JP2003516753A - 植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物 - Google Patents

植物における異種ポリペプチドの発現のためのｄｎａ構築物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は新規植物発現構築物に関する。より明細には、本発明は、植物において作動可能に連結された遺伝子の発現を調節するための５’調節配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の分野） 本発明は、植物における遺伝子発現の制御のための核酸分子、特に新規植物プ
ロモーターの単離と使用に関する。
【０００２】 （発明の背景） 植物遺伝子工学の目標の１つは、作物栽培学的に重要な特性又は形質を備えた
植物を生産することである。遺伝子工学における最近の進歩は、外来遺伝子を含
み且つ発現するトランスジェニック植物を生産するために不可欠のツールを提供
した（Ｋａｈｌら、Ｗｏｒｌｄ Ｊ．ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃ
ｈ．１１：４４９−４６０，１９９５）。植物遺伝子工学の対象となる特に望ま
しい形質あるいは品質は、昆虫、菌類病及び他の有害生物や病害を引き起こす因
子に対する抵抗性、除草剤に対する耐性、高い安定性又は保存性、収率、環境耐
性及び栄養強化を含むであろうが、これらに限定されない。植物の形質転換と再
生におけるテクノロジーの進歩は、研究者達が異種又は天然のソースからの１個
又はそれ以上の遺伝子のような外因性ＤＮＡを取り出し、かかる外因性ＤＮＡを
植物ゲノムに組み込むことを可能にした。１つのアプローチでは、特定植物又は
植物組織において通常は発現されない新規遺伝子の発現が、所望する表現型効果
を与えることができる。また別のアプローチでは、アンチセンス方向での遺伝子
又は遺伝子の部分の転写が、外因性遺伝子の発現を妨げる又は抑制することによ
って所望する効果をもたらすこともある。
【０００３】 トランスジェニック植物を生産するためには、植物において発現されたとき所
望する表現型を与える異種遺伝子配列を含む構築物を植物細胞に導入する。構築
物はまた、異種遺伝子配列に作動可能に連結された植物プロモーターを含み、し
ばしばプロモーターは通常は異種遺伝子と結合しない。次に構築物を植物細胞に
導入して形質転換植物細胞を生成し、かかる形質転換植物細胞をトランスジェニ
ック植物へと再生させる。プロモーターは、プロモーターが作動可能に連結され
ている導入ＤＮＡ配列の発現を制御し、従ってＤＮＡ配列によって付与される所
望特性に影響を及ぼす。
【０００４】 １個又はそれ以上の遺伝子が、植物の成長及び生育期間の適切な時期に、植物
における至適な位置で、そして所望する効果を生じるために必要な量で、効率的
に転写されるように、様々なプロモーターを遺伝子発現に合わせて作製すること
は好都合であろう。例えば、遺伝子産物の構成的発現は、植物のある部位では有
益であるが、他の部位ではあまり有用でないことがありうる。また別の場合には
、植物の特定の生育段階で、あるいは特定の環境又は化学的刺激に応答して産生
される遺伝子産物を得ることは有益であると考えられる。遺伝学的に改善された
生殖質の商業的開発はまた、作物に多数の形質を導入する段階、しばしば遺伝子
スタッキングアプローチと称される段階へと進んできた。このアプローチでは、
対象とする異なる特性を付与する多数の遺伝子を植物に導入することができる。
多数の遺伝子を植物に導入するときには、各々の遺伝子が至適発現のために調節
又は制御されていること、そして遺伝子の沈黙化の潜在的可能性を低減するため
に調節要素は多様であることが重要である。これらやその他の配慮に照らして、
遺伝子発現の至適制御と調節要素の多様性が植物バイオテクノロジーにおいて重
要であることは明白である。
【０００５】 （発明の概要） 本発明は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）アクチン（Ａｃｔｉｎ
）プロモーター配列Ａｃｔ１ａ、Ａｃｔ１ｂ、Ａｃｔ２、Ａｃｔ３、Ａｃｔ７、
Ａｃｔ８、Ａｃｔ１１、Ａｃｔ１２及び延長因子１α（ＥＦ１α）プロモーター
配列、及び作物細胞において機能する異種構造遺伝子配列に作動可能に連結され
たこれらのプロモーターから誘導される断片及びシスエレメントを含むＤＮＡ植
物発現構築物に関する。
【０００６】 それ故、本発明の１つの実施形態に従えば、作動可能に連結された、作物の細
胞において機能性である、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号
１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号
２６から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備えるプロモーター、プ
ロモーターに対して異種の構造ＤＮＡ配列、及び植物においてＲＮＡ配列の３’
末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非
翻訳領域を含む、組換えＤＮＡ構築物が提供される。例えば、プロモーターは基
本的に、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２
２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６のいずれかか
