DE69837916T2 - Verwendung von glyphosat-resistente maislinien - Google Patents

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    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C12N9/1092—3-Phosphoshikimate 1-carboxyvinyltransferase (2.5.1.19), i.e. 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase

Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren, um transgene Maispflanzen herzustellen, die gegen die Herbizide resistent sind, und Verfahren zum Verwenden derselben.
  • 2. Beschreibung der verwandten Technik
  • Die chemische Unkrautbekämpfung ist ein leistungsfähiges Mittel unseres technologischen Zeitalters. Das Abtöten von Unkraut, das lange als eine der anstrengendsten der landwirtschaftlichen Tätigkeiten bekannt war, hat eine völlig neue Seite bekommen, da immer mehr Chemikalien zum Arsenal der Herbizide hinzugefügt werden. Die Vereinigten Staaten haben die Welt sowohl bei der Herstellung als auch der Verwendung von Herbiziden angeführt, und als Ergebnis sind die Erträge von Mais, Sojabohnen, Baumwolle, Zuckerrüben und vielen anderen Feldfrüchten seit 1945 gestiegen, in einigen Fällen um 100 % oder mehr. Während die Verwendung von Düngemitteln und neuen, hoch ertragreichen Getreidesorten stark zur „grünen Revolution" beigetragen haben, stand die chemische Unkrautbekämpfung somit an der vordersten Front der technologischen Errungenschaft.
  • Eine besonders nützliche Art Herbizid ist eine, die ein breites Spektrum an Herbizidaktivität aufweist. Die Verwendung solcher Herbizide erübrigt die Notwendigkeit der Anwendung zahlreicher Herbizide. Das Problem mit derartigen Herbiziden liegt darin, dass sie typischerweise eine schädliche Wirkung auf jegliche Getreidearten ausüben, die gegenüber dem Herbizid exponiert werden. Eine Möglichkeit, um diese zu überwinden, besteht darin, dass man transformierte Getreidepflanzen mit Genen herstellt, die eine Resistenz gegen bestimmte Herbizide mit breitem Spektrum verleihen.
  • Kürzlich erzielte Fortschritte beim gentechnischen Verändern haben die notwendigen Mittel bereitgestellt, um Pflanzen so zu transformieren, dass sie fremde Gene enthalten. Es können daher Pflanzen hergestellt werden, die einzigartige Charakteristika von agronomischer Bedeutung aufweisen. Natürlich ist die Unkrautbekämpfung über eine Herbizidtoleranz eine solche vorteilhafte Eigenschaft, die hochgradig Kosten senkend und umweltverträglich ist. Herbizid-tolerante Pflanzen können die Notwendigkeit der Bodenbestellung, um Unkräuter zu bekämpfen, verringern, und dadurch die Bodenerosion wirksam verringern. Weiterhin können Herbizid-resistente Pflanzen die Zahl der verschiedenen auf dem Feld angewendeten Herbizide verringern.
  • Ein Herbizid, das in dieser Hinsicht der Gegenstand von zahlreichen Untersuchungen ist, ist N-Phosphonomethyl-glycin, das üblicherweise als Glyphosat bezeichnet wird. Glyphosat inhibiert den Shikimisäure-Stoffwechselweg, der zur Biosynthese von aromatischen Verbindungen führt, die Aminosäuren und Vitamine umfassen. Spezifisch inhibiert Glyphosat die Umwandlung von Phosphoenolpyruvinsäure und 3-Phosphoshikimisäure zu 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäure durch das Inhibieren des Enzyms 5-Enolpyruvyl-3-phosphoshikimisäuresynthase (EPSP-Synthase oder EPSPS).
  • Es wurde gezeigt, dass Glyphosat-tolerante Pflanzen durch das Einführen der Fähigkeit, eine höhere Konzentration der EPSP-Synthase herzustellen, in das Genom der Pflanze hergestellt werden können, wobei das Enzym bevorzugterweise Glyphosat-tolerant ist (Shah et al., 1986). Die Einführung von einem oder mehr als einem Glyphosat-Abbaugen in Pflanzen kann in Abhängigkeit von den physiologischen Wirkungen der Abbauprodukte ein Mittel zum Verleihen von Glyphosattoleranz an Pflanzen und/oder zum Verstärken der Toleranz von transgenen Pflanzen bereitstellen, die bereits eine Glyphosat-tolerante EPSP-Synthase exprimieren.
  • Der Glyphosat-Stoffwechsel (Abbau) wurde in einer großen Vielzahl von Pflanzen untersucht, und in den meisten dieser Untersuchungen wurde von wenig Abbau berichtet. In denjenigen Fällen, in denen von Abbau berichtet wurde, ist das anfängliche Abbauprodukt gewöhnlich Aminomethylphosphonat (AMPA) (Coupland, 1985; Marshall et al., 1987). In diesen Fällen ist es nicht klar, ob Glyphosat von der Pflanze oder von den kontaminierenden Mikroben auf der Blattoberfläche verstoffwechselt wird, auf die Glyphosat angewendet wurde. Von AMPA wurde berichtet, dass es viel weniger phytotoxisch auf die meisten Pflanzenarten wirkt als Glyphosat (Franz, 1985), aber nicht bei allen Pflanzenarten (Maier, 1983; Tanaka et al., 1986). Der Glyphosatabbau in Böden ist umfangreicher und schneller (Torstensson, 1985). Das identifizierte Hauptabbauprodukt ist AMPA (Rueppel et al., 1977; Nomura und Hilton, 1977), ein Phosphonat, das von einer großen Vielzahl von Mikroorganismen verstoffwechselt werden kann (Zeleznick et al., 1963; Mastalerz et al., 1965; Cook et al., 1978; Daughton et al., 1979a; 1979b; 1979c; Wackelt et al., 1987a). Es wurde eine Anzahl von Reinkulturen von Bakterien identifiziert, die Glyphosat über einen der beiden bekannten Wege abbauen (Schowanek und Verstraete, 1990; Weidhase et al., 1990; Liu et al., 1991). Von einem Weg, an dem eine „C-P-Lyase" beteiligt ist, die Glyphosat zu Sarkosin und anorganischem Orthophosphat (Pi) abbaut, wurde bei einer Pseudomonas-Art (Shinabarger und Braymer, 1986; Kishore und Jacob, 1987) und einer Arthrobacter-Art (Pipke et al., 1987b) berichtet. Von Reinkulturen, die in der Lage waren, Glyphosat zu AMPA abzubauen, wurde bei einer Flavobacterium-Art (Balthazor und Hallas, 1986), bei einer Pseudomonas-Art (Jacob et al., 1988) und bei Arthrobacter atrocyaneus (Pipke und Amrhein, 1988) berichtet. Zusätzlich wurde eine große Anzahl von Glyphosat zu AMPA umwandelnden Isolaten aus industriell aktivierten Schlämmen identifiziert, die Glyphosatabfälle behandeln (Hallas et al., 1988). Jedoch wurden bisher weder die Anzahl und die Natur der für diese Abbauvorgänge verantwortlichen bakteriellen Gene bestimmt, noch wurde das oder wurden die Gene isoliert.
  • Die Entwicklung von gegen die Herbizidverbindung Glyphosat resistenten Pflanzen war ein Ziel beim Verändern zahlreicher Pflanzenarten ( US-Pat. Nr. 4,769,061 ). Von der Entwicklung von Glyphosat-resistenten Tabakpflanzen haben Comai et al., (1985) berichtet. Die Herbizidresistenz wurde Pflanzen durch die Expression eines aus Salmonella typhimurium stammenden aroA-Genes verliehen, das für eine Glyphosat-resistente Form des Enzyms EPSP-Synthase kodiert. Zusätzlich wurden Glyphosat-resistente Sojabohnen hergestellt (Monsanto, APHIS Petition 93-258-01p). Verfahren zur Herstellung von Glyphosat-resistenten Getreidepflanzen sind ebenfalls beschrieben worden ( WO 95/06128 ; US-Patent Nr. 5,554,798 ). In ähnlicher Weise wurde ein Glyphosat-Oxidoreduktase-Gen zur Verwendung beim Verleihen von Glyphosatresistenz beschrieben ( US-Pat. Nr. 5,463,175 ). WO 9506128A offenbart transformierte Maiszellen. WO 9704103 , EP-A-0426641 und WO 9704116 betreffen alle Glyphosat-resistenten Mais.
  • Das letztendliche Ziel beim Herstellen von transgenen Glyphosat-resistenten Maispflanzen ist es, Pflanzen bereitzustellen, die mit einer Menge Glyphosat behandelt werden können, die ausreicht, um Unkräuter abzutöten, ohne eine schädliche Wirkung auf den Ertrag oder Fruchtbarkeit auszuüben. In dieser Hinsicht ist der Stand der Technik gescheitert. Es besteht in der Landwirtschaft daher ein großer Bedarf an Maispflanzen, die auf dem Feld direkt mit Glyphosat besprüht werden können, das dadurch Unkräuter abtötet, aber ansonsten keine schädliche Wirkung auf das Getreide selbst hervorruft.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung, wie in den Ansprüchen definiert, strebt danach, Mängel des Standes der Technik durch das Bereitstellen von fruchtbaren transgenen Maispflanzen zu überwinden, die auf dem Feld mit Glyphosat ohne einen sich daraus ergebenden Verlust beim Ertrag oder der Fruchtbarkeit behandelt werden können. Somit betrifft ein Aspekt der vorliegenden Offenbarung eine fruchtbare transgene Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst. Insbesondere umfasst die Expressionskassette: (i) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (ii) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, wobei der Ertrag der fruchtbaren transgenen Maispflanze nicht von einer Glyphosat-Behandlungsmenge beeinflusst wird, die den Ertrag einer Maispflanze beeinflusst, der das modifizierte Maisgen fehlt.
  • In einem weiteren Aspekt kann die Maispflanze einen Promotor umfassen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor besteht. Die Pflanze kann eine Expressionskassette umfassen, die aus pDPG434, pDPG427 oder pDPG443 stammt. Die Expressionskassette kann weiterhin als pDPG434 definiert sein, und die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GA21 und FI117 besteht; wobei diese Ereignisse umfassende Samen bei der ATCC hinterlegt und ihnen die ATCC-Zugangsnummern ATCC 209033 bzw. ATCC 209031 zugeordnet wurden. Die das Transformationsereignis FI117 umfassende Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie ein bar-Gen umfasst.
  • In noch einem weiteren Aspekt kann die Maispflanze eine pDPG427-Expressionskassette umfassen und weiterhin derart definiert sein, dass sie das Transformationsereignis GG25 umfasst, oder sie kann eine Expressionskassette von pDPG443 umfassen, und die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie das Transformationsereignis GJ11 umfasst; wobei die Transformationsereignisse GG25 und GJ11 umfassende Samen bei der ATCC hinterlegt und ihnen die ATCC-Zugangsnummern ATCC 209032 bzw. ATCC 209030 zugeordnet wurden. Es ist beabsichtigt, dass die Offenbarung die Nachkommenschaft jeglicher Generation und jeglicher Samen der obigen Maispflanzen genauso wie die Samen der Nachkommenschaft jeglicher Generation umfasst.
  • Die vorliegende Offenbarung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen einer fruchtbaren transgenen Maispflanze. Das Verfahren umfasst: (i) Bereitstellen einer Expressionskassette umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, (ii) Kontaktieren der Empfänger-Maiszellen mit der Expressionskassette unter Bedingungen, die die Aufnahme der Expressionskassette durch die Empfänger-Zellen erlauben; (iii) Selektieren von Empfänger-Zellen, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfassen; (iv) Regenerieren von Pflanzen aus den selektierten Zellen; und (v) Identifizieren einer fruchtbaren transgenen Maispflanze, deren Ertrag nicht durch eine Glyphosat-Behandlungsmenge beeinflusst ist, die den Ertrag einer Maispflanze beeinflusst, der das modifizierte Maisgen fehlt.
  • Das Verfahren kann jegliches Verfahren zum Kontaktieren umfassen, das die Mikroprojektilbombardierung, Elektroporation oder durch Agrobacterium vermittelte Transformation umfasst, ist aber nicht auf diese beschränkt. Das Selektieren kann das Behandeln von Empfänger-Zellen mit Glyphosat umfassen. Der Promotor kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor besteht. Insbesondere kann die Expressionskassette aus pDPG434, pDPG427 und/oder pDPG443 stammen. Die Expressionskassette kann insbesondere pDPG434 sein, und die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GA21 und FI117 besteht. Bei diesem Verfahren kann das Transformationsereignis auch FI117 sein, und die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie ein bar-Gen umfasst. Die Expressionskassette kann auch pDPG427 sein, und die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie das Transformationsereignis GG25 umfasst. Das Verfahren umfasst auch eine Expressionskassette von pDPG443, wobei die Maispflanze weiter derart definiert sein kann, dass sie das Transformationsereignis GJ11 umfasst.
  • In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Offenbarung eine fruchtbare transgene Maispflanze, die nach einem Verfahren hergestellt ist, umfassend: (i) Bereitstellen einer Expressionskassette umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist; (ii) Kontaktieren von Empfänger-Maiszellen mit der Expressionskassette unter Bedingungen, die die Aufnahme der Expressionskassette durch die Empfänger-Zellen erlauben; (iii) Selektieren von Empfänger-Zellen, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfassen; (iv) Regenerieren von Pflanzen aus den selektierten Zellen; und (v) Identifizieren eines fruchtbaren transgenen Mais, dessen Ertrag nicht durch eine Glyphosat-Behandlungsmenge beeinflusst wird, die den Ertrag eines Mais beeinflusst, dem das modifizierte Maisgen fehlt. Der Mais kann einen Promotor aufweisen, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor besteht. Die Expressionskassette kann aus pDPG434, pDPG427 und pDPG443 stammen. Die Offenbarung umfasst die Nachkommenschaft jeglicher Generation und jeglicher Samen der fruchtbaren transgenen Maispflanze genauso wie Samen der Nachkommenschaft der Maispflanze.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente, durch Inzucht erzeugte, fruchtbare Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an Position 102 ein Isoleucin und an Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist. Der Promotor kann aus der Gruppe gewählt sein, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor besteht. Die Expressionskassette kann aus pDPG434, pDPG427 und pDPG443 stammen. Insbesondere kann die durch Inzucht erzeugte Maispflanze weiter derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die GJ11, FI117, GG25 oder GA21 umfasst, wobei diese Transformationsereignisse umfassende Samen hinterlegt und ihnen die ATCC-Zugangsnummern ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033 zugeordnet wurden.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung ist eine Glyphosat-resistente, gekreuzte fruchtbare transgene Maispflanze, die gemäß dem Verfahren hergestellt ist, umfassend: (i) Erhalten einer fruchtbaren transgenen Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist; (ii) Kreuzen der fruchtbaren transgenen Maispflanze mit einer zweiten Maispflanze, der die Expressionskassette fehlt, um eine dritte Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst, und (iii) Rückkreuzen der dritten Maispflanze, um eine rückgekreuzte fruchtbare Maispflanze zu erhalten, wobei das modifizierte EPSPS-Gen durch ein weibliches Elternteil vererbt wird. Insbesondere kann die Maispflanze eine durch Inzucht erzeugte Maispflanze sein. Die dritte Maispflanze kann ein Hybrid sein. Die Maispflanze kann insbesondere weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GJ11, FI117, GG25 oder GA21 besteht, ATCC-Zugangsnummern ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033.
  • Noch eine weitere Ausführungsform der Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente, gekreuzte fruchtbare transgene Maispflanze, die gemäß des Verfahrens hergestellt ist, umfassend: (i) Erhalten einer fruchtbaren transgenen Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an Position 102 ein Isoleucin und an Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, und (ii) Kreuzen der fruchtbaren transgenen mit einer zweiten Maispflanze, der die Expressionskassette fehlt, um eine dritte Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst, wobei das modifizierte EPSPS-Gen über ein weibliches Elternteil vererbt wird. Insbesondere kann die Maispflanze durch Inzucht erzeugt sein, und die dritte Maispflanze kann ein Hybrid sein. Insbesondere kann die Maispflanze weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GJ11, FI117, GG25 oder GA21 besteht, wobei die diese Transformationsereignisse umfassenden Samen hinterlegt und ihnen die Zugangsnummern ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033 zugeordnet wurden.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente, gekreuzte fruchtbare transgene Maispflanze, die gemäß dem Verfahren hergestellt ist, umfassend: (i) Erhalten einer weiblichen transgenen Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an Position 102 ein Isoleucin und an Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, (ii) Kreuzen der fruchtbaren transgenen Maispflanze mit einer zweiten Maispflanze, um eine dritte Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst, und (iii) Rückkreuzen der dritten Maispflanze, um eine rückgekreuzte fruchtbare Maispflanze zu erhalten, wobei das modifizierte EPSPS-Gen durch einen weiblichen Elternteil vererbt wird. Insbesondere kann die Maispflanze durch Inzucht erzeugt sein, und die dritte Maispflanze kann ein Hybrid sein. Die Maispflanze kann weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem GJ11-, FI117-, GG25- oder GA21-Transformationsereignis besteht, wobei die diese Transformationsereignisse umfassenden Samen die ATCC-Zugangsnummern ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033 aufweisen.
  • Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente Hybrid-Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist. Der Promotor ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor besteht, und die Expressionskassette stammt aus pDPG434, pDPG427 und pDPG443. Die Maispflanze kann insbesondere weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GA21, GG25, GJ11 und FI117 besteht.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente, transgene Hybrid-Maispflanze, die gemäß des Verfahrens hergestellt ist, das das Kreuzen einer ersten und zweiten durch Inzucht erzeugten Maispflanze umfasst, wobei eine der ersten oder zweiten durch Inzucht erzeugten Maispflanze eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist. Der Promotor ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus einem Reis-Aktin-Promotor, einem Mais-Histon-Promotor und einem fusionierten CaMV-35S-Arabidopsis-Histon-Promotor ausgewählt ist, und die Expressionskassette stammt aus pDPG434, pDPG427 und/oder pDPG443. Die Maispflanze kann insbesondere weiterhin derart definiert sein, dass sie ein Transformationsereignis umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus GA21, GG25, GJ11 und FI117 besteht.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft eine Glyphosat-resistente, gekreuzte, weibliche transgene Maispflanze, die durch ein Verfahren hergestellt ist, umfassend: (i) Erhalten einer fruchtbaren transgenen Maispflanze, die eine chromosomal integrierte Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, (ii) Kreuzen der fruchtbaren transgenen Maispflanze mit einer zweiten Maispflanze, um eine dritte Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst, und (iii) Kreuzen der dritten fruchtbaren transgenen Maispflanze mit einer vierten Maispflanze, um einen fünfte transgene Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst. Die zweite und die vierte Maispflanze weisen den gleichen Gentyp auf. Alternativ weisen die zweite und die vierte Maispflanze verschiedene Gentypen auf.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft einen Samen einer fruchtbaren, transgenen Maispflanze, wobei der Samen eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, wobei der Samen durch ein Verfahren hergestellt ist, der die folgenden Schritte umfasst: (i) Erhalten einer fruchtbaren, transgenen Eltern-Maispflanze, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfasst, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, (ii) Züchten der Elternpflanze mit einer zweiten fruchtbaren Maispflanze, um eine Vielzahl an Nachkommen fruchtbarer transgener Maispflanzen zu erzeugen, wobei Maispflanzen der Nachkommenschaft Pflanzen umfassen, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette exprimieren, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Produkt kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, (iii) Selektieren einer Pflanze aus den Maispflanzen der Nachkommenschaft, die eine Resistenz gegen Glyphosat aufweist. und (iv) Erhalten von Samen aus der selektierten Maispflanze der Nachkommenschaft. Die Maispflanzen der Nachkommenschaft sind zwei Generationen von der transgenen Eltern-Maispflanze entfernt.
  • Die Maispflanzen der Nachkommenschaft, die eine Resistenz gegen Glyphosat aufweisen, können durch das Untersuchen von Pflanzen auf eine Resistenz gegen Glyphosat bei einer Behandlungsmenge von z. B. 1X, 2X, 3X oder 4X (1X ist äquivalent zu 16 Unzen RoundupTM pro Acre) selektiert werden. Insbesondere ist die zweite fruchtbare Maispflanze eine nicht-transgene Maispflanze, und die Pflanze ist mit Pollen aus einer männlichen transgenen Eltern-Maispflanze bestäubt. Die Eltern-Maispflanze kann mit Pollen aus der zweiten fruchtbaren Maispflanze bestäubt sein, wobei die Eltern-Maispflanze eine weibliche transgene Eltern-Maispflanze ist.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Erhöhen des Ertrages von Getreide auf einem Feld, umfassend: (i) Auspflanzen von fruchtbaren transgenen Maispflanzen, die mit einer Expressionskassette transformiert sind, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Protein kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, und (ii) Anwenden von Glyphosat auf das Feld bei einer Behandlungsmenge, die den Ertrag einer Maispflanze inhibiert, die das modifizierte Maisgen nicht umfasst, wobei der Ertrag der fruchtbaren transgenen Maispflanze nicht durch die Glyphosat-Behandlung beeinflusst wird. Insbesondere kann die Glyphosat-Behandlungsmenge 1X, 2X oder 4X betragen.
  • Noch ein weiterer Aspekt der Offenbarung betrifft ein Verfahren zum Inhibieren des Unkrautwachstums auf einem Getreidefeld, umfassend: (i) Auspflanzen von fruchtbaren transgenen Maispflanzen, die mit einer Expressionskassette transformiert sind, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Protein kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, und (ii) Anwenden von Glyphosat auf das Feld bei einer Behandlungsmenge, die den Ertrag einer Maispflanze inhibiert, die das modifizierte Maisgen nicht enthält, wobei der Ertrag der fruchtbaren transgenen Maispflanze durch die Glyphosat-Behandlung nicht beeinflusst wird. Insbesondere kann die Glyphosat-Behandlungsmenge 1X, 2X oder 4X betragen.
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Anbauen von Getreide, umfassend: (i) Auspflanzen von fruchtbaren transgenen Maispflanzen, die mit einer Expressionskassette transformiert sind, umfassend (a) ein modifiziertes Mais-EPSPS-Gen, das für ein EPSPS-Protein kodiert, das an der Position 102 ein Isoleucin und an der Position 106 ein Serin aufweist, und (b) einen in Mais aktiven Promotor, der in Pollen weniger wirksam exprimiert wird als in vegetativem Gewebe und mit dem EPSPS-Gen funktionsfähig verbunden ist, und (ii) Behandeln des Getreides mit Glyphosat bei einer Behandlungsmenge, die den Ertrag einer Maispflanze inhibiert, die das modifizierte Maisgen nicht umfasst, wobei der Ertrag der fruchtbaren transgenen Maispflanze durch die Glyphosat-Behandlung nicht beeinflusst wird. In besonderen Ausführungsformen kann die Behandlungsmenge 1X, 2X oder 4X betragen.
  • Es ist klar, dass die Fähigkeit, selbst eine einzige fruchtbare, transgene Getreidelinie bereitzustellen, im Allgemeinen ausreichend ist, um die Einführung des transgenen Bestandteils (z. B. rekombinante DNA) von der Linie in eine zweite Getreidelinie der Wahl zu erlauben. Dies ist der Fall, weil das Praktizieren der Erfindung es einem durch das Bereitstellen von fruchtbaren transgenen Nachkommen nachfolgend erlaubt, ein ausgewähltes Gen durch eine Serie von Züchtungsmanipulationen aus einer Getreidelinie in eine völlig andere Getreidelinie zu bewegen. Daher ist es beabsichtigt, dass die vorliegende Offenbarung eine jegliche Maispflanze aus jeglicher Generation umfasst, die ein Transgen oder mehrere Transgen aufweist, die ein GJ11-, FI117-, GG25- oder GA21-Transformationsereignis umfassen, wobei Samen, die diese Transformationsereignisse umfassen, die ATCC-Zugangsnummern ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033 aufweisen. Die Offenbarung umfasst weiterhin die Samen von Maispflanzen jeglicher Generation, die die GJ11-, FI117-, GG25- oder GA21-Transformationsereignisse umfasst.
  • Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zum Pflanzenzüchten bereit wie in den Ansprüchen 1-8 beansprucht, umfassend die Schritte (i) Aussähen von Samen in Bestäubungsnähe, die in der Lage sind, zu einer ersten und einer zweiten Elternpflanze heranzuwachsen, wobei die erste Elternpflanze ein erstes Transgen umfasst, die Pflanze in der Lage ist, durch Behandlung mit einem vorausgewählten Herbizid männlich steril gemacht zu werden, und wobei die erste Pflanze gegen das vorausgewählte Herbizid resistent ist; (ii) Kultivieren der Samen, um die erste und zweite Elternpflanze herzustellen, (iii) Induzieren von männlicher Sterilität in der ersten Elternpflanze durch Behandeln der Pflanze mit dem vorausgewählten Herbizid, (iv) Erlauben der zweiten Getreidepflanze, die erste Elternpflanze zu bestäuben; und (v) Sammeln der auf der ersten Pflanze hergestellten Samen. In besonderen Ausführungsformen ist die zweite Elternpflanze weiter derart definiert, dass sie resistent gegen das vorausgewählte Herbizid ist.
  • Die erste und zweite Pflanze kann aus der Gruppe ausgewählt sein, die aus Mais, Weizen, Reis, Hafer, Gerste und Sorghum besteht. Das vorausgewählte Herbizid ist Glyphosat, das Herbizid kann jedoch in anderen offenbarten Ausführungsformen, die nicht zu dieser Erfindung gehören, Glufosinat, Imidazolinon, Sulphonylharnstoff, Kanamycin, G418, Bromoxynil oder Methotrexat sein. Das erste Transgen kann ein GG25-Transformationsereignis und/oder ein GJ11-Transformationsereignis oder jegliches andere geeignete ähnliche Transgen umfassen. Die zweite Pflanze kann ein GA21-Transformationsereignis und/oder ein FI117-Transformationsereignis oder jegliches andere geeignete ähnliche Transgen umfassen. In besonderen Ausführungsformen umfasst der Schritt des Induzieren männlicher Sterilität das Behandeln mit einer Konzentration von Glyphosat von 8 Unzen pro Acre bis 96 Unzen pro Acre, mit der zwischen den Entwicklungsphasen V5 und VT behandelt werden kann.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1. Plasmidkarte von pDPG165. Die Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Basenpaaren angegeben.
  • 2. Plasmidkarte von pDPG427. Die für Southern Blot-Analysen verwendeten Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Basenpaaren angegeben.
  • 3. Plasmidkarte von pDPG434. Die für Southern Blot-Analysen verwendeten Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Basenpaaren angegeben.
  • 4. Plasmidkarte von pDPG443. Die für Southern Blot-Analysen verwendeten Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Basenpaaren angegeben.
  • 5A und 5B. Southern Blot-Analyse, um die Anzahl der transgenen Insertionen in GA21 zu bestimmen. A: Spur 1 enthält mit EcoRV verdaute GA21-DNA. Spur 2 enthält mit EcoRV verdaute, nicht transformierte Kontroll-DNA. Spur 3 enthält mit NotI verdauten pDPG434. Der Blot wurde mit dem 3,4 kb NotI-Fragment aus pDPG434 sondiert. B: Der in A gezeigte Blot wurde abgezogen und erneut mit einem 324 bp-Fragment des mutierten EPSPS-Gens sondiert.
  • 6. Southern Blot-Analyse, um die Kopienanzahl und Integrität des mutierten EPSPS-Gens abzuschätzen. Spur 1 enthält mit EcoRI/XbaI verdaute GA21-DNA. Spur 2 enthält nicht transformierte, mit EcoRI/XbaI verdaute Kontroll-DNA. Spur 3 enthält mit EcoRI/XbaI verdauten pDPG434. Der Blot wurde mit dem 324 bp-PCR-Fragment des EPSPS-Gens sondiert.
  • 7. Southern Blot-Analyse, um das Fehlen der Plasmid-Rückgratsequenz in GA21 zu bestätigen. Genomische DNA einer mit dem bla-Gen transformierten Pflanze (Spur 1), einer GA21-Pflanze (Spur 2) und mit Plasmid-DNA von pDPG427 wurde mit BglII verdaut. Der Blot wurde mit einem 1,7-SspI/AflIII-kb-Fragment aus pBluescript SK(–) sondiert, das den ColE1-Replikationsursprung und das bla-Gen enthält.
  • 8A und 8B. Wirkung der Glyphosat-Behandlung auf das Wachstum und die Fruchtbarkeit von DK580- und DK626-BC4-Hybriden der GA21-, FI117-, GG25- und GJ11-Transformationsereignisse. Die Behandlungen bestanden aus Glyphosat-Behandlungen der Mengen 0X, 1X und 4X (1X = 16 Unzen ROUNDUP ULTRATM/Acre). Die mittlere ELH (erweiterte Blatthöhe in Zentimetern) wurde 10 Tage nach der Glyphosat-Behandlung gemessen. A. Wirkungen der Glyphosat-Behandlung in der Entwicklungsphase V4. B. Wirkungen der Glyphosat-Behandlung in der Entwicklungsphase V8 der.
  • 9A und 9B. Wirkung einer Glyphosat-Behandlung auf den Ertrag von DK580- und DK626-Hybriden mit den FI117-, GA21-, GG25- und GJ11-Transformationsereignissen. Vergleiche werden zwischen den 4 Transformationsereignissen in jedem der beiden Hybride sowohl mit als auch ohne Glyphosat-Behandlung angestellt. Zusätzlich werden Vergleiche zwischen jedem der Hybride mit dem introgressierten Transformationsereignis gegen den Hybrid ohne das Transformationsereignis angestellt. A. Vergleiche der Wirkung der Glyphosat-Behandlung auf den Ertrag von DK580-Hybriden, wenn mit ihr in V4 behandelt wird. B. Wirkung der Glyphosat-Behandlung auf den Ertrag von DK626-Hybriden, wenn mit ihr in V8 behandelt wird.
  • 10. Southern Blot-Analyse, um die transgenen Insertionen GA21, FI117, GG25 und GJ11 nachzuweisen. Southern Blot von mit BglII verdauter genomischer DNA (Spuren 2, 5, 10, 11, 12) und von Plasmid-DNA (Spur 13). Der Blot wurde mit der 0,27 kb nos-3'-Polyadenylierungsregion aus dem Nopalin-Synthasegen von Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984) sondiert. Die Spuren 2, 5, 10 und 11 enthalten genomische DNA aus Pflanzen, die die FI117-, GA21-, GG25- bzw. GJ11-Transformationsereignisse aufweisen. Spur 12 enthält DNA aus einer nicht-transformierten Maispflanze als Negativkontrolle, und Spur 13 enthält pDPG427-Plasmid-DNA.
  • 11A, 11B und 11C. Southern Blot-Analyse, um die transgenen Insertionen GA21, GG25 und GJ11 unter Verwendung von verschiedenen Restriktionsenzyme nachzuweisen. Genomische DNA einer nicht-transformierten Kontrollpflanze (Spur 1) genauso wie von das GA21-, GG25- und GJ11 (Spuren 2, 3 bzw. 4)-Transformationsereignis enthaltenden Pflanzen wurden mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut und mit einem durch PCR erzeugten 324 bp-Fragment des EPSPS-Gens (bezüglich der Erzeugung des EPSPS-Fragmentes siehe Beispiel 8) sondiert. Die DNA wurde mit EcoRI (11A), SphI (11B) und SacI (11C) verdaut.
  • 12 Abgeleitete Aminosäuresequenz aus dem mutierten Getreide-EPSPS-Protein. Die Sequenz umfasst, das aus den Getreide- und Sonnenblumen-Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylaseoxygenase (RuBisCo)-Genen (die Aminosäuren 1-125 sind das Transitpeptid) isolierte OTP-Transitpeptid.
  • 13. Feldgestaltung zur Untersuchung der Glyphosat-Resistenz in GA21-, GG25-, FI117- und GJ11-DK580- und DK626-Hybriden. Die Wiederholung (1-3), Spalte (COL1-COL12), Reihe (1-4), Hybrid (DK580 oder DK626), das Transformationsereignis (GA21, FI117, GG25 oder GJ11), der Status, ob transformiert oder nicht-transformiert (N oder T), die Glyphosat- Behandlungsmenge (0X, 1X oder 4X) und die Entwicklungsphase bei der Glyphosat-Behandlung (V4 oder V8) sind angegeben. Die Tests wurden während des Jahres 1996 in Dekalb, Illinois und Thomasboro, Illinois durchgeführt. Alle Reihen wurden mit der doppelten normalen Bepflanzungsdichte, d. h. 60 Samen pro Reihe, bepflanzt, weil die Hybride sich hinsichtlich der Eigenschaft der Glyphosat-Resistenz 1:1 aufspalten. Besprühte Pflanzen wurden nicht früher als 7 Tage nach der Behandlung von Glyphosat zu einem Zeitpunkt auf 30 Pflanzen pro Reihe ausgedünnt, zu dem Glyphosat-empfindliche Pflanzen identifiziert werden konnten. Unbesprühte Bereiche wurden gleichzeitig auf 30 Pflanzen pro Reihe ausgedünnt.
  • 14. Plasmidkarte von pDPG425. Hauptbestandteile und Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Kilobasenpaaren angegeben.
  • 15. Plasmidkarte von pDPG405. Hauptbestandteile und Restriktionsstellen sind gezeigt, und ihre Lage ist in Basenpaaren angegeben.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Zusätzlich zur direkten Transformation eines bestimmten Gentypen mit einem mutierten EPSPS-Gen können Glyphosat-resistente Pflanzen durch das Kreuzen einer Pflanze, die ein mutiertes EPSPS-Gen aufweist, mit einer zweiten, Glyphosat-empfindlichen Pflanze hergestellt werden. Das „Kreuzen" einer Pflanze, um eine Pflanzenlinie bereitzustellen, die relativ zu einer Ausgangspflanzenlinie einen erhöhten Ertrag aufweist, wie hierin offenbart, wird als die Techniken definiert, die bewirken, dass ein mutiertes EPSPS-Gen in eine Pflanzenlinie durch das Kreuzen einer Ausgangslinie mit einer Spenderpflanzenlinie eingeführt wird, die ein mutiertes EPSPS-Gen umfasst. Man würde im Allgemeinen die folgenden Schritte ausführen, um dies zu erreichen:
    • (a) Pflanze Samen der ersten (Ausgangslinie) und zweiten (Spenderpflanzenlinie, die ein mutiertes EPSPS-Gen enthält) Elternpflanzen aus;
    • (b) Ziehe die Samen der ersten und zweiten Elternpflanze zu Pflanzen heran, die Blüten tragen;
    • (c) Bestäube die weibliche Blüte der ersten Elternpflanze mit den Pollen der zweiten Elternpflanze; und
    • (d) Ernte auf der ersten Elternpflanze, die die weibliche Blüte trägt, hergestellte Samen.
  • Eine Rückkreuzungsumwandlung ist hierin als das Verfahren definiert, das die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Kreuzen einer Pflanze eines ersten Gentyps, der eine erwünschtes Gen, ein erwünschtes DNA-Sequenz-Element enthält, mit einer Pflanze eines zweiten Gentyps, dem das erwünschte Gen, die erwünschte DNA-Sequenz oder das erwünschte DNA-Element fehlt;
    • (b) Selektieren einer oder mehr als einer Pflanze aus der Nachkommenschaft, die das erwünschte Gen, die erwünschte DNA-Sequenz oder das erwünschte DNA-Element enthält;
    • (c) Kreuzen der Pflanze aus der Nachkommenschaft mit einer Pflanze des zweiten Gentyps; und
    • (d) Wiederholen der Schritte (b) und (c) zum Zwecke des Übertragens des erwünschten Gens, der erwünschten DNA-Sequenz oder des erwünschten DNA-Elementes von einer Pflanze eines ersten Gentyps auf einer Pflanze eines zweiten Gentyps.
