CN107058303B - 一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记及其应用 - Google Patents

一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术与分子标记，具体公开了一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记GmPAP14‑intron5‑36，所述功能标记正向引物序列为：5′‑ATGATTTCAGACAAACACGATTC‑3′；所述功能标记反向引物序列：5′‑ACAGCTGACGAATGCAATTTAAC‑3′。该功能标记可在磷高效大豆品种中扩增出一条241bp特异片段，而在磷低效大豆品种中扩增出一条277bp特异片段。本发明基于所述功能标记，还提供了其在判断大豆品种植酸磷利用效率方面，以及在大豆品种分子标记辅助选择育种方面的应用。

Description

一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术与分子标记，具体地说，涉及一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记。
背景技术
土壤磷有50％～80％以有机态形式存在，植酸磷占一半以上；且植酸磷大多不溶于水，不能被植物直接吸收利用(Lung et al.,2006； Bilyeu et al.,2008；George etal.,2008)。同时，每年施入土壤的大部分磷肥还会由于吸附、沉降和转化作用成为有机态形式而被固定于土壤，不能被当季植物吸收(Baeket al.,2013；Wang et al.,2013)。据统计，我国每年约施用1100万吨纯磷，占世界总用量30％左右，但磷肥当季利用率却仅有10％～15％，相当于每年约有1000万吨纯磷积累于土壤，形成植物不能直接利用的非有效态(吴平，2010)。由此可见，土壤中的总磷含量并不低，只是植物可吸收利用的有效态磷含量较低，即所谓的“遗传学缺磷”，土壤现已成为巨大的“潜在磷库”，亟待开发利用(Rose etal.,2013；Teng et al.,2013)。因此，如何充分利用土壤中的有机态磷(尤其是植酸磷)，减少外部磷肥施入量就成为磷素营养研究中的重要课题，对于提高磷肥利用效率、解决植物磷素短缺、缓解磷肥危机及减少环境磷污染等均具有重要意义。
磷利用效率是多基因控制的数量性状，通过传统育种很难达到预期的效果，分子标记辅助育种为改良作物磷利用效率提供了新的途径。分子标记作为较理想的遗传标记，能够直接反映生物个体间DNA 水平的差异(Clark et al.,1974；丁玉川等,2004；Simonset al.,2014)。诸多学者利用RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP等分子标记进行了 QTL分析，发掘了一些与目标性状连锁的分子标记(Salviet al.,2005； Wissuwaet al.,2005)。Gamuyao等发现水稻Pup1与磷利用紧密连锁，可用于分子辅助育种，并根据该位点克隆了水稻PSTOL1 (phosphorus-starvation tolerance 1)，该基因编码一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，超量表达PSTOL1显著提高水稻磷的吸收和产量，进一步证明Pup1的可靠性。有学者通过分析G19833(磷高效菜豆)和 DOR364(磷低效菜豆)发现，磷高效基因型中缺少一个酸性磷酸酶亚型，同时对二者重组自交系群体的叶片酸性磷酸酶活性分析发现，其分布接近1:1，表明该表现差异可能由单基因或单主效基因控制，同时发现F701D与叶片酸性磷酸酶活性紧密连锁(Lianget al.,2010)。 Li等根据株高、地上部鲜重、根系鲜重、根系干重、根长、叶中磷含量、根中磷含量定位了大豆磷营养效率相关性状的QTL位点(Li etal., 2005)；Zhang等对大豆磷利用相关性状进行了QTL，结果发现 Sat_183，Sat_724与大豆磷效率利用连锁(Zhanget al.,2009)。尽管 QTL定位了许多与磷利用效率相关的分子标记，然而这些标记通常与目标基因距离较远，并且评价这些标记与性状连锁的紧密程度限于作图群体，因此很少一部分用于分子辅助育种。
基因功能标记与该基因控制的性状紧密联系，通过其检测的序列多态性与表型直接相关，且与性状完全共分离。因此，该类标记用于分子标记辅助育种准确性更高。基因功能标记开发基于功能明确的基因以及该基因在品种间的等位变异(Andersenet al.,2003)。目前，基因功能标记开发已在小麦、水稻等作物深入研究。何心尧等克隆了普通小麦2A和2D染色体上PPO基因Ppo-A1与Ppo-D1全长序列，针对Ppo-D1位点等位变异Ppo-D1a和Ppo-D1b分别开发了显性标记 PPO16和PPO29，PPO16在低PPO活性品种扩增713bp条带，而PPO29在高PPO活性品种扩增490bp条带，且与PPO活性相关(He etal.,2007)。Hur等(Huretal.,2013)克隆了不同抗性水稻中Xa3，序列比对发现，序列间存在多态性，根据其多态性开发了显性功能标记BB3-RF/BB3-RR，该标记仅在抗病品系中扩增出255bp条带。
大豆基因功能标记开发鲜有报道，Juwattanasomran等根据控制大豆芳香气味GmBADH2等位变异，开发了SNP标记，该标记能够区分芳香气味品种和无芳香气味品种，同时该标记已用于分子标记辅助育种培育芳香气味大豆品种(Juwattanasomranet al.,2011；Juwattanasomranet al.,2012)。然而至今，尚无与大豆磷利用效率相关的功能标记研究报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记及其应用。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明首先提供了一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记 GmPAP14-intron5-36，所述功能标记正向引物序列为：5′ -ATGATTTCAGACAAACACGATTC-3′；所述功能标记反向引物序列：5′-ACAGCTGACGAATGCAATTTAAC-3′。
