MX2012014066A - Evento de brassica transgenica mon 88302 y metodos para su uso. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona plantas que contienen el evento transgénico MON 88302 que exhibe tolerancia al herbicida glifosato; la invención también proporciona semillas, partes de plantas, células, productos de materia prima y métodos relacionados con el evento; la invención también proporciona moléculas de ADN que son únicas para el evento y que fueron creadas por la inserción de ADN transgénico en el genoma de una planta de Brassica napus.

Description

EVENTO DE BRASSICA TRANSGÉNICA MON 88302 Y MÉTODOS PARA SU USO REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional estadounidense N° 61/351 ,317, presentada el 4 de junio de 2010, que se incorpora a la presente en su totalidad mediante esta referencia.

INCORPORACIÓN DE LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias contenida en el archivo con el nombre "MONS291WO_ST25.txt", que pesa 21 kilobytes (tamaño medido en Microsoft Windows®) y que fue creada el 31 de mayo de 2011 , se adjunta a la presente en formato electrónico y se incorpora a la presente mediante esta referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la biotecnología y la agricultura y, más específicamente con el campo de la plantas de cultivo transgénicas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cultivo de Brassica es importante en muchas partes del mundo! Se pueden aplicar métodos biotecnológicos a estos cultivos para producir cultivos con características mejoradas, como la tolerancia a los herbicidas. La tolerancia a los herbicidas puede lograrse en plantas transgénicas mediante la expresión de un transgén que tenga la capacidad de proporcionar dicha tolerancia. La expresión de un transgén en una planta puede estar influenciada por una combinación de factores, como los elementos reguladores utilizados en el cásete transgénico, la ubicación cromosómica del inserto transgénico y la proximidad de cualquier elemento regulador endógeno cercano al sitio de integración. Por ejemplo, se ha observado que puede haber una amplia variación en el nivel global de expresión transgénica o en el patrón espacial o temporal de la expresión transgénica entre evento producidos de manera similar. Por esta razón, puede ser necesario producir y probar cientos de eventos de transformación de plantas individuales para identificar en última instancia un evento útil para propósitos agrícolas comerciales. Dicho evento, una vez identificado que posee la expresión transgénica y las características moleculares deseadas, puede usarse luego para introgresar la característica en otros fondos genéticos utilizando métodos de mejora vegetal. La progenie resultante contendría el evento transgénico y tendría, por lo tanto, las características de expresión transgénica para esa característica del transformante original. Esto podría utilizarse para producir una cantidad de variedades de cultivo diferentes que contengan la característica mejorada y se adapten de manera adecuada a las condiciones de cultivo locales específicas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona plantas y semillas transgénicas que comprenden el evento MON 88302, del cual se depositó una muestra de semillas representativa con el número de adquisición PTA-10955 en la American Type Culture Collection (ATCC). Las plantas que contienen el evento exhiben una tolerancia comercialmente aceptable a aplicaciones del herbicida glifosato. La invención proporciona retoños de plantas, partes de plantas y células que contienen el evento; moléculas de ADN recombinante relacionadas con el evento y métodos de utilizar estas moléculas; materia prima derivada o que contiene el evento; y métodos para usar el evento.

La invención proporciona una planta, semilla, célula, progenie de planta o parte de planta que contiene el evento y materias primas derivas de una planta, célula, parte de planta o semilla que contiene el evento. Por lo tanto, la invención proporciona una planta, semilla, célula, progenie de planta, parte de planta o materia prima que contiene una molécula de ADN que posee una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8, y fragmentos de estas. La invención proporciona una planta, semilla, célula, progenie de planta o parte de planta que contiene una molécula de ADN recombinante que produce un amplicón que contiene una molécula de ADN de la invención, por ejemplo, en un método de amplificación de ADN.

La invención proporciona moléculas de ADN relacionadas con este evento. Estas moléculas de ADN pueden comprender secuencias de nucleótidos que representan o derivan del unión de la inserción transgénica y el ADN genómico flanqueante del evento MON 88302, y/o una región del ADN genómico que flanquea al ADN insertado, y/o una región del ADN transgénico integrado que flanquea el sitio de inserción, y/o una región del cásete de expresión transgénica integrado, y/o una secuencia contigua de cualquiera de estas regiones. La invención también proporciona moléculas de ADN útiles como cebadores y sondas diagnósticas para el evento. Se proporcionan plantas, células, partes de plantas, materias primas, progenies y semillas que contienen estas moléculas.

La invención proporciona métodos, composiciones y kits útiles para detectar la presencia de ADN derivado del evento. La invención proporciona un método para la detección del evento mediante el contacto de una muestra que contiene ADN con un grupo de cebadores que cuando se utilizan en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico del evento producen un amplicón diagnóstico para el evento, llevando a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos y, de esta manera, produciendo el amplicón y detectando el amplicón. La invención también proporciona un método para la detección del evento mediante el contacto de una muestra que contiene ADN con un sonda que, cuando se utiliza en una reacción de hibridación con ADN genómico del evento, se híbrida con una molécula de ADN específica para el evento, llevando a cabo una reacción de hibridación y detectando la hibridación de la sonda con la molécula de ADN. También se proporcionan kits que comprenden los métodos y composiciones de la invención útiles para detectar la presencia de ADN derivado del evento.

La invención proporciona un método para controlar malas hierbas en un campo cultivando plantas que contienen el evento (es decir, plantando semillas que contienen los eventos) y luego aplicando una dosis eficaz de glifosato que sea capaz de controlar las malas hierbas sin dañar las plantas que contienen el evento.

La invención proporciona métodos para producir una planta y/o semilla que tolera la aplicación de herbicida glifosato mediante el cruce de una planta con tolerancia al glifosato que contiene el evento o que contiene una secuencia selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 con una segunda planta, produciendo de esa manera una semilla, cultivar la semilla para producir progenies de planta, tratar los progenies de plantas con glifosato y seleccionar una progenie de planta que contenga el evento y sea tolerante al glifosato. La invención proporciona métodos para producir una planta y/o semilla que tolera la aplicación de herbicida glifosato mediante la autofertilización de una planta con tolerancia al glifosato que contiene el evento o que contiene una secuencia selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8 produciendo de esa manera una semilla, cultivar la semilla para producir progenies de planta, tratar las progenies de plantas con glifosato y seleccionar una progenie de planta que contenga el evento y sea tolerante al glifosato.

La invención proporciona métodos de determinar la cigosidad de una planta o semilla que contiene el evento, mediante el contacto de una muestra que contiene ADN con un primer grupo de cebadores que, cuando se utilizan en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico del evento MON 88302 producen un amplicón diagnóstico para el evento, llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, lo que produce el amplicón, detectar el amplicón, poner en contacto la muestra con un segundo grupo de cebadores que, cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de plantas produce un segundo amplicón que contiene ADN genómico natural homólogo a la región genómica de una inserción transgénica identificada como el evento MON 88302, llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, lo que produce un segundo amplicón, detectar el segundo amplicón y comparar el primer y el segundo amplicón en una muestra, donde la presencia de ambos amplicones indica que la muestra y, por lo tanto, la planta o semilla es heterocigota para la inserción transgénica.

Los aspectos de la invención que anteceden y otros se volverán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Representación esquemática del evento MON 88302; [A] corresponde a la posición relativa de la región de unión 5'; [B] corresponde a la posición relativa de la región de unión 3'; [C] corresponde a la posición relativa de la región flanqueante y una porción del extremo 5' del ADN transgénico insertado; [D] corresponde a la posición relativa de la región flanqueante 3' y una porción del extremo 3' del ADN transgénico insertado; [E] representa el cásete de expresión transgénica; y [F] representa la secuencia contigua de las secuencias flanqueantes genómicas de Brassica napus y el cásete de expresión transgénica.

Figura 2: Muestra el rendimiento de grano del evento RT73 en comparación con MON 88302 cuando se aplica glifosato en la etapa de cuatro a seis hojas. RT73 se designa como RR1.

Figura 3: Muestra el rendimiento de grano del evento RT73 en comparación con MON 88302 cuando se aplica glifosato cuando sale la primera flor. RT73 se designa como RR1.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEQ ID NO:1 - Una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la secuencia de unión 5' entre el ADN genómico de Brassica napus y el cásete de expresión transgénica integrado. Esta secuencia de nucleótidos corresponde a las posiciones 762 hasta la 821 de la SEQ ID NO:3 ([C], véase la Figura 1 ) y a las posiciones 762 hasta la 821 de la SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:2 — Una secuencia de sesenta nucleótidos que representa la secuencia de unión 3' entre el cásete de expresión integrado y el ADN genómico de Brassica napus. Esta secuencia de nucleótidos corresponde a las posiciones 313 hasta la 372 de la SEQ ID NO:4 ([D], véase la Figura 1) y a las posiciones 5189 hasta la 5248 de la SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:3 -La secuencia 5' que flanquea el ADN insertado del evento MON 88302 hasta e incluyendo una región de ADN transgénico. Las posiciones de nucleótidos 762 hasta la 821 de la SEQ ID NO:3 corresponden a las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 60 de la SEQ ID NO. ; las posiciones de nucleótidos 742 hasta 841 de la SEQ ID NO:3 corresponden a las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 100 de la SEQ ID NO:7; y las posiciones de nucleótidos 792 hasta la 956 de la SEQ ID NO:3 corresponden a las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 165 de la SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO:4 -La secuencia 3' que flanquea el ADN insertado del evento MON 88302 hasta e incluyendo una región de ADN transgénico.

Las posiciones de nucleótidos 313 hasta la 372 de la SEQ ID NO:4 corresponden a las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 60 de la SEQ ID NO:2¡ las posiciones de nucleótidos 293 hasta 392 de la SEQ ID NO:4 corresponden a las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 100 de la SEQ ID NO:8; y las posiciones de nucleótidos 1 hasta la 342 de la SEQ ID NO:4 corresponden a las posiciones de nucleótidos 4086 hasta la 4427 de la SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO:5 - La secuencia del cásete de expresión transgénica integrado confiriendo tolerancia al herbicida glifosato. SEQ ID NO:5 corresponde a las posiciones de nucleótidos 792 hasta la 5218 de la SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:6 - Una secuencia de nucleótidos que representa el cóntigo de la secuencia 5' que flanquea el ADN insertado del evento MON 88302 (SEQ ID NO:3), la secuencia del cásete de expresión integrado (SEQ ID NO:5) y la secuencia 3' que flanquea el ADN insertado del evento MON 88302 (SEQ ID NO:4).

SEQ ID NO:7 - Una secuencia de 100 nucleótidos que representa la secuencia de unión 5' entre el ADN genómico de Brassica napus y el cásete de expresión transgénica integrado. Esta secuencia de nucleótidos corresponde a las posiciones 742 hasta la 841 de la SEQ ID NO:3 ([C], véase la Figura 1) y a las posiciones 742 hasta la 841 de la SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:8 - Una secuencia de 100 nucleótidos que representa la secuencia de unión 3' entre el cásete de expresión integrado y el ADN genómico de Brassica napus. Esta secuencia de nucleótidos corresponde a las posiciones 293 hasta la 392 de la SEQ ID NO:4 ([D], véase la Figura 1) y a las posiciones 5169 hasta la 5268 de la SEQ ID NO:6.

SEQ ID NO:9 - Cebador SQ20901 utilizado para identificar el evento MON 88302. El cebador SQ20901 es complementario del cásete de expresión insertado en la región cerca del límite de inserción del transgén 3'. Un amplicón producido usando la combinación de cebadores SQ20901 y SQ23770 (SEQ ID NO: 10) es un resultado positivo para la presencia del evento MON 88302.

La SEQ ID NO:10 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ23770 y utilizado para identificar el evento MON 88302. El cebador SQ23770 es complementario de una región 3' que flanquea el cásete de expresión insertado y cerca del límite de inserción de ADN transgénico. Un amplicón producido usando la combinación de cebadores SQ20901 (SEQ ID NO:9) y SQ23770 es un resultado positivo para la presencia del evento MON 88302.

La SEQ ID NO: 1 1 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador PB10164 y utilizado para identificar el evento MON 88302. Es complementario de una región 3' que flanquea el cásete de expresión insertado y cercano al límite de inserción de ADN transgénico. Este cebador es un oligonucleótido sintético marcado con 6FAM™. La liberación de una señal fluorescente en una reacción de amplificación usando los cebadores SQ20901 y SQ23770 (SEQ ID NOs: 9-10) en combinación con la sonda PB10164 marcada con 6FAM™ es diagnóstica del evento MON 88302 en un ensayo TAQMAN®.

La SEQ ID NO: 12 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ21948 y utilizado para identificar la cigosidad del evento MON 88302.

La SEQ ID NO: 13 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ24635 y utilizado para identificar la cigosidad de Brassica napus de tipo salvaje.

La SEQ ID NO: 14 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ22176 y utilizado para identificar la cigosidad del evento MON 88302 y de Brassica napus de tipo salvaje.

SEQ ID NO: 15 es la secuencia de una sonda (PB4213) para un ensayo de cigosidad del evento MON 88302.

SEQ ID NO: 16 es la secuencia de una sonda (PB10787) para un ensayo de cigosidad de Brassica napus de tipo salvaje.

La SEQ ID NO.17 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ2563 y utilizado como un control interno en los ensayos TAQMAN®.

La SEQ ID NO: 18 es la secuencia de un cebador denominado como Cebador SQ2564 y utilizado como un control interno en los ensayos TAQMAN®.

La SEQ ID NO: 19 es la secuencia de una sonda de oligonucleótidos sintético marcado con VIC™ (PB0751) utilizado como un control interno en los ensayos TAQMAN®.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Las siguientes definiciones y métodos se proporcionan para definir mejor la presente invención y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se indique de otra manera, los términos deben entenderse según el uso convencional dado por los expertos en la técnica pertinente.

Como se utiliza en la presente, el término "comprende" significa "incluye, de modo no taxativo".

La presente invención proporciona el evento transgénico MON 88302. El término "evento", tal como se usa en la presente, se refiere a moléculas de ADN producidas como resultado de insertar ADN transgénico en el .genoma de una planta en una ubicación particular en un cromosoma. El evento MON 88302 se refiere las moléculas de ADN producidas como resultado de la inserción de ADN transgénico que posee una secuencia proporcionada en la presente como SEQ ID NO:5 en una ubicación en particular en el genoma A de Brassica napus en el grupo de enlace N4. Las plantas y semillas que contienen el evento MON 88302 también se proporcionan en la presente invención. Se ha depositado una muestra de semillas que contiene MON 88302 en la American Type Culture Collection (ATCC) con el número de adquisición PTA-10955. Las plantas que contienen el evento MON 88302 exhiben una tolerancia comercialmente aceptable a aplicaciones del herbicida glifosato.

