CN103468724B - 花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用。本发明在花生中分离获得SOS家族基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。本发明对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有指导作用。

Description

花生抗盐基因AhSOS2、克隆方法及应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体说，涉及克隆花生中抗盐的AhSOS2基因并利用其构建融合表达载体，进而通过转基因途径改变植物性状的方法及应用。

背景技术

盐碱土是地球上广泛分布的一种土壤类型，我国盐碱土地主要分布在东北、华北、西北内陆地区以及长江以北沿海地带。土壤盐害即盐胁迫，主要表现为渗透胁迫，通过破坏细胞的正常离子分布和动态平衡，干扰植物细胞内的各种代谢过程，最终造成植物的伤害甚至死亡，对作物的产量和品质均有重要的影响。然而，随着人口增加和耕地减少，地球表面大面积盐碱地资源的开发利用具有极其重要的现实意义。因为绝大多数植物对盐碱、干旱的耐受性差，只能生长在氯化钠含量为0.3%以下的土壤中，这极大的限制了植物在盐碱滩地上的生长。目前，对植物抗盐、抗逆机制的研究及培育作物抗逆新品种已成为广大植物学家和育种学家研究的主要任务之一。以围绕抗逆基因对植物在逆境环境下的作用为主的研究，已成为从系统水平上探索胁迫生物学和提高植物胁迫抗性和耐性的有效手段。

在盐胁迫条件下，大量的盐分进入植物细胞，造成Na⁺离子毒害和细胞失水，破坏了植物细胞中稳定的Na⁺、Cl^-平衡，也影响K⁺的吸收和Ca²⁺等离子在胞内的分布，从而影响细胞内的生理调节、信号传导等一系列途径。盐害引起的渗透胁迫，以及由此产生的营养亏缺和次级氧化胁迫，还造成了植物细胞内活性氧的过量积累。大量的活性氧可引起细胞膜脂和蛋白质的过氧化，从而造成生物大分子损伤、代谢途径紊乱，导致植物生长停滞甚至死亡。

盐胁迫下，细胞内的离子平衡的调节对于植物的耐盐性十分重要。离子平衡的建立在细胞水平上主要包括两方面：Na⁺的外排和Na⁺的区隔化。Na⁺外排主要由细胞质膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（如：SOS1，Salt Overly Sensitive1）利用质子泵供能将细胞内的Na⁺排到胞外而完成。Na⁺的区隔化主要是液泡膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白（如：NHX1）起作用，通过质子泵水解ATP供能，将胞质中的Na⁺区隔化至液泡内。Na⁺的外排和Na⁺的区隔化减少了Na⁺在细胞内的积累，同时促进K⁺的高亲和性吸收，这对维持植物细胞内K⁺和Na⁺的稳态平衡，维持稳定的pH值和离子稳态起着重要的作用。

美国朱健康实验室最先从拟南芥(Arabidopsis thaliana)中发现了参与介导盐胁迫下细胞内Na⁺的外排及向液泡内的区隔化的相关因子。通过快中子轰击(fast neutron bombardment)、T-DNA诱变以及化学突变（如EMS诱导）等方法，他们创制了大量的拟南芥突变植株，从中筛选并获得了5组盐敏感突变体，并进一步鉴定了5个相关基因，因以上基因均在同一信号通路中，故命名为SOS家族（Salt Overly Sensitive），其成员即包括AtSOS1、AtSOS2、AtSOS3、AtSOS4和AtSOS5。之后该家族相关成员在其他物种中也均有报道。

其中SOS2类基因编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其N-末端催化位点与酵母SNF1激酶和哺乳动物的AMPK激酶非常相似，正常情况下，该基因在植物体内含量很低，但盐胁迫下，其在拟南芥根中表达量明显上调。植物在受到高盐胁迫时，会打破体内的离子平衡，Qiu等通过检测拟南芥突变植株与野生型植株细胞内Na⁺和H⁺含量，证明了SOS信号通路对于植物抗盐过程具有不可替代作用，SOS3是一个Ca²⁺感受器，能够激活体内的SOS2蛋白激酶，并与SOS2结合形成SOS3-SOS2蛋白激酶复合物，通过磷酸化激活SOS1，使细胞膜上的Na⁺/H⁺逆向转运蛋白发挥作用，将体内的Na⁺排出体外（Qiu QS，Guo Y，Dietrich MA，SchumakerKS，Zhu JK.Regulation of SOS1，a Plasma Membrane Na^+/H⁺Exchanger in Arabidopsisthaliana，by SOS2and SOS3.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99:8436-8441.）。Quan等通过质壁分离和GFP染色技术证明了SOS3的同系物SCABP8/CBL10与SOS2蛋白激酶相互作用提高拟南芥芽组织的耐盐性，并且SCABP8与SOS2共同激活SOS1发挥作用（Ruidang Q，Huixin L，Imelda M，Yuguo Z，Wanhong C，Yongqing Y，Mei S，Shouyi C，Jose′M.Pardo，and Yan G，SCABP8/CBL10，a Putative Calcium Sensor，Interacts with the Protein KinaseSOS2to Protect Arabidopsis Shoots from Salt Stress.The Plant Cell，2007，19:1415-1431.）。

