CN113980973A

CN113980973A - 烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用

Info

Publication number: CN113980973A
Application number: CN202111189331.0A
Authority: CN
Inventors: 余婧; 雷波; 余世洲; 赵会纳
Original assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2021-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2022-01-28

Abstract

本发明公开了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用，旨在解决现有技术中缺磷土壤影响烟草生长的技术问题。本发明克隆了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明克隆的烟草NtSPX4‑1、NtSPX4‑2基因为烟草磷吸收负调控基因，NtSPX4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，可利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良，培育磷高效烟草品种。

Description

烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用

技术领域

本发明涉及烟草磷代谢技术领域，具体涉及一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用。

背景技术

磷是烟草生长发育过程中最重要的营养元素之一，参与体内多种代谢过程，缺磷会抑制细胞的分裂和增殖，造成烟株生长缓慢，根系发育不良，推迟成熟期，叶片狭小，叶色暗绿，调制后的叶片缺乏光泽，油分不足，影响主要化学成分的含量及比例，品质低劣。据调查统计，我国约有2/3的土壤缺磷，并且由于土壤对磷的强烈化学固化作用，土壤中可吸收利用的有效磷极度缺乏。

因此，通过分子手段提高烟草对磷的吸收和利用效率，具有重要的生产意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用，以期解决现有技术中缺磷土壤影响烟草生长的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明克隆了一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

植物中含有SPX结构域的蛋白质参与磷酸盐稳态，包括磷转运和对磷缺乏的适应。但目前关于SPX4基因在烟草磷吸收转运中的功能还未见报道。本发明首次发现了两个烟草磷吸收负调控基因NtSPX4-1和NtSPX4-2。

基于上述两个烟草磷吸收负调控基因NtSPX4-1和NtSPX4-2，本发明构建了一种烟草磷吸收负调控基因敲除载体，包括位于所述基因36～55 bp处的gRNA靶位点序列；所述序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明将上述烟草磷吸收负调控基因敲除载体转化宿主菌，构建了一种由所述的敲除载体构建的重组菌。

作为本发明的优选实施方式，所述重组菌为农杆菌GV3101菌株。

为改良磷高效烟草品种，本发明提供了一种敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，包括以下步骤：

（1）将所述的敲除载体构建的重组菌侵染烟草叶片；

（2）将所述侵染后的叶片转移到分化培养基上进行分化培养和筛选；

（3）将所述筛选出的分化芽转至生根培养基上成苗，即成。

作为本发明的优选实施方式，在所述步骤（2）中，所述分化培养基为添加有0.15mg·L^-1 NAA，1 mg·L^-1 6BA和500 mg·L^-1噻孢霉素的MS培养基。

作为本发明的优选实施方式，在所述步骤（3）中，所述生根培养基为添加有0.1mg·L^-1NAA和500 mg·L^-1噻孢霉素的MS培养基。

作为本发明的优选实施方式，所述MS培养基还添加有6.0～8.0 mg·L^-1潮霉素。

最后，本发明将所述的基因、载体、重组菌或方法在磷低效的烟草品种进行定向改良中应用。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

本发明克隆的烟草NtSPX4-1、NtSPX4-2基因为烟草磷吸收负调控基因，NtSPX4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，可利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良，培育磷高效烟草品种。

附图说明

图1为NtSPX4- CRISPR/Cas 9基因敲除载体结构图。

图2为NtSPX4-KO株系中NtSPX4基因突变检测结果图。

图3为不同磷浓度处理对烟苗生长发育和物质积累的影响；图中，A为磷浓度为10mmol·L^-1的高磷Hoagland溶液中烟苗生长情况；B为磷浓度为1 mmol·L^-1的标准Hoagland溶液中烟苗生长情况；C为磷浓度为0.005 mmol·L^-1的低磷Hoagland溶液中烟苗生长情况；D为不同磷浓度处理对烟苗鲜重测定柱状图。

图4为不同磷浓度处理下速效磷含量测定柱状图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的分析软件如无特别说明，均为常规软件；所涉及的方法，如无特别说明，均为常规方法。所设涉及的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。

实施例一：烟草中NtSPX4基因的克隆

根据水稻中的OsSPX4基因序列为基础，利用Primer Primer 5.0软件设计上下游引物 (F1：ATGAAATTCGGGAAAGAATTTA，R1：CTATTCTGGTGGATGGGAATCC)。以烟草（品种K326）叶片cDNA为模板进行扩增，扩增产物进行测序，获得了两条与水稻OsSPX4基因高度同源的基因序列，其编码的蛋白在N端均具有一个典型的单一的SPX结构域，分别命名为NtSPX4-1、NtSPX4-2。NtSPX4-1的CDS序列如SEQ ID NO.1所示， NtSPX4-2的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2：NtSPX4基因敲除载体NtSPX4- CRISPR/Cas 9的构建