ら誘導される５’調節領域（その中に位置するイントロン配列を含めて又は除い
て）から構成されうる。構造遺伝子は、配列の発現がトランスジェニック作物に
おいて作物栽培学的に有用な形質又は産物をもたらす、いかなる異種ヌクレオチ
ド配列も含みうる。
【０００７】 本発明のもう１つの局面は、作物の除草剤耐性を付与するために用いられる蛋
白質をコードする、本発明のプロモーター配列に作動可能に連結された構造ＤＮ
Ａ配列を含むＤＮＡ構築物である。この除草剤耐性蛋白質は、単独の又は１つ又
はそれ以上のグリホセート分解性蛋白質遺伝子と組み合わせた、グリホセート耐
性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子のようなグリホセート耐性蛋白質遺伝子を含むが、
これらに限定されない。
【０００８】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、プロモーターが、カリモウイルス（ｃ
ａｕｌｉｍｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、例えばカリフラワーモザイクウイルス
３５Ｓプロモーター又はゴマノハグサ（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスプロ
モーターのような異種プロモーター配列に作動可能に連結された、配列番号９、
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配
列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上から誘導される
少なくとも１個のシスエレメントを含むハイブリッド又はキメラプロモーターで
ある、上述したようなＤＮＡ構築物が提供される。
【０００９】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、プロモーターが、トランスジェニック
作物細胞において発現する異種遺伝子配列に作動可能に連結された、配列番号９
、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、
配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上から誘導され
る少なくとも１個のシスエレメントを含むハイブリッド又はキメラプロモーター
である、上述したようなＤＮＡ構築物が縦列で提供される。キメラプロモーター
配列は、より特定すると配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番
号３０において同定される配列を含む。
【００１０】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、ＤＮＡ構築物を植物細胞に導入したと
き、グリホセート１リットル当たり少なくとも５０グラム酸当量（ｇ ａ．ｅ．
／ｌ）を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与するように、
構造ＤＮＡ配列がグリホセート耐性遺伝子である、上述したようなＤＮＡ構築物
が提供される。他の関連実施形態では、ＤＮＡ構築物は、より高いグリホセート
濃度、例えばグリホセート１リットル当たり少なくとも３００グラム酸当量を含
むグリホセート製剤に対する耐性を植物細胞に付与する。１つの実施形態に従え
ば、ＤＮＡ構築物は、例えば１エーカー当たり１６オンス（ｏｚ）の割合のＲｏ
ｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（登録商標）の少なくとも１回の施用に対する耐性を植
物細胞に付与し、また他の実施形態では、グリホセート耐性は、例えば１エーカ
ー当たり１６オンス、１エーカー当たり３２オンス、又は１エーカー当たり６４
オンスの１回から２回又はそれ以上の施用にまで及ぶ。
【００１１】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、単子葉植物種及び双子葉植物種を含め
て、上述したようなＤＮＡ構築物で形質転換されたトランスジェニック作物が提
供される。我々は、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌナズナＥＦ１αプロモ
ーターが、ａｒｏＡ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺伝子の発現を制御する
ために使用したとき、植物が修業的施用率のグリホセートを許容し、良好な栄養
耐性と生殖組織への低い損傷を示す、例えば綿、トマト及びヒマワリのような他
の作物種において十分に活性であることを発見した。そのようなプロモーターは
また、植物において、除草剤耐性、昆虫の防除、病害抵抗性、高い安定性又は保
存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他の所望するポリペプチド産物の発現
、あるいは植物生理又は形態における望ましい変化、等を付与する遺伝子を含む
がこれらに限定されない、対象とする他の遺伝子を発現するために使用できる。
【００１２】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌ
ナズナＥＦ１αプロモーターを含む多数のＤＮＡ構築物で形質転換され、ａｒｏ
Ａ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺伝子の発現を制御するために使用したと
