CN101775381B

CN101775381B - 植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN101775381B
Application number: CN 201010033992
Authority: CN
Inventors: 李瑞芬; 魏建华; 王宏芝
Original assignee: BEIJING AGRICULTURAL BIOLOGICAL TECHNOLOGY Research CENTRE
Current assignee: BEIJING AGRICULTURAL BIOLOGICAL TECHNOLOGY Research CENTRE
Priority date: 2010-01-12
Filing date: 2010-01-12
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2030-01-12
Also published as: CN101775381A

Abstract

本发明公开了一种植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入拟南芥突变体sos2-1或拟南芥野生型中可提高转基因植株抗盐性和抗旱性。

Description

植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用。

背景技术

土壤盐渍化、干旱等逆境是植物生长、发育的主要环境限制因素。植物无法逃避逆境，只能应对。因此，植物演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生理水平上响应的精细调控机制。许多研究表明，各种逆境胁迫作用于植物细胞，首先引发细胞内Ca²⁺浓度的改变。Ca²⁺浓度在时空上的变化，代表了某种特定胁迫信息，称为钙信号。钙离子感受器可以随时监测钙信号，并通过与其作用的蛋白传导信号，然后调控下游早期响应基因的表达，进而产生从细胞到整个植株的生理适应性变化(Luan S，Kudla J，Rodriguez-Concepcion M，Yalovsky S，and Gruissem W，2002.Calmodulins and CalcineurinB-like Proteins：Calcium Sensors for Specific Signal Response Coupling in Plants.Plant Cell.14：389～400)。在植物应答逆境胁迫过程中，Ca²⁺-Ca²⁺感受器-作用蛋白-靶基因是关键的调控途径，控制着胁迫响应基因的开与关。

CIPK(CBL-interacting protein kinase)是近几年才发现的一类编码丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)激酶基因，目前发现它仅存在于植物中。CIPK与存在于高等植物体内的钙调磷酸酶B的蛋白(Calcineurin B-Like protein，简称CBL，又称Ca²⁺感受器)相互作用构成复杂多样的网络系统，即Ca²⁺-CBL-CIPK-靶基因调控途径，在植物对逆境应答的信号转导过程中起重要作用(Li Ruifen，Zhang Junwen，Wei Jianhua，MaRongcai.Functionsand Mechanisms of the CBL-CIPK signaling system in plant response to abiotic stresses.Progress in Natural Science，2009，19(6)：667-676)。迄今为止，已在模式植物拟南芥中发现25个AtCIPKs、水稻中发现30个OsCIPKs，其中一些CIPK基因的功能得到鉴定，大部分CIPK基因的功能还不清楚。例如，AtCIPK24参与拟南芥SOS耐盐调控途径(Zhu JK，Liu J，Xiong L，1998.Genetic analysis of salt tolerance in Arabidopsis.Evidence for a criticalrole of potassium nutrition.Plant Cell，10：1181～1191)，AtCIPK23参与拟南芥K⁺平衡调控(XuJ，Li H-D，Chen L-Q，Wang Y，Liu L-L，He L，and Wu W-H，2006.A protein kinase，interactingwith two calcineurin B-like proteins，regulates K⁺transporter AKT1 in Arabidopsis.Cell，125：1347～1360；Li L，Kim B-G，Cheong Y H，Pandey G K，and Luan S，2006.A Ca²⁺ signalingpathway regulates a K channel for low-K⁺ response in Arabidopsis.Proc Natl Acad Sci USA，103(33)：12625～12630)，AtCIPK11参与拟南芥应答高pH胁迫(Fuglsang A T，Guo Y，CuinT A，Qiu Q，Song C，Kristiansen K A，Bych K，Schulz A，Shabala S，Schumaker K S，PalmgrenM G，and Zhu J-K，2007.Arabidopsis protein kinase PKS5 inhibits the plasma membraneH⁺-ATPase by preventing interaction with 14-3-3 protein.Plan Cell，19：1617～1634)，这些调控途径的阐明为解析植物抗逆机制、克隆抗逆调控基因和改良作物抗逆性提供了重要的理论依据。CIPK基因在其他非模式植物中研究的较少，仅涉及到豌豆(Pisum sativum)(Mahajan S，Sopory S K，Tuteja N，2006.Cloning and characterization of CBL-CIPKsignalling components from a legume(Pisum sativum).FEBS Journal，273(5)：907～925)、水稻(Xiang Y，Huang Y and Xiong L，2007.Characterization of stress-responsive CIPK genes inrice for stress tolerance improvement.Plant Physiol，144：1416～4280)、棉花(Gao P，Zhao PM，Wang J，Wang HY，Du XM，Wang GL，Xia GX，2008.Co-expression and preferentialinteraction between two calcineurin B-like proteins and a CBL-interacting protein kinase fromcotton.Plant Physiol Biochem，46(10)：935-940)和玉米(Zhao J F，Sun Z F，Zheng J，Guo X Y，Dong Z G，Huai J L，Gou M Y，He J G，Jin Y S，Wang J H，Wang G Y，2008.Cloning andcharacterization of a novel CBL-interacting protein kinase from maize.Plant Mol Biol，DOI10.1007/s11103-008-9445-y)等物种。由于不同物种同源CIPK基因可能具有不同功能或新功能，克隆应答各种逆境胁迫的CIPK基因，有可能解析某种抗逆调控途径。但目前研究的材料大部分局限于模式植物或甜土植物，非特殊种质。一些特殊生境种质材料可能具有解密逆境Ca²⁺信号的特殊途径，挖掘克隆特殊生境植物信号组分基因，对有效利用基因资源改良作物抗逆性具有重要意义。

短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubularum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，可在含盐量0.6-1.0％的土地上良好生长，它的耐盐性可与小花碱茅等媲美，具有重要的应用和科学研究价值。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，目前尚未挖掘出起关键作用的抗逆调控基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物抗逆性相关的蛋白。

本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为HbCIPK2，来源于短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。

为了使1)中的HbCIPK2便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的HbCIPK2可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的HbCIPK2的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端第68-1426位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因也属于本发明的保护范围。

与植物抗逆性相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列1的自5′末端第68-1426位脱氧核糖核苷酸；

2)核苷酸序列是序列表中的序列1的基因；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列1由1689个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第68-1426位碱基，编码具有序列表中序列2的氨基酸序列的HbCIPK2蛋白。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

