CN103911317A - 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用 - Google Patents

一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN103911317A
CN103911317A CN201410083783.4A CN201410083783A CN103911317A CN 103911317 A CN103911317 A CN 103911317A CN 201410083783 A CN201410083783 A CN 201410083783A CN 103911317 A CN103911317 A CN 103911317A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glyphosate
desert
red bacterium
glyphosate tolerant
rhodobacter
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410083783.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103911317B (zh
Inventor
张维
吴港
王琳
林敏�
陈明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.
Original Assignee
Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biotechnology Research Institute of CAAS filed Critical Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority to CN201410083783.4A priority Critical patent/CN103911317B/zh
Publication of CN103911317A publication Critical patent/CN103911317A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103911317B publication Critical patent/CN103911317B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明发现沙漠红细菌Rhodobacter shamoensis W402具有耐草甘膦功能，可作为胁迫环境修复的功能菌株，并可构建转基因生物，培育抗逆境生物。

Description

一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种具有耐草甘膦功能的沙漠红细菌。本发明还涉及该菌作为草甘膦污染环境修复的功能菌株方面的应用。 
背景技术
草甘膦是全世界使用量最大的除草剂品种之一，但它作为一种非选择性除草剂，对农作物同样有灭生性作用，这大大限制了草甘膦在农业生产中的应用范围。虽然目前国际国内对耐草甘膦菌株的开发和研究较多，大多集中在假单胞菌属。Rhodobacter属耐草甘膦微生物却鲜有报道。 
因此，筛选新的具有优良草甘膦耐受性的菌株对于草甘膦土壤环境的修复及克隆新的抗草甘膦基因意义重大，可为转基因抗草甘膦作物的培育提供新的资源。同时，通过对其抗草甘膦机理的研究，进一步加深人们对于草甘膦耐受性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得其它优良性状。 
发明内容
本发明的目的是分离出具有耐草甘膦功能的新种微生物。 
本发明人发现并分离培养出一种新的菌种，经鉴定确认该菌种属于红细菌，被命名为沙漠红细菌，Rhodobacter shamoensis【sha.mo.en’sis.N.L.masc.adj.】。本发明发现该菌具有耐草甘膦功能。 
该菌种已在国家知识产权局指定的保藏单位中国普通微生物菌种保藏中心保藏。 
本发明的耐草甘膦沙漠红细菌具有下述特征： 
1.形态特征 
在电子显微镜下可见，为杆状细菌（图3）。 
2.在各种培养基上的特征： 
在LB琼脂培养基上，菌落呈现柠檬黄色、凸起状，表面湿润，边缘整齐，无胞外分泌物（图2）。 
在TGY培养基上长势缓慢。 
3.生理生化特征 
该菌株为严格好氧生长，革兰氏阴性，无运动性，非自养菌株。白氨酸芳胺酶阳性，酸性磷酸酶阳性，萘酚-AS-BI-磷酸水解酶阳性，α-葡萄糖甙酶阳性。 
4.碳源利用 
能以葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、L-鼠李糖、L-丙氨酸、D-甘露糖为碳源，但不能以L-海藻糖、蔗糖、D-纤维二糖、D-蜜二糖和α-环糊精等为碳源。 
5.其它性质 
最适生长温度30℃。细胞壁脂肪酸含有Summed Feature8(C18:1ω7c and/or C18:1ω6c),C18:0,11-MethylC18:1ω7c,C17:0,C10:03-OH,C16:0和C12:03-OH，其中以Summed Feature8(C18:1ω7c and/or C18:1ω6c),C18:0和11-Methyl C18:1ω7c为主。 
所述的耐草甘膦沙漠红细菌的培养条件为： 
（1）培养基：采用LB琼脂培养基。具体配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L 
（2）pH7.0； 
（3）培养温度：30℃。 
本发明发现的耐草甘膦沙漠红细菌的16SrDNA与同属的其它种的差异显著（相似度<96%）： 
与Rhodobacter capsulatus ATCC11166的相似度为95.833%； 
与Rhodobacter sphaeroides2.4.1的相似度为95.681%； 
与Haematobacter missouriensis H1892的相似度为95.529%； 
与Rhodobacter megalophilus JA194的相似度为95.309%； 
与Rhodobacter veldkampii ATCC35703的相似度为95.202%； 
与Rhodobacter azotoformans KA25的相似度为94.337%； 
