CN106831969A

CN106831969A - 植物耐盐相关蛋白及其应用

Info

Publication number: CN106831969A
Application number: CN201710234504.3A
Authority: CN
Inventors: 李瑞芬; 张海纹
Original assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Current assignee: Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date: 2017-04-11
Filing date: 2017-04-11
Publication date: 2017-06-13

Abstract

本发明公开了一种植物耐盐相关蛋白及其应用。本发明提供了一种蛋白质，获自野大麦，命名为HbSOS1蛋白，是如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物耐盐性相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明还保护HbSOS1蛋白的编码基因(HbSOS1基因)也属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，上调HbSOS1基因的表达量能够提高生物耐盐性。同时提高HbSOS1基因、HbSCaBP4基因和HbCIPK2基因的表达量，能够更为显著的提高生物的耐盐性。本发明可以应用到植物育种中，对培育耐盐植物有着积极的作用。

Description

植物耐盐相关蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物耐盐相关蛋白及其应用。

背景技术

土壤盐渍化、干旱等逆境是植物生长、发育的主要环境限制因素。植物为了应对逆境，在长期进化过程中演化形成一套感知逆境胁迫、传导逆境信号，并在分子、细胞和生理水平上响应的精细调控机制。Ca²⁺依赖的信号途径在植物多种生物过程包括逆境胁迫响应中发挥重要作用。在解密Ca²⁺信号、应答植物逆境胁迫的过程中钙离子感受器是重要的信号传递者，调控胁迫响应基因的开与关。根据功能和结构的不同，钙离子感受器分为响应型和依赖性钙离子感受器。前者既能结合Ca²⁺，又具有激酶活性，如钙离子依赖性蛋白激酶(CDPKs)；而后者只能结合Ca²⁺，并与特异的蛋白激酶互作后才能传递钙信号，如SOS3类似钙离子感受器(SOS3-LIKE CALCIUM BINDING PROTEIN，简称SCaBP)。

野大麦(Hordeumbrevisubulatum(Trin.)Link)是禾本科大麦属一种多年生兼性盐生的优良牧草，主要分布在西西伯利亚、蒙古和我国东北、华北、新疆、西藏和内蒙等省区，是盐化和碱化草甸草原的建群种，可在含盐量0.6-1.0％的土地上良好生长，它的耐盐性可与小花碱茅等媲美，具有重要的应用和科学研究价值。但前人只局限在形态、解剖、生理等方面的研究，在抗逆调控基因的克隆与功能分析方面研究较少。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐盐相关蛋白及其应用。

本发明提供了一种蛋白质，获自野大麦，命名为HbSOS1蛋白，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与生物耐盐性相关的由序列2衍生的蛋白质。

为了使(a1)中的HbSOS1蛋白便于纯化和检测，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的HbSOS1蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(a2)中的HbSOS1蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述HbSOS1蛋白的基因(HbSOS1基因)也属于本发明的保护范围。

所述HbSOS1基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b1)编码区如序列表中序列1自5′末端第71-3490位核苷酸所示的DNA分子；

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的DNA序列杂交且编码与生物耐盐性相关蛋白的DNA分子；

(b4)与(b1)或(b2)或(b3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码与生物耐盐性相关蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

含有所述HbSOS1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体具体可为在p424pMA1载体的多克隆位点中插入了序列表的序列1自5′端第71-3490位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

所述重组表达载体具体可为将p424pMA1载体的SpeI和SalI酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列1自5′端第71-3490位核苷酸所示的双链DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护HbSOS1蛋白或HbSOS1基因在调控生物耐盐性中的应用。

本发明还保护HbSOS1蛋白或HbSOS1基因在生物育种中的应用。

所述生物育种是为了选育耐盐性高的生物。

本发明还保护培育转基因生物的方法，为方法A或方法B或方法C。

所述方法A是将HbSOS1基因导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物。

所述方法B是将HbSOS1基因和HbCIPK2基因共同导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物。

所述方法C是将HbSOS1基因、HbCIPK2基因和HbSCaBP4基因共同导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物。

所述HbCIPK2基因为编码HbCIPK2蛋白的基因。

所述HbSCaBP4基因为编码HbSCaBP4蛋白的基因。

所述HbCIPK2蛋白是由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述HbSCaBP4蛋白是由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

所述编码HbCIPK2蛋白的基因为如下(c1)或(c2)所述的DNA分子：

(c1)编码区如序列表中序列5自5′末端第68-1426位核苷酸所示的DNA分子；

(c2)序列表中序列5所示的DNA分子。

所述编码HbSCaBP4蛋白的基因为如下(d1)或(d2)所述的DNA分子：

(d1)编码区如序列表中序列3自5′末端第85-741位核苷酸所示的DNA分子；

(d2)序列表中序列3所示的DNA分子。

本发明还保护提高生物耐盐性的方法，为方法D或方法E或方法F。

所述方法D是增加目的生物中HbSOS1蛋白的表达量和/或活性，提高生物耐盐性。

所述方法E是增加目的生物中HbSOS1蛋白和所述HbCIPK2蛋白的表达量和/或活性，提高生物耐盐性。

所述方法F是增加目的生物中HbSOS1蛋白、所述HbCIPK2蛋白和所述HbSCaBP4蛋白的表达量和/或活性，提高生物耐盐性。

以上任一所述目的生物可为植物或微生物。所述微生物具体可为酵母。所述酵母具体可为酵母敏盐突变菌株AXT3K。

本发明还保护所述方法A、方法B、方法C、方法D、方法E或方法F在生物育种中的应用。

所述生物育种是为了选育耐盐性高的生物。

本发明还保护所述HbSCaBP4蛋白的应用，为如下(e1)-(e6)中的至少一种：

(e1)调控植物盐胁迫下的抗氧化性；

(e2)提高植物盐胁迫下的抗氧化性；

(e3)调控植物耐盐性；

(e4)提高植物耐盐性；

(e5)调控植物抗氧化性；

(e6)提高植物抗氧化性。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法(方法G)，是将所述HbSCaBP4基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物盐胁迫下的抗氧化性高于所述目的植物。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

本发明还保护所述方法G在生物育种中的应用。

所述生物育种是为了选育耐盐性高的生物。

以上任一所述生物可为植物或微生物。

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。所述双子叶植物可为山柑目植物。所述山柑目植物可为十字花科植物。所述十字花科植物可为南芥族植物。所述南芥族植物可为拟南芥属植物。所述所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

所述微生物具体可为酵母。所述酵母具体可为酵母敏盐突变菌株AXT3K。

本发明提供了一种HbSOS1蛋白及其编码基因，上调HbSOS1基因的表达量能够提高生物耐盐性。同时提高HbSOS1基因、HbSCaBP4基因和HbCIPK2基因的表达量，能够更为显著的提高生物的耐盐性。本发明可以应用到植物育种中，对培育耐盐植物有着积极的作用。

附图说明

图1为HbSCaBP4表达谱。

图2为HbSCaBP4在突变体sos3过表达转基因株系耐盐性分析。

图3为HbSCaBP4在野生型WT过表达转基因株系耐盐性分析。

图4为HbSCaBP4转基因株系盐胁迫后活性氧组织染色。

图5为HbSCaBP4与蛋白激酶HbCIPK2互作的鉴定。

图6为蛋白激酶HbCIPK2与Na⁺转运体HbSOS1互作的鉴定。

图7为HbSOS1表达及功能受HbSCaBP4-HbCIPK2调控的分析。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

Fe-EDTA溶液：称取7.45g Na₂-EDTA和5.57g FeSO₄.7H₂0，溶解于200mL蒸馏水中，加热搅拌使其溶解，蒸馏水定容至1L。

A-Z溶液：称取H₃B0₃2.80mg，CuS0₄·5H₂00.08mg，ZnSO₄·7H₂00.22mg，MgCl₂·6H₂081mg，HMoO·4H₂00.09mg，蒸馏水定容至1L。

1/2Hoagland培养液：0.51gKNO₃、0.82gCa(N0₃)₂、0.49g MgSO₄.7H₂0、0.136gKH₂PO₄，蒸馏水定容至1L；再加入1mL Fe-EDTA溶液；然后加入1mLA-Z溶液。