  • Die Introgression eines DNA-Elementes in einen Pflanzen-Gentyp ist als das Ergebnis des Verfahrens der Rückkreuzungsumwandlung definiert. Ein Pflanzengenotyp, in den eine DNA-Sequenz introgressiert wurde, kann als ein durch Rückkreuzung umgewandelter Gentyp, eine durch Rückkreuzung umgewandelte Linie, eine durch Rückkreuzung umgewandelte Inzucht oder ein durch Rückkreuzung umgewandelter Hybrid bezeichnet werden. In ähnlicher Weise kann ein Pflanzengenotyp, dem die erwünschte DNA-Sequenz fehlt, als ein nicht umgewandelter Gentyp, eine nicht umgewandelte Linie, eine nicht umgewandelte Inzucht oder ein nicht umgewandelter Hybrid bezeichnet werden.
  • Es ist vorgesehen, dass Glyphosat-resistente Pflanzen durch die Übertragung von der DNA-Sequenz, die ein mutiertes EPSPS-Gen umfasst und von benachbarten pflanzengenomischen DNA-Sequenzen aus mit einem FI117-, GA21-, GG25- und GJ11 mutierten EPSPS-Gen transformierten Spenderpflanzen umfasst, auf einer Empfänger-Pflanze erhalten werden, wobei die Empfängerpflanze nach der Einführung des für das mutierte EPSPS-Gen kodierenden DNA-Segmentes eine erhöhte Toleranz gegenüber dem Herbizid Glyphosat folgend aufweist. Die DNA-Sequenz kann durch den Vorgang der Rückkreuzungsumwandlung weiterhin auf andere Gentypen übertragen werden, und die Glyphosat-Resistenz der durch Rückkreuzung umgewandelten Pflanzen oder der von ihnen stammenden Hybride ist im Vergleich zu der nicht umgewandelten Pflanze erhöht. Integrationsereignisse des mutierten EPSPS-Gens, genauso wie die assoziierte Vektor-DNA, können als genetische Marker bei dem Marker-gestützten Züchten zum Zweck des Selektierens von Maispflanzen mit erhöhter Herbizidresistenz verwendet werden.
  • I. Herbizidbekämpfung von Unkräutern
  • Die chemische Unkrautbekämpfung ist eine Wissenschaft, die Wissen auf den Gebieten der Chemie und Biologie, eine gewisse Vertrautheit mit den Reaktionen von Pflanzen auf phytotoxische Agenzien und wenigstens Beobachtungserfahrungen hinsichtlich der Reaktionen von üblichen Unkräutern und Feldfrüchten auf Herbizide umfasst. Die Ökologie von Unkräutern und Feldfrüchten und die Berücksichtigung von den Faktoren, die die Selektivität, Toleranz und Empfindlichkeit bestimmen, sind wichtig. Und schließlich benötigt man einen großen Überhang an detaillierten Informationen, die die Rolle der Unkrautbekämpfung in der praktischen Landwirtschaft betreffen.
  • Unkräuter stellen für die menschliche Gesundheit und das menschliche Wohlergehen eine Bedrohung dar. Sie verringern den Ertrag und Wert von Feldfrüchten, und erhöhen die Kosten der Produktion und Ernte. Die Hauptmittel, durch die Unkräuter diese Wirkungen verursachen, sind:
    • 1. Konkurrieren mit Feldfruchtpflanzen um die für das Wachstum und die Entwicklung notwendigen Faktoren.
    • 2. Herstellung von toxischen oder reizenden Chemikalien, die bei Menschen oder Tieren Gesundheitsprobleme verursachen.
    • 3. Herstellung immenser Mengen von Samen oder vegetativen reproduktiven Teilen oder von beidem, die landwirtschaftliche Produkte verunreinigen und die Arten auf landwirtschaftlichen Flächen verewigen.
    • 4. Produktion riesiger Mengen an Vegetation, die weggeworfen werden muss, auf landwirtschaftlichen und nicht landwirtschaftlichen Flächen.
  • Auf nichtlandwirtschaftlichen Flächen werden Unkräuter eher als Ärgernis als eine Bedrohung betrachtet, doch selbst in diesem Fall sind Unkräuter eine potentielle Gefahr für den Menschen. Pollen von Unkraut kann Heuschnupfen oder andere Allergien verursachen, und in ihrem Saft oder auf ihren Blättern vorhandene toxische Chemikalien können Hautreizungen oder -ausschläge verursachen, wenn sie gestreift werden. Einige von Unkräutern produzierte Substanzen sind tödlich, wenn sie aufgenommen werden. Unkräuter neigen dazu, Werkzeuge und Ausrüstung, Schalter und Ventile, Bewässerungswege und selbst Löcher im Boden zu verdecken. Das Wachstum dichter feuchtigkeitshaltender Unkräuter trägt zur Verschlechterung von Holzstrukturen und zum Rosten von Metallzäunen, Gebäuden und von unbeweglichen Maschinen bei. Tote, trockene Unkräuter stellen im Falle der Entzündung durch einen Funken, einer achtlos weggeworfenen Zigarette oder gar eines Stück Glases, das Sonnenlicht reflektiert, eine Feuergefahr dar. Unkräuter verringern die Freude an Erholungsgebieten. Sie behindern den Fluss von Wasser in Wasserwegen und stören den Wasserverkehr, besonders in tropischen und subtropischen Regionen.
  • Auf landwirtschaftlichen Flächen verringern Unkräuter den Ertrag und die Qualität von Feldfrüchten, stören das Ernten und Erhöhen die Zeit und die Kosten, die mit der Getreideproduktion verbunden sind. Unkräuter beherbergen Insekten und mit Pflanzenkrankheiten zusammenhängende Organismen, und in einigen Fällen dienen sie als notwendige wechselnde Wirte für diese Schädlinge. Einige Unkräuter sind im Heu, auf Weiden und auf Weidegebieten aufgrund der mechanischen Verletzungen, die sie dem Vieh zufügen, unerwünscht. Hölzerne Stämme, Dornen und steife Samengrannen verursachen am Mund- und Verdauungstrakt des Viehs Verletzungen, und die Haare und Fasern einiger Pflanzen neigen dazu, aneinanderzugeraten und die Eingeweide zu blockieren, was besonders bei Pferden ernste Probleme verursacht. Wenn sie von Milchkühen aufgenommen werden, verleihen einige Unkräuter wie unter anderem Ambrosien, wilder Knoblauch (Allium vineale L.) und Senf Milch und Butter einen deutlich unangenehmen Geruch oder Geschmack. Mit Widerhaken versehene Verteilungseinheiten von Samen können sich in der Wolle von Schafen derart verfangen, dass sie ihren Marktwert erheblich verringern. Parasitische Pflanzen wie beispielsweise der Teufelszwirn (Cuscuta sp.), der Sommerwurz (Orobanche sp.) und Pflanzen der Gattung Striga rauben organische Nährstoffe von ihren Wirtpflanzen.
  • Unkräuter können zusätzlich als Wirtspflanzen für Landwirtschaftsschädlinge dienen. Beispiele für Unkräuter, die als Wirte für Pflanzenschädlinge dienen, sind unten zitiert. Pfefferkraut und Descurainia-Arten (Descurainia sp.) erhalten im späten Herbst, Winter und Frühling große Populationen der Kohlmotten aufrecht, sie sind auch Wirte der Rüben-Blattlaus und der grünen Pfirsich-Blattlaus. Mehrere Unkrautarten der Nachtschattenfamilie (Solanaceae) sind Wirte für Insekten, die üblicherweise die Aubergine, den Pfeffer, die Kartoffel und die Tomate angreifen; zum Beispiel ist die Pferdenessel (Solanum carolinense L.) ein Wirt des Colorado-Kartoffelkäfers, und der schwarze Nachtschatten (S. nigrum L.) ist ein Wirt des Kohlspanners. Die purpurne Trichterwinde ist ein wichtiger Wirt von Insekten, die die Süßkartoffel angreifen, vor allem für den hochgradig zerstörerischen Süßkartoffel-Rüsselkäfer. Ambrosien dienen als Wirt für Mansonia-Moskitos, einen Insektenvektor für die menschlichen Krankheiten Enzephalitis und ländliche Filiarienkrankheit. Die europäische Berberitze (Berberis vulgaris L.) ist in den nördlichen Getreidegegenden der Vereinigten Staaten ein notwendiger Wirt des Getreidestammbrandes. Eleusinen (Eleusine induce [L.] Great.) und Zyperngras sind Wirte des Gersten-Gelbzwerg-Virus. Johannisbeeren und Stachelbeeren (Ribes sp.) sind Wirte des weißen Kieferbläschenbrandes.
  • Eine Feldfrucht, die auf chemische Unkrautbekämpfung hochgradig angewiesen ist, ist das Getreide. Getreide wurde in der Zeitspanne zwischen 1982 und 1993 auf 60 Millionen bis 83 Millionen Acres pro Jahr angebaut. 1993 wiesen fünfzehn Staaten eine von Getreide bedeckte Fläche von über einer Million Acres auf, und 74 % der Feldfrüchte wurden in Iowa, Illinois, Nebraska, Minnesota und Indiana angebaut. Etwa 97 % der Getreideanbauflächen in den Vereinigten Staaten wurden mit Herbiziden behandelt, und über 98 % der Getreideanbauflächen in Iowa, Illinois, Minnesota und Indiana wiesen Herbizidbehandlungen auf (Agricultural Chemical Usage, 1994). Darüber hinaus wurden 1982 durchschnittlich 2,1 aktive Inhaltsstoffe pro Acre angewandt.
  • Unkräuter konkurrieren mit Getreide um Nährstoffe, Wasser und Licht, und wenn sie nicht bekämpft werden, können sie den Ertrag an Getreide erheblich verringern. Zum Beispiel wird geschätzt, dass die Getreideerträge zwischen 1972 und 1976 aufgrund von Unkräutern um etwa 10 % verringert waren (Chandler, J.M., 1981, CRC Handbook of Pest Management in Agriculture, Bd. 1, herausgegeben von Pimentel, D., S. 95-109). Es ist besonders wichtig, Unkraut früh während der Getreidepflanzenentwicklung zu bekämpfen, weil selbst geringe Zahlen von Unkräutern einen dramatischen negativen Einfluss auf den Feldfruchtertrag haben können. Unkräuter werden primär durch mechanische oder chemische Mittel bekämpft. Obwohl die mechanische Kultivierung breit praktiziert wird, sind Maßnahmen zur chemischen Unkrautbekämpfung weit verbreitet, und mehr als 95 % der Feldfruchternte in den Vereinigten Staaten ist mit chemischen Herbiziden behandelt. Eine nicht unterscheidende Verwendung von Herbiziden kann jedoch zur Entwicklung von resistenten Unkräutern führen. Es ist daher wichtig, Verfahren zur chemischen Unkrautbekämpfung zu entwickeln, die neue Wirkungsmodi darstellen, und bei denen es unwahrscheinlich ist, dass sie resistente Unkräuter selektieren.
  • Eine vielfältige Gruppe von Unkrautarten macht bei Getreide eine Anzahl von Verfahren zur Unkrautbekämpfung notwendig. Breitblättrige Unkräuter wie beispielsweise die Samtpappel, der weiße Gänsefuß, wilde Sonnenblumen, Ambrosien und Vogelknöteriche sind bei Getreide von Belang. Weiterhin sind grasartige Unkräuter wie beispielsweise das Kubagras, die Mohrenhirse, die gabelblütige Hirse, der Fuchsschwanz, die gemeine Quecke, die Rispenhirse und das wollene Tassengras bei Getreide üblich. Beständige Kräuter sind ein zusätzliches Problem, da sie in der Lage sind, sich durch Samen und/oder unter dem Grund befindliche Pflanzenteile zu verbreiten, und sie können die Behandlungen mit mannigfaltigen Herbiziden notwendig machen. Die große Menge an Unkrautarten, die auf einem Getreidefeld gefunden werden, erfordert die Verwendung von mannigfaltigen Arten von Herbiziden und vielfache Behandlungen, um eine Unkrautbekämpfung zu erreichen. Deshalb schwanken Herbizid-Behandlungspläne in Abhängigkeit von dem Unkrautspektrum und von örtlichen landwirtschaftlichen Praktiken. Tabelle 1 fasst die Herbizidbehandlung von Getreideflächen im Jahre 1993 zusammen. Tabelle 1 Herbizidbehandlungen bei Getreide
    Prozentanteil an mit Haupt-Getreideherbiziden behandelten Acres
    Wichtige Getreide anbauende Staaten (umfassend Minn.)
    Herbizidname Minnesota
    Atrazin 69 37
    Metolachlor 32 24
    Alachlor 24 23
    Dicama 21 48
    Cyanazin 20 16
    2,4-D 12 13
    Bromoxynil 8 14
    Nicosulfuron 6 19
    Quelle: Agricultural Chemical Usage, März 1994, NASS und ERS, USDA.
  • Eine Einzelbehandlung mit Herbiziden nahe der Zeit des Auspflanzen ist bei Getreide am üblichsten. Diese Behandlung umfasst gewöhnlich eines der Triazin-Herbizide (Atrazin, Cyanazin, Simazin), um breitblättrige Unkräuter zu bekämpfen, und ein Acetanilid-Herbizid (Metolachlor, Alachlor), um einjährige Gräser zu bekämpfen. Eine Bekämpfung der breitblättrigen Unkräuter und der Problemgräser mit Herbiziden für nach dem Erscheinen wie Dicama, Bromoxynil, Bentazon, Nicosulfuron und Primisulfuron trat bei etwa der Hälfte der Getreideanbauflächen im Jahre 1993 auf. Die Auswahl des Herbizids ist in allen außer den nördlichen zentralen Staaten (z. B. Minnesota und South Dakota) konsistent. 1993 wurde Atrazin bei etwa 69 % der Getreideanbauflächen verwendet.
  • Die gewöhnlichste Flüssigkeitsbehältermischung zur Unkrautbekämpfung mit breitem Spektrum bestand aus Atrazin und Metolachlor. Die Herbizidverwendung in den nördlichen zentralen Staaten unterscheidet sich davon jedoch in der Weise, dass es aufgrund des Übertrages auf kleine Trauben und Sojabohnen und der Böden der Region mit hohem pH und wenig Niederschlag eine verringerte Verwendung von Atrazin gibt. Weiterhin Herbizide für nach dem Erscheinen bevorzugt, weil die Wachstumszeit in der nördlichen zentralen Region kürzer ist und sie die Pflanzungsarbeiten nicht verzögern. Zum Beispiel war das Herbizid für nach dem Erscheinen Dicamba 1993 das häufigste Herbizid, das bei Getreide in Minnesota verwendet wurde (alle Daten aus Agricultural Chemical Usage, 1994).
  • Beim Auswählen eines Herbizides zur Bekämpfung von Unkräutern bei Getreide muss eine Chemikalie ausgewählt werden, die ein geeignetes Spektrum an Unkräutern aufweist, die abgetötet werden, und die keine schädlichen, lang anhaltenden Wirkungen auf die Umwelt ausübt. Zusätzlich ist es bei zunehmenden nicht für Getreide oder minimal für Getreide verwendeten Ackerflächen notwendig, Unkrautbekämpfungsagenzien zur Verfügung zu haben, die wie erforderlich nach dem Erscheinen und punktbezogen angewendet werden können. Einige der Herbizide, mit denen derzeit Getreide behandelt wird, sind mit Bezug auf ihr Unkrautspektrum begrenzt, können im Boden überdauern oder Grundwasser verunreinigen, oder sie können zur Entwicklung Herbizid-resistenter Unkräuter führen. Darüber hinaus sind einige Herbizide, die ein verringertes Potenzial schädlicher Wirkungen auf die Umwelt haben und fähig sind, ein breites Spektrum an Unkräutern abzutöten, bei ihrer Fähigkeit, Pflanzen abzutöten, nicht unterscheidend, d. h. Feldfruchtpflanzen wie beispielsweise Getreide sind genauso betroffen wie Unkrautarten. Nur durch die Einführung von Genen, die eine Resistenz gegen solche Herbizide verleihen, können diese Chemikalien zur Unkrautbekämpfung bei Getreide verwendet werden.
  • Glyphosat ist ein Breitbandherbizid für nach dem Erscheinen, das im Boden schnell abgebaut wird, eine geringe Toxizität auf andere als die Zielorganismen aufweist und nicht zur Grundwasserverunreinigung beiträgt. Die Verfügbarkeit von Glyphosat zur Unkrautbekämpfung bei auf Feldern angebautem Getreide fehlte früher aufgrund des breiten Spektrums seiner Wirkungen. Die hierin beschriebenen Glyophosat-resistenten transgenen Pflanzen werden dem Bauern eine erhöhte Flexibilität beim Umgehen mit Unkrautproblemen verschaffen. Glyphosat-resistente Getreidehybride werden dem Bauern 1) die Verwendung eines neuen Herbizides, das eine Bekämpfung eines breiten Spektrums von einjährigen und beständigen, breitblättrigen und grasartigen Unkräutern bietet, 2) weniger Abhängigkeit von einer Herbizid-Behandlung vor dem Anbau, 3) eine erhöhte Flexibilität beim Anwenden von Herbiziden wie erforderlich, 4) einen neuen Herbizidwirkungsmodus, der die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von Herbizid-resistenten Unkräutern verringern wird, und 5) ein Herbizid zur Verwendung bei anderen Systemen als Ackerbausystemen, die Treibstoff sparen und die Bodenerosion verringern, bieten. Aufgrund der angebotenen Vorteile werden Herbizide für nach dem Erscheinen jedes Jahr auf immer mehr Getreideanbauflächen angewandt, z. B. erhalten etwa 15 Millionen Acres Getreide, 20 % der gesamten Getreideanbauflächen, ausschließlich Behandlungen mit Herbiziden für nach dem Erscheinen. Glyphosat-resistentes Getreide wird für den Bauern ein alternatives Verfahren zur Unkrautbekämpfung bereitstellen. Derzeit werden während der Wachstumszeit im Durchschnitt 2,1 Herbizide auf Getreide angewendet. Es wird erwartet, dass die Verwendung von Glyphosat zur Unkrautbekämpfung die Zahl der Arten von Herbiziden, die angewendet werden, genauso wie die Zahl der erforderlichen Behandlungen verringern wird. Glyphosat-resistentes Getreide wird daher die Umweltrisiken verringern, die Herbizide darstellen, während es gleichzeitig die Wirksamkeit der chemischen Unkrautbekämpfung erhöht.
  • II. DNA-Abgabe
  • Nach der Erzeugung von Empfänger-Zellen umfasst die vorliegende Offenbarung im Allgemeinen als Nächstes Schritte, die auf das Einführen eines exogenen DNA-Segmentes in eine Empfänger-Zelle gerichtet sind, um eine transformierte Zelle zu erzeugen. Man glaubt, dass die Häufigkeit des Auftretens von DNA empfangenden Zellen gering ist. Darüber hinaus ist es am wahrscheinlichsten, dass nicht alle DNA-Segmente empfangenden Empfänger-Zellen zu einer transformierten Zelle (ihren werden, wobei die DNA stabil in das Pflanzengenom integriert ist und/oder exprimiert wird. Einige können nur eine anfängliche oder vorübergehende Genexpression zeigen. Es können jedoch bestimmte Zellen von nahezu jeglicher Monokotyledonenart stabil transformiert werden, und diese Zellen entwickelten sich durch die Anwendung der hierin offenbarten Techniken zu transgenen Pflanzen.
  • Es gibt viele Verfahren zum Einführen transformierender DNA-Segmenten in Zellen, aber nicht alle sind geeignet, um DNA an Pflanzenzellen abzugeben. Man glaubt, dass geeignete Verfahren praktisch jegliches Verfahren umfassen, durch das DNA in eine Zelle eingeführt werden kann, wie beispielsweise eine Agrobacterium-Infektion, eine direkte Abgabe von DNA, wie beispielsweise z. B. durch PEG-vermittelte Transformation von Protoplasten (Omirulleh et al., 1993), durch Austrocknungs-/Inhibitions-vermittelte DNA-Aufnahme, durch Elektroporation, durch Hin-und-Her-Bewegen mit Siliziumcarbidfasern, durch Beschleunigung von mit DNA beschichteten Partikeln, etc. Die durch Agrobacterium vermittelte Transformation von Mais wurde im US-Patent Nr. 5,591,616 beschrieben. Bei bestimmten Ausführungsformen sind Beschleunigungsverfahren bevorzugt und umfassen z. B. die Bombardierung mit Mikroprojektilen und dergleichen.
  • (ii) Mikroprojektilbombardierung
  • Ein weiteres vorteilhaftes Verfahren zum Abgeben transformierender DNA-Segmente an Pflanzenzellen ist die Mikroprojektilbombardierung. Bei diesem Verfahren können Partikel mit Nukleinsäuren beschichtet und durch eine Antriebskraft an Zellen abgegeben werden. Beispielhafte Partikel umfassen diejenigen, die Wolfram, Gold, Platin und dergleichen umfassen. Es ist vorgesehen, dass die DNA-Präzipitation auf Metallpartikel unter Verwendung der Mikroprojektilbombardierung in einigen Fällen nicht für die DNA-Abgabe an eine Empfänger-Zelle notwendig wäre. Es ist jedoch vorgesehen, dass Partikel DNA enthalten können, statt mit DNA beschichtet zu sein. Daher wird vorgeschlagen, dass mit DNA beschichtete Partikel das Ausmaß der DNA-Abgabe über Partikelbombardierung erhöhen, aber an und für sich nicht notwendig sind.
  • Zusätzlich zu der Tatsache, dass sie ein wirkungsvolles Mittel zum reproduzierbar stabilen Transformieren von Monokotyledonen ist, besteht ein Vorteil der Mikroprojektilbombardierung darin, dass weder die Isolierung von Protoplasten (Cristou et al., 1988) noch die Empfindlichkeit für eine Agrobacterium-Infektion benötigt wird. Eine veranschaulichende Ausführungsform eines Verfahrens zum Abgeben von DNA an Maiszellen durch Beschleunigung ist ein Biolistics-Partikelabgabesystem, das verwendet werden kann, um mit DNA beschichtete Partikel oder Zellen durch einen Schirm, wie beispielsweise einen aus rostfreiem Stahl bestehenden oder einen Nytex-Schirm auf eine Filteroberfläche anzutreiben, die mit in Suspension kultivierten Maiszellen bedeckt ist. Der Schirm verteilt die Partikel, so dass sie nicht in großen Aggregaten an die Empfänger-Zellen abgegeben werden. Man glaubt, dass ein zwischen der Projektilvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen liegender Schirm die Größe der Projektilaggregate verringert und durch das Verringern des Schadens, der durch zu große die Projektile an den Empfängerzellen angerichtet wird, zu einer höheren Transformationshäufigkeit beitragen kann.
  • Für die Bombardierung liegen die Zellen in der Suspension bevorzugterweise konzentriert auf Filtern oder auf festem Kulturmedium vor. Alternativ können unreife Embryos oder andere Zielzellen auf festem Kulturmedium angeordnet sein. Die zu bombardierenden Zellen sind in einer geeigneten Entfernung unter der Makroprojektile anhaltenden Platte angeordnet. Wenn es erwünscht wird, kann ein oder mehr als ein Schirm zwischen der Beschleunigungsvorrichtung und den zu bombardierenden Zellen angeordnet sein. Durch die Verwendung der hierin dargestellten Techniken kann man bis zu 1000 oder mehr Konzentrationspunkte von Zellen erhalten, die ein Markergen vorübergehend exprimieren. Die Zahl der Zellen in einem Konzentrationspunkt, die das exogene Genprodukt 48 Stunden nach der Bombardierung exprimieren, reicht häufig von 1 bis 10 und durchschnittlich von 1 bis 3.
  • Bei der Bombardierungstransformation kann man die Kulturbedingungen vor der Bombardierung und die Bombardierungsparameter optimieren, um die maximalen Anzahlen stabiler Transformanten zu erhalten. Sowohl die physikalischen als auch die biologischen Parameter für die Bombardierung sind bei dieser Technologie wichtig. Die physikalischen Faktoren sind diejenigen, die am Manipulieren der DNA/des Mikroprojektilpräzipitates beteiligt sind, oder diejenigen, die den Flug oder die Geschwindigkeit von entweder den Makro- oder Mikroprojektilen beeinflussen. Die biologischen Faktoren umfassen alle Schritte, die zur Manipulation der Zellen vor und unmittelbar nach der Bombardierung gehören, die osmotische Anpassung der Zielzellen, um dazu beizutragen, dass das mit der Bombardierung verbundene Trauma gelindert wird, und auch die Natur der transformierenden DNA, wie beispielsweise linearisierte DNA oder intakte supergecoilte Plasmiden. Man glaubt, dass die Manipulationen vor der Bombardierung für die erfolgreiche Transformation unreifer Embryos besonders wichtig sind.
  • Dementsprechend ist es vorgesehen, dass man möglicherweise verschiedene der Bombardierungsparameter in Studien im kleinen Maßstab anpassen möchte, um die Bedingungen vollständig zu optimieren. Insbesondere kann man wünschen, physikalische Parameter wie die Lückenentfernung, Flugentfernung, Gewebeentfernung und den Heliumdruck anzupassen. Man möchte möglicherweise auch die Traumaverringerungsfaktoren (TRFs) durch das Modifizieren von Bedingungen minimieren, die den physiologischen Zustand der Empfänger-Zellen beeinflussen, und die daher die Transformations- und Integrationseffizienzen beeinflussen können. Zum Beispiel können der osmotische Zustand, die Wasseranlagerungen Gewebe und die Phase der Subkultur oder des Zellzyklus der Empfänger-Zellen zur optimalen Transformation angepasst werden. Die Ergebnisse von solchen Optimierungsstudien im kleinen Maßstab sind hierin offenbart, und die Ausführung anderer routinemäßiger Anpassungen wird den Fachleuten auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
  • III. Empfängerzellen für die Transformation
  • Gewebekulturen erfordern Medien und kontrollierte Umgebungen. „Medien" bedeutet die zahlreichen Nährstoffmischungen, die verwendet werden, um Zellen in vitro, d. h. außerhalb des intakten lebendigen Organismus, wachsen zu lassen. Das Medium ist gewöhnlich eine Suspension verschiedener Kategorien von Bestandteilen (Salzen, Aminosäuren, Wachstumsregulatoren, Zuckern, Puffer), die für das Wachstum der meisten Arten von Zellen benötigt werden. Es benötigt jedoch jeder spezifische Zelltyp eine spezifische Bandbreite an Bestandteilsverhältnissen zum Wachsen, und eine noch spezifischere Bandbreite an Mischungsverhältnissen zum optimalen Wachstum. Die Geschwindigkeit des Zellwachstums wird innerhalb mit der Reihe der Wachstum dieses Zelltyps erlaubenden Medien initiierten Kulturen ebenfalls schwanken.
  • Nährstoffmedien werden als Flüssigkeit zubereitet, aber diese kann durch das Hinzugeben der Flüssigkeit zu Materialien, die in der Lage sind, einen festen Träger bereitzustellen, verfestigt werden. Zu diesem Zweck wird am üblichsten Agar verwendet. Bactoagar, Hazelton-Agar, Gelrit und Gelgro sind spezifische Arten von festen Trägern, die zum Heranziehen von Pflanzenzellen in der Gewebekultur geeignet sind.
  • Einige Zelltypen werden entweder in einer Flüssigsuspension oder auf festen Medien wachsen und sich teilen. Wie hierin offenbart, werden Maiszellen in eine Suspension oder auf festem Medium wachsen, aber die Regeneration von Pflanzen aus Suspensionskulturen erfordert irgendwann während der Entwicklung die Übertragung aus flüssigen auf feste Medien. Die Art und das Ausmaß der Differenzierung von Zellen in der Kultur wird nicht nur von der Art des verwendeten Mediums und von der Umgebung, beispielsweise dem pH, beeinflusst werden, sondern auch davon, ob die Medien fest oder flüssig sind. Die Tabelle 2 veranschaulicht die Zusammensetzung verschiedener Medien, die für die Erzeugung von Empfänger-Zellen und zur Pflanzenregeneration nützlich sind.
  • Empfänger-Zellen-Ziele umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Meristem-Zellen, Typ I-, Typ II- und Typ III-Kallus, unreife Embryonen und Gametenzellen wie beispielsweise Mikrosporen-Pollen, Sperma und Eizellen. Es ist vorgesehen, dass jegliche Zelle, aus der eine fruchtbare transgene Pflanze regeneriert werden kann, als Empfängerzelle nützlich ist. Typ I-, Typ II- und Typ III-Kallus kann aus Gewebequellen initiiert werden, die unreife Embryos, apikale Meristeme von Sämlingen, Mikrosporen und dergleichen umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Diejenigen Zellen, die fähig sind, als Kallus zu proliferieren, sind ebenfalls Empfängerzellen für eine genetische Transformation. Die vorliegende Offenbarung stellt Techniken zum Transformieren unreifer Embryos bereit, gefolgt von der Initiierung von Kallus und der nachfolgenden Regeneration von fruchtbaren transgenen Pflanzen. Die direkte Transformation unreifer Embryos erübrigt die Notwendigkeit einer lang andauernden Entwicklung von Empfänger-Zellkulturen. Pollen genauso wie ihre Vorläuferzellen, Mikrosporen, können in der Lage sein, als Empfänger-Zellen für eine genetische Transformation oder als Vektoren zu fungieren, um fremde DNA zum Einbau während der Befruchtung zu tragen. Die direkte Transformation von Pollen würde die Notwendigkeit der Zellkultur erübrigen. Meristemische Zellen (d. h. Pflanzenzellen, die zur kontinuierlichen Zellteilung befähigt, durch eine undifferenzierte zytologische Erscheinungsform gekennzeichnet sind und normalerweise an den Wachstumspunkten oder -geweben in Pflanzen wie beispielsweise Wurzelspitzen, Stammspitzen, seitlichen Knospen etc. gefunden werden), können eine andere Art von Empfänger-Pflanzenzelle darstellen. Aufgrund von ihrem undifferenzierten Wachsen und ihrer Fähigkeit der Organdifferenzierung und ihrer Totipotenz kann eine einzelne transformierte meristemische Zelle als ganze transformierte Pflanze wiedergewonnen werden. Tatsächlich wird vorgeschlagen, dass embryogene Suspensionskulturen ein in vitro-System meristemischer Zellen sein können, die gesteuert von der Umgebung der Medien die Fähigkeit der weiterlaufenden Zellteilung in einem undifferenzierten Zustand beibehalten könnten.
  • Kultivierte Pflanzenzellen, die als Empfänger-Zellen zum Transformieren mit erwünschten DNA-Segmenten dienen können, umfassen Getreidezellen und spezifischer Zellen von Zea mays L. Somatische Zellen gehören zu verschiedenen Arten von Zellen. Embryogene Zellen sind ein Beispiel für somatische Zellen, die dazu induziert werden können, über eine Embryobildung eine Pflanze zu regenerieren.
  • Nicht-embryogene Zellen sind diejenigen Zellen, die typischerweise nicht auf solch eine Weise reagieren werden. Ein Beispiel für nicht-embryogene Zellen sind bestimmte Zellen des Black Mexican Scout(BMS)-Getreides. Diese Zellen wurden unter Verwendung des neo-Gens durch Mikroprojektilbombardierung transformiert, gefolgt von einer Selektion mit dem Aminoglycosid Kanamycin (Klein et al., 1989). Jedoch wurde festgestellt, dass diese BMS-Kultur nicht regenerierfähig war. Die Entwicklung von embryogenen Maiskalli und von Suspensionskulturen, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nützlich sind, z. B. als Empfänger-Zellen zur Transformation, wurde im US-Patent Nr. 5,134,074 beschrieben.
  • Es können bestimmte Techniken verwendet werden, die Empfänger-Zellen innerhalb einer Zellpopulation anreichern. Zum Beispiel führt eine Typ II-Kallus-Entwicklung, gefolgt von manueller Selektion und Kultur von krümeligem, embryogenem Gewebe im Allgemeinen zu einer Anreicherung von Empfänger-Zellen zur Verwendung z. B. bei der Mikroprojektiltransformation. Das Kultivieren in Suspension, insbesondere unter Verwendung der hierin offenbarten Medien, kann das Verhältnis von Empfänger- zu Nicht-Empfänger-Zellen bei jeglicher gegebener Population verbessern. Techniken zur manuellen Selektion, die verwendet werden können, um Empfängerzellen zu selektieren, können z. B. das Einschätzen der Zellmorphologie und -differenzierung umfassen, oder können verschiedene physikalische oder biologische Mittel verwenden. Die Kryokonservierung ist ein mögliches Verfahren zum Selektieren von Empfänger-Zellen.
  • Die manuelle Selektion von Empfänger-Zellen, z. B. durch das Selektieren embryogener Zellen von der Oberfläche eines Typ II-Kallus, ist ein Mittel, das bei einem Versuch verwendet werden kann, Empfänger-Zellen vor dem Kultivieren (egal, ob auf festen Medien oder in Suspension kultiviert) anzureichern. Die bevorzugten Zellen können diejenigen sein, die sich an der Oberfläche eines Zellclusters befinden, und sie können weiterhin durch ihren Mangel an Differenzierung, ihre Größe und ihr dichtes Zytoplasma identifizierbar sein. Die bevorzugten Zellen werden im Allgemeinen diejenigen Zellen sein, die weniger differenziert sind oder sich noch nicht auf eine Differenzierung eingelassen haben. Somit könnte man diejenigen Zellen identifizieren und selektieren wollen, die eine hohe zytoplasmatische Dichte aufweisen, vergleichsweise unvakuoliert mit einem hohen Verhältnis von Nukleus zu Zytoplasma (z. B. durch zytologische Beobachtungen bestimmt), von geringer Größe (z. B. 10- 20 :m) und in der Lage sind, andauernde Teilungen und eine somatische Proembryobildung zu durchlaufen.
  • Es wird vorgeschlagen, dass auch andere Mittel zum Identifizieren solcher Zellen verwendet werden können. Zum Beispiel die Verwendung von Farbstoffen wie beispielsweise Evan's Blau, die von Zellen mit vergleichsweise unpermeablen Membranen wie beispielsweise embryogenen Zellen, ausgeschlossen werden und durch vergleichsweise differenzierte Zellen, wie beispielsweise wurzelartige Zellen und Schlangenzellen (so genannt aufgrund ihrer schlangenartigen Erscheinung) aufgenommen werden.
  • Andere mögliche Mittel zum Identifizieren von Empfänger-Zellen umfassen die Verwendung von Isoenzymmarkern embryogener Zellen, wie beispielsweise der Glutamatdehydrogenase, die durch zytochemische Färbungen nachgewiesen werden können (Fransz et al., 1998). Es wird jedoch gewarnt, dass die Verwendung von Isoenzymmarkern wie beispielsweise Glutamatdehydrogenase zu einem gewissen Ausmaß von falschen Positiven bei nicht-embryogenen Zellen wie Wurzelzellen führen kann, die nichtsdestotrotz eine vergleichsweise hohe Stoffwechselaktivität aufweisen.