进一步地，本发明基于所述功能标记，提供了其在判断大豆品种植酸磷利用效率方面的应用。
所述应用具体为：
以待测大豆样本基因组DNA为模板，利用所述功能标记进行PCR 扩增，若扩增出241bp特异片段，则判断样本为磷高效大豆品种，若扩增出277bp特异片段，则判断样本为磷低效大豆品种。
进一步地，PCR体系为：
Figure BDA0001207633070000031
Figure BDA0001207633070000041
PCR反应程序为：95℃10min；95℃30s，53℃30s，72℃30 s，35个循环；72℃10min。
基于上述应用，本发明还进一步提供了所述功能标记在大豆品种分子标记辅助选择育种方面的应用。
进一步地，含有前述功能标记的试剂或试剂盒也在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果在于：
本发明首次公开了一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记，经过对30个大豆品种(磷高效品种17个，磷低效品种13个)进行扩增后分析扩增条带与表型性状相关性，验证了所述功能标记的可靠性。
附图说明
图1为植酸磷处理下GmPAP14基因在“中黄15”(磷高效大豆品种)与“牛毛黄”(磷低效大豆品种)根系中的差异表达结果图；其中，横坐标表示植酸磷处理天数，纵坐标表示GmPAP14在“中黄15”与“牛毛黄”根系表达量；图中：NMH为牛毛黄；ZH15为中黄15。
图2为GmPAP14z和GmPAP14n克隆电泳结果，图中：M为DNA Marker DL 10000；1为GmPAP14z扩增结果，2为GmPAP14n扩增结果。
图3为GmPAP14z和GmPAP14n序列比对结果。
图4为构建GmPAP14基因植物表达载体电泳结果；图4 ： a中： M1：DL10000；1：质粒对照；2：pBI121-GmPAP14酶切结果；图4 ： b 中：M2：DL10000；1：质粒对照；2-3：pBI121-GmPAP14z与 pBI121-GmPAP14n酶切结果。
图5为转基因拟南芥PCR检测结果图。
图6为转基因拟南芥在不同磷处理下的表型和GmPAP14相对定量分析；图6 ： a为适磷和植酸磷条件下，转基因拟南芥和野生型表型观察；图6 ： b，c为转基因拟南芥和野生型叶片长度测定观察；图6 ： d为不同磷条件下，GmPAP14在转基因拟南芥的表达分析；+Pi表示适磷处理；+Po表示植酸磷处理。
图7为转基因拟南芥酸性磷酸酶和植酸酶活性测定结果；图7 ： a为转基因拟南芥酸性磷酸酶活性测定；图7 ： b为转基因拟南芥植酸酶活性测定。
图8为转基因拟南芥干重和磷含量测定结果；图8 ： a为不同磷条件下，转基因拟南芥和野生型生物重测定；图8 ： b为不同磷条件下，转基因拟南芥和野生型磷含量测定。
图9为GmPAP14功能标记开发与大豆品种标记分型结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例
(一)GmPAP14基因分子克隆
1.基因克隆所用材料处理：选取饱满、整齐一致的大豆品种“中黄15”和“牛毛黄”种子进行催芽，催芽后选择出芽一致的材料播种于石英砂，3d后移栽至蛭石。待生长21d后取样，所取样品迅速在液氮中冷冻，-80℃超低温冰箱保存待用。
2.实时定量PCR分析所用材料处理：选取饱满、整齐一致的磷高效大豆“中黄15”和磷低效大豆“牛毛黄”种子播种于蛭石，7d后选取植株根系样品进行分析，并记为0d；随后进行2个不同磷素处理 (适磷条件为1.0mmol/L的KH2PO4，植酸磷条件为1.0mmol/L植酸磷)，并在磷处理后的7d、14d、21d、28d、35d、42d、48d、56 d、63d及70d分别取样，所取样品进行液氮冷冻，-80℃超低温冰箱保存待用。
3.大豆DNA提取：大豆植株DNA提取采用CTAB法进行。
4.大豆总RNA提取：大豆植株总RNA(适磷、植酸磷处理)提取参照TRNzol TotalRNA Reagent操作指南进行。
5.cDNA反转录合成：大豆植株总RNA经反转录后获得cDNA，合成过程参照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作指南进行。
6.PCR扩增所用引物的设计：根据大豆紫色酸性磷酸酶基因 GmPAP14(GenBankNo.JN967626)cDNA序列设计特异性引物 GmPAP14-F1、GmPAP14-R1，进行PCR扩增。其中GmPAP14-F1、 GmPAP14-R1引物序列如下：
GmPAP14-F1：5’-ATGGGTGTTGTGGAGGGTCTCT-3’
GmPAP14-R1：5’-TTAATGTGAAACATGAGCCGTGG-3’
7.GmPAP14z和GmPAP14n分子克隆：利用设计好的引物 GmPAP14-F1、GmPAP14-R1，以“中黄15”和“牛毛黄”DNA为模板进行PCR扩增，克隆GmPAP14z和GmPAP14n基因开放阅读框序列。 PCR反应体系及程序如下：
Figure BDA0001207633070000061
Figure BDA0001207633070000071
Figure BDA0001207633070000072
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段，并连接于 pMD18-T载体，反应体系如下：
PCR product 4μL
pMD18-T Vector(50ng) 1μL
10×Ligation Buffer 1μL
T<sub>4</sub>DNA Ligase 1μL
ddH<sub>2</sub>O 3μL
将上述混合液混匀后，16℃连接12h。
