CN101948852B - 苘麻epsps基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明从苘麻中分离到epsps基因序列。该基因所编码的EPSPS对草甘膦具有良好的抗性，该基因可作为功能基因用于抗草甘膦转基因植物的培育。

Description

苘麻epsps基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种来源于苘麻编码EPSPs(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphate synthase，5-烯醇内酮酞莽草酸-3-磷酸合成酶)的基因，该基因的编码产物能有效抵御工作浓度下除草剂草甘膦(glyphosate)的竞争性抑制，从而使植物获得抗草甘膦的能力。 

背景技术

epsps基因的编码产物是芳香族氨基酸——色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸生物合成过程中的一个关键酶，它催化S3P(shikimate-3-phosphate，3-磷酸莽草酸)或SHKP与PEP(phosphoenolpyruvate，磷酸烯醇式丙酮酸)合成EPSP(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，5-烯醇内酮酞莽草酸-3-磷酸)，从而形成芳香族氨基酸，提供植物生长所需的氨基酸。 

草甘膦是PEP的类似物，它是植物体内EPSPs的特效抑制剂，能与PEP竞争性抑制EPSPs的活性从而阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。草甘膦还能抑制光合作用中的光合磷酸化，且对循环及非循环磷酸化均有抑制作用，从而阻抑植物的新陈代谢。此外草甘膦还抑制莽草酸、胡萝卜素、叶黄素、叶绿素和核酸的生物合成，抑制叶绿体核糖体、叶绿体RNA及色素的形成，并对叶绿体亚微结构有影响。因此，草甘膦高效的杀草能力是多种因素共同作用的综合结果。 

草甘膦作为一种广谱灭生性、内吸传导型优秀除草剂，对绝大多数植物具有灭生性作用，是目前世界上使用面积最大的除草剂，它对于许多一年生和多年生杂草和双子叶植物都有极强的控制能力。草甘膦价格不高、除草性强，但它在杀死杂草的同时对作物产生药害，因此目前国内外高度重视对抗草甘膦作物品种的培育和推广。 

本发明的主要目的是克隆对草甘膦不敏感的苘麻中的epsps基因，使其能够作为优秀的抗草甘膦基因转化到植物中，使转基因植物具有良好的抗草甘膦能力，从而在生产上能够扩大草甘膦的适用范围，在有效抑制杂草生长的同时不会对转基因植物的正常生长发育产生危害。 

苘麻epsps基因是一种优良的抗草甘膦基因，目前在NCBI/nr/BLAST中尚未见苘麻epsps基因的注册信息，并且通过BLAST比对与其它物种epsps基因的相似度也不高。 

发明内容

本发明的目的是提供一种对草甘膦不敏感的来源于苘麻的抗草甘膦基因：苘麻epsps基因。 

本发明提供的苘麻epsps基因，是下列核苷酸序列之一： 

1)序列表中的SEQ ID NO：1所示的第1位至第1575位的核苷酸序列； 

2)与序列表中SEQ ID NO：1所示的第1位至第1575位的核苷酸序列具有超过90％的同源性，并同时具有相同功能的DNA类似物。 

本发明的再一个目的是提供一种对草甘膦不敏感的苘麻epsps基因编码的具有抗草甘膦功能的蛋白质，是具有序列SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或将SEQ ID NO：2的氨基酸残基序列经过一个、几个或一些氨基酸残基的取代、缺失或添加，具有与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相同活性且同源性超过90％的由序列SEQ ID NO：2衍生的蛋白质。 

含有上述核苷酸序列的表达载体、重组宿主菌，及将表达载体或重组宿主菌导入植物细胞和植物所获得的重组植物细胞系和转基因植株，均属于本发明的保护范围。 

可以将本发明提供的抗草甘膦苘麻epsps基因或同源性超过90％并具有相同功能的DNA类似物导入单子叶植物或双子叶植物，如水稻、小麦、棉花、玉米、拟南芥、油菜或大豆等，以期获得对草甘膦具有抗性的转基因植物。本发明的基因对培育抗草甘膦植物品种具有重要意义。 

