi19基因进行敲除的实验结果表明，相对于野生型玉米自交系B73植株，基因编辑植株的病情指数显著增加，转基因植株的抗病性显著降低。过表达ZmPR10基因的玉米转基因株系中ZmPR10基因的表达量显著增高，相应的转基因植株的病情指数显著降低，转基因植株的抗病性显著增强。

综上，本发明提供了两个抗玉米灰斑病的基因ZmDi19和ZmPR10，转基因过表达和CRISPR敲除实验证明了ZmDi19基因的抗灰斑病功能；转基因过表达实验证明了ZmPR10基因的抗灰斑病功能；ZmDi19和ZmPR10基因均正调控玉米灰斑病抗病性，ZmDi19基因的过表达能够提高受体植物中蛋白质ZmDi19的含量和/或活性，进而增强转基因植株对灰斑病的抗病性；ZmPR10基因的过表达能够提高受体植物中蛋白质ZmPR10的含量和/或活性，进而增强转基因植株对灰斑病的抗病性。本发明为调控玉米灰斑病抗病性提供了良好的基因资源，对于玉米的抗灰斑病育种具有重大的应用价值，对于保证玉米的高产稳产具有重要的意义。

附图说明

图1为pBCXUN载体的结构示意图。

图2为实施例2中基因表达水平鉴定的结果。

图3为实施例2中抗病性鉴定的结果。

图4为实施例3中基因编辑鉴定的结果。

图5为实施例3中抗病性鉴定的结果。

图6为实施例5中基因表达水平鉴定的结果。

图7为实施例5中抗病性鉴定的结果。

图8为实施例5中抗病性鉴定的结果表型图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的表达量数据采用箱线图展示，每个箱线图包含有至少三个生物重复获得的数据。上、下边缘分别表示最大值和最小值，箱型表示25％至75％分位数，中间横线表示中位数。灰斑病等级的实际分布采用分半小提琴图或小提琴图展示，图中星型表示病情指数。以上图形均用R绘制；统计检验采用t-test，P＜0.05表示与对照相比具有显著性差异。

下述实施例中的玉米尾孢菌(Cercospora zeina)，记载于如下文献：FirstReport of Gray Leaf Spot of Maize Caused by Cercospora zeina in China，PlantDisease/Vol.97No.12。

下述实施例中的pBCXUN载体(pBCXUN vector)，记载于如下文献：ZmHAK5 andZmHAK1 function in K+uptake and distribution in maize under low K+conditions.Journal of Intergrative Plant Biology(2018)doi:10.1111/jipb.12756。pBCXUN载体的结构示意图见图1。

下述实施例中的pBUE411载体(pBUE411 vector)，记载于如下文献：ZmCCT9enhances maize adaptation to higher latitudes.Huang ect.，PNAS(2018)115(2):E334-E341 DOI:10.1073/pnas.1718058115。

实施例1、ZmDi19蛋白及其编码基因的获得

本申请的发明人经过广泛而深入的研究，从玉米自交系B73中分离克隆出一个调控植物抗病性的基因，将其命名为ZmDi19基因(其编码的蛋白质名称为ZmDi19)。玉米自交系B73的基因组DNA中的ZmDi19基因如序列表的SEQ ID No.1所示。ZmDi19基因存在三个转录本，第一个转录本编码序列表的SEQ ID No.2所示的蛋白质；第二个转录本编码序列表的SEQ ID No.4所示的蛋白质；第三个转录本编码序列表的SEQ ID No.6所示的蛋白质。玉米自交系B73的cDNA中第一个转录本对应的开放阅读框如序列表的SEQ ID No.3中第448-1137位核苷酸所示。玉米自交系B73的cDNA中第二个转录本对应的开放阅读框如序列表的SEQ ID No.5中第13-618位核苷酸所示。玉米自交系B73的cDNA中第三个转录本对应的开放阅读框如序列表的SEQ ID No.7中第1517-2065位核苷酸所示。

实施例2、ZmDi19基因过表达植物的获得和鉴定

一、重组表达载体的构建

1、取玉米自交系B73的新鲜叶片，提取总RNA，反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用ZmDi19-OE-F和ZmDi19-OE-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

ZmDi19-OE-F：5’-ATGGACTCCGAGCACTGGAT-3’；

ZmDi19-OE-R：5’-TCAGTCGCCGAATAGAGTAG-3’。

3、取pBCXUN载体(图1)，采用限制性内切酶XcmI进行酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒，命名为pBCXUN-ZmDi 19。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：重组质粒pBCXUN-ZmDi19是在pBCXUN载体的XcmI酶切位点插入了核苷酸序列是序列表中SEQ ID No.3的第448-1137位的DNA片段后得到的重组质粒。实际应用中，也可以分别直接合成外源片段然后插入pBCXUN载体的XcmI酶切位点，从而得到重组质粒。

二、过表达植物的获得

1、将重组质粒pBCXUN-ZmDi19导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmDi 19。

2、取步骤1得到的重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmDi19，采用农杆菌介导法对玉米自交系B73的幼胚进行遗传转化，得到T₀代植株。