き、植物が修業的施用率のグリホセートを許容し、良好な栄養耐性と生殖組織へ
の低い損傷を示す、例えば綿、トマト及びヒマワリのような他の作物種において
十分に活性であるトランスジェニック作物植物が提供される。そのようなプロモ
ーターはまた、植物において、除草剤耐性、昆虫の防除、病害抵抗性、高い安定
性又は保存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他の所望するポリペプチド産
物の発現、あるいは植物生理又は形態における望ましい変化、等を付与する遺伝
子を含むがこれらに限定されない、対象とする他の遺伝子を発現するために使用
できる。
【００１３】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、シロイヌナズナアクチン及びシロイヌ
ナズナＥＦ１αプロモーターを、ａｒｏＡ：ＣＰ４のようなグリホセート耐性遺
伝子の発現を制御するために使用したとき、植物が修業的施用率のグリホセート
を許容し、良好な栄養耐性と生殖組織への低い損傷を示す、例えば綿、トマト、
キャノーラ、ダイズ及びヒマワリのような他の植物種で十分に活性な、植物にお
けるプロモーター活性を備えるカリモウイルスＤＮＡ分子と融合したキメラＤＮ
Ａ分子として含むＤＮＡ構築物で形質転換されたトランスジェニック作物が提供
される。そのようなプロモーターはまた、植物において、除草剤耐性、昆虫の防
除、病害抵抗性、高い安定性又は保存性、より高い収率、栄養強化、製薬又は他
の所望するポリペプチド産物の発現、あるいは植物生理又は形態における望まし
い変化、等を付与する遺伝子を含むがこれらに限定されない、対象とする他の遺
伝子を発現するために使用できる。
【００１４】 本発明のもう１つの実施形態に従えば、植物において構造ＤＮＡ配列を発現す
るための方法が提供される。そのような方法は、上述したようなＤＮＡ構築物を
提供し、かかるＤＮＡ構築物を植物細胞に導入して、構造ＤＮＡが植物において
発現可能であるように植物細胞を再生して植物を生産することを含む。関連実施
形態に従えば、雑草を防除する方法が提供され、かかる方法においては、ＤＮＡ
構築物がグリホセート耐性遺伝子を含み、作物を有意に害することなく雑草を防
除するのに十分な量のグリホセートをかかるＤＮＡ構築物で形質転換した作物に
施用する。
【００１５】 （図面の簡単な説明） 図１は、ｐＣＧＮ８０８６のプラスミドマップである。 図２は、ｐＭＯＮ４５３２５のプラスミドマップである。 図３は、ｐＭＯＮ４５３３１のプラスミドマップである。 図４は、ｐＭＯＮ４５３３２のプラスミドマップである。 図５は、ｐＣＧＮ９１９０のプラスミドマップである。 図６は、ｐＣＧＮ９１５３のプラスミドマップである。 図７は、ｐＣＧＮ８０９９のプラスミドマップである。 図８は、ｐＣＧＮ８０８８のプラスミドマップである。 図９は、ｐＣＧＮ８０６８のプラスミドマップである。 図１０は、ｐＣＧＮ８０９６のプラスミドマップである。 図１１は、ｐＣＧＮ９１５１のプラスミドマップである。 図１２は、ｐＭＯＮ１０１５６のプラスミドマップである。 図１３は、ｐＭＯＮ５２０５９のプラスミドマップである。 図１４は、ｐＭＯＮ５４９５２のプラスミドマップである。 図１５は、ｐＭＯＮ５４９５３のプラスミドマップである。 図１６は、ｐＭＯＮ５４９５４のプラスミドマップである。 図１７は、ｐＭＯＮ５４９５５のプラスミドマップである。 図１８は、ｐＭＯＮ５４９５６のプラスミドマップである。
【００１６】 （配列表の簡単な説明） 配列番号１は、Ａｃｔ２プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライ
マーである。
【００１７】 配列番号２は、Ａｃｔ２プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライ
マーである。
【００１８】 配列番号３は、Ａｃｔ８プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライ
マーである。
【００１９】 配列番号４は、Ａｃｔ８プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライ
マーである。
【００２０】 配列番号５は、Ａｃｔ１１プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプラ
イマーである。
【００２１】 配列番号６は、Ａｃｔ１１プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプラ
イマーである。
【００２２】 配列番号７は、ＥＦ１プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプライマ
ーである。
【００２３】 配列番号８は、ＥＦ１プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプライマ
ーである。
【００２４】 配列番号９は、Ａｃｔ２遺伝子のイントロン配列を含むＡｃｔ２プロモーター
の配列である。塩基１−７６４位はプロモーター配列を表わす；塩基７６５−１
２１５位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’非翻訳領域（５
’ＵＴＲ）の５個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基５９７位に位置する。
