CN113801953A - 一种鲜食大豆香味性状相关的Indel/SNP分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Indel/SNP分子标记在鲜食大豆香味性状检测中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第40bp处发生11个碱基的缺失，以及36bp处AGA突变为GAG，52bp处GT突变为TC，56bp处CCG突变为AAT，62bp处TC突变为CT。本发明还提供了用于检测该Indel/SNP位点的引物序列及基于高分辨率溶解曲线(HRM)的鉴定方法，根据目标DNA序列片段溶解曲线峰的不同，可区分位点的基因型，进而判断样本香味相关功能基因GmBADH2的纯合与杂合。利用本发明所提供的Indel/SNP标记和检测方法，在鲜食大豆幼苗阶段就可以判断个体基因型，做到香味性状的早选择早淘汰，这对于提高鲜食大豆香味品质的选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测与鲜食大豆香味性状相关的GmBADH2基因纯合与杂合的Indel/SNP分子标记，属农业生物技术领域。
背景技术
鲜食大豆(又称菜用大豆、毛豆)，系鼓粒期间籽粒饱满，荚色翠绿时采青食用大豆专用型品种，它具有糯脆香甜的口感，豆荚茸毛稀疏，结荚均匀，成熟期一致，便于一次性采青，可炒食、凉拌，加工制罐或速冻加工出口。鲜食大豆营养丰富，据研究表明，鲜食大豆富含植物蛋白质、不饱和脂肪酸、植物粗纤维及人体必需的各种矿物质和维生素A、维生素C、维生素E，且所含的氨基酸种类齐全、含量丰富，营养价值高，食用口感好，是当今被公认的无公害或少污染的安全保健食品。其中，香味大豆含有类似于芳香水稻的香味，由于消费者的偏好，它在食品风味品质中起着至关重要的作用，其市场价格高于普通鲜食大豆品种。因此，选育含有芳香气味的鲜食大豆品种，成为鲜食大豆风味品质育种的重要目标。
已有研究表明，鲜食大豆中的香味与2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的含量相关。2AP是一种易挥发的天然香味化合物，在许多物种中都被检测到。但由于其含量极低、极易挥发、不稳定，使得其含量鉴定成本高、准确度低、难度大。已有研究表明，植物包括大豆中2AP的含量性状由单基因控制，其代谢途径与糖酵解和氨基酸合成途径相关；植物中调控2AP合成代谢的关键基因为 BADH2，其功能的丧失可导致2AP含量的增加；该基因的等位突变在水稻、高粱、大豆中均有发现；任何导致BADH2基因功能丧失的突变均可以改变植物体内2AP的含量。Indel(insertion-deletion插入/缺失)是指基因组同一位点的序列发生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，SNP(single nucleotide polymorphism)是指在基因组上单个核苷酸的置换、颠换、缺失和插入。 Indel/SNP标记具有遗传稳定性好、多态性高、分型系统简单等优点；。因此开发BADH2基因中的Indel/SNP标记的筛选，可以方便准确地鉴定候选个体的基因型，从而有效加快育种进程，降低育种成本。
发明内容
本发明提供了一种与鲜食大豆香味性状相关的GmBADH2基因纯合与杂合的Indel/SNP分子标记及其检测方法。
本发明对大豆基因组5号染色体的GmBADH2基因(Glyma05g01770)区段进行核苷酸多态性检测，得到一个与鲜食大豆香味性状相关的Indel/SNP分子标记，该分子标记位于GmBADH2基因的第一个外显子区，第40bp处发生1 1个碱基的缺失，以及36bp处AGA突变为GAG，52bp处GT突变为TC，56b p处CCG突变为AAT，62bp处TC突变为CT。
本发明首先提供了Indel/SNP分子标记在鲜食大豆香味性状检测中的应用，其特征在于，所述Indel分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第4 0bp处发生11个碱基的缺失，以及36bp处AGA突变为GAG，52bp处GT突变为TC，56bp处CCG突变为AAT，62bp处TC突变为CT。
另外，本发明提供了一种引物对在鲜食大豆香味性状检测中的应用，其特征在于，所述引物对的DNA序列为：
EX1-HRM-F 5’-TCTCTCCTTTGACGACAAGATGAGC-3’
EX1-HRM-R 5’-GGGTTGATGATGGGAATCCGAT-3’。