3、将T₀代植株进行PCR鉴定。

PCR鉴定方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用bar-F和bar-R组成的引物对进行PCR扩增，如果得到约262bp的扩增产物、PCR鉴定为阳性、该植株为转基因植株，如果没有得到扩增产物、PCR鉴定为阴性、该植株为非转基因植株。PCR鉴定引物序列如下：

bar-F：5’-GAAGGCACGCAACGCCTACGA-3’；bar-R：5’-CCAGAAACCCACGTCATGCCA-3’。

采用重组质粒pBCXUN-ZmDi19进行步骤二，对随机选取的PCR检测阳性的三个转基因植株进行命名，分别为ZmDi19-OE#1植株、ZmDi19-OE#2植株、ZmDi19-OE#3植株。

三、回交分离后代的获得

T₀代植株自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为T₁代植株；从T₁代植株中筛选转基因植株，PCR鉴定方法同步骤二的3；将T₁代转基因植株作为母本，玉米自交系B73作为父本，进行杂交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为F₁代植株；从F₁代植株中筛选转基因植株，PCR鉴定方法同步骤二的3；将F₁代转基因植株作为母本，玉米自交系B73作为父本，进行杂交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为BC₁F₁代植株；从BC₁F₁代植株中筛选转基因植株和非转基因植株，PCR鉴定方法同步骤二的3；将BC₁F₁代转基因植株作为母本，玉米自交系B73作为父本，进行杂交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为BC₂F₁代植株；从BC₂F₁代植株中筛选转基因植株和非转基因植株，PCR鉴定方法同步骤二的3；将BC₂F₁代转基因植株作为母本，玉米自交系B73作为父本，进行杂交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为BC₃F₁代植株；从BC₃F₁代植株中筛选转基因植株和非转基因植株，PCR鉴定方法同步骤二的3。

T0代植株分别为：ZmDi19-OE#1植株、ZmDi19-OE#2植株、ZmDi19-OE#3植株。按照上述方法分别得到ZmDi19-OE#1植株的BC₃F₁代转基因植株和非转基因植株、ZmDi19-OE#2植株的BC₃F₁代转基因植株和非转基因植株、ZmDi19-OE#3植株的BC₃F₁代转基因植株。

四、植株的抗病性鉴定

供试植株为：ZmDi19-OE#1植株的BC₁F₁和BC₃F₁代转基因植株和非转基因植株、ZmDi19-OE#2植株的BC₁F₁和BC₃F₁代转基因植株和非转基因植株、ZmDi19-OE#3植株的BC₁F₁和BC₃F₁代转基因植株和非转基因植株(野生型玉米自交系B73)。

1、基因表达水平鉴定

提取供试植株叶片的总RNA并反转录得到cDNA，以GAPDH基因为内参基因，通过qPCR检测ZmDi19基因的相对表达水平。结果见图2。

用于检测ZmDi19基因的引物对：

ZmDi19-F：5’-ATGGACTCCGAGCACTGGAT-3’；

ZmDi19-R：5’-AACCATCTCTGAGCAGACAG-3’。

用于检测GAPDH基因的引物对：

GAPDH-F：5’-ATCAACGGCTTCGGAAGGAT-3’；

GAPDH-R：5’-CCGTGGACGGTGTCGTACTT-3’。

2、抗病性鉴定

抗病性鉴定在中国农业大学上庄实验基地进行。

灰斑病致病菌：玉米尾孢菌(Cercospora zeina)。

正常培养供试植株，喇叭口期接种致病菌，然后继续正常培养，授粉两周后进行表型调查，采用分级调查计算病情指数(DSI)。接种致病菌的具体方法(菌液灌心法)：用无菌水悬浮灰斑病致病菌的孢子，得到孢子浓度为2-4×10⁵个/mL的孢子悬液，利用注射器将孢子悬液灌注于玉米喇叭口中，每株玉米灌注5ml。

病情等级的分级标准(X代表病斑面积占叶片面积的百分比)：

1级(赋值为0)：X≤5％；

3级(赋值为0.25)：5％＜X≤10％；

5级(赋值为0.5)：10％＜X≤30％；

7级(赋值为0.75)：30％＜X≤70％；

9级(赋值为1)：70％＜X≤100％。

抗病性鉴定结果见图3。图3中，n表示各组植株数量，分隔线前的数字为非转基因植株的数量，分隔线后的数字为转基因植株的数量。星号表示每组的病情指数。

结果表明，与非转基因植株相比，转基因植株中ZmDi19基因的表达量显著提高，相应的转基因植株的病情指数显著降低。

实施例3、ZmDi19基因编辑植株的获得和鉴定

一、基因编辑载体的构建

设计基因编辑的靶点序列为：5’-CGCGGCTTGGGGTTCGAAC-3’(SEQ ID No.8)；

构建基因编辑载体，即如下重组质粒pBUE411-sgRNA：在pBUE411载体的BsaI酶切位点插入序列表的SEQ ID No.8所示的双链DNA分子后得到的重组质粒。重组质粒pBUE411-sgRNA已进行测序验证。基因编辑载体pBUE411-sgRNA编码一个sgRNA，其中sgRNA的靶序列结合区如序列表的SEQ ID No.9所示。基因编辑载体中具有Cas9基因，并表达得到Cas9蛋白。构建的基因编辑载体pBUE411-sgRNA用于对ZmDi19基因进行基因敲除。

二、基因编辑植株的获得

1、将基因编辑载体pBUE411-sgRNA导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌EHA105/pBUE411-sgRNA。

2、取步骤1得到的重组农杆菌EHA105/pBUE411-sgRNA，采用农杆菌介导法对玉米自交系B73的幼胚进行遗传转化，得到T₀代植株。

3、从T₀代植株中筛选目标序列发生变异的植株。

具体方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用Cas19F和Cas19R组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物并进行测序，将测序结果与野生型序列进行比较(野生型序列如序列表的SEQ ID No.1中第285-1070位所示)，筛选得到具有差异序列的植株。