扩增上述HbCIPK2基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与植物抗逆性相关蛋白编码基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有HbCIPK2基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用HbCIPK2基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体具体可为在pGreen0029的多克隆位点间插入上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育抗逆性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗逆性提高的转基因植物的方法，是将上述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因HbCIPK2导入目的植物中，得到抗逆性强于所述目的植物的抗逆转基因植物。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因HbCIPK2是通过所述重组表达载体导入植物中的。

上述抗逆转基因植物具体可为抗旱和/或抗盐转基因植物。

携带有本发明的与植物抗逆性相关蛋白编码基因HbCIPK2的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主可以是双子叶植物或单子叶植物，如既可以是水稻、小麦、大豆、烟草、玉米、油菜、高粱、棉花等农作物，也可以是苜蓿、三叶草、冰草等牧草以及草莓、西红柿等果蔬花卉植物，或杨树等林木植物及其他所有可以转化的植物材料。

实验证明：HbCIPK2基因在根和叶中的表达均受高盐、PEG和ABA诱导，而与低温、外源Ca²⁺胁迫无关，表达分析表明该基因与逆境胁迫有关。

HbCIPK2基因在短芒大麦草(野大麦)基因组中没有内含子，属于不含内含子亚族基因，且为单拷贝基因。

亚细胞定位表明HbCIPK2主要在细胞膜表达，这与其在196-213Aa处有一个明显的跨膜结构域一致，可能与其传导逆境信号的功能有关。

在拟南芥突变体sos2-1中过量表达HbCIPK2可互补突变体的敏盐表型，在野生型拟南芥中过量表达HbCIPK2可提高转基因植株耐盐性；另外，HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1或野生型中过量表达后的抗旱性也明显提高。

附图说明

图1为短芒大麦草(野大麦)根盐胁迫早期cDNA-AFLP分析部分结果，B、C和F示上调带(F为DEF1916)，A、D、E和G示下调带。

图2为HbCIPK2与AtCIPKs的系统进化树分析。

图3为HbCIPK2基因推导氨基酸序列保守结构域预测。

图4为HbCIPK2基因推导氨基酸序列与相关序列的比对分析(相关序列GeneBanK的登陆号：SbCIPK25，FJ901206；AtCIPK2，AF286050；OsCIPK2，EU703793；ZmCIPK15，nm_001154581)。

图5为HbCIPK2结构域分析。

图6为HbCIPK2的疏水性和跨膜域分析。

图7为HbCIPK2基因在各种胁迫下的表达分析，图7A是430mM NaCl胁迫下的表达分析，上行为HbCIPK2在430mM NaCl胁迫下的野大麦根和叶组织中的表达情况；下行为内标基因actin的表达情况；图7B为HbCIPK2基因在PEG和ABA等各种逆境胁迫下的表达分析，上四行为HbCIPK2基因在根和叶组织中的表达情况；最后一行为内标基因actin基因的表达情况。

图8为HbCIPK2基因的拷贝数和在基因组中的结构分析，A为以DNA和cDNA为模板扩增HbCIPK2基因，二者大小一致；B为野大麦基因组DNA分别用HindIII、EcoRI、KpnI和PstI酶切，以HbCIPK2特异探针杂交，其中3种单酶切杂交信号均为1个，表明该基因在基因组中为单拷贝。

图9为HbCIPK2的亚细胞定位分析。

图10为HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过表达可互补敏盐表型-发芽试验，A为转基因株系(s6和s11)、突变体sos2-1及对照(WT)在含NaCl不同浓度(0、100、125、150和175mM)培养基上的发芽图片；B为转基因株系、突变体sos2-1及对照(WT)在不同盐浓度下的发芽率(图片和发芽率统计均为发芽后7天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

图11为HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过表达可互补敏盐表型-幼苗生长试验，A为转基因株系(s6和s11)、突变体sos2-1及对照(WT)在MS培养基上发芽5天后、转移到含NaCl不同浓度(0、100、125、150和175mM)培养基上的胁迫生长14天图片；B为转基因株系、突变体sos2-1及对照(WT)在不同盐浓度培养基上胁迫生长14天后的平均单株鲜重(图片和平均单株鲜重统计均为胁迫生长14天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

图12为HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过表达株系在NaCl胁迫下正常抽苔。

图13为HbCIPK2在拟南芥野生型WT过表达可增加植物耐盐性-发芽试验，A为转基因株系W55、W115和W116及对照(WT)在含NaCl不同浓度(0、100、125、150和175mM)培养基上的发芽图片；B为转基因株系及对照(WT)在不同盐浓度下的发芽率(图片和发芽率统计均为发芽后7天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

图14为HbCIPK2在拟南芥野生型WT过表达可增加植物耐盐性-幼苗生长试验，A为转基因株系W55、W115和W116及对照(WT)在MS培养基上发芽5天后、转移到含NaCl不同浓度(0、100、125、150和175mM)培养基上的胁迫生长14天图片；B为转基因株系及对照(WT)在不同盐浓度培养基上胁迫生长14天后的平均单株鲜重(图片和平均单株鲜重统计均为胁迫生长14天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

图15为HbCIPK2在拟南芥野生型WT过表达在NaCl胁迫下生长旺盛。

图16为HbCIPK2在拟南芥野生型WT过表达可增加植物抗旱性-发芽试验，A为转基因株系W55、W115和W116及对照(WT)在含甘露醇(Mannitol)不同浓度(0、300、350、和400mM)培养基上的发芽图片；B为转基因株系及对照(WT)在不同甘露醇浓度下的发芽率(图片和发芽率统计均为发芽后7天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

图17为HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过表达可增加植物抗旱性-幼苗生长试验，A为转基因株系(s6和s11)、突变体sos2-1及对照(WT)在含甘露醇(Mannitol)不同浓度(0、300、350、和400mM)培养基上的发芽图片；B为转基因株系、突变体sos2-1及对照(WT)在不同盐浓度下的发芽率(图片和发芽率统计均为发芽后7天的结果，*和**分别代表在p＜0.05和p＜0.01水平下与WT对照的差异程度，n＝3)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。

本发明所依赖的遗传资源是盐生牧草-短芒大麦草(野大麦)(

brevisubulatum(Trin.)Link)，是由全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心(http://www.genebank.cn/003ZYXX6_yx.asp)于2006年10月提供，因此其原始来源不清楚。