8.利用上述连接产物转化大肠杆菌菌株Top10，挑取阳性克隆，进行质粒提取，经酶切和测序分析，获得GmPAP14z序列，长度3040 bp，GmPAP14n序列，长度3076bp。序列如下：
大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP14基因在大豆品种“中黄15”中基因组DNA序列(GmPAP14z)，长度为3040bp，序列如SEQ ID No.1 所示。
大豆紫色酸性磷酸酶GmPAP14基因在大豆品种“牛毛黄”中基因组DNA序列(GmPAP14n)，长度为3076bp，序列如SEQ ID No.2 所示。
根据已有的GmPAP14 cDNA序列设计引物，分别扩增“中黄15”与“牛毛黄”大豆品种中的GmPAP14 gDNA序列，经凝胶电泳检测结果显示(如图2所示)，GmPAP14 DNA序列(GmPAP14 gDNA)大小约为3000bp，经回收目的片段、连接T载体、转化大肠杆菌感受态细胞Top10，筛选阳性单克隆，DNA测序分析最终获得了2个大豆品种GmPAP14 DNA序列。
(二)GmPAP14基因在不同大豆品种中的表达分析
以GmPAP14为目标基因，大豆组成型表达Actin11基因为内参对照，设计实时定量PCR引物GmPAP14-F2和GmPAP14-R2，采用
Figure BDA0001207633070000081
GreenⅠ荧光染料法进行荧光实时定量PCR，通过比较Ct进行 GmPAP14基因表达水平的相对定量分析。
GmPAP14-F2：5’-TCAAGCAGCCCCTTCATTAG-3’
GmPAP14-R2：5’-AGTTTTCCTTCGGCAATCTTC-3’
GmPAP14基因在不同大豆品种根系中的相对表达量＝2–△△CT，
其中ΔΔCt＝(CtGmPAP14–CtActin11)植酸磷处理–(Ct GmPAP14–Ct Actin11)对照处理。
由图1可见，在植酸磷处理14d～70d，中黄15GmPAP14表达量始终显著高于牛毛黄(除植酸磷处理21d二者无显著差异外)，说明GmPAP14与中黄15大豆品种磷素高效利用密切相关。
(三)GmPAP14真核表达载体构建
(1)设计带XbaⅠ/SacⅠ酶切位点引物，扩增GmPAP14c序列。引物如下：
GmPAP14-F3：5’-TCTAGAATGGGTGTTGTGGAGGGTCTCT-3’；
GmPAP14-R3：5’-GAGCTCTTAATGTGAAACATGAGCCGTGG-3’。
设计带XbaⅠ/SacⅠ酶切位点的引物，扩增GmPAP14z序列，引物如下：
GmPAP14-F4：5’-TCTAGAATGGGTGTTGTGGAGGGTCTCT-3’；
GmPAP14-R4：5’-GAGCTCTTAATGTGAAACATGAGCCGTGG-3’。
设计带BamHⅠ/SacⅠ酶切位点的引物，扩增GmPAP14n序列，引物如下：
GmPAP14-F5：5’-GGATCCATGGGTGTTGTGGAGGGTC-3’；
GmPAP14-R5：5’-GAGCTCTTAATGTGAAACATGAGCCGTGG-3’。
扩增产物与pBI121载体连接构建植物表达载体，并通过PCR、酶切、测序最终确定连接正确的单克隆，用于后续农杆菌转化。
GmPAP14c扩增体系和程序如下：
PCR扩增体系：
cDNA 1.0μL
GmPAP14-F3 1.0μL
GmPAP14-R3 1.0μL
2.5mM dNTPs 2.0μL
10×Buffer 2.0μL
LA Taq DNA polymerase 0.2μL
ddH<sub>2</sub>O 12.8μL
PCR扩增程序：
95℃ 10min
98℃ 10s
72℃ 1.5min
Go to step 2 30cycles
72℃ 10min
(2)采用QXbaI和QSacI酶切pMD-GmPAP14c和pBI121载体，反应体系如下：
QXbaI 1μL
QSacI 1μL
10×QBuffer 2μL
Plasmid 5μL
H<sub>2</sub>O 11μL
(3)酶切完成后，经电泳检测，将片段大小正确的目的条带，分别进行胶回收；利用紫外分光光度计测定其浓度，使回收的载体片段与目的片段摩尔比在1:3～1:10。将目的片段与载体片段进行连接，反应体系如下：
Figure BDA0001207633070000091
Figure BDA0001207633070000101
混匀后，16℃连接12～16h。
(4)将连接产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，菌液PCR和酶切鉴定阳性克隆，并进行测序分析，测序正确的重组子即为构建成功的pBI121-GmPAP14c载体。
(5)GmPAP14z和GmPAP14n扩增体系、扩增程序、酶切体系、连接体系参照GmPAP14c方法。
利用已有中间载体pMD19-GmPAP14与植物超表达载体pBI121，构建GmPAP14植物超表达载体。经酶切、连接、转化、筛选阳性克隆、DNA测序分析，获得了紫色酸性磷酸酶GmPAP14的植物超表达载体pBI121-GmPAP14(GmPAP14c)。根据GmPAP14z 和GmPAP14n序列，设计带有各自酶切位点的引物，通过PCR扩增、测序并与pBI121载体连接，成功构建了35s启动子驱动的 pBI121-GmPAP14z和pBI121-GmPAP14n植物超表达载体。
(四)GmPAP14基因生物学功能分析
1.拟南芥遗传转化：采用浸花法(Floral dip)将携带有 pBI121-GmPAP14c、pBI121-GmPAP14z、pBI121-GmPAP14n的农杆菌转入拟南芥Columbia生态型。
2.转基因阳性植株DNA分子鉴定：根据表达载体序列和 GmPAP14序列设计跨载体引物，PCR鉴定转基因阳性植株。阳性植株自交，植株成熟后，分单株收获种子，干燥后的种子在-20℃保存待用。引物如下：
GmPAP14-F6：5’-AGGTGGCTCCTACAAATGCC-3’；
GmPAP14-R6：5’-AGACATCGCTGTCAAGTGGC-3’。
