CN101831443A - 编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其中所述EPSPS具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，所述基因具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，本发明的基因是从新疆纳拉提草原周边采集的土样中分离获得的一株人苍白杆菌中通过同源克隆的方法从该菌株中克隆得到的。通过草甘膦抗性实验，发现该基因具有良好的草甘膦抗性，是同类基因中的优秀者。本发明还提供其克隆载体和表达载体用于生物转化，可用于转化农作物，达到植物耐受除草剂的目的。

Description

编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其应用

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，特别是涉及一个草甘膦抗性编码基因的克隆与应用。

背景技术

在农业生产中，要定期除掉田间杂草以免它们跟农作物争夺肥料。与手工除草相比，喷洒除草剂可以减小劳动强度，降低劳动成本，提高粮食产量。除草剂有很多种，毒性有强有弱，针对性也不同。草甘膦是一种比较温和、对环境破坏性很低的除草剂，但是它在杀死杂草的同时，也对作物有破坏作用，影响作物的生长。农民为了能够有针对性地除去杂草，往往要用好几种毒性较强的除草剂。给农作物转入草甘膦抗性基因，让作物体内在这个基因的指导下生产出能抵抗草甘膦的破坏作用的某种酶，作物即使吸入了草甘膦也能继续生长。因此，种植了抗除草剂转基因作物后，农民只要施加一两次温和的草甘膦，就可除去野草，又不损害农作物，而不必采用多次施加各种较有针对性但是毒性较强的除草剂。

一直以来，从自然界中寻找对草甘膦具有良好抗性的基因是我们的研究重点。各国科学家已经从根癌农杆菌(A.tumefaciens sp.strainCP4)、无色杆菌(A.sp.strain LBAA)、假单胞菌(P.sp.strain PG2982)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)等菌株中克隆了对草甘膦不敏感的EPSPS基因。这些基因在农作物中的过量表达，可以提高植物对草甘膦类除草剂的抗性。此外，通过突变EPSPS的某些位点的氨基酸，可以降低EPSPS对草甘膦的亲和性，提高基因的草甘膦耐受性。

20世纪80年代以来，美国Monsanto和Calegene等公司获得转基因抗草甘膦大豆、玉米、油菜、甜菜和棉花等作物系列品种，其中大豆等多种转基因作物已进入商品化生产。但大面积商业化应用的主要是Monsanto公司的CP4 EPSPS基因。目前，培育能够稳定遗传，并保证作物产量、质量的抗草甘膦作物仍是研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其具有优良的草甘膦抗性。

一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，其中所述EPSPS具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的氨基酸序列。本发明的基因，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的基因是从新疆纳拉提草原周边采集的土样中分离获得的一株人苍白杆菌中通过同源克隆的方法从该菌株中克隆得到的。通过草甘膦抗性实验，发现该基因具有良好的草甘膦抗性，可以耐受200mM草甘膦浓度，是同类基因中的优秀者。通过与经典的一型和二型合酶进行同源性比对发现，该基因与二型合酶相似性更高。通过进一步的分析发现，二型合酶中与草甘膦耐受有关的保守序列GDKS，SAQVK，NPTR，和RDHTE均在野生型的P23EPSPS中存在。通过将此基因连接到原核表达载体上并转入EPSPS合酶缺陷的大肠杆菌中发现，该基因可以互补EPSPS缺陷，使缺陷菌株恢复在M9限制性培养基上生长的功能。

应当理解，考虑到密码子的简并性和用于具体表达的植物或微生物的优选密码子，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，或在其非编码区在不影响基因表达的条件下，对SEQ ID No.1所示的核苷酸序列进行修改。因此，本发明还包含对SEQ ID No.1所示序列进行的替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，具有与本发明基因相同功能的核苷酸序列。

进一步地，本发明提供所述基因的克隆载体或表达载体，以及其转化宿主。其宿主可以为原核细胞、植物细胞、植物组织等等，其中的原核转化宿主细胞，可耐受300mmol以下的草甘膦。

本发明还提供一种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，并且，本发明还包括对表达自本发明基因的蛋白质(SEQ ID No.2)进行各种取代、添加和/或缺失一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明提供的基因和表达载体可用于转化农作物，达到植物耐受除草剂的目的。

附图说明

图1为实施例1中aroA_P23PCR扩增结果，其中1：DL2000Marker，2：aroA_P23；

图2为实施例4中aroA_P23互补实验结果，其中1：ER2799，2：ER-pUC18，3：ER-pUCP23；

图3为实施例4中ER-pUCP23和ER-pUC18菌株在不同草甘膦浓度的培养基中的生长；

图4为实施例6中P23EPSPS蛋白诱导表达SDS-PAGE检测，其中1：低分子量标准蛋白，2：pET_P23，IPTG诱导4h，3：pET_P23，IPTG诱导0h；