实施例1、植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因的发现及其分析

一、植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因的发现

1、实验步骤

1)短芒大麦草(野大麦)材料培养

盐生牧草-短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)，是由全国畜牧兽医总站畜禽牧草种质资源保存利用中心。在室温条件下短芒大麦草(野大麦)种子用去离子水浸泡12h后，放入到4℃冰箱中过夜。用灭菌的去离子水冲洗3遍，放于湿润纱布的培养皿中，25℃萌芽。经过4～5天待其大部分发芽之后，转到灭菌的盛有1/2Hoagland培养液的玻璃瓶中(用不透光的纸包住)，在温度22-23℃，光照强度1000-3000umol m^-2s^-1，光照12h/天、黑暗12h/天的条件下生长，待长到两叶一心时，在1/2Hoagland培养液中加入NaCl等进行胁迫，在要求的处理时间点取材备用[Hoagland营养液配方：0.51g/L KNO₃、0.82g/L Ca(NO₃)₂、0.49g/L MgSO₄.7H₂O、0.136g/L KH₂PO₄；再加入1mL Fe EDTA溶液(配制方法：分别溶解7.45g Na₂EDTA、5.57g FeSO₄.7H₂O于200mL蒸馏水中，加热。不断搅拌Na₂EDTA溶液与FeSO₄溶液混合，定容至1L)；然后加入1mL A-Z溶液(配制方法：H₃BO₃ 2.80mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.08mg/L，ZnSO₄·7H₂O 0.22mg/L，MgCl₂·6H₂O 81mg/L，HMoO·4H₂O 0.09mg/L)]。

2)cDNA-AFLP分析

在430mmo/L NaCl胁迫下，取短芒大麦草(野大麦)幼苗30min和未处理幼苗的根为材料，用铝薄纸包好标明，立即投入液氮中固定，-80℃保存备用。根据Trizol(Invitrogen，USA)试剂盒说明，提取经盐处理短芒大麦草(野大麦)根及对照材料的总RNA，DNase I消化总RNA中残留的DNA，酚/氯仿/异戊醇混合液(25∶24∶1)抽提总RNA，分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，根据OD₂₆₀值计算RNA的产量；根据OD₂₆₀/OD₂₈₀值判断RNA的质量。根据SMART^TMcDNA文库构建试剂盒(Clontech，USA)操作说明，合成双链cDNA，根据QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen，Germany)操作说明纯化双链cDNA，并用AseI/TaqI(NEB，USA)双酶切双链cDNA，根据Bachem等(1998)方法进行AFLP反应(Bachem C W B，Oomen R J FJ，Visser R G F，1998.Transcript imaging with cDNA-AFLP：a step-by-step protocol.PlantMolecular Biology Report，16：157-173)，反应产物在Dual Dedicated height nucleic acidsequencer(型号DDH-500-33，C.B.S.，USA)承载的6％测序胶分离，银染后分析盐处理材料和对照之间带谱差异。

3)差异表达片段克隆与功能预测

回收盐处理显著差异表达片段，并进行二次扩增，回收扩增产物，克隆到pGEM-Teasy载体(Promega，USA)，单克隆在北京奥科生物技术公司测序。所获得的差异表达片段序列在公共数据库(NCBI，National Center for Biotechnology Information.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)进行了比对，根据与已知功能基因的一致性(E值小于1e^-5)来推测差异表达片段的可能功能。

4)SMART RACE扩增基因全长

根据差异表达片段(DEF，Differential Expressed Fragment)在公共数据库的比对结果，发现DEF1916与多种植物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因同源性较高，设计了扩增3’端序列的引物(1916-F-1：AGGGTGGGCTCACAGATCAG；1916-F-2：CACCATTTCTGAATGCAGAAGGC)，以及扩增5’端序列的引物(1916-R-1：GTGCCGCAGGATGTGTGGAG；1916-R-2：CAGCGTCTTCCTTGAGCCTTCCTCTCTG)，根据BD SMARTTMRACE cDNA Amplification试剂盒(Clontech，Cat.No.634914，USA)操作说明，以步骤2)中盐处理单链cDNA为模板进行巢式PCR扩增(PCR程序：94℃预变性2min；94℃变性30sec，63℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸7min，10℃保存)。PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)，单克隆在北京奥科生物技术公司测序。所获得的DEF1916 3’/5’序列与DEF1916序列拼接，获得该基因的全长序列。

2、结果分析

利用cDNA-AFLP(cDNA-Amplified Fragment Length Polymorphism)技术分析短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)在430mM NaCl处理30min(Treat，简称T)与未处理根组织(Control，简称C)的基因差异表达(图1)。在110条上调带中选取大小为200～600bp、可重复的条带进行回收再扩增、克隆并测序分析。获得16个差异表达片段(DEF，Differential Expressed Fragment)的测序结果，在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)Blast分析表明，有13个分别和已知基因或蛋白质同源性较高；3个DEF没有同源性基因，为未知基因片段。其中DEF1916与拟南芥、水稻等植物中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase)、与钙调磷酸酶B相互作用的蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)、SOS2(Salt-Overly-Sensitive 2)等有很高的同源性，推测其在短芒大麦草(野大麦)对植物逆境应答的信号转导中起重要作用。也就是说，该DEF对逆境胁迫信号的感知、转导和调控抗性基因的表达等不同过程可能发挥作用。

为此，利用SMART RACE技术获得DEF1916的全长序列。HbCIPK2 cDNA全长为1689bp，核苷酸序列如序列表中序列1所示。其中，5’非翻译区67bp，起始密码子为ATG，开放阅读框1359bp，编码序列表中序列2所示的452个氨基酸，分子量约为51KD，蛋白pI为9.51，终止密码子为TGA，3’非翻译区235bp。将序列2所示的蛋白命名为HbCIPK2，将编码该蛋白的基因命名为HbCIPK2。