将上述鉴定正确的含有pBI121-GmPAP14c、 pBI121-GmPAP14z、pBI121-GmPAP14n的农杆菌阳性克隆分别转化拟南芥植株，并收获转化后的种子。通过卡那霉素筛选获得抗性植株，根据GmPAP14c、GmPAP14z、GmPAP14n序列设计特异引物，进行抗性植株PCR鉴定(如图5所示)，结果表明，能够扩增出大小为400bp目的片段，与预期结果一致，证明3个表达载体均已成功转入拟南芥。通过连续自交最终获得了转GmPAP14c、 GmPAP14z、GmPAP14n T3拟南芥株系。
3.转基因阳性植株实时定量PCR分析：将转GmPAP14c、 GmPAP14z、GmPAP14n和野生型拟南芥种子分别播种于蛭石，进行适磷(KH2PO4)和植酸磷(phytate-P)处理，28d后取样，进行GmPAP14 定量表达分析，以期验证差异序列与GmPAP14转录水平的相关性。定量表达分析所用引物序列如下：
基因引物：
GmPAP14-F7：5’-ATGACAGAACCACAGCCAGAG-3’；
GmPAP14-R7：5’-ACTGGGTGCCAGTATCTGTTG-3’。
内参引物：
eEF1a-F：5’-TACCTCCCAGGCTGATTGTG-3’；
eEF1a-R：5’-GGGTTGTAGCCGACCTTCTT-3’。
磷素处理28d后观察植株结果发现，在适磷处理条件下，转GmPAP14c、GmPAP14z、GmPAP14n拟南芥植株长势与野生型对照基本一致；而在植酸磷处理条件下，转GmPAP14c、GmPAP14z、 GmPAP14n拟南芥植株长势显著优于野生型对照(见图6a)。分析转基因拟南芥叶片长度发现，植酸磷处理条件下，转GmPAP14c、 GmPAP14z、GmPAP14n拟南芥与野生型对照叶片长度存在显著差异，且按照GmPAP14c、GmPAP14z、GmPAP14n的顺序依次降低(见图6c)。通过分析转不同表达载体(pBI121-GmPAP14c、 pBI121-GmPAP14z、pBI121-GmPAP14n)拟南芥的GmPAP14表达量，结果发现，适磷处理条件下，转GmPAP14c、GmPAP14z拟南芥植株的GmPAP14表达量显著高于转GmPAP14n植株，且以转 GmPAP14c植株表达量最高；植酸磷处理条件下，与适磷处理相比，转GmPAP14c拟南芥的GmPAP14表达量提高了2.8倍，转GmPAP14z拟南芥的GmPAP14表达量提高了1.8倍，而转GmPAP14n拟南芥的 GmPAP14表达量没有明显改变。由此可见，GmPAP14gDNA序列第 5内含子36bp的等位变异在一定程度上影响了GmPAP14cDNA转录水平，即“中黄15”的GmPAP14序列中36bp缺失更利于基因的转录，增加了基因表达量。
4.转基因拟南芥阳性植株生化指标测定
将转GmPAP14c、GmPAP14z、GmPAP14n和野生型拟南芥种子分别播种于蛭石，进行适磷(KH2PO4)和植酸磷(phytate-P)处理，观察不同磷条件下拟南芥生长状态，28d后取样，进行植株酶活、干重、全磷含量分析。
(1)根系酸性磷酸酶活性测定
转基因拟南芥和野生型对照生长28d，移至2.0mL离心管(含1 mmol/Lρ-NPP，ρ-NPP为测定酸性磷酸酶活性的标准底物)，24℃生长1d，取500μL 0.5mmol/L NaOH终止反应，在410nm波长下测定其吸光值；酸性磷酸酶活性为每个植株每小时催化ρ-NPP释放ρ-NP 的数量(ρ-NP为ρ-NPP被分解后的产物)。
(2)根系植酸酶活性测定：
转基因拟南芥和野生型对照生长20d后，移至2.0mL离心管(含 1mmol/L植酸钠，植酸钠为测定植酸酶活性的标准底物)，24℃生长 2d，测定其植酸酶活性；植酸酶活性为每个植株每小时催化植酸钠释放无机磷的数量(无机磷为植酸钠被分解后的产物)。
通过分析转GmPAP14c、GmPAP14z、GmPAP14n拟南芥植株与野生型的酸性磷酸酶活性，结果表明，转GmPAP14c、GmPAP14z拟南芥酸性磷酸酶活性显著高于转GmPAP14n拟南芥与野生型对照，而转GmPAP14n拟南芥酸性磷酸酶活性显著高于野生型对照，转 GmPAP14c与GmPAP14z拟南芥间的酸性磷酸酶活性差异不显著(图7a)。转基因植株植酸酶活性分析结果显示，植酸酶活性从高到低依次为GmPAP14z、GmPAP14c、GmPAP14n、野生型，且两两之间差异均达到显著水平(图7b)。
(3)转基因阳性植株表型观察及生物重与磷含量测定
分别观察上述转基因材料和野生型对照植株在植酸磷处理下的生长情况，并收获拟南芥植株，80℃烘干，进行生物重测定，通过钼蓝分光光度法进行磷含量测定。
分析不同磷素处理条件下的转GmPAP14c、GmPAP14z、 GmPAP14n拟南芥与野生型对照的地上部干重、磷素含量，结果表明，转GmPAP14c、转GmPAP14z和转GmPAP14n拟南芥地上部干重均显著高于野生型对照，转GmPAP14c最高，转GmPAP14z与转 GmPAP14n差异不显著。转基因植株磷含量分析结果显示，适磷处理条件下，各转基因株系与野生型对照间差异不显著；而植酸磷处理条件下，3个转基因株系磷素含量均显著高于野生型对照，依次为转GmPAP14c>转GmPAP14z>转GmPAP14n>野生型，说明转GmPAP14 拟南芥增强植株对其根际周围植酸磷分解利用，且36bp序列差异影响基因功能(图8)。
(五)功能标记开发及其实用性初步验证
(1)通过基因组网站(http://www.phytozome.net/)进行 GmPAP14基因染色体定位，根据定位结果，利用DNAMAN软件进行等位基因差异位点分析。
利用大豆基因组网站(http://www.phytozome.net/)，对获得的 GmPAP14z和GmPAP14n序列进行Blast分析(如图3所示)，结果显示，其定位于大豆基因组Chr12，且在2个品种间存在序列差异，其中“中黄15”的GmPAP14z大小为3040bp，“牛毛黄”的GmPAP14n 大小为3076bp；经比较GmPAP14z与GmPAP14n发现，二者在基因的第5内含子存在一个突变位点，与GmPAP14z相比，GmPAP14n在第5内含子处存在一个36bp插入序列。