Cas19F：5’-TCCGATCCGGTGCGACTACTAAC-3’；

Cas19R：5’-TCCCAGGTCAACCAAGCACAA-3’。

4、取步骤3筛选的T₀代植株，自交并收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为T₁代植株。

5、从T₁代植株中筛选基因编辑植株。

(1)将植株进行以基因编辑载体中的bar基因为靶标的PCR鉴定。PCR鉴定方法：取植株叶片，提取基因组DNA，采用bar-F和bar-R组成的引物对进行PCR扩增，如果没有得到扩增产物、PCR鉴定为阴性。

(2)将植株进行以基因编辑目标区域为靶标的鉴定。鉴定方法同步骤3。

如果某一植株步骤(1)PCR鉴定为阴性，且步骤(2)的鉴定结果显示与野生型序列具有差异且为纯合型(且两条染色体一致)，该植株为纯合突变基因编辑植株。

获得了三株纯合突变基因编辑植株，分别命名为ZmDi19-KO#1植株、ZmDi19-KO#2植株、ZmDi19-KO#3植株。

三株基因编辑植株的测序结果见图4。与野生型玉米自交系B73相比，两条同源染色体中ZmDi19基因均发生突变：

ZmDi19-KO#1植株是在野生型植株的序列SEQ ID No.1的第752-753位核苷酸之间插入了1个核苷酸(A)，ZmDi19-KO#2植株缺失野生型植株的序列SEQ ID No.1的第728-752位核苷酸(25个核苷酸)，ZmDi19-KO#3植株是在野生型植株的序列SEQ ID No.1的第752-753位核苷酸之间插入了1个核苷酸(C)，三种突变均造成移码突变，从而将ZmDi19基因敲除。

6、取基因编辑植株ZmDi19-KO#1、ZmDi19-KO#2和ZmDi19-KO#3，自交2代，获得后代植株，即为基因编辑株系。

获得了三个基因编辑株系，分别命名为ZmDi19-KO#1株系、ZmDi19-KO#2株系、ZmDi19-KO#3株系。

三、基因编辑植株的抗病性鉴定

供试植株为：ZmDi19-KO#1株系的T₂代植株、ZmDi19-KO#2株系的T₂代植株、ZmDi19-KO#3株系的T₂代植株，玉米自交系B73植株。

方法同实施例2的步骤四的2。

抗病性鉴定结果见图5。图5中，n表示植株数量，星号表示各组株系的病情指数。结果显示，相对于玉米自交系B73植株，基因编辑植株的病情指数显著增加。

实施例4、ZmPR10蛋白及其编码基因的获得

鉴于ZmDi19为含有锌指结构域的转录因子，该家族成员可以结合TACA(A/G)T元件从而调控靶标基因的表达。为了鉴定ZmDi19调控的靶标基因，我们采用了转录组和蛋白组分析技术，筛选ZmDi19基因过表达后在转录水平和蛋白水平发生变化的候选靶标基因。结合TACA(A/G)T元件分析，共筛选到12个在启动子区域含有该元件且表达发生改变的候选靶标基因。通过酵母单杂交一对一验证，最终鉴定到ZmDi 19可以结合编码病程相关蛋白基因ZmPR10的启动子，证明了ZmPR10基因即为ZmDi19的靶标基因。

玉米自交系B73的基因组DNA中的ZmPR10基因的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。ZmPR10基因仅有1个转录本，编码序列表的SEQ ID No.11所示的蛋白质。玉米自交系B73的cDNA中ZmPR10转录本的开放阅读框如序列表的SEQ ID No.12中第1-483位核苷酸所示。所述ZmPR10基因的编码序列为SEQ ID No.12，编码氨基酸序列是SEQ ID No.11的蛋白质ZmPR10。

实施例5、ZmPR10基因过表达植株纯系的获得和鉴定

一、重组表达载体的构建

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用ZmPR10-OE-F和ZmPR10-OE-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

ZmPR10-OE-F:5’-ATGGCCTCCGCCAACAGC-3’；

ZmPR10-OE-R:5’-TTAGTTGTAGGCGTCGGGG-3’。

3、取pBCXUN载体，采用限制性内切酶XcmI进行酶切，回收载体骨架。

4、将步骤2得到的PCR扩增产物和步骤3得到的载体骨架连接，得到重组质粒，命名为pBCXUN-ZmPR10。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：重组质粒pBCXUN-ZmPR10是在pBCXUN载体的XcmI酶切位点插入了核苷酸序列是SEQ ID No.12所示的DNA分子后得到的重组质粒。

二、过表达植株纯系的获得

1、将重组质粒pBCXUN-ZmPR10导入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmPR10。

2、取步骤1得到的重组农杆菌EHA105/pBCXUN-ZmPR10，采用农杆菌介导法对玉米自交系B73的幼胚进行遗传转化，得到T₀代植株。

3、将T₀代植株进行PCR鉴定。

PCR鉴定方法同实施例2的步骤二的3。

采用重组质粒pBCXUN-ZmPR10进行步骤二，对随机选取的PCR检测阳性的四个转基因植株进行命名，分别为：ZmPR10-OE#1植株、ZmPR10-OE#2植株、ZmPR10-OE#3植株、ZmPR10-OE#4植株。

