CN1952152A - 运动发酵单胞菌高抗草甘膦的epsp合酶基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的EPSP合酶及其应用。本发明筛选出了一种新的EPSP合酶基因，并分别将该基因导入受体菌E.coli和模式植物烟草中，使所得到的遗传工程菌株及转基因烟草获得了对除草剂草甘膦的耐受能力。

Description

运动发酵单胞菌高抗草甘膦的EPSP合酶基因及其应用

技术领域：

本发明涉及一种EPSP合酶基因。本发明还涉及含有所述EPSP合酶基因的质粒，以及该基因在制备转基因工程菌和培育转基因植物方面的用途。

背景技术：

草甘膦(Glyphosate)为内吸传导型、广谱灭生性除草剂，其作用机制是通过抑制植物体内EPSP合酶(全称为5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)活性，干扰植物体内芳香族氨基酸的生物合成，导致植物死亡(S.R.Padgette et al.，in Herbicide-Resistent Crops：Agricultural，Environmental，Economic，Regulatory，and TechnicalAspects，S.O.Duke，Ed.(CRC Press，Boca Raton，FL，1996)，pp.53-84)。

如果植物体内的EPSP合酶基因发生突变，产生出与草甘膦亲和性较低的EPSP合酶，不能很好的甚至根本不能与草甘膦结合，则此植物就具有了抗草甘膦能力。

目前已经从沙门氏菌属(Salmonella typhimurium)、大肠杆菌(Escherichia coli)以及农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等很多微生物中筛选分离到了具有这种抗草甘膦机制的株系，并克隆了它们的EPSP合酶基因。而对于来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)株系抗草甘膦EPSP合酶的报道尚未有报道。

我国在转基因抗草甘膦作物方面的研究已取得一定进展，但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。因此，本领域迫切需要开发新的抗草甘膦的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶。

发明内容：

本发明的目的是提供获得耐受草甘膦的能力的遗传工程重组生物。

本发明的技术方案是筛选到一种新的EPSP合酶基因(以下称为ZM-EPSP合酶基因)，并将该基因导入受体生物，使所得到的遗传工程重组生物获得耐受草甘膦的能力。

具体内容如下：

1.通过构建高抗草甘膦的运动发酵单胞菌ZM的粘粒基因文库，用功能筛选的方法克隆得到ZM-EPSP合酶基因，该基因的序列如SEQ ID NO：1所示，其大小为1362bp；

2.将上述SEQ ID NO：1所示的基因片段连接到克隆载体pACYC184中，构建具有完整ZM-EPSP合酶基因的重组质粒pAYZM；

3.将含ZM-EPSP合酶基因的重组质粒pAYZM导入不具草甘膦抗性的受体大肠杆菌JM109中，获得能够耐受草甘膦的遗传工程菌株；

4.将上述SEQ ID NO：1所示的基因片段连接到植物表达载体中，构建具有完整ZM-EPSP合酶基因的重组质粒pCBZM；

5.将含ZM-EPSP合酶基因的重组质粒pCBZM导入不具草甘膦抗性的烟草品种NC89中，获得能够耐受草甘膦的遗传工程烟草植株。

本发明的ZM-EPSP合酶蛋白第106位、131位氨基酸发生了由L到F及由M到I的改变，从而使该蛋白具有了较高的草甘膦抗性。

实验结果表明，含有本发明所得的ZM-EPSP合酶基因的重组大肠杆菌及转基因烟草获得了较强的草甘膦耐受能力。

具体实施方式：

以下实施例中所举的质粒、菌株等只是用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。实际上，用本发明发现的基因和方法，本领域技术人员可以得到其它多种具有草甘膦耐受能力的遗传工程菌株与植物。

实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

植物表达载体pBI121：为Clontech公司市售产品；

克隆载体pACYC184为NEB(New Eng)公司市售产品；

受体菌E.coli BL21：北京天为时代公司市售产品。

实施例1  高抗草甘膦的DNA片段克隆

1、草甘膦极端污染环境中土壤样品的采集

自然环境中特别是在长期使用草甘膦等除草剂地区的土壤中，存在种类繁多的能耐受草甘膦或其它除草剂的细菌菌株。从被草甘膦污染达十年以上的活性污泥中(某草甘膦生产工厂开放式分装点)采集样品。

