CN109337885B - 球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA在棉花和烟草育种中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因在棉花和烟草育种中的应用。本发明通过构建上述基因的超量表达载体并整合到棉花和烟草基因组中，提高棉花和烟草植株的耐盐性。本发明还提供了改良棉花和烟草种子的植物表达载体，包括球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。本发明所述的球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因可以提高棉花和烟草的耐盐性，为棉花和烟草育种提供一种新选择。

Description

球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA在棉花和 烟草育种中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因在棉花和烟草育种中的应用。

背景技术

棉花是重要的天然纤维作物及经济作物，在我国的国民经济中地位突出。我国既是世界上的棉花生产大国，年产量占全球总量的25％左右，也是世界上的棉花消费大国，消费量约占全球消费的40％。因此，提高棉花的产量和品质是棉花研究领域的重要课题。土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题。当前，全球盐渍化土地面积已达9.5×108hm²，中国盐渍化土地面积约2亿hm²。土壤的盐渍化是限制作物产量的一个重要因素，也是世界农业生产急待解决的重要问题(Maet al.,2011)。若要解决这个问题，一方面，需要对盐渍土壤进行长期的改良；另一方面，需要培育出适应盐渍土壤的高度耐盐的作物新品种。

Ca²⁺信号通过含有EF结构域(elongation factor-hand,EF-hand)的钙传感元件(calcium sensor)进行信号转导(Day et al.,2002)。根据EF-hand结构域的数目、组成方式及氨基酸序列的同源性，含有EF-hand结构域的钙离子受体在植物中主要分为三类：钙离子依赖型蛋白质激酶(Ca²⁺dependent protein kinase,CDPKs)、钙调素(calmodulin,CaM)和钙调磷酸酶B亚基类似蛋白(calcineurim B-like proteins,CBL)(Reddy et al.,2011)。细胞受到胞外或胞内刺激后，细胞质内Ca²⁺从内质网、线粒体、叶绿体和液泡等细胞器中释放，然后与胞内受体钙调素(calmodulin,CaM)或CaM相关蛋白结合，进一步通过与细胞内多种酶或蛋白质结合以调节细胞生理生化过程(Dodd et al.,2010)。

钙调磷酸酶是Ca²⁺/CaM依赖性的异源二聚体蛋白磷酸酶，也是迄今发现的唯一受Ca²⁺和钙调素(calmodulin,CaM)调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸酶。钙调磷酸酶由A、B两个亚基组成，钙调磷酸酶的A亚基为催化亚基，B亚基为调节亚基，属于PP2B类蛋白磷酸酶。有研究表明，钙调磷酸酶全酶是由催化亚基CNA和调节亚基CNB组合而成的异源二聚体(Rusnak and Pamela,2000)。CNA是全酶的催化亚基，是全酶的催化和调节核心，从哺乳动物到低等真核生物，其氨基酸序列均高度保守。CNA由521个氨基酸组成，与其他的蛋白质磷酸酶具有高度的同源性。CNA的催化核心区域是由两个β片层组成一个形状类似λ，角度约30度的变形“β三明治”。一侧链上有一段混合的α/β结构，另一侧上连接的是α螺旋，底物由一个广而浅的隧道通向这个活性中心。CNA上5个结构域中的N端结构区域通过一个15个氨基酸残基的loop与CNB的N端α-螺旋相连，称为CNB结合区域(BBH)，是B亚基和免疫抑制复合物的结合部位。CNA的15-24残基与CNB的C端之间的盐键作用力，很可能是CNA与CNB之间的另一主要作用力。BBH的上部是非极性的，和CNB的疏水凹槽形成了互补表面，其下部分除了N末端的一个疏水斑之外均是极性的。另外的CaM结合区域，CaM在这个区域与CNA结合，在Ca²⁺存在的条件下，可以激活钙调磷酸酶(Kssinger et al.,1995；Griffith et al.,1995；Rusnak and Pamela,2000)。所以CNA可以与CNB或CaM结合激活钙调磷酸酶的活性并行使其功能。根据钙调磷酸酶的A、B亚基的作用机理，推测CNA和CNB可能参与了盐胁迫响应的调控。所以研究两个亚基在受体植物耐盐性中的功能，对于提高作物盐耐受能力具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于为棉花和烟草耐盐性育种提供一种新选择。本发明的又一目的在于提供含上述植物表达载体的转基因棉花和烟草的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：

