CN105505948A - 大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1、编码蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体公开了一种磷饥饿负调控基因GmSPX1、编码蛋白及其应用。该基因的核苷酸序列如Seq？ID？NO.1所示。本发明发现通过任何一种可以导入外源基因GmSPX1的植物表达载体转化植物细胞可获得过表达GmSPX1的转基因植株，与未转基因植株相比其全磷含量明显减少，磷饥饿相关基因显著下调，根系统形态也发生明显改变，突变体磷中毒现象得到缓解。本发明公开的基因可作为目的基因导入植物，提高转基因植物磷体内代谢平衡的能力，对培育磷高效利用大豆品种有重要意义。

Description

大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1、编码蛋白及其应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1、编码蛋白及其应用。
背景技术
在植物生长发育所必须的17种元素中，磷元素(P)是非常重要的一种。包括核糖核酸(Nucleicacids)合成、细胞膜(Membrane)构建和ATP合成等在内的植物细胞活动中都离不开P元素。甚至有很多参与酶促反应和信号传导过程的复合物中也都必须含有P元素。植物根只能以吸收土壤中无机磷酸盐(Pi)的方式来获取所必须的P元素。然而由于土壤所带电荷为负，所以Pi就很容易浸出，而且土壤中大多数的Pi不是被微生物转化为有机化合物，就是通过与阳离子相互作用变得不溶于水，结果就是大量的P被固定在土壤中无法被植物所利用。因此，为确保农作物的产量，在农业生产中就会使用大量的磷肥，但是，这种做法受到越来越多的关注和质疑，这不仅是经济层面上的问题，更是一个生态环境上的问题，一是因为磷肥会对环境造成污染；二是因为要保持磷资源的可持续性利用。所以近年来在农业生产过程中为了提高磷的利用效率，一般从这两个方面来入手，第一，优化土壤中P元素的浓度；第二，培育在缺磷条件下依旧可以保证产量的磷高效作物。故此，在分子生物学层面上研究植物是如何感知和响应外界Pi含量变化的非常重要。
尽管Pi在土壤中的含量差异很大，但是植物细胞内Pi的浓度是能够被严格调控并保持在一个相对稳定的平衡中的。因为植物在长久的进化过程中，已经发展出一系列的协调策略，包括节约利用、循环利用和提高从外界环境中吸收Pi的能力等。近年来，虽然对磷饥饿相关的生物化学和形态学方面的研究已经取得了一些实质性的进展，然而由于有非常多的代谢通路参与了磷酸盐调控，而且这些通路往往又非常复杂多变，所以我们对植物是如何感知外界环境中Pi浓度变化，又是如何正确地进行信号传导等问题的了解依旧非常有限。
在植物中可以把包含SPX结构域的蛋白质分为四大类。第一类，只包含有SPX结构域的蛋白；第二类，除了SPX结构域，在C末端还包含有一个EXS结构域的蛋白；第三类，除了SPX结构域，在C末端还包含有一个MFS结构域的蛋白；第四类，除了SPX结构域，在C末端还包含有一个RING结构域的蛋白。
第一类在拟南芥中报道有4个蛋白(AtSPX1-AtSPX4)、水稻中报道有6个蛋白(OsSPX1-OsSPX6)、大豆中报道有9个蛋白(GmSPX1-GmSPX9)、菜豆中报道3个蛋白(PvSPX1-PvSPX3)；通过对这些基因的亚细胞定位和组织表达分析发现，它们在植物的根、茎、叶、子叶、花粉、细胞核和胞浆中都有表达；除了拟南芥中的AtSPX4和水稻中的OsSPX4，其他基因在低磷环境下都会被诱导表达；在AtSPX1、AtSPX2和AtSPX4突变体株系中，不管是在低磷胁迫环境还是在正常环境下都没有观察到明显的表型变化，而在spx1/spx2双突变体中观察到Pi的大量积累；在最近的研究中发现AtSPX1可以与AtPHR1互作，形成蛋白复合物；在上文中提到，AtPHR1在磷饥饿响应中起到中心调控的作用，它可以识别并结合在很多磷饥饿相关基因启动子的P1BS位点上，激活这些基因表达来缓解磷饥饿对植物造成的影响；AtSPX1的表达可以受到磷饥饿胁迫不断升高，它自身的启动子区域中也包含有P1BS元件，可以被PHR1所识别并激活，但是AtSPX1又可以与AtPHR1结合形成SPX1/PHR1复合物，并抑制AtPHR1的转录激活活性，导致AtPHR1下游的很多基因(包括AtSPX1)的表达受到抑制，以起到调控植物自身Pi动态平衡的作用，这与之前作者在2008年提到的在过表达AtSPX1拟南芥株系中发现ACP5、PAP2和RNS1基因表达量显著升高的结果有些矛盾，但是作者并没有给出明确的解释；AtSPX3则被认为在拟南芥磷饥饿响应中起到负调控作用，AtSPX3的表达被干扰后很多PSI基因的表达会上调，植株全磷含量也大幅上升，甚至出现磷中毒的现象。
