CN111041042B - 一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系的建立方法，选取生长18～22天左右的中间锦鸡儿幼苗，使用1mL无针头注射器，在叶片的背面将农杆菌悬浮液注入叶片内，注射完后，黑暗覆膜24h，揭膜后继续黑暗处理2天，剪取侵染后1～11天样品进行GUS染色，在转化后4天即可观察到GUS报告基因在中间锦鸡儿叶片中的表达，在转化6天时表达量最高，此外，加入Silwet L‑77表面活性剂后GUS报告基因的表达要比不加以及加入其它表面活性剂的效果要好。本发明适用于叶片蜡质层较厚，叶片较小的植物，操作简单，表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持。

Description

一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系的建立方法。
背景技术
植物细胞瞬时表达是一种获得目的基因短暂的高水平表达的技术，能够方便、快捷的研究基因启动子活性、基因功能和蛋白质定位等。植物瞬时表达技术不需要通过长时间的转基因植物的筛选、传代，非常适用于再生困难的植物。与稳定表达相比，瞬时表达具有操作简单、周期短、表达效率高等优点。最早建立农杆菌介导的瞬时表达体系的植物是烟草，现在已经应用于许多植物中，包括拟南芥、大豆、百脉根、水稻、番茄、葡萄、大白菜等。
现如今，豆科植物的瞬时表达体系的研究还比较少，构建成功的例子也不是很多，研究较多的豆科植物有大豆、豌豆以及百脉根等，而中间锦鸡儿瞬时表达体系目前还没有人进行系统的研究。目前，植物瞬时表达方法主要有农杆菌介导的真空渗透法和注射法、基因枪法和原生质体电转化法。有学者对大豆瞬时表达最优条件进行了摸索，发现真空渗透配合一定时间的超声辅助侵染法能够提高农杆菌介导的GUS基因的表达，但是转化效率并不是很高。此外，使用注射渗透法侵染大豆叶片，发现GUS基因表达微弱，表达不一致，并且仅发生在叶组织中的一小部分。
中间锦鸡儿(Caragana intermedia Kuang.)系豆科锦鸡儿属旱生落叶灌木，主要分布于我国内蒙古、宁夏及陕西北部的干旱半干旱的荒漠地区。锦鸡儿属植物具有抗寒、抗旱、耐盐碱、耐瘠薄等特点，对沙漠地区有很强的适应能力，既保持水土、防风固沙，还有较高的饲用价值。虽然中间锦鸡儿还没有完善的基因组数据库，但是从转录组数据库中筛选具有抗逆价值的基因并完成功能验证已经不是一个不可能完成的任务。但是由于缺乏再生体系和转基因技术，迫切需要在中间锦鸡儿中发展基于瞬时表达技术的基因功能验证方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种在中间锦鸡儿中实现基因瞬时表达的方法，用于基因的功能验证研究。通过以下技术方案来实现：
(1)将含有GUS报告基因的表达载体电转化入农杆菌GV3101感受态细胞中；
(2)配置1/2MS液体培养基；
(3)将(1)中得到的农杆菌以及不含有任何外源载体的农杆菌GV3101在LB液体培养基过夜培养至OD所需浓度，再用(2)中的培养基将菌体稀释到所需OD值，静置数小时，
(4)选取生长18～22d左右的中间锦鸡儿幼苗，剪去不适宜注射的叶片，将(3)制备所得的农杆菌悬浮液缓慢的注射入叶片背面，使菌液充满叶片。
(5)瞬时转化后观察2-11d时间内中间锦鸡儿叶片GUS报告基因表达情况。
所述步骤(1)具体为：所用到的含有GUS报告基因表达载体为pCambia1305.2，农杆菌GV3101。
所述步骤(2)具体为：1/2MS培养基配方为：
Figure GDA0003684357330000021
KOH-HCl调pH值至5.8，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min。