【００２５】 配列番号１０は、Ａｃｔ１８遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ８プロモー
ターの配列である。塩基１−７９７位はプロモーター配列を表わす；塩基７９８
−１２５９位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴＲの１
０個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基６４６位に位置する。
【００２６】 配列番号１１は、Ａｃｔ１１遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１１プロモ
ーターの配列である。塩基１−１２１８位はプロモーター配列を表わす；塩基１
２１９−１３８１位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴ
Ｒの１０個の塩基を表わす；転写開始部位は塩基１０６２位に位置する。
【００２７】 配列番号１２は、ＥＦ１遺伝子の第一イントロンを含むＥＦ１プロモーターの
配列である。塩基１−５３６位はプロモーター配列を表わす；塩基５３７−１１
３７位は、イントロン及びそれに続く、ＡＴＧに先行する５’ＵＴＲの２２個の
塩基を表わす；転写開始部位は塩基４８１位に位置する。
【００２８】 配列番号１３は、Ａｃｔ１ａプロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプ
ライマーである。
【００２９】 配列番号１４は、Ａｃｔ１ｂプロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプ
ライマーである。
【００３０】 配列番号１５は、Ａｃｔ１ａ及びＡｃｔ１ｂプロモーターの単離のために使用
する逆ＰＣＲプライマーである。
【００３１】 配列番号１６は、Ａｃｔ３プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプラ
イマーである。
【００３２】 配列番号１７は、Ａｃｔ３プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプラ
イマーである。
【００３３】 配列番号１８は、Ａｃｔ７プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプラ
イマーである。
【００３４】 配列番号１９は、Ａｃｔ７プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプラ
イマーである。
【００３５】 配列番号２０は、Ａｃｔ１２プロモーターの単離のために使用する正ＰＣＲプ
ライマーである。
【００３６】 配列番号２１は、Ａｃｔ１２プロモーターの単離のために使用する逆ＰＣＲプ
ライマーである。
【００３７】 配列番号２２は、Ａｃｔ１ａ遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１ａプロモ
ーターの配列である。塩基１−１０３３位はプロモーター配列を表わす；塩基１
０３４−１５７８位はイントロン及び５’ＵＴＲを表わす。
【００３８】 配列番号２３は、Ａｃｔ１ｂ遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１ｂプロモ
ーターの配列である。塩基１−９１４位はプロモーター配列を表わす；塩基９１
５−１４６８位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００３９】 配列番号２４は、Ａｃｔ３遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ３プロモータ
ーの配列である。塩基１−１０２３位はプロモーター配列を表わす；塩基１０２
４−１６４２位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４０】 配列番号２５は、Ａｃｔ７遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ７プロモータ
ーの配列である。塩基１−６００位はプロモーター配列を表わす；塩基６０１−
１２４１位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４１】 配列番号２６は、Ａｃｔ１２遺伝子の第一イントロンを含むＡｃｔ１２プロモ
ーターの配列である。塩基１−１０１７位はプロモーター配列を表わす；塩基１
０１８−１３１３位はイントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４２】 配列番号２７は、Ａｃｔ１１遺伝子の第一イントロンを含むキメラＦＭＶ−Ａ
ｃｔ１１プロモーターの配列である。塩基１−５３６位は重複ＦＭＶプロモータ
ー配列を表わす；塩基５５３−１９４６位はシロイヌナズナアクチン１１プロモ
ーター、イントロン及び５’ＵＴＲ配列を表わす。
【００４３】 配列番号２８は、ＥＦ１α遺伝子の第一イントロンを含むキメラＦＭＶ−ＥＦ
１αプロモーターの配列である。塩基１−５３６位はＦＭＶプロモーター配列を
表わす；塩基５５３−１６９５位はＥＦ１αプロモーター、イントロン及び５’
ＵＴＲ配列を表わす。
【００４４】 配列番号２９は、Ａｃｔ８遺伝子の第一イントロンを含むＣａＭＶ−Ａｃｔ８
プロモーターの配列である。塩基１−５２３位はＣａＭＶプロモーター配列を表
わす；塩基５３４−１８００位はＡｃｔ８プロモーター、イントロン及び５’Ｕ