在对水稻OsSPX的研究中也得到了类似的结果；虽然OsSPX4在磷饥饿胁迫的条件下表达量并没有明显的变化，但是发现OsSPX4突变体中PSI基因的表达量却显著升高，植物全磷含量也会大幅升高；酵母双杂实验和BiFC等实验发现OsSPX4可以与OsPHR2互作，并且在正常磷环境下OsSPX4可以抑制OsPHR2的活性，但在低磷环境下OsSPX4会通过蛋白酶体途径而被降解失活；最近的报道中也发现，OsSPX1和OsSPX2有类似的作用，在正常磷环境下OsSPX1/OsSPX2与OsPHR2是高亲和的，而在磷饥饿胁迫下OsSPX1/OsSPX2与OsPHR2就会变成低亲和的；在对OsSPX3和OsSPX5的研究中发现，它们不仅可以负向调控水稻Pi从地下部到地上部转运的过程，而且还可以抑制OsPHR2的表达，但目前尚未有直接的互作证据。
在菜豆的研究中发现，PvSPX1在磷响应过程中起正向调控的作用，过表达PvSPX1的菜豆根中，PSI基因的表达会大幅上调，全磷含量也会提高，而且发现其根毛的发育会被激活。在过表达PvPHR1的菜豆根中，PvSPX1的表达量大幅上升，说明PvSPX1的表达可以被PvPHR1激活。在大豆中GmSPX3也被证实在大豆的磷饥饿响应中起正向调控的作用。
发明内容
1、发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1。
本发明的另一个目的是提供该基因所编码的蛋白。
本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒。
本发明的又一个目的是提供上述基因或重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡及培育磷高效利用大豆品种中的应用。
2、技术方案
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1，其核苷酸序列如序列表SeqIDNO.1所示。
本发明还提供了一种大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1所编码的蛋白，其氨基酸序列如序列表SeqIDNO.2所示。
进一步地，本发明提供了一种含有该大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1的重组质粒，是将大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1插入pEarleygate103植物过量表达载体和融合表达载体pJIT-166-GFP中而成的。
进一步地，本发明提供了扩增所述大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1全长或其任意片段的引物对，该引物对的上游引物如序列表SeqIDNo.3所示，下游引物如序列表SeqIDNo.4所示。
进一步地，本发明提供了所述的大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1或所述重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡中的应用。
进一步地，本发明提供了所述的大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1或所述重组质粒在培育磷高效利用大豆品种中的应用。
进一步地，本发明提供了一种培育转基因植物的方法，就是将所述磷饥饿负调控基因GmSPX1通过重组质粒导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物相比于目的植物全磷含量明显减少，磷饥饿相关基因显著下调。
3、有益效果
⑴本发明所提供的大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1，位于第1条染色体上，读码框长度为786bp；其编码的蛋白仅包含有一个SPX结构域，属于大豆GmSPX家族成员；利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明GmSPX1基因导入植物细胞，可获得全磷含量明显减少，磷饥饿相关基因显著下调的转基因植株；