所述步骤(3)具体为：将携带有pCambia1305.2载体和无任何外源载体的农杆菌GV3101接种到5mL LB液体培养基(Tryptone 1g，Yeast extract 0.5g，NaCl 1g，NaOH或HCl调pH值至7.0，去离子水定容到100mL，121℃高压灭菌20min。)中，LB液体培养基含有50μg/mL卡那霉素、25μg/mL硫酸庆大霉素。28℃，200rpm振荡过夜培养至OD600值为1.3～1.4，取1mL菌液再次转接到25mL新鲜的LB液体培养基中(体积比为1:50)，28℃，200rpm振荡过夜培养至OD600值为1.3～1.4。将达到OD600值的菌液4℃，5000-6000rpm离心20min，弃上清，使用(2)中得到的1/2MS液体培养基将菌体重悬至OD600＝0.7～0.8，混匀后，黑暗22℃静置3～4h，期间每30min上下颠倒一次菌体。用于悬浮农杆菌所用的1/2MS液体培养基中需要加入终浓度为100μmol/mL的乙酰丁香酮和终浓度为0.01％的不同的表面活性剂。
不同的表面活性剂分别为Silwet L-77、Tween-20以及Triton X-100等3种。
100mmol/L乙酰丁香酮配制：称取0.3924g乙酰丁香酮，溶解并定容于20mL DMSO内，分装至1mL离心管内，-20℃保存备用。
所述步骤(4)具体为：在正常生长条件下，选取生长18～22天左右的中间锦鸡儿幼苗，将不适宜注射的叶子减掉，选取较平展的，完整的叶子进行注射。使用1mL无针头的针管吸取静置3～4h的农杆菌悬浮液，吸满后中等力度按压针管，在叶片的背面通过气孔将农杆菌悬浮液注入叶片内，直至菌液充满整个叶片，叶片呈半透明状证明菌液已经全部注入叶片中。注射完后，黑暗覆膜24h，揭膜后继续黑暗处理2天。
所述步骤(5)具体为：侵染后，保持房间湿度为80％左右，温度为22～24℃左右，每隔3～4h对幼苗进进行喷水，在2～11天时间内取中间锦鸡儿叶片检测GUS基因表达情况。每个处理6～8个叶片。随后将叶片放入GUS染色液中染色，GUS染色液配方如下：
(1)0.2M NaH2PO4·2H2O：称取1.56g，用无菌水定容至50mL；
(2)0.2M Na2HPO4：称取1.42g，用无菌水定容至50mL；
(3)0.1M K3Fe(CN)6：称取0.82g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；
(4)0.1M K4Fe(CN)6·3H2O：称取1.05g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；
(5)100mg/ml X-GLUC：称取5mg X-GLUC，用50μL二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存；100mg/ml X-GLUC现用现配。
配制100mL GUS缓冲液：
Figure GDA0003684357330000031
配制好后可4℃避光保存2个月，保存时间不宜过长。
GUS染色液：
100mL GUS缓冲液中加入500μL 100mg/mL X-GLUC，现用现配。
GUS组织化学染色方法：
GUS染色在37℃培养箱中进行，时间为15～16h。脱色：先用95％乙醇高温(水煮沸，然后断电，温度在90℃以上)脱色3次左右，然后更换新95％乙醇，静置3h左右，脱色至背景颜色为白色，肉眼观察GUS染色情况并拍照。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明通过注射的侵染方式使基因在中间锦鸡儿叶片中过量表达，这种方法适用于叶片蜡质层较厚，叶片较小的植物。操作简单，表达水平高而且结果可靠，可为开展基因功能验证和筛选功能基因提供技术支持。
2、本发明是以1/2MS培养基为基础，同时从3种不同的表面活性剂中选择效果最好的Silwet L-77来辅助农杆菌的侵染，增加了农杆菌在中间锦鸡儿叶表皮上的富集，提高了瞬时表达转化效率。
附图说明
图1为植物表达载体pCambia1305.2的结构示意图；
图2为pCambia1305.2载体的PCR验证结果，其中1～10为引物②扩增结果，11～20为引物①扩增结果；
图3为生长20天大小的中间锦鸡儿幼苗以及注射法侵染中间锦鸡儿叶片，其中，a为生长20天大小的中间锦鸡儿幼苗，b为注射法侵染中间锦鸡儿叶片过程；
图4为注射叶片与未注射叶片之间的差别；