4、T₀代植株自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株，即为T₁代植株。从T₁代植株中筛选转基因植株(PCR鉴定)进行自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株即为T₂代植株。从T₂代植株中筛选转基因植株(PCR鉴定)进行自交，收获籽粒，将籽粒培育为植株即为T₃代植株。PCR鉴定方法同实施例2的步骤二的3。对于某一T₂代植株，如果其自交得到的T₃代植株均为转基因植株，该T₂代植株为纯合的转基因植株。纯合的转基因植株自交得到的后代为纯合的转基因株系。

得到如下纯合的转基因株系：ZmPR10-OE#1株系、ZmPR10-OE#2株系、ZmPR10-OE#3株系、ZmPR10-OE#4株系。按照上述方法分别得到ZmPR10-OE#1株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#2株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#3株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#4株系的T₃代植株。

三、植株的抗病性鉴定

供试植株为：ZmPR10-OE#1株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#2株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#3株系的T₃代植株、ZmPR10-OE#4株系的T₃代植株，以及玉米自交系B73植株。

1、基因表达水平鉴定

方法同实施例2的步骤四的1。其中，用于检测ZmPR10基因的引物对如下所示：

ZmPR10-F：5’-TTCACCTCAGTCATGCCGTT-3’；

ZmPR10-R：5’-GGCGGTGACGGACTCCTT-3’。

鉴定结果见图6。

2、抗病性鉴定

方法同实施例2的步骤四的2。

抗病性鉴定结果见图7和图8。图7中，n表示各组植株数量，星号表示每组的病情指数。

结果表明，与玉米自交系B73植株(对照非转基因植株)相比，转基因植株中ZmPR10基因的表达量显著增高，相应的转基因植株的病情指数显著降低。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> ZmDi19基因及其靶标基因ZmPR10在培育抗灰斑病植物中的应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3281