二、植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因的分析

1、HbCIPK2结构域和进化树分析

1)实验步骤

在NCBI网上在线blast分析并获得HbCIPK2的同源序列，利用ClustalX软件(Thompson et al.，1997)将所有推导的氨基酸序列进行比对；在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml网站上预测该基因保守结构功能域；并在http://au.expasy.org/tools/scanprosite预测HbCIPK2的结构；在NCBI的Genbank查询拟南芥和水稻CIPK家族基因登陆号(25 AtCIPKs access number in Genbank：AtCIPK01，AAG28776；AtCIPK02，AAF86506；AtCIPK03，AAF86507；AtCIPK04，AAG01367；AtCIPK05，AAF86504；AtCIPK06，AAF86505；AtCIPK07，AAK16682；AtCIPK08，AAK16683；AtCIPK09，AAK16684；AtCIPK10，AAK16685；AtCIPK11，AAK16686；AtCIPK12，AAK16687；AtCIPK13，AAK16688；AtCIPK14，AAK16689；AtCIPK15，AAK16692；AtCIPK16；AAK50348；AtCIPK17，AAK64513；AtCIPK18，AAK59695；AtCIPK19，AAK50347；AtCIPK20，AAK61493；AtCIPK21，AAK59696；AtCIPK22，AAL47845；AtCIPK23，AAK61494；AtCIPK24，AAK72257；AtCIPK25，AAL41008。30 OsCIPKs access number in Genbank：OsCIPK01，ACD76973；OsCIPK02，ACD76974；OsCIPK03，ACD76975-449；OsCIPK04，Q2QMI0；OsCIPK05，ACD76976；OsCIPK06，Q6Z9F4；OsCIPK07，BAG99286-447；OsCIPK08，Q5JLD8；OsCIPK09，Q10SC8；OsCIPK10，ACD76977；OsCIPK11，ACD76978；OsCIPK12，ACD76979；OsCIPK13，Q5QNM6；OsCIPK14，BAF34612；OsCIPK15，BAF34613；OsCIPK16，Q6ERS4；OsCIPK17，ACD76980；OsCIPK18，ACD76981；OsCIPK19，Q68Y49；OsCIPK20，Q60EY8；OsCIPK21，Q0D4B2；OsCIPK22，Q5KQF5；OsCIPK23，Q6ZLP5；OsCIPK24，Q69Q47；OsCIPK25，ACU57073；OsCIPK26，ACD76986；OsCIPK27，OsCIPK28，A3B529；OsCIPK29，Q7XIW5；OsCIPK30，Q5JLQ9)，采用ClustalX软件结合邻位相连法(Neighbor-joining)构建系统进化树，并采用Bootstraping法对进化树进行检验(bootstrap值＞1000)；在http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html网站上利用TMPRED程序分析HbCIPK2跨膜域与疏水性等。

2)实验结果

与拟南芥、水稻CIPK家族比对和系统进化树分析表明，该基因与水稻CIPK家族中OsCIPK2的同源最高(84％)，与OsCIPK24同源性仅为45％；在拟南芥CIPK家族中，与AtCIPK2的同源性最高为59％，而与AtCIPK24同源性为46％(图2)。故命名为HbCIPK2新基因。从分子进化树分析，该基因与AtCIPK2、OsCIPK2属于同一亚族，属于不含内含子亚族；而AtCIPK24、OsCIPK24则属于有内含子亚族(图2)。

HbCIPK2推导的氨基酸序列在国际互联网NCBI的保守域数据库(Conserved domaindatabase，CDD)分析表明，HbCIPK属于Ser/Thr蛋白激酶，在N端有一个激酶催化域，并包含一个激活环和一个底物结合域，说明这些功能域在植物蛋白激酶中高度保守；C端含有一个调节域(图3)。

Blast分析表明，HbCIPK2与水稻、玉米、高粱、拟南芥等植物的蛋白激酶，特别是与CIPK家族基因的同源性较高(图4)，在激酶域的152-181Aa处有一个激活环，其中，丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)和酪氨酸(Tyr，Y)是高度保守的氨基酸残基；在调节域的316-336Aa处，有一个24个氨基酸组成的FISL保守域，在激酶域和调节域之间有一个结合域(图5)。

通过HbCIPK2跨膜域与疏水性等特性分析表明，该蛋白是一个可溶性蛋白，但在196-213Aa之间有一个明显的跨膜域(图6)，它结合在细胞膜还是细胞内膜(细胞器膜)上，需要进一步亚细胞定位分析，这可能与其在膜上传导Ca²⁺信号的功能有关。

2、HbCIPK2基因表达分析

1)实验步骤

短芒大麦草(野大麦)幼苗培养至两叶一心时，分别在430mM NaCl、15％PEG600、50uMABA、4℃低温及5mmol/L Ca²⁺胁迫条件下，在处理0、30min、1hr、3hr、6hr、12hr各时间点取根和叶材料，按步骤一的步骤1的步骤2)的方法提取总RNA、消化DNA及反转录cDNA为模板，以actin基因为内标(actin-F：5′AGCAACTGGGATGACATGGAG-3′.actin-R：5′-CTACCTTGATCTTCATGCTG-3′)，以HbCIPK2基因3’端编码序列中的一段为上游引物(HbCIPK2-RT-F：5’-GCTGCTCAGATACAATTTACAAGC-3’)，以3’UTR中的一段为下游引物，(HbCIPK2-RT-R：5’-GCATTGAACGACTTGGCATCTG-3’)，扩增产物约650bp，通过RT-PCR(PCR程序：94℃预变性2min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸5min，10℃保存)分析基因表达情况。

2)结果分析

利用半定量RT-PCR分析了HbCIPK2基因在不同逆境胁迫下的时空表达特点(图7)。

如图7A所示，在430mM NaCl胁迫下短芒大麦草(野大麦)HbCIPK2基因随着胁迫时间的增加，在根和叶片中的表达量不同：在根中胁迫30min-3h的表达量最高，随后降低；在叶中3-6h表达量最高，随后降低。HbCIPK2基因在叶中的表达高峰比根要滞后一些，这与根先感受Na+胁迫，根内HbCIPK2基因先表现出反应，而叶中HbCIPK2基因对盐胁迫响应滞后一致，表明HbCIPK2基因受盐诱导，并具有时空表达特点。

如图7B所示，15％PEG-6000处理模拟干旱胁迫，无论在根或叶组织中未处理条件下HbCIPK2基因不表达或表达量很低，但随着胁迫时间的延长，该基因在根维持较高表达量，而在叶中胁迫3h开始增强，6h表达最高，随后降低，说明该基因对渗透胁迫有响应。在50uM ABA胁迫处理条件下HbCIPK2基因在根部的表达水平与胁迫关系不明显。而在叶组织中表达水平有变化，即在1h开始增加，直到24h仍表现为表达量增加。可见，HbCIPK2基因在50uM ABA胁迫下有响应，且表达模式与盐胁迫不同。在4℃低温和外源Ca²⁺胁迫下HbCIPK2基因在根和叶中的表达基本没有变化，说明该基因对低温胁迫响应不明显。