Una planta que comprende el evento puede referirse al transformante original que incluye el transgén insertado en la ubicación en particular en el genoma de la planta. Una planta que comprende el evento puede también referirse a progenies del transformante original que incluyen el transgén insertado en la ubicación en particular en el genoma de la planta. Dicha progenie puede producirse mediante autofecundación o cruzamiento entre el transformante o su progenie y otra planta. La otra planta puede ser una planta transgénica que contiene el mismo transgén o uno diferente y/o una planta no transgénica, tal como una de una variedad diferente. Incluso luego del retrocruzamiento repetido con un progenitor recurrente, el ADN insertado y el ADN flanqueante del progenitor transformado está presente en la progenie de la cruza en la misma ubicación genómica.

El evento transgénico MON 88302 fue creado por la inserción de ADN transgénico (proporcionado en la presente como SEQ ID NO:5) en el grupo de enlace N4 del genoma A de una planta Brassica napus. Brassica napus se conoce comúnmente como colza y los cultivares específicos pueden denominarse cañóla. Tal como se usa en la presente, el término "cañóla" o "planta de cañóla" se refiere a una planta Brassica capaz de ser usada para producir aceite de cañóla (es decir, aceite que cumple con la designación de calidad específica de contener menos de 2% de ácido erúcico) e incluye variedades de Brassica napus, Brassica napobrassica, Brassica rapa, Brassica júncea y Brassica campestris. Debido a que Brassica napus es un alotetraploide que surge de la cruza y conservación de ambos genomas de Brassica rapa (previamente Brassica campestris) y Brassica olerácea, puede utilizarse una planta de Brassica napus que contiene el evento transgénico MON 88302 con métodos de reproducción para introducir el evento MON 88302 y, por lo tanto, la característica de tolerancia al glifosato, en otros miembros del género Brassica. Los ejemplos de miembros del género Brassica útiles en la práctica de los métodos de la invención incluyen, de modo no taxativo, Brassica júncea, Brassica napobrassica, Brassica olerácea, Brassica carinata, Brassica napus, Brassica rapa, y Brassica campestris, así como también cualquier otra planta que pertenecen al género Brassica que permiten la reproducción entre especies Brassica.

Una molécula de ADN que contiene el evento MON 88302 se refiere a una molécula de ADN que contiene al menos una porción del ADN transgénico insertado (proporcionado como la SEQ ID NO:5) y al menos una porción del ADN genómico flanqueante inmediatamente adyacente al ADN insertado. Como tal, una molécula de ADN que contiene el evento MON 88302 tiene una secuencia de nucleótidos que representa al menos una porción del inserto de ADN transgénico y al menos una porción de la región particular del genoma de la planta dentro de la cual se insertó el ADN transgénico. El arreglo del ADN insertado en el evento MON 88302 en relación con el genoma de planta circundante es específico y único para el evento MON 88302 y como tal la secuencia de nucleótidos de dicha molécula de ADN es descriptiva e identifica el evento MON 88302. Los ejemplos de la secuencia de dicha molécula de ADN se proporcionan en la presente como SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. Esta molécula de ADN también es una parte integral del cromosoma de una planta que comprende el evento MON 88302 y puede pasarse a la progenie de la planta.

El evento MON 88302 confiere tolerancia al herbicida glifosato aplicado a la planta. "Glifosato" se refiere a N-fosfonometil-glicina y sus sales. El glifosato es un herbicida que tiene actividad en un amplio espectro de especies vegetales. Cuando se aplica a una superficie de una planta, el glifosato se mueve sistemáticamente a través de la planta. El glifosato es fototóxico debido a su inhibición de la vía de ácido siquímico, lo que proporciona un precursor para la síntesis de aminoácidos aromáticos.

Tal como se usa en la presente, el término "recombinante" se refiere a una forma de ADN y/o proteína y/o un organismo que no se encontraría normalmente en la naturaleza y como tal fue creado por la intervención humana. Tal intervención humana puede producir una molécula de ADN recombinante y/o una planta recombinante. Tal como se usa en la presente, una "molécula de ADN recombinante" es una molécula de ADN que comprende una combinación de moléculas de ADN que no se encontrarían juntas en la naturaleza y son el resultado de la intervención humana, por ejemplo, una molécula de ADN que está compuesta por una combinación de al menos dos moléculas de ADN heterólogas la una con la otra, y/o una molécula de ADN que se encuentra sintetizada artificialmente y comprende una secuencia de polinucleótidos que se aparta de la secuencia de polinucleótidos que normalmente existiría en la naturaleza, y/o una molécula de ADN que comprende un transgén incorporado artificialmente en un ADN genómico de una célula hospedadora y el ADN flanqueante asociado del genoma de la célula hospedadora. Un ejemplo de una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN descrita en la presente que resulta de la inserción del transgén en el genoma de Brassica napus, que puede resultar en última instancia en la expresión de un ARN recombinante y/o molécula de proteína en ese organismo. Tal como se usa en la presente, una "planta recombinante" es una planta que no existiría normalmente en la naturaleza, es el resultado de la intervención humana, y contiene un transgén y/o molécula de ADN heteróloga incorporada en su genoma. Como resultado de dicha alteración genómica, la planta recombinante es claramente diferente de la planta de tipo salvaje relacionada. Un ejemplo de una planta recombinante es una planta de la que se describe en la presente que comprende el evento MON 88302.

Tal como se usa en la presente, el término "transgén" se refiere a una molécula de polinucleótidos que se incorpora artificialmente en el genoma de una célula hospedadora. Tal transgén puede ser heterólogo a la célula hospedadora. El término "planta transgénica" se refiere a una planta que comprende dicho transgén.

Tal como se usa en la presente, el término "heterólogo" se refiere a una primera molécula que no se encuentra normalmente en combinación con una segunda molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una molécula puede derivar de una primera especie e insertarse en el genoma de una segunda especie. La molécula sería, por lo tanto, heteróloga al hospedador y se incorporaría artificialmente en el genoma de una célula hospedadora.

Tal como se usa en la presente, el término "quimérico" se refiere a una molécula de ADN única producida mediante la fusión de una primera molécula de ADN con una segunda molécula de ADN, donde ni la primera ni la segunda molécula de ADN se encontraría normalmente es esa configuración, es decir, fusionada la una a la otra. La molécula de ADN quimérica es, por lo tanto, una nueva molécula de ADN que no se encontraría normalmente de otra manera en la naturaleza.

La presente invención proporciona moléculas de ADN y sus secuencias de nucleótidos correspondientes. Tal como se usa en la presente, los términos "secuencia de ADN", "secuencia de nucleótidos" y "secuencia de polinucleótidos" se refieren a la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN, presentadas normalmente desde el extremo 5' (corriente arriba) hasta el extremo 3' (corriente abajo). La nomenclatura utilizada en la presente es la requerida por el Título 37 del Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos § 1.822 y establecida en las tablas de la norma WIPO ST.25 (1998), Apéndice 2, Tablas 1 y 3. La presente invención se describe haciendo referencia a solo una cadena de las dos cadenas de secuencia de nucleótidos que se proporcionan en el evento transgénico MON 88302. Por lo tanto, mediante implicación y derivación, las secuencias complementarias, también denominadas en la técnica como el complemento completo o las secuencias complementarias inversas, se encuentran dentro del alcance de la presente invención y se pretende que estén, por lo tanto, dentro del alcance de la materia reivindicada.

La secuencia de nucleótidos que corresponde a la secuencia de nucleótidos completa del ADN transgénico insertado y segmentos sustanciales del ADN genómico de Brassica napus que flanquea cualquier extremo del ADN transgénico insertado se proporciona en la presente como la SEQ ID NO:6. Una subsección de esta se inserta en el ADN transgénico proporcionado como SEQ ID NO:5. La secuencia de nucleótidos del ADN genómico que flanquea el extremo 5' del ADN transgénico insertado y una porción del extremo 5' del ADN insertado se proporcionan en la presente como SEQ ID NO:3. La secuencia de nucleótidos del ADN genómico que flanquea el extremo 3' del ADN transgénico insertado y una porción del extremo 3* del ADN insertado se proporcionan en la presente como SEQ ID NO:4. La región que abarca la ubicación donde el ADN transgénico se conecta y se une al ADN genómico se denomina en la presente como la unión. Una "secuencia de unión" o "región de unión" se refiere a una secuencia de ADN y/o molécula de ADN correspondiente que abarca el ADN transgénico insertado y el ADN genómico flanqueante adyacente. Los ejemplos de una secuencia de unión del evento ON 88302 se proporcionan en la presente como SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. La identificación de una de estas secuencias de unión en una molécula de nucleótidos derivada de una planta o semilla de Brassica hace concluir que el ADN se obtuvo del evento ON 88302 y es diagnóstico de la presencia en una muestra de ADN del evento MON 88302. SEQ ID NO:1 es una secuencia de 60 nucleótidos que abarca la unión entre el ADN genómico y el extremo 5' del ADN insertado. SEQ ID NO:7 es una secuencia de 100 nucleótidos que abarca la unión entre el ADN genómico y el extremo 5' del ADN insertado. SEQ ID NO:2 es una secuencia de 60 nucleótidos que abarca la unión entre el ADN genómico y el extremo 3' del ADN insertado. SEQ ID NO:8 es una secuencia de 100 nucleótidos que abarca la unión entre el ADN genómico y el extremo 3' del ADN insertado. Cualquier segmento de ADN derivado del evento transgénico MON 88302 que incluye SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:7 se encuentra dentro del alcance de las presente invención. Cualquier segmento de ADN derivado del evento transgénico MON 88302 que incluye SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:8 se encuentra dentro del alcance de las presente invención. Además, cualquier polinucleótido que comprende una secuencia complementaria a cualquiera de las secuencias descritas en este párrafo se encuentra dentro del alcance la presente invención. La Figura 1 ilustra la disposición física de las SEQ ID NOs: 1-5 y SEQ ID NOs: 7-8 en relación con la SEQ ID NO:6 dispuesta de 5' a 3'. La presente invención también proporciona una molécula de ácido nucleico que comprende una molécula de ADN que tiene una secuencia que es al menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la longitud completa de la SEQ ID NO:6.

La presente invención proporciona moléculas de ADN de ejemplo que pueden utilizarse como cebadores o sondas para diagnosticar la presencia de ADN derivado del evento MON 88302 en una muestra. Dichos cebadores o sondas son específicos para una secuencia de ácidos nucleicos diana y como tales son útiles para la identificación de la secuencia de ácido nucleico del evento MON 88302 por medio de los métodos de la invención descritos en la presente.

Un "cebador" es típicamente un polinucleótido altamente purificado, asilado que está designado para su uso en métodos de hibridación específicos que implican la amplificación térmica. Se puede utilizar un par de cebadores con ADN molde, tal como una muestra de ADN genómico de Brassica napus, en una amplificación térmica, tal como una reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para producir un amplicón, donde el amplicón producido a partir de tal reacción tendría una secuencia de ADN correspondiente a la secuencia del ADN molde localizado entre los dos sitios donde los cebadores se hibridaron con el molde. Tal como se usa en la presente, un "amplicón" es una pieza o fragmento de ADN que ha sido sintetizado mediante el uso de técnicas de amplificación, es decir, el producto de una reacción de amplificación. En una modalidad de la invención, un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 comprende una secuencia que no se encuentra naturalmente en el genoma de Brassica napus. Un amplicón de la presente invención comprende al menos alrededor de 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, y complementos de estas. Un cebador se diseña típicamente para que se hibride con una cadena de ADN diana complementaria para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y la presencia del cebador es un punto de reconocimiento para que una polimerasa comience la extensión del cebador (es decir, la polimerización de nucleótidos adicionales en una molécula de polinucleótidos que se extiende}) utilizando como molde la cadena de ADN diana. Se pretende que los pares de cebadores, como se utilizan en la presente invención, se refieran al uso de dos cebadores que se unen a cadenas opuestas de un segmento de nucleótidos de cadena doble con el fin de amplificar de forma lineal el segmento de polinucleótidos entre las posiciones a las que se dirige la unión de miembros individuales del par de cebadores, típicamente en una reacción de amplificación térmica u otros métodos de amplificación de ácidos nucleicos convencionales. Las moléculas de ADN de ejemplo útiles como cebadores se proporcionan como las SEQ ID NOs: 9-10. El par de cebadores se proporciona como la SEQ ID NO:9 y la SEQ ID NO: 10 puede utilizarse como una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN, y ambas moléculas son cada una de longitudes suficientes de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6 o complementos de estas para funcionar como cebadores de ADN de manera que, cuando se utilizan juntas en una reacción de amplificación térmica con ADN molde derivado del evento MON 88302, se produciría un amplicón que es específico y único para la porción 3' del evento transgénico MON 88302. Este par de cebadores de ejemplo puede utilizarse para amplificar una región de unión 3' diagnóstica del evento MON 88302. De manera similar, la invención proporciona pares de cebadores que pueden utilizarse para amplificar una región de unión 5' diagnóstica del evento MON 88302. Dichos cebadores pueden comprender una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN que es diferente de la primera molécula de ADN, y ambas moléculas son cada una de longitudes suficientes de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, o SEQ ID NO:6 o complementos de estas para funcionar como cebadores de ADN de manera que, cuando se utilizan juntas en una reacción de amplificación térmica con ADN molde derivado del evento MON 88302, se produciría un amplicón que es específico y único para la porción 5' del evento transgénico MON 88302.

Una "sonda" es un ácido nucleico aislado que es complementario de una cadena de un ácido nucleico diana. Las sondas, de acuerdo con la presente invención, incluyen no solo ácidos desoxirribonucleicos o ribonucleicos, sino que también incluye poliamidas y otros materiales de soda que se unen específicamente a una secuencia de ADN diana y la detección de tal unión puede ser útil en el diagnóstico, discriminación, determinación o confirmación de la presencia de esa secuencia de ADN diana en una muestra en particular. Una sonda se puede unir a una etiqueta detectable convencional o molécula informante, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima.

En una modalidad de la invención, una sonda diagnóstica para el evento MON 88302 comprende una secuencia que no se encuentra naturalmente en el genoma de Brassica napus. En la SEQ ID NO:1 1 , se proporciona una molécula de ADN de ejemplo útil como sonda.