拟南芥突变体sos3：在http：//www.arabidopsis.org网站的突变体编号为CS3864。参考文献：Liu JP&Zhu J K J.An Arabidopsis mutant that requiresincreased calcium for potassium nutrition and salttolerance.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94：14960-14964；公众可以从北京市农林科学院获得。

野大麦：参考文献：Li RF，Zhang JW，Wu GY，Wang HZ，Chen YJ，Wei JH.HbCIPK2，anovel CBL-interacting protein kinase from halophyte Hordeumbrevisubulatum，confers salt and osmotic stress tolerance.Plant，Cell and Environment，2012，35(9)：1582-1600.；公众可以从北京市农林科学院获得。

哥伦比亚生态型拟南芥：参考文献：Li RF，Zhang JW，Wu GY，Wang HZ，Chen YJ，Wei JH.HbCIPK2，a novel CBL-interacting protein kinase from halophyteHordeumbrevisubulatum，confers salt and osmotic stress tolerance.Plant，Celland Environment，2012，35(9)：1582-1600.；公众可以从北京市农林科学院获得。

HbCIPK2-GFP载体：参考文献：Li RF，Zhang JW，Wu GY，Wang HZ，Chen YJ，WeiJH.HbCIPK2，a novel CBL-interacting protein kinase from halophyteHordeumbrevisubulatum，confers salt and osmotic stress tolerance.Plant，Celland Environment，2012，35(9)：1582-1600.；公众可以从北京市农林科学院获得。

p35S：GFP：参考文献：LiRF，Zhang JW，Wu GY，Wang HZ，Chen YJ，Wei JH.HbCIPK2，a novel CBL-interacting protein kinase from halophyte Hordeumbrevisubulatum，confers salt and osmotic stress tolerance.Plant，Cell and Environment，2012，35(9)：1582-1600.；公众可以从北京市农林科学院获得。

pGreen0029载体：天恩泽公司，网址：http：//www.tiandz.com/product/4017.html。

pBT3-STE载体：北京达科为公司。

pPR3-STE载体：北京达科为公司。

pUC-SPYCE载体：德国MünsterInstitut für Botanik。

pUC-SPYNE载体：德国MünsterInstitut Für Botanik。

pcDNA3.1(+)质粒：Invitrogen公司。

pDR195载体：参考文献：Rentsch，D.，Laloi，M.，Rouhara，I.，Schmelzer，E.，Delrot，S.&Frommer，W.B.V.(1995)NTR1 encodes a high affinity oligopeptidetransporter in Arabidopsis.FEBS Lett.370，264-268.；公众可以从北京市农林科学院获得。

p424pMA1载体：参考文献：Mumberg D，Müller R，Funk M.1994.Regulatablepromoters of Saccharomyces cerevisiae：comparison of transcriptional activityand their use for heterologous expression.Nucleic Acids Research 25：5767-5768.；公众可以从北京市农林科学院获得。

pYPGE15载体：参考文献：Quintero F J，Ohta M，Shi H，Zhu J-K and Pardo JM.Reconstitution in yeast of theArabidopsisSOSsignaling pathway for Nahomeostasis.PNAS，2002，99(13)：9061-9066.；公众可以从北京市农林科学院获得。

农杆菌GV3101：上海北诺生物科技有限公司，网址：http：//www.app17.com/c76211/products/d4152051.html。

酵母敏盐突变菌株AXT3K：参考文献：Quintero FJ，Ohta M，Shi H，Zhu JK，PardoJM.2002.Reconstitution in yeast of the Arabidopsis SOS signaling pathway forNa+ homeostasis.Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 99(13)：9061-9066.；公众可以从北京市农林科学院获得。

Lipofectamin^TM 2000：Invitrogen公司。

以下实施例中所涉及的HbCIPK2基因的cDNA序列如序列表中序列5所示，其中第68-1426位为编码序列(ORF)。序列5编码序列表中序列6所示的蛋白质(HbCIPK2蛋白)，由452个氨基酸残基组成。

实施例1、耐盐相关蛋白的获得

一、HbSOS1蛋白及其编码基因的获得

对野大麦基因组进行序列分析，发现一种Na⁺/H⁺转运体，将其命名为HbSOS1蛋白，如序列表的序列2所示。将编码HbSOS1蛋白的基因命名HbSOS1基因，HbSOS1基因全长cDNA如序列表的序列1所示，序列1自5’端第71-3490位为开放阅读框。

二、HbSCaBP4蛋白及其编码基因的获得

对野大麦基因组进行序列分析，发现一种钙离子感受器，将其命名为HbSCaBP4蛋白，如序列表的序列4所示。将编码HbSCaBP4蛋白的基因命名HbSCaBP4基因，HbSCaBP4基因全长cDNA如序列表的序列3所示，序列3自5’端第85-741位为开放阅读框。

实施例2、HbSCaBP4和HbSOS1表达分析及亚细胞定位

一、表达分析

1、取野大麦种子，置于去离子水中，室温浸泡12h，然后置于4℃冰箱中过夜。

2、取步骤1处理的种子，用灭菌的去离子水冲洗3遍，置放有湿润纱布的培养皿中，25℃萌芽。经过4-5天待种子大部分发芽之后，转移至灭菌的盛有1/2Hoagland培养液的玻璃瓶中(玻璃瓶用不透光的纸包住)培养(温度22-23℃，光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照12h/黑暗12h)，待幼苗长至两叶一心时取材。

3、将步骤2长至两叶一心的幼苗，分别进行如下分组处理：

组I：将幼苗置于含有350mM NaCl的1/2Hoagland培养液中，室温培养6h。

组II：将幼苗置于含有350mM甘露醇的1/2Hoagland培养液中，室温培养6h。

组III：将幼苗置于含有10％(体积百分比)PEG6000的1/2Hoagland培养液中，室温培养6h。

组IV：将幼苗置于1/2Hoagland培养液中，4℃培养12h。

对照组：将幼苗置于1/2Hoagland培养液中，室温培养6h。

4、完成步骤3中，取所述幼苗的根和叶，提取总RNA并反转录为cDNA，采用RT-PCR的方法检测HbSCaBP4和HbSOS1的表达情况(以Cyclophilin基因为内参基因)，采用引物F1和引物R1组成的引物对检测HbSCaBP4基因的表达，采用引物F2和引物R2组成的引物对检测HbSOS1基因的表达。采用引物F3和引物R3组成的引物对检测Cyclophilin基因的表达。

F1：5’-CACTGCCCTATCTCCAGGAC-3’；

R1：5’-GTGGCAGGCATGGTTCTTAT-3’；

F2：5’-CAGGGTGGIAGCAGGTGATAACT-3’；

R2：5’-TCAACAACAACAAAATATCGGTACA-3’；

F3：5’-CCTGTCGTGTCGTCGGTCTAAA-3’；

R3：5’-ACGCAGATCCAGCAGCCTAAAG-3’。

HbSCaBP4的检测结果如图1a所示。结果表明，HbSCaBP4主要在根部表达，且对高盐、模拟干旱和低温胁迫均有响应，根部表达量显著增加，特别是NaCl胁迫下根部表达量增加最大。从表达特性来看，HbSCaBP4在高盐胁迫下表达均显著增加，说明HbSCaBP4与盐胁迫有关，可能参与耐盐性调控。

HbSOS1的检测结果如图7a所示。结果表明，HbSOS1主要在野大麦根部表达，在NaCl胁迫下根部表达极显著增加。说明HbSOS1受盐胁迫表达，其功能与耐盐性调控有关。

二、亚细胞定位

1、HbSCaBP4：：GFP融合基因表达载体：将序列表的序列3自5’端第85-738位核苷酸所示的双链DNA分子插入HbCIPK2-GFP载体的BamHI和KpnII酶切位点之间，得到HbSCaBP4：：GFP融合基因表达载体(测序验证正确)。

2、取生长5周的哥伦比亚生态型拟南芥叶片，参照文献：Sheen J.SignalTransduction in Maize and Arabidopsis Mesophyll Protoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制备拟南芥原生质体。

3、取步骤1得到的HbSCaBP4：：GFP融合基因表达载体，通过PEG介导法转化步骤2制备的拟南芥原生质体，转化后的原生质体在23℃培养12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦显微镜(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)观察GFP的表达部位。