2、从草甘膦极端污染土壤样品中分离鉴定运动发酵单胞菌

样品接种在草甘膦终浓度(100mmol/L，200mmol/L，300mmol/L，350mmol/L，400mmol/L，450mmol/L，500mmol/L，550mmol/L，600mmol/L，650mmol/L，700mmol/L，800mmol/L，900mmol/L，1000mmol/L)的MOPs液体培养基中，30℃，200r/min摇瓶振荡培养2d，稀释菌液，然后在草甘膦浓度为200mmol/L的MOPs固体培养基上涂板，挑取单菌落反复划线纯化后接种在LB固体培养基上。对筛选出的单一菌株进行细菌形态、生理生化综合特征表型鉴定。

提取细菌总DNA，以DNA为模板，用引物F27：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，引物R1492 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR扩增出16S rDNA。产物经纯化，用pGEM-Teasy连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。16S rDNA测序由上海基康公司完成。将测序结果用BLAST软件与Genebank中16S rDNA序列进行同源性比较，并用DNAMAN V4软件的Multiple Sequence Alignment进行同源性分析，初步鉴定为Zymomonas mobilis。

3、运动发酵单胞菌总DNA粘粒文库的构建

粘粒文库的构建按Stratagene公司说明书进行；DNA片段用Clontech公司的Gel-extractKit纯化。菌株染色体DNA用Sau3AI部分酶切，回收30-40kb的片段，去磷酸化；与经XbaI酶切，去磷酸化，再用Bam I酶切的Super Cosl Cosmid载体(Stratagene公司)相连，噬菌体蛋白Gigapack packing包装转染大肠杆菌JM109，将转染后的细胞涂板在Amp100μg/ml LB平板上。

4、筛选草甘膦抗性转化子

从Amp 100μg/ml LB平板上挑单菌落，划板在草甘膦浓度20mmol/L的MOPs培养基固体平板上，筛选得到阳性克隆。克隆片段用EcoRI消化，与经EcoRI酶切pACYC184载体(本实验室保存)相连，转化JM109后，在Tc 50μg/ml和草甘膦20mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到8kb亚克隆片段，该片段用HindIII酶切后，与经HindIII酶切的pGEM-3zf(-)载体(本实验室保存)相连，转化JM109后，在Amp 100μg/ml和草甘膦20mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到包括3.5kb亚克隆片段的草甘膦抗性转化子。

5.高抗草甘膦的DNA片段的亚克隆及抗性验证

为确定草甘膦抗性基因的编码区，以3.5kb片段为模板，以引物I(5′-ctg gaa ttcATGACCCGTC CTGTTCACGC-3′，含Eco RI位点))和引物II(5′-gtc ga att cTCATTTTACAAGCCCCA-3，含Eco RI位点))进行PCR扩增得到1.36kb ZM-EPSP基因(从碱基第1至1362位)。PCR循环为：94℃，5min→94℃，30sec→57℃，1min 20sec→72℃，30sec，30个循环。

将PCR产物经Eco RI酶切与经相同酶切去磷酸化的pACYC184相连，连接产物转化JM109。在Tc四环素50μg/ml和草甘膦10mmol/L双重抗性的MOPs固体培养基上筛选得到阳性克隆。重组质粒命名为1.36-pACYC184。

1.36-pACYC184转化JM109后在不同草甘膦浓度(0至160mmol/L)的MOPs液体培养基中观察发现它能在草甘膦浓度为90mmol/L的MOPs液体培养基中很好的生长。结果表明含有ZM-EPSP合酶基因的重组大肠杆菌具有了草甘膦抗性。

实施例2  高抗草甘膦的DNA片段的序列分析及其ZM-EPSP合酶功能验证

1、高抗草甘膦的DNA片段的序列分析

对实施例1中所亚克隆的高抗草甘膦DNA片段进行全核甘酸序列测定。分析结果表明，它有一个完整的阅读框架，编码ZM-EPSP合酶其序列如SEQ ID NO：1所示，aroA编码包括终止密码子在内的453个氨基酸的ZM-EPSP合酶。

将所亚克隆的高抗草甘膦编码序列与已报道的EPSP合酶编码基因(aroA)比较，在核甘酸水平同源性很低。氨基酸序列同源性分析结果表明，与已知ClassI EPSP合酶(来源于大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等)氨基酸同源性并不高，与大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌来源的EPSP合酶氨基酸同源性分别为24.07％和24.73％；与psedomonas flurescens G2的EPSP合酶同源性为24.74％，与Agrobacterium tumefaciens sp.strain CP4的EPSP合酶同源性为54.92％.