Las sondas y los cebadores, según la presente invención, pueden tener una identidad de secuencia completa con la secuencia diana, aunque pueden diseñarse cebadores y sondas que difieran de la secuencia diana y conserven la capacidad de hibridarse preferentemente con secuencias diana mediante métodos convencionales. Con el fin de que una molécula de ácido nucleico sirva como un cebador o sonda se necesita que sea lo suficientemente complementaria en secuencia para ser capaz de formar una estructura de doble cadena estable con las concentraciones particulares de solvente y sal empleadas. Se puede utilizar cualquier método de hibridación o amplificación de ácidos nucleicos convencional para identificar la presencia de ADN transgénico del evento MON 88302 en una muestra. Las sondas y los cebadores son por lo general de al menos de alrededor de 1 1 nucleótidos, de al menos alrededor de 18 nucleótidos, de al menos alrededor de 24 nucleótidos o de al menos alrededor de 30 nucleótidos o más de longitud. Dichas sondas y cebadores se hibridan específicamente con una secuencia de ADN diana en condiciones de hibridación restrictivas. Las condiciones restrictivas convencionales se describen en Sambrook et él, 1989, y en Haymes et ál., In: Nucleic Acíd Hybridization, A Practica! Approach, IRL Press, Washington, DC (1985). Tal como se usa en la presente, se dice que dos moléculas de ácido nucleico son capaces de hibridarse específicamente la una con la otra si las dos moléculas son capaces de formar una estructura de ácidos nucleicos de doble cadena, antiparalela. Se dice que una molécula de ácido nucleico es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si exhibe una complementariedad completa. Tal como se usa en la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si pueden hibridarse la una con la otra con una estabilidad suficiente como para permitirles permanecer hibridadas la una con la otra al menos en condiciones "de baja rigurosidad" convencionales. De manera similar, Se dice que las moléculas son "complementarias" si pueden hibridarse la una con la otra con una estabilidad suficiente como para permitirles permanecer hibridadas la una con la otra al menos en condiciones "de alta rigurosidad" convencionales. Por lo tanto, se permite el distanciamiento .de la complementariedad completa, siempre y cuando dichos distanciamientos no impidan completamente la capacidad de las moléculas de formar una estructura de cadena doble.

Tal como se usa en la presente, el término "aislado" se refiere al menos a la separación parcial de una molécula de otras moléculas que se asocian normalmente con ella en su estado natural. En una modalidad, el término "aislado" se refiere a una molécula de ADN que está al menos parcialmente separada de los ácidos nucleicos que normalmente flanquean la molécula de ADN en su estado natural. Por lo tanto, las moléculas de ADN fusionadas a secuencias codificantes o reguladoras con las que normalmente no se asocian, por ejemplo, como resultado de técnicas recombinantes, se consideran aisladas en la presente. Dichas moléculas se consideran aisladas incluso cuando están integradas en el cromosoma de una célula hospedadora o presentes en una solución de ácidos nucleicos con otras moléculas de ADN.

Se pueden utilizar cualquier cantidad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica para aislar y manipular una molécula de ADN o fragmento de esta, descrita en la presente invención. Por ejemplo, puede utilizarse tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para amplificar una molécula de ADN de partida particular y/o para producir variantes de la molécula original. Las moléculas de ADN, o un fragmento de estas, pueden también obtenerse mediante otras técnicas, tal como mediante la síntesis directa del fragmento por medios químicos, como se practica comúnmente mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos automático.

Por lo tanto, las moléculas de ADN y las secuencias de nucleótidos correspondientes proporcionadas en la presente son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento MON 88302, seleccionar variedades de plantas o híbridos que comprenden el evento MON 88302, detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88302 en una muestra, y monitorear muestras para detectar la presencia y/o ausencia del evento MON 88302 o plantas o partes de plantas que comprenden el evento MON 88302.

La presente invención proporciona plantas, progenies, semillas, células de plantas, partes de plantas (como el polen, óvulos, vaina, flor, raíz o tejido de tallo, fibras y hojas) y materias primas. Estas plantas, progenies, semillas, células de plantas, partes de plantas y materias primas contienen una cantidad detectable de un polinucleótido de la presente invención, es decir, tal como un polinucleótido que tiene al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8. Las plantas, progenies, semillas, células de plantas y partes de plantas de la presente invención pueden también contener uno o más transgenes adicionales. Tal transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o molécula de ARN que otorga un rasgo deseable incluyendo, de modo no taxativo, mayor resistencia a insectos, mayor eficiencia del uso de agua, mayor desempeño de la producción, mayor resistencia a la sequía, mayor calidad de semillas, resistencia a las enfermedades, calidad nutricional mejorada y/o mejor tolerancia a los herbicidas, donde el rasgo deseable se mide con respecto a una planta comparable que no tiene tal transgén adicional.

La presente invención proporciona plantas, progenies, semillas, células de plantas, partes de plantas, como el polen, óvulos, vaina, flores, raíz o tejido de tallo y hojas derivados de una planta transgénica que comprende el evento MON 88302. Una muestra representativa de la semilla que contiene el evento MON 88302 ha sido depositada según el Tratado de Budapest con el fin de permitir la presente invención. El depósito seleccionado para recibir la semilla es la American Type Culture Collection (ATCC) con domicilio en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia EUA, Código Postal 201 10. El depósito de la ATCC le asignó el número de adquisición PTA-10955 a la semilla del evento MON 88302.

La presente invención proporciona un microorganismo que comprende una molécula de ADN que tiene las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8 presentes en su genoma. Un ejemplo de tal microorganismo es una célula de planta transgénica. Los microorganismo, tales como una célula de planta de la presente invención, son útiles en muchas aplicaciones industriales que incluyen, de modo no taxativo: (i) el uso como herramienta de investigación para investigación científica o industrial; (ii) el uso en cultivo para producir productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteínas endógenos o recombinantes o pequeñas moléculas que pueden utilizarse para una investigación científica posterior o como productos industriales; y (iii) el uso con técnicas de cultivo de tejidos vegetales modernas para producir plantas o cultivos de tejidos de plantas transgénicos que pueden luego utilizarse para la investigación o producción agrícola. La producción y uso de microorganismos tales como células de plantas transgénicas utiliza técnicas microbiológicas modernas y la intervención humana para producir un microorganismo artificial y único. En este proceso, se inserta un ADN recombinante en el genoma de la célula de una planta para crear una célula de planta transgénica que se encuentra separada y es única a partir de células de plantas de origen natural. Esta célula de planta transgénica pueden luego cultivarse como las bacterias y las células de lavadura por medio del uso de técnicas microbiológicas recombinantes y puede existir en un estado no diferenciado unicelular. La composición genética y el fenotipo de la nueva célula de planta es un efecto técnico creado por la integración del ADN heterólogo en el genoma de la célula. Otro aspecto de la presente invención es un método para utilizar un microorganismo de la presente invención. Los métodos para usar microorganismos de la presente invención, tales como células de plantas transgénicas, incluyen (i) métodos para producir células transgénicas integrando ADN recombinante en el genoma de la célula y luego usando está célula para obtener células adicionales que posean el mismo ADN heterólogo; (ii) métodos de cultivar las células que contienen el ADN recombinante usando técnicas microbiológicas modernas; (iii) métodos de producir y purificar productos de carbohidratos, lípidos, ácidos nucleicos o proteínas endógenos o recombinantes a partir de células cultivadas; y (iv) métodos de usar técnicas de cultivo de tejidos de plantas modernas con células de plantas transgénicas para producir plantas transgénicas o cultivos de tejidos de plantas transgénicas.

Tal como se usa en la presente, "progenie" incluye cualquier planta, semilla, célula de planta y/o parte de planta regenerables que comprenden el ADN del evento derivado de una planta primitiva y/o un polinucleótido que tienen al menos una de las secuencias proporcionadas como las SEQ ID NO:1 , SEQ I NO:2, SEQ ID NO:7, o SEQ ID NO:8. Las plantas, progenies y semillas pueden ser homocigotos o heterocigotos para el transgén. Las progenies se pueden cultivar a partir de semillas producidas por una planta que contenga el evento MON 88302 y/o a partir de semillas producidas por una planta fertilizada con polen de una planta que contenga el evento MON 88302.

Las progenies de planta se pueden autopolinizar (también llamado "autofecundación") para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén. La autofecundación de la progenie adecuada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes agregados y exógenos.

De manera alternativa, las progenies de planta pueden cruzar de manera exogámica, por ejemplo, reproducirse con otra planta, para producir una semilla o planta varietal o híbrida. La otra planta puede ser transgénica o no transgénica. Por lo tanto, una semilla o planta híbrida o varietal de la presente invención puede derivar de un cruzamiento de un primer progenitor que no tiene el ADN específico y único del evento MON 88302 con un segundo progenitor que comprende el evento MON 88302, dando como resultado un híbrido que comprende el ADN único y específico del evento MON 88302. Cada progenitor puede ser un híbrido o un endocriado/varietal, siempre y cuando la cruza o reproducción dé como resultado una planta o semilla de la presente invención, es decir, una semilla que tiene al menos un alelo que contiene el ADN específico y único del evento MON 88302 y/o las SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2. Por lo tanto, dos plantas transgénicas diferentes pueden aparearse para producir progenie híbrida que contiene dos genes exógenos, agregados de segregación independiente. Por ejemplo, la planta tolerante al glifosato que contiene el evento MON 88302 puede cruzarse con otra planta transgénica para producir una planta que posee las características de ambos progenitores transgénicos. Un ejemplo de esto sería una cruza de la planta de Brassica tolerante al glifosato que comprende el evento MON 88302 con una planta de Brassica, tal como mostaza o cañóla, y que tiene una o más características adicionales, dando como resultado una progenie de planta o semilla que es tolerante al glifosato y que tiene una o más características adicionales. En la técnica se conocen plantas de Brassica que tienen características transgénicas deseables, que incluyen, pero de modo no taxativo, plantas Brassica que tienen la característica de la tolerancia a los herbicidas (por ejemplo, el evento RT200, el evento RT73, el evento MS1 , el evento RF1 , el evento RF2, Topas 19/2, MS8, RF3, T45), un sistema de reproducción híbrida o un sistema de fertilización (por ejemplo, el evento MS1 , el evento MS8, el evento RF1 , el evento RF2, el evento Rf3), control de insectos, rendimiento mejorado, resistencia a enfermedades (por ejemplo, resistencia a la Sclerotinia, resistencia al pie negro, resistencia a la hernia del repollo, resistencia a la enfermedad del Panamá), composición aceitosa alterada o mejorada (por ejemplo, el evento pCGN3828-212/86-18, el evento pCGN3828-212/23), todos descritos, por ejemplo, en el listado disponible al público del United States Department of Agriculture (USDA) Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) de peticiones para estados no reglamentados, en la técnica se conocen plantas de Brassica que tienen características no transgénicas deseables, que incluye, de modo no taxativo, características de tolerancia a los herbicidas (por ejemplo, 1471 para la tolerancia a la imidazolinona, CLB-1 para la tolerancia a la imidazolinona, TTC para la tolerancia a la triazina) resistencia a patógenos, control de insectos, rendimiento mejorado, resistencia a enfermedades (por ejemplo, resistencia a la Sclerotinia, resistencia al Pie Negro, resistencia a la hernia del repollo, resistencia a la enfermedad del Panamá), composición aceitosa alterada o mejorada (que incluye najo contenido de linoleico y/o alto contenido oleico), composición nutricional y/o química alterada, composición proteica alterada, tolerancia al frío, tolerancia a la sequía, madurez y/o floración alteradas, y otras cualidades agrícolas mejoradas o alteradas.

También se contempla el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, como lo es la propagación vegetativa. Las descripciones de otros métodos de reproducción que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de diversas referencias, por ej., Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wl (1987).

La presente invención proporciona una parte de planta que deriva de plantas que comprenden el evento MON 88302. Tal como se usa en la presente, "parte de planta" se refiere a cualquier parte de una planta que está compuesta por material derivado de una planta que comprende el evento MON 88302. Las partes de plantas incluyen, de modo no taxativo, polen, óvulos, vaina, flores, raíz o tejido de tallo, fibras y hojas. Las partes de plantas pueden ser viables, no viables, regenerables y/o no regenerables.

La presente invención proporciona un producto de materia prima que deriva de una planta que comprende el evento MON 88302. Tal como se usa en la presente, "producto de materia prima" se refiere a cualquier composición o producto que comprende un material derivado de una planta, semilla, célula de planta o parte de planta que comprende el evento MON 88302. Los productos de materia prima se pueden vender a consumidores y pueden ser viables o no viables. Los productos de materia prima no viables incluyen, de modo no taxativo, semillas y granos no viables; semillas procesadas, partes de semillas y partes de plantas; tejido de planta deshidratado, tejido de planta congelado y tejido de planta procesado; semillas y partes de plantas procesadas para alimentos de animales para el consumo de animales terrestres y/o acuáticos, aceite, aceite de maíz, harina, copos, fibra y cualquier otro alimento para consumo humano y biomasas y productos de combustible. Los productos de materia prima viables incluyen, de modo no taxativo, semillas y células de plantas. Por lo tanto, una planta que comprende el evento MON 88302 se puede usar para fabricar cualquier producto de materia prima típicamente adquirido de una planta Brassica. Cualquiera de estos productos de materia prima que deriva de las plantas que comprenden el evento MON 88302 puede contener al menos una cantidad detectable del ADN específico y único que corresponde al evento MON 88302 y específicamente puede contener una cantidad detectable de un polinucleótido que contiene al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID N0:1 o SEQ ID N0:2. Se puede usar cualquier método estándar de detección de moléculas de polinucleótidos, incluyendo métodos de detección que se describen en la presente. Un producto de materia prima se encuentra dentro del alcance de la presente invención si hay cualquier cantidad detectable de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 en el producto de materia prima.

Las plantas, progenie, semillas, células de planta, partes de planta (tales como polen, óvulo, vaina, flor, tejido de raíz o tallo y hojas) y productos de materia prima de la presente invención son por lo tanto útiles para, entre otras cosas, cultivar plantas a efectos de producir semillas y/o partes de plantas que comprenden el evento MON 88302 a efectos agrícolas, producir progenie que comprende el evento MON 88302 a efectos de reproducción e investigación de plantas, uso con técnicas microbiológicas para aplicaciones industriales y de investigación y venta a los consumidores.

