KR20130086599A - 유전자 이식 브라씨카의 사건 mon 88302 및 이것의 사용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글라이포세이트 제초제에 저항성을 나타내는 유전자 이식 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 제공한다. 본 발명은 또한 해당 사건과 관련된 종자, 식물 부분, 세포, 일반 상품, 및 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 사건에 독특하며 브라씨카 나푸스(Brassica napus) 식물의 게놈 내로 유전자 이식 DNA의 삽입에 의해 만들어지는 DNA 분자를 제공한다.
Description
관련 출원과의 상호참조
이 출원은 2010년 6월 4일 출원된 미국 가특허출원 제61/351,317호의 우선권을 주장하며, 이 기초출원은 본 명세서에 그것의 전문이 참조로 포함되어 있다.
서열목록의 포함
21킬로바이트(마이크로소프트 윈도우(등록상표)에서 측정한 용량)이며, 2011년 5월 31일 만들어진 파일명 “MONS291WO_ST25.txt로 포함된 서열목록은 본 명세서와 함께 전자적 제출로 출원되며 본 명세서에 참조로 포함된다.
본 발명의 기술분야
본 발명은 생명공학 및 농업분야 및 더 구체적으로는 유전자 이식 작물 식물 분야에 관한 것이다.
브라씨카(Brassica) 작물은 세계의 많은 지역에서 중요하다. 제초제 저항성과 같은 개선된 특성을 가지는 작물을 생산하기 위하여 생명공학 방법이 이들 작물에 적용될 수 있다. 제초제 저항성은 이러한 저항성을 제공할 수 있는 이식유전자의 발현에 의해 유전자 이식 식물 내에서 달성될 수 있다. 식물 내 이식유전자의 발현은 이식유전자 카세트 내 사용된 조절 구성요소, 이식유전자 삽입물의 염색체 위치, 및 통합 부위에 가까운 임의의 내인성 조절 구성요소의 근처와 같은 인자의 조합에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, 이식유전자 발현의 전반적 수준에서 또는 유사하게 만들어진 사건(event) 간 이식유전자 발현의 공간적 또는 시간적 패턴에서 큰 변화가 있을 수 있다는 것이 관찰되었다. 이런 이유로, 상업적 농업 목적에 유용한 한 사건을 궁극적으로 확인하기 위하여 수백 가지의 개개의 식물 형질전환 사건을 만들고 시험하는 것이 필요할 수 있다. 이러한 사건은, 일단 원하는 형질전환 발현 및 분자적 특징을 가지는 것으로 확인된다면, 식물 육종 방법을 사용하여 다른 유전적 배경 내로 해당 특성을 유전질침투(introgressing)시키기 위해 사용될 수 있다. 얻은 자손은 유전자 이식 사건을 함유하며, 따라서 본래 형질전환주의 특성에 대해 해당 유전자 이식 발현 특징을 가진다. 이는 개선된 특성을 포함하며 특이적 국소 생장 조건에 적합하게 된 다수의 상이한 작물 품종을 만들기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 접수번호 PTA-10955로 미국 미생물보존센터(American Type Culture Collection, ATCC)에 기탁된 대표적 종자 샘플인, 사건 MON 88302를 포함하는 유전자 이식 식물 및 종자를 제공한다. 해당 사건을 포함하는 식물은 글라이포세이트(glyphosate) 제초제 시용(application)에 상업적으로 허용가능한 저항성을 나타낸다. 본 발명은 해당 사건을 포함하는 자손 식물, 식물 부분, 및 세포; 해당 사건과 관련된 재조합 DNA 분자 및 이들 분자의 사용방법; 해당 사건으로부터 유래된 또는 해당 사건을 포함하는 일반 상품(commodity product); 및 해당 사건의 사용방법을 제공한다.
본 발명은 해당 사건을 포함하는 식물, 종자, 세포, 자손 식물, 또는 식물 부분 및 해당 사건을 포함하는 식물, 세포, 식물 부분, 또는 종자로부터 유래된 일반 상품을 제공한다. 따라서 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8, 및 이들의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하는 식물, 종자, 세포, 자손 식물, 식물 부분 또는 일반 상품을 제공한다. 본 발명은, 예를 들어 DNA 증폭 방법에서 본 발명의 DNA 분자를 포함하는 앰플리콘을 생성하는 재조합 DNA 분자를 포함하는 식물, 종자, 세포, 자손 식물, 또는 식물 부분을 제공한다.
본 발명은 사건과 관련된 DNA 분자를 제공한다. 이 DNA 분자는 이식유전자 삽입의 접합을 나타내는 또는 접합으로부터 유래되는 뉴클레오타이드 서열 및 사건 MON 88302의 측면의 게놈 DNA, 및/또는 삽입 DNA 측면 게놈 DNA 영역, 및/또는 삽입 부위 측면 통합된 이식유전자 DNA 영역, 및/또는 통합된 유전자 이식 발현 카세트의 영역, 및/또는 이들 영역 중 어떤 것의 연속 서열을 포함할 수 있다. 본 발명은 또한 사건을 위한 진단용 프라이머 및 프로브로서 유용한 DNA 분자를 제공한다. 이들 분자를 포함하는 식물, 세포, 식물 부분, 일반 상품, 자손, 및 종자가 제공된다.
본 발명은 사건으로부터 유래된 DNA 존재오무를 검출하는데 유용한 방법, 조성물, 및 키트를 제공한다. 본 발명은 해당 사건으로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용될 때 사건을 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 프라이머 세트와 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계, 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이에 의해 앰플리콘을 생성하는 단계, 및 앰플리콘을 검출하는 단계에 의한 사건 검출 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 해당 사건으로부터의 게놈 DNA와 혼성화 반응에 사용될 때, 사건에 특이적인 DNA 분자와 혼성화하는 프로브와 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계, 혼성화 반응을 수행하는 단계, 및 DNA 분자에 프로브의 혼성화를 검출하는 단계에 의한 사건 검출 방법을 제공한다. 사건으로부터 유래된 DNA 존재 검출에 유용한 본 발명의 방법 및 조성물을 포함하는 키트가 또한 제공된다.
본 발명은 해당 사건을 포함하는 식물을 심는 단계(즉 해당 사건을 포함하는 식물 종자) 다음에, 해당 사건을 포함하는 식물을 손상시키지 않고 잡초를 제거할 수 있는 글라이포세이트의 유효량을 시용하는 단계에 의해 들판에서 잡초를 제거하는 방법을 제공한다.
본 발명은 해당 사건을 포함하거나 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 글라이포세이트 저항성 식물을 제2 식물과 교배하고, 이에 의해 종자를 생산하는 단계, 종자를 생장시켜 자손 식물을 생산하는 단계, 글라이포세이트로 자손 식물을 처리하는 단계, 및 해당 사건을 포함하며 글라이포세이트에 저항성이 있는 자손 식물을 선택하는 단계에 의해 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 식물 및/또는 종자 생산 방법을 제공한다. 본 발명은 해당 사건을 포함하거나 또는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 글라이포세이트 저항성 식물을 자가생식하여, 이에 의해 종자를 생산하는 단계, 종자를 생장시켜 자손 식물을 생산하는 단계, 해당 자손 식물을 글라이포세이트로 처리하는 단계; 및 해당 사건을 포함하며 글라이포세이트에 저항성이 있는 자손 식물을 선택하는 단계에 의한 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 식물 및/또는 종자의 생산 방법을 제공한다.
본 발명은 사건 MON 88302로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용될 때 해당 사건을 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 제1 프라이머 세트와 DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계, 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이에 의해 앰플리콘을 생성하는 단계, 앰플리콘을 검출하는 단계, 식물로부터의 게놈 DNA와 핵산 증폭 반응에 사용될 때 사건 MON 88302로 확인되는 유전자 이식 삽입의 게놈 영역과 상동성인 천연 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하는 제2 프라이머 세트와 해당 샘플을 접촉시키는 단계, 핵산 증폭 반응을 수행하고, 이에 의해 제2 앰플리콘을 생성하는 단계, 제2 앰플리콘을 검출하는 단계, 및 샘플 내 제1 앰플리콘과 제2 앰플리콘을 비교하는 단계를 포함하되, 상기 두 앰플리콘의 존재는 해당 샘플을 나타내며, 따라서 식물 또는 종자는 이식유전자 삽입에 이형 접합적인 것인, 식물 또는 종자의 접합상태(zygosity) 결정방법을 제공한다.
본 발명의 앞서 언급한 및 다른 양태는 하기 상세한 설명에서 더욱 명백해질 것이다.
도 1: 사건 MON 88302의 다이어그램 표현; [A]는 5' 접합 영역의 상대적 위치에 대응하고; [B]는 3' 접합 영역의 상대적 위치에 대응하며; [C]는 삽입된 유전자 이식 DNA의 측면 영역 및 5' 말단 일부의 상대적 위치에 대응하고; [D]는 해당 삽입 유전자 이식 DNA의 3' 측면 영역 및 3' 말단 일부의 상대적 위치에 대응하며; [E]는 유전자 이식 발현 카세트를 나타내고; [F]는 브라씨카 나푸스(Brassica napus) 게놈의 측면 서열 및 유전자 이식 발현 카세트의 연속 서열을 나타낸다.
도 2: 글라이포세이트가 4 내지 6개의 잎 단계에 시용될 때 MON 88302과 비교하여 RT73 사건의 곡물 수확량을 나타낸다. RT73은 RR1로 지정된다.
도 3: 글라이포세이트가 제1 개화에 시용될 때 MON 88302와 비교하여 RT73 사건의 곡물 수확량을 나타낸다. RT73은 RR1으로 지정된다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 - 브라씨카 나푸스 게놈 DNA와 통합된 유전자 이식 발현 카세트 사이의 5' 접합 서열을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3([C], 도 1 참조)의 위치 762 내지 821 및 서열번호 6의 위치 762 내지 821에 대응한다.
서열번호 2 - 통합된 발현 카세트와 브라씨카 나푸스 게놈 DNA 사이의 3' 접합을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4([D], 도 1을 참조)의 위치 313 내지 372, 및 서열번호 6의 위치 5189 내지 5248에 대응한다.
서열번호 3 - 유전자 이식 DNA 영역까지 및 유전자 이식 DNA 영역을 포함하는 사건 MON 88302의 삽입 DNA 측면의 5' 서열. 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 762 내지 821은 서열번호 1의 위치 1 내지 60에 대응하며; 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 742 내지 841은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100에 대응하고, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 792 내지 956은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 165에 대응한다.
서열번호 4 - 유전자 이식 DNA 영역까지 및 유전자 이식 DNA 영역을 포함하는 사건 MON 88302의 삽입 DNA 측면의 3' 서열. 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 313 내지 372는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 60에 대응하며; 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 293 내지 392는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100에 대응하고, 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 342는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 위치 4086 내지 4427에 대응한다.
서열번호 5 - 글라이포세이트 제초제 저항성을 부여하는 통합된 유전자 이식 발현 카세트의 서열. 서열번호 5는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 위치 792 내지 5218에 대응한다.
서열번호 6 - 사건 MON 88302의 삽입된 DNA 측면의 5' 서열의 콘틱(contig)을 나타내는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3), 통합된 발현 카세트의 서열(서열번호 5), 및 사건 MON 88302의 통합된 DNA 측면의 3' 서열(서열번호 4).
서열번호 7 - 브라씨카 나푸스 게놈 DNA와 통합된 유전자 이식 발현 카세트 사이의 5' 접합 서열을 나타내는 100-뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3([C], 도 1을 참조)의 위치 742 내지 841 및 서열번호 6의 위치 742 내지 841에 대응한다.
서열번호 8 - 통합된 발현 카세트와 브라씨카 나푸스 게놈 DNA 사이의 3' 접합을 나타내는 100-뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4([D], 도 1을 참조)의 위치 293 내지 392, 및 서열번호 6의 위치 5169 내지 5268에 대응한다.
서열번호 9 - 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프라이머 SQ20901. 프라이머 SQ20901은 3' 이식유전자 삽입 가장자리 근처의 영역에서 삽입된 발현 카세트에 상보적이다. 프라이머 SQ20901와 SQ23770의 조합을 사용하여 만들어진 앰플리콘(서열번호 10)은 사건 MON 88302의 존재에 대한 긍정적 결과이다.
서열번호 10은 프라이머 SQ23770로 언급되며 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프라이머 서열. 프라이머 SQ23770은 삽입 발현 카세트 측면이며 이식유전자 DNA 삽입 가장자리 근처의 3' 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ20901(서열번호 9)와 SQ23770의 조합을 사용하여 생성된 앰플리콘은 사건 MON 88302의 존재에 대한 긍정적 결과이다.
서열번호 11은 프로브 PB10164로 언급되며 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프로브의 서열. 이는 삽입된 발현 카세트 측면이며 이식유전자 DNA 삽입 가장자리 근처의 3' 영역에 상보적이다. 이 프로브는 6FAM(상표명)-표지 합성 올리고뉴클레오타이드이다. 6FAM(상표명)-표지 프로브 PB10164와 조합하여 프라이머 SQ20901 및 SQ23770(서열번호 9 내지 10)을 사용하는 증폭 반응에서 형광 신호의 방출은 TAQMAN(등록상표) 분석에서 사건 MON 88302의 진단용이다.
서열번호 12는 프라이머 SQ21948로 언급되며 MON 88302 사건 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열.
서열번호 13은 프라이머 SQ24635로 언급되며 브라씨카 나푸스 야생형 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열.
서열번호 14는 프라이머 SQ22176로 언급되며 MON 88302 사건 및 브라씨카 나푸스 야생형 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머 서열.
서열번호 15는 MON 88302 사건 접합상태 분석을 위한 프로브(PB4213) 서열.
서열번호 16은 브라씨카 나푸스 야생성 접합상태 분석에 대한 프로브(PB10787) 서열.
서열번호 17은 프라이머 SQ2563로 언급되며, TAQMAN(등록상표) 분석의 내부 대조군으로 사용되는 프라이머 서열.
서열번호 18은 프라이머 SQ2564로 언급되며, TAQMAN(등록상표) 분석의 내부 대조군으로 사용되는 프라이머 서열.
서열번호 19는 TAQMAN(등록상표) 분석 내 내부 대조군으로 사용된 VIC(상표명)-표지 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브(PB0751)의 서열.
도 2: 글라이포세이트가 4 내지 6개의 잎 단계에 시용될 때 MON 88302과 비교하여 RT73 사건의 곡물 수확량을 나타낸다. RT73은 RR1로 지정된다.
도 3: 글라이포세이트가 제1 개화에 시용될 때 MON 88302와 비교하여 RT73 사건의 곡물 수확량을 나타낸다. RT73은 RR1으로 지정된다.
서열의 간단한 설명
서열번호 1 - 브라씨카 나푸스 게놈 DNA와 통합된 유전자 이식 발현 카세트 사이의 5' 접합 서열을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3([C], 도 1 참조)의 위치 762 내지 821 및 서열번호 6의 위치 762 내지 821에 대응한다.
서열번호 2 - 통합된 발현 카세트와 브라씨카 나푸스 게놈 DNA 사이의 3' 접합을 나타내는 60개 뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4([D], 도 1을 참조)의 위치 313 내지 372, 및 서열번호 6의 위치 5189 내지 5248에 대응한다.
서열번호 3 - 유전자 이식 DNA 영역까지 및 유전자 이식 DNA 영역을 포함하는 사건 MON 88302의 삽입 DNA 측면의 5' 서열. 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 762 내지 821은 서열번호 1의 위치 1 내지 60에 대응하며; 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 742 내지 841은 서열번호 7의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100에 대응하고, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 위치 792 내지 956은 서열번호 5의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 165에 대응한다.
서열번호 4 - 유전자 이식 DNA 영역까지 및 유전자 이식 DNA 영역을 포함하는 사건 MON 88302의 삽입 DNA 측면의 3' 서열. 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 313 내지 372는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 60에 대응하며; 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 293 내지 392는 서열번호 8의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 100에 대응하고, 서열번호 4의 뉴클레오타이드 위치 1 내지 342는 서열번호 5의 뉴클레오타이드 위치 4086 내지 4427에 대응한다.
서열번호 5 - 글라이포세이트 제초제 저항성을 부여하는 통합된 유전자 이식 발현 카세트의 서열. 서열번호 5는 서열번호 6의 뉴클레오타이드 위치 792 내지 5218에 대응한다.
서열번호 6 - 사건 MON 88302의 삽입된 DNA 측면의 5' 서열의 콘틱(contig)을 나타내는 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3), 통합된 발현 카세트의 서열(서열번호 5), 및 사건 MON 88302의 통합된 DNA 측면의 3' 서열(서열번호 4).
서열번호 7 - 브라씨카 나푸스 게놈 DNA와 통합된 유전자 이식 발현 카세트 사이의 5' 접합 서열을 나타내는 100-뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3([C], 도 1을 참조)의 위치 742 내지 841 및 서열번호 6의 위치 742 내지 841에 대응한다.
서열번호 8 - 통합된 발현 카세트와 브라씨카 나푸스 게놈 DNA 사이의 3' 접합을 나타내는 100-뉴클레오타이드 서열. 이 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 4([D], 도 1을 참조)의 위치 293 내지 392, 및 서열번호 6의 위치 5169 내지 5268에 대응한다.
서열번호 9 - 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프라이머 SQ20901. 프라이머 SQ20901은 3' 이식유전자 삽입 가장자리 근처의 영역에서 삽입된 발현 카세트에 상보적이다. 프라이머 SQ20901와 SQ23770의 조합을 사용하여 만들어진 앰플리콘(서열번호 10)은 사건 MON 88302의 존재에 대한 긍정적 결과이다.
서열번호 10은 프라이머 SQ23770로 언급되며 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프라이머 서열. 프라이머 SQ23770은 삽입 발현 카세트 측면이며 이식유전자 DNA 삽입 가장자리 근처의 3' 영역에 상보적이다. 프라이머 SQ20901(서열번호 9)와 SQ23770의 조합을 사용하여 생성된 앰플리콘은 사건 MON 88302의 존재에 대한 긍정적 결과이다.
서열번호 11은 프로브 PB10164로 언급되며 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 사용된 프로브의 서열. 이는 삽입된 발현 카세트 측면이며 이식유전자 DNA 삽입 가장자리 근처의 3' 영역에 상보적이다. 이 프로브는 6FAM(상표명)-표지 합성 올리고뉴클레오타이드이다. 6FAM(상표명)-표지 프로브 PB10164와 조합하여 프라이머 SQ20901 및 SQ23770(서열번호 9 내지 10)을 사용하는 증폭 반응에서 형광 신호의 방출은 TAQMAN(등록상표) 분석에서 사건 MON 88302의 진단용이다.
서열번호 12는 프라이머 SQ21948로 언급되며 MON 88302 사건 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열.
서열번호 13은 프라이머 SQ24635로 언급되며 브라씨카 나푸스 야생형 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머의 서열.
서열번호 14는 프라이머 SQ22176로 언급되며 MON 88302 사건 및 브라씨카 나푸스 야생형 접합상태를 확인하기 위해 사용된 프라이머 서열.
서열번호 15는 MON 88302 사건 접합상태 분석을 위한 프로브(PB4213) 서열.
서열번호 16은 브라씨카 나푸스 야생성 접합상태 분석에 대한 프로브(PB10787) 서열.
서열번호 17은 프라이머 SQ2563로 언급되며, TAQMAN(등록상표) 분석의 내부 대조군으로 사용되는 프라이머 서열.
서열번호 18은 프라이머 SQ2564로 언급되며, TAQMAN(등록상표) 분석의 내부 대조군으로 사용되는 프라이머 서열.
서열번호 19는 TAQMAN(등록상표) 분석 내 내부 대조군으로 사용된 VIC(상표명)-표지 합성 올리고뉴클레오타이드 프로브(PB0751)의 서열.
다음의 정의 및 방법은 본 발명을 더 잘 정의하기 위하여, 본 발명의 실행에서 당업자를 안내하기 위하여 제공된다. 달리 주목되지 않는다면, 용어는 당업자에 의해 통상적인 어구에 따르는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "포함하는"은 "포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌"을 의미한다.