  • (i) Kultivieren von Zellen als zukünftige Empfänger bei einer Transformation
  • Die Erfinder glauben, dass die Fähigkeit, Kulturen von Maiszellen herzustellen und zu cryokonservieren, dahingehend für bestimmte Aspekte der vorliegenden Offenbarung wichtig ist, dass sie ein Mittel zum reproduzierbaren und erfolgreichen Herstellen von Zellen für eine partikelvermittelte Transformation, Elektroporation oder andere Verfahren zur DNA-Einführung darstellt. Die unten beschriebenen Untersuchungen stellen Techniken dar, die erfolgreich von den Erfindern angewandt wurden, um transformierbare und regenerierfähige Kulturen von Maiszellen zu erzeugen. Eine Vielzahl von verschiedenen Arten von Medien wurde durch die Erfinder entwickelt und beim Ausführen verschiedener Aspekte der Erfindung verwendet. Die folgende Tabelle, Tabelle 2, gibt die Zusammensetzung der Medien an, die von den Erfindern zum Ausführen dieser Aspekte der Erfindung bevorzugt sind. Tabelle 2 Gewebekulturmedien, die zur Entwicklung von Typ II-Kallus, zur Entwicklung von Suspensionskulturen und zur Regeneration von Pflanzenzellen (spezifisch Maiszellen) verwendet werden
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    7 MS* 2 % 6,0 0,25 mg Thiamin 0,5 mg BAP 0,5 mg NAA Bactoagar
    10 MS 2 % 6,0 0,25 mg Thiamin 1 mg BAP 1 mg 2,4-D 400 mg L-Prolin Bactoagar
    19 MS 2 % 6,0 0,25 mg Thiamin 0,25 mg BAP 0,25 mg NAA Bactoagar
    20 MS 3 % 6,0 0,25 mg 1 mg BAP 1 mg NAA Bactoagar
    52 MS 2 % 6,0 0,25 mg Thiamin 1 mg 2,4-D 10–7M ABA BACTOAGAR
    101 MS 3 % 6,0 MS-Vitamine 100 mg myo-Inositol Bactoagar
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    142 MS 6 % 6,0 MS-Vitamine 5 mg BAP 0,186 mg NAA 0,175 mg IAA 0,403 mg 2IP Bactoagar
    157 MS 6 % 6,0 MS-Vitamine 3,3 mg myo-Inositol Bactoagar
    163 MS 3 % 6,0 MS-Vitamine 3,3 mg Dicamba 200 mg myo-Inositol Bactoagar
    171 MS 3 % 6,0 MS-Vitamine 0,25 mg 2,4-D 10 mg BAP 100 mg myo-Inositol Bactoagar
    173 MS 6 % 6,0 MS-Vitamine 5 mg BAP 0,186 mg NAA 0,175 mg IAA 0,403 mg 2IP 10–7M ABA 200 mg myo-Inositol Bactoagar
    177 MS 3 % 6,0 MS-Vitamine 0,25 mg 2,4-D 10 mg BAP 10–7M ABA 100 mg myo-Inositol Bactoagar
    185 MS - 5,8 3 mg BAP 0,04 mg NAA RT-Vitamine 1,65 mg Thiamin 1,38 g L-Prolin 20 g Sorbitol Bactoagar
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    189 MS - 5,8 3 mg BAP 0,04 mg NAA 0,5 mg Niacin 800 mg L-Asparagin 100 mg Casaminosäuren 20 g Sorbitol 1,4 g L-Prolin 100 mg myo-Inositol Gelgro
    201 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 1 mg 2,4-D 100 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin Gelgro
    205 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 0,5 mg 2,4-D 100 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin Gelgro
    209 N6 6 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 100 mg Caseinhydrolysat 0,69 g L-Prolin Bactoagar
    210 N6 3 % 5,5 N6-Vitamine 2 mg 2,4-D 250 mg Ca-Pantothenat 100 mg myo-Inositol 790 mg L-Asparagin 100 mg Caseinhydrolpat 1,4 g L-Prolin Hazelton-Agar**** 2 mg L-Glycin
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    212 N6 3 % 5,5 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 2 mg 2,4-D 250 mg Ca-Pantothenat 100 mg myo-Inositol 100 mg Caseinhydrolysat 1,4 g L-Prolin Hazelton-Agar****
    227 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 13,2 mg Dicamba 100 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin Gelgro
    273 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 1 mg 2,4-D 16,9 mg AgNO3 100 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin
    279 N6 2 % 5,8 3,3 mg Dicamba 1 mg Thiamin 0,5 mg Niacin 800 mg L-Asparagin 100 mg Caseinhydrolysat 100 mg myo-Inositol 1,4 g L-Prolin Gelgro****
    288 N6 3 % 3,3 mg Dicamba 1 mg Thiamin 0,5 mg Niacin 0,8 g L-Asparagin 100 mg myo-Inositol 1,4 g L-Prolin 100 mg Caseinhydrolysat 16,9 mg AgNO3 Gelgro
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    401 MS 3 % 6,0 3,73 mg Na2EDTA 0,25 mg Thiamin 1 mg 2,4-D 2 mg NAA 200 mg Caseinhydrolysat 500 mg K2SO4 400 mg KH2PO4 100 mg myo-Inositol
    402 MS 3 % 6,0 3,73 mg Na2EDTA 0,25 mg Thiamin 1 mg 2,4-D 200 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin 500 mg K2SO4 400 mg KH2PO4 100 mg myo-Inositol
    409 MS 3 % 6,0 3,73 mg Na2EDTA 0,25 mg Thiamin 9,9 mg Dicamba 200 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin 500 mg K2SO4 400 mg KH2PO4 100 mg myo-Inositol
    501 Clark-Medium*** 2 % 5,7
    607 1/2 × MS 3 % 5,8 1 mg Thiamin 1 mg Niacin Gelrit
    615 MS 3 % 6,0 MS-Vitamine 6 mg BAP 100 mg myo-Inositol Bactoagar
    617 1/2 × MS 1,5 % 6,0 MS-Vitamine 50 mg myo-Inositol Bactoagar
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    708 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 1,5 mg 2,4-D 200 mg Casein-Hydrolysat 0,69 g L-Prolin Gelrit
    721 N6 2 % 5,8 3,3 mg Dicamba 1 mg Thiamin 0,5 mg Niacin 800 mg L-Asparagin 100 mg myo-Inositol 100 mg Casein-Hydrolysat 1,4 g L-Prolin 54,65 g Mannitol Gelgro
    726 N6 3 % 5,8 3,3 mg Dicamba 0,5 mg Niacin 1 mg Thiamin 800 mg L-Asparagin 100 mg myo-Inositol 100 mg Caseinhydrolysat 1,4 g L-Prolin
    727 N6 3 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 9,9 mg Dicamba 100 mg Caseinhydrolysat 2,9 g L-Prolin Gelgro
    728 N6 3 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 9,9 mg Dicamba 16,9 mg AgNO3 100 mg Casein-Hydrolysat 2,9 g L-Prolin Gelgro
    Tabelle 2 (fortgesetzt)
    MEDIUM NR. BASALMEDIUM SACCHAROSE pH ANDERE BESTANDTEILE** (Menge/L)
    734 N6 2 % 5,8 N6-Vitamine 2 mg L-Glycin 1,5 mg 2,4-D 14 g Fe-Sequestreene (ersetzt FE-EDTA) 200 mg Casein-Hydrolysat 0,69 g L-Prolin Gelrit
    735 N6 2 % 5,8 1 mg 2,4-D 0,5 mg Niacin 0,91 g L-Asparagin 100 mg myo-Inositol 1 mg Thiamin 0,5 g MES 0,75 g MgCl2 100 mg Caseinhydrolysat 0,69 g L-Prolin Gelgro
    2004 N6 3 % 5,8 1 mg Thiamin 0,5 mg Niacin 3,3 mg Dicamba 17 mg AgNO3 1,4 g L-Prolin 0,8 g L-Asparagin 100 mg Caseinhydrolysat 100 mg myo-Inositol Gelrit
    2008 N6 3 % 5,8 1 mg Thiamin 0,5 mg Niacin 3,3 mg Dicamba 1,4 g L-Prolin 0,8 g L-Asparagin Gelrit
    • * Grund-MS-Medium beschrieben in Murashige und Skoog (1962). Dieses Medium wird typischerweise durch das Verringern des NH4NO3 von 1,64 g/l auf 1,55 g/l und durch das Auslassen von Pyridoxin HCl, Nikotinsäure, myo-Inositol und Glycerin modifiziert.
    • ** NAA = Naphtholessigsäure IAA = Indolessigsäure 2-IP = 2, Isopentyladenin 2,4-D = 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure BAP = 6-Benzylaminopurin ABA = Abscisinsäure
    • *** In Clark (1982) beschriebenes Grundmedium
    • **** Diese Medien können mit oder ohne verfestigendes Agens hergestellt werden.
  • Eine Anzahl von transformierbaren Maiskulturen wurde unter Verwendung der in den folgenden Beispielen dargestellten Protokolle entwickelt. Eine Zusammenstellung der initiierten und auf Transformierungsfähigkeit überprüften Kulturen ist in Tabelle 3 dargestellt, wobei die Ergebnisse der Studien in den beiden rechten Spalten angegeben sind. Die Tabelle zeigt das allgemeine Selektionsprotokoll, das für jede dieser Kulturen verwendet wurde. Die numerischen Bezeichnungen unter „Protokoll" stehen für das Folgende:
    • 1. Gewebe (Suspension) wurde auf Filter plattiert, bombardiert, und die Filter wurden dann auf Kulturmedium übertragen. Nach 2-7 Tagen wurden die Filter auf Selektivmedium übertragen. Ungefähr 3 Wochen nach der Bombardierung wurde Gewebe von den Filtern in der Form von getrennten Kallusklumpen auf frisches Selektivmedium gegeben.
    • 2. Wie in 1 oben, abgesehen davon, dass die Suspension nach der Bombardierung zurück in Flüssigkeit gegeben wurde – der Flüssigselektion 7-14 Tage lang unterzogen und dann bei geringer Dichte auf frische Selektionsplatten auspipettiert.
    • 3. Kallus wurde bombardiert, während er direkt auf Medium oder auf Filter aufgebracht war. Die Zellen wurden für 1-14 Tage nach der Partikelbombardierung auf Selektivmedium übertragen. Das Gewebe wurde auf Filtern 1-3 Mal mit Intervallen von 2 Wochen auf frisches Selektivmedium übertragen. Der Kallus wurde dann kurz in Flüssigkeit eingebracht, um das Gewebe bei geringer Dichte auf Selektivplatten zu verteilen.
    • 4. Kallusgewebe wurde ein bis sieben Tage nach der DNA-Einführung auf Selektivplatten übertragen. Das Gewebe wurde ein kleinen Einheiten von Kallus auf Selektivplatten subkultiviert, bis Transformanten identifiziert wurden.
  • Die Summen zeigen, dass 27 von 37 Maiskulturen transformierbar waren. Von den überprüften Zelllinien produzierten 11 von 20 fruchtbare Pflanzen und 7 sind in Arbeit. Wie diese Tabelle anzeigt, wurden aus zehn unterschiedlichen Gentypen von Mais transformierbare Kulturen hergestellt, die sowohl Hybrid- als auch Inzucht-Sorten umfassen. Diese Techniken zur Entwicklung von transformierbaren Kulturen sind bei der direkten Transformation von intakten Geweben wie beispielsweise unreifen Embryos wichtig, weil diese Techniken sich auf die Fähigkeit verlassen, Transformanten in Systemen mit kultivierten Zellen zu selektieren. Tabelle 3 Initiierte Maiskulturen
    Genotyp Kultur Verfahren Transformier -bar Fruchtbare Pflanzen
    A188 × B73 G(1 × 6)92 1 + -
    G(1 × 6)716 1,2 + +
    G(1 × 6)82 1 + -
    G(1 × 6)98 1 - NA
    G(1 × 6)99 1 - NA
    D(1 × 6)122#3 2 - NA
    D(1 × 6)114 2 - NA
    D(1 × 6)17#33 2 - NA
    HB13-3 3 + +
    HA133-227 2 - NA
    G(6 × 1)17#25C 3 + +
    ABT4 4 + +
    ABT3 4 + +
    AB60 4 + +
    AB61 4 + +
    AB63 4 + +
    AB80 4 + +
    Tabelle 3 (fortgesetzt)
    Genotyp Kultur Verfahren Transformierbar Fruchtbare Pflanzen
    AB82 4 + +
    ABT6 4 + ND
    AB12 4 + +
    PH2 4 + +
    AB69 4 + -
    AB44 4 + -
    AB62 4 + ND
    A188 × B84 G(1 × M)82 1 + -
    A188 × H99 HJ11-7 3 + -
    B73 × A188 G(6 × 1)12#7 2 - NA
    D(6 × 1)11#43 7 - NA
    E1 2 + -
    Hi-II G(CW)31#24 + +
    B73 (6)91#3 2 - NA
    (6)91#2 2 - NA
    B73-derived AT824 1, 2, 3 + +
    N1017A AZ11137a 2 + -
    Cat 100 CH 2 + ND
    CC 2 + ND
    A188 E4 2 + -
    • Das Symbol „–" zeigt an, dass die Linie nach 3 Versuchen nicht transformierbar war, oder dass die Pflanzen steril waren.
    • NA bedeutet nicht anwendbar
    • ND bedeutet nicht ausgeführt
  • (ii) Medien
  • Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Empfänger-Zellen nach dem Wachstum in Kultur selektiert. Wenn diese verwendet werden, können kultivierte Zellen entweder auf festen Trägern oder in der Form flüssiger Suspensionen herangezogen werden. In jedem Fall können Nährstoffe für die Zellen in der Form von Medien bereitgestellt werden, und die Umgebungsbedingungen können gesteuert werden. Es gibt viele Arten von Gewebekulturmedien, die Aminosäuren, Salze, Zucker, Wachstumsregulatoren und Vitamine umfassen. Die meisten der bei der Praktizierung der Erfindung verwendeten Medien werden einige ähnliche Bestandteile (siehe Tabelle 2) aufweisen, die Medien unterscheiden sich in Abhängigkeit von der besonderen vorgesehenen Anwendung bezüglich der Zusammensetzung und den Verhältnissen ihrer Inhaltsstoffe. Zum Beispiel wachsen verschiedene Zelltypen normalerweise in mehr als einer Art von Medium, werden aber in Abhängigkeit von dem Wachstumsmedium verschiedene Wachstumsgeschwindigkeiten und verschiedene Morphologien zeigen. In einigen Medien überleben Zellen, aber sie teilen sich nicht.
  • Es sind zuvor verschiedene Arten von Medien beschrieben worden, die für die Kultur von Pflanzenzellen geeignet sind. Beispiele für diese Medien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf das N6-Medium, das von Chu et al. (1975) beschrieben wurde, und das MS-Medium (Murashige & Skoog, 1962). Die Erfinder haben entdeckt, dass Medien, wie beispielsweise MS, die ein hohes Ammoniak-/Nitrat-Verhältnis aufweisen, bei der Erzeugung von Empfänger-Zellen dahingehend kontraproduktiv sind, dass sie den Verlust Fähigkeit zur Gestaltbildung fördern. Auf der anderen Seite weist das N6-Medium ein etwas geringeres Ammoniak-/Nitrat-Verhältnis auf, und es ist vorgesehen, dass es die Erzeugung von Empfänger-Zellen durch das Halten von Zellen in einem proembryogenen Zustand mit der Fähigkeit andauernder Teilungen fördert.
  • (iii) Haltung
  • Das Verfahren zur Haltung von Zellkulturen kann zu ihrer Nützlichkeit als Quellen von Empfänger-Zellen für eine Transformation beitragen. Die manuelle Selektion von Zellen zur Übertragung auf frisches Kulturvolumen, die Häufigkeit der Übertragung auf frisches Kulturvolumen, die Zusammensetzung des Kulturvolumens und Umgebungsfaktoren, die folgende umfassen, aber nicht beschränkt sind auf die Lichtqualität und -quantität und die Temperatur sind alle wichtige Faktoren für das Halten von Kallus- und/oder Suspensionskulturen, die als Quellen von Empfänger-Zellen nützlich sind. Es ist vorgesehen, dass das Abwechseln von Kallus zwischen verschiedenen Kulturbedingungen beim Anreichern von Empfängerzellen innerhalb einer Kultur nützlich sein kann. Zum Beispiel wird vorgeschlagen, dass Zellen in einer Suspensionskultur kultiviert werden können, aber in regelmäßigen Intervallen auf festes Medium übertragen werden können. Nach einer Wachstumszeitspanne auf festem Medium können die Zellen zur Rückübertragung auf flüssiges Kulturmedium manuell selektiert werden. Es wird vorgeschlagen, dass es durch das Wiederholen dieser Sequenz von Übertragungen auf frisches Kulturmedium möglich ist, auf Empfänger-Zellen anzureichern. Es ist auch vorgesehen, dass das Durchführen von Zellkulturen durch ein 1,9 mm-Sieb für das Aufrechterhalten der Krümeligkeit einer Kallus- oder einer Suspensionskultur nützlich ist und für das Anreichern von transformierbaren Zellen nutzbringend sein kann.
  • (iv) Kryokonservierungsverfahren
  • Die Kryokonservierung ist wichtig, weil sie einem erlaubt, eine bekannte transformierbare Zellkultur zur zukünftigen Verwendung zu erhalten und zu konservieren, während die kumulativen abträglichen Wirkungen, die mit verlängerten Kulturperioden verbunden sind, beseitigt werden.
  • Zellsuspensionen und -kallus wurden unter Verwendung von Modifikationen der früher veröffentlichten Verfahren (Finkle, 1985; Withers & King, 1979) kryokonserviert. Das Kryokonservierungsprotokoll umfasste das stufenweise Hinzugeben einer vorgekühlten (0 °C) konzentrierten Kryoschutzmischung schrittweise über eine Zeitspanne von ein bis zwei Stunden zu vorgekühlten (0 °C) Zellen. Die Mischung wurde über diese Zeitspanne bei 0 °C gehalten. Das Volumen des hinzugegebenen Kryoschutzmittels war gleich dem Anfangsvolumen der Zellsuspension (1:1-Zugabe), und die Endkonzentration der Kryoschutzzusatzstoffe betrug 10 % Dimethylsulfoxid, 10 % Polyethylenglycol (6000 MW), 0,23 M Prolin und 0,23 M Glucose. Der Mischung wurde gestattet, 30 Minuten lang bei 0 °C zu äquilibrieren, und während dieser Zeit wurde die Zellsuspensions-/Kryoschutzstoffmischung in 1,5 ml-Aliquots (0,5 ml komprimiertes Zellvolumen) in 2 ml-Polyethylen-Kryoröhrchen aufgeteilt. Die Röhrchen wurden bei 0,5 °C/Minute auf –8 °C abgekühlt und bei dieser Temperatur zur Eiskristallisationskeimbildung gehalten.
  • Sobald die extrazelluläre Eisbildung visuell bestätigt war, wurden die Röhrchen bei 0,5 °C/Minute von –8 °C auf –35 °C abgekühlt. Sie wurden bei dieser Temperatur 45 Minuten lang gehalten (um eine gleichmäßige kälteinduzierte Entwässerung durch die Zellcluster hindurch sicherzustellen). An diesem Punkt hatten die Zellen das meiste ihres osmotischen Volumens verloren (d. h. es war wenig freies Wasser in den Zellen übrig), und sie konnten zur Lagerung sicher in flüssigen Stickstoff eingetaucht werden. Die Knappheit von in den Zellen verbliebenem freiem Wasser zusammen mit den schnellen Abkühlungsgeschwindigkeiten von –35 auf –196 °C verhinderte die Bildung großer organisierter Eiskristallen in den Zellen. Die Zellen werden in flüssigem Stickstoff gelagert, was die Zellen wirkungsvoll immobilisiert und Stoffwechselprozesse bis auf den Punkt verlangsamt, an dem eine langfristige Lagerung nicht schädlich sein sollte.
  • Das Auftauen der extrazellulären Lösung wurde durch das Entnehmen des Kryoröhrchens aus dem flüssigen Stickstoff und das Wirbeln des Röhrchens in sterilem 42 °C warmem Wasser über eine Zeitdauer von ungefähr 2 Minuten erreicht. Das Röhrchen wurde aus der Wärme unmittelbar entfernt, nachdem die letzten Eiskristalle geschmolzen waren, um ein Aufwärmen des Gewebes zu verhindern. Die (immer noch in der Kryoschutzmischung vorliegende) Zellsuspension wurde auf einen Filter pipettiert und ruhte auf einer Schicht BMS-Zellen (die Ernährerschicht, die während der Erholung eine Heilungswirkung bereitstellte). Die Verdünnung des Kryoschutzmittels trat langsam auf, während die gelösten Stoffe durch den Filter diffundierten, und Nährstoffe nach oben zu den sich erholenden Zellen diffundierten. Sobald das nachfolgende Wachstum der aufgetauten Zellen festgestellt wurde, wurde das wachsende Gewebe auf frisches Kulturmedium übertragen. Die Zellcluster wurden zurück in das flüssige Suspensionsmedium übertragen, sobald sich eine ausreichende Zellmasse rückgebildet hatte (gewöhnlich innerhalb von 1 bis 2 Wochen). Nachdem die Kultur in Flüssigkeit reetabliert war (innerhalb von 1 bis 2 zusätzlichen Wochen), wurde sie für Transformationsexperimente verwendet. Wenn es erwünscht ist, können zuvor kryokonservierte Kulturen wieder zur Lagerung eingefroren werden.
  • IV. Exogene Gene umfassende DNA-Segmente
  • Wie zuvor erwähnt, gibt es mehrere Verfahren, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind, um die DNA-Segmente zu konstruieren, die DNA in eine Wirtszelle einbringen. Der allgemeine Aufbau der Vektoren, die hierin verwendet werden, sind Plasmide, die einen Promotor, andere regulatorische Regionen, strukturelle Gene und ein 3'-Ende umfassen.
  • Die Pflanzen der vorliegenden Offenbarung weisen ein mutiertes EPSPS-Gen auf, das eine Glyphosat-Resistenz verleiht. Die bevorzugte EPSPS-Sequenz umfasst, wie in 12 gezeigt, ein Chloroplasten-Transitpeptid aus Mais in Kombination mit dem EPSPS-Gen. Es soll verstanden werden, dass dieses Chloroplasten-Transitpeptid homolog sein könnte, d. h. aus dem Mais-EPSPS-Gen, oder heterolog, d. h. aus jeglichem anderen Gen. Bevorzugterweise wird das Transitpeptid das optimierte Transitpeptid sein, das in den hierin offenbarten Konstrukten verwendet wird. Alternativ kann das EPSPS-Gen ohne ein Transitpeptid verwendet werden, und das Gen kann nach den Techniken, die in US-Patent 5,451,513 beschrieben sind, in das Chloroplasten-Genom transformiert werden.
  • Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung wurden mehrere Plasmide konstruiert, die für eine Vielzahl von verschiedenen Genen kodieren, deren wichtige Merkmale unten in Tabelle 4 dargestellt sind. Bestimmte Plasmide unter diesen sind auch in den 1-4 gezeigt: pDPG165 (1), pDPG427 (2), pDPG434 (3) und pDPG443 (4).
  • Tabelle 4 zeigt die bei der Konstruktion von Glyphosat-resistenten Maislinien verwendeten Vektoren GA21, GG25, GJ11 und FI117. Die Tabelle 5 zeigt die Bestandteile des Plasmides pDPG434, das bei der Transformation von GA21 und FI117 verwendet wurde. Das für das Enzym EPSPS kodierende Gen wurde aus Zea mays kloniert. Zwei Mutationen wurden in die Aminosäuresequenz von EPSPS eingeführt, um Glyphosat-Resistenz zu verleihen, d. h. eine Substitution des Threonins durch Isoleucin an der Aminosäureposition 102 und eine Substitution von Prolin durch Serin an der Aminosäureposition 106. Die Pflanzenexpressionsvektoren pDPG427, pDPG434 und pDPG443 wurden unter Verwendung des promotorlosen mutierten Mais-EPSPS-Expressionsvektors konstruiert, der von Rhone Poulenc Agrochimie (pDPG425) erhalten wurde. Das mutierte EPSPS-Gen in diesem Vektor kodiert für ein Enzym mit den Aminosäureänderungen an den Positionen 102 (Threonin zu Isoleucin) und 106 (Prolin zu Serin). Eine Beschreibung der Konstruktion dieser Vektoren ist hierin dargestellt. Tabelle 4 Für die Transformation der Glyphosat-resistenten Maislinien GA21, GG25, GJ11 und FI117 verwendete Vektoren
    BEZEICHNUNG DES REKOMBINANTEN VEKTORS & QUELLE ELTERNREPLIKON DNA-INSERTION ÜBERLEGTE EXPRESSIONSVERSUCHE
    pDPG165 pUC19 1, 3, 4 1
    pDPG427 pSK- 2, 5, 6, 7 2
    pDPG434 pSK- 2, 9, 7, 6 2, 7
    pDPG443 pSK- 2, 6, 7, 8 2, 7
  • SCHLÜSSEL: Insertions-DNA und überlegte Expressionsversuche
    • 1. Das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus kodiert für Phosphinothricin- Acetyltransferase (PAT). PAT-exprimierende Zellen sind gegen das Herbizid Basta resistent. White, J., Chang, S.-V.P., Bibb, M.J., und Bibb, M.J. 1990. Nucl. Ac. Research 18: 1062.
    • 2. Das EPSPS-Gen (5-Enolpyruvy/Shikimat-3-Phosphatsynthase) aus Zea Mays wurde mutiert, um eine Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat zu verleihen. Ein Threonin Aminosäureposition 102 wurde gegen Isoleucin ausgetauscht, und ein Prolin Aminosäureposition 106 wurde gegen Serin ausgetauscht.
    • 3. Promotorsequenzen aus dem Blumenkohlmosaikvirus-Genom. Odell, J.T., Nagy, F. und Chua, N.-H. 1985. Nature 313: 810-812.
    • 4. Terminatorsequenz aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. (a) Bevan, M., 1984. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721; (b) Ingelbrecht, I.L.W., Herman, L.M.F., DeKeyser, R.A., Van Montagu, M.C., Depicker, A.G. 1989. The Plant Cell 1: 671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M., Chilton, M.D., 1983. Nucleic Acid Research. 11: 369-385; (d) Ellis, J.G., Llewellyn, D.J., Walker, J.C., Dennis, E.S., Peacocu, W.J. 1987. EMBO J. 6: 3203-3208.
    • 5. Enhancer-Sequenzen aus dem Mais-Alkoholdehydrogenase-Gen. Callis, J., Fromm, M.E., Walbot, V., 1987. Genes Dev. 1: 1183-1200.
    • 6. Terminatorsequenzen aus dem Ti-Plasmid von Agrobacterium (nos 3'-Ende) (a) Bevan, M., 1984. Nucleic Acid Research 12: 8711-8721; (b) Ingelbrecht, I.L.W., Herman, L.M.F., DeKeyser, R.A., Van Montagu, M.C., Depicker, A.G. 1989. The Plant Cell 1: 671-680; (c) Bevan, M., Barnes, W.M., Chilton, M.D., 1983. Nucleic Acid Research. 11: 369-385.
    • 7. Eine Chloroplasten-Transitpeptidsequenz, hier als die optimierte Transitpeptidsequenz (OTP) bezeichnet, die aus der DNA-Sequenz aus Mais- und Sonnenblumen-Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylaseoxygenase (RuBisCo)-Genen (Lebrun et al., 1996; Rhone Roulenc Agrochimie) besteht.
    • 8. Fusionierte Promotorsequenzen aus dem Genom des Blumenkohlmosaikvirus und dem Arabidopsis thaliana-H4-Histon-Gen. Konstruiert von Rhone Poulenc Agrochimie.
    • 9. Aktin-1 5'-Region umfassend Promotor aus Oryza sativa (McElroy et al., 1991).
  • Tabelle 5 Zusammenfassung von im Plasmid pDPG434 vorhandenen Sequenzen
    Vektorbestandteil Ungefähre Größe, Kb Beschreibung
    Reis-Aktin-Promotor und -Intron 1,37 Den Promotor und das erste Intron enthaltende 5'-Region des Reis-Aktin-1-Gens (McElroy et al., 1991)
    Optimiertes Transitpeptid (OTP) 0,37 Chloroplasten-Transitpeptidsequenz konstruiert auf der Grundlage von Transitpeptidsequenzen aus Mais- und Sonnenblumen-Ribulose-1,5-bisphosphatcarboxylaseoxygenase (RuBisCo)-Genen (Lebrun et al., 1996)
    mutiertes Mais-EPSPS-Gen 1,34 Wildtyp-Mais-EPSPS-Gen (Lebrun et al., 1991), das Mutationen an der Aminosäureposition 102 (Threonin zu Isoleucin) und 106 (Prolin zu Serin) enthält
    nos 3'-Ende 0,24 Polyadenylierungsregion aus dem Nopalinsynthasegen aus Agrobacterium tumefaciens (Bevan, 1984)
    lac 0,24 Einen Teil der für lacI kodierende Sequenz, der Promotor plac, und ein Teil einer für β-Galactosidase oder das lacZ-Protein kodierenden Sequenz (Panisch-Perron et al., 1985)
    bla 0,86 Das TEM-Typ-β-Lactamasegen aus dem E. coli-Plasmid pBR322 verleiht Resistenz auf Bakterienzellen gegen Ampicillin oder andere Penizilline (Sutcliffe, 1978). Das Gen steht unter der Kontrolle des nativen bakteriellen Promotors.
    ColE1-ori 0,65 Der DNA-Replikationsursprung des E. coli high copy-Plasmides pUC19 (Panisch-Perron et al., 1985)
  • V. Identifizierung von transformierten Zellen unter Verwendung von Selektion
  • Man glaubt, dass DNA bei einem jedem Experiment nur in einen kleinen Prozentanteil der Zellen eingeführt wird. Um ein effizienteres System zur Identifizierung derjenigen Zellen bereitzustellen, die DNA empfangen und sie in ihre Genome integrieren, könnte man daher wünschen, dass man ein Mittel zum Selektieren derjenigen Zellen verwendet, die stabil transformiert sind. Eine beispielhafte Ausführungsform eines solchen Verfahrens besteht darin, ein Markergen in die Wirtszelle einzuführen, das eine Resistenz gegen irgendein normalerweise inhibitorisches Agens verleiht, z. B. ein Antibiotikum oder ein Herbizid. Die potentiell transformierten Zellen werden dann gegenüber dem Agens exponiert. In der Population überlebender Zellen befinden sich diejenigen Zellen, bei denen das resistenzverleihende Gen im Allgemeinen integriert wurde und in ausreichenden Konzentrationen exprimiert wird, um das Überleben der Zelle zu gestatten. Die Zellen können weiter untersucht werden, um die stabile Integration der exogenen DNA zu bestätigen. Unter Verwendung von embryogenen Suspensionskulturen können stabile Transformanten mit einer Häufigkeit von ungefähr 1 pro 1000 vorübergehend exprimierenden Konzentrationspunkten wiedergewonnen werden.
  • Ein Herbizid, das für die Selektion von transformierten Zelllinien bei der Praktizierung der Erfindung nützlich ist, ist das mit einem breiten Spektrum wirkende Herbizid Glyphosat. Glyphosat inhibiert die Aktivität des Enzyms EPSPS, das im biosynthetischen Stoffwechselweg der aromatischen Aminosäuren aktiv ist. Die Inhibition des Enzyms führt zur Aushungerung bezüglich der Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan und bezüglich sekundärer daraus abgeleiteter Stoffwechselprodukte. Das US-Patent 4,535,060 beschreibt die Isolierung von EPSPS-Mutationen, die eine Glyphosat-Resistenz auf aroA, dem Salmonella typhimurium-Gen für EPSPS, verleihen. Das EPSPS-Gen wurde aus Zea mays kloniert, und denjenigen ähnelnde Mutationen, die in einem Glyphosat-resistenten aroA-Gen gefunden wurden, wurden in vitro eingeführt. Das mutierte Gen kodiert für ein Protein mit Aminosäureveränderungen an den Resten 102 und 106. Obwohl diese Mutationen auf dem Enzym EPSPS eine Resistenz gegen Glyphosat verleihen, wird erwartet, dass andere Mutationen ebenfalls nützlich sein werden.
  • Beispielhafte Ausführungsformen von Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, DNA an Pflanzenwirtszellen abzugeben, sind die Plasmide pDPG165, pDPG427, pDPG434 und pDPG443. Diese und andere geeignete Plasmidvektoren sind weiterhin in der US-Patentanmeldung Nr. 08/113,561 , eingereicht am 25. August 1993, diskutiert. Ein sehr wichtiger Bestandteil des pDPG165-Plasmides für die Zwecke der genetischen Transformation ist das bar-Gen, das für einen Marker zur Selektion von transformierten Zellen kodiert, die gegenüber Bialaphos oder PPT exponiert sind. Die Plasmide pDPG434, pDPG427, pDPG441, pDPG443 und pDPG436, pDPG447, pDPG465 und pDPG467 enthalten ein Mais-EPSPS-Gen mit Mutationen an den Aminosäureresten 102 und 106, das von verschiedenen, unterschiedlichen Promotoren angetrieben sind ( US-Patentanmeldung Nr. 08/113,561 , eingereicht am 25. August 1993). Ein sehr wichtiger Bestandteil dieser Plasmide für die Zwecke der genetischen Transformation ist das mutierte EPSPS-Gen, das für einen Marker zur Selektion von transformierten Zellen kodiert.
  • VI. Herstellung und Charakterisierung von stabilem transgenen Mais
  • Nach dem Bewirken der Abgabe exogener DNA an Empfänger-Zellen betreffen die nächsten Schritte im Allgemeinen das Identifizieren der transformierten Zellen zum weiteren Kultivieren und zur weiteren Pflanzenregeneration. Wie hierin erwähnt, könnte man sich wünschen, dass man ein selektierbares oder screenbares Markergen wie das oder zusätzlich zu dem exprimierbaren interessierenden Gen verwendet, um die Fähigkeit, Transformanten zu identifizieren, zu verbessern. In diesem Fall würde man im Allgemeinen die potentiell transformierte Zellpopulation durch das Exponieren der Zellen gegen ein selektives Agens oder selektive Agenzien testen, oder man würde die Zellen auf die erwünschte Markergeneigenschaft screenen.
  • (i) Selektion
  • Eine beispielhafte Ausführungsform von Verfahren zum Identifizieren transformierter Zellen umfasst das Exponieren der bombardierten Kulturen gegen ein selektives Agens, wie beispielsweise einen Stoffwechselinhibitor, ein Antibiotikum, ein Herbizid oder dergleichen. Zellen, die transformiert wurden und ein Markergen stabil integriert haben, das eine Resistenz gegen das verwendete selektive Agens verleiht, werden in der Kultur wachsen und sich in der Kultur teilen. Empfindliche Zellen werden weiterem Kultivieren nicht zugänglich sein.
  • Um das selektive EPSPS-Glyphosat-System zu verwenden, wird bombardiertes Gewebe 0-28 Tage lang auf nichtselektivem Medium kultiviert und anschließend auf Medium übertragen, das zwischen 1-3 mM Glyphosat enthält, je nachdem, wie viel angemessen ist. Während Bereiche von 1-3 mM Glyphosat typischerweise bevorzugt sein werden, wird vorgeschlagen, dass Bereiche von 0,1-50 mM Glyphosat Behandlung bei der Praktizierung der Erfindung einen Nutzen finden werden. Das Gewebe kann zum Bombardieren auf jeglichen porösen, inerten, festen oder halbfesten Träger gegeben werden, der Filter und festes Kulturmedium umfasst, aber nicht darauf beschränkt ist.
  • Es ist weiter vorgesehen, dass Kombinationen von screenbaren und selektierbaren Markern bezüglich der Identifizierung von transformierten Zellen nützlich sein werden. Bei manchen Arten von Zellen oder Geweben kann ein Selektionsagens wie beispielsweise Bialaphos oder Glyphosat möglicherweise nicht genug Abtötungsaktivität bereitstellen, um transformierte Zellen deutlich zu erkennen, oder kann möglicherweise eine erhebliche nicht-selektive Inhibition von Transformanten und Nicht-Transformanten gleichermaßen bewirken, und somit bewirken, dass die Selektionstechnik nicht wirksam ist. Es wird vorgeschlagen, dass die Selektion mit einer wachstumsinhibierenden Verbindung wie beispielsweise Bialaphos oder Glyphosat bei Konzentrationen unterhalb von denjenigen, die eine 100 %ige Inhibition verursachen, gefolgt von einem Screenen von wachsenden Gewebe auf die Expression eines screenbaren Markergens wie beispielsweise Luziferase, es einem erlauben würde, Transformanten von Zell- oder Gewebearten zu gewinnen, die der Selektion alleine nicht zugänglich sind. Es wird vorgeschlagen, dass Kombinationen von Selektion und Screening einen in die Lage versetzen könnten, Transformanten in einer größeren Vielzahl von Zell- und Gewebearten zu identifizieren.