La presente invención proporciona métodos para controlar malas hierbas en un campo. Se proporciona un método para controlar malas hierbas en un campo que consiste en plantar plantas que comprenden el evento MON 88302 en un campo y aplicar al menos una dosis eficaz como herbicida glifosato al campo a efectos de controlar las malas hierbas en el campo sin dañar las plantas que comprenden MON 88302. También se proporciona otro método para controlar malas hierbas en un campo que consiste en aplicar al menos una cantidad eficaz como herbicida glifosato al campo para controlar malas hierbas en el campo y luego plantar cultivos que comprenden el evento MON 88302 en el campo. Los métodos de la invención se pueden usar solos o en combinación. La aplicación del glifosato puede ser presiembra (es decir, cualquier momento antes de plantar una semilla que comprende el evento MON 88302, incluyendo, de modo no taxativo, alrededor de 14 días presiembra a alrededor de 1 día presiembra o concurrente con sembrar una semilla que comprende el evento MON 88302), premergencia (es decir, cualquier momento después de plantar la semilla que comprende el evento MON 88302 y antes de que emerjan las plantas que comprenden el evento MON 88302) y/o postemergencia (es decir, cualquier momento después de que emerjan las plantas que comprenden el evento MON 88302). Al poner en práctica los métodos de la invención, se pueden utilizar múltiples aplicaciones de glifosato durante una temporada de cultivo, por ejemplo, como dos aplicaciones (tal como una aplicación presiembra y una aplicación postemergencia o una aplicación preemergencia y una aplicación postemergencia) o tres aplicaciones (tales como aplicación presiembra, una aplicación preemergencia y una aplicación postemergencia). El glifosato total aplicado durante la temporada de cultivo puede por lo tanto incluir una o más aplicaciones de temporada donde la suma de múltiples aplicaciones de temporada conforma el glifosato total aplicado. Tal como se usa en la presente, una cantidad de glifosato eficaz para controlar el crecimiento de malas hierbas, es decir, una dosis eficaz como herbicida glifosato para usarse en el campo como una aplicación en cultivo para controlar el crecimiento de malas hierbas en el campo, debería consistir en un intervalo de alrededor de 0.14 kilogramos de glifosato por hectárea a alrededor de 7.16 kilogramos de glifosato por hectárea total en una temporada de cultivo. Por ejemplo, una dosis eficaz como herbicida glifosato para usarse en el campo como una aplicación en cultivo puede ser de al menos alrededor de 0.14, alrededor de 0.56, alrededor de 1.12, alrededor de 1.79, alrededor de 2.24, alrededor de 2.8, alrededor de 3.36, alrededor de 3.92, alrededor de 4.48, alrededor de 5.04, alrededor de 5.6, alrededor de 6.16, alrededor de 6.72 o alrededor de 7.16 kilogramos por hectárea total en una temporada de cultivo.

Se proporcionan métodos para producir una planta tolerante a herbicidas que comprende un evento transgénico MON 88302. Las plantas transgénicas usadas en estos métodos pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de progenie producidas por estos métodos pueden ser plantas vanetales o híbridas; se pueden cultivar a partir de semillas producidas por una planta y/o de semillas que comprenden el evento MON 88302 producido por una planta fertilizada con polen de una planta que comprende el evento MON 88302 y pueden ser homocigotas o heterocigotas para el transgén. Las plantas de progenie se pueden autopolinizar posteriormente para generar una verdadera línea de reproducción de plantas, es decir, plantas homocigotas para el transgén o alternativamente se pueden cruzar exogámicamente, por ej., reproducir con otra planta no relacionada, para producir una semilla o planta varietal o híbrida.

Una planta que tolera la aplicación del herbicida glifosato se puede producir realizando un cruzamiento sexual entre una planta que comprende el evento MON 88302 que comprende una molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 con otra planta y produciendo así semillas, que luego crecen para producir plantas de progenie. Estas plantas de progenie se pueden tratar luego con el herbicida glifosato para seleccionar plantas de progenie que son tolerantes al herbicida glifosato. De manera alternativa, estas plantas de progenie se pueden analizar usando métodos de diagnóstico para seleccionar plantas de progenie que contienen el ADN de evento MON 88302. La otra planta usada en el cruzamiento puede o no ser tolerante al herbicida glifosato y puede o no ser transgénica. La semilla y/o progenie de planta producida puede ser una semilla varietal o híbrida. Al poner en práctica este método, el paso de realizar un cruzamiento sexual entre una planta y otra, es decir, realizar una polinización cruzada, puede lograrse o facilitarse mediante intervención humana, por ejemplo: un humano recoge con sus manos el polen de una planta y pone en contacto este polen con el estilo o estigma de una segunda planta; un humano, con sus manos y/o mediante acciones, retira, destruye o cubre el estambre o las anteras de una planta (por ej., mediante intervención manual o mediante la aplicación de un gameticida químico) de forma tal de evitar la autopolinización natural y que la polinización cruzada tenga que ocurrir para que la fertilización ocurra; mediante colocación, por parte de un humano, de insectos de polinización en una posición para la "polinización dirigida" (por ej., colocando colmenas en huertos o campos o enjaulando plantas con insectos de polinización): mediante la apertura o remoción de partes de la flor, por parte de un humano, para permitir colocar o poner en contacto polen ajeno en el estilo o estigma; mediante colocación selectiva de plantas (por ej., plantar intencionalmente plantas en proximidad de polinización) y/o mediante la aplicación de productos químicos para precipitar la floración o para fomentar la receptividad (del estigma por el polen).

Una planta que tolera la aplicación del herbicida glifosato se puede producir autofecundando una planta que comprende el evento MON 88302 que comprende una molécula de polinucleótido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2 y produciendo así una semilla, que luego crece para convertirse en plantas de progenie. Estas plantas de progenie se pueden tratar luego con el herbicida glifosato para seleccionar plantas de progenie que son tolerantes al herbicida glifosato. De manera alternativa, estas plantas de progenie se pueden analizar usando métodos de diagnóstico para seleccionar plantas de progenie que contienen el ADN de evento MON 88302. Al "poner en práctica este método, el paso de realizar un cruzamiento sexual de una planta con sí misma, es decir, realizar una autopolinización o autofecundación, puede lograrse o facilitarse mediante intervención humana, por ejemplo: un humano recoge con sus manos el polen de la planta y pone en contacto este polen con el estilo o estigma de la misma planta y luego opcionalmente evitar una fertilización adicional de la planta; un humano, con sus manos y/o mediante acciones, retira, destruye o cubre el estambre o las anteras de otras plantas cercanas (por ej., los despanoja o aplica un gameticida químico) de forma tal de evitar la polinización cruzada natural y que la autopolinización tenga que ocurrir para que la fertilización ocurra; mediante colocación, por parte de un humano, de insectos de polinización en una posición para la "polinización dirigida" (por ej., enjaulando una planta sola con insectos de polinización): mediante la manipulación, por parte de un humano, de la flor o sus partes para permitir la autopolinización; mediante la colocación selectiva de plantas (por ej., plantar intencionalmente plantas más allá de proximidad de polinización) y/o mediante la aplicación de productos químicos para precipitar la floración o para fomentar la receptividad (del estigma por el polen).

Las semillas y plantas de progenie abarcadas por estos métodos y producidas usando estos métodos serán distintas de otras plantas, por ejemplo, debido a que las semillas y plantas de progenie: son recombinantes y como tal, son creadas mediante intervención humana; son tolerantes al herbicida glifosato; contienen al menos un alelo que consiste en el ADN transgénico de la presente invención y/o contienen una cantidad detectable de una secuencia de polinucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, Una semilla se puede seleccionar de una progenie de planta individual y mientras que la semilla comprenda la SEQ ID NO:1 y SEQ ID NO:2, estará dentro del alcance de la presente invención.

Al poner en práctica la presente invención, se pueden cruzar dos plantas transgénicas diferentes para producir una descendencia híbrida que contiene dos genes heterólogos de segregación independiente. La autofecundación de la progenie adecuada puede producir plantas que son homocigotas para ambos genes. También se contempla el retrocruzamiento con una planta parental y el cruzamiento exogámico con una planta no transgénica, como lo es la propagación vegetativa. Las descripciones de otros métodos que se usan comúnmente para diferentes rasgos y cultivos se pueden encontrar en una de diversas referencias, por ej., Fehr, en Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wl (1987).

Las plantas y semillas usadas en los métodos que se describen en la presente también pueden contener uno o más transgenes adicionales. Tal transgén puede ser cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína o molécula de ARN que otorga un rasgo deseable incluyendo, de modo no taxativo, mayor resistencia a los insectos, mayor eficiencia en el uso del agua, mayor desempeño de la producción, mayor resistencia a la sequía, mayor calidad de semillas, calidad nutricional mejorada y/o mejor tolerancia a los herbicidas, donde el rasgo deseable se mide con respecto a una planta que no tiene tal transgén adicional.

Por lo tanto, los métodos de la presente invención son útiles para, entre otras cosas, controlar las malas hierbas en un campo mientras se cultivan plantas a efectos de producir semillas y/o partes de plantas que comprenden el evento ON 88302 a efectos agrícolas o de investigación, seleccionar progenies que comprenden el evento MON 88302 a efectos de reproducir plantas o para investigación y producir semillas y plantas de progenie que comprenden el evento MON 88302.

Las plantas, progenie, semillas, células de planta, partes de planta (tales como polen, óvulo, vaina, flor, tejido de raíz o de tallo y hojas) y los productos de materia prima de la presente invención se pueden evaluar para determinar la composición de ADN, expresión génica y/o expresión de proteínas. Tal evaluación se puede realizar usando métodos estándar tales como PCR, transferencia Northern, análisis Southern, transferencia Western, inmunoprecipitación y ELISA o usando los métodos de detección y/o los kits de detección que se proporcionan en la presente.

Se proporcionan los métodos para detectar la presencia de materiales específicos para el evento MON 88302 en una muestra. Un método consiste en detectar la presencia de ADN específico de y que deriva de una célula, tejido o planta que comprende el evento MON 88302. El método proporciona una muestra de ADN molde que se debe poner en contacto con un par de cebadores que es capaz de producir un amplicón de ADN del evento MON 88302 tras someterlo a condiciones adecuadas para amplificación térmica, particularmente un amplicón que contiene al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o los complementos de las mismas. El amplicón se produce a partir de una molécula de ADN molde derivada del evento MON 88302, siempre que la molécula de ADN molde incorpore las secuencias de nucleótidos específicas y únicas tal como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. El amplicón puede ser un ADN o ARN de cadena doble o simple, dependiendo de la polimerasa que se selecciona para usarse en la producción del amplicón. El método proporciona detectar la molécula de amplicón producida en cualquiera de estas reacciones de amplificación térmica y confirmar, dentro de la secuencia del amplicón, la presencia de nucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o los complementos de las mismas. La detección de los nucleótidos que corresponden a la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o los complementos de las mismas en el amplicón es determinante y/o diagnóstica de la presencia del ADN específico del evento MON 88302 y por lo tanto, del material biológico que comprende el evento MON 88302 en la muestra.

Se proporciona otro método para detectar la presencia de una molécula de ADN que corresponde a SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 en una muestra que consiste en un material que deriva de una planta o tejido de planta. El método consiste en (i) extraer una muestra de ADN de una planta o de un grupo de plantas diferentes, (ii) poner en contacto la muestra de ADN con una molécula de sonda de ADN que presenta al menos 40 nucleótidos contiguos como se establece en la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, (iii) permitir que la sonda y la muestra de ADN se hibriden en condiciones de hibridación rigurosas y luego (iv) detectar un evento de hibridación entre la sonda y la muestra de ADN diana. La detección de la composición híbrida es diagnóstica de la presencia de SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4, según corresponda, en la muestra de ADN. La ausencia de hibridación es alternativamente diagnóstica de la ausencia del evento transgénico en la muestra. De manera alternativa, determinar que una planta particular contiene cualquiera o ambas secuencias que corresponden a la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o los complementos de las mismas, determina que la planta contiene al menos un alelo que corresponde al evento MON 88302.

Por lo tanto, es posible detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico de la presente invención por cualquier método de detección de ácido nucleico conocido, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o hibridación de ADN usando sondas de ácido nucleico. Un ensayo de PCR específico del evento lo discute, por ejemplo, Taverniers et ál. (J. Agrie. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005) donde se demuestra un sistema de localización específico del evento para líneas de maíz transgénico Bt11 , Bt176 y GA21 y del evento transgénico RT73. En este estudio, las sondas y cebadores específicos del evento se diseñaron según las secuencias de las uniones de genoma/transgén para cada evento. También se han descrito métodos de detección de ADN específico del evento de planta transgénica en las patentes estadounidenses N° 6,893,826; 6,825,400; 6,740,488; 6,733,974; 6,689,880; 6,900,014 y 6,818,807.

Se proporcionan kits de detección de ADN. Un tipo de kit contiene al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 para funcionar como una sonda o cebador de ADN específico para detectar la presencia de ADN derivado del evento transgénico MON 88302 en una muestra. La molécula de ADN que se detecta con el kit contiene al menos 40 nucleótidos contiguos de la secuencia tal como se establece en la SEQ ID NO:1. De manera alternativa, el kit puede contener al menos una molécula de ADN de longitud suficiente de nucleótidos contiguos de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 o SEQ ID NO:6 para funcionar como una sonda o cebador de ADN específico para detectar la presencia de ADN derivado del evento transgénico MON 88302 en una muestra. La molécula de ADN que se detecta con el kit contiene al menos 40 nucleótidos contiguos tal como se establece en la SEQ ID NO:2.

Un kit alternativo utiliza un método donde la muestra de ADN diana se pone en contacto con un par de cebadores tal como se describe anteriormente, luego se realiza una reacción de amplificación de ácido nucleico suficiente para producir un amplicón que comprende al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2. La detección del amplicón y la determinación de la presencia de no menos de 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2, o los complementos de las mismas, dentro de la secuencia del amplicón, es diagnóstica de la presencia de ADN específico del evento MON 88302 en una muestra de ADN.

Se proporciona una molécula de ADN suficiente para usarse como una sonda de ADN que es útil para determinar, detectar o diagnosticar la presencia o incluso la ausencia de ADN específico y único para el ADN del evento MON 88302 en una muestra. La molécula de ADN contiene al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 , o el complemento de la misma, o al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:2, o el complemento de la misma.

La amplificación de ácido nucleico se puede lograr por cualquiera de los diversos métodos de amplificación de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluyendo métodos de amplificación térmica. La secuencia del inserto de ADN heterólogo, secuencias de unión o secuencias flanqueantes del evento MON 88302 (donde las muestras de semilla representativas comprenden el evento MON 88302 depositadas como ATCC PTA-10955) se pueden verificar (y corregirse, en caso de ser necesario) mediante amplificación de tales secuencias a partir del evento usando cebadores que derivan de las secuencias que se proporcionan en la presente seguido de secuenciación de ADN estándar del amplicón o del ADN clonado.