ＴＲ配列を表わす。
【００４５】 配列番号３０は、Ａｃｔ２遺伝子の第一イントロンを含むＣａＭＶ−Ａｃｔ２
プロモーターの配列である。塩基１−５２３位はＣａＭＶプロモーター配列を表
わす；塩基５３４−１７４２位はＡｃｔ２プロモーター、イントロン及び５’Ｕ
ＴＲ配列を表わす。
【００４６】 （発明の詳細な説明） 本出願は、１９９９年１２月１６日提出の米国特許仮出願第６０／１７１，１
７３号の優先権を主張する。次の定義及び方法は、本発明をよりよく規定し、本
発明の実施において当業者の手引きとなるために提供するものである。特に異な
る記載がない限り、用語は関連技術における当業者の慣例的使用法に従って理解
されねばならない。３７ＣＦＲ §１．８２２に述べられているＤＮＡ塩基の表
記法を使用する。アミノ酸残基については標準的な１文字３文字表記法を用いる
。
【００４７】 「核酸（配列）」又は「ポリヌクレオチド（配列）」は、ゲノム又は合成由来
の一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、すなわち、それぞれ５’（上流）末端か
ら３’（下流）末端まで読み取った、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレ
オチド塩基のポリマーを指す。核酸はセンス鎖又は相補（アンチセンス）鎖であ
りうる。
【００４８】 「天然」は、天然に生じる（「野生型」）核酸配列を指す。
【００４９】 「異種」配列は、外来ソース又は外来種から生じる、又は同じソースからであ
っても、その元の形態から改変されている配列を指す。
【００５０】 「単離」核酸配列は、当該核酸が天然に生じる生物の細胞において通常結合し
ている他の核酸配列、すなわち他の染色体又は染色体外ＤＮＡから離れて実質的
に分離又は精製されている。かかる語は、夾雑核酸及び他の細胞成分を実質的に
除去するように生化学的に精製された核酸を包含する。かかる語はまた、組換え
核酸及び化学合成核酸を包含する。
【００５１】 ここで使用するとき「実質的に精製された」との語は、その天然状態で通常結
合している他の分子から分離された分子を指す。より好ましくは、実質的に精製
された分子は試料中に存在する主要種である。実質的に精製された分子は、自然
混合物中に存在する他の分子を６０％以上、好ましくは７５％、より好ましくは
９０％含まない（溶媒を除く）。実質的に精製された」との語は、それらの天然
状態で存在する分子を包含することは意図されていない。
【００５２】 第一核酸配列は、他の核酸（又はその相補鎖）と至適に整列したとき（比較の
ウインドーに対して標準配列の合計２０％未満の適切なヌクレオチド挿入又は欠
失で）、少なくとも２０個のヌクレオチド部分、好ましくは少なくとも５０個の
ヌクレオチド部分、より好ましくは少なくとも１００個のヌクレオチド部分、最
も好ましくは第一核酸配列の長さ全体にわたる比較ウインドーに対して少なくと
も７５％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約８０％の同一性、
より好ましくは少なくとも約８５％の同一性、最も好ましくは少なくとも約９０
％の同一性が存在する場合、標準核酸配列に対して「実質的な同一性」を示す。
比較ウインドーを整列するための配列の至適整列は、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍ
ａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１の局所相同性アルゴ
リズムによって；ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．
４８：４４３，１９７０の相同整列アルゴリズムによって；ＰｅａｒｓｏｎとＬ
ｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４
，１９８８の類似性検索法によって；好ましくはｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．
０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩでのこれらのアルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳ
ＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ処理によって実施する
ことができる。標準核酸は完全長分子又はより長い分子の部分でありうる。代替
的に、２個の核酸は、下記に定義するようなストリンジェント条件下で一方を他
方にハイブリダイズした場合、実質的な同一性を有しうる。
【００５３】 第一核酸配列は、第一核酸配列が第二核酸配列の機能に影響を及ぼすように配
列が配置されているとき、第二核酸配列と「作動可能に連結されて」いる。好ま
しくは、２個の配列は１個の近接核酸分子の部分であり、より好ましくは隣接す
る。例えば、プロモーターが細胞において遺伝子の転写を調節又は仲介する場合
、プロモーターは遺伝子に作動可能に連結されている。
【００５４】 「組換え」核酸は、配列のさもなければ離れた２つのセグメントの人工的組合
せによって、例えば化学合成によって又は核酸の分離したセグメントの遺伝子工
学手法による操作によって、作製される。核酸操作のための手法は周知である（
例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｍａｉｌｇａら、