  • (ii) Regeneration und Samenproduktion
  • Zellen, die die Exponierung gegen das selektive Agens überleben, oder Zellen, die in einem Screeningtest als positiv bewertet wurden, können in Medium, das die Regeneration von Pflanzen unterstützt, kultiviert werden. In einer beispielhaften Ausführungsform können MS- und N6-Medien durch das Einschließen weiterer Substanzen, wie beispielsweise von Wachstumsregulatoren modifiziert werden (siehe Tabelle 2). Ein bevorzugter Wachstumsregulator für solche Zwecke ist Dicama oder 2,4-D. Jedoch können andere Wachstumsregulatoren verwendet werden, die NAA, NAA + 2,4-D oder vielleicht sogar Picloram umfassen. Es wurde festgestellt, dass die Verbesserung von Medien auf diesen und anderen Wegen das Wachstum von Zellen in spezifischen Entwicklungsphasen erleichtert. Das Gewebe kann auf einem Grundmedium mit Wachstumsregulatoren aufrechterhalten werden, bis genügend Gewebe verfügbar ist, um Bemühungen zur Regenerierung von Pflanzen zu beginnen, oder es kann anschließend nach wiederholten Runden manueller Selektion, bis die Morphologie des Gewebes für die Regeneration geeignet ist, über mindestens zwei Wochen, auf Medien übertragen wird, die der Reifung von Embryoiden förderlich sind. Die Kulturen werden alle zwei Wochen auf dieses Medium übertragen. Die Entwicklung von Trieben wird die Zeit zum Übertragen auf Medium angeben, dem Wachstumsregulatoren fehlen.
  • Den transformierten Zellen, die durch Selektion oder Screening identifiziert und in einem geeigneten Medium kultiviert werden, das die Regeneration unterstützt, wird dann gestattet werden, zu Pflanzen zu reifen. Sich entwickelnde Pflänzchen werden auf eine Pflanzenwachstumsmischung ohne Boden übertragen und verfestigt, z. B. in einer Kammer mit gesteuerten Umgebungsbedingungen bei etwa 85 % relativer Feuchtigkeit, 600 ppm CO2 und 25-250 Mikroeinstein m–2 s–1 Licht. Man lässt die Pflanzen bevorzugterweise in einer Wachstumskammer reifen.
  • (iii) Charakterisierung
  • Um die Anwesenheit von exogener DNA oder einem oder mehr als einem „Transgen" in den sich regenerierenden Pflanzen zu bestätigen, kann eine Vielzahl von Tests durchgeführt werden. Solche Tests umfassen z. B. „molekularbiologische" Tests, wie beispielsweise Southern und Northern-Blotten und PCR, „biochemische" Tests, wie beispielsweise das Nachweisen der Anwesenheit eines Proteinproduktes, z. B. durch immunologische Mittel (ELISAs und Western Blots) oder durch eine enzymatische Funktion, Tests mit Pflanzenteilen, wie beispielsweise Blatt- oder Wurzeltests, und auch durch das Analysieren des Phänotyps der ganzen regenerierten Pflanze.
  • 1. DNA-Integration, RNA-Expression und Vererbung
  • Genomische DNA kann aus Kallus-Zelllinien oder jeglichen Pflanzenteilen isoliert werden, um die Anwesenheit des exogenen Gens durch die Verwendung von Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannten Techniken festzustellen. Es ist zu bemerken, dass intakte Sequenzen nicht immer vorhanden sein werden, vermutlich aufgrund einer Wiederarrangierung oder Deletion von Sequenzen in der Zelle.
  • Die Anwesenheit von DNA-Elementen, die durch die Verfahren der Erfindung eingeführt wurden, kann durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bestimmt werden.
  • Ein positiver Nachweis der DNA-Integration in das Wirtsgenom und die unabhängigen Identitäten der Transformanten können unter Verwendung der Southern-Hybridisierungstechnik bestimmt werden.
  • Es ist vorgesehen, dass man unter Verwendung der Dot- oder Slot-Blot-Hybridisierungstechniken, die Modifizierungen der Southern-Hybridisierungstechniken sind, die gleichen Informationen erhalten könnte, die aus der PCR abgeleitet werden, z. B. die Anwesenheit eines Gens.
  • Sowohl PCR- als auch Southern-Hybridisierungstechniken können verwendet werden, um die Übertragung eines Transgens an die Nachkommenschaft zu zeigen. In den meisten Fällen wird sich das charakteristische Southern-Hybridisierungsmuster für einen gegebenen Transformanten in der Nachkommenschaft als ein oder mehr als ein Mendel'sches Gen (Spencer et al., 1992) aufspalten, was die stabile Vererbung des Transgens anzeigt.
  • Während DNA-Analysetechniken unter Verwendung von aus jeglichem Teil einer Pflanze isolierter DNA ausgeführt werden können, wird RNA nur in bestimmten Zellen oder Gewebetypen exprimiert werden, und daher wird es notwendig sein, RNA zur Analyse aus diesen Geweben präparieren. PCR-Techniken können auch für den Nachweis und die Quantifizierung von aus eingeführten Genen hergestellter RNA verwendet werden. Bei dieser Anwendung der PCR ist es zunächst notwendig, die RNA unter Verwendung von Enzymen wie der reversen Transkriptase revers zu DNA zu transkribieren, und die DNA anschließend durch die Verwendung von herkömmlichen PCR-Techniken zu amplifizieren. In den meisten Fällen werden PCR-Techniken, obwohl sie nützlich sind, die Integrität des RNA-Produktes nicht zeigen. Weitere Informationen hinsichtlich der Natur des RNA-Produktes können durch Northern-Blotten erhalten werden. Diese Technik wird die Anwesenheit einer RNA-Spezies anzeigen und Informationen mit Hinblick auf die Integrität von derjenigen RNA geben. Die Anwesenheit oder Abwesenheit einer RNA-Spezies kann auch unter Verwendung von Dot- oder Slot-Blot-Northern-Hybridisierungen bestimmt werden. Diese Techniken sind Modifikationen des Northern-Blotten und werden lediglich die Anwesenheit oder Abwesenheit einer RNA-Spezies zeigen.
  • 2. Genexpression
  • Während Southern-Blotten und PCR verwendet werden können, um das fragliche Gen oder die fraglichen Gene nachzuweisen, stellen sie keine Informationen dahingehend bereit, ob ein Gen exprimiert wird. Die Expression kann durch das spezifische Identifizieren der Proteinprodukte des eingeführten Gens oder durch das Untersuchen der Phänotypveränderungen überprüft werden, die durch ihre Expression hervorgerufen werden.
  • Die Expression eines Genprodukts wird sehr häufig durch das Untersuchen der phänotypischen Ergebnisse seiner Expression festgestellt werden. Diese Tests können ebenfalls viele Formen annehmen, die das Analysieren von Veränderungen der chemischen Zusammensetzung, der Morphologie oder der physiologischen Eigenschaften der Pflanze umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Die chemische Zusammensetzung kann durch die Expression von Genen verändert werden, die für Enzyme oder Speicherproteine kodieren, die die Aminosäurezusammensetzung ändern, und sie kann durch Aminosäureanalyse oder durch Enzyme nachgewiesen werden, welche die Stärkemenge verändern, die durch Reflexionsspektrometrie im nahen Infrarotbereich analysiert werden kann. Die morphologischen Veränderungen können eine höhere Statur oder dickere Stängel umfassen. Am häufigsten werden Veränderungen als Reaktion von Pflanzen oder Pflanzenteilen auf verhängte Behandlungen unter vorsichtig gesteuerten Bedingungen überprüft, was als Biotests bezeichnet wird.
  • VII. Genetische Analyse von Glyphosat-resistenten transgenen Pflanzen
  • Bei besonderen Ausführungsformen der Offenbarung können Verfahren zum Nachweisen einer Veränderung bei der Expression von bestimmten Transgenen, wie beispielsweise dem bar-Gen und mutiertem EPSPS, verwendet werden. Dieses Verfahren kann das Bestimmen der Konzentration des durch diese Gene exprimierten Proteins oder das Feststellen spezifischer Veränderungen des exprimierten Produktes umfassen. Offensichtlich hat diese Art von Tests eine Bedeutung beim Screenen von Transformanten auf eine potentielle Herbizidresistenz. Solche Tests können in manchen Fällen schneller, genauer und weniger teuer als herkömmliche Screeningtests sein.
  • Die biologische Probe kann potentiell jegliche Art von Pflanzengewebe sein. Nukleinsäure wird gemäß Standardtechniken (Sambrook et al., 1989) aus Zellen isoliert, die in der biologischen Probe enthalten sind. Die Nukleinsäure kann genomische DNA oder fraktionierte oder Ganzzell-RNA sein. Wenn RNA verwendet wird, kann gewünscht werden, die RNA zu einer komplementären DNA umzuwandeln. In einer Ausführungsform ist die RNA Ganzzell-RNA; in einer anderen Form ist sie poly-A-RNA. Normalerweise wird die Nukleinsäure amplifiziert.
  • In Abhängigkeit von dem Format wird die spezifische interessierende Nukleinsäure in der Probe direkt unter Verwendung von Amplifizierung oder mit einer zweiten, bekannten Nukleinsäure nach der Amplifizierung identifiziert. Anschließend wird das identifizierte Produkt nachgewiesen. Bei bestimmten Behandlungen kann der Nachweis durch visuelle Mittel (z. B. Ethidiumbromidfärbung eines Gels) durchgeführt werden. Alternativ kann der Nachweis die indirekte Identifizierung des Produktes über Chemilumineszenz, die radioaktive Szintigraphie einer Radiomarkierung oder eine Fluoreszenzmarkierung oder sogar über ein System unter Verwendung von elektrischen oder thermischen Impulssignalen (Affymax Technology; Bellus, 1994) umfassen.
  • Nach dem Nachweis kann man die Ergebnisse, die bei einer gegebenen Pflanze festgestellt wurden, mit einer statistisch signifikanten Referenzgruppe nicht transformierter Kontrollpflanzen vergleichen. Typischerweise werden die nicht transformierten Kontrollpflanzen einen genetischen Hintergrund aufweisen, der dem der transformierten Pflanzen ähnlich ist. Auf diese Weise ist es möglich, Unterschiede hinsichtlich der Menge oder Art des Proteins nachzuweisen, das in verschiedenen transformierten Pflanzen nachgewiesen wird.
  • Eine Vielzahl von verschiedenen Tests ist beim Screening der Glyphosat-resistenten Pflanzen der vorliegenden Offenbarung und den verbundenen exogenen Elementen vorgesehen. Diese Techniken können in einigen Fällen verwendet werden, um sowohl das Vorhandensein der bestimmten Gene als auch Umarrangierungen festzustellen, die in dem Genkonstrukt aufgetreten sein können. Diese Techniken umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), direkte DNA-Sequenzierung, PFGE-Analyse, Southern- oder Northern-Blotten, einzelsträngige Konformationsanalyse (SSCA), RNAse-Schutztest, allelspezifisches Oligonukleotid (ASO), Dot-Blot-Analyse, denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese, RFLP und PCR-SSCP.
  • (i) Primer und Sonden
  • Es ist beabsichtigt, dass der Begriff Primer, wie hierin definiert, jegliche Nukleinsäure umfassen soll, die fähig ist, die Synthese von einer entstehenden Nukleinsäure bei einem Matrizen-abhängigen Verfahren zu primen. Typischerweise sind Primer Oligonukleotide einer Länge von zehn bis zwanzig Basenpaaren, aber längere Sequenzen können verwendet werden. Primer können in einer doppelsträngigen oder einzelsträngigen Form bereitgestellt werden, obwohl die einzelsträngige Form bevorzugt ist. Sonden sind unterschiedlich definiert, obwohl sie als Primer fungieren können. Sonden sind, während sie vielleicht zu primen fähig sind, konstruiert worden, um an Ziel-DNA oder -RNA zu binden, und müssen nicht bei einem Amplifikationsvorgang verwendet werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen sind die Sonden oder Primer mit einer radioaktiven Spezies (32P, 14C, 35S, 3H oder anderen Markierung), mit einem Fluorophor (Rhodamin, Fluorescein), einem Antigen (Biotin, Streptavidin, Digoxigenin) oder einem Chemilumineszenzstoff (Luziferase) markiert.
  • (ii) Matrizen-abhängige Amplifizierungsverfahren
  • Eine Anzahl Matrizen-abhängiger Verfahren sind verfügbar, um die Markersequenzen zu amplifizieren, die in einer gegebenen Matrizen-Probe vorhanden sind. Eines der bekanntesten Amplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (bezeichnet als PCRTM), die im Detail in den US-Patenten mit den Nummern 4,683,195 , 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben ist.
  • Kurz gesagt werden bei der PCR zwei Primersequenzen hergestellt, die zu Regionen auf gegenüberliegenden komplementären Strängen der Markersequenz komplementär sind. Ein Überschuss an Desoxynukleosidtriphosphaten wird zusammen mit einer DNA-Polymerase, z. B. Taq-Polymerase, zu einer Reaktionsmischung hinzugegeben. Wenn die Markersequenz in einer Probe vorhanden ist, werden die Primer an den Marker binden, und die Polymerase wird bewirken, dass die Primer durch das Hinzufügen von Nukleotiden entlang der Markersequenz verlängert werden. Durch das Erhöhen und Erniedrigen der Temperatur der Rekationsmischung werden die verlängerten Primer von dem Marker dissoziieren, um Reaktionsprodukte zu bilden, überschüssige Primer werden an den Marker und an die Reaktionsprodukte binden, und der Vorgang wird wiederholt.
  • Eine Prozedur zur PCR-Amplifikation mit reverser Transkriptase kann ausgeführt werden, um die Menge der amplifizierten mRNA zu quantifizieren. Verfahren zum reversen Transkribieren von RNA zu cDNA sind wohlbekannt und in Sambrook et al., 1989 beschrieben. Alternative Verfahren zur reversen Transkription verwenden thermostabile, RNA-abhängige DNA-Polymerasen. Diese Verfahren sind in WO 90/07641 , eingereicht am 21. Dezember 1990, beschrieben. Methoden mit der Polymerase-Kettenreaktion sind auf dem Gebiet wohlbekannt.
  • Ein anderes Verfahren zur Amplifizierung ist die Ligase-Kettenreaktion („LCR"), die in EPO Nr. 320 308 offenbart ist. Bei der LCR werden zwei komplementäre Sondenpaare hergestellt, und in Anwesenheit der Zielsequenz wird jedes Paar an gegenüberliegende komplementäre Stränge des Ziels binden, so dass sie aneinandergrenzen. Bei Anwesenheit einer Ligase werden die beiden Sondenpaare sich verbinden, um eine einzelne Einheit zu bilden. Durch Temperaturzyklisieren wie bei der PCR dissoziieren gebundene ligierte Einheiten von dem Ziel und dienen anschließend als „Zielsequenzen" zur Ligation von überschüssigen Sondenpaaren. Das US-Patent mit der Nummer 4,883,750 beschreibt ein Verfahren, das der LCR ähnlich ist, zum Binden von Sondenpaaren an eine Zielsequenz.
  • Die in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US87/00880 beschriebene Qbeta-Replikase kann bei der vorliegenden Erfindung als noch ein weiteres Amplifikationsverfahren verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird eine replikative RNA-Sequenz, die eine zu der des Ziels komplementäre Region aufweist, in Gegenwart einer RNA-Polymerase zu einer Probe hinzugegeben. Die Polymerase wird die replikative Sequenz kopieren, die dann nachgewiesen werden kann.
  • Ein isothermisches Amplifizierungsverfahren, bei dem Restriktionsendonukleasen und Ligasen verwendet werden, um die Amplifikation von Zielmolekülen zu erreichen, die Nukleotid-5'-[Alpha-thio]-triphosphate in einem Strang einer Restriktionsstelle enthalten, können auch bei der Amplifikation von Nukleinsäuren bei der vorliegenden Erfindung nützlich sein, Walker et al. (1992).
  • Die Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ist ein weiteres Verfahren zum Ausführen einer isothermischen Amplifikation von Nukleinsäuren, das vielfache Runden Strangverdrängung und -synthese, d. h. Nick-Translation, umfasst. Ein ähnliches Verfahren, als Reperatur-Ketten-Reaktion (RCR) bezeichnet, umfasst das Annellieren von verschiedenen Sonden über eine Region, die das Ziel einer Amplifizierung ist, gefolgt von einer Reparaturreaktion, bei der nur zwei der vier Basen anwesend sind. Die anderen Basen können als biotinylierte Derivative zum leichten Nachweis hinzugegeben werden. Bei der SDA wird ein ähnlicher Ansatz verwendet. Zielspezifische Sequenzen können auch unter Verwendung einer zyklischen Sondenreaktion (CPR) nachgewiesen werden. Bei der CPR wird eine Sonde, die 3'- und 5'-Sequenzen nicht-spezifischer DNA und einer mittlere Sequenz mit spezifischer RNA aufweist, an DNA hybridisiert, die in der Probe vorhanden ist. Nach der Hybridisierung wird der Reaktionsansatz mit RNAse H behandelt, und die Produkte der Sonde werden als unterschiedliche Produkte identifiziert, die nach dem Verdau freigesetzt werden. Die Originalmatrize wird an eine andere Zyklisierungs-Sonde annelliert, und die Reaktion wird wiederholt.
  • Noch weitere Amplifikationsverfahren, die in der GB-Anmeldung Nr. 2 202 328 und in der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US89/01025 beschrieben sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei der ersten der beiden Anmeldungen werden „modifizierte" Primer bei einer PCR-artigen, Matrizen- und Enzym-abhängigen Synthese verwendet. Die Primer können durch das Markieren mit einem Einfangteil (z. B. Biotin) und/oder einem Detektorteil (z. B. Enzym) modifiziert werden. Bei der zweiten der beiden Anmeldungen wird ein Überschuss markierter Sonden zu einer Probe hinzugegeben. Bei Anwesenheit der Zielsequenz bindet die Sonde und wird katalytisch gespalten. Nach der Spaltung wird die Zielsequenz intakt freigesetzt, um an den Überschuss an die Sonde gebunden zu werden. Eine Spaltung der markierten Sonde zeigt das Vorhandensein der Zielsequenz an.
  • Andere Prozeduren zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassen auf Transkription basierende Amplifikationssysteme (TAS), einschließlich der auf der Nukleinsäuresequenz basierenden Amplifikation (NASBA) und 3SR (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315 ). Bei der NASBA können die Nukleinsäuren zur Amplifikation durch standardgemäße Phenol/Chloroformextrahierung, Hitzedenaturierung einer klinischen Probe, Behandlung mit einem Lysepuffer und Minisein-Säulen zur Isolierung von DNA und RNA oder um Guanidiniumchlorid-Extrahierung von RNA präpariert werden. Diese Amplifikationstechniken umfassen das Annellieren eines Primers, der zielspezifische Sequenzen aufweist. Nach der Polymerisierung werden DNA/RNA-Hybride mit RNase H verdaut, während doppelsträngige DNA-Moleküle noch einmal hitzedenaturiert werden. In jedem Fall wird die einzelsträngige DNA durch das Hinzugeben eines zweiten zielspezifischen Primers, gefolgt von einer Polymerisierung, vollständig doppelsträngig gemacht. Die doppelsträngigen DNA-Moleküle werden dann durch eine RNA-Polymerase wie beispielsweise T7 oder SP6 vielfach transkribiert. In einer isothermischen zyklischen Reaktion werden die RNAs revers zu einzelsträngiger DNA transkribiert, die anschließend zu doppelsträngiger DNA umgewandelt wird, und dann noch einmal mit einer RNA-Polymerase wie beispielsweise T7 oder SP6 transkribiert. Die sich ergebenden Produkte zeigen unabhängig davon, ob sie verkürzt oder vollständig sind, zielspezifische Sequenzen an.
  • Davey et al. offenbaren in EPO Nr. 329 822 ein Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation, das das zyklische Synthetisieren von einzelsträngiger RNA („ssRNA"), von ssDNA und von doppelsträngiger DNA (dsDNA) umfasst, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Die ssRNA ist eine Matrize für ein erstes Primeroligonukleotid, das durch eine reverse Transkriptase (RNA-abhängige DNA-Polymerase) verlängert wird. Die RNA wird dann durch die Aktivität von Ribonuklease H (RNase H, eine RNase, die für RNA in einem Duplex entweder mit DNA oder RNA spezifisch ist) von dem sich ergebenden DNA-RNA-Duplex entfernt. Die sich ergebende ssDNA ist eine Matrize für einen zweiten Primer, der auch die Sequenzen eines RNA-Polymerase-Promotors (wie beispielsweise T7-RNA-Polymerase) am 5'-Ende seiner zur Matrize homologen Sequenz umfasst. Dieser Primer wird dann durch DNA-Polymerase (wie beispielsweise das große „Klenow"-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I) erweitert, was ein doppelsträngiges DNA („dsDNA")-Molekül ergibt, das eine zu der Sequenz der Original-RNA zwischen den Primer identischen Sequenz aufweist, und das zusätzlich an einem Ende eine Promotorsequenz aufweist. Diese Promotorsequenz kann von der geeigneten RNA-Polymerase verwendet werden, um viele RNA-Kopien der DNA herzustellen. Diese Kopien können dann wieder in den Zyklus eintreten, was zu einer sehr schnellen Amplifikation führt. Bei einer geeigneten Wahl der Enzyme kann diese Amplifikation isothermisch ohne das Hinzugeben von Enzymen bei jedem Zyklus ausgeführt werden. Aufgrund der zyklischen Natur dieses Verfahrens kann für die Ausgangssequenz entweder die Form von DNA oder von RNA gewählt werden.
  • Miller et al., PCT-Anmeldung WO 89/06700 , offenbaren ein Schema zur Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz auf der Grundlage der Hybridisierung einer Promotor-Primer-Sequenz an eine einzelsträngige Ziel-DNA („ssDNA"), gefolgt von der Transkription von vielen RNA-Kopien der Sequenz. Dieses Schema ist nicht zyklisch, d. h. von den sich ergebenden RNA-Transkripten werden keine neuen Matrizen hergestellt. Andere Amplifikationsverfahren umfassen „RACE" und „einseitige PCR” (Frohman, M.S., In: PCT PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODSAND APPLICATIONS, Academic Press, N.Y., 1990; Ohara et al., 1989).
  • Auf der Ligation von zwei (oder mehr) Oligonukleotiden in der Anwesenheit von Nukleinsäure, die die Sequenz des sich ergebenden „di-Oligonukleotides" aufweist, und das dadurch ablaufende Amplifizieren des di-Oligonukleotides basierende Verfahren können ebenfalls für den Amplifikationsschritt der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Wu et al., (1989).
  • (iii) Sourthern/Northern-Blotten
  • Blot-Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt. Southern-Blotten umfasst die Verwendung von DNA als Ziel, wohingegen Northern-Blotten die Verwendung von RNA als Ziel umfasst. Jede stellt verschiedene Arten von Informationen bereit, obwohl das Blotten von cDNA in vielerlei Hinsicht analog zum Blotten von RNA-Spezies ist.
  • Kurz gesagt wird eine Sonde verwendet, um auf DNA- oder RNA-Spezies zu zielen, die auf einem geeigneten Träger, oft einem Filter aus Nitrozellulose, immobilisiert worden ist. Die verschiedenen Spezies sollten räumlich getrennt werden, um die Analyse zu erleichtern. Dies wird oft durch eine Gelelektrophorese von Nukleinsäurespezies, gefolgt vom „Blotten" auf den Filter, erreicht.
  • Anschließend wird das geblottete Ziel mit einer Sonde (gewöhnlich markiert) unter Bedingungen inkubiert, die eine Denaturierung und Rehybridisierung fördern. Weil die Sonde so konstruiert ist, dass sie Basenpaarungen mit dem Ziel bildet, wird die Sonde unter renaturierenden Bedingungen einen Teil der Zielsequenz binden. Ungebundene Sonde wird anschließend entfernt, und der Nachweis wird wie oben beschrieben erreicht.
  • (iv) Auftrennungsverfahren
  • Es ist normalerweise in einer Phase oder der anderen wünschenswert, das Amplifikationsprodukt der Matrize und den Überschuss an Primer zum Zwecke des Bestimmens, ob eine spezifische Amplifizierung stattgefunden hat, aufzutrennen. In einer Ausführungsform werden die Amplifikationsprodukte unter Verwendung von Standardverfahren durch Agarose-, Agarose-Acrylamid- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt. Siehe Sambrook et al., 1989.
  • Alternativ können chromatographische Techniken verwendet werden, um die Auftrennung zu bewirken. Es gibt viele Arten von Chromatographien, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können: Adsorptions-, Verteilungs-, Ionenaustausch- und Chromatographie mit molekularem Sieb und viele spezialisierte Techniken, um diese zu verwenden, einschließlich Säulen-, Papier-, Dünnschicht- und Gaschromatographie (Freifelder, 1982).
  • (v) Nachweisverfahren
  • Die Produkte können visualisiert werden, um die Amplifikation der Markersequenzen zu bestätigen. Ein typisches Visualisierungsverfahren umfasst das Färben eines Gels mit Ethidiumbromid und die Visualisierung unter UV-Licht. Alternativ können die Amplifikationsprodukte nach der Auftrennung gegenüber einem Röntgenfilm exponiert werden, falls die Amplifikationsprodukte integral mit radio- oder fluorometrisch markierten Nukleotiden markiert sind, oder unter geeigneten stimulierenden Spektren visualisiert werden.
  • In einer Ausführungsform wird die Visualisierung indirekt erreicht. Nach der Auftrennung der Amplifikationsprodukte wird eine markierte Nukleinsäuresonde in Kontakt mit der amplifizierten Markersequenz gebracht. Die Sonde ist bevorzugterweise an ein Chromophor konjugiert, kann aber radiomarkiert sein. In einer weiteren Ausführungsform ist die Sonde an einen Bindungspartner, wie beispielsweise an Antikörper oder Biotin, konjugiert, und das andere Mitglied des Bindungspaares trägt einen nachweisbaren Teil.
  • In einer Ausführungsform erfolgt der Nachweis durch eine markierte Sonde. Die davon umfassten Techniken sind den Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt und können in vielen Standardbüchern über molekulare Protokolle gefunden werden. Siehe Sambrook et al., 1989. Zum Beispiel identifizieren mit einem Chromophor oder mit einer Radiomarkierung versehene Sonden oder Primer das Ziel während oder nach der Amplifikation.
  • Ein Beispiel des Vorhergehenden ist im US-Patent Nr. 5,279,721 beschrieben, das eine Vorrichtung und ein Verfahren zur automatisierten Elektrophorese und Übertragung von Nukleinsäuren offenbart. Die Vorrichtung erlaubt eine Elektrophorese und Blotten ohne externe Manipulation des Gels und ist zum Ausführen von Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ideal geeignet.
  • Zusätzlich können die oben beschriebenen Amplifikationsprodukte einer Sequenzanalyse unterzogen werden, um spezifische Arten von Variationen unter Verwendung von standardgemäßen Sequenzanalysetechniken zu identifizieren. Mit bestimmten Verfahren wird eine erschöpfende Analyse von Genen durch Sequenzanalyse unter Verwendung von für optimales Sequenzieren konstruierten Primersätzen ausgeführt (Pignon et al., 1994). Die vorliegende Offenbarung stellt Verfahren bereit, durch die jegliche oder alle dieser Arten von Analysen verwendet werden können. Unter Verwendung der hierin offenbarten Sequenzen können Oligonukleotidprimer konstruiert werden, um die Amplifikation von Sequenzen bei den GA21-, GG25-, GJ11- und FI117-Transformationsereignissen genauso wie von flankierenden genomischen Regionen zu erlauben, die anschließend durch direktes Sequenzieren analysiert werden können.
  • (vi) Gestaltung und theoretische Erwägungen bei der relativen quantitativen RT-PCR
  • Die reverse Transkription (RT) von RNA zu cDNA, gefolgt von relativer quantitativer PCR (RT-PCR), kann verwendet werden, um die relative Konzentration von spezifischen mRNA-Spezies, die aus Pflanzen isoliert wurden, zu bestimmen. Durch das Feststellen, dass die Konzentration einer spezifischen mRNA-Spezies schwankt, wird gezeigt, dass das für die spezifische mRNA-Spezies kodierende Gen differenziell exprimiert wird.
  • Bei der PCR erhöht sich die Anzahl der Moleküle der amplifizierten Ziel-DNA um einen Faktor, der sich zwei annähert, mit jedem Zyklus der Reaktion, bis irgendein Reagens limitierend wird. Danach wird die Geschwindigkeit der Amplifikation zunehmend verringert, bis es zwischen den Zyklen keine Zunahme des amplifizierten Ziels gibt. Wenn eine Kurve aufgetragen wird, bei der die Zyklenanzahl auf der X-Achse und der Logarithmus der Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA auf der Y-Achse aufgetragen wird, wird durch das Verbinden der aufgetragenen Punkte eine gebogene Linie von charakteristischer Form gebildet. Beginnend mit dem ersten Zyklus ist die Steigung der Kurve positiv und konstant. Dies nennt man den linearen Teil der Kurve. Nachdem ein Reagens limitierend wird, beginnt die Steigung der Linie abzunehmen und wird schließlich Null. An diesem Punkt wird die Konzentration der amplifizierten Ziel-DNA mit Hinblick auf einen festen Wert asymptotisch. Dies nennt man den Plateau-Teil der Kurve.
  • Die Konzentration der Ziel-DNA im linearen Teil der PCR-Amplifikation ist zur Ausgangskonzentration des Ziels, bevor die Reaktion begann, direkt proportional. Durch das Bestimmen der Konzentration der amplifizierten Produkte der Ziel-DNA bei PCR-Reaktion, die die gleiche Anzahl von Zyklen durchlaufen haben und sich in ihren linearen Bereichen befinden, ist es möglich, die relativen Konzentration der spezifischen Zielsequenz in der ursprünglichen DNA-Mischung zu bestimmen. Wenn die DNA-Mischungen cDNAs sind, die aus aus verschiedenen Geweben oder Zellen isolierten RNAs synthetisiert wurden, können die relativen Häufigkeiten der spezifischen mRNA, aus der die Zielsequenz abgeleitet wurde, für die jeweiligen Gewebe oder Zellen bestimmt werden. Diese direkte Proportionalität zwischen der Konzentration des PCR-Produktes und den relativen mRNA-Häufigkeiten gilt nur im linearen Bereich der PCR-Reaktion.
  • Die Endkonzentration der Ziel-DNA im Plateau-Teil der Kurve wird durch die Verfügbarkeit von Reagenzien in der Reaktionsmischung bestimmt und ist von der ursprünglichen Konzentration der Ziel-DNA unabhängig. Daher ist die erste Bedingung, die erfüllt werden muss, bevor die relativen Häufigkeiten einer mRNA-Spezies durch RT-PCR für eine Reihe von RNA-Populationen bestimmt werden können, dass die Konzentrationen der amplifizierten PCR-Produkte bestimmt werden müssen, wenn sich die PCR-Reaktionen im linearen Teil ihrer Kurven befinden.
  • Die zweite Bedingung, die bei einem RT-PCR-Experiment erfüllt werden muss um die relativen Häufigkeiten einer bestimmten mRNA-Spezies erfolgreich zu bestimmen, ist, dass relative Konzentrationen der amplifizierbaren cDNAs gegen irgendeinen unabhängigen Standard normalisiert werden müssen. Das Ziel eines RT-PCR-Experimentes besteht darin, die Häufigkeit einer bestimmten mRNA-Spezies relativ zur durchschnittlichen Häufigkeit aller mRNA-Spezies in der Probe zu bestimmen.
  • Die meisten Protokolle für kompetitive PCR verwenden interne PCR-Standards, die ungefähr so häufig vorkommen wie das Ziel. Diese Strategien sind wirkungsvoll, wenn die Produkte der PCR-Amplifikationen während ihrer linearen Phasen beprobt werden. Wenn die Produkte beprobt werden, wenn die Reaktionen sich der Plateau-Phase annähern, dann wird das weniger häufig vorkommende Produkt relativ überrepräsentiert. Vergleiche relativer Häufigkeiten, die für viele verschiedene RNA-Proben angestellt werden, wie es beispielsweise der Fall ist, wenn RNA-Proben auf differenzielle Expression untersucht werden, werden derart verzerrt, dass Unterschiede der relativen Häufigkeiten von RNAs geringer erscheinen, als sie tatsächlich sind. Dies ist kein erhebliches Problem, wenn der interne Standard sehr viel häufiger vorkommt als das Ziel. Wenn der interne Standard häufiger vorkommt als das Ziel, dann können direkte lineare Vergleiche zwischen den RNA-Proben angestellt werden.
  • Die obige Diskussion beschreibt theoretische Erwägungen bezüglich eines RT-PCR-Tests bei Pflanzengewebe. Die bei Pflanzengewebeproben inhärenten Probleme bestehen darin, dass sie von schwankender Quantität sind (was die Normalisierung problematisch macht) und dass sie von schwankender Qualität sind (was die Co-Amplifikation einer zuverlässigen internen Kontrolle notwendig macht, bevorzugterweise einer von größerer Größe als das Ziel). Beide dieser Probleme sind gelöst, wenn die RT-PCR als eine relative quantitative RT-PCR mit einem internen Standard ausgeführt wird, bei der der interne Standard ein amplifizierbares cDNA-Fragment ist, das größer als das Ziel-DNA-Fragment ist, und bei der die Häufigkeit der mRNA, die für den internen Standard kodiert, etwa 5-100 Mal höher ist als die der mRNA, die für das Ziel kodiert. Dieser Test misst die relative Häufigkeit, nicht die absolute Häufigkeit der jeweiligen mRNA-Spezies.
  • Andere Untersuchungen können unter Verwendung eines herkömmlicheren relativen quantitativen RT-PCR-Tests mit einem externen Standardprotokoll ausgeführt werden. Diese Tests bestimmen die PCR-Produkte in dem linearen Teil ihrer Amplifikationskurven. Die Anzahl der PCR-Zyklen, die für das Bestimmen optimal sind, muss für jedes Ziel-cDNA-Fragment empirisch bestimmt werden. Zusätzlich müssen die Produkte der reversen Transkriptase von jeder der aus den verschiedenen Gewebeproben isolierten RNA-Populationen vorsichtig auf gleiche Konzentrationen amplifizierbarer cDNAs normalisiert werden. Diese Erwägung ist sehr wichtig, weil der Test die absolute mRNA-Häufigkeit misst. Die absolute mRNA-Häufigkeit kann nur in normalisierten Proben als Maß einer differentiellen Genexpression verwendet werden. Während die empirische Bestimmung des linearen Bereiches der Amplifikationskurve und die Normalisierung von cDNA-Präparationen anstrengende und zeitaufwändige Vorgänge sind, können die sich ergebenden RT-PCR-Tests denjenigen überlegen sein, die von dem relativen quantitativen RT-PCR-Test mit einem internen Standard abgeleitet sind.
  • Ein Grund für diesen Vorteil besteht darin, dass ohne den internen Standard/Kompetitor im linearen Bereich der Amplifikationskurve alle Reagenzien zu einem einzigen PCR-Produkt umgewandelt werden können und somit die Empfindlichkeit des Tests erhöhen. Ein anderer Grund liegt darin, dass die Darstellung des Produktes auf einem Elektrophoresegel oder einem anderen Darstellungsverfahren mit nur einem PCR-Produkt weniger komplex wird, weniger Hintergrund aufweist und einfacher zu interpretieren ist.
  • (via) Chiptechnologien
  • Von den Erfindern der vorliegenden Erfindung spezifisch vorgesehen sind Chip-basierte DNA-Technologien wie diejenigen, die von Hacia et al. (1996) und Shoemaker et al. (1996) beschrieben wurden. Kurz gesagt umfassen diese Techniken quantitative Verfahren zum schnellen und genauen Analysieren großer Anzahlen von Genen. Durch das Markieren von Genen mit Oligonukleotiden oder unter Verwendung von festen Sondentests kann man eine Chiptechnologie verwenden, um Zielmoleküle in der Form von Reihen mit hoher Dichte aufzugliedern und diese Moleküle auf der Basis von Hybridisierung zu screenen. Siehe auch Pease et al. (1994); Fodor et al. (1991).