目前已经从陆地棉、芥菜及大豆中得到了与拟南芥中的SOS2序列上同源、功能上相同或者相似的基因。这些研究结果表明SOS2基因在植物界中是广泛存在的，并且在不同的植物中，它们执行着相似或者相同的功能。拟南芥AtSOS1、AtSOS2和AtSOS3同时在拟南芥中表达显著提高了转基因植株的耐盐性，在酵母中，同时表达SOS1，SOS2和SOS3大大提高了酵母的耐盐性，其耐盐性比只表达其中一个蛋白有更加明显的提高，进一步证明SOS1依赖SOS2和SOS3的调节，以介导Na⁺外排，在植物耐盐中起到重要的作用。

花生(Arachis hypogaea L.)是重要的油用兼食用作物，其产量和品质与人类生活密切相关。花生主要生长于干旱和半干旱地区，是一种较耐旱作物，能忍耐极低的叶片水势，叶片水势降到-45Pa时，植株仍能维持生命力。花生在应对恶劣环境中选择性的积累了胁迫抗性基因，然而对花生分子生物学研究进展却很有限，关于花生耐盐胁迫及其在离子稳态调节方面的研究则更少。虽然模式植物拟南芥中的SOS信号途径研究较清楚，但对该途径在其他物种如何参与抗盐、耐盐及相关机制的了解还较少。本发明在花生中分离获得SOS家族基因AhSOS2，并通过构建相应的植物表达载体转化水稻对基因抗盐及抗逆功能进行了验证，该方面工作的开展有助于加深对SOS途径及其在植物抗盐方面的认识和了解，为改良及培育植物抗盐及抗逆新品种提供理论依据。

发明内容

本发明提供了克隆花生中具有抗盐及抗逆能力的基因AhSOS2的方法，并通过构建植物表达载体，利用基因工程手段获得该基因的转基因植物材料，对基因生物学功能及其在植物抗盐、抗逆等方面的应用进行研究。同时通过构建该基因的原核表达载体，检测蛋白水平的表达情况，并通过在原核菌株中对该基因的功能进行分析，进一步验证了该基因在抗逆环境下发挥一定的作用，同时对获得的转基因水稻植株进行盐胁迫处理，初步对植株抗盐能力进行了分析，揭示该基因在植物抗逆过程中的作用。

本发明的技术方案是：花生抗盐基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ NO.1所示，氨基酸序列如SEQ NO.2所示，该基因编码蛋白产物属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。

花生抗盐基因AhSOS2的克隆方法，其特征是，首先提取花生叶片的RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得AhSOS2基因的全长序列。引物序列：

AhSOS21:5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3′（SEQ NO.3）；

AhSOS22：5′-TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3′（SEQ NO.4）。

本发明对基因表达模式进行验证的荧光定量PCR表明，正常生长条件下，AhSOS2在花生的根、茎、叶中均有表达；但在盐（250mmol L^-1NaCl）处理条件下，基因在花生幼苗的茎中表达量明显增强，表达量约是未经处理时的30倍；且基因对干旱处理也产生响应，经30%PEG6000模拟干旱处理后，基因在花生幼苗叶中表达量有较大程度的升高，显示基因表达受盐及干旱等胁迫条件的诱导，基因在参与植物抗盐及抗逆过程中可能发挥作用。

本发明还根据花生AhSOS2基因序列设计特异引物，利用PCR的方法扩增目的基因，经酶切及连接，将目的基因AhSOS2与PET28a载体成功连接，获得原核表达载体pET28a-AhSOS2，并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，SDS-PAGE电泳分析，获得预期大小的蛋白条带，证明该基因在蛋白水平完成了表达，并同时对基因原核蛋白表达系统进行了优化。