附图表说明 

图1为Trizol reagent提取苘麻总RNA的琼脂糖凝胶电泳结果。 

图2为苘麻epsps基因3’RACE电泳图。 

图3为苘麻epsps基因5’RACE电泳图。 

图4为苘麻epsps基因5′端序列的克隆。 

图5为苘麻epsps基因全长的克隆。 

图6为pBI121-E的酶切鉴定。 

图7为转基因烟草再生。 

图8为转基因烟草的PCR鉴定。 

图9为转苘麻epsps植株抗草甘膦分析。 

具体实施方式

下文通过实施例对本发明做进一步说明 

实施例1苘麻epsps基因克隆 

1.Trizol reagent提取苘麻总RNA 

(1)取不多于0.1克冷冻的研磨过的苘麻叶片组织，加200uL的水饱和酚充分混匀，再加入0.5mL提取试剂(4℃)，震荡至彻底混匀； 

(2)室温放置5min，注意平放离心管，使表面积最大； 

(3)4℃12000r/min离心2min，上清转入新的无RNase离心管； 

(4)加0.1mL 5M NaCl，温和混匀，在加0.3mL氯仿，上下颠倒混匀； 

(5)4℃12000r/min离心10min，取上层水相转入新的无RNase离心管； 

(6)加与所得体积相当体积得异丙醇，混匀室温放置10min； 

(7)4℃12000r/min离心10min，弃掉上清，注意不要倒出沉淀； 

(8)加DEPC水40uL，10×Reaction Buffer 5uL，RNase-Free DNase 5uL，37℃温育30min； 

(9)酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，氯仿各抽提一次； 

(10)用等体积的异丙醇，室温沉淀10min； 

(11)70c/o的乙醇洗一次； 

(12)30uL DEPC处理的水溶解，琼脂糖凝胶电泳分析结果见图1。 

2.苘麻epsps基因3’端序列的获得 

(1)RT-PCR 

取1μg的青麻的总RNA，利用3′RACE技术克隆青麻epsps基因的末端序列。利用Oligo(dT)结合RNA的poly(A)尾巴进行反转录。 

Oligo(dT)：5’-gctgtcaacgatacgctacgtaacggcatgacagtgtN-3’ 

反转录体系及步骤如下： 

RNA          1μg 

dNTP         2μL 

Oligo(dT)    1μL 

ddH₂O        补足15μL，然后70℃解链5min，迅速放入冰中，冷却2min 

RNAin        1μL 

5×buffer    5μL，42℃预热1min，然后加入 

RTase        1μL 

Total        25μL 

混匀，反转录42min；反转录产物-20℃冻存，备用。 

(2)3′RACE-PCR扩增 

根据基因组序列已知信息，结合其它物种的epsps基因的保守的核苷酸序列，设计并合成3′正向特异引物c-1和正向巢式特异引物c-2，结合3′RACE试剂盒的反向引物3′pri和巢式反向引物N3′pri，以反转录产物为模板，使用3′正向特异引物c-1和3′RACE试剂盒的反向引物3′pri进行首轮PCR扩增，在此 基础上再以首轮的PCR产物为模板，用正向巢式特异引物c-2和巢式反向引物N3′pri进行第二次PCR扩增，获得一条1kb左右大小的条带。电泳结果见图2。 

引物序列如下： 

c-1：5’-tctcctggaaatgcttacgtcgaag-3’ 

c-2：5’-agctagttacttcctggctggtgct-3’ 

3′pri：5’-gctgtcaacgatacgctacgtaacg-3’ 

N3′pri：5’-cgctacgtaacggcatgacagtg-3’ 

(3)epsps基因3′端序列的克隆 

将3′RACE结果电泳分析，将所得到的条带回收，连接转化，酶切鉴定，筛选阳性克隆，测序分析。 

3.苘麻epsps基因5’端序列的获得 

(1)RT-PCR 

根据基因组序列已知信息，结合其它物种的epsps基因的保守的核苷酸序列，设计并合成反转录引物5-R-1和第一次步移特异性反向引物c-3-1、第一次特异性反向巢式引物c-3-2，根据第一次步移所获得的序列信息设计合成第二次步移的反转录引物5-R-2第二次步移特异性反向引物c-3-3、第二次步移特异性反向引物c-3-4，取2μg的青麻的总RNA，利用5′RACE技术克隆棉花epsps基因的末端序列。利用反转录引物进行反转录。反转录引物一般12-15个碱基，用DEPC水配制。 

引物序列如下： 

5-R-1：5’-ccaagagccaaag-3’ 

c-3-1：5’-gccaaaggagctgccatgagt-3’ 

c-3-2：5’-gctgccatgagtaaagcggtc-3’ 

5-R-2：5’-atgaacatcgtcgc-3’ 

c-3-3：5’-cctcggatagagcagctagaagcag-3’ 

c-3-4：5’-gttggagagtgatttagagccgggt-3’ 

(2)RNAase处理 

反转录成cDNA向反转录体系中加入RNase 1uL，37℃，15min，充分消除RNA和DNA-RNA杂交链。然后70℃，15min，使RNAas失活。 

(3)cDNA的回收 

1)将binding solution(NaI)温度平衡至室温，遇热约100uL的灭菌的超纯水，备用； 

2)向第一链cDNA体系中加入120uL的binding solution，混匀； 

3)将cDNA NaI溶液转移至S.N.A.P柱子上，放入离心管中，13000g离心20sec； 

4)去掉离心管，将离心管中的binding solution保留，直到确保cDNA回收； 

5)将cDNA吸附柱放入一个新的离心管，加入预冷的400uL的1×wash buffer，然后13000g离心20sec，弃掉washiing buffer，重复洗涤步骤三次； 