综上所述，短芒大麦草(野大麦)HbCIPK2基因受盐、干旱和ABA诱导表达，而对低温和外源Ca²⁺胁迫响应不明显。表明该基因有可能参与依赖于ABA的信号途径。

3、HbCIPK2基因的拷贝数和在基因组中的结构分析

1)实验步骤

短芒大麦草(野大麦)幼苗培养至两叶一心时，采用CTAB法提取DNA(Murray MG&Thompson WF，1980.Rapid isolation of high-molecular-weight plant DNA.Nucl.Acids Res.8：4321-4325)。为分析HbCIPK2基因在基因组中结构特征，取100ng DNA为模板，根据HbCIPK2基因编码区序列设计引物(序列同下面的步骤4中的HbCIPK2-BamHI-F和HbCIPK2-KpnI-R)，PCR扩增HbCIPK2基因序列，并以短芒大麦草(野大麦)cDNA为模板作对照。为Southern分析，取100ug DNA，选用HindIII、EcoRI、KpnI、PstI进行酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳，通过毛细管吸附转移至带正电荷的尼龙膜(Hybond-N⁺，Roche GmbH，Germany)上(Sambrook J，Fritsch E&Maninatis T，1989.Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，pp499-502)，参照PCR Dig probe synthesis Kit(Roche，11636090910)操作说明，以步骤2中的HbCIPK2-RT-F和HbCIPK2-RT-R合成650bp HbCIPK2基因探针(包括约500bp 3’编码序列和150bp 3’UTR序列)；参照Dig Dection starter Kit II(Roche，11585614910)操作说明，洗膜和免疫学检测；杂交膜直接在光学成像系统(FUJI LAS-4000，Japan)曝光拍照。

2)实验结果

为明确HbCIPK2基因在短芒大麦草(野大麦)基因组中是否具有内含子及其排列情况等结构特征，首先以短芒大麦草(野大麦)基因组DNA为模板，并以cDNA为对照，扩增该基因编码序列(图8A)，结果二者扩增片段大小一致，经测序分析，确定两片段序列没有差异，表明该基因在短芒大麦草(野大麦)基因组中没有内含子，属于不含内含子亚族，这与该基因进化树分析结果一致。同时，短芒大麦草(野大麦)基因组DNA用分别用HindIII、EcoRI、KpnI和PstI酶切，与HbCIPK2特异探针杂交，其中3种单酶切均有1个杂交信号，表明该基因在基因组中为单拷贝(图8B)。

4、HbCIPK2亚细胞定位分析

1)实验步骤

为构建HbCIPK2-GFP融合基因表达载体，通过PCR扩增HbCIPK2基因编码区序列并引入BamHI/KpnI酶切位点(HbCIPK2-BamHI-F：5’-TGGATCCATGGGGGAGCAGAAG-3’，HbCIPK2-KpnI-R：5’-TGGTACCACATGGTTGCTGCTGCGG-3’)，同样扩增GFP基因带KpnI/SacI酶切位点(GFP-kpnI-F：5’-AGGGTACCAGTAAAGGAGAAGAACTTTC-3’，GFP-SacI-R：5’-AGGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCCATGCC-3’)，测序正确后，在pGEM-T载体上通过KpnI/SacI酶切位点将GFP基因融合在HbCIPK2基因的3’端，然后通过BamHI/SacI酶切位点将HbCIPK2-GFP融合基因构建到pGreen0029(含CaMV35启动子和Nos终止子)的多克隆位点，获得HbCIPK2-GFP融合基因表达载体，并构建GFP基因对照表达载体，将目标载体和对照载体分别克隆到农杆菌菌株Gv3101(含助手载体pSoup)进行本生烟草(N.benthamiana)瞬时表达。当本生烟长到5-6片叶子时，在生长健壮的叶片背面分别注射OD₆₀₀约为0.5的含目标载体和对照载体的农杆菌菌液(Waadt R，Schmidt L K，Lohse M，Hashimoto K，Bock R and Kudla J，2008.Multicolor bimolecular fluorescence complementationreveals simultaneous formation of alternative CBL/CIPK complexes in planta.The Plant Journal，56：505-516)。注射2-3天后，撕取被注射叶片下表皮，在Confocal激光共聚焦显微镜(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)观察GFP的表达部位。

2)结果分析

为确定HbCIPK2的亚细胞分布，构建HbCIPK2：GFP融合蛋白的表达载体，并以含GFP的表达载体为对照，通过农杆菌介导的推压法转化本生烟草(N.benthamiana)分析HbCIPK2的亚细胞定位情况(图9)。GFP在细胞膜、细胞质-细胞核部位都表达，而HbCIPK2主要在细胞膜表达，这与其结构中含有跨膜结构一致，属于跨膜蛋白。

实施例2、抗逆转基因植物的获得及其检测

一、抗逆转基因植物的获得

1、HbCIPK2基因的获得

合成下述两个引物：

HbCIPK2-BamHI-F：5’-TGGATCCATGGGGGAGCAGAAG-3’；

HbCIPK2-SacI-R：5’-TGAGCTCTCAACATGGTTGCTGCTG-3’。

以盐生牧草-短芒大麦草(野大麦)的基因组DNA为模板，用上述两个引物进行PCR扩增，将扩增片段HbCIPK2进行测序，发现扩增片段具有序列表中序列1的自5’端第68-1426位所示的核苷酸。

2、重组表达载体的构建

将步骤1得到的HbCIPK2插入到pGreen0029(含CaMV35启动子和Nos终止子)(购自http://www.pgreen.ac.uk/)的BamHI和SacI酶切位点之间，构成表达载体pGreen0029-HbCIPK2。

3、转化植物

将步骤2得到的表达载体电击转化到农杆菌菌株Gv3101(含助手载体pSoup)(购自http://www.pgreen.ac.uk/)，制备转化菌液((5％蔗糖，0.05％Silwet L-77，OD₆₀₀＝0.8～1.2)。按照Clough和Bent(1998)(Clough S J and Bent A F，1998.Floral dip：a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal，16(6)：735-743)提出的蘸花法(floral dip)对拟南芥野生型(网上购目www.arabidopsis.org)(Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia)和拟南芥突变体sos2-1(网上购自www.arabidopsis.org)(在http://www.arabidopsis.org网站的突变体编号为CS3863)进行浸染转化。

上述蘸花法的具体步骤如下：拟南芥种子用0.1％琼脂悬起来，置于4℃层积处理2天，播于培养钵(花卉土∶跖石＝1∶1)，浇水覆膜，在温室条件下(23℃，每天16小时光照、8小时黑暗)直至发芽，揭去膜，间苗使每钵4株，每隔2天浇水，生长4-5周后抽苔，待苔长自2-3厘米时，剪去出生苔以促进侧苔的生长；待侧苔上大部分孕蕾且刚刚现蕾(即花瓣未张开)，修建植株，即将花瓣已张开的小花及未见花瓣露出的小花去掉。在蘸花前一天浇足水，将所制备的工程菌液盛于中号烧杯(高10cm，直径6cm)，将修剪好的植株倒置于烧杯上，浸染3-4分钟，将植株横放在培养间黑暗培养2天，再将植株正常培养直至结实，收获转化当代种子。