本发明同时利用斑点法对AhSOS2基因进行功能验证，将成功转入PET28a质粒和pET28a-AhSOS2重组质粒的大肠杆菌菌株BL21（DE3）经IPTG诱导后，在含NaCl的平板上进行点样，37℃倒置过夜培养，通过比较观察菌斑的数量及大小，进而对该基因的原核蛋白表达菌株的抗盐能力进行验证。

本发明还通过液体培养法检测AhSOS2基因的生长曲线，将成功转入PET28a质粒和PET28a-AhSOS2重组质粒的大肠杆菌BL21（DE3）经IPTG诱导后，在含有250mmol L^-1NaCl的LB中进行培养，每隔2h进行取样，紫外分光光度计下测定OD₆₀₀的吸光值。结果显示，含有重组质粒的大肠杆菌比含有空载体的菌株生长速度快，经12h培养后，菌液浓度与含有空载体的菌株的菌液浓度的差值最大，显示含有AhSOS2基因的菌株具有一定的抗盐功能，该结果也是对前文中斑点法结果的补充和验证。

本发明还提供一个经人工改造的pCAMBIA1301P植物表达载体。经酶切及连接，将目的基因AhSOS2与pCAMBIA1301P构建融合表达载体，即获得植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2。进一步借助于基因工程手段，将该表达载体转化入受体材料水稻中，进而提高水稻的抗盐及抗逆能力。

本发明将筛选获得的转基因阳性水稻植株的T₁代种子进行水培培养，待其长至三叶期时进行0mmol L^-1、100mmol L^-1和250mmol L^-1不同浓度梯度的NaCl盐胁迫处理，观察幼苗长势和叶片生长情况，结果初步证明了该基因在水稻抗盐及抗胁迫过程中发挥作用。

本发明以花生为材料，克隆得到了SOS2基因家族的一个重要基因AhSOS2，并对该基因在逆境条件下的表达模式进行了研究，同时对该基因进行原核表达载体的构建，验证了该基因可在蛋白水平进行表达，利用斑点法和基因原核表达系统对该基因的功能进行了初步验证，同时检测了该基因在盐处理条件下的生长曲线，通过将该基因异源转化入水稻并获得相应的转基因植株，对基因在抗盐及抗逆过程中的作用进行了初步鉴定，对进一步实现对花生进行有目的，有针对性的品质、性状改良，创新花生抗逆新种质，具有积极的指导作用。

附图说明

图1：简并引物对AhSOS2序列的PCR扩增电泳结果；其中1、2和3分别表示AhSOS2在50℃、52℃和54℃不同解链温度下的PCR扩增产物，从图1中可以看出，其EST序列的长度为780bp；

图2：AhSOS2全长序列扩增PCR电泳结果，其中1、2、3和4分别表示AhSOS2的PCR产物；

图3：荧光定量PCR分析AhSOS2基因的组织表达特性；

图4：荧光定量PCR对250mmol L^-1NaCl处理花生幼苗后基因AhSOS2的诱导表达模式分析；其中图A、B、C分别代表根、茎和叶；

图5：荧光定量PCR对30%PEG6000模拟干旱处理花生幼苗后基因AhSOS2的诱导表达模式分析；其中图A、B、C分别代表根、茎和叶；

图6：基因AhSOS2原核蛋白表达SDS-PAGE结果；其中1代表PET28a空载体诱导12h的电泳结果，2-8分别代表诱导时间为0、2、4、6、8、10、12h的电泳结果；

图7：不同浓度NaCl处理条件下，含有PET28a、PET28a-AhSOS2的菌株，在不同浓度条件下（10^-3、10^-4），在LB平板上的菌斑生长结果比较；

图8：液体培养法，对含有空载体PET28a的菌株及含有重组质粒PET28a-AhSOS2的菌株在盐溶液（250mmol L^-1NaCl）中的生长曲线的测定结果；

图9：植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2的构建过程示意图；

图10：利用GUS组织化学染色法，对获得的转基因水稻的组织化学鉴定结果，其中CK为对照，T₁代表转入AhSOS2基因的转基因植株，经GUS染色后显蓝色；

图11：通过PCR分子检测法，对AhSOS2转基因水稻的鉴定，其中泳道+为阳性对照，-为阴性对照，泳道1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15经PCR获得目的条带，与阳性对照一致，为转基因植株；