植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ
ｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅ
ｓｓ，１９９５；Ｂｉｒｒｅｎら、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉ
ｓ）：１巻、ＤＮＡの分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）（１９９７）、２巻
、遺伝子の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ）（１９９８）、３巻、クロ
ーニング系（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）、４巻、遺伝子マ
ッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（１９９９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【００５５】 核酸の化学合成の方法は、例えばＢｅａｕｃａｇｅとＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ，
Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９−１８６２，１９８１、及びＭａｔｔ
ｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１の中
で論じられている。核酸の化学合成は、例えば市販の自動オリゴヌクレオチドシ
ンセサイザーで実施することができる。
【００５６】 「合成核酸配列」は、特定宿主細胞における発現増強のため及び適切な構築物
へのクローン化のために設計し、化学合成することができる。宿主細胞はしばし
ばコドン使用の好ましいパターンを示す（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９）。特定宿
主における発現を増強するために設計される合成ＤＮＡは、それ故、宿主細胞に
おけるコドン使用のパターンを反映すべきである。ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃ
ｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓ
ｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ ５３７１１の「ＢｅｓｔＦｉｔ」又は「Ｇａｐ」プログラムを含むがこれ
らに限定されないコンピュータプログラムが、これらの目的のために使用可能で
ある。
【００５７】 核酸の「増幅」又は「核酸複製（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｐｒｏｄｕ
ｃｔｉｏｎ）」は核酸配列のさらなるコピーの産生を指し、ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）テクノロジーを用いて実施される。様々な増幅方法が当該技術にお
いて既知であり、中でも特に、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６
８３，２０２号において、ならびにＰＣＲプロトコール：方法と応用ガイド（Ｐ
ＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ｉｎｎｉｓら編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓ
ｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０において記述されている。ＰＣＲにおいて、
プライマーは、ＤＮＡ鋳型にアニーリングされてポリメラーゼ連鎖反応を開始さ
せる、定義された配列の短いオリゴヌクレオチドを指す。
【００５８】 「形質転換された」、「トランスフェクションされた」又は「トランスジェニ
ック」は、組換え構築物のような外来核酸が導入された細胞、組織、器官、又は
生物を指す。好ましくは、導入核酸は、当該導入核酸がその後の子孫に遺伝され
るようにレシピエント細胞、組織、器官又は生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる
。「トランスジェニック」又は「形質転換」細胞あるいは生物は、細胞又は生物
の子孫、ならびに交配においてそのような「トランスジェニック」植物を親とし
て使用する育種プログラムから生産され、組換え構築物又は構築物の存在から生
じる変化した表現型を示す子孫も包含する。
【００５９】 「遺伝子」の語は、ペプチド、ポリペプチド、蛋白質をコードする染色体ＤＮ
Ａ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又は他のＤＮＡ、又はＲＮＡ分
子、及び発現の調節に関わるコード配列に隣接する領域を指す。一部の遺伝子は
ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドへと翻訳されうる（構造遺伝子）；他の遺伝
子は、発現の調節因子として、ＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）及び他の種
類の遺伝子機能に転写されうる（レギュレーター遺伝子）。