4、取p35S：GFP为阳性对照，通过PEG介导法转化步骤2制备的拟南芥原生质体，转化后的原生质体在23℃培养12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦显微镜(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)观察GFP的表达部位。

结果如图1c所示。结果表明，HbSCaBP4主要在细胞膜上表达，其定位与功能直接相关。

实施例3、HbSCaBP4基因在调控植物耐盐性中的应用

一、转基因株系的获得

1、pGreen0029-HbSCaBP4过表达载体：将序列表的序列3自5’端第85-741位核苷酸所示的双链DNA分子插入pGreen0029载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到pGreen0029-HbSCaBP4过表达载体(测序验证正确)。

2、将步骤1制备的pGreen0029-HbSCaBP4过表达载体导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌HbSCaBP4。

3、采用蘸花法(方法参照文献：Clough S.J.&BentA.F.，1998.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.The Plant Journal 16,735-743)用步骤2得到的重组农杆菌HbSCaBP4侵染哥伦比亚生态型拟南芥，得到T₀代种子。在含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上进行筛选，在T₃代得到野生型转HbSCaBP4基因纯合株系。

4、采用蘸花法(方法参照文献：Clough S.J.&BentA.F.，1998.Floral dip：asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.The Plant Journal 16,735-743)用步骤2得到的重组农杆菌HbSCaBP4侵染拟南芥突变体sos3，得到T₀代种子。在含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上进行筛选，在T₃代得到突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系。

5、采用pGreen0029载体替代pGreen0029-HbSCaBP4过表达载体，按照步骤2-3进行操作，得到野生型转空载体拟南芥。

6、采用pGreen0029载体替代pGreen0029-HbSCaBP4过表达载体，按照步骤2和4进行操作，得到突变体sos3转空载体拟南芥。

二、转基因株系检测

待测材料为：哥伦比亚生态型拟南芥(WT)种子、拟南芥突变体sos3种子、野生型转HbSCaBP4基因纯合株系(4W-47、4W-12、4W-61)的T₃代种子、突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系(4s-21、4s-116、4s-119)的T₃代种子、野生型转空载体拟南芥的T₃代种子、突变体sos3转空载体拟南芥的T₃代种子。

1、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于含有不同浓度(0mM、100mM、125mM、150mM)NaCl的MS平板上，22-23℃培养2天(光照强度2000μmol m^-2s^-1，光照16h/黑暗8h)，再垂直放置生长7天，记录各株系发芽率。

2、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于MS平板上培养，取发芽5天的幼苗，转接至含有不同浓度(0mM、100mM、125mM、150mM、175mM)NaCl的MS平板上，垂直生长2周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)后观察幼苗的生长状况，统计幼苗的主根长和侧根数。

3、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于营养钵(1质量份花卉土和1质量份跖石混合)，温室中生长3周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)，选取生长状态一致的幼苗进行如下分组处理：

盐处理组：第1天：每钵浇30mL含有50mM NaCl的蒸馏水；第3天：每钵浇30mL含有100mM NaCl的蒸馏水；第5天：每钵浇30mL含有150mM NaCl的蒸馏水；第7天：每钵浇30mL含有200mM NaCl的蒸馏水；第9天：每钵浇30mL含有250mM NaCl的蒸馏水。

对照组：第1天：每钵浇30mL蒸馏水；第3天：每钵浇30mL蒸馏水；第5天：每钵浇30mL蒸馏水；第7天：每钵浇30mL蒸馏水；第9天：每钵浇30mL蒸馏水。

第16天，记录各株系萎蔫和抽苔实情况，并拍照。

4、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于MS平板上，发芽后垂直放置生长2周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)，然后转移至含有不同浓度(0mM、125mM)NaCl的MS平板上1周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)。观察幼苗表型，收集根部和茎叶，用去离子水冲洗5次，吸干，记录鲜重，用日立Z-8000原子吸收仪测定Na⁺、K⁺含量(单位：mg·g^-1DW)。

5、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于MS平板上，发芽后垂直放置生长3周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)，采用Northern blotting检测HbSCaBP4表达情况：提取总RNA，1％甲醛变性凝胶电泳、转膜；扩增HbSCaBP4基因完整CDS序列为探针；参照Dig Dection starter Kit II(Roche，11585614910)操作说明，洗膜和免疫学检测；杂交膜直接在光学成像系统(FUJI LAS-4000，Japan)曝光拍照。

6、取待测种子(每个株系60粒)消毒处理后，接种于MS平板上，发芽后垂直放置生长2周(22-23℃、光照强度2000μmol m-2s-1，光照16h/黑暗8h)，然后转移至含有150mMNaCl的MS平板上处理60h，分别取幼苗和叶片进行活性氧染色：放入25mMHEPES缓冲液(pH 7.6，含0.1mg/mL四唑氮蓝NBT)中染色，反复抽真空3次，静置过夜；第二天倒掉染液，加入95％(体积百分比)乙醇水溶液，煮沸脱色至叶绿素去除，观察。

突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系检测结果如图2所示。图2a为步骤5的检测结果。图2b为步骤1的检测结果。图2c为步骤2的表型观察结果。图2d为步骤3的表型观察结果。图2e和图2f为步骤2的检测结果。图2g和图2h为步骤4的检测结果。

结果表明，在不含NaCl的培养基上，突变体sos3转HbSCaBP4株系与突变体sos3的发芽率均为100％，但在含100-125mM NaCl的MS平板上，转基因株系发芽率显著高于突变体sos3的发芽率(图2b)。当转基因株系生长5天后转移至含0、100、125、150和175mM NaCl的MS平板上垂直生长7天，在不含NaCl的平板上各转基因株系与突变体sos3间在主根长和侧根数方面均没有差别，而在含100-175mM NaCl平板上的转基因株系能够生长，但突变体sos3不能生长，主要表现在主根长和侧根数均显著高于亲本(图2c、e-f)；转基因株系的K+含量也显著高于突变体sos3的含量，相反，转基因株系的Na⁺则显著低于突变体sos3(图2g-h)。温室盆栽生长3周的转基因株系在250mM NaCl胁迫1周后生长势优于对照突变体sos3，其叶片萎蔫率低于突变体sos3(图2d)。突变体sos3转空载体拟南芥与突变体sos3表型和各检测结果均无显著性差异。结果证明HbSCaBP4可以互补拟南芥突变体的敏盐性。HbSCaBP4主要在根部发挥耐盐调控作用。

野生型转HbSCaBP4基因纯合株系检测结果如图3所示。图3a为步骤5的检测结果和步骤2的表型观察结果。图3b为步骤3的检测结果。

结果表明，在不同含NaCl平板上转基因株系的根长与野生型差别不明显，但是在高浓度NaCl(150-175mM)胁迫下转基因株系侧根数极显著高于野生型的侧根数，侧根密度也显著高于野生型。

图4为突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系和野生型转HbSCaBP4基因纯合株系盐胁迫后活性氧染色结果。结果表明，突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系比突变体sos3染色浅，野生型转HbSCaBP4基因纯合株系比野生型染色浅，野生型转HbSCaBP4基因纯合株系与突变体sos3转HbSCaBP4基因纯合株系相比，染色浅一些，突变体sos3的染色最深，染色浅说明胁迫后产生的活性氧较少，相反则活性氧多。由此，进一步表明在盐胁迫下，HbSCaBP4可提高植株的抗氧化能力。

综上表明，HbSCaBP4可以调控植物的耐盐性。

实施例4、HbSCaBP4与蛋白激酶HbCIPK2相互作用分析

一、酵母双杂交实验

1、pBT3-STE-HbCIPK2载体：将序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的双链DNA分子插入pBT3-STE载体的SfiI酶切位点之间，得到pBT3-STE-HbCIPK2载体(测序验证正确)。

2、pPR3-STE-HbSCaBP4载体：将序列表的序列3自5’端第85-741位核苷酸所示的双链DNA分子插入pPR3-STE载体的SfiI酶切位点之间，得到pPR3-STE-HbSCaBP4载体(测序验证正确)。