图12：AhSOS2转基因水稻抗盐能力的初步分析，CK为盐胁迫处理3d后的对照水稻幼苗，从左至右分别为0、100和250mmol L^-1不同浓度NaCl胁迫处理；T₁为盐胁迫处理3d后的转AhSOS2基因水稻幼苗，从左至右分别为0、100和250mmol L^-1不同浓度NaCl胁迫处理。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步阐述，以下实验步骤及涉及的培养基均为本领域常规技术，试剂均为市售产品。

实施例1：花生中AhSOS2基因的克隆

参考已发表的拟南芥SOS2基因序列，结合搜索NCBI数据库，获得不同物种中SOS2基因，以基因的氨基酸序列为基础设计简并引物，PCR扩增，获得AhSOS2的EST序列（图1）。在获得的EST序列的基础上，分别设计5′race和3′race特异性引物，按照试剂盒（TaKaRa）说明书进行AhSOS2的5′末端和3′末端的扩增，利用CAP3软件进行ESTs片段拼接，得到AhSOS2序列。以提取花生叶片RNA反转录的单链cDNA为模版，根据电子拼接的AhSOS2全长序列设计基因特异性引物AhSOS21和AhSOS22，PCR反应体系为（20μl）：PCR mix10μl、上、下游引物各0.5μl、cDNA2μl、ddH₂O7μl，PCR反应步骤：94℃3min；94℃30s、56℃1.5min、72℃40s、共35个循环；最后72℃10min，获得一个全长为1462bp的AhSOS2基因的全长序列（图2），其核苷酸序列如SEQ NO.1所示，氨基酸序列如SEQ NO.2所示。该片段全长为1462bp，包含1341bp的开放阅读框(ORF)，生物信息学分析显示，该基因编码446个氨基酸，属丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。所述特异性引物为：

AhSOS21：5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3′（SEQ NO.3）；

AhSOS22：5′-TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3′（SEQ NO.4）。

实施例2：基因AhSOS2在花生不同组织的表达模式及受高盐、干旱胁迫后的诱导表达模式分析

一、AhSOS2在花生不同组织中的表达模式分析

1.植物中RNA的提取

（1）参照SDS法，向1.5ml离心管中加入0.5ml SDS缓冲液、0.3ml tris平衡酚，0.25ml氯仿、0.1ml巯基乙醇。植物材料研磨后（充分研磨）迅速转移入离心管中（约0.1g），涡旋震荡5min；

（2）12000rpm离心15min，吸取上清，（注意不能吸进中间层，否则DNA污染严重）转移上清液至预先加有等体积的氯仿/异戊醇（体积比24:1，下同）的离心管中，涡旋震荡5min；

（3）12000rpm离心15min；

（4）转移上清至新管，加入5mol L^-1的LiCl至终浓度2.5mol L^-1，混匀，4℃放置2h或过夜，12000rpm离心15min；

（5）弃上清，絮状沉淀为DNA，去除。沉淀用70%乙醇洗涤，超净台吹干，加30-50μlDEPC-H₂O溶解沉淀（不易溶解，适当延长时间吹打使之彻底溶解）；

（6）在EP管中配制下列反应液：

（7）37℃反应30min；

（8）再加入50μl的DEPC-H₂O；

（9）加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），充分混匀，震荡3min，4℃12000rpm离心10min；

（10）离心，取上清移至另一管中，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1）重复抽提一次；

（11）加入1/10体积的3mol L^-1NaAc(PH5.2)，2.5倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置30min或过夜；

（12）离心回收沉淀，70%乙醇清洗，干燥；

（13）用适量DEPC-H₂O溶解，分光光度计测含量后，取4μg电泳检测。

2.单链cDNA的获得及表达模式分析：

以生长15天的花生品种“鲁花14”的根、茎、叶、花、果针（其中花和果针取自田间）的RNA为材料，利用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒反转录成单链cDNA，用于之后的荧光定量PCR。