上述突变体的表型为叶片表面光滑，无或少表皮毛，进一步详细描述见(Liu J，IshitaniM，Halfter U，Kim C-S，and Zhu J-K，2000.The Arabidopsis thaliana SOS2 gene encodes aprotein kinase that is required for salt tolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97(7)：3730～3734)。

收获转化后的T₀代种子在含50mg/L Kan的MS平板(含4.3g/L MS粉，20g/L蔗糖，6g/L植物凝胶，pH5.8)上筛选转化子。然后进行PCR检测(引物为：HbCIPK2-BamHI-F：5’-TGGATCCATGGGGGAGCAGAAG-3’；HbCIPK2-SacI-R：5’-TGAGCTCTCAACATGGTTGCTGCTG-3’)，得到32株转pGreen0029-HbCIPK2的转基因拟南芥野生型的阳性株系，得到3株转pGreen0029-HbCIPK2的转基因拟南芥突变体的阳性株系。

将上述32个独立的转pGreen0029-HbCIPK2的转基因拟南芥野生型T3代，在含150mMNaCl培养基筛选，发芽率达到20％以上的株系有8个。选取8个株系中的3个株系(命名为W55、W115和W116)进行下面步骤二的抗逆分析。

将上述3个独立的转pGreen0029-HbCIPK2的转基因拟南芥突变体T2代，命名为S3、S6和S11，表型观察发现，其中S6和S11转基因株系叶片有表皮毛，恢复了表型；仅S3株系叶片表面仍然光滑，没有恢复表型。因此，选择S11和S6转基因株系进行下面步骤二的抗逆分析。

二、抗逆转基因植物的检测

1、HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过量表达可互补敏盐表型

实验设以下2个对照：

对照1：拟南芥突变体sos2-1；

对照2：拟南芥野生型WT。

1)发芽试验验证HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过量表达可互补敏盐表型

实验步骤：将转基因株系(S6和S11)、对照1和对照2的种子消毒后铺在含NaCl(0，100，125和150mM)的MS平板上，每株系至少60粒种子。4℃沉积处理(春化处理)2天，在温度22-23℃，光照强度1000-3000umol m^-2s^-1，光照时间16h/天的条件下生长2天，垂直放置生长5天，记录各株系发芽率。

结果分析：结果如图10A和B所示，在不含NaCl的MS培养基上，sos2-1、WT和转基因株系S6、S11的发芽率均为100％，没有差别；在含100mM NaCl的培养基上，WT的发芽率下降为84％，S6和S11分别为88％、90％，而sos2-1发芽率平均仅为18％，与其它系发芽率呈极显著差异(p＜0.01)，表明sos2-1具有明显的敏盐表型；在含125mM NaCl的培养基上，sos2-1发芽率将至9％，WT发芽率下降为21％，而2个转基因系发芽率达到约68-69％，比前二者发芽率极显著增加(p＜0.01)，表明HbCIPK2在sos2-1过表达可互补其敏盐表型，且发芽率高于野生型发芽率；在含150mM NaCl的培养基上sos2-1和WT均不发芽，而S6和S11仍发芽(37-39％)(图10)。进一步表明，HbCIPK2基因在突变体sos2-1过表达能够互补其敏盐性，HbCIPK2基因具有提高植物耐盐性的功能，但有可能与sos2-1功能不完全相同。

2)幼苗生长试验验证HbCIPK2在拟南芥突变体sos2-1过量表达可互补敏盐表型

实验步骤：将在MS平板上发芽5天的幼苗(S6、S11、对照1和对照2的种子发芽的幼苗)转移至含NaCl(0、100、125、150、175mM)的MS平板上，垂直生长2周后观察生长状况，记录鲜重。

结果分析：胁迫生长试验照片如图11A所示。在MS培养基上2个转基因株系、突变体sos2-1及对照(WT)幼苗生长没有差别；随着盐浓度的增加，2个转基因株系和野生型对照幼苗生长变慢，单株幼苗鲜重下降，但三者差异不显著，而sos2-1突变体在含100-125mM NaCl的培养基上生长2周后变褐，停止生长，其单株鲜重与野生型的呈极显著差异；在含150mM NaCl的培养基上野生型部分叶片开始变黄，而转基因株系生长良好，且转基因株系单株鲜重大于野生型的，突变体sos2-1大部分叶片白化；在175mM NaCl胁迫下2个转基因株系、突变体sos2-1与野生型生长表型差异更加明显(图11B)。本试验充分表明，HbCIPK2基因能够互补拟南芥突变体sos2-1的敏盐表型。

3)拟南芥突变体sos2-1转基因株系在NaCl胁迫下抽苔正常

实验步骤：将4℃沉积处理2天的转基因株系及对照种子播于营养钵(花卉土∶跖石＝1∶1，120℃灭菌4-5hrs)，在温室中生长3周，取生长状态一致的幼苗进行NaCl胁迫处理的抽苔实验。

为避免盐冲击，盐处理组每钵先浇30mL的50mM NaCl，每隔2天，依次递增50mM，最终浇至250mM，同时以每次浇等体积水为浇水对照组。胁迫终浓度2天后恢复正常管理，正常管理一周后，记录各株系抽苔数和结实情况，并拍照。

结果分析：如图12(浇水对照组的图略)所示，浇水对照组各株系间生长正常，均正常抽苔开花。胁迫组中突变体sos2-1全部植株均在抽苔前褐化、死亡；约56％的野生型植株能抽苔，但抽出的抽苔与浇水对照组相比，较矮小或分枝少，剩余植株不抽苔或抽出的苔不足5cm；转基因株系s6和s11抽苔植株比例与野生型接近，且大部分植株抽出的苔高度与浇水对照组接近，且分枝多，开花和结实与浇水对照组同步。通过该试验表明，HbCIPK2基因在拟南芥突变体sos2-1中过表达可互补其敏盐表型。