⑵使用本发明的基因构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素、卡那霉素等)；
⑶携带有本发明GmSPX1的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株；被转化的宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物；
⑷本发明的基因对大豆体内磷元素代谢有积极的调控作用，特别的在培育高磷吸收大豆品种育种中具有重要意义。
附图说明
图1为大豆GmSPX1基因的PCR检测电泳图。
图2为大豆GmSPX1基因的表达分析图。
注：用低磷处理大豆幼苗，分别于0d、1d、5d和10d，然后恢复磷元素供给培养1天(R-11d)探索基因表达量的变化；数值以3个重复的平均值±标准差形式表示。
图3为大豆GmSPX1基因的植物过量表达载体构建和融合表达载体构建图。
图4为转基因拟南芥苗的检测效果图。
图5为pEarleygate103和pJIT-166-GFP的结构示意图。
图6为转基因拟南芥中磷饥饿诱导相关基因荧光定量PCR图。
图7为转基因拟南芥总磷含量的测定图。
图8为转基因拟南芥根毛长度与数量的测量图。
图9为转基因拟南芥根毛发育相关基因荧光定量PCR图。
图10为转基因拟南芥根尖活性氧(ROS)检测图。
图11为大豆GmSPX1基因的亚细胞定位图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1的克隆
(1)设计引物，提取RNA，反转cDNA：
用RNAisoReagent(购自TaKaRa)提取低磷处理5天后的大豆品种Williams82根部总RNA，经1％琼脂糖电泳检测RNA的完整性；cDNA的合成按照TaKaRa公司SYBRPrimeScriptRT-PCRKitII试剂盒说明操作。扩增基因GmSPX1的引物序列为：
SeqIDNO.3：GmSPX1-F5’-ATGAAGTTTGGGAAGAGACT-3’；
SeqIDNO.4：GmSPX1-R5’-ACAATAGGAACTGCAGCATTG-3’。
(2)PCR扩增，具体步骤如下：
步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应液(50μL体系)：ExTaq酶mix(25μL)，GmSPX1-F(1μL)，GmSPX1-R(1μL)，cDNA(1μL)，ddH2O(22μL)；
步骤二：设定反应程序为：95℃，5min；(94℃，30sec；58℃，30sec；72℃，60sec；30个循环)；72℃，10min；4℃保存；
步骤三：PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如图1所示经过15分钟的琼脂糖凝胶电泳，获得了786bp大小的单一条带，与目的基因大小一致，回收纯化后将PCR产物连接至pMD19-TSimple质粒；将重组质粒转化大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，隔夜培养挑取单菌落，培养过夜后进行菌检，将正确的PCR条带送测序；根据测序结果，保存插入片段正确的菌液并提取质粒。
实施例2：大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1的荧光定量分析
(1)选取处理时间分别为0d、1d、5d、10d和R-11d(恢复处理1天)的大豆根与叶的cDNA样品为材料，选用的荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒为IQSYBRGreen(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)；
(2)设计引物
针对GmSPX1基因序列设计荧光定量特异性引物为：
SeqIDNO.5：上游引物5’-TGAATGATCCTGCTCCAGTTT-3’；
SeqIDNO.6：下游引物5’-TATCTTCAACGGTGGCAATG-3’。
内参基因选用Tubulin，引物序列如下：
SeqIDNO.7：上游引物5’-GGAGTTCACAGAGGCAGAG-3’；