图5为实施例7中P23EPSPS氨基酸序列与经典的class I和class IIEPSPS比较结果；

图6为实施例9中JM-pUCP23和JM-pUC18菌株在不同草甘膦浓度的培养基中的生长。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：人苍白杆菌EPSPS编码基因全序列的获得

本发明从新疆纳拉提草原周边采集的土样中分离获得了一株人苍白杆菌，命名为P23。通过同源克隆的方法从该菌株中克隆了EPSPS编码基因。

1、基因组提取方法：基因组使用

公司的细菌基因组DNA提取试剂盒进行提取，详见其说明书。

2、PCR扩增方法

以NCBI中Ochrobacrum anthorpi全长EPSPS基因序列(登录号CP000758)设计两条寡核甘酸引物，PCR扩增获得P23的EPSPS编码全序列。

引物如下：

p23F：5’-ATGTCCCATTCTGCACCCCCGAAAC-3’

(如SEQ ID No.3所示)

p23R：5’-TCATCGCGCGTCGCTCAGTTCGAT-3’

(如SEQ ID No.4所示)

PCR反应条件如下：

灭菌蒸馏水    35.75μl

5×Buffer     10μl

dNTPs(10mmol) 1μl

Promega Taq   0.25μl

P23F(10pmol)  1μl

P23R(10pmol)  1μl

DNA           1μl(100ng)

                      

              50μl

PCR反应程序如下：

95℃ 5min

72℃ 7min

4℃  forever

PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，用Omega胶回收试剂盒回收约1500bp的DNA片段(见图1)，连接到pGEM T-easy载体上，热击法转化大肠杆菌JM109，通过蓝白斑筛选后挑取阳性克隆测序，所得的序列为Ochrobacrum anthorpi P23的EPSPS编码全序列。其中连接条件如下：

T4DNA连接酶            1μl

T4DNA连接酶10×buffer  1μl

pGEMT-easy             1μl 50ng

aroA_P23                3μl 60ng

灭菌蒸馏水             4μl

                        

4℃过夜连接            10μl

扩增得到的EPSPS编码基因，命名为aroA_P23。该基因序列如SEQID No.1所示。推导出该基因的蛋白序列，命名为P23EPSPS，序列如SEQ ID No.2所示。

实施例2：aroA_P23与克隆载体pUC18的重组及转化大肠杆菌JM109

1、PCR扩增方法

依据实施例1的测序结果，重新设计引物，从P23基因组中进行PCR扩增。

引物如下：

p23F-BamH I  CGGGATCCATGTCCCATTCTGCACCCCCGAAAC

(如SEQ ID No.5所示)

p23R-SalI    ACGCGTCGACTCATCGCGCGTCGCTCAGTTCGAT

(如SEQ ID No.6所示)

PCR反应条件如下：

灭菌蒸馏水             20.5μl

2×Buffer              25μl

dNTPs(10mmol)          1μl

PrimeSTAR HS           0.5μl

P23F-BamHI(10pmol)     1μl

P23R-SalI-1(10pmol)    1μl

DNA                    1ul(50ng)

                         

                       50μl

PCR反应程序如下：

98℃ 5min

4℃  forever

PCR扩增产物经琼脂糖电泳后，用Omega胶回收试剂盒回收约1500bp的DNA片段，之后用BamHI和SalI进行双酶切，酶切后用胶回收的方法回收约1500bp的片段，连接经过同样处理的pUC18载体，4℃连接过夜，热击法转化大肠杆菌JM109，菌落PCR的方法检测阳性克隆，测序，所得的序列为Ochrobacrum anthorpi P23的EPSPS编码全序列。与实施例1所得结果相同。

其中酶切条件如下：

pUC18/aroA_P23    15μl

BamHI                   0.5μl

SalI                    0.5μl

10×Buffer              2μl

灭菌蒸馏水              2μl

                            

37℃酶切3h              20μl

连接条件如下：

T4DNA连接酶             1μl

T4DNA连接酶10×buffer   1μl

pUC18(BamHI、SalI)      3μl 50ng

aroA_P23(BamHI、SalI)    3μl

灭菌蒸馏水              2μl

                            