2、HbCIPK2在野生型拟南芥过量表达可提高耐盐性

过表达实验设以下两个对照：

对照3：按照获得转pGreen0029-HbCIPK2的转基因拟南芥野生型株系的方法，将pGreen0029导入拟南芥野生型中，构成空载体对照3。

对照4：拟南芥野生型WT。

1)发芽试验验证HbCIPK2基因在野生型拟南芥中过表达可提高植株耐盐性

实验步骤：将转基因株系(W55、W115和W116)、对照3和对照4的种子进行发芽试验，试验步骤与步骤1的步骤1)中发芽试验步骤相同。

结果分析：空载体对照与野生型对照的表型一致，所以图中未显示空载体对照，发芽试验结果表明，在未含盐的MS培养基上，W55、W115和W116的发芽率与野生型的发芽率均为100％，表明3个转基因株系在发芽方面均正常(图13A)；在含100mM NaCl培养基上，野生型和3个转基因株系的发芽率均降低，但野生型与3个转基因株系发芽率的差异不明显；当NaCl浓度增加至125mM时，野生型发芽率降低的幅度大于转基因株系，过表达株系W55、W115和W116发芽率均显著高于野生型WT发芽率(p＜0.01，图13B)；特别是在含150mM NaCl培养基上，野生型基本不能发芽，而3个转基因株系仍能够发芽，发芽率接近60％(图13B)，该NaCl浓度范围是筛选转基因耐盐株系比较适宜浓度。该试验表明转基因株系在NaCl胁迫下具有一定耐盐性。

2)幼苗生长试验验证HbCIPK2基因在野生型拟南芥中过表达可提高植株耐盐性

实验步骤：将转基因株系(W55、W115和W116)、对照3和对照4的幼苗进行生长试验，试验步骤与步骤1的步骤2)中生长试验步骤相同。

结果分析：胁迫生长试验如图14A所示。幼苗生长试验表明，在未含NaCl的MS培养基上，3个转基因与野生型生长速率基本一致，其平均单株幼苗鲜重之间没有差别；随着盐浓度的增加，幼苗生长变慢，单株鲜重下降，但转基因株系下降的幅度比野生型WT小，但在150mM NaCl培养基上3个转基因株系幼苗的生长速率显著高于野生型，主要表现在转基因株系的平均单株鲜重显著大于野生型的平均单株鲜重(图14B)；而且在含175mMNaCl培养基上它们生长差异比较明显(图14)，表明幼苗生长的盐敏感浓度高于种子发芽时的浓度。幼苗生长试验进一步表明，拟南芥野生型过量表达HbCIPK2基因可提高植株的耐盐性。空载体对照与野生型对照的表型一致，所以图中未显示空载体对照。

3)HbCIPK2在野生型拟南芥中过表达株系在NaCl胁迫下抽苔旺盛

实验步骤：将转基因株系(W55、W115和W116)、对照3和对照4的种子发芽长成幼苗后进行进行NaCl胁迫处理的抽苔实验，试验步骤与步骤1的步骤3)中抽苔试验步骤相同。

结果分析：空载体对照与野生型对照的表型一致，所以图中未显示空载体对照，结果如图15(浇水对照组图略)所示，浇水对照组各株系间生长与处理组各系间无差异，均正常开花结实。胁迫组中约50％的野生型植株能抽苔，但抽出的抽苔与浇水对照组相比，较矮小或分枝少，剩余植株不抽苔或抽出的苔不足5cm；而过表达系W55、W115和W116抽苔植株比例高于野生型，与浇水对照组接近，且大部分植株抽出的苔高度与浇水对照组接近，且分枝多，开花和结实与浇水对照组同步。通过该试验表明，HbCIPK2基因在拟南芥野生型中过表达可提高其盐性。

3、拟南芥过量表达HbCIPK2可提高植物抗旱性

1)拟南芥野生型过量表达HbCIPK2可提高转基因株系在渗透胁迫下的发芽率

实验步骤：将转基因株系(W55、W115和W116)、对照3和对照4的种子进行发芽试验，试验步骤与步骤1的步骤1)中发芽试验步骤的区别在于：MS平板中含甘露醇(0、300、350和400mM)，而不含有NaCl，其余步骤完全相同。

结果分析：空载体对照3与野生型对照4的表型一致，所以图中未显示空载体对照，发芽试验结果如图16A所示。发芽试验结果表明，在未含甘露醇(Mannitol)的MS培养基上，野生型和3个转基因株系的发芽率均为100％；在含300mM Mannitol培养基上，野生型WT发芽率降至不足40％，而W55、W115和W116的发芽率仍接近100％，所有发芽幼苗的子叶比未胁迫条件下的幼苗子叶小一些；在含350mM Mannitol培养基上，野生型WT发芽率显著低于3个转基因株系的发芽率(p＜0.01)；在含400mM Mannitol培养基上，野生型WT基本不发芽，而约50％的W55、W115和W116种子长出胚根、并露出较小的绿色子叶(图16B)。该试验表明，拟南芥野生型过量表达HbCIPK2可提高转基因株系在渗透胁迫下的发芽率。

2)拟南芥突变体sos2-1过量表达HbCIPK2可提高转基因株系在渗透胁迫下的发芽率

将转基因株系(S6和S11)、对照1和对照2的种子按照上述步骤3的步骤1)的方法进行发芽率实验。

发芽率实验如图17A所示。发芽试验结果表明，在未含甘露醇(Mannitol)的MS培养基上，野生型、突变体sos2-1和2个转基因株系的发芽率均为100％；在含300mM Mannitol培养基上，野生型WT发芽率下降，而突变体sos2-1及转基因株系(s6和s11)的发芽率仍接近100％，它们的发芽率显著高于野生型(p＜0.01)；在含350mM Mannitol培养基上，野生型WT发芽率仍显著低于突变体sos2-1及转基因株系(s6和s11)的发芽率，但突变体sos2-1的发芽率与转基因株系(s6和s11)的没有差别；在含400mM Mannitol培养基上，野生型WT基本不发芽，而转基因株系(s6和s11)的发芽率稍高于突变体sos2-1的发芽率(图17B)。该试验表明，拟南芥突变体sos2-1在渗透胁迫下的发芽率高于野生型，芥突变体sos2-1过量表达HbCIPK2可提高转基因株系在渗透胁迫下的发芽率。

序列表

<110>北京农业生物技术研究中心

<120>植物抗逆相关的蛋白激酶及其编码基因与应用

<160>2

<210>1

<211>1689

<212>DNA

<213>短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)

