PT1240340E - Construções de dna para expressão de polipéptidos heterólogos em plantas - Google Patents

Construções de dna para expressão de polipéptidos heterólogos em plantas Download PDF

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PT1240340E
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PT00984233T
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Karen L Fincher
Stanislaw Flasinski
Jack Q Wilkinson
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Monsanto Technology Llc
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Description

ΡΕ1240340 1 DESCRIÇÃO " CONSTRUÇÕES DE DNA PARA EXPRESSÃO DE POLIPÉPTIDOS HETERÓLOGOS EM PLANTAS "
Campo do invento O presente invento está relacionado com o isolamento e utilização de moléculas de ácido nucleico para o controlo da expressão de genes em plantas, especificamente com novos promotores vegetais.
Fundamento do invento
Um dos objectivos da engenharia genética de plantas é produzir plantas com caracteristicas ou qualidades importantes em termos agronómicos. Avanços recentes na engenharia genética proporcionaram as ferramentas necessárias para produzir plantas transgénicas que possuem e expressam genes estranhos (Kahl et al., World J. of Microbiol. Biotech. 11:449-460, 1995).
Caracteristicas ou qualidades de interesse para a engenharia genética de plantas incluirão, sem lhes estar limitadas, resistência a insectos, a doenças fúngicas e a outras pragas e agentes causadores de doença, tolerância a herbicidas, maior estabilidade ou armazenamento, tolerâncias ambientais e melhorias nutricionais. Os avanços 2 ΡΕ1240340 tecnológicos na transformação e regeneração de plantas permitiram aos investigadores pegar em DNA exógeno, como seja um gene ou genes de uma fonte heteróloga ou nativa, e incorporar o DNA exógeno no genoma da planta. Numa abordagem, a expressão de um novo gene que normalmente não é expresso numa planta ou tecido particular pode conferir um efeito fenotipico pretendido. Numa outra abordagem, a transcrição de um gene ou de parte de um gene numa orientação contrária à da cadeia codificadora pode produzir um efeito desejável ao prevenir ou inibir a expressão de um gene endógeno.
Para produzir uma planta transgénica, uma construção que inclua uma sequência de gene heterólogo, que confira um fenótipo pretendido quando expresso nas plantas, é introduzido numa célula vegetal. A construção também inclui um promotor vegetal que está operacionalmente ligado à sequência de gene heterólogo, frequentemente um promotor normalmente não associado ao gene heterólogo. A construção é então introduzida numa célula vegetal para produzir uma célula vegetal transformada e a célula vegetal transformada é regenerada numa planta transgénica. 0 promotor controla a expressão da sequência de DNA introduzida à qual o promotor está operacionalmente ligado e assim afecta a característica pretendida conferida pela sequência de DNA.
Será vantajoso possuir uma variedade de promotores para talhar a expressão do gene de forma que o gene ou genes sejam transcritos eficientemente na altura 3 ΡΕ1240340 certa durante o crescimento e desenvolvimento da planta, na localização óptima da planta e na quantidade necessária para produzir o efeito pretendido. Por exemplo, a expressão constitutiva do produto de um gene pode ser benéfica numa localização da planta mas menos benéfica numa outra parte da planta. Noutros casos, pode ser benéfico ter o produto de um gene produzido numa determinada fase do desenvolvimento da planta ou como resposta a determinados estímulos ambientais ou químicos. 0 desenvolvimento comercial de germoplasma geneticamente melhorado também avançou para a fase de introdução de múltiplas características, muitas vezes referida como a abordagem de empilhamento de genes. Nesta abordagem, múltiplos genes conferindo diferentes características de interesse podem ser introduzidos numa planta. É importante quando da introdução de múltiplos genes numa planta que cada gene seja modulado ou controlado para haver expressão óptima e que os elementos reguladores sejam diversos de forma a reduzir o potencial de silenciamento de genes. Face a estas e outras considerações, é aparente que o controlo da expressão génica e a diversidade de elementos reguladores são importantes na biotecnologia vegetal.
Sumário do invento 0 presente invento está relacionado com um promotor híbrido compreendendo as sequências descritas em SEQ ID NO:28. O referido promotor híbrido é uma sequência de promotor quimérico compreendendo pelo menos um elemento 4 ΡΕ1240340 estimulador cis derivado do promotor do virus do mosaico da escrofulária (FMV) operacionalmente ligado a pelo menos um elemento cis de um promotor do factor de elongação la (EFla) de Arabidopsis, este último consistindo essencialmente numa região reguladora 5' derivada de SEQ ID NO:12 . 0 invento está ainda relacionado com uma construção de DNA compreendendo: uma ou mais cassetes de expressão compreendendo uma sequência de DNA de promotor hibrido, como atrás definido, e uma sequência de DNA estrutural operacionalmente ligada ao promotor hibrido. 0 gene estrutural pode compreender qualquer sequência nucleotidica heteróloga em que a expressão da sequência resulta numa caracteristica ou produto útil em termos agronómicos numa planta transgénica cultivada.
De acordo com um outro aspecto do invento é uma construção de DNA compreendendo uma sequência de DNA estrutural operacionalmente ligada às sequências do promotor do presente invento que codifica uma proteína empregue para conferir tolerância a herbicidas a uma planta cultivada. Esta proteína de tolerância a herbicidas inclui, mas não lhes está limitado, genes de proteínas de tolerância ao glifosato, tais como o gene da sintetase EPSP resistente ao glifosato, sozinho ou em combinação com um ou mais genes de proteínas que degradam o glifosato. 5 ΡΕ1240340
De acordo com uma outra realização do invento, é proporcionada uma construção de DNA como a descrita atrás, em que a sequência de DNA estrutural é um gene de tolerância ao glifosato, de forma que quando a construção de DNA é introduzida numa célula vegetal, confere à célula vegetal tolerância a uma formulação aquosa do glifosato que inclui pelo menos 50 gramas de equivalente ácido por litro (g a.e/1) de glifosato. Noutras realizações relacionadas, a construção de DNA confere à célula vegetal tolerância a formulações de glifosato tendo concentrações de glifosato mais elevadas (por exemplo, pelo menos 300 gramas de equivalente ácido por litro de glifosato) . De acordo com uma realização, a construção de DNA confere à célula vegetal tolerância a pelo menos uma aplicação de Roundup Ultra® numa taxa de 1,12 kg/ha (16 onças (oz) por acre), por exemplo, e noutras realizações, a tolerância ao glifosato estende-se a uma ou mais aplicações de 1,12 kg/ha (16 oz por acre), 2,24 kg/ha (32 oz por acre) ou 4,48 kg/ha (64 oz por acre).
De acordo com uma outra realização do invento, são proporcionadas plantas de culturas transgénicas que estão transformadas com uma construção de DNA como descrito atrás, incluindo espécies monocotiledóneas e espécies dicotiledóneas. Descobrimos que os promotores da actina de Arabidopsis e de EFla de Arabidopsis são suficientemente activos em espécies de plantas cultivadas tais como o algodoeiro, tomateiro e girassol, por exemplo, que quando usados para controlar a expressão de um gene de tolerância 6 ΡΕ1240340 ao glifosato, como seja aroA:CP4, as plantas toleram as proporções de aplicação comerciais de glifosato, apresentando tolerância vegetativa e pouca destruição dos tecidos reprodutivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de interesse em plantas, incluindo, mas não estando limitado a genes que conferem tolerância a herbicidas, controlo de insectos, resistência a doença, aumento da estabilidade ou do armazenamento, maior rendimento, melhoria nutricional, expressão de um fármaco ou de outro produto polipeptídico pretendido ou uma alteração desejável na fisiologia ou morfologia da planta, etc.
De acordo com uma outra realização do invento, são proporcionadas plantas de culturas transgénicas que estão transformadas com múltiplas construções de DNA compreendendo promotores da actina de Arabidopsis e de EFla de Arabidopsis que sejam suficientemente activos noutras espécies vegetais tais como o algodoeiro, o tomateiro, o girassol, por exemplo, que quando usados para controlar a expressão de um gene de tolerância ao glifosato como seja aroA:CP4, as plantas toleram as taxas de aplicação comerciais de glifosato, apresentando tolerância vegetativa e pouca destruição dos tecidos reprodutivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de interesse em plantas, incluindo, mas não estando limitado a genes que conferem tolerância a herbicidas, controlo de insectos, resistência a doença, aumento da estabilidade ou de armazenamento, maior rendimento, 7 ΡΕ1240340 melhoria nutricional, expressão de um fármaco ou de outro produto polipeptidico pretendido ou uma alteração desejável na fisiologia ou morfologia da planta, etc.
De acordo com uma outra realização do invento, são proporcionadas culturas de plantas transgénicas transformadas com construções de DNA compreendendo os promotores da actina de Arabidopsis e de EFla de Arabidopsis como moléculas quiméricas fundidas com moléculas de DNA de caulimovirus tendo suficiente actividade de promotor em plantas de outras espécies vegetais tais como o algodoeiro, tomateiro, canola, soja e girassol, por exemplo, que quando usado para controlar a expressão de um gene de tolerância ao glifosato como seja aroA:CP4, as plantas toleram as taxas de aplicação comerciais de glifosato, apresentando tolerância vegetativa e pouca destruição dos tecidos reprodutivos. Tais promotores podem também ser usados para expressar outros genes de interesse em plantas, incluindo, mas não estando limitado a genes que conferem tolerância a herbicidas, controlo de insectos, resistência a doença, aumento da estabilidade ou de armazenamento, maior rendimento, melhoria nutricional, expressão de um fármaco ou de outro produto polipeptidico pretendido ou uma alteração desejável na fisiologia ou morfologia da planta, etc.
De acordo com uma outra realização do invento, são proporcionados métodos para a expressão de uma sequência de DNA estrutural numa planta. Tais métodos ΡΕ1240340 compreendem, obtenção de uma construção de DNA como descrita atrás, introdução da construção de DNA numa célula vegetal e regeneração da célula vegetal para produzir uma planta tal que o DNA estrutural é expressável na planta. De acordo com uma realização relacionada, é proporcionado um método de controlo de ervas daninhas em que a construção de DNA compreende um gene de tolerância ao glifosato e aplica-se a uma cultura de plantas transformadas com a construção de DNA uma quantidade de glifosato que é suficiente para controlar as ervas daninhas sem destruir significativamente as plantas cultivadas.
Breve descrição dos desenhos A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura A Figura 1 é um mapa do plasmídeo pCGN8086. 2 é um mapa do plasmideo pMON45325. 3 é um mapa do plasmideo pMON45331. 4 é um mapa do plasmideo pMON45332. 5 é um mapa do plasmideo pCGN9190. 6 é um mapa do plasmideo pCGN9153. 7 é um mapa do plasmideo pCGN8099. 8 é um mapa do plasmideo pCGN8088. 9 é um mapa do plasmideo pCGN8068. 10 é um mapa do plasmideo pCGN8096. 11 é um mapa do plasmídeo pCGN9151. 12 é um mapa do plasmídeo pMON10156. 13 é um mapa do plasmídeo pMON52059. 14 é um mapa do plasmídeo pMON54952. 15 é um mapa do plasmídeo pMON54953. ΡΕ1240340 9 A Figura 16 é um mapa do plasmídeo pMON54954. A Figura 17 é um mapa do plasmideo pMON54955. A Figura 18 é um mapa do plasmideo pMON54956.
Breve descrição da listagem de sequências SEQ ID N0:1 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Act2. SEQ ID NO:2 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Act2. SEQ ID NO:3 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Act8. SEQ ID NO:4 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Act8. SEQ ID N0:5 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Actll. SEQ ID NO:6 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Actll. SEQ ID N0:7 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor EF1. SEQ ID NO:8 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor EF1. 10 ΡΕ1240340 SEQ ID NO:9 é a sequência do promotor Act2 incluindo a sequência de intrão do gene Act2. As posições de bases 1-764 representam a sequência do promotor; as posições de bases 765-1215 representam o intrão seguido de 5 bases da região 5' não traduzida (5'UTR) antes do ATG; o local de iniciação da transcrição está situado na posição da base 597. SEQ ID NO: 10 é a sequência do promotor Act8 incluindo o primeiro intrão do gene Act8. As posições de bases 1-797 representam a sequência do promotor; as posições de bases 798-1259 representam o intrão seguido de 10 bases da 5'UTR antes do ATG; o local de iniciação da transcrição está situado na posição da base 646. SEQ ID NO: 11 é a sequência do promotor Actll incluindo o primeiro intrão do gene Actll. As posições de bases 1-1218 representam a sequência do promotor; as posições de bases 1219-1381 representam o intrão seguido de 10 bases da 5'UTR antes do ATG; o local de iniciação da transcrição está situado na posição da base 1062. SEQ ID NO:12 é a sequência do promotor EF1 incluindo o primeiro intrão do gene EF1. As posições de bases 1-536 representam a sequência do promotor; as posições de bases 537-1137 representam o intrão seguido de 22 bases da 5'UTR antes do ATG; o local de iniciação da transcrição está situado na posição da base 481. 11 ΡΕ1240340
SEQ ID NO:13 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Actla. SEQ ID NO:14 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Actlb. SEQ ID NO:15 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Actla e Actlb. SEQ ID NO:16 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Act3. SEQ ID NO:17 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Act3. SEQ ID NO:18 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Act7. SEQ ID NO:19 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Act7. SEQ ID NO:20 é a sequência iniciadora directa para PCR usada no isolamento do promotor Actl2. SEQ ID NO:21 é a sequência iniciadora inversa para PCR usada no isolamento do promotor Actl2. SEQ ID NO:22 é a sequência do promotor Actla incluindo o primeiro intrão do gene Actla. As posições de bases 1-1033 representam a sequência do promotor; as 12 ΡΕ1240340 posições de bases 1034-1578 representam a sequência do intrão e da 5'UTR. SEQ ID NO:23 é a sequência do promotor Actlb incluindo o primeiro intrão do gene Actlb. As posições de bases 1-914 representam a sequência do promotor; as posições de bases 915-1468 representam a sequência do intrão e da 5'UTR. SEQ ID NO: 24 é a sequência do promotor Act3 incluindo o primeiro intrão do gene Act3. As posições de bases 1-1023 representam a sequência do promotor; as posições de bases 1024-1642 representam a sequência do intrão e da 5'UTR. SEQ ID NO: 25 é a sequência do promotor Act7 incluindo o primeiro intrão do gene Act7. As posições de bases 1-600 representam a sequência do promotor; as posições de bases 601-1241 representam a sequência do intrão e da 5'UTR. SEQ ID NO:26 é a sequência do promotor Actl2 incluindo o primeiro intrão do gene Actl2. As posições de bases 1-1017 representam a sequência do promotor; as posições de bases 1018-1313 representam a sequência do intrão e da 5'UTR. SEQ ID NO:27 é a sequência do promotor quimérico FMV-Actll incluindo o primeiro intrão do gene Actll. As 13 ΡΕ1240340 posições de bases 1-536 representam a sequência do promotor FMV; as posições de bases 553-1946 representam a sequência do promotor, do intrão e da 5'UTR da actina 11 de Arabidopsis. SEQ ID NO:28 é a sequência do promotor quimérico FMV-EFla incluindo o primeiro intrão do gene EFla. As posições de bases 1-536 representam a sequência do promotor FMV; as posições de bases 553-1695 representam a sequência do promotor, do intrão e da 5'UTR da actina 11 de EFla. SEQ ID NO:29 é a sequência do promotor CaMV-Act8 incluindo o primeiro intrão do gene Act8. As posições de bases 1-523 representam a sequência do promotor CaMV; as posições de bases 534-1800 representam a sequência do promotor, do intrão e da 5'UTR de Act8. SEQ ID NO:30 é a sequência do promotor CaMV-Act2 incluindo o primeiro intrão do gene Act2. As posições de bases 1-523 representam a sequência do promotor CaMV; as posições de bases 534-1742 representam a sequência do promotor, do intrão e da 5'UTR de Act2.
Descrição detalhada do invento
As definições e métodos que se seguem são proporcionados para definir melhor e orientar os familiarizados com a área na execução do presente invento. A menos que de outra forma seja referido, os termos deverão ser entendidos de acordo com a sua utilização convencional 14 ΡΕ1240340 pelo familiarizados com a área. Foi usada a nomenclatura das bases de DNA como descrita em 37 CRF § 1.822. Foi usada a nomenclatura convencional de uma e três letras para os resíduos de aminoácidos. "Ácido nucleico (sequência)" ou "polinucleótido (sequência)" refere-se a DNA ou RNA de cadeia simples ou dupla de origem genómica ou sintética, i.e., um polímero de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas, respectivamente, lido do extremo 5' (a montante) para 3' (a jusante). O ácido nucleico pode representar a cadeia codificadora ou a sua complementar ("anti-sentido"). "Nativa" refere-se a uma sequência de ácido nucleico natural ("selvagem"). Sequência "heteróloga" refere-se a uma sequência que deriva de uma fonte ou espécie ou, se da mesma fonte, está modificada relativamente à sua forma original.
Uma sequência de ácido nucleico "isolada" está substancialmente separada ou purificada relativamente a outras sequências de ácido nucleico com as quais o ácido nucleico está normalmente associado na célula do organismo em que o ácido nucleico naturalmente ocorre, i.e., outro DNA cromossómico ou extracromossómico. 0 termo engloba ácidos nucleicos que foram bioquimicamente purificados de forma a remover ácidos nucleicos contaminantes e outros componentes celulares. 0 termo também engloba ácidos nucleicos recombinantes e ácidos nucleicos obtidos por 15 ΡΕ1240340 síntese química. O termo "substancialmente purificado", como aqui usado, refere-se a uma molécula separada de outras moléculas que normalmente lhe estão associadas no seu estado nativo. Mais de preferência, uma molécula substancialmente purificada é a espécie predominante presente numa preparação. Uma molécula substancialmente purificada pode estar mais de 60%, de preferência 75%, mais de preferência 90% livre das outras moléculas (excepto o solvente) presentes na mistura natural. 0 termo "substancialmente purificado" não se destina a incluir moléculas presentes no seu estado nativo.
Uma primeira sequência de ácido nucleico apresenta "identidade substancial" com uma sequência de ácido nucleico de referência se, quando optimamente alinhada (com inserções ou deleções adequadas de nucleótidos totalizando menos de 20 por cento da sequência de referência ao longo da janela de comparação) com os outros ácidos nucleicos (ou a sua cadeia complementar), existir pelo menos 75% de identidade da sequência de nucleótidos, de preferência pelo menos cerca de 80% de identidade, mais de preferência pelo menos cerca de 85% de identidade e mais de preferência pelo menos cerca de 90% de identidade ao longo da janela de comparação de pelo menos 20 posições de nucleótidos, de preferência pelo menos 50 posições de nucleótidos, mais de preferência pelo menos 100 posições de nucleótidos e mais de preferência ao longo da 16 ΡΕ1240340 todo o comprimento do primeiro ácido nucleico. 0 alinhamento óptimo de sequências para alinhamento de uma janela de comparação pode ser conduzido pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; pelo algoritmo de alinhamento de homologias de Needleman e Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; pelo método de pesquisa de semelhanças de Pearson e Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444, 1988; de preferência através de implementações computarizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA) no pacote de programas Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI. O ácido nucleico de referência pode ser uma molécula de tamanho integral ou uma porção de uma molécula mais longa. Como alternativa, dois ácidos nucleicos possuem identidade substancial se um hibridar com o outro em condições restringentes, como definido abaixo.
Uma primeira sequência de ácido nucleico está "operacionalmente ligada" a uma segunda sequência de ácido nucleico quando as sequências estão arranjadas de forma que a primeira sequência de ácido nucleico afecte a função da segunda sequência de ácido nucleico. De preferência, as duas sequências são parte de uma única molécula de ácido nucleico contigua e mais de preferência são adjacentes. Por exemplo, um promotor está operacionalmente ligado a um gene se o promotor regular ou mediar a transcrição do gene numa célula. 17 ΡΕ1240340
Um ácido nucleico "recombinante" é produzido através de uma combinação artificial de dois segmentos da sequência que de outra forma estariam separados, e.g., através da sintese química ou através da manipulação de segmentos isolados de ácidos nucleicos por técnicas de engenharia genética. As técnicas para a manipulação de ácidos nucleicos são conhecidas (ver por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997), volume 2, Detecting Genes, (1998), volume 3, Cloning Systems, (1999) volume 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, New York). Os métodos para a síntese química de ácidos nucleicos estão discutidos, por exemplo, em Beaucage e Carruthers, Tetra. Letts. 22:1859-1862, 1981, e Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185, 1981. A síntese química de ácidos nucleicos pode ser realizada, por exemplo, em sintetizadores automáticos de oligonucleótidos comercializados.