4℃连接过夜             10μl

实施例3：P23EPSP合酶互补实验

1、实验方法：

将实施例2得到的重组载体pUC18-P23热击转化到EPSPS缺陷的大肠杆菌菌株ER2799中，所获得菌株命名为ER-pUCP23。将测序验证正确的克隆菌株ER-pUCP23，菌液涂布在M9固体平板上。同时以ER2799和转入了空载pUC18的ER2799做对照。

2、结果：

P23基因具有编码完整的EPSPS的功能。

实施例4：实施例3的克隆菌株的草甘膦抗性

1、实验方法：

大肠杆菌菌株ER-pUCP23接入含有不同浓度的液体培养基中(0、100、200、300、350、400、450mmol的草甘膦浓度)，结果显示ER-pUCP23能在300mmol草甘膦的M9培养基中生长，而阴性对照菌株在任何草甘膦浓度的培养基中均不能生长(见图2)。

2、结果：

ER-pUCP23菌株能够在300mM的草甘膦浓度下生长，但生长比较缓慢，200mM是基本能保持其正常生长的较合适的草甘膦浓度。在高于300mM的M9培养基中几乎不能生长。而对照菌株ER-pUC18在任何草甘膦浓度的培养基中均不能生长(见图3)。

实施例5：aroA_P23与表达载体pET28a的重组及转化大肠杆菌

1、实验方法：

从JM109/pUC_P23中提取质粒pUC_P23，用限制性内切酶BamHI和SalI进行质粒的双酶切；同时将表达载体pET28a用以上两种酶做双酶切。将酶切处理后的pUC_P23和表达载体pET28a用T4DNA连接酶连接，形成pET28a-P23，热击转化大肠杆菌BL21(DE3)，条件与实施例2一致。

实施例6：P23EPSPS的原核表达

1、实验方法：

构建好的重组载体pET28a-P23热击转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌JM109中，经0.5mmol IPTG诱导4h后检测目的蛋白的表达。

2、实验结果：

经过SDS-PAGE检测，目的蛋白有大量的表达，大小约为46kDa。(见图4)该蛋白经过浓缩以及纯化后，在竞争性抑制剂草甘膦的存在下测定P23EPSPS蛋白的酶动力学常数K_m、K_i，结果表明该合酶具有优秀的草甘膦抗性。

实施例7：EPSPS的多序列比对

1、实验方法：

将我们所克隆到的aroA_P23的氨基酸序列与已经发现的class I和class II EPSPS经过clustaW比对后，使用Mega4.0构建系统进化树。

2、实验结果：

P23EPSPS序列与II型合酶的相似性更高，属于II型(见图5)。该类合酶具有天然的草甘膦抗性。

实施例8：aroA_P23的酶动力学常数测定

1、实验方法：

采用孔雀绿染色法测定反应释放无机磷的吸光值从而达到测定酶活性的目的。K_m[PEP]的测定方法是将底物S3P溶液浓度恒定于1mM，在不同PEP浓度(0.01、0.03、0.04、0.05、0.07、0.1、0.2mM)下测定酶反应速率。

K_i[glyphosate]测定方法是在不同草甘膦浓度下(0、0.5、1、1.5)，测定PEP浓度为0.01、0.03、0.04、0.05、0.07、0.1、0.2mM时EPSPS的酶反应速度。将反应体系中底物S3P的浓度恒定为1mM。测定结果使用软件GraphPad Prism5.0的酶动力学分析模块，计算K_m、K_i值。

2、实验结果：

表1：aroA_P23酶动力学常数

EPSPS   来源	类   型	Vmax  (U/mg)	Km[PEP]  (μM)	Ki[glyphosate]  (μM)	Ki/Km	Reference
							aroAP23	II	6.97±0.3	11.12±2.2	298±61.1	26.8	本研究
aroAE.coli	I	(7.558  ±0.468)×  10-3	22.28  ±6.26	1.48±0.459	0.07	He，et  al.，2003

以上酶活特征常数说明aroA_P23和aroA_E.coli两种酶的K_m[PEP]值基本相似。aroA_P23的K_i[glyphosate]的值是aroA_E.coli的K_i[glyphosate]的两百倍。这些结果说明了aroA_P23与底物有很强的亲和性，受草甘膦的抑制作用远远小于aroA_E.oli，从而对抑制剂草甘膦的耐受能力也很强。在目前已经报道的各种II型EPSPS中，aroA_P23具有很强的竞争力。

实施例9：重组菌株的草甘膦抗性研究

1、实验方法：

为了验证基因aroA_P23的草甘膦抗性大小，将pUCP23重组质粒转入大肠杆菌JM109中，命名为JM-pUCP23(JM109/pUC18-P23)。将空载pUC18转入JM109中，命名为JM-pUC18，以该菌作为对照，观察在0、10、20、50、100、200、300mmol不同浓度草甘膦的M9液体培养基中，37℃、200rpm，摇瓶培养48h后菌株生长情况。