3、根据酵母双杂交试剂盒DUA Lmembrane starter kits(Switzerland，P01201-P01229)操作说明，以步骤1构建的pBT3-STE-HbCIPK2载体为诱饵载体，采用步骤2构建的pPR3-STE-HbSCaBP4载体为捕获载体，转化酵母NMY51菌株(试剂盒中提供)，观察菌斑生长情况，同时根据操作说明进行β-Gal染色分析。采用试剂盒中提供的阳性对照载体作为阳性对照。设置采用pPR3-STE载体为捕获载体的阴性对照。

结果如图5a所示。酵母菌斑在选择性培养基梯度稀释生长和β-Gal染色分析结果表明，HbSCaBP4与HbCIPK2互作。

二、双分子荧光互补实验(BiFC)

1、HbSCaBP4：：SPYCE融合基因载体：将序列表的序列3自5’端第85-741位核苷酸所示的双链DNA分子插入pUC-SPYCE载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，得到HbSCaBP4：：SPYCE融合基因载体(测序验证正确)。

2、SPYNE：：HbCIPK2融合基因载体：将序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的双链DNA分子插入pUC-SPYNE载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，得到SPYNE：：HbCIPK2融合基因载体(测序验证正确)。

3、取生长5周的哥伦比亚生态型拟南芥叶片，参照文献：Sheen J.SignalTransduction in Maize and Arabidopsis Mesophyll Protoplasts[J].PlantPhysiology，2001，127(4)：1466-1475.中的方法制备拟南芥原生质体。

4、取步骤1得到的HbSCaBP4：：SPYCE融合基因载体和步骤2得到的SPYNE：：HbCIPK2融合基因载体进行分组，通过PEG介导法转化步骤3制备的拟南芥原生质体，转化后的原生质体在23℃培养12-18h，然后使用Confocal激光共聚焦显微镜(Nikon，TE2000-E/C1，Japan)观察。

组I：5μgHbSCaBP4：：SPYCE融合基因载体和5μg SPYNE：：HbCIPK2融合基因载体；

组II：5μg pUC-SPYCE载体和5μg SPYNE：：HbCIPK2融合基因载体。

结果图5b所示。结果表明，HbSCaBP4与HbCIPK2在细胞质膜上互作。

三、免疫共沉淀(CoIP)

1、pcDNA3.1-HbSCaBP4-HA质粒：人工合成序列3所示的双链DNA分子。以所述双链DNA分子为模板，采用引物F4和引物R4进行PCR扩增，将扩增产物插入pcDNA3.1(+)质粒的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到pcDNA3.1-HbSCaBP4-HA质粒(测序验证正确)。

F4：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGCTGCG-3’：

R4：5’-GGAATTCTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTACATTTTGCTGATT-3’；

引物R4中，下划线部分为HA序列。

2、pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒：人工合成序列5所示的双链DNA分子。以所述双链DNA分子为模板，采用引物F5和引物R5进行PCR扩增，将扩增产物插入pcDNA3.1(+)质粒的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒(测序验证正确)。

F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’：

R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’：

引物R5中，下划线部分为myc序列。

3、将HEK 293T细胞接种至24孔板(每孔接种5-10×10⁴个细胞)，采用DMEM培养基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，37℃静置培养直至细胞长至40-60％。

4、完成步骤3后，取所述24孔板，进行如下分组处理：

组1：弃掉培养液，更换为DMEM培养基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，培养1h后，向每孔中加入300μL室温孵育5min后的转染复合物A，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养24h；

组2：弃掉培养液，更换为DMEM培养基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，培养1h后，向每孔中加入300μL室温孵育5min后的转染复合物B，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养24h；

组3：弃掉培养液，更换为DMEM培养基(10％胎牛血清+100μg/ml青霉素+100μg/ml链霉素)，培养1h后，向每孔中加入300μL室温孵育5min后的转染复合物C，轻微摇动细胞培养板，使之混匀，培养24h。

转染复合物A：将1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒加至150μL Lipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

转染复合物B：将1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP4-HA质粒加至150μL Lipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

转染复合物C：将1.2μg的pcDNA3.1-HbSCaBP4-HA质粒加至150μL Lipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

5、完成步骤4后，收集细胞，用冷PBS洗一遍，再用细胞裂解液[150mMNaCl，50mMTris(pH 7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm离心15min，收集上清液。

6、将步骤5的上清液进行蛋白定量，取等量的蛋白分别与小鼠单克隆HA M5抗体(1：2000，Sigma)和c-Myc抗体(1：2000，Santa Cruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A琼脂糖磁珠(GE Healthcare公司)孵育1h。然后用细胞裂解液清洗磁珠3次，结合蛋白用2×上样缓冲液(Bio-rad公司)洗脱下来，在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用相应的二抗杂交，用化学发光剂(购自Thermo公司)在X-光片上曝光。

结果如图5c所示。结果表明，免疫共沉淀(CoIP)技术从生化水平进一步证明HbSCaBP4与HbCIPK2存在互作关系。

实施例5、蛋白激酶HbCIPK2与HbSOS1蛋白相互作用

一、酵母双杂交实验

1、pBT3-STE-HbSOS1载体：将序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的双链DNA分子插入pBT3-STE载体的SfiI酶切位点之间，得到pBT3-STE-HbSOS1载体(测序验证正确)。

2、pPR3-STE-HbCIPK2载体：将序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的双链DNA分子插入pPR3-STE载体的SfiI酶切位点之间，得到pPR3-STE-HbCIPK2载体(测序验证正确)。

3、根据酵母双杂交试剂盒DUA Lmembrane starter kits(Switzerland，P01201-P01229)操作说明，以步骤2构建的pBT3-STE-HbCIPK2载体为诱饵载体，采用步骤1构建的pPR3-STE-HbSOS1载体为捕获载体，转化酵母NMY51菌株(试剂盒中提供)，观察菌斑生长情况，同时根据操作说明进行β-Gal染色分析。采用试剂盒中提供的阳性对照载体作为阳性对照。设置采用pPR3-STE载体为捕获载体的阴性对照。

结果如图6a所示。酵母菌斑在选择性培养基梯度稀释生长和β-Gal染色分析结果表明，HbSOS1与HbCIPK2互作。

二、免疫共沉淀(CoIP)

1、pcDNA3.1-HbSOS1-Flag质粒：人工合成序列1所示的双链DNA分子。以所述双链DNA分子为模板，采用引物F6和引物R6进行PCR扩增，将扩增产物插入pcDNA3.1(+)质粒的KpnI和XhoI酶切位点之间，得到pcDNA3.1-HbSOS1-Flag质粒(测序验证正确)。

F6：5’-GGGGTACCGCCACCATGGAGGAGG-3’；

R6：5’-GCTCTAGATTACTTGTCATCGTCTTTGTAGTCCATGTTGCCTCGT-3’：

引物R6中，下划线部分为Flag序列。

F5：5’-CGGGATCCGCCACCATGGGGGAGC-3’；

R5：5’-GGAATTCTTACAGGTCCTCCTCTGAGATCAGCTTCTGCATTGATGCCATACATGGTTGC-3’：

引物R5中，下划线部分为myc序列。

4、完成步骤4后，取所述24孔板，进行如下分组处理：

转染复合物A：将1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒加至150μLLipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

转染复合物B：将1.2μg的pcDNA3.1-HbCIPK2-myc质粒和1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag质粒加至150μL Lipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

转染复合物C：将1.2μg的pcDNA3.1-HbSOS1-Flag质粒加至150μLLipofectamin^TM2000中，轻微吹打混匀。

5、完成步骤4后，收集细胞，用冷PBS洗一遍，再用细胞裂解液[150mM NaCl，50mMTris(pH 7.6)，1％(v/v)NP40，10％(v/v)甘油]裂解30min，4℃、12000rpm离心15min，收集上清液。

6、将步骤5的上清液进行蛋白定量，取等量的蛋白分别与Flag抗体(1：2000，SantaCruz)和c-Myc抗体(1：2000，Santa Cruz)在4℃孵育3h，然后4℃添加蛋白G/A琼脂糖磁珠(GE Healthcare公司)孵育1h。然后用细胞裂解液清洗磁珠3次，结合蛋白用2×上样缓冲液(Bio-rad公司)洗脱下来，在12％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，转移至硝酸纤维素膜上，用相应的二抗杂交，用化学发光剂(购自Thermo公司)在X-光片上曝光。