球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因在棉花和烟草抗逆性育种中的应用。

进一步地，所述的应用为球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因在提高棉花植株耐盐性中的应用。

进一步地，所述的应用为球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因在提高烟草植株耐盐性中的应用。

进一步地，球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因的cDNA分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因编码的蛋白质分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

一种改良棉花和烟草种子的植物表达载体，其主要活性成分为球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。

进一步地，所述的球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因编码的蛋白质分别具有SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

进一步地，所述的球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB、A亚基BbCNA基因的cDNA分别具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述表达该蛋白质的元件从5’-3’方向依次包含组成型启动子p35S，球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB基因，终止子。

进一步地，所述表达该蛋白质的元件从5’-3’方向依次包含组成型启动子p35S，球孢白僵菌类钙调磷酸酶A亚基BbCNA基因，终止子。

本发明具有的有益效果：

本发明采用了来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的组成型启动子p35S。本发明是通过组成型表达球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因，以提高棉花和烟草的耐盐性。

试验结果证明，球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA转基因烟草和棉花植株生长及发育正常，可正常开花结实，幼苗生长与野生型对照无明显差异。这表明，超量表达BbCNB和BbCNA基因对烟草和棉花植株的生长发育没有明显影响。35S：BbCNB和35S：BbCNA转基因烟草幼苗在添加有150mM和200mM的NaCl培养基中主根伸长、根毛生长及真叶发育状态均优于野生型。转基因棉花植株在含有4g/kg和6g/kg NaCl的土壤中生长状态优于野生型植株。转基因植株中渗透调节物质脯氨酸含量，以及与植物抗逆调节相关基因的表达量均有不同程度的上调。

以上结果显示，在棉花和烟草中超量表达BbCNB和BbCNA基因可以提高植株对盐胁迫的耐受能力。本发明为棉花耐盐性育种提供了一种新选择。本发明方法简便易行，效果显著，可以提高棉花和烟草种子耐盐性，能提高棉花和烟草的经济效益。

附图说明

图1：BbCNA和BbCNB蛋白与其它来源的钙调磷酸酶A、B亚基蛋白的多重序列比较

图2：35S：BbCNA和35S：BbCNB表达载体的构建流程图。

载体主要元件标示，gus:nptII：β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；nos：终止子；kanamycin：卡那霉素抗性基因；p35S：来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的植物组成型启动子；CaMV35S poly A：35S终止子；T-Border：T-DNA插入边界。

图3：T₀代转基因烟草叶片中BbCNA和BbCNB基因的表达量检测

图4：烟草耐盐性分析

图5：T₀代转基因棉花叶片中BbCNA和BbCNB基因的表达量检测

图6：棉花耐盐性分析

具体实施方式

下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》(Sambrook和Russell,2001)。实施例中所使用的引物序列见表1。

表1引物序列表

实施例1：

球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因的克隆

前期从球孢白僵菌基因组中克隆得到钙调磷酸酶B亚基的编码基因，将其命名为BbCNB(基因登录号：GQ372972.1)。为获得其cDNA克隆，提取盐胁迫下培养的球孢白僵菌总RNA，反转录获得cDNA，从中克隆到钙调磷酸酶A亚基的编码基因BbCNA(基因登录号：EU386770.1)和B亚基的编码基因BbCNB(无内含子)。利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取球孢白僵菌的RNA。参照Takara说明书进行cDNA的合成，用作BbCNB和BbCNA基因克隆的模板。最后用设计合成的该基因的特异引物，以上述的cDNA为模板，扩增该基因的完整cDNA序列。扩增条件如下：10×PCR buffer for KOD Plus 5μL，25mmol MgSO₄ 5μL，2mmol/L dNTPs 2μL，引物1(5μmol/L)2μL，引物2(5μmol/L)2μL，KOD Plus聚合酶1U/μL，陆地棉cDNA约60ng，双蒸水补足至50μL。扩增程序为：94℃，2min；94℃，15sec；56℃，30sec；68℃，1.5min，35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，克隆至平端载体pEASY-Blunt(TransGen Biotech)后寄至华大公司测序验证。

在NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上对获得的基因序列进行检索，BbCNA基因全长为1928bp，包含一个长为1578bp的完整开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。DNAStar软件分析该ORF编码525个氨基酸残基，预测分子量(Molecular Weihgt)约为60.00KDa。BbCNB基因全长为680bp，其中包含一个525bp的完整开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)。DNAStar软件分析该ORF编码174个氨基酸残基，预测分子量(MolecularWeihgt)约为19.68KDa。用BbCNA和BbCNB基因序列推导出相应的氨基酸序列，在NCBI网站上对棉花、拟南芥、烟草中的钙调磷酸酶A、B亚基同源蛋白与BbCNA、BbCNB进行氨基酸序列比对。结果显示，如图1A所示，球孢白僵菌来源的BbCNA与棉花(Gossypium hirsutum)、烟草(Nicotiana tabacum)及拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物来源的钙调磷酸酶A亚基同源蛋白的氨基酸序列同源性分别为36.7％、34.7％和35.1％；如图1B所示，BbCNB与棉花、烟草和拟南芥来源的钙调磷酸酶B亚基同源蛋白的氨基酸序列同源性分别为27.4％、26.9％和28.6％。其氨基酸序列分析表明，不同来源的B亚基蛋白上都有相同的EF-handCa²⁺结合区域，且A亚基上与B亚基结合的活性区域同源性较高，预测在功能上具有相似性。

在NCBI数据库中，选择来自不同物种的类钙调磷酸酶B亚基基因(GhCBL1)进行同源性比对。参与分析的序列：GhCBL1(GenBank登录号：NP_001313993.1)(棉花，Gossypiumhirsutum)，NtCBL1(GenBank登录号：XP_016451516.1)(烟草，Nicotiana tabacum)，AtCBL1(GenBank登录号：NP_567533.1)(拟南芥，Arabidopsis thaliana)。由图1可知，BbCNA和BbCNB蛋白同这些来自不同物种的蛋白一样，存在着保守结构域Pfam Domain,transmembran helix region，表明所克隆的球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因编码类钙调磷酸酶B亚基基因、A亚基基因。

实施例2：DNA片段回收，载体构建，大肠杆菌转化

紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒(Aidlab)的方法回收相应的DNA片段。载体构建流程见图2。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。

回收的片段与载体建立如下连接体系：10×T4 DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4 DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL的连接体系。

载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1：3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。

本研究用于棉花转化的表达载体质粒的整个T-DNA区段约17.8kb，结构见图3，包括筛选标记基因和报告基因的融合基因(gus:nptII)、目的片段(BbCNB和BbCNA)两个表达元件。确定筛选标记基因特性可以采用PCR进行检测，报告基因gus可通过组织化学染色确定。筛选目的片段是否已经整合到棉花DNA可通过PCR进行检测。目的基因BbCNA构建入植物表达载体pLGN的流程见图3A。目的基因BbCNB构建入植物表达载体pLGN的流程见图3B。在p5骨架载体的基础上，其T-DNA区段(RB和LB之间区域)替换成标记基因nptII的融合基因表达盒，并在P5表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。根据表达载体的构建流程图，采用相应的限制性内切酶消化，按照上述的链接反应，构建BbCNB和BbCNA基因的特异表达载体。

实施例3：农杆菌及烟草和棉花的遗传转化

1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。

参考Bio-RAD MicroPulser用户说明书，将上述植物表达载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。

2.特异表达载体整合到陆地棉基因组

采用农杆菌介导的方法对棉花进行遗传转化(Luo et al.，2007)，将获得的转基因棉花植株通过GUS染色的方法进行筛选，将GUS染色呈阳性的幼苗置于清水中，22℃培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。

3.超量正向表达载体整合到烟草基因组

烟草的遗传转化采用叶盘法：以10μL枪头挑取用于转化的农杆菌菌落至装有约30mL已添加125μg/mL链霉素和50μg/mL卡那霉素的YEB液体培养基的三角瓶中培养至OD600nm达到1.0。取10mL菌液25℃、8000rpm离心5min，以12mL共培养液重悬菌体并转移至无菌的三角瓶中，25℃，100rpm培养1h。选取健壮无菌苗叶片，超净工作台上切成0.5cm×0.5cm的叶盘，浸泡于农杆菌菌液中，25℃，100rpm浸染45min～60min。将叶盘转移至固体共培养基中培养2d，之后相继转移至筛选培养基、出芽培养基、生根培养基中。当抗性苗生长至5～10cm时，移栽至温室生长。