본 발명은 유전자 이식 사건 MON 88302를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "사건"은 염색체의 특정 위치에서 식물의 게놈 내로 유전자 이식 DNA 삽입 결과로 생성된 DNA 분자를 말한다. 사건 MON 88302는 연결 기 N4 상에서 브라씨카 나푸스 A 게놈 내 특정 위치 내로 서열번호 5로서 본 명세서에서 제공되는 서열을 가지는 유전자 이식 DNA의 삽입 결과로 생성된 DNA 분자를 말한다. 사건 MON 88302를 포함하는 식물 및 종자가 또한 본 발명에서 제공된다. MON 88302를 함유하는 종자 샘플은 접수번호 PTA-10955로 미국 미생물보존센터(ATCC)에 기탁되었다. MON 88302를 포함하는 식물은 글라이포세이트 제초제 시용에 상업적으로 허용가능한 저항성을 나타낸다.
사건을 포함하는 식물은 식물 게놈 내 특정 위치 내로 삽입된 이식유전자를 포함하는 본래의 형질전환주를 말할 수 있다. 해당 사건을 포함하는 식물은 또한 식물의 게놈 내 특정 위치 내로 삽입된 이식유전자를 포함하는 본래 형질전환주의 자손을 말할 수 있다. 이러한 자손은 자가생식에 의해 또는 형질전환주 또는 그것의 자손과 다른 식물 사이의 성적 이종 교배에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다른 식물은 동일 또는 상이한 이식유전자 및/또는 비유전자 이식 식물, 예컨대 상이한 품종으로부터의 그것을 포함하는 유전자 이식 식물일 수 있다. 반복친(recurrent parent)으로 반복된 여교배(여교배) 후 조차, 형질전환된 모체로부터 삽입 DNA 및 측면 DNA는 동일 게놈 위치에서 이종교배의 자손 중에 존재한다.
유전자 이식 사건 MON 88302는 브라씨카 나푸스 식물 A 게놈의 연결기 N4 내로 유전자 이식 DNA의 삽입에 의해 만들어졌다(본 명세서에서 서열번호 5로 제공됨). 브라씨카 나푸스는 평지씨로서 흔히 알려져 있으며 특정 재배품종은 카놀라로 언급될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "카놀라" 또는 카놀라 식물"은 카놀라 오일(즉, 2% 미만의 에루스산을 함유하는 특정 품질의 지정을 충족시키는 오일)을 생산하는데 사용될 수 있는 브라씨카 식물을 말하며, 브라씨카 나푸스, 브라씨카 나포브라씨카(Brassica napobrassica), 브라씨카 라파(Brassica rapa), 브라씨카 준세아(Brassica juncea), 및 브라씨카 캄페스트리스(Brassica campestris)의 품종을 포함한다. 브라씨카 나푸스가 브라씨카 라파(앞의 브라씨카 캄페스트리스)와 브라씨카 올레라세아(Brassica oleracea) 둘 다의 게놈의 교배와 보존으로부터 생기는 이질사배체이기 때문에, 유전자 이식 사건 MON 88302를 포함하는 브라씨카 나푸스 식물은 MON 88302 사건, 이에 따른 글라이포세이트 저항성 특성을 브라씨카 속의 다른 구성원 내로 도입하기 위한 육종 방법으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법을 실행하는데 유용한 브라씨카 속 구성원의 예는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 브라씨카 준세아, 브라씨카 나포브라씨카, 브라씨카 올레라세아, 브라씨카 카리나타, 브라씨카 나푸스, 브라씨카 라파 및 브라씨카 캄페스트리스뿐만 아니라 브라씨카 종 사이의 육종을 허용하는 브라씨카 속에 속하는 임의의 다른 식물을 포함한다.
사건 MON 88302를 포함하는 DNA 분자는 삽입 유전자 이식 DNA의 적어도 일부(서열번호 5로 제공됨) 및 삽입 DNA에 바로 인접한 측면의 게놈 DNA의 적어도 일부를 포함하는 DNA 분자를 말한다. 이와 같이, 사건 MON 88302를 포함하는 DNA 분자는 유전자 이식 DNA 삽입의 적어도 일부 및 유전자 이식 DNA 내로 삽입되는 식물 게놈의 특정 영역의 적어도 일부를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 가진다. 주위의 식물 게놈에 관하여 사건 MON 88302 내 삽입 DNA의 배열은 사건 MON 88302에 대해 특이적이고 독특하며, 이러한 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열은 사건 MON 88302에 대해 서술적이며 확인적이다. 이러한 DNA 분자 서열의 예는 본 명세서에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8로 제공된다. 이 DNA 분자는 또한 사건 MON 88302를 포함하는 식물 염색체의 통합 부분이며 식물의 자손으로 통과될 수 있다.
사건 MON 88302는 식물에 시용된 글라이포세이트 제초제에 저항성을 부여한다. "글라이포세이트"는 N-포스포노메틸-글라이신 및 그것의 염을 말한다. 글라이포세이트는 넓은 범위의 식물 종에서 활성을 가지는 제초제이다. 식물 표면에 시용될 때, 글라이포세이트는 식물을 통해 조직적으로 이동한다. 글라이포세이트는 방향족 아미노산의 합성을 위한 전구체를 제공하는 시킴산 경로의 그것의 억제에 기인하여 광독성이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합"(recombinant)은 천연에서 정상적으로 발견되지 않고 인간의 개입에 의해 만들어지는 DNA 및/또는 단백질 및/또는 유기체 형태를 말한다. 이러한 인간 개입은 재조합 DNA 분자 및/또는 재조합 식물을 생산할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "재조합 DNA 분자"는 함께 자연적으로 발생하지 않으며 인간 개입의 결과인 DNA분자의 조합을 포함하는 DNA 분자, 예를 들어 서로 이종성인 적어도 2개의 DNA 분자의 조합을 포함하는 DNA 분자, 및/또는 천연에서 정상적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드 서열로부터 벗어나는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하며 인공적으로 합성된 DNA 분자, 및/또는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 인공적으로 포함된 이식유전자 및 숙주 세포 게놈의 관련된 측면 DNA이다. 재조합 DNA 분자의 예는 브라씨카 나푸스 게놈 내로 이식유전자의 삽입으로부터 초래된 본 명세서에 기재된 DNA 분자인데, 이는 재조합 RNA 및/또는 그 유기체 내 단백질 분자의 발현을 궁극적으로 초래할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, "재조합 식물"은 천연에서 정상적으로 존재하지 않으며, 인간 개입의 결과이고, 이식유전자 및/또는 그것의 게놈 내에 포함된 이종성 DNA 분자를 함유하는 식물이다. 이러한 게놈 변경의 결과로서, 재조합 식물은 관련된 야생형 식물과 명백하게 상이하다. 재조합 식물의 예는 사건 MON 88302를 포함하는 것으로 본 명세서에 기재된 식물이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이식유전자"(trans gene)는 숙주 세포의 게놈 내로 인공적으로 포함된 폴리뉴클레오타이드 분자를 말한다. 이러한 이식유전자는 숙주 세포와 이종성일 수 있다. 용어 "유전자 이식 식물"은 이러한 이식유전자를 포함하는 식물을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성"(heterologous)은 천연에서 제2 분자와 조합하여 정상적으로 발견되지 않는 제1 분자를 말한다. 예를 들어, 분자는 제1 종으로부터 유래될 수 있고 제2 종의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 따라서 분자는 숙주와 이종성일며 숙주 세포 게놈 내로 인공적으로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라"(chimeric)는 제1 DNA 분자를 제2 DNA 분자에 융합시켜 생성되는 단일 DNA 분자를 말하며, 여기서 제1DNA 분자도 제2 DNA 분자도 정상적으로는 그러한 입체배치 즉, 서로 융합된 것으로 발견되지 않는다. 따라서 키메라 DNA 분자는 천연에서 달리 정상적으로 발견되지 않는 신규 DNA 분자이다.
본 발명은 DNA 분자 및 그의 대응하는 뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 본원에 사용된 용어 "DNA 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은 5' (상류) 말단에서 3' (하류) 말단으로 보통 제시되는 DNA 분자의 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 명명법은 미국 연방규정집 § 1.822의 표제 37에서 요구되며 WIPO 표준 ST.25(1998)에서의 표, 즉 부록 2, 표 1 및 3에 개시되어 있는 명명법이다. 본 발명은 유전자 이식 사건 MON 88302에 제공된 2개의 뉴클레오타이드 서열 가닥 중 단지 하나의 가닥에 대해 개시한다. 따라서, 연루 및 일탈에 의해, 완전한 보체 또는 역 보체 서열로 당업계에서 언급되는 상보적 서열은 또한 본 발명의 범주 내에 있으며, 또한 따라서 특허청구범위의 대상 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
삽입된 유전자 이식 DNA의 완전한 뉴클레오타이드에 대응하는 뉴클레오타이드 서열 및 삽입된 유전자 이식 DNA의 말단 중 하나의 측면에 있는 브라씨카 나푸스 게놈 DNA의 실질적 절편은 본 명세서에서 서열번호 6으로 제공된다. 이것의 세분은 서열번호 5로서 제공되는 삽입된 유전자 이식 DNA이다. 삽입된 유전자 이식 DNA의 5' 말단 및 삽입된 DNA의 5' 말단 일부 측면의 게놈 DNA 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 서열번호 3으로 제공된다. 삽입된 유전자 이식 DNA의 3' 말단 및 삽입된 DNA의 3' 말단 일부의 뉴클레오타이드 서열은 본 명세서에서 서열번호 4로 제공된다. 유전자 이식 DNA가 게놈 DNA와 이어지고 연결되는 위치에 걸친 영역은 본 명세서에서 접합으로 지칭된다. "접합 서열" 또는 "접합 영역"은 삽입 유전자 이식 DNA 및 인접한 측면의 게놈 DNA에 걸친 DNA 서열 및/또는 대응하는 DNA 분자를 말한다. 사건 MON 88302의 접합 서열의 예는 본 명세서에서 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 7 및 서열번호 8로 제공된다. 브라씨카 식물 또는 종자로부터 유래된 뉴클레오타이드 분자 내 이들 접합 서열 중 하나의 확인은, DNA가 사건 MON 88302부터 얻어진 것임을 확실하게 하고, 사건 MON 88302로부터의 DNA 샘플의 존재유무를 위한 진단용이다. 서열번호 1은 게놈 DNA와 삽입 DNA의 5' 말단 사이의 접합에 걸친 60개의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 7은 게놈 DNA와 삽입 DNA의 5' 말단 사이의 접합에 걸친 100개의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 2는 게놈 DNA와 삽입 DNA의 3' 말단 사이의 접합에 걸친 60개의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 8은 게놈 DNA와 삽입 DNA의 3' 말단 사이의 접합에 걸친 100개의 뉴클레오타이드 서열이다. 서열번호 1 또는 서열번호 7을 포함하는 유전자 이식 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 임의의 절편은 본 발명의 범주 내에 있다. 서열번호 2 또는 서열번호 8을 포함하는 유전자 이식 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 임의의 절편은 본 발명의 범주 내에 있다. 게다가, 이 단락 내에 기재된 임의의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 임의의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 범주 내에 있다. 도 1은 5' 내지 3'으로 배열된 서열번호 6에 대해 서열번호 1 내지 5 및 서열번호 7 내지 8의 물리적 배열을 도시한다. 본 발명은 또한 서열번호 6의 전장과 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일한 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 존재를 진단하기 위한 프라이머 또는 프로브 중 하나로서 사용될 수 있는 예시적 DNA 분자를 제공한다. 이러한 프라이머 또는 프로브는 표적 핵산 서열에 특이적이며, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법에 의해 사건 MON 88302 핵산 서열의 확인에 유용하다.
"프라이머"(primer)는 열 증폭을 수반하는 특이적 어닐링 또는 혼성화 방법에서 사용에 위해 지정된 전형적으로 매우 정제되고, 분리된 폴리뉴클레오타이드이다. 프라이머 쌍은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 열 증폭에서 브라씨카 나푸스 게놈 DNA의 샘플과 같은 주형 DNA를 사용하여 앰플리콘을 생성할 수 있으며, 이때 이러한 반응으로부터 생성된 해당 앰플리콘은 프라이머가 주형에 혼성화된 2개의 부위 사이에 위치된 주형 DNA의 서열에 대응하는 DNA 서열을 가진다. 본 명세서에서 사용되는 "앰플리콘"은 증폭 기법을 사용하여 합성된 DNA 조각 또는 단편, 즉 증폭 반응의 생성물이다. 본 발명의 한 실시형태에서, 사건 MON 88302을 위한 진단용 앰플리콘은 브라씨카 나푸스 게놈에서 자연적으로 발견되지 않는 서열을 포함한다. 본 발명의 앰플리콘은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 적어도 약 40개의 연속적 뉴클레오타이드, 및 이들의 보체를 포함한다. 프라이머는 상보적 표적 DNA에 혼성화하도록 전형적으로 설계되어 프라이머와 표적 DNA 가닥 사이에 혼성체를 형성하고, 프라이머의 존재는 주형으로서 표적 DNA 가닥을 사용하여 프라이머의 확장(즉, 연장 폴리뉴클레오타이드 분자 내로 추가적인 뉴클레오타이드의 중합화)을 시작하는 중합효소에 의한 인식 지점이다. 본 발명에서 사용되는 프라이머 쌍은 전형적으로 열 증폭 반응 또는 다른 통상적인 핵산 증폭 방법으로 프라이머 쌍의 개개의 구성원에 의한 결합을 위해 표적화된 위치 사이의 폴리뉴클레오타이드 절편을 선형으로 증폭시킬 목적을 위해 이중 가닥 뉴클레오타이드 절편의 마주보는 가닥과 결합하는 2개의 프라이머의 사용을 말하는 것으로 의도된다. 프라이머로서 유용한 예시적 DNA 분자는 서열번호 9 내지 10으로 제공된다. 서열번호 9 및 서열번호 10으로 제공되는 프라이머 쌍은 제1 DNA 분자와 상이한 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자로 사용될 수 있으며, 두 분자는 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6 또는 이들의 보체의 각각의 충분한 길이로 DNA 프라이머로서 작용하며, 따라서 사건 MON 88302로부터 유래된 주형 DNA와 열 증폭 반응에서 함께 사용될 때, 유전자 이식 사건 MON 88302의 3' 일부에 특이적이며 독특한 앰플리콘이 생성된다. 이 예시적 프라이머 쌍은 사건 MON 88302를 위한 진단용인 3' 접합 영역을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있다. 유사하게, 본 발명은 사건 MON 88302을 위한 진단용인 5' 접합 영역을 증폭시키기 위하여 사용될 수 있는 프라이머 쌍을 제공한다. 이러한 프라이머는 제1 DNA 분자와 상이한 제1 DNA 분자 및 제2 DNA 분자를 포함할 수 있으며 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 연속적 뉴클레오타이드 또는 이들의 보체 둘 다의 충분한 길이는 DNA 프라이머로 작용하여, 사건 MON 88302로부터 유래된 주형 DNA와 열 증폭 반응에서 함께 사용될 때, 유전자 이식 사건 MON 88302의 5' 일부에 특이적이며 독특한 앰플리콘이 생성된다.
"프로브"(probe)는 표적 핵산의 가닥에 상보적인 분리된 핵산이다. 본 발명에 따르는 프로브는 데옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라 특정 샘플 내 표적 DNA 서열의 존재를 진단하고, 식별하며, 결정하거나 확인하는데 유용할 수 있는 이러한 결합의 표적 DNA 서열 및 검출에 특이적으로 결합하는 폴리아마이드 및 다른 프로브 물질을 포함한다. 프로브는 통상적인 검출가능 표지 또는 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 리간드, 화학 발광제, 또는 효소에 부착될 수 있다. 본 발명의 한 실시형태에서, 사건 MON 88302을 위한 진단용 프로브는 브라씨카 나푸스 게놈 내에서 자연적으로 발견되지 않는다. 프로브로서 유용한 예시적 DNA 분자는 서열번호 11로 제공된다.
표적 서열에 우선적으로 혼성화하는 능력을 보유하는 표적 서열과 다른 프라이머 및 프로브가 통상적인 방법으로 설계될 수 있지만, 본 발명에 따르는 프로브 및 프라이머는 표적 서열을 확인하기 위한 완전한 서열을 가질 수 있다. 프라이머 또는 프로브로서 작용하는 핵산 분자를 위하여, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에서 안정한 이중 가닥 구조를 형성할 수 있는 서열로 단지 충분하게 상보적으로 될 필요가 있다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법은 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유전자 이식 DNA의 존재를 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 프로브 및 프라이머는 일반적으로 길이로 적어도 약 11개 뉴클레오타이드, 적어도 약 18개 뉴클레오타이드, 적어도 약 24개 뉴클레오타이드, 또는 적어도 약 30개 뉴클레오타이드이다. 이러한 프로브 및 프라이머는 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 DNA 서열에 특이적으로 혼성화한다. 통상적인 엄격 조건은 문헌[Sambrook et al., 1989, 및 Haymes et al ., In: Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)]에 의해 기재된다. 본 명세서에서 사용되는 2개의 핵산 분자는 2개의 분자가 역평행, 이중가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면, 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것을 말한다. 핵산 분자는 그것이 완전한 상보성을 나타낸다면 다른 핵산 분자의 "보체"가 되는 것으로 언급된다. 본 명세서에서 사용되는 분자는 분자 중 하나의 모든 뉴클레오타이드가 다른 것의 뉴클레오타이드와 상보적일 때 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 두 분자는 그것들이 충분한 안정성으로 서로 혼성화되어 그것이 적어도 통상적인 "낮은 엄격도"(low-stringency) 조건 하에 서로 어닐링된 채로 남아있도록 할 수 있다면, "최소로 상보성"인 것으로 언급된다. 유사하게, 해당 분자는 그것들이 충분한 안정성으로 서로 혼성화되어 그것이 통상적인 "높은 엄격도"(high-stringency) 조건 하에 서로 어닐링된 채로 남아있도록 할 수 있다면 "상보적"이 되는 것으로 언급된다. 따라서 완전한 상보성으로부터 일탈은, 이러한 일탈이 분자의 용량이 이중 가닥 구조를 형성하는 것을 완전히 불가능하게 하지 않는한 허용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "분리된"(isolated)은 분자를 그것의 본래 또는 천연 상태로 그것과 정상적으로 결합된 다른 분자로부터 적어도 부분적으로 분리하는 것을 말한다. 한 실시형태에서, 용어 "분리된"은 DNA 분자가 그것의 본래 또는 천연 상태에서 정상적으로 측면의 핵산으로부터 적어도 부분적으로 분리된 DNA 분자를 말한다. 따라서, 예를 들어 재조합 기법의 결과로서 정상적으로 관련된 조절 또는 암호화 서열에 융합된 DNA 분자는 본 명세서에서 분리된 것으로 생각된다. 이러한 분자는 숙주 세포의 염색체 내로 통합되거나 다른 DNA 분자와 함께 핵산 용액 중에 존재할 때조차 분리된 것으로 생각된다.
당업자에게 잘 알려진 다수의 방법이 본 발명에 개시된 DNA 분자, 또는 이것의 단편을 분리하고 조작하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, PCR(중합효소 연쇄 반응) 기법이 특정 출발 DNA 분자를 증폭하고 및/또는 본래 분자의 변이체를 생성하는데 사용될 수 있다. DNA 분자, 또는 이것의 단편은 또한 예컨대 자동화 올리고뉴클레오타이드 신시사이저를 사용하여 흔히 실행되는 화학적 수단에 의해 단편을 직접적으로 합성함으로써 얻을 수 있다.
본 명세서에서 제공되는 DNA 분자 및 대응하는 뉴클레오타이드 서열은 따라서 특히 사건 MON 88302를 확인하고, 사건 MON 88302를 포함하는 식물 변이체 또는 혼성체를 선택하며, 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA 존재를 검출하고, 사건 MON 88302 또는 사건 MON 88302를 포함하는 식물 또는 식물 부분의 존재 및/또는 부재에 대한 샘플 모니터링에 유용하다.