根据NtSPX4-1和NtSPX4-2的CDS序列，在36～55 bp处设计gRNA靶位点序列（Targeting Sequence：AGAAACCCTACCCGAATGGAGGG），并添加BsaI酶切位点。化学合成靶位点序列及其反向互补序列，退火后形成Oligo二聚体，Oligo二聚体与CRISPR/Cas 9载体经BsaI酶切后进行连接，反应体系如下：CRISPR/Cas 9载体2.0 μL，Oligo二聚体1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，无菌水补充至10.0 μL，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中培养，挑选阳性菌斑，提质粒进行测序，获得NtSPX4- CRISPR/Cas 9基因敲除载体，载体如图1所示。

实施例3：NtSPX4基因敲除株系的创制

采用冻融法将NtSPX4- CRISPR/Cas 9基因敲除载体转入农杆菌GV3101菌株，烟草转化采用叶盘转化法，侵染后的叶片转移到含有6.0 mg·L^-1潮霉素的分化培养基（MS培养基+0.15 mg·L^-1 NAA+1 mg·L^-1 6BA+500 mg·L^-1噻孢霉素）上进行分化培养和筛选，分化芽转至含有8.0 mg·L^-1潮霉素的生根培养基（MS培养基+0.1 mg·L^-1NAA+500 mg·L^-1噻孢霉素）上成苗。提取潮霉素抗性植株的DNA，在靶位点上下游设计引物（F5：TCGGGAAAGAATTTACAACGC，R5：CAATTCCTGGAAGCGAATAAT）进行PCR扩增，对PCR产物进行测序筛选靶位点发生碱基突变的株系，所得NtSPX4基因敲除株系其命名为NtSPX4-KO，该株系中NtSPX4-1与NtSPX4-2均在第52 bp处插入一个碱基T，这导致了NtSPX4的移码突变，蛋白翻译提前中止（如图2所示）。

实施例4：低磷及高磷处理对NtSPX4-KO及对照株系生长发育和物质积累的影响

烟草种子消毒后，均匀等量的点在浸透蒸馏水的海绵上（30 cm×20 cm×1 cm），置于培养箱中暗培养，种子露白后进行光照培养。待烟苗长至两叶一心期时，将海绵转移至不同磷浓度的Hoagland溶液中进行培养。高磷处理（HP）中磷浓度为10 mmol·L^-1、对照处理（MP）中磷浓度为1 mmol·L^-1、低磷处理（LP）中磷浓度为0.005 mmol·L^-1，其它元素浓度保持一致。低磷处理用KCl补充溶液中的K⁺，高磷处理用NaH₂PO₄补充溶液中的Pi，调节pH至6.0。培养过程中，每天定时定量更换溶液，观察记录烟苗的生长发育状况。

如图3所示，在磷浓度为1 mmol·L^-1的标准Hoagland溶液（MP）中，NtSPX4-KO株系与对照生长发育正常，二者无明显差异；在磷浓度为10 mmol·L^-1的高磷Hoagland溶液（HP）中，NtSPX4-KO株系与对照相比生长发育受到抑制，对照茎围较粗，株高较高，叶片较大，说明高磷对NtSPX4-KO株系生长有一定抑制作用；在磷浓度为0.005 mmol·L^-1的低磷Hoagland溶液（LP）中，NtSPX4-KO株系与对照生长发育均受到抑制，发育迟缓，叶色深绿，叶片变厚，但总体上NtSPX4-KO株系株高较高，叶片数较多，叶片较大，生长势优于对照。

处理20天后，将海绵上的烟株取出称重，每个处理10个生物学重复，进行烟苗生物量的测定。如图3中D所示，对照烟苗的鲜重随着磷浓度的升高而增加，NtSPX4-KO株系在正常磷浓度下生物量积累最高，在高磷和低磷条件下生物量减少，高磷条件下NtSPX4-KO株系的生物量较对照降低了约45%左右，低磷条件下NtSPX4-KO株系的生物量较对照提高了39%左右。

如图4所示，处理20天后，每个处理取5株烟苗，混合均匀，进行有效磷含量的测定。结果表明，在低磷、高磷以及正常磷浓度处理下，NtSPX4-KO株系中可利用的有效磷含量均极显著高于对照。

综上，本发明实施例克隆的烟草NtSPX4-1、NtSPX4-2基因为烟草磷吸收负调控基因，NtSPX4基因敲除可显著提高烟株有效磷含量，促进植株生长发育和物质积累，因而，利用该基因对磷低效的烟草品种进行定向改良具有重要的生产意义。