SeqIDNO.8：下游引物5’-CACTTACGCATCACATAGCA-3’。
(3)荧光定量PCR扩增，具体步骤如下：
步骤一：按照以下组份顺序配制PCR反应体系(20μL体系)：2×SuperRealPreMix(SYBRGreen)(10μL)，引物(各0.5μL)，cDNA(2μL)，ddH2O(7μL)；
步骤二：使用CFX96Touch(Bio-Rad)实时荧光定量PCR仪，设定PCR反应程序为，95℃，15min；(95℃，10sec；60℃，30sec；40个循环)；
步骤三：荧光定量PCR所获得的结果，均采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量，具体方法如下，以正常磷环境下生长0d、1d、5d、10d和R-11d的大豆根和叶组织cDNA的Ct值为对照组，以低磷环境下生长0d、1d、5d、10d和R-11d的大豆根和叶组织cDNA的Ct值为处理组；设0d的Δ值为1，计算出处理1d、5d、10d和R-11d相较于0d时的表达倍数；公式如下：2-ΔΔCt＝[(Cttreated-Ctcontrol)sampleA-(Cttreated-Ctcontrol)sampleB]；三次生物学重复所计算出的数据，与对照组数据在Excel2007软件中进行Student’st-test检测，获得处理组相对表达量变化三次生物学重复的标准差，以*P＝0.05；**P＝0.01；***P＝0.001的标准绘制成图。
步骤四：如图2所示，低磷环境的诱导下，大豆叶中和根中GmSPX1的表达随着磷饥饿胁迫时间的延长而不断积累，相对表达量显著升高，在第10天达到最大值；并且在恢复磷浓度处理一天后，GmSPX1的表达量相较第十天有显著的下调，说明低磷环境会诱导GmSPX1基因的表达。
实施例3：大豆GmSPX1基因在拟南芥中的表达分析
(1)利用Gateway技术构建植物表达载体pEarleygate103-GmSPX1(如图3A,B所示)。根据Gateway说明书设计特异性引物；
SeqIDNO.9：上游引物如下
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAAGTTTGGGAAGAGACT-3’
SeqIDNO.10：下游引物如下
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCACAATAGGAACTGCAGCATTG-3’；
(2)以实施例1中获得的PCR扩增产物为模板，进行PCR扩增，具体操作同实施例1，然后依次进行BP反应及LR反应；
BP反应：按以下组份配制反应液，加入200μLEP管中：GmSPX1(3μL)，pDONR221(1μL)，ddH2O(4μL)；迅速涡旋BPClonase酶一次，加入2μL至上述反应液中，再次涡旋混合物，然后于25℃水浴过夜；次日加入1μL蛋白酶K溶液，于37℃水浴10min，后存于-20℃冰箱中，待转化；将反应液转化大肠杆菌，挑取单菌落，培养后，经过PCR检测验证GmSPX1是否成功导入pDONR221中，琼脂糖凝胶电泳获得了与目的基因大小一致的条带(如图3A所示)，然后进行测序，选取正确测序结果提取质粒，待LR反应。
LR反应：按以下组份配制反应液，加入200μLEP管中：pMDC83(1μL)，pDONR221-GmSPX1(3μL)，ddH2O(4μL)；迅速涡旋LPClonase酶一次，加入2μL至上述反应液中，再次涡旋混合物，然后于25℃水浴过夜；次日加入1μL蛋白酶K溶液，于37℃水浴10min，后存于-20℃冰箱中，待转化；将反应液转化大肠杆菌，挑取单菌落，培养后经过PCR检测验证GmSPX1是否成功导入pEarleygate103中，琼脂糖凝胶电泳获得了与目的基因大小一致的条带(如图3B所示)，然后进行测序，选取正确测序结果提取质粒，获得了pEarleygate103-GmSPX1质粒(如图5A所示)。
(3)将正确含有目的基因的植物表达载体利用滴花法转化拟南芥，具体步骤如下：
步骤一：在拟南芥生生长至刚开花时，剪断主茎以促进侧枝花序生长；
步骤二：当花蕾露白时，培养带有pEarleygate103-GmSPX1的农杆菌，200rpm28℃条件下摇菌至OD600值达到1.2-1.8，4000rpm4℃离心10min；
步骤三：用5％的蔗糖溶液重悬2次，将OD值稀释到0.8-1.0；
步骤四：加入表面活性剂SilwetL-77(用量0.01％)混匀菌液；