El amplicón producido por estos métodos se puede detectar por una pluralidad de técnicas. Uno de estos métodos es Genetic Bit Analysis (Nikiforov, et ál. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994) donde se diseña un oligonucleótido de ADN que superpone tanto la secuencia de ADN genómico flanqueante como la secuencia de ADN insertado. El oligonucleótido se inmoviliza en pocilios de una placa de micropocillos. Luego de la amplificación térmica de la región de interés (usando un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante adyacente), un amplicón de cadena simple se puede hibridar al oligonucleótido inmovilizado y servir como molde para una reacción de extensión de una sola base usando una polimerasa de ADN y ddNTP etiquetados específicos para la próxima base esperada. La lectura puede ser fluorescente o basada en ELISA. La detección de una señal fluorescente o de otra naturaleza indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante debido a la exitosa amplificación, hibridación y extensión de una sola base.

Otro método es la técnica de pirosecuenciación, tal como lo describe Winge (Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000). En este método, se diseña un oligonucleótido que superpone la unión de ADN genómico adyacente y ADN de inserción. El oligonucleótido se híbrida a un amplicón de cadena simple a partir de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada y uno en la secuencia genómica flanqueante) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN, ATP, sulfurilasa, luciferasa, apirasa, adenosina 5' fosfosulfato y luciferina. Se agregan ddNTP individualmente y la incorporación da como resultado una señal de luz que se mide. Una señal de luz indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante del transgén debido a la exitosa amplificación, hibridación y extensión de una sola base o múltiples bases.

La polarización fluorescente, tal como lo describe Chen, et ál., (Genome Res. 9:492-498, 1999) es un método que se puede usar para detectar el amplicón. Usando este método se diseña un oligonucleótido que superpone la unión de ADN genómico flanqueante y de inserción. El oligonucleótido se híbrida a un amplicón de cadena simple a partir de la región de interés (un cebador en la secuencia insertada de ADN y uno en la secuencia genómica flanqueante de ADN) y se incuba en presencia de una polimerasa de ADN y un ddNTP con etiquetado fluorescente. La extensión de una sola base da como resultado la incorporación de ddNTP. La incorporación se puede medir como un cambio en la polarización usando un fluorómetro. Un cambio en la polarización indica la presencia de la secuencia de inserción/flanqueante del transgén debido a la exitosa amplificación, hibridación y extensión de una sola base.

TAQMAN® (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) también se puede usar para detectar y/o cuantificar la presencia de una secuencia de ADN usando las instrucciones proporcionadas por el fabricante. En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótido FRET que superpone la unión de ADN genómico flanqueante y de inserción. La sonda FRET y los cebadores de amplificación (un cebador en la secuencia de inserción de ADN y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. La hibridación de la sonda FRET da como resultado la escisión y liberación del resto fluorescente lejos del resto de inactivación en la sonda FRET. Una señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/de inserción del transgén debido a la exitosa amplificación e hibridación.

Se han descrito balizas moleculares para usarse en la detección de secuencias tal como lo describe Tyangi, et ál. (Nature Biotech.14:303-308, 1996). En resumen, se diseña una sonda de oligonucleótido FRET que superpone la unión de ADN genómico flanqueante y de inserción. La estructura única de la sonda FRET da como resultado que contenga una estructura secundaria que mantiene los restos fluorescentes y de inactivación cerca. La sonda FRET y los cebadores de amplificación (un cebador en la secuencia de inserción de ADN y uno en la secuencia genómica flanqueante) se ciclan en presencia de una polimerasa termoestable y dNTP. Luego de la exitosa amplificación, la hibridación de la sonda FRET a la secuencia diana da como resultado la remoción de la estructura secundaria de la sonda y la separación espacial de los restos fluorescentes y de inactivación, lo que da como resultado la producción de una señal fluorescente. La señal fluorescente indica la presencia de la secuencia flanqueante/de inserción del transgén debido a la exitosa amplificación e hibridación.

Otros métodos descritos, tales como microfluidos (publicación de patente estadounidense N° 2006068398, patente estadounidense N° 6,544,734) proporcionan métodos y dispositivos para separar y amplificar las muestras de ADN. Tintes ópticos usados para detectar y medir moléculas de ADN específicas (WO/05017181). Dispositivos de nanotubos (WO/06024023) que comprenden un sensor electrónico para la detección de moléculas de ADN o nanoperlas que se unen a moléculas de ADN específicas y que luego se pueden detectar.

Se pueden desarrollar kits de detección de ADN usando las composiciones que se describen en la presente y los métodos conocidos en la técnica de detección de ADN. Los kits son útiles para la identificación del evento MON 88302 en una muestra y se pueden aplicar a métodos para reproducir plantas que contienen el evento de ADN apropiado. Los kits pueden contener sondas o cebadores de ADN que son similares o complementarios a la SEQ ID NO: 1-6 o fragmentos o complementos de las mismas.

Por lo tanto, los kits y métodos de detección de la presente invención son útiles, entre otras cosas, para identificar el evento MON 88302, seleccionar variedades o híbridos de plantas que comprenden el evento MON 88302, detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88302 en una muestra, y monitorear muestras para detectar la presencia y/o ausencia del evento MON 88302 o plantas, partes de plantas o productos de materias primas que comprenden el evento MON 88302.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar ejemplos de determinadas modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deberían reconocer que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan enfoques que los inventores descubrieron que funcionan correctamente en la práctica de la invención y, por lo tanto, pueden considerarse como que constituyen ejemplos de modos preferidos para ponerla en práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deberían, en vista de la presente descripción, reconocer que pueden realizarse muchos cambios a las modalidades específicas descritas y aun así obtener un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Transformación de Brassica naous v selección del evento MON 88302 Este ejemplo describe cómo se crearon los eventos transgénicos y cómo se seleccionó el evento MON 88302. El evento MON 88302 transgénico se generó por transformación mediada por Agrobacteríum de células Brassica napus con el ADN transgénico que se ¡lustra en la Figura 1 , cuya secuencia se establece en la SEQ ID NO:5. El inserto de transgén que se proporciona como SEQ ID NO:5 es un cásete de expresión que comprende un promotor quimérico que consiste en: una molécula potenciadora derivada del potenciador 35S de virus del mosaico de la Celedonia (E-FMV.35S) unido operativamente a una molécula promotora derivada del gen Arabidopsis thaliana Tsf1 (P-At.Tsf1) unido operativamente a una molécula líder derivada del gen Arabidopsis thaliana Tsf1 (L-At.Tsf1 )¡ unido operativamente a un secuencia de intrones derivada del gen Arabidopsis thaliana Tsf1 (l-At.Tsf1 ); unido operativamente a una molécula de ADN que codifica un péptido de tránsito de cloroplastos (CTP2, Arabidopsis thaliana EPSPS); unido operativamente a una molécula de ADN que codifica un EPSPS resistente al glifosato (CP4-syn); conectado operativamente a una molécula de ADN 3' UTR derivada del gen Pisum sativum (T-RbcS2, E9).

Primero cada uno de los explantes de Brassica napus se transformó con uno de cinco casetes de expresión usando transformación mediada por Agrobacterium. Luego se seleccionaron las células trasformadas en medio que contiene glifosato y se regeneraron las células sobrevivientes en plantas. Se generaron más de 23,000 explantes y a partir de esto se produjeron 224 eventos R0 individuales totales y se usaron para un posterior análisis (Tabla 1).

TABLA 1 Transformación de Brassica napus v selección del evento MON 88302 Se analizaron las muestras de tejido de los eventos usando análisis de PCR TAQMAN® para eliminar los eventos de múltiples copias y/o molecularmente complejos. De los 224 eventos iniciales, 104 avanzaron conforme a la presencia de una única copia del transgén y la ausencia de secuencias de estructura principal de vector, según se determinó por análisis de PCR TAQMAN®. Específicamente, de la construcción 1 (con los 97 eventos iniciales) 37 eventos R1 avanzaron; de la construcción 2 (con los 69 eventos iniciales) 32 eventos R1 avanzaron; de la construcción 3 (con los 43 eventos iniciales) 1 1 eventos R1 avanzaron; de la construcción 4 (con aproximadamente 30 eventos) 14 eventos R1 avanzaron y de la construcción 5 (con aproximadamente 25 eventos) 10 eventos R1 avanzaron.

Los 104 eventos que contenían una única copia del transgén avanzaron a prueba de invernadero (GH), incluyendo análisis molecular adicional y prueba de eficacia. El análisis molecular de invernadero de R1 incluyó: un análisis de transferencia Southern inicial para confirmar la presencia de una única copia del transgén y la ausencia de las secuencias de estructura principal del vector; los niveles de expresión de proteína CP4 medidos en la etapa de 3-4 hojas, la etapa de rosetta y en la semilla y procesamiento de CP4 según se mide por análisis de transferencia Western (los eventos de las construcciones 4 y 5 no se incluyeron en este análisis). La prueba de la eficacia del invernadero de R1 incluyó: segregación, clorosis/necrosis, tolerancia vegetativa, primera flor, reducción en el crecimiento, tolerancia reproductora del macho según se mide por viabilidad del polen y conteos de semillas. Del análisis de la prueba molecular y de eficacia del invernadero de los 104 eventos, 25 eventos avanzaron a ensayos de campo del primer año. Específicamente, para la construcción 1 , 16 eventos R2 de los 37 eventos R1 evaluados avanzaron, para la construcción 2, 3 eventos R2 de los 32 eventos R1 evaluados avanzaron, para la construcción 3, 1 1 eventos R1 avanzaron a la prueba de invernadero, 0 eventos R2 avanzaron; para la construcción 4, 3 eventos R2 de los 14 eventos R1 evaluados avanzaron; para la construcción 5, 3 eventos R2 de los 10 eventos R1 evaluados avanzaron a prueba de campo.

Los 25 eventos R2 se analizaron luego en la prueba de campo del primer año para la evaluación agronómica en parcelas emparejadas en las mismas ubicaciones. Se iniciaron ensayos de campo agronómicos para evaluar el impacto de la inserción genética sobre el crecimiento y desarrollo de la planta. Los 16 eventos R2 de la construcción 1 se evaluaron en 5 ubicaciones. Los 3 eventos R2 de las construcción 2, los 3 eventos R2 de la construcción 4 y los 3 eventos R2 de la construcción 5 se evaluaron en 4 ubicaciones. Cada estudio contenía el par de isolínea positivo y negativo de cada evento, así como el germoplasma de transformación parental y una variedad comercial. Para la evaluación agronómica, se observaron el vigor de la planta, la parada temprana, la fecha de la primera flor y la altura de la planta para evaluar el desarrollo de la planta. También se evaluaron los datos de rendimiento como un indicador del efecto de inserción del gen en el crecimiento y desarrollo de la planta. Se usó un diseño de parcela dividida emparejada con 3 replicaciones, donde los eventos se usaron como parcelas completas y las isolíneas como subparcelas. Las isolíneas positivas y negativas de cada evento se emparejaron mientras que una variedad comercial y la referencia de transformación se emparejaron e incluyeron como controles. Las parcelas se mantuvieron sin malas hierbas a través de la temporada utilizando programas de herbicidas convencionales complementados por desherbado manual; según sea necesario. No se aplicaron tratamientos con glifosato en este protocolo de campo.

Se tomó un conteo de emergencia/parada para cada parcela a 7 a 10 días luego de plantar. Los cotiledones que habían despejado completamente la tierra se consideraron "emergidos". Se determinó el vigor de la planta en la etapa de 2 a 3 hojas (antes de la primera aplicación de herbicida de la parcela emparejada de la prueba de eficacia) usando una escala que se encuentra en el intervalo entre 1 (vigor excelente), donde 5 es el promedio, y 9 (vigor bajo). La fecha de primera flor se registró luego de que todas las parcelas habían comenzado a florecer y se expresó como un porcentaje de flores abiertas por planta por parcela. La altura de planta de 5 plantas por parcela se midió desde la superficie de tierra hasta la parte superior del racimo más alto de flor mediana a tardía y se expresó en cm. Se estimaron la uniformidad y la capacidad de pararse usando una escala que varía de 1 (excelente), donde 5 es el promedio y 9 (bajo). Cada ensayo se cosechó luego de que la mayoría de las parcelas había alcanzado la maduración. Algunas parcelas se combinaron directamente, mientras que otras parcelas se empujaron una vez que se alcanzó la maduración y la hilera se combinó aproximadamente 10 días a partir de eso. Se registraron la humedad y los pesos de las semillas individuales (Ib/A) y se recogieron las muestras de semilla para realizarles un análisis de aceite y proteína. Cada ubicación se analizó individualmente y se analizaron los promedios a través de las ubicaciones usando software estadístico: Los datos se analizaron para detectar valores atípicos usando el procedimiento estándar de dos pasos según residuos estudentados borrados usando un ajuste Bonferroni para una tasa de error Tipo I respecto al experimento de 5% en cada ubicación. Se retiraron los valores atípicos antes del análisis. Se realizó el análisis estándar de varianza para un diseño de parcela dividida con una estimación de probabilidad máxima restringida. Se calcularon los promedios de mínimos cuadrados para cada isolínea de cada evento y se usaron pruebas t con índices de error con respecto a la comparación de 5% para determinar la importancia de inserción genética sobre las características del crecimiento de la cañóla. Se compararon los rasgos del evento de isolíneas positivas con los rasgos de las isolíneas negativas correspondientes. Debido a diferencias en maduración entre los eventos, se excluyeron la comparación entre las isolíneas positivas y las isolíneas negativas agrupadas así como las comparaciones con el estándar comercial y la referencia de transformación.

Los resultados de los ensayos de campo de agronomía del primer año indicaron que ambas construcciones produjeron múltiples eventos donde las características agronómicas y el rendimiento no se vieron afectadas negativamente por la inserción genética. Según la evaluación agronómica, 15 eventos fueron candidatos para avanzar a ensayos de campo de segundo año. Específicamente, 14 eventos de la construcción 1 (16 eventos R2 en los ensayos de campo) y 1 evento de la construcción 2 (3 eventos R2 en los ensayos de campo) fueron candidatos para avanzar a ensayos de campo de segundo año.

Los 25 eventos también se evaluaron en pruebas de campo del primer año para determinar la eficacia ubicada en el mismo sitio de prueba que los ensayos de campo de agronomía. Se iniciaron ensayos de campo de eficacia para evaluar la tolerancia vegetativa y reproductora de los eventos a aplicaciones secuenciales de glifosato a diversos momentos e índices de aplicación. Los 16 eventos R2 de la construcción 1 se evaluaron en 5 ubicaciones. Los 3 eventos R2 de las construcción 2, los 3 eventos R2 de la construcción 4 y los 3 eventos R2 de la construcción 5 se evaluaron en 4 ubicaciones. Cada estudio contenía la isolínea positiva de cada evento y dos variedades comerciales. Se usó un diseño de parcela dividida, con 3 replicaciones con tratamientos con herbicidas como parcelas completas y entradas de evento como subparcelas. Se incluyó un tratamiento no rociado para su comparación.