Uma "sequência de ácido nucleico sintética" pode ser projectada e sintetizada quimicamente para expressão aumentada em células hospedeiras particulares e para fins de clonagem em construções adequadas. As células hospedeiras muitas vezes apresentam um padrão de utilização de codões preferido (Murray et al., 1989). Os DNAs sintéticos destinados a aumentar a expressão num hospedeiro particular deverão assim reflectir o padrão de utilização 18 ΡΕ1240340 de codões da célula hospedeira. Existem programas de computadores para estes fins incluindo nas não estando limitados aos programas BestFit" ou "Gap" do pacote Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711. "Amplificação" de ácidos nucleicos ou "reprodução de ácidos nucleicos" refere-se à produção de cópias adicionais de uma sequência de ácido nucleico e é realizada usando tecnologias de reacção em cadeia da polimerase (PCR). É conhecida uma variedade de métodos de amplificação e estão descritos, inter alia, nas Patentes U.S. Nos. 4683195 e 4683202 e em PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. No PCR, uma sequência iniciadora refere-se a um oligonucleótido pequeno, de sequência definida, que é emparelhado com uma matriz de DNA para iniciar a reacção em cadeia da polimerase. "Transformado", "transfectado" ou "transgénico" refere-se a uma célula, tecido, órgão ou organismo no qual foi introduzido um ácido nucleico estranho, como seja uma construção recombinante. De preferência, o ácido nucleico introduzido é integrado no DNA genómico da célula, tecido órgão ou organismo recipiente de forma que o ácido nucleico introduzido é herdado pela progénie subsequente. Uma célula ou organismo "transgénico" ou "transformado" também inclui progénie da célula ou organismo e progénie produzida a 19 ΡΕ1240340 partir de um programa de cruzamento empregando tal planta "transgénica" como progenitora num cruzamento e apresentando um fenótipo alterado resultante da presença de uma construção recombinante ou construção. 0 termo "gene" refere-se a uma molécula de DNA cromossómico, DNA de plasmideo, cDNA, DNA sintético ou outro DNA que codifica um péptido, polipéptido, proteína ou RNA e regiões flanqueantes da sequência codificadora envolvidas na regulação da expressão. Alguns genes podem ser transcritos em mRNA e traduzidos em polipéptidos (genes estruturais); outros genes podem ser transcritos em RNA (e.g. rRNA, tRNA); e outros tipos de genes funcionam como reguladores da expressão (genes reguladores). "Expressão" de um gene refere-se à transcrição de um gene para produzir o correspondente mRNA e tradução deste mRNA para produzir o correspondente produto do gene, i.e., um péptido, polipéptido ou proteína. A expressão dos genes é controlada ou modulada por elementos reguladores incluindo elementos reguladores 5' tais como promotores. "Componente genética" refere-se a qualquer sequência de ácido nucleico ou elemento genético que pode também ser um componente ou parte de uma construção de expressão. Exemplos de componentes genéticos incluem, mas não estão limitados a regiões do promotor, líder não traduzido 5' , intrões, genes, regiões não traduzidas 3' e outros elementos ou sequências reguladores que afectam a 20 ΡΕ1240340 transcrição ou tradução de uma ou mais sequências de ácido nucleico.
Os termos "construção de DNA recombinante", "construção de expressão" ou "cassete de expressão" refere-se a qualquer agente como seja plasmideo, cosmideo, virus, BAC (cromossoma bacteriano artificial) , sequência de replicação autónoma, fago ou sequência nucleotidica de DNA ou de RNA, linear ou circular, de cadeia simples ou de cadeia dupla, derivada de qualquer fonte, capaz de integração genómica ou de replicação autónoma, compreendendo uma molécula de DNA em que uma ou mais sequências de DNA foram ligadas numa forma funcionalmente operativa usando técnicas de DNA recombinante bem conhecidas. "Complementar" refere-se à associação natural de sequências de ácido nucleico através do emparelhamento de bases (pares A-G-T com a sequência complementar T-C-A). A complementaridade entre duas moléculas de cadeia simples pode ser parcial, se apenas alguns dos pares de ácido nucleico forem complementares; ou completa se todos os pares de bases forem complementares. O grau de complementaridade afecta a eficiência e a força das reacções de hibridação e de amplificação. "Homologia" refere-se ao nivel de similaridade entre sequências de ácido nucleico e de aminoácidos em termos de percentagem de identidade posicionai de 21 ΡΕ1240340 nucleótidos ou de aminoácidos, respectivamente, i. e., similaridade ou identidade de sequências. Homologia também se refere ao conceito de propriedades funcionais semelhantes entre diferentes ácidos nucleicos ou proteínas. "Promotor" refere-se a uma sequência de ácido nucleico localizada a montante ou 5' relativamente ao codão de iniciação da tradução de uma grelha de leitura aberta (ou região codificadora de proteína) de um gene e que está envolvida no reconhecimento e ligação de RNA-polimerase II e outras proteínas (factores de transcrição que actuam em trans) para iniciar a transcrição. Um "promotor vegetal" é um promotor nativo ou não nativo que é funcional nas células vegetais. Os promotores constitutivos são funcionais na maioria ou na totalidade dos tecidos de uma planta ao longo do desenvolvimento da planta. Promotores específicos de tecido, órgão ou célula são expressos apenas, ou predominantemente, num tecido, órgão ou tipo de célula particular, respectivamente. Para além de ser expresso "especificamente" num determinado tecido, órgão ou tipo celular, um promotor pode apresentar "expressão "aumentada, i.e., um nível de expressão mais elevado, numa parte (e.g., tipo de célula, tecido ou órgão) da planta comparativamente com outras partes da planta. Os promotores temporalmente regulados são funcionais apenas, ou predominantemente, durante certos períodos do desenvolvimento vegetal ou em determinadas alturas do dia, como no caso dos genes associados ao ritmo circadiano, por exemplo. Os promotores induzíveis expressam selectivamente 22 ΡΕ1240340 uma sequência de DNA ligada operacionalmente em resposta à presença de um estimulo endógeno ou exógeno, por exemplo por compostos quimicos (indutores químicos) ou em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou do desenvolvimento. Promotores induzíveis ou regulados incluem, por exemplo, promotores regulados pela luz, calor, pressão, excesso de água ou seca, fito-hormonas, ferimento ou produtos químicos tais como etanol, ácido salicílico ou protectores.
Qualquer promotor vegetal pode ser usado como uma sequência reguladora 5' para modulação da expressão de um gene ou genes particulares. Um promotor preferido será um promotor da RNA-polimerase II vegetal. Os promotores da RNA-polimerase II vegetal, como os de outros eucariotas superiores, possuem estruturas complexas e são constituídos por diversos elementos distintos. Um desses elementos é a caixa TATA ou caixa de Goldberg-Hogness, a qual é necessária para a expressão correcta de genes eucarióticos in vitro e iniciação precisa e eficiente da transcrição in vivo. A caixa TATA está tipicamente posicionada a aproximadamente -25 a -35, ou seja 25 a 35 pares de bases (pb) a montante (5' ) do local de iniciação da transcrição ou local da coifa ("cap"), o qual é definido como a posição +1 (Breathnach and Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50:349-383, 1981; Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227, 1983). Um outro elemento comum, a caixa CCAAT, está situado entre -70 e -100 pb. Nas plantas, a caixa CCAAT pode ter uma sequência de consenso 23 ΡΕ1240340 diferente da sequência funcionalmente análoga dos promotores de mamifero (o análogo vegetal foi designado a "caixa AGGA" para se diferenciar da sua contraparte animal; Messing et al., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211-227, 1983). Ainda, virtualmente todos os promotores incluem sequências adicionais a montante activadoras ou estimuladoras (Benoist and Chambon, Nature 290:304-310, 1981; Gruss et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 78:943-947, 1981; and Khoury and Gruss, Cell 27:313-314, 1983) estendendo-se entre cerca de -100 pb e cerca de -1000 pb ou mais a montante do local de iniciação da transcrição.
Quando fundidos com sequências de DNA heterólogas, tais promotores, tipicamente, fazem com qua sequência fundida seja transcrita numa forma semelhante à da sequência do gene com que o promotor está normalmente associado. Fragmentos de promotor que incluem sequências reguladoras podem ser adicionados, por exemplo fundidos com o extremo 5' de um promotor activo, ou inseridos dentro dele, tendo as suas próprias sequências reguladoras parciais ou completas (Fluhr et al., Science 232:1106-1112, 1986; Ellis et al., EMBO J. 6:11-16, 1987; Strittmatter and Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Poulsen and Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Cornai et al., Plant Mol. Biol. 15:373-381, 1991). Como alternativa, sequências reguladoras heterólogas podem ser adicionadas à região 5' a montante de um promotor inactivo truncado, e.g., um promotor que inclui apenas o núcleo TATA e, por vezes, os elementos CCAAT (Fluhr et al., Science 232:1106- 24 ΡΕ1240340 1112, 1986; Strittmatter and Chua,Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225:65-71, 1991).
Os promotores são tipicamente constituídos por múltiplos "elementos reguladores da transcrição actuantes em cis" ou simplesmente "elementos cis", cada um dos quais confere um aspecto diferente do controlo global da expressão génica (Strittmatter and Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Ellis et al., EMBO J. 6:11-16, 1987; Benfey et al., EMBO J. 9:1677-1684, 1990). Os "elementos cis" ligam-se a factores proteicos actuantes em trans que regulam a transcrição. Alguns elementos cis ligam-se a mais de um factor e os factores de transcrição actuantes em trans podem interagir com diferentes afinidades com mais de um elemento cis (Johnson and McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58:799-839, 1989). Os factores de transcrição vegetais, correspondendo a elementos cis, e a análise da sua interaeção estão discutidos, por exemplo, em: Martin, Curr. Opinions Biotech. 7:130-138, 1996; Murai, In: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422; e Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300. As sequências de promotor do presente invento podem conter "elementos cis" que conferem ou modulam a expressão génica.
Os elementos cis podem ser identificados por uma série de técnicas, incluindo análise de deleções, i.e., 25 ΡΕ1240340 deleção de um ou mais nucleótidos do extremo 5' ou internos relativamente ao promotor; a análise das proteinas de ligação a DNA usando "footprinting" com Dnase I, interferência de metilação, ensaios de alteração da mobilidade em electroforese, "footprinting" genómico in vivo através de PCR mediado por ligação e outros ensaios convencionais; ou por similaridade de sequências com motivos de elementos cis conhecidos, através de métodos de convencionais de comparação de sequências. A estrutura fina de um elemento cis pode ainda ser estudada por mutagénese (ou substituição) de um ou mais nucleótidos do elemento ou por outros métodos convencionais (ver por exemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422; e Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300).
Os elementos cis podem ser obtidos por síntese química ou por clonagem a partir de promotores que incluem tais elementos. Os elementos cis podem ser igualmente sintetizados com sequências flanqueantes adicionais que possuem locais úteis de enzimas de restrição para facilitar subsequente manipulação. Numa realização, os promotores são constituídos por múltiplos "elementos cis" distintos. 0 promotor híbrido do invento compreende os "elementos cis" das sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO:12, os quais podem ser identificados usando programas de computador incluindo, mas não estando limitados a MEME ou 26 ΡΕ1240340 SIGNALSCAN que foram projectados especificamente para identificar elementos cis ou domínios ou motivos dentro das sequências.
Os promotores vegetais podem também incluir promotores produzidos através da manipulação de promotores conhecidos, para produzir promotores sintéticos quiméricos ou híbridos. Tais promotores podem também combinar elementos cis de um ou mais promotores, por exemplo, através da adição de uma sequência reguladora heteróloga para um promotor activo com as suas próprias sequências reguladoras parciais ou completas (Ellis et al., EMBO J. 6:11-16, 1987; Strittmatter and Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Poulsen and Chua, Mol. Gen. Genet. 214:16-23, 1988; Cornai et al., Plant. Mol. Biol. 15:373-381, 1991). Podem também ser desenvolvidos promotores quiméricos através da adição de uma sequência reguladora heteróloga à região 5' a montante de um promotor truncado inactivo, i.e., um promotor que inclui apenas o núcleo TATA e, facultativamente, os elementos CCAAT (Fluhr et al., Science 232:1146-1112, 1986; Strittmatter and Chua, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 84:8986-8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225:65-71, 1991).
Promotores quiméricos ou híbridos de acordo com o presente invento podem incluir pelo menos um elemento cis, como sejam elementos que são regulados por numerosos factores ambientais tais como luz, calor ou pressão; elementos que são regulados ou induzidos por agentes 27 ΡΕ1240340 patogénicos ou químicos e similares. Tais elementos podem regular positivamente ou negativamente a expressão génica, dependendo das condições. Exemplos de elementos cis incluem, mas não estão limitados a elementos de resposta ao oxigénio (Cowen et al. , J. Biol. Chem. 268(36):26904, 1993), elementos regulados pela luz (ver por exemplo, Bruce and Quail, Plant Cell 2: 1081, 1990, and Bruce et al., EMBO J. 10:3015, 1991), um elemento cis de resposta ao tratamento com metiljasmonato (Beaudoin and Rothstein, Plant Mol. Biol. 33:835, 1997), elementos de resposta ao ácido salicílico (Strange et al., Plant J. 11:1315, 1997), elementos de resposta ao choque térmico (Pelham et al., Trends Genet. 1:31, 1985), elementos de resposta aos ferimentos e pressão abiótica (Loace et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89:9230, 1992; Mhiri et al., Plant Mol. Biol. 33:257, 1997), elementos de resposta ao frio (Baker et al., Plant Mol. Biol. 24:701, 1994; Jiang et al., Plant Mol. Biol. 30:679, 1996; Nordin et al., Plant Mol. Biol. 21:641, 1993; Zhou et al., J. Biol. Chem. 267:23515, 1992), e elementos de resposta à secura, (Yamaguchi et al., Plant Cell 6:251-264, 1994; Wang et al., Plant Mol. Biol. 28:605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant Science 2:48, 1997).
Os promotores híbridos podem ser projectados ou manipulados por uma série de métodos. Muitos promotores possuem sequências a montante que activam, estimulam ou definem a força e/ou especificidade do promotor (Atchison, Ann. Rev. Cell Biol. 4:127, 1988). Genes de T-DNA, por exemplo, possuem caixas "TATA" que definem o local de 28 ΡΕ1240340 iniciação da transcrição e outros elementos a montante localizados a montante do local de iniciação da transcrição modulam os niveis de transcrição (Gelvin, em: Transgenic
Plants (Kung, S. -D. and Us,R., eds, San Diego: Academic Press, pp.4 9-87, 1988). Um outro promotor quimérico combinou um trimero do activador da sintetase de octopina (ocs) com o activador mais promotor da sintetase de manopina (mas) e originou um aumento na expressão de um gene repórter (Min Ni et al., The Plant Journal 7:661, 1995). As sequências reguladoras a montante do presente invento podem ser usadas para a construção de tais promotores quiméricos ou hibridos. Métodos para a construção de promotores variantes do presente invento incluem mas não estão limitados à combinação de elementos de controlo de diferentes promotores ou duplicação de regiões de um promotor (ver por exemplo Patente U.S. 5110732 e Patente U.S. 5097025). Os familiarizados com a matéria conhecem as condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (e.g., moléculas de DNA, plasmideos, etc.), geração de organismos recombinantes e rastreio e isolamento de genes, (ver por exemplo Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: volume 1, Analyzing DNA, (1997), volume 2,
Detecting Genes, (1998), volume 3, Cloning Systems, (1999) volume 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, New
York). 29 ΡΕ1240340 A projecção, construção e utilização de promotores quiméricos ou hibridos compreendendo o elemento cis de SEQ ID NO: 12, para a modulação ou regulação da expressão de sequências de ácido nucleico operacionalmente ligadas estão também incluídas no presente invento. A sequência de promotor de SEQ ID NO: 28 é capaz de transcrever sequências de DNA operacionalmente ligadas em múltiplos tecidos e portanto pode selectivamente regular a expressão de genes em múltiplos tecidos.
Para uma série de caracteristicas agronómicas, a transcrição de um gene ou genes de interesse é desejável em múltiplos tecidos para conferir as caracteristicas pretendidas. É desejável dispor de promotores adequados que regulem a transcrição de genes operacionalmente ligados em tecidos alvo seleccionados com interesse, uma vez que pode não ser desejável expressar um gene em todos os tecidos, mas apenas em determinados tecidos. Por exemplo, caso se pretenda expressar selectivamente um gene alvo para expressão de genes de tolerância a herbicidas, pode-se pretender a expressão do gene de tolerância a herbicidas em tecidos vegetativos e reprodutivos. As sequências de promotor do presente invento são úteis para a regulação da expressão génica em múltiplos tecidos incluindo, mas não estando limitados a tecidos meristemáticos de crescimento rápido, tecidos reprodutores masculinos (androceu) como seja pólen, anteras e filamentos e tecidos reprodutores femininos (gineceu) como seja o estigma, estilete e 30 ΡΕ1240340 ovários, folhas, sépalas e pétalas. Os promotores do presente invento têm, assim, utilidade na expressão de genes de tolerância a herbicidas, por exemplo, sempre que seja pretendida tolerância em múltiplos tecidos e fases do desenvolvimento da planta. As sequências do promotor do presente invento têm utilidade na regulação da transcrição de qualquer gene alvo, incluindo mas não estando limitado a genes para o controlo de fertilidade, tolerância a insectos, tolerância a fungos, tolerância a herbicidas ou qualquer caracteristica desejável com interesse. Genes particularmente preferidos incluem genes de tolerância a herbicidas ou genes de tolerância a insectos.
Numa realização, os promotores do presente invento possuem utilidade particular para regulação da expressão de um gene de tolerância a herbicida em que se pretenda a expressão de um gene em múltiplos tecidos. Por exemplo, o gene de tolerância a herbicidas pode conferir tolerância ao herbicida glifosato. Exemplos de genes de tolerância ao glifosato adequados incluem, mas não estão limitados a genes da sintetase EPSP de resistência ao glifosato ou produtos de genes que degradam glifosato tais como, uma oxi-redutase do glifosato e N-acetil-transferase de fosfonato. É importante ter uma larga variedade de escolhas de elementos reguladores 5' para qualquer estratégia de biotecnologia vegetal, de forma a dispor-se de elementos reguladores adequados que sejam mais eficientes para o perfil de expressão pretendido. 31 ΡΕ1240340
Numa outra realização, os promotores do presente invento possuem utilidade na determinação da função de genes. A função de muitos genes é desconhecida e os promotores do presente invento podem ser usados como elementos genéticos numa construção para permitir uma avaliação fenotípica de um ou mais genes expressos numa orientação com sentido ou anti-sentido. Os promotores do presente invento podem ser componentes numa construção de expressão em plantas, desenvolvida para um ensaio de elevado número de amostras, em que são pretendidos niveis elevados de expressão génica em tecidos constitutivos e reprodutivos.
Qualquer planta pode ser seleccionada para a identificação de genes e sequências reguladoras. Exemplos de alvos vegetais adequados para o isolamento de genes e sequências reguladoras incluirão mas não estão limitados a alfafa, macieira, damasqueiro, Arabidopsis, alcachofra, rúcula, espargos, abacate, banana, centeio, feijoeiro, beterraba, amora, mirtilo, couve-brócolo, couves de bruxelas, couve, canola, meloa, cenoura, mandioca, ricino, couve-flor, aipo, cereja, chicória, coentro, citrinos, Clementinas, trevo, coco, café, milho, algodão, arando, pepino, abeto de Douglas, beringela, endivia, escarola, eucalipto, erva-doce, figueira, alho, abóbora, videira, toranja, melão, nabo mexicano, quivi, alface, alho francês, limão, lima, pinheiro do Arcansas, linhaça, manga, melão, cogumelo, nectarina, cevada, óleo de palma, óleo de colza, quiabo, azeitona, cebola, laranja, uma planta ornamental, 32 ΡΕ1240340 palma, papaia, salsa, nabo, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimento, dióspiro, pinheiro, ananás, banana, ameixa, romã, choupo, batata, abóbora, marmeleiro, pinheiro de Monterrey, chicória, colza, framboesa, arroz, centeio, sorgo, Southern pine, soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba, cana sacarina, girassol, batata-doce, liquidambar, tangerina, chá, tabaco, tomate, triticale, turfa, nabo, vinha, melancia, trigo, plantas de fibras e curgete. São plantas particularmente preferidas para a identificação de sequências reguladoras Arabidopsis, milho, trigo, soja e algodão.
As sequências de promotor do presente invento foram isoladas a partir do DNA da planta Arabidopsis thaliana. Numa realização preferida, uma construção inclui as sequências de promotor do presente invento operacionalmente ligadas a uma sequência susceptivel de ser transcrita juntamente com elementos terminadores e reguladores adequados. Tal construção pode ser usada para transformar uma planta alvo adequada com interesse. Qualquer planta pode ser usada como hospedeiro adequado para as construções de ácido nucleico compreendendo as sequências de promotor do presente invento. Exemplos de plantas alvo adequadas de interesse incluirão, mas não estão limitadas a alfafa, couve-brócolo, couve, canola, couve-flor, milho, algodão, arando, pepino, alface, ervilha, choupo, pinheiro, batateira, cebola, arroz, framboesa, soja, cana sacarina, beterraba, girassol, tomate e trigo. 33 ΡΕ1240340 Métodos de isolamento e modificação de promotores
Qualquer série de métodos pode ser usada para isolar fragmentos das sequências de promotor aqui descritas. Uma abordagem baseada em PCR pode ser usada para amplificar regiões flanqueantes de uma biblioteca genómica de uma planta, usando informação de sequências disponível ao público. Uma série de métodos é conhecida dos familiarizados com a área para amplificar sequências de DNA desconhecidas adjacentes a uma região nuclear de sequência conhecida. Os métodos incluem mas não estão limitados a PCR inverso (IPCR), PCR sistema Vectorette, PCR em forma de Y e abordagens de andamento pelo genoma. Para o presente invento, as moléculas de ácido nucleico foram isoladas a partir de Arabidopsis desenhando sequências iniciadoras para PCR com base na informação de sequências disponível.
Os fragmentos de ácido nucleico podem também ser obtidos por outras técnicas tais como síntese directa do fragmento por meios químicos, como é vulgarmente praticado usando um sintetizador automático de oligonucleótidos. Os fragmentos podem também ser obtidos através da aplicação de tecnologia de reprodução de ácidos nucleicos, como seja a tecnologia de PCR (reacção em cadeia da polimerase), por técnicas de DNA recombinante conhecidas, de um modo geral, dos familiarizados com a área da biologia molecular. Relativamente à amplificação de uma sequência de ácido nucleico alvo (e.g. por PCR) usando um par de sequências iniciadoras de amplificação particular, "condições de PCR 34 ΡΕ1240340 restringentes" refere-se a condições que permitem que o par de sequências iniciadoras hibride apenas com a sequência de ácido nucleico alvo a que uma sequência iniciadora tendo a correspondente sequência selvagem (ou o seu complemento) se ligará e de preferência produzirá um único produto de amplificação.
Os familiarizados com a matéria conhecem os métodos para a preparação de DNA genómico vegetal. Numa abordagem, podem ser preparadas bibliotecas de DNA genómico a partir de uma espécie escolhida através da digestão parcial com uma enzima de restrição e selecção pelo tamanho de fragmentos de DNA com uma gama de tamanhos particular. O DNA genómico pode ser clonado numa construção adequada, incluindo mas não estando limitado a um bacteriófago, e preparado usando uma construção adequada, como seja um bacteriófago, usando um kit de clonagem adequado comercializado por uma série de vendedores (ver por exemplo Stratagene, La Jolla CA or Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
Para além da sua utilização na modulação da expressão genética, as sequências de promotor do presente invento também são úteis como sondas ou sequências iniciadoras em experiências de hibridação de ácidos nucleicos. As sondas e sequências iniciadoras de ácido nucleico do presente invento podem hibridar em condições restringentes com uma sequência de DNA alvo. 0 termo "condições de hibridação restringentes" é definido como condições sob as quais uma sonda ou sequência iniciadora 35 ΡΕ1240340 híbrida especificamente com uma sequência alvo e não com sequências não alvo, como pode ser determinado empiricamente. 0 termo "condições restringentes" é funcionalmente definido relativamente à hibridação de uma sonda de ácido nucleico com um ácido nucleico alvo (i.e., com uma sequência de ácido nucleico particular de interesse) através do procedimento de hibridação específica (ver por exemplo Sambrook et al., 1989, at 9.52-9.55,
Sambrook et al., 1989 at 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa,
Nucl. Acids Res. 12:203-213, 1984; e Wetmur and Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968). Condições de restringência adequadas que promovem a hibridação de DNA são, por exemplo, cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) 6,0X a cerca de 45°C, seguido de uma lavagem com SSC 2,0X a 50°C, sendo conhecidas dos familiarizados com a matéria ou podendo ser encontrados em manuais de laboratório, incluindo mas não estando limitado a Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-
6.3.6. Por exemplo, a concentração de sal no passo de lavagem pode ser seleccionada de uma restringência baixa de aproximadamente 2,0X SSC a 50°C até uma restringência elevada de aproximadamente 0,2X SSC a 50°C. Ainda, a temperatura no passo de lavagem pode ser aumentada de condições de restringência baixa à temperatura ambiente, cerca de 22°C, até condições de restringência elevada a cerca de 65°C. Tanto a temperatura como o sal podem variar ou a concentração de sal pode ser mantida constante enquanto a outra variável é alterada. Por exemplo, a hibridação usando sondas ou sequências iniciadoras de DNA 36 ΡΕ1240340 ou de RNA pode ser realizada a 65°C em SSC 6X, 0,5% SDS, solução de Denhardt 5X, 100 yg/ml de DNA não específico (e.g., DNA de esperma de salmão sonicado) com lavagem em SSC 0,5X, 0,5% SDS a 65°C, para elevada restringência.
Uma molécula de ácido nucleico é referida como sendo o "complemento" de outra molécula de ácido nucleico se apresentar complementaridade completa. Como aqui usado, as moléculas são referidas como apresentando "complementaridade completa" quando todos os nucleótidos de uma das moléculas são complementares dos nucleótidos da outra. Duas moléculas são referidas como sendo "minimamente complementares" se puderem hibridar uma com a outra com estabilidade suficiente para lhes permitir manterem-se emparelhadas uma com a outra pelo menos em condições convencionais de "restringência baixa". De modo semelhante, as moléculas são referidas como sendo "complementares" se hibridarem uma com a outra com estabilidade suficiente para lhes permitir permanecerem emparelhadas uma com a outra em condições convencionais de "elevada restringência". Considera-se que as condições de hibridação de baixa restringência, tais como temperaturas de hibridação e/ou lavagem baixas, podem ser usadas para identificar sequências relacionadas tendo um grau mais baixo de similaridade de sequências se a especificidade de ligação da sonda ou da sequência iniciadora com a sequência alvo for preservada. Assim, as sequências nucleotidicas do presente invento podem ser usadas pela sua capacidade para selectivamente formar moléculas de cadeia dupla com 37 ΡΕ1240340 segmentos complementares de fragmentos de DNA. A detecção de segmentos de DNA via hibridação é conhecida dos familiarizados com a matéria e assim, dependendo da aplicação pretendida, desejar-se-á empregar condições de hibridação diversas para se conseguir graus variáveis de selectividade da sonda para a sequência alvo e o método de eleição dependerá dos resultados pretendidos. Condições de restringência convencionais estão descritas em Sambrook, et al.r Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, and by Haymes et al., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985. A sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:12, ou um seu fragmento, região, elemento cis ou oligómero destas sequências, foram usados em ensaios de hibridação de outros tecidos vegetais para identificar genes estreitamente relacionados ou homólogos e sequências reguladoras associadas. Estas incluem mas não estão limitadas a ensaios de hibridação Southern ou Northern em qualquer substrato, incluindo mas não estando limitado a um tecido vegetal adequadamente preparado, celulose, nylon ou combinação de filtros, transístores ou lâmina de vidro. Tais metodologias são conhecidas na área e estão disponíveis num kit ou preparação que pode ser fornecida comercialmente.
Um fragmento de um ácido nucleico como aqui usado é uma porção do ácido nucleico de tamanho inferior ao tamanho integral. Por exemplo, para o presente invento 38 ΡΕ1240340 qualquer comprimento da sequência nucleotídica que seja inferior ao das sequências nucleotídicas descritas de SEQ ID NO:12, é considerado como um fragmento. Um fragmento pode também compreender pelo menos um comprimento mínimo capaz de hibridar especificamente com um ácido nucleico nativo em condições de hibridação restringentes como definido atrás. 0 comprimento de cada fragmento mínimo é de preferência pelo menos 8 nucleótidos, mais de preferência 15 nucleótidos, mesmo mais de preferência pelo menos 20 nucleótidos e mais de preferência pelo menos 30 nucleótidos de uma sequência de ácido nucleico nativa.
Uma "sonda" é um ácido nucleico isolado a que se liga uma marca detectável convencional ou molécula repórter, e.g., um isótopo radioactivo, ligando, agente quimioluminescente ou enzima. "Sequências iniciadoras" são ácidos nucleicos isolados que são emparelhadas com uma cadeia de DNA alvo complementar através de hibridação de ácido nucleico para formar um híbrido entre a sequência iniciadora e a cadeia de DNA alvo, depois prolongada ao longo da cadeia de DNA alvo por uma polimerase, e.g., uma DNA-polimerase. Os pares de sequências iniciadoras podem ser usados para amplificação de uma sequência de ácido nucleico, e.g., através da reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou de outros métodos convencionais de amplificação de ácidos nucleicos.
As sondas e sequências de ácido nucleico têm, de um modo geral, 11 nucleótidos ou mais de comprimento, de 39 ΡΕ1240340 preferência 18 nucleótidos ou mais, mais de preferência 25 nucleótidos e mais de preferência 30 nucleótidos ou mais. Tais sondas e sequências iniciadoras hibridam especificamente com uma sequência de DNA ou RNA alvo em condições de hibridação de restringência elevada e hibridam especificamente com uma sequência nativa alvo de uma outra espécie em condições de restringência mais baixa. De preferência, as sondas e sequências iniciadoras de acordo com o presente invento possuem similaridade de sequências completa com a sequência nativa, apesar das sondas diferirem da sequência nativa e de reterem a capacidade de hibridar com sequências alvo nativas, podem ser projectadas por métodos convencionais. Métodos para a preparação e utilização de sondas e sequências iniciadoras estão descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (daqui em diante "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (com actualizações periódicas) (daqui em diante, "Ausubel et al., 1992); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to
Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Os pares de sequências iniciadoras para PCR podem ser preparados a partir de uma sequência conhecida, por exemplo, através da utilização de programas informáticos destinados a esse fim, como sejam Primer (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). As sequências iniciadoras e sondas baseadas 40 ΡΕ1240340 nas sequências nativas de promotores aqui descritos podem ser usadas para confirmar e, se necessário, modificar as sequências descritas por métodos convencionais, e.g., através da reclonagem e da re-sequenciação.
Construções e construções de expressão Ácidos nucleicos nativos ou sintéticos de acordo com o presente invento podem ser incorporados em construções de ácido nucleico recombinantes, tipicamente construções de DNA, susceptiveis de serem introduzidas e replicadas numa célula hospedeira. Numa realização preferida, a sequência nucleotidica do presente invento como mostrada em SEQ ID NO:28 é incorporada numa cassete de expressão que inclui as regiões de promotor do presente invento operacionalmente ligadas a um componente genético, como seja um gene seleccionável, detectável ou uma marca quantificável.
Numa outra realização, as sequências de ácido nucleico descritas no presente invento como se mostra em SEQ ID NO:28, estão operacionalmente ligadas a um componente genético, como seja um ácido nucleico que confere uma característica desejável associada a morfologia, fisiologia, crescimento e desenvolvimento da planta, rendimento, aumento do teor nutritivo, resistência a doença ou a pragas, ou tolerância ambiental ou química. Estes componentes genéticos tais como genes marcadores ou genes de interesse agronómico podem funcionar na 41 ΡΕ1240340 identificação de uma célula vegetal ou planta transformada ou de um produto de utilidade agronómica.
Numa outra realização, um componente genético produz um produto que serve como sistema de selecção e funciona num tecido vegetal regenerável para produzir um composto que conferirá ao tecido vegetal resistência a um composto que, de outra forma, seria tóxico. Os genes de interesse para usar como marca seleccionável, detectável ou quantificável incluirão mas não estão limitados a GUS (sequência codificadora da beta-glucuronidase), GFP (sequência codificadora da proteina fluorescente verde), LUX (gene codificador da luciferase), genes de marcas de resistência a antibióticos ou genes de tolerância a herbicidas. Exemplos de transposões e de genes de resistência a antibióticos associados incluem os transposões Tns (bla), Tn5 (nptII ) , Tn7 (dhfr ) , penicilinas, canamicina e (neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (e trimetoprim); cloranfenicol; canamicina e tetraciclina.
As caracteristicas úteis para marcas seleccionáveis em plantas foram descritas numa publicação sobre o uso de microrganismos (Advisory Committee on Novel Foods and Processes, Julho 1994). Estas incluem a selecção restringente com um número minimo de tecidos transformados, grandes números de eventos de transformação independente sem interferência significativa com a regeneração, aplicação a um grande número de espécies e disponibilidade 42 ΡΕ1240340 de um ensaio para classificar os tecidos relativamente à presença da marca.
Na área é conhecida uma série de genes marcadores seleccionáveis e várias marcas de resistência a antibióticos satisfazem estes critérios, incluindo as de resistência à canamicina (nptll), higromicina B (aph IV) e gentamicina (aac3 e aacC4). Genes de marcas seleccionáveis dominantes úteis incluem genes codificadores de genes de resistência a antibióticos (e.g., resistência a higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina ou espectinomicina); e genes de resistência a herbicidas (e.g., acetiltransferase de fosfinotricina). Uma estratégia útil para a selecção de transformantes relativamente à resistência a herbicidas está descrita, e.g., em Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984. Genes de marcas seleccionáveis particularmente preferidos para usar no presente invento serão genes que confiram resistência a compostos tais como antibióticos, como sejam canamicina, e herbicidas tipo glifosato (Della-Cioppa et al., Bio/Technology 5(6), 1987, Patente U.S. 5,463,175, Patente U.S. 5,633,435). Outros sistemas de selecção podem ser igualmente implementados e ainda estarão dentro do âmbito do presente invento.
Para a realização do presente invento, são empregues composições e métodos convencionais para a preparação e utilização de construções de DNA e células 43 ΡΕ1240340 hospedeiras, como discutido, inter alia, em Sambrook et al.r 1989. Numa realização preferida, a célula hospedeira é uma célula vegetal. Uma série de construções de DNA adequadas para a transfecção estável de células vegetais ou para o estabelecimento de plantas transgénicas foi descrita em, e.g., Powels et ai., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987); Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990; e R.R.D. Croy Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. As construções de expressão em plantas podem incluir, por exemplo, um ou mais genes vegetais clonados sob o controlo transcricional de sequências reguladoras 5' e 3' . Podem também incluir uma marca seleccionável como descrito para seleccionar as células hospedeiras contendo a construção de expressão. Tais construções de expressão em plantas também possuem uma região reguladora de promotor (e.g., uma região reguladora que controla a expressão induzível ou constitutiva, regulada pelo ambiente ou pelo desenvolvimento ou especifica de célula ou tecido) , um local de iniciação da transcrição, um local de ligação ao ribossoma, um sinal de processamento de RNA, um local de terminação da transcrição e um sinal de poliadenilação. Outras sequências de origem bacteriana são igualmente incluídas para permitir que a construção seja clonada num hospedeiro bacteriano. Tipicamente, a construção conterá também uma origem de replicação procariótica de gama larga de hospedeiros. Numa realização particularmente preferida, a célula hospedeira é 44 ΡΕ1240340 uma célula vegetal e a construção para a expressão em plantas compreende uma região de promotor como discutido em SEQ ID NO:28; uma sequência susceptivel de ser transcrita operacionalmente ligada; e uma sequência de terminação da transcrição. Outras sequências reguladoras consideradas como componentes genéticos numa construção de expressão incluem mas não estão limitados a uma sequência lider não traduzida que pode estar acoplada ao promotor. Numa realização particularmente preferida, a célula hospedeira é uma célula vegetal e a construção para expressão em plantas compreende uma região do promotor como descrita em SEQ ID NO:28 uma sequência susceptivel de ser transcrita operacionalmente ligada; e uma sequência de terminação da transcrição. As construções para a expressão em plantas podem igualmente compreender sequências adicionais, incluindo mas não estando limitado a sequências de poli-adaptador que possuem locais para enzimas de restrição úteis para fins de clonagem.
Elementos genéticos em construções de expressão para plantas
As construções de expressão em plantas podem incluir mais de uma sequência de genes expressáveis, cada uma operacionalmente ligada a um promotor diferente. Uma série de promotores tem utilidade para a expressão de genes em plantas para qualquer gene de interesse incluindo mas não estando limitado a marcas seleccionáveis, genes de tolerância a pragas, tolerância a doenças, melhoria do teor 45 ΡΕ1240340 nutritivo, e qualquer outro gene com interesse agronómico. Exemplos de promotores constitutivos úteis para a expressão de genes vegetais incluem mas não estão limitados ao promotor P-35S do virus do mosaico da couve-flor (CaMV), o qual confere elevado nível de expressão constitutiva na maioria dos tecidos de plantas (ver, e.g., Odel et al., Nature 313:810, 1985), incluindo monocotiledóneas (ver, e.g., Dekeyser et al., Plant Cell 2:591, 1990; Terada e Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220:389, 1990); um promotor 35S estimulado (P-e35S) compreendendo uma sequência estimuladora 35S de CaMV duplicada em tandem; o promotor da sintetase de nopalina (An et al., Plant Physiol. 88:547, 1988); o promotor da sintetase de octopina (Fromm et al., Plant Cell 1:977, 1989); e o promotor do vírus do mosaico de escrofulária (P-FMV) como descrito nas Patentes U.S. N° 5378619 e uma versão estimulada (P-eFMV) derivada da sequência do promotor de P-FMV; o promotor 19S do vírus da couve-flor; um promotor do vírus baciliforme da cana sacarina; um promotor do vírus do marmoreado amarelo da comelina; e outros promotores de vírus de DNA das plantas conhecidos por se expressarem em células vegetais.
Uma variedade de promotores de genes vegetais que são regulados em resposta a sinais ambientais, hormonais, químicos e/ou de desenvolvimento podem ser usados para a expressão de um gene operacionalmente ligado em células vegetais, incluindo promotores regulados por (1) calor Callis et al., Plant Physiol. 88:965, 1988), (2) luz (e.g., promotor da ervilheira rbcS-3A, Kuhlemeier et al., Plant 46 ΡΕ1240340
Cell 1:471, 1989; promotor rbcS do milho, Schaffner and Sheen, Plant Cell 3:997, 1991; ou promotor da proteína de ligação à clorofila a/b, Simpson et al., EMBO J. 4:2723, 1985), (3) hormonas, tais como ácido absissico (Marcotte et al., Plant Cell 1:969, 1989), (4) ferimento (e.g., wunl, Siebertz et al., Plant Cell 1:961, 1989); ou (5) produtos quimicos tais como jasmonato de metilo, ácido salicilico, ou protector. Pode ser também vantajoso empregar (6) promotores específicos de órgãos (e.g., Roshal et al., EMBO J. 6:1155, 1987; Schernthaner et al., EMBO J. 7:1249, 1988; Bustos et al., Plant Cell 1:839, 1989).
Os promotores do presente invento são promotores vegetais que são capazes de transcrever sequências de DNA operacionalmente ligadas em tecido meristemático de crescimento rápido e em tecidos reprodutores e podem ser operacionalmente ligados a qualquer gene de interesse numa construção de expressão.
As construções de expressão em plantas podem incluir sinais de processamento de RNA, e.g., intrões, os quais podem estar posicionados a montante ou a jusante de uma sequência codificadora de polipéptido no transgene. Ainda, as construções de expressão podem incluir sequências reguladoras adicionais da região 3' não traduzida de genes vegetais (Thomburg et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:744 (1987); An et ai., Plant Cell 1:115 (1989), e.g., uma região de terminador para aumentar a estabilidade do mRNA, como seja a região do terminador PI-II das regiões 47 ΡΕ1240340 terminadoras 3' da sintetase de ocotpina ou de nopalina da batateira. As regiões não traduzidas 5' de um mRNA podem desempenhar um papel importante na iniciação da tradução e podem ser também um componente genético numa construção para expressão em plantas. Por exemplo, foi demonstrado que as sequências lider 5' não traduzidas derivadas de genes das proteínas de choque térmico estimulam a expressão de genes em plantas (ver, por exemplo a Patente U.S. 5362865) . Estas sequências reguladoras adicionais a montante e a jusante podem derivar de uma fonte que é nativa ou heteróloga relativamente a outros elementos presentes na construção para expressão.
As sequências de promotor do presente invento são usadas para controlar a expressão de genes em células vegetais. As sequências de promotor descritas são componentes genéticos que são parte de construções usadas na transformação de plantas. As sequências do promotor do presente invento podem ser usadas com qualquer plasmídeo ou construção adequada para a transformação de plantas, contendo uma marca seleccionável ou detectável e elementos reguladores associados, como descrito, juntamente com um ou mais ácidos nucleicos expressos de forma suficiente para conferir uma característica particular desejável. Exemplos de genes estruturais adequados com interesse agronómico considerados no presente invento incluirão mas não estão limitados a um ou mais genes para a tolerância a insectos, como seja um gene de Bacillus thuringiensis (B.t.), tolerância a pragas como sejam os genes para controlo de 48 ΡΕ1240340 doenças fúngicas, tolerância a herbicidas tais como os genes que conferem tolerância ao glifosato e genes para melhorar qualidades tais como rendimento, aumento do teor nutritivo, tolerâncias ambientais ou à pressão, ou quaisquer alterações desejáveis na fisiologia, crescimento, desenvolvimento, morfologia ou produtos da planta. Por exemplo, os genes estruturais incluirão qualquer gene que confira tolerância a insectos, incluindo mas não estando limitados a um gene de Bacillus que controla insectos como descrito em W09931248, Patente U.S. N° 5689052, Patentes U.S. Nos 5500365 e 5880275. Numa outra realização, o gene estrutural pode conferir tolerância ao herbicida glifosato conforme conferido por genes incluindo mas não estando limitados ao gene EPSP de resistência ao glifosato de Agrobacterium estirpe CP4 (aroA:CP4) como descrito na Patente U.S. 5633435 ou gene da oxi-redutase do glifosato (GOX) como descrito na Patente U.S. N° 5463175.
Como alternativa, as sequências de DNA codificadoras podem originar estes fenótipos através da codificação de uma molécula de RNA não susceptível de ser traduzida que faz com que haja inibição dirigida da expressão de um gene endógeno, por exemplo através de mecanismos mediados por sequências complementares ou por supressão (ver, por exemplo, Bird et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9:207,1991). O RNA pode também ser uma molécula de RNA catalítico (i.e., uma ribozima) manipulada para cortar um produto de mRNA endógeno pretendido (ver por exemplo, Gibson and Shillitoe, Mol. Biotech. 7:125,1997). 49 ΡΕ1240340
Assim, qualquer gene que produza uma proteína ou mRNA que expresse uma alteração de fenótipo ou morfologia com interesse é útil para a realização do presente invento.
Para além de elementos reguladores ou de sequências situadas a montante (5') ou dentro de uma sequência de DNA, existem sequências a jusante (3' ) que afectam a expressão dos genes. Assim, o termo sequência reguladora como aqui usado refere-se a qualquer sequência nucleotídica situada a montante, dentro ou a jusante de uma sequência de DNA que controla, medeia ou afecta a expressão de um produto de gene conjuntamente com o sistema de síntese proteica da célula.
Os familiarizados com a área conhecem as construções adequadas para a transformação de plantas. As sequências de promotor do presente invento são, de preferência, incorporadas numa construção de expressão usando marcas detectáveis ou quantificáveis como descrito e testado em análises transitórias para proporcionar uma indicação da expressão dos genes nas plantas transformadas. Os métodos para testar a expressão de genes em ensaios transitórios são conhecidos dos familiarizados com a matéria. A expressão transitória de genes de marcas foi descrita usando uma variedade de plantas, tecidos e sistemas de entrega de DNA. Por exemplo, tipos de análises transitórias podem incluir mas não estão limitados a entrega directa de genes via electroporação ou bombardeamento de tecidos com partículas em qualquer ensaio 50 ΡΕ1240340 transitório com plantas usando quaisquer espécies de plantas com interesse. Tais sistemas transitórios incluirão mas não estão limitados a protoplastos de culturas em suspensão de triqo (Zhou et al., Plant Cell Reports 12:612. 1993), electroporação de protoplastos da folha de triqo (Sethi et al., J. Crop Sei. 52: 152, 1983); electroporação de protoplastos preparados a partir de tecido de milho (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) ou bombardeamento com partículas de tecidos específicos com interesse. 0 presente invento enqloba a utilização de qualquer sistema de expressão transitório para avaliar sequências reguladoras operacionalmente ligadas a genes repórter seleccionados, genes de marcas ou gene com interesse agronómico. Exemplos de tecidos de plantas considerados para testar em ensaios transitórios através de um sistema de entrega adequado incluirão mas não estão limitados a tecidos da base das folhas, calos, cotilédones, raízes, endosperma, embriões, tecido floral, pólen e tecido epidérmico.
Qualquer marca quantificável ou detectável pode ser usada num ensaio transitório. Os genes de marcas preferidos para as análises transitórias dos promotores ou das sequências reguladoras 5' do presente invento incluem um gene de β-glucuronidase (GUS) ou um gene de uma proteína fluorescente verde (GFP). As construções de expressão contendo as sequências reguladoras 5' operacionalmente ligadas a um gene de marca são entregues nos tecidos e os tecidos são analisados pelo mecanismo adequado, dependendo 51 ΡΕ1240340 da marca. As análises quantitativas ou qualitativas são usadas como ferramenta para avaliar o potencial perfil de expressão das sequências reguladoras 5' quando operacionalmente ligadas a genes de interesse agronómico em plantas estáveis. Finalmente, as sequências reguladoras 5' do presente invento são directamente incorporadas em construções adequadas de transformação de plantas para expressão compreendendo as sequências reguladoras 5' operacionalmente ligadas a uma sequência de DNA com interesse susceptivel de ser transcrita, usada para transformar plantas e as plantas estavelmente transformadas e a sua progénie analisadas relativamente ao perfil de expressão pretendido conferido pelas sequências reguladoras 5' .
As construções de expressão adequadas para introdução de DNA exógeno em células vegetais incluirão mas não estão limitadas a plasmídeo T sem braços para os métodos mediados por Agrobacterium. Estas construções podem conter uma marca de resistência, 1-2 fronteiras de T-DNA e origens de replicação para E. coli e Agrobacterium juntamente com um ou mais genes de interesse e regiões reguladoras associadas. Os familiarizados com a área sabem que para as abordagens mediadas por Agrobacterium existem uma série de estirpes e métodos. Tais estirpes incluirão mas não estão limitados a Agrobacterium estirpes C58, LBA4404, EHA101 e EHA105. São particularmente preferidas as estirpes de Agrobacterium tumefaciens. 52 ΡΕ1240340
Exemplos de ácidos nucleicos que podem ser introduzidos pelos métodos abrangidos pelo presente invento incluem, por exemplo, sequências ou genes de DNA derivados de outras espécies, ou mesmo genes ou sequências que derivam ou estão presentes nas mesmas espécies, mas que são incorporados em células recipientes através de métodos de engenharia genética em vez das técnicas de reprodução ou de cruzamento clássicas. No entanto, o termo "exógeno" destina-se também a referir genes que não estejam normalmente presentes na célula a ser transformada ou talvez simplesmente não presentes na forma, estrutura, etc., como encontrado no segmento de DNA ou gene transformante, ou genes que estão normalmente presentes e que se pretende expressar numa forma que difere do padrão de expressão natural, e.g., para sobre-expressão. Assim, o termo gene ou DNA "exógeno" destina-se a referir qualquer gene ou segmento de DNA que seja introduzido numa célula recipiente, independentemente de um gene semelhante poder já estar presente nessa célula. 0 tipo de DNA incluído no DNA exógeno pode incluir DNA que já esteja presente na célula vegetal, DNA de uma outra planta, DNA de um organismo diferente ou um DNA gerado externamente, como seja uma sequência de DNA contendo uma mensagem complementar da sequência codificadora de um gene, ou uma sequência de DNA codificadora de uma versão sintética ou modificada de um gene.
As construções de transformação de plantas contendo as sequências de promotor do presente invento 53 ΡΕ1240340 podem se introduzidas em plantas através de qualquer método adequado de transformação de plantas. Existem vários métodos para a introdução de sequências de DNA em células vegetais e são conhecidos na área. Métodos adequados incluem mas não estão limitados a infecção bacteriana (e.g., com Agrobacterium como descrito atrás), construções binárias de cromossomas bacterianos artificiais, entrega directa de DNA (e.g. através de transformação mediada por PEG, internalização de DNA mediada por desidratação/inibição, electroporação, agitação com fibras de carboneto de silicio) e aceleração de partículas revestidas com DNA (revisto em Potrykus, Ann. Ver. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42:205, 1991).
Os métodos para transformar especificamente dicotiledóneas usam essencialmente Agrobacterium tumefaciens. Por exemplo, as plantas transgénicas descritas incluem mas não estão limitadas a algodoeiro Patente U.S. No. 5,004,863; Patente U.S. No. 5,159,135; Patente U.S. No. 5,518,908, WO 97/43430), soja (Patent U.S. No. 5,569,834; Patente U.S. No. 5,416,011; McCabe et al., Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou et ai., Plant Physiol., 87:671, 1988); Brassica (Patente U.S. No. 5,463,174) e amendoim (Cheng et ai., Plant Cell Rep., 15: 653, 1996). Métodos semelhantes foram descritos na transformação de monocotiledóneas. A transformação e a regeneração de plantas usando estes métodos foram descritos para uma série de culturas, incluindo mas não estando 54 ΡΕ1240340 limitado a espargos (Asparagus officinalis; Bytebier et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U'.A., 84: 5345, 1987); cevada (Hordeum vulgarae; Wan and Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); milho (Zea mays; Rhodes, C.A., et ai., Science, 240: 204, 1988; Gordon-Kamm, et ai., Plant Cell, 2: 603, 1990;
Fromm, et ai., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, et ai., Bio/Technology, 11: 194, 1993); aveia (Avena sativa;
Somers, et ai., Bio/Technology, 10: 1589, 1992); orchardgrass (Dactylis glomerata; Horn, et ai., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); arroz (Oryza sativa, includindo as variedades indica e japonica, Toriyama, et ai., Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, et al., Plant Cell
Rep., 7: 379, 1988; Luo and Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang and Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, et al., Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor; Casas, A.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 90: 11212, 1993); cana sacarina (Saccharum spp.; Bower and Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuca alta (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. et al.,
Bio/Technology, 10: 691, 1992); relva (Agrostis palustris;
Zhong et al., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); trigo (Triticum aestivum; Vasil et ai., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T., et ai., Plant Physiol., 102: 1077, 1993;
Becker, et ai., Plant, J. 5: 299, 1994) e alfafa (Masoud, S.A., et al., Transgen. Res., 5: 313, 1996). É aparente para os familiarizados com a área que podem ser usadas e modificadas várias metodologias de transformação para a produção de plantas transgénicas estáveis derivadas de qualquer uma de uma variedade de culturas alvo com 55 ΡΕ1240340 interesse . Métodos de análise de plantas
As plantas transformadas são analisadas relativamente à presença de genes com interesse e ao nivel e/ou perfil de expressão conferido pelas sequências de promotor do presente invento. Os familiarizados com a matéria conhecem vários métodos disponíveis para a análise de plantas transformadas. Vários métodos são usados para avaliar a expressão de genes e determinar se os genes introduzidos estão integrados, se funcionam adequadamente e se são herdados conforme esperado. Para o presente invento os promotores podem ser avaliados através da determinação dos níveis de expressão de genes a que os promotores estejam operacionalmente ligados. Uma avaliação preliminar da função do promotor pode ser determinada através de um método de ensaio transitório usando genes repórter, mas uma avaliação do promotor mais definitiva pode ser determinada a partir da análise de plantas estáveis. Métodos para a análise de plantas incluem mas não estão limitados a transferências Southern ou transferências Northern, abordagens baseadas em PCR, análises bioquímicas, métodos de rastreio fenotípico, avaliação de campo e ensaios de imunodiagnóstico.
Os métodos do presente invento, incluindo mas não estando limitados a tecnologias de PCR, isolamento de DNA genómico, construção de construções de expressão, ensaios 56 ΡΕ1240340 transitórios e métodos de transformação de plantas, são bem conhecidos dos familiarizados com a matéria e são realizados usando técnicas convencionais ou modificações das mesmas.
Testes de aspersão com glifosato
Numa realização foi efectuada uma avaliação em estufa ou no campo para a tolerância ao glifosato. 0 termo "glifosato" foi aqui usado para referir colectivamente o herbicida parental N-fosfonometilglicina (também conhecido como ácido glifosato) , um sal ou éster do mesmo, ou um composto que é convertido em N-fosfonometilglicina em tecidos vegetais ou que de outra forma proporciona N-fosfonometilglicina na forma iónica (também conhecido com ião glifosato) . Para fins ilustrativos, os sais de glifosato solúveis em água, úteis aqui, estão descritos nas Patentes U.S. No. 3799758 e No. 4405531 de Franz, cuja descrição é aqui incluída como referência. Os sais de glifosato que podem ser usados de acordo com o presente incluem nas não estão restringidos a metais alcalinos, por exemplo sais de sódio e potássio; sal de amónio; sais de alquilamónio Ci-ιβ, por exemplo de dimetilamónio e de isopropilamónio; sal de alcanoilamónio Ci-ιβ, por exemplo sal de monoetanolamónio; sais de alquilsulfónio Ci_i6, por exemplo trimetilsulfónio; misturas dos mesmos e similares. A molécula de ácido glifosato tem três locais acídicos com diferentes valores de pKa; assim, podem ser usados sais mono-, di- e tribásicos, ou qualquer mistura dos mesmos, ou 57 ΡΕ1240340 sais de qualquer nível intermédio de neutralização.
Os sais de glifosato são importantes em termos comerciais, em parte devido a serem solúveis em água. Muitos sais de amónio, alquilamónio, alcanoilamónio, alquilsulfónio e de metais alcalinos são altamente solúveis em água, permitindo a formulação como soluções aquosas altamente concentradas que podem ser diluídas em água na altura de usar.
Tais soluções aquosas concentradas podem conter cerca de 50 a cerca de 500 gramas por litro de glifosato, expresso como equivalente ácido (g a.c./l). Concentrações de glifosato mais elevadas, por exemplo cerca de 300 a cerca de 500 g a.e./l, são as preferidas.
Os sais de glifosato são, em alternativa, formulados como composições solúveis em água ou dispersáveis em água, por exemplo na forma de pós, grânulos, pastilhas ou comprimidos. Tais composições são frequentemente conhecidas como formulações secas, ainda que o termo "seco" não deva ser entendido neste contexto como implicando ausência completa de água. Tipicamente, as formulações secas possuem menos de aproximadamente 5% por peso de água, por exemplo cerca de 0,5% a cerca de 2% por peso de água. Tais formulações destinam-se à dissolução ou dispersão em água quando da utilização.
As formulações secas de glifosato consideradas 58 ΡΕ1240340 podem conter cerca de 5% a cerca de 80% por peso de glifosato, expresso como equivalente ácido (%a.e.)· São preferidas as concentrações mais elevadas de glifosato dentro da gama atrás referida, por exemplo cerca de 50% a cerca de 80% a.e. Sais de glifosato especialmente úteis pata a preparação de formulações secas são os sais de sódio e amónio.
As composições para tratamento de plantas e composições concentradas, liquidas e secas, do invento podem facultativamente conter um ou mais ingredientes excipientes. Ingredientes excipientes especialmente úteis para as composições de glifosato são os tensioactivos, os quais ajudam na retenção de soluções aquosas para aspersão sobre as superfícies relativamente hidrofóbicas das folhas das plantas, assim como ajudam o glifosato a penetrar na camada cerosa (cutícula) da folha e assim contactar os tecidos vivos dentro da folha. Os tensioactivos podem igualmente desempenhar outras funções úteis. Não existe restrição no tipo ou classe química do tensioactivo que pode ser usado nas composições de glifosato do invento. Tipos não iónicos, aniónicos, catiónicos e anfotéricos, ou combinações de mais de um destes tipos, são todos úteis em situações particulares. No entanto, é geralmente preferido que pelo menos um dos tensioactivos se estiver presente não seja aniónico, i.e., pelo menos um dos tensioactivos deverá ser não iónico, catiónico ou anfotérico. 59 ΡΕ1240340
Muitos tensioactivos úteis aqui possuem uma estrutura quimica que compreende um ou mais grupos cada um deles consistindo numa única unidade de óxido de alquileno C2-4 ou uma cadeia polimerizada ou copolimerizada de unidades de óxido de alquileno C2-4. Tais tensioactivos são referidos como tensioactivos de polioxialquileno e incluem tipos não iónicos, aniónicos, catiónicos e anfotéricos. Tensioactivos polioxietilenos úteis nas composições presentemente consideradas possuem cerca de 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4. Nos tensioactivos de polioxialquilenos preferidos, as unidades de óxido de alquileno formam uma ou mais cadeias de óxido de etileno ou de óxido de etileno e de óxido de propileno copolimerizadas, cada cadeia de unidades de óxido de alquileno tendo um grupo hidrido ou uma protecção de alquilo C1-4 ou de alcanoilo Cl-4 no extremo.
Os grupos hidrofóbicos de tensioactivos úteis nas composições do invento podem ser essencialmente baseados em hidricarbonetos, neste caso os grupos hidrofóbicos são tipicamente cadeias de aquilo, alcenilo, alquilarilo, alcanoilo ou alcenoilo 08-24, de preferência C12-18· Estas cadeias podem ser lineares ou ramificadas. Como alternativa, os grupos hidrofóbicos podem conter átomos de silicone, por exemplo na forma de grupos siloxano tais como heptametiltrisiloxano ou átomos de flúor, por exemplo como cadeias de alquilo parcialmente fluoradas ou de perfluoroalquilo. 60 ΡΕ1240340
Entre os tensioactivos não iónicos, classes especialmente preferidas incluem polioxietileno alquilo, alcenilo ou éteres de alquilarilo, tais como álcoois etoxilados primários ou secundários ou alquilfenóis, ésteres de alquilo ou de alcenilo de polioxietileno, tais como ácidos gordos etoxilados, ésteres de de alquilo de polioxietileno sorbitano, ésteres de glicerilalquilo, ésteres de sucrose, poliglicósidos de alquilo e similares. Exemplos específicos representativos de tais tensioactivos não iónicos incluem polioxietileno (9) nonilfenol, Neodol™ 25-7 da Shell (um álcool linear primário de polioxietileno (7) C12-15) , Tergitol™ 15-S-9 da Union Carbide (um álcool secundário de polioxietileno (9) C12-15 ), Tween™ 20 da ICI (um monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano) e Agrimul™ PG-2069 da Henkel (poliglucósido de alquilo Cg-n).
Entre os tensioactivos catiónicos, classes especialmente preferidas incluem polioxietileno alquilaminas ou alcenilaminas terciárias, tais como aminas gordas etoxiladas, tensioactivos de amónio quaternário polioxietileno alquileteraminas e similares. Exemplos específicos representativos de tais tensioactivos catiónicos incluem polioxietileno (5) cocoamina, polioxietileno (15) amina de sebo, cloreto de disteariletilamónio, brometo de cetiltrimetilamónio, cloreto de metil-bis(2-hidroxietil)cocoamónio, cloreto de N-dodecilpiridina e cloreto de polioxipropileno (8) etoxitrimetilamónio. São particularmente preferidas as alquieteraminas de polioxietilenp como descritas na 61 ΡΕ1240340
Publicação PCT N° W096/32839. Muitos tensioactivos catiónicos de amónio quaternário de diversas estruturas são conhecidos na área como sendo úteis na combinação com glifosato e podem ser usados nas composições aqui consideradas; tais tensioactivos de amónio quaternário possuem a fórmula (NRaRbRcRd)mAn em que A é um anião adequado, como seja cloreto, brometo, iodeto, acetato, sulfato ou fosfato, m e n são inteiros de forma que as cargas eléctricas positivas nos catiões (NRaRbRcRd) equilibram as cargas eléctricas negativas nos aniões A e as opções para Ra, Rb, Rc e Rd incluem, sem limitações: (i) Ra é benzilo ou alquilo ou alcenilo Cs-24, de preferência C12-18 e Rb, Rc e Rd são independentemente alquilo C1-4, de preferência metilo; (ii) Ra e Rb são independentemente alquilo ou alcenilo Cs-24, de preferência C12-18 e Rc e Rd são independentemente alquilo Ci_4, de preferência metilo; (iii) Ra é alquilo ou alcenilo Cs-24, de de preferência metilo; preferência C12-18, Rb é uma cadeia polioxialquileno tendo cerca de 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4, de preferência unidades de óxido de etileno, e Rc e Rd são independentemente alquilo Ci_4, 62 ΡΕ1240340 (iv) Ra é alquilo ou alcenilo C8-24, de preferência C12-18/ Rb e Rc são cadeias de polioxialquileno tendo no total cerca de 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4, de preferência unidades de óxido de etileno, e Rd é independentemente alquilo Ci_4, de preferência metilo; ou (v) Ra é uma cadeia de polioxialquileno tendo cerca de 2 a cerca de 100 unidades de óxido de alquileno C2-4 em que unidades de óxido de alquileno C3-C4, de preferência unidades de óxido de propileno, predominam e Rb, Rc e Rd são independentemente alquilo C1-4, de preferência metilo ou etilo. Tensioactivos de amónio quaternário particularmente preferidos deste tipo estão descritos na Patente U.S. N° 5464807 de Claude et al.
Numa realização, o anião A associado a tal tensioactivo de amónio quaternário pode ser um anião qlifosato.
Entre tensioactivos anfotéricos, incluindo como habitualmente na área tensioactivos mais correctamente descritos como zuiteriónicos, classes especialmente preferidas incluem óxidos polioxietileno alquilamina, alquilbetainas, aminoácidos substituidos com alquilo e similares. Exemplos representativos de tais tensioactivos anfotéricos incluem óxido de dodecildimetilamina, óxido de polioxietileno (2) cocoamina e estearildimetilbetaina. 63 ΡΕ1240340
Fontes de referência convencionais, a partir das quais os familiarizados com a matéria podem seleccionar tensioactivos adequados, sem se limitarem às classes atrás mencionadas, incluem Handbook of Industrial Surfactants, Second Edition (1997) publicado por Gower, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, Sixth Edition (1995) Volumes 1 e 2, publicado por Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association.
Outros componentes facultativos de composições do invento incluem agentes para modificar a cor, a viscosidade, propriedades gelificantes, ponto de congelação, higroscopicidade, comportamento de aglutinação, velocidade de dissolução, dispersibilidade ou outras caracteristicas da formulação.
Exemplos de formulações comerciais de glifosato incluem, sem restrição, os vendidos pela Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUND-UP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® e ACCORD®, todos eles possuem glifosato como sal de isopropilamónio; Os vendidos pela Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY e RIVAL®, os quais possuem glifosato como sal de amónio; os vendidos pela Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que possuem glifosato como sal de sódio; e os vendidos pela Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, o qual possui glifosato 64 ΡΕ1240340 com sal de trimetilsulfónio. A selecção das frequências de aplicação de uma formulação de glifosato que sejam biologicamente eficazes está dentro dos conhecimentos dos técnicos agricolas comuns. Os familiarizados com a matéria reconhecerão igualmente que as condições das plantas individuais, condições climáticas e condições de crescimento podem afectar os resultados conseguidos na realização do processo do presente invento. Ao longo de duas décadas de utilização de glifosato e de estudos publicados relatando tal usado proporcionaram informação abundante na qual quem faz controlo de ervas daninhas pode seleccionar as frequências de aplicação do glifosato que sejam eficazes em termos herbicidas em espécies particulares, em fases particulares do crescimento e em condições ambientais particulares.
Um processo do presente invento é aplicável a qualquer espécie vegetal em que o glifosato seja biologicamente eficaz como herbicida ou regulador do crescimento da planta. Isto inclui uma larga variedade de espécies vegetais a nivel mundial. Igualmente, as composições do invento podem ser aplicadas a qualquer espécie vegetal em que o glifosato seja biologicamente eficaz.
Numa realização, um herbicida contendo glifosato é aplicado à planta compreendendo as construções de DNA do presente invento e as plantas são avaliadas relativamente à 65 ΡΕ1240340 tolerância ao herbicida glifosato. Qualquer formulação de glifosato pode ser usada para testar plantas compreendendo as construções de DNA do presente invento. Por exemplo, pode ser usada uma composição de glifosato como o Roundup Ultra™. Os parâmetros a testar numa avaliação da tolerância ao glifosato da planta variarão dependendo de uma série de factores. Os factores incluirão, mas não estão limitados ao tipo de formulação de glifosato, concentração e quantidade de glifosato usada na formulação, tipo de planta, fase do desenvolvimento da planta durante o período de aplicação, condições ambientais, método de aplicação e número de vezes que uma formulação particular é aplicada. Por exemplo, as plantas podem ser testadas num ambiente de estufa usando um método de aplicação por aspersão. A gama testada usando o Roundup Ultra™ pode incluir, mas não está limitada a 0,56 a 17,93 kg/ha (8 oz/acre a 256 oz/acre) . A gama preferida comercialmente eficaz pode ser de 1,12 a 4,48 kg/ha (16 oz/acre a 64 oz/acre) de Roundup Ultra™, dependendo da cultura e da fase do desenvolvimento da planta. Uma cultura pode ser aspergida com pelo menos uma aplicação de uma formulação de glifosato. Para testar em algodão uma aplicação de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) na fase foliar 3 pode ser seguida de aplicações adicionais em fases mais tardias do desenvolvimento. Para trigo, pode ser usada uma aplicação de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) na fase foliar 3-5 e pode ser seguida de aplicações pré- ou pós-colheita, dependendo do tipo de trigo a ser testado. Os parâmetros a testar podem ser optimizados para cada cultura de forma a encontrar a planta particular compreendendo as construções 66 ΡΕ1240340 do presente invento que conferem o nível eficaz pretendido em termos comerciais de tolerância ao glifosato.
Os exemplos que se seguem são incluídos para demonstrar as realizações preferidas do invento.
Exemplos que não estão dentro do âmbito das reivindicações foram mantidos para fins ilustrativos.
Exemplos
Exemplo 1
As construções de plasmídeos usadas foram construções de clonagem em pUC ou construções de dupla fronteira para transformação de plantas, contendo uma origem de replicação de E. coli como seja ori 322, uma origem de replicação para uma gama larga de hospedeiros como seja oriV ou oriRi, e uma região codificadora para uma marca seleccionável como seja Spc/Str que codifica adeniltransferase de aminoglicósido (aadA) Tn7 que confere resistência a espectinomicina ou a estreptomicina, ou uma marca seleccionável com gentamicina (Gm, Gent). Para a transformação de plantas, a estirpe hospedeira bacteriana foi Agrobacterium tumefaciens ABI ou LBA4404.
Os elementos genéticos estão descritos como se segue: P-35S é o RNA 35S de CaMV contendo uma duplicação da região -90-300 como descrito na Patente U.S. n° 5424200; P- 67 ΡΕ1240340 FMV é o promotor do vírus do mosaico de escrofulária como descrito na Patente U.S. N° 5378619; P-eFMV é um derivado de P-FMV; CTP2 é a região do péptido de trânsito da sintetase EPSP de Arabidopsis como descrito na Patente U.S. N° 5633435; aroA:CP4syn (aroA:CP4) é a região codificadora de EPSP CP4 (sequência sintética) como descrito na Patente U.S. N° 5633435 ou ainda modificada para a expressão em plantas com base na utilização de codões de espécies vegetais particulares; E9 3' é o extremo 3' de um isolado do gene RbcS de ervilheira que funciona como um sinal de poliadenilação; nos é o extremo 3' do gene da sintetase de nopalina que funciona como um sinal de poliadenilação; Hsp70 é a sequência líder não traduzida de Petunia hybrida como descrito na Patente U.S. n° 5362865; GUS é a sequência codificadora da beta-glucuronidase de E. coli (Jefferson, R.A. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 83:8447-8451, 1987); a fronteira direita (RB) e a fronteira esquerda (LB) são do plasmídeo Ti das estirpes octopina e nopalina de Agrobacterium tumefaciens. 0 P-AtAct2 é o promotor do gene da actina 2 de Arabidopsis thaliana; AtActi é o intrão na região não traduzida (UTR) 5' do gene da actina 2 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct8 é o promotor do gene da actina 8 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i é o intrão na UTR5' do gene da actina 8 de Arabidopsis thaliana; P-AtActll é o promotor do gene da actina 11 de Arabidopsis thaliana; AtActlli é o intrão na UTR5' do gene da actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtActla é o promotor do gene da actina la de Arabidopsis thaliana, L-AtActla é o líder não traduzido e I-AtActla é o intrão do DNA genómico do gene da 68 ΡΕ1240340 actina la; P-AtActlb é o promotor do gene da actina lb de Arabidopsis thaliana, L-AtActlb é o líder não traduzido e I-AtActlb é o intrão do DNA genómico do gene da actina lb; P-AtAct3 é o promotor do gene da actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 é o líder não traduzido e I-AtAct3 é o intrão do DNA genómico do gene da actina 3; P-AtAct7 é o promotor do gene da actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 é o líder não traduzido e I-AtAct7 é o intrão do DNA genómico do gene da actina 7; P-AtActl2 é o promotor do gene da actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtActl2 é o líder não traduzido e I-AtActl2 é o intrão do DNA genómico do gene da actina 12; P-AtEFla (P-AtEFl ou EFla) é o promotor do gene do factor de elongação la de Arabidopsis thaliana, AtEFla-i (AtEFl-i) é o intrão na UTR5' do gene do factor de elongação la de Arabidopsis thaliana.
As Figuras 1-18 mostram exemplos de construção para a transformação de plantas que possuem uma a três cassetes para expressão em plantas. Múltiplas combinações de cassetes de expressão em plantas compreendendo o promotor e elementos genéticos do presente invento podem ser construídas e testadas em plantas cultivadas pelos familiarizados com a área da biologia molecular vegetal sem experimentação adicional. As construções ilustradas nas Figuras não devem ser consideradas como as únicas construções que podem ser montadas, mas servem apenas como exemplos para os familiarizados com a área. A Figura 1 (pCGN8086) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão 69 ΡΕ1240340 compreendendo um promotor do presente invento (P-AtAct8) operacionalmente ligado a um gene de interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 2 (pMON45325) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo pelo menos um promotor do presente invento (P-AtActll) operacionalmente ligado a um gene de interesse (CTP2-aroA:CP4syn) . A Figura 3 (pMON45331) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtEFl mais intrão) operacionalmente ligado a um gene de interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figure 4 (pMON45332) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo pelo menos um promotor do presente invento (P-AtEFl mais intrão) operacionalmente ligado a um gene de interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 5 (pMON9190) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo três cassetes de expressão em que pelo menos dois promotores do presente invento (P-AtEFl mais intrão, AtEFla-i; P-AtAct2 mais intrão, AtAct2i) estão operacionalmente ligados a um gene de interesse (CTP2-aroA:CP4syn) e o promotor P-eFMV está operacionalmente e ligado c CTP2-aroA:CP4syn. As cassetes de expressão em plantas da Figura 6 (pMON9153) são idênticas às ilustradas na Figura 4 (pMON45332), este mapa do plasmideo é ilustrado com o objectivo de identificar as cassetes de expressão relativamente a dados apresentados no fenótipo da planta nas tabelas de dados mostradas na especificação. A Figura 7 70 ΡΕ1240340 (pCGN8099) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo promotores híbridos do presente invento, P-FMV-AtEFla e P-e35S-AtAct8, dirigindo a transcrição do gene com interesse (aroA:CP4syn). A Figura 8 (pCGN8088) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo um promotor do presente invento, P-AtAct8 mais intrão, AtAct8i, e o promotor P-eFMV dirigindo a expressão de um gene com interesse (aroA: CP4syn) . A Figura 9 (pCGN8068) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo um promotor do presente invento, P-AtAct2 mais intrão, AtAct2i, e o promotor P-eFMV dirigindo a expressão de um gene com interesse (aroA:CP4syn). A Figura 10 (pCGN8096) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo promotores híbridos do presente invento, P-FMV/-AtActll e P-e35S-AtAct2, dirigindo a transcrição do gene com interesse (aroA:CP4syn). A Figura 11 (pCGN9151) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo promotores híbridos do presente invento, P-FMV/-AtEFla e P-e35S-AtAct2, dirigindo a transcrição do gene com interesse (aroA:CP4syn). A Figura 13 (pMON10156) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo duas cassetes de expressão compreendendo o promotor do presente invento P-eFMV dirigindo a transcrição 71 ΡΕ1240340 do gene com interesse (aroA:CP4syn) , este vector foi usado para fins comparativos com as sequências de promotor do presente invento. A Figura 14 (pMON54952) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtActla mais o intrão AtActla) operacionalmente ligado a pelo menos do gene com interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 15 (pMON54953) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtActlb mais o intrão AtActlb) operacionalmente ligado a pelo menos do gene com interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 16 (pMON54954) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtAct3 mais o intrão AtAct3) operacionalmente ligado a pelo menos do gene com interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 17 (pMON54955) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtAct7 mais o intrão AtAct7) operacionalmente ligado a pelo menos do gene com interesse (CTP2-aroA:CP4syn). A Figura 18 (pMON54956) proporciona um exemplo de uma construção para transformação de plantas contendo uma cassete de expressão compreendendo um promotor do presente invento (P-AtActl2 mais o intrão AtActl2) operacionalmente ligado a pelo menos do gene com interesse (CTP2-aroA:CP4syn). 72 ΡΕ1240340
Exemplo 2
As construções de clonagem e as construções GUS estão apresentadas na Tabela 1. 0 promotor e o intrão da actina 2 de Arabidopsis (Genbank número de acesso U41998 como descrito em An et al., Plant J. 10:107-121, 1996) foi isolado usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como matriz (Rogers and Bendich, Plant Mol. Biol. 5:69, 1998) usando SEQ ID N0:1 (sequência iniciadora directa) e SEQ ID NO: 2 (sequência iniciadora inversa) numa reacção como se segue: 0,5 yg de DNA matriz, 25 pmoles de cada sequência iniciadora, polimerase Taq (BMB, Indianapolis, IN) usando esferas de cera para um PCR de "iniciação a quente". As condições do termociclador para o PCR foram as seguintes: 94°C durante um minuto; 30 ciclos de: 92°C durante 40 segundos, 55°C durante um minuto, 72°C durante um minuto e 30 segundos; e uma extensão de cinco minutos a 72°C. A reacção de PCR foi purificada usando GeneClean II (BiolOl Inc., Vista, CA), digerido com HindIII e Ncol e ligado à construção pMON26149 (Tabela 1) digerida com HindIII e Ncol. A sequência do clone do promotor foi verificada e a construção resultante foi designada pM0N2617 0 (Tabela 1) .
Tabela 1. Construções de clonagem e construções GUS contendo as sequências dos promotores da actina e de EF1 de Arabidopsis 73 ΡΕ1240340
Construção Descrição Promotor*/Ge ne/3' pMON2 614 9 construção de clonagem pMON26149 pMON2 617 0 construção para expressão em plantas Act2/GUS/nos pMON2 6171 construção para expressão em plantas Act8/GUS/nos pMON8 67 7 construção de clonagem pMON4 8 4 07 construção para expressão em plantas Actll/GUS/nos pMON2 6152 construção de clonagem pMON2 617 7 construção para expressão em plantas EF1/GUS/nos pMON11750 construção para expressão em plantas e35S/GUS/nos pMON15737 construção para expressão em plantas FMV/GUS/nos * As sequências do promotor da actina e do factor de elongação também contêm a sequência do intrão da UTR5' do gene correspondente.
Exemplo 3
0 promotor e o intrão da actina 8 de Arabidopsis (Genbank número de acesso U42007 como descrito em An et al., Plant J. 10:107-121, 1996) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como matriz e as condições de PCR e métodos de purificação descritos no Exemplo 2 usando as sequências iniciadoras SEQ ID NO: 3 (sequência iniciadora directa) e SEQ ID NO:4 (sequência iniciadora inversa). O promotor foi clonado usando enzimas de restrição como descrito no Exemplo 2, verificada a sequência e a construção resultante foi designada pMON26171 (Tabela 1) . 74 ΡΕ1240340
Exemplo 4 0 promotor e o intrão da actina 11 de Arabidopsis (Genbank número de acesso U27981 como descrito em Huang et al., Plant Mol. Biol., 33:125-139, 1997) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como matriz e as condições de PCR e métodos de purificação descritos no Exemplo 2 usando as sequências iniciadoras SEQ ID NO:5 (sequência iniciadora directa) e SEQ ID NO:6 (sequência iniciadora inversa). 0 promotor foi clonado usando as enzimas de restrição EcoRV e Ncol e ligado a pMON8677 (Tabela 1), verificada a sequência e a construção resultante foi designada pMON48407 (Tabela 1).
Exemplo 5 0 promotor e o intrão do factor de elongação la de Arabidopsis (AtEFla) (Genbank número de acesso XI6430 como descrito em Axelos et al., Mol. Gen. Genet. 219:106-112, 1989; Curie et al., NAR 19:1305-1310; Curie et al.,
Plant Mol. Biol. 18:1083-1089, 1992; Curie et al., Mol.
Gen. Genet. 238:428-436, 1993) foram isolados usando DNA de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como matriz e as condições de PCR e métodos de purificação descritos no
Exemplo 2 usando as sequências iniciadoras SEQ ID NO: 7 (sequência iniciadora directa) e SEQ ID NO: 8 (sequência iniciadora inversa). O promotor foi clonado usando as enzimas de restrição HindIII e Ncol e ligado a pMON26152 (Tabela 1) como descrito no Exemplo 2, verificada a 75 ΡΕ1240340 sequência e a construção resultante foi designada pMON26177 (Tabela 1).
Exemplo 6
As construções para transformação de plantas descritas foram introduzidas em Agrobacterium. A transformação de algodoeiro foi realizada essencialmente como descrito em WO/0036911, aqui incluído como referência na sua totalidade. A transformação de Arabidopsis foi realizada como descrito em Ye et al., Plant Journal 19:249-257, 1999. A transformação do tomateiro foi realizada como descrito na Patente U.S. N° 5565347 aqui incluída como referência na sua totalidade.
Exemplo 7
Uma construção de DNA foi usada para transformar um cultura alvo com interesse através de um sistema de libertação adequado como seja um método de transformação mediada por Agrobacterium (ver por exemplo Patente U.S. N° 5569834 aqui incluído por referência na sua totalidade, Patente U.S. N° 5416011 aqui incluída como referência na sua totalidade, Patente U.S. N° 65631152 aqui incluída como referência na sua totalidade, Patente U.S. N° 5159135 aqui incluída como referência na sua totalidade, Patente U.S. N° 5005863 aqui incluída como referência na sua totalidade e Pedido de Patente Provisório U.S. N° 60/111795 aqui incluída como referência na sua totalidade. Como 76 ΡΕ1240340 alternativa, pode ser usado um método de bombardeamento de partículas (ver por exemplo Pedidos de Patentes WO 92/15675. WO 97/48814 e Pedido de Patente Europeia 586355 e Pedidos de Patente U.S. Nos 5120657, 5503998, 5503728 e 5015580, todas elas são aqui incluídas como referência na sua totalidade).
Existe um grande número de sistemas e métodos de transformação e regeneração que são do conhecimento dos familiarizados com a área. As plantas transformadas estavelmente e a sua progénie são subsequentemente analisadas relativamente à expressão do gene em tecidos de interesse através de uma série de métodos de avaliação moleculares, de imunodiagnóstico, bioquímicos e/ou de campo conhecidos dos familiarizados com a matéria, incluindo, mas não estando limitado a testes de aspersão com uma formulação de glifosato em concentrações comercialmente eficazes realizadas numa câmara de crescimento ou no ambiente do campo.
Exemplo 8
Os ensaios GUS são realizados através de métodos de rotina conhecidos dos familiarizados com a área (ver por exemplo, Jefferson et al., EMBO J. 6:3901, 1987). Para o algodoeiro, foram testadas as plantas R0. O tecido foi seleccionado pelo tamanho em várias fases do desenvolvimento, retiradas amostras e reunidas para análise. O botão floral do algodoeiro foi colhido e 77 ΡΕ1240340 amostras de tecido reprodutor masculino (anteras e filamentos), amostras de tecido reprodutor feminino (todo o estigma, estilete e ovário) e corola (sépalas e pétalas) foram retiradas. Para a selecção de acordo com o tamanho, três botões florais de cada fase foram seleccionados de forma a incluirem vários tamanhos, incluindo pequenos (menos de 0,5 cm), médios (entre 0,5 e 0,7 cm) e grandes (fase de vela ou de flor aberta) . As amostras de folhas foram colhidas cerca de 1-2 semanas após as plantas de algodoeiro serem colocadas na estufa e as outras amostras foram colhidas aproximadamente 1-2 meses mais tarde. As primeiras folhas não foram colhidas (as cinco primeiras posições de frutificação foram deixadas intactas).
Para Arabidopsis, as plantas VI foram analisadas e apenas os segregantes homozigóticos e heterozigóticos foram testados. Oito a dez eventos por construção foram analisados (cinco plantas por evento). Os resultados de GUS para Arabidopsis representam amostras reunidas de 8-10 eventos. Os valores nas tabelas apresentadas (Tabela 2 e Tabela 3) representam a expressão média de GUS para o tecido designado (pmol/UM/min/mg).
Exemplo 9
As plantas foram analisadas relativamente à expressão de GUS em tecido foliar e em tecidos reprodutores incluindo botões florais imaturos e flores. Os resultados estão apresentados na Tabela 2. As construções testadas 78 ΡΕ1240340 incluíram pMON48407 (P-AtActll + intrão/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrão/GUS/nos), pMON26171 (P-AtAct8 + intrão/GUS/nos), pMON11750 (e35S/GUS/nos) , pMON26177 (P-EFla + intrão/GUS/nos), e pMON15737 (P-FMV/GUS/nos) . Os promotores da actina e do factor de elongação conferiram níveis elevados de expressão de GUS em múltiplos tecidos incluindo tecidos reprodutores.
Tabela 2. Expre ssão média de GUS em Arabidopsis VI Construção Folha Botão floral imaturo Flor Gineceu Androceu pMON48407 6944 7394 8359 ND ND pM0N2 617 0 45238 74099 54502 73623 217292 pMON26171 29343 35884 37125 76311 207100 pMON11750 60844 14032 16263 35882 115049 pMON26177 47598 72871 96420 191066 507370 pMON15737 28314 57903 84457 44696 87876
Exemplo 10
As plantas de algodoeiro RO foram testadas relativamente à expressão do gene repórter GUS em tecidos seleccionados de várias fases do desenvolvimento. Os botões florais foram classificados de acordo com o tamanho (pequeno, médio e grande; grande = vela e flor aberta). O androceu representou os tecidos reprodutores masculinos. O gineceu representou os tecidos reprodutores femininos incluindo a totalidade do receptáculo (estigma, estilete e 79 ΡΕ1240340 ovários). A amostra da corola era composta por sépalas e pétalas. O tecido foi preparado e os ensaio de GUS realizados como descrito no EXEMPLO 8. Os resultados estão resumidos na Tabela 3. As construções testadas incluíram pMON48407 (P-EFIoí + intrão/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrão/gus/nos), e pMON48407 (P-AtActll + intrão/gus/nos).
Seis plantas foram testadas e obtidos os valores médios de GUS para pMON26177. Vinte plantas foram testadas e obtidos os valores médios de GUS para pMON26170. Oito plantas foram testadas e obtidos os valores médios de GUS para pMON48407. Os resultados demonstram que os promotores da actina e do factor de elongação podem ser usados para a expressão eficaz de genes operacionalmente ligados, particularmente em tecidos reprodutores.
Tabela 3. Resultados do ensaio de GUS para as plantas de algodoeiro
Construção Promotor/intrão Tecido testado Resultados de pMON26177 ElFa folha 11600 pMON26177 ElFa corola pequena 396 pMON26177 ElFa gineceu pequeno 8670 pMON26177 ElFa androceu pequeno 13771 pMON26177 ElFa corola média 362 pMON26177 ElFa gineceu médio 3318 pMON26177 ElFa androceu médio 8006 pMON26177 ElFa corola grande 351 - 80 - ΡΕ1240340 pMON2 617 7 EI Fa gineceu grande 500 pMON2 617 7 EI Fa androceu grande 15512 pM0N2 617 0 Act2 folha 12718 pM0N2 617 0 Act2 corola pequena 1296 pMON2 617 0 Act2 gineceu pequeno 16684 pMON2 617 0 Act2 androceu pequeno 7570 pMON2 617 0 Act2 corola média 742 pMON2 617 0 Act2 gineceu médio 10041 pM0N2 617 0 Act2 androceu médio 7893 pMON2 617 0 Act2 corola grande 289 pMON2 617 0 Act2 gineceu grande 3218 pMON2 617 0 Act2 androceu grande 42737 pMON4 8 4 07 Actll folha 28289 pMON48407 Actll corola pequena 10 pMON4 8 4 07 Actll gineceu pequeno 40755 pMON4 8 4 07 Actll androceu pequeno 47834 pMON4 8 4 07 Actll corola média 742 pMON4 8 4 07 Actll gineceu médio 52495 pMON48407 Actll androceu médio 35573 pMON48407 Actll corola grande 1072 pMON4 8 4 07 Actll gineceu grande 4869 pMON4 8 4 07 Actll androceu grande 42737 Exemplo 11 As plantas transformadas foram igualmente testadas num teste de aspersão em estufa usando uma formulação de glifosato Roundup Ultra™ com um sistema de aspersão em linha ("Track Sprayer") (Roundup Ultra é uma 81 ΡΕ1240340 marca registada da Monsanto Company). As plantas estavam na fase de crescimento de "duas" ou mais folhas verdadeiras e as folhas foram secas antes da aplicação da aspersão com Roundup®. A formulação usada era Roundup Ultra™ como uma formulação de 31b/galão a.e. (equivalente ácido). A calibração usada foi a seguinte.
Capacidade do bico; 9501 fluxo constante Pressão de aspersão: 40 psi
Altura da aspersão: 18 polegadas entre o topo da canópia e a ponta do bico
Velocidade de deslocação l,lpés/seg., correspondendo a uma leitura de 1950-1,0 volts
Formulação: Roundup Ultra™ (3 lbs. a.e./galão)
As concentrações de aspersão variarão, dependendo das gamas de testagem pretendidas. Por exemplo, para uma taxa de 8 oz/acre, é usada uma solução de trabalho de 3,1 ml/1 e para uma taxa de 64 oz/A é usada uma gama de trabalho de 24,8 ml/1. O periodo de avaliação variará, dependendo da cultura, fase do desenvolvimento da planta e do nivel de tolerância pretendido.
Exemplo 12
As construções para expressão em plantas usadas para a transformação de tomateiro estão apresentadas na 82 ΡΕ1240340
Tabela 4. As plantas de tomateiro (TO) contendo construções compreendendo pelo menos um promotor da actina ou do factor de elongação (com intrão) operacionalmente ligado a um gene de tolerância ao glifosato aroA:CP4 foram testadas num teste de aspersão de glifosato em estufa com uma formulação de glifosato (Roundup Ultra™) relativamente à eficiência para conferir tolerância ao glifosato a plantas de tomateiro transgénicas. Facultativamente, pelo menos uma sequência de promotor da actina ou do factor de elongação operacionalmente ligada a um gene aroA:CP4 e um promotor do caulimovirus eFMV operacionalmente ligado a um aroA:CP4 usados para transformar plantas de tomateiro foram testados através da aplicação por vaporização com glifosato (Roundup Ultra™). As plantas de tomateiro foram aspergidas com 48 oz./acre, depois avaliadas passadas duas semanas após a aplicação para análise da tolerância vegetativa e até 60 dias pós-aplicação para análise da tolerância reprodutiva. Os resultados estão apresentados na Tabela 4 e variaram de acordo com a eficiência da selecção de linhas reprodutoras tolerantes. A percentagem de tolerância vegetativa é a percentagem das linhas testadas que demonstraram tolerância vegetativa suficiente aos danos do glifosato para serem consideradas para estudos posteriores de caracteristicas agronómicas na preparação de candidatos comerciais. A percentagem de tolerância reprodutiva é a percentagem de linhas tolerantes vegetativas que também demonstraram suficiente tolerância reprodutiva para serem consideradas para posterior avaliação agronómica. Todas as construções mostraram-se funcionais relativamente a proporcionarem 83 ΡΕ1240340 tolerância vegetativa e tolerância reprodutiva às plantas de tomateiro transgénicas. Várias combinações de promotores foram capazes de aumentar a eficiência com gue as linhas vegetativas e reprodutivas tolerantes podiam ser seleccionadas através do rastreio nesta experiência. As construções contendo o promotor EFla de Arabidopsis estão mais especificamente associadas com uma percentagem elevada de linhas vegetativamente tolerantes. O promotor P-Act2 em combinação com P-eFMV e P-AtEFla (+CGN9190) proporcionaram um aumento na percentagem de linhas reprodutivamente tolerantes gue foram testadas por este método.
Tabela 4. Ensaios de aspersão em linha em estufa com taxa de aplicação de 48 oz./Acre1
Construção Descrição #Linhas %Tolerância %Toler. Testadas Vegetativa1 Reprod. pCGN9190 eFMV/CP4 + EFla/CP4 + 930 83,2 52,4 Act2/CP4 pCGN9153 EFla /CP4 + eFMV/CP4 391 73, 9 38, 9 pCGN8086 Act8/CP4 21 47,6 38, 1 pCGN8099 EFla /CP4 + Act8/CP4 71 84,5 36, 6 pCGN8088 eFMV/CP4 + Act8/CP4 144 79,9 34,7 pMON45325 eFMV/CP4 + Actll/CP4 90 70,0 34,4 pCGN8096 Actll/CP4 + Act2/CP4 201 62,7 10,4 pCGN8067 Act2/CP4 205 67,3 8,8 1
Uma aplicação 1 Resultados reunidos de 25 testes. Avaliados 14 dias pós- 84 ΡΕ1240340 aplicação 2 Resultados reunidos de 25 testes. Avaliados 60 dias pós-aplicação O rendimento das sementes de tomateiro foi usado como uma medida da eficácia de várias sequências de promotores e combinação de cassetes de expressão usadas no presente invento para conferir tolerância ao glifosato em plantas de tomateiro transgénicas. Na Tabela 5, estão apresentados os resultados de três experiências de campo com plantas de tomateiro transgénicas contendo construções com os promotores do presente invento a dirigirem a expressão da sequência codificadora de AroA:CP4 relativamente à tolerância ao glifosato. A experiência 1 é um teste das plantas produzidas a partir das construções que possuem o promotor do virus do mosaico da escrofulária (P-FMV) na versão nativa e na versão de derivado em duplicado (P-eFMV) e com elementos genéticos adicionais nas construções usadas para testar as sequências de promotor do presente invento. Elementos genéticos adicionais tais como a fonte da sequência não traduzida 5' e do péptido de trânsito para os cloroplastos foram igualmente testados. A construção pMON20998 compreende o P-eFMV, ligado ao lider da UTR5' de Hsp70 de petúnia, ligado ao péptido de trânsito para os cloroplastos de EPSPS de Arabidopsis (CTP2), ligado à região de terminação 3' E9. A construção pMON20999 difere de pMON20998 apenas no promotor ser P-FMV. A construção pMON10156 difere de pMON20998 apenas por CTP ser do péptido de trânsito para os cloroplastos de EPSPS de Petunia 85 ΡΕ1240340 (CTP4). A construção pMON45312 difere de pMON20998 apenas por a sequência lider ser a sequência lider nativa de FMV.
As plantas de tomateiro foram transplantadas para o campo em filas. As plantas foram tratadas por aspersão no campo a uma taxa de 4 8 oz./acre com herbicida Roundup. A semente de tomateiro foi colhida do fruto e pesada. Uma linha de tomateiro não aspergida serviu de controlo para fins de comparação e a eficácia de cada construção foi expressa como uma percentagem do controlo. O resultado da Experiência 1 (coluna 1 da Tabela 5) é que o promotor de FMV e P-eFMV apenas proporcionam 5-11% da produção de semente de um controlo não aspergido. As experiências 2 e 3 testam as construções do presente invento em diferentes localizações (colunas 2 e 3 da Tabela 5) . A experiência 2 foi conduzida na mesma localização da Experiência 1, as construções pCGN8099 (Figura 7) , pCGN9151 (Figura 11) e pCGN9190 (Figura 5) tiveram bom desempenho ao proporcionarem 25-46% da semente relativamente a um controlo não aspergido. Numa localização diferente que tinha uma estação de crescimento mais fria, a Experiência 3 demonstrou que pCGN8068 (Figura 9), pCGN8088 (Figura 8), pCGN8099, pCGN9151, pCGN9153 (Figure 6) e pMON45325 (Figura 2) são capazes de conferir suficiente tolerância ao glifosato para os tomateiros produzirem 34-77% da produção normal de semente relativamente a um controlo não aspergido. 86 ΡΕ1240340
Tabela 5. Experiências de rendimento de sementes de tomateiro _
Exp. 1 Peso da semente % do controlo Exp. 2 Peso da semente % do controlo Exp. 3 Peso da semente % do controlo pMON2 0 9 98 0,52 5,3 pMON20999 0,84 8,6 pMON10156 0,50 5,1 pMON45312 1,07 11,0 pCGN8 0 68 0,48 8,4 7,06 77,8 pCGN8088 0,43 7,6 3, 09 34,1 pCGN8 0 9 6 0,40 7,0 pCGN8 0 9 9 1,85 32,5 6, 93 76,4 PCGN9151 1,46 25, 7 6,11 67,4 pCGN9153 0,68 12, 0 4,03 44,4 pCGN9190 2,64 46, 4 pMON45325 0,31 5,4 3, 37 37,2 pCGN8 0 67 controlo 9, 73 100,0 5, 69 1000,0 9, 07 100, 0
Exemplo 13 SEQ ID NOS: 1-8 e SEQ ID NOS :13-21 são sequências iniciadoras de PCR desenhadas a partir de informação pública de sequências dos genes Actl, Act2 (Genbank #U41998), Act3, Act7, Act8 (Genbank #ATU42007), Actll (Genbank #ATU27981), Actl2 e Elfla (Genbank #X16430) de Arabidopsis thaliana. Estas sequências foram usadas para prolongar a sequência de ácido nucleico usando técnicas de 87 ΡΕ1240340 amplificação por reacção em cadeia da polimerase (PCR) (ver por exemplo, Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1986; Erlich, et al., Pedido de Patente Europeia 50424; Pedido de Patente Europeia 84796, Pedido de Patente Europeia 258017, Pedido de Patente Europeia 237362; Mullis, Pedido de Patente Europeia 201184; Mullis, et al., Patente U. S. No. 4683202; Erlich, Patente U. S. 4582788; e Saiki, et al., Patente U. S. No. 4683194). Os familiarizados com a matéria conhecem múltiplos métodos de amplificação por PCR que são usados para identificar sequências de ácido nucleico adjacentes a uma sequência conhecida. Por exemplo, foram descritos métodos de PCR inverso (IPCR), os quais são usados para amplificar sequências de DNA desconhecidas adjacentes a uma região nuclear de sequência conhecida. Existem outros métodos disponíveis tais como PCR de captura (Lagerstrom M., et al., PCR Methods Applic. 1:111, 1991), e PCR migrante (Parker, et al., Nucleic Acids Res 19:3055, 1991).Uma série de fabricantes desenvolveram kits baseados em modificações destes métodos para identificação de sequências de interesse. Avanços técnicos, incluindo melhorias no desenho de sequências iniciadoras e adaptadores, melhorias na enzima polimerase e capacidades dos termocicladores facilitaram métodos mais rápidos e eficientes para o isolamento de sequências com interesse. ΡΕ1240340
Tabela 5a. Sequências iniciadoras para o isolamento de sequências dos promotores de actina e do EFla de Arabidopsis
At. Actina 2 directo: TTTTTTTTGATATCAAGCTTCAACTATTTTTATGTATGC At. Actina 2 inverso: GCCTCAGCCATGGTGAGTCTGCTGCAAACACACAAAAAGA GTTCAAT At. Actina 8 directo: TTTTTTTTGATATCAAGCTTCCATTTTTCT TTTGCATAAT TC At. Actin 8 inverso: GCATCGGCCATGGTGAGTCTTCTGCAATCAAAAACATAAA GATCTGA At. Actin 11 directo: TTTTTTTTTAAGCTTGATATCACAACCAAATGTCAAATGG At. Actin 11 inverso: CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTC At. EFla directo: TTTTTTTTTAAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTG At. EFla inverso: CTTTTCCCATGGTAGATCTCTGGTCAACAA ATC At. Actina la directo: CCCAAGCTTAAATGACATCAGATACACGC At. Actina lb directo: CATAAGCTTAGAGGTCCAAATTCA At. Actina I inverso: CCATCAGCCATGGTCTTCTACCTTTATGCAAA At. Actina 3 directo:
CCAAGCTTACCACACTCAGATGCATAAACAAACACA
At. Actina 3 inverso: 89 ΡΕ1240340 CATCAGCCATGGTCTACTCTCTGCAAAAACA At. Actina 7 directo: GCAAAGCTTACTAGTCAACAATTGGCC At. Actina 7 inverso: GATCGGCCATGGTTCACTAAAAAAAAAG At. Actina 12 directo:
GGAAGCTTGCGGCCGCTTTCTACTCTACATGTTTCT
As folhas de plantas jovens de Arabidopsis thaliana (1 g) foram homogeneizadas em 9 ml de tampão CTAB (Saghai-Maroof et al. 1984, PNAS 81:8014-8018). O tampão CTAB continha TrisHCl 100 mM, pH 7.8, NaCl 700mM, EDTA 50mM, 1% CTAB (brometo de alquiltrimetil-hilamónio) e 2- mercaptoetanol 140 mM. Após 90 minutos de incubação a 65°C, adicionou-se 4,5 ml de clorofórmio:álcool isoamilico (24:1) e as amostras foram misturadas durante 10 minutos. A fase aquosa foi separada por centrifugação durante 10 minutos a 1500 g e foi novamente extraida com clorofórmio:álcool isoamilico. Após segunda centrifugação, a fase aquosa foi transferida para um tubo contendo 50 ml de RNase A a 10 mg/ml (sem DNase) e incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos para remover RNA. O DNA foi precipitado com 6 ml de isopropanol e suspenso em 1 ml de tampão TrisHCl 10 mM pH 8,5. A solução de DNA foi extraida uma vez com igual volume de fenol e uma vez com igual volume de clorofórmio:álcool isoamilico. Após centrifugação, adicionou-se à fase aquosa 1/10 de volume de acetato de sódio (3M, pH 5,2), seguido de 2,5 volumes de etanol. O DNA foi pescado, lavado com etanol a 70%, depois seco ao ar e 90 ΡΕ1240340 suspenso em 0,2 ml de tampão TrisHCl 10 mM. 0 DNA genómico de Arabidopsis (100 ng) foi usado em reacções de PCR de 50 μΐ. As reacções contendo as sequências iniciadoras mostradas na Tabela 5a continham soluções 0,2 mM de sequência iniciadora directa e reversa, dNTPs 200 nM e tampão de PCR com magnésio e mistura de DNA polimerase Expand™ High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals). Após 2 minutos de desnaturação inicial a 94°C, as reacções foram sujeitas a ciclos de 0,5 min a 94°C, 0,5 min a 55°C e 1,5 minutos a 72°C durante 35 vezes. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese num gel de 1% de agarose. Os fragmentos de DNA isolados em gel representando sequências de Actina la, Actina lb, Actina 7 e Actina 12 foram fosforilados com DNA cinase de T4 e ligados à construção de clonagem pUC19 cortada com Smal e desfosforilada. As colónias brancas foram testadas relativamente à presença de insertos adequados e sequenciados com M13 para confirmar a presença de promotores de actina. Clones seleccionados foram designados como pMON54941 (P-AtActla), pMON54942(P-
AtActlb), pMON54 94 3 (P-AtAct7) e pMON54944 (P-AtActl2). Subsequentemente, os fragmentos de DNA contendo os promotores da actina foram removidos das construções de pUC19 contendo as sequências de inserto por digestão com HindIII e Ncol, os fragmentos de DNA foram isolados em gel e ligados a pMON26165 que tinha sido digerido com as mesmas enzimas de restrição. Um produto de PCR para o promotor da Actina 3 (P-AtAct3) foi digerido com HindIII e Ncol e 91 ΡΕ1240340 clonado directamente em pMON26165 para formar pMON54951. pMON26165 possui o segmento do gene terminador GUS/nos. A ligação com os segmentos do promotor permite testar cada promotor relativamente à actividade funcional através da expressão da enzima β-glucuronidase nas células vegetais. As células vegetais podem ser isoladas, por exemplo protoplastos foliares do tabaco, ou as células vegetais podem fazer parte de um tecido ou órgão vegetal, como seja a folha, raiz, cotilédone, hipocótilo, embrião, flor ou órgão de reserva. 0 nivel de expressão de GUS dirigido por estes promotores foi testado em hipocótilo de soja e comparado com GUS dirigido pelo promotor P-e35S (Tabela 6) . DNA de plasmídeo/partícula de ouro foram usados para bombardear hipocótilos de soja, depois após 48 horas a actividade de GUS foi testada histoquimicamente. Todos os promotores de actina testados neste ensaio apresentaram actividade funcional no tecido de hipocótilo demonstrando a sua utilidade para a expressão de transgene em espécies de cultivadas heterólogas. As construções contendo aroA:CP4 EPSPS dirigido pelos promotores de Actina la, (pMON54952), Actin lb (pMON54953), Actina 3 (pMON54954), Actina 7 (pMON54955) e Actina 12 (pMON54956) de Arabidopsis do presente invento foram preparados em construções binárias de Agrobacterium para a transformação de plantas para a expressão estável de EPSPS resistente ao glifosato em plantas cultivadas. Estas construções foram usadas para transformar células de soja e de algodoeiro, as células 92 ΡΕ1240340 foram seleccionadas e regeneradas para plantas em meio de cultura de tecidos contendo glifosato e depois testadas relativamente à expressão da proteina aroA:CP4 e à tolerância à aplicação de glifosato. As plantas que mostraram tolerância ao glifosato em termos comerciais aceitáveis foram ainda desenvolvidas por métodos de cruzamento convencionais para transferir a caracteristica de tolerância ao glifosato em germoplasma adaptado para cultura.
Tabela 6. Actividade de diferentes promotores da actina de Arabidopsis em ensaios transitórios comparativamente com P- e35S.
Construção Actividade GUS Pe35S/GUS +++ P-AtActla/GUS ++ P-AtActlb/GUS + + P-AtAct3/GUS + + P-AtAct7/GUS + + P-AtAct12/GUS +
Exemplo 14 A produção de algodoeiro foi correlacionada com o número de flores que ocorrem durante as primeiras quatro a cinco semanas de floração. A evolução destas flores para cápsulas maduras e a sua contribuição para a colheita da fibra do algodão é um componente chave da produção. Quando 93 ΡΕ1240340 da determinação da eficácia das construções transgénicas para conferir tolerância a herbicidas em algodoeiro, a quantidade de cápsulas obtidas é uma medida da eficácia e uma caracteristica desejável. As plantas de algodoeiro transgénicas contendo promotores do presente invento (Tabela 7) foram testadas em condições de estufa relativamente às cápsulas obtidas. Os promotores dirigiram a expressão da sequência codificadora de aroA:CP4 para o fenótipo de tolerância ao glifosato. As plantas foram transformadas pelo método mediado por Agrobacterium ou através de um método com pistola de partículas. As construções para pistolas de partículas continham uma cassete adicional para expressão de GUS útil para a localização histoquímica da actividade de β-glucuronidase a partir dos promotores do presente invento. As plantas transgénicas foram regeneradas em meio contendo glifosato e as plantas enraizadas em meio de enraizamento. As plântulas enraizadas foram envasadas em solo e transferidas para uma estufa de crescimento para um período de fortalecimento. A semente destas linhas de plantas foram colhidas e plantadas. Quinze plantas de cada linha foram aspergidas com glifosato a 3,36 kg/ha (48 onças/acre) na fase foliar 4. Pelo menos 8 plantas sobreviventes de cada linha foram aspergidas novamente na fase foliar 8 com glifosato a 48 onças/acre. Quando atingiram a maturidade, foi contado o número de cápsulas nas primeiras posições para as cinco primeiras cápsulas. As linhas que tinham 3 ou mais das cápsulas na primeira posição mantidas após a aspersão com glifosato (mapa da planta ^3) foram conduzidas para estudos 94 ΡΕ1240340 posteriores. A Tabela 7 ilustra os dados produzidos a partir deste estudo. O número de linhas mapeadas indica o número de linhas sobreviventes à primeira aplicação de aspersão de glifosato. 0 padrão comercial é a Linha 1445 (pMON17136) que possui o promotor P-FMV a dirigir a expressão de CTP2-aroA:CP4 gene/E9 3', esta linha mantém menos de 1 das cinco primeiras cápsulas. As construções pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088 e pCGN8068 proporcionam suficiente tolerância reprodutiva ao glifosato em algodoeiro, de forma que 14-35% das linhas testadas com estas construções foram usados noutros ensaios agronómicos.
Tabela 7. Estudo da retenção das cápsulas de algodão em estufa
Construção Promotores # linhas Mapa de plantas^3 mapeadas %>3 pCGN8099 FMV:EFla + e35S:Act8 104 36 34, 6% PCGN9153 EFla + FMV 36 12 33, 3% PCGN9165 EFla + 35S/GUS 3 1 33, 3% PCGN9152 EFla 7 0 0,0% PCGN8088 Act8 + FMV 43 6 14, 0% PCGN8086 Act8 7 0 0,0% PCGN8068 Act2 + FMV 37 7 18, 9% PCGN8067 Act2 37 0 0,0% pCGN8084 Act2 + FMV + 35S/GUS 5 0 0,0% pCGN8085 Act2 + FMV/GUS 1 0 0,0% pCGN9164 Actll + 35S/GUS 21 1 4,8% 95 ΡΕ1240340 pMON45325 Actll + FMV 43 0 0,0% PCGN8096 FMV:Act11 + e35S:Act2 14 0 0,0% pCGN9154 FMV:Actll + e35S:Act2 16 1 6,3% Linha 1445 FMV <1,0
Exemplo 15 A produção de algodoeiro foi correlacionada com o número de flores durante as primeiras quatro a cinco semanas de floração. A evolução destas flores para cápsulas maduras e a sua contribuição para a colheita fibra de algodão é um componente chave da produção. Quando da determinação da eficácia das construções transgénicas para conferir tolerância a herbicidas em algodoeiro, a quantidade de cápsulas que maturaram é uma medida da eficácia e uma caracteristica desejável. As plantas de algodoeiro transgénicas contendo promotores do presente invento (Tabela 7) foram testadas em condições de estufa relativamente à maturação de cápsulas. As plantas de algodoeiro transgénicas contendo promotores do presente invento foram testadas em condições de campo, em duas localizações diferentes, relativamente à maturação das cápsulas. As linhas de algodoeiro transgénicas 502-254-2 (pCGN8 0 68), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153) e 60-1 (pCGN9153) foram comparadas com 1445 (linha de tolerância ao glifosato) e PM1218BR (Paymaster 1218 parental) que continha a construção pMON17136 (P- FMV/CTP2-aroA:CP4/E93'), uma linha selvagem não transgénica, Coker 130, foi incluida. A organização do 96 ΡΕ1240340 campo é a de um talhão para avaliação aleatória consistindo em 2 linhas x 20-30 pés x 3 repetições. O glifosato foi aplicado como formulação Roundup Ultra™ nas razões de 1,12 lb ai/A = 48 oz de produto e 1,5 lb ai/A = 64 oz de produto pelo menos na fase foliar 8 de desenvolvimento do algodoeiro. Todos os talhões de algodoeiro foram sujeitos a um maneio agressivo relativamente ao controlo de ervas daninhas e de pragas de insectos, assim como a outras actividades agronómicas tais como a época da plantação, fertilização, rega, utilização de PGR e desfolhação. A percentagem de maturação das cápsulas foi determinada através do mapeamento da localização de cada uma das cápsulas maturadas através de selecção ao acaso de dez plantas do meio das duas filas centrais (cinco de cada fila) de cada talhão para mapear. O primeiro mapeamento deverá ser feito 4 semanas após a primeira flor (mapa do meio da estação), um segundo mapeamento deverá ser feito na colheita. Os dados colhidos incluem o número de cápsulas da primeira posição nos cinco gomos florais da base da planta que são contados como uma indicação da tolerância reprodutiva das linhas de algodoeiro transgénicas ao glifosato. A Tabela 8 ilustra a vantagem que os promotores do presente invento conferiram às plantas transgénicas de algodoeiro relativamente à maturação de cápsulas. Este aumento da tolerância reprodutiva resultou num aumento do rendimento da fibra (Tabela 9) e igualmente no aumento da produção de sementes (Tabela 10) 97 ΡΕ1240340
Tabela 8. Maturação de cápsulas no mapa da planta na estação média das flores nas 5 primeiras posições
Localização 1 Localização 2 Não 48 64 Não 48 64 tratada oz/A oz/A tratada oz/A oz/A (17136)1445 68 67 53 81 63 62 (8068) 502-254-2 87 72 64 77 80 69 8068-701-178-2-2 85 77 60 84 86 76 (8088)53-2 89 81 80 79 76 73 (9153) 178-1 77 83 73 85 71 79 (9153) 60-1 80 89 81 77 82 87 PM1218BR 92 56 63
Tabela 9. Produção de fibras (lbs/Acre) e percentagem da produção (Localização 1)
Cultivar Não tratada 48 oz/A 64 oz/A 48 oz/A 64 oz/A 8068-502-254-2-4 1103 960 87,0% 858 77, 8% 8068-701-178-2-2 1326 1219 91,9% 1177 88, 8% 9153-60-1-1 1177 1206 102,5% 1171 99,5% 9153-178-1-1 1112 769 69,2% 750 67,4% 8088-53-2-11 1283 1071 83,5% 1097 85,5% 1445 1018 563 55,3% 490 48, 1% C130 1200 0 0, 0% 0 0, 0% PM1218BR 1092 826 75, 6% 713 65,3% 98 ΡΕ1240340
Tabela 10. Produção de semente de algodoeiro (lbs/Acre) e percentagem de produção (Localização 1)
Cultivar Não tratada 48 oz/A 64 oz/A 48 oz/A 64 oz/A 8068-502-254-2-4 3357 2932 87,1% 2646 78, 8% 8068-701-178-2-2 3720 3521 94,7% 3328 89,5% 9153-60-1-1 3294 3413 103,6% 3316 100,7% 9153-178-1-1 3468 2355 67,9% 2218 64,0% 8088-53-2-11 3404 2950 86, 7% 2968 87,2% 1445 2835 1624 57,3% 1372 48, 4% C130 3272 0 0, 0% 0 0, 0% PM1218BR 3036 2192 72,2% 1885 62,1%
Exemplo 16
A eficácia do promotor híbrido P- FMV-AtEFla em dirigir a expressão da sequência codificadora CTP2-aroA:CP4 (Figura 13, pMON52059) e de P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93' (pMON15737) foi comparada em Arabidopsis thaliana transgénica. As plantas de Arabidopsis thaliana foram produzidas por infiltração sob vácuo Bechtold et al. , C R
Acad Paris Life Sei 316: 1194-1199). As sementes foram semeadas no solo em tabuleiros numa estufa de crescimento ajustada a 24 °C, 16 horas de ciclo de luz (120 μΕ nTV1) para permitir o crescimento normal e o desenvolvimento das plantas. As plantas de Arabidopsis transgénicas tolerantes ao glifosato evento pMON52059 VI foram seleccionadas 99 ΡΕ1240340 através de aplicação por aspersão do herbicida glifosato numa taxa de 1,68 kg/ha (24 onças/acre), as plantas sobreviventes foram transplantadas para vasos individuais. Oito plantas pMON52059 VI e oito plantas homozigóticas pMON15737 foram aspergidas uma segunda vez correspondendo à observação de rebentação, aproximadamente 16 dias após aplicação numa taxa de 1,68 kg/ha (24 onças/acre) . A segunda aspersão determinará a eficácia das duas construções para conferir tolerância reprodutiva. As plantas foram observadas relativamente aos efeitos vegetativos da aplicação de glifosato. Todas as plantas tinham tolerância vegetativa completa e não foram observadas flores anormais. No entanto, a ocorrência de aborto de síliquas indicou que não existia semente nas siliquas abortadas. O número total de siliquas produzidas por cada planta e as siliquas que continham sementes (siliquas férteis) foi contado e tabulado. Os resultados estão apresentados na Tabela 9 e indicam que a construção do promotor hibrido pMON52059 demonstrou um aumento superior a 10 vezes nas siliquas férteis, 89% comparativamente a pMON15737 a 8%. O número de estruturas frutificantes férteis está relacionado com a quantidade de semente que pode ser produzida, isto é especialmente importante em culturas cuja produção está associada aos números de sementes. Culturas tais como algodoeiro, soja, canola, trigo e milho são culturas em que a tolerância reprodutiva ao glifosato é essencial para um bom rendimento. 100 ΡΕ1240340
Tabela 11. Comparação do promotor híbrido P-FMV-EFla (pMON52059) e P-FMV (pMON15737) em conferir tolerância reprodutiva ao glifosato em plantas de Arabidopsis pMON52059 pMON15737 Número Síliquas Total de Percentagem Número Síliquas Total de Percentagem da férteis síliquas de da férteis síliquas de planta fertilidade planta fertilidade 8819 39 50 78, 0% 1 74 540 13,7% 8820 626 691 90, 6% 2 23 600 3, 8% 8821 507 561 90, 4% 3 1 470 0,2% 8822 0 69 0, 0% 4 20 646 3,1% 8823 512 534 95, 9% 5 43 717 6, 0% 8827 326 354 92,1% 6 22 651 3,4% 8833 432 461 93,7% 7 178 868 20,5% 8838 323 374 86,4% 8 40 520 7,7% Total 2765 3094 89,4% Total 401 5012 8,0%
Exemplo 17 O girassol (Helianthus annuus L.) é uma cultura de importância agronómica pelo óleo e como alimento. As construções pMON45325 (Figura 2), pMON45332 (Figura 4), e pMON45331 (Figura 3) do presente invento foram usadas para transformar girassol. A transformação de girassol mediada por Agrobacterium foi descrita (Schrammeijer et al., Plant Cell Reports, 9:55-60, 1990; EP 0 486 234). Os métodos conhecidos dos familiarizados com área da transformação de 101 ΡΕ1240340 plantas com construções para a expressão de transgenes podem incluir hipocótilos, meristemas apicais, protoplasmas e outros tecidos do girassol. A linha de girassol transgénica SFB250-27 possui a cassete de expressão PMON20999 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93' ) ; SFB288-01, SFB295-09 possuem pMON45325 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93'::P-AtActll + intrão/CTP2-arOA:CP4/E93'); SFB289-01 possui pMON45332 (P-
AtEFla + intrão/CTP2-aroA:CP4/E93'::P-eFMV/CTP2-
aroA:CP4/E93' ); SFB303-08, SFB303-09, SFB303-11, e HA300B possuem pMON45331 (P-AtEFla + intrão/CTP2-aroA:CP4/E9). Estas linhas foram testadas relativamente à tolerância ao glifosato e estão apresentadas na Tabela 12.
No girassol, a tolerância reprodutiva ao glifosato pode ser medida em função da percentagem de cabeças normais, percentagem com tamanho normal das cabeças e produção de pólen. Estas plantas são aspergidas com glifosato nas fases foliares V-4 e V-8 numa taxa de 2,14 kg/ha (0,32 oz/acre) ou 4,48 kg/ha (64 onças/acre). As plantas de girassol foram avaliadas relativamente à tolerância vegetativa ao glifosato. A tolerância vegetativa foi conseguida em niveis de 2,24 e 4,48 kg/ha (32 e 64 oz/acre) de aspersão com glifosato nas fases foliares V4 e V8 do desenvolvimento da planta.
As linhas de girassol transgénicas com tolerância vegetativa ao glifosato foram classificadas relativamente ao número de cabeças normais, percentagem de cabeças normais, percentagem com tamanho normal das cabeças e 102 ΡΕ1240340 percentagem com disseminação de pólen normal. Estas caracteristicas foram quantificadas num teste de campo numa localização. A tabulação dos dados das pontuações das cabeças e da produção de pólen está na Tabela 12. As linhas seleccionadas a partir das construções do presente invento apresentam maior percentagem de cabeças normais, geralmente maior percentagem com tamanho normal da cabeça e melhor disseminação de pólen.
Tabela 12. Avaliação de resistência ao glifosato em girassol
Linha# #cabeças % de cabeças normais % de cabeças com tamanho normal % pólen disseminado SFB250-27 28 29 75 36 SFB288-01 11 36 73 73 SFB295-09 28 57 64 68 SFB289-01 13 38 92 38 SFB303-08 25 68 92 64 SFB303-09 43 81 88 88 SFB305-11 45 71 84 100 HA300B 30 100 97 97 Segregante 0 0 0 0 não trans 103 ΡΕ1240340
Exemplo 18
Os elementos reguladores que actuam em cis necessários para a regulação correcta do promotor podem ser identificados por uma série de meios. Num método, a análise de deleções é realizada para remover regiões do promotor e os fragmentos de promotor resultantes são testados relativamente à actividade de promotor. Os fragmentos de DNA são considerados necessários para a regulação do promotor se a actividade do promotor truncado for alterada comparativamente com o fragmento de promotor original. Através desta análise de deleções, podem ser identificadas pequenas regiões de DNA necessárias à regulação positiva ou negativa da transcrição. Os motivos da sequência do promotor podem ser igualmente identificados e novos promotores manipulados para conterem estes elementos cis para modulação da expressão de sequências ligadas operacionalmente susceptíveis de serem transcritas. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5223419, aqui incluida como referência na sua totalidade, a Patente U.S. N° 4990607 aqui incorporada como referência na sua totalidade e Patente U.S. N° 5097025 aqui incluida como referência na sua totalidade.
Uma abordagem alternativa é procurar sequências semelhantes entre promotores com perfis de expressão semelhantes. Os promotores com padrões sobreponiveis de actividade podem ter mecanismos reguladores comuns. Podem ser usados vários programas de computadores para 104 ΡΕ1240340 identificar sequências conservadas de motivos entre promotores, incluindo mas não estando limitado a MEME, SIGNAL SCAN ou GENE SCAN. Estes motivos podem representar locais de ligação para factores de transcrição que actuam na regulação dos promotores. Uma vez identificados os motivos de sequências, a sua função pode ser testada. Por exemplo, as sequências dos motivos podem ser deletadas do promotor para determinar se o motivo é necessário para o funcionamento correcto do promotor. Como alternativa, o motivo pode ser adicionado a um promotor mínimo para testar se é suficiente para activar a transcrição. Os elementos suspeitos de regulação negativa podem ser testados através da adição a um promotor activo e testando a redução da actividade do promotor. Alguns elementos reguladores que actuam em cis podem requerer outros elementos para funcionarem. Assim, podem ser testados múltiplos elementos em várias combinações através de uma série de métodos conhecidos dos familiarizados com a área.
Outros elementos de promotores podem actuar de forma aditiva ou sinergística afectando a actividade do promotor. Neste contexto, os elementos do promotor de diferentes regiões reguladoras 5' podem ser colocados em tandem para se obter um promotor com um espectro diferente de actividade ou com perfil de expressão diferente. Assim, combinações de elementos de promotores de fontes heterólogas ou duplicação de elementos semelhantes ou do mesmo elemento podem conferir um nível mais elevado de expressão de sequências ligadas operacionalmente 105 ΡΕ1240340 susceptíveis de serem transcritas. Por exemplo, um elemento de promotor pode ser multimerizado para aumentar os níveis de expressão especificamente no padrão afectado por esse elemento do promotor.
Os métodos técnicos necessários à construção de construções de expressão contendo os novos elementos reguladores 5' manipulados são conhecidos dos familiarizados com a área. Os promotores manipulados são testados em construções de expressão e testados transitoriamente através da ligação operacional dos novos promotores a um gene repórter adequado, como seja GUS e testando num ensaio transitório em plantas. Os novos promotores são ligados operacionalmente a um ou mais genes de interesse e incorporados numa construção para transformação de plantas juntamente com ou ou mais elementos reguladores adicionais e usados para transformar uma planta alvo com interesse através de um sistema de entrega de DNA adequado. As plantas estavelmente transformadas e subsequente progénie são avaliadas por uma série de métodos moleculares, de imunodiagnóstico, bioquímicos, fenotípicos ou de campo adequados para a avaliação das características pretendidas. 106 ΡΕ1240340
Listagem de sequências <110> Fincher, Karen L.
Flasinski, Stanislaw Wilkinson, Jack Q. <120> Novas construções para expressão em plantas
<130> 11898. 0018. 00PC00 MOBS018P <140> US 60/171,173 <141> 1999-12-16 <160> 30 <170> Patentln version 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 1 ttttttttga tatcaagctt caactatttt tatgtatgc 39 <210> 2 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <22 0> 107 ΡΕ1240340 <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 2 gcctcagcca tggtgagtct gctgcaaaca cacaaaaaga gttcaat 47 <210> 3 <211> 4 <212> DNA <213> Artificial <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 4 gcatcggcca tggtgagtct tctgcaatca aaaacataaa gatctga 47 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético 108 ΡΕ1240340 <400> 5 ttttttttta agcttgatat cacaaccaaa tgtcaaatgg 40 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> oligonucleótido sintético <4 0 0> 6 ccatctgcca tggtctatat cctgtc 26 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 7 ttttttttta agcttgatat cggaagtttc tctcttg 37
<210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial 109 ΡΕ1240340 <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 8 cttttcccat ggtagatctc tggtcaacaa ate 33
<210> 9 <211> 1219 <212> DNA <213> Arabidopsis Thaliana <400> 9 110 ΡΕ1240340 caaetafcttt tatgtatgca agagtcagca tâtgtataat tgatfccagaa tcgfctttgac 60 gagctcggat gtagtagtag ccafcfcafctta atgtacatac caatcgtgaa tagtgatatg 120 atgaaacatt gtaccttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag acacfcttctt ISO tcacggtccg aattaatcat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat tacgttgaat 240 tgtatgaaat etaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgee tggattgact 300 cggtttaagt taaceactaa aaaaacggag ctgtcatgfca acacgcggat cgagcaggtc 360 acagtcatga agccatcaaa geaaaagaac taaeccaagg gctgagatga ttaattagtt 420 taaaaattag tcaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt tatctttacc 480 tgtggtcgaa acgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg ccgaaaataa 540 agttgtaaga gataaacccg cctatataaa tfccatatatt ttcctctccg ctttgaattg 600 tctcgctgtc ctccteactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt gacagagaag 660 aaeaaggaag aagactaaga gagataafccc aggagattca ttcfcccgttt 720 tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc fcctttctttc caaggtaata ggaactttct 780 ggatctactt tatttgctgg atctegatct tgttttctca atttccttga gatctggaafc 840 tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag aatcgatcta 900 agttgaccga tcagttagcc cgattatagc caccagaatt tggcfctgacc ttgatggaga 960 gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat etgaactgtt 1020 gaagttagat tgaatctgaa cacfcgtcaat gttagattga atctgaacac tgtttaagtt 1080 agatgaagtt tgtgcataga ttcttcgaaa ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac 1140 agaaagctat ttctgattca atcagggttt atfctgactgt attgaactct ttttgcgtgt 1200 ttgeageaga ctcaccatg 1219
<210> 10 <211> 1271 <212> DNA <213> Arabidopsis Thaliana <22 0> <221> misc feature <222> (535)..(536) 111 ΡΕ1240340 <223> y = c ou t/u <220> <221> misc_feature <222> (561)..(561) <223> y = c ou t/u <400> 10 ccatttttct tttgcaeaat ccatgtttat ttttttattt tttfccatctt gcataattca 60 tgcctaaaag gatatataca tgggtctact acattetcet gacaccacgt tttatgtgtt 120 cgfcctfccfcga aaataatcat caaaatattt caggacttgt ttacgttttc aggagaaaaa 180 aaataactgt acccttttca atatagaaat aacatttgta gaaatcgtgg attttcctta 240 ataaacaatc caaaacacga ceaccgtfcgt ctcctcgact cggtaacacc cgatcgccga 300 cttgaaaatt agaagaaaaa tgaaaagaat aataaaaaaa aaaaaggaat gatgattgaa 360 gctgtcatat atgtcgaccc tatcacagtc aafcecaatag cctatattcg ccaactgata 420 tatccaacgg ctcacaaatt ttcacaaact tttcaaaaaa gtataataaa agaggctgtc 480 tgacagccat gtcacgttat actttttccg tatgatcgaa afcgattcgtc cctgyygaat S40 ttaattattt ccaaaactga ygactctaaa gaaaaaaaaa tagtttttca gataaacccg 600 cctatataaa tagttcaaca ctcggCttat ttcttctccc ctcaaagaat tgcctcgtcg 660 tcfcteagctt categgeegt tgcatttcce ggcgataaga gagagaaaga ggagaaagag 720 tgagccagtt cttcatcgtc gtggfctcttg tttcttcctc gatctctcga tcttetgcct 780 ttgcttttcc gattaaggta áttaaaacct ccgatctact tgttctfcgfcg ttggatctcg 840 atcaegattt ctaagttacc ttcaaaagtt gtttccgatt tgattttgat tggaatfctag 300 atcggteaaa ccactggaaa fcttttgatcc tggcaccgat tagctcaacg attcatgttt 360 gacttgatct tgcgttgtafc ttgaaatcga tccggatcct ttcgcttctt cfcgtcaatag 1020 gaatccgaaa tttgaaafcgt tagtfcgaagt ttgacttcag attctgttga tttattgact 1080 gtaacatttt gtcttccgat gagtafcggat: tcgfcfcgaaat ctgctttcat tatgafctcta 1140 ttgatagata catcatacat tgaattgaat ctactcatga atgaaaagcc tggtttgacc 1200 aagaaagtgt tttcggtttt ctcgaCcaag attcagatct Ctatgttttfc gattgcagat 1260 112 ΡΕ1240340 1271 cgtagaccat g
<210> 11 <211> 1393 <212> DNA <213> Arabidopsis Thaliana <4 0 0> 11 113 ΡΕ1240340 acaaeeaaafc gtcaaatgga atgcãtcaga gaecaaacct gtaagagtcc acaaaacaat 60 fccaaagaaag aacatcaaca attcagagat tcaatcccaa aacaaaaaga gaacfcgaaae 120 caaatcgtac ctacacgacc agtgaagaca ccaatagaga gctctgtcgt agaatacaac ISO aeatcaagcg caattagcag aaãcagtctc ttcatctgcc gatttccact cgtcactact 240 ccaaaaacct cccaaaccat fcteeaaaaca gacacttttg ccatgcctac atcttcccet 300 tccccgaaaa açacatcatt tccatcaacg gagtaaatat ceggeggcat atcgatgctc 360 gagaccgtcc fcatcgagaaa aggcttagcc gcfcfcccgtga ccgccggcgt tcgtggaccg 420 tgagattgct gaaaegagcg agaataagca agcetccgat cattagcagc atatccgaca 480 tcgctgctcc gatcatcagg gagctcgtta tcgcctcgag gaccaaagga aatggatcte 540 tccattttct tctttgatefc taaagtfccca acctcggcaa ataotaaaat caacagtcag 600 ccgcacaaag aaactctgct batacagtaa agtcaatggg ccacfcgttct aagcçeataç 660 ataattttag aagcccatag aatacaaaag agtcaagaag cattgaccgc acaagaaaaa 720 aacaattgtt aaaaagggtc ggttagtgtg tatgtatata tgaaatgcaa caaacattat 780 aeagcccatt aaatacggtt gtcacaggta gatgteccça ttaaggaact ttatccagcc 840 cafctaaatta ctttacagag taaaagagag agagaagatc tacagttacg ttaccaaatt 900 ttcgaaatga tttaattagt aataaataaa taattaaatg fccagttacfcc ccfcttagaaa 960 getaaafcaag acagcfcgttt ccaccaacaa cgtgactggt cgtggggtcc tcctCcgttc 1020 aaagtgatat tcagaaatca acggctgaga tcttctccat caatatttafc tacgggccta 1080 ttccttcctt tçttaaactt caactctccg gctcacattc tettcttcat tcgctccgtt 1140 tctctctcaa aaactacaca ceegtaccac accaccaccc tcctcgtttc ctcagagafcc 1200 ççctctctaa cttctaaggt aatcacattt ccataacgtt ccatcgtcat tgattcttca 1260 ttagtafcgcg tttatgaagc tttttcaatt taattctctt tggtagatcfc taagattect 1320 ctgtttcttg caaaataaag ggttcaatta tgctaatatt· ttttatatca attttgacag 1380 gatatagacc a cg 1393
<210> 12 <211> 1160 <212> DNA <213> Arabidopsis Thaliana 114 ΡΕ1240340 <22 0> <221> misc_feature <222> (565).. (565) <223> y = c ou t/u <22 0> <221> misc_feature <222> (571)..(571) <223> y = c ou t/u <22 0> <221> misc_feature <222> (638)..(638) <223> η = a ou g or c ou t/u <22 0> <221> misc_feature <222> (656)..(656) <223> n = a ou g or c ou t/u <4 0 0> 12 115 ΡΕ1240340 ggaagtettcr. etcttgaggg aggttgctcg tggaatggga cacatacggt fcgttataata 60 aaccatttec attgfccatga gatfcttgagg ttaatacaca ctttacttgt tcattatttt 120 atttggtgtt tgaataaatg atataaatgg ctcttgataa cctgcattca ttgagatatc 180 aaatatttac tctagagaag agtgtcâtat agattgatgg tccacaacca atgaaatttt 240 tgggagacga acatgtataa ccatttgctt gaataaecfcfc aattaaaagg tgtgattaaa 300 tgatgttfcgt aacatgtagt actaaacatt cataaaacac aaccaaccca agaggtattg 360 agtattcacg gctaaacagg ggeafcaatgg taatctaaag aatgatatta ttttatgtta 420 aaccctaaca tfcggtttcgg attcaacgct ataaataaaa ccactctcgfc tgctgattcc 480 âtttategtc cttattgacc etagccgcta caeacttttc tgcgatatct ctgaggtaag 540 cgtxaacgta cccttaratc gttcyttttc yttttogtct gctgatcgfct gctcafcatta 600 tttcgatgat tgttggattc gatgctcttt gttgattnat cgttctgaaa attctnatct 660 gttgtttaga ttttatcgat tgttaatatc aacgtttcac tgcttctaaa cgataattta 720 ttcatgaaac tattttccca ttctgatcga tcttgtttfcg agattttaat ctgttcgatt 780 gattgctggc cggtggatct atatacgagt gaacttgttg atttgcgtat ttaagatgta 840 fcgtegatttg aattgfcgatt gggtaattct ggagtagcat aacaaatcca gtgttccctt 900 tttotaaggg taattcccgg attgtt cgct ttatatctct fcgaaattgcc gatttgactg 960 aatttagctc gcttagctea gatgatagag caccacaatt tttgtggtag aaatcggttt 1020 gacfcccgafca gcggettttt actatgattg ttttgtgtta aagatgattt tcataatggt 1080 tatatatgec tactgttttt attgattcaa tatttgafctg ttcttttttt tgcagatctg 1140 ttgaccagag atctaccatg 1160 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 13 cccaagctta aatgacatca gatacacgc 29 116 ΡΕ1240340
<210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 14 cataagctta gaggtccaaa ttca 24 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 15 ccatcagcca tggtcttcta cctttatgca aa 32 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <22 0> 117 ΡΕ1240340 <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 16 ccaagcttac cacactcaga tgcataaaca aacaca 36 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 17 catcagccat ggtctactct ctgcaaaaac a 31 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 18 gcaaagctta ctagtcaaca attggcc 27 <210> 19 <211> 28 118 ΡΕ1240340 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <4 0 0> 19 gatcggccat ggttcactaa aaaaaaag 28 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido sintético <400> 20 ggaagcttgc ggccgctttc tactctacat gtttct 36
<210> 21 <211> 31 <212> DNA <213> Oligonucleótido sintético <400> 21 gactagccgc catggttcaa tctctagctg a 31 <210> 22 119 ΡΕ1240340
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(1198) <223> n = a ou g or c ou t/u <220> <221> misc_feature <222> (1216) .. (1216) <223> n = a ou g or c ou t/u <220> 128 ΡΕ1240340 <221> misc_feature <222> (1125) . . (1125) <223> y = c ou t/u <22 0> <221> misc_feature <222> (1131) . . (1131) <223> y = c ou t/u <400> 28 aatfcctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggt.acagag tctccaaaec attagccaaa 60 agctacagga gatcaatgaa gaatcttcaa tcaaagtaaa ctactgttcc agcacatgca 120 tcatggteay taagtfctcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtfca gtgggcatcfc 3,80 tcgaaagtaa tettgteaac atcgagcagc cggcttgfcgg ggaccagaca aaaaaggaat 240 129 ΡΕ1240340 ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatcttcg cctttatcgc aaagataaag 30Í cagattccte tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagcfcgt ectgacagce 36< cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattagc ttgagctcag 42t gatttagçag cattccagat fcgggtteaat caaçaaggta cgagccatat cactttattc 48< aaafctggttat cgccaaaacc aagaaggaac tcccafccctc aaaggtttgt aaggaagaat 540 tcgafcatcaa gcttgatatc ggaagtttct cccttgaggg aggtfegctcg tggaatggga 600 cacafcatggt tgttataata aaccacttcc atfcgtcatga gattfctgagg ttaatatata 660 ctttacttgt tcattatttt atttggtgtt tgaacaaatg atataaatgg etcttgataa 720 tctgcattca ttgagafcatc aaatafcttac tctagagaag agtgtcatat agattgatgg 780 cccacaatca atgaaatttt tgggagacga acatgtataa ccatfctgctt gaataacett 840 aattaaaagg tgtgattaaa tgatgttfcgt aacatgtagt actaaacatt cataaaacac 500 aaccaaccca agaggtattg agtattcacg gctaaacagg ggcataatgg taatttaaag 960 aacgatatta ttttatgtta aaccctaaca ttggtfctcgg attcaaogct ataaataaaa 1020 ccactctcgt tgctgattcc attfcafccgfct cttattgacc ctagccgcta cacacttttc 1080 tgcgatatec etgaggtaag cgttaacgta cccttaratc gttcyttttc yttttcgfccfc 1140 gctgatcgtt gctcatatta tctcgatgat tgttggattc gatgcccttt gttgattnat 1200 cgttctgaaa attctnatct gttgtttaga tfcttatcgat tgttaatatc aacgtttcac 1260 fcgcttctaaa cgataattta ttcatgaaac tatttfcccca ttctgatcga tcttgfctttg 1320 agatfcttaat tcgttcgatc gattgttggt tggtggatct atatacgagt gaacttgttg 1380 atttgcgtat ttaagatgta tgtcgatttg aattgfcgatt gggtaattct ggagtagcat 1440 aaeaaatcca gfcgttccctt fcfcfcctaaggg taattctegg at&gtttgcfc ttatatct.cc 1500 tgaaattgcc gattcgattg aatttagctc gcttagctca gatgatagag caecacaatt 1560 tttgtggfcag aaatcggttt gactccgata gcggcttttt actatgattg ttttgtgfcfca 1620 aagatgattt tcataatggt tacatatgtc tactgttttt attgattcaa tatttgattg 1680 ttcttttttt tgcag 1695
<210> 29 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial 130 ΡΕ1240340 <22 0> <223> sintético <22 0> <221> misc feature <222> (1068 )..(1069) <223> Υ = c ou t/u <22 0> <221> misc feature <222> (1094) .. (1094) <223> Υ = c ou t/u <400> 29 131 ΡΕ1240340 ggtccgatgt gagaetttte aaeaaagggt aatafcecgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta tfcgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcatfcgc gataaaggaa aggccatcgt fcgaagatgcc tctgccgaca gcggtcccaa ISO agacggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtettc 240 aaagcaagtg gattgatgtg acggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tccgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggcgg ctcctacaaa tgccatcatt gegataaagg aaaggccate gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagafcggac ccccacccac gaggagcato gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggatfcgatg tgatatcaag cttccacttt S40 tcfctctgcafc aattcatgtt tattttttta tttttttcat ctfcgcataat tcatgtttaa 600 aaggatatac acatgggtet actacattct cctgaeatta cgttttatgt gtttgtcfctc 660 tgaaaataat eateaaaata tttcaggaet tgtttacgtt fctcaggagaa aaaaaataac 220 tgtacccttt tcaacataga aataacattt gtagaaafccg tggattttcc ttaataaaca 780 atccaaaaca cgaccaccgt tgtctcctcg actcggtaac acccgatcgc cgacttgaaa 840 attagaagaa aaafcgaaaag aataataaaa aaaaaaaagg aatgatgatt gaagctgfcca 900 tatafcgtcga ccctafccaca gfccaatccaa tagcctatat tcgccaactg atacatccaa »60 cggcfccacaa attttcacaa acttttcaaa aaagtataac aaaagaggct gtctgacagc 1020 eatgtcaegt tataettttt ccgtatgatc gaaatgafctc gtctttgyyg aatttaatta 1080 ctfcccaaaat tgaygactct aaagaaaaaa aaatagttrtt tcagataaac ccgcctatat 1140 aaatagttca acactcggtt tatttcttct cccctcaaag aattgccfceg tcgtcttcrag 1200 cttcatcggc cgttgcattt cccggcgata agagagagaa agaggagaaa gagtgagcca 1260 gatctfccatc gtcgtggtcc tccgatcaag gtaattaaaa ttgtttcttc ctcgatctct ectccgatct acttgttctt cgatcttcfcg gtgttggatc ctfcttgcctt tcgattacga 1320 1380 tttctaagtt accttcaaaa gttgtfctccg atttgatttt gattggaatt tagatcggtc 1440 aaactactgg aaatttttga tcctggcacc gattagctca acgattcatg tttgacttga 1500 fccttgcgfcfcg tatttgaaat egatccggat cctttcgctt cttctgtcaa taggaatctg 1560 aaatttgaaa tgttagttga agtttgactt cagattctgt tgatttattg actgtaacat 1620 tttgtcttcc gacgagtatg gattcgttga aatctgcttt cattatgatt ctattgatag 1680 atacatcata cattgaattg aatcfcactca tgaatgaaaa gcctggtttg attaagaaag 1740 tgttttcggt tttctcgatc aagattcaga tetttatgtt tttgattgca gatcgtagac 1800 132 ΡΕ1240340 <210> 30 <211> 1742 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 30 gtccgatgtg agacttttca acaaagggtã atatccggaa aeefcectcgg at&ecattgc 60 ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc 120 eatcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa 180 gatggacccc cacccacgag gagcategtg gaaaaagaag acgttccaac cacgfccttca 240 aagcaagtgg attgatgtga cggtccgatg tgagactttt caaçaaaggg taatatccgg 300 aaaceccctc ggaxtccatt gceeagctat ctgteacfctfc attgtgaaga tagtggaaaa 360 ggaaggtggc ccctacaaat geeatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc 420 ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga 480 agacgfctcca aecaegfcctt caaagcaagt ggattgatgt gatatcaagc ttcraacfcatt 540 fcttatgtatg eaagagtcag catatgtata attgattcag aatcgfcfcttg acgagttcgg 600 atgtagfcagfc agccattatt taatgfcacat acfcaatcgtg aafcagtgata cgatgaaaca 660 ttgtatctca ttgtataaat atccataaac acatcatgaa agacactttc fctfccacggtc 720 tgaattaatt atgafcacaao tctaatagaa aacgaattaa attacgttga afefcgtatgaa 780 atctaattga acaagccaac cacgacgacg actaacgttg cctggattga ctcggttwa 840 gttaaccact aaaaaaacgg agetgtcatg taacacgcgg «tcgagcagg tcacagtcat 900 133 ΡΕ1240340 gaagceatca aagcaaaaga actaatccaa gggcfcgagat gattaattag tttaaaaatt 960 agttaacacg agggaaaagg ctgtctgaca gccaggtcac gttatcttta cctgtggtcg 1020 aaatgactcg cgtctgccga ttttaattat ttttttgaaa ggccgaaaat aaagttgtaa 1080 gagataaacc cgcctatata aafctcatata ttttcctctc cgctttgaafc tgtctcgttg 1140 tcctcctcac tttcafccagc cgtcttgaat ctccggcgac ttgacagaga agaaeaagga 1200 agaagactaa gagagaaagt aagagataat ccaggagatt cattefccegt tttgaatctt 1260 cctcaatctc atcttcttcc gctctttctt tccaaggtaa taggaacttt ctggatctac 1320 ttfcatttgcc ggatcccgat cttgttttct caatttcctt gagafcctgga attcgtttaa 1180 tttggatctg tgaacctcca ctaaatcttt tggttttact agaatcgatc taagttgacc 1440 gatcagttag ctcgattata gctaccagaa tttggcttga ccttgatgga gagatecatg 1500 ttcatgctac ctgggaaatg atttgtatat gtgaattgaa atctgaactg ttgaagttag 1S60 attgaatctg aacactgtca atgttagatt gaatctgaac actgtttaag ttagatgaag 1620 tttgtgfcata gattcttcga aactttagga tttgtagtgt cgtacgttga acagaaagct 1680 atttctgatt caatcagggt ttatttgact gtattgaaefc ctfcttcgtgt gtttgcagca 1740 ga 1742
Lisboa, 25 de Julho de 2012

Claims (30)

  1. ΡΕ1240340 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um promotor híbrido compreendendo a sequência como descrita em SEQ ID NO:28.
  2. 2. Uma construção de DNA compreendendo: uma ou mais cassetes de expressão compreendendo o promotor híbrido da reivindicação 1 e uma sequência de DNA estrutural operacionalmente ligada ao promotor híbrido.
  3. 3. Uma construção de DNA da reivindicação 2, em que a referida sequência de DNA estrutural está ainda operacionalmente ligada a uma região não traduzida 3'.
  4. 4. A construção de DNA da reivindicação 2 ou 3, em que a sequência de DNA estrutural é um gene de tolerância a herbicida.
  5. 5. A construção de DNA da reivindicação 4, em que o gene de tolerância a herbicida é um gene de tolerância ao glifosato.
  6. 6. A construção de DNA da reivindicação 5, em que o gene da tolerância ao glifosato é um gene da sintetase de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSP sintetase) ou um gene da oxido-redutase de glifosato (GOX).
  7. 7. A construção de DNA da reivindicação 5, em 2 ΡΕ1240340 que o gene de tolerância ao glifosato é um gene aroA:CP4.
  8. 8. A construção de DNA da reivindicação 7, em que o gene aroA:CP4 está ainda operacionalmente ligado a uma sequência de DNA estrutural codificadora de um péptido de trânsito para o cloroplasto (CTP), em que o referido CTP é CTP2 de Arabidopsis (CTP2-aroA:CP4).
  9. 9. A construção de DNA da reivindicação 3, em que a região não traduzida 3' compreende um terminador da transcrição.
  10. 10. A construção de DNA da reivindicação 98 ou 9, em que CTP2-aroA:CP4 está ainda operacionalmente ligado à região de terminação 3' E9 (CTP2-aroA:CP4-E93').
  11. 11. A construção de DNA da reivindicação 2, em que uma ou mais cassetes de expressão compreendem um promotor hibrido da reivindicação 1 operacionalmente ligado a uma sequência de DNA estrutural codificadora de aroA:CP4 EPSPS como se mostra na FIG. 11 ou 13, sequência de DNA estrutural essa que está operacionalmente ligada a uma sequência de DNA estrutural codificador de CTP2 e à região de terminação 3' E9.
  12. 12. Construção de DNA da reivindicação 2 compreendendo uma primeira e uma segunda cassete de expressão como se mostra na FIG. 7, em que a primeira cassete de expressão compreende um promotor hibrido da 3 ΡΕ1240340 reivindicação 1 ligado operacionalmente a uma sequência de DNA estrutural codificadora de aroA:CP4 EPSPS, sequência de DNA estrutural essa que está ainda operacionalmente ligada a uma sequência de DNA estrutural codificadora de CTP2 e a uma região de terminação 3' de E9 e a segunda cassete de expressão compreende um promotor híbrido CaMV-Act8 operacionalmente ligado a uma sequência de DNA estrutural codificadora de aroA:CP4 EPSPS, sequência de DNA estrutural essa que está ainda operacionalmente ligada a uma sequência de DNA estrutural codificadora de CTP2 e a uma região de terminação 3' E9.
  13. 13. A construção de DNA da reivindicação 2, em que a sequência de DNA estrutural é um gene de controlo de insectos de Bacillus thuringiensis.
  14. 14. Uma célula vegetal transgénica compreendendo a construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13.
  15. 15. Uma planta transgénica compreendendo a construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13.
  16. 16. caracterizada glifosato e reprodutivo. A planta transgénica da reivindicação 15, ainda por ter tolerância vegetativa ao apresentar destruição baixa do tecido 4 ΡΕ1240340
  17. 17. A planta transgénica da reivindicação 16, em que a planta é capaz e tolerar a exposição a uma taxa até 17,93 kg/ha (256 oz/acre).
  18. 18. A planta transgénica da reivindicação 16, em que a planta é capaz de tolerar a exposição ao glifosato numa taxa que varia entre 1,12 e 4,48 kg/ha (16 a 64 oz/acre).
  19. 19. A planta transgénica de qualquer uma das reivindicações 15 a 18, em que a referida planta é uma planta cultivada monocotiledónea.
  20. 20. A planta transgénica da reivindicação 19, em que a referida planta cultivada monocotiledónea é centeio, milho, arroz, sorgo ou trigo.
  21. 21. A planta transgénica de qualquer uma das reivindicações 15 a 18, em que a referida planta é uma planta cultivada dicotiledónea.
  22. 22. A planta transgénica da reivindicação 21, em que a referida planta cultivada dicotiledónea é alfafa, tomateiro, soja, algodoeiro, canola ou girassol.
  23. 23. A planta transgénica da reivindicação 22, em que a referida planta cultivada dicotiledónea é o algodoeiro compreendendo a construção de DNA como se mostra na FIG. 7, o referido algodoeiro tendo um valor de mapa de 5 ΡΕ1240340 cápsulas de algodão superior ou igual a 3 após a exposição a glifosato aplicado após a fase de 4 folhas, em que o valor do mapa de cápsulas de algodão é determinado por aspersão do algodoeiro após a fase de 4 folhas com glifosato numa taxa de 3,36 kg/ha (48 oz/acre), permitindo ao algodoeiro crescer até à maturidade e determinando o número de cápsulas das primeiras posições para as cinco primeiras bolas.
  24. 24. Uma semente da planta transgénica da reivindicação 15, em que a referida semente compreende a referida construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13.
  25. 25. Uma semente de acordo com a reivindicação 24, em que a referida semente é uma semente transgénica seleccionada do grupo consistindo em sementes de Arabidopsis thaliana, soja, canola, trigo, milho, algodão e tomate.
  26. 26. Um produto útil em termos agronómicos processado a partir da planta transgénica da reivindicação 15, em que o produto compreende a construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13.
  27. 27. Utilização do promotor híbrido da reivindicação 1 na construção de uma planta transgénica, em que a referida planta transgénica compreende o referido promotor híbrido. 6 ΡΕ1240340
  28. 28. Um método de produção de uma planta transgénica, compreendendo a regeneração da célula vegetal transgénica da reivindicação 14 numa planta transgénica, em que a referida planta transgéncia compreende a referida construção de DNA.
  29. 29. Um método de expressão de uma sequência de DNA estrutural numa planta, o método compreendendo: (1) Obtenção de uma construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 13; (2) Introdução da construção de DNA numa célula vegetal; e (3) Regeneração da célula vegetal para produzir a planta, de forma que a sequência de DNA estrutural seja expressável na planta.
  30. 30. Um método de controlo de ervas daninhas, o método compreendendo: (1) Obtenção de uma planta transformada com uma construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12; e (2) aplicação à planta de uma quantidade suficiente de glifosato para controlar ervas daninhas sem danificar a planta. Lisboa, 25 de Julho de 2012
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