  • IX. Regenerierung von Pflanzen aus transformierten Zellen
  • Zur Verwendung in der Landwirtschaft ist die Transformation von Zellen in vitro nur ein Schritt in Richtung der kommerziellen Verwendung dieser neuen Verfahren. Die Pflanzen müssen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, und die regenerierten Pflanzen müssen sich zu vollständigen Pflanzen entwickeln, die in der Lage sind, auf offenen Feldern zu Feldfrüchten heranzuwachsen. Zu diesem Zweck werden fruchtbare Maispflanzen benötigt.
  • Während der Entwicklung der Suspensionskultur werden kleine Zellaggregate (10-100 Zellen) gebildet, augenscheinlich aus größeren Zellclustern, und geben der Kultur ein zerstreutes Erscheinungsbild. Nach dem Ausplattieren dieser Zellen auf festen Medien kann die Entwicklung somatischer Embryos induziert werden, und diese Embryos können reifen gelassen, auskeimen gelassen und zu fruchtbaren samentragenden Pflanzen herangezogen werden. Alternativ können auf festem Kulturmedium wachsende Kalluszellen induziert werden, somatische Embryos zu bilden, aus denen sich fruchtbare, samentragende Pflanzen entwickeln können. Die Charakteristika der Embryogenizität, Regenerationsfähigkeit und Pflanzenfruchtbarkeit gehen bei einer Suspensionskultur allmählich als Funktion der Zeit verloren. Die Kryokonservierung von Suspensionszellen hält die Entwicklung der Kultur an und verhindert den Verlust dieser Charakteristika während der Kryokonservierungszeitspanne.
  • X. Glyphosat-induzierte männliche Sterilität in GJ11 und GG25
  • Wie unten gezeigt, können spezifische Behandlungen mit Glyphosat verwendet werden, um in Getreidepflanzen männliche Sterilität zu induzieren, die ein oder mehr als ein bestimmtes Transformationsereignissen, wie beispielsweise die GJ11- oder GG25-Transformationsereignisse, umfassen. Eine Vielzahl verschiedener Parameter der Glyphosat-Behandlung können verwendet werden und induzieren immer noch eine männliche Sterilität in Pflanzen, die ein GG25-, GJ11- oder ein anderes ähnliches Transformationsereignis aufweisen, während sie gleichzeitig die weibliche Fruchtbarkeit beibehalten. Die Behandlung wird bevorzugterweise in der V4- oder einer späteren Entwicklungsphase stattfinden, und kann bis zu und einschließlich jeglicher Zeit stattfinden, bevor der Pollen vergossen wird (Phase VT). Spezifische Zeitpunkte während der Entwicklung, die verwendet werden können, umfassen z. B. V4, V5, V6, V7, V8, V9, V10, V11, V12, V13, V14, V15, V16, V17, V18 und jegliche spätere Phase, die vor dem Vergießen des Pollens liegt. In besonderen Ausführungsformen können die V12-V14-, V15-V17- und V18-VT-Bereiche bevorzugt sein. Es ist auch vorgesehen, dass man mehr als eine Glyphosat-Behandlung vorzunehmen wünschen kann, z. B. können Glyphosat-Behandlungen während den Phasen V12 und V15 vorgenommen werden. Die verwendeten Behandlungsmengen können schwanken. Mit der vorliegenden Erfindung wird das Äquivalent einer Behandlungsmenge von oben zwischen und einschließlich 8 Unzen pro Acre und 96 Unzen pro Acre Glyphosat (z. B. ROUNDUP ULTRATM) nützlich sein. Spezifisch vorgesehen für die Verwendung sind alle Konzentrationen zwischen ungefähr 8 Unzen und ungefähr 96 Unzen pro Acre, einschließlich etwa 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40, 44, 48, 52, 56, 60, 64, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92 und 96 Unzen pro Acre. Konzentrationen, die für besonders nützlich gehalten werden, umfassen z. B. etwa 32, 64 und 96 Unzen pro Acre. Alternativ wird vorgesehen, dass andere Glyphosat-Konzentrationen erfolgreich mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können; solche Behandlungen werden zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung jedoch weniger bevorzugt sein.
  • (i) Die Verwendung von Herbizid-induzierter männlicher Sterilität bei Züchtungsprogrammen
  • Getreide weist eine diploide Phase auf, was bedeutet, dass zwei Zustände jedes Genes (zwei Allele) jeden Lokus (Position auf einem Chromosom) besetzen. Wenn die Allele bei einem Lokus die gleichen sind, sagt man, dass Homozygotie vorliegt. Wenn sie sich unterscheiden, sagt man, dass Heterozygotie vorliegt. In einer vollständig durch Inzucht erzeugten Pflanze sind alle Loki homozygot. Weil viele Loki, wenn sie homozygot sind, schädlich für die Pflanze sind und insbesondere zu verringerter Vitalität, weniger Getreidekörnern, schwachem und/oder armseligem Wachstum führen, ist die direkte Verwendung von Inzuchten direkt durch den Bauern nicht bevorzugt. Unter manchen Umständen verhindert ein heterozygoter Vorteil bei einigen Loki die Verewigung der Homozygotie wirkungsvoll. Im Allgemeinen wird Hybridmais eine größere Vitalität zeigen als Inzuchten. Die Herstellung von Hybriden wird daher von großem Interesse für den Züchter und Anbauer sein.
  • Eine wichtige Anwendung der induzierten männlichen Sterilität der Transformationsereignisse der vorliegenden Erfindung wird bei der Herstellung von Hybridgetreidesamen liegen. Bei dieser Verwendung werden Elternpflanzen in Bestäubungsnähe zueinander in abwechselnden Reihen gepflanzt, in Blöcken oder in jeglichem anderen praktischen Pflanzmuster. Eine der Pflanzen, die weibliche Elternpflanze, wird typischerweise ein GG25- oder GJ11-Transformationsereignis oder ein ähnliches Transformationsereignis umfassen, das männliche Sterilität zeigt, während die als männlicher Elternteil verwendete Pflanze Glyphosat-resistent sein wird und bevorzugterweise ein GA21-, FI117- oder ähnliches Transformationsereignis aufweisen wird, das nach der Glyphosat-Behandlung männliche und weibliche Fruchtbarkeit auslöst. Ein bevorzugter männlicher Elternteil wird ein GA21-Transformationsereignis umfassen.
  • Für die Hybridherstellung sind die männlichen und weiblichen Eltern typischerweise unterschiedliche Elite-Inzuchten, die von verschiedenen die Hybridvigor betreffenden Hintergründen stammen, in die eine ein oder mehr als ein geeignetes Transformationsereignis rückgekreuzt worden ist. Die Pflanzen beider Elternteile werden dann kultiviert und bis zur Blütezeit herangezogen. Während dieser Zeit der Kultivierung und bevor Pollen vergossen wird, werden eine oder mehr als eine Glyphosat-Behandlung gemacht, wodurch männliche Sterilität in Pflanzen induziert wird, die die GG25-, GJ11- oder ähnliche Transformationsereignisse enthalten. Vorteilhafterweise werden die Pflanzen im Allgemeinen während dieser Wachstumsphase mit Düngemitteln und/oder anderen landwirtschaftlichen Chemikalien behandelt werden, je nachdem, was der Anbauer für angemessen hält.
  • Nach der Sterilisierung finden Hybridisierung und Befruchtung statt. Getreidepflanzen (Zea mays L.) können entweder durch natürliche oder mechanische Techniken gekreuzt werden. Die natürliche Bestäubung tritt bei Getreide auf, wenn Wind Pollen aus den Rispenköpfen auf die Seidenfäden bläst, die von den Spitzen der beginnenden Ohren hervorstehen. Ein künstlich geregeltes Bestäuben kann entweder durch das Steuern der Arten von Pollen bewirkt werden, die auf die Seidenfäden geblasen werden, oder durch das Bestäuben von Hand. Bei herkömmlichen Pflanzenzüchtungsschemata werden zur Blütezeit typischerweise die Rispenköpfe aller Elternpflanzen, die als das weibliche Elternteil verwendet werden, entfernt. Das Rispenentfernen kann manuell oder, wenn es gewünscht ist, durch eine Maschine vorgenommen werden. Diese Technik ist zwar wirkungsvoll, aber extrem arbeitsintensiv und erhöht die Gesamtkosten der Hybridsamenherstellung erheblich. Alternativ können herkömmliche nukleäre oder zytoplasmatische oder männliche Sterilitäts-Systeme verwendet werden, aber solche Systeme werden die Bemühungen, spezifische durch Inzucht erzeugte Linien zu verewigen, verkomplizieren.
  • Bei der vorliegenden Erfindung werden die weiblichen Elternpflanzen ein GG25- oder GJ11-Transformationsereignis oder anderes Ereignis mit ähnlichen Eigenschaften umfassen und werden in der V5-Phase oder einer späteren Phase mit Glyphosat behandelt, was eine männliche Sterilität bei den Pflanzen verursacht und dadurch die Notwendigkeit der Rispenentfernung vermeidet. Diese Behandlung kann an einzelnen Pflanzen ausgeführt werden, wird aber bevorzugtererweise eine Behandlung des gesamten Feldes von männlichen und weiblichen Elternpflanzen von oben sein. In diesem Fall wird es sowohl für die männlichen als auch für die weiblichen Elternpflanzen notwendig sein, unter den Bedingungen der Glyphosat-Behandlung, die verwendet wird, um die männliche Sterilität zu bewirken, Glyphosat-resistent und männlich bzw. weiblich fruchtbar zu sein. Ein geeignetes männliches Elternteil wird daher unter den Glyphosat-Behandlungsbedingungen, die verwendet werden, um eine männliche Sterilität bei dem weiblichen Elternteil zu induzieren, voll fruchtbar sein. Alternativ kann das männliche Elternteil von der Glyphosat-Behandlung ausgeschlossen werden, und daher kann potentiell jede Maispflanze als das männliche Elternteil verwendet werden. Beispielhafte männliche Elternteile, die mit Glyphosat behandelt werden können, sind Maispflanzen, die ein GA21- oder FI117-Transformationsereignis aufweisen, wobei GA21 am bevorzugtesten ist.
  • Den Pflanzen wird erlaubt, weiter zu wachsen, und eine natürliche Kreuzbestäubung findet als Ergebnis der Wirkung von Wind statt, was bei der Bestäubung von Gräsern, einschließlich Getreide, normal ist. Als Ergebnis der induzierten männlichen Sterilität der weiblichen Elternpflanze ist der gesamte Pollen aus der männlichen Elternpflanze für die Bestäubung verfügbar, weil Rispen, und daher Pollen-tragende Blütenteile zuvor unter allen als weiblicher Teil in der Hybridisierung verwendeten Pflanzen sterilisiert worden sind. Natürlich werden während dieser Hybridisierungsprozedur die Elternsorten derart herangezogen, dass sie von anderen Getreidefeldern isoliert sind, um jegliche zufällige Kontamination mit Pollen aus fremden Quellen in nicht mit Glyphosat behandelten Feldern zu minimieren oder zu verhindern. Diese Isolierungstechniken liegen durchaus im Bereich der Fähigkeit von Fachleuten auf dem Gebiet.
  • Beiden durch Inzucht erzeugten Elternpflanzen des Getreides kann erlaubt werden, bis zur Reife, oder die männlichen Reihen können zerstört werden, nachdem das Blühen abgeschlossen ist. Nur die Ohren der weiblichen durch Inzucht erzeugten Elternpflanzen werden geerntet, um die Samen einer neuen F1 oder anderen Art von Hybrid zu erhalten. Der neue hergestellte Hybridsamen kann dann in einer nachfolgenden Anbauzeit mit den gewünschten Charakteristika dahingehend, dass die Hybridgetreidepflanzen erhöhte Kornerträge bereitstellen und die anderen erwünschten hierin offenbarten Charakteristika erreicht werden, ausgepflanzt werden. Der gesammelte Samen stellt daher ein wertvolles kommerzielles Produkt dar, dass an Bauern verkauft werden kann, für weitere Züchtungsprogramme verwendet werden kann, durch den Züchter direkt auf dem Feld ausgepflanzt werden kann oder verarbeitet werden kann.
  • In einer Ausführungsform ist der durch ein derartiges Verfahren hergestellte Getreidesamen ein Samen der ersten Generation, der in der Lage ist, zu einer F1-Hybridgetreidepflanze auszuwachsen, die durch ein Verfahren hergestellt wird, wobei sowohl die erste als auch die zweite Elterngetreidepflanze durch Inzucht erzeugte Getreidepflanzen sind, in die die geeigneten Transformationsereignisse der vorliegenden Erfindung rückgekreuzt worden sind. In einer weiteren Ausführungsform kann eine oder können beide der ersten und zweiten Elterngetreidepflanzen Hybride sein, die die geeigneten Transformationsereignisse aufweisen.
  • Wenn eine durch Inzucht erzeugte Getreidepflanze, die GG25, GJ11 oder ein anderes Transformationsereignis mit einem ähnlichen Phänotyp umfasst, mit einer anderen, verschiedenen Getreideinzucht gekreuzt wird, wird Samen hergestellt, der in der Lage ist, zu einer F1-Getreidehybridpflanze der ersten Generation auszuwachsen. Dieser F1-Samen, die F1-Hybridgetreidepflanzen, die daraus herangezogen werden, und der Samen dieser F1-Hybrid-Getreidepflanze werden als Aspekte der vorliegenden Offenbarung betrachtet. Das Ziel eines Verfahrens zum Herstellen eines F1-Hybrides besteht darin, das genetische Komplement von Getreide zu manipulieren, um neue Kombinationen von Genen zu erzeugen, die Wechselwirken, um neue oder verbesserte Eigenschaften (phänotypische Charakteristika) zu erzeugen. Ein Verfahren zum Herstellen eines F1-Hybrides beginnt typischerweise mit der Herstellung von einer oder mehr als einer durch Inzucht erzeugten Pflanze. Diese Pflanzen werden durch das wiederholte Kreuzen von ahnenverwandten Getreidepflanzen hergestellt, um zu versuchen, bestimmte Gene innerhalb der durch Inzucht erzeugten Pflanzen zu konzentrieren. Daher ist jegliche Inzucht, die ein Transformationsereignis der vorliegenden Offenbarung umfasst, auch ein Teil der Offenbarung.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Kreuzen die folgenden Schritte:
    • (a) Auspflanzen von Samen in Bestäubungsnähe einer ersten und zweiten Elterngetreidepflanze, wobei die erste Elterngetreidepflanze bevorzugterweise eine Inzucht ist, die ein GG25-, GJ11- oder ein anderes Transformationsereignis umfasst, das einen ähnlichen Phänotyp verleiht, und wobei die zweite Elternpflanze bevorzugterweise FI117-, GA21- oder ein anderes Transformationsereignis aufweist, das einen ähnlichen Phänotyp verleiht;
    • (b) Kultivieren oder Heranziehen von Samen der ersten und zweiten Elterngetreidepflanzen;
    • (c) Behandeln der Elterngetreidepflanzen zwischen den Phasen V8 und VT der Entwicklung mit 8 bis 96 Unzen Glyphosat (ROUNDUP ULTRATM) pro Acre;
    • (d) Erlauben, dass eine Kreuzbestäubung zwischen der ersten und zweiten Elterngetreidepflanze stattfindet;
    • (e) Ernten von auf der ersten Pflanze hergestellten Samen; und, wo erwünscht,
    • (f) Heranziehen des geernteten Samens zu einer Getreidepflanze.
  • Die Nützlichkeit der Verfahren der vorliegenden Erfindung erstreckt sich auch auf Kreuzungen mit anderen Arten. Üblicherweise werden geeignete Arten Mitglieder der Familie Graminaceae und besonders der Gattungen Zea, Tripsacum, Coix, Schlerachne, Polytoca, Chionachne und Trilobachne, vom Stamm Maydeae sein. Von diesen sind Zea und Tripsacum am meisten bevorzugt. Die verschiedenen Sorten von Korn-Sorghum, Sorghum bicolor (L.) Moench sind für Kreuzungen mit Getreidepflanzen, die Transformationsereignisse der vorliegenden Offenbarung umfassen, potentiell geeignet.
  • (ii) Verwendung von Herbizidbehandlungen für die Samenreinheit
  • Die vorliegende Erfindung kann auch verwendet werden, um eine genetische Reinheit bei Züchtungsprotokollen zu bewirken oder sie zu gewährleisten. Es ist spezifisch vorgesehen, dass Pollenkörner, die nicht ein Allel aufweisen, das GA21, FI117 oder ein ähnliches Transformationsereignis umfasst, durch das Behandeln eines Feldes mit Glyphosat sterilisiert werden. Somit könnte man die erhaltene Samenreinheit hinsichtlich des Resistenzallels durch die geeignete Verwendung von Glyphosatbehandlungen bei spezifischen transgenen Pflanzen stark erhöhen. Dies könnte verwendet werden, um die Introgression von einem GA21-, FI117- oder einem anderen Transformationsereignis, das Pollen mit einer Resistenz gegen ein bestimmtes Herbizid bereitstellt, in einen bestimmten genetischen Hintergrund zu beschleunigen. Durch die wirkungsvolle Beseitigung von Pollenkörnern, denen die Eigenschaft der Herbizidresistenz fehlt, werden andere als Resistenz-Allele aus der Kreuzung entfernt werden. Das Nettoergebnis besteht darin, dass eine Pflanze, die bezüglich eines bestimmten Allels hemizygot ist, bei einer Kreuzung dazu gezwungen werden kann, sich so zu verhalten, als ob sie mit Hinblick auf die Resistenzeigenschaft homozygot wäre. Dies kann bei der Introgression der Eigenschaft in eine bestimmte genetische Linie beschleunigen und auch die bei der Pflanzenzüchtung benötigte Zeit durch das Beseitigen der Notwendigkeit der Herstellung von Herbizidresistenz-Allel-Homozygoten zum Verwenden bei der Hybridherstellung verringern. Weiterhin kann man durch die Behandlung der aus den hergestellten Samen herangezogenen Pflanzen mit Glyphosat das relative Verhältnis und daher die genetische Reinheit von Samen bestimmen, die wenigstens ein erstes Herbizidresistenz-Transformationsereignis geerbt haben.
  • Damit man Glyphosat verwenden kann, um Pollen, der nicht das erwünschte Herbizid-Resistenz-Transformationsereignis aufweist, selektiv unfähig zu machen, weibliche Reproduktionsstrukturen zu befruchten, würde man ein Protokoll verwenden, das demjenigen ähnlich ist, das für die durch induzierbare männliche Sterilität gestützte Hybridherstellung verwendet wird. Spezifischer kann man 8 bis 96 Unzen Glyphosat von oben auf Pflanzen anwenden, die wenigstens eine Kopie des Resistenzallels aufweisen. Die Zeitpunkte der Behandlungen würden vor dem Pollenvergießen, den V5- und VT-Entwicklungsphasen liegen.
  • Sobald Samen hergestellt ist, der ein Herbizidresistenz-Allel aufweist, kann die Samenreinheit durch das Behandeln einer ausgewählten Anzahl von Pflanzen, die aus dem Samen mit Herbizid herangezogen wurden, gemessen werden. Durch Bestimmungen der Anzahl der Pflanzen, die empfindlich für oder resistent auf das Herbizid reagieren, kann man die relative Reinheit der Samen bestimmen. Potentiell können jegliches Herbizid und das entsprechende Herbizidresistenz-Allel zu diesem Zweck verwendet werden. Spezifische Beispiele umfassen ein mutiertes EPSPS-Gen, ein Phosphinotricin-Acetyltransferasegen, das Glufosinat-Resistenz verleiht, ein mutiertes Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen, das eine Resistenz gegen Imidazolinon- oder Sulphonylharnstoff-Herbizide verleiht, ein neo-Gen, das für Kanamycin und eine G418-Resistenz kodiert, ein Nitrilasegen, das eine Resistenz gegen Bromoxynil verleiht, und ein DHFR-Gen, das eine Resistenz gegen Methotrexat verleiht.
  • (iii) Anwendbarkeit von Herbizid-induzierter männlicher Sterilität
  • Es ist von den Erfindern spezifisch vorgesehen, dass die induzierbare männliche Sterilität der vorliegenden Erfindung Anwendbarkeit auf andere Arten als Mais und auf andere Herbizid-Resistenz-Allele als EPSPS finden wird. Insbesondere glaubt man, dass die Glyphosat-induzierbare Natur der männlichen Sterilität bei Pflanzen, die die GG25- und GJ11-Transformationsereignisse aufweisen, relativ zum Mangel an männlicher Sterilität bei GA21- und FI117-Pflanzen, das Ergebnis einer Promotorfunktion bei der Expression des Resistenzproteins, in diesem Fall einem mutierten EPSPS, ist. Man glaubt, dass der Reis-Aktin-Promotor bei FI117 und GA21 die Expression des mutierten EPSPS-Gens in Pollen effizienter antreibt als der Mais-Histon-Promotor und der CaMV35S-Arabidopsis-Histon-Promotor von GG25 bzw. GJ11 es tun. Das Ergebnis ist, dass Pollen aus FI117 und GA21 eine Toleranz gegen Glyphosat aufweist, die relativ zum Pollen der GG25- und GJ11-Pflanzen oder relativ zu Pflanzen, denen das mutierte EPSPS-Allel fehlt, erheblich erhöht ist.
  • Daher kann man durch die Selektion eines Promotors, der in Pollen schwach exprimiert wird, mit Absicht Herbizid-resistente Pflanzen konstruieren, bei denen männliche Sterilität durch Behandlungen mit Herbiziden induziert werden kann. Man kann zusätzlich durch die Verwendung des gleichen Resistenzgens, das jedoch funktionsfähig mit einem konstitutiven Promotor verbunden ist, der in Pollen wirksamer exprimiert wird, auch Pflanzen der gleichen Art erhalten, die eine Resistenz gegen das gleiche Herbizid aufweisen, aber nicht induzierbar männlich steril sind. Andere Arten als Mais, bei denen diese Technik für besonders geeignet gehalten wird, umfassen Sorghum, Gerste, Hafer, Weizen, Reis und die Sojabohne. Andere Herbizidresistenz-Allele als das EPSPS-Gen, die zu diesen Zweck für besonders geeignet gehalten werden, umfassen ein Phosphinothricin-Acetyltransferasegen, das eine Glufosinatresistenz verleiht, ein mutiertes Acetolactat-Synthase (ALS)-Gen, das eine Resistenz gegen Imidazolinon- oder Sulphonylharnstoff-Herbizide verleiht, ein neo-Gen, das für Kanamycin kodiert, und die G418-Resistenz, ein Nitrilasegen, das eine Resistenz gegen Bromoxynil verleiht, und ein DHFR-Gen, das eine Methotrexat-Resistenz verleiht.
  • XI. Definitionen
  • Weibliche reproduktive Herbizidtoleranz: eine Pflanze, die diese Eigenschaft zeigt, wird nach einer Behandlung der Pflanze mit einer Herbizidbehandlung, die in der Lage ist, weibliche Sterilität bei Pflanzen zu bewirken, die diese Eigenschaft nicht zeigen, weiblich fruchtbar bleiben.
  • Lebensunfähiger Pollen: Pollen, der nicht in der Lage ist, eine Pflanze zu befruchten, um Samen herzustellen.
  • Männliche reproduktive Herbizidtoleranz: ein Merkmal, bei dem eine Pflanze mit einer Herbizid-Behandlung behandelt werden kann und männlich fruchtbar bleibt, wobei die Herbizidbehandlung in der Lage ist, männliche Sterilität bei anderen als männlichen reproduktiv toleranten Pflanzen zu bewirken.
  • Männlich steril: eine männlich sterile Pflanze ist eine Pflanze, die nicht in der Lage ist, sich selbst zu befruchten oder andere Pflanzen zu befruchten, um Samen herzustellen.
  • Vegetative Herbizidtoleranz: eine Pflanze, die diese Eigenschaft zeigt, ist in der Lage, mit einer Behandlungsmenge eines Herbizids behandelt und nicht getötet zu werden, die sonst in der Lage ist, die entsprechende nicht vegetativ herbizidtolerante Pflanzen zu töten.
  • XII. Hinterlegungsinformationen
  • Eine Hinterlegung von Samen, die die GJ11-, FI117-, GG25- und GA21-Transformationsereignisse umfassen, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md, 20852, vorgenommen. Das Datum der Hinterlegung war der 14. Mai 1997. Die ATCC-Zugangsnummern der Samen von Maispflanzen, die die GJ11-, FI117-, GG25- und GA21-Transformationsereignisse umfassen, sind: ATCC 209030, ATCC 209031, ATCC 209032 bzw. ATCC 209033. Alle Beschränkungen nach der Hinterlegung wurden entfernt, und es ist beabsichtigt, dass die Hinterlegung alle Bedingungen des 37 C.F.R. § 1.801-1.809 erfüllt. Die Hinterlegung wird bei der Hinterlegungsstelle für eine Zeitspanne von 30 Jahren oder 5 Jahre nach der letzten Anfrage oder für die wirksame Lebensdauer des Patienten, was immer länger ist, aufrechterhalten werden, und wird während dieser Zeit wie notwendig ersetzt werden.
  • XIII. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele 12, 13, 17 sind umfasst, um bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung zu zeigen. Die anderen Beispiele dienen nur vergleichenden Zwecken. Es sollte durch die Fachleute auf dem Gebiet anerkannt werden, dass die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, von denen die Erfinder entdeckt haben, dass sie bei der Praktizierung der Erfindung gut funktionieren, und somit können sie als bevorzugte Modi für ihre Praktizierung darstellend betrachtet werden. Jedoch sollten die Fachleute auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung anerkennen, dass bei den spezifischen Ausführungsformen, die offenbart sind, viele Änderungen vorgenommen werden können und immer noch ein gleichartiges oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne dass von der Erfindung abgewichen wird. Spezifischer wird es augenscheinlich sein, dass bestimmte Agenzien, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, die hierin beschriebenen Agenzien ersetzen können, während das gleiche Ergebnis oder ähnliche Ergebnisse erzielt werden würden. All diese ähnlichen Ersatzformen und Modifikationen, die für den Fachmann auf dem Gebiet augenscheinlich sind, werden als von dem Umfang der Erfindung, wie sie durch die beigefügten Ansprüche definiert ist, umfasst betrachtet.
  • BEISPIEL 1
  • Initiierung und Aufrechterhaltung der Zelllinie AT824
  • Dieses Beispiel beschreibt die Initiierung und Aufrechterhaltung der Zelllinie AT824, die für Transformationsexperimente routinemäßig verwendet worden ist. Unreife Embryos (0,5-1,0 mm) wurden aus der aus B73 stammenden durch Inzucht erzeugten Linie AT ausgeschnitten und auf N6-Medium mit 100 μM Silbernitrat, 3,3 mg/L Dicamba, 3 % Saccharose und 12 mM Prolin kultiviert (2004). Sechs Monate nach der Initiierung wurde Typ I-Kallus auf Medium 2008 übertragen. Zwei Monate später wurde Typ I-Kallus auf ein Medium mit einer geringeren Saccharosekonzentration (279) übertragen. Ein Sektor aus Typ II-Kallus wurde 17 Monate später identifiziert und auf 279-Medium übertragen. Diese Zelllinie ist in ihrer Natur einheitlich, unorganisiert, schnell wachsend und embryogen. Diese Kultur war im Zusammenhang mit der Erfindung wünschenswert, weil sie hinsichtlich einer Kultur in flüssigem oder auf festem Medium leicht adaptierbar ist.
  • Die ersten Suspensionskulturen von AT824 wurden 31 Monate nach der Kulturinitiierung initiiert. Suspensionskulturen können in einer Vielzahl von Kulturmedien initiiert werden, die Medien umfassen, die 2,4-D genauso wie Dicamba als Auxinquelle enthalten, d. h. die als 210, 401, 409, 279 bezeichneten Medien. Die Kulturen werden durch das Übertragen von ungefähr 2 ml komprimiertem Zellvolumen auf 20 ml frisches Kulturmedium bei Intervallen von 3 2 Tag aufrechterhalten. AT824 kann routinemäßig zwischen flüssigen und festen Kulturmedien ohne Wirkung auf das Wachstum oder auf die Morphologie übertragen werden.
  • Suspensionskulturen von AT824 wurden anfänglich 33-37 Monate nach der Kulturinitiierung kryokonserviert. Die Überlebensrate dieser Kultur wurde verbessert, wenn sie nach drei Monten in Suspensionskultur kryokonserviert wurde. AT824-Suspensionkulturen wurden seit dem anfänglichen Datum des Einfrierens kryokonserviert und aus Kryokonservierungen bei regelmäßigen Intervallen wieder initiiert. Wiederholte Einfrierzyklen haben das Wachstum oder die Transformationsfähigkeit der Kultur nicht beeinflusst.
  • BEISPIEL 2
  • Erzeugung der Glyphosat-resistenten Linie GA21 durch Mikroprojektilbombardierung von AT824-Zellen
  • Das mutierte Mais-EPSPS-Gen wurde durch Mikroprojektilbombardierung in AT824-Suspensionskulturzellen eingeführt, im Wesentlichen wie im US-Patent mit der Nummer 5,554,798 und in der US-Patentanmeldung mit der Nummer 08/113,561 , eingereicht am 25. August 1993, beschrieben ist. In diesem Beispiel stammte das mutierte Mais-EPSPS-Gen aus dem Plasmid pDPG434 (3). Das Plasmid pDPG434 enthält ein Mais-EPSPS-Gen mit zwei Aminosäureänderungen, Thr zu Ile an der Position 102 und Pro to Ser an der Position 106. Ein ungefähr 3,4 kb großes NotI-Restriktionsfragment, das die Expressionskassette mit dem mutierten Mais-EPSPS von pPDG434 enthält, wurde für die Transformation verwendet.
  • Die Expressionskassette mit dem mutierten Mais-EPSPS enthält einen Reis-Aktin-Promotor und das nos 3'-Ende.
  • Die Suspensionskultur AT824 (beschrieben in Beispiel 1) wurde auf frischem Medium 409 3 Tage vor der Partikelbombardierung subkultiviert. Die Zellen wurden auf festem 279-Medium 0-8 Stunden vor der Bombardierung ausplattiert (etwa 0,5 ml komprimiertes Zellvolumen pro Filter).
  • Die DNA wurde wie folgt auf Goldpartikel präzipitiert. Eine Vorratslösung von Goldpartikeln wurde durch das Hinzugeben von 60 mg 0,7 μm- oder 1 μm-Goldpartikeln zu 1000 μl absolutem Ethanol und das wenigstens drei Stunden lange Inkubieren bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Lagerung bei –20 °C, hergestellt. Zwanzig bis fünfunddreißig μl sterile Goldpartikel wurden in einer Mikrozentrifuge 1 Min. lang abzentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt, und ein ml steriles Wasser wurde zu dem Röhrchen hinzugegeben, gefolgt von einer 5 Minuten langen Zentrifugation bei 2000 Upm. Die Mikroprojektilpartikel wurden in 30 μl DNA-Lösung resuspendiert, die etwa 10-20 μg der NotI-verdauten pDPG434-Expressionskassette mit dem mutierten EPSPS enthielt. Zweihundertzwanzig Mikroliter steriles Wasser, 250 μl 2,5 M CaCl2 und 50 μl Spermidin wurden hinzugegeben. Die Mischung wurde gründlich durchmischt und auf Eis gestellt, gefolgt von 10 Minuten langem Vortexen bei 4 °C und einer 5-minütigen Zentrifugation bei 500 Upm. Der Überstand wurde entfernt, und das Pellet wurde in 600 μl absolutem Ethanol resuspendiert. Nach einer 5-minütigen Zentrifugation bei 500 Upm wurde das Pellet in 36 μl absolutem Alkohol resuspendiert und es wurde ihm erlaubt, sich 4 Minuten lang abzusetzen. Zehn μl der Partikelpräparation wurden auf der Oberfläche der Flyerscheibe ausgeteilt und dem Ethanol wurde gestattet, vollständig zu trocknen. Die Partikel wurden dann mit einem Heliumschuss von ungefähr 1100 psi unter Verwendung der DuPont Biolistics PDS1000He-Partikelbombardierungsvorrichtung beschleunigt.
  • Nach der Bombardierung mit mit der pDPG434-Expressionskassette beschichteten Goldpartikeln wurden AT824-Zellen 4 Tage lang auf 279-Medium (Tabelle 2) kultiviert. Nachfolgend wurden die Zellen zurück in flüssiges 401-Medium (Tabelle 2) bei einer Dichte von etwa 2 ml komprimiertem Zellvolumen (PCV) pro 20 ml gegeben und 4 Tage lang kultiviert. Die Zellen wurden anschließend bei einer Dichte von 2 ml PCV/20 ml auf frisches 401-Medium übertragen, das 1 mg/L Bialaphos (Bialaphos wurde während dieser Phase zufällig statt des Glyphosates verwendet) enthielt, und vier Tage lang kultiviert. Die Subkultur wurde wiederholt, dieses Mal in 401 plus 1 mM Glyphosat, und nach vier Tagen wurden die Zellen bei einer Dichte von etwa 0,1 ml PCV pro 100 X 20 mm Petrischale, die 279 plus 1 mM Glyphosat enthielt, ausplattiert. Sechs bis acht Wochen nach der Bombardierung wurden Glyphosat-resistente Kolonien von den Selektionsplatten entfernt und auf frischem 279 plus 1 mM Glyphosat subkultiviert. 35 Glyphosat-resistente Kalluslinien wurden in diesem Beispiel gewonnen. Ungefähr 96 Pflanzen wurden aus 18 der transgenen Kalluslinien regeneriert.
  • BEISPIEL 3
  • Stabile Transformation von AT824-Zellen durch Elektroporation
  • Mais-Suspensionskulturzellen wurden unter Verwendung von den in Kryzek et al. ( US Patent Nr. 5,384,956 ) beschriebenen Bedingungen mit Enzym behandelt und elektroporiert. AT824-Suspensionskulturzellen wurden drei Tage nach der Subkultur durch rostfreies 1000 μm-Stahlgitter gesiebt und bei 1,5 ml komprimierten Zellen pro 10 ml in Inkubationspuffer (0,2 M Mannitol, 0,1 % Rinderserumalbumin, 80 mM Kalziumchlorid und 20 mM 2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure, pH 5,6) gewaschen. Die Zellen wurden anschließend 90 Minuten lang in Inkubationspuffer behandelt, der 0,5 % Pektolyase Y-23 (Seishin Pharmaceutical, Tokyo, Japan) enthielt, bei einer Dichte von 1,5 ml komprimierten Zellen pro 5 ml Enzymlösung behandelt. Während der Enzymbehandlung wurden die Zellen im Dunkeln bei ungefähr 25 °C und 60 Upm auf einem rotierenden Schüttler inkubiert. Nach der Pektolyasebehandlung wurden die Zellen einmal mit 10 ml Inkubationspuffer gewaschen, gefolgt von drei Waschschritten mit Elektroporationspuffer (10 mM HEPES, 0,4 mM Mannitol). Die Zellen wurden bei einer Dichte von 1,5 ml komprimierten Zellen in einem Gesamtvolumen von 3 ml in Elektroporationspuffer resuspendiert.
  • Linearisierte Plasmid-DNA, ungefähr 60 μg mit NotI ausgeschnittene EPSPS-Expressionskassette aus pDPG427 (GG25) oder pDPG443 (GJ11), oder 100 μg Ganz-pDPG165 und -pDPG434 (FI117)-Plasmid-DNA (50 μg von jedem Plasmid) wurden zu 0,5 ml Aliquots vom Elektroporationspuffer gegeben. Die DNA/der Elektroporationspuffer wurde dann bei Raumtemperatur ungefähr 10 Minuten lang inkubiert. Zu diesen Aliquots wurden 0,5 ml der Suspensionskulturzellen/Elektroporationspuffer (der ungefähr 0,25 ml komprimierte Zellen enthielt) hinzugegeben. Die Zellen und die DNA im Elektroporationspuffer wurden ungefähr 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Aliquots von einem halben ml dieser Mischung wurden auf die Elektroporationskammer (Puite, 1985) übertragen, die in eine sterile 60 X 15 mm Petrischale gestellt wurde. Die Zellen wurden mit einem 70, 100 oder 140 Volt (V)-Puls elektroporiert, der aus einem 140 Mikrofarad (μf)-Kondensator entladen wurde.