实施例4：烟草和陆地棉各个组织RNA的提取及定量PCR分析

利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(Aidlab)提取烟草和棉花各个组织的RNA。参照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(MBI)说明书进行cDNA一链的逆转录，用作定量RT-PCR分析模板。采用iQ SYBR Green Supermix(BIO-RAD)试剂分析目的基因的相对表达量。内标基因选择陆地棉的GhHIS1基因(AF024716)，引物为Histone3-1(5’-GAAGCC TCA TCG ATA CCG TC-3’)和Histone3-2(5’-CTA CCA CTA CCA TCA TGG C-3’)。其余基因的定量PCR引物见序列表1。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。计算各材料中目的基因和内标的比值，既得目的基因在不同器官组织中的相对表达量，见图3和图5。

构建CaMV35S启动子调控BbCNA和BbCNB基因的表达载体pLGN-35S:BbCNA和pLGN-35S:BbCNB。利用农杆菌介导的遗传转化将35S:BbCNA和35S:BbCNB超量表达载体导入烟草中。通过抗生素筛选和GUS组织染色鉴定的方法筛选出转基因烟草植株。

将筛选获得的转基因烟草栽种于温室营养钵中，取倒数第三叶片提取RNA分析BbCNA和BbCNB基因的表达情况。qRT-PCR结果显示，BbCNA和BbCNB基因在烟草中均能够正常表达。BbCNA和BbCNB转基因株系中，分别以12号和6号转化子叶片中基因表达水平为最高，分别见图3A和图3B。

通过农杆菌介的导遗传转化方法将35S:BbCNA和35S:BbCNB转入冀棉14中，将GUS染色阳性的转基因棉花植株栽种于温室中，提取转基因棉花幼苗植株倒数第三叶的RNA用于测定相应基因的表达水平。qRT-PCR结果显示，BbCNA-45-1植株的BbCNA表达水平较高，BbCNB-39-4和BbCNB-37-8中BbCNB的表达水平较高，如图5所示。

实施例5：BbCNA和BbCNB转基因烟草耐盐性分析

如图4A所示，与野生型烟草相比，转基因烟草BbCNA和BbCNB植株的表型没有发生明显变化。转基因烟草可以正常开花结实，其植株形态与野生型没有明显差异。

如图4B所示，在不含NaCl的MS培养基上萌发培养转基因烟草，统计15d后主根长，野生型烟草的主根长为5.39±1.25cm，CNA-11和CNA-12的主根长分别为5.79±0.96cm和5.90±1.27cm，CNB-6的主根长为5.72±0.46cm，与野生型相比没有明显变化，表明转基因烟草可以正常萌发生长。在含100mM NaCl的MS培养基上生长15d后，野生型烟草的主根长为2.26±1.43cm，CNA-11、CNA-12、CNB-6转化子的主根长为2.10±0.43cm，较野生型烟草的主根均明显变长。在含200mM NaCl的MS培养基上，转基因植株的存活率均高于野生型植株，如图4B所示，野生型烟草已经萎蔫变黄，转基因烟草幼苗均还存活，仅主根的伸长受到抑制。结果表明，在烟草中超量表达球孢白僵菌来源的钙调磷酸酶A、B亚基编码基因BbCNA和BbCNB可以提高烟草的耐盐性。

实施例6：BbCNA和BbCNB转基因棉花农艺形状的测定

棉花耐盐性分析：

选取足够数量的饱满棉花种子用1‰的H₂O₂的水溶液浸泡12h，均匀铺在放有多层湿润滤纸的培养皿中，再覆盖多层湿润滤纸，将培养皿置于30℃恒温暗培养箱中，待种子萌发，下胚轴伸长至2～3cm时，移至装有水的塑料杯中水培(28±2℃，相对湿度85％，光照时间13h/d)，定时补充水分。棉花幼苗生长至2叶期，选取生长状态相近的幼苗，转移至装有0mM和200mM NaCl的水溶液的塑料培养杯中，28±2℃，相对湿度85％，光照时间13h/d。以0mM NaCl的水溶液处理为对照，以200mM NaCl水溶液为盐胁迫处理，试验期间隔天更换等量的溶液，分别于10d后选取相应的材料用于拍照和分析。