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 1

acggcgagtc agtctcagtg ggggacggcc gacgagccga ccgcctcagc tctgcggctc 60

tgcctgctca cctcgttctc ccggcgcggc ccggcgggga cggcaaccac cgcacggcga 120

ataaaaaaac agaaccagcg gcgccacgtc cctgtcctcc tcctctctct ctccacattt 180

cctctcccga taagagtgag gcctcggctc agcttgagct tcccctccct cccctcctgc 240

gctccagctc ccctccatcc tcggccaaaa attctgcggc gagctccgat ccggtgcgac 300

tactaaccca cgccgcagaa gccgcgcgtc ctgatcgcgc gggggtcgag gagaggggaa 360

gcgcggcgcc gcggttgcct gccaccgcac cgccgcagga gaaggaagag gagcccgtat 420

ccctccgccc cgctgcccgc cggaccgatg gactccgagc actggatctc gcgcctggcc 480

gccgcgaagc gcttctacgc ggcgcagctc ggccacagcg gtgcggctac cgcgctccct 540

ccagccccgt gttccgttcc gctgggtctg ccttcgtggc ggcgtggttt ctgactgctt 600

caccctgggc ttgcttttgc gggcgcagat cgggccggga tggatgagct ggagatggac 660

gaggaggtca ggcccgagtt cccctgcccc tactgctacg aggaccacga cgtcggatcc 720

ctctgcgcgc acctggagga ggagcacccg ttcgaacccc aagccgcggt gagtgccccc 780

ccaccggacg ccttaggccc tgtttggcac agctgctgct ggttgaaaaa gcagcttatc 840

tgataagctg gtgaaaagca gcttatgctt gttggctgct tttagtgtat tctgagaagc 900

agctgaacta ataagctgct ggagaagcta gctgtttggc aaaacttctg cttaaatttg 960

tgaagaagct gaaaataagc tgtgccaaac agggccttag tctggtgtgt tttgccctcc 1020

tatgaattgc tagagaggat ttagcgaatt tgtgcttggt tgacctggga actgaccaca 1080

tgatgctagt cgtgtcggcg cgggtgcttg atcatatggg ttatatacct tgttctgatt 1140

ggaatttgga actagcagct cgttggcgtt gacttttgaa gaacgagatt gttcttcttt 1200

tacacttttc gggatctatt ggacaggaga agtatgggaa agatggtaca atttgattac 1260

ttgaactatc cttttagtct gcctaaatga aacgagagtt ttgggaaatg aatatatgac 1320

aacttggagc ttctcggaga tgcaaagtga aagctaatct atcatacgtc agtgttataa 1380

gcctgtggct ggggtttttg tcaatataca accatggact gaagtctgct acaagaaagc 1440

ttacaaatag gtatctatga gaagaaacga ttcaagtttg atccgaagaa tgaacatcgc 1500

tgccttcgga ctagtgaact ggaacatcag ctttggaagg aacccagtaa ctcagtatca 1560

ggggtagaac ttctagctta tcctaagttg tagatttaag agcttagttg tctccaatgt 1620

ttatggtatc tgctgctgca agttgatttg aggacccttt ctcttcgcct cagttgaaac 1680

gatcttttgc ataagctata agcctatagc atggacgaaa ctcaccttaa cgatgtcgtt 1740

gcatttatgc ccatcttgct ggttacttta ttcctgccct gattttttgc actgcccatt 1800

ccaggcctgc cctgtctgct cagagatggt tacgaaggat atggttaacc atattactac 1860

gcaacatgga tatttattca aggtattctc acaccgtgga catgtgaatt cgtggttctt 1920

gacctcgctc accaagtcac catttgatgc atacgagtgt aggcttacag tttatgaagt 1980

gcttttttct ctcccttgaa actcatccgc cttctgccct cccgcagaat cgccgccggc 2040

tgcgcagatt catcattcca ggcagccagg ccctctcttt gctgagccga gatctacggg 2100

aagcccactt gcaggtgctc ctcggaggag gcggacagag atccagcgac aacagcagca 2160

gcagcagcgc cacgaacatt tcggctgatc ctcttctgtc gtcgttcggc cttggcttcc 2220

ctacctcaga cgcggagcaa gcatccaagt cgactgtttc cattcctgat gatgcaacga 2280

cggtgaaaga agcgcccgct caggcacgga agctaaggta tattttatac gcatccatgc 2340

taaaatgaaa cgctagtgag tcgacaggct taacaaccac atcgtttttt cgcccagtcg 2400

tggcggacac catagtcttc atgttacttt ctggactact agtttagagt cgggcatctg 2460

aactgtctcg tgtgacaggg aaatcttata tgtggccacc atgcaaatct gagccagtag 2520

ttctcgtagt cttgtagact agatagctcg ttttgtttac ccgttcggaa agatgcctcc 2580

tgttgaataa taaagtcttc caaccagcaa cttggtttca ttgaaaaaat gatgagcagt 2640

gtagtatcaa acttcctctt cgcccttctg caacttgctg ttttgtaaaa cgcatagatg 2700

aagcaggctg tccacgcgac cattaaaccc tgctcatctt accaattgat tgtacacaca 2760

acacagttca gtcatcagat gtgttcgttt ttttttgtgg cacagtatcg attcgtcgct 2820

cacaagtgaa gaaagggagc tgaagcggaa gcaagcccgc gtcagagcca cgttcgtgca 2880

ggacctgctg ctctctactc tattcggcga ctgatgacga accagagcga gcctggtatt 2940

atcactggaa ggtgcagagt tgatgtgggc gtgatgtatc tttctaagtt attgtaagcc 3000

ggtctctgtc ttcacaactg acgatctgtg tgtggtacgc accacgcacg caagtcgcgg 3060

ttgtgcgtgt acgtctgaac tctggagcat tggtttgttg taccaacata atgagtcaca 3120

acggcggatg gctggctata cgtacactgc agtagtgcgt aggagcgatt agaccagttc 3180

cgaaactaca gccatgaagc gcatggctgt acactgcact gtataggtta cgatcagtga 3240

gttccgaaac tgtgcttaga ccggggctcc tctgcctttt c 3281

<210> 2

<211> 229

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 2

Met Asp Ser Glu His Trp Ile Ser Arg Leu Ala Ala Ala Lys Arg Phe

1 5 10 15

Tyr Ala Ala Gln Leu Gly His Ser Asp Arg Ala Gly Met Asp Glu Leu

20 25 30

Glu Met Asp Glu Glu Val Arg Pro Glu Phe Pro Cys Pro Tyr Cys Tyr

35 40 45

Glu Asp His Asp Val Gly Ser Leu Cys Ala His Leu Glu Glu Glu His

50 55 60

Pro Phe Glu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Pro Val Cys Ser Glu Met Val