(2)根据GmPAP14z和GmPAP14n在第5内含子存在的36bp 序列差异，开发了一对特异扩增Chr12并能区分上述等位变异的共显性功能标记GmPAP14-intron5-36，标记引物如下：
GmPAP14-intron5-36F：5’-ATGATTTCAGACAAACACGATTC-3’；
GmPAP14-intron5-36R：5’-ACAGCTGACGAATGCAATTTAAC-3’。
该标记在磷高效大豆品种中扩增出一条241bp特异片段，而在磷低效大豆品种中扩增一条277bp特异片段。
(3)利用该标记扩增课题组已鉴定的30个不同磷效率大豆品种，结果表明，17个磷高效品种中有14份能够扩增出241bp片段，符合率为82.4％；13个磷低效品种中有6份能够扩增出277bp片段，符合率为46.2％。进一步利用该标记鉴定155份大豆品种，结果显示能够将供试品种划分为2种类型，一种为GmPAP14z基因型，共计118份，另一种为GmPAP14n基因型，共计37份。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记及其应用
<130> KHP161118781.4Q
<160> 20
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3040
<212> DNA
<213> GmPAP14z
<400> 1
atgggtgttg tggagggtct cttagcattg gctttggttc tgagtgtttg cgtggtgtgc 60
aatggaggct caagcagccc cttcattagg aaagttgaga agacagtgga tatgccactt 120
gacagcaatg tctttgctgt tcctcctggt tataatgctc cccagcaggt atctacctac 180
ccttctcttc ttcttcttta ctatcttcat ttttaattct ggttttctgt tagagtagag 240
agggaagtgg ttaatgatgc tttgctgccc agtgaatcaa gttctgtact tgccattaac 300
caatgagtga aatttagatg cagttttatg cttgtgtgcc attctccaat tcaaattaga 360
gtttcacttt gataatttga ggtgatgttt gatagaaatc tttattatca tcatattatc 420
caagtgaaat ttcagttctg ataccagcat agcaccaaaa acaccaatag agctacatct 480
atgctttgtg cttaaccaat tctctttcta aattcaacat ttttacattt ttgcaccctt 540
tgggattttt tctttctttg atttgaatca atggctccta tgcattaagg ttcatataac 600
gcaaggtgac cttgtgggga aagcagtgat cgtgtcatgg gtgacagtgg atgaaccggg 660
gtcgagcgaa gtgcattact ggagtgagaa cagtgacaag aagaagattg ccgaaggaaa 720
acttgttact tataggttct tcaattacac atctggtttt attcatcaca ccaccatcag 780
aaatttggag gtaattctct tttccattac tttggcttta tgctgtttat tgtccagata 840
gatgccaggc tagaatcttg tgaaagaaaa gaaaaagggc attttgcttt gtgaatcaat 900
tgttgatacg tgtgcttctt ttggggcagt acaacaccaa atactactat gaggttggac 960
ttgggaacac aacacggcag ttttggtttg tgactcctcc tgaaatcggt cccgatgtgc 1020
catatacatt tggtctcata ggtaagtgta ctattctatc aaagtaattc ggagtcactg 1080
agggggtcta gctcaactgt ctttatcacc ttgaattgtt gagcattcat cattaatttg 1140
ggaaggaaaa atgctatatg tttgtgtacc aataggccat tatgtttcct gtaaactggt 1200
ttgtctttat ttgcagggga tcttggtcag agttttgatt caaataaaac tctttctcac 1260
tatgaattga acccaagaaa aggacaaact gtactattcg ttggagacct ctcttatgcg 1320
gataactacc caaatcatga taacattagg tgggattctt ggggaaggtt tacagaaagg 1380
agtgttgctt atcaaccatg gatatggact gcaggaaacc atgaaattga ttttgctcca 1440
gaaattgtaa gcttctcata agaattgact ttattttgtt ttaactatct gagaaactct 1500
tcattctttt attttttcaa ccataaattc taaccctcgt gtaatgcatt ttcctagtcc 1560
aaattagtaa gaagtaagtt tttaacatgg atcactgctt tgttgtaggg tgaaactgta 1620
cctttcaagc cttataccca ccgttaccat gtttcttata aagcatctca aagtacttca 1680