棉花种子用水浸泡至破壳，水培萌发至子叶完全舒展开，更换到含有200mM NaCl水溶液中培养10d，以非转基因棉花作为阴性对照。如图6A所示，非转基因型棉花幼苗的子叶和真叶都已萎蔫，转基因棉花的子叶和真叶没有出现萎蔫或较少萎蔫。表明超量表达BbCNA和BbCNB基因可以提高棉花幼苗的耐盐能力。利用不透水的花盆设置了对照(0g/kg)、中度(4g/kg)、强度(6g/kg)三个梯度来模拟盐碱地种植移栽后的棉花幼苗，观察植株田间长势发现在对照情况下WT和转基因无差异，但在盐胁迫下，转基因材料的株高，叶片大小，叶片数量均大于WT，见图6B。

qRT-PCR结果显示，在正常生长的转基因棉花中，与胁迫应答相关基因的表达水平较野生型都有所提高，见图6C。在没有受到外界环境诱导的情况下，在棉花中超量表达BbCNA和BbCNB时，这些与逆境胁迫应答相关基因的表达水平上调，表明转基因植株在基因表达水平上具备了可以适应外界环境胁迫的条件。

选取温室正常生长且生长状态相近的棉花叶片，提取新鲜叶片中渗透调节物脯氨酸，如图6D所示，在没有外界环境胁迫的情况下，各转基因株系中脯氨酸含量较对照组棉花均有所提高，其中CNA-45和CNB-43叶片中脯氨酸含量为13.68±0.01μg/g和13.49±0.01μg/g，较对照的8.17±0.01μg/g分别提高了67.4％和68.2％。结果表明，棉花中超量表达球孢白僵菌来源的钙调磷酸酶A、B亚基编码基因BbCNA和BbCNB，渗透调节物脯氨酸的含量升高，从而其耐盐性得到提高。

检测了转基因棉花成熟植株叶片中与胁迫应答相关基因表达水平的变化，以明确在棉花中超量表达BbCNA和BbCNB对棉花胁迫响应途径的影响。在所检测的基因中，DREB2A可以响应ABA和渗透胁迫(Liu et al.,1998)；RD29A和KIN1可以受到寒冷、干旱、盐胁迫及ABA的诱导(Kurkela and Borg-FrancK，1992；Tahtiharju et al.,1997)；MYB108是钙离子/钙调素依赖的MYB转录因子，可以响应干旱、盐胁迫等逆境胁迫(Yoo et al.,2005)；SOS3是植物中盐离子响应元件(Chinnusamy et al.,2004；Mahajan et al.,2008)。

植物在受到逆境胁迫后，会激活相关基因的表达，使植物体内胁迫相关的物质发生变化以应对外界的变化。脯氨酸是植物蛋白质的重要组分之一，并且可以以游离状态广泛存在于植物体中。由于脯氨酸亲水性极强，在组织细胞内的代谢过程中，有降低凝固点和防止细胞脱水的作用。因此在逆境条件下，比如干旱、盐碱、热、冷、冻，植物体内的脯氨酸含量会显著增加，植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，因此测定脯氨酸含量是评价植物抗旱性的一个生理指标。

棉花子指、衣分、衣指的测定：

将已经收获的籽棉用机器脱绒，统计转基因棉花和非转基因棉花的子指、衣分、衣指。选100粒籽棉，轧花后，分别称量100粒棉花纤维重量(也称衣指)和100粒种子重量(也称子指)，测量棉花的衣分即棉纤维的重量/棉纤维+棉籽的总重。每个转基因植株选取300粒籽棉，3次重复，统计数据见表2。

表2 BbCNA和BbCNB转基因棉花与野生型棉花的子指、衣分和衣指对比

基因序号	子指(g)	衣分(％)	衣指(g)
				WT	10.91±0.02	35.42±0.14	5.98±0.01
CNA-29	10.25±0.25	36.43±0.25	5.87±0.15
				CNA-50	11.44±0.11	37.46±0.12	6.85±0.07
CNB-15	11.08±0.33	35.70±0.33	6.15±0.18
				CNB-37	10.85±0.19	36.61±0.19	6.26±0.11
CNB-39	10.61±0.20	37.41±0.13	6.34±0.12