65 70 75 80

Thr Lys Asp Met Val Asn His Ile Thr Thr Gln His Gly Tyr Leu Phe

85 90 95

Lys Asn Arg Arg Arg Leu Arg Arg Phe Ile Ile Pro Gly Ser Gln Ala

100 105 110

Leu Ser Leu Leu Ser Arg Asp Leu Arg Glu Ala His Leu Gln Val Leu

115 120 125

Leu Gly Gly Gly Gly Gln Arg Ser Ser Asp Asn Ser Ser Ser Ser Ser

130 135 140

Ala Thr Asn Ile Ser Ala Asp Pro Leu Leu Ser Ser Phe Gly Leu Gly

145 150 155 160

Phe Pro Thr Ser Asp Ala Glu Gln Ala Ser Lys Ser Thr Val Ser Ile

165 170 175

Pro Asp Asp Ala Thr Thr Val Lys Glu Ala Pro Ala Gln Ala Arg Lys

180 185 190

Leu Ser Ile Asp Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu Lys Arg

195 200 205

Lys Gln Ala Arg Val Arg Ala Thr Phe Val Gln Asp Leu Leu Leu Ser

210 215 220

Thr Leu Phe Gly Asp

225

<210> 3

<211> 1504

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 3

acggcgagtc agtctcagtg ggggacggcc gacgagccga ccgcctcagc tctgcggctc 60

tgcctgctca cctcgttctc ccggcgcggc ccggcgggga cggcaaccac cgcacggcga 120

ataaaaaaac agaaccagcg gcgccacgtc cctgtcctcc tcctctctct ctccacattt 180

cctctcccga taagagtgag gcctcggctc agcttgagct tcccctccct cccctcctgc 240

gctccagctc ccctccatcc tcggccaaaa attctgcggc gagctccgat ccggtgcgac 300

tactaaccca cgccgcagaa gccgcgcgtc ctgatcgcgc gggggtcgag gagaggggaa 360

gcgcggcgcc gcggttgcct gccaccgcac cgccgcagga gaaggaagag gagcccgtat 420

ccctccgccc cgctgcccgc cggaccgatg gactccgagc actggatctc gcgcctggcc 480

gccgcgaagc gcttctacgc ggcgcagctc ggccacagcg atcgggccgg gatggatgag 540

ctggagatgg acgaggaggt caggcccgag ttcccctgcc cctactgcta cgaggaccac 600

gacgtcggat ccctctgcgc gcacctggag gaggagcacc cgttcgaacc ccaagccgcg 660

gcctgccctg tctgctcaga gatggttacg aaggatatgg ttaaccatat tactacgcaa 720

catggatatt tattcaagaa tcgccgccgg ctgcgcagat tcatcattcc aggcagccag 780

gccctctctt tgctgagccg agatctacgg gaagcccact tgcaggtgct cctcggagga 840

ggcggacaga gatccagcga caacagcagc agcagcagcg ccacgaacat ttcggctgat 900

cctcttctgt cgtcgttcgg ccttggcttc cctacctcag acgcggagca agcatccaag 960

tcgactgttt ccattcctga tgatgcaacg acggtgaaag aagcgcccgc tcaggcacgg 1020

aagctaagta tcgattcgtc gctcacaagt gaagaaaggg agctgaagcg gaagcaagcc 1080

cgcgtcagag ccacgttcgt gcaggacctg ctgctctcta ctctattcgg cgactgatga 1140

cgaaccagag cgagcctggt attatcactg gaaggtgcag agttgatgtg ggcgtgatgt 1200

atctttctaa gttattgtaa gccggtctct gtcttcacaa ctgacgatct gtgtgtggta 1260

cgcaccacgc acgcaagtcg cggttgtgcg tgtacgtctg aactctggag cattggtttg 1320

ttgtaccaac ataatgagtc acaacggcgg atggctggct atacgtacac tgcagtagtg 1380

cgtaggagcg attagaccag ttccgaaact acagccatga agcgcatggc tgtacactgc 1440

actgtatagg ttacgatcag tgagttccga aactgtgctt agaccggggc tcctctgcct 1500

tttc 1504

<210> 4

<211> 201

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 4

Met Asp Glu Leu Glu Met Asp Glu Glu Val Arg Pro Glu Phe Pro Cys

1 5 10 15

Pro Tyr Cys Tyr Glu Asp His Asp Val Gly Ser Leu Cys Ala His Leu

20 25 30

Glu Glu Glu His Pro Phe Glu Pro Gln Ala Ala Ala Cys Pro Val Cys

35 40 45

Ser Glu Met Val Thr Lys Asp Met Val Asn His Ile Thr Thr Gln His

50 55 60

Gly Tyr Leu Phe Lys Asn Arg Arg Arg Leu Arg Arg Phe Ile Ile Pro

65 70 75 80

Gly Ser Gln Ala Leu Ser Leu Leu Ser Arg Asp Leu Arg Glu Ala His

85 90 95

Leu Gln Val Leu Leu Gly Gly Gly Gly Gln Arg Ser Ser Asp Asn Ser

100 105 110

Ser Ser Ser Ser Ala Thr Asn Ile Ser Ala Asp Pro Leu Leu Ser Ser

115 120 125

Phe Gly Leu Gly Phe Pro Thr Ser Asp Ala Glu Gln Ala Ser Lys Ser

130 135 140

Thr Val Ser Ile Pro Asp Asp Ala Thr Thr Val Lys Glu Ala Pro Ala

145 150 155 160

Gln Ala Arg Lys Leu Ser Ile Asp Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Arg