2、高抗草甘膦的DNA片段的ZM-EPSP合酶功能验证

序列分析结果显示抗性克隆中含有ZM-EPSP合酶，为了证实其具有ZM-EPSP合酶活性，本实验以大肠杆菌EPSP合酶缺陷型菌株为受体菌株，采用CaCl₂法将1.36-pACYC184转化大肠杆菌EPSP合酶缺陷型菌株ER2799(New England Biolabs，Inc提供)，涂板在Tc50μg/mlLB固体平板上，用牙签点取所有的转化子到草甘膦20mmol/L MOPs固体培养基上，受体菌株ER2799、含有载体质粒(pACYC184、pGEM-3zf)的ER2799为阴性对照，如抗草甘膦亚克隆含有可表达的EPSP合酶基因，互补了受体菌的缺陷，则能够利用限制性培养基的无机物合成氨基酸并生长，否则就不能生长。

试验结果表明，发现其在功能上与EPSP合酶缺陷型菌株互补，能在限制性培养基MOPs固体平板上生长，而空白质粒pACYC184及缺陷菌株都不能在MOPs固体平板上生长。说明该基因具有完整的ZM-EPSP合酶的功能。

实施例3  高抗草甘膦的ZM-EPSP合酶基因的人工合成

根据已完成的含1362编码区的核甘酸序列，首先分8个区段分别根据正链和副链序列，分别合成出长度150-200bp、具有粘性末端的单链寡核甘酸片段。将正链和副链各一一对应的8个互补的单链寡核甘酸片段分别退火，形成8个带有粘性末端的双链寡核甘酸片段。混合双链寡核甘酸片段，经T4 DNA连接酶催化组装成一个完整的ZM-EPSP合酶基因。该合成的DNA片段含有SEQ ID NO：1中1-1347位的核甘酸序列，并且合成基因的两端含XbaI和SacI位点。

将上述人工合成的5’和3’端酶切位点为XbaI和SacI位点ZM-EPSP基因，用于下面高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表达载体的构建。

实施例4  高抗草甘膦的ZM-EPSP合酶基因植物表达载体的构建

高抗草甘膦的ZM-EPSP合酶基因植物表达载体构建的具体方法如下：

A.pBI121(ClonTech公司)和pCAMBIA2301(ClonTech公司)用HindIII和EcoRI双酶切，将pBI121带有p35S-GUS-Nos-ter的片段连入pCAMBIA2301，形成中间载体p35S-2301-GUS；

B.用XbaI和SacI双切p35S-2301-GUS和上述人工合成的ZM-EPSP基因，用ZM-EPSP置换p35S-2301-GUS相应酶切位点的GUS，从而获得高抗草甘膦的ZM-EPSP合酶基因植物表达载体。再将其转入农杆菌中，用于转化模式植物烟草。

实施例5  利用叶盘法转化构建抗草甘膦的转基因烟草

(1)用无菌牙签挑取YPE选择平板上的实施例5中制备的阳性克隆，接种于2ml YEB液体(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振荡培养24-36小时；

(2)室温下4000g离心10分钟；

(3)弃上清，菌体用1/2MS液体培养基悬浮，稀释到原体积的5-20倍，使菌体的OD600在0.5左右；

(4)取生长两周左右的烟草的无菌叶片，去掉其主叶脉，将其剪成约1cm²见方的小叶片；

(5)将叶片放入制备好的菌液中，浸泡2-5分钟，在无菌滤纸上吸干菌液；把经浸染的叶片放于MS培养基上，28℃暗培养48小时；

(6)将叶片转到愈伤培养基(MS+6-BA 1.0mg/l+NAA 0.1mg/l+Kan 50mg/l+羧苄青霉素250mg/l)上，25-28℃光照下培养，7-15天可见愈伤组织的形成；

(7)约20天后可见分化芽长出，待芽长大后，切下，置于生根培养基(1/2MS+NAA0.5mg/l+Kan 25mg/l)上进行生根培养，2-7天左右生根；

(8)待根系发达后，将植株取出，用无菌水洗净附着着的固体培养基，移入土壤中，刚开始几天用玻璃罩罩几天，待植株健壮后再取下玻璃罩，转移至含10mM的草甘膦的固体培养基中筛选草甘膦抗性的植株。