步骤五：用枪头将菌液滴到花蕾上，重复一次；
步骤六：用黑色塑料袋套袋，暗培养一天后正常培养；
步骤七：在花期中可多次侵染；
步骤八：待种子成熟后，分株收种。
(4)阳性转基因苗的筛选，具体步骤如下：
步骤一：选取适量的转基因拟南芥种子和野生型拟南芥种子，使用含有20mg·L-1Bar的1/2MS培养基，对拟南芥种子进行培养；。
步骤二：培养2周后进行观察，若植株为阳性苗则可以在筛选培养基上正常生长至长出2片真叶，并且根系发达，而野生型植株和转基因阴性植株则不能正常生长；
步骤三：将初步鉴定的阳性苗转移至营养土中继续培养至即将抽薹；
步骤四：取叶片提取DNA进行PCR检测，阳性苗继续培养收种；
步骤五：重复上述收种、消毒、培养、鉴定的过程，待繁殖到T3代进行功能验证。
(5)荧光定量PCR的方法检测转基因拟南芥中GmSPX1的表达量
实验材料为拟南芥WT，拟南芥突变体spx3，过表达转基因植株OXSPX1和突变体spx3的过表达植株spx3/OXSPX1；荧光定量PCR验证突变体中AtSPX3的表达量和过表达株系中GmSPX1的表达量，结果发现spx3中AtSPX3表达几乎为0(如图4A所示)，过表达株系(OXSPX1-3、OXSPX1-5、spx3\OXSPX1-1和spx3\OXSPX1-3)中GmSPX1的表达均大幅高于AtSPX3(如图4B所示)，说明拟南芥突变体spx3，过表达转基因植株OXSPX1和突变体spx3的过表达植株spx3/OXSPX1均达到了实验要求。
实施例4：磷饥饿诱导相关基因的表达
分别检测了野生型(WT)、spx3、GmSPX1过表达植株(OxSPX1)和GmSPX1过表达spx3突变体(spx3/OxSPX1)中AtPHT1-4、AtPHT1-5和AtACP5的表达。分别将10日龄的WT、spx3、OxSPX1和spx3/OxSPX1置于正常磷(625μMKH2PO4)条件下和低磷(6.25μMKH2PO4)条件下培养，然后取根部组织为样本进行后续实验。
所用引物如下：
在低磷环境下spx3根中AtPHT1-4、AtPHT1-5和AtACP5的表达量与WT相比都大幅上调；OXSPX1根中AtACP5的表达量在正常磷和低磷环境下均显著下调，而AtPHT1-4和AtPHT1-5的表达量只有在正常磷条件下才表现出显著下调(如图6所示)，这说明GmSPX1负向调控PHT1和ACP5基因的表达；而且之后再以spx3/OXSPX1为材料验证，发现spx3中AtPHT1-4、AtPHT1-5和AtACP5的高表达会受到过表达GmSPX1的抑制(图6中以灰色柱显示)，此结果也证实了GmSPX1在转录水平上起负调控作用。
实施例5：转基因植株全磷含量的测定，具体步骤如下：
分别检测了野生型(WT)、spx3、GmSPX1过表达植株(OxSPX1)和GmSPX1过表达spx3突变体(spx3/OxSPX1)中的全磷含量。分别将20日龄的WT、spx3、OxSPX1和spx3/OxSPX1置于正常磷(625μMKH2PO4)条件下和低磷(6.25μMKH2PO4)条件下培养，然后取整株幼苗进行后续实验。
步骤一：称取0.02g左右的样品干重，加入8mLddH2O和2mLHNO3，用微波消解系统(MilestoneETHOS)200℃消煮10min，冷却至室温后，用ddH2O定容至10mL；
步骤二：用PerkinElmerOptima2100DVICP-OESsystem对样品总磷含量进行测定；
步骤三：用磷标样(1000μg/mL)稀释不同浓度，做标准曲线。
如图7所示，发现与WT相比，在正常环境和低磷环境中OXSPX1和spx3/OXSPX1的全磷含量均明显下降，而突变体spx3的全磷含量并没有明显变化。
实施例6：转基因植株根系统的观察
(1)将生长在1/2MS培养基中10天的拟南芥幼苗转移到全磷MS培养基中培养10天，使用体视镜(OLYMPUSMVX10)拍摄初生根，使用ImageJ来测定该区域内(5mm)的根毛的长度和根毛的总数。
如图8所示，低磷环境下OXSPX1和spx3/OXSPX1中的根毛的长度明显变短，数量也明显变少，而WT和突变体spx3的根毛并没有明显的不同，这说明转基因根系结构的改变确实是由于GmSPX1过表达造成的。
(2)有报道称AtUBP14和AtPIP5K特异性的在低磷环境下影响拟南芥根毛的发育，所以我们检测了低磷环境下AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3在转基因植株根中的表达，所用引物序列如下：