165 170 175

Glu Leu Lys Arg Lys Gln Ala Arg Val Arg Ala Thr Phe Val Gln Asp

180 185 190

Leu Leu Leu Ser Thr Leu Phe Gly Asp

195 200

<210> 5

<211> 807

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 5

gatcgggccg ggatggatga gctggagatg gacgaggagg tcaggcccga gttcccctgc 60

ccctactgct acgaggacca cgacgtcgga tccctctgcg cgcacctgga ggaggagcac 120

ccgttcgaac cccaagccgc ggcctgccct gtctgctcag agatggttac gaaggatatg 180

gttaaccata ttactacgca acatggatat ttattcaaga atcgccgccg gctgcgcaga 240

ttcatcattc caggcagcca ggccctctct ttgctgagcc gagatctacg ggaagcccac 300

ttgcaggtgc tcctcggagg aggcggacag agatccagcg acaacagcag cagcagcagc 360

gccacgaaca tttcggctga tcctcttctg tcgtcgttcg gccttggctt ccctacctca 420

gacgcggagc aagcatccaa gtcgactgtt tccattcctg atgatgcaac gacggtgaaa 480

gaagcgcccg ctcaggcacg gaagctaagt atcgattcgt cgctcacaag tgaagaaagg 540

gagctgaagc ggaagcaagc ccgcgtcaga gccacgttcg tgcaggacct gctgctctct 600

actctattcg gcgactgatg acgaaccaga gcgagcctgg tattatcact ggaaggtgca 660

gagttgatgt gggcgtgatg tatctttcta agttattgta agccggtctc tgtcttcaca 720

actgacgatc tgtgtgtggt acgcaccacg cacgcaagtc gcggttgtgc gtgtacgtct 780

gaactctgga gcattggttt gttgtac 807

<210> 6

<211> 182

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 6

Met Ser Leu His Leu Cys Pro Ser Cys Trp Leu Leu Tyr Ser Cys Pro

1 5 10 15

Asp Phe Leu His Cys Pro Phe Gln Ala Cys Pro Val Cys Ser Glu Met

20 25 30

Val Thr Lys Asp Met Val Asn His Ile Thr Thr Gln His Gly Tyr Leu

35 40 45

Phe Lys Asn Arg Arg Arg Leu Arg Arg Phe Ile Ile Pro Gly Ser Gln

50 55 60

Ala Leu Ser Leu Leu Ser Arg Asp Leu Arg Glu Ala His Leu Gln Val

65 70 75 80

Leu Leu Gly Gly Gly Gly Gln Arg Ser Ser Asp Asn Ser Ser Ser Ser

85 90 95

Ser Ala Thr Asn Ile Ser Ala Asp Pro Leu Leu Ser Ser Phe Gly Leu

100 105 110

Gly Phe Pro Thr Ser Asp Ala Glu Gln Ala Ser Lys Ser Thr Val Ser

115 120 125

Ile Pro Asp Asp Ala Thr Thr Val Lys Glu Ala Pro Ala Gln Ala Arg

130 135 140

Lys Leu Ser Ile Asp Ser Ser Leu Thr Ser Glu Glu Arg Glu Leu Lys

145 150 155 160

Arg Lys Gln Ala Arg Val Arg Ala Thr Phe Val Gln Asp Leu Leu Leu

165 170 175

Ser Thr Leu Phe Gly Asp

180

<210> 7

<211> 2254

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 7

accgcacggc gaataaaaaa acagaaccag cggcgccacg tccctgtcct cctcctctct 60

ctctccacat ttcctctccc gataagagtg aggcctcggc tcagcttgag cttcccctcc 120

ctcccctcct gcgctccagc tcccctccat cctcggccaa aaattctgcg gcgagctccg 180

atccggtgcg actactaacc cacgccgcag aagccgcgcg tcctgatcgc gcgggggtcg 240

aggagagggg aagcgcggcg ccgcggttgc ctgccaccgc accgccgcag gagaaggaag 300

aggagcccgt atccctccgc cccgctgccc gccggaccga tggactccga gcactggatc 360

tcgcgcctgg ccgccgcgaa gcgcttctac gcggcgcagc tcggccacag cgatcgggcc 420

gggatggatg agctggagat ggacgaggag gtcaggcccg agttcccctg cccctactgc 480

tacgaggacc acgacgtcgg atccctctgc gcgcacctgg aggaggagca cccgttcgaa 540

ccccaagccg cggtgagtgc ccccccaccg gacgccttag gccctgtttg gcacagctgc 600

tgctggttga aaaagcagct tatctgataa gctggtgaaa agcagcttat gcttgttggc 660

tgcttttagt gtattctgag aagcagctga actaataagc tgctggagaa gctagctgtt 720

tggcaaaact tctgcttaaa tttgtgaaga agctgaaaat aagctgtgcc aaacagggcc 780

ttagtctggt gtgttttgcc ctcctatgaa ttgctagaga ggatttagcg aatttgtgct 840

tggttgacct gggaactgac cacatgatgc tagtcgtgtc ggcgcgggtg cttgatcata 900

tgggttatat accttgttct gattggaatt tggaactagc agctcgttgg cgttgacttt 960

tgaagaacga gattgttctt cttttacact tttcgggatc tattggacag gagaagtatg 1020

ggaaagatgg tacaatttga ttacttgaac tatcctttta gtctgcctaa atgaaacgag 1080

agttttggga aatgaatata tgacaacttg gagcttctcg gagatgcaaa gtgaaagcta 1140

atctatcata cgtcagtgtt ataagcctgt ggctggggtt tttgtcaata tacaaccatg 1200

gactgaagtc tgctacaaga aagcttacaa ataggtatct atgagaagaa acgattcaag 1260

tttgatccga agaatgaaca tcgctgcctt cggactagtg aactggaaca tcagctttgg 1320

aaggaaccca gtaactcagt atcaggggta gaacttctag cttatcctaa gttgtagatt 1380

taagagctta gttgtctcca atgtttatgg tatctgctgc tgcaagttga tttgaggacc 1440

ctttctcttc gcctcagttg aaacgatctt ttgcataagc tataagccta tagcatggac 1500

gaaactcacc ttaacgatgt cgttgcattt atgcccatct tgctggttac tttattcctg 1560

ccctgatttt ttgcactgcc cattccaggc ctgccctgtc tgctcagaga tggttacgaa 1620

ggatatggtt aaccatatta ctacgcaaca tggatattta ttcaagaatc gccgccggct 1680

gcgcagattc atcattccag gcagccaggc cctctctttg ctgagccgag atctacggga 1740