结果如图6b所示。结果表明，免疫共沉淀(CoIP)技术从生化水平进一步证明HbSOS1与HbCIPK2存在互作关系。

实施例6、HbSCaBP4、蛋白激酶HbCIPK2和HbSOS1蛋白调控耐盐性

1、p424pMA1载体：以pDR195载体为模板，采用引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R进行PCR扩增，采用扩增产物取代p424GALL载体SacI和XbaI酶切位点之间的片段，得到p424pMA1载体(测序验证正确)。

pMA1-SacI-F：5’-TGAGCTCCCTGAAACGGAGAAACATAAAC-3’；

pMA1-XbaI-R：5’-CTCTAGAGCTGGGGTATATTTTTTTTCTTTCTTTTG-3’；

引物pMA1-SacI-F和引物pMA1-XbaI-R中，下划线部分分别为SacI和XbaI酶切位点。

2、p424pMA1-HbSOS1载体：将序列表的序列1自5’端第71-3490位核苷酸所示的双链DNA分子插入步骤1制备的p424pMA1载体的SpeI和Sa1I酶切位点之间，得到p424pMA1-HbSOS1酵母表达载体(测序验证正确)。

3、pDR195-HbCIPK2载体：将序列表的序列5自5’端第68-1426位核苷酸所示的双链DNA分子插入pDR195载体的XhoI和BamHI酶切位点之间，得到pDR195-HbCIPK2酵母表达载体(测序验证正确)。

4、pYPGE15-HbSCaBP4载体：将序列表的序列3自5’端第85-741位核苷酸所示的双链DNA分子插入pYPGE15载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间，得到pYPGE15-HbSCaBP4酵母表达载体(测序验证正确)。

5、将载体分组转化至酵母敏盐突变菌株AXT3K中，对于单个质粒转化的在单缺选择培养基(SD/-Trp，Clontech公司)上培养至菌液OD_600nm＝0.8；对于两个以上质粒转化的在双缺选择培养基(SD/-Trp-Ura，Clontech公司)上培养至菌液OD_600nm＝0.8。将菌液离心，将沉淀用无菌水洗涤3次，最后重悬于无菌水中，按10倍梯度稀释，分别取3μL原液和各稀释液滴在含有不同浓度(0mM、75mM、100mM)NaCl的AP培养基(10mM精氨酸、8mM磷酸、2％葡萄糖、2mM MgSO₄、1mMKCl、0.2mM CaCl₂，500ng/ml H₃8O₄，50ng/ml CuSO₄，100ng/ml KI，400ng/mlMnSO₄，200ng/ml Na₂MoO₄，400ng/ml ZnSO₄，10ng/ml生物素，0.4ng/ml烟草酸，2ug/ml肌醇，0.4ng/ml泛酸钙)上，在30℃培养3天观察菌斑生长情况。

组I：5μgp424pMA1载体；

组II：5μgp424pMA1-HbSOS1载体；

组III：5μgpDR195-HbCIPK2载体和5μgp424pMA1-HbSOS1载体；

组IV：5μgpYPGE15-HbSCaBP4载体、5μgpDR195-HbCIPK2载体和5μgp424pMA1-HbSOS1载体；

结果如图7b所示。将HbSOS1单独在AXT3K突变体中表达后可以在含75mM NaCl的AP平板上生长，而转空载体的菌株不能生长。HbSOS1与HbCIPK2组合表达与HbSOS1单独表达没有差别。HbSCaBP4组合HbCIPK2、HbSOS1表达后，该菌株不仅在含75mM NaCl的AP平板上生长，还可以在含100mM NaCl平板上生长。

<110> 北京市农林科学院

<120> 植物耐盐相关蛋白及其应用

<160> 6

<210> 1

<211> 3652

<212> DNA

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agtacatggg gactgaaaga gcagtccacc tcgcctcatc 60