본 발명은 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물 부분(예컨대 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유질, 및 잎), 및 일반 상품을 제공한다. 이 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물 부분, 및 일반 상품은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 즉 예컨대 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 7, 또는 서열번호 8로 제공되는 서열 중 적어도 하나를 가지는 폴리뉴클레오타이드의 검출가능한 양을 함유한다. 본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물 부분은 또한 하나 이상의 추가적인 이식유전자를 함유할 수 있다. 이러한 이식유전자는 원하는 특성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 증가된 내충성, 증가된 물 사용효율, 증가된 수확량 성능, 증가된 내건성, 증가된 종자 품질, 내병성, 개선된 영양 품질, 및/또는 증가된 제조제 저항성을 포함하며, 여기서 원하는 특성은 이러한 추가적인 이식유전자가 없는 비슷한 식물에 대해 측정된다.
본 발명은 사건 MON 88302를 포함하는 유전자 이식 식물로부터 유래된 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 및 식물 부분, 예컨대 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 잎을 제공한다. 사건 MON 88302를 포함하는 종자의 대표적인 샘플은 본 발명을 가능하게 할 목적을 위하여 부다페스트 조약에 따라 기탁되었다. 기탁을 위해 선택된 저장소는 미국 버지니아주 우편번호 20110 매너서스시 유니버시티 블러바드 10801에 소재한 미국 미생물보존센터(ATCC)이다. ATCC 저장소는 사건 MON 88302 종자에 접수번호 PTA-10955를 할당하였다.
본 발명은 그것의 게놈에 존재하는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 7, 또는 서열번호 8을 가지는 DNA 분자를 포함하는 미생물을 제공한다. 이러한 미생물의 예는 유전자 이식 식물 세포이다. 본 발명의 식물 세포와 같은 미생물은 다수의 산업적 적용에서 유용하며, 이에 제한되는 것은 아니지만 (i) 과학적 탐구 또는 산업적 연구를 위한 연구 도구로서 용도; (ii) 이후의 과학적 연구를 위해 또는 산업적 생성물로서 사용될 수 있는 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산 또는 단백질 생성물 또는 소분자를 생성하기 위한 배양물 내 용도; 및 (iii) 이후에 농업 연구 또는 생산을 위해 사용될 수 있는 유전자 이식 식물 또는 식물 조직 배양물을 생성하기 위한 최신 식물 조직 배양물에 의한 용도를 포함한다. 유전자 이식 식물 세포와 같은 미생물의 생산 및 사용은 인간이 만든 독특한 미생물을 생산하기 위하여 최신 미생물 기법 및 인간 개입을 이용한다. 이 목적을 위하여, 재조합 DNA는 식물 세포 게놈 내로 삽입되어 자연적으로 발생하는 식물 세포와 별개이며 독특한 유전자 이식 식물 세포를 만든다. 그 다음에 이 유전자 이식 식물 세포는 최신 미생물 기법을 사용하여 박테리아 및 효모 세포와 매우 유사하게 배양될 수 있고, 분화되지 않은 단세포 상태로 존재할 수 있다. 새로운 식물 세포의 유전적 조성물 및 표현형은 세포의 게놈 내로 이종성 DNA의 도입에 의해 만들어진 기술적 효과이다. 본 발명의 다른 양태는 본 발명의 미생물을 사용하는 방법이다. 유전자 이식 식물 세포와 같은 본 발명의 미생물을 사용하는 방법은 (i) 세포의 게놈 내로 재조합 DNA를 도입하는 단계, 그 다음에 이 세포를 사용하여 동일 이종성 DNA를 소유하는 추가적인 세포를 유도하는 단계에 의한 유전자 이식 세포 생산방법; (ii) 최신 미생물 기법을 사용하여 재조합 DNA를 함유하는 세포 배양방법; (iii) 배양 세포로부터 내인성 또는 재조합 탄수화물, 지질, 핵산 또는 단백질 생성물의 생성 및 정제방법; 및 (iv) 유전자 이식 식물 세포와 함께 최신 식물 조직 배양 기법을 사용하는 유전자 이식 식물 또는 유전자 이식 식물 조직 배양물의 생산방법을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "자손"은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 7, 또는 서열번호 8로 제공되는 서열 중 적어도 하나를 가지는 조상 식물로부터 유래된 사건 DNA를 포함하는 임의의 식물, 종자, 식물 세포, 및/또는 재생시킬 수 있는 식물 부분 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 식물, 자손, 및 종자는 이식유전자에 동형접합적 또는 이형접합적일 수 있다. 자손은 사건 MON 88302를 포함하는 식물에 의해 생산된 종자 및/또는 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터의 꽃가루에 의해 수정된 식물에 의해 생산된 종자로부터 생장될 수 있다.
자손 식물은 자가수분(또한 "자가생식"으로 알려짐)되어 식물의 순수 육성계통(true breeding line), 즉 이식유전자에 동형 접합적인 식물을 만들어낼 수 있다. 적절한 자손의 자가생식은 첨가된 유전자와 외인성 유전자 둘 다에 대해 동형 접합적인 식물을 생산할 수 있다.
대안적으로, 자손 식물은 변종의 또는 혼성의 종자 또는 식물을 생산하기 위해 다른 식물과 함께 이종교배, 예를 들어 육종될 수 있다. 다른 식물은 유전자 이식 또는 비유전자 이식일 수 있다. 따라서 본 발명의 변종의 또는 혼성의 종자 또는 식물은 사건 MON 88302의 특이적이고 독특한 DNA가 없는 제1 모체를 사건 MON 88302를 포함하는 제2 모체와 교배함으로써 유래될 수 있으며, 이는 사건 MON 88302의 특이적이며 독특한 DNA를 포함하는 혼성체를 야기한다. 교배 또는 육종이 본 발명의 식물 또는 종자, 즉 사건 MON 88302의 특이적이며 독특한 DNA를 함유하는 적어도 하나의 대립유전자 및/또는 서열번호 1 및 서열번호 2를 가지는 종자를 초래한다면, 각각의 모체는 혼성체 또는 근친교배/변종일 수 있다. 따라서 2가지의 상이한 유전자 이식 식물은 2개의 독립적으로 분리된, 첨가 유전자와 외인성 유전자를 함유하는 혼성 자식을 생산하도록 교배될 수 있다. 예를 들어, 사건 MON 88302를 포함하는 글라이포세이트 저항성 식물은 다른 유전자 이식 식물과 교배되어 유전자 이식 모체 둘 다의 특징을 가지는 식물을 생산할 수 있다. 이것의 한 예는 사건 MON 88302를 포함하는 글라이포세이트 저항성 브라씨카 식물과 하나 이상의 추가적인 특성을 가지는 겨자 또는 카놀라와 같은 브라씨카 식물의 교배인데, 이는 글라이포세이트에 저항성이 있고 하나 이상의 추가적인 특성을 가지는 자손 식물 또는 종자를 초래한다. 원하는 유전자 이식 특성을 가지는 브라씨카 식물은 당업계에 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 제초제 저항성의 특성을 가지는 브라씨카 식물(예를 들어 사건 RT200, 사건 RT73, 사건 MS1, 사건 RF1, 사건 RF2, Topas 19/2, MS8, RF3, T45), 혼성 육종 시스템 또는 생식력 시스템(예를 들어, 사건 MS1, 사건 MS8, 사건 RF1, 사건 RF2, 사건 Rf3), 곤충 대조군, 향상된 수확량, 내병성(예를 들어, 균핵병(Sclerotinia) 내성, 감자줄기검은병 내성, 뿌리혹병 내성, 위조병 내성), 변경된 또는 향상된 오일 조성물(예를 들어, 사건 pCGN3828-212/86-18, 사건 pCGN3828-212/23)을 포함하며, 이들 모두는 예를 들어 미국 농무부(United States Department of Agriculture, USDA) 미국 동식물 검역소(Animal and Plant Health Inspection Service, APHIS) 비규제 품목(Petitions for Nonregulated Status) 목록으로부터 공공연하게 입수가능하다. 원하는 비유전자 이식 특성을 가지는 브라씨카 식물은 당업계에 공지되어 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만 제초제 저항성(예를 들어, 이미다졸리논 저항성에 대해 1471, 이미다졸리논 저항성에 대해 CLB-1, 트라이아진 저항성에 대해 TTC), 병원체 저항성, 해충구제, 향상된 수확량, 내병성(예를 들어, 균핵병 내성, 감자줄기검은병 내성, 뿌리혹병 내성, 위조병 내성), 변경된 또는 향상된 오일 조성물(낮은 리놀렌산 및/또는 높은 올레산을 포함), 변경된 화학적 및/또는 영양적 조성물, 변경된 단백질 조성, 내한성, 내건성, 변경된 성숙 및/또는 개화, 및 다른 변경된 또는 개선된 작물학적 품질을 포함한다.
모체 식물에 여교배 및 비유전자 이식 식물과 이종교배가 또한 생각되는데, 이는 그대로 영양생식이다. 상이한 특성 및 작물에 대해 보통 사용되는 다른 육종 방법의 기재는 몇몇 참고문헌 중 하나에서 발견할 수 있다, 예를 들어 문헌[Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)].
본 발명은 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터 유래된 식물 부분을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "식물 부분"은 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터 유래된 물질을 포함하는 임의의 식물 부분을 말한다. 식물 부분은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 섬유질 및 잎을 포함한다. 식물 부분은 생존가능, 생존불능, 재생가능, 및/또는 재생불능일 수 있다.
본 발명은 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터 유래된 일반 상품을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 "일반 상품"은 사건 MON 88302를 포함하는 식물, 종자, 식물 세포, 또는 식물 부분으로부터 유래된 물질을 포함하는 임의의 조성물 또는 제품을 말한다. 일반 상품은 소비자에게 판매될 수 있고 생존가능하거나 생존불능일 수 있다. 생존불능 일반 상품은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 생존불능 종자 및 곡물; 가공처리된 종자, 종자 부분, 및 식물 부분; 탈수된 식물 조직, 냉동 식물 조직, 및 가공처리된 식물 조직; 육생 및/또는 수생 동물 소비를 위해 동물 사료로 가공처리된 종자 및 식물 부분, 오일, 으깬 곡물(meal), 가루, 플레이크, 겨, 섬유질, 및 인간 소비를 위한 임의의 다른 음식물; 및 바이오매스 및 연료 제품을 포함한다. 생존가능 일반 상품은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 종자 및 식물 세포를 포함한다. 따라서 사건 MON 88302를 포함하는 식물은 브라씨카 식물로부터 전형적으로 획득된 임의의 일반 상품을 제조하기 위하여 사용될 수 있다. 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터 유래된 임의의 이러한 일반 상품은 사건 MON 88302에 대응하는 특이적이고 독특한 DNA의 최소한의 검출가능한 양을 함유할 수 있으며, 구체적으로는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 함유하는 검출가능한 양의 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 분자에 대해 임의의 표준 검출방법이 사용될 수 있으며, 본 명세서에 개시된 검출 방법을 포함한다. 일반 상품 내 서열번호 1 또는 서열번호 2의 임의의 검출가능한 양이 있다면, 일반 상품은 본 발명의 범주 내에 있다.
식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물 부분(예컨대 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 본 발명의 일반 상품은 따라서 농업적 목적을 위해 사건 MON 88302를 포함하는 종자 및/또는 식물 부분을 생산하고, 식물 육종 및 연구 목적을 위해 사건 MON 88302를 포함하는 자손을 생산하며, 산업 및 연구 적용을 위한 미생물 기법과 함께 사용하고, 소비자에게 판매하는 목적을 위하여, 특히 식물 생장에 유용하다.
본 발명은 들판에서 잡초를 제거하는 방법은 들판에서 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 심는 단계 및 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 손상시키는 일없이 들판에서 잡초를 제거한 목적으로 들판에 적어도 하나의 제초제의 글라이포세이트의 유효량을 시용하는 단계로 이루어진 들판에서 잡초를 제거하는 방법을 제공한다. 또한 들판에서 잡초를 제거하기 위하여 들판에 적어도 하나의 제초제의 글라이포세이트의 유효량을 시용하는 단계 및 그 다음에 들판에 사건 MON 88302를 포함하는 작물을 심는 단계로 이루어진 들판에서 잡초를 제거하는 다른 방법이 제공된다. 본 발명의 방법은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 글라이포세이트의 시용은 심기 전(즉, 사건 MON 88302를 포함하는 종자를 심기 전 언제든지, 이에 제한되는 것은 아니지만 식물을 심기 전 약 14일 내지 약 1일 또는 사건 MON 88302를 포함하는 종자 파종과 동시를 포함), 발생 전(즉, 사건 MON 88302를 포함하는 종자를 심은 후 및 사건 MON 88302를 포함하는 식물의 발생 전 언제든지), 및/또는 발생 후(즉, 사건 MON 88302를 포함하는 식물이 발생한 후 언제든지)일 수 있다. 본 발명 방법의 실행에서, 글라이포세이트의 다수 회 시용은 생장 계절에 걸쳐, 예를 들어 2회 시용(예컨대 심기 전 시용 및 발생 후 시용 또는 발생 전 시용 및 발생 후 시용) 또는 3회 시용(예컨대 심기 전 시용, 발생 전 시용, 및 발생 후 시용)으로 사용될 수 있다. 따라서 생장 계절에 걸쳐 시용된 전체 글라이포세이트는 1회 이상의 제철의(in-season) 시용을 포함하며, 여기서 다수 회 제철의 시용은 함께 시용된 전체 글라이포세이트를 만들도록 첨가한다. 본 명세서에서 사용되는 잡초 생장을 제어하는데 효과적인 글라이포세이트의 양, 즉 들판에서 잡초 생장을 제어하기 위하여 작물에 시용으로서 들판 중에 사용을 위한 글라이포세이트의 제초제 유효량은 생장 계절에 걸쳐 에이커 당 약 0.125 파운드의 글라이포세이트 내지 전체 에이커(acre) 당 약 6.4 파운드의 글라이포세이트의 범위로 이루어져야 한다. 예를 들어, 작물에 시용으로서 들판에서 사용을 위한 글라이포세이트의 제초제 유효량은 생장 계절에 걸쳐 에이커 당 적어도 약 0.125, 약 0.5, 약 1.0, 약 1.6, 약 2.0, 약 2.5, 약 3.0, 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 또는 약 6.4 파운드일 수 있다.
유전자 이식 사건 MON 88302를 포함하는 제초제 저항성 식물의 생산 방법이 제공된다. 이 방법으로 사용된 유전자 이식 식물은 이식 유전자에 동형 접합적 또는 이형 접합적일 수 있다. 이 방법으로 생산된 자손 식물은 변종 또는 혼성체인 식물일 수 있고; 사건 MON 88302를 포함하는 식물로부터의 꽃가루로 수정된 식물에 의해 생산된 사건 MON 88302를 포함하는 식물 및/또는 종자로부터 생산된 종자로부터 생장될 수 있으며; 이식유전자에 동형 접합적 또는 이형 접합적일 수 있다. 자손 식물은 식물의 순수 육성계통, 즉 이식유전자에 대해 동형 접합적인 식물을 만들어내도록 순차적으로 자가수분될 수 있고, 또는 대안으로 이종교배, 예를 들어 다른 관련없는 식물과 함께 재배되어 변종 또는 혼성체의 종자 또는 식물을 생산할 수 있다.
글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 식물은 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 다른 식물과 성적으로 교배함으로써 생산되고, 이에 의해 이후에 자손 식물로 생장되는 종자를 생산할 수 있다. 그 다음에 이들 자손 식물은 글라이포세이트 제초제로 처리되어 글라이포세이트 제초제에 저항성이 있는 자손식물을 선택할 수 있다. 대안으로, 이들 자손 식물은 사건 MON 88302 DNA를 함유하는 자손 식물을 선택하는 진단 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 교배에 사용되는 다른 식물은 글라이포세이트 제초제에 저항성이 있을 수도 있고 또는 없을 수도 있으며, 유전자 이식이 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 생산된 해당 자손 식물 및/또는 종자는 변종 또는 혼성체 종자일 수 있다. 이 방법의 실행에서, 하나의 식물을 다른 식물과 성적으로 교배하는 단계, 즉 타가수분(cross-pollinating)은 인간 개입에 의해, 예를 들어 한 식물의 꽃가루를 수집하고 이 꽃가루를 제2 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시키는 인간 손에 의해; 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거하고, 파괴하거나 또는 덮어씌우는 인간 손 및/또는 인간 작용에 의해(예를 들어 수조작 개입으로 또는 화학적 살정제의 시용으로) 달성되거나 용이하게 될 수 있고, 따라서 "지정된 수분"을 위한 위치에서 꽃가루 매개충의 인간 배치에 의해(예를 들어 과수원 또는 들판에 벌집을 놓음으로써 또는 식물을 꽃가루 매개충과 함께 가둠으로써); 암술대 또는 암술머리 상에 외래 꽃가루를 배치 또는 접촉시키는 꽃의 부분을 인간이 개방하거나 제거함으로써; 선택적 식물 배치에 의해(예를 들어 근접 수분이 일어나도록 의도적으로 식물을 심는 것); 및/또는 개화를 재촉하거나 (꽃가루에 대한 암술머리의) 수용성을 조성하기 위한 화학물질의 시용에 의해, 천연 자가 수분은 방지되며 수정이 발생하도록 타가수분이 일어나야 한다.
글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 식물은 서열번호 1 및 서열번호 2 의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 자가생식하고, 이에 의해 이후에 자손 식물로 생장되는 종자를 생산함으로써 생산될 수 있다. 그 다음에 이들 자손 식물은 글라이포세이트 제초제로 처리되어 글라이포세이트 제초제에 저항성이 있는 자손 식물을 선택할 수 있다. 대안으로, 이들 자손 식물은 사건 MON 88302 DNA를 함유하는 자손 식물을 선택하는 진단 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 이 방법의 실행에서, 한 식물을 그 자체와 성적으로 교배하는 단계, 즉 자가수분 또는 자가생식이 인간 개입에 의해, 예를 들어 한 식물의 꽃가루를 수집하고 이 꽃가루를 동일 식물의 암술대 또는 암술머리와 접촉시킨 후, 선택적으로 식물의 추가적인 수정을 방지하는 인간 손에 의해; 다른 근처 식물의 수술 또는 꽃밥을 제거하고, 파괴하거나 또는 덮어씌우는 인간 손 및/또는 인간 작용에 의해(예를 들어 웅수절제(detasseling) 또는 화학적 살정제의 시용으로) 달성되거나 용이하게 될 수 있고, 따라서 "지정된 수분"을 위한 위치에서 꽃가루 매개충의 인간 배치에 의해(예를 들어 식물을 단독으로 꽃가루 매개충과 함께 가둠으로써); 꽃 또는 그것의 부분이 자가수분 되도록 하는 인간 조작에 의해(예를 들어 근접 수분이 일어나도록 의도적으로 식물을 심는 것); 및/또는 개화를 재촉하거나 (꽃가루에 대한 암술머리의) 수용성을 조성하기 위한 화학물질의 시용에 의해, 천연 타가수분은 방지되며, 수정이 발생하도록 자가수분이 일어나야 한다.
본 방법에 의해 포함되고 본 방법을 사용하여 생산된 자손 식물 및 종자는 다른 식물과 다른데, 예를 들어 자손 식물 및 종자가 재조합체이며, 인간 개입에 의해 만들어지고; 글라이포세이트 제초제 저항성이 있으며; 본 발명의 이식 유전자 DNA로 이루어진 적어도 하나의 대립유전자를 함유하고; 및/또는 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열의 검출가능한 양을 함유하기 때문이다. 종자는 개개의 자손 식물로부터 선택될 수 있으며, 종자가 서열번호 1 및 서열번호 2를 포함하는한, 이는 본 발명의 범주 내일 것이다.
본 발명의 실행에서, 2가지 상이한 유전자 이식 식물은 교배되어 2개의 독립적으로 분리하는 이종성 유전자를 함유하는 혼성 자식을 생산할 수 있다. 적절한 자손의 자가생식은 유전자 둘 다에 대해 동형 접합적인 식물을 생산할 수 있다. 모체 식물에 여교배 및 비유전자 이식 식물과 이종교배가 또한 생각되는데, 이는 그대로 영양생식이다. 상이한 특성 및 작물에 대해 보통 사용되는 다른 방법의 기재는 몇몇 참고문헌 중 하나에서 발견할 수 있다, 예를 들어 문헌[Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)].