Los eventos se evaluaron para detectar la tolerancia vegetativa y reproductora a una única aplicación de 1.6 Ib AE/A o dos aplicaciones secuenciales de 0.8 Ib AE/A cuando se aplicaron desde la emergencia del cultivo hasta la primera flor. Se aplicó Roundup WeatherMAX® en tres diferentes índices que eran equivalente a 2x, 4x y 8x del índice de aplicación simple (Tabla 2). La aplicación inicial se realizó en la etapa de cuatro hojas seguida de una segunda aplicación en la etapa antes de la salida. Para minimizar el posible daño a la planta a partir de tensioactivos y otros componentes de formulación, se prepararon soluciones de rociado para administrar 3.2 y 6.4 Ib AE/A (4x y 8x) usando 1.6 Ib AE/A of Roundup Weather AX® como tasa base y agregando material técnico (glifosato sin tensioactivo) para lograr el índice deseado. Todas las aplicaciones se realizaron usando un aguilón de pulverizadora montando en un tractor equipado con boquillas de aventador plano calibradas para administrar 10 a 20 GPA.

La recolección de datos se realizó como se describe anteriormente. La lesión por glifosato se evaluó como se describe a continuación. Antes de cada aplicación de glifosato, se documentó la altura de la planta y la cantidad de hojas para 5 plantas por parcela en las parcelas tratada y no tratada. Para determinar si el glifosato había causado lesión a los eventos, se tomaron estimaciones visuales del porcentaje de clorosis y porcentaje de necrosis a los 7 a 10 días después de cada aplicación de glifosato. La lesión vegetativa se valoró luego de la primera aplicación de glifosato mientras que el porcentaje reproductivo de clorosis/necrosis se evaluó luego de la segunda aplicación usando una escala que varía de 0% (sin lesión) a 100% (muerte de la planta). La reducción en el crecimiento se evaluó a los 14 a 21 días luego de cada aplicación usando una escala que varía de 0 a 100%. La reducción en el crecimiento vegetativo se evaluó luego de la primera aplicación mientras que la reducción en el crecimiento reproductor se determinó luego de la aplicación secuencial. Los promedios de mínimos cuadrados se calcularon para cada combinación de nivel y evento de glifosato y las pruebas t se usaron para determinar la importancia de los efectos del glifosato sobre la tolerancia del evento. Los rendimientos de eventos de los tratamientos de glifosato se compararon con el rendimiento del control no tratado así como con el estándar comercial, RT73, dentro de cada índice de herbicida y se realizaron comparaciones entre índices de herbicida para cada evento.

Los resultados de los ensayos de campo de eficacia del primer año indican que la construcción 1 produjo eventos que tenían excelente tolerancia vegetativa y reproductora al glifosato. La lesión vegetativa observada al índice de concepto de producto 2x fue mínima y se consideró comercialmente insignificante. Se observó una tolerancia reproductora destacada para los eventos de la construcción 1. El rendimiento de todos los eventos de la construcción 1 no se vio afectado negativamente por el glifosato, sin importar el índice, con la excepción de un evento que mostró una reducción significativa en el rendimiento al índice máximo de aplicación (6.4 Ib AE/A seguido de 6.4 Ib AE/A). Los eventos derivados de la construcción 2 no tuvieron tolerancia al glifosato vegetativo suficiente como para avanzar. Se observaron niveles inaceptables de lesión en todos los índices de glifosato analizados. El glifosato redujo significativamente el rendimiento de todos los eventos de la construcción 2, sin importar el índice de aplicación. Los eventos derivados de la construcción 4 y 5 no se desempeñaron tan bien como los eventos de la construcción 1 y, por lo tanto, no avanzaron a las pruebas de campo del segundo año. Según la prueba de campo del primer año, 13 eventos de la construcción 1 avanzaron a la prueba de campo del segundo año.

EJEMPLO 2 Comparación de RT73 con MON 88302 Se diseñaron luego ensayos de campo para evaluar MON 88302 en comparación con la cañóla Genuity™ Roundup Ready® actual comercial (evento RT73). Las comparaciones de MON 88302 con RT73 mostraron que MON 88302 proporcionó tolerancia superior al cultivo a mayores índices de aplicación de glifosato, permitiendo así un mejor control de las malas hierbas a mayores índices de glifosato de malas hierbas difíciles de controlar, tales como diente de león, cardo canadiense, cebada de cola de zorro, alforfón salvaje, quinoa común y kochia. Las comparaciones de MON 88302 con RT73 también mostraron que MON 88302 proporcionó mayor tolerancia al cultivo a un intervalo de aplicación mayor para el glifosato, permitiendo así la aplicación de glifosato durante un período más amplio desde la postemergencia hasta la primera flor, permitiendo el control de malas hierbas que roban el rendimiento incluso en una etapa de crecimiento posterior del cultivo de lo que era posible con RT73. La combinación MON 88302 de una mayor tolerancia a mayores índices de glifosato y tolerancia a aplicaciones de glifosato en una etapa posterior de cultivo proporciona la ventaja, en comparación con RT73, de permitir la aplicación de glifosato en una etapa de crecimiento posterior, cuando las condiciones ambientales tienen aplicaciones tempranas limitadas y/o mejor control de posteriores brotes de malas hierbas que reducirían el rendimiento del cultivo.

El índice de glifosato registrado actual del sistema de cañóla Genuity™ Roundup Ready® (evento RT73) es una única aplicación de 675 g ae/ha o dos aplicaciones de 450 g ae/ha hasta la etapa de seis hojas del cultivo de cañóla. RT73 se comparó con el evento MON 88302 en múltiples índices de aplicación simples de glifosato. Se realizaron aplicaciones de postemergencia a la primera flor del cultivo de cañóla. El sistema de cañóla Genuity™ Roundup Ready® (evento RT73) se representó por la variedad polinada abierta comercial 34-65 y el evento MON88302 se transformó en el germoplasma Ebony.

Se establecieron ocho ensayos donde seis se cosecharon (un sitio se perdió debido a la sequía y un sitio se perdió debido al granizo y los datos de un sitio cosechado no se usó debido a que el coeficiente de variación (CV) excedía el valor de corte predeterminado). Se utilizaron prácticas estándar de cultivo de cañóla a través de la temporada para optimizar el crecimiento de la planta. Los herbicidas convencionales preemergentes y postemergentes y el tratamiento de semillas que contenía fungicida e insecticida se usaron para minimizar la presión de la peste. Se establecieron ensayos como un diseño de bloque dividido con sistemas de cañóla Roundup Ready® (evento RT73) o MON 88302 bloqueados e índices de herbicida aleatorizadas dentro del bloque. Las parcelas tenían dos metros por seis y se replicaron tres veces. Las parcelas se rociaron con rociadores de aguilón manuales a un índice de aplicación de 100-110 l/ha en la etapa de cultivo adecuada. Se usó la formulación canadiense de Roundup WeatherMAX® (540 g /L) como el producto de glifosato. La etapa de cuatro a seis hojas se definió como cuatro a seis hojas reales en el tallo principal y la primera flor se produjo cuando 50% de las plantas tenían al menos una flor. Se registró el porcentaje de clorosis (% de CHLR) siete a diez días después de la aplicación de herbicida (DAT o días después del tratamiento). El porcentaje de clorosis es una estimación visual de la cantidad de amarilleamiento en las hojas de plantas como resultado del tratamiento con herbicida en comparación con el control no tratado en una escala de 1 a 100. Se registró la reducción en el porcentaje de crecimiento (% de GR) 14-21 días después de la aplicación de herbicida (DAT). La reducción en el porcentaje de crecimiento es una evaluación visual usada para describir la reducción en el crecimiento de las plantas que consiste en, de modo no taxativo, altura reducida y/o cantidad de follaje en el área tratada. La evaluación se relaciona solo con la porción de la planta que está sobre la tierra. La reducción en el porcentaje de crecimiento se compara con la prueba no tratada y se evalúa en una escala de 1 a 100. La maduración se registró como días después de plantar hasta cuando 30% de las semillas en el racimo principal son de color marrón/negro. Se registró el porcentaje de humedad de semilla electrónicamente durante la cosecha. Todas las parcelas se envolvieron y luego se dejaron secar hasta que la humedad de las semillas fuera lo suficientemente baja como para facilitar la cosecha. Se registró el peso y la humedad de la semilla electrónicamente durante la cosecha y se convirtieron en bushel/acre a 10% de humedad de semilla. Cada ubicación se analizó individualmente y se analizaron los promedios a través de las ubicaciones usando software estadístico. Los datos se analizaron para detectar valores atípicos usando el procedimiento estándar de dos pasos según residuos estudentados borrados, usando un ajuste de tasa de falso descubrimiento (FDR) para una tasa de error Tipo I respecto al ejercicio de 5% en cada ubicación. Se retiraron los valores atípicos antes del análisis. El análisis estándar de varianza de un diseño de parcela dividida se realizó mediante un modelo mezclado con una estimación de probabilidad máxima restringida, la variedad y el tratamiento de herbicida se trataron como efectos fijos, las replicaciones y ubicaciones fueron efectos aleatorios. Se calcularon los promedios de mínimos cuadrados para cada variedad y cada tratamiento y se usaron pruebas t con tasas de error con respecto a la comparación de 5% para determinar la importancia entre la variedad y el control en cada nivel de tratamiento con herbicida sobre las características de crecimiento de cañóla. La lesión, maduración y rendimiento del cultivo se midieron para evaluar los beneficios.

En la Tabla 2, se proporcionan los datos sobre la tolerancia de cañóla al glifosato que comprenden el evento RT73, en comparación con la cañóla que comprende el evento MON 88302. En resumen, la tolerancia al glifosato de MON 88302 fue superior a la tolerancia al glifosato de RT73, tanto en la tolerancia a mayores índices de aplicación de glifosato (g ae/ha) y el intervalo de la etapa de cultivo donde se toleró la aplicación de glifosato. Por ejemplo, RT73 mostró 4.7% de clorosis en el índice de aplicación de 1800 g ae/ha en la etapa de 4-6 hojas, donde MON 88302 mostró solo 1.7% de clorosis a un índice similar en esta etapa y no mostró mayor clorosis al doble del índice (3600 g ae/ha). Además, el evento MON 88302 no mostró reducción en el porcentaje de crecimiento al índice de aplicación de 1800 g ae/ha en la etapa de 4-6 hojas mientras que RT73 tuvo una reducción en el crecimiento de 5.3%. Al índice de glifosato de 3600 g ae/ha de etapas de aplicación de cuatro a seis hojas y de cultivo de primera flor, RT73 mostró 10% de clorosis, mientras que MON 88302 mostró solo 1.7% y 4.7%, respectivamente. Al índice de glifosato de 3600 g ae/ha de etapas de aplicación de cuatro a seis hojas y de cultivo de primera flor, RT73 mostró 20.8% y 8.1% de reducción en el crecimiento, respectivamente, mientras que MON 88302 mostró solo 0.3% y 1.1%, respectivamente.

TABLA 2 Tolerancia al qlifosato en el evento RT73 en comparación con MON 88302 En la Tabla 3 se proporcionan los datos sobre los días posteriores a plantar la hilera de cañóla que comprende el evento RT73, en comparación con la cañóla que comprende el evento MON 88302. En resumen, la maduración se retrasó significativamente en el sistema de cañóla Genuity™ Roundup Ready® (evento RT73) a un índice de 3600 g ae/ha tanto en las aplicaciones de cuatro a seis hojas como en las de primera hoja, lo que probablemente sea una consecuencia de la lesión al cultivo. No se observó retraso en la maduración en las plantas MON 88302 excepto por una reducción significativa de la maduración al índice de 1800 g ae/ha en la etapa de aplicación de cuatro a seis hojas.

TABLA 3 Días posteriores a plantar en la hilera en el evento RT73 en comparación con MON 88302 Los datos sobre la humedad de la semilla de cañóla, que comprende el evento RT73, en comparación a la cañóla que comprende el evento MON 88302 se proporcionan en la Tabla 4. La humedad de las semillas se midió de manera electrónica cuando se cosecharon las parcelas individuales. La humedad de las semillas dentro de cada sistema fue una comparación entre el índice de glifosato rociado y el tratamiento sin rociado. La humedad de las semillas en el sistema de Cañóla Genuity™ Roundup Ready® fue más alta en los índices de 1800 g ae/ha y 3600 g ae/ha tanto en las aplicaciones en etapa de cultivo de cuatro a seis hojas como en las de primera flor. La humedad de las semillas aumentada en estos dos tratamientos refleja nuevamente un retraso en la madurez, que es resultado del daño a los cultivos previamente descrito. No se observaron efectos significativos en la humedad de las semillas en plantas MON 88302.

TABLA 4 Humedad de las semillas en el evento RT73 en comparación con MON 88302 Los datos sobre el rendimiento de la cañóla que comprende el evento RT73, en comparación con la cañóla que comprende el evento MON 88302 se proporcionan en la Tabla 5 y las Figuras 2 y 3. Se realizaron comparaciones de rendimiento entre los diferentes índices de gíifosato y el tratamiento sin rociado para la cañóla que contenía cada evento. En el sistema de Cañóla Genuity™ Roundup Ready®, se observó una reducción de rendimiento significativa con los índices 1800 y 3600 g ae/ha tanto en las aplicaciones de cuatro a seis hojas como en las de primera flor y el índice 900 g/ha en aplicaciones de primera flor. No se observaron diferencias significativas en el rendimiento en plantas de MON 88302 con ningún índice ni tiempo.

TABLA 5 Rendimiento en el evento RT73 en comparación con MON 88302 El índice actual marcado de gíifosato para el sistema de Cañóla Genuity™ Roundup Ready® es 675 g ae/ha aplicado una vez o 450 g ae/ha aplicado dos veces. Las aplicaciones pueden hacerse hasta la etapa de seis hojas. Los índices para el MON88302 pueden ser hasta 1800 g ae/ha aplicado hasta la primera flor del cultivo. El sistema de Cañóla Genuity™ Roundup Ready® tuvo 11.4% de reducción de rendimiento con el índice de aplicación de MON 88302 propuesto de 1800 g ae/ha y 30% de reducción de rendimiento en 2X el índice propuesto (Figura 2). Estas reducciones en el rendimiento se observaron en la etapa de aplicación de cultivos de Cañóla Genuity™ Roundup Ready® actualmente marcada de cuatro a seis hojas. No se observaron reducciones en el rendimiento significativas en las plantas de MON 88302. La Figura 3 muestra los rendimientos con los índices de glifosato y las etapas de cultivo (primera flor). Hubo una reducción significativa en el rendimiento con todos los índices que se mostró para el sistema de Cañóla Genuity™ Roundup Ready® en esta etapa de cultivo tardía. No se observaron reducciones en el rendimiento significativas en las plantas de MON 88302.