本发明的第三个目的在于提供用于判断鲜食大豆香味GmBADH2基因纯合或杂合的高分辨率溶解曲线(HRM)检测方法。
鲜食大豆香味性状检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样本基因组DNA为模板，利用引物对通过荧光定量PCR方法扩增目标序列，所述引物对的DNA序列为：
EX1-HRM-F 5’-TCTCTCCTTTGACGACAAGATGAGC-3’
EX1-HRM-R 5’-GGGTTGATGATGGGAATCCGAT-3’
(2)HRM分子标记出现在80℃的溶解曲线峰，为GmBADH2隐性纯合基因型；出现80℃和82℃的溶解曲线峰，为GmBADH2杂合基因型；出现82℃的溶解曲线峰，为GmBADH2纯合基因型。
(3)所述Indel/SNP分子标记用于判断鲜食大豆香味性状，出现在82℃的溶解曲线峰以及出现80℃和82℃的溶解曲线峰，为非香味性状大豆。出现8 0℃的溶解曲线峰，为香味性状大豆。
HRM分子标记与检测方法可在辅助选育鲜食大豆香味性状的过程中应用，通过标记检测，能够区分出鲜食大豆籽粒是否具有香味。根据HRM溶解曲线的Tm值的高低可区分位点的基因型，进而判断样本GmBADH2基因的纯合与杂合。Tm值为80℃为GmBADH2隐性纯合基因型；Tm值为80℃和82℃时，为GmBADH2杂合基因型；Tm值为82℃时，为GmBADH2纯合基因型。利用本发明所提供的HRM标记和检测方法，在鲜食大豆苗期阶段就可以判断个体基因型，做到香味性状的早选择早淘汰，这对于提高选种效率、节约育种成本，具有重要的实用价值。
附图说明
图1：SEQ ID No.1特定区域的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。
图2：HRM标记的溶解曲线图。
图3：香味性状与非香味性状特定区域多序列比对图。
图4：丹波黑和衢鲜1号测序峰图。
图5：丹波黑和衢鲜1号杂交F2代单株基因分型测序峰图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例进一步阐述本发明。
实施例1鲜食大豆香味主效基因GmBADH2的HRM分子标记检测方法
1、实验仪器设备
超低温冰箱(Thermo，美国)；高速冷冻离心机(Eppendorf，德国)；基因突变检测仪(
480Ⅱ，瑞士)；可调式微量移液器(Eppendorf，德国)；化学发光凝胶成像系统(G:BOX，中国)；电泳仪(BIO-RAD，美国)。
2、大豆基因组DNA提取
取大豆幼苗叶片，用植物基因组DNA提取试剂盒(Solarbio，中国)提取大豆全基因组DNA。提取后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量；微量核酸浓度测定仪测定DNA浓度。
3、引物设计
针对Phytozome数据库Glycine max Wm82.a2.v1基因组5号染色体的GmB ADH2基因区段设计特异性引物，引物信息见表1。扩增产物的核酸序列见SE Q ID No.1。
表格1引物信息
4、高分辨率溶解曲线(HRM)扩增
以样本DNA为模板，用
480Ⅱ进行扩增。PCR反应体系为：基因组DNA2ul，2X
480High Resolution Melting Master Mix 10u L，上下游引物(10uM)各0.2ul，Mgcl2 2ul，加水补至20uL。反应条件为：9 5℃ 10min，然后进入PCR循环，95℃10sec，57℃ 15sec，72℃ 20sec，45个循环；95℃ 1min，40℃1min，65℃至95℃持续，40℃10sec。反应完全后，经计算，确保扩增曲线及溶解曲线良好，溶解曲线结果见附图2。
5、结果与分析
该Indel/SNP位点位于大豆5号染色体GmBADH2基因的40-50bp处，此处突变引起溶解曲线的不同。经PCR扩增SEQ ID No.1序列特定区域后，非香味性状片段大小为108bp，对应溶解温度为82℃、80℃和82℃，香味性状片段大小为97bp，对应溶解温度为80℃；PCR扩增产物见图1。香味性状与非香味性状特定区域多序列比对图如图3所示。因此：若溶解曲线峰为80℃，表明该In del位点的等位基因是GmBADH2隐性纯合型；若溶解曲线峰为80℃和82℃，表明该位点等位基因是GmBADH2杂合型；若溶解曲线峰为82℃，表明该位点等位基因是GmBADH2纯合型。
6、测序验证
将三种基因型的PCR产物回收后进行DNA测序，测序峰图见图4。根据测序峰图与溶解曲线峰判断结果是一致的。