图5为注射侵染后培养不同时间的中间锦鸡儿，其中1～5分别为：
(1)1/2MS+100μmol/L乙酰丁香酮(AS，工作浓度)+GV3101(阴性对照)
(2)1/2MS+100μmol/L乙酰丁香酮(AS，工作浓度)+pCambia1305.2
(3)1/2MS+100μmol/L乙酰丁香酮(AS，工作浓度)+pCambia1305.2+0.01％SilwetL-77
(4)1/2MS+100μmol/L乙酰丁香酮(AS，工作浓度)+pCambia1305.2+0.01％Tween-20
(5)1/2MS+100μmol/L乙酰丁香酮(AS，工作浓度)+pCambia1305.2+0.01％TrionX-100；
图6为注射侵染后培养不同时间的中间锦鸡儿GUS染色情况，其中1～5同图5注释。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但本发明并不局限于此。
实施例1农杆菌GV3101感受态细胞的制备
(1)在含有25μg/mL庆大霉素抗性LB平板上划单克隆，28℃培养约36～48h；
(2)挑取单克隆到2mL含庆大霉素抗性的LB液体培养基中，28℃过夜摇菌18～24h；
(3)取1mL菌液转接到含有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，28℃振荡培养6～8h(此时要求OD600≈0.6左右，即菌处于对数生长期)；
(4)将菌液分装到50mL灭菌离心管中，冰上静置20min；
(5)6℃，3500rpm/min，离心10min，弃上清，回收菌体；
(6)加入50mL已灭菌的10％的甘油，悬浮菌体；
(7)6℃，3500rpm/min，离心10min，弃上清，回收菌体；
(8)重复步骤6和7；
(9)加入1mL已灭菌的10％的甘油，分装，每100μL一份，液氮速冻，置于-80℃备用。
实施例2将pCambia1305.2表达载体电转化入农杆菌GV3101感受态
(一)实验方法
(1)取出pCambia1305.2质粒并化冻，置于冰上。清洗电极杯(电极杯需要用75％乙醇浸泡10min，再用100％乙醇浸泡10min，清水洗净，通风橱吹干)。
(2)从-80℃冰箱中取出农杆菌GV3101感受态细胞，置于冰上，化冻。
(3)将1μL质粒加入到感受态细胞中，轻弹混匀，然后用剪过并灭菌的枪头将全部农杆菌吸出加入到预冷的电极杯中(U＝1400V，T＝5.4～5.8ms)。
(4)将所有转化液吸出，加入到含有800μL LB液体培养基的1.5mL EP管中，28℃，160rpm振荡培养2h。
(5)吸取50μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素的双抗性平板中，28℃倒置培养36～48h。
(6)挑取平板上单菌落，菌落PCR鉴定表达载体是否成功的转入农杆菌GV3101中。PCR引物设计根据pCambia1305.2载体上35S启动子以及GRP-GusPlus编码基因等2条序列设计，共设计2对引物，其中，引物①设计位置为35S启动子处，扩增目的片段长度为884bp；引物②设计位置为GRP-GusPlus编码基因处，扩增目的片段长度为1023bp。
(2)实验结果
如图2所示，共挑取20个农杆菌GV3101单克隆，检测发现，2对不同的引物均能扩增出片段大小符合目的片段大小的条带，说明pCambia1305.2载体已经转入农杆菌GV3101中。将鉴定正确的农杆菌加入4mL LB液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养36～48h，保种，贮存于-80℃备用。
实施例3农杆菌介导的中间锦鸡儿叶片瞬时表达体系的优化
(一)实验方法
(1)中间锦鸡儿的种植与选取
中间锦鸡儿种子采自内蒙古呼和浩特市和林县以及四子王旗。挑选籽粒饱满、无虫眼儿的种子播种于营养土与蛭石(V:V＝1:3)的钵子中，培养于25℃、16h光照/8h黑暗的温室中。选取生长20天左右并且长势健康的中间锦鸡儿幼苗进行注射(图3)，将一些不适宜注射的叶片剪去，例如不平展的以及刚长出来的很小的叶片，剩下的叶片均为注射叶片。