如图9所示，实验结果同植株的表型完全一致，在低磷环境下OXSPX1和spx3/OXSPX1根中AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表达相较于WT和spx3都明显下调，结果说明GmSPX1在根系的发育过程中起了很重要的作用，可以抑制拟南芥根毛的发育，而且可能是GmSPX1通过负向调控AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表达来实现的。
实施例7：转基因拟南芥根尖活性氧含量的测定
在植物中，受到逆境而导致氧化胁迫的发生是一种普遍现象，植物体内过量的活性氧将会对幼苗、细胞结构与功能、生物大分子、酶系统和DNA造成一定的伤害，植物中高浓度的ROS将会造成细胞不可逆转的伤害和死亡，所以，植物细胞进化出了高效的ROS清除机制，达到使细胞免受活性氧毒害的作用。
常规的ROS(ReactiveOxygenSpecies)检测方法--如化学发光法等，存在着各种的缺陷，而新开发出的荧光探针技术有着操作简便，可在单细胞水平对细胞内活性氧进行定位定量的动态监测等优势。
本研究以拟南芥根部为材料，通过暗孵育把H2DCF-DA荧光染料导入到拟南芥根尖细胞中，利用激光共聚焦扫描显微镜观察蓝光诱导下的拟南芥根尖细胞活性氧的变化，以期探讨不同磷浓度诱导下活性氧的产生，具体步骤如下：
步骤一：将拟南芥WT、OXSPX1灭菌后播种在1/2MS培养基中；
步骤二：培养14天后，将幼苗分别移到3种磷浓度的MS培养基中(-P，6.25μMKH2PO4；+P，625μMKH2PO4；4×P，2500μMKH2PO4)培养2天；
步骤三：将处理后的幼苗浸泡在30μmol/L的H2DCF-DA荧光染料溶液中孵育15分钟～20分钟，随后用缓冲液漂洗2次～3次；
步骤四：迅速转移到激光共聚焦扫描显微镜下观察，设定吸收滤色镜选用500–550nm，叶绿体自发荧光(激发波长为488nm)，实验中每个结果重复3次～6次。
如图10所示，发现在正常磷和低磷条件下，OXSPX1根尖中的绿色荧光的亮度和荧光值明显比WT高，也就是说其根尖组织中积累了大量的过氧化氢，说明过表达GmSPX1会导致拟南芥体内活性氧的大爆发。
实施例8：GmSPX1的亚细胞定位
(1)GmSPX1的亚细胞定位所使用的载体为pJIT-166-GFP，pJIT-166-GFP-GmSPX1载体的构建方法为双酶切法，设计特异性引物，加HindIII、BamHI酶切位点和保护碱基。
特异性引物为：
SeqIDNO.11：上游引物如下
5’-CCCAAGCTTATGAAGTTTGGGAAGAGACTCAAGC-3’；
SeqIDNO.12：下游引物如下
5’-CGCGGATCCAGGGAGGAGGAAAATGGAAAT-3’；
经过PCR反应程序及PCR产物回收，然后对PCR产物回收和空载pJIT-166-GFP进行双酶切，回收纯化正确的片段进行连接。将反应液转化大肠杆菌，挑取单菌落，培养后进行测序，选取正确测序结果提取质粒，获得pJIT-166-GFP-GmSPX1质粒(如图5B所示)，并进行双酶切检测再次检验质粒是否正确，琼脂糖凝胶电泳获得了与目的基因大小一致的条带，证实实验结果真实可信(如图3C所示)。
(2)使用基因枪轰击洋葱内表皮和PEG转化拟南芥原生质体两种方法来探究GmSPX1在植物细胞中的定位。
A.基因枪转化洋葱表皮法，具体步骤如下：
步骤一：使用新鲜洋葱，将其鳞茎切成适量大小，剥取内表皮迅速贴到等渗的MS培养基上，倒置25℃暗培养过夜；
步骤二：制备微弹：在1.5mL的无菌离心管中加入8.5μL金粉，涡旋2min，使其均匀悬浮；在该管中依次加入5μL质粒DNA(1μg/μL)，10μLCaCl2(2.5M)，4μL亚精胺(0.1M)，涡旋2-3min充分混匀，4℃静置10min；10000rpm离心10s，弃上清，加入140μL70％乙醇，涡旋2min；重复上一步；加入10μL无水乙醇重悬，充分混匀；
步骤三：基因枪轰击洋葱表皮细胞，通过基因枪将包裹DNA的金粉微弹轰击至洋葱表皮细胞中，25℃暗培养20h后，将洋葱表皮置于载玻片上，使用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光的位置。
B.拟南芥原生质体转化法，具体步骤如下：
试剂配制，现用现配：