EJEMPLO 3 Caracterización de secuencias de ADN de MON 88302 El ADN insertado en el genoma de la planta de MON 88302 y la secuencia genómica que flanquea el inserto se caracterizaron por análisis moleculares detallados. Estos análisis incluyeron: secuenciar la secuencia insertada, determinar el número de inserto (número de sitios de integración dentro del genoma), determinar el número de copia (número de copias de un ADN transgénico dentro de una ubicación), evaluar la integridad del cásete génico insertado, y caracterizar las secuencias flanqueantes.

Las secuencias de ADN genómico que flanquean la inserción del ADN del transgén en el evento MON 88302 se determinaron mediante el uso de amplificación térmica inversa como se describió en Ochman et él., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.). Se aisló ADN genómico de planta de ébano no transgénico y diferentes eventos transgénicos que surgen de la transformación mediada por Agrobacterium de Brassica napus descrita en el Ejemplo 1. El tejido utilizado para el aislamiento de ADN se produjo en condiciones de invernadero estándar. Aproximadamente 1 gramo de tejido joven de hoja se combinó con nitrógeno líquido y se molió hasta obtener un polvo fino usando un mortero y mano de mortero. El ADN se extrajo usando un kit de extracción de ADN genómico Nucleón™ PhytoPure™ (RPN8511 , Amersham, Piscataway, NJ) según las instrucciones del fabricante. Luego de la etapa final de precipitación, se resuspendió ADN de muestras individuales en 0.5 mi de TE (10 mM de Tris-HCI pH 8.0, 1 mM de EDTA). Este método puede ser modificado por un experto en la técnica para extraer ADN de cualquier tejido, incluyendo, de modo no taxativo, la semilla.

Una alícuota de ADN de cada muestra se digirió con endonucleasas restrictivas seleccionadas en función del análisis de restricción del ADN del transgén. Luego de la autoligación de los fragmentos de restricción, se llevó a cabo la amplificación térmica usando cebadores diseñados para la secuencia de ADN del transgén que amplificaría secuencias mediante el uso del sistema de amplificación ELONGASE® (N° de Cat. 10481-018, Invitrogen, Carlsbad, CA) o el sistema de PCR con moldes de larga expansión N° de cat. 1681842, Roche Applied Science, Indianapolis, IN) que se extiende lejos de los extremos 5' y 3' del ADN del transgén. Los amplicones producidos a partir de las reacciones se separaron por electroforesis en gel de agarosa y se purificaron usando un kit de purificación con gel QIAGEN (Qiagen, Valencia, CA). Los amplicones purificados con gel se clonaron en el vector pCR®-XL-TOPO® (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos resultantes que contenían el evento MON 88302 que flanquea las secuencias genómicas se secuenció usando protocolos de secuenciación de ADN estándar. El ADN genómico adyacente a, o que flanquea, el extremo 5' del ADN transgénico insertado en el genoma se presenta como la SEQ ID NO:3 ([C], ver la Figura 1). El ADN genómico adyacente al extremo 3' del ADN transgénico insertado en el genoma se presenta como la SEQ ID NO:4 2([D], ver la Figura 1). El segmento del ADN del cásete de expresión que se integró completamente en el ADN genómico se presentó como la SEQ ID N0:Í5 ([E], ver Figura 1).

Secuencias de moléculas de ADN aisladas se compararon con el ADN del transgén para identificar la secuencia flanqueante y el fragmento de ADN del transgén co-aislado. La confirmación de la presencia del cásete de expresión se logró mediante amplificación térmica con cebadores diseñados en función de los datos deducidos de la secuencia flanqueante y la secuencia de ADN del transgén conocida. La secuencia de tipo salvaje correspondiente a la misma región en la que el ADN del transgén se integró en la línea transformada se aisló usando cebadores diseñados a partir de las secuencias flanqueantes en el evento MON 88302. Las reacciones de amplificación térmica se llevaron a cabo usando el sistema de amplificación ELONGASE® N° de cat. 10481-018, Invitrogen, Carlsbad, CA). Las secuencias flanqueantes en el evento MON 88302 y la secuencia de tipo salvaje de ébano se analizaron contra múltiples bases de datos de nucleótidos y proteínas. Esta información se utilizó para examinar la relación del transgén con el genoma de la planta y para evaluar la integridad del sitio de inserción. La secuencia flanqueante y las secuencias de tipo salvaje se utilizaron para diseñar cebadores para los ensayos finales de TAQMAN utilizados para identificar los eventos.

EJEMPLO 4 Ensayos TAQMAN® finales específicos para el evento Este ejemplo describe un método de amplificación térmica TAQMAN® final específico para el evento desarrollado para identificar el evento MON88302 en una muestra. Los ejemplos de condiciones útiles con el método TAQMAN® final específico para el evento MON 88302 son los siguientes. Paso 1 : 18 megohm de agua ajustada para un volumen final de 10 pl. Paso 2: 5.0 pl de Mezcla Maestra Universal 2X (dNTP, enzima, amortiguador) a una concentración final de 1X. Paso 3: 0.5 µ? de mezcla del cebador- 1 y cebador-2 (resuspendida en 18 megohm de agua hasta una concentración de 20 uM para cada cebador) hasta una concentración final de 1.0 µ? (por ejemplo, en un tubo microcentrífugo, lo siguiente debe añadirse para lograr 500 µ? a una concentración final de 20 uM: 100 µ? del Cebador SQ20901 (SEQ ID NO:9) a una concentración de 100 µ?; 100 µ? del Cebador SQ23770 (SEQ ID NO: 10) a una concentración de 100 µ?; 300 µ? o 18 megohm de agua). Paso 4: 0.2 µ? del Evento 6-FAM™ MGB sonda PB10164 (SEQ ID NO:11 ) a una concentración final de 0.2 µ?. Paso 5: 0.5 µ? de mezcla de cebador de control interno SQ2563 (SEQ ID NO: 17) y cebador de control interno SQ2564 (SEQ ID NO:18) a una concentración final de 1.0 µ? para cada cebador. Paso 6: 0.2 µ? de la sonda PB0751 VIC™ de control interno (SEQ ID NO: 19) a una concentración final de 0.2 µ?. Paso 7: 3.0 µ? de ADN extraído (molde) para cada muestra con cada una de las siguientes conteniendo 1. Las muestras de hojas a ser analizadas; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Control de agua negativo (sin molde); 4. ADN de ON 88302 de control positivo Paso 8: Condiciones del termociclador como siguen: Un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; Un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de 95 °C durante 15 segundos, luego 64 °C durante 1 minuto con -1 °C/ciclo; cuarenta ciclos de 95 °C durante 15 segundos luego 54 °C 1 minuto; ciclo final de 10 °C.

Las moléculas de ADN útiles en el método son, por ejemplo, los cebadores SQ20901 (SEQ ID NO:9) y SQ23770 (SEQ ID NO: 10) y la sonda PB10164 de oligonucleótidos etiquetado con 6FAM™ (SEQ ID ??. 1 ). Se pueden diseñar otras sondas y cebadores en función de las secuencias del inserto del transgén y/o secuencias flanqueantes proporcionados en la presente. SQ20901 (SEQ ID NO:9) y SQ23770 (SEQ ID NO: 10), cuando se utilizan en estos métodos de reacción con PB10164 (SEQ ID NO: 1 1) producen un amplicón que es diagnóstico del ADN del evento MON 88302. El método de amplificación TAQMAN final también confirma la integridad del ADN molde mediante amplificación de FatA, un gen endógeno de copia única dentro de Brassica napus. Las moléculas de ADN útiles en el método son, por ejemplo, los cebadores SQ2563 (SEQ ID NO: 17) y SQ2564 (SEQ ID NO:18) y la sonda PB0751 de oligonucleótidos etiquetado con VIC™ (SEQ ID NO: 19). Los controles para este análisis incluyen un control positivo a partir de Brassica napus que contenía ADN del evento MON 88302, un control negativo de Brassica napus no transgénico y un control negativo que no contiene ADN molde.

El método de amplificación térmica TAQMAN® final también se utilizó para desarrollar ensayos de cigosidad para el evento MON 88302. Un ensayo de cigosidad es útil para determinar si una planta que comprende un evento es homocigota para el ADN del evento; esto es contener el ADN exógeno en la misma ubicación en cada cromosoma de un par cromosómico; o heterocigota para el ADN de un evento, esto es contener el ADN exógeno en solo un cromosoma de un par cromosómico; o es nulo para el ADN del evento, esto es, de tipo salvaje. Este ejemplo describe un método de amplificación térmica TAQMAN® final específico para el evento desarrollado para determinar la cigosidad del evento MON88302 en una muestra. Para este ensayo, se empleó un ensayo de tres cebadores donde el cebador SQ21948 (SEQ ID NO: 12) se híbrida y se extiende específicamente desde el ADN exógeno insertado, el cebador SQ22176 (SEQ ID NO: 13) se híbrida y se extiende específicamente desde el ADN que flanquea el lado 5' del ADN exógeno insertado, y el cebador SQ24635 (SEQ ID NO: 14) se híbrida y se extiende específicamente a partir del ADN que flanquea el lado 3' del ADN exógeno insertado. Los tres cebadores son diagnósticos para el evento. En este ejemplo, el cebador SQ22176 (SEQ ID NO: 13) y el cebador SQ2 948 (SEQ ID NO:12) y la sonda de oligonucleótidos marcado con 6FAM™ PB4213 (SEQ ID NO: 15) son diagnósticos cuando hay una copia del ADN exógeno insertado. En este ejemplo, el cebador SQ22176 (SEQ ID NO: 13) y el cebador SQ24635 (SEQ ID NO: 14) y la sonda de oligonucleótidos marcado con VIC™ PB 0787 (SEQ ID NO: 16) son diagnósticos cuando no hay una copia del ADN exógeno insertado presente en el ADN genómico, es decir, de tipo salvaje. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta homocigota para el evento MON 88302, hay una señal fluorescente de la sonda de oligonucleótidos marcado con 6FAM™ PB4213 (SEQ ID NO: 15) que es indicativo y diagnóstico de una planta homocigota para el evento MON 88302. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta heterocigota para el evento MON 88302, hay una señal fluorescente de la sonda de oligonucleótidos marcado con 6FAM™ PB4213 (SEQ ID NO;15) y la sonda de oligonucleótidos marcado con VIC™ PB10787 (SEQ ID NO: 16) que es indicativo y diagnóstico de una planta heterocigota para el evento MON 88302. Cuando los tres cebadores y las dos sondas se mezclan en una reacción de PCR con ADN extraído de una planta que es nula para el evento MON 88302 (es decir, de tipo salvaje), hay una señal fluorescente solo de la sonda de oligonucleótidos marcado con VIC™ PB10787 (SEQ ID NO: 16) que es indicativo y diagnóstico de una planta nula para el evento MON 88302 (es decir, de tipo salvaje). Los ejemplos de condiciones útiles para este método son los siguientes. Paso 1 : 18 megohm de agua ajustada para un volumen final de 10 µ?. Paso 2: 5.0 µ? de Mezcla Maestra Universal 2X (dNTP, enzima, amortiguador) a una concentración final de 1X. Paso 3: 0.5 µ? de los cebadores de cigosidad SQ21948, SQ22176, SQ24635 (resuspendidos en 18 megohm de agua hasta una concentración de 20 uM para cada cebador) en una concentración final de 1.0 µ? (por ejemplo, en un tubo microcentrífugo, lo siguiente debe añadirse para lograr 500 µ? a una concentración final de 20 uM: 100 µ? del Cebador 1 a una concentración de 100 µ?; 100 µ? del Cebador 2 a una concentración de 100 µ?; 300 µ? o 18 megohm de agua). Paso 4: 0.2 µ? de la sonda de cigosidad MGB marcado con 6-FAM™ PB4213 (SEQ ID NO: 15) (resuspendido en 18 megohm de agua a una concentración de 10 µ?) en una concentración final de 0.2 µ?. Paso 5: 0.5 µ? de mezcla del cebador de control interno SQ22176 (SEQ ID NO: 13) y el cebador de control interno SQ24635 (SEQ ID NO:14) (resuspendida en 18 megohm de agua a una concentración de 20 uM para cada cebador) en una concentración final de 1.0 µ? para cada cebador. Paso 6: 0.2 µ? de la sonda de control interno PB10787 marcado con VIC™ (SEQ ID NO: 16) (resuspendido en 18 megohm de agua a una concentración de 10 µ?) en una concentración final de 0.2 µ?. Paso 7: 3.0 µ? de ADN extraído (molde) para cada muestra con cada una de las siguientes conteniendo 1. Las muestras de hojas a ser analizadas; 2. Control negativo (ADN no transgénico); 3. Control de agua negativo (sin molde); 4. ADN de MON 88302 de control positivo Paso 8: Condiciones del termociclador como siguen: Un ciclo a 50 °C durante 2 minutos; Un ciclo a 95 °C durante 10 minutos; diez ciclos de 95 °C durante 15 segundos, luego 64°C durante 1 minuto con -1 °C/ciclo; treinta ciclos de 95 °C durante 15 segundos luego 54 °C 1 minuto; ciclo final de 10 °C. Puede utilizarse un sistema 9700 o termociclador Stratagene Robocycler, motor MJ motor ADN PTC-225. Otros métodos y aparatos son conocidos para los expertos en la técnica y serían útiles para producir amplicones para identificar el ADN del evento MON 88302 en una muestra biológica. Cuando se llevan a cabo amplificaciones térmicas en el gradiente Eppendorf Mastercycler o motor MJ, el termociclador debe utilizarse en el modo calculado. Cuando se llevan a cabo amplificaciones térmicas en el Perkin-Elmer 9700, el termociclador debería ajustarse con la velocidad de rampa al máximo.