cacgccggcg atggaggagg aggccggcgc cccgagcccc gacgacgccg tgctcttctt 120

cggggtgtcc ctcgtgctgg gcatcgcctc ccgccacctc ctccgcggca cccgcgtccc 180

ctacaccgtc gccctcctcg tcctcggcgt cgccctcggc ggcctcgagt acgggaccaa 240

gcacggcctg ggcaagctcg gaaatggcat tcgcatctgg gcggccataa atcccgatct 300

acttctggcc gttttcctcc ccgccctcct cttcgaaagc tccttctcaa tggaagtcca 360

ccaaatcaag aaatgcatgg cacagatggt gttacttgct gttccaggtg tggtgatctc 420

aacagttttg cttggcactg ctgtaaagct tacttttcca tacgactgga actggaaaac 480

atcgttcttg tttagtggac tgcttagtgc aacagaccct gttgctgtgg tcgctcttct 540

aaaagatcta ggagcaagca aaaagctcag tacaataatt gaaggagaat ccttaatgaa 600

tgatgggact gctattgttg tctatcagtt attctatcga atggtgcttg gaagaacttt 660

tgatgcaggg tccataatta agttcttgtc agaagtttca cttggagctg ttgctctagg 720

ccttgcattt ggagttgcat cagtattatg gctgggattt attttcaatg atacaatcat 780

agagatttca cttacccttg ctgtcagcta tattgctttc ttcactgcgc aagatgcatt 840

ggagatctct ggtgttttgg ccgtcatgac cttggggatg ttctatgctg ctttcgcaaa 900

aactgctttt aagggtgaca gccaggaaag tttgcatcat ttctgggaaa tggtggctta 960

cattgcgaac acacttattt tcatactgag tggggttgtt attgcagatg gtgtactaca 1020

agataatatt cattttgaga ggcatggcac atcatggggg ttccttcttc tgctctatgt 1080

gtttgtgcaa atatcgcgtg ctgtagttgt cggtgttttg tatccattat tgagtcactt 1140

tggatatggt atggacgtca aagaagccac agttcttgtt tggtcagggc tgcgaggggc 1200

tgttgctcta tcactctctc tgtctgttaa acgtgctagt gattcagttc aatcttatct 1260

gaaaccagaa gttggaacaa tgtttgtgtt cttcacaggt ggtatcgtgt ttctgacatt 1320

gattttgaat ggttccacca cacaattttt gttgcacctg cttggcttgg gaaaattgtc 1380

agcaacaaag cttcgtgtat tgaagtatac acggtatgaa atgctaaaca aggcattgga 1440

ggcttttggt gatctcaggg atgatgagga acttgggcct gctgattgga ttactgtgaa 1500

gaaacatatc acatgtttga ataacttgga agatgaacaa gcacatcccc atgatgttcc 1560

tgacaaggat gatcacgtac ataccatgaa tttggaggat actcgagtgc ggcttttgaa 1620

tggtgtgcaa gctgcttact ggggaatgct tgaagagggg cgaataactc aatctacagc 1680

aaatatgtta atgagatcgg ttgatgaggc tatggatctt gtttctagcc aatcattatg 1740

cgactggaat ggtttgcggt ccagtgttca tttcccaaag tattataggt tccttcagat 1800

gagcagattg ccacgaaagc ttgtcacata cttcacggta gaaagattgg agttaggatg 1860

ttacatctgt gcggcatttc tccgtgctca tagaatcgcg aggagacaac tacatgattt 1920

tcttggtgat agtgatattg caagaatcgt catcaatgaa agtaccgctg cgggggagga 1980

agctaaaaag tttctggaag atgttcgtgt tacatttcct caggtgcttc gtgtattaaa 2040

gactcgacaa gtaacttatg cggtattgac acacttgagc gagtatattc aagacctcgg 2100

gaagacaggg ttgctcgagg aaaaggaaat agttcatctc gatgatgctt tgcagacaga 2160

cttgaagaaa cttaagagga acccaccact ggtgaaaatg ccaagaatta gcgaacttct 2220

aaacacccat cctttagttg gtgcactgcc tgctgctgct cgtgatccgt tattaagtaa 2280

tacaaaagaa tcaataaaag tacatggaac gatcctttac agagaaggct caaggccgac 2340

tggtatatgg cttgtttcga ctggaattgt aaagtggaca agtcagagac tcagcaccag 2400

gcattcactg gatccaatat tgtcacatgg aagtactttg ggtctatacg aggcattaat 2460

tggaaagcca tatatttgtg acattattac agaatcggtg gtgcattgtt tcttcattga 2520

agcggagaaa atagagcaac tgcgccagtc tgatccttct attgaggatt tcatgtggca 2580

ggaaagtgct ctagttattg caaggatgtt tctcccccag atatttgaga aaatggcaat 2640

gcgtgagatg agggttctca tttctgaaag atccagtatg aaaatctaca ttaagggtga 2700

agacattgaa ctcgggccta attacatcgg catcttattg gaaggattcc tgaagacaga 2760

gaaccgaaat tcgatcaaac atccagctgt gctgctgccg tcgaacactg atttgaattc 2820

atttggcttg cagtcttcag ccttgaacat tatagactac tgctatactg catcgagtta 2880

tcaggtggaa gctagatcaa gggctatctt gtttgaaata gggagggccg atatggaagc 2940

cgatgtacaa agaagtgcat caatgctgtc tcccaccctt ggaccaccac gaacgcagag 3000

caaggagcat gttggtttgc tcaggtggcc ggaaaattct gggagatcca gagggcctgg 3060

aaatccaagc ttagctgaaa tcagaaacca gcctggtaac ttctctgcta aagccttgca 3120

agtcagcatg tacgggggca tgatggatga catgctccct gctcagcggc ggcaaccgag 3180

gtttgatcat gtagaaggaa accagaagca cagcttatcc tatccagagg tgccttcaag 3240

ggcatccaac acgcggtctc tgctttctgt gaagtcggcg ggtcccagtg tgatgaacag 3300

aaaatctgct cccgctcaag ctccggctcc tgagattgcc cccttttcac cccaagcagc 3360

tggccgggta cgcagggtgg tagcaggtga taactcgagt gacgattccg agggggaaga 3420

cgttgtcaga gtggactctc ccggcatgct ctctctccat ccaccctctg gcccacgacg 3480

aggcaactga cggatgcagc atgtaccgat attttgttgt tgttgaataa gaacttccaa 3540

aaaatggcag catgtatatc tctatatgtg taaaatatac gataataaca tcttttgtgg 3600

aacttgaggg tgcaaagttg gtggcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 3652

<210> 2

<211> 1139

<212> PRT

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 2

Met Glu Glu Glu Ala Gly Ala Pro Ser Pro Asp Asp Ala Val Leu Phe

1 5 10 15

Phe Gly Val Ser Leu Val Leu Gly Ile Ala Ser Arg His Leu Leu Arg

20 25 30

Gly Thr Arg Val Pro Tyr Thr Val Ala Leu Leu Val Leu Gly Val Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Leu Glu Tyr Gly Thr Lys His Gly Leu Gly Lys Leu Gly

50 55 60

Asn Gly Ile Arg Ile Trp Ala Ala Ile Asn Pro Asp Leu Leu Leu Ala

65 70 75 80

Val Phe Leu Pro Ala Leu Leu Phe Glu Ser Ser Phe Ser Met Glu Val

85 90 95

His Gln Ile Lys Lys Cys Met Ala Gln Met Val Leu Leu Ala Val Pro

100 105 110

Gly Val Val Ile Ser Thr Val Leu Leu Gly Thr Ala Val Lys Leu Thr

115 120 125

Phe Pro Tyr Asp Trp Asn Trp Lys Thr Ser Phe Leu Phe Ser Gly Leu

130 135 140

Leu Ser Ala Thr Asp Pro Val Ala Val Val Ala Leu Leu Lys Asp Leu

145 150 155 160

Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Thr Ile Ile Glu Gly Glu Ser Leu Met

165 170 175

Asn Asp Gly Thr Ala Ile Val Val Tyr Gln Leu Phe Tyr Arg Met Val

180 185 190

Leu Gly Arg Thr Phe Asp Ala Gly Ser Ile Ile Lys Phe Leu Ser Glu

195 200 205

Val Ser Leu Gly Ala Val Ala Leu Gly Leu Ala Phe Gly Val Ala Ser

210 215 220

Val Leu Trp Leu Gly Phe Ile Phe Asn Asp Thr Ile Ile Glu Ile Ser

225 230 235 240

Leu Thr Leu Ala Val Ser Tyr Ile Ala Phe Phe Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Leu Glu Ile Ser Gly Val Leu Ala Val Met Thr Leu Gly Met Phe Tyr

260 265 270

Ala Ala Phe Ala Lys Thr Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gln Glu Ser Leu

275 280 285

His His Phe Trp Glu Met Val Ala Tyr Ile Ala Asn Thr Leu Ile Phe

290 295 300

Ile Leu Ser Gly Val Val Ile Ala Asp Gly Val Leu Gln Asp Asn Ile

305 310 315 320

His Phe Glu Arg His Gly Thr Ser Trp Gly Phe Leu Leu Leu Leu Tyr

325 330 335

Val Phe Val Gln Ile Ser Arg Ala Val Val Val Gly Val Leu Tyr Pro

340 345 350

Leu Leu Ser His Phe Gly Tyr Gly Met Asp Val Lys Glu Ala Thr Val

355 360 365

Leu Val Trp Ser Gly Leu Arg Gly Ala Val Ala Leu Ser Leu Ser Leu

370 375 380

Ser Val Lys Arg Ala Ser Asp Ser Val Gln Ser Tyr Leu Lys Pro Glu

385 390 395 400

Val Gly Thr Met Phe Val Phe Phe Thr Gly Gly Ile Val Phe Leu Thr

405 410 415

Leu Ile Leu Asn Gly Ser Thr Thr Gln Phe Leu Leu His Leu Leu Gly

420 425 430

Leu Gly Lys Leu Ser Ala Thr Lys Leu Arg Val Leu Lys Tyr Thr Arg

435 440 445

Tyr Glu Met Leu Asn Lys Ala Leu Glu Ala Phe Gly Asp Leu Arg Asp

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Gly Pro Ala Asp Trp Ile Thr Val Lys Lys His Ile