본 명세서에 개시된 방법에서 사용된 식물 및 종자는 또한 하나 이상의 추가적인 이식유전자를 함유할 수 있다. 이러한 이식유전자는 원하는 특성을 부여하는 단백질 또는 RNA 분자를 암호화하는 임의의 뉴클레오타이드 서열일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지만, 증가된 내충성, 증가된 물 사용효율, 증가된 수확량 성능, 증가된 내건성, 증가된 종자 품질, 내병성, 개선된 영양 품질, 및/또는 증가된 제조제 저항성을 포함하며, 여기서 원하는 특성은 이러한 추가적인 이식유전자가 없는 비슷한 식물에 대해 측정된다.
따라서 본 발명의 방법은 특히 농업 또는 연구 목적을 위해 들판에서 잡초를 제거하는 한편, 사건 MON 88302을 포함하는 종자 및/또는 식물 부분을 생산하는 목적을 위해 식물을 생장시키고, 식물 육종 또는 연구 목적을 위해 사건 MON 88302를 포함하는 자손을 선택하고, 사건 MON 88302를 포함하는 자손 식물 및 종자를 생산한다.
본 발명의 식물, 자손, 종자, 식물 세포, 식물 부분(예컨대 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 또는 줄기 조직, 및 잎), 및 일반 상품은 DNA 조성, 유전자 발현 및/또는 단백질 발현을 위해 평가될 수 있다. 이러한 평가는 PCR, 노던 블롯팅, 사우던 분석, 웨스턴 블롯팅, 면역 침강, 및 ELISA와 같은 표준 방법을 사용하여 또는 본 명세서에서 제공되는 검출 방법 및/또는 검출 키트를 사용하여 행해질 수 있다.
샘플 내 사건 MON 88302에 특이적인 물질 존재의 검출 방법이 제공된다. 한 방법은 사건 MON 88302를 포함하는 세포, 조직, 또는 식물에 특이적이고 이들로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는 단계로 이루어진다. 본 방법은 열 증폭에 적절한 조건으로 실시될 때 사건 MON 88302 DNA로부터 앰플리콘, 특히 서열번호 1 또는 서열번호 2 중 하나의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드 또는 이들의 보체를 함유하는 앰플리콘을 생성할 수 있는 프라이머 쌍과 접촉되는 주형 DNA 샘플을 제공한다. 주형 DNA 분자가 서열번호 1 및 서열번호 2에서 제시되는 특이적이고 독특한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다면, 해당 앰플리콘은 사건 MON 88302로부터 유래된 주형 DNA 분자로부터 생성된다. 앰플리콘 생성에서 사용을 위해 선택된 중합효소에 따라서 해당 앰플리콘은 단일 또는 이중 가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있다. 본 방법은 임의의 이러한 열 증폭 반응으로 생성된 앰플리콘 분자를 검출하는 단계, 및 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대응하는 뉴클레오타이드 또는 이들의 보체의 존재를 앰플리콘의 서열 내에서 확인하는 단계를 제공한다. 앰플리콘 내 서열번호 1 또는 서열번호 2에 대응하는 뉴클레오타이드 또는 이들의 보체의 검출은 사건 MON 88302 특이적 DNA의 존재 및 따라서 샘플 내 사건 MON 88302를 포함하는 생물학적 물질을 위해 결정적이며 및/또는 진단적이다.
다른 방법은 식물 또는 식물 조직으로부터 유래된 물질로 이루어진 샘플 내 서열번호 3 및 서열번호 4에 대응하는 DNA 분자 존재의 검출 단계를 제공한다. 해당 방법은 (i) 식물로부터, 또는 상이한 식물의 그룹으로부터 DNA 샘플을 추출하는 단계, (ii) DNA 샘플을 서열번호 1 또는 서열번호 2 중 하나에서 제시되는 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 나타내는 DNA 프로브와 접촉시키는 단계, (iii) 프로브 및 DNA 샘플을 엄격한 혼성화 조건하에 혼성화시키는 단계, 및 그 다음에 (iv) 프로브와 표적 DNA 샘플 사이의 혼성화 사건을 검출하는 단계로 이루어진다. 혼성체 조성물의 검출은 경우에 따라 DNA 샘플에서 서열번호 3 또는 서열번호 4의 존재를 위한 진단용이다. 혼성화의 부재는 샘플 내 유전자 이식 사건 부재의 대안적 진단이다. 대안적으로, 특정 식물은 서열번호 1 또는 서열번호 2, 또는 이들의 보체에 대응하는 서열 중 하나 또는 둘 다를 함유하는 것의 결정은 해당 식물은 사건 MON 88302에 대응하는 적어도 하나의 대립유전자를 함유하는 것에 결정적이다.
따라서 핵산 프로브를 사용하는 중합효소 연쇄반응(PCR) 또는 DNA 혼성화와 같은 임의의 잘 알려진 핵산 검출 방법에 의해 본 발명의 핵산 분자 존재를 검출할 수 있다. 사건-특이적 PCR 분석은, 예를 들어 문헌[Taverniers et al. (J. Agric. Food Chem., 53: 3041-3052, 2005)]에서 논의되는데, 여기서 유전자 이식 메이즈 계통 Bt11, Bt176, 및 GA21에 대한 및 유전자 이식 사건 RT73에 대한 사건 특이적 추적 시스템은 증명되었다. 이 연구에서, 사건 특이적 프라이머 및 프로브는 각 사건에 대한 게놈/이식유전자 접합의 서열을 기반으로 설계되었다. 유전자 이식 식물 사건 특이적 DNA 검출 방법은 또한 미국특허 제6,893,826호; 제6,825,400호; 제제6,740,488호; 제6,733,974호; 제6,689,880호; 제6,900,014호 및 제6,818,807호에 기재되었다.
DNA 검출 키트가 제공된다. 한 유형의 키트는 샘플 내 유전자 이식 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는데 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로 작용하는 서열번호 3, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 충분한 길이의 연속적 뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 DNA 분자를 함유한다. 키트로 검출되는 DNA 분자는 서열번호 1에서 제시되는 서열의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 함유한다. 대안적으로, 키트는 샘플 내 유전자 이식 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하는데 특이적인 DNA 프라이머 또는 프로브로 작용하는 서열번호 4, 서열번호 5, 또는 서열번호 6의 충분한 길이의 연속적 뉴클레오타이드 중 적어도 하나의 DNA 분자를 함유할 수 있다. 키트로 검출된 DNA 분자는 서열번호 2에서 제시되는 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 함유한다.
대안의 키트는 표적 DNA 샘플이 상기 기재한 프라이머 쌍과 접촉된 다음, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 포함하는 앰플리콘을 생성하기에 충분한 핵산 증폭 반응을 수행하는 방법을 사용한다. 앰플리콘의 검출 및 해당 앰플리콘 서열 내에서 서열번호 1 또는 서열번호 2의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드 또는 이들의 보체 존재의 검출은 DNA 샘플 내 사건 MON 88302 특이적 DNA의 존재를 위한 진단용이다.
DNA 프로브로서 사용에 충분한 DNA 분자는 샘플 내 사건 MON 88302 DNA에 특이적이며 독특한 DNA의 존재 또는 부재조차도 결정하고, 검출하거나 또는 진단하는데 유용하게 제공된다. DNA 분자는 서열번호 1의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드, 또는 이들의 보체, 또는 서열번호 2의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드, 또는 이들의 보체를 함유한다.
핵산 증폭은 열 증폭 방법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 수행된다. 이종성 DNA 삽입 서열, 접합 서열, 또는 사건 MON 88302 측면의 서열은 (ATCC PTA-10955로 기탁된 사건 MON 88302를 포함하는 대표적인 종자 샘플과 함께) 본 명세서에서 제공되는 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하는 사건으로부터 이러한 서열을 증폭시킨 다음 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 서열을 증폭시킴으로써 확인될 수 있다(필요하다면 수정될 수 있다).
이들 방법으로 생성된 앰플리콘은 다수의 기법으로 검출될 수 있다. 하나의 이러한 방법은 Genetic Bit Analysis(Nikiforov, et al. Nucleic Acid Res. 22:4167-4175, 1994)인데, 여기서 DNA 올리고뉴클레오타이드는 인접한 측면의 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA서열 둘 다를 중첩하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드는 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 열 증폭 후(삽입 서열 내 하나의 프라이머 및 인접한 측면의 게놈 서열 내 하나를 사용하여), 단일 가닥 앰플리콘은 혼성화되어 올리고뉴클레오타이드를 고정시킬 수 있고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 특이적인 표지된 ddNTP를 사용하여 단일 염기 연장 반응을 위한 주형으로 작용할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 형광 또는 다른 신호의 검출은 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 연장에 기인하는 삽입/측면 서열의 존재를 나타낸다.
다른 방법은 문헌[Winge (Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000)]로 기재되는 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기법이다. 이 방법에서 올리고뉴클레오타이드는 인접한 게놈 DNA 및 삽입 DNA 접합을 중첩하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드는 관심의 영역으로부터 단일 가닥 앰플리콘에 혼성화되고(삽입된 서열 내 하나의 프라이머 및 측면의 게놈 서열 내 하나) DNA 중합효소, ATP, 설푸릴라제, 루시퍼라제, 아피라제, 아데노신 5' 포스포설페이트 및 루시페린의 존재에서 인큐베이션된다. ddNTP는 개개로 첨가되고, 포함물은 광신호가 측정되도록 한다. 광신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다회 염기 연장에 기인하는 이식유전자 삽입/측면의 서열 존재를 나타낸다.
문헌[Chen, et al ., (Genome Res. 9:492-498, 1999)]에 기재된 형광 편광은 앰플리콘을 검출하기 위하여 사용될 수 있는 방법이다. 이 방법을 사용하여 올리고뉴클레오타이드는 게놈 측면과 삽입된 DNA 접합을 중첩하도록 설계된다. 올리고뉴클레오타이드는 관심의 영역으로부터 단일 가닥 앰플리콘으로 혼성화되며(삽입된 DNA 내 하나의 프라이머 및 측면의 게놈 DNA 서열 내 하나), DNA 중합효소 및 형광 표지된 ddNTP의 존재 하에서 인큐베이션된다. 단일 염기 연장은 ddNTP의 포함을 초래한다. 포함물은 형광계를 사용하여 편광의 변화로 측정될 수 있다. 편광의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 연장에 기인하는 이식유전자 삽입/측면의 서열 존재를 나타낸다.
TAQMAN(등록상표)(미국 캘리포니아주 포스터 시티에 소재한 PE Applied Biosystems)는 또한 제조업자에 의해 제공된 설명서를 사용하여 DNA 서열의 존재를 검출하고 및/또는 정량화하기 위하여 사용될 수 있다. 간략하게는, FRET 올리고뉴클레오타이드 프로브는 게놈 측면과 삽입 DNA 접합을 중첩하도록 설계된다. FRET 프로브 및 증폭 프라이머(삽입 DNA 서열 내 하나의 프라이머 및 측면의 게놈 서열 내 하나)는 열 안정적인 중합효소 및 dNTP의 존재하에서 순환된다. FRET 프로브의 혼성화는 FRET 프로브 상에서 퀀칭 모이어티로부터 형광 모이어티의 절단 및 방출을 초래한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하여 측면의/이식유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
분자 비콘(molecular Beacon)은 문헌[Tyangi, et al . (Nature Biotech.14:303-308, 1996)]에 기재된 서열 검출에서 사용을 위해 기재되었다. 간략하게는, FRET 올리고뉴클레오타이드 프로브는 측면의 게놈 및 삽입 DNA 접합을 중첩하도록 설계된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 그것이 인접하여 형광성과 퀀칭 모이어티를 유지하는 2차 구조를 포함하도록 야기한다. FRET 프로브 및 증폭 프라이머(삽입 DNA서열 내 하나의 프라이머 및 측면의 게놈 서열 내 하나)는 열안정적 중합효소 및 dNTP의 존재 중에서 순환된다. 성공적 증폭 후, 표적 서열에 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 신호의 생성을 초래하는 퀀칭 모이어티와 형광성의 공간적 분리를 야기한다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하여 측면의/이식유전자 삽입 서열의 존재를 나타낸다.
다른 기재 방법, 예컨대 마이크로유체(미국 공개 제2006068398호, 미국특허제6,544,734호)는 DNA 샘플을 분리하고 증폭시키는 방법 및 장치를 제공한다. 특이적 DNA 분자를 검출하고 측정하기 위하여 광학 염료가 사용되었다(WO/05017181). 나노튜브 장치(WO/06024023)는 특이적 DNA 분자에 결합하고 그 다음에 검출된 수 있는 DNA 분자 또는 나노비드에 대한 전자적 센서를 포함한다.
본 명세서에 개시된 조성물 및 DNA 검출의 당업자에게 잘 공지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 키트는 샘플 내 사건 MON 88302의 확인에 유용하고 적절한 사건 DNA를 함유하는 식물을 육종하기 위한 방법에 적용될 수 있다. 키트는 서열번호 1 내지 6과 유사하거나 상보적인 DNA 프라이머 또는 프로브, 또는 이들의 단편 또는 보체를 함유할 수 있다.
따라서 본 발명의 키트 및 검출 방법은 특히 사건 MON 88302를 확인하고, 사건 MON 88302를 포함하는 식물 변종 또는 혼성체를 선택하며, 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA의 존재를 검출하고, 사건 MON 88302 또는 사건 MON 88302를 포함하는 식물, 식물 부분 또는 일반 상품의 존재 및/또는 부재에 대해 샘플을 모니터링하는데 유용하다.
다음의 예는 본 발명의 특정 바람직한 실시형태의 예를 증명하기 위하여 포함된다. 다음의 실시예에 개시된 기술은 본 발명자들이 본 발명의 실행이 제대로 작용한다는 것을 발견한 접근을 나타내며, 따라서 그것의 바람직한 실행 방식의 실시예를 구성하는 것으로 생각될 수 있다는 것은 당업자에 의해 인식되어야 한다. 그러나 당업자는 본 개시에 비추어, 다수의 변화가 개시된 특정 실시형태로 만들어질 수 있으며 본 발명의 정신과 범주로부터 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 얻을 수 있다는 것을 인식하여야 한다.
실시예
실시예
1:
브라씨카
나푸스의
형질전환 및
MON
88302 사건 선택
이 실시예는 유전자 이식 사건이 만들어지는 방법 및 사건 MON 88302가 선택되는 방법을 기재한다. 유전자 이식 사건 MON 88302는 도 1, 서열번호 5에서 제시된 서열에 도시된 유전자 이식 DNA를 가지는 브라씨카 나푸스 세포의 아그로박테리움 매개 형질전환에 의해 만들어진다. 서열번호 5로 제공되는 이식유전자 삽입물은 애기장대(Arabidopsis thaliana) Tsf1 유전자(P-At.Tsf1)로부터 유래된 프로모터 분자에 작동가능하게 연결되며; 애기장대 Tsf1 유전자로부터 유래된 리더 분자(L-At.Tsf1)에 작동가능하게 연결되고; 애기장대 Tsf1 유전자(I-At.Tsf1)로부터 유래된 인트론 서열에 작동가능하게 연결되며; 엽록체 수송 펩타이드를 암호화하는 DNA 분자(CTP2, 애기장대 EPSPS)에 작동가능하게 연결되고; 글라이포세이트 저항성 EPSPS(CP4-syn)를 암호화하는 DNA 분자에 작동가능하게 연결되며; 완두콩(Pisum sativum) 유전자(T-RbcS2, E9)로부터 유래된 3' UTR DNA분자에 작동가능하게 연결된 현삼 모자이크 바이러스(E-FMV.35S)로부터의 35S 인핸서로부터 유래된 인핸서 분자로 이루어진 키메라 프로모터를 포함하는 발현 카세트이다.
브라씨카 나푸스로부터의 외식편을 우선 아그로박테리움-매개 형질전환을 사용하여 5개의 발현 카세트 중 1개로 각각 형질전환시켰다. 그 다음에 글라이포세이트를 함유하는 배지 상에서 형질전환된 세포를 선택하였고, 살아있는 세포를 식물 내로 재생시켰다. 23,000개 이상의 외식편을 만들었고 이것으로부터 전체 224개의 개개의 R0 사건을 생산하였으며 이후의 스크리닝을 위해 사용하였다(표 1)
| 브라씨카 나푸스의 형질전환 및 MON 88302 사건 선택 | |||||||
| 구성체 | 형질전환 | 단일 복제물 | GH 효능 |
GH 분자 |
FT 1년차 |
FT 2년차 |
잎 사건 |
| 1 | 8325 외식편으로부터 97 사건 | 37 | 24 | 16 | 16 | 13 진행 8 시험 |
3 |
| 2 | 4625 외식편으로부터 69 사건 | 32 | 5 | 3 | 3 | 0 | --- |
| 3 | 10245 외식편으로부터 43 사건 | 11 | 0 | --- | --- | --- | --- |
| 4 | ~30 사건 | 14 | 6 | 해당없음 | 3 | 0 | --- |
| 5 | ~25 사건 | 10 | 6 | 해당없음 | 3 | 0 | --- |
사건으로부터 조직 샘플을 TAQMAN(등록상표) PCR 분석을 사용하여 스크리닝하여 다중 복제 및/또는 분자에 의한 복합체 사건을 제거하였다. 처음 224개 사건에 대해, 104개는 이식유전자의 단일 복제물의 존재 및 TAQMAN(등록상표) PCR 분석으로 결정되는 벡터 백본 서열의 부재를 기반으로 진행하였다. 구체적으로, 구성체 1로부터(초기 97 사건으로) 37개의 R1 사건이 진행되었고; 구성체 2로부터(초기 69개 사건으로) 32개의 R1 사건이 진행되었으며; 구성체 3으로부터(초기 43 사건으로) 11개의 R1 사건이 진행되었고; 구성체 4로부터(대략 30개 사건으로) 14개 R1 사건이 진행되었으며, 구성체 5로부터(대략 25개 사건) 10개 R1 사건이 진행되었다.
이식유전자의 단일 복제물을 함유하는 104개 사건을 추가적인 분자 분석 및 효능 시험을 포함하는 온실시험(greenhouse testing, GH)으로 진행시켰다. R1 온실 분자 분석은 이식유전자의 단일 복제물의 존재 및 벡터 백본 서열의 부재를 확인하는 초기 사우던 블롯 분석; 3 내지 4개의 잎 단계, 로제트(rosette) 단계 및 종자에서 측정한 CP4 단백질 발현 수준; 및 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 CP4 처리를 포함하였다(구성체 4 및 5로부터의 사건은 이 분석 중에 포함되지 않았다). R1 온실 효능 시험은 분리, 위황병/괴사, 식물과 관련된 저항성, 제1 개화, 생장 감소, 꽃가루 생존력으로 측정되는 수컷 생식 저항성, 및 종자 수를 포함한다. 104개 사건에 대한 온실 분자 및 효능 시험의 분석으로부터, 25개 사건은 1년차 실지 시험(field trial)으로 진행시켰다. 구체적으로 구성체 1에 대해 진행된 37개의 R1 사건 시험으로부터 16개의 R2 사건이 있었고; 구성체 2에 대해 진행된 32개의 R1 사건으로부터 3개의 R2 사건이 있었고; 구성체 3에 대해, 온실 시험으로 진행되는 11개의 R1 사건이 있으며, 0개의 R2 사건이 진행되고; 구성체 4에 대해 진행된 14개의 R1 사건으로부터 3개의 R2 사건이 있었고; 구성체 5에 대해 실지 시험으로 진행된 10개의 R1 사건 시험으로부터 3개의 R2사건이 있었다.
그 다음에 25개의 R2 사건을 동일 위치에서 대응짝 구획 내 작물학적 평가에 대한 1년치 실지 시험에서 분석하였다. 작물학적 실지 시험을 개시하여 식물 생장과 발달 상에 유전자 삽입의 영향을 평가하였다. 구성체 1로부터 16개의 R2 사건을 5 위치에서 평가하였다. 구성체 2로부터 3개의 R2 사건, 구성체 4로부터 3개의 R2 사건, 및 구성체 5로부터 3개의 R2 사건을 4개의 위치에서 평가하였다. 각 연구는 각 사건의 양성 및 음성 등치선 쌍뿐만 아니라 모체의 형질전환 생식질 및 상업적 다양성을 포함하였다. 작물학적 평가에 대해, 초세(plant vigor), 초기 식분, 제1 개화일, 및 식물의 키를 관찰하여 식물 발달을 평가하였다. 또한 식물 생장 및 발달 상의 유전자 삽입 효과 표시로서 수확량 데이터를 평가하였다. 3개의 복제물에 의한 대응 짝 분할구 배치법(split plot design)을 전체 구획으로서 사건 및 서브구획으로서 등치선과 함께 사용하였다. 각 사건의 양의 및 음의 등치선은 짝지어지는 한편 상업적 변종 및 형질전환 배경은 짝지어지고 대조군으로 포함된다. 구획은 필요하다면 손제초로 보충되는 통상적인 제초제 프로그램을 사용하여 계절 내내 잡초가 없도록 유지하였다. 글라이포세이트 처리는 이 들판 프로토콜에 시용되지 않았다.