EJEMPLO 5 Identificación del evento MON 88302 en cualquier actividad de reproducción de MON 88302 Este ejemplo describe cómo se puede identificar el evento MON88302 en la progenie de cualquier actividad de reproducción usando plantas que comprenden el evento MON 88302. Se utilizan pares de cebadores del ADN del evento para producir un amplicón diagnóstico para el evento MON88302. Un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 comprende al menos una secuencia de unión, proporcionada en la presente como la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 ([A] y [B], respectivamente como se ilustra en la Figura 1). La SEQ ID NO:1 ([A] de la Figura 1) es una secuencia de nucleótidos que corresponde a la unión de la secuencia flanqueante con el extremo 5' del inserto del transgén (posiciones 762 a la 821 de la SEQ ID NO:3 [C], ver la Figura 1 ). La SEQ ID NO:2 ([B] ver la Figura 1) es una secuencia de nucleótidos que corresponde a la unión de la secuencia flanqueante con el extremo 3' del inserto del transgén (posiciones 313 a la 372 de la SEQ ID NO:4 [D], ver la Figura 1).

Los pares de cebadores del evento que producirán un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 incluyen pares de cebadores diseñados usando las secuencias flanqueantes (SEQ ID NO:3 y 4) y la secuencia de ADN transgénico insertado (SEQ ID NO:5). Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que al menos se encuentran 40 nucleótidos de la SEQ ID N0:1 , se diseña una molécula de cebador directo basada en la SEQ ID NO:3 a partir de las bases 1 a 791 y una molécula de cebador inverso basada en la secuencia de ADN del cásete de expresión insertado, la SEQ ID NO:5 de las posiciones 1 a la 4427 en la cual las moléculas del cebador poseen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridarse de manera específica con la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:5. Para adquirir un amplicón diagnóstico en el que al menos se encuentren 40 nucleótidos de la SEQ ID NO:2, se diseña una molécula de cebador directo basada en el cásete de expresión insertado, SEQ ID NO:5 de las posiciones 1 a la 4427 y una molécula de cebador inversa basada en la secuencia flanqueante 3', la SEQ ID NO:4 a partir de las bases 343 hasta 1250, en la cual las moléculas del cebador poseen una longitud suficiente de nucleótidos contiguos para hibridarse de manera específica con la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:5. A fines prácticos, se deberían diseñar cebadores que producen amplicones dentro de un intervalo de tamaño limitado, por ejemplo, entre 100 y 1000 bases. Los amplicones de tamaño más pequeño (menor longitud de polinucleótidos) en general pueden ser producidos de forma más confiable en reacciones de PCR, permiten ciclos de tiempo más cortos y pueden ser fácilmente separados y visualizados en geles de agarosa o pueden adaptarse para utilizarse en ensayos tipo TAQMAN® finales. Pueden producirse amplicones más pequeños y detectarse mediante métodos conocidos en la técnica de detección de amplicones. Además, los amplicones producidos usando pares de cebadores pueden clonarse en vectores, propagarse, aislarse y secuenciarse o pueden secuenciarse directamente con métodos bien establecidos en la técnica. Cualquier par de cebadores derivado de la combinación de la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO:5 o la combinación de la SEQ ID NO:4 y la SEQ ID NO:5 que sean útiles en el método de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 o progenie de este es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebador de polinucleótido de ADN aislado única que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:3, o su complemento, que sea útil en un método de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico para las plantas que contienen el evento MON 88302 o progenie de estas es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebador de polinucleótido de ADN aislada única que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:4, o su complemento, que sea útil en un método de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico para las plantas que contienen en el evento MON 88302 o progenie de estas es un aspecto de la presente invención. Cualquier molécula de cebador de polinucleótido de ADN aislada única que comprende al menos 11 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:5, o su complemento, que sea útil en un método de amplificación de ADN para producir un amplicón diagnóstico para las plantas que contienen en el evento MON 88302 o progenie de estas es un aspecto de la presente invención.

Un ejemplo de las condiciones de amplificación para este análisis se describe en el Ejemplo 4 anteriormente. Sin embargo, cualquier modificación de estos métodos o el uso de cebadores de ADN homólogos o complementarios de la SEQ ID NO:3 o SEQ ID NO:4 o secuencias de ADN del inserto de transgén (SEQ ID NO:5) del evento MON 88302 que produzca un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 se encuentra dentro del alcance de la presente descripción. Un amplicón diagnóstico comprende una molécula de ADN homologa o complementaria de al menos un ADN deunión transgénica/genómica (SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8) o una porción sustancial de esta.

Un análisis para el evento MON 88302 en una muestra puede incluir un control positivo a partir del evento MON 88302, un control negativo a partir de una planta comparable que no sea el evento MON 88302 (por ejemplo, de modo no taxativo, Brassica napus), y/o un control negativo que no contiene ADN genómico. Un par de cebadores que amplifica una molécula de ADN endógeno puede servir corno un control interno para las condiciones de amplificación de ADN. Cualquier fragmento de una secuencia seleccionada de las secuencias como se establecen en las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO.4, o SEQ ID NO:5 pueden usarse como un cebador de amplificación de ADN para la producción de un amplicón mediante los métodos descritos en el Ejemplo 4 y dicho amplicón puede ser diagnóstico para el evento MON 88302 cuando se usa el evento MON 88302 como molde para dicha reacción de amplificación diagnóstica. El uso de estas secuencias de cebadores de ADN con modificaciones a los métodos descritos en el Ejemplo 4 se encuentra dentro del alcance de la invención. El amplicón producido por al menos una secuencia de cebador de ADN derivada de las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:5 que es diagnóstica para el evento MON 88302 es un aspecto de la invención.

Por lo tanto, pueden diseñarse los kits de detección de ADN, que contienen al menos un cebador de ADN con nucleótidos contiguos de una longitud suficiente derivado de las SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, o SEQ ID NO:5 y que, cuando se utilizan en un método de amplificación de ADN, producen un amplicón diagnóstico para una planta que comprende el evento MON 88302 o su progenie, y estos son un aspecto de la invención. Una parte de planta o semilla o producto de materia prima que produce un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 cuando se prueba en un método de amplificación de ADN es un aspecto de la invención. El ensayo para el amplicón del evento MON 88302 puede llevarse a cabo mediante el uso de cualquier termociclador o sistema de amplificación de ácidos nucleicos que puede usarse para producir un amplicón diagnóstico del evento MON 88302, como se describió en la presente.

Se ha realizado un depósito de una muestra representativa de la semilla del evento MON 88302 descrito anteriormente y citado en las reivindicaciones conforme al Tratado de Budapest con la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110. El número de adquisición ATCC para su depósito es PTA-10955. El depósito se mantendrá durante un período de 30 años, o 5 años después del último pedido, o durante el período de vigencia de la patente, según cual sea más largo y se reemplazará cuando sea necesario durante ese período.

Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, debería ser evidente para los expertos en la técnica que la disposición y detalles de la invención pueden ser modificados sin alejarse de tales principios. Reivindicamos que todas las modificaciones se encuentran dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (35)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula de ADN que comprende: a. una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8; b. una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos que posee al menos 95% de identidad con respecto a la SEQ ID NO:6; o c. una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia complementaria de (a) o (b).

2. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN deriva del evento MON 88302, una muestra representativa de semilla que comprende el evento MON 88302 ha sido depositada con el número de adquisición de la ATCC PTA-10955.

3. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN está comprendida en una planta, célula de planta, semilla, progenie de planta, parte de planta o producto de materia prima de Brassica.

4. - La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN es un amplicón producido a partir de una molécula de molde derivada del ADN del evento MON 88302.

5.- La molécula de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha molécula de ADN es diagnóstico de la presencia del evento MON 88302.

6.- Una sonda de polinucleótidos diagnóstico para la presencia del evento 88302, en donde dicha sonda de polinucleótidos tiene una longitud suficiente como para unirse a una molécula de ácidos nucleicos que comprende la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 y en donde dicha sonda de polinucleótidos se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que comprende la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2 y no se híbrida en condiciones de hibridación rigurosas con una molécula de ADN que no comprende la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2.

7. - Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN derivada del evento MON 88302 en una muestra de ADN, dicho método comprende: a. poner en contacto una muestra de ADN con la sonda de polinucleótidos de la reivindicación 6; b. someter dicha muestra y dicha sonda de polinucleótidos a condiciones de hibridación rigurosas; y c. detectar la hibridación de dicha sonda de polinucleótidos con dicha molécula de ADN, en donde la detección de dicha hibridación es diagnóstico para la presencia de dicha molécula de ADN derivada del evento MON 88302 en dicha muestra de ADN.

8. - Un par de moléculas de ADN que consisten en una primera molécula de ADN y una segunda molécula de ADN diferente de la primera molécula de ADN, en donde dichas moléculas de ADN comprenden una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos con nucleótidos contiguos de longitud suficiente de la SEQ ID NO:6, o un complemento de esta, para funcionar como cebadores de ADN cuando se utilizan juntos en una reacción de amplificación con molde derivado del evento MON 88302 para producir un amplicón diagnóstico para el ADN del evento MON 88302 en una muestra.

9. - El par de moléculas de ADN de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque dicho amplicón comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO:1 y la SEQ ID NO:2.

10. - Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN derivada del evento MON 88302 en una muestra de ADN, dicho método comprende: a. poner en contacto una muestra de ADN con el par de moléculas de ADN de la reivindicación 8; b. llevar a cabo una reacción de amplificación suficiente para producir un amplicón que comprende una molécula de polinucleótidos que tiene al menos 40 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:2¡ y c. detectar dicho amplicón; en donde la detección de dicho amplicón es diagnóstico para la presencia de dicha molécula de ADN derivada del evento MON 88302 en dicha muestra de ADN.

11 - Un kit de detección de ADN que comprende al menos una molécula de polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos de nucleótidos contiguos de longitud suficiente de la SEQ ID NO:6, y complementos de ésta, para funcionar como un cebador de ADN o sonda de polinucleótidos específica para detectar la presencia de ADN derivado del evento MON 88302, en donde la detección de dicho ADN es diagnóstica para la presencia de dicho ADN del evento MON 88302 en una muestra.

12.- Una planta, semilla, célula o parte de planta de ésta que comprende una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID ??. , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7, y SEQ ID NO:8.

13. - La planta, semilla, célula, o parte de planta de ésta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha planta, semilla, célula o parte de planta de ésta es tolerante al tratamiento con herbicida glifosato.

14. - La planta, semilla, célula o parte de planta de ésta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque cuyo genoma produce un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 cuando se prueba en un método de amplificación de ADN.

15. - La parte de la planta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicha parte de planta se selecciona del grupo que consiste en polen, óvulo, vaina, flor, tejido de raíz, tejido de tallo o tejido de hoja.

16. - Una planta, semilla, célula o parte de planta de ésta que comprende el evento MON 88302, una muestra representativa de semilla que comprende el evento MON 88302 ha sido depositada con el número de adquisición PTA-10955 de la ATCC.

17. - La planta, semilla, célula, o parte de planta de ésta de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicha planta, semilla, célula o parte de planta de ésta es tolerante al tratamiento con herbicida glifosato.

18. - La planta o semilla de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque dicha planta o semilla es un híbrido que posee al menos un progenitor derivado del evento MON 88302.

19. - Una semilla, planta, o parte de ésta que tiene la capacidad de producir un amplicón diagnóstico para el evento MON 88302 cuando se prueba en un método de amplificación de ADN, en donde dicho amplicón comprende una molécula de ADN que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8

20.- Un material de planta no viviente derivado del eve'nto MON 88302 que comprende una molécula de ADN que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

21. - Un microorganismo que comprende una molécula de polinucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

22. - El microorganismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado además porque dicho microorganismo en una célula de planta.

23. - Un producto de materia prima derivado de una planta, semilla, célula o parte de planta de ésta que comprende el evento MON 88302.

24. - El producto de materia prima de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho producto de materia prima comprende una molécula de ADN que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.

25. - El producto de materia prima de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque dicho producto de materia prima se selecciona del grupo que consiste en semillas enteras o procesadas, pienso para animales, aceite, harina de maíz, harina, copos, salvado, biomasa y productos combustibles.

26. - Un método para controlar las malas hierbas en un campo que comprende plantas que contienen el evento MON 88302, dicho método comprende tratar el campo con una cantidad de glifosato eficaz para controlar el crecimiento de malas hierbas en dicho campo sin dañar dichas plantas que contienen el evento MON 88302.

27. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicha cantidad de glifosato eficaz para controlar el crecimiento de las malas hierbas es de alrededor de 0.14 Kg/ha a alrededor de 7.16 Kg/ha.

28. - El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque dicha cantidad de glifosato eficaz para controlar el crecimiento de las malas hierbas es de alrededor de 1.79 Kg/ha.

29. - El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque dicho tratamiento del campo es realizado luego de la etapa de 6 hojas de dichas plantas que contienen el evento MON 88302.

30. - Un método para producir una planta de Brassica que tolere la aplicación de herbicida glifosato que comprende: a. cruzar una planta de Brassica tolerante al glifosato que contiene el evento MON 88302 con una segunda planta de Brassica, y de esta manera producir una semilla; b. cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de progenies de planta; c. seleccionar una progenie de planta que contenga el evento MON 88302.

31 . - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha selección de progenie de planta comprende tratar dichas progenies de planta con glifosato y seleccionar una progenie de planta que sea tolerante al glifosato.

32. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha selección de una progenie de planta comprende identificar una progenie de planta que contenga una molécula de ADN que tenga una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:7 SEQ ID NO:8.

33. - El método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque dicha segunda planta de Brassica carece de tolerancia al herbicida glifosato.

34. - Un método para producir una planta de Brassica que tolere la aplicación de herbicida glifosato que comprende: a. autofecundar una planta de Brassica del evento con tolerancia al glifosato que contenga el evento MON 88302, y de esta manera producir una semilla; b. cultivar dicha semilla para producir una pluralidad de progenies de planta; c. seleccionar una progenie de planta que contenga el evento MON 88302.

35. - Un método para determinar la cigosidad de una planta o semilla del evento MON 88302 que comprende: a. poner en contacto una muestra que contiene ADN con un grupo de cebadores que comprenden las SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO: 14, que cuando se utilizan en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico del evento MON 88302 producen un primer amplicón que es diagnóstico para el evento MON.88302; b. llevar a cabo una reacción de amplificación de ácido nucleicos, produciendo de esta manera dicho primer amplicón; c. detectar dicho primer amplicón; d. poner en contacto dicha muestra que contiene ADN con dicho grupo de cebadores, que cuando se utiliza en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos con ADN genómico de plantas produce un segundo amplicón que contiene el ADN genómico natural homólogo a la región genómica de una inserción de transgén identificada como el evento MON 88302; e. llevar a cabo una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, produciendo de esta manera dicho segundo amplicón; f. detectar dicho segundo amplicón; y g. comparar dicho primer y segundo amplicones en una muestra, en donde la presencia de ambos amplicones indica que dicha muestra es heterocigota para la inserción del transgén.