以花生Actin为内标，其引物序列为P677F：5′-GTCATCGTCATCCTCTTCTC-3′（SEQNO.5）；P677R：5′-CATTCCTGTTCCATTGTCAC-3′（SEQ NO.6），用于荧光定量PCR的引物为Real-R:5′-CACAGAGACTTGAAGCCT-3′（SEQ NO.7），Real-F:5′-GGAGAACATCAACACCCT-3′（SEQ NO.8），反应在ABI PRISM7900HT(Applied Biosystems)荧光定量PCR仪上进行，反应体系为SYBR Green Master(Rox)10μl，Real-R0.8μl，Real-F0.8μl，cDNA2μl，ddH₂O补齐至20μl，反应参数设置如下：95℃10min；95℃10s；60℃20s；72℃20s；40个循环。按照2^-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。结果显示：AhSOS2基因在花中表达强度较高，表达量约为其他组织中表达量的12倍（如图3所示）。

二.AhSOS2受盐、干旱胁迫后诱导表达模式分析

1.植物中RNA的提取：

取生长一致的花生幼苗做如下处理：（1）30%PEG6000模拟干旱，分别处理：3h、6h、12h、24h、48h；（2）250mmol L^-1NaCl，分别处理：3h、6h、12h、24h、48h。每种处理取花生根、茎、叶、花、果针各0.2g（其中花和果针取自田间），以正常生长的花生幼苗作对照，植物材料取材后立即放入液氮速冻，之后保存于-80℃冰箱备用。按照与实施例2的一、1的方法提取经过不同胁迫处理植株的总RNA。

2.基因的诱导表达模式分析：

以花生Actin为内标，对AhSOS2经盐、干旱处理后的诱导表达模式进行分析。相关引物和实验方法参数参照实施2的一、2的方法进行。

实验结果显示，随250mmol L^-1NaCl处理时间的延长，AhSOS2在花生的根、茎、叶中的表达量都有所上调，其中在茎中基因表达量变化最明显，在NaCl处理48h后，基因表达量是未处理时的30倍以上；而在根中，随着盐处理时间的延长，基因表达量逐渐上调，在盐处理48h时基因表达量达到了最高，是未处理时的3.5倍；而基因在花生叶中的表达受NaCl诱导不是很明显，表现为先下调，再上调的趋势，且盐处理48h后，基因表达量仅比未经处理时提高20%（图4）。

30%PEG6000模拟干旱处理条件下，AhSOS2在花生的根、茎、叶中表达量都有所上调，在叶中，PEG处理48h时基因表达量是未处理时的12倍；在茎中，当PEG处理6h后，基因表达量是未处理时的3.5倍，而在处理12h后基因表达略有下调，处理24h后基因表达又恢复并上调至未处理时的3.4倍，并随着处理时间的延长，基因表达又略微下调；而AhSOS2在根中的表达受PEG诱导不是很明显，但也达到未处理条件下的1.7倍左右。以上结果显示，基因AhSOS2能够应答盐以及干旱胁迫，暗示该基因在花生抗盐和抗旱等胁迫过程中可能具有一定的作用（图5）。

实施例3：AhSOS2原核表达载体的构建及鉴定

一、AhSOS2基因原核表达载体的构建：

1.以实施例1的AhSOS2全长基因的PCR产物为模版，以AhSOS2-EcoR1-1：

5′-CGGAATTCATGAAGA AGGTGAGGAATAAGATCG-3′（下划线显示酶切位点）（SEQ

NO.9），AhSOS2-Sal1-2：5′-GCGTCGACTACAGTCATTTGTCGAAGCATACC-3′（下划线

显示酶切位点）（SEQ NO.10）为引物，反应体系（20μl）：PCR mix10μl、10μmol L^-1上、

下游引物各0.5μl、质粒0.1μl、ddH₂O补齐。PCR反应程序如下：94℃3min；之后94℃

30s、56℃1.5min、72℃40s、共35个循环；最后72℃10min，获得目的条带。

2.用EcoR I/Sal I酶切原核表达载体pET28a及AhSOS2基因片段，片段经回收后，用T₄DNA酶16℃过夜连接，得到重组原核表达载体pET28a-AhSOS2，转化大肠杆菌DH5α。