465 470 475 480

Thr Cys Leu Asn Asn Leu Glu Asp Glu Gln Ala His Pro His Asp Val

485 490 495

Pro Asp Lys Asp Asp His Val His Thr Met Asn Leu Glu Asp Thr Arg

500 505 510

Val Arg Leu Leu Asn Gly Val Gln Ala Ala Tyr Trp Gly Met Leu Glu

515 520 525

Glu Gly Arg Ile Thr Gln Ser Thr Ala Asn Met Leu Met Arg Ser Val

530 535 540

Asp Glu Ala Met Asp Leu Val Ser Ser Gln Ser Leu Cys Asp Trp Asn

545 550 555 560

Gly Leu Arg Ser Ser Val His Phe Pro Lys Tyr Tyr Arg Phe Leu Gln

565 570 575

Met Ser Arg Leu Pro Arg Lys Leu Val Thr Tyr Phe Thr Val Glu Arg

580 585 590

Leu Glu Leu Gly Cys Tyr Ile Cys Ala Ala Phe Leu Arg Ala His Arg

595 600 605

Ile Ala Arg Arg Gln Leu His Asp Phe Leu Gly Asp Ser Asp Ile Ala

610 615 620

Arg Ile Val Ile Asn Glu Ser Thr Ala Ala Gly Glu Glu Ala Lys Lys

625 630 635 640

Phe Leu Glu Asp Val Arg Val Thr Phe Pro Gln Val Leu Arg Val Leu

645 650 655

Lys Thr Arg Gln Val Thr Tyr Ala Val Leu Thr His Leu Ser Glu Tyr

660 665 670

Ile Gln Asp Leu Gly Lys Thr Gly Leu Leu Glu Glu Lys Glu Ile Val

675 680 685

His Leu Asp Asp Ala Leu Gln Thr Asp Leu Lys Lys Leu Lys Arg Asn

690 695 700

Pro Pro Leu Val Lys Met Pro Arg Ile Ser Glu Leu Leu Asn Thr His

705 710 715 720

Pro Leu Val Gly Ala Leu Pro Ala Ala Ala Arg Asp Pro Leu Leu Ser

725 730 735

Asn Thr Lys Glu Ser Ile Lys Val His Gly Thr Ile Leu Tyr Arg Glu

740 745 750

Gly Ser Arg Pro Thr Gly Ile Trp Leu Val Ser Thr Gly Ile Val Lys

755 760 765

Trp Thr Ser Gln Arg Leu Ser Thr Arg His Ser Leu Asp Pro Ile Leu

770 775 780

Ser His Gly Ser Thr Leu Gly Leu Tyr Glu Ala Leu Ile Gly Lys Pro

785 790 795 800

Tyr Ile Cys Asp Ile Ile Thr Glu Ser Val Val His Cys Phe Phe Ile

805 810 815

Glu Ala Glu Lys Ile Glu Gln Leu Arg Gln Ser Asp Pro Ser Ile Glu

820 825 830

Asp Phe Met Trp Gln Glu Ser Ala Leu Val Ile Ala Arg Met Phe Leu

835 840 845

Pro Gln Ile Phe Glu Lys Met Ala Met Arg Glu Met Arg Val Leu Ile

850 855 860

Ser Glu Arg Ser Ser Met Lys Ile Tyr Ile Lys Gly Glu Asp Ile Glu

865 870 875 880

Leu Gly Pro Asn Tyr Ile Gly Ile Leu Leu Glu Gly Phe Leu Lys Thr

885 890 895

Glu Asn Arg Asn Ser Ile Lys His Pro Ala Val Leu Leu Pro Ser Asn

900 905 910

Thr Asp Leu Asn Ser Phe Gly Leu Gln Ser Ser Ala Leu Asn Ile Ile

915 920 925

Asp Tyr Cys Tyr Thr Ala Ser Ser Tyr Gln Val Glu Ala Arg Ser Arg

930 935 940

Ala Ile Leu Phe Glu Ile Gly Arg Ala Asp Met Glu Ala Asp Val Gln

945 950 955 960

Arg Ser Ala Ser Met Leu Ser Pro Thr Leu Gly Pro Pro Arg Thr Gln

965 970 975

Ser Lys Glu His Val Gly Leu Leu Arg Trp Pro Glu Asn Ser Gly Arg

980 985 990

Ser Arg Gly Pro Gly Asn Pro Ser Leu Ala Glu Ile Arg Asn Gln Pro

995 1000 1005

Gly Asn Phe Ser Ala Lys Ala Leu Gln Val Ser Met Tyr Gly Gly

1010 1015 1020

Met Met Asp Asp Met Leu Pro Ala Gln Arg Arg Gln Pro Arg Phe

1025 1030 1035

Asp His Val Glu Gly Asn Gln Lys His Ser Leu Ser Tyr Pro Glu

1040 1045 1050

Val Pro Ser Arg Ala Ser Asn Thr Arg Ser Leu Leu Ser Val Lys

1055 1060 1065

Ser Ala Gly Pro Ser Val Met Asn Arg Lys Ser Ala Pro Ala Gln

1070 1075 1080

Ala Pro Ala Pro Glu Ile Ala Pro Phe Ser Pro Gln Ala Ala Gly

1085 1090 1095

Arg Val Arg Arg Val Val Ala Gly Asp Asn Ser Ser Asp Asp Ser

1100 1105 1110

Glu Gly Glu Asp Val Val Arg Val Asp Ser Pro Gly Met Leu Ser

1115 1120 1125

Leu His Pro Pro Ser Gly Pro Arg Arg Gly Asn

1130 1135

<210> 3

<211> 1159

<212> DNA

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 3

gtagagtgcg gagcttattc tctcgcgggc aaggcgtgct gtgctcgatc ggcttagctt 60

ccgccggagc cggagaagca gcggatgggc tgcgtgtcgt cgtcgccgag gcggtccagg 120

cgcgcgccgg ggtacgagga gcccgccgtc ctcgcctccc agacctcctt cacggtgaac 180

gaggtggagg cgctctacga gctctacaag aagctcagct actccatctt caaagacggc 240

ctcatccaca aggaggagtt ccagctcgcc ctcttccgga ccagcaaagg gccgagcctg 300

ttcgccgaca gggtgttcga cctcttcgat ctgaagcgca acggggtgat cgagttcggc 360

gagttcgtgc gctcgctcag catcttccac cccaaagcgc ctgaatcgga caagaccgcg 420

tttgcattca agttgtatga tttgaggggg acaggctaca tcgagaaaga agagcttcgg 480

gagatggtgg tggcactcct cgacgagtcc gacctgtgcc tctccgatag cgccgtcgag 540

gagatcgtcg acaatacgtt cagtcaagca gactcgaatg gcgatgacag gatagacccc 600

aaggagtggg aggatttcgt caagaagaac ccagcrtcgc tcaggaacat gtcactgccc 660

tatctccagg acattacgac ggcgtttccg agcttcgtga tgcattcgga agtcgacgat 720

tacagcggaa tcagcaaata agaaccatgc ctgccacaag atccgttccg ggccatatat 780

gaatgcactg ccgggggagg ctatgcattc agaagtgcgt gagctggaac tagaaaatcc 840

ccggagctcg aaccggacga gaaaacacgg caatcaatcc ggaagccggt gagcgtgaga 900

cgatgaccgg acagacaatg acttcttgct gatgtgagat gggcgtcaga gtatgagaaa 960

ggggctctgt acctacctca agtgtgcaga gaggttatcg aaacacggag cagtgactag 1020

gcagtgagta gaggttaaca tagattgtat agatcagtaa ctgttctttt ttaataatat 1080

ggctgcatgc atcgattgat gcagaggccg ggagctttgt tcctcctttt caaaaaaaaa 1140

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1159

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 4

Met Gly Cys Val Ser Ser Ser Pro Arg Arg Ser Arg Arg Ala Pro Gly

1 5 10 15

Tyr Glu Glu Pro Ala Val Leu Ala Ser Gln Thr Ser Phe Thr Val Asn

20 25 30

Glu Val Glu Ala Leu Tyr Glu Leu Tyr Lys Lys Leu Ser Tyr Ser Ile

35 40 45

Phe Lys Asp Gly Leu Ile His Lys Glu Glu Phe Gln Leu Ala Leu Phe

50 55 60

Arg Thr Ser Lys Gly Pro Ser Leu Phe Ala Asp Arg Val Phe Asp Leu

65 70 75 80

Phe Asp Leu Lys Arg Asn Gly Val Ile Glu Phe Gly Glu Phe Val Arg

85 90 95

Ser Leu Ser Ile Phe His Pro Lys Ala Pro Glu Ser Asp Lys Thr Ala

100 105 110

Phe Ala Phe Lys Leu Tyr Asp Leu Arg Gly Thr Gly Tyr Ile Glu Lys

115 120 125

Glu Glu Leu Arg Glu Met Val Val Ala Leu Leu Asp Glu Ser Asp Leu

130 135 140

Cys Leu Ser Asp Ser Ala Val Glu Glu Ile Val Asp Asn Thr Phe Ser

145 150 155 160

Gln Ala Asp Ser Asn Gly Asp Asp Arg Ile Asp Pro Lys Glu Trp Glu

165 170 175