심은 후 7일 내지 10일에 각 구획에 대한 발생/식분 수를 취하였다. 토양을 완전히 정화한 자엽을 "발생"으로 생각하였다. 1(우수한 초세) 내지 평균이 되는 5, 및 9(불량한 초세) 범위의 등급을 사용하여 2 내지 3개의 잎 단계(효능 시험의 대응짝 구획의 제1 제초제 시용 전)에서 초세를 결정하였다. 제1 개화일을 모든 구획이 개화를 시작한 후 기록하였고 구획 당 식물마다 개화하는 백분율로 표현하였다. 구획 당 5개 식물의 식물 높이를 중간 내지 늦은 개화에서 가장 높은 총상꽃차례(raceme)의 토양 표면으로부터 상단까지를 측정하였고 ㎝로 표현하였다. 균일성 및 직립가능성을 1(우수함), 평균 5 내지 9(불량)의 범위에 있는 등급을 사용하여 평가하였다. 주요 구획이 성숙에 도달한 후 각 실험을 채취하였다. 일부 구획은 직접 콤바인 수확된 반면, 다른 구획은 일단 성숙함에 도달하면, 그로부터 대략 10일 후에 콤바인 수확하였다. 수분 및 개개의 종자 중량을 기록하였고(lb/A) 종자 샘플을 오일 및 단백질 분석을 위해 수집하였다. 각 위치를 개개로 분석하였고 위치를 가로지르는 평균을 통계 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 각 위치에서 5%의 실험별 제1종 오류 확률에 대해 본페로니(Bonferroni) 조절을 사용하여 외적 스튜던트 잔차(deleted studentized residual)를 기준으로 표준 2패스 과정을 사용하여 이상 값(outlier)에 대해 데이터를 스크리닝하였다. 이상 값을 분석 전에 제거하였다. 분할구 배치법에 대한 표준 분산분석을 제한된 최대 우도 추정법으로 수행하였다. 최소 제곱법 평균을 각 사건의 각 등치선에 대해 계산하였고, 5% 실험별 오류 확률로 t-테스트를 사용하여 카놀라 생장 특징 상에 유전자 삽입의 유의성을 결정하였다. 양의 등치선의 사건 특성을 대응하는 음의 등치선의 특성과 비교하였다. 사건 사이의 성숙도의 차이에 기인하여, 양의 등치선과 합동 음의 등치선 사이의 비교뿐만 아니라 상업적 표준과 형질전환 배경에 대한 비교를 제외하였다.
1년자 작물 실지 시험의 결과는 2개의 구성체가 모두 다수의 사건을 만들고, 이때 작물학적 특징 및 수확량은 유전자 삽입에 의해 부정적으로 영향을 받지 않는다는 것을 나타내었다. 작물학적 평가를 기준으로, 15개의 사건은 2년차 실지 시험으로 진행되는 후보가 되었다. 구체적으로 구성체 1로부터 14개의 사건(실지 시험에서 16개의 R2 사건) 및 구성체 2로부터 1개의 사건(실지 시험에서 3개의 R2 사건)은 2년차 실지 시험으로 진행되는 후보가 되었다.
25개의 사건은 또한 작물 실지 시험으로서 동일한 시험 부위에 위치된 효능에 대한 1년차 실지 시험으로 평가하였다. 다양한 시용 시간 및 확률에서 글라이포세이트의 순차적 시용에 대해 사건의 식물 저항성 및 재생적 저항성을 평가하기 위하여 효능 실지 시험을 개시하였다. 구성체 1로부터 16개의 R2 사건은 5개 위치에서 평가하였다. 구성체 2로부터 3개의 R2 사건, 구성체 4로부터 3개의 R2 사건, 및 구성체 5로부터 3개의 R2 사건을 4개의 위치에서 평가하였다. 각 연구는 각 사건의 양의 등치선 및 2개의 상업적 품종을 포함하였다. 3개의 복제에 의한 분할구 배치법을 전체 구획으로서 제초제 처리 및 서브구획으로서 사건 항목으로 사용하였다. 비분무 처리를 비교를 위해 포함하였다.
작물 발생으로부터 제1 개화까지 시용될 때, 사건을 1.6 lb AE/A의 단일 시용 또는 0.8 lb AE/A의 2회 순차적 시용 중 하나로 식물 저항성 및 재생 저항성에 대해 평가하였다. Roundup WeatherMAX(등록상표)을 2x, 4x, 및 8x의 1회 시용량(application rate)과 동등하게 3가지의 상이한 비율로 시용하였다(표 2). 초기 시용을 4개 잎 단계로 만든 후 프레볼트 단계에서 제2 시용을 하였다. 계면활성제 및 다른 제형 성분으로부터 잠재적인 식물 손상을 최소화하기 위하여, 3.2 및 6.4 lb AE/A(4x 및 8x)을 전달하기 위한 분무 용액을 기저율로 1.6 lb AE/A의 Roundup WeatherMAX(등록상표)을 사용하고 기술적 물질(계면활성제가 없는 글라이포세이트)를 첨가하여 원하는 비율을 달성하여 제조하였다. 모든 시용은 10 내지 20 GPA를 전달하도록 캘리브레이션된 편평-팬 노즐을 구비한 트랙터 장착 분무장치(spray boom)를 사용하여 만들었다.
상기와 같이 데이터 수집을 수행하였다. 글라이포세이트 손상을 다음과 같이 평가하였다. 각 글라이포세이트 시용 전, 처리 및 미처리 구획 내 구획 당 5개 식물의 식물 높이 및 잎의 수를 기록하였다. 글라이포세이트가 사건에 대한 손상을 야기하였는지 여부를 결정하기 위하여, 각 글라이포세이트 시용 후 제7일 내지 제10일에 위황병% 및 괴사%의 시각적 추정을 하였다. 제1 글라이포세이트 시용 후 식물 손상을 평가한 한편, 재생의 위황병/괴사%를 0%(손상 없음) 내지 100%(식물사멸) 범위의 등급을 사용하여 제2 시용 후 평가하였다. 0% 내지 100% 범위의 등급을 사용하여 각 시용 후 제14일 내지 제21일에 생장 감소를 평가하였다. 제1 시용 후 식물 생장 감소를 평가한 반면, 재생 생장 감소를 순차적 시용 후 결정하였다. 최소제곱법 평균을 글라이포세이트 수준과 사건의 각 조합에 대해 계산하였고, t-테스트를 사용하여 사건 저항성 상에 글라이포세이트 효과의 유의성을 결정하였다. 글라이포세이트 처리로부터 사건 수확량을 각 제초제 비율 내에서 비처리 대조군뿐만 아니라 상업적 표준, RT73의 수확량과 비교하였고, 각 사건에 대해 제초제 비율에 걸친 비교를 하였다.
1년차 효능 실지 시험으로부터 결과는 구성체 1이 글라이포세이트에 우수한 식물 저항성 및 재생 저항성을 가지는 사건을 생산한다는 것을 나타낸다. 2x 제품 컨셉트 비율로 관찰한 식물 손상은 매우 부수적이었고 상업적으로 중요하지 않은 것으로 생각되었다. 구성체 1 사건에 대해 뛰어난 재생 저항성이 관찰되었다. 가장 높은 시용량으로(6.4 lb AE/A 다음에 6.4 lb AE/A) 상당한 수확량 감소를 나타낸 한 사건을 제외하고 비율과 상관없이, 모든 구성체 1 사건의 수확량은 글라이포세이트에 의해 부정적으로 영향받지 않았다. 구성체 2로부터 유래된 사건은 발달을 위한 충분한 식물의 글라이포세이트 저항성을 가지지 않았다. 시험한 모든 글라이포세이트 비율에서 허용가능하지 않은 손상 수준이 관찰되었다. 글라이포세이트는 시용량과 상관없이 모든 구성체 2 사건의 수확량을 상당히 감소시켰다. 구성체 4 및 5로부터 유래된 사건뿐만 아니라 구성체 1로부터 유래된 사건을 수행하지 않았고, 따라서 2년차 실지 시험으로 진행되지 않았다. 1년차 실지 시험을 기반으로, 구성체 1로부터 13개의 사건은 2년차 실지 시험으로 진행하였다.
실시예
2:
RT73
과
MON
88302의 비교
그 다음에 현재 상업적 Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라(RT73 사건)과 비교하여 MON 88302를 평가하도록 실지 시험을 설계하였다. MON 88302과 RT73의 비교는 MON 88302가 더 높은 글라이포세이트 시용량으로 우수한 작물을 제공한다는 것을 나타내었고, 따라서 제거가 어려운 잡초, 예컨대 민들레, 캐나다 엉겅퀴, 강아지풀, 야생 메밀, 보통의 명아주, 및 코키아를 더 높은 글라이포세이트 비율에서 잡초 제거를 개선시킬 수 있다. MON 88302과 RT73의 비교는 또한 MON 88302가 글라이포세이트에 대해 더 넓은 시용 범위로 우수한 작물 저항성을 제공한다는 것을 나타내었으며, 따라서 발생 후로부터 제1 개화까지 범위에 있는 넓은 창에 걸쳐 글라이포세이트를 시용할 수 있고, RT73로 가능한 것보다 작물의 후기 생장 단계에서조차 수확량-도봉(yield-robbing) 잡초 제거를 가능하게 한다. 더 높은 글라이포세이트 비율에 대해 증가된 저항성 및 후가 작물 단계에서 글라이포세이트 시용에 대한 저항성의 MON 88302 조합은, 환경적 조건이 조기 시용으로 제한되고 및/또는 작물 수확량을 감소시키는 잡초의 늦은 홍조의 제거를 개선시킬 때, RT73과 비교하여 후기 생장 단계에서 글라이포세이트를 시용하는 이점을 제공한다.
Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템(사건 RT73)에 대해 현재 등록된 글라이포세이트 비율은 카놀라 작물의 6개 잎 단계까지 675 g ae/ha의 1회 시용 또는 450 g ae/ha의 2회 시용이다. RT73을 여러 번의 글라이포세이트 1회 시용량에서 MON 88302 사건과 비교하였다. 카놀라 작물의 발생으로부터 제1 개화까지 시용하였다. Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템(RT73 사건)을 상업적 방임수분품종(open pollinated variety) 34-65로 표시하였고, 사건 MON88302를 Ebony 생식질 내로 형질전환하였다.
채취을 위해 취한 6개로 8회의 시험을 확립하였다(한 부위는 가뭄으로 상실되었고, 한 부위는 우박으로 상실되었으며 하나의 채취 부위로부터 데이터는 사전결정된 차단 값을 초과하는 변동계수(coefficient of variation, CV)에 기인하여 사용하지 않았다). 표준 카놀라 생장 실행을 계절 내내 이용하여 식물 생장을 최적화하였다. 발생 전 및 발생 후 통상적인 제초제 및 살진균제 및 살충제를 함유하는 종자 처리를 사용하여 해충압력을 최소화하였다. 실험을 Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라(RT73 사건) 또는 MON 88302 시스템 블록화되고 제초제 비율이 블록 내에서 무작위화되는 분할 블록 설계로 설정하였다. 구획은 2×6 미터이었고 3회 반복하였다. 적절한 작물 단계에서 구획을 소형 직선식 분무기로 100-110 ℓ/ha 시용량으로 분무하였다. Roundup WeatherMAX(등록상표)(540 g/ℓ)의 캐나다 제형을 글라이포세이트 상품으로 사용하였다. 4 내지 6개 잎 단계를 주요 줄기 상에서 4 내지 6 순수 잎으로 정의하였고, 제1 개화는 식물의 50%가 적어도 하나의 꽃을 가질 때이다. 위황병%(% CHLR)를 제초제 시용(DAT(days after treatment) 또는 처리 후 일수) 후 7 내지 10일에 기록하였다. 위황병%는 1 내지 100 등급 상에서 미처리 확인과 비교하여 제초제 처리 결과로서 식물 잎이 노랗게 되는 양의 시각적 추정이다. 생장감소%(Percent growth reduction, %GR)를 제초제 시용 후(DAT) 14 내지 21로 기록하였다. 생장 감소%는 이에 제한되는 것은 아니지만 처리한 영역의 나뭇잎의 감소된 키 및/또는 양으로 이루어진 식물 생장 감소를 설명하기 위해 사용된 시각적 평가이다. 평가는 식물의 지상부분만 존재한다. 생장 감소%는 비처리 확인과 비교하고 1 내지 100 등급으로 평가한다. 성숙은 심은 후 주요 총상꽃차례 상에서 종자의 30%가 색이 갈색/검정색이 될 때까지 일수로 기록하였다. 종자 수분%를 채취 동안 전자적으로 기록하였다. 모든 구획을 수확한 다음 종자 수분이 채취가 용이할만큼 충분히 낮아질 때까지 건조시켰다. 중량 및 종자 수분을 채취 동안 전자적으로 기록하였고 10% 종자 수분에서 부셸(bushel)/에이커로 변환하였다. 각 위치를 개별적으로 분석하였고 위치를 가로지르는 평균을 통계적 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 데이터를 각 위치에서 5%의 실험별 제1종 오류 확률에 대해 거짓 발견율(False Discovery Rate, FDR) 조정을 사용하여 외적 스튜던트 잔차를 기준으로 표준 2패스 과정을 사용하여 가외치에 대해 스크리닝하였다. 분할 구획 설계에 대한 분산의 표준 분석을 제한 최대 우도법 추정-품종과 혼합된 모델로 수행하였고 제초제 처리를 혼합된 효과로 처리하였으며, 복제 및 위치는 무작위 효과이었다. 각 품종 및 각 처리에 대해 최소 제곱법을 계산하였고, 5%의 실험별 오류 확률로 t-테스트를 사용하여 카놀라 생장 특징 상의 각 제초제 처리 수준에서 품종과 대조군 사이의 유의도를 결정하였다. 이익을 평가하기 위하여 작물 손상, 성숙, 및 수확량을 측정하였다.
사건 MON 88302를 포함하는 카놀라와 비교하여 사건 RT73을 포함하는 카놀라의 글라이포세이트 저항성 데이터를 표 2에서 제공한다. 간략하게, MON 88302의 글라이포세이트 저항성은 증가된 글라이포세이트 시용량(g ae/ha)과 글라이포세이트 시용에 저항성을 나타내는 작물 단계의 범위 둘 다에서 RT73의 글라이포세이트 저항성보다 우수하였다. 예를 들어, RT73은 4-6개 잎 단계에 대해 1800g ae/ha 시용량에서 4.7% 위황병을 나타내었는데, MON 88302는 이 단계의 유사한 비율에서 단지 1.7% 위황병을 나타내었고 2배 비율(3600 g ae/ha)에서 위황병이 증가되지 않았다. 추가로, MON 88302 사건은4-6잎 단계에 대해 1800 g ae/ha 시용량에서 생장감소%를 나타내지 않은 반면, RT73은 5.3% 생장감소가 있었다. 4 내지 6개 잎 및 제1 개화 작물 시용 단계의 3600 g ae/ha 글라이포세이트 비율에서 RT73은 10% 위황병을 나타낸 반면, MON 88302는 각각 단지 1.7% 및 4.7%를 나타내었다. 4 내지 6개 잎 및 제1 개화 시용 단계에 대한 3600 g ae/ha 글라이포세이트 비율에서 RT73은 각각 20.8% 및 8.1% 생장 감소를 나타낸 반면, MON 88302는 각각 단지 0.3% 및 1.1%를 나타내었다.
| MON 88302와 비교하여 RT73의 글라이포세이트 저항성 | ||||
| 7-10 DAT % CHLR |
14-21 DAT % GR |
|||
| 사건 | 글라이포세이트 비율(g ae/ha) |
작물 단계 | 평균 | 평균 |
| RT73 | 0 | 4-6 잎 | 0.0 | 0.0 |
| RT73 | 450 | 4-6 잎 | 0.3 | 0.9 |
| RT73 | 900 | 4-6 잎 | 2.2 | 1.3 |
| RT73 | 1800 | 4-6 잎 | 4.7 | 5.3 |
| RT73 | 3600 | 4-6 잎 | 10.0 | 20.8 |
| RT73 | 450 | 제1 개화 | 0.6 | 0.8 |
| RT73 | 900 | 제1 개화 | 1.8 | 0.3 |
| RT73 | 1800 | 제1 개화 | 6.7 | 3.3 |
| RT73 | 3600 | 제1 개화 | 10.0 | 8.1 |
| MON88302 | 0 | 4-6 잎 | 0.0 | 0.0 |
| MON88302 | 450 | 4-6 잎 | 0.0 | 0.3 |
| MON88302 | 900 | 4-6 잎 | 0.7 | 0.7 |
| MON88302 | 1800 | 4-6 잎 | 1.7 | 0.0 |
| MON88302 | 3600 | 4-6 잎 | 1.7 | 0.3 |
| MON88302 | 450 | 제1 개화 | 0.0 | 0.0 |
| MON88302 | 900 | 제1 개화 | 0.3 | 0.8 |
| MON88302 | 1800 | 제1 개화 | 0.9 | 0.0 |
| MON88302 | 3600 | 제1 개화 | 4.7 | 1.1 |
사건 RT73을 포함하는 카놀라를 MON 88302를 포함하는 카놀라와 비교하는 심은 후 수확할 때까지 일수의 데이터를 표 3에서 제공한다. 간략하게는, 성숙은 아마도 작물 손상의 결과로 4 내지 6개 잎 및 제1 개화 시용 둘 다의 3600 g ae/ha 비율로 Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템(RT73 사건) 중에서 유의하게 지연되었다. 4 내지 6개 잎 시용 단계의 1800 g ae/ha 비율에서 성숙의 유의한 단축이 있었던 것을 제외하고 MON 88302 식물에서 성숙의 지연은 관찰되지 않았다.
| MON 88302와 비교하여 RT73에서 심은 후 수확까지 일수 | ||||||
| 품종 | 시용 | 비율 g/ha ae | 평균 | 대조군 | 델타-일수 | P 값 |
| RT73 | 4-6 잎 | 450 | 103.6 | 103.8 | -0.20 | 0.45 |
| RT73 | 4-6 잎 | 900 | 103.6 | 103.8 | -0.25 | 0.36 |
| RT73 | 4-6 잎 | 1800 | 104.3 | 103.8 | 0.43 | 0.12 |
| RT73 | 4-6 잎 | 3600 | 104.7 | 103.8 | 0.83 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 450 | 103.8 | 103.8 | 0.00 | 1.00 |
| RT73 | 제1 개화 | 900 | 104.2 | 103.8 | 0.33 | 0.21 |
| RT73 | 제1 개화 | 1800 | 104.3 | 103.8 | 0.50 | 0.06 |
| RT73 | 제1 개화 | 3600 | 104.7 | 103.8 | 0.83 | <0.05 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 450 | 104.7 | 105.2 | -0.46 | 0.10 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 900 | 105.2 | 105.2 | 0.04 | 0.90 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 1800 | 104.5 | 105.2 | -0.67 | <0.05 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 3600 | 105.2 | 105.2 | 0.00 | 1.00 |
| MON88302 | 제1 개화 | 450 | 105.1 | 105.2 | -0.08 | 0.75 |
| MON88302 | 제1 개화 | 900 | 104.7 | 105.2 | -0.42 | 0.12 |
| MON88302 | 제1 개화 | 1800 | 104.9 | 105.2 | -0.25 | 0.34 |
| MON88302 | 제1 개화 | 3600 | 105.0 | 105.2 | -0.17 | 0.53 |
사건 MON 88302를 포함하는 카놀라와 비교한 사건 RT73을 포함하는 카놀라의 종자 수분 데이터를 표 4에서 제공한다. 개개의 구획을 채취하였을 때 종자 수분을 전자적으로 측정하였다. 각 시스템 내 종자 수분은 분무된 글라이포세이트 비율과 비문무 처리 사이의 비교이다. Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템 내 종자 수분은 4 내지 6개 잎 및 제1 개화 작물 단계 시용 둘 다의 1800 g ae/ha 및 3600 g ae/ha에서 높았다. 이 두 처리에서 증가된 종자 수분은 또한 앞서 기재한 작물 손상의 결과인 성숙의 지연을 반영한다. MON 88302 식물에서 종자 수분 상에 유의한 효과가 없음을 관찰하였다.