cccttctggt attctatcaa gagagcttca gcacacatca ttgttttggc ctcatattca 1740
gcgtatggta atgctagatg tcttttgcat gatacatatt tatgtagaga gcactggctg 1800
attctatgat ttcagacaaa cacgattctg tttgtaataa tttcacctta gtgattacct 1860
atatgacttg gaaaagatca aattttactg aataatttca gttcttagat ctatatatat 1920
ctatctgtat gtatgtatgt ttccattaaa tgtggaatgt taaatatcac agacaaacac 1980
ttgccttaaa tgatctgtgc gtgtgtctgt gctaacatgt aaagttaaat tgcattcgtc 2040
agctgttctg ttactacttg gattaaatgc acacataatc tgagatatca ttgtttttaa 2100
agtggtatct cttttgttac aataatcttc cattttctca ggaaaatata caccacaata 2160
taaatggctt gaaaaggagc taccgaaagt taacaggaca gagactcctt ggttgattgt 2220
tctcatgcat tcaccttggt ataatagcta caattatcac tatatggaag gggaaacaat 2280
gagagtcatg tatgagccct ggtttgtgca gtacaaggtt gatgttgtgt ttgctggtca 2340
tgttcatgcc tatgaacgat ctgtaagtgc taaaacttgg tctcttaagc tactagcact 2400
tcaattcctc atttgaaatt tctacaacat gtttttgaaa gccgccggta tcaatcatgt 2460
atcattaggc ttgcattcaa acttgaaaag ataactgtgc aagtaaatgt cagtttctgg 2520
ccctaaaaac ttaagatgaa aataagctac aaaaatattg cacaagtaat acacttcaat 2580
aaactttttt gaatttgtat ttgattgatg agctactatg tatcaggagc gtgtttccaa 2640
tgttgcatac aatattgtaa atggtctttg tgctcctgta aatgataaat cagctcctgt 2700
atatataacc attggggatg gaggaaacct tgaaggttta gcaaccaagt aagttcatta 2760
tatgtaacat gatgagtctt gtcacatttt tttttatttt tatgcctcta agtttgatat 2820
aaatgacatg agttgcagca tgacagaacc acagccaaag tattttacat tccgagaggc 2880
cagctttgga catgccattt ttgacataac gaaccgaact catgctcact atagctggca 2940
ccgaaatcaa gatggagttg ctgtggaggc cgattccctt tggtttttca acagatactg 3000
gcacccagtt gatgattcca cggctcatgt ttcacattaa 3040
<210> 2
<211> 3076
<212> DNA
<213> GmPAP14n
<400> 2
atgggtgttg tggagggtct cttagcattg gctttggttc tgagtgtttg cgtggtgtgc 60
aatggaggct caagcagccc cttcattagg aaagttgaga agacagtgga tatgccactt 120
gacagcgatg tctttgctgt tcctcctggt tataatgctc cccagcaggt acctacctac 180
ccttctcttc ttcttcttta ctatcttcat ttttaattct ggttttctgt tagagtagag 240
agggaagtgg ttaatgatgc tttgctgccc agtgaatcaa gttctgtact tgccatcaac 300
caatgagtga aatttagatg cagttttatg cttgtgtgcc attctccaat tcaaattaga 360
gtttcacttt gataatttga gatgatgttt gatagaaatc tttattatca tcatattatc 420
caagtgaaat ttcagttctg ataccagcat agcaccaaaa acaccaatag agctacatct 480
atgctttgtg cttaaccaat tctctttcta gattcaacat ttttacattt ttgcaccctt 540
tgggattttt tctttctttg atttgaatca atggctccta tgcattaagg ttcatataac 600
gcaaggtgac cttgtgggga aagcagtgat cgtgtcatgg gtgacagtgg atgaaccggg 660
gtcgagcgaa gtgcattact ggagtgagaa cagtgacaag aagaagattg ccgaaggaaa 720
acttgttact tataggttct tcaattactc atctgggttt atacaccaca ccaccatcag 780
aaatttggag gtaattatct tttccattac tttggttcta tgctgcttat tgtccagata 840