  • Ungefähr 10 Minuten nach der Elektroporation wurden die Zellen mit 2,5 ml 409-Medium, einschließlich 0,3 M Mannitol, verdünnt. Die Zellen wurden dann von dem meisten des flüssigen Mediums durch das Aufziehen der Suspension in eine Pipette und das Herausdrücken des Mediums mit der Spitze der Pipette an die Petrischale gehalten, um die Zellen zu behalten, aufgetrennt. Die Zellen und eine kleine Menge Medium (ungefähr 0,2 ml) wurden auf einen Filter gegeben (Whatman #1, 4,25 cm) und überschichteten festes 279-Medium (Tabelle 2) einschließlich 0,3 M Mannitol. Nach ungefähr fünf Tagen wurden das Gewebe und die stützenden Filter auf 279-Medium übertragen, das 0,2 M Mannitol enthielt. Nach ungefähr sechs Tagen wurden das Gewebe und die stützenden Filter auf 279-Medium ohne Mannitol übertragen.
  • BEISPIEL 4
  • Regeneration von AT824-Transformanten
  • Transformanten wurden wie in Beispiel 2 und Beispiel 3 beschrieben hergestellt. Zur Regeneration wurde das Gewebe auf Haltungsmedium (279) gehalten, das 1 mM Glyphosat oder 1 mg/L Bialaphos enthielt. Nachfolgend wurden die Transformanten ein- bis dreimal, aber üblicherweise zweimal auf 189-Medium subkultiviert (erster Durchlauf im Dunkeln und zweiter Durchlauf bei wenig Licht) und einmal oder zweimal auf 101-Medium in Petrischalen, bevor sie auf 501- oder 607-Medium in Pflanzen-Cons übertragen wurden. Veränderungen des Regenerationsprotokolls sind auf der Grundlage des Fortschrittes der Pflanzenregeneration normal. Daher wurden einige der Transformanten zunächst routinemäßig auf Haltungsmedium subkultiviert, gefolgt von zweimal auf 189-Medium, einmal oder zweimal auf 101-Medium, gefolgt von einer Übertragung auf 501- oder 607-Medium in Pflanzen-Cons. Da sich die Triebe auf 101-Medium entwickelten, wurde die Lichtintensität durch das langsame Anpassen der Entfernung der Platten von der über ihnen angebrachten Lichtquelle angepasst. Alle Subkulturintervalle betrugen bei ungefähr 24 °C ungefähr 2 Wochen. Transformierte Pflanzen, die Triebwurzeln entwickelten, wurden auf Erde übertragen.
  • Pflänzchen in Erde wurden in einer erleuchteten Wachstumskammer inkubiert, und die Bedingungen wurden langsam angepasst, um die Pflanzen an die trockeneren und stärker erleuchteten Bedingungen des Treibhauses zu adaptieren oder zu konditionieren. Nach dem Adaptieren/Konditionieren in der Wachstumskammer wurden die Pflanzen einzeln auf 5 Gallonen-Töpfe mit Erde im Treibhaus umgetopft.
  • BEISPIEL 5
  • Regeneration der Glyphosat-resistenten Linie FI117 unter Verwendung von Bialaphos-Selektion
  • Die Zellen von AT824 wurden mit den Plasmiden pDPGl65 und pDPG434 wie in Beispiel 3 beschrieben elektroporiert. In diesem Fall erlaubte die Co-Transformation mit dem das bar-Gen-enthaltenden Plasmid pDPG165 die Selektion auf Bialaphos. Nach der Erholung und nachdem das Gewebe etwa 4 Tage lang auf 279-Medium gewachsen war, wurde das Gewebe auf jedem Filter auf eine Flasche übertragen, die etwa 20 ml flüssiges 401-Medium einschließlich 1 mg/L Bialaphos enthielt. Vier Tage später wurde das Gewebe in jeder Flasche auf eine neue Flasche übertragen, die etwa 20 ml frisches 401-Medium enthielt, das 1 mg/L Bialaphos enthielt. Drei Tage später wurden die Zellen bei einer Dichte von etwa 0,1 ml PCV pro 100 × 20 mm Petrischale ausplattiert, die 279-Medium plus 1 mg/L Bialaphos enthielt. Ungefähr 34 Bialaphos-resistente Kalluslinien wurden bei diesem Beispiel mit einer Häufigkeit von 17 Kalluslinien pro Elektroporation selektiert. Ungefähr 48 Pflanzen wurden aus 18 Kalluslinien regeneriert. Das Screening von Pflanzen auf Glyphosat-Resistenz wurde nachfolgend wie in Beispiel 5 beschrieben ausgeführt.
  • BEISPIEL 6
  • Screenen transgener Pflanzen auf Glyphosat-Resistenz
  • Aus den Kalluslinien GA21, GG25, GJ11 und FI117 (R0-Generation) regenerierte Pflanzen, von denen jede das mutierte EPSPS-Gen enthielt, wurden mit nicht transgenen, durch Inzucht erzeugten Pflanzen im Treibhaus gekreuzt. Von der Nachkommenschaft dieser Kreuzungen wurde erwartet, dass sie sich mit Hinblick auf die Eigenschaft der Herbizidresistenz 1:1 aufspaltet. Die Glyphosatresistenz wurde in der Nachkommenschaft der R0-Kreuzungen (R1-Generation) in einem Treibhaus durch die Behandlung mit RoundupTM-Marke (Monsanto) Glyphosat bei einer Menge von 16 oz./Acre überprüft. Transgene Linien, die eine Resistenz gegen Glyphosat zeigten, wurden selektiert und wiederum mit einer nicht transgenen Inzucht rückgekreuzt. Die sich dabei ergebende Nachkommenschaft wurde dann auf Testfeldern auf Glyphosat-Resistenz gescreent. Aus diesen Tests wurden die GA21-, FI117-, GG25- und GJ11-Transformationsereignisse für weitere Untersuchungen auf der Grundlage ihres Glyphosat-resistenten Phänotyps selektiert.
  • BEISPIEL 7
  • Isolierung von genomischer Getreide-DNA
  • Die Glyphosat-resistenten Getreidelinien GA21, FI117, GG25 und GJ11 wurden mit verschiedenen durch Inzucht erzeugte Linien gekreuzt, um die Hybridentwicklung wie in Beispiel 14 beschrieben zu erleichtern. Die für Southern Blot-Analysen verwendete genomische DNA wurde aus den sich ergebenden rückgekreuzten Pflanzen isoliert. Die Rückkreuzungspopulationen bestanden aus Pflanzen, die sich hinsichtlich der GA21-, FI117-, GG25- oder GJ11-Insertion 1:1 aufspalteten. Positive und negative GA21-, aus der Aufspaltung hervorgegangene Pflanzen wurden durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der bei der Transformation verwendeten, mit Bezug auf das pDPG434-Fragment spezifischen Oligonukleotidprimer identifiziert. Negative aus der Aufspaltung hervorgegangene Pflanzen dienten als nicht transgene Kontrollpflanzen. Die für diese Analyse verwendeten PCR-Primer umspannten die mutiertes EPSPS-nos-Nahtstelle und erzeugten ein 192 bp-Fragment. Die Sequenz des oberen auf dem mutierten EPSPS-Gen liegenden Primer ist 5'-ACGTACGACGACCACAGGATG-3'. Die Sequenz des unteren auf nos liegenden Primers ist 5'-GCAAGACCGGCAACAGGATTC-3'. Die genomische DNA wurde wie beschrieben in Dellaporta et al. (1983) aus positiven und negativen Pflanzen isoliert. Die DNA wurde aus auf Feldern und im Treibhaus herangezogenen Pflanzen isoliert.
  • BEISPIEL 8
  • DNA-Sonden-Herstellung und -Hybridisierung
  • Für die Sondenherstellung verwendete DNA-Fragmente wurden durch Gelaufreinigung von Restriktionsverdauen und von Plasmid-DNA isoliert oder durch PCR erzeugt. Das mutierte EPSPS-PCR-Fragment, das als Sonde verwendet wurde, wurde unter Verwendung von Primern erzeugt, die ein innerhalb des EPSPS-Gen liegendes 324 bp-Fragment erzeugen. Dieses Fragment beginnt ungefähr 400 bp stromabwärts vom Startcodon. Die Primersequenzen, die verwendet wurden, um dieses Fragment zu erzeugen, sind: 5'-TTTGGCTCTTGGGGATGTG-3' (oberer) und 5'-TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3' (unterer). Die Sonden wurden unter Verwendung des zufälligen Priming-Verfahrens (Boehringer Mannheim) mit 32P markiert und unter Verwendung von Quik-Sep®-Spin-Säulen (Isolab Inc., Akron, OH) aufgereinigt. Die Blots wurden 1-2 Stunden lang bei 65 °C vorhybridisiert und ungefähr 18 Stunden lang mit denaturierter Sonde bei 65 °C hybridisiert. Die Vorhybridisierungs- und Hybridisierungslösung bestand aus 5X SCP, 2X Denhardt'scher Lösung, 0,05 M Tris, pH 8,0, 0,2 % SDS, 10 mM EDTA, 100 mg/l Dextransulfat und 125 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA. Nach der Hybridisierung wurden die Blots 4 Mal 10 Minuten lang in 0,25 X SCP/0,2 % SDS gewaschen. Die Membranen wurden trockengeblottet und durch Autoradiographie visualisiert. Um Blots erneut zu sondieren, wurden die Sonden durch das 10 Min. lange Behandeln von Blots in 0,05 M NaOH/0,2 % SDS, gefolgt von einer 20 Min. langen Neutralisierung in 0,2 M Tris, pH 7,5/0,2 % SDS/0,1 X SCP bei ungefähr 25 °C behandelt.
  • Ungefähr 10 μg genomische DNA wurden für jeden Restriktionsverdau verwendet. Die DNA wurde gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) mit Restriktionsenzymen verdaut. Die DNA wurde auf TAE-Gelen (0,04 M Tris-Acetat, 0,001 M EDTA), einschließlich 0,8 % Agarose, aufgetrennt. Das Southern-Blotten (Southern, 1975) wurde unter Verwendung von MagnachargeTM-Membran (Micron Separations Inc., Westborough, MA) ausgeführt, und die DNA wurde mit der Membran unter Verwendung von UV-Licht quervernetzt, und die Membranen wurden 2 Std. lang in einem Vakuumofen bei 80 °C gebacken.
  • BEISIEL 9
  • Anzahl der Kopien und Integrität des mutierten EPSPS-Transgens in GA21
  • Die Getreidelinie GA21 wurde analysiert, um die Anzahl der Insertionen des pDPG434-NotI-EPSPS-Fragmentes zu bestimmen, das für die Transformation verwendet wurde. Genomische GA21-DNA wurde mit einem Restriktionsenzym verdaut, das nicht innerhalb des NotI-EPSPS-Fragmentes schneidet, welches für die Transformation verwendet wurde, und sie wurde mit dem ganzen NotI-EPSPS-Fragment sondiert. Für diese Analyse wurden GA21-DNA und nicht transformierte Kontrol-DNAs mit EcoRV verdaut und mit dem NotI-EPSPS-Fragment aus pDPG434 sondiert. Mit NotI verdauter pDPG434 wurde als Positivkontrolle bei einer Menge von ungefähr einer Kopie pro Genom umfasst. Bei GA21 hybridisierte eine einzelne Bande von etwa 15 kb mit der Sonde, was anzeigt, dass eine einzelne Insertion des für die Transformation verwendeten Plasmid-DNA-Fragmentes aufgetreten war (5A). Etwas zusätzliche Hybridisierung wurde bei GA21 und nicht transformierter Kontroll-DNA beobachtet; dieses Ergebnis war wie erwartet, da die verwendete Sonde die Transitpeptidsequenz (die Mais-DNA umfasst) und das mutierte Mais-EPSPS-Gen enthielt. Von diesen beiden Sequenzen wird erwartet, dass sie mit nicht transformierter Mais-DNA aufgrund des Vorhandenseins endogener Sequenzen mit Homologie zur Sondensequenz hybridisieren.
  • Um die Anwesenheit einer einzelnen Insertion des pDPG434-Plasmid-Fragmentes in GA21 weiter zu klären, wurde die Sonde von dem in 5A gezeigten Blot entfernt, und der Blot wurde unter Verwendung eines kleinen DNA-Fragmentes rehybridisiert, das ein innerhalb des mutierten EPSPS-Gens liegendes Fragment ist. Die 324 bp-EPSPS-Sonde hybridisierte stark mit der gleichen, ungefähr 15 kb großen Bande in der GA21-DNA, was die Anwesenheit einer einzigen Insertion des NotI-EPSPS-Fragmentes, das für die Transformation verwendet worden war, anzeigt (5B). Unter Verwendung der 324 bp-EPSPS-Sonde wurde eine Hybridisierung an zwei Banden mit geringerem Molekulargewicht sowohl bei der GA21- als auch der nicht-transformierten Kontroll-DNA beobachtet, was das Vorhandensein endogener Kopien des nativen EPSPS-Gens anzeigt.
  • Um zu bestimmen, ob das mutierte EPSPS-Gen in der Glyphosat-resistenten Getreidelinie GA21 intakt war, und um die Anzahl der Kopien abzuschätzen, wurden genomische DNA aus einer GA21-Transformante, nicht transformierte Kontroll-DNA und pDPG434 mit EcoRI/XbaI verdaut und mit der 324 bp-EPSPS-Sonde sondiert. Dieser Restriktionsverdau setzt ein Fragment von ungefähr 1,8 kb aus dem pDPG434 frei, das die OP-Sequenz und das mutierte EPSPS-Gen (3) enthält. Mit EcoRI/XbaI verdauter pDPG434 wurde auf dem Gel laufengelassen, um eine Kopie der EcoRI/XbaI-OTP-EPSPS-Sequenz pro Genom anzunähern. Es wurde festgestellt, dass die 324 bp mutiertes EPSPS-Sonde mit einem ungefähr 1,8 kb großen Fragment in GA21- und den pDPG434-Verdauen hybridisiert, aber nicht in dem Verdau nicht transformierter Kontroll-DNA (6). Dieses Ergebnis zeigt, dass das auf pDPG434 vorhandene 1,8 kb OTP-EPSPS-Fragment in der Glyphosat-resistenten Getreidelinie GA21 intakt ist. Ein Vergleich der Hybridisierungsintensität des pDPG434-Verdaus mit dem Verdau der GA21-DNA zeigt das Vorhandensein von ungefähr zwei Kopien der OTP-EPSPS-Sequenz in GA21 an (6).
  • BEISPIEL 10
  • Fehlen von Plasmid-Rückgratsequenzen in GA21
  • Um das Fehlen von Plasmid-Rückgratsequenzen zu bestätigen, die den ColE1-Replikationsursprung und das bla-Gen enthalten, das für β-Lactamase kodiert, wurden DNA aus einer transgenen Getreidelinie, die eine Einzelkopie von bla enthält, DNA aus einer GA21-Pflanze und Plasmid-DNA mit BglII verdaut und mit einem 1,7 kb-SspI/AflIII-Fragment aus Bluescript SK(–) (Stratagene, La Jolla, CA) sondiert, der ColE1 und bla enthält. Das verwendete Plasmid, pDPG427, ist mit pDPG434 identisch, enthält aber einen Mais-Histon-Promotor statt des Reis-Aktin-Promotors. Wie erwartet wurde keine Hybridisierung an die GA21-DNA beobachtet. Wie ebenfalls erwartet wurde eine Hybridisierung an eine ungefähr 5 kb große Bande in der DNA aus der bla-positiven Pflanze und aus pDPG427 beobachtet (7).
  • BEISPIEL 11
  • Die Konstruktion der Plasmide pDPG165, pDPG434 und pDPG443
  • Für das bar-Gen kodierende DNA-Segmente wurden in das Plasmid pDPG165 (1) eingefügt, im Wesentlichen wie in der US-Patentanmeldung Nr. 08/113,561 , eingereicht am 25. August 1993, beschrieben ist. Das bar-Gen wurde aus Streptomyces hygroscopicus (White et al., 1990) kloniert und liegt in der Form eines 559-bp-SmaI-Fragmentes im Plasmid pIJ4101 vor. Die Sequenz der kodierenden Region dieses Gens ist zu der veröffentlichten (Thompson et al., 1987) identisch. Um das Plasmid pDPG165 zu erzeugen, wurde das SmaI-Fragment aus pIJ4104 in einen pUC19-basierten Vektor ligiert, der den Blumenkohlmosaikvirus (CaMV)-35S-Promotor (stammend aus pBI221.1, bereitgestellt von R. Jefferson, Plant Breeding Institute, Cambridge, England), einen Polylinker und das Transcript 7 (Tr7)-3'-Ende aus Agrobacterium tumefaciens (3'-Ende bereitgestellt durch D. Stalker, Calgene, Inc., Davis, CA) enthielt.
  • Die Plasmide pDPG434 (3) und pDPG443 (4) wurden durch das Klonieren der entsprechenden Promotoren in mit SmaI linearisierten pDPG425 (14) konstruiert. Die linearisierten Vektoren wurden mit alkalischer Phosphatase aus Kälbern behandelt, um eine erneute Zirkularisierung vor der Ligation zu verhindern. Der Reis-Aktin-Promotor und das Intron wurden in der Form eines 1,5 kb-HindIII-Fragmentes aus pDPG421 isoliert (pDM302; Cao et al., Plant Cell Rep (1992) 11: 586-591). Der 2X-35S/Arabidopsis-Histon-Promotor wurde in der Form eines 1,8 kb-EcoRI/HindIII-Fragmentes aus pDPG405 (15) isoliert. Die oben erwähnten Promotorfragmente wurden mit T4-DNA-Polymerase behandelt, um vor der Ligation in mit SmaI linearisierten pDPG425 (Rhone Poulenc Agrochimie) glatte Enden zu erzeugen. Das vierte verwendete Plasmid, pDPG427 (2), wurde von Rhone Poulenc Agrochimie erhalten. Eine Liste der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Plasmide und der Bestandteile der Plasmide ist in Tabelle 4 angegeben. Eine Liste der Bestandteile von pDPG434 ist in Tabelle 5 gezeigt.
  • BEISPIEL 12
  • Wirkung der Glyphosat-Behandlung auf das Wachstum und die Fruchtbarkeit der DK580- und DK626-Hybride von FI117, GA21, GG25 und GJ11
  • BC4-Hybride von DK580 und DK626, die eines der FI117-, GA21-, GG25- oder GJ11-Transformationsereignisse enthielten, wurden wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt. Vergleiche der Wirkung einer Glyphosat-Behandlung auf das Wachstum (mittlere erweiterte Blatthöhe) und die männliche Fruchtbarkeit wurde sowohl bei den Phasen V4 und V8 der Entwicklung angestellt. Die Entwicklungsskala, die verwendet wurde, um die Getreidepflanzen zu beurteilen, ist auf dem Gebiet wohlbekannt und in Special Report Nr. 48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative Extension Servide, Ames, IA beschrieben. Jeder der Hybride wurde sowohl in der Phase V4 als auch V8 unter Verwendung von 0X Glyphosat (d. h. nur Wasser), 1X Glyphosat oder 4X Glyphosat (die Konzentration 1X entspricht 16 Unzen/Acre ROUNDUP ULTRATM) überprüft.
  • Die Tests wurden in eine in vier Reihen und 3 Rep. doppelt aufgeteilte Auftragung mit den Hybriden als Hauptauftragungen, Transformantenquellen (d. h. GA21, GG25, FI117 und GJ11) als Unterauftragungen und Zeit/Mengen-Kombinationen als Unterauftragungen (12) entworfen. Statistische Verfahren zur Gestaltung und zur Analyse von aus experimentellen Feldauftragungen abgeleiteten Daten sind in Gomez und Gomez (1984) beschrieben. Die Tests wurden während des Jahres 1996 in Dekalb, Illinois und Thomasboro, Illinois ausgeführt. Alle Reihen wurden mit der doppelten normalen Bepflanzungsdichte bepflanzt, d. h. 60 Samen pro Reihe, weil die Hybride sich hinsichtlich der Glyphosat-Resistenzeigenschaft 1:1 aufspalteten. Besprühte Pflanzen wurden nicht früher als 7 Tage nach der Behandlung mit Roundup ausgedünnt, zu einer Zeit, zu der gegen Roundup empfindliche Pflanzen identifiziert werden konnten. Unbesprühte Auftragungen wurden zur gleichen Zeit auf 30 Pflanzen pro Reihe ausgedünnt. 5-10 Tage nach der Herbizidbehandlung wurden die folgenden Daten in jeder Reihe gesammelt: Anzahl toter Pflanzen, Anzahl beschädigter Pflanzen und Anzahl normaler Pflanzen. Nach dem Ausdünnen wurde die mittlere erweiterte Blatthöhe bei 10 resistenten Pflanzen pro Auftragung gemessen. Während des Restes der Anbausaison wurden die folgenden agronomischen Daten gesammelt: Zahl der frühen Stände, Sämlingsvitalität, Zahl der endgültigen Stände, Pflanzenhöhe, Ohrenhöhe, Intaktheit, grün bleiben, Zahl kahler Pflanzen, Zahl männlich steriler Pflanzen, Zahl abgeworfener Ohren, Anzahl der an den Wurzeln abgeknickten Pflanzen, Zahl der an den Stielen abgeknickten Pflanzen, Gewicht der schaligen Körner, Prozent Feuchtigkeit der Körner bei der Ernte und Testgewicht.
  • Die Ergebnisse zeigen, dass alle 4 Transformationsereignisse sowohl bei den 1X- als auch 4X-Behandlungsmengen eine erhebliche Resistenz gegen Glyphosat ergaben (7A, 7B). Insgesamt ergab das GA21-Transformationsereignis dahingehend die wirkungsvollste Resistenz, dass bei der 4X-Behandlungsmenge 3 von 4 GA21-Behandlungen (7A, 7B) die größten mittleren Höhen der erweiterten Blätter aufwiesen. Darüber hinaus ergaben alle 4 der GA21-Behandlungen männlich fruchtbare Pflanzen. Bei der V8-Phase der Behandlung ergaben nur die GJ11- und GJ25-Behandlungen männlich sterile Pflanzen (8B), während bei der V4-Phase der Behandlung alle Pflanzen männlich fruchtbar waren (8A).
  • BEISPIEL 13
  • Wirkung der Glyphosat-Behandlung auf den Ertrag der DK580- und DK626-Hybride des FI117-, GA21-, GG25- und GJ11-Transformationsereignisse
  • Vier DK580- und vier DK626-Hybride, von denen jede ein anderes mutiertes EPSPS-Transgen aus einem der GA21-, FI117-, GJ11- oder GG25-Transformationsereignisse enthielt, wurden im Feldversuch mit der Glyphosat-Behandlung wie in Beispiel 12 beschrieben auf mögliche Wirkungen auf den Ertrag untersucht, mit Behandlungen, wie in 12 gezeigt. Die Hybride wurden wie in Beispiel 14 beschrieben hergestellt. Die Ertragsabschätzungen wurden unter Verwendung von Gewichten der schaligen Körner, angepasst an 15,5 % Feuchtigkeit, verarbeitet. Die Daten wurden unter Verwendung der SAS PROC MIXED- und PROC SUM-Prozeduren analysiert. Nur Hybride, auf die kein Glyphosat angewendet worden war, wurden verglichen, um jegliche Wirkungen der Herbizidbehandlungsmengen und/oder der Unkrautkonkurrenz auf den Kornertrag zu entfernen. Die Diskussion hierin wird sich auf die Ergebnisse konzentrieren, die den Kornertrag betreffen.
  • 9A zeigt, dass erhebliche Verringerungen des Ertrages bei 3 der 4 DK580-Hybride nicht beobachtet werden, wenn Glyphosat in der Phase V4 angewendet wird. Weiterhin wies die Behandlungsgruppe im Fall des GA21-Transformationsereignisses einen höheren Ertrag auf, obwohl festgestellt wurde, dass der Unterschied nicht statistisch signifikant war. Die Unterschiede hinsichtlich des Ertrags zwischen DK580-Hybriden mit dem introgressierten mutiertes EPSPS-Transformationsereignis relativ zu dem Hybrid ohne das Ereignis waren nur bei dem FI117-Ereignis signifikant. In diesem Fall wies der Glyphosat-resistente Hybrid einen höheren Ertrag als der entsprechende nicht resistente Hybrid auf. Die Ergebnisse zeigen, dass mit Glyphosat ohne eine entsprechende Verringerung des Ertrags drei der vier DK580-Hybride in der Entwicklungsphase V4 behandelt werden können.
  • Vergleiche der Wirkungen einer Glyphosat-Behandlung auf den Ertrag von jedem der DK626-Hybride in der Entwicklungsphase V8 sind in 9B angegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass selbst in der Phase V8 weder bei dem GA21- noch bei dem FI117-introgressierten DK626-Hybrid ein signifikanter Verlust des Ertrages nach einer 4X-Menge der Glyphosat-Behandlung beobachtet wird. Weiterhin zeigte der GA21-Hybrid wieder relativ zu den unbehandelten Kontrollen des gleichen genetischen Hintergrundes eine Zunahme des Ertrages.
  • BEISPIEL 14
  • Introgression von GA21, FI117, GG25 und FJ11 in Elite-Inzuchten und Maishybride
  • Rückkreuzen kann verwendet werden, um eine durch Inzucht erzeugte Pflanze zu verbessern. Das Rückkreuzen überträgt eine spezifische erwünschte Eigenschaft von einer Inzucht-Quelle auf eine Inzucht, der diese Eigenschaft fehlt. Dies kann z. B. durch das zuerst durchgeführte Rückkreuzen einer überlegenen Inzucht (A) (wiederkehrendes Elternteil) mit einer Spenderinzucht (nicht wiederkehrendes Elternteil) erreicht werden, die das geeignete Gen oder die geeigneten Gene hinsichtlich der in Frage stehenden Eigenschaft trägt. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzung wird zunächst unter der sich ergebenden Nachkommenschaft auf die erwünschte Eigenschaft, die auf das nicht wiederkehrende Elternteil übertragen werden soll, untersucht, die selektierte Nachkommenschaft wird dann wieder mit dem überlegenen wiederkehrenden Elternteil gepaart (A). Nach fünf oder mehr Rückkreuzungsgenerationen mit einer Selektion auf die erwünschte Eigenschaft ist die Nachkommenschaft hinsichtlich der Loci hemizygot, die das übertragene Charakteristikum steuern, in diesem Fall ein mutiertes EPSPS-Transgen, aber hinsichtlich der meisten oder fast aller anderen Gene die Eigenschaften des überlegenen Elternteil zeigen. Die letzte Rückkreuzungsgeneration würde selbst bestäubt werden, um Nachkommenschaft zu ergeben, die bezüglich des zu übertragenden Gens oder der zu übertragenen Gene, d. h. einen GA21-, GG25-, GJ11- und/oder FI117-Transformationsereignis, reinrassig ist.
  • Daher kann durch eine Serie von Züchtungsmanipulationen ein selektiertes, für ein mutiertes EPSPS kodierendes Gen ohne die Notwendigkeit weiterer rekombinanter Manipulationen von einer Getreidelinie in eine völlig andere Getreidelinie bewegt werden. Eingeführte Transgen sind dahingehend wertvoll, dass sie sich genetisch wie jegliches andere Getreidegen verhalten und durch Züchtungstechniken in einer Weise manipuliert werden können, die für jegliches andere Getreidegen identisch ist. Beispielhafte Vorgehensweisen dieser Natur wurden durch die Erfinder erfolgreich ausgefüwrt. Bei diesen Rückkreuzungsstudien wurden die Transformanten GA21, FI117, GG25 und GJ11 jeweils in die Elite-Inzucht-Linien FELL ( US-Patentanmeldung Nr. 08/181,708 , eingereicht am 14. Januar 1994) und NL054B ( US-Patentanmeldung Nr. 08/595,549 , eingereicht am 6. Februar 1996) durch Rückkreuzen introgressiert, obwohl die Umwandlung zu viel mehr Inzuchten derzeit in Arbeit ist. Unter Verwendung dieser Inzuchten als weibliche Elternteile wurden zwei solche beispielhafte Hybride, DK626 und DK580, hergestellt. Diese Hybride wurden im Feldversuch hinsichtlich des Ertrags und anderer agronomischer Charakteristiken genauso wie hinsichtlich der Herbizidtoleranz getestet.
  • Die Elite-Inzuchten FELL und NL054B wurden jeweils viermal mit den GA21-, FI117-, GJ11- und GG25-Transformanten rückgekreuzt. Bei jeder Rückkreuzungsgeneration wurden Pflanzen, die das mutierte EPSPS-Gen enthielten, auf der Grundlage der Resistenz gegen eine 1X-Behandlung mit Glyphosat identifiziert.
  • Nach dem Rückkreuzen über vier Generationen gegen ein wiederkehrendes Elite-Inzucht-Elternteil ist die transformierte Linie der Erwartung nach in einem genetischen Hintergrund vorhanden, der zu wenigstens 93 % mit dem des wiederkehrenden Elternteils (FELL oder NL054B) identisch ist. Nach der Rückkreuzungsumwandlung wurden die Pflanzen zweimal selbst bestäubt, um Pflanzen zu identifizieren, die mit Bezug auf das introgressierte interessierende Gen, d. h. die GA21-, FI117-, GJ11- und GG25-Insertionsereignisse, homozygot sind. Die Hybride wurden durch das Kreuzen der FBLL- und NL054B-Inzuchtelternpflanzen hergestellt, die eines der Insertionsereignisse GA21-, FI117-, GJ11- oder GG25 enthielten, mit einer nicht transformierten durch Inzucht erzeugten männlichen Pflanze hergestellt. Die DK580-Hybride wurden durch eine Kreuzung von FBLL mit MBZA ( US-Patentanmeldung Nr. 08/182,616 , eingereicht am 14. Januar 1994) hergestellt, und die DK626-Hybride wurden durch eine Kreuzung von NL054B mit MM402A ( US-Patentanmeldung Nr. 08/181,019 , eingereicht am 13. Januar 1994) hergestellt, und dadurch wurden Hybride gewonnen, die hinsichtlich des entsprechenden Transformationsereignisses hemizygot waren.
  • BEISPIEL 15
  • Markergestütztes Züchten
  • Die Identifikation von Maislinien, die zur erhöhten Glyphosatresistenz gezüchtet wurden, kann leicht durch das Verwenden eines Integrationsereignisses mit einem mutierten EPSPS-Gen der GA21-, GG25-, FI117- oder GJ11-Transformationsereignisse unterstützt werden. Techniken zum Isolieren von Nukleinsäuren und Proteinen sind Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt (Sambrook et al., 1989) und können in Verbindung mit den Integrationsereignissen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um selektiv Pflanzen zu segregieren, die eine erhöhte Glyphosatresistenz aufweisen.
  • Es ist vorgesehen, dass die Integrationsereignisse mit dem mutierten EPSPS-Gen als DNA-Sonden für das markergestützte Züchten nützlich sein werden. Bei dem Verfahren des markergestützten Züchten werden DNA-Sequenzen verwendet, um wünschenswerten agronomischen Eigenschaften (Tanksley et al., 1989) beim Vorgang des Pflanzenzüchtens zu folgen. Daher können Tests, die das Vorhandensein von Integrationsereignissen mit dem mutierten EPSPS der vorliegenden Offenbarung anzeigen, zur Identifikation von Pflanzen mit erhöhter Glyphosatresistenz verwendet werden.
  • Markergestütztes Züchten unter Verwendung eines Integrationsereignisses mit mutiertem EPSPS-Gen wird wie folgt durchgeführt. Samen einer einen erwünschten Ertrag erbringenden Pflanze werden im Treibhaus oder auf dem Feld im Boden eingepflanzt. Blattgewebe wird von der Pflanze zur Präparation von DNA zu jeglichem Zeitpunkt des Wachstums geerntet, bei dem ungefähr ein Gramm Blattgewebe von der Pflanze entfernt werden kann, ohne das die Lebensfähigkeit der Pflanze beeinträchtigt wird. Genomische DNA wird unter Verwendung der Prozedur von Shure et al. (1983) in modifizierter Form isoliert. Ungefähr ein Gramm Blattgewebe von einem Sämling wird über Nacht in 15 ml-Polypropylenröhrchen lyophilisiert. Gefriergetrocknetes Gewebe wird unter Verwendung von einem Glasstab in dem Röhrchen zu einem Pulver gemahlen. Pulverisiertes Gewebe wird gründlich mit 3 ml Extraktionspuffer (7,0 M Harnstoff, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 M EDTA, 1 % Sarkosin) vermischt. Das Gewebe-/Puffer-Homogenat wird mit 3 ml Phenol/Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wird durch Zentrifugation abgetrennt und zweimal unter Verwendung von 1/10-Volumen 4,4 M Ammoniumacetat, pH 5,2, und einem gleichen Volumen Isopropanol präzipitiert. Das Präzipitat wird mit 75 % Ethanol gewaschen und in 100-500 μl TE (0,01 M Tris-HCl, 0,001 M EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Genomische DNA wird einem 3-fachen Überschuss von Restriktionsenzymen verdaut, einer Elektrophorese durch 0,8 % Agarose (FMC) unterzogen und unter Verwendung von 10X SCP (20 SCP: 2M NaCl, 0,6 M Dinatriumphosphat, 0,02 M Dinatrium-EDTA) auf Nytran (Schleicher und Schuell) übertragen (Southern, 1975).
  • Ein Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, dass viele verschiedene Restriktionsenzyme nützlich sein werden und dass die Auswahl des Restriktionsenzyms von der DNA-Sequenz des mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignisses abhängen wird, das als Sonde verwendet wird, und von den DNA-Sequenzen im Maisgenom, die das mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignis umgeben. Als Sonde wird man DNA- oder RNA-Sequenzen verwenden wollen, die mit DNA aus der Plasmid-DNA des Integrationsereignisses hybridisieren werden. Das Transformationsereignis – Plasmidkombinationen, die hierin verwendet werden, sind zum Beispiel GA21-pDPG434, GG25-pDPG427, GJ11-pDPG443 und FI117-pDPG434 und pDPG165. Man wird ein Restriktionsenzym auswählen, das nach der Hybridisierung ein DNA-Fragment herstellen wird, welches als das mutierte EPSPS-Gen-Integrationsereignis identifizierbar ist.
  • Es wird erwartet, dass ein oder mehr als ein Restriktionsenzym verwendet werden wird, um genomische DNA entweder einzeln oder in Kombinationen zu verdauen. Die Filter werden in 6X SCP, 10 % Dextransulfat, 2 % Sarkosin und 500 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA und mit einer 32P-markierten Sonde vorhybridisiert werden, die durch zufälliges Priming erzeugt wurde (Feinberg & Vogelstein, 1983). Hybridisierte Filter werden 30 Minuten lang in 2X SCP, 1 % SDS bei 65 °C gewaschen und durch Autoradiographie unter Verwendung von Kodak XAR5-Film visualisiert. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass es viele verschiedene Möglichkeiten gibt, um DNA aus Pflanzengeweben zu isolieren, und dass es viele verschiedene Protokolle für die Southern-Hybridisierung gibt, die identische Ergebnisse ergeben werden. Fachleute auf dem Gebiet werden erkennen, dass die radioaktive Sonde von dem Southern-Blot nach der Autoradiographie entfernt werden kann, und dass der Southern-Blot mit einer anderen Sonde gegen das mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignis erneut sondiert werden kann. Auf diese Weise kann man jedes der verschiedenen mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignisse identifizieren, die in der Pflanze vorhanden sind.
  • Jede Spur des Southern-Blots stellt aus einer Pflanze isolierte DNA dar. Durch die Verwendung der Vielfalt der mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignisse als Sonden auf dem gleichen Blot mit genomischer DNA kann die Zusammensetzung jeder Pflanze hinsichtlich der Integrationsereignisse bestimmt werden. Korrelationen zwischen den Beiträgen verschiedener Integrationsereignisse zum Erhöhen der Herbizidresistenz der Pflanze werden etabliert. Nur diejenigen Pflanzen, die die erwünschte Kombination von Integrationsereignissen aufweisen, lässt man sich zur Reife fortentwickeln und werden für die Bestäubung verwendet. Mutiertes EPSPS-Gen-Integrationsereignissen entsprechende DNA-Sonden sind im Verlauf des Pflanzenzüchtens nützliche Marker, um bestimmte Integrationsereignisse zu identifizieren und zu kombinieren, ohne die Pflanzen wachsen lassen zu müssen und ohne die Pflanzen auf ihre agronomische Leistung untersuchen zu müssen.