与Rhodobacter aestuarii JA296的相似度为93.486%等等。 
此外，与红细菌属标准菌株——Rhodobacter capsulatus ATCC11166的对比实验显示，本发明发现的耐草甘膦沙漠红细菌与标准菌株的微生物学特性有显著差异（表1）。 
表1耐草甘膦沙漠红细菌与R.capsulatusATCC11166的微生物学特性比较 
注：“+”表示阳性，“-”表示阴性，“±”表示在不同菌株中为变量 
本发明的沙漠红细菌为Rhodobacter属的革兰氏阴性菌，在相同浓度的草甘膦M9液体培养基中培养，其存活率高于对照菌株3倍以上（图1）。 
该属鲜有报道具有耐草甘膦功能。通过对其机理的研究，可以进一步加深人们对于草甘膦耐受性产生机理的认识，构建新的转基因生物，使其获得其它优良性状。Rhodobacter shamoensis W402作为一个新的物种，将为耐草甘膦作物的培育和新的抗草甘膦基因的发掘提供新的资源。 
因此，本发明的耐草甘膦沙漠红细菌，可以作为草甘膦污染环境修复的功能菌株，将其优良的抗草甘膦基因转入其它生物体中，使其可以获得优良的抗逆性状；同时，它也可 能作为新的基因工程菌株，通过接受外来其它优良基因从而获得更多的优良性状；此外，通过传统的诱变育种手段进行性状的改良，还可以获得更多性状的菌株。对研究其DNA损伤的修复分子机理，促进新的DNA技术在环境保护、生物修复、人类健康等的发展有着重要意义。 
附图说明
图1耐草甘膦沙漠红细菌与对照菌株（E.coli K12）对草甘膦的耐受对比，图中，较平缓的曲线表示耐草甘膦沙漠红细菌的生存曲线，L形曲线表示对照菌株的生存曲线。 
图2耐草甘膦沙漠红细菌的菌落形态； 
图3耐草甘膦沙漠红细菌的扫描电镜图片； 
图4耐草甘膦沙漠红细菌与其它红细菌属成员之间的进化分析（基于16S rDNA序列分析）； 
生物材料保藏信息： 
名称：沙漠红细菌（Rhodobacter shamoensis） 
保藏编号：CGMCC No.8817 
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 
保藏时间：2014年2月13日。 
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 
具体实施方式
实施例1耐草甘膦沙漠红细菌的分离培养 
于新疆塔克拉玛干沙漠边缘的红柳树根际土壤中采集砂土。称取土样1.0g，放入盛99mL无菌水的三角瓶中，置摇床振荡20min使土壤均匀分散成为土壤悬液（10-2）。用100μL移液枪从中吸取100μL土壤悬液，注入事先分装有900μL无菌水的离心管中，吹吸3次，振荡均匀（10-3）。然后使用同样方法，配置成稀释度为10-4，10-5的土壤菌悬液。取合适浓度的菌悬液200μL涂布于LB琼脂培养基平板上，翻转平板置于30℃培养箱中培养3天，即可获得本发明所述的耐草甘膦沙漠红细菌。 
LB琼脂培养基：10‰氯化钠；5‰酵母提取物；10‰胰蛋白胨；15‰琼脂。 
培养温度为30℃。 
实施例2耐草甘膦沙漠红细菌的草甘膦耐受实验 
1、试验方法 
将本发明所述的耐草甘膦沙漠红细菌菌液通过5000rpm、10min、4℃离心收集菌体； 将菌体重悬于等体积0.1M磷酸钾Buffer（pH7.0），之后再次使用5000rpm、10min、4℃离心收集菌体，如此洗涤菌体2次；最终将菌体再次重悬于等体积0.1M磷酸钾Buffer（pH7.0）。将菌悬液分别接入草甘膦浓度为50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L和300mmol/L的M9液体培养基中，30℃摇床培养72h后，测定培养液的OD600（同时以不加草甘膦的M9液体培养基作为对照）。 
同时以大肠杆菌（E.coli K12）菌株为对照。 
实验菌和对照菌各进行了3组平行试验。 
2、结果 
结果显示，本发明的耐草甘膦沙漠红细菌在150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L和300mmol/L的草甘膦浓度下，其培养液的OD600值均高于对照大肠杆菌2倍以上（表2、表3）。 
表2耐草甘膦沙漠红细菌（R.shamoensis W402）草甘膦耐受实验 
草甘膦浓度（mmol/L） 0 50 100 150 200 250 300
培养液OD600 0.55 0.32 0.44 0.47 0.48 0.50 0.54
培养液OD600的标准差 0.021 0.0031 0.016 0.0017 0.014 0.0029 0.026
表3大肠杆菌（E.coli K12）草甘膦耐受实验 
草甘膦浓度（mmol/L） 0 50 100 150 200 250 300
培养液OD600 2.32 0.22 0.19 0.17 0.15 0.17 0.18
培养液OD600的标准差 0.012 0.0064 0.0035 0.0057 0.020 0.011 0.0035
实施例3耐草甘膦沙漠红细菌菌株16S rDNA的提取 
本发明还提供了耐草甘膦沙漠红细菌（R.shamoensis W402）的基因组提取、16S rDNA的扩增及测序方法，具体按照下述操作进行： 
1.基因组提取方法 
本发明所述的耐草甘膦沙漠红细菌的基因组使用公司的细菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱形）进行提取，详见其说明书。 
2.PCR扩增方法 
本发明所述的耐草甘膦沙漠红细菌的16S rDNA的PCR扩增所用的通用引物序列的设计参照William G.Weisburg(1991)的文章，引物由北京擎科生物技术公司合成。扩增所用 的试剂盒购买于宝生物工程（大连）有限公司。 
正向引物F27(5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’)， 
反向引物R1492(5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’)， 
表4PCR扩增体系 
成分 加入量
ExTaqDNA聚合酶 0.5μL
dNTPs 5μL
F27引物 1μL
R1492引物 1μL
ExTaqBuffer(10×) 5μL
模板 1μL
ddH2O 定容至50μL
PCR反应程序 
将扩增得到的16S rDNA序列，连接于公司的pSURE-T载体上，委托宝生物工程（大连）有限公司对于插入序列进行测序。 