agcccacttg caggtgctcc tcggaggagg cggacagaga tccagcgaca acagcagcag 1800

cagcagcgcc acgaacattt cggctgatcc tcttctgtcg tcgttcggcc ttggcttccc 1860

tacctcagac gcggagcaag catccaagtc gactgtttcc attcctgatg atgcaacgac 1920

ggtgaaagaa gcgcccgctc aggcacggaa gctaagtatc gattcgtcgc tcacaagtga 1980

agaaagggag ctgaagcgga agcaagcccg cgtcagagcc acgttcgtgc aggacctgct 2040

gctctctact ctattcggcg actgatgacg aaccagagcg agcctggtat tatcactgga 2100

aggtgcagag ttgatgtggg cgtgatgtat ctttctaagt tattgtaagc cggtctctgt 2160

cttcacaact gacgatctgt gtgtggtacg caccacgcac gcaagtcgcg gttgtgcgtg 2220

tacgtctgaa ctctggagca ttggtttgtt gtac 2254

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

cgcggcttgg ggttcgaac 19

<210> 9

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

cgcggcuugg gguucgaac 19

<210> 10

<211> 576

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 10

atggcctccg ccaacagctg gaccctcgag atcgcgtcgc cggtggctcc gcagcgcctg 60

ttccgcgccg ccgtgatgga ctggcacacc ctggcgccca aggtcgcctc ccacgtcgtc 120

gccagcgcgc agcccgtgga gggcgacggc ggcgttggca gcgtcaggca gttcaacttc 180

acctcaggta agtgcccagc ccaggccagc atgctctctc tctctttcgc ctgatcgatc 240

aaacagctaa gcgcacgacg tcgtgcggtc gctcttgcag tcatgccgtt cagcttcatg 300

aaggagaggc tcgagttcct ggacgcggac aagtgcgagt gcaagaacac gctcatcgag 360

ggcggcggca tcggcgtcgc catcgaaacg gcgacgtcgc acatcaaggt ggagcccgcg 420

gccggcggcg ggagcgtggt gaaggtcgaa tccacttaca agctgctgcc gggcgtggag 480

gtgaaggacg agatcgccaa ggccaaggag tccgtcaccg ccatcttcaa gggtgccgag 540

gcctacctcg tcgccaaccc cgacgcctac aactaa 576

<210> 11

<211> 160

<212> PRT

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 11

Met Ala Ser Ala Asn Ser Trp Thr Leu Glu Ile Ala Ser Pro Val Ala

1 5 10 15

Pro Gln Arg Leu Phe Arg Ala Ala Val Met Asp Trp His Thr Leu Ala

20 25 30

Pro Lys Val Ala Ser His Val Val Ala Ser Ala Gln Pro Val Glu Gly

35 40 45

Asp Gly Gly Val Gly Ser Val Arg Gln Phe Asn Phe Thr Ser Val Met

50 55 60

Pro Phe Ser Phe Met Lys Glu Arg Leu Glu Phe Leu Asp Ala Asp Lys

65 70 75 80

Cys Glu Cys Lys Asn Thr Leu Ile Glu Gly Gly Gly Ile Gly Val Ala

85 90 95

Ile Glu Thr Ala Thr Ser His Ile Lys Val Glu Pro Ala Ala Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Val Val Lys Val Glu Ser Thr Tyr Lys Leu Leu Pro Gly Val

115 120 125

Glu Val Lys Asp Glu Ile Ala Lys Ala Lys Glu Ser Val Thr Ala Ile

130 135 140

Phe Lys Gly Ala Glu Ala Tyr Leu Val Ala Asn Pro Asp Ala Tyr Asn

145 150 155 160

<210> 12

<211> 483

<212> DNA

<213> 玉米（Zea mays）

<400> 12

atggcctccg ccaacagctg gaccctcgag atcgcgtcgc cggtggctcc gcagcgcctg 60

ttccgcgccg ccgtgatgga ctggcacacc ctggcgccca aggtcgcctc ccacgtcgtc 120

gccagcgcgc agcccgtgga gggcgacggc ggcgttggca gcgtcaggca gttcaacttc 180

acctcagtca tgccgttcag cttcatgaag gagaggctcg agttcctgga cgcggacaag 240

tgcgagtgca agaacacgct catcgagggc ggcggcatcg gcgtcgccat cgaaacggcg 300

acgtcgcaca tcaaggtgga gcccgcggcc ggcggcggga gcgtggtgaa ggtcgaatcc 360

acttacaagc tgctgccggg cgtggaggtg aaggacgaga tcgccaaggc caaggagtcc 420

gtcaccgcca tcttcaaggg tgccgaggcc tacctcgtcg ccaaccccga cgcctacaac 480

taa 483

Claims

1.蛋白质的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

D1）在提高植物灰斑病抗性中的应用；

D2）在培育抗灰斑病植物中的应用；

D3）在抗灰斑病植物育种中的应用；

所述蛋白质为下述任一种：

A1）氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.11的蛋白质；

A2）在A1）的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；

所述植物为单子叶植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述蛋白质来源于玉米。

3.与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料的应用，其特征在于，所述应用为下述任一种：

E1）在提高植物灰斑病抗性中的应用；

E2）在培育抗灰斑病植物中的应用；

E3）在抗灰斑病植物育种中的应用；

所述生物材料为下述B1）至B4）中的任一种：

B1）编码权利要求1或2中所述蛋白质的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，B1）所述核酸分子为下述任一种：

C1）核苷酸序列是SEQ ID No.3的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.3的第448-1137位的cDNA分子；

C2）核苷酸序列是SEQ ID No.12的DNA分子或编码序列是SEQ ID No.12的cDNA分子。

5.一种培育抗灰斑病植物的方法，其特征在于，所述方法包括提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性，得到灰斑病抗性高于所述目的植物的抗灰斑病植物；所述植物为单子叶植物；所述提高目的植物中权利要求1或2中所述蛋白质的含量和/或活性通过提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量来实现。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述提高目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量通过将权利要求1或2中所述蛋白质的编码基因导入所述目的植物来实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述蛋白质的编码基因为下述任一种：

F1）编码序列是SEQ ID No.3的第448-1137位的cDNA分子；

F2）编码序列是SEQ ID No.12的cDNA分子。