| MON 88302와 비교하여 RT73에서 종자 수분 | ||||||
| 품종 | 시용 | 비율 g/ha ae | 처리 평균 | 대조군 | 델타% | P 값 |
| RT73 | 4-6 잎 | 450 | 7.6 | 7.3 | 0.4 | 0.41 |
| RT73 | 4-6 잎 | 900 | 7.7 | 7.3 | 0.4 | 0.35 |
| RT73 | 4-6 잎 | 1800 | 8.4 | 7.3 | 1.1 | <0.05 |
| RT73 | 4-6 잎 | 3600 | 9.8 | 7.3 | 2.5 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 450 | 7.7 | 7.3 | 0.4 | 0.39 |
| RT73 | 제1 개화 | 900 | 8.0 | 7.3 | 0.7 | 0.09 |
| RT73 | 제1 개화 | 1800 | 8.3 | 7.3 | 1.0 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 3600 | 9.3 | 7.3 | 2.0 | <0.05 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 450 | 8.0 | 8.1 | -0.1 | 0.86 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 900 | 8.0 | 8.1 | 0.0 | 0.96 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 1800 | 8.0 | 8.1 | -0.1 | 0.87 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 3600 | 7.9 | 8.1 | -0.2 | 0.69 |
| MON88302 | 제1 개화 | 450 | 8.2 | 8.1 | 0.2 | 0.72 |
| MON88302 | 제1 개화 | 900 | 8.3 | 8.1 | 0.2 | 0.60 |
| MON88302 | 제1 개화 | 1800 | 8.1 | 8.1 | 0.1 | 0.87 |
| MON88302 | 제1 개화 | 3600 | 8.4 | 8.1 | 0.3 | 0.44 |
사건 MON 88302를 포함하는 카놀라와 비교한 사건 RT73을 포함하는 카놀라의 수확량 상의 데이터를 표 5 및 도 2 및 도 3에서 제공한다. 각 사건을 포함하는 카놀라에 대해 상이한 글라이포세이트 비율과 비분무 처리 사이의 수확량 비교를 만들었다. Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템에서, 4 내지 6개 잎 및 제1 개화 시용 둘 다에서 1800 및 3600 g ae/ha 비율 및 제1 개화 시용의 900 g/ha 비율에서 유의한 수확량 감소를 관찰하였다. 임의의 비율 또는 시간에 MON 88302 식물에서 수확량의 유의차가 없음을 관찰하였다.
| MON 88302와 비교하여 RT73에서 수확량 | ||||||
| 품종 | 시용 | 비율 g/ha ae | 처리한 평균 | 대조군 | 델타 bu/ac | P 값 |
| RT73 | 4-6 잎 | 450 | 56.0 | 58.0 | -2.0 | 0.45 |
| RT73 | 4-6 잎 | 900 | 55.6 | 58.0 | -2.4 | 0.36 |
| RT73 | 4-6 잎 | 1800 | 51.4 | 58.0 | -6.6 | <0.05 |
| RT73 | 4-6 잎 | 3600 | 40.6 | 58.0 | -17.4 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 450 | 56.1 | 58.0 | -1.9 | 0.46 |
| RT73 | 제1 개화 | 900 | 51.2 | 58.0 | -6.8 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 1800 | 48.2 | 58.0 | -9.8 | <0.05 |
| RT73 | 제1 개화 | 3600 | 41.5 | 58.0 | -16.5 | <0.05 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 450 | 53.7 | 52.2 | 1.5 | 0.57 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 900 | 54.4 | 52.2 | 2.2 | 0.40 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 1800 | 51.6 | 52.2 | -0.6 | 0.82 |
| MON88302 | 4-6 잎 | 3600 | 50.9 | 52.2 | -1.3 | 0.61 |
| MON88302 | 제1 개화 | 450 | 52.3 | 52.2 | 0.1 | 0.98 |
| MON88302 | 제1 개화 | 900 | 50.4 | 52.2 | -1.7 | 0.49 |
| MON88302 | 제1 개화 | 1800 | 52.5 | 52.2 | 0.3 | 0.91 |
| MON88302 | 제1 개화 | 3600 | 48.4 | 52.2 | -3.8 | 0.14 |
Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템에 대해 글라이포세이트의 현재 표지된 비율은 675 g ae/ha 1회 시용 또는 450 g ae/ha 2회 시용이다. 시용은 6개 잎 단계까지로 구성될 수 있다. MON88302에 대한 비율은 작물의 제1 개화까지 시용된 1800 g ae/ha까지일 수 있다. Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템은 1800 g ae/ha에서 계획된 MON 88302 시용량에서 11.4% 수확량 감소 및 계획량의 2X로 30% 수확량 감소가 있었다(도 2). 이 수확량 감소를 현재 표지된 4 내지 6개 잎의 Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 작물 시용 단계에서 관찰하였다. MON 88302 식물에서 상당한 수확량 감소는 관찰되지 않았다. 도 3은 글라이포세이트 비율 및 작물 단계(제1 개화)에서 수확량을 나타낸다. 이런 이후의 작물 단계에서 Genuity(상표명) Roundup Ready(등록상표) 카놀라 시스템에 대해 나타낸 모든 비율에서 상당한 수율 감소가 있었다. MON 88302 식물에서 상당한 수율 감소는 관찰되지 않았다.
실시예
3:
MON
88302
DNA
서열의
특징화
식물 MON 88302의 게놈 및 삽입물 측면의 게놈 서열 내로 삽입된 DNA를 상세한 분자 분석으로 특징화하였다. 이 분석은 삽입 서열의 시퀀싱, 삽입 수의 결정(게놈 내 통합 부위의 수), 복제물 수의 결정(1 좌위 내 이식유전자 DNA 복제물의 수), 삽입된 유전자 카세트 통합의 평가, 및 측면 서열의 특징화를 포함하였다.
사건 MON 88302 내 이식유전자 DNA 삽입 측면의 게놈 DNA 서열을 문헌[Ochman et al., 1990 (PCR Protocols: A guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc.)]에서 기재한 역 열증폭을 사용하여 결정하였다. 식물 게놈 DNA를 비유전자 이식 Ebony 및 실시예 1에서 설명한 브라씨카 나푸스의 아그로박테리움-매개 형질전환에서 생기는 상이한 유전자 이식 사건으로부터 분리하였다. DNA 분리를 위해 사용한 조직을 표준 온실 조건 하에 생산하였다. 대략 1그램의 어린 잎 조직을 액체 질소와 합쳤고 막자 사발을 사용하여 미세한 분말로 그라인딩하였다. 제조업자의 프로토콜에 따라서 Nucleon(상표명) PhytoPure(상표명) Genomic DNA 추출 키트(RPN8511, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 Amersham)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 최종 침전 단계 후, 개개의 샘플로부터 DNA를 0.5 ㎖의 TE(10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) 중에서 재현탁하였다. 이 방법은 이에 제한되는 것은 아니지만 종자를 포함하는 임의의 조직으로부터 DNA를 추출하기 위하여 당업자에 의해 변형될 수 있다.
각 샘플로부터 DNA 알리쿼트를 이식유전자 DNA의 제한 분석을 기반으로 선택한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하였다. 제한 단편의 자가결찰 후, 이식유전자 DNA의 5' 및 3' 말단으로부터 연장하는 ELONGASE(등록상표) 증폭 시스템(Cat. No. 10481-018, 미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 또는 Expand Long Template PCR 시스템(Cat. No. 1681842, 미국 인디애나주 인디애나폴리스시에 소재한 Roche Applied Science) 중 하나를 사용하여 서열을 증폭시키는 이식유전자 DNA 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 열 증폭을 수행하였다. 반응으로부터 생성된 앰플리콘을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였고 QIAGEN 겔 정제 키트(미국 캘리포니아주 발렌시아에 소재한 Qiagen)를 사용하여 정제하였다. 겔 정제 앰플리콘을 제조업자의 프로토콜에 따라서 pCR(등록상표)-XL-TOPO(등록상표) 벡터(미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 게놈 서열 측면의 사건 MON 88302를 함유하는 결과 플라스미드를 표준 DNA 서열 프로토콜을 사용하여 시퀀싱하였다. 게놈 내로 삽입된 유전자 이식 DNA의 5' 말단에 인접하거나 측면에 있는 게놈 DNA를 서열번호 3([C], 도 1 참조)으로 제시한다. 게놈 내로 삽입된 유전자 이식 DNA의 3' 말단에 인접한 게놈 DNA를 서열번호 4 2([D], 도 1 참조)로 제시한다. 게놈 DNA 내로 완전히 통합된 발현 카세트 DNA의 절편을 서열번호 5([E], 도 1 참조)로 제시한다.
분리된 DNA 분자 서열을 이식유전자 DNA 서열과 비교하여 측면 서열 및 공동분리된 이식유전자 DNA 단편을 확인하였다. 추론된 측면 서열 데이터 및 공지된 이식유전자 DNA 서열을 기반으로 설계한 프라이머로 열 증폭에 의해 발현 카세트 존재의 확인을 달성하였다. 이식유전자 DNA가 형질전환주 내로 통합된 동일 영역에 대응하는 야생형 서열을 사건 MON 88302 내 측면 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 분리하였다. ELONGASE(등록상표) 증폭 시스템(Cat. No. 10481-018, 미국 캘리포니아주 칼스베드에 소재한 Invitrogen)을 사용하여 열 증폭 반응을 수행하였다. 사건 MON 88302의 측면 서열 및 Ebony 야생형 서열을 다수의 뉴클레오타이드 및 단백질 데이터베이스에 대해 분석하였다. 이 정보를 사용하여 식물 게놈에 이식유전자의 관계를 시험하고 삽입 부위 통합을 평가하였다. 측면 서열 및 야생형 서열을 사용하여 사건을 확인하기 위해 사용한 TAQMAN 종말점 분석을 위한 프라이머를 설계하였다.
실시예 4: 사건 특이적 종말점
TAQMAN(등록상표) 분석
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이 실시예는 샘플 내 사건 MON 88302를 확인하기 위하여 개발된 사건 특이적 종말점 TAQMAN(등록상표) 열 증폭 방법을 기재한다. 사건 MON 88302 특이적 종말점 TAQMAN(등록상표) 방법에 유용한 조건의 예는 다음과 같다. 단계 1: 10㎕의 최종 부피로 조절된 18 메그옴 물. 단계 2: 1X 최종 농도로 5.0 ㎕의 2X Universal Master Mix(dNTPs, 효소, 완충제). 단계 3: 1.0 μM 최종 농도(예를 들어 마이크로원심분리기 튜브 내에서, 다음은 20μM의 최종 농도로 500 ㎕를 달성하도록 첨가되어야 한다: 100 μM의 농도에서 100 ㎕의 프라이머 SQ20901(서열번호 9); 100 μM의 농도에서 100㎕의 프라이머 SQ23770(서열번호 10); 300㎕의 18 메그옴 물)로 0.5 ㎕ 프라이머-1 및 프라이머-2 혼합(각 프라이머에 대해 20μM 농도로 18 메그옴 물 중에서 재현탁). 단계 4: 0.2 μM 최종 농도로 0.2 ㎕ 사건 6-FAM(상표명) MGB 프로브 PB10164(서열번호 11). 단계 5: 0.5 ㎕ 내부 대조군 프라이머 SQ2563(서열번호 17) 및 내부 대조군 프라이머 SQ2564(서열번호 18)를 각 프라이머에 대해 1.0μM의 최종 농도로 혼합. 단계 6: 0.2 μM 최종 농도로 0.2 ㎕ 내부 대조군 VIC(상표명) 프로브 PB0751(서열번호 19). 단계 7: 다음 중 각각 하나를 가지는 각 샘플에 대해 3.0 ㎕ 추출 DNA(주형) 1. 분석되는 잎 샘플; 2. 음성 대조군(비유전자 이식 DNA); 3. 음성 물 대조군(주형 없음); 4. 양성 대조군 MON 88302 DNA. 단계 8: 다음과 같은 열 순환기 조건: 2분 동안 50℃에서 1회 순환; 10분 동안 95℃에서 1회 순환; 15초 동안 95℃ 다음에 -1℃/순환으로 1분 동안 64℃에서 10회 순환; 15초 동안 95℃ 다음에 1분 동안 54℃에서 40회 순환; 10℃에서 최종 순환.
본 방법에 유용한 DNA 분자는, 예를 들어 프라이머 SQ20901(서열번호 9) 및 SQ23770(서열번호 10) 및 6FAM(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB10164(서열번호 11)이다. 다른 프로브 및 프라이머는 본 명세서에 제공된 이식유전자 삽입물의 서열 및/또는 측면의 서열을 기반으로 설계될 수 있다. PB10164(서열번호 11)와 함께 이 반응 방법으로 사용될 때 SQ20901(서열번호 9) 및 SQ23770(서열번호 10)은 사건 MON 88302 DNA를 위한 진단용인 앰플리콘을 생성한다. 종말점 TAQMAN 증폭 방법은 또한 브라씨카 나푸스 내 단일 복제물 내인성 유전자인 FatA의 증폭에 의해 주형 DNA의 통합을 확인한다. 본 방법에 유용한 DNA 분자는, 예를 들어 프라이머 SQ2563(서열번호 17) 및 SQ2564(서열번호 18) 및 VIC(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB0751(서열번호 19)이다. 이 분석을 위한 대조군은 사건 MON 88302 DNA를 함유하는 브라씨카 나푸스로부터의 양성 대조군, 비유전자 이식 브라씨카 나푸스로부터의 음성 대조군, 및 주형 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함한다.
종말점 TAQMAN(등록상표) 열 증폭 방법은 또한 사건 MON 88302에 대해 접합상태 분석을 개발하기 위하여 사용되었다. 접합상태 분석은 사건을 포함하는 식물이 사건 DNA에 대해 동형 접합적인지, 즉 염색체 쌍의 각 염색체 상에서 동일 위치 내 외인성 DNA를 포함하는지; 또는 사건 DNA에 대해 이형 접합적인지, 즉 염색체 쌍의 단지 하나의 염색체 상에서 외인성 DNA를 포함하는지; 또는 사건 DNA에 아무런 가치가 없는지, 즉 야생형인지 여부를 결정하는데 유용하다. 이 실시예는 샘플 내 사건 MON 88302의 접합상태를 결정하기 위하여 개발된 사건 특이적 종말점 TAQMAN(등록상표) 열 증폭 방법을 기재한다. 이 분석에 대해, 3개의 프라이머 분석이 사용되되, 프라이머 SQ21948(서열번호 12)는 삽입된 외인성 DNA로부터 특이적으호 혼성화하고 연장되며, 프라이머 SQ22176(서열번호 13)는 삽입된 외인성 DNA의 5'쪽 측면의 DNA으로부터 특이적으로 혼성화하고 연장되고, 프라이머 SQ24635(서열번호 14)는 삽입된 외인성 DNA의 3'쪽 측면의 DNA로부터 특이적으로 혼성화하고 연장된다. 3개의 프라이머는 사건을 위한 진단용이다. 이 실시예에서, 프라이머 SQ22176(서열번호 13) 및 프라이머 SQ21948(서열번호 12) 및 6FAM(상표명)-표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB4213(서열번호 15)는 삽입된 외인성 DNA의 복제물이 있을 때의 진단용이다. 이 실시예에서, SQ22176(서열번호 13) 및 프라이머 SQ24635(서열번호 14) 및 VIC(상표명)-표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB10787(서열번호 16)는 게놈 DNA 내 존재하는 삽입된 외인성 DNA의 복제물이 없을 때, 즉 야생형일 때의 진단용이다. 3개의 프라이머 및 2개의 프로브가 사건 MON 88302에 대해 동형 접합적인 식물로부터 추출된 DNA와 PCR 반응에서 함께 혼합될 때, 사건 MON 88302에 대해 동형 접합적인 식물을 표시하며 진단용인 6FAM(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB4213(서열번호 15)로부터만 형광 신호가 있다. 3개의 프라이머 및 2개의 프로브를 사건 MON 88302에 이형접합적인 식물로부터 추출된 DNA와 PCR 반응에서 함께 혼합할 때, 사건 MON 88302에 대해 이형 접합적인 식물을 표시하며 진단용인 6FAM(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB4213(서열번호 15) 및 VIC(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB10787(서열번호 16) 둘 다로부터 형광 신호가 있다. 3개의 프라이머 및 2개의 프로브를 사건 MON 88302에 아무 가치가 없는 식물로부터 추출한 DNA와 PCR 반응에서 함께 혼합할 때, 사건 MON 88302에 아무 가치가 없는, 즉 야생형인 식물을 표시하며 진단용인 VIC(상표명)-표지 올리고뉴클레오타이드 프로브 PB10787(서열번호 16)으로부터만 형광 신호가 있다. 이 방법에 유용한 조건의 예는 다음과 같다. 단계 1: 10 ㎕의 최종 부피로 조절된 18 메그옴 물. 단계 2: 1X 최종 농도로 5.0 ㎕의 2X Universal Master Mix(dNTPs, 효소, 완충제). 단계 3: 1.0 μM의 최종 농도(예를 들어 마이크로원심분리기 튜브 내에서, 다음은 20μM의 최종 농도로 500 ㎕를 달성하도록 첨가되어야 한다: 100 μM의 농도에서 100 ㎕의 프라이머 1; 100 μM의 농도에서 100㎕의 프라이머 2; 300㎕의 18 메그옴 물)로 0.5 ㎕의 접합상태 프라이머 SQ21948, SQ22176, SQ24635(각 프라이머에 대해 20μM의 농도로 18 메그옴 물 중에서 재현탁) 단계 4: 0.2 μM 최종 농도로 0.2 ㎕ 접합상태 6-FAM(상표명) MGB 프로브 PB4213(서열번호 15)(10μM의 농도로 18 메그옴 물 중에서 재현탁). 단계 5: 0.5 ㎕ 내부 대조군 프라이머 SQ22176(서열번호 13) 및 내부 대조군 프라이머 SQ24635(서열번호 14)를 각 프라이머에 대해 1.0μM의 최종 농도로 혼합(각 프라이머에 대해 20μM의 농도로 18 메그옴 물 중에서 재현탁). 단계 6: 0.2 μM 최종 농도로 0.2 ㎕ 내부 대조군 VIC(상표명) 프로브 PB10787(서열번호 16)(10 μM의 농도로 18 메그옴 물 중에서 재현탁). 단계 7: 다음 중 각각 하나를 가지는 각 샘플에 대해 3.0 ㎕ 추출 DNA(주형) 1. 분석되는 잎 샘플; 2. 음성 대조군(비유전자 이식 DNA); 3. 음성 물 대조군(주형 없음); 4. 양성 대조군 MON 88302 DNA. 단계 8: 다음과 같은 열순환기 조건: 2분 동안 50℃에서 1회 순환; 10분 동안 95℃에서 1회 순환; 15초 동안 95℃ 다음에 -1℃/순환으로 1분 동안 64℃에서 10회 순환; 15초 동안 95℃ 다음에 1분 동안 54℃에서 30회 순환; 10℃에서 최종 순환. System 9700 또는 Stratagene Robocycler, MJ Engine DNA Engine PTC-225 열 순환기를 사용할 수 있다. 생물학적 샘플 내 사건 MON 88302 DNA를 확인하기 위한 앰플리콘을 생성하는데 유용한 다른 방법 및 장치는 당업자에게 공지되어 있다. Eppendorf Mastercycler Gradient 또는 MJ Engine 내 열 증폭을 수행할 때, 열 순환기는 계산된 방식으로 실행되어야 한다. Perkin-Elmer 9700에서 열 증폭을 수행할 때, 열 순환기는 최대 램프 속도로 설정되어야 한다.