6)然后用400uL的70％乙醇洗涤cDNA吸附柱，离心13000g，20sec，重复一次； 

7)弃掉洗涤液和离心管，将吸附柱放入一个新的离心管，加入50uL预热的超纯水，离心13000g，20sec洗脱cDNA，-20℃保存备用。 

(4)加尾(Tailing) 

对cDNA的末端加尾，使之能与通用引物UAP结合，与特异性引物扩增出5′末端序列。 

具体方法如下： 

DEPC水        13μL 

cDNA          5μL 

5×tailing buffer    5μL 

TdT                  1μL，2min，然后加入 

dCTP                 1μL 

Total                25μL 

37℃温育2h。 

(5)PCR扩增 

用第一次步移特异性反向引物c-3-1、第一次特异性反向巢式引物c-3-2，结合5’RACE试剂盒的正向引物AAP和正向巢式引物AUAP，以反转录产物为模板，进行第一次步移，获得一条550bp的条带(见图3a)，将所得到的条带回收、连接、转化、鉴定和测序比对，发现是epsps基因的片段，但未发现起始密码子，因此用第二次步移的反转录引物5-R-2第二次步移特异性反向引物c-3-3、第二次步移特异性反向引物c-3-4，结合5’RACE试剂盒的正向引物AAP和正向巢式引物AUAP，以反转录产物为模板，进行第二次步移，获得一条400bp的条带(见图3b、3c)，将所得到的条带回收、连接、转化、鉴定和测序比对，发现是epsps基因的片段且在该序列第65个碱基处发现有起始密码子，证明苘麻epsps基因5′端得编码序列已经完整。 

引物序列如下： 

AAP：5’-ggccacgcgtcgactagtacgggggggggg-3’ 

AUAP：5’-ggccacgcgtcgactagtac-3’ 

(6)epsps基因5′端序列的克隆 

根据5′端两次步移序列信息设计合成的上游引物F-3和下游引物C-3-1以5′端第一次步移反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增，获得了一条900bp大小的条带(见图4)。将此条带回收、连接、转化、保存。 

引物序列如下： 

F-3：5’-gaggatccaaattttagagaactaaaggttc-3’ 

4.苘麻epsps基因中间部分cDNA片段及全基因的获得 

根据基因组序列已知信息，结合其它物种的epsps基因的保守的核苷酸序列，设计并合成扩增中间部分cDNA片段的正向引物F-1和反向引物5-1，通过PCR扩增获得中间部分cDNA片段。再根据epsps基因5`端序列和3`端序列信息，利用三个基因片段的重叠区域，在两端设计正向引物F-3和末端反向引物Nprimer，PCR扩增出全长基因(见图5)。克隆至pGEM-T载体上，获得pGEM-TE载体，测序分析。 

引物序列如下： 

F-1：5’-caatggtaagttgggaacaatcaag-3’ 

5-1：5’-cctcagcgaattttacatcaccctg-3’ 

实施例2苘麻epsps基因植物表达载体的构建 

1.提取pGEM-TE载体和pBI121的质粒，用BamHI和EcoRI双酶切质粒。 

酶切体系 

pGEM-TE载体  5μL    pBI121载体   30μL 

BamHI        3μL    BamHI        3μL 

EcoRI        3μL    EcoRI        3μL 

BufferR      5μL    BufferR      5μL 

ddH2O        34μL   ddH2O        6μL 

Total        50μL   Total        50μL 

酶切条件：37℃，酶切5h。 

2.分别回收pGEM-TE载体的epsps酶切片段和pBI121载体序列，进行连接反应。 

连接体系 

pBI121载体   1μL 

epsps        3μL 

T4-ligase    1μL 

Buffer       1μL 

ddH2O        4μL 

Total        10μL 

连接条件：16℃，连接12-24h。 

3.转化连接产物，挑取克隆，酶切鉴定 

酶切体系 

pBI121载体   30μL 

BamHI        3μL 

EcoRI        3μL 

BufferR      5μL 

ddH2O        6μL 

Total        50μL 

酶切条件：37℃，酶切5h。 

将酶切鉴定及测序均正确的表达载体命名为pBI121-E(见图6)，保存备用。 

实施例3苘麻epsps基因转化烟草 

1.根癌农杆菌LBA4404感受态的制备 

(1)将-80℃冰箱中冻存的农杆菌划线接种于固体YEB培养基(含50mg/L的Rif)，28℃条件下两天可长出菌斑；从培养基上挑取农杆菌单个菌接种于5mL的YEB液体培养基(含50mg/L的Rif)，于28℃、200r/min的摇床上培养，两天左右菌液浑浊； 