上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

SEQUENCE LISTING

<110> 贵州省烟草科学研究院

<120> 烟草磷吸收负调控基因NtSPX4及其应用

<130> 2021

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 924

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 1

atgaaattcg ggaaagaatt tacaacgcat ttagaagaaa ccctacccga atggagggac 60

aagtatttgt gttacaagcc cttgaagaag cttctcaagc accacctccg ttctatcccg 120

gctaccggcg ataatcttcc cgacggcggt gacaatcccc ctcctcttcc tccgccgcac 180

ttgcaggact ggttcgttag aattctgaat gaggaactcg acaaattcaa cgatttctac 240

gtcgataaag aggaggaatt tattattcgc ttccaggaat tgaaggagcg aattgaaaga 300

gtgaaggaga agagtggcag agatggagtt ctcgcaaaag acagtgaatt tagtgatgag 360

atgatgggga tacgtagaga ctttgttgcc atacacgggg agatggttct tctgaaaaat 420

tacagctctc taaattttgc aggtcttgtt aagattttga agaagtttga taaacgaact 480

gggggattgt tgcgtcttcc tttcacacaa cttgctcttg atcaaccctt ctttacaacg 540

gagcctctaa atagattagt ccgtgagtgt gaggaaaatc tcgaactcct atttcctttg 600

gaagcggaag ttgttgaatc agatgctact gcagaagggc caacaggagg aactacttct 660

tatgcttcaa acatttctcc ggcattgcca cttggggaag aaaatgtgga tatatatcga 720

agtacacttg ctgcaatcaa agccattcag gggctgaaaa aggcaagctc cacatataat 780

ccactatcat tctcatatat ctttggtgac caagataatg atagcacggg cgctataacg 840

gcagagaact ctgattcaga ccagttggtt gcctctcaga atgataaaga gacagatcaa 900

gaggattccc atccaccaga atag 924

<210> 2

<211> 933

<212> DNA

<213> Nicotiana tabacum

<400> 2

atgaaattcg ggaaagaatt tacaacgcat ttagaagaaa ccctacccga atggagggac 60

aagtatttgt gctacaagcc cttgaagaag cttctcaagc accacctccg ttctagccct 120

gctaccggcg ataatcttcc cgacggcggc gacaatcccc ctcctcttcc tcctccgcct 180

cccccgcact tgcaggactg gttcgtcaga attctcaatg aggaactcaa caaattcaac 240

gatttctacg tcgataaaga ggaggaattt attattcgct tccaggaatt gaaggagcga 300

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agtgatgaga cgatgggaat acgtaaagac tttgttgcca tacacgggga gatggttctt 420

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aaacgaactg ggggattgtt gcgtcttcct ttcacacaac ttgctcttga tcaacccttc 540

tttacaacag aacctctaaa tagattagtc cgtgagtgtg aggaaaatct cgagctccta 600

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actacttctt atgcttcaaa tatttctcca gcattgccac ttggggaaga aaatgtggat 720

atatatcgaa gtacacttgc tgcaatcaaa gccattcagg ggctgaaaaa ggcaagctcc 780

acatataatc cactatcatt ctcatatatc tttggtgacc aagataatga tagcacgggc 840

gctataacgg cagagaactc tgattcagac cagttggctg cctctcagaa tgataaagag 900

acagatcaag aggattccca tccaccagaa tag 933

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

agaaacccta cccgaatgga ggg 23

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

atgaaattcg ggaaagaatt ta 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctattctggt ggatgggaat cc 22

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

tcgggaaaga atttacaacg c 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 7

caattcctgg aagcgaataa t 21

Claims

1.一种烟草磷吸收负调控基因NtSPX4，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。

2.一种烟草磷吸收负调控基因敲除载体，其特征在于，包括gRNA靶位点序列；所述序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种由权利要求2所述的敲除载体构建的重组菌。

4.依据权利要求3所述的敲除载体构建的重组菌，其特征在于，所述重组菌为农杆菌GV3101菌株。

5.一种敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求3或4所述的敲除载体构建的重组菌侵染烟草叶片；

（3）将所述筛选出的分化芽转至生根培养基上成苗，即成。

6.依据权利要求5所述的敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，在所述步骤（2）中，所述分化培养基为添加有0.15 mg·L^-1 NAA，1 mg·L^-1 6BA和500 mg·L^-1 噻孢霉素的MS培养基。

7.依据权利要求5所述的敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，在所述步骤（3）中，所述生根培养基为添加有0.1 mg·L^-1NAA和500 mg·L^-1 噻孢霉素的MS培养基。

8.依据权利要求6或7所述的敲除烟草磷吸收负调控基因的方法，其特征在于，所述MS培养基还添加有6.0～8.0 mg·L^-1潮霉素。

9.权利要求1～8任一项权利要求所述的基因、载体、重组菌或方法在磷低效的烟草品种进行定向改良中的应用。