酶液：1.5％cellulaseR10，0.3％macerozymeR10，0.4M甘露醇，20MmKCl，20mMMES(PH5.7)，10mMCaCl2，0.1％BSA，溶解后用0.45μM滤膜过滤后备用，10mL酶液可酶解15片左右的叶子。
PEG4000溶液：40％PEG4000，0.2M甘露醇，100mMCaCl2，用ddH2O补齐后，在250rpm的摇床上震荡混匀10-15min，静止30min左右。
W5溶液：2mMMES(PH5.7)，154mMNaCl，125mMCaCl2，5mMKCl，溶解后用0.45μm滤膜过滤后备用。
MMG溶液：4mMMES(pH5.7)，0.4M甘露醇，15mMMgCl2，溶解后用0.45μM滤膜过滤后备用。
步骤一：分离原生质体：
选用3-4周大小还未抽苔的幼苗，剪取健康新鲜圆润的叶片，使用锋利的手术刀将叶片的叶尖和叶柄切除，然后迅速将叶片以垂直叶脉的方向切成0.5-1mm的小条，并放入酶液中(酶液用玻璃培养皿盛放，避免强光照射)，然后置于25℃摇床中，60rpm避光震荡3小时左右，直至叶片全部酶解，如有少许叶条剩余，可以用力震荡酶液以将原生质体完全释放出来。
步骤二：感受态制备：
准备灭菌的50mL圆底离心管和200目的纱布，将纱布折成漏斗状，用W5润洗后，将上述原生质体-酶液缓慢的过滤至离心管中；300g/1min离心沉淀原生质体，尽量去除上清后用5-10mL预冷的W5轻柔重悬，后在冰上静置30min；室温中，300g/5分钟离心沉淀原生质体，小心去除上清；用适量MMG溶液重悬原生质体，终浓度控制在2×105个/mL。
步骤三：质粒转化：
分别将10μg高浓度质粒(1μg/μL)加入到2mL离心管中，再缓慢加入100μL原生质体轻柔混合；缓慢加入110μLPEG溶液，轻柔弹拨离心管底至混匀；黑暗诱导转化15分钟；用室温下的W5加满离心管以稀释转化液，混匀以终止转化；300g/min沉淀原生质体，去除上清后再加1mLW5溶液清洗一次。
步骤四：原生质体孵育和镜检：
用1mLW5溶液轻柔重悬原生质体，移入0.1％BSA润洗过的24孔细胞培养板中，室温避光培养15-18小时；在激光共聚焦下观察绿色荧光在细胞中的分布。
观察结果如图11所示，a为GmSPX1-GFP在洋葱细胞中表达；b为GmSPX1-GFP在拟南芥原生质体中表达；c为空载在洋葱细胞中表达；d为空载在拟南芥原生质体中表达，可以看出GmSPX1-GFP荧光信号很强，绿色荧光遍布整个细胞内，说明GmSPX1所编码的蛋白在整个植物细胞中都有分布。

Claims (8)

1.一种大豆磷饥饿负调控基因GmSPX1，其特征在于，所述磷饥饿负调控基因GmSPX1的核苷酸序列如序列表SeqIDNO.1所示。
2.一种权利要求1所述的磷饥饿负调控基因GmSPX1所编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如序列表SeqIDNO.2所示。
3.一种含有权利要求1所述的磷饥饿负调控基因GmSPX1的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒是将权利要求1所述的磷饥饿负调控基因GmSPX1插入pEarleygate103植物过量表达载体和融合表达载体pJIT-166-GFP中而成的。
4.扩增权利要求1所述磷饥饿负调控基因GmSPX1全长或其任意片段的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物如序列表SeqIDNo.3所示，下游引物如序列表SeqIDNo.4所示。
5.权利要求1所述磷饥饿负调控基因GmSPX1或权利要求3所述重组质粒在调控大豆体内磷代谢平衡中的应用。
6.权利要求1所述磷饥饿负调控基因GmSPX1或权利要求3所述重组质粒在培育磷高效利用大豆品种中的应用。
7.一种培育转基因植物的方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述磷饥饿负调控基因GmSPX1导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物相比于目的植物全磷含量明显减少，磷饥饿相关基因显著下调。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法中磷饥饿负调控基因GmSPX1是通过权利要求3所述的重组载体导入目的植物的。
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