(2)将菌液按1∶100接入50mL液体YEB培养基(50mg/L的Rif)的大三角瓶中，在28℃、200r/min的摇床上继续培养48h左右到OD600＝0.5； 

(3)将菌液转入两支50mL灭菌离心管，冰浴30min，4℃，5000r/min离心5min，弃去上清液； 

(4)每支离心管加10mL冰冷的0.1mol/L NaCl悬浮沉淀。4℃下5000r/min离心5min； 

(5)弃去上清液，再加入10mL冰冷的0.1mol/L NaCl悬浮沉淀，4℃下5000r/min离心5min； 

(6)弃去上清液，每支离心管用0.5mL冰冷的CaCl220mmol/L，含15％甘油)悬浮，每支1.5mL离心管分装100μL，液氮中速冻10min后迅速置于-80℃保存； 

2.pBI121-E转化根癌农杆菌LBA4404 

(1)在200μL LBA4404感受态细胞中加入2μg重组质粒DNA，冰浴5min，然后转至液氮中冷冻8min； 

(2)迅速于37℃水浴中温5min后，加入800μL YEB液体培养基； 

(3)28℃、250rpm预表达培育4～5h小时，然后涂铺含有卡那霉素、链霉素的YEB平板，28℃培育24～48h后可出现菌落； 

(4)挑取菌落做菌落PCR鉴定，确定正确后保存于-70℃备用。 

3.烟草无菌苗的准备 

(1)取NC89烟草的成熟种子，经70％乙醇消毒1分钟、10％次氯酸钠消毒15-20分钟后，无菌水冲洗3-4次； 

(2)在超净工作台上将灭菌后的烟草种子接至MS培养基上，25℃光照培养箱培养(16小时光照，8小时黑暗)至5-8cm高幼苗； 

4.农杆菌的准备 

(1)挑取含目的质粒的农杆菌单菌落于2ml含50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素的YEB培养基中，28℃、200rpm培养过夜； 

(2)吸取2ml培养物转入50mg/L卡那霉素、50mg/L链霉素的YEB培养基中，28℃、200rpm继续培养至OD600值约为0.6左右； 

(3)将菌液转至无菌离心管中，5000rpm离心5分钟； 

(4)菌体沉淀用MS液体培养基洗涤一次后，再用MSO液体培养基重悬，使OD600值约为0.2-0.5左右，准备用于烟草叶片。 

5.农杆菌介导转化烟草 

(1)取烟草无菌苗的嫩叶片，用刀切成约0.5cm的小方块，在农杆菌悬液中浸泡5～10min，然后用无菌滤纸吸干； 

(2)共培养：将叶块摆放在共培养培养基中(上面铺2层滤纸)于25℃避光共培养3d； 

(3)选择培养：将叶片转移到选择培养基中，于25℃光照培养箱(光照12h，黑暗12h)中培养至抗性芽的出现； 

(4)抗性小芽的获得：将2～3cm长的抗性芽移到生根培养基中，7d左右逐渐长出根来。约一个月后待小苗长到5～6cm高时，移栽到含有营养土的小塑料钵中。 

转基因烟草再生见图7。 

6.转基因烟草的PCR检测 

检测引物采用F-3和末端反向引物Nprimer，以基因组为模板进行PCR扩增，采用50μL体系，含模板DNA1μL，10μmol引物各1μL，2.5mmoldNTP 4μL，buffer 5μL，Taq酶1μL，加去离子水补足50μL；反应进行条件是94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min，35个循环；72℃，10min，扩增结果见图8。 

实施例4苘麻epsps基因抗草甘膦鉴定 

分别对转基因植株和对照野生型植株喷施1％浓度的草甘膦，处理一周后发现对照野生型植株生长停滞并萎蔫，叶柄出现萎缩和发黄症状，茎部也出现微黄现象，而转基因植株生长势头良好，绿色组织的表型正常(图9a)，随着处理时间的延长，对照野生型植株的叶柄完全脱水、干黄，茎部发黄并萎缩，而转基因植株叶柄和茎部依然翠绿(图9b)。说明苘麻epsps具有抗草甘膦的能力。 

本说明书中所涉及的棉花GhPsbP启动子的保藏信息如下： 

1.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 

2.保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所 

3.保藏日期：2010年8月16日 

4.保藏编号：CGMCC No.4078 

5.分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli) 

Claims (4)

1.一种来源于苘麻的抗草甘膦基因epsps，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述基因的编码产物，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.抗草甘膦基因的植物表达载体，其特征在于带有权利要求1所述的抗草甘膦基因的SEQ ID NO：1核苷酸序列。

4.含有权利要求1所述抗草甘膦基因的宿主菌。

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