Claims (4)

1.沙漠红细菌（Rhodobacter shamoensis），其保藏编号为：CGMCC8817。
2.权利要求1所述的沙漠红细菌作为草甘膦污染环境修复的功能菌株的应用。
3.权利要求1所述的沙漠红细菌在构建具有抗草甘膦功能的转基因生物方面的应用。
4.权利要求1所述的沙漠红细菌在诱变育种和改良植物的抗草甘膦功能性状方面的应用。
CN201410083783.4A 2014-03-07 2014-03-07 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用 Active CN103911317B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410083783.4A CN103911317B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410083783.4A CN103911317B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103911317A true CN103911317A (zh) 2014-07-09
CN103911317B CN103911317B (zh) 2016-01-20

Family

ID=51037325

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410083783.4A Active CN103911317B (zh) 2014-03-07 2014-03-07 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103911317B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911318A (zh) * 2014-03-07 2014-07-09 中国农业科学院生物技术研究所 耐辐射沙漠红细菌及其应用
CN113604411A (zh) * 2021-10-08 2021-11-05 山东益生种畜禽股份有限公司 草甘膦降解菌及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030204873A1 (en) * 1997-12-10 2003-10-30 Frank Schmidt Method for producing transgenic plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, and method for identifying 5-aminolevulinic acid synthesis effectors
CN1766086A (zh) * 2004-10-27 2006-05-03 王栋 类球红细菌发酵液在农药残留降解中的应用
CN1952152A (zh) * 2005-10-17 2007-04-25 中国农业科学院生物技术研究所 运动发酵单胞菌高抗草甘膦的epsp合酶基因及其应用
CN102965296A (zh) * 2012-02-10 2013-03-13 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所 一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030204873A1 (en) * 1997-12-10 2003-10-30 Frank Schmidt Method for producing transgenic plants with modified 5-aminolevulinic acid biosynthesis, and method for identifying 5-aminolevulinic acid synthesis effectors
CN1766086A (zh) * 2004-10-27 2006-05-03 王栋 类球红细菌发酵液在农药残留降解中的应用
CN1952152A (zh) * 2005-10-17 2007-04-25 中国农业科学院生物技术研究所 运动发酵单胞菌高抗草甘膦的epsp合酶基因及其应用
CN102965296A (zh) * 2012-02-10 2013-03-13 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所 一株对草甘膦具有高抗活性的固氮克雷伯氏菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PADDOCK ML等: "Reaction centers from three herbicide-resistant mutants of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1:sequence analysis and preliminary characterization", 《PHOTOSYNTH RES》, vol. 17, 31 July 1988 (1988-07-31), pages 75 - 96 *
S.V.KONONOVA等: "Phosphonates and Their Degradation by Microorganisms", 《BIOCHEMISTRY(MOSCOW)》, vol. 67, no. 2, 31 December 2002 (2002-12-31), pages 220 - 233 *
汤鸣强 等: "抗草甘膦酵母菌ZM-1的分离鉴定及其生长降解特性", 《微生物学通报》, vol. 37, no. 9, 20 September 2010 (2010-09-20), pages 1402 - 1409 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103911318A (zh) * 2014-03-07 2014-07-09 中国农业科学院生物技术研究所 耐辐射沙漠红细菌及其应用
CN103911318B (zh) * 2014-03-07 2016-01-13 中国农业科学院生物技术研究所 耐辐射沙漠红细菌及其应用
CN113604411A (zh) * 2021-10-08 2021-11-05 山东益生种畜禽股份有限公司 草甘膦降解菌及其应用