【００６０】 遺伝子の「発現」は、対応するｍＲＮＡを作製するための遺伝子の転写及び対
応する遺伝子産物、すなわちペプチド、ポリペプチド又は蛋白質を作製するため
のこのｍＲＮＡの翻訳を指す。遺伝子発現は、プロモーターのような５’調節エ
レメントを含めた調節エレメントによって制御又は調節される。
【００６１】 「遺伝成分」は、発現構築物の成分又は一部でもありうる何らかの核酸配列又
は遺伝エレメントを指す。遺伝成分の例は、プロモーター領域、５’非翻訳リー
ダー、イントロン、遺伝子、３’非翻訳領域、及び１個又はそれ以上の核酸配列
の転写又は翻訳に影響を及ぼす他の調節配列又は配列を含むが、これらに限定さ
れない。
【００６２】 「組換えＤＮＡ構築物」、「組換え構築物」、「発現構築物」又は「発現カセ
ット」の語は、１個又はそれ以上のＤＮＡ配列が周知の組換えＤＮＡ手法を用い
て機能的に作動可能に連結されたＤＮＡ分子を含む、ゲノム組み込み又は自律複
製することができる、何らかのソースから誘導されるプラスミド、コスミド、ウ
イルス、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、自律複製配列、ファージ、又は線状又は環
状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオチド配列のような因子を指す。
【００６３】 「相補的」は、塩基の対合（相補的配列Ｔ−Ｃ−ＡとのＡ−Ｇ−Ｔ対）による
核酸配列の自然結合を指す。２つの一本鎖分子間の相補性は、核酸対の一部だけ
が相補的である場合には部分的であり、すべての塩基対が相補的である場合には
完全であると考えられる。相補性の度合は、ハイブリダイゼーション及び増幅反
応の効率と強さに影響を及ぼす。
【００６４】 「相同性」は、それぞれヌクレオチド又はアミノ酸のパーセント位置同一性の
見地から見た核酸又はアミノ酸配列間の類似性のレベル、すなわち配列類似性又
は同一性を指す。相同性はまた、異なる核酸又は蛋白質の間での同様の機能特性
の概念も表わす。
【００６５】 「プロモーター」は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（又は蛋白質コ
ード領域）の翻訳開始コドンの上流又は５’側に位置し、ＲＮＡポリメラーゼＩ
Ｉ及び他の蛋白質（トランス作用性転写因子）の認識と結合に関与して転写を開
始させる核酸配列を指す。「植物プロモーター」は、植物細胞において機能性で
ある天然又は非天然プロモーターである。構成的プロモーターは、植物の生育期
間を通じて植物の大部分又はすべての組織において機能性である。組織、器官又
は細胞特異的プロモーターは、それぞれ特定の組織、器官又は細胞型においての
み又は主として特定の組織、器官又は細胞型において発現される。所与の組織、
器官又は細胞型において「特異的に」発現されるのではなく、プロモーターは、
植物のある部分（例えば細胞型、組織又は器官）において植物の他の部分に比べ
て「増強された」発現、すなわちより高い発現レベルを示すと考えられる。一次
的に調節されるプロモーターは、植物生育の一定の期間にのみ又は主として一定
の期間に、あるいは例えば概日リズムに関連する遺伝子の場合のように、１日の
うちの一定の時間にのみ又は主として一定の時間に機能性である。誘導的プロモ
ーターは、例えば化合物（化学的誘導物質）による内因性又は外因性刺激の存在
に応答して、又は環境、ホルモン、化学及び／又は生育シグナルに応答して、作
動可能に連結されたＤＮＡ配列を選択的に発現する。誘導的又は調節下プロモー
ター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）は、例えば光、熱、ストレス、
洪水又は干ばつ、植物ホルモン、損傷、エタノール、ジャスモネート（ｊａｓｍ
ｏｎａｔｅ）、サリチル酸又はサフェナー（ｓａｆｅｎｅｒ）のような化学物質
によって調節されるプロモーターを含む。
【００６６】 植物プロモーターは、１個又はそれ以上の特定遺伝子の発現を調節するための
５’調節配列として使用できる。１つの好ましいプロモーターは、植物ＲＮＡポ
リメラーゼＩＩプロモーターであろう。植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ
ーは、他の高等真核生物のものと同様に、複雑な構造を持ち、いくつかの異なる
エレメントから成る。１つのそのようなエレメントは、インビトロでの真核細胞
遺伝子の正しい発現とインビボでの正確で効率的な転写開始のために必要な、Ｔ
ＡＴＡボックス又はＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックスである。ＴＡＴ
Ａボックスは典型的には、約−２５から−３５、すなわち転写開始部位の２５か
ら３５塩基対（ｂｐ）上流、又は＋１位と定義されるキャップ部位に位置する（
ＢｒｅａｔｈｎａｃｈとＣｈａｍｂｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５
０：３４９−３８３，１９８１；Ｍｅｓｓｉｎｇら、「植物の遺伝子工学（Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」より、Ｋｏｓｕ
ｇｅら編集、ｐ．２１１−２２７，１９８３）。もう１つの共通エレメント、Ｃ
ＣＡＡＴボックスは、−７０から−１００ｂｐの間に位置する。植物においては
、ＣＣＡＡＴボックスは、哺乳類プロモーターの機能的に類似する配列とは異な
るコンセンサス配列を持つことがある（植物相似物は、その動物対応物と識別す