  • BEISPIEL 16
  • Allgemeine Testverfahren
  • Die DNA-Analyse wurde wie folgt durchgeführt. Genomische DNA wurde unter Verwendung der Prozedur von Shure et al., 1983, in einer modifizierten Form, isoliert. Ungefähr 1 gm Kallusgewebe wurde in flüssigem Stickstoff unter Verwendung eines Mörsers und eines Stößels zu einem feinen Pulver gemahlen. Das pulverisierte Gewebe wurde gründlich mit 4 ml Extraktionspuffer (7,0 M Harnstoff, 0,35 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl pH 8,0, 0,01 M EDTA, 1 % Sarkosin) vermischt. Das Gewebe-/Puffer-Homogenat wurde mit 4 ml Phenol/Chloroform extrahiert. Die wässrige Phase wurde durch Zentrifugation abgetrennt, durch Miracloth durchgeführt und zweimal unter Verwendung von 1/10 Volumen 4,4 M Ammoniumacetat, pH 5,2 und einem gleichen Volumen Isopropanol präzipitiert. Das Präzipitat wurde mit 70 % Ethanol gewaschen und in 200-500:1 TE (0,01 M Tris-HCl, 0,001 M EDTA, pH 8,0) resuspendiert. Das Pflanzengewebe kann auch für die Isolierung von DNA unter Verwendung der vorangehenden Prozedur verwendet werden.
  • Das Vorhandenseins eines Gens in einer transformierten Zelle kann durch die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) nachgewiesen werden. Unter Verwendung dieser Technik können spezifische DNA-Fragmente amplifiziert und nach einer Agarosegelelektrophorese nachgewiesen werden. Zum Beispiel kann das mutierte EPSPS- Gen unter Verwendung von PCR nachgewiesen werden. Zweihundert bis 1000 ng genomische DNA werden zu einer Reaktionsmischung hinzugegeben, die 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2; 50 mM KCl, 0,1 mg/ml Gelatine, jeweils 200 μM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, jeweils 0,5 μM Vorwärts- und Rückwärts-dia-primer, 20 % Glycerin und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase enthält. Die Primersequenzen sind (obere) 5'-TTTGGCTCTTGGGGATGTG-3' und (untere) 5'-TTACGCTAGTCTCGGTCCAT-3'. Die Reaktion wird in einer Thermalzyklisierungsmaschine wie folgt laufengelassen: 3 Minuten bei 94 °C, 39 Wiederholungen von Zyklus 1 eine Minute lang bei 94 C, 1 Minute bei 50 C, 30 Sekunden bei 72 C, gefolgt von 5 Minuten bei 72 C. Zwanzig μl jeder Reaktionsmischung werden auf einem 3,5 % NuSieve-Gel in TBE-Puffer (90 mM Tris-Borat, 2 mM EDTA) zwei bis vier Stunden lang bei 50 V laufengelassen. Unter Verwendung dieser Primer wird ein 324-Basenpaar-Fragment des mutierten EPSPS-Transgenes vervielfältigt.
  • Zur Southern Blot-Analyse wurde genomische DNA mit einem 3-fachen Überschuss der Restriktionsenzyme verdaut, einer Elektrophorese durch 0,8 % Agarose (FMC) unterzogen und auf Nytran (Schleicher und Schuell) unter Verwendung von 10X SCP (20X SCP: 2 M NaCl, 0,6 M Dinatriumphosphat, 0,02 M Dinatrium-EDTA) übertragen (Southern, 1975). Die Filter wurden bei 65 °C in 6X SCP, 10 % Dextransulfat, 2 % Sarkosin und 500 μg/ml Heparin (Chomet et al., 1987) 15 Minuten lang vorhybridisiert. Die Filter wurden über Nacht bei 65 C in 6X SCP, einschließlich 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 32P-markierte Sonde, hybridisiert. Die Filter wurden in 2X SCP, 1 % SDS bei 65 C 30 Minuten lang gewaschen und durch Autoradiographie unter Verwendung von Kodak XAR5-Film visualisiert. Zur Rehybridisierung wurden die Filter 10 Min. lang in destilliertem Wasser aufgekocht, um die erste Sonde zu entfernen, und dann wie oben beschrieben vorhybridisiert.
  • BEISPIEL 17
  • Unkrautbekämpfung auf landwirtschaftlichen Feldern mit Glyphosat-resistenten Maispflanzen
  • RoundupTM ist eine kommerzielle Formulierung von Glyphosat, die von der Firma Monsanto hergestellt und verkauft wird. Die Menge RoundupTM (Glyphosat), die auf ein landwirtschaftliches Feld angewendet wird, auf dem Glyphosat-resistente Maispflanzen wachsen, hängt von dem besonderen Unkraut oder dem Spektrum von Unkräutern ab, die auf dem Feld vorhanden sind und deren Bekämpfung gewünscht wird. Die Herbizid-Behandlungsmengen reichen typischerweise von vier Unzen RoundupTM bis zu 256 Unzen RoundupTM pro Acre (die 1X-Menge ist zu 16 Unzen RoundupTM pro Acre äquivalent, d. h. 64 Unzen/Acre ist 4X). Bevorzugterweise werden zwischen 8 Unzen und 128 Unzen RoundupTM pro Acre auf ein landwirtschaftliches Feld angewendet, auf dem Glyphosat-resistente Maispflanzen vorhanden sind. Bevorzugtererweise können etwa 16 Unzen bis etwa 64 Unzen pro RoundupTM Acre auf das Feld angewendet werden. Eine Behandlung mit RoundupTM, die die 1X-Menge überschreitet, und die 1X, 2X, 3X, 4X und mehr umfasst, ist ausreichend, um Maispflanzen abzutöten, die keine exprimierte Kopie des mutierten EPSPS-Gens aufweisen, und wird zusätzlich ein breites Spektrum von Unkräutern abtöten.
  • Eine anfängliche Feldbehandlung mit Glyphosat wird typischerweise zwischen den Entwicklungsphasen V3 bis V5 ausgeführt werden und typischerweise aus einer 2X-Behandlung bestehen. Die Behandlungsmenge kann, auf der Grundlage der Häufigkeit und/oder der Art von Unkräutern, die behandelt werden, wie erforderlich erhöht oder erniedrigt werden. In Abhängigkeit von der Lage des Feldes und von den Wetterbedingungen, die das Wachstums des Unkrauts und die Art des Unkrautbefalls beeinflussen werden, kann es wünschenswert sein, weitere Glyphosat-Behandlungen durchzuführen. Die zweite Glyphosat-Behandlung wird typischerweise aus etwa einer 2X-Glyphosatbehandlung bestehen, die zwischen den Phasen der Reifung V6 und V8 vorgenommen werden wird. Die Behandlungsmenge kann wiederum auf der Grundlage der Feldbedingungen angepasst werden. Derartige Verfahren zur Behandlung landwirtschaftlicher Ernten mit Herbiziden sind auf dem Gebiet wohlbekannt und allgemein in Anderson (1983) zusammengefasst.
  • Ein Landwirt kann auch eine Kombination von Herbiziden, einschließlich RoundupTM, auf ein Feld anwenden, auf dem Glyphosat-resistente Maispflanzen vorhanden sind. Kombinationen von Herbiziden werden als „Flüssigkeitsbehältermischungen" bezeichnet. Ein zweites Herbizid wird in Kombination mit RoundupTM geliefert, um die Aktivität von RoundupTM zu ergänzen und dadurch die Effizienz der Unkrautbekämpfung zu erhöhen. Z. B. kann RoundupTM auf ein Feld mit Glyphosat-resistenten Maispflanzen zusammen mit einem Herbizid mit Restaktivität angewendet werden, wie beispielsweise einem Triazin-Herbizid, um eine länger andauernde Unkrautbekämpfung bereitzustellen. Ein Herbizid, das in einer Mischung mit Glyphosat besonders nützlich sein kann, ist Acetochlor. Es ist vorgesehen, dass RoundupTM auf ein landwirtschaftliches Feld, das Glyphosat-resistente Maispflanzen umfasst, in Verbindung mit einem oder mehr als einem der in Tabelle 1 aufgeführten Herbizide angewendet werden kann. Es wird verstanden, dass die Herbizidliste in Tabelle 1 nicht beschränkend ist und dass ein Fachmann auf dem Gebiet die Identität anderer Herbizid-Chemikalien kennen wird, die ein Landwirt in Verbindung mit RoundupTM auf ein Feld anwenden könnte.
  • Ein Landwirt kann Glyphosat zur Unkrautbekämpfung auf ein Feld zu jeder Zeit während des Wachstums der Getreidepflanzen anwenden wollen, zu der der Landwirt das Unkrautwachstum bekämpfen möchte. Bevorzugterweise wird Glyphosat an das Feld während des vegetativen Wachstums der Maispflanzen, d. h. vor dem Beginn der Blüte, angewendet. RoundupTM kann auf Glyphosat-resistente Pflanzen auf dem Feld zu jeglicher Entwicklungsphase einschließlich zwischen den Phasen V1 und V10, angewendet werden (die Entwicklungsskala ist in „How a Corn Plant Grows", Special Report No. 48, Iowa State University of Science and Technology, Cooperative Extension Service, Ames IA). Bevorzugtererweise wird RoundupTM auf die Felder während der Phasen V2, V3, V4, V5, V6, V7 oder V8 des vegetativen Wachstums angewandt, und am bevorzugtesten während der Wachstumsphasen V4, V5, V6, V7 oder V8 der Maispflanze. Weiterhin können vielfache Behandlungen mit RoundupTM erwünscht werden, um das Wachstum von Unkraut zu bekämpfen. Zum Beispiel kann RoundupTM auf das Feld sowohl während der Wachstumsphase V4 der Glyphosat-resistenten Maispflanze als auch während der Wachstumsphase V8 angewendet werden. Darüber hinaus kann RoundupTM auf der Grundlage des tatsächlichen Bedarfes angewendet werden, um das Wachstum bestimmter Unkräuter zu bekämpfen, wenn dies benötigt wird.
  • BEISPIEL 18
  • Verwendung von transgenen Getreideernten
  • Das letztendliche Ziel bei der Pflanzentransformation besteht darin, Pflanzen herzustellen, die für den Menschen nützlich sind. In dieser Hinsicht können die gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugten transgenen Pflanzen zu nahezu jeglichem Zweck verwendet werden, von dem der Anbauer oder der Verbraucher glaubt, dass er einen Wert hat. Zum Beispiel kann man Samen aus transgenen Pflanzen ernten wollen. Dieser Samen kann wiederum für eine breite Vielzahl von Zwecken verwendet werden. Der Samen kann an Landwirte zum Anpflanzen auf dem Feld verkauft werden oder kann direkt als Nahrungsmittel entweder für Tiere oder Menschen verwendet werden. Alternativ können aus dem Samen selbst Produkte hergestellt werden. Beispiele für Produkte, die aus dem Samen hergestellt werden können, umfassen Öl, Stärke, Tiernahrungsmittel oder für den Menschen bestimmte Nahrungsmittel, Pharmazeutika und verschiedene Industrieprodukte. Solche Produkte können aus bestimmten Pflanzenteilen oder aus der ganzen Pflanze hergestellt sein. Ein aus der ganzen Pflanze hergestelltes Produkt, dem man einen besonderen Wert zumisst, ist Silofutter zur Tierfütterung.
  • Mittel zum Herstellen von Produkten aus Pflanzen wie beispielsweise denjenigen, die mit der vorliegenden Erfindung hergestellt werden können, sind seit dem Beginn der Landwirtschaft wohlbekannt und werden für den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein. Spezifische Verfahren zur Ernteverwendung können z. B. in Sprague und Dudley (1988) und Watson und Ramstad (1987) gefunden werden.
  • LITERATURANGABEN
  • Die unten aufgelisteten Literaturangaben ergänzen, erklären, stellen einen Hintergrund bereit für oder lehren Methoden, Techniken und/oder Zusammensetzungen, die hierin verwendet werden.
    • PCT-Anmeldung Nr. WO 89/06700
    • PCT-Anmeldung PCT/US98/01025
    • PCT-Anmeldung WO 88/10315
    • PCT Nr. WO 91/02071
    • PCT/US87/00880
    • US-Patent Nr. 4,769,061
    • US-Patent Nr. 4,535,060
    • US-Patent Nr. 4,683,195
    • US-Patent Nr. 4,683,202
    • US-Patent Nr. 4,800,159
    • US-Patent Nr. 4,883,750
    • US-Patent Nr. 5,279,721
    • US-Patent Nr. 5,384,253
    • US-Patent Nr. 5,384,956
    • US-Patent Nr. 5,463,175
    • US-Patent Nr. 5,554,798
    • US-Patent Nr. 5,591,616
    • US-Patentanmeldung Nr. 08/113,561 , eingereicht am 25. August 1993
    • US-Patentanmeldung Nr. 08/181,019 , eingereicht am 13. Januar 1994
    • US-Patentanmeldung Nr. 08/182,616 , eingereicht am 14. Januar 1994
    • US-Patentanmeldung Nr. 08/181,708 , eingereicht am 14. Januar 1994
    • US-Patentanmeldung Nr. 08/595,549 , eingereicht am 6. Februar 1996
    • WO 90/07641
    • WO 95/06128
    • Anderson, W.P., „Weed Science Principles, West Publishing Company, 1983.
    • Balthazor und Hallas, "Glyphosate-degrading microorganisms from industrial activated sludge," Appl. Environ. Microbiol, 51: 432-434, 1986.
    • Bevan, „Binary Agrobacterium vectors for plant transformation," Nucleic Acids Res., 12: 8711-8721, 1984
    • Bevan et al., Nucleic Acid Research, 11: 369-385, 1983.
    • Callis et al., Genes and Develop., 1: 1183-1200, 1987
    • Cao et al., Plant Cell Rep, 11: 586-591, 1992.
    • Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425, 1977
    • Chomet et al., 1987 EMBO J 6: 295-302
    • Chu et al., Scientia Sinica, 18: 659-668, 1975.
    • Clark, J. of Plant Nutrition, 5: 1039, 1982.
    • Comai et al., Nature, 317: 741-744, 1985.
    • Coupland, "Metabolism of glyphosate in plants in The Herbicide Glyphosate," 25-34, 1985.
    • Cristou et al., Plant Physiol, 87: 671-674, 1988.
    • Daughten et al., "Biodegradation of phosphonate toxicants yields methane or ethane on cleavage of the C-P bond," FEMS Microbiol. Lett., 5: 91-93, 1979b.
    • Daughton et al., Bacterial conversion of alkylphosphonates to natural products via carbon-phosphorus bond cleavage," J. Agric. Food Chem., 27: 1375-1382, 1979a.
    • Daughton et al., "Phosphate and soil binding: factors limiting bacterial degradation of ionic phosphorus-containing pesticide metabolites," Appl. Environ. Microbiol., 37: 605-609, 1979c.
    • De Block et al., EMBO J., 6: 2513-2518; siehe auch PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/05629 , 1987.
    • De Block et al., Plant Physiol, 91: 694-701, 1989.
    • Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function : Impact of New Concepts, 18 Stadler Genetics Symposium, J.P. Gustafson und R. Appels, Hrsg. (New York: Plenum Press), S. 263-282, 1988).
    • Ellis et al., EMBO Journal, 6(11): 3203-3208, 1987.
    • EPO No. 329 822
    • Feinberg und Vogelstein, Anal Biochem, 132: 6-13, 1983.
    • Finkle et al., Plant Sci, 42: 133-140, 1985.
    • Fodor et al., Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis. Science, 251: 767-773, 1991. Fransz et al., Plant Cell Rep, 8: 67-70, 1989.
    • Franz, "Discovery, development and chemistry of glyphosate," The Herbicide Glyphosate, 3-17, 1985.
    • Frohman, In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990.
    • Gomez und Gomez, Statistical Procedures for Agricultural Research, John Wiley and Sons, 1984.
    • Hacia et al., Detection of heterozygous mutations in BRCA1 using high density oligonucleotide arrays and two-colour fluorescence analysis. Nature Genetics, 14: 441-447, 1996.
    • Hallas et al., "Characterization of microbial traits associated with glyphosate biodegradation in industrial activated sludge," J. Industrial Microbiol., 3: 377-385, 1988.
    • Ingelbrecht et al., The Plant Cell, 1: 671-680, 1989.
    • Jacob et al., "Metabolism of glyphosate in Pseudomonas sp. Strain LBr," Appl. Environ. Microbiol., 54: 2953-2958, 1988.
    • Kishore und Jacob, "Degradation of glyphosate by Pseudomonas sp. PG2928 via a sarcosine intermediate," J. Biol. Chem., 262: 12164-12168, 1987.
    • Klein et al., Plant Physiol, 91: 440-444, 1989.
    • Kwoh et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 1173, 1989.
    • Lebrun et al., „Molecular basis of resistance to shikimic herbicides in adapted maize cell cultures," 1991. Genbank-Zugang X63374.
    • Lebrun et al., "Chimeric gene for the transformation of plants," U.S. Patent No. 5,510,471 , 1996.
    • Liu et al., "Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhixobiaceae," Environ. Microbiol., 57: 1799-1804, 1991.
    • Maier, Phosphorus Sulfur, 14: 295, 1983.
    • Marshall et al., Pestic. Sci., 18: 65-77, 1987.
    • Mastalerz et al., "Utilization of carbon-bound phosphorus by microorganisms," Acta Biochim. Pol., 12: 151-156, 1965.
    • Murakami, Mol Gen Genet, 205: 42-50, 1986.
    • Murashige and Skoog, Physiol Plant, 15: 473-497, 1962.
    • Odell et al., Nature, 313: 810-812, 1985.
    • Ogawa et al, Sci. Rep., 3: 42-48, 1973.
    • Omirulleh et al., Plant Molecular Biology, 21: 415-428, 1993.
    • Pease et al., Light-generated oligonucleotide arrays for rapid DNA sequence analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 5022-5026, 1994.
    • Pipke und Amrhein, "Degradation of the phosphonate herbicide glyphosate by Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752," Appl. Environ. Microbiol., 54: 1293-1296, 1988.
    • Puite et al., Plant Cell Rep., 4: 274-276, 1985.
    • Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manural, 2. Ausg., 1989:
    • Schowanek und Verstraete, "Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples," Appl. Environ. Microbiol., 56: 895-903, 1990.
    • Shah et al., Science, 233: 478-481, 1986.
    • Shinabarger und Braymer, "Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. Strain PG2982," J. Bacteriol., 168: 702-707, 1986.
    • Shoemaker et al., Quantitative phenotypic analysis of yeast deletion mutants using a highly parallel molecular bar-coding strategy. Nature Genetics 14: 450-456, 1996.
    • Shure et al., Cell, 35: 225-233, 1983.
    • Southern, "Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis," J. Mol. Biol., 98: 503-517, 1975.
    • Spencer et al., Plant Molecular Biology, 18: 201-210, 1992.
    • Sprague G. und Dudley J. W. (Hrsg.), "Corn and Improvement", Dritte Ausg., American Society of Agronomy, 1988.
    • Sutcliffe, "Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322," Proc. Natl. Acad, Sci., USA 75: 3737-3741, 1978.
    • Tanaka et al., "Synthesis and pesticidal activities of phosphonate analogs of amino acids," J. FAc. Agr. Kyushu Univ., 30: 209-223, 1986.
    • Tanksley et al., 1989 Bio/Technology 7: 257-264.
    • Thompson et al., EMBO J. 6: 2519-2623, 1987.
    • Torstensson, "Behavior of glyphosate in soils and its degradation," The Herbicide Glyphosate, 137-150, 1985.
    • Walker et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89: 392-396 1992.
    • Watson S. und Ramstad P.E. (Hrsg.), "Corn: Chemistry and Technology", American Association of Cereal Chemists, 1987.
    • Weidhase et al., "Utilization of glyphosate by Pseudomonas sp. GS," Zentralbl. Mikrobiol., 145: 6, 1990.
    • White et al., Nucl Acids Res., 18: 1062, 1990.
    • Withers and King, Plant Physiol. 64: 675-678, 1979.
    • Wu et al., Genomics, 4: 560, 1989.
    • Yanisch-Perron et al., "Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors," Gene, 33: 103-119, 1985.
    • Zeleznick et al., "Growth of Escherichia coli on methyl – and ethylphosphonic acids," Biochim. Biophys. Acta., 78: 546-547, 1963.

Claims (11)

  1. Verfahren zum Züchten von Pflanzen, umfassend die Schritte: i) Aussähen von Samen in Bestäubungsnähe, wobei die Samen in der Lage sind, zu einer ersten und einer zweiten Elternpflanze heranzuwachsen, wobei die erste monokotyledone Elternpflanze eine Expressionskassette umfasst, die ein Gen, das Glyphosattoleranz verleiht, und einen in der ersten monokotyledonen Elternpflanze aktiven Promotor umfasst, der mit dem Gen funktionsfähig verbunden ist, wobei die erste monokotyledone Elternpflanze nach Behandlung mit Glyphosat vegetativ tolerant, männlich steril und weiblich fruchtbar ist, und wobei der Promotor in Pollen weniger wirksam als in vegetativem Gewebe exprimiert wird; ii) Kultivieren der Samen, um die erste und die zweite Elternpflanze zu erzeugen, iii) Behandeln der ersten monokotyledonen Elternpflanze mit Glyphosat, wodurch die erste monokotyledone Elternpflanze männlich steril gemacht wird; iv) Erlauben, dass die zweite Elternpflanze die erste monokotyledone Elternpflanze bestäubt; und v) Ernten von Samen, die von der ersten monokotyledonen Elternpflanze gebildet sind; wobei die Elternpflanzen der Familie Graminaceae angehören.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die zweite Elternpflanze ein zweites Transformationsereignis durchlauft, vegetativ tolerant ist und nach der Behandlung mit Glyphosat männlich fruchtbar ist, und das Verfahren weiterhin das Behandeln der zweiten Elternpflanze mit Glyphosat umfasst.
  3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zweite Elternpflanze nach der Behandlung mit Glyphosat weiblich fruchtbar ist.
  4. Verfahren nach einem der Ansprache 1 bis 3, umfassend das Behandeln der ersten und zweiten Elternpflanze mit Glyphosat durch eine Behandlung von oben.
  5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprache, wobei das Herbizidtoleranzgen eine Glyphosat-tolerante Form von EPSPS ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schritt des Behandelns der ersten monokotyledonen Elternpflanze mit Glyphosat das Behandeln mit 0,59 Litern Glyphosat pro Hektar bis 7,0 Litern Glyphosat pro Hektar umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Schritt des Behandeln der ersten Elternpflanze mit Glyphosat das Behandeln der ersten monokotyledone Elternpflanze mit Glyphosat während den Entwicklungsphasen V4 und VT umfasst.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und die zweite Elternpflanze aus der Gruppe ausgewählt sind, die Mais, Weizen, Reis, Hafer, Gerste und Sorghum, bevorzugterweise Mais, umfasst.
  9. Verfahren zur Herstellung einer vegetativ Glyphosat-toleranten und weiblich fruchtbaren Maispflanze, umfassend: i) Bereitstellen einer Expressionskassette, die (a) ein Gen, das für ein Glyphosat-resistentes EPSPS-Protein kodiert, und (b) einen Promotor umfasst, der in der Pflanze aktiv ist und funktionsfähig mit dem EPSPS-Gen verbunden ist, wobei der Promotor in Pollen weniger wirksam als in vegetativem Gewebe exprimiert wird; ii) Kontaktieren von Empfänger-Maiszellen mit der Expressionskassette unter Bedingungen, die die Aufnahme der Expressionskassette durch die Empfänger-Maiszellen erlauben; iii) Auswählen von Empfänger-Zellen, die eine chromosomal eingebaute Expressionskassette umfassen; iv) Regenerieren von Pflanzen aus den ausgewählten Zellen; und v) Identifizieren einer vegetativ Glyphosat-toleranten und weiblich fruchtbaren Maispflanze, die die Expressionskassette umfasst, unter den regenerierten Pflanzen.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, weiterhin umfassend die Schritte: vi) Kreuzen der fruchtbaren Glyphosat-toleranten Maispflanze mit einer zweiten Maispflanze, der die Expressionskassette fehlt, um eine dritte Maispflanze zu erhalten, die die Expressionskassette umfasst; und vii) Rückkreuzen der dritten Maispflanze, um eine rückgekreuzte fruchtbare Maispflanze zu erhalten, wobei das EPSPS-Gen über eine männliche Elternpflanze vererbt wird.
  11. Verfahren zum Heranziehen von Mais, umfassend: i) Auspflanzen von vegetativ Glyphosat-toleranten und weiblich fruchtbaren Maispflanzen, die eine Expressionskassette umfassen, die a) ein Gen, das für ein Glyphosat-resistentes EPSPS-Protein kodiert, und b) einen in Mais aktiven Promotor umfasst, der funktionsfähig mit dem EPSPS-Gen verbunden ist, wobei der Promotor in Pollen weniger wirksam exprimiert wird als in vegetativem Gewebe; und ii) Behandeln der Maispflanzen mit Glyphosat mit einer Behandlungsmenge, die das Wachstum von Unkraut hemmt, aber nicht den Ertrag der Maispflanzen beeinflusst.
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US899247 1997-07-23
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US927368 1997-09-11
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WO (1) WO1998044140A1 (de)

Families Citing this family (321)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9808475A (pt) * 1997-04-03 2000-05-23 Dekalb Genetics Corp Linhagens de milho resistentes à glifosato.
CA2279258A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Novartis Ag Glyphosate resistant transgenic plants
DK1173582T3 (da) * 1999-04-29 2006-10-23 Syngenta Ltd Herbicidresistente planter
HUP0201013A2 (en) * 1999-04-29 2002-07-29 Syngenta Ltd Herbicide resistant plants
MXPA01010922A (es) * 1999-04-29 2003-06-24 Syngenta Ltd Plantas resistentes a herbicidas.
AU5043000A (en) * 1999-05-24 2000-12-12 Iowa State University Research Foundation Inc. Near infrared spectroscopy system and method for the identification of genetically modified grain
AR025996A1 (es) 1999-10-07 2002-12-26 Valigen Us Inc Plantas no transgenicas resistentes a los herbicidas.
EP1582583A3 (de) * 2000-03-09 2005-10-12 Monsanto Technology LLP DNS Konstrukte, die ein EPSP Synthase Promoter enthalten, und deren Verwendungen
WO2001066704A2 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Monsanto Technology Llc Methods for making plants tolerant to glyphosate and compositions thereof
BR122013026754B1 (pt) * 2000-06-22 2018-02-27 Monsanto Company Molécula de dna e processos para produzir uma planta de milho tolerante à aplicação do herbicida glifosato
US6646264B1 (en) 2000-10-30 2003-11-11 Monsanto Technology Llc Methods and devices for analyzing agricultural products
US7462481B2 (en) 2000-10-30 2008-12-09 Verdia, Inc. Glyphosate N-acetyltransferase (GAT) genes
WO2002046387A2 (en) 2000-12-07 2002-06-13 Syngenta Limited Plant derived hydroxy phenyl pyruvate dioxygenases (hppd) resistant against triketone herbicides and transgenic plants containing these dioxygenases
WO2002045510A2 (en) * 2000-12-07 2002-06-13 D & Pl Technology Holding Corporation Glyphosate-induced male sterility in dicots
US7977046B2 (en) * 2002-05-10 2011-07-12 Monsanto Technology Llc Method of selecting DNA constructs for herbicide tolerance in plants
CA2480937C (en) 2002-04-04 2012-10-02 Monsanto Technology Llc Automated picking, weighing and sorting system for particulate matter
WO2004009761A2 (en) 2002-07-18 2004-01-29 Monsanto Technology Llc Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing
CA2516221C (en) 2003-02-18 2014-05-13 Monsanto Technology Llc Glyphosate resistant class i 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (epsps)
CA2539935C (en) 2003-09-23 2015-11-17 Monsanto Technology Llc High throughput automated seed analysis system
WO2005030968A2 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Monsanto Technology Llc Actin regulatory elements for use in plants
US7405074B2 (en) 2004-04-29 2008-07-29 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Glyphosate-N-acetyltransferase (GAT) genes
AR050469A1 (es) 2004-08-26 2006-10-25 Monsanto Technology Llc Ensayo automatico de semillas
US7703238B2 (en) 2004-08-26 2010-04-27 Monsanto Technology Llc Methods of seed breeding using high throughput nondestructive seed sampling
US20060200878A1 (en) 2004-12-21 2006-09-07 Linda Lutfiyya Recombinant DNA constructs and methods for controlling gene expression
EP3339441A1 (de) * 2005-10-13 2018-06-27 Monsanto Technology LLC Verfahren zur herstellung von hybridsaat
WO2007070389A2 (en) * 2005-12-12 2007-06-21 Syngenta Participations Ag Control of parasitic weeds
JP2009523418A (ja) 2006-01-12 2009-06-25 サイバス，エルエルシー Ｅｐｓｐｓ変異体
EP1984390A2 (de) * 2006-01-23 2008-10-29 Board of Trustees of Michigan State University Verfahren für die züchtung von glyphosateresistenten pflanzen und zusammensetzungen davon
US8028469B2 (en) 2006-03-02 2011-10-04 Monsanto Technology Llc Automated high-throughput seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds
US7998669B2 (en) 2006-03-02 2011-08-16 Monsanto Technology Llc Automated contamination-free seed sampler and methods of sampling, testing and bulking seeds
EP2016180B1 (de) 2006-05-09 2013-04-17 The Curators Of The University Of Missouri Plattformen für künstliche pflanzenchromosomen durch telomerverkürzung
JP2009536819A (ja) * 2006-05-12 2009-10-22 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オーガニゼイション 除草剤を分解するための酵素
RU2009102660A (ru) 2006-06-28 2010-08-10 Монсанто Текнолоджи Ллс (Us) Установка и способ сортировки мелких предметов
EP2559767B1 (de) 2006-10-12 2017-04-12 Monsanto Technology LLC Pflanzliche Mikro-RNAs und Verfahren zur Verwendung davon
CN101772300B (zh) 2007-05-31 2013-07-24 孟山都技术有限公司 种子分拣器
EP2180779A4 (de) * 2007-08-30 2010-11-24 Seminis Vegetable Seeds Inc Vorwärtszüchtung
US7830504B2 (en) 2007-11-20 2010-11-09 Monsanto Technology Llc Automated systems and assemblies for use in evaluating agricultural products and methods therefor
WO2009085982A1 (en) * 2007-12-19 2009-07-09 Monsanto Technology Llc Method to enhance yield and purity of hybrid crops
WO2009134966A1 (en) * 2008-05-02 2009-11-05 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Chemical selection of resistant gametes of plants in the field
US8304616B2 (en) * 2009-04-07 2012-11-06 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Soybean variety G00-3209
US8071865B2 (en) 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV589782
US8071864B2 (en) 2009-04-15 2011-12-06 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV897903
US8362332B2 (en) 2009-04-15 2013-01-29 Monsanto Technology Llc Plants and seeds of corn variety CV165560
US20100299773A1 (en) * 2009-05-20 2010-11-25 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for selecting an improved plant
US9842252B2 (en) 2009-05-29 2017-12-12 Monsanto Technology Llc Systems and methods for use in characterizing agricultural products
IN2012DN00427A (de) * 2009-07-01 2015-05-15 Bayer Bioscience Nv
US8937214B2 (en) 2009-10-23 2015-01-20 Monsanto Technology Llc Methods and compositions for expression of transgenes in plants
MX358629B (es) 2009-11-23 2018-08-28 Monsanto Technology Llc Evento transgenico de maiz mon 87427 y la escala de desarrollo relativo.
SG190295A1 (en) 2010-11-29 2013-06-28 Bayer Ip Gmbh Alpha,beta-unsaturated imines
CN103281900A (zh) 2010-12-01 2013-09-04 拜耳知识产权有限责任公司 氟吡菌酰胺用于防治作物中的线虫以及提高产量的用途
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
BR112013022998A2 (pt) 2011-03-10 2018-07-03 Bayer Ip Gmbh método para aprimorar a germinação das sementes.
EP3292761A1 (de) 2011-03-23 2018-03-14 Bayer Intellectual Property GmbH Wirkstoffkombinationen
WO2012136581A1 (en) 2011-04-08 2012-10-11 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
ES2714714T3 (es) 2011-04-22 2019-05-29 Bayer Cropscience Ag Composiciones de compuestos activos que comprenden un derivado de (tio)carboximida y un compuesto fungicida
US9241493B2 (en) 2011-06-14 2016-01-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of an enaminocarbonyl compound in combination with a biological control agent
PE20141518A1 (es) 2011-07-01 2014-11-17 Monsanto Technology Llc Metodos y composiciones para la regulacion selectiva de la expresion de proteinas
US10538774B2 (en) 2011-08-22 2020-01-21 Basf Agricultural Solutions Seed, Us Llc Methods and means to modify a plant genome
EP2561759A1 (de) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoralkyl-substituierte 2-amidobenzimidazole und ihre Wirkung auf das Pflanzenwachstum
JP6002225B2 (ja) 2011-09-12 2016-10-05 バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ 殺菌性４−置換−３−｛フェニル［（ヘテロシクリルメトキシ）イミノ］メチル｝−１，２，４−オキサジアゾール−５（４ｈ）−オン誘導体
BR112014006217B1 (pt) 2011-09-16 2019-01-15 Bayer Intellectual Property Gmbh utilização de acilsulfonamidas para melhorar o rendimento de plantas,método para induzir respostas de regulação de crescimento em plantas úteis ou plantas de cultura e composição.
IN2014CN01860A (de) 2011-09-16 2015-05-29 Bayer Ip Gmbh
UA113967C2 (xx) 2011-09-16 2017-04-10 Застосування 5-феніл- або 5-бензил-2-ізоксазолін-3-карбоксилатів для покращення урожайності рослин
WO2013050410A1 (en) 2011-10-04 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh RNAi FOR THE CONTROL OF FUNGI AND OOMYCETES BY INHIBITING SACCHAROPINE DEHYDROGENASE GENE
KR20140102238A (ko) 2011-11-21 2014-08-21 바이엘 인텔렉쳐 프로퍼티 게엠베하 살진균제 n-[(트리치환실릴)메틸]-카르복사미드 유도체
CA2857438A1 (en) 2011-11-30 2013-06-06 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal n-bicycloalkyl and n-tricycloalkyl (thio)carboxamide derivatives
IN2014CN04325A (de) 2011-12-19 2015-09-04 Bayer Cropscience Ag
EP2797895B1 (de) 2011-12-29 2015-08-05 Bayer Intellectual Property GmbH Fungizide 3- [(1,3-thiazol-4-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substitut-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-on-derivate
CN104470896B (zh) 2011-12-29 2016-11-09 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌的3-[(吡啶-2-基甲氧基亚氨基)(苯基)甲基]-2-取代的-1,2,4-噁二唑-5(2h)-酮衍生物
ES2665361T3 (es) 2012-01-25 2018-04-25 Bayer Intellectual Property Gmbh Combinación de principios activos que contiene bacilo de fluopyram y agente de control biológico
US20150011389A1 (en) 2012-01-25 2015-01-08 Bayer Intellectual Property Gmbh Active Compound Combinations Containing Fluopyram and Biological Control Agent
PE20190346A1 (es) 2012-02-27 2019-03-07 Bayer Ip Gmbh Combinaciones de compuestos activos
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
CN104245687B (zh) 2012-04-12 2016-12-14 拜尔农科股份公司 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶
US20150080337A1 (en) 2012-04-20 2015-03-19 Bayer Cropscience N-cycloalkyl-n-[(trisubstitutedsilylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
KR102062517B1 (ko) 2012-04-20 2020-01-06 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 Ｎ-시클로알킬-ｎ-［（헤테로시클릴페닐）메틸렌］-（티오）카르복사미드 유도체
EP2662363A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenpyrazol-Biphenyl-Carboxamide
EP2662360A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenpyrazol-Indanyl-Carboxamide
EP2662362A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol-Indanyl-Carboxamide
EP2847170B1 (de) 2012-05-09 2017-11-08 Bayer CropScience AG Pyrazol-indanyl-carboxamide
EP2662370A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenpyrazol-Benzofuranyl-Carboxamide
JP6326043B2 (ja) 2012-05-09 2018-05-16 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト ５−ハロゲノピラゾールインダニルカルボキサミド類
EP2662364A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol-Tetrahydronaphthyl-Carboxamide
EP2662361A1 (de) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol-Indanyl-Carboxamide
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
MX362859B (es) 2012-05-30 2019-02-20 Bayer Cropscience Ag Composiciones que comprenden un agente de control biologico y un insecticida.