실시예
5: 임의의
MON
88302 육종 활동에서 사건
MON
88302의 확인
이 실시예는 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 사용하는 임의의 육종 활동의 자손 내에서 사건 MON 88302를 확인할 수 있는 법을 기재한다. DNA 사건 프라이머 쌍은 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성하기 위하여 사용된다. 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘은 적어도 하나의 접합 서열을 포함하며, 본 명세서에서 서열번호 1 또는 서열번호 2([A] 및 [B], 각각 도 1에서 도시)로 제공된다. 서열번호 1(도 1의 [A])은 이식유전자 삽입물의 5' 말단과 측면 서열의 접합에 대응하는 뉴클레오타이드 서열이다(서열번호 3 [C]의 위치 762 내지 821, 도 1 참조). 서열번호 2([B], 도 1 참조)는 이식유전자 삽입물의 3' 말단과 측면 서열의 접합에 대응하는 뉴클레오타이드 서열이다(서열번호 4 [D]의 위치 313 내지 372, 도 1 참조).
사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 사건 프라이머 쌍은 측면 서열(서열번호 3 및 4) 및 삽입된 유전자 이식 DNA 서열(서열번호 5)를 사용하여 설계된 프라이머 쌍을 포함한다. 서열번호 1의 적어도 40개의 뉴클레오타이드가 발견된 진단용 앰플리콘을 획득하기 위하여, 염기 1 내지 791의 서열번호 3을 기반으로 앞쪽의 프라이머 분자 및 프라이머 분자가 서열번호 3 및 서열번호 5에 특이적으로 혼성화하는 연속 뉴클레오타이드의 충분한 길이를 가지는 위치 1 내지 4427의 서열번호 5인 삽입된 발현 카세트 DNA 서열을 기반으로 역 프라이머 분자를 설계한다. 서열번호 2의 적어도 40개 뉴클레오타이드에서 발견된 진단용 앰플리콘을 획득하기 위하여 위치 1 내지 4427의 서열번호 5인 삽입된 발현 카세트를 기반으로 한 앞쪽의 프라이머 분자 및 염기 343 내지 1250의 서열번호 4인 3' 측면의 서열을 기반으로 한 역 프라이머 분자를 설계하였으며, 이때 해당 프라이머 분자는 서열번호 4 및 서열번호 5에 특이적으로 혼성화하는 연속적 뉴클레오타이드의 충분한 길이를 가진다. 실행적 목적을 위해, 예를 들어 100 내지 1000개 염기 사이에 제한된 크기 범위의 앰플리콘을 생성하는 프라이머를 설계하여야 한다. 일반적으로 더 작은 (더 짧은 폴리뉴클레오타이드 길이) 크기의 앰플리콘은 PCR 반응에서 더 확실하게 생성되며, 순환 시간을 더 짧게 하고, 종말점 TAQMAN(등록상표)-유사 분석에서 사용에 또는 사용을 위해 적합화된 아가로스 겔 상에서 용이하게 분리되며 시각화된다. 더 작은 앰플리콘은 앰플리콘 검출의 당업계에 공지된 방법에 의해 생성되고 검출될 수 있다. 추가로, 프라이머 쌍을 사용하여 생성된 앰플리콘은 벡터 내로 클로닝되고, 전파되며, 분리되고 시퀀싱되거나 당업계에 잘 확립된 방법으로 직접적으로 시퀀싱될 수 있다. 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘 또는 이것의 자손을 생산하는 DNA 증폭 방법에서 유용한 서열번호 3과 서열번호 5의 조합 또는 서열번호 4와 서열번호 5의 조합으로부터 유래된 임의의 프라이머 쌍은 본 발명의 양태이다. 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 위한 진단용 앰플리콘 또는 이것의 자손을 생산하는 DNA 증폭 방법에서 유용한 서열번호 3의 적어도 11개의 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 단일 분리 DNA 폴리뉴클레오타이드 프라이머 분자, 또는 그것의 보체는 본 발명의 양태이다. 사건 MON 88302를 포함하는 식물 또는 이것의 자손을 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 DNA 증폭 방법에 유용한 서열번호 4의 적어도 11개의 연속적 뉴클레오타이드, 또는 그것의 보체를 포함하는 임의의 분리된 DNA 폴리뉴클레오타이드 프라이머 분자는 본 발명의 양태이다. 사건 MON 88302를 포함하는 식물 또는 이것의 자손을 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 DNA 증폭 방법에 유용한 서열번호 5의 적어도 11개의 연속적 뉴클레오타이드, 또는 그것의 보체를 포함하는 임의의 분리된 DNA 폴리뉴클레오타이드 프라이머 분자는 본 발명의 양태이다.
이 분석을 위한 증폭 조건의 예는 상기 실시예 4에 기재한다. 그러나 이 방법의 임의의 변형 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4에 상동성이거나 상보적인 DNA 프라이머 또는 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 사건 MON 88302의 이식 유전자 삽입물(서열번호 5)의 DNA 서열의 용도는 본 발명의 범주 내에 있다. 진단용 앰플리콘은 적어도 하나의 이식유전자/게놈 접합 DNA(서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8), 또는 이것의 실질적 부분에 상동성 또는 상보적인 DNA 분자를 포함한다.
샘플 내 사건 MON 88302에 대한 분석은 사건 MON 88302로부터의 양성 대조군, 사건 MON 88302가 아닌 비슷한 식물로부터의 음성 대조군(예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, 브라씨카 나푸스), 및/또는 게놈 DNA를 함유하지 않는 음성 대조군을 포함할 수 있다. 내인성 DNA 분자를 증폭하는 프라이머 쌍은 DNA 증폭 조건에 대한 내부 대조군으로 작용할 수 있다. 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5에서 제시된 서열로부터 선택된 서열의 어떤 단편은 실시예 4에 기재된 방법으로 앰플리콘의 생성을 위한 DNA 증폭 프라이머로 사용될 수 있으며, 이러한 앰플리콘은 이러한 진단용 증폭 반응에 대한 주형으로서 사건 MON 88302를 사용할 때 사건 MON 88302를 위한 진단용일 수 있다. 실시예 4에 기재된 방법에 대한 변형을 가지는 이들 DNA 프라이머 서열의 사용은 본 발명의 범주 내이다. 사건 MON 88302를 위한 진단용인 서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로부터 유래된 적어도 하나의 DNA 프라이머 서열에 의해 생성된 앰플리콘은 본 발명의 양태이다.
서열번호 3, 서열번호 4, 또는 서열번호 5로부터 유래된 연속적 뉴클레오타이드의 충분한 길이의 적어도 하나의 DNA 프라이머를 함유하는 DNA 검출 키트는, 사건 MON 88302를 포함하는 식물 또는 그것의 자손을 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 DNA 증폭 방법에서 사용될 때, 이와 같이 설계될 수 있으며, 본 발명의 양태이다. DNA 증폭 방법에서 시험될 때 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성하는 식물 부분 또는 종자 또는 일반 상품은 본 발명의 양태이다. 사건 MON 88302 앰플리콘에 대한 분석은 본 명세서에 기재된 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성하기 위하여 사용될 수 있는 임의의 열 순환기 또는 핵산 증폭 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 개시되고 특허청구범위에 인용된 사건 MON 88302의 대표적 샘플의 기탁물은 미국 버지니아주 20110 매너서스시 유니버시티 블러바드 10801에 소재한 미국 미생물보존센터(ATCC)에 의해 부다페스트 조약 하에 만들어졌다. 이 기탁물에 대한 ATCC 접수번호는 PTA-10955이다. 기탁물은 30년, 또는 마지막 요청 후 5년의 기간, 또는 특허 존속 기간 동안 중에서 긴 기간 동안 기탁소에서 유지될 것이며, 필요하다면 해당 기간 동안 대체될 것이다.
본 발명의 원칙을 설명하고 기재할 때, 본 발명이 이러한 원칙으로부터 벗어나지 않고 정연하고 상세하게 변형될 수 있다는 것이 당업자에게 명백하여야 한다. 본 발명자들은 첨부하는 특허청구범위의 정신과 범주 내에서 모든 변형을 요구한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Monsanto Technology LLC
Brown, Andrew J
Byrne, James F III
Cole, Robert H II
Crowley, James H
Miklos, John A
Ripley, Robert C
Seifert-Higgins, Simone
Xie, Jiali
<120> TRANSGENIC BRASSICA EVENT MON 88302 AND METHODS OF USE THEREOF
<130> MONS:291WO
<140> Unknown
<141> 2011-06-01
<150> 61/351,317
<151> 2010-06-04
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 1
aaacctttta gtcatcatgt tgtaccactt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg 60
<210> 2
<211> 60
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola gemonic DNA and transgene DNA
<400> 2
tttcccggac atgaagccat ttacaattga ccatcatact caacttcaat tttttttaat 60
<210> 3
<211> 956
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 3
ttatctatct ttttttgtag gtcctaataa acgggctaca gcactttgtg ccaacaaagg 60
tgaagccaaa gttacagata gtcgaaacat ttatcaaggt aagcaaacca gaaactcata 120
tgaaagtata gcagacttga gatcataata tgctggtgat acacacttaa aaatcggaat 180
catcactcat tttttttgca ggcatactat ctgccagaga cggaatatgt ccactgggca 240
agagctcatc cggtaaacaa acaaatcttt cttaatcttt cttaatcttt ataatgtttt 300
gcgtaaatta aatcgatggg atagaagact aatatgatta aaatgtgtaa acatacagga 360
atatacgaaa gcacaggtca ttggacttgt gaatttagta gccaccatga aaagctggaa 420
gaggaaaacg cgtctagaag ttgtggataa gattgaatca gctgctgcat agatcaaatc 480
taaaagcaac aacaaagtaa tttttttact tcttttctct ggtcttgttc tgtctttgct 540
tttggctctt acttttgcgt tttgaaccga gtgtgtaaat ttgaggataa gcccttctta 600
gttatcatct ttcttttgct taatggggtt tgtgtaaaag atcctcctca agttgtacag 660
tcttgaagag attgtaacac acggtttcct acatttaaat acttaattaa tgtctcagta 720
tttgtattat cagttccttg aaccttattt tatagtgcac aaaacctttt agtcatcatg 780
ttgtaccact tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatcccc 840
atcaagctct agctagagcg gccgcgttat caagcttctg caggtcctgc tcgagtggaa 900
gctaattctc agtccaaagc ctcaacaagg tcagggtaca gagtctccaa accatt 956
<210> 4
<211> 1250
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 4
caattgattg acaacatgca tcaatcgacc tgcagccact cgaagcggcc gcatcgatcg 60
tgaagtttct catctaagcc cccatttgga cgtgaatgta gacacgtcga aataaagatt 120
tccgaattag aataatttgt ttattgcttt cgcctataaa tacgacggat cgtaatttgt 180
cgttttatca aaatgtactt tcattttata ataacgctgc ggacatctac atttttgaat 240
tgaaaaaaaa ttggtaatta ctctttcttt ttctccatat tgaccatcat actcattgct 300
gatccatgta gatttcccgg acatgaagcc atttacaatt gaccatcata ctcaacttca 360
atttttttta atgtcattat gatagatgaa taattccttt tcttatcctg ttgaccataa 420
taatgataaa acagtaatca tgataaatat atcaaaaagt gtattttaaa aattttctaa 480
tcattattcg agaaaaaaaa caaatcattt gtaagtttca ctgttaacta cagatgaaac 540
atcttttgtt tttaacgttt taatgatatt gaaatcaatc agaataaaag gtgtctcatc 600
tcttgtgtac tgtcatgttt gcgatgagag gctggaagaa agactagtca aaagacttca 660
aagctgtggt gatttagttg tatctccaac catttttaat gcaacgcatg gttcatctac 720
tggtacctgt tgcacaataa aacattcaaa aacatgttat tttacaaatc ttcactaaaa 780
gccttcaatt tcatatgatg cgtgtcaatg taaaccgact tcttattttc aaactgttga 840
tgtgaaagag agaaaaaaat cagagaagta aaatttatga aggagattta ctaagaagta 900
aattgtttta taaataatta tttttatata aaataagatt tattattatt ttttcatgtt 960
aatgttaaaa gacctttaaa aaatatgcat tacgttttta taacagtaga gatgttttta 1020
agaattgata ttaggtagct ttttaaaatt aatttagtaa ttatctaaaa aaaatgatct 1080
cttttataaa aagaaaaaat cacagagatc cagatactgt cgtgtgaagt attaaagaga 1140
tgtctttaaa aagtattaaa gagacagtcg acagtttgct atctgttgta ataaataata 1200
gaaaaataaa gaaactgcag caggaagata aagaaaacat gagagacata 1250
<210> 5
<211> 4427
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Transgene insert
<400> 5
caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatcccca tcaagctcta 60
gctagagcgg ccgcgttatc aagcttctgc aggtcctgct cgagtggaag ctaattctca 120
gtccaaagcc tcaacaaggt cagggtacag agtctccaaa ccattagcca aaagctacag 180
gagatcaatg aagaatcttc aatcaaagta aactactgtt ccagcacatg catcatggtc 240
agtaagtttc agaaaaagac atccaccgaa gacttaaagt tagtgggcat ctttgaaagt 300
aatcttgtca acatcgagca gctggcttgt ggggaccaga caaaaaagga atggtgcaga 360
attgttaggc gcacctacca aaagcatctt tgcctttatt gcaaagataa agcagattcc 420
tctagtacaa gtggggaaca aaataacgtg gaaaagagct gtcctgacag cccactcact 480
aatgcgtatg acgaacgcag tgacgaccac aaaagaatta gcttgagctc aggatttagc 540
agcattccag attgggttca atcaacaagg tacgagccat atcactttat tcaaattggt 600
atcgccaaaa ccaagaagga actcccatcc tcaaaggttt gtaaggaaga attcgatatc 660
aagcttgata tcggaagttt ctctcttgag ggaggttgct cgtggaatgg gacacatatg 720
gttgttataa taaaccattt ccattgtcat gagattttga ggttaatata tactttactt 780
gttcattatt ttatttggtg tttgaataaa tgatataaat ggctcttgat aatctgcatt 840
cattgagata tcaaatattt actctagaga agagtgtcat atagattgat ggtccacaat 900
caatgaaatt tttgggagac gaacatgtat aaccatttgc ttgaataacc ttaattaaaa 960
ggtgtgatta aatgatgttt gtaacatgta gtactaaaca ttcataaaac acaaccaacc 1020
caagaggtat tgagtattca cggctaaaca ggggcataat ggtaatttaa agaatgatat 1080
tattttatgt taaaccctaa cattggtttc ggattcaacg ctataaataa aaccactctc 1140
gttgctgatt ccatttatcg ttcttattga ccctagccgc tacacacttt tctgcgatat 1200
ctctgaggta agcgttaacg tacccttaga tcgttctttt tctttttcgt ctgctgatcg 1260
ttgctcatat tatttcgatg attgttggat tcgatgctct ttgttgattg atcgttctga 1320
aaattctgat ctgttgttta gattttatcg attgttaata tcaacgtttc actgcttcta 1380
aacgataatt tattcatgaa actattttcc cattctgatc gatcttgttt tgagatttta 1440
atttgttcga ttgattgttg gttggtggat ctatatacga gtgaacttgt tgatttgcgt 1500
atttaagatg tatgtcgatt tgaattgtga ttgggtaatt ctggagtagc ataacaaatc 1560
cagtgttccc tttttctaag ggtaattctc ggattgtttg ctttatatct cttgaaattg 1620
ccgatttgat tgaatttagc tcgcttagct cagatgatag agcaccacaa tttttgtggt 1680
agaaatcggt ttgactccga tagcggcttt ttactatgat tgttttgtgt taaagatgat 1740
tttcataatg gttatatatg tctactgttt ttattgattc aatatttgat tgttcttttt 1800
tttgcagatt tgttgaccag agatctacca tggcgcaagt tagcagaatc tgcaatggtg 1860
tgcagaaccc atctcttatc tccaatctct cgaaatccag tcaacgcaaa tctcccttat 1920
cggtttctct gaagacgcag cagcatccac gagcttatcc gatttcgtcg tcgtggggat 1980
tgaagaagag tgggatgacg ttaattggct ctgagcttcg tcctcttaag gtcatgtctt 2040
ctgtttccac ggcgtgcatg cttcacggtg caagcagccg tccagcaact gctcgtaagt 2100
cctctggtct ttctggaacc gtccgtattc caggtgacaa gtctatctcc cacaggtcct 2160
tcatgtttgg aggtctcgct agcggtgaaa ctcgtatcac cggtcttttg gaaggtgaag 2220
atgttatcaa cactggtaag gctatgcaag ctatgggtgc cagaatccgt aaggaaggtg 2280
atacttggat cattgatggt gttggtaacg gtggactcct tgctcctgag gctcctctcg 2340
atttcggtaa cgctgcaact ggttgccgtt tgactatggg tcttgttggt gtttacgatt 2400
tcgatagcac tttcattggt gacgcttctc tcactaagcg tccaatgggt cgtgtgttga 2460
acccacttcg cgaaatgggt gtgcaggtga agtctgaaga cggtgatcgt cttccagtta 2520
ccttgcgtgg accaaagact ccaacgccaa tcacctacag ggtacctatg gcttccgctc 2580
aagtgaagtc cgctgttctg cttgctggtc tcaacacccc aggtatcacc actgttatcg 2640
agccaatcat gactcgtgac cacactgaaa agatgcttca aggttttggt gctaacctta 2700
ccgttgagac tgatgctgac ggtgtgcgta ccatccgtct tgaaggtcgt ggtaagctca 2760
ccggtcaagt gattgatgtt ccaggtgatc catcctctac tgctttccca ttggttgctg 2820
ccttgcttgt tccaggttcc gacgtcacca tccttaacgt tttgatgaac ccaacccgta 2880
ctggtctcat cttgactctg caggaaatgg gtgccgacat cgaagtgatc aacccacgtc 2940
ttgctggtgg agaagacgtg gctgacttgc gtgttcgttc ttctactttg aagggtgtta 3000
ctgttccaga agaccgtgct ccttctatga tcgacgagta tccaattctc gctgttgcag 3060
ctgcattcgc tgaaggtgct accgttatga acggtttgga agaactccgt gttaaggaaa 3120
gcgaccgtct ttctgctgtc gcaaacggtc tcaagctcaa cggtgttgat tgcgatgaag 3180
gtgagacttc tctcgtcgtg cgtggtcgtc ctgacggtaa gggtctcggt aacgcttctg 3240
gagcagctgt cgctacccac ctcgatcacc gtatcgctat gagcttcctc gttatgggtc 3300
tcgtttctga aaaccctgtt actgttgatg atgctactat gatcgctact agcttcccag 3360
agttcatgga tttgatggct ggtcttggag ctaagatcga actctccgac actaaggctg 3420
cttgatgagc tcaagaattc gagctcggta ccggatcctc tagctagagc tttcgttcgt 3480
atcatcggtt tcgacaacgt tcgtcaagtt caatgcatca gtttcattgc gcacacacca 3540
gaatcctact gagtttgagt attatggcat tgggaaaact gtttttcttg taccatttgt 3600
tgtgcttgta atttactgtg ttttttattc ggttttcgct atcgaactgt gaaatggaaa 3660
tggatggaga agagttaatg aatgatatgg tccttttgtt cattctcaaa ttaatattat 3720
ttgttttttc tcttatttgt tgtgtgttga atttgaaatt ataagagata tgcaaacatt 3780
ttgttttgag taaaaatgtg tcaaatcgtg gcctctaatg accgaagtta atatgaggag 3840
taaaacactt gtagttgtac cattatgctt attcactagg caacaaatat attttcagac 3900
ctagaaaagc tgcaaatgtt actgaataca agtatgtcct cttgtgtttt agacatttat 3960
gaactttcct ttatgtaatt ttccagaatc cttgtcagat tctaatcatt gctttataat 4020
tatagttata ctcatggatt tgtagttgag tatgaaaata ttttttaatg cattttatga 4080
cttgccaatt gattgacaac atgcatcaat cgacctgcag ccactcgaag cggccgcatc 4140
gatcgtgaag tttctcatct aagcccccat ttggacgtga atgtagacac gtcgaaataa 4200
agatttccga attagaataa tttgtttatt gctttcgcct ataaatacga cggatcgtaa 4260
tttgtcgttt tatcaaaatg tactttcatt ttataataac gctgcggaca tctacatttt 4320
tgaattgaaa aaaaattggt aattactctt tctttttctc catattgacc atcatactca 4380
ttgctgatcc atgtagattt cccggacatg aagccattta caattga 4427
<210> 6
<211> 6126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 6
ttatctatct ttttttgtag gtcctaataa acgggctaca gcactttgtg ccaacaaagg 60
tgaagccaaa gttacagata gtcgaaacat ttatcaaggt aagcaaacca gaaactcata 120
tgaaagtata gcagacttga gatcataata tgctggtgat acacacttaa aaatcggaat 180
catcactcat tttttttgca ggcatactat ctgccagaga cggaatatgt ccactgggca 240
agagctcatc cggtaaacaa acaaatcttt cttaatcttt cttaatcttt ataatgtttt 300
gcgtaaatta aatcgatggg atagaagact aatatgatta aaatgtgtaa acatacagga 360
atatacgaaa gcacaggtca ttggacttgt gaatttagta gccaccatga aaagctggaa 420
gaggaaaacg cgtctagaag ttgtggataa gattgaatca gctgctgcat agatcaaatc 480
taaaagcaac aacaaagtaa tttttttact tcttttctct ggtcttgttc tgtctttgct 540
tttggctctt acttttgcgt tttgaaccga gtgtgtaaat ttgaggataa gcccttctta 600
gttatcatct ttcttttgct taatggggtt tgtgtaaaag atcctcctca agttgtacag 660
tcttgaagag attgtaacac acggtttcct acatttaaat acttaattaa tgtctcagta 720
tttgtattat cagttccttg aaccttattt tatagtgcac aaaacctttt agtcatcatg 780
ttgtaccact tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg gaaacgacaa tctgatcccc 840