gatgccaagc tagaagcttg ggaaagaaaa taaaaagggc attttgcttt gtgtatcaat 900
tgttgatatg tgtgcttctt ttggggcagt acaaaaccaa atactactat gaggttggac 960
ttgggaacac aacacggcaa ttttggtttg tgactcctcc tgaaattggt cctgatgtgc 1020
catacacatt tggtctcata ggtaagtgta ctattctatc aaagtaattc ggagtcactg 1080
agggggtcta gctcaattgt ctttatcacc ttgaattgtt gagcattcat cattaatttg 1140
ggaaggaaaa atgctatatg tttgtgtacc aataggccat tatgtttcct gtaaactggt 1200
ttgtctttat ttgcagggga tcttggtcag agttttgatt caaataaaac tctttctcac 1260
tatgaattga acccaagaaa aggacaaact gtactattcg ttggagacct ctcttatgcg 1320
gataactacc caaatcatga taacattagg tgggattctt ggggaaggtt tacagaaagg 1380
agtgttgctt atcaaccatg gatatggact gcaggaaacc atgaaattga ttttgctcca 1440
gaaattgtaa gcttctcata agaattgact ttattttgtt ttaactatct gagaaacttt 1500
tcattctttt attttttcaa ccataaattc taaccctcgt gtaatgcatt ttcctagtcc 1560
aaattagtaa gaagtaagtt tttaacatgg atcactgctt tgttgtaggg tgaaactgta 1620
cctttcaagc cttataccca ccgttaccat gttccttata aagcatctca aagtacttca 1680
cccttctggt attctatcaa gagagcttca gcacacatca ttgttttggc ctcatattca 1740
gcgtatggta atgctagatg tcttttgcat gatacatatt tatgtagaga gcactggctg 1800
attctatgat ttcagacaaa cacgattctg tttgtaataa tttcacctta gtgattacct 1860
atatgacttg gaaaagatca aattttactg aataatttca gttcttagat ctatatatat 1920
ctatctgtat gtatgtatgt ttccattaaa tgtggaatgt tattgtttat ctctaaagca 1980
tgatgtcggt gtccttaagt ccttgaccaa caacacttgc cttaaatgat ctgtgcgtgt 2040
gtctgtgcaa acatgtaaag ttaaattgca ttcgtcagct gttctgttac tacttggatt 2100
aaatgcacac ataatctgtg atatcattgt ttttaaagtg gtatctcttt tgttacaata 2160
atcttccatt ttctcaggaa aatatacacc acaatataaa tggcttgaaa aggagctacc 2220
gaaagttaac aggacagaga ctccttggtt gattgttctc atgcattcac cttggtataa 2280
tagctacaat tatcactata tggaagggga aacaatgaga gtcgtgtatg agccctggtt 2340
tgtgcagtac aaggttgatg ttgtgttcgc tggtcatgtt catgcctatg aacgatctgt 2400
aagtgctaaa acttggtctc ttaagctact agcacttcaa ttcctcattt gaaatttcta 2460
caacatgttt ctgaaagccg ccggtatcaa tcatgtatca ttaggcttgc attcaaactt 2520
gaaaagataa ctgtgcaagt aaatgtcagt ttctggccct aaaaacttaa gatgaaaata 2580
agctacaaaa atgttgcaca agtaatacac ttcaataaac ttttttgaat ttgtatctga 2640
ttgatgagct actatgtatc aggagcgtgt ttccaatgtt gcatacaata ttgtaaatgg 2700
tctttgtgct cctgtaaatg ataaatcagc tcctgtatat ataaccattg gggatggagg 2760
aaaccttgaa ggtttagcaa ccaagtaagt tcattatatg taacatgatg agtcttgtca 2820
tatttcttct tatttttatg cctctaagtc tgatataaat gacatgagtt gcagcatgac 2880
agaaccacag ccaaagtatt ctgcattccg agaggccagc tttggacatg ccatttttga 2940
cataacgaac cgaactcatg ctcactatag ctggcaccga aatcaagatg gagttgctgt 3000
ggaggccgat tccctttggt ttttcaacag atactggcac ccagttgatg attccacggc 3060
tcatgtttca cattaa 3076
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> GmPAP14-F1
<400> 3
atgggtgttg tggagggtct ct 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> GmPAP14-R1
<400> 4
ttaatgtgaa acatgagccg tgg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> GmPAP14-F2
<400> 5
tcaagcagcc ccttcattag 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> GmPAP14-R2
<400> 6
agttttcctt cggcaatctt c 21
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> GmPAP14-F3
<400> 7
tctagaatgg gtgttgtgga gggtctct 28
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> GmPAP14-R3
<400> 8
gagctcttaa tgtgaaacat gagccgtgg 29
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> GmPAP14-F4
<400> 9
tctagaatgg gtgttgtgga gggtctct 28
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> GmPAP14-R4
<400> 10
gagctcttaa tgtgaaacat gagccgtgg 29
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> GmPAP14-F5
<400> 11
ggatccatgg gtgttgtgga gggtc 25
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> GmPAP14-R5
<400> 12
gagctcttaa tgtgaaacat gagccgtgg 29
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> GmPAP14-F6
<400> 13
aggtggctcc tacaaatgcc 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> GmPAP14-R6
<400> 14
agacatcgct gtcaagtggc 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> GmPAP14-F7
<400> 15
atgacagaac cacagccaga g 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> GmPAP14-R7
<400> 16
actgggtgcc agtatctgtt g 21
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> eEF1a-F
<400> 17
tacctcccag gctgattgtg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> eEF1a-R
<400> 18
gggttgtagc cgaccttctt 20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> GmPAP14-intron5-36F
<400> 19
atgatttcag acaaacacga ttc 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> GmPAP14-intron5-36R
<400> 20
acagctgacg aatgcaattt aac 23

Claims (7)

1.一种与大豆植酸磷利用效率相关的功能标记GmPAP14-intron5-36，其特征在于，所述功能标记正向引物序列为：5′-ATGATTTCAGACAAACACGATTC-3′；所述功能标记反向引物序列：5′-ACAGCTGACGAATGCAATTTAAC-3′。
2.权利要求1所述功能标记在判断大豆品种植酸磷利用效率方面的应用。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，以待测大豆样本基因组DNA为模板，利用权利要求1所述功能标记进行PCR扩增，若扩增出241bp特异片段，则判断样本为磷高效大豆品种，若扩增出277bp特异片段，则判断样本为磷低效大豆品种。
4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，PCR体系为：
DNA，50ng/μL 1.0μL 10×PCR buffer，含Mg<sup>2+</sup> 2.0μL 2.5mM dNTPs 2.0μL rTaq DNA polymerase，2.5U/μL 0.2μL GmPAP14-intron5-36F，5μM 1.0μL GmPAP14-intron5-36R，5μM 1.0μL ddH<sub>2</sub>O 12.8μL
。
5.根据权利要求3或4所述应用，其特征在于，PCR反应程序为：95℃ 10min；95℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 30s，35个循环；72℃ 10min。
6.权利要求1所述功能标记在大豆品种分子标记辅助选择育种方面的应用。
7.含有权利要求1所述功能标记的试剂或试剂盒。
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