2、实验结果：

从图6可以看出，在没有加入草甘膦时JM-pUC18和JM-pUCP23的生长情况基本一致，但是在加入了草甘膦以后，前者的生长受到了极大的抑制，后者在低浓度草甘膦时生长反而受到了刺激，比不含草甘膦时生长状态要好。随着草甘膦浓度达到50mM时，JM-pUC18生长完全被抑制了，而JM-pUCP23的生长情况明显好于JM-pUC18。可见，转入了pUCP23重组质粒显著的提高了大肠杆菌JM109的草甘膦耐受能力。

由以上实施例可以看出，本发明通过从人苍白杆菌中克隆编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，EC 2.5.1.19)的基因，提供了一种来源于细菌的EPSPS编码基因全序列及其相应得氨基酸序列。具有优良的草甘膦抗性。又提供了含有P23EPSPS的克隆载体pUC18-P23和原核表达载体pET-P23以及分别含有这两种载体的大肠杆菌(E.coli)JM109细胞JM109/pUC18-P23和JM109/pET28a-P23。本发明可用于转化农作物，达到植物耐受除草剂的目的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶的基因及其应用

 

<130>KHP09112312.5

 

<160>6

 

<170>PatentIn version 3.5

 

<210>1

 

<211>1353

 

<212>DNA

 

<213>P23aroA

 

<400>1

 