CN113604411B (zh) * 2021-10-08 2021-12-17 山东益生种畜禽股份有限公司 草甘膦降解菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN103911317B (zh) 2016-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Yadav et al. Culturable diversity and functional annotation of psychrotrophic bacteria from cold desert of Leh Ladakh (India)
Nagar ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF PHOSPHATE SOLUBLIZING BACTERIA FROM ANAND AGRICULTURE SOIL.
Holochová et al. Description of Massilia rubra sp. nov., Massilia aquatica sp. nov., Massilia mucilaginosa sp. nov., Massilia frigida sp. nov., and one Massilia genomospecies isolated from Antarctic streams, lakes and regoliths
CN108998389A (zh) 对稻黄单胞菌和稻瘟病菌具有拮抗作用的假单胞菌及应用
Beghalem et al. Molecular and phenotypic characterization of endophytic bacteria isolated from sulla nodules
Estrada-de Los Santos et al. Cupriavidus plantarum sp. nov., a plant-associated species
Chibeba et al. Polyphasic characterization of nitrogen-fixing and co-resident bacteria in nodules of Phaseolus lunatus inoculated with soils from Piauí State, Northeast Brazil
Mazinani et al. Genetic diversity of Azotobacter strains isolated from soils by amplified ribosomal DNA restriction analysis
Ambrosini et al. Paenibacillus helianthi sp. nov., a nitrogen fixing species isolated from the rhizosphere of Helianthus annuus L.
CN110172422B (zh) 一株溶蛋白芽孢杆菌及其在防治根结线虫中的应用
Zhou et al. Exploration of applying growth-promotion bacteria of Chlorella sorokiniana to open cultivation systems
Li et al. Diversity of cultivable endophytic bacteria associated with halophytes in Xinjiang of China and their plant beneficial traits
CN103911317B (zh) 一种具有耐草甘膦功能的细菌及其应用
Yakkou et al. Identification and characterization of microbial community in the coelomic fluid of earthworm (Aporrectodea molleri)
CN108865945B (zh) 耐除草剂2,4-d桂林类芽孢杆菌及其应用
CN106566789B (zh) 一株富磷和降解有机磷农药的Lysinibacillus macroides及应用
Rojas-Rojas et al. Draft genome of Paraburkholderia caballeronis TNe-841 T, a free-living, nitrogen-fixing, tomato plant-associated bacterium
Viana et al. Cultivable bacterial diversity associated with bromeliad roots from ironstone outcrops in central Brazil
CN103911318B (zh) 耐辐射沙漠红细菌及其应用
Aliliche et al. Molecular phylogenetic analysis of Rhizobium sullae isolated from Algerian Hedysarum flexuosum
CN103981122B (zh) 一种赣州慢生根瘤菌及其用途
Ehis-Eriakha et al. Isolation and molecular characterization of diazotrophic bacteria in arable soils
Marzban et al. Biodiversity and phylogenetic study of root nodule bacteria isolated from some wildly grown legume species growing in rangeland areas
CN100400646C (zh) 耐氯菌株1号
CN110684699A (zh) 一株纤维化纤维微细菌dgnk-jj1及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220321

Address after: 572025 building 3, nuclear energy R & D and Industrial Park, Yiju Road, Yazhou District, Sanya City, Hainan Province

Patentee after: Longping Biotechnology (Hainan) Co.,Ltd.

Address before: 100081 No. 12 South Main Street, Haidian District, Beijing, Zhongguancun

Patentee before: BIOTECHNOLOGY Research Institute CHINESE ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES