CN103096712B - 转基因芸苔属植物事件mon 88302及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含转基因事件MON？88302的植物，所述植物显示对草甘膦除草剂的耐受性。本发明还提供了与所述事件相关的种子、植物部分、细胞、商业产品和方法。本发明还提供了对于事件是独特的并且通过将转基因DNA插入欧洲油菜植物的基因组产生的DNA分子。

Description

转基因芸苔属植物事件MON 88302及其使用方法
参考相关申请
本申请要求保护2010年6月4日提交的美国临时申请No.61/351,317(通过引用整体并入本文)的利益。
序列表的并入
文件中包含的称为“MONS291WOST25.txt”的序列表(其具有21千字节(MicrosoftWindows中测量的大小)并且创建于2011年5月31日)随同电子投稿一起提交并且通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及生物技术和农业领域，尤其涉及转基因作物植物领域。
发明背景
芸苔属作物在世界上许多地区是非常重要的。可将生物技术的方法用于此类作物以产生具有改良性状例如除草剂耐受性的作物。可通过表达能够提供这样的耐受性的转基因来在转基因植物中获得除草剂耐受性。转基因在植物中的表达可受因素例如转基因盒中使用的调控元件、转基因插入物的染色体定位以及接近整合位置的任何内源调控元件的接近度(proximity)的组合影响。例如，已观察到在类似产生的事件之间在转基因表达的总体水平上或转基因表达的空间或时间模式上存在广泛的变化。为此原因，可能必需产生和测试数百个单个植物转化事件以最终鉴定对于商业农业目的是有用的一个事件。一旦被鉴定为具有期望的转基因表达和分子特征，随后可使用植物育种方法将这样的事件用于将该性状渐渗入其它遗传背景。所得的后代可包含转基因事件，因此可具有原始转化体的该性状的转基因表达特征。这可用于产生许多不同的包含改良的性状并且经适当地改造适合于特定地方生长条件的作物品种。
发明概述
本发明提供了包含事件MON88302的转基因植物和种子，其代表性种子样品已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-10955保藏。包含事件的植物展示商业上可接受的对草甘膦除草剂的应用的耐受性。本发明提供了包含事件的后代植物、植物部分和细胞；与事件相关的重组DNA分子和使用此类分子的方法；从事件衍生的或包含其的商业产品；以及使用事件的方法。
本发明提供了包含事件的植物、种子、细胞、后代植物或植物部分以及从包含事件的植物、细胞、植物部分或种子衍生的商业产品。本发明因此提供了包含具有核苷酸序列的DNA分子的植物、种子、细胞、后代植物、植物部分或商业产品，所述核苷酸序列选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8及其片段。本发明提供了包含重组DNA分子的植物、种子、细胞、后代植物或植物部分，所述重组DNA分子例如在DNA扩增法中产生包含本发明的DNA分子的扩增子。
本发明提供了与事件相关的DNA分子。此类DNA分子可包含代表或来源于如下序列的核苷酸序列：事件MON88302的转基因插入与侧翼基因组DNA的接合处，和/或侧翼连接插入的DNA的基因组DNA的区域，和/或侧翼连接插入位点的整合的转基因DNA的区域，和/或整合的转基因表达盒的区域，和/或此类区域的任何区域的连续序列。本发明还提供了用作诊断事件的引物和探针的DNA分子。提供了包含此类分子的植物、细胞、植物部分、商业产品、后代和种子。
本发明提供了用于检测来源于事件的DNA的存在的方法、组合物和试剂盒。本发明提供了通过如下步骤检测事件的方法：将包含DNA的样品与当与来自事件的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时产生诊断事件的扩增子的引物组接触，进行核酸扩增反应，从而产生扩增子，和检测扩增子。本发明还提供了通过如下步骤检测事件的方法：将包含DNA的样品与当与来自事件的基因组DNA一起用于杂交反应时与对于事件是特异性的DNA分子杂交的探针接触，进行杂交反应，和检测探针对DNA分子的杂交。还提供了包括用于检测来源于事件的DNA的存在的本发明的方法和组合物的试剂盒。
本发明提供了通过如下步骤控制田间杂草的方法：通过种植包含事件的植物(即，种植包含事件的种子)，随后施用有效剂量的能够控制杂草而不损伤包含事件的植物的草甘膦。
本发明提供了通过如下步骤产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物和/或种子的方法：将包含事件或包含选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8的序列的耐受草甘膦的植物与第二植物接触，从而产生种子，生长所述种子以产生后代植物，用草甘膦处理后代植物，以及选择包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。本发明提供了通过如下步骤产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物和/或种子的方法：将包含事件或包含选自SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：3，SEQIDNO：4，SEQIDNO：6，SEQIDNO：7和SEQIDNO：8的序列的耐受草甘膦的植物自交，从而产生种子，生长种子以产生后代植物，利用草甘膦处理后代植物；和选择包含事件并且耐受草甘膦的后代植物。
本发明提供了通过如下步骤测定包含事件的植物或种子的接合性的方法：将包含DNA的样品与当与来自事件MON88302的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时产生诊断事件的扩增子的第一引物组接触，进行核酸扩增反应，从而产生扩增子，检测扩增子，将样品与第二引物组(所述第二引物组，当与来自植物的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时产生第二扩增子，所述第二扩增子包含与鉴定为事件MON88302的转基因插入的基因组区域同源的天然基因组DNA)接触，进行核酸扩增反应，从而产生第二扩增子，检测第二扩增子，并且比较样品中的第一与第二扩增子，其中两种扩增子的存在表明样品和从而植物或种子对于转基因插入是杂合的。
本发明的上述和其它方面根据下列详述将变得更显而易见的。
附图简述
图1：事件MON88302的图解表示；[A]相应于5’连接区域(junctionregion)的相对位置；[B]相应3’连接区域的相对位置；[C]相应于插入的转基因DNA的侧翼区域的相对位置和5’末端的部分；[D]相应于插入的转基因DNA的3’侧翼区域的相对位置和3’末端的部分；[E]表示转基因表达盒；和[F]表示欧洲油菜(Brassicanapus)基因组侧翼序列和转基因表达盒的连续序列。
图2：显示当在4至6叶期施用草甘膦时与MON88302相比较RT73事件的籽粒产量。RT73命名为RR1。
图3：显示当在第一朵花时施用草甘膦时与MON88302相比较RT73事件的籽粒产量。RT73命名为RR1。
序列简述
SEQIDNO：1-代表欧洲油菜基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’接合序列的60个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQIDNO：3的位点762至821([C]，参见图1)和相应于SEQIDNO：6的位点762至821。
SEQIDNO：2-代表整合的转基因表达盒与欧洲油菜基因组DNA之间的3’接合处的60个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQIDNO：4的位点313至372([D]，参见图1)和相应于SEQIDNO：6的位点5189至5248。
SEQIDNO：3-侧翼连接事件MON88302的插入DNA达到和包括转基因DNA的区域的5’序列。SEQIDNO：3的核苷酸位点762至821相应于SEQIDNO：1的核苷酸位点1至60；SEQIDNO：3的核苷酸位点742至841相应于SEQIDNO：7的核苷酸位点1至100，以及SEQIDNO：3的核苷酸位点792至956相应于SEQIDNO：5的核苷酸位点1至165。
SEQIDNO：4-侧翼连接事件MON88302的插入DNA达到和包括转基因DNA的区域的3’序列。SEQIDNO：4的核苷酸位点313至372相应于SEQIDNO：2的核苷酸位点1至60；SEQIDNO：4的核苷酸位点293至392相应于SEQIDNO：8的核苷酸位点1至100，以及SEQIDNO：4的核苷酸位点1至342相应于SEQIDNO：5的核苷酸位点4086至4427。
SEQIDNO：5-赋予草甘膦除草剂耐受性的整合的转基因表达盒的序列。SEQIDNO：5相应于SEQIDNO：6的核苷酸位点792至5218。
SEQIDNO：6-代表侧翼连接事件MON88302的插入的DNA的5’序列(SEQIDNO：3)、整合的表达盒的序列(SEQIDNO：5)和侧翼连接事件MON88302的插入的DNA的3’序列(SEQIDNO：4)的重叠群的核苷酸序列。
SEQIDNO：7-代表欧洲油菜基因组DNA与整合的转基因表达盒之间的5’接合序列的100个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQIDNO：3的位点742至841([C]，参见图1)和相应于SEQIDNO：6的位点742至841。
SEQIDNO：8-代表整合的表达盒与欧洲油菜基因组DNA之间的3’接合处的100个核苷酸的序列。该核苷酸序列相应于SEQIDNO：4的位点293至392([D]，参见图1)，和相应于SEQIDNO：6的位点5169至5268。
SEQIDNO：9-用于鉴定事件MON88302的引物SQ20901。引物SQ20901与插入的表达盒在接近3’转基因插入边界的区域上互补。使用引物SQ20901和SQ23770(SEQIDNO：10)的组合产生的扩增子为事件MON88302的存在的阳性结果。
SEQIDNO：10为称为引物SQ23770并且用于鉴定事件MON88302的引物的序列。引物SQ23770与侧翼连接插入的表达盒并且接近转基因DNA插入边界的3’区域互补。使用引物SQ20901(SEQIDNO：9)和SQ23770的组合产生的扩增子为事件MON88302的存在的阳性结果。
SEQIDNO：11为称为探针PB10164和用于鉴定事件MON88302的探针的序列。其与侧翼连接插入的表达盒并且与转基因DNA插入边界接近的3’区域互补。该探针为6FAMTM-标记的合成寡核苷酸。在使用与6FAMTM-标记的探针PB10164组合的引物SQ20901和SQ23770(SEQIDNO：9-10)的扩增反应中荧光信号的释放在TAQMAN测定中被诊断为事件MON88302。
SEQIDNO：12为称为引物SQ21948并且用于鉴定MON88302事件的接合性的引物的序列。
SEQIDNO：13为称为引物SQ24635并且用于鉴定欧洲油菜野生型的接合性的引物的序列。
SEQIDNO：14为称为引物SQ22176并且用于鉴定MON88302事件和欧洲油菜野生型的接合性的引物的序列。
SEQIDNO：15为用于MON88302事件的接合性的测定的探针(PB4213)的序列。
SEQIDNO：16为用于欧洲油菜野生型的接合性测定的探针(PB10787)的序列。
SEQIDNO：17为称为引物SQ2563并且用作TAQMAN测定的内部对照的引物的序列。
SEQIDNO：18为称为引物SQ2564并且用作TAQMAN测定的内部对照的引物的序列。
SEQIDNO：19为用作TAQMAN测定的内部对照的VICTM-标记的合成寡核苷酸探针(PB0751)的序列。
详细描述
下列定义和方法被提供来更好地定义本发明和在本发明的实施中指导本领域技术人员。除非另外指出，否则将根据相关领域技术人员常规使用的含义来理解术语。
如本文中所用，术语“包含”意指“包括但不限于”。
本发明提供了转基因事件MON88302。如本文中所用，术语“事件”是指作为将转基因DNA在染色体的特定位置上插入植物的基因组的结果产生的DNA分子。事件MON88302是指作为具有本文中提供为SEQIDNO：5的序列的转基因DNA至欧洲油菜A基因组的连锁群N4上的特定位置的插入的结果而产生的DNA分子。也在本发明中提供了包含事件MON88302的植物和种子。包含MON88302的种子样品已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)以登录号PTA-10955保藏。包含MON88302的植物显示商业上可接受的对草甘膦除草剂的施用的耐受性。
包含事件的植物可以指包括插入植物的基因组中的特定位置的转基因的原始转化体。包含事件的植物还可指包括插入植物的基因组的特定位置的转基因的原始转化体的后代。这样的后代可通过自交或通过转化体或其后代与另一种植物之间的有性异型杂交(outcross)来产生。这样的其它植物可以为包含相同或不同的转基因的转基因植物和/或非转基因植物例如来自不同品种的非转基因植物。甚至在轮回亲本重复回交后，来自转化的亲本的插入的DNA和侧翼DNA在相同的基因组位置上存在于杂交的后代中。
转基因事件MON88302通过转基因DNA(在本文中提供为SEQIDNO：5)至欧洲油菜植物的A基因组的连锁群N4的插入来产生。欧洲油菜通常被称为油菜籽，特定品种可称为油菜(canola)。如本文中所用，术语“油菜”或“油菜植物”是指能够被用于产生介花油(canolaoil)(即满足包含少于2％的芥酸的特殊质量指标的油)的芥属植物，包括多种品种：欧洲油菜，芜菁甘蓝(Brassicanapobrassica)、芜菁(Brassicarapa)、芥菜型油菜(Brassicajuncea)和白菜型油菜(Brassicacampestris)。因为欧洲油菜为由芜菁(先前称为白菜型油菜)和甘蓝(Brassicaoleracea)杂交产生并且保留两者的基因组的异源四倍体，可将包含转基因事件MON88302的欧洲油菜植物与育种方法一起使用以将MON88302事件(从而草甘膦耐受性性状)引入芸苔属的其它成员。用于实施本发明的方法的芸苔属的成员的实例包括但不限于芥菜型油菜、芜菁甘蓝(Brassicanapobrassica)、甘蓝、埃塞俄比亚芥(Brassicacarinata)、欧洲油菜、芜菁和白菜型油菜，以及属于芸苔属的允许芸苔属种之间育种的任何其它植物。
包含事件MON88302的DNA分子是指包含插入的转基因DNA的至少一部分(提供为SEQIDNO：5)和紧邻插入的DNA的侧翼基因组DNA的至少一部分的DNA分子。这样，包含事件MON88302的DNA分子具有代表转基因DNA插入物的至少一部分和已将转基因DNA插入其中的植物的基因组的特定区域的至少一部分的核苷酸序列。与周围植物基因组相关的事件MON88302中的插入的DNA的排列对于事件MON88302是特异性的和独特的，因此，这样的DNA分子的核苷酸序列是描述性的并鉴定事件MON88302。这样的DNA分子的序列的实例在本文中提供为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8。该DNA分子也是包含事件MON88302的植物的染色体的整体部分并且可被传递至植物的后代。
事件MON88302赋予对施用至植物的草甘膦除草剂的抗性。“草甘膦”是指N-磷酰甲基-甘氨酸及其盐。草甘膦为对广谱植物种类具有活性的除草剂。当施用于植物表面时，草甘膦全身性地移动遍布植物。草甘膦因其对提供了用于合成芳香族氨基酸的前体的莽草酸途径的抑制而具有光毒性。
如本文中所用，术语“重组”是指通常未在自然界中发现的并且因而通过人干预产生的DNA和/或蛋白质和/或生物体形式。这样的人干预可产生重组DNA分子和/或重组植物。如本文中所用，“重组DNA分子”为包含不能一起天然存在的DNA分子的组合并且为人干预的结果的DNA分子，例如由至少两个彼此异源的DNA分子的组合组成的DNA分子，和/或为人工合成的并且包含从通常存在于自然界中的多核苷酸序列衍生的多核苷酸序列的DNA分子，和/或包含人工地整合入宿主细胞的基因组DNA的转基因和相连的宿主细胞的基因组的侧翼DNA的DNA分子。重组DNA分子的实例为本文中描述的因转基因至欧洲油菜基因组内的插入而产生的DNA分子，其可最终导致重组RNA和/或蛋白质分子在该生物体中表达。如本文中所用，“重组植物”为通常非天然地存在的植物，其为人干预的结果，并且包含整合入其基因组的转基因和/或异源DNA分子。作为这样的基因组改变的结果，重组植物与相关的野生型植物截然不同。重组植物的实例为在本文中描述为包含事件MON88302的植物。
如本文中所用，术语“转基因”是指人工地整合入宿主细胞的基因组的多核苷酸分子。这样的转基因对于宿主细胞可以是异源的。术语“转基因植物”是指包含这样的转基因的植物。
如本文中所用，术语“异源的”是指通常被发现在自然界中不与第二分子组合的第一分子。例如，分子可来源于第一物种并且被插入第二物种的基因组。分子因此对于宿主是异源的并且被人工地整合入宿主细胞的基因组。
如本文中所用，术语“嵌合的”是指通过将第一DNA分子融合于第二DNA分子产生的单个DNA分子，其中通常发现第一和第二DNA分子通常都不以该构型(即彼此融合)存在。嵌合DNA分子因此为另外通常在自然界中不能被发现的新DNA分子。
本发明提供了DNA分子及其相应的核苷酸序列。如本文中所用，术语“DNA序列”、“核苷酸序列”和“多核苷酸序列”是指通常从5’(上游)末端至3’(下游)末端显示的DNA分子的核苷酸的序列。本文中使用的命名法为美国联邦法规法典(UnitedStatesCodeofFederalRegulations)§1.822的Title37所要求的和WIPOStandardST.25(1998)，附录2中的表(表1和3)中所示的命名法。本发明仅公开转基因事件MON88302中提供的两条单核苷酸序列链的一条链。因此，通过推断和推断，互补序列(在本领域中也称为完全互补序列或逆互补序列)在本发明的范围内，从而也预期在所述主题的范围内。
相应于插入的转基因DNA的完全核苷酸序列和侧翼连接插入的转基因DNA的任一末端的欧洲油菜基因组DNA的大部分区段的核苷酸序列在本文中提供为SEQIDNO：6。该核苷酸序列的小部分为提供为SEQIDNO：5的插入的转基因DNA。侧翼连接插入的转基因DNA的5’末端和插入的DNA的5’末端的一部分的基因组DNA的核苷酸序列在本文中提供为SEQIDNO：3。侧翼连接插入的转基因DNA的3’末端和插入的DNA的3’末端的一部分的基因组DNA的核苷酸序列在本文中提供为SEQIDNO：4。横跨其中转基因DNA连接于和联接于基因组DNA的位置的区域，在本文中称为接合处(junction)。“接合序列(junctionsequence)”或“接合区域(junctionregion)”是指横跨插入的转基因DNA和相邻侧翼基因组DNA的DNA序列和/或相应DNA分子。事件MON88302的接合序列的实例在本文中提供为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：7和SEQIDNO：8。来源于芸苔属植物或种子的核苷酸分子中这些接合序列之一的鉴定确定了DNA获自事件MON88302并且被诊断为来自事件MON88302的DNA在样品中的存在。SEQIDNO：1为横跨基因组DNA与插入的DNA的5’末端之间的接合处的60个核苷酸的序列。SEQIDNO：7为横跨基因组DNA与插入的DNA的5’末端之间的接合处的100个核苷酸的序列。SEQIDNO：2为横跨基因组DNA与插入的DNA的3’末端之间的接合处的60个核苷酸的序列。SEQIDNO：8为横跨基因组DNA与插入的DNA的3’末端之间的接合处的100个核苷酸的序列。来源于转基因事件MON88302的包括SEQIDNO：1或SEQIDNO：7的DNA的任何区段在本发明的范围内。来源于转基因事件MON88302的包括SEQIDNO：2或SEQIDNO：8的DNA的任何区段在本发明的范围内。此外，包含与本段落内描述的任何序列互补的序列的任何多核苷酸在本发明的范围内。图1举例说明了SEQIDNO：1-5和SEQIDNO：7-8相对于从5’至3’排列的SEQIDNO：6的物理排列。本发明还提供了包含DNA分子的核酸分子，所述DNA分子具有与SEQIDNO：6的全长具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
本发明提供了可用作用于诊断来源于事件MON88302的DNA在样品中的存在的引物或探针的示例性DNA分子。此类引物或探针对于靶核酸序列是特异性的，因此对于利用本文中描述的本发明的方法鉴定事件MON88302核酸序列是有用的。
“引物”通常是高度纯化的分离的多核苷酸，其被设计来用于包括热扩增的特异性退火或杂交法。可将一对引物与模板DNA例如欧洲油菜基因组DNA的样品一起用于热扩增，例如聚合酶链式反应(PCR)，以产生扩增子，其中从这样的反应产生的扩增子可具有相应于位于其中引物与模板杂交的两个位点之间的模板DNA的序列的DNA序列。如本文中所用，“扩增子”为一条或一段已使用扩增技术合成的DNA，即扩增反应的产物。在本发明的一个实施方案中，诊断事件MON88302的扩增子包括未在欧洲油菜基因组中天然存在的序列。本发明的扩增子包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2及其互补序列的至少约40个连续核苷酸。引物通常被设计来与互补靶DNA链杂交以形成引物与靶DNA链之间的杂种，并且引物的存在是被聚合酶识别以开始使用靶DNA链作为模板延伸引物(即，另外的核苷酸至不断延长的多核苷酸分子内的聚合)的点。如本发明中所用，引物对意指为了线性扩增被引物对的单个成员靶向结合的位置之间的多核苷酸区段，通常在热扩增反应或其它常规核酸扩增法中使用两个结合双链核苷酸区段的相反链的引物。用作引物的示例性DNA分子提供为SEQIDNO：9-10。提供为SEQIDNO：9和SEQIDNO：10的引物对可用作第一DNA分子和与第一DNA分子不同的第二DNA分子，并且两个分子各自具有充分长度的SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的连续核苷酸或其互补序列以用作DNA引物，以便当与来源于事件MON88302的模板DNA一起用于热扩增反应中时，可产生对于转基因事件MON88302的3’部分是特异性和独特的扩增子。该示例性引物对可用于扩增诊断事件MON88302的3’接合区域。类似地，本发明提供了可用于扩增诊断事件MON88302的5’接合区域的引物对。此类引物可包含第一DNA分子和与第一DNA分子不同的第二DNA分子，两者具有充分长度的SEQIDNO：3、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的连续核苷酸或其互补序列以用作DNA引物，以便当与来源于事件MON88302的模板DNA一起用于热扩增反应时，可产生对于转基因事件MON88302的5’部分是特异性和独特的扩增子。
“探针”为与靶核酸的链互补的分离的核酸。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸而且还包括特异性结合靶DNA序列的聚酰胺和其它探针材料，并且这样的结合的检测在诊断、鉴别、确定或确认该靶DNA序列在特定样品中的存在中是有用的。可将探针连接于常规可检测标记或报道分子例如放射性同位素、配体、化学发光剂或酶。在本发明的一个实施方案中，诊断事件MON88302的探针包括未在欧洲油菜基因组中天然存在的序列。用作探针的示例性DNA分子提供为SEQIDNO：11。
根据本发明的探针和引物可与靶序列具有完全序列同一性，虽然可通过常规方法设计与靶序列不同的保持优先与靶序列杂交的能力的引物和探针。为了核酸分子能够用作引物或探针，其仅需在序列上充分互补以能够在所使用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。任何常规核酸杂交或扩增方法可用于鉴定来自事件MON88302的转基因DNA在样品中的存在。探针和引物在长度上通常为至少约11个核苷酸、至少约18个核苷酸、至少约24个核苷酸或至少约30个核苷酸或更多个核苷酸。此类探针和引物在严格杂交条件下与靶DNA序列特异性杂交。常规严格条件由Sambrook等人，1989和由Haymes等人在：NucleicAcidHybridization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，DC(1985)中描述。如本文中所用，如果两个核酸能够形成反向平行双链核酸结构，则两个核苷酸分子被认为能够彼此特异性杂交。如果核酸分子显示完全互补性，则它们被认为是另一个核酸分子的“互补序列”。如本文中所用，当分子之一的每一个核苷酸与另一个分子的核苷酸互补时，则分子被认为显示“完全互补性”。如果两个分子以足以允许它们在至少常规“低严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被认为是“最低程度互补”。类似地，如果分子可以以足以允许它们在常规“高严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交，则它们被认为是“互补的”。因此偏离完全互补性是可允许的，只要这样的偏离不完全排除分子形成双链结构的能力。
如本文中所用，术语“分离的”是指至少部分地将分子与通常在其自体或天然状态中与其联接的其它分子分离。在一个实施方案中，术语“分离的”是指这样的DNA分子，其至少部分地与在自体或天然状态中通常侧翼连接所述DNA分子的核酸分离。因此，例如作为重组技术的结果融合于它们通常不与其联接的调控或编码序列的DNA分子在本文中被认为是分离的。此类分子即使当整合入宿主细胞的染色体或与其它DNA分子一起存在于核酸溶液中时亦被认为是分离的。
本领域技术人员公知的许多方法可用于分离和操作本发明中公开的DNA分子或其片段。例如，PCR(聚合酶链式反应)技术可用于扩增特定起始DNA分子和/或产生原始分子的变体。DNA分子或其片段还可通过其它技术例如通过利用化学方法直接合成片段(这通常通过使用自动寡核苷酸合成仪来实施)来获得。
因此本文中提供的DNA分子和相应的核苷酸序列尤其对于鉴定事件MON88302，选择包含事件MON88302的植物品种或杂种，检测来源于事件MON88302的DNA在样品中的存在，和监测样品的事件MON88302的存在和/或不存在或包含事件MON88302的植物和植物部分是有用的。
本发明提供了植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、纤维和叶)以及商业产品。此类植物、后代、种子、植物细胞、植物部分和商业产品包含可检测量的本发明的多核苷酸，即例如具有提供为SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：7或SEQIDNO：8的序列的至少一个的多核苷酸。本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分还可包含一个或多个另外的转基因。这样的转基因可以是编码赋予期望的性状(包括但不限于增强的昆虫抗性、增加的水分利用效率、增加的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、疾病抗性、改良的营养质量和/或增强的除草剂耐受性)蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，其中相对于缺乏这样的另外的转基因的可比较植物测量期望的性状。
本发明提供了来源于包含事件MON88302的转基因植物的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织以及叶。为了使得能够进行本发明，已按照布达佩斯协议保藏了包含事件MON88302的种子的代表性样品。经选择用于接收保藏物的贮藏处为美国典型培养物保藏中心(ATCC)，地址为10801UniversityBoulevard，Manassas，VirginiaUSA，ZipCode20110。ATCC贮藏处已给事件MON88302种子分配了登录号PTA-10955。
本发明提供了在其基因组中包含具有SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：7或SEQIDNO：8的DNA分子的微生物。这样的微生物的实例为转基因植物细胞。微生物例如本发明的植物细胞在许多工业应用中是有用的，所述工业应用包括但不限于：(i)用作用于科学调查或工业研究的研究工具；(ii)用于用于产生可用于随后的科学研究或用作工业产品的内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物或小分子的培养；和(iii)与现代植物组织培养技术一起使用以产生随后可用于农业研究或生产的转基因植物或植物组织培养物。微生物例如转基因植物细胞的产生和使用利用现代微生物学技术和人干预来产生人造的独特的微生物。在该方法中，将重组DNA插入植物细胞的基因组以产生与天然存在的植物细胞分离且独特的转基因植物细胞。该转基因植物细胞可随后使用现代微生物技术进行培养(与细菌和酵母细胞非常相似)，并且可以以未分化的单细胞状态存在。新型植物细胞的遗传组成和表型为通过将异源DNA整合入细胞的基因组产生的技术作用。本发明的另一个方面为使用本发明的微生物的方法。使用本发明的微生物例如转基因植物细胞的方法包括(i)通过将重组DNA整合入细胞的基因组，随后使用该细胞衍生具有相同异源DNA的另外的细胞来产生转基因细胞的方法；(ii)使用现代微生物技术培养包含重组DNA的细胞的方法；(iii)从培养细胞产生并且纯化内源或重组碳水化合物、脂质、核酸或蛋白质产物的方法；和(iv)使用现代植组织培养技术利用转基因植物细胞产生转基因植物或转基因植物组织培养物的方法。
如本文中所用，“后代”包括从具有提供为SEQIDNO：1，SEQIDNO：2，SEQIDNO：7或SEQIDNO：8的序列的至少一个的祖先植物和/或多核苷酸衍生的包含事件DNA的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。植物、后代和种子对于转基因可以是纯合的或杂合的。后代可从由包含事件MON88302的植物产生的种子和/或从由利用包含事件MON88302的植物的花粉授精的植物产生的种子生长而来。
可将后代植物自花受粉(也称为“自交”)以产生植物的纯育品系，即对于转基因是纯合的植物。适当的后代的自交可产生对于两个添加的外源基因是纯合的植物。
或者，可将后代植物与另一种植物异型杂交例如交配，以产生品种或杂种种子或植物。另一种植物可以为转基因或非转基因的。本发明的品种或杂种种子或植物因此可通过如下步骤来衍生：将不存在事件MON88302的特异性和独特的DNA的第一亲本与包含事件MON88302的第二亲本杂交，从而导致包含事件MON88302的特异性和独特的DNA的杂种。每一个亲本可以为杂种或近交种(inbred)/品种，只要杂交或交配导致本发明的植物或种子，即具有至少一个包含事件MON88302的特异性和独特的DNA和/或SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的等位基因的种子。因此可将两种不同的转基因植物交配以产生包含两个独立地分离的额外的外源基因的杂种后代。例如，可将包含事件MON88302的耐受草甘膦的植物与另一种转基因植物杂交以产生具有两个转基因亲本的特征的植物。该方法的一个实例为包含事件MON88302的耐受草甘膦的芸苔属植物与具有一个或多个另外的性状的芸苔属植物例如芥菜或油菜的杂交，从而导致耐受草甘膦并且具有一个或多个另外的性状的后代植物或种子。具有期望的转基因性状的芸苔属植物在本领域是已知的，包括但不限于具有除草剂耐受性(例如，事件RT200、事件RT73、事件MS1、事件RF1、事件RF2、Topas19/2、MS8、RF3、T45)的性状的芸苔属植物，杂交育种系统或繁育系统(fertilitysystem)(例如，事件MS1、事件MS8、事件RF1、事件RF2、事件Rf3)、昆虫控制、增加的产量、疾病抗性(例如，核盘菌属(Sclerotinia)抗性、黑腿病抗性、甘蓝根肿病抗性、镰刀霉枯萎病(FusariumWilt)抗性)、改变的或改良的油的组成(例如，事件pCGN3828-212/86-18、事件pCGN3828-212/23)，它们全部描述于例如可公共获得的美国农业部(USDA)动植物卫生检疫处(AnimalandPlantHealthInspectionService)(APHIS)非管制状态申请列表。具有期望的非转基因性状的芸苔属植物在本领域是已知的，包括但不限于性状：除草剂耐受性(例如，1471(对于咪唑啉酮耐受性)、CLB-1(对于咪唑啉酮耐受性)、TTC(对于三嗪耐受性))、病原体抗性、昆虫控制、增加的产量、疾病抗性(例如，核盘菌属抗生、黑腿病抗性、甘蓝根肿病抗性、镰刀霉枯萎病抗性)、改变的或改良的油的组成(包括低亚麻酸和/或高油酸)、改变的化学和/或营养组成、改变的蛋白质组成、冷耐受性、干旱耐受性、改变的成熟和/或开花以及其它改变的或改良的农艺学性质。
还涉及对亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，同样地涉及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述可见于几篇参考文献之一，例如，Fehr，参见BreedingMethodsforCultivarDevelopment，WilcoxJ.编辑，AmericanSocietyofAgronomy，MadisonWI(1987)中。
本发明提供了来源于包含事件MON88302的植物的植物部分。如本文中所用，“植物部分”是指由从包含事件MON88302的植物衍生的材料组成的植物的任何部分。植物部分包括但不限于花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织、纤维及叶。植物部分可以是能活的、不能存活的、可再生的和/或非可再生的。
本发明提供了从包含事件MON88302的植物衍生的商业产品。如本文中所用，“商业产品”是指由从包含事件MON88302的植物、种子、植物细胞或植物部分衍生的材料组成的任何组合物或产品。商业产品可售予消费者并且可以是能活的或不能存活的。不能存活的商业产品包括但不限于不能存活的种子和谷物；经处理的种子、种子部分和植物部分；脱水的植物组织、冷冻的植物组织和经处理的植物组织；经处理用于陆生和/或水生动物消费的动物饲料的植物、油、谷物粗粉(meal)、面粉、薄片、麸、纤维和用于人消费的任何其它食品；和生物质及燃料产品。能活的商业产品包括但不限于种子和植物细胞。因此包含事件MON88302的植物可用于制造通常从芸苔属植物获得的任何商业产品。从包含事件MON88302的植物衍生的任何此类商业产品可包含至少可检测量的相应于事件MON88302的特异性和独特的DNA，并且特别地可包含可检测量的包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少40个连续核苷酸的多核苷酸。可使用检测多核苷酸分子的任何标准方法，包括本文中公开的检测方法。如果在商业产品中存在任何可检测量的SEQIDNO：1或SEQIDNO：2，那么商业产品在本发明的范围内。
因此本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)以及商业产品尤其对于生长植物以产生用于农业目的的包含事件MON88302的种子和/或植物部分、产生用于植物育种和研究目的的包含事件MON88302的后代是有用的，可与用于工业和研究应用的微生物学技术一起使用和售予消费者。
本发明提供了用于控制田地中的杂草的方法。提供了用于控制田地中杂草的方法，其由在田地中种植包含事件MON88302的植物和为了控制田地中的杂草对田地施用至少一个除草上有效的剂量的草甘膦(而不损伤包含MON88302的植物)组成。还提供了用于控制田地中的杂草的另一种方法，其由如下步骤组成：给田地施用至少一个除草上有效的剂量的草甘膦，随后在田地中种植包含事件MON88302的作物。可单独地或组合地使用本发明的方法。草甘膦的施用可以在种植前(即，在种植包含事件MON88302的种子之前的任何时间，包括但不限于约种植前14天至约种植前1天或与播种包含事件MON88302的种子同时)、出苗前(即，在种植包含事件MON88302的种之后和在包含事件MON88302的植物出苗之前的任何时间)和/或出苗后(即，在包含事件MON88302的植物出苗后的任何时间)进行。在实施本发明的方法中，可在生长季节中使用草甘膦的多次施用，例如两次施用(例如种植前施用和出苗后施用或出苗前施用和出苗后施用)或三次施用(例如，种植前施用、出苗前施用和出苗后施用)。在生长季节中施用的总草甘膦因此可包括一个或多个季节内施用，其中多次季节内施用的总和加起来产生施用的总草甘膦。如本文中所用，有效地控制杂草生长的草甘膦的量，即在田地中用作作物内(in-crop)施用以控制田地中杂草生长的草甘膦的除草上有效的剂量，应当由在整个生长季节中在总共约0.125磅草甘膦每英亩与约6.4磅草甘膦每英亩之间的范围组成。例如，用于在田间用作作物内施用的草甘膦的除草上有效的剂量在整个生长季节可以为总共至少约0.125、约0.5、约1.0、约1.6、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约5.5、约6.0或约6.4磅每英亩。
提供了用于产生包含转基因事件MON88302的耐受除草剂植物的方法。此类方法中使用的转基因植物对于转基因可以是纯合的或杂合的。通过此类方法产生的后代植物可以是品种或杂种植物；可从由植物产生的种子和/或从由利用包含事件MON88302的植物的花粉授精的植物产生的包含事件MON88302的种子生长而来；以及对于转基因可以是纯合的或杂合的。随后可将后代植物自花受粉以产生植物的纯育品系，即对于转基因是纯合的植物，或可选择地将后代植物异型杂交，例如与另一种无关植物交配以产生品种或杂种种子或植物。
可通过将包含事件MON88302的含有包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的序列的多核苷酸分子的植物与另一种植物有性杂交并从而产生种子(随后将所述种子生长成后代植物)来产生耐受草甘膦除草剂的施用的植物。随后可利用草甘膦除草剂处理此类后代植物以选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，可使用诊断方法分析此类后代植物以选择包含事件MON88302DNA的后代植物。杂交中使用的其它植物可以耐受或可以不耐受草甘膦除草剂以及可以为或可以不为转基因的。所产生的后代植物和/或种子可以为品种或杂种种子。在实施本方法中，可通过人工干预，例如：通过人手工收集一种植物的花粉和将该花粉与第二种植物的花柱(style)或柱头接触；通过人手工和/或人行动除去、破坏或覆盖植物的雄蕊或花药(例如，通过人工干预或通过施用化学杀配子剂)以便防止天然自花受粉并且使得必将发生异花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过在果园或田间放置蜂箱或通过用传粉昆虫笼框植物(cagingplants))；通过人工打开或除去花的部分以允许外来花粉置于花柱或柱头上或接触花柱或柱头；通过选择性放置植物(例如，有意地在传粉距离之内种植植物)；和/或通过施用化学药品以促成开花或促进感受性(柱头对花粉的)来完成或促成将一种植物与另一种植物的有性杂交即异花受粉的步骤。
耐受草甘膦除草剂的施用的植物可通过将包含事件MON88302(包含含有SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的序列的多核苷酸分子)的植物自交和从而产生种子(随后将所述种子生长成后代植物)来产生。随后可用草甘膦除草剂处理这些后代植物以选择耐受草甘膦除草剂的后代植物。或者，可使用诊断方法分析此类后代植物以选择包含事件MON88302DNA的后代植物。在实施本方法中，可通过人工干预，例如：通过人手工收集植物的花粉和将该花粉与相同植物的花柱或柱头接触，和随后任选地阻止植物的进一步受粉；通过人手工和/或人行动除去、破坏或覆盖其它附近植物的雄蕊或花药(例如，通过去雄或通过施用化学杀配子剂)以便防止天然异花受粉并且使得必将发生自花受粉以使受精发生；通过在进行“定向受粉”的位置人工放置传粉昆虫(例如，通过用传粉昆虫笼框单独的植物)；通过人工操作花或其部分以允许自花受粉；通过选择性放置植物(例如，有意地在传粉距离之外种植植物)；和/或通过施用化学药品以促成开花或促进感受性(柱头对花粉的)来完成或促成将一种植物与其自身有性杂交即自花受粉或自交的步骤。
由此类方法包括的和通过使用此类方法产生的后代植物和种子与其它植物截然不同，例如因为所述后代植物和种子：是重组的并且通过人工干预产生；为耐受草甘膦除草剂的；包含至少一个由本发明的转基因DNA组成的等位基因；和/或包含可检测量的选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的多核苷酸序列。种子可选自单株后代植物，并且只要种子包含SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，其就可在本发明的范围内。
在实施本发明中，可将两种不同的转基因植物杂交以产生包含两个独立地分离的异源基因的杂种后代。适当的后代的自交可产生对于两个基因都是纯合的植物。还涉及对亲本植物的回交和与非转基因植物的异型杂交，同样地涉及营养繁殖。通常用于不同性状和作物的其它方法的描述可见于几个参考文献之一例如aFehr，参见BreedingMethodsforCultivarDevelopment中，WilcoxJ.编辑，AmericanSocietyofAgronomy，MadisonWI(1987)中。
用于本文中公开的方法的植物和种子还可包含一种或多种另外的转基因。这样的转基因可以是编码赋予期望的性状的蛋白质或RNA分子的任何核苷酸序列，所述期望的性状包括但不限于增强的昆虫抗性、增加的水分利用效率、增加的产量性能、增强的抗旱性、增强的种子质量、改良的营养质量和/或增强的除草剂耐受性)，其中相对于缺乏这样的另外的转基因的植物测量期望的性状。
因此本发明的方法尤其对于控制田地中杂草同时生长植物以产生用于农业或研究目的的包含事件MON88302的种子和/植物部分，选择用于植物育种或研究目的的包含事件MON88302的后代，和产生包含事件MON88302的后代植物和种子是有用的。
可评估本发明的植物、后代、种子、植物细胞、植物部分(例如花粉、胚珠、豆荚、花、根或茎组织及叶)和商业产品的DNA组成、基因表达和/或蛋白质表达。这样的评估可通过使用标准方法例如PCR、northern印迹、southern分析、western印迹、免疫沉淀和ELISA或通过使用本文中提供的检测法和/或检测试剂盒来进行。
提供了检测对于事件MON88302是特异性的材料在样品中的存在的方法。一种方法由检测对于包含事件MON88302的细胞、组织或植物是特异性的DNA和来源于所述细胞、组织或植物的DNA的存在组成。方法提供了待与引物对接触的模板DNA样品，所述引物对能够在经历适合于热扩增的条件时从事件MON88302DNA产生扩增子，特别地包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或其互补序列的至少40个连续核苷酸的扩增子。扩增子从来源于事件MON88302的模板DNA分子产生，只要模板DNA分子结合SEQIDNO：1和SEQIDNO：2中所示的特异性和独特的核苷酸序列。扩增子可以为单链或双链DNA或RNA，这取决于被选择用于产生扩增子的聚合酶。该方法提供了检测在任何这样的热扩增反应中产生的扩增子分子，和确认相应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或其互补序列的核苷酸在扩增子的序列中的存在。扩增子中相应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或其互补序列的核苷酸的检测是事件MON88302特异性DNA和从而包含事件MON88302的生物材料在样品中的存在的确定和/或诊断。
提供了用于检测相应于SEQIDNO：3和SEQIDNO：4的DNA分子在由来源于植物或植物组织的材料组成的样品中的存在的另一种方法。方法由如下步骤组成：(i)从植物或从一组不同的植物提取DNA样品，(ii)将DNA样品与显示SEQIDNO：1或SEQIDNO：2中所示的至少40个连续核苷酸的DNA探针分子接触，(iii)允许探针和DNA样品在严格杂交条件下杂交，和随后(iv)检测探针与靶DNA样品之间的杂交事件。杂交组合物的检测被诊断为SEQIDNO：3或SEQIDNO：4(视具体情况而定)在DNA样品中的存在。杂交的不存在为转基因事件在样品中的不存在的替代性诊断。或者，确定特定植物包含相应于SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的序列或其互补序列之任一或两者为确定植物包含至少一个相应于事件MON88302的等位基因。
因此可能通过任何公知的核酸检测方法例如聚合酶链式反应(PCR)或使用核酸探针的DNA杂交检测本发明的核酸分子的存在。事件特异性PCR测定例如由Taverniers等人(J.Agric.FoodChem.，53：3041-3052，2005)进行了论述，其中显示了转基因玉蜀黍品系Bt11、Bt176和GA21以及转基因事件RT73的事件特异性跟踪系统。在本研究中，基于每一个事件的基因组/转基因接合处的序列设计事件特异性引物和探针。转基因植物事件特异性DNA检测法已在美国专利No.6,893,826；6,825,400；6,740,488；6,733,974；6,689,880；6,900,014和6,818,807中进行了描述。
提供了DNA检测试剂盒。一种类型的试剂盒包括至少一种具有足够长度的SEQIDNO：3、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的连续核苷酸(以用作对于检测来源于转基因事件MON88302的DNA在样品中的存在是特异性的DNA引物或探针)的DNA分子。利用试剂盒检测的DNA分子包含SEQIDNO：1所示的序列的至少40个连续核苷酸。或者，试剂盒可包括至少一种具有足够长度的SEQIDNO：4、SEQIDNO：5或SEQIDNO：6的连续核苷酸(以用作对于检测来源于转基因事件MON88302的DNA在样品中的存在是特异性的DNA引物或探针)的DNA分子。待利用试剂盒检测的DNA分子包SEQIDNO：2中所示的至少40个连续核苷酸。
备选试剂盒使用其中将靶DNA样品与上述引物对接触，随后进行足以产生包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少40个连续核苷酸的扩增子的核酸扩增反应的方法。扩增子的检测和确定SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的不少于40个连续核苷酸或其互补序列在扩增子的序列中的存在被诊断为事件MON88302特异性DNA在DNA样品的存在。
提供了足以用作DNA探针的DNA分子，其对于确定、检测或对于诊断对于事件MON88302DNA是特异性和独特的DNA在样品中的存在或甚至不存在是有用的。DNA分子包含SEQIDNO：1或其互补序列的至少40个连续核苷酸，或SEQIDNO：2或其互补序列的至少40个连续核苷酸。
可利用本领域已知的多种核酸扩增法(包括热扩增法)的任一方法实现核酸扩增。可通过使用来源于本文中提供的序列的引物，然后进行扩增子或克隆的DNA的标准DNA测序来验证(和必要时校正)来自事件MON88302(包含事件MON88302的代表性种子样品以ATCCPTA-10955保藏)的异源DNA插入物、接合序列或侧翼序列。
可利用多种技术检测由此类方法产生的扩增子。一种这样的方法为遗传位点分析(GeneticBitAnalysis)(Nikiforov，等人NucleicAcidRes.22：4167-4175，1994)，其中设计了与相邻的侧翼基因组DNA序列和插入的DNA序列重叠的DNA寡核苷酸。将寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在热扩增目标区域(使用插入的序列中的一个引物和相邻侧翼基因组序列中的一个引物)后，可将单链扩增子与固定的寡核苷酸杂交，并将其用作模板、使用DNA聚合酶和对于预期的下一个碱基是特异性的标记的ddNTP进行单碱基延伸反应。读出可以是基于荧光或ELISA的。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，荧光或其它信号的检测表示插入物/侧翼序列的存在。
另一个方法为由Winge(Innov.Pharma.Tech.00：18-24，2000)描述的焦磷酸测序技术。在该方法中，设计与相邻基因组DNA和插入DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域(一个引物在插入的序列中以及一个引物在侧翼基因组序列中)的单链扩增子杂交，在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和萤光素存在的情况下进行温育。分别单独地添加ddNTP，掺入导致被测量的光信号。归因于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸，光信号表示转基因插入物/侧翼序列的存在。
由Chen，等人，(GenomeRes.9：492-498，1999)描述的荧光偏振为可用于检测扩增子的方法。通过使用该方法，设计与基因侧翼序列和插入的DNA接合处重叠的寡核苷酸。将寡核苷酸与来自目标区域(一个引物在插入的DNA中并且一个引物在侧翼基因组DNA序列中)的单链扩增子杂交，并且在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP存在的情况下进行温育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。掺入可使用荧光计测量为偏振的改变。归因于成功的扩增、杂交和单碱基延伸，偏振的改变表示转基因插入物/侧翼序列的存在。
通过使用由制造商提供的说明书，TAQMAN(PEAppliedBiosystems，FosterCity，CA)也可用于检测和/或定量DNA序列的存在。简而言之，设计与基因组侧翼序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸探针。在耐热聚合酶和dNTP存在的情况下，循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入物DNA序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。FRET探针的杂交导致荧光部分的切割和释放，与FRET探针上的猝灭部分分离。归因于成功扩增和杂交，荧光信号表示侧翼/转基因插入序列的存在。
已描述了分子信标在序列检测中的用途，如Tyangi等人(NatureBiotech.14：303-308，1996)中所描述的。简而言之，设计与侧翼基因组序列和插入DNA接合处重叠的FRET寡核苷酸。RRET探针的独特结构导致其包含使荧光与猝灭部分保持紧密靠近的二级结构。在耐热聚合酶和dNTP存在的情况下循环FRET探针和扩增引物(一个引物在插入DNA物序列中并且一个引物在侧翼基因组序列中)。在成功的扩增后，FRET探针对靶序列的杂交导致探针二级结构的消除以及荧光部分与猝灭部分的空间分离，从而导致荧光信号的产生。归因于成功的扩增和杂交而，荧光信号表示侧翼/转基因插入物序列的存在。
其它描述的方法例如微流体学(microfluidics)(美国专利公布No.2006068398、美国专利No.6,544,734)提供了分离和扩增DNA样品的方法和装置。用于检测和测量特异性DNA分子的光学染料(WO/05017181)。包括用于检测结合特异性DNA分子并且随后可被检测的DNA分子或纳米珠粒的电子传感器的纳米管装置(WO/06024023)。
可使用本文中公开的组合物和DNA检测领域内公知的方法来开发DNA检测试剂盒。试剂盒用于鉴定样品中的事件MON88302并且可被用于培养包含适当的事件DNA的植物的方法。试剂盒可包含与SEQIDNO：1-6或其片段或互补序列相似或互补的DNA引物或探针。
本发明的试剂盒和检测方法因而尤其对于鉴定事件MON88302事件，选择包含事件MON88302的植物品种或杂种，检测来源于事件MON88302的DNA在样品中的存在，和监测样品的事件MON88302的存在或不存在或包含事件MON88302的植物、植物部分或商业产品是有用的。
下列实施例被包括用来举例说明本发明的某些优选实施方案的实例。本领域技术人员应当理解，下列实施例中公开的技术代表本发明人已发现非常适合于本发明的实施，从而被认为构成用于其实施的优选模式的实例的方法。然而，鉴于本公开内容，本领域技术人员应当理解可在不背离本发明的精神和范围的情况下在公开的特定实施方案中进行许多改变，并且获得类似或相似的结果。
实施例
实施例1：欧洲油菜的转化和MON88302事件的选择
本实施例描述了如何产生转基因事件和如何选择事件MON88302。通过利用图1中举例说明的转基因DNA进行欧洲油菜细胞的农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化来产生转基因事件MON88302，所述转基因的DNA序列示于SEQIDNO：5。提供为SEQIDNO：5的转基因插入物为包含嵌合启动子的表达盒，其如下部分组成：来源于玄参花叶病毒的35S增强子(E-FMV.35S)的增强子分子，该增强子分子有效地联接于来源于拟南芥Tsf1基因的启动子分子(P-At.Tsf1)，所述启动子分子有效地联接于来源于拟南芥Tsf1基因的前导序列分子(L-At.Tsf1)；所述前导序列分子有效地联接于来自拟南芥Tsf1基因(I-At.Tsf1)的内含子序列；所述内含子序列有效地联接于编码叶绿体转运肽的DNA分子(CTP2，拟南芥EPSPS)；编码叶绿体转运肽的DNA分子有效地联接于编码抗草甘膦EPSPS的DNA分子(CP4-syn)；所述编码抗草甘膦EPSPS的DNA分子有效地联接于来源于豌豆基因的3’UTRDNA分子(T-RbcS2，E9)。
首先使用农杆菌属介导的转化，利用5个表达盒之一各自转化来自欧洲油菜的外植体。随后在含有草甘膦的培养基上选择转化的细胞，将存活的细胞再生成植物。产生超过23,000个外植体，从所述外植体产生224个总的个体R0事件，并将其用于随后的筛选(表1)。
表1：欧洲油菜的转化和MON88302事件的选择
使用TAQMANPCR分析筛选事件的组织样品以排除多拷贝和/或分子络合物件。基于通过TAQMANPCR分析测定的单拷贝的转基因的存在和载体主链序列的不存在，从初始224个事件选择104个事件继续进行测试。具体地，从构建体1(对于初始97个事件)选择37个R1事件继续进行测试；从构建体2(对于初始69个事件)选择32个R1事件继续进行测试；从构建体3(对于初始43个事件)选择11个R1事件继续进行测试；从构建体4(对于约30个事件)选择14个R1事件继续进行测试，从构建体5(对于约25个事件)选择10个R1事件继续进行测试。
将104个包含单拷贝的转基因的事件继续进行温室测试(GH)，包括额外的分子分析和功效测试。R1温室分子分析包括：确认单拷贝的转基因的存在和载体主链序列的不存在的初始Southern印迹分析；在3-4叶期、莲座期和种子中测量的CP4蛋白质表达水平；以及CP4加工，如通过Western印迹分析测量的(来自构建体4和5的事件未包括在该分析中)。R1温室功效测试包括：分离、萎黄病/坏死、营养体耐受性(vegetativetolerance)、第一朵花、生长减缓、雄性生殖耐受性(如通过花粉活力测量的)和种子计数。根据104个事件的温室分子和功效测试的分析，25个事件被选择继续进行第一年田间试验。具体地，对于构建体1，从测试的37个R1事件选择16个R2事件用于继续进行测试；对于构建体2，从测试的32个R1事件选择3个R2事件继续进行测试；对于构建体3，对于继续进行温室测试的11个R1事件，无R2事件被选择继续进行测试；对于构建体4，从测试的14个R1事件选择3个R2事件用于继续进行测试；对于构建体5，从测试的10个R1事件选择3个R2事件用于继续进行田地测试。
随后在第一年田地试验中在相同位置的成对地块中分析25个R2事件的农艺学评估。开始农艺学田间试验以评估基因插入对植物生长和发育的影响。在5个位置评估来自构建体1的16个R2事件。在4个位置评估来自构建体2的3个R2事件，来自构建体4的3个R2事件和来自构建体5的3个R2事件。每一个研究包括每一个事件的阳性和阴性等值线对(isolinepair)以及亲本转化种质和商业品种。为了进行农艺学评估，观察植物活力、早期直立(earlystand)、第一朵花日期(dateoffirstflower)和植株高度以估量植物发育。产量数据也被评估为基因插入对植物生长和发育的影响的指标。对于事件，将具有3个重复的成对裂区设计(pairedsplitplotdesign)用作整个地块，而对于等值线用作子地块。将每一个阳性的阳性和阴性等值线配对，同时将商业品种和转化背景配对并且包括为对照。使用补充以手工除草(必要时)的常规除草剂程序，在整个季节中使地块保持无杂草；在该田间方案中未使用草甘膦处理。
在种植后第7至10天进行每一个地块的出苗/直立计数。已完全清除土壤的子叶被认为是“已出苗的”。使用范围在1(优良的活力)与9(活力较低)之间(5为平均值)的评级在2至3叶期(在对用于功效测试的成对地块第一次施用除草剂之前)测定植物的活性。在所有地块已开始开花后记录第一朵花日期，将其表示为每植物每地块开放花朵的百分比。中花至晚花期从土壤表面至最高总状花序的顶部测量每地块5株植物的植物高度，并且以厘米表示。使用范围在1(优良)与9(较差)之间(5为平均值)的评级评估一致性和直接能力(standability)。在大部分地块已达到成熟后收获每一个试验。将一些地块直接组合，然而在达到成熟后将其它地块推翻，此后约10天将收割的刈痕(swath)组合。记录潮湿的单一种子重量(lb/A)，收集种子样品以进行油和蛋白质分析。单独地分析每一个位置，使用统计软件分析跨位置的平均值。在每一个位置对5％的实验类I型误差率使用Bonferroni调整，基于剔除学生化残差(deletedstudentizedresiduals)使用使用标准两遍法(standardtwo-passprocedure)筛选数据的异常值。在分析之前除去异常值。利用约束最大似然估计(restrictedmaximumlikelihoodestimation)进行裂区设计的标准方差分析。计算每一个事件的每一个等值线的最小二乘平均值，将利用5％的比较类误差率的t-检验用于测定基因插入对油菜生长特征影响的显著性。将阳性等值线的事件性状与相应的阴性等值线的性状相比较。由于事件之间成熟度的差异，排除阳性等值线与汇集的阴性等值之间的比较以及与商业标准和转化背景的比较。
第一年农艺学田间性状的结果显示两个构建体都产生多个事件，其中农艺学特征和产量都未受基因插入的负面影响。基于农艺学评估，15个事件为被选择用于第二年田间试验的候选者。具体地，来自构建体1(在田间试验中16个R2事件)的14个事件和来自构建体2(在田间试验中3个R2事件)的1个事件为被选择继续进行第二年田间试验的候选者。
还在第一年田间测试中测试25个事件的位于与农艺学田间试验相同的测试位置上的功效。开始功效田间试验以评估事件对以各种施用时间安排和施用量连续施用草甘膦的营养和生殖耐受力。在5个位置评估来自构建体1的16个R2事件。在4个位置评估来自构建体2的3个R2事件，来自构建体4的3个R2事件和来自构建体5的3个R2事件。每一个研究包括每一个事件和两个商业品种的阳性等值线。对于除草剂处理，将具有3个重复的裂区设计用作完整地块，而对于事件条目，将其用作子地块。将非喷雾处理包括用于比较。
评估事件对1.6lbAE/A的单次施用或0.8lbAE/A的两次连续施用(当从作物出苗直至第一花朵施用时)的营养和生殖耐受性。以3个不同的施用量(等同于2x，4x和8x的单次施用量)施用RoundupWeatherMAX(表2)。在四叶期进行初始施用，然后在预筛选(prebolt)期进行第二次施用。为了使表面活性剂和其它制剂组分造成的潜在植物损伤减小至最低程度，使用1.6lbAE/A的RoundupWeatherMAX作为基础施用量(baserate)和添加技术材料(technicalmaterial)(不具有表面活性剂的草甘膦)(以获得期望的施用量)来制备递送3.2和6.4lbAE/A(4x和8x)的喷雾剂溶液。使用配备标有刻度以递送10至20GPA的扇形雾化喷嘴(flat-fannozzle)的拖拉机悬挂式喷雾吊杆进行所有施用。
如上所述进行数据收集。如下评估草甘膦损伤。在每一次草甘膦施用之前，测定处理和未处理的地块中每地块5株植物的株高和叶数目。为了确定草甘膦是否对事件造成损伤，在每一次草甘膦施用后7至10天进行萎黄病百分比和坏死百分比的目测评估。使用范围在0％(无损伤)与100％(植物死亡)之间的等级在第一次草甘膦施用后对营养损伤进行评级，然而在第二次施用后对生殖萎黄病/坏死百分比进行评估。使用范围在0与100％之间的等级在每一次施用后14至21天评估生长下降。在第一次施用后评估营养生长下降，然而在连续施用后测定代表性生长下降。计算草甘膦水平与事件的每一个组合的最小二乘平均值，使用t-检验来测定草甘膦对事件耐受性的影响的显著性。在每一个除草剂施用量内将来自草甘膦处理的事件产量与未处理对照的产量以及与商业标准RT73相比较，以及对每一个事件进行除草剂施用量间的比较。
第一年功效田间试验的结果显示构建体1产生对草甘膦具有优良营养和生殖耐受性的事件。在2x产品概念施用量观察到的营养损伤是非常小的并且被认为是商业上不显著的。观察到构建体1事件的优异生殖耐受性。所有构建体1事件的产量都未受到草甘膦的负面影响，无论施用量如何，除一个在最高施用量(6.4lbAE/A，然后6.4lbAE/A)下显示显著的产量下降的事件外。来源于构建体2的事件不具有用于继续测试的足够的营养草甘膦耐受性。在所有测试的草甘膦施用量上观察到不可接受的损伤水平。草甘膦显示降低了所有构建体2事件的产量，无论施用量如何。来源于构建体4和5的事件表现不如来源于构建体1的事件，因此未被选择继续进行第二年田间测试。基于第一年田间测试，选择13个来自构建体1的事件继续进行第二年田间试验。
实施例2：RT73与MON88302的比较
随后设计田间试验来与现有的商业GenuityTMRoundupReady油菜(RT73事件)相比较评估MON88302。MON88302与RT73的比较显示MON88302提供优良的对更高的草甘膦施用量的作物耐受性，从而使得能够以更高的草甘膦施用量提高难以控制的杂草例如蒲公英、加拿大蓟、孤尾草、野生乔麦、普通-藜草(lambsquarter)和地肤属(kochia)的杂草控制。MON88302与RT73的比较也显示MON88302提供了优良的对草甘膦的更广泛应用范围的作物耐受性，从而使得能够在范围从出苗后至第一花朵的更宽的窗口上进行草甘膦施用，从而使得能够甚至在比对于RT73可能的生长期更晚的作物生长期控制掠夺产量(yield-robbing)的野草。增强的对更高的草甘膦施用量的耐受性和在更晚的作物期对草甘膦施用的耐受性的MON88302组合与RT73相比较提供了有利方面：当环境条件已限制早期施用时允许在更晚的生长期施用草甘膦和/或提高对可降低作物产量的杂草的晚期暴发的控制。
GenuityTMRoundupReady油菜系统(事件RT73)的目前注册的草甘膦施用量为晚至油菜作物的六叶期的675gae/ha的单次施用或两次450gae/ha施用。在多个单次草甘膦施用量上比较RT73与MON88302事件。从油菜作物的出苗后至第一花朵进行施用。GenuityTMRoundupReady油菜系统(RT73事件)以商业开放授粉品种(openpollinatedvariety)34-65为代表，将事件MON88302转化入黑檀树种质。
建立8个试验，将6个用于收获(将一个位置经历干旱，一个位置经历冰雹，来自一个收获位置的数据因超过预定截断值的变异系数(CV)而被弃用)。在整个季节利用标准油菜生长实践来最优化植物生长。将出苗前和出苗后常规除草剂和包含杀真菌剂和杀虫剂的种子处理用于使害虫压力降至最低限度。将试验设立裂区设计，将GenuityTMRoundupReady油菜(RT73事件)或MON88302系统分块，在块内随机化除草剂施用量。地块为2乘6米并且重复3次。在适当的作物期，利用手提式吊杆喷雾器以100-110l/ha施用施用量对地块进行喷雾。将RoundupWeatherMAX的加拿大制剂(540g/L)用作草甘膦产品。4至6叶期被定义为在主茎上具有4至6片真叶，并且第一朵花为当50％的植物具有至少一朵花的时候。在除草剂施用后(DAT或处理后天数)7至10天记录萎黄病百分比(CHLR％)。萎黄病百分比为作为基于1至100的等级与未处理的对照相比较的除草剂处理的结果，关于植物的叶的黄化量的目测评估。在除草剂施用后(DAT)14-21天记录生长下降百分比(GR％)。生长下降百分比为用于描述植物生长下降的目测评估，所述生长下降由如下方面组成：包括但不限于经处理的区域的叶的降低的高度和/或数量。评估仅与植物的地上部分相关。将生长下降百分比与未处理的对照相比较，将其基于1至100的等级进行分级。将成熟记录为种植后至当30％的主总状花序上的种子在颜色上为褐色/黑色时的天数。在收获过程中电子地记录种子含水量百分比。收割所有地块，随后让其干燥直至种子含水量低至足以有利于收获。在收获过程中电子地记录重量和种子含水量，并且在10％的种子含水量上将其转换成蒲式尔/英亩。单独地分析每一个位置，使用统计软件分析跨位置的平均值。在每一个位置对5％的实验类I型误差率使用假发现率(FalseDiscoveryRate)(FDR)调整，基于剔除学生化残差使用标准两遍法筛选数据的异常值。在分析之前除去异常值。利用约束最大似然估计通过混合模型进行裂区设计的标准方差分析-将品种和除草剂处理处理为固定效应，重复和位置为随机效应。计算每一个品种和每一个处理的最小二乘平均值，将利用5％的比较类误差率的t-检验用于测定在每一个除草剂处理水平上品种与对照的油菜生长特征之间的显著性。测量作物损伤、成熟和产量以评估益处。
关于与包含事件MON88302的油菜相比较包含事件RT73的油菜的草甘膦耐受性的数据提供于表2中。简而言之，MON88302的草甘膦耐受性在对增加的草甘膦施用量(gae/ha)的耐受性和其中耐受草甘膦施用的作物生长期的范围上都优于RT73的草甘膦耐受性。例如，RT73至4-6叶期在1800gae/ha施用量上显示4.7％的萎黄病，然而MON88302在该时期在相似的施用量上仅显示1.7％的萎黄病，并且在双倍的施用量(3600gae/ha)上未显示增加的萎黄病。此外，MON88302事件至4-6叶期在1800gae/ha的施用量上未显示生长下降百分比，然而RT73具有5.3％的生长下降。在4至6叶期和第一花朵作物施用期，RT73在3600gae/ha草甘膦施用量上显示10％的萎黄病，然而MON88302分别仅显示1.7％和4.7％。在3600gae/ha草甘膦施用量上，在4至6叶期和第一花朵作物施用期，RT73分别显示20.8％和8.1％的生长下降，然而MON88302分别仅显示0.3％和1.1％。
表2：RT73事件与MON88302相比较的草甘膦耐受性
关于包含事件RT73的油菜与包含事件MON88302相比较的种植后至收割的天数的数据提供于表3中。简而言之，在4至6叶期和第一花朵施用时在3600gae/ha的施用量上GenuityTMRoundupReady油菜系统(RT73事件)的成熟被显著延迟，这可能是作物损伤的结果。在预期在4至6叶期施用分期时在1800gae/ha的施用量上存在成熟的显著缩短的MON88302植物中未观察到成熟的延迟。
表3：RT73事件与MON88302相比较的种植后至收割的天数
关于包含事件RT73的油菜与包含事件MON88302的油菜相比较的种子含水量的数据提供于表4中。当收获单个的地块时电子地记录种子含水量。比较每一个系统内的以一定施用量喷施草甘膦的处理与未喷施的处理之间的种子含水量。GenuityTMRoundupReady油菜系统的种子含水量在4-6叶期和第一花朵作物生长期施用时在1800gae/ha和3600gae/ha的施用量上更高。这两个处理中的增加的种子含水量再次反映了成熟的延迟，这是先前描述的作物损伤的结果。在MON88302植物中未观察到对种子含水量的显著影响。
表4：RT73事件与MON88302相比较的种子含水量
关于包含事件RT73的油菜与包含事件MON88302的油菜时候比较的产量的数据提供于表5和图2及3中。进行包含每一个事件的油菜的以不同施用量喷施草甘膦的处理与未喷施的处理之间的产量比较。在GenuityTMRoundupReady油菜系统中，在4至6叶和第一朵花施用时在1800和3600gae/ha的施用量上以及在第一朵花施用时在900g/ha的施用量上观察到显著的产量下降。在MON88302植物中在任何施用量或时间安排上未观察到产量的显著差异。
表5：RT73事件与MON88302相比较的产量
用于GenuityTMRoundupReady油菜系统的草甘膦的目前标记的施用量为675gae/ha(一次施用)或450gae/ha(两次施用)。可直至6叶期进行施用。用于MON88302的施用量在直至作物的第一朵花时施用时可达到1800gae/ha。GenuityTMRoundupReady油菜系统在建议的1800gae/ha的MON88302施用量上具有11.4％的产量下降和在2X建议的施用量下具有30％的产量下降(图2)。在4至6叶的目前标记的GenuityTMRoundupReady油菜作物施用期观察到这些产量下降。在MON88302植物中未观察到显著的产量下降。图3显示在草甘膦施用量和作物分期(第一朵花)下的产量。在该更晚的作物分期上对于GenuityTMRoundupReady油菜系统在所有施用量下存在显著的产量下降。在MON88302植物中未观察到显著的产量下降。
实施例3：MON88302DNA序列的表征
利用所述分子分析表征插入植物MON88302的基因组的DNA和侧翼连接该插入物的基因组序列。此类分析包括：对插入物序列进行测序，测定插入物数目(基因组中的整合位点的数目)，测定拷贝数(转基因DNA在一个基因座内的拷贝数目)，评估插入的基因盒的完整性以及表征侧翼序列。
使用Ochman等人，1990(PCRProtocols：AguidetoMethodsandApplications，AcademicPress，Inc.)中描述的反向热扩增(inversethermalamplification)测定侧翼连接事件MON88302中的转基因DNA插入的基因组DNA序列。从非转基因黑檀树和通过实施例1中描述的欧洲油菜的农杆菌属介导的转化产生的不同转基因事件分离植物基因组DNA。在标准温室条件下产生用于DNA分离的组织。将约1克的嫩叶组织与液氮组合，使用研钵和研杵将其研磨成细粉。按照制造商的方案使用NucleonTMPhytoPureTM基因组DNA提取试剂盒(RPN8511，Amersham，Piscataway，NJ)提取DNA。在最终的沉淀步骤后，将来自个体样品的DNA重悬浮于0.5ml的TE(10mMTris-HClpH8.0，1mMEDTA)中。该方法可经本领域技术人员改进以从任何组织(包括但不限于种子)提取DNA。
利用基于转基因DNA的限制性分析选择的限制性核酸内切酶降解来自每一个样品的DNA的等分。在限制片段自身连接后，使用根据转基因DNA序列设计的引物进行热扩增，所述热扩增可使用ELONGASE扩增系统(目录号10481-018，Invitrogen，Carlsbad，CA)或ExpandLongTemplatePCR系统(目录号1681842，RocheAppliedScience，Indianapolis，IN)从转基因DNA的5’和3’末端延伸来扩增序列。利用琼脂糖凝胶电泳分离从反应产生的扩增子，随后使用QIAGEN凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)进行纯化。按照制剂商的方案将凝胶纯化的扩增子克隆入pCR-XL-TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用标准DNA测序方案对所得的包含事件MON88302侧翼基因组序列的质粒进行测序。将与插入基因组的转基因DNA的5’末端相邻或侧翼连接其的基因组DNA提供为SEQIDNO：3([C]，参见图1)。将与插入基因组的转基因DNA的3’末端相邻的基因组DNA提供为SEQIDNO：42([D]，参见图1)。将完全整合入基因组DNA的表达盒DNA的区段提供为SEQIDNO：5([E]，参见图1)。
将分离的DNA分子序列与转基因DNA序列相比较以鉴定侧翼序列和共分离的转基因DNA片段。利用基于推导的侧翼序列数据和已知的转基因DNA序列设计的引物通过热扩增来实现表达盒的存在的确认。使用从事件MON88302的侧翼序列设计的引物分离相应于转基因DNA在转化品系中被整合入其中的相同区域的野生型序列。使用ELONGASE扩增系统(目录号10481-018，Invitrogen，Carlsbad，CA)进行热扩增反应。针对多个核苷酸和蛋白质数据库分析事件MON88302和黑檀树野生型序列中的侧翼序列。将该信息用于检查转基因与植物基因组的关系和评估插入位点的完整性。将侧翼序列和野生型序列用于设计用于TAQMAN终点测定(其用于鉴定事件)的引物。
实施例4：事件特异性终点TAQMAN测定
本实施例描述了被开发来鉴定样品中的事件MON88302的事件特异性TAQMAN终点热扩增法。用于事件MON88302特异性终点TAQMAN法的条件的实例如下。步骤1：用18兆欧的水将终体积调整至10μl。步骤2：将5.0μl2X通用预混合物(UniversalMasterMix)(dNTP、酶、缓冲液)调整至1X终浓度。步骤3：将0.5μl引物-1和引物-2的混合物(对于每一个引物，重悬浮于18兆欧的水中至20uM的浓度)调整至1.0μM的终浓度(例如在微量离心管中，应当以20uM的终浓度添加下列物质以达到500μl：100μl浓度为100μM的引物SQ20901(SEQIDNO：9)；100μl浓度为100μM的引物SQ23770(SEQIDNO：10)；300μl的18兆欧的水)。步骤4：将0.2μl事件6-FAMTMMGB探针PB10164(SEQIDNO：11)调整至0.2μM的终浓度。步骤5：将0.5μl内部对照引物SQ2563(SEQIDNO：17)和内部对照引物SQ2564(SEQIDNO：18)混合物调整至1.0μM的终浓度(对于每一引物)。步骤6：将0.2μl内部对照VICTM探针PB0751(SEQIDNO：19)调整至0.2μM的终浓度。步骤7：对于每一个样品加入3.0μl提取的DNA(模板)，每一个样品各自包含下列物质：1.待分析的叶子样品；2.阴性对照(非转基因DNA)；3.阴性水对照(无模板)；4.阳性对照MON88302DNA。步骤8：热循环仪条件如下：在50℃下进行1个循环，进行2分钟；在95℃下进行一个循环，进行10分钟；10个循环(在95℃下进行15秒，随后在64℃下进行1分钟，每循环下降1℃)；40个循环(在95℃下进行15秒，随后在54℃下进行1分钟)；10℃的终循环。
用于方法的DNA分子为例如引物SQ20901(SEQIDNO：9)和SQ23770(SEQIDNO：10)以及6FAMTM-标记的寡核苷酸探针PB10164(SEQIDNO：11)。可基于本文中提供的转基因插入物和/或侧翼序列的序列设计其它探针和引物。SQ20901(SEQIDNO：9)和SQ23770(SEQIDNO：10)，当与PB10164(SEQIDNO：11)一起用于此类反应法时，产生诊断事件MON88302DNA的扩增子。终点TAQMAN扩增法还通过FatA(欧洲油菜中的单拷贝内源基因)的扩增确认了模板DNA的完整性。用于方法的DNA分子为例如引物SQ2563(SEQIDNO：17)和SQ2564(SEQIDNO：18)以及VICTM-标记的寡核苷酸探针PB0751(SEQIDNO：19)。用于该分析的对照包括来自包含事件MON88302DNA的欧洲油菜的阳性对照、来自非转基因欧洲油菜的阴性对照和不包含模板DNA的阴性对照。
终点TAQMAN热扩增法也用于开发用于事件MON88302的接合性测定。接合性测定用于确定包含事件的植物对于事件DNA是纯合的；即在染色体对的每一条染色体上的相同位置中包含外源DNA；还是对于事件DNA是杂合的，即仅在染色体对的一条染色体上包含外源DNA；或对于事件DNA是空的，即为野生型。本实施例描述了被开发来测定样品的事件MON88302的接合性的事件特异性终点TAQMAN热扩增法。为了进行该测定，采用三引物测定，其中引物SQ21948(SEQIDNO：12)与插入的外源DNA特异性杂交并且从其延伸，引物SQ22176(SEQIDNO：13)与侧翼连接插入的外源DNA的5′侧的DNA特异性杂交并且从其延伸，并且引物SQ24635(SEQIDNO：14)与侧翼连接插入的外源DNA的3′侧的DNA特异性杂交并且从其延伸。三引物被诊断为事件。在本实施例中，当存在插入的外源DNA的拷贝时，引物SQ22176(SEQIDNO：13)和引物SQ21948(SEQIDNO：12)以及6FAMTM-标记的寡核苷酸探针PB4213(SEQIDNO：15)具有诊断价值。在本实施例中，当在基因组DNA中不存在插入的外源DNA的拷贝即野生型时，SQ22176(SEQIDNO：13)和引物SQ24635(SEQIDNO：14)以及VICTM-标记的寡核苷酸探针PB10787(SEQIDNO：16)具有诊断价值。当将3个引物和2个探针与从对于事件MON88302是纯合的植物提取的DNA一起混合在PCR反应物中时，仅存在来自6FAMTM-标记的寡核苷酸探针PB4213(SEQIDNO：15)的荧光信号，这表示和诊断了对于事件MON88302是纯合的植物。当将三个引物和两个探针与从对于事件MON88302是杂合的植物提取的DNA一起混合在PCR反应物中时，存在来自6FAMTM-标记的寡核苷酸探针PB4213(SEQIDNO：15)和VICTM-标记的寡核苷酸探针PB10787(SEQIDNO：16)的荧光信号，这表示和诊断了对于事件MON88302是杂合的植物。当将三个引物和两个探针与从对于事件MON88302是空的(即野生型)植物提取的DNA一起混合在PCR反应物中时，存在仅来自VICTM-标记的寡核苷酸探针PB10787(SEQIDNO：16)的荧光信号，这表示和诊断了对于事件MON88302是空的(即野生型)植物。用于本方法的条件的实例如下。步骤1：使用18兆欧的水终体积调整至10μl。步骤2：将5.0μl的2X通用预混合物(dNTP、酶、缓冲液)调整至1X终浓度。步骤3：将0.5μl的接合性引物SQ21948、SQ22176、SQ24635(对于每一引物，重悬浮于18兆欧的水至20uM的浓度)调整至1.0μM的终浓度(例如，在微量离心管中，应当添加下列物质以获得终浓度为20uM的500μl：100μl浓度为100μM的引物1；100μl浓度为100μM的引物2；300μl的18兆欧的水)。步骤4：将0.2μl接合性6-FAMTMMGB探针PB4213(SEQIDNO：15)(重悬浮于18兆欧的水至10μM的浓度)调整至0.2μM的终浓度。步骤5：将0.5μl内部对照引物SQ22176(SEQIDNO：13)和内部对照引物SQ24635(SEQIDNO：14)的混合物(对于每一个引物，重悬浮于18兆欧的水中至20uM的浓度)调整至1.0μM的终浓度(对于每一引物)。步骤6：将0.2μl内部对照VICTM探针PB10787(SEQIDNO：16)(重悬浮于18兆欧的水中至10μM的终浓度)调整至0.2μM的终浓度。步骤7：对于每一个样品加入3.0μl提取的DNA(模板)，每一个样品各自包含下列物质：1.待分析的叶子样品；2.阴性对照(非转基因DNA)；3.阴性水对照(无模板)；4.阳性对照MON88302DNA。步骤8：热循环仪条件如下：在50℃下进行1个循环，进行2分钟；在95℃下进行一个循环，进行10分钟；10个循环(在95℃下进行15秒，随后在64℃下进行1分钟，每循环下降1℃)；30个循环(在95℃下进行15秒，随后在54℃下进行1分钟)；可使用System9700或StratageneRobocycler，MJEngineDNAEnginePTC-225热循环仪。可用于产生用于鉴定生物样品的事件MON88302DNA的扩增子的其它方法和装置对于本领域技术人员来说是已知的。当在EppendorfMastercycler梯度或MJEngine中进行热扩增时，应当以计算的模式运行热循环仪。当在Perkin-Elmer9700中进行热扩增时，应当将热循环仪的斜坡限速(rampspeed)设置为最大。
实施例5：在任何MON88302繁殖活动(breedingactivity)中进行的事件MON88302的鉴定
本实施例描述了可使用包含事件MON88302的植物鉴定任何繁殖活动的后代中的事件MON88302的方法。将DNA事件引物对用于产生诊断事件MON88302的扩增子。诊断事件MON88302的扩增子包括至少一个接合序列，在本文中提供为SEQIDNO：1或SEQIDNO：2([A]和[B]，分别如图1中说明的)。SEQIDNO：1(图1的[A])为相应于侧翼序列与转基因插入物的5’末端的接合处的核苷酸序列(SEQIDNO：3的位点762至82[C]，参见图1)。SEQIDNO：2([B]，参见图1)为相应于侧翼序列与转基因插入物的3’末端的接合处的核苷酸序列(SEQIDNO：4的位点313至372[D]，参见图1)。
将产生事件MON88302的诊断扩增子的事件引物对包括使用侧翼序列(SEQIDNO：3和4)和插入的转基因DNA序列(SEQIDNO：5)设计的引物对。为了获得其中发现SEQIDNO：1的至少40个核苷酸的诊断扩增子，可设计基于SEQIDNO：3的碱基1至791的正向引物分子和基于插入的表达盒DNA序列(SEQIDNO：5的位点1至4427)的反向引物分子，其中引物分子具有足以与SEQIDNO：3和SEQIDNO：5特异性杂交的长度的连续核苷酸。为了获得其中发现SEQIDNO：2的至少40个核苷酸的诊断扩增子，可设计基于插入的表达表达盒(SEQIDNO：5的位点1至4427)的正向引物分子和基于3’侧翼序列(SEQIDNO：4的碱基343至1250)的反向引物分子，其中引物分子具有足以与SEQIDNO：4和SEQIDNO：5特异性杂交的长度的连续核苷酸。为了实践目的，应当设计产生具有有限的大小范围例如100至1000个碱基的扩增子的引物。更小的(更短的多核苷酸长度)大小的扩增子通常可在PCR反应中更可靠地产生，允许更短的循环时间，并且可在琼脂糖凝胶上容易地分离和显现或经改造适用于终点TAQMAN-样测定。可通过扩增子检测领域内已知的方法产生和检测更小的扩增子。此外，将使用引物对产生的扩增子克隆入载体，扩增、分离，并对其进行测序，或可利用本领域已良好建立的方法直接对所述扩增子进行测序。来源于SEQIDNO：3与SEQIDNO：5的组合或SEQIDNO：4与SEQIDNO：5的组合的任何引物对(所述引物对在DNA扩增法中用于产生诊断事件MON88302或其后代的扩增子)为本发明的方面。包含SEQIDNO：3的至少11个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子(其在DNA扩增法中用于产生诊断包含事件MON88302的植物或其后代的扩增子)为本发明的方面。包含SEQIDNO：4的至少11个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子(其在DNA扩增法中用于产生包含诊断事件MON88302的植物或其后代的扩增子)为本发明的方面。包含SEQIDNO：5的至少11个连续核苷酸或其互补序列的任何单个分离的DNA多核苷酸引物分子(所述引物分子在DNA扩增法中用于产生诊断包含事件MON88302的植物或其后代的扩增子)为本发明的方面。