3.将成功转入大肠杆菌的阳性克隆送到山东省农业科学院生物技术研究中心测序部进行测序。

4.原核表达载体对大肠杆菌BL21（DE3）的转化：

（1）从-70℃冰箱取出感受态细胞置于冰上溶解。

（2）将AhSOS2与载体PET28a的连接产物5μl加至感受态细胞中，充分混匀，冰上放置30min。

（3）42℃热激90s，在此过程中不要晃动离心管。

（4）热激完毕后立即取出放于冰上2min。

（5）加入800μl的LB液体培养基，37℃，200rpm孵育1h。

（6）将菌液涂布在卡那霉素（Kan）抗性的LB固体平板上，37℃培养12h。

（7）将平板放入4℃保存。

二、AhSOS2基因的诱导表达、优化及SDS-PAGE电泳：

1.接种100μl经过PCR鉴定并保存的菌液于30ml LB液体培养基中，并加入30μl Kan至终浓度为50mg L^-1，37℃条件下180rpm摇床培养12h（OD₆₀₀=0.6左右）；

2.向培养液中加入30μl IPTG至终浓度为1.0mmol L^-1，25℃、200rpm摇床培养0、2、4、6、8、10、12h，诱导重组蛋白表达以确定最佳诱导时间；

3.将IPTG诱导的菌体以等量还原性2×SDS样品缓冲液裂解，取等量上清液以浓度12％的SDS-PAGE分离，经考马斯亮兰R-250染色后在凝胶成像仪上对电泳结果进行鉴定并拍照（图6）。从图6可以看出：经IPTG诱导，可以得到预期大小的53kDa蛋白条带，随着IPTG诱导时间的延长，蛋白条带的亮度逐渐变大，当诱导时间到8h时，蛋白亮度达到最大。

实施例4：斑点法对AhSOS2基因功能的初步验证

一、NaCl处理液的配置：

分别配置0、100、250、500、750和1000mmol L^-1不同浓度的NaCl固体培养基。

二、将分别含有PET28a-AhSOS2和PET28a空载体的菌株经37℃培养至OD₆₀₀为0.6，之后经IPTG诱导12h；将培养好的菌液分别稀释10^-3和10^-4倍，各取10μl点于含有不同浓度NaCl的LB固体培养板上，晾干后用封口膜封好；

三、37℃培养箱倒置过夜培养；

对菌株在NaCl培养板上的生长情况进行拍照（图7）。从图7可以看出：随着NaCl处理浓度的提高，PET28a-AhSOS2和PET28a空载体的菌斑都随之减少，当NaCl浓度达到500mmol L^-1时，没有菌落，并且相同NaCl浓度的培养板上，含有PET28a-AhSOS2重组质粒的菌斑比PET28a空载体菌斑的数量明显增多，说明AhSOS2基因在高盐胁迫下具有一定的抗性。实施例5：液体培养法

一、将分别含有PET28a和PET28a-AhSOS2的大肠杆菌BL21（DE3）菌株进行活化，加入

Kan至终浓度50μg mL^-1，同时加入IPTG至终浓度为1mmol L^-1；

二、取1ml活化的菌液加入300ml含有250mmol L^-1NaCl的LB中，加入Kan至终浓度50μg mL^-1，200rpm于37℃摇菌；

三、每隔2h取一次菌液，至菌液浓度OD₆₀₀达到2.0左右；

四、紫外分光光度计下测量OD₆₀₀的吸光值，并记录；

五、将记录的结果进行整理，获得菌株的生长曲线（图8）。从图8可以看出：含有重组质粒的大肠杆菌比含有空载体的菌株生长速度快，经12h培养后，菌液浓度与含有空载体的菌株的菌液浓度的差值最大，显示含有AhSOS2基因的菌株具有一定的抗盐功能。实施例6：AhSOS2植物双元表达载体的构建

一、AhSOS2基因的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2的构建（图9）

1.pCAMBIA1301P的构建：

将克隆获得的CAMV35S promoter序列插入到商业化的pCAMBIA1301载体的多克隆位点EcoR I和Kpn I之间，得到改造的植物表达载体，命名为pCAMBIA1301P。

2.酶切及连接反应：

（1）酶切反应：将实施例1的AhSOS2的PCR产物回收并进行双酶切，酶切体系为：PCR

产物10μl，Kpn I和Xba I各3μl，10×T buffer M10μl，ddH₂O补齐至100μl。37℃酶切4h；将改造的植物表达载体pCAMBIA1301P也进行双酶切，酶切体系：质粒10μl，KpnI和Xba I各3μl，10×T buffer M10μl，ddH₂O补齐至100μl。37℃酶切4h。

（2）连接反应：将酶切并回收的AhSOS2产物与植物表达载体酶切回收产物进行连接。反应体系为（10μl）：酶切并回收的AhSOS2产物3μl，pCAMBIA1301P载体1μl，T₄DNA连接酶1μl，T₄DNA连接酶buffer1μl，ddH₂O补齐至10μl。16℃反应过夜。