(2)含有表达载体的农杆菌菌悬液的制备
以pCambia1305.2载体(图1)上携带的GUS基因为报告基因，优化转化体系。将该载体电转化入农杆菌GV3101感受态细胞中，将鉴定为阳性克隆的农杆菌接种到4mL LB液体培养基中(含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素)，28℃，200rpm过夜摇菌。次日，一部分菌液保种，保种的步骤为：取1mL菌液于1.5mL EP管中，4000rpm离心2min，弃上清，加入800μL新鲜LB液体培养基以及200μL 75％甘油，混匀，液氮速冻并放于-80℃冰箱中长期保存。另一部分菌液扩大培养，将1～1.5mL菌液再次转接到25mL LB液体培养基中(含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL庆大霉素)，28℃，200rpm过夜摇菌，次日检测OD600＝1.3～1.5。将菌液4℃，5000～6000rpm离心10min，弃上清，用1/2MS液体培养基(1/2MS培养基配方为上述步骤2，加入Silwet L-77、Tween 20以及Triton X-100等三种不同的表面活性剂，0.001％、0.005％以及0.01％等三个不同浓度梯度，此外，还加入终浓度为100μmol/mL的乙酰丁香酮作为诱导剂，充分混匀)将菌体重悬至OD600＝0.7～0.8，室温黑暗静置3～4h后进行注射，静置期间每30min上下颠倒农杆菌悬浮液，目的是为了让农杆菌充分的悬浮于1/2MS培养基中。
(3)注射法侵染中间锦鸡儿叶片
注射时，尽量在光线较暗的位置进行，目的是为了农杆菌中Vir基因能更好地受到乙酰丁香酮的诱导，此外，黑暗的环境更有利于农杆菌菌体细胞与植物细胞相互作用。使用1mL一次性无针头注射器，吸满农杆菌悬浮液后，按压注射器，在叶片背面通过气孔将农杆菌悬浮液注入叶片内(图3)。侵染完后，将植物置于黑暗条件下培养3天，期间覆膜24h。从侵染后第2天开始剪取叶片样品，直到第11天，每种条件取6～8个叶片样品进行GUS染色，染色15～16h后进行脱色，染色脱色步骤同步骤(5)，直至叶片叶绿素被完全脱掉为止，拍照。
(二)实验结果
结果显示：侵染4天后(图5)，在中间锦鸡儿叶片上能够清晰的观察到注射的痕迹，注射部位成灰白色，叶片坏死、枯黄较少。侵染10天后(图5)，在中间锦鸡儿注射部位不仅能观察到有明显的的注射痕迹，注射部位边缘还出现了细胞坏死和枯黄等症状，说明农杆菌的侵染以及表面活性剂的添加会影响植物细胞的正常生长发育。为了探索最佳的表面活性剂，提高转化效率，本发明在侵染培养基中加入了3种表面活性剂：Silwet L-77、Tween-20和Triton X-100，浓度均为0.01％，并对不同表面活性剂的侵染效果做了检测，如图6所示，在侵染后1-3天，各种侵染条件下均没有观察到明显的GUS报告基因的表达。在侵染后4天，加入Triton X-100表面活性剂的农杆菌侵染液侵染过的叶片在叶片的边缘出现了明显的蓝色，并且一直持续到第7天，说明GUS报告基因的表达主要集中在叶片的边缘，这期间并未在叶片的中间部位检测到GUS报告基因的表达，而其他侵染条件下并没有观察到明显的GUS基因的表达。在侵染后第5-6天，不加入任何表面活性剂与加入Silwet L-77表面活性剂的侵染条件侵染过的叶片出现明显的蓝色，染色面积占整个叶片面积的70％以上，说明GUS报告基因在第5-6天时表达量最高，而在侵染后7-8天依然可以观察到加入Silwet L-77表面活性剂侵染条件下的叶片GUS基因的表达，染色面积为整个叶片面积的50％以上，而未加入任何表面活性剂侵染条件下的叶片GUS已经基本上没有了表达。此外，加入Tween-20的侵染条件下的叶片只有在第7天时出现少许GUS基因的表达，其他时间均没有出现明显的蓝色，这些结果说明，加入Silwet L-77表面活性剂对农杆菌侵染中间锦鸡儿叶片的效果是最好的。以上实验进行3次生物学重复。

Claims (7)

1.一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含有GUS报告基因的表达载体电转化入农杆菌GV3101感受态细胞中；所用到的含有GUS报告基因表达载体为pCambia1305.2；