如表2所示，对照组子指为10.91±0.02g，转基因在10.25±0.25(CNA-29)到11.44±0.11(CNA-50)之间，与对照相比变化不大。结果表明，在棉花中超量表达球孢白僵菌来源的钙调磷酸酶A、B亚基编码基因BbCNA和BbCNB对棉花种子大小和重量没有明显的影响。棉花衣分是纤维占籽棉重量的百分比，即衣分(％)＝纤维重量/(纤维重量+种子重量)×100。统计结果显示，非转基因对照的衣分为35.42±0.14％，转基因棉花在35.70±0.33(CNB-15)到37.46±0.12(CNA-50)之间，与对照相比略有上调，但变化不明显。衣指是每百粒棉籽产生纤维的重量，结果显示，对照组的衣指为5.98±0.01g，转基因棉花的衣指在5.87±0.15(CNA-29)到6.85±0.07(CNA-50)之间，与对照相比没有明显差异。结果表明，在棉花中超量表达球孢白僵菌来源的钙调磷酸酶A、B亚基编码基因BbCNA和BbCNB对棉花种子产生纤维的能力没有明显的影响。

棉花纤维品质检测：

如表3所示，纤维品质检测结果显示，转基因棉花的纤维长度在27.53±0.19mm到28.40±0.30之间，与对照组的29.53±0.42mm略有降低。马克隆值作为衡量棉花纤维成熟度和细度的综合指标，在一定范围内，马克隆值越低表示纤维越细。检测结果显示，转基因棉花的马克隆值与对照相比没有明显变化。但是转基因棉花的纤维强度较对照组略有下降。从纤维整齐度和伸长率来看，转基因棉花与对照之间没有明显差异。总体结果表明，除了纤维长度和比强度略有下降外，在棉花中超量表达球孢白僵菌来源的钙调磷酸酶A、B亚基编码基因BbCNA和BbCNB对棉花纤维品质的其它指标没有显著影响。

表3 BbCNA和BbCNB转基因棉花与野生型棉花的纤维品质对比

上述实施例表明，本发明改良棉花和烟草种子性状的方法，能够在棉花的特定部位的特定发育阶段特异性地表达BbCNA和BbCNB基因，进而实现内源调控种子发育，在棉花和烟草中超量表达BbCNA和BbCNB基因对植株的生长发育没有明显影响，可以提高棉花和烟草植株对盐胁迫的耐受能力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 西南大学

<120> 球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因在棉花和烟草育种中

的应用

<130> 2018

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 525

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcaaca ccaccagcgc cgtcctggac aacattgtcc aagggtccaa cttcgacaga 60

gaggaagtcg atcgcctacg gaagcgcttt atgaagctgg acaaggacaa ctcgggcaca 120

atcgaacgcg atgaattcct cagcctgccg caaatctcat caaaccctct cgcgacacgc 180

atgattgcta ttttcgacga agacggtggc ggcgacgtcg atttccagga attcgtgtcc 240

ggcctgagtg cgttcagcag caagggcaac aaggagcaaa agctgcgctt cgccttcaag 300

gtctacgaca ttgaccgcga cggctacatc agcaacggcg agctcttcat cgtgctcaag 360

atgatggtcg gtaacaacct caaggatcag cagctgcagc agattgtcga caagaccatc 420

atggaggccg acctggacgg cgacggcaag ataagctttg aggagtttac caagatggta 480

gaaaataccg acgtgagcat gagcatgact ttagaccaat tttga 525

<210> 2

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Asn Thr Thr Ser Ala Val Leu Asp Asn Ile Val Gln Gly Ser

1 5 10 15

Asn Phe Asp Arg Glu Glu Val Asp Arg Leu Arg Lys Arg Phe Met Lys

20 25 30

Leu Asp Lys Asp Asn Ser Gly Thr Ile Glu Arg Asp Glu Phe Leu Ser

35 40 45

Leu Pro Gln Ile Ser Ser Asn Pro Leu Ala Thr Arg Met Ile Ala Ile

50 55 60

Phe Asp Glu Asp Gly Gly Gly Asp Val Asp Phe Gln Glu Phe Val Ser

65 70 75 80

Gly Leu Ser Ala Phe Ser Ser Lys Gly Asn Lys Glu Gln Lys Leu Arg

85 90 95

Phe Ala Phe Lys Val Tyr Asp Ile Asp Arg Asp Gly Tyr Ile Ser Asn

100 105 110

Gly Glu Leu Phe Ile Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Leu Lys

115 120 125

Asp Gln Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Met Glu Ala Asp

130 135 140

Leu Asp Gly Asp Gly Lys Ile Ser Phe Glu Glu Phe Thr Lys Met Val

145 150 155 160

Glu Asn Thr Asp Val Ser Met Ser Met Thr Leu Asp Gln Phe

165 170

<210> 3

<211> 1578

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaagatg gcacccaagt taacaccatg gagcgtgttt gcaaagacgt gcaagcacca 60