二、农杆菌LBA4404感受态的制备

1.划线培养农杆菌LBA4404，挑取单菌落接种到含有100μg ml^-1利福平霉素（Rif）的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜；

2.取50ml含有100μg ml^-1Rif的LB液体培养基，将过夜活化的农杆菌按1:25的比例接种，28℃振荡培养至OD₆₀₀约为0.6-0.8，放置冰上1h；

3.4000rpm，4℃离心10min，弃上清，用5ml预冷的0.1mol NaCl悬浮菌体；

4.4000rpm，4℃离心10min，弃上清，用1ml预冷的20mM的CaCl₂悬浮菌体；

5.每管50μl分装，液氮速冻，-70℃保存。

6.质粒转化农杆菌LBA4404

1）将农杆菌感受态细胞从-70℃冰箱取出后置于冰上缓慢融化；

2）加入5μl质粒于50μl的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

3）放入液氮中速冻5min，立即置于37℃水浴锅中保温融化5min；

4）加入500μl LB液体培养基，28℃220rpm，振荡培养3-5h；

5）取出菌液，均匀涂布于含100μg ml^-1Rif，50μg ml^-1Kan的LB固体培养基上，28℃倒置培养2-3d。

7.农杆菌阳性克隆的PCR鉴定

1）用牙签挑取单克隆于含有50μg ml^-1Kan和100μg ml^-1Rif的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜，以此菌液为模板进行PCR检测；

2）PCR反应体系为（25μl）：PCR mix10μl、10μmol L^-1上、下游引物各0.5μl、菌液2μl、ddH₂O12μl；

3）PCR反应步骤：94℃3min；之后94℃30s、56℃1.5min、72℃40s、共35个循环；最后72℃10min；

4）PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例7：农杆菌介导转化水稻愈伤组织

一、水稻愈伤组织的培养

1.取水稻成熟饱满种子，人工脱壳，放入100ml无菌烧杯中，70%酒精消毒1min；无菌水冲洗2次，100ml30%次氯酸钠溶液浸泡20min；用无菌蒸馏水清洗种子3遍，再加入100ml30%次氯酸钠溶液浸泡20min；用无菌蒸馏水清洗种子5遍，最后一遍浸泡20min。

2.种子放在无菌滤纸上晾干，将种子种植于诱导培养基中，每皿12-14粒；操作完毕用封口膜封好，在30℃光照培养箱培养4周；

3.在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在30℃光照培养箱，继代培养1-2周，获得成熟的愈伤组织。

二、转化及植株的获得

1.将已转化成功的农杆菌菌液100μl接于4ml LB培养液中（含50mg L^-1Rif和50mg L^-1链霉素（Str），28℃，220rpm振荡培养过夜；

2.将1ml此菌液转接到30ml LB培养液中（含50mg L-¹Rif和50mg L^-1Str），28℃，220rpm振荡培养至菌液OD₆₀₀为0.8-1.0；

3.取1ml菌液于离心管中，4℃，4000rpm，离心1min，去上清。用含200μmol L^-1乙酰丁香酮（As）的30ml悬浮农杆菌的液体培养基（AAM）液制成悬浮液。将长到一定大小的水稻愈伤组织放入农杆菌悬浮液中侵染10min；

4.将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min，随后将愈伤组织转移至共培养基上，19-20℃暗培养3d；

5.将共培养基上的愈伤组织放入50ml的三角瓶中，用无菌水清洗6次。再用含500mg L^-1头孢青霉素（Cef）的无菌水浸泡1h。最后置于无菌滤纸上沥干2h；

6.利用含250mg L^-1Cef和30mg L^-1潮霉素（Hyg）的选择培养基对愈伤组织进行第一轮筛选，30℃，光照培养箱中培养2周左右；

7.将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg L^-1Cef和40mg L^-1Hyg的培养基上进行第二轮选择，30℃，光照培养箱中培养10d左右；

8.从选择培养基上挑取颜色鲜黄的抗性愈伤移入预分化培养基中，28℃，暗培养5-7天，再转移至分化培养基中，30℃，光照培养箱中培养至分化成苗。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中；