(2)配置1/2MS液体培养基；具体配方为：
Figure FDA0003684357320000011
KOH-HCl调pH值至5.8，定容至1000mL，121℃高压灭菌20min；在1/2MS培养基中加入终浓度为100mmol/L乙酰丁香酮，其配制方法为：称取0.3924g乙酰丁香酮，溶解并定容于20mLDMSO内，分装至1mL离心管内，-20℃保存备用；在1/2MS培养基中加入浓度为0.01％SilwetL-77；
(3)将(1)中得到的农杆菌以及不含有任何外源载体的农杆菌GV3101在LB液体培养基过夜培养至OD所需浓度，再用(2)中的培养基将菌体稀释到所需OD值，静置数小时；
(4)选取生长18～22d左右的中间锦鸡儿幼苗，剪去不适宜注射的叶片，将(3)制备所得的农杆菌悬浮液缓慢的注射入叶片背面，使菌液充满叶片；具体为：在正常生长条件下，选取生长18～22天左右的中间锦鸡儿幼苗，将不适宜注射的叶子减掉，选取较平展的，完整的叶子进行注射；使用1mL无针头的针管吸取静置3～4h的农杆菌悬浮液，吸满后中等力度按压针管，在叶片的背面通过气孔将农杆菌悬浮液注入叶片内，直至菌液充满整个叶片，叶片呈半透明状证明菌液已经全部注入叶片中，注射完后，黑暗覆膜24h，揭膜后继续黑暗处理2天；
(5)瞬时转化后观察2-11天内中间锦鸡儿叶片GUS报告基因表达情况。
2.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，所述步骤(3)中农杆菌GV3101在LB液体培养基中过夜培养后，OD600≈1.3，且使用步骤(2)中得到的1/2MS液体培养基将菌体重悬至OD600＝0.7～0.8。
3.根据权利要求2所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，将菌体重悬至OD所需值后，混匀，黑暗22℃静置3～4h，期间每30min上下颠倒一次菌体。
4.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，侵染后，保持房间湿度为80％左右，温度为22～24℃左右，每隔3～4h对幼苗进进行喷水，在2～11天时间内取中间锦鸡儿叶片检测GUS基因表达情况；每个处理6～8个叶片；随后将叶片放入GUS染色液中染色，GUS染色液配方如下：
(1)0.2M NaH2PO4·2H2O：称取1.56g，用无菌水定容至50mL；
(2)0.2M Na2HPO4：称取1.42g，用无菌水定容至50mL；
(3)0.1M K3Fe(CN)6：称取0.82g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；
(4)0.1M K4Fe(CN)6·3H2O：称取1.05g，用无菌水定容至25mL，4℃避光保存；
(5)100mg/ml X-GLUC：称取5mg X-GLUC，用50μL二甲基甲酰胺溶解，4℃避光保存；100mg/ml X-GLUC现用现配。
5.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，配置100mL GUS缓冲液所需要的试剂体积为：
Figure FDA0003684357320000021
配制好后可4℃避光保存2个月，保存时间不宜过长。
6.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，100mL GUS缓冲液中加入500μL 100mg/mL X-GLUC，现用现配。
7.根据权利要求1所述一种农杆菌介导的中间锦鸡儿瞬时表达体系建立的方法，其特征在于，GUS组织化学染色方法为，GUS染色在37℃培养箱中进行，时间为15～16h；脱色：先用95％乙醇高温，水煮沸，然后断电，温度在90℃以上，脱色3次左右，然后更换新95％乙醇，静置3h左右，脱色至背景颜色为白色，肉眼观察GUS染色情况并拍照。
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