gccacctcca agcctacaga tgaacaattc ttctcggaca gcacccgtac caagcccgac 120

attcactttc tcaagcagca cttttaccgc gagggtcgtt tgaccgacga gcaggctctc 180

ttcattctca agaccggcgc cgacgtcttg cgcgcagagc ccaatctgct cgagatggat 240

gcccccatca ccgtctgcgg tgacgtccat ggccagtact acgatctgat gaagctcttc 300

gaggtcggtg gcgaccctgc cgagacgcgc tacctgttcc tcggcgatta cgtcgaccgt 360

ggctactttt ccattgagtg tgttttgtac ctgtggtcgc tcaagattca ctaccccaaa 420

accctctggc tgctgcgcgg caaccacgag tgccgccact tgaccgacta ctttaccttt 480

aagctagagt gcaagcacaa atactccgaa gccatttacg aggcctgcat cgaggctttt 540

tgctgccttc ctctagctgc tgtcatgaac aagcaatttc tctgtattca cggaggtctt 600

agccctgaac tgcacactct ggatgatttg agaaatattg atcgattcag agagcctcct 660

acgcagggtc tcatgtgcga cattctctgg gctgaccctc ttgaagactt tggacaggaa 720

aagacgagcg actatttttt gcataaccac gtacgaggat gctcatactt ttttccatac 780

cctgcagcat gcgcctttct cgagaagaac aatttgctgt ccgtcatccg cgcacacgaa 840

gcccaggacg ccggctatcg aatgtaccgc aagaccaaga cgactggctt ccctagtgtc 900

atgaccattt tttccgcacc caactacctc gacgtgtata ataacaaggc cgcggtcctt 960

aagtacgaaa acaacgtcat gaatatccgc caattcaact gcacaccgca cccttactgg 1020

ctacccaact ttatggacgt ctttacctgg tcgctaccct ttgtcggaga aaagattaca 1080

gacatgttga ttgccattct cagcacgtgc tctgaagagg aacttagaga ggagacgccc 1140

tcgtcgacct cgccgggcgg cgtgtcgcca cctgtcgtcg cgacgcccga cgaccccaac 1200

tcgattgaat tcaagcgccg agcgatcaaa aacaagattc tcgccattgg tcgtatgtca 1260

cgagtgtttc aggtcctgcg cgaggaggcg gagcgtgtca cagagctcaa aacagtcgct 1320

ggcggccgtt tgcctgcggg tactctgatg ctgggtgccg agggcatcaa aaatgccatc 1380

agctcctttg aggatgccaa gaaggtggat ttgcaaaacg agcacctgcc tcctagccaa 1440

gaggaagtta ccagacacca gtcagaggag agaaacattg cgatgcaaaa ggctgtgcac 1500

gacgccgaca atgacaagaa gctacatcaa ctgtcgagaa ggcttagcac agaccgcaag 1560

cccgcctccc gctcgtag 1578

<210> 4

<211> 525

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Glu Asp Gly Thr Gln Val Asn Thr Met Glu Arg Val Cys Lys Asp

1 5 10 15

Val Gln Ala Pro Ala Thr Ser Lys Pro Thr Asp Glu Gln Phe Phe Ser

20 25 30

Asp Ser Thr Arg Thr Lys Pro Asp Ile His Phe Leu Lys Gln His Phe

35 40 45

Tyr Arg Glu Gly Arg Leu Thr Asp Glu Gln Ala Leu Phe Ile Leu Lys

50 55 60

Thr Gly Ala Asp Val Leu Arg Ala Glu Pro Asn Leu Leu Glu Met Asp

65 70 75 80

Ala Pro Ile Thr Val Cys Gly Asp Val His Gly Gln Tyr Tyr Asp Leu

85 90 95

Met Lys Leu Phe Glu Val Gly Gly Asp Pro Ala Glu Thr Arg Tyr Leu

100 105 110

Phe Leu Gly Asp Tyr Val Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Glu Cys Val