(9)抗性植株经Southern、Northem杂交以及Westhern blot验证为转基因的抗性植株。

(10)用浓度为1.6％草甘膦盐水剂喷非转基因烟草苗，发现非转基因烟草苗萎焉，而在同样浓度下，转ZM-EPSP基因的烟草苗却能正常生长。为了进一步检测转基因烟草的抗性，采用几个梯度的草甘膦铵盐水剂：0.25％，1％，1.6％，2.5％，5％，10％，发现非转基因烟草苗在0.25％草甘膦铵盐水剂下就不能生长，而转基因烟草在5％草甘膦铵盐水剂下能正常生长，而在10％草甘膦铵盐水剂下能正常生长两周，然后，茎部开始腐烂最后死亡。

研究结果表明，含有ZM-EPSP合酶基因的转基因烟草植株获得了较强的草甘膦抗性。

附录

SEQ ID NO：1运动发酵单胞菌高抗草甘膦的EPSP合酶基因核甘酸序列

atgacccgtc ctgttcacgc ttgcccgctt gttagtcgca aggctccgcc gctttccggc      60

aaggtgcatg tccctggtga caaatcaatt tcccatcggg cgttgatgct gtctgccttg     120

gcggttggtg aaagttttgt agaaggcctg ttggaaggcg aagacgttct ggcaacagcc     180

gaagcgatgc gctctatggg cgcggatatt cgaaaagatg aaaaaggatg ctggcatatt     240

catggtgtcg gcgtcggaag tcttttgcag ccgcagaatg ctttggatat gggtaattca     300

ggcacctcta cccgtttcct gatgggggtt gtcgcttccc atcccattac ggcgaccttt     360

atcggggatg cttctttatc caaaagacca atcggacgta tttcgacccc gctttctctg     420

atgggggcgc gtttttcagc ggcagaaggc aatcgcttgc cgatgacggt taccggcctt     480

tatccggcga tcccgattga atatcgccta ccggttgcat ctgcacaggt gaaatcagca     540

atattactgg caggtttgaa tacgccgggc atcacccgcg ttattgaacc cgtgccgact     600

cgtgaccata gcgaacggat gttaaaaggc tatggtgcca atctttcggt cgaagaaaat     660

gacggtgtca ggattatttc tatccatggc gaagccgagt taaaaccaca gcatattata     720

gtgccaggtg acccctcctc agcggctttt ctggtcgtag cgggacttat tgttccaggg     780

tctgacctga ttgttgaaaa tgttggcctt aacccgaccc gttctggtct ctataccatg     840

ttaaaagcca tgggcggtca aatcgaatat cttaatccac gagaagttgg cggcgaacct     900

gttgctgatc tttcggttaa atattctcat ttaaaggcta tcgacgtgcc gccttcgatt     960

gtgccgtcga tgattgatga attccccatt ctgtttattg ccgctgccat ggcagaaggt    1020

aaaagcacgc tgcaaggtct cgctgaatta cgggtcaaag aatctgaccg tattgccgtg    1080

atggcagaag gtctaaaagc cttgggcgtt tctttggaag aaaaagaaga cggcctgatt    1140

atcgaaggct cagcgggtga aggccttggt caaaaaggca aaatggtatc catcgccgca    1200

catctcgatc atcggattgc catgagtttt gcggtagccg gtcttgtttc tgaaggtggg    1260

gtcacgatcg atgatcgccg tccgatcatg accagctttc cggtctttgg tcagctattc    1320

aaagaattgg gcgctgaatt cgaaatgggg cttgtaaaat ga                       1362

Claims (9)

1.SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

2.权利要求1所示基因的用途，是制备耐受草甘膦的基因工程菌或植物。

3.含有权利要求1所示基因的重组质粒。

4.权利要求3所述的重组质粒，是含有权利要求1所示基因的重组大肠杆菌。

5.权利要求3所述的重组质粒，是含有权利要求1所示基因在烟草中表达的质粒。

6.权利要求3或4所述的重组质粒的用途，是制备耐受草甘膦基因工程菌或制备耐受草甘膦转基因植物。

7.一种耐受草甘膦的基因工程菌，特征是含有权利要求3所述的重组质粒。

8.一种耐受草甘膦转基因植物的培育方法，是将权利要求3所述的重组质粒转化至受体植物。

9.权利要求9所述的耐受草甘膦转基因植物的培育方法，所述受体植物为烟草。