atcaagctct agctagagcg gccgcgttat caagcttctg caggtcctgc tcgagtggaa 900
gctaattctc agtccaaagc ctcaacaagg tcagggtaca gagtctccaa accattagcc 960
aaaagctaca ggagatcaat gaagaatctt caatcaaagt aaactactgt tccagcacat 1020
gcatcatggt cagtaagttt cagaaaaaga catccaccga agacttaaag ttagtgggca 1080
tctttgaaag taatcttgtc aacatcgagc agctggcttg tggggaccag acaaaaaagg 1140
aatggtgcag aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct ttgcctttat tgcaaagata 1200
aagcagattc ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt ggaaaagagc tgtcctgaca 1260
gcccactcac taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca caaaagaatt agcttgagct 1320
caggatttag cagcattcca gattgggttc aatcaacaag gtacgagcca tatcacttta 1380
ttcaaattgg tatcgccaaa accaagaagg aactcccatc ctcaaaggtt tgtaaggaag 1440
aattcgatat caagcttgat atcggaagtt tctctcttga gggaggttgc tcgtggaatg 1500
ggacacatat ggttgttata ataaaccatt tccattgtca tgagattttg aggttaatat 1560
atactttact tgttcattat tttatttggt gtttgaataa atgatataaa tggctcttga 1620
taatctgcat tcattgagat atcaaatatt tactctagag aagagtgtca tatagattga 1680
tggtccacaa tcaatgaaat ttttgggaga cgaacatgta taaccatttg cttgaataac 1740
cttaattaaa aggtgtgatt aaatgatgtt tgtaacatgt agtactaaac attcataaaa 1800
cacaaccaac ccaagaggta ttgagtattc acggctaaac aggggcataa tggtaattta 1860
aagaatgata ttattttatg ttaaacccta acattggttt cggattcaac gctataaata 1920
aaaccactct cgttgctgat tccatttatc gttcttattg accctagccg ctacacactt 1980
ttctgcgata tctctgaggt aagcgttaac gtacccttag atcgttcttt ttctttttcg 2040
tctgctgatc gttgctcata ttatttcgat gattgttgga ttcgatgctc tttgttgatt 2100
gatcgttctg aaaattctga tctgttgttt agattttatc gattgttaat atcaacgttt 2160
cactgcttct aaacgataat ttattcatga aactattttc ccattctgat cgatcttgtt 2220
ttgagatttt aatttgttcg attgattgtt ggttggtgga tctatatacg agtgaacttg 2280
ttgatttgcg tatttaagat gtatgtcgat ttgaattgtg attgggtaat tctggagtag 2340
cataacaaat ccagtgttcc ctttttctaa gggtaattct cggattgttt gctttatatc 2400
tcttgaaatt gccgatttga ttgaatttag ctcgcttagc tcagatgata gagcaccaca 2460
atttttgtgg tagaaatcgg tttgactccg atagcggctt tttactatga ttgttttgtg 2520
ttaaagatga ttttcataat ggttatatat gtctactgtt tttattgatt caatatttga 2580
ttgttctttt ttttgcagat ttgttgacca gagatctacc atggcgcaag ttagcagaat 2640
ctgcaatggt gtgcagaacc catctcttat ctccaatctc tcgaaatcca gtcaacgcaa 2700
atctccctta tcggtttctc tgaagacgca gcagcatcca cgagcttatc cgatttcgtc 2760
gtcgtgggga ttgaagaaga gtgggatgac gttaattggc tctgagcttc gtcctcttaa 2820
ggtcatgtct tctgtttcca cggcgtgcat gcttcacggt gcaagcagcc gtccagcaac 2880
tgctcgtaag tcctctggtc tttctggaac cgtccgtatt ccaggtgaca agtctatctc 2940
ccacaggtcc ttcatgtttg gaggtctcgc tagcggtgaa actcgtatca ccggtctttt 3000
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ggctcctctc gatttcggta acgctgcaac tggttgccgt ttgactatgg gtcttgttgg 3180
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tcgtgtgttg aacccacttc gcgaaatggg tgtgcaggtg aagtctgaag acggtgatcg 3300
tcttccagtt accttgcgtg gaccaaagac tccaacgcca atcacctaca gggtacctat 3360
ggcttccgct caagtgaagt ccgctgttct gcttgctggt ctcaacaccc caggtatcac 3420
cactgttatc gagccaatca tgactcgtga ccacactgaa aagatgcttc aaggttttgg 3480
tgctaacctt accgttgaga ctgatgctga cggtgtgcgt accatccgtc ttgaaggtcg 3540
tggtaagctc accggtcaag tgattgatgt tccaggtgat ccatcctcta ctgctttccc 3600
attggttgct gccttgcttg ttccaggttc cgacgtcacc atccttaacg ttttgatgaa 3660
cccaacccgt actggtctca tcttgactct gcaggaaatg ggtgccgaca tcgaagtgat 3720
caacccacgt cttgctggtg gagaagacgt ggctgacttg cgtgttcgtt cttctacttt 3780
gaagggtgtt actgttccag aagaccgtgc tccttctatg atcgacgagt atccaattct 3840
cgctgttgca gctgcattcg ctgaaggtgc taccgttatg aacggtttgg aagaactccg 3900
tgttaaggaa agcgaccgtc tttctgctgt cgcaaacggt ctcaagctca acggtgttga 3960
ttgcgatgaa ggtgagactt ctctcgtcgt gcgtggtcgt cctgacggta agggtctcgg 4020
taacgcttct ggagcagctg tcgctaccca cctcgatcac cgtatcgcta tgagcttcct 4080
cgttatgggt ctcgtttctg aaaaccctgt tactgttgat gatgctacta tgatcgctac 4140
tagcttccca gagttcatgg atttgatggc tggtcttgga gctaagatcg aactctccga 4200
cactaaggct gcttgatgag ctcaagaatt cgagctcggt accggatcct ctagctagag 4260
ctttcgttcg tatcatcggt ttcgacaacg ttcgtcaagt tcaatgcatc agtttcattg 4320
cgcacacacc agaatcctac tgagtttgag tattatggca ttgggaaaac tgtttttctt 4380
gtaccatttg ttgtgcttgt aatttactgt gttttttatt cggttttcgc tatcgaactg 4440
tgaaatggaa atggatggag aagagttaat gaatgatatg gtccttttgt tcattctcaa 4500
attaatatta tttgtttttt ctcttatttg ttgtgtgttg aatttgaaat tataagagat 4560
atgcaaacat tttgttttga gtaaaaatgt gtcaaatcgt ggcctctaat gaccgaagtt 4620
aatatgagga gtaaaacact tgtagttgta ccattatgct tattcactag gcaacaaata 4680
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tgctttataa ttatagttat actcatggat ttgtagttga gtatgaaaat attttttaat 4860
gcattttatg acttgccaat tgattgacaa catgcatcaa tcgacctgca gccactcgaa 4920
gcggccgcat cgatcgtgaa gtttctcatc taagccccca tttggacgtg aatgtagaca 4980
cgtcgaaata aagatttccg aattagaata atttgtttat tgctttcgcc tataaatacg 5040
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catcatactc attgctgatc catgtagatt tcccggacat gaagccattt acaattgacc 5220
atcatactca acttcaattt tttttaatgt cattatgata gatgaataat tccttttctt 5280
atcctgttga ccataataat gataaaacag taatcatgat aaatatatca aaaagtgtat 5340
tttaaaaatt ttctaatcat tattcgagaa aaaaaacaaa tcatttgtaa gtttcactgt 5400
taactacaga tgaaacatct tttgttttta acgttttaat gatattgaaa tcaatcagaa 5460
taaaaggtgt ctcatctctt gtgtactgtc atgtttgcga tgagaggctg gaagaaagac 5520
tagtcaaaag acttcaaagc tgtggtgatt tagttgtatc tccaaccatt tttaatgcaa 5580
cgcatggttc atctactggt acctgttgca caataaaaca ttcaaaaaca tgttatttta 5640
caaatcttca ctaaaagcct tcaatttcat atgatgcgtg tcaatgtaaa ccgacttctt 5700
attttcaaac tgttgatgtg aaagagagaa aaaaatcaga gaagtaaaat ttatgaagga 5760
gatttactaa gaagtaaatt gttttataaa taattatttt tatataaaat aagatttatt 5820
attatttttt catgttaatg ttaaaagacc tttaaaaaat atgcattacg tttttataac 5880
agtagagatg tttttaagaa ttgatattag gtagcttttt aaaattaatt tagtaattat 5940
ctaaaaaaaa tgatctcttt tataaaaaga aaaaatcaca gagatccaga tactgtcgtg 6000
tgaagtatta aagagatgtc tttaaaaagt attaaagaga cagtcgacag tttgctatct 6060
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gacata 6126
<210> 7
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 7
accttatttt atagtgcaca aaacctttta gtcatcatgt tgtaccactt caaacactga 60
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<210> 8
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chimeric DNA molecule of Canola genomic DNA and transgene DNA
<400> 8
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<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 9
cattgctgat ccatgtagat ttcc 24
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 10
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 13
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 14
tcatcaactt caattttttt taatgtcatt 30
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
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<212> DNA
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<220>
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tgcttttgga tactaattaa cac 23
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<211> 20
<212> DNA
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<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 17
gcgagctgat ctggacatga 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 18
cacccatccg atgtaggtga c 21
<210> 19
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Chemically Synthesized Oligonucleotide PCR Primer
<400> 19
ccagcacgtg aataa 15
Claims (35)
- DNA 분자로서,
a. 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자;
b. 서열번호 6과 적어도 95% 동일성을 가지는 뉴클레오타이드 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자; 또는
c. 상기 a 또는 b와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 것인 DNA 분자. - 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 사건(event) MON 88302, ATCC 접수번호 PTA-10955 하에 기탁된 사건 MON 88302를 포함하는 종자의 대표적인 샘플로부터 유래된 것인 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 브라씨카(Brassica) 식물, 식물 세포, 종자, 자손 식물, 식물 부분 또는 일반 상품(commodity product)에 포함된 것인 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 사건 MON 88302의 DNA로부터 유래된 주형 분자로부터 생성된 앰플리콘인 것인 DNA 분자.
- 제1항에 있어서, 상기 DNA 분자는 상기 사건 MON 88302의 존재를 진단하기 위한 것인 DNA 분자.
- 사건 88302의 존재를 위한 진단용 폴리뉴클레오타이드 프로브로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브는 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 핵산 분자에 결합하기에 충분한 길이를 가지며, 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브는, 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하는 DNA 분자와 엄격한 혼성화 조건(stringent hybridization conditions) 하에 혼성화하고, 서열번호 1 또는 서열번호 2를 포함하지 않는 DNA 분자와 엄격한 혼성화 조건 하에서는 혼성화하지 않는 것인, 사건 88302의 존재를 위한 진단용 폴리뉴클레오타이드 프로브.
- DNA 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA 분자의 존재를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
a. DNA 샘플을 제6항의 상기 폴리뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계;
b. 상기 샘플 및 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브에 엄격한 혼성화 조건을 실시하는 단계; 및
c. 상기 DNA 분자에 상기 폴리뉴클레오타이드 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하되,
상기 혼성화를 검출하는 단계는 상기 DNA 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 상기 DNA 분자의 존재를 진단하는 것인, DNA 분자 존재의 검출방법. - 제1 DNA 분자 및 제1 DNA 분자와 상이한 제2 DNA 분자로 이루어진 DNA 분자 쌍으로서, 상기 DNA 분자는 서열번호 6의 연속적 뉴클레오타이드의 충분한 길이의 뉴클레오타이드 서열 또는 이것의 보체를 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하여, 사건 MON 88302로부터 유래된 주형과 증폭 반응에서 함께 사용될 때, DNA 프라이머로 작용하여 샘플 내 사건 MON 88302 DNA에 진단적인 앰플리콘을 생성하는 것인 DNA 분자 쌍.
- 제8항에 있어서, 상기 앰플리콘은 서열번호 1 및 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것인 DNA 분자 쌍.
- DNA 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA 분자 존재의 검출방법으로서, 상기 방법은
a. DNA 샘플을 제8항의 DNA 분자 쌍과 접촉시키는 단계;
b. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 적어도 40개의 연속적 뉴클레오타이드를 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 앰플리콘을 생성하기에 충분한 증폭 반응을 수행하는 단계; 및
c. 상기 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함하되,
상기 앰플리콘을 검출하는 단계는 상기 DNA 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 상기 DNA 분자의 존재를 진단하는 것인, DNA 샘플 내 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA 분자 존재의 검출방법. - 사건 MON 88302로부터 유래된 DNA 존재 검출에 특이적인 DNA 프라이머 또는 폴리뉴클레오타이드 프로브로 작용하기 위한 서열번호 6의 연속적 뉴클레오타이드의 충분한 길이의 뉴클레오타이드 서열, 및 이것의 보체를 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 DNA 검출 키트로서, 상기 DNA의 검출은 샘플 내 상기 사건 MON 88302 DNA의 존재를 진단하기 위한 것인, DNA 검출 키트.
- 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 제12항에 있어서, 상기 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분은 글라이포세이트(glyphosate) 제초제 처리에 저항성이 있는 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 제12항에 있어서, 상기 게놈은 DNA 증폭 방법으로 시험될 때 사건 MON 88302에 진단적인 앰플리콘을 생성하는 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 제12항에 있어서, 상기 식물 부분은 꽃가루, 밑씨, 꼬투리, 꽃, 뿌리 조직, 줄기 조직, 또는 잎 조직으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 사건 MON 88302를 포함하는 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분으로서, 종자의 대표적인 샘플은 ATCC 접수번호 PTA-10955로 기탁된 사건 MON 88302를 포함하는 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 제16항에 있어서, 상기 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분은 글라이포세이트 제초제 처리에 저항성이 있는 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- 제16항에 있어서, 상기 식물 또는 종자는 사건 MON 88302로부터 유래된 적어도 하나의 모체를 가지는 혼성체인 것인, 식물, 종자, 세포, 또는 이들의 식물 부분.
- DNA 증폭 방법으로 시험될 때 사건 MON 88302를 위한 진단용 앰플리콘을 생성할 수 있는 종자, 식물 또는 이들의 부분으로서, 상기 앰플리콘은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하는 것인, 종자, 식물 또는 이들의 부분.
- 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 분자를 포함하는 사건 MON 88302로부터 유래된 살아있지 않은 식물 물질.
- 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 미생물.
- 제21항에 있어서, 상기 미생물은 식물 세포인 것인 미생물.
- 사건 MON 88302를 포함하는 식물, 종자, 세포 또는 이들의 식물 부분으로부터 유래된 일반 상품.
- 제23항에 있어서, 상기 일반 상품은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하는 것인 일반 상품.
- 제23항에 있어서, 상기 일반 상품은 전체 또는 가공처리된 종자, 동물 사료, 오일, 으깬 곡물(meal), 가루, 플레이크, 겨, 바이오매스 및 연료 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 일반 상품.
- 사건 MON 88302를 포함하는 식물을 포함하는 들판에서 잡초를 제거하는 방법으로서, 상기 방법은 사건 MON 88302를 포함하는 상기 식물을 손상시키는 일없이 상기 들판 내 잡초의 생장 제어에 유효한 글라이포세이트의 양으로 상기 들판을 처리하는 단계를 포함하는 것인, 잡초 제거방법.
- 제26항에 있어서, 상기 잡초의 생장 제어에 유효한 글라이포세이트의 상기 양은 에이커(acre) 당 약 0.125 파운드 내지 약 6.4 파운드인 것인, 잡초 제거방법.
- 제27항에 있어서, 상기 잡초의 생장 제어에 유효한 글라이포세이트의 상기 양은 에이커 당 약 1.6 파운드인 것인, 잡초 제거방법.
- 제26항에 있어서, 상기 들판의 상기 처리는 사건 MON 88302를 포함하는 상기 식물의 6개 이상의 잎 단계에서 행해지는 것인, 잡초 제거방법.
- 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법으로서,
a. 사건 MON 88302를 포함하는 글라이포세이트 저항성 사건 브라씨카 식물을 제2 브라씨카 식물과 교배함으로써 종자를 생산하는 단계;
b. 상기 종자를 생장시켜 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및
c. 사건 MON 88302를 포함하는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는, 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법. - 제30항에 있어서, 상기 자손 식물을 선택하는 단계는 상기 자손 식물을 글라이포세이트로 처리하는 단계 및 글라이포세이트에 저항성이 있는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것인, 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법.
- 제30항에 있어서, 상기 자손 식물을 선택하는 단계는 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 7 및 서열번호 8로 이루어진 군으로부터 선택된 뉴클레오타이드 서열을 가지는 DNA 분자를 포함하는 자손 식물을 확인하는 단계를 포함하는 것인, 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법.
- 제30항에 있어서, 상기 제2 브라씨카 식물은 글라이포세이트 제초제에 저항성이 없는 것인, 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법.
- 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물을 생산하는 방법으로서,
a. 사건 MON 88302를 포함하는 글라이포세이트 저항성 사건 브라씨카 식물을 자가생식함으로써 종자를 생산하는 단계;
b. 상기 종자를 생장시켜 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및
c. 사건 MON 88302를 포함하는 자손 식물을 선택하는 단계를 포함하는 것인, 글라이포세이트 제초제 시용에 저항성이 있는 브라씨카 식물의 생산방법. - 사건 MON 88302 식물 또는 종자의 접합상태를 결정하는 방법으로서,
a. 사건 MON 88302로부터의 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에서 사용될 때, 사건 MON 88302를 위한 진단용인 제1 앰플리콘을 생성하는 서열번호 12, 서열번호 13, 및 서열번호 14를 포함하는 프라이머 세트와, DNA를 포함하는 샘플을 접촉시키는 단계;
b. 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 상기 제1 앰플리콘을 생성하는 단계;
c. 상기 제1 앰플리콘을 검출하는 단계;
d. 식물로부터의 게놈 DNA와의 핵산 증폭 반응에 사용될 때, 사건 MON 88302로서 확인된 이식유전자 삽입의 게놈 영역과 상동성인 천연 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생성하는 상기 프라이머 세트와, DNA를 포함하는 상기 샘플을 접촉시키는 단계;
e. 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 상기 제2 앰플리콘을 생성하는 단계;
f. 상기 제2 앰플리콘을 검출하는 단계; 및
g. 샘플 내 상기 제1 앰플리콘과 제2 앰플리콘을 비교하는 단계를 포함하되.
상기 두 앰플리콘의 존재는 상기 샘플이 이식유전자 삽입에 이형접합적이라는 것을 나타내는 것인, 사건 MON 88302 식물 또는 종자의 접합상태 결정 방법.
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