atgtcccatt ctgcaccccc gaaaccagca accgcccgcc gctcggaggc acttacgggc     60

gaaattcgca ttccgggtga caaatccatc tcgcatcgtt ccttcatgtt cggcggcctt    120

gcatcgggtg aaacccgcat caccggcctt ctggaaggcg aagacgtcat caataccggt    180

cgcgccatgc aggccatggg cgcgaaaatc cgcaaggatg gcgatgcctg gatcatcaat    240

ggcgtcggca acggctgcct gttgcagccc gaagcagcgc tcgacttcgg caatgccgga    300

accggtgcgc gcctcaccat gggccttgtc ggcacctatg acatgagaac ctcctttatc    360

ggcgatgcct cgctttccaa gcgcccgatg ggtcgcgtgc tgaacccgtt gcgtgaaatg    420

ggcgttcagg tggaagcagc cgaaggcgac cgcatgccgc tgacgctgat cggccccaag    480

acggccaatc cgatcaccta tcgcgtgccg atggcatccg cacaggtcaa atccgccgtg    540

ctgctcgccg gtctcaacac gccgggcgtc accaccgtca tcgaaccggt catgacccgc    600

gaccacaccg aaaagatgct gcagggcttt ggcgccgatc tttcggttga aaccgacaag    660

gacggcgtgc gccatatccg catcaccgga cagggcaagc ttatcggcca gaccatcgac    720

gtaccgggtg atccgtcgtc aacggctttc ccgctcgttg ccgcccttct ggtcgaaggt    780

tcggatgtta ccatccgcaa cgtgctgatg aacccgaccc gtaccggcct gatcctgacg    840

ttgcaggaaa tgggcgccga tatcgaagtg ctcaatgccc gtcttgccgg cggcgaggat    900

gtcgccgatc tgcgcgtgaa ggcctcgaag ctgaagggcg ttgtcgttcc gccggaacgc    960

gctccgtcga tgatcgatga atatccggtt ctggccatcg ccgcgtcctt cgcggaaggc    1020

gaaaccgtga tggacggtct cgacgaactg cgcgtcaagg aatcggatcg tctggcagcg    1080

gttgcacgcg gtcttgaagc caatggcgtc gattgcaccg aaggcgagat gtcgctgacg    1140

gtccgcggtc gtcccgacgg caagggactg ggcggtggca cagtcgcaac ccatctcgat    1200

caccgcatcg cgatgagctt cctcgtcatg ggccttgcat cggaaaagcc ggtgacggtt    1260

gacgacagca ccatgatcgc cacgtctttc cccgaattca tggacatgat gccgggactg    1320

ggcgccaaga tcgaactgag cgacgcgcga tga                                 1353

<210>2

<211>450

<212>PRT

<213>P23EPSPS

<400>2

Met Ser His Ser Ala Pro Pro Lys Pro Ala Thr Ala Arg Arg Ser Glu

1               5                   10                  15

Ala Leu Thr Gly Glu Ile Arg Ile Pro Gly Asp Lys Ser Ile Ser His

            20                  25                  30

Arg Ser Phe Met Phe Gly Gly Leu Ala Ser Gly Glu Thr Arg Ile Thr

        35                  40                  45

Gly Leu Leu Glu Gly Glu Asp Val Ile Asn Thr Gly Arg Ala Met Gln

    50                  55                  60

Ala Met Gly Ala Lys Ile Arg Lys Asp Gly Asp Ala Trp Ile Ile Asn

65                  70                  75                  80

Gly Val Gly Asn Gly Cys Leu Leu Gln Pro Glu Ala Ala Leu Asp Phe

                85                  90                  95

Gly Asn Ala Gly Thr Gly Ala Arg Leu Thr Met Gly Leu Val Gly Thr

            100                 105                 110

Tyr Asp Met Arg Thr Ser Phe Ile Gly Asp Ala Ser Leu Ser Lys Arg

        115                 120                 125

Pro Met Gly Arg Val Leu Asn Pro Leu Arg Glu Met Gly Val Gln Val

    130                 135                 140

Glu Ala Ala Glu Gly Asp Arg Met Pro Leu Thr Leu Ile Gly Pro Lys

145                 150                 155                 160

Thr Ala Asn Pro Ile Thr Tyr Arg Val Pro Met Ala Ser Ala Gln Val

                165                 170                 175

Lys Ser Ala Val Leu Leu Ala Gly Leu Asn Thr Pro Gly Val Thr Thr

            180                 185                 190

Val Ile Glu Pro Val Met Thr Arg Asp His Thr Glu Lys Met Leu Gln

        195                 200                 205

Gly Phe Gly Ala Asp Leu Ser Val Glu Thr Asp Lys Asp Gly Val Arg

    210                 215                 220

His Ile Arg Ile Thr Gly Gln Gly Lys Leu Ile Gly Gln Thr Ile Asp

225                 230                 235                 240

Val Pro Gly Asp Pro Ser Ser Thr Ala Phe Pro Leu Val Ala Ala Leu

                245                 250                 255

Leu Val Glu Gly Ser Asp Val Thr Ile Arg Asn Val Leu Met Asn Pro

            260                 265                 270

Thr Arg Thr Gly Leu Ile Leu Thr Leu Gln Glu Met Gly Ala Asp Ile

        275                 280                 285

Glu Val Leu Asn Ala Arg Leu Ala Gly Gly Glu Asp Val Ala Asp Leu

    290                 295                 300

Arg Val Lys Ala Ser Lys Leu Lys Gly Val Val Val Pro Pro Glu Arg

305                 310                 315                 320

Ala Pro Ser Met Ile Asp Glu Tyr Pro Val Leu Ala Ile Ala Ala Ser

                325                 330                 335

Phe Ala Glu Gly Glu Thr Val Met Asp Gly Leu Asp Glu Leu Arg Val

            340                 345                 350

Lys Glu Ser Asp Arg Leu Ala Ala Val Ala Arg Gly Leu Glu Ala Asn

        355                 360                 365

Gly Val Asp Cys Thr Glu Gly Glu Met Ser Leu Thr Val Arg Gly Arg

    370                 375                 380

Pro Asp Gly Lys Gly Leu Gly Gly Gly Thr Val Ala Thr His Leu Asp

385                 390                 395                 400

His Arg Ile Ala Met Ser Phe Leu Val Met Gly Leu Ala Ser Glu Lys

                405                 410                 415

Pro Val Thr Val Asp Asp Ser Thr Met Ile Ala Thr Ser Phe Pro Glu

            420                 425                 430

Phe Met Asp Met Met Pro Gly Leu Gly Ala Lys Ile Glu Leu Ser Asp

       435                 440                 445

Ala Arg

    450

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgtcccatt ctgcaccccc gaaac                                            25

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcatcgcgcg tcgctcagtt cgat                                       24

<210>5

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

cgggatccat gtcccattct gcacccccga aac                             33

<210>6

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

acgcgtcgac tcatcgcgcg tcgctcagtt cgat                            34

Claims (8)

1.一种编码5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS的基因，其特征在于，其中所述EPSPS具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个氨基酸且具有相同功能的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的基因，其特征在于，其具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述基因的克隆载体或表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主。

5.如权利要求4所述的宿主，其特征在于，其可耐受300mmol以下的草甘膦。

6.一种5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶，其特征在于，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或该序列经改变、添加和/或缺失一个或多个核苷酸且具有相同功能的氨基酸序列。

7.权利要求1或2所述的基因在制备草甘膦耐受性转基因农作物中的应用。

8.权利要求3所述的表达载体在制备草甘膦耐受性转基因农作物中的应用。

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