实施例2该分子标记在杂交亲本(丹波黑和衢鲜1号)的验证试验
1、试验材料及方法
丹波黑来自浙江省农科院作核所，无香味性状，衢鲜1号来自衢州市农林科学院，具有香味性状。提取丹波黑和衢鲜1号的基因组DNA，按照实施例1 中的步骤进行检测，根据溶解曲线峰判断样本基因型。
应用GC-IMS的方法对丹波黑与衢鲜1号的2AP含量进行测定，具体为：采摘新鲜豆荚，水烧开将大豆放入，水再次开后5-10min取出，去壳放入GC- IMS的孵育器中。气相色谱离子迁移谱联用仪的检测条件为：分析时间 20min，色谱柱类型为FS-SE-54-CB-1 15m ID:0.53mm，柱温60℃，漂移气流量为150mL/min，载气/漂移气为N2，IMS温度为45℃，进针体积400ul，孵育时间15min，孵育温度60℃，进样针温度为65℃，孵化转速500rpm。2AP浓度测定采用外标法。
2、结果与分析
丹波黑和衢鲜1号的HRM检测结果表明：丹波黑的溶解曲线峰为82℃，表明该位点等位基因是GmBADH2显性纯合型，衢鲜1号的溶解曲线峰为8
0℃，表明该位点等位基因是GmBADH2隐性纯合型。溶解曲线结果见图2，测序峰图见图4。丹波黑和衢鲜1号2AP含量见表2。
表2：丹波黑和衢鲜1号鲜豆中2AP含量
实施例3大豆香味相关Indel/SNP分子标记在杂交群体中的验证试验
1、试验材料及方法
以丹波黑和衢鲜1号为亲本配制杂交组合，获得杂交种子，F1代淘汰假杂种，获得F1代种子，田间播种获得F2代植株；取丹波黑和衢鲜1号杂交F2代中的117个单株，提取单株基因组DNA，按照实施例1中的步骤进行检测，根据溶解曲线峰判断样本基因型。2AP含量的测定同实施案例2。
2、结果与分析
117个F2单株中其中26个单株的熔解温度为80℃，纯合隐性基因型，其2 AP的平均含量为6.19μg/g，与亲本衢鲜1号含量相近；32个单株的熔解温度为82℃，纯合显性基因型，其2AP的含量未能检测到，与亲本丹波黑相似；59 个单株的熔解温度为80℃和82℃，杂合基因型，2AP含量未能检测到(表 3)。
表3杂交群体结果信息
针对上述HRM检测结果，将前10个样本送测序，测序结果与HRM分型结果一致，表明HRM分型准确，正确率100％，且与香味表型性状表现为共分离。表明Indel/SNP标记可以用于杂交群体和自然群体中香味性状的筛选，提高育种效率，节约育种成本。测序结果见表4，具体测序峰图结果见图5。
表4样本测序结果
以上实验表明Indel/SNP标记可以用于杂交群体和自然群体中香味性状的筛选，提高育种效率，节约育种成本。
序列表
<110> 浙江省农业科学院
<120> 一种鲜食大豆香味性状相关的Indel/SNP分子标记及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> Glyma.05G033500.1
<400> 1
atgagcatcc caattcccca tcggcagtta ttcatagacg gagactggaa agtccccgtc 60
ctcaagaatc ggattcccat catcaaccct tccacccaac acatcatcgg ggatatccca 120
gcagctacta aggaagacgt tgatctcgct gtcgctgccg ccaaagctgc cctctcccgc 180
aacaagggcg ccgattgggc ctccgcttcc ggctccgttc gggctcgcta cctccgcgcc 240
atcgctgcca agatcaccga gaaaaagcct gaactagcaa aactcgaagc tattgactgt 300
ggaaaaccgc tcgatgaagc cgcctgggac atcgacgatg ttgctggttg ctttgagttc 360
tatgctgacc ttgctgaaaa attggacgca cagcaaaagg ctcatgtgtc tcttcccatg 420
gacacattca agagttatgt tcttaaggag ccgattggag tcgttgcttt aataactcct 480
tggaattatc ctctgttgat ggctacgtgg aaggttgctc ctgctctggc ggccggctgt 540
gctgcaatat tgaagccctc tgagttggca tctgtgacat gtttggagct cgctgaaatt 600