9.挑取根部和茎叶分化得较完好转基因苗，炼苗3-4天，移至栽培缸，于温室中培养。

实施例8：转基因水稻植株的鉴定

一、水稻基因组DNA的提取

1.参照CTAB提取基因组DNA的方法，称取0.2g水稻叶片，在液氮中充分研磨，加入600μl CTAB提取液（2%的CTAB；2%的PVP；0.1M的Tris-HCl，pH8.0;2M的NaCl；25mM的EDTA；2%的β-巯基乙醇），65℃水浴20min；

2.12000rpm离心10min，吸取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1），颠倒混匀后静置10min，重复2次；

3.转移上清，加入等体积预冷的异丙醇，于冰上沉淀DNA15min；

4.室温，12000rpm离心10min，弃上清；

5.用75%乙醇洗涤沉淀2次，12000rpm离心5min；

6.弃上清，干燥沉淀，加入20μl灭菌ddH₂O溶解，可直接用做PCR模板。

二、对PCR方法鉴定为转基因阳性的株系，进一步用GUS组织化学染色法进行确认

1.选取2-3cm T₁代转基因水稻叶片浸泡在预先配制好的GUS染液里；

2.37℃保温、染色过夜；

3.用75%乙醇脱色至阴性对照为白色，于体视显微镜(LEICA S-系列)下观察染色结果，照相并记录（图10）。

三、转基因植株的分子鉴定

以上述提取的水稻基因组DNA为模版，以扩增AhSOS2基因全长的引物进行PCR，引物序列如下：AhSOS21:5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3′（SEQ NO.3）、AhSOS22：5′-TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3′（SEQ NO.4），PCR反应步骤为：94℃3min；之后94℃30s、56℃1.5min、72℃40s、共35个循环；最后72℃10min。扩增出相应大小特异条带的为转基因株系（图11）。

实施例9：转基因水稻植株功能的初步验证

一、浸种：挑取饱满的优良品种“中花11”转基因及野生型T0代水稻种子，放入培养皿中，加入自来水，黑暗下浸种2-3d；水培水稻种子：待浸种结束后，将种子转入纸杯中，加入水稻培养液，于28℃，75RH，16h光照，8h黑暗条件下培养；

二、NaCl处理液的配置：配置0mmol L^-1、100mmol L^-1和250mmol L^-1不同浓度的NaCl培养液；

三、待水稻苗长至三叶期时，进行NaCl胁迫处理，以为转基因水稻苗做对照，处理三天，观察水稻苗长势，记录并拍照。如图12所示，无论转AhSOS2基因的水稻还是对照水稻，在盐胁迫下，随着NaCl处理浓度的提高，植株受损伤程度也越来越严重，但总体来说，转基因株系在不同NaCl浓度下的长势均优于对照植株。其中在250mmol L-1NaCl处理下，这种长势差异最为明显，经250mmol L-1NaCl处理3d后，对照株系叶片黄化和萎蔫程度都很严重，茎杆因脱水严重导致变细、抗倒伏能力降低，且根部生长受抑制；而转基因水稻叶片在短时间高盐处理下仅出现轻微的黄化和萎蔫，茎部相对粗壮、抗倒伏能力较好，虽然根部生长也受到一定程度的抑制，但整体生长状态较好。

Claims (7)

1.花生抗盐基因AhSOS2，其核苷酸序列如SEQ NO.1所述。

2.权利要求1所述的花生抗盐基因AhSOS2的克隆方法，其特征是，首先提取花生叶片的RNA，反转录获得单链cDNA，以单链cDNA为模版，以下述序列为引物，通过PCR获得AhSOS2基因的全长序列，其引物序列为：

AhSOS21：5′-GGTACCTAGATTAGCCGTTAGCGTTGT-3′

AhSOS22：5′-TCTAGACTGGATCATACAGTCATTTGTCG-3′。

3.权利要求1所述的花生抗盐基因AhSOS2在提高作物的抗盐性方面的应用。

4.一种含有权利要求1所述的花生抗盐基因AhSOS2的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为重组原核表达载体pET28a-AhSOS2。

6.如权利要求4所述的表达载体，其特征是，所述表达载体为植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2，所述pCAMBIA1301P是将CAMV 35S promoter序列插入到pCAMBIA1301载体的多克隆位点EcoR I和Kpn I之间，改造得到的植物表达载体。

7.一种提高作物抗盐性的方法，其特征是，权利要求6的植物双元表达载体pCAMBIA1301P-AhSOS2借助于基因工程手段介导作物遗传转化，获得转基因植株。