Asp Phe Val Lys Lys Asn Pro Ala Ser Leu Arg Asn Met Ser Leu Pro

180 185 190

Tyr Leu Gln Asp Ile Thr Thr Ala Phe Pro Ser Phe Val Met His Ser

195 200 205

Glu Val Asp Asp Tyr Ser Gly Ile Ser Lys

210 215

<210> 5

<211> 1689

<212> DNA

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 5

cccggtttgt tcccgacatc gcatgctccc ggccgccatg gcggccgcgg gaattcgatt 60

tggatccatg ggggagcaga aggggaatat tctgatgcac aagtacgaga tggggaagat 120

gctcgggcag gggacctttg ccaaggtcta ccatgcccgc aacatcgaga cctcgcagag 180

cgtcgccatc aaggtgaccg acaaggagaa ggttatgaag ggtgggctca cagatcagat 240

caagcgcgag atctctgtga tgaagctggt gaagcaccct aacattgttc agatgtatga 300

ggtcatggca accaaaacaa agatttactt tgtgttggag catgtcaagg gcggtgagct 360

gtttaacaag gttcagagag gaaggctcaa ggaagacgct gcaaggaagt acttccagca 420

gctgatctgc gcagttgact tttgtcacag caggggcgtc tatcaccgtg atttgaagcc 480

ggagaacctt cttcttgatg agaacagcaa cctgaaggtt tcagatttcg gtctgagcac 540

catttctgaa tgcagaaggc ttgacgggct gctccacaca tcctgcggca ctcctgctta 600

tgttgcccct gaagtgatca ataggaaagg ctatgacggc gccaaggctg acatctggtc 660

ttgtggggtg atcctctttg ttcttttggc tgggtatctc cctttccagg ataagaattt 720

gatgaacatg tataagaaga ttgggaaagc agagttcaaa tgcccgagct ggttctcttc 780

agatatccga aggcttctgc taaggattct cgatcctaac cccagcacaa ggatctcgat 840

tgaaagaatc atggaacatc cttggttcag gaagggtctg gatgcaaagc tgctcagata 900

caatttacaa gcaaaagatg ctgtccctgc tgctgacatg actgtgactt ctgattcccc 960

tagcagcagc aactcagcaa ttgaaggcaa ggaacaagaa gcgaaaaagc tctccaactt 1020

gaatgccttt gatataatct ccctctcaaa tggactcgac ctctccggta tgtttgagga 1080

caacgacaag aagagggagt ccaagttcac gtccaccaac tcggcttcga cgatcgtatc 1140

caagatcgag gacatcgcaa agggcatgcg actgaagctc gtcaagaaag atggtggcat 1200

gttgaagatg gaaggctcca agcccggaag gaaaggtgtc atgtctattg atgctgagat 1260

attcgaggtc acccctgact tccatctcgt ggagttgaag aagacaaacg gcgacactct 1320

ggagtaccag agggtcttga accaggagat gaggccagcg ctgaaggaca tagtctgggc 1380

ttggcaaggc gagccgcagc cgcagccgca gcagcaacca tgttgatgtt gagaagaact 1440

gtgccaagtg cgacatttta ctagctgagt caattaccag gcgttcgtgt gtttctgtaa 1500

tttttattat cccagtttgt tattcgtttc cattcccttc ccttcgtgat gtctgtgtaa 1560

acttcagtta tcatcttttg atgaagactt atttaaaagc atgctgtctc cagaacagat 1620

gccaagtcgt tcaatgcttt ttcatggaca gcgcgtttgt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1680

aaaaaaaaa 1689

<210> 6

<211> 452

<212> PRT

<213> 野大麦（Hordeum brevisubulatum）

<400> 6

Met Gly Glu Gln Lys Gly Asn Ile Leu Met His Lys Tyr Glu Met Gly

1 5 10 15

Lys Met Leu Gly Gln Gly Thr Phe Ala Lys Val Tyr His Ala Arg Asn

20 25 30

Ile Glu Thr Ser Gln Ser Val Ala Ile Lys Val Thr Asp Lys Glu Lys

35 40 45

Val Met Lys Gly Gly Leu Thr Asp Gln Ile Lys Arg Glu Ile Ser Val

50 55 60

Met Lys Leu Val Lys His Pro Asn Ile Val Gln Met Tyr Glu Val Met

65 70 75 80

Ala Thr Lys Thr Lys Ile Tyr Phe Val Leu Glu His Val Lys Gly Gly

85 90 95

Glu Leu Phe Asn Lys Val Gln Arg Gly Arg Leu Lys Glu Asp Ala Ala

100 105 110

Arg Lys Tyr Phe Gln Gln Leu Ile Cys Ala Val Asp Phe Cys His Ser

115 120 125

Arg Gly Val Tyr His Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Asp

130 135 140

Glu Asn Ser Asn Leu Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Thr Ile Ser

145 150 155 160

Glu Cys Arg Arg Leu Asp Gly Leu Leu His Thr Ser Cys Gly Thr Pro

165 170 175

Ala Tyr Val Ala Pro Glu Val Ile Asn Arg Lys Gly Tyr Asp Gly Ala

180 185 190

Lys Ala Asp Ile Trp Ser Cys Gly Val Ile Leu Phe Val Leu Leu Ala

195 200 205

Gly Tyr Leu Pro Phe Gln Asp Lys Asn Leu Met Asn Met Tyr Lys Lys

210 215 220

Ile Gly Lys Ala Glu Phe Lys Cys Pro Ser Trp Phe Ser Ser Asp Ile

225 230 235 240

Arg Arg Leu Leu Leu Arg Ile Leu Asp Pro Asn Pro Ser Thr Arg Ile

245 250 255

Ser Ile Glu Arg Ile Met Glu His Pro Trp Phe Arg Lys Gly Leu Asp

260 265 270

Ala Lys Leu Leu Arg Tyr Asn Leu Gln Ala Lys Asp Ala Val Pro Ala

275 280 285

Ala Asp Met Thr Val Thr Ser Asp Ser Pro Ser Ser Ser Asn Ser Ala

290 295 300

Ile Glu Gly Lys Glu Gln Glu Ala Lys Lys Leu Ser Asn Leu Asn Ala

305 310 315 320

Phe Asp Ile Ile Ser Leu Ser Asn Gly Leu Asp Leu Ser Gly Met Phe

325 330 335

Glu Asp Asn Asp Lys Lys Arg Glu Ser Lys Phe Thr Ser Thr Asn Ser

340 345 350

Ala Ser Thr Ile Val Ser Lys Ile Glu Asp Ile Ala Lys Gly Met Arg

355 360 365

Leu Lys Leu Val Lys Lys Asp Gly Gly Met Leu Lys Met Glu Gly Ser

370 375 380

Lys Pro Gly Arg Lys Gly Val Met Ser Ile Asp Ala Glu Ile Phe Glu

385 390 395 400

Val Thr Pro Asp Phe His Leu Val Glu Leu Lys Lys Thr Asn Gly Asp

405 410 415

Thr Leu Glu Tyr Gln Arg Val Leu Asn Gln Glu Met Arg Pro Ala Leu

420 425 430

Lys Asp Ile Val Trp Ala Trp Gln Gly Glu Pro Gln Pro Gln Pro Gln

435 440 445

Gln Gln Pro Cys

450

Claims

1.一种蛋白质，是如下(a1)或(a2)：

(a1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)-(b4)中任一所述的DNA分子：

(b2)序列表中序列1所示的DNA分子；

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述基因，在调控生物耐盐性中的应用。

6.培育转基因生物的方法，为方法A或方法B或方法C；

所述方法A是将权利要求2或3所述基因导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物；

所述方法B是将权利要求2或3所述基因和HbCIPK2基因共同导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物；

所述方法C是将权利要求2或3所述基因、HbCIPK2基因和HbSCaBP4基因共同导入目的生物中，得到转基因生物；所述转基因生物耐盐性高于所述目的生物；

所述HbCIPK2基因为编码HbCIPK2蛋白的基因；

所述HbSCaBP4基因为编码HbSCaBP4蛋白的基因；

所述HbCIPK2蛋白是由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

7.提高生物耐盐性的方法，为方法D或方法E或方法F；

所述方法D是增加目的生物中权利要求1所述蛋白质的表达量和/或活性，提高生物耐盐性；

所述方法E是增加目的生物中权利要求1所述蛋白质和HbCIPK2蛋白的表达量和/或活性，提高生物耐盐性；

所述方法F是增加目的生物中权利要求1所述蛋白质、HbCIPK2蛋白和HbSCaBP4蛋白的表达量和/或活性，提高生物耐盐性；

8.权利要求7中所述的HbSCaBP4蛋白的应用，为如下(e1)-(e6)中的至少一种：

(e1)调控植物盐胁迫下的抗氧化性；

(e2)提高植物盐胁迫下的抗氧化性；

(e3)调控植物耐盐性；

(e4)提高植物耐盐性；

(e5)调控植物抗氧化性；

(e6)提高植物抗氧化性。

9.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求6中所述的HbSCaBP4基因导入目的植物中，得到转基因植物；所述转基因植物盐胁迫下的抗氧化性高于所述目的植物。

10.权利要求1所述的蛋白质，或，权利要求2或3所示的基因，或，权利要求6或7或9所述的方法，在生物育种中的应用。