用于该分析的扩增条件的实例描述于上述实施例4中。然而，此类方法的任何变动或与SEQIDNO：3或SEQIDNO：4或事件MON88302的转基因插入物(SEQIDNO：5)的DNA序列同源或互补的DNA引物(所述引物产生诊断事件MON88302的扩增子)的使用在本说明书的范围内。诊断扩增子包含与至少一个转基因/基因组接合DNA(SEQIDNO：1或SEQIDNO：2或SEQIDNO：7或SEQIDNO：8)或其大部分同源或互补的DNA分子。
用于样品的事件MON88302的分析可包括来自事件MON88302的阳性对照、来自不为事件MON88302的可比较的植物(例如，但不限于欧洲油菜)的阴性对照和/或不包含基因组DNA的阴性对照。可扩增内源DNA分子的引物对可用作DNA扩增条件的内部对照。选自SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5所示序列的序列的任何片段可用作用于通过实施例4中描述的方法产生扩增子的DNA扩增引物，并且当使用事件MON88302作为用于这样的诊断扩增反应的模板时，这样的扩增子可被诊断为事件MON88302。此类具有变动的DNA引物序列用于实施例中描述的方法的用途在本发明的范围内。被诊断为事件MON88302的由至少一个来源于SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5的DNA引物序列产生的扩增子为本发明的方面。
因此可设计DNA检测试剂盒并且所述试剂盒可为本发明的方面，所述DNA检测试剂盒包括至少一个具有充分长度的来源于SEQIDNO：3、SEQIDNO：4或SEQIDNO：5的连续核苷酸并且当用于DNA扩增法时产生包含事件MON88302的植物或其后代的诊断扩增子的DNA引物。当在DNA扩增法中测试时可产生事件MON88302的诊断扩增子的植物部分或种子或商业产品为本发明的方面。可通过使用任何热循环仪或可用于产生诊断如本文中描述的事件MON88302的扩增子的核酸扩增系统测定事件MON88302扩增子。
上文中公开的和权利要求中引用的事件MON88302种子的代表性样品已由美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801UniversityBoulevard，Manassas，VA.20110在布达佩斯协议下进行保藏。该保藏物的ATCC登录号为PTA-10955。将保藏物在最近的请求后在贮藏所维持30年或5年的时期，或维持专利的有效使用期(更长的时间为准)，并且在该期间必要时可替换保藏物。
由于已举例说明和描述了本发明的原理，因此对于本领域技术人员来说很显然的是本发明可在不背离这些原理的情况下在排列和细节上变动本发明。我们要求保护在所述权利要求的精神和范围内的所有变动。

Claims (21)

1.一种重组DNA分子，其包含：
具有选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8的序列的多核苷酸分子，且进一步包含编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列，其中SEQIDNO：1、3或7位于编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的5’侧翼以及SEQIDNO：2、4或8位于编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的3’侧翼。
2.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子来源于事件MON88302，包含事件MON88302事件的种子的代表性样品已于ATCC登录号PTA-10955下保藏。
3.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子包含在芸苔属植物、植物细胞、种子、后代植物、植物部分或商业产品中。
4.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子为从来源于事件MON88302的DNA的模板分子产生的扩增子。
5.根据权利要求1所述的DNA分子，其中所述DNA分子被诊断为事件MON88302的存在。
6.一种诊断事件MON88302的存在的多核苷酸探针，其中所述多核苷酸探针具有充分长度以结合包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的核酸分子，并且其中所述多核苷酸探针在严格杂交条件下与包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的DNA分子杂交，并且在严格杂交条件下不与不包含SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的DNA分子杂交，且其中所述探针包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：1的至少40个连续核苷酸。
7.一种用于检测来源于事件MON88302的DNA分子在DNA样品中的存在的方法，所述方法包括：
a.将DNA样品与根据权利要求6所述的多核苷酸探针接触；
b.将所述样品和所述多核苷酸探针经历严格杂交条件；和
c.检测所述多核苷酸探针对所述DNA分子的杂交
其中所述杂交的检测诊断所述来源于事件MON88302的DNA分子在所述DNA样品中的存在。
8.一对由第一DNA分子和与所述第一DNA分子不同的第二DNA分子组成的DNA分子，其中所述DNA分子包含具有拥有充分长度的SEQIDNO：6的连续核苷酸或其互补序列的核苷酸序列的多核苷酸分子，且其中所述第一DNA分子存在于SEQIDNO：6的转基因插入物DNA序列，和所述第二DNA分子存在于SEQIDNO：6的芸苔属基因组DNA序列，以用作当与来源于事件MON88302的模板一起用于扩增反应中时产生诊断样品中的事件MON88302DNA的扩增子的DNA引物，其中所述扩增子包含选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的核苷酸序列。
9.一种检测来源于事件MON88302的DNA分子在DNA样品中的存在的方法，所述方法包括：
a.将DNA样品与根据权利要求8所述的DNA分子对接触；
b.进行足以产生包含具有SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的至少40个连续核苷酸的多核苷酸分子的扩增子的扩增反应；和
c.检测所述扩增子，
其中所述扩增子的检测被诊断为所述来源事件MON88302的DNA分子在所述DNA样品中的存在。
10.一种DNA检测试剂盒，包含：
a)一对包含第一DNA分子和与所述第一DNA分子不同的第二DNA分子的DNA分子，其中所述第一和第二DNA分子各自包含具有充分长度的SEQIDNO：6的连续核苷酸和其互补序列，且其中所述第一DNA分子存在于SEQIDNO：6的转基因插入物DNA序列，和所述第二DNA分子存在于SEQIDNO：6的芸苔属菜基因组DNA序列，以用作当与来源于事件MON88302的模板一起用于扩增反应中时产生诊断样品中的所述事件MON88302DNA的存在的扩增子的DNA引物，且其中所述扩增子包含选自SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的核苷酸序列；或
b)至少一种诊断事件MON88302的DNA探针，其中所述DNA探针包含SEQIDNO：2或SEQIDNO：1的至少40个连续核苷酸。
11.一种来源于事件MON88302的无生命植物材料，所述事件MON88302包含选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8，且进一步包含编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的DNA分子，其中SEQIDNO：1、3或7位于编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的5’侧翼以及SEQIDNO：2、4或8位于编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的3’侧翼。
12.一种用于控制包括包含事件MON88302的植物的田地中杂草的方法，所述方法包括利用有效地控制所述田地中的杂草生长的量的草甘膦处理田地而不损伤所述包含事件MON88302的植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述有效地控制杂草的生长的草甘膦的量为约0.125磅至约6.4磅每英亩。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述有效地控制杂草的生长的草甘膦的量为约1.6磅每英亩。
15.根据权利要求12所述的方法，其中在所述包含事件MON88302的植物的6叶期后对田地进行所述处理。
16.一种产生耐受草甘膦除草剂的施用的芸苔属植物的方法，包括：
a.将耐受草甘膦的包含事件MON88302的芸苔属植物与第二芸苔属植物杂交，从而产生种子；
b.生长所述种子以产生多个后代植物；
c.选择包含事件MON88302的后代植物。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述选择后代植物包括用草甘膦处理所述后代植物和选择耐受草甘膦的后代植物。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述选择后代植物包括鉴定包含具有选自SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：6、SEQIDNO：7、SEQIDNO：8的核苷酸序列，且进一步包含编码草甘膦耐受的5-烯醇丙酮-3-磷酸莽草酸合酶的序列的DNA分子的后代植物。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述第二芸苔属植物不存在对草甘膦除草剂的耐受性。
20.一种产生耐受草甘膦除草剂的施用的芸苔属植物的方法，包括：
a.将耐受草甘膦的包含事件MON88302的事件芸苔属植物自交，从而产生种子；
b.生长所述种子以产生多个后代植物；
c.选择包含事件MON88302的后代植物。
21.一种测定事件MON88302植物或种子的接合性的方法，包括：
a.将包含DNA的样品与包含SEQIDNO：12、SEQIDNO：13和SEQIDNO：14的引物组接触，所述引物组当与来自事件MON88302的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时，产生被诊断为事件MON88302的第一扩增子；
b.进行核酸扩增反应，从而产生所述第一扩增子；
c.检测所述第一扩增子；
d.将包含DNA的所述样品与所述引物组接触，所述引物组，当与来自植物的基因组DNA一起用于核酸扩增反应时，产生第二扩增子，所述第二扩增子包含与鉴定为事件MON88302的转基因插入的基因组区域同源的自体基因组DNA；
e.进行核酸扩增反应，从而产生所述第二扩增子；
f.检测所述第二扩增子；和
g.比较样品中的所述第一和第二扩增子，其中两个扩增子的存在表示所述样品对于所述转基因插入是杂合的。
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