JP6285423B2 (ja) 2012-05-30 2018-02-28 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 生物農薬および殺虫剤を含む組成物
HUE040336T2 (hu) 2012-05-30 2019-03-28 Bayer Cropscience Ag Biológiai hatóanyagot és fluopikolidot tartalmazó készítmény
EP2854548B1 (de) 2012-05-30 2018-08-01 Bayer Cropscience AG Zusammensetzung enthaltend einen biologischen wirkstoff und ein fungizid ausgewählt aus metalaxyl und metalaxyl-m
AR091196A1 (es) 2012-05-30 2015-01-21 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un agente de control biologico y un fungicida
US20150289514A1 (en) 2012-05-30 2015-10-15 Bayer Cropscience Ag Composition comprising a biological control agent and a fungicide selected from inhibitors of the respiratory chain at complex iii
BR112014029224A2 (pt) 2012-05-30 2017-06-27 Bayer Cropscience Ag composição que compreende um agente de controle biológico e um fungicida
PL2854550T3 (pl) 2012-05-30 2019-01-31 Bayer Cropscience Ag Kompozycja zawierająca środek do kontroli biologicznej i środek grzybobójczy
WO2013181610A1 (en) 2012-06-01 2013-12-05 Newleaf Symbiotics, Inc. Microbial fermentation methods and compositions
AU2013298625A1 (en) 2012-07-31 2015-01-22 Bayer Cropscience Ag Compositions comprising a pesticidal terpene mixture and an insecticide
AR092564A1 (es) 2012-09-14 2015-04-22 Bayer Cropscience Lp Variantes de la enzima 4-hidroxifenil piruvato deoxigenasa (hppd) y metodos de uso para conferir tolerancia a herbicidas en plantas
EP2719280A1 (de) 2012-10-11 2014-04-16 Bayer CropScience AG Verwendung von N-Phenylehtylpyrazol-Carboxamid-Derivaten oder Salzen davon für das Resistenzmanagement von phytopathogenen Pilzen
US20150250176A1 (en) 2012-10-19 2015-09-10 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
LT2908641T (lt) 2012-10-19 2018-04-25 Bayer Cropscience Ag Būdas, skirtas augalų apdorojimui kovojant prieš grybus, kurie yra atsparūs fungicidams, panaudojant karboksamido arba tiokarboksamido darinius
EP2908639A1 (de) 2012-10-19 2015-08-26 Bayer Cropscience AG Wirkstoffverbindungskombinationen mit carboxamidderivaten
AU2013333845B2 (en) 2012-10-19 2017-06-08 Bayer Cropscience Ag Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives
EP2735231A1 (de) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen
CA2892702A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal or pesticidal mixture
BR122020019349B1 (pt) 2012-11-30 2021-05-11 Bayer Cropscience Ag composição, seu processo de preparação, método para controlar um ou mais microrganismos nocivos, semente resistente a microorganismos nocivos e seu método de tratamento
CA2892701A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary pesticidal and fungicidal mixtures
JP6367215B2 (ja) 2012-11-30 2018-08-01 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 二成分殺菌剤混合物
US9775351B2 (en) 2012-11-30 2017-10-03 Bayer Cropscience Ag Ternary fungicidal and pesticidal mixtures
EP2925144A2 (de) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Zusammensetzung aus einem biologischen bekämpfungsmittel und einem insektizid
EP2925140A2 (de) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Zusammensetzung mit einem biologischen bekämpfungsmittel und einem fungizid
BR112015012781A2 (pt) 2012-12-03 2018-06-26 Bayer Cropscience Ag composição compreendendo agentes de controle biológico
MX352629B (es) 2012-12-03 2017-12-01 Bayer Cropscience Ag Composición que comprende un agente de control biológico y un insecticida.
WO2014086753A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Composition comprising biological control agents
WO2014086750A2 (en) 2012-12-03 2014-06-12 Bayer Cropscience Ag Composition comprising a biological control agent and an insecticide
EP2925141A2 (de) 2012-12-03 2015-10-07 Bayer CropScience AG Zusammensetzung mit einem biologischen bekämpfungsmittel und einem fungizid
PT3318129T (pt) 2012-12-03 2020-02-18 Bayer Cropscience Ag Composição compreendendo uma combinação de paecilomyces lilacinus e fluopiram
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
BR112015014307A2 (pt) 2012-12-19 2017-07-11 Bayer Cropscience Ag difluorometil-nicotínico- tetrahidronaftil carboxamidas
EP2953464A1 (de) 2013-02-11 2015-12-16 Bayer Cropscience LP Zusammensetzungen mit gougerotin und einem fungizid
EP2953468A1 (de) 2013-02-11 2015-12-16 Bayer Cropscience LP Zusammensetzungen mit einem streptomyces-basierten biologischen bekämpfungsmittel und einem insektizid
WO2014124361A1 (en) 2013-02-11 2014-08-14 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising a streptomyces-based biological control agent and another biological control agent
CN105247054B (zh) 2013-03-07 2019-06-18 阿则耐克斯公司 毒素基因及其使用方法
WO2014170364A1 (en) 2013-04-19 2014-10-23 Bayer Cropscience Ag Binary insecticidal or pesticidal mixture
MX358633B (es) 2013-04-19 2018-08-28 Bayer Cropscience Ag Metodo de uso mejorado del potencial de produccion de plantas transgenicas.
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
US9770022B2 (en) 2013-06-26 2017-09-26 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
US20160219812A1 (en) * 2013-07-25 2016-08-04 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing hybrid brassica seed
WO2015085117A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Newleaf Symbiotics, Inc. Compositions and methods for improving fruit production
BR112016012880B1 (pt) * 2013-12-04 2021-01-05 Newleaf Symbiotics, Inc. métodos e composições para aprimorar o rendimento de soja
CN115710559A (zh) * 2013-12-04 2023-02-24 新叶共生有限公司 用于改良玉米产量的方法和组合物
CN105873907B (zh) 2013-12-05 2019-03-12 拜耳作物科学股份公司 N-环烷基-n-{[2-(1-取代的环烷基)苯基]亚甲基}-(硫代)甲酰胺衍生物
UA120701C2 (uk) 2013-12-05 2020-01-27 Байєр Кропсайєнс Акцієнгезелльшафт N-циклоалкіл-n-{[2-(1-заміщений циклоалкіл)феніл]метилен}-(тіо)карбоксамідні похідні
EP2885970A1 (de) 2013-12-21 2015-06-24 Bayer CropScience AG Fungizide Zusammensetzungen mit Verbindung I, mindestens einem Succinat-Dehydrogenase-Hemmer (SDH) und mindestens einem Triazolfungizid
CA2942171C (en) 2014-03-11 2023-05-09 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
WO2015142393A1 (en) 2014-03-17 2015-09-24 Newleaf Symbiotics, Inc. Compositions and methods for improving tomato production
WO2015160620A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and an insecticide
WO2015160619A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a fungicide
WO2015160618A1 (en) 2014-04-16 2015-10-22 Bayer Cropscience Lp Compositions comprising ningnanmycin and a biological control agent
US10757946B2 (en) 2014-09-16 2020-09-01 Newleaf Symbiotic, Inc. Microbial inoculant formulations
EP3283476B1 (de) 2015-04-13 2019-08-14 Bayer Cropscience AG N-cycloalkyl-n-[(biheterocyclylmethylen)-(thio)carboxamid-fungizide
EP3097782A1 (de) 2015-05-29 2016-11-30 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Verfahren zur bekämpfung von phytopathogenen nematoden durch kombination von fluopyram und biologischen pflanzenschutzmitteln
JP6873979B2 (ja) 2015-09-11 2021-05-19 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト Ｈｐｐｄ変異体および使用方法
WO2017197588A1 (zh) * 2016-05-17 2017-11-23 四川天豫兴禾生物科技有限公司 抗草甘膦基因筛选方法、epsps突变基因和缺陷型菌株及应用
CA3032030A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants
MX2019005835A (es) 2016-11-23 2019-10-30 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Genes de toxinas axmi669 y axmi991 y metodos para su uso.
WO2018114393A1 (en) 2016-12-19 2018-06-28 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
US11279946B2 (en) 2017-01-18 2022-03-22 Basf Argicultural Solutions Seed Us Llc BP005 toxin gene and methods for its use
UY37570A (es) 2017-01-18 2018-08-31 Bayer Cropscience Lp Uso de bp005 para el control de patógenos de planta
WO2018153730A1 (en) 2017-02-21 2018-08-30 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018165091A1 (en) 2017-03-07 2018-09-13 Bayer Cropscience Lp Hppd variants and methods of use
MX2019011623A (es) * 2017-03-30 2019-11-18 Monsanto Technology Llc Sistemas y metodos de uso para utilizar en la identificacion de multiples ediciones genomicas y predecir los efectos acumulados de las ediciones genomicas identificadas.
WO2018184970A1 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2018188962A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
BR112019021938A2 (pt) 2017-04-21 2020-05-05 Bayer Cropscience Lp método de melhoria de segurança de cultivos
WO2018202491A1 (en) 2017-05-04 2018-11-08 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
JP7160487B2 (ja) 2017-05-04 2022-10-25 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア 植物病原菌を駆除するための置換５－（ハロアルキル）－５－ヒドロキシ－イソオキサゾール
WO2018219797A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Basf Se Substituted oxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
EP3642187A1 (de) 2017-06-19 2020-04-29 Basf Se 2-[[5-(trifluoromethyl)-1,2,4-oxadiazol-3-yl]aryloxy](thio)acetamide zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen
WO2019025250A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR COMBATING PHYTOPATHOGENIC FUNGI
WO2019038042A1 (en) 2017-08-21 2019-02-28 Basf Se SUBSTITUTED TRIFLUOROMETHYLOXADIAZOLES FOR THE CONTROL OF PHYTOPATHOGENIC FUNGI
US11076596B2 (en) 2017-09-18 2021-08-03 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019068811A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Bayer Aktiengesellschaft COMPOSITIONS COMPRISING FLUOPYRAM AND TIOXAZAFENE
US20210032651A1 (en) 2017-10-24 2021-02-04 Basf Se Improvement of herbicide tolerance to hppd inhibitors by down-regulation of putative 4-hydroxyphenylpyruvate reductases in soybean
BR112020008092A2 (pt) 2017-10-24 2020-09-15 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC método para conferir tolerância a um herbicida e planta de soja transgênica
US11147275B2 (en) 2017-11-23 2021-10-19 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
AU2018375795A1 (en) 2017-11-30 2020-07-02 Boragen, Inc. Benzoxaborole compounds and formulations thereof
WO2019121143A1 (en) 2017-12-20 2019-06-27 Basf Se Substituted cyclopropyl derivatives
WO2019137995A1 (en) 2018-01-11 2019-07-18 Basf Se Novel pyridazine compounds for controlling invertebrate pests
BR112020013680A2 (pt) 2018-01-29 2020-12-01 BASF Agro B.V. formulações agroquímicas, uso de formulações e método para controlar insetos
US11926835B1 (en) 2018-01-29 2024-03-12 Inari Agriculture Technology, Inc. Methods for efficient tomato genome editing
WO2019154665A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
CA3088722A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 Basf Se New pyridine carboxamides
UA126830C2 (uk) 2018-03-01 2023-02-08 Басф Агро Б.В. Фунгіцидні композиції мефентрифлуконазолу
WO2019219464A1 (en) 2018-05-15 2019-11-21 Basf Se Substituted trifluoromethyloxadiazoles for combating phytopathogenic fungi
WO2019224092A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Basf Se Pesticidally active c15-derivatives of ginkgolides
US20210323950A1 (en) 2018-06-04 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Herbicidally active bicyclic benzoylpyrazoles
CN112867494A (zh) 2018-08-18 2021-05-28 博瑞金股份有限公司 取代苯并氧杂硼杂环戊烯的固体形式和其组合物
EP3613736A1 (de) 2018-08-22 2020-02-26 Basf Se Substituierte glutarimidderivate
EP3628158A1 (de) 2018-09-28 2020-04-01 Basf Se Pestizide zusammensetzung die eine mesoionische verbindung und ein biopestizid enthält
WO2020083662A1 (en) 2018-10-23 2020-04-30 Basf Se Tricyclic pesticidal compounds
EP3643705A1 (de) 2018-10-24 2020-04-29 Basf Se Pestizidverbindungen
EP3670501A1 (de) 2018-12-17 2020-06-24 Basf Se Substituierte [1,2,4]triazol-verbindungen als fongizide
JP2022517947A (ja) 2019-01-11 2022-03-11 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピア １－（１，２－ジメチルプロピル）－ｎ－エチル－５－メチル－ｎ－ピリダジン－４－イル－ピラゾール－４－カルボキサミドの結晶形態
EP3696177A1 (de) 2019-02-12 2020-08-19 Basf Se Heterocyclische verbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
CA3139524A1 (en) 2019-05-10 2020-11-19 Bayer Cropscience Lp Active compound combinations
EP3769623A1 (de) 2019-07-22 2021-01-27 Basf Se Mesoionische imidazolverbindungen und derivate zur bekämpfung von tierischen schädlingen
CN113923987A (zh) 2019-05-29 2022-01-11 巴斯夫欧洲公司 用于防除动物害虫的介离子咪唑鎓化合物和衍生物
WO2020244970A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se New carbocyclic pyridine carboxamides
CN113993847A (zh) 2019-06-06 2022-01-28 巴斯夫欧洲公司 杀真菌的n-(吡啶-3-基)羧酰胺类
WO2020244969A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Basf Se Pyridine derivatives and their use as fungicides
EP3766879A1 (de) 2019-07-19 2021-01-20 Basf Se Pestizide pyrazolverbindungen
TW202118392A (zh) 2019-07-22 2021-05-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之５－胺基取代的吡唑及三唑
UY38796A (es) 2019-07-23 2021-02-26 Bayer Ag Novedosos compuestos de heteroaril-triazol como plaguicidas
US20220264880A1 (en) 2019-07-23 2022-08-25 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
WO2021022069A1 (en) 2019-08-01 2021-02-04 Bayer Cropscience Lp Method of improving cold stress tolerance and crop safety
EP3701796A1 (de) 2019-08-08 2020-09-02 Bayer AG Wirkstoffkombinationen
US20220403410A1 (en) 2019-09-26 2022-12-22 Bayer Aktiengesellschaft Rnai-mediated pest control
WO2021063735A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se New bicyclic pyridine derivatives
WO2021063736A1 (en) 2019-10-02 2021-04-08 Basf Se Bicyclic pyridine derivatives
CN114760842A (zh) 2019-10-02 2022-07-15 拜耳公司 包含脂肪酸的活性化合物结合物
US20230028441A1 (en) 2019-10-09 2023-01-26 Bayer Aktiengesellschaft Novel heteroaryl-triazole compounds as pesticides
UY38910A (es) 2019-10-09 2021-05-31 Bayer Ag Compuestos de heteroarilo-triazol como pesticidas, formulaciones, usos y métodos de uso de los mismos
WO2021089673A1 (de) 2019-11-07 2021-05-14 Bayer Aktiengesellschaft Substituierte sulfonylamide zur bekämpfung tierischer schädlinge
WO2021097162A1 (en) 2019-11-13 2021-05-20 Bayer Cropscience Lp Beneficial combinations with paenibacillus
TW202134226A (zh) 2019-11-18 2021-09-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
EP4061131A1 (de) 2019-11-18 2022-09-28 Bayer Aktiengesellschaft Wirkstoffkombinationen mit fettsäuren
TW202136248A (zh) 2019-11-25 2021-10-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基-三唑化合物
EP4097125A1 (de) 2020-01-31 2022-12-07 Pairwise Plants Services, Inc. Unterdrückung der schattenvermeidungsreaktion bei pflanzen
BR112022016400A2 (pt) 2020-02-18 2022-10-25 Bayer Ag Compostos inovadores de heteroaril-triazol como pesticidas
EP3708565A1 (de) 2020-03-04 2020-09-16 Bayer AG Pyrimidinyloxyphenylamidine und ihre verwendung als fungizide
EP4135512A1 (de) 2020-04-16 2023-02-22 Pairwise Plants Services, Inc. Verfahren zur steuerung der meristemgrösse zur pflanzenverbesserung
WO2021209490A1 (en) 2020-04-16 2021-10-21 Bayer Aktiengesellschaft Cyclaminephenylaminoquinolines as fungicides
TW202200570A (zh) 2020-04-21 2022-01-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之經２—（雜）芳基取代的稠合雜環衍生物
US20230157287A1 (en) 2020-04-28 2023-05-25 Basf Se Pesticidal compounds
EP3903582A1 (de) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Verwendung von verbindungen vom strobilurintyp zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l in dem mitochondrialen cytochrom-b-protein enthalten, das resistenz gegenüber qo-inhibitoren ii verleiht
EP3903584A1 (de) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Verwendung von verbindungen vom strobilurintyp zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l in dem mitochondrialen cytochrom-b-protein enthalten, das resistenz gegenüber qo-inhibitoren iv verleiht
EP3903581A1 (de) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Verwendung von strobilurin-verbindungen zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l im mitochondrialen cytochrom b-protein enthalten, zur vermittlung einer resistenz gegen qo-inhibitoren i
EP3903583A1 (de) 2020-04-28 2021-11-03 Basf Se Verwendung von verbindungen vom strobilurintyp zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l in dem mitochondrialen cytochrom-b-protein enthalten, das resistenz gegenüber qo-inhibitoren iii verleiht
TW202208347A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 德商拜耳廠股份有限公司 作為殺蟲劑之新穎雜芳基三唑化合物
JP2023538713A (ja) 2020-05-06 2023-09-11 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 殺真菌性化合物としてのピリジン（チオ）アミド
JP2023525349A (ja) 2020-05-12 2023-06-15 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 殺真菌性化合物としてのトリアジンおよびピリミジン（チオ）アミド化合物
EP3909950A1 (de) 2020-05-13 2021-11-17 Basf Se Heterocyclische verbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
US20230192617A1 (en) 2020-05-19 2023-06-22 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Azabicyclic(thio)amides as fungicidal compounds
CN116096230A (zh) 2020-06-02 2023-05-09 成对植物服务股份有限公司 控制分生组织大小以改良作物的方法
BR112022024394A2 (pt) 2020-06-04 2023-01-31 Bayer Ag Heterociclil pirimidinas e triazinas como novos fungicidas
WO2021249800A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Basf Se Substituted [1,2,4]triazole compounds as fungicides
EP3945089A1 (de) 2020-07-31 2022-02-02 Basf Se Verwendung von verbindungen vom strobilurintyp zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l in dem mitochondrialen cytochrom-b-protein enthalten, das resistenz gegenüber qo-inhibitoren v verleiht
JP2023529475A (ja) 2020-06-10 2023-07-10 バイエル、アクチエンゲゼルシャフト 新規殺菌剤としてのアザビシクリル置換複素環
MX2022015896A (es) 2020-06-17 2023-02-22 Pairwise Plants Services Inc Métodos para el control del tamaño del meristemo para la mejora de cultivos.
BR112022025344A2 (pt) 2020-06-18 2023-01-03 Bayer Ag Composição para uso na agricultura
CN116157017A (zh) 2020-06-18 2023-05-23 拜耳公司 作为杀菌剂用于作物保护的3-(哒嗪-4-基)-5,6-二氢-4h-1,2,4-噁二嗪衍生物
UY39276A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag Uso de compuestos de 1,3,4–oxadiazol–2–ilpirimidina para controlar microorganismos fitopatógenos, métodos de uso y composiciones.
UY39275A (es) 2020-06-19 2022-01-31 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazol pirimidinas como fungicidas, procesos e intermediarios para su preparación, métodos de uso y usos de los mismos
WO2021255089A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,3,4-oxadiazole pyrimidines and 1,3,4-oxadiazole pyridines as fungicides
BR112022025692A2 (pt) 2020-06-19 2023-02-28 Bayer Ag 1,3,4-oxadiazóis e seus derivados como fungicidas
EP3929189A1 (de) 2020-06-25 2021-12-29 Bayer Animal Health GmbH Neue heteroarylsubstituierte pyrazinderivate als pestizide
US20230247994A1 (en) 2020-07-02 2023-08-10 Bayer Aktiengesellschaft Heterocyclene derivatives as pest control agents
EP3939961A1 (de) 2020-07-16 2022-01-19 Basf Se Strobilurintyp und deren verwendung zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen
WO2022017836A1 (en) 2020-07-20 2022-01-27 BASF Agro B.V. Fungicidal compositions comprising (r)-2-[4-(4-chlorophenoxy)-2-(trifluoromethyl)phenyl]-1- (1,2,4-triazol-1-yl)propan-2-ol
EP3970494A1 (de) 2020-09-21 2022-03-23 Basf Se Verwendung von verbindungen vom strobilurintyp zur bekämpfung von phytopathogenen pilzen, die eine aminosäuresubstitution f129l in dem mitochondrialen cytochrom-b-protein enthalten, das resistenz gegenüber qo-inhibitoren viii verleiht
WO2022033991A1 (de) 2020-08-13 2022-02-17 Bayer Aktiengesellschaft 5-amino substituierte triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022053453A1 (de) 2020-09-09 2022-03-17 Bayer Aktiengesellschaft Azolcarboxamide als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022058327A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Bayer Aktiengesellschaft Substituted ureas and derivatives as new antifungal agents
EP3974414A1 (de) 2020-09-25 2022-03-30 Bayer AG 5-amino substituierte pyrazole und triazole als schädlingsbekämpfungsmittel
WO2022089969A1 (en) 2020-10-27 2022-05-05 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
WO2022090071A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Use of mefenpyr-diethyl for controlling phytopathogenic fungi
WO2022090069A1 (en) 2020-11-02 2022-05-05 Basf Se Compositions comprising mefenpyr-diethyl
WO2022106304A1 (en) 2020-11-23 2022-05-27 BASF Agro B.V. Compositions comprising mefentrifluconazole
AU2021403544A1 (en) 2020-12-14 2023-06-29 Basf Se Sulfoximine pesticides
EP3915971A1 (de) 2020-12-16 2021-12-01 Bayer Aktiengesellschaft Phenyl-s(o)n-phenylamidine und verwendung davon als fungizide
WO2022129188A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft 1,2,4-oxadiazol-3-yl pyrimidines as fungicides
WO2022129196A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft Heterobicycle substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
EP4262394A1 (de) 2020-12-18 2023-10-25 Bayer Aktiengesellschaft Verwendung von dhodh-inhibitor zur bekämpfung phytopathogener pilze in nutzpflanzen
WO2022129190A1 (en) 2020-12-18 2022-06-23 Bayer Aktiengesellschaft (hetero)aryl substituted 1,2,4-oxadiazoles as fungicides
EP4036083A1 (de) 2021-02-02 2022-08-03 Bayer Aktiengesellschaft 5-oxy substituierte hetereozyklen, als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4043444A1 (de) 2021-02-11 2022-08-17 Basf Se Substituierte isoxazolinderivate
EP4291641A1 (de) 2021-02-11 2023-12-20 Pairwise Plants Services, Inc. Verfahren und zusammensetzungen zur modifizierung des cytokininoxidasespiegels in pflanzen
CN117203227A (zh) 2021-02-25 2023-12-08 成对植物服务股份有限公司 用于修饰植物中根结构的方法和组合物
BR112023019788A2 (pt) 2021-03-30 2023-11-07 Bayer Ag 3-(hetero)aril-5-clorodifluorometil-1,2,4-oxadiazol como fungicida
WO2022207494A1 (en) 2021-03-30 2022-10-06 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
CN117479836A (zh) 2021-05-03 2024-01-30 巴斯夫欧洲公司 提高农药微生物的农药有效性的添加剂
CN117597344A (zh) 2021-05-06 2024-02-23 拜耳公司 烷基酰胺取代的环状咪唑及其作为杀虫剂的用途
TW202311258A (zh) 2021-05-12 2023-03-16 德商拜耳廠股份有限公司 作為除蟲劑之經2-(雜)芳基取代之稠合雜環衍生物
EP4091451A1 (de) 2021-05-17 2022-11-23 BASF Agro B.V. Zusammensetzungen mit mefentrifluconazol
KR20240008857A (ko) 2021-05-18 2024-01-19 바스프 에스이 살진균제로서의 신규한 치환된 피리딘
IL308529A (en) 2021-05-18 2024-01-01 Basf Se New converted pyridines as fungicides
EP4341257A1 (de) 2021-05-18 2024-03-27 Basf Se Neue substituierte chinoline als fungizide
US20220411813A1 (en) 2021-06-17 2022-12-29 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of growth regulating factor family transcription factors in soybean
UY39827A (es) 2021-06-24 2023-01-31 Pairwise Plants Services Inc Modificación de genes de ubiquitina ligasa e3 hect para mejorar los rasgos de rendimiento
US20230027468A1 (en) 2021-07-01 2023-01-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing root system development
EP4119547A1 (de) 2021-07-12 2023-01-18 Basf Se Triazolverbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
WO2023011957A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Basf Se (3-quinolyl)-quinazoline
CA3227665A1 (en) 2021-08-02 2023-02-09 Wassilios Grammenos (3-pirydyl)-quinazoline
CA3229056A1 (en) 2021-08-12 2023-02-16 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
AU2022326207A1 (en) 2021-08-13 2024-02-15 Bayer Aktiengesellschaft Active compound combinations and fungicide compositions comprising those
US20230063927A1 (en) 2021-08-17 2023-03-02 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying cytokinin receptor histidine kinase genes in plants
EP4140986A1 (de) 2021-08-23 2023-03-01 Basf Se Pyrazolverbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
WO2023025682A1 (en) 2021-08-25 2023-03-02 Bayer Aktiengesellschaft Novel pyrazinyl-triazole compounds as pesticides
EP4140995A1 (de) 2021-08-27 2023-03-01 Basf Se Pyrazin verbindungen zur kontrolle von wirbellosen schädlingen
US20230074699A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of ubiquitin binding peptidase genes in plants for yield trait improvement
AR126938A1 (es) 2021-09-02 2023-11-29 Pairwise Plants Services Inc Métodos y composiciones para mejorar la arquitectura de las plantas y los rasgos de rendimiento
EP4144739A1 (de) 2021-09-02 2023-03-08 Bayer Aktiengesellschaft Anellierte pyrazole als schädlingsbekämpfungsmittel
EP4151631A1 (de) 2021-09-20 2023-03-22 Basf Se Heterocyclische verbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
WO2023049720A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for reducing pod shatter in canola
WO2023060028A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Pairwise Plants Services, Inc. Methods for improving floret fertility and seed yield
AR127300A1 (es) 2021-10-07 2024-01-10 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de la flor y el rendimiento de semillas
WO2023072670A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors x
WO2023072671A1 (en) 2021-10-28 2023-05-04 Basf Se Use of strobilurin type compounds for combating phytopathogenic fungi containing an amino acid substitution f129l in the mitochondrial cytochrome b protein conferring resistance to qo inhibitors ix
WO2023078915A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether (thio)amides as fungicidal compounds
WO2023099445A1 (en) 2021-11-30 2023-06-08 Bayer Aktiengesellschaft Bis(hetero)aryl thioether oxadiazines as fungicidal compounds
EP4194453A1 (de) 2021-12-08 2023-06-14 Basf Se Pyrazinverbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
AR127904A1 (es) 2021-12-09 2024-03-06 Pairwise Plants Services Inc Métodos para mejorar la fertilidad de floretes y el rendimiento de semillas
EP4198033A1 (de) 2021-12-14 2023-06-21 Basf Se Heterocyclische verbindungen zur bekämpfung von wirbellosen schädlingen
EP4198023A1 (de) 2021-12-16 2023-06-21 Basf Se Pestizidaktive thiosemicarbazonverbindungen
WO2023147526A1 (en) 2022-01-31 2023-08-03 Pairwise Plants Services, Inc. Suppression of shade avoidance response in plants
WO2023148030A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests in corn
WO2023148028A1 (en) 2022-02-01 2023-08-10 Globachem Nv Methods and compositions for controlling pests
WO2023156402A1 (en) 2022-02-17 2023-08-24 Basf Se Pesticidally active thiosemicarbazone compounds
EP4238971A1 (de) 2022-03-02 2023-09-06 Basf Se Substituierte isoxazolinderivate
WO2023168217A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Pairwise Plants Services, Inc. Modification of brassinosteroid receptor genes to improve yield traits
WO2023192838A1 (en) 2022-03-31 2023-10-05 Pairwise Plants Services, Inc. Early flowering rosaceae plants with improved characteristics
WO2023196886A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving resistance to fusarium head blight
WO2023205714A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2023215704A1 (en) 2022-05-02 2023-11-09 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for enhancing yield and disease resistance
WO2023213670A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Crystalline forms of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine
WO2023213626A1 (en) 2022-05-03 2023-11-09 Bayer Aktiengesellschaft Use of (5s)-3-[3-(3-chloro-2-fluorophenoxy)-6-methylpyridazin-4-yl]-5-(2-chloro-4-methylbenzyl)-5,6-dihydro-4h-1,2,4-oxadiazine for controlling unwanted microorganisms
US20230416767A1 (en) 2022-05-05 2023-12-28 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying root architecture and/or improving plant yield traits
WO2024006679A1 (en) 2022-06-27 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for modifying shade avoidance in plants
US20240000031A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
US20240002873A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024028243A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Pyrazolo pesticidal compounds
US20240043857A1 (en) 2022-08-04 2024-02-08 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield traits
WO2024036240A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for controlling meristem size for crop improvement
WO2024054880A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Pairwise Plants Services, Inc. Methods and compositions for improving yield characteristics in plants
EP4342885A1 (de) 2022-09-20 2024-03-27 Basf Se N-(3-(aminomethyl)-phenyl)-5-(4-phenyl)-5-(trifluoromethyl)-4,5-dihydroisoxazol-3-amin-derivate und ähnliche verbindungen als pestizide
WO2024068517A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068520A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068519A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-(hetero)aryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
WO2024068518A1 (en) 2022-09-28 2024-04-04 Bayer Aktiengesellschaft 3-heteroaryl-5-chlorodifluoromethyl-1,2,4-oxadiazole as fungicide
EP4295688A1 (de) 2022-09-28 2023-12-27 Bayer Aktiengesellschaft Wirkstoffkombination

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5094945A (en) 1983-01-05 1992-03-10 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use
US4535060A (en) 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4761373A (en) 1984-03-06 1988-08-02 Molecular Genetics, Inc. Herbicide resistance in plants
US4940835A (en) 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
NZ217113A (en) 1985-08-07 1988-06-30 Monsanto Co Production of eucaryotic plants which are glyphosate resistant, vectors (transformation and expression), chimeric gene and plant cells
US4735649A (en) * 1985-09-25 1988-04-05 Monsanto Company Gametocides
US5068193A (en) 1985-11-06 1991-11-26 Calgene, Inc. Novel method and compositions for introducing alien DNA in vivo
ES2018274T5 (es) 1986-03-11 1996-12-16 Plant Genetic Systems Nv Celulas vegetales resistentes a los inhibidores de glutamina sintetasa, preparadas por ingenieria genetica.
EP0290395B1 (de) 1987-05-05 1994-01-26 Sandoz Ag Pflanzengewebe-Transformation
US4971908A (en) 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5145783A (en) * 1987-05-26 1992-09-08 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US5356799A (en) * 1988-02-03 1994-10-18 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
NZ227835A (en) * 1988-02-03 1992-09-25 Paladin Hybrids Inc Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production
GB8810120D0 (en) * 1988-04-28 1988-06-02 Plant Genetic Systems Nv Transgenic nuclear male sterile plants
EP0348348B1 (de) 1988-06-20 2000-08-09 Novartis AG Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen mit nicht-pflanzlichen Proteinase-Inhibitoren
GB8818706D0 (en) 1988-08-05 1988-09-07 Ici Plc Dna constructs & plants incorporating them
EP0360750A3 (de) 1988-09-22 1991-01-02 Ciba-Geigy Ag Herbizid-tolerante Pflanzen
JPH04504355A (ja) * 1989-02-02 1992-08-06 パラディン　ハイブリッズ　インコーポレーテッド ハイブリッド種子生産の分子的方法
US5550318A (en) * 1990-04-17 1996-08-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
BR9007588A (pt) 1989-08-09 1992-06-30 Dekalb Plant Genetics Processo e composicoes para a producao de plantas monocotiledoneas ferteis,transformadas de maneira estavel,e suas celulas
US7705215B1 (en) * 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
ATE196318T1 (de) * 1989-10-31 2000-09-15 Monsanto Co Promotor für transgene pflanzen
US5641876A (en) 1990-01-05 1997-06-24 Cornell Research Foundation, Inc. Rice actin gene and promoter
AU7182791A (en) 1990-01-05 1991-07-24 Cornell Research Foundation Inc. Rice actin gene and promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
DE4013099A1 (de) 1990-04-25 1991-10-31 Hoechst Ag Verfahren zur transformation somatischer embryonen von nutzpflanzen
EP0469273B1 (de) 1990-06-23 2003-12-10 Bayer CropScience GmbH Fertile transgene Maispflanzen mit artfremdem Gen sowie Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0546090B2 (de) 1990-08-31 2006-07-19 Monsanto Company Glyphosattolerante 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimat-synthasen
US5633435A (en) * 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
WO1992004454A1 (en) * 1990-09-06 1992-03-19 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compounds and constructs for producing male sterile plants
ES2147551T3 (es) 1990-11-23 2000-09-16 Aventis Cropscience Nv Procedimiento para transformar plantas monocotiledoneas.
US5436389A (en) 1991-02-21 1995-07-25 Dekalb Genetics Corp. Hybrid genetic complement and corn plant DK570
DE4126414A1 (de) * 1991-08-09 1993-02-11 Hoechst Ag Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung
US6013859A (en) * 1994-07-14 2000-01-11 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Molecular methods of hybrid seed production
FR2736926B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
FR2736929B1 (fr) * 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn isolee pouvant servir de zone de regulation dans un gene chimere utilisable pour la transformation des plantes
US6476291B1 (en) * 1996-12-20 2002-11-05 New Zealand Institute For Food And Crop Research Limited True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions
WO1997023634A2 (en) * 1995-12-21 1997-07-03 New Zealand Institute For Crop & Food Research Limited Production of true-breeding transgenic seeds from plants heterozygous for transgene insertions
BR9808475A (pt) * 1997-04-03 2000-05-23 Dekalb Genetics Corp Linhagens de milho resistentes à glifosato.
US6750377B1 (en) * 1998-06-19 2004-06-15 Advanta Technology Ltd. Method of breeding glyphosate resistant plants

Also Published As

Publication number Publication date
CA2285618C (en) 2015-07-07
CA2888685A1 (en) 1998-10-08
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WO1998044140A1 (en) 1998-10-08
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ATE364705T1 (de) 2007-07-15
US7314970B2 (en) 2008-01-01
AR012335A1 (es) 2000-10-18
BR9808475A (pt) 2000-05-23
DK0975778T3 (da) 2007-10-08
AR055400A2 (es) 2007-08-22
AU6882298A (en) 1998-10-22
CA2285618A1 (en) 1998-10-08
DE69837916D1 (de) 2007-07-26
EP0975778A1 (de) 2000-02-02
AR055142A2 (es) 2007-08-08
EP0975778B1 (de) 2007-06-13

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