115 120 125

Leu Tyr Leu Trp Ser Leu Lys Ile His Tyr Pro Lys Thr Leu Trp Leu

130 135 140

Leu Arg Gly Asn His Glu Cys Arg His Leu Thr Asp Tyr Phe Thr Phe

145 150 155 160

Lys Leu Glu Cys Lys His Lys Tyr Ser Glu Ala Ile Tyr Glu Ala Cys

165 170 175

Ile Glu Ala Phe Cys Cys Leu Pro Leu Ala Ala Val Met Asn Lys Gln

180 185 190

Phe Leu Cys Ile His Gly Gly Leu Ser Pro Glu Leu His Thr Leu Asp

195 200 205

Asp Leu Arg Asn Ile Asp Arg Phe Arg Glu Pro Pro Thr Gln Gly Leu

210 215 220

Met Cys Asp Ile Leu Trp Ala Asp Pro Leu Glu Asp Phe Gly Gln Glu

225 230 235 240

Lys Thr Ser Asp Tyr Phe Leu His Asn His Val Arg Gly Cys Ser Tyr

245 250 255

Phe Phe Pro Tyr Pro Ala Ala Cys Ala Phe Leu Glu Lys Asn Asn Leu

260 265 270

Leu Ser Val Ile Arg Ala His Glu Ala Gln Asp Ala Gly Tyr Arg Met

275 280 285

Tyr Arg Lys Thr Lys Thr Thr Gly Phe Pro Ser Val Met Thr Ile Phe

290 295 300

Ser Ala Pro Asn Tyr Leu Asp Val Tyr Asn Asn Lys Ala Ala Val Leu

305 310 315 320

Lys Tyr Glu Asn Asn Val Met Asn Ile Arg Gln Phe Asn Cys Thr Pro

325 330 335

His Pro Tyr Trp Leu Pro Asn Phe Met Asp Val Phe Thr Trp Ser Leu

340 345 350

Pro Phe Val Gly Glu Lys Ile Thr Asp Met Leu Ile Ala Ile Leu Ser

355 360 365

Thr Cys Ser Glu Glu Glu Leu Arg Glu Glu Thr Pro Ser Ser Thr Ser

370 375 380

Pro Gly Gly Val Ser Pro Pro Val Val Ala Thr Pro Asp Asp Pro Asn

385 390 395 400

Ser Ile Glu Phe Lys Arg Arg Ala Ile Lys Asn Lys Ile Leu Ala Ile

405 410 415

Gly Arg Met Ser Arg Val Phe Gln Val Leu Arg Glu Glu Ala Glu Arg

420 425 430

Val Thr Glu Leu Lys Thr Val Ala Gly Gly Arg Leu Pro Ala Gly Thr

435 440 445

Leu Met Leu Gly Ala Glu Gly Ile Lys Asn Ala Ile Ser Ser Phe Glu

450 455 460

Asp Ala Lys Lys Val Asp Leu Gln Asn Glu His Leu Pro Pro Ser Gln

465 470 475 480

Glu Glu Val Thr Arg His Gln Ser Glu Glu Arg Asn Ile Ala Met Gln

485 490 495

Lys Ala Val His Asp Ala Asp Asn Asp Lys Lys Leu His Gln Leu Ser

500 505 510

Arg Arg Leu Ser Thr Asp Arg Lys Pro Ala Ser Arg Ser

515 520 525

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actagtatgg gcaacaccac cagcgccgt 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtacctcaa aattggtcta aagtcatgc 29

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actagtatgg aagatggcac ccaagtta 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtaccctac gagcgggagg cgggctt 27

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gggtccaact tcgacagaga 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tagaccttga aggcgaagcg 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

caattcaact gcacaccgca 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gcaggacctg aaacactcgt 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gaagcctcat cgataccgtc 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ctaccactac catcatggc 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggctttatcg agcgtgagga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atctccattg acggagacgc 20

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcagctggtg ctggagctgg a 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cttgttcagg ccggtcttgt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagcaggatt cgctatctgt 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

catcctttcc ctcgagctga 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gactgatgag gtgaagccag a 21

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ccaagtgatt gtggagactc t 21

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acgtttggat ccctcgtctg 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ttcaacccca ccccatgttc 20

Claims (2)

1.球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因在提高棉花植株耐盐性中的应用，其特征在于：球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB基因的cDNA核苷酸序列如SEQID NO.1所示，球孢白僵菌类钙调磷酸酶A亚基BbCNA基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：球孢白僵菌类钙调磷酸酶B亚基BbCNB和A亚基BbCNA基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

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