<400>1

cccggtttgt tcccgacatc gcatgctccc ggccgccatg gcggccgcgg gaattcgatt 60

tggatccatg ggggagcaga aggggaatat tctgatgcac aagtacgaga tggggaagat 120

gctcgggcag gggacctttg ccaaggtcta ccatgcccgc aacatcgaga cctcgcagag 180

cgtcgccatc aaggtgaccg acaaggagaa ggttatgaag ggtgggctca cagatcagat 240

caagcgcgag atctctgtga tgaagctggt gaagcaccct aacattgttc agatgtatga 300

ggtcatggca accaaaacaa agatttactt tgtgttggag catgtcaagg gcggtgagct 360

gtttaacaag gttcagagag gaaggctcaa ggaagacgct gcaaggaagt acttccagca 420

gctgatctgc gcagttgact tttgtcacag caggggcgtc tatcaccgtg atttgaagcc 480

ggagaacctt cttcttgatg agaacagcaa cctgaaggtt tcagatttcg gtctgagcac 540

catttctgaa tgcagaaggc ttgacgggct gctccacaca tcctgcggca ctcctgctta 600

tgttgcccct gaagtgatca ataggaaagg ctatgacggc gccaaggctg acatctggtc 660

ttgtggggtg atcctctttg ttcttttggc tgggtatctc cctttccagg ataagaattt 720

gatgaacatg tataagaaga ttgggaaagc agagttcaaa tgcccgagct ggttctcttc 780

agatatccga aggcttctgc taaggattct cgatcctaac cccagcacaa ggatctcgat 840

tgaaagaatc atggaacatc cttggttcag gaagggtctg gatgcaaagc tgctcagata 900

caatttacaa gcaaaagatg ctgtccctgc tgctgacatg actgtgactt ctgattcccc 960

tagcagcagc aactcagcaa ttgaaggcaa ggaacaagaa gcgaaaaagc tctccaactt 1020

gaatgccttt gatataatct ccctctcaaa tggactcgac ctctccggta tgtttgagga 1080

caacgacaag aagagggagt ccaagttcac gtccaccaac tcggcttcga cgatcgtatc 1140

caagatcgag gacatcgcaa agggcatgcg actgaagctc gtcaagaaag atggtggcat 1200

gttgaagatg gaaggctcca agcccggaag gaaaggtgtc atgtctattg atgctgagat 1260

attcgaggtc acccctgact tccatctcgt ggagttgaag aagacaaacg gcgacactct 1320

ggagtaccag agggtcttga accaggagat gaggccagcg ctgaaggaca tagtctgggc 1380

ttggcaaggc gagccgcagc cgcagccgca gcagcaacca tgttgatgtt gagaagaact 1440

gtgccaagtg cgacatttta ctagctgagt caattaccag gcgttcgtgt gtttctgtaa 1500

tttttattat cccagtttgt tattcgtttc cattcccttc ccttcgtgat gtctgtgtaa 1560

acttcagtta tcatcttttg atgaagactt atttaaaagc atgctgtctc cagaacagat 1620

gccaagtcgt tcaatgcttt ttcatggaca gcgcgtttgt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaa 1689

<210>2

<211>452

<212>PRT

<213>短芒大麦草(野大麦)(Hordeum brevisubulatum(Trin.)Link)

<400>2

Met Gly Glu Gln Lys Gly Asn Ile Leu Met His Lys Tyr Glu Met Gly

1 5 10 15

Lys Met Leu Gly Gln Gly Thr Phe Ala Lys Val Tyr His Ala Arg Asn

20 25 30

Ile Glu Thr Ser Gln Ser Val Ala Ile Lys Val Thr Asp Lys Glu Lys

35 40 45

Val Met Lys Gly Gly Leu Thr Asp Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Val

50 55 60

Met Lys Leu Val Lys His Pro Asn Ile Val Gln Met Tyr Glu Val Met

65 70 75 80

Ala Thr Lys Thr Lys Ile Tyr Phe Val Leu Glu His Val Lys Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Phe Asn Lys Val Gln Arg Gly Arg Leu Lys Glu Asp Ala Ala

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Cys Ala Val Asp Phe Cys His Ser

115 120 125

Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Asn Ser Asn Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Thr Ile Ser

145 150 155 160

Glu Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Leu His Thr Ser Cys Gly Thr Pro

165 170 175

Ala Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile Asn Arg Lys Gly Tyr Asp Gly Ala

180 185 190

Lys Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val Leu Leu Ala

195 200 205

Gly Tyr Leu Pro Phe Gln Asp Lys Asn Leu Met Asn Met Tyr Lys Lys

210 215 220

Ile Gly Lys Ala Glu Phe Lys Cys Pro Ser Trp Phe Ser Ser Asp Ile

225 230 235 240

Arg Arg Leu Leu Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Ser Thr Arg Ile

245 250 255

Ser Ile Glu Arg Ile Met Glu His Pro Trp Phe Arg Lys Gly Leu Asp

260 265 270

Ala Lys Leu Leu Arg Tyr Asn Leu Gln Ala Lys Asp Ala Val Pro Ala

275 280 285

Ala Asp Met Thr Val Thr Ser Asp Ser Pro Ser Ser Ser Asn Ser Ala

290 295 300

Ile Glu Gly Lys Glu Gln Glu Ala Lys Lys Leu Ser Asn Leu Asn Ala

305 310 315 320

Phe Asp Ile Ile Ser Leu Ser Asn Gly Leu Asp Leu Ser Gly Met Phe

325 330 335

Glu Asp Asn Asp Lys Lys Arg Glu Ser Lys Phe Thr Ser Thr Asn Ser

340 345 350

Ala Ser Thr Ile Val Ser Lys Ile Glu Asp Ile Ala Lys Gly Met Arg

355 360 365

Leu Lys Leu Val Lys Lys Asp Gly Gly Met Leu Lys Met Glu Gly Ser

370 375 380

Lys Pro Gly Arg Lys Gly Val Met Ser Ile Asp Ala Glu Ile Phe Glu

385 390 395 400

Val Thr Pro Asp Phe His Leu Val Glu Leu Lys Lys Thr Asn Gly Asp

405 410 415

Thr Leu Glu Tyr Gln Arg Val Leu Asn Gln Glu Met Arg Pro Ala Leu

420 425 430

Lys Asp Ile Val Trp Ala Trp Gln Gly Glu Pro Gln Pro Gln Pro Gln

435 440 445

Gln Gln Pro Cys

450

Claims

1.一种蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列2所示。

2.权利要求1所述蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述蛋白的编码基因为如下1)或2)所述的基因：

2)其核苷酸序列是序列表中的序列1。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为在pGreen0029的多克隆位点间插入权利要求2或3所述基因得到的重组表达载体。

6.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述的编码基因转入目的植物中，得到抗逆性强于所述目的植物的抗逆转基因植物，所述抗逆转基因植物为抗旱和/或抗盐转基因植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述的编码基因是通过权利要求4或5所述的重组表达载体导入植物中。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述植物为水稻、小麦、大豆、烟草、拟南芥、玉米、油菜、高粱、棉花、苜蓿、三叶草、冰草、草莓或西红柿。