tgcaaagaag tcgggcttcc tcctggcgtg ttgaacattc tcactggatt aggacctgaa 660
gcgggtgctc ctttagcagc tcatcccgat gtagacaaga ttgcctttac tggaagctct 720
gcaactggga gcaaaattat gacagctgca gctcagctga tcaagcctgt ttcactagag 780
cttggtggga aaagcccaat cattgttttt gaggatgttg accttgacaa ggctgctgaa 840
tggaccatat ttggttgctt ctggacaaat ggtcagatat gcagtgcaac ttcccgcctt 900
attgaaagta tagcaacaga atttttgaat aggattgtga aatgggtcaa aaacatcaaa 960
atttctgatc ccttggaaga aggttgcaga ctaggcccta ttgttagtga aggacagtat 1020
gaaaagatat tgaagtttat ctcaaatgct aagagtgagg gtgcaaccat tttgactggt 1080
gggtctcgcc cagagcatct aaagaaggga ttctttgttg accaactaga agaagtattt 1140
ggaccagttc tctgtgtaaa aacatttagc actgaggaag aagctattga tctagcaaat 1200
gacactgtat atggcttggg ttctgctgta atatcaaatg atctagaaag atgtgagcgc 1260
attactaagg cttttaaggc tggaattgtg tggattaatt gctctcaacc atgcttcact 1320
caagccccat ggggaggcat taaacgcagt ggttttggtc gtgaattagg agaatgggga 1380
cttgataatt acttgagtgt gaagcaagtg acccaatata tctctgatga accgtggggc 1440
tggtaccagt ctccttcaag gctgtga 1467
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tctctccttt gacgacaaga tgag 24
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gggttgatga tgggaatccg at 22
Claims (3)
1.一种Indel/SNP分子标记在鲜食大豆香味性状检测中的应用，其特征在于，所述Indel/SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，第40bp处发生11个碱基的缺失，以及36bp处AGA突变为GAG，52bp处GT突变为TC，56bp处CCG突变为AAT，62bp处TC突变为CT。
2.一种引物对在鲜食大豆香味性状检测中的应用，其特征在于，所述引物对的序列为：
EX1-HRM-F 5’-TCTCTCCTTTGACGACAAGATGAGC-3’
EX1-HRM-R 5’-GGGTTGATGATGGGAATCCGAT-3’。
3.鲜食大豆香味性状检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以待测样本的基因组DNA为模板，利用引物对通过荧光定量方法扩增目标序列，所述引物对的DNA序列为：
EX1-HRM-F 5’-TCTCTCCTTTGACGACAAGATGAGC-3’
EX1-HRM-R 5’-GGGTTGATGATGGGAATCCGAT-3’
(2)利用基因分型溶解曲线的温度来对样本进行香味相关功能基因GmBA DH2的基因型分析；
(3)Indel/SNP分子标记出现在80℃的溶解曲线峰，为GmBADH2隐性纯合基因型；出现80℃和82℃的溶解曲线峰，为GmBADH2杂合基因型；出现82℃的溶解曲线峰，为GmBADH2纯合基因型。
(4)所述Indel/SNP分子标记用于判断鲜食大豆香味性状，出现在80℃的溶解曲线峰，为香味性状大豆。出现82℃的溶解曲线峰以及出现80℃和82℃的溶解曲线峰，为非香味性状大豆。
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