るために「ＡＧＧＡボックス」と称されてきた；Ｍｅｓｓｉｎｇら、「植物の遺
伝子工学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」
より、Ｋｏｓｕｇｅら編集、ｐ．２１１−２２７，１９８３）。さらに、実質的
にすべてのプロモーターが、約−１００ｂｐから−１，０００ｂｐまで又は転写
開始部位のより上流までに及ぶ付加的な上流活性化配列又はエンハンサーを含む
（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０，
１９８１；Ｇｒｕｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８
：９４３−９４７，１９８１；及びＫｈｏｕｒｙとＧｒｕｓｓ，Ｃｅｌｌ ２７
：３１３−３１４，１９８３）。
【００６７】 異種ＤＮＡ配列に融合したとき、そのようなプロモーターは典型的には、プロ
モーターが通常結合する遺伝子配列のものと同様にして融合配列の転写を生じさ
せる。調節配列を含むプロモーター断片を付加することができる（例えば、それ
自身の部分又は完全調節配列を備える活性プロモーターの５’末端に融合するか
又はその中に挿入する（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１１０６−１
１１２，１９８６；Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１１−１６，１９８７；
ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８４：８９８６−８９９０，１９８７；ＰｏｕｌｓｅｎとＣｈｕａ，Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１４：１６−２３，１９８８；Ｃｏｍａｉら、Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５：３７３−３８１，１９９１））。代替的に
、異種調節配列を、不活性のトランケートされたプロモーター、例えばコアＴＡ
ＴＡと、時としてＣＣＡＡＴエレメントだけを含むプロモーターの５’上流領域
に付加することができる（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１１０６−
１１１２，１９８６；Ｅｌｌｉｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１１−１６，１９８７
；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．ＵＳＡ ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ａｒｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：６５−７１，１９９１）。
【００６８】 プロモーターは典型的には、各々が遺伝子発現の全体的制御の異なる局面を与
える、多数の異なる「シス作用性転写調節エレメント」又は単に「シスエレメン
ト」から成る（ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ｅｌｌｉｓら、
ＥＭＢＯ Ｊ．６：１１−１６，１９８７；Ｂｅｎｆｅｙら、ＥＭＢＯ Ｊ．９
：１６７７−１６８４，１９９０）。「シスエレメント」は、転写を調節するト
ランス作用性蛋白質因子に結合する。一部のシスエレメントは２個以上の因子に
結合し、トランス作用性転写因子は２個以上のシスエレメントと様々な親和性で
相互作用しうる（ＪｏｈｎｓｏｎとＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．５８：７９９−８３９，１９８９）。シスエレメントに対応する植物
転写因子及びそれらの相互作用の分析は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏ
ｐｉｎｉｏｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１３０−１３８，１９９６；Ｍｕｒａｉ
、「植物生化学及び分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
）」、Ｄａｓｈｅｋ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．３９７−４２２
；及び「植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｍａｌｉｇａら編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９５，ｐ．２３３−３００の中で論
じられている。本発明のプロモーター配列は、遺伝子発現を付与する又は調節す
る「シスエレメント」を含みうる。
【００６９】 シスエレメント（Ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔ）は、欠失分析、すなわち５’末端
から又はプロモーターの内部から１個又はそれ以上のヌクレオチドを欠失させる
こと、Ｄｎａｓｅ Ｉフットプリント法、メチル化干渉、電気泳動移動度変化ア
ッセイ、ライゲーション仲介ＰＣＲによるインビボゲノムフットプリント法その
他の従来のアッセイを用いるＤＮＡ結合蛋白質分析を含めた多くの手法によって
、あるいは従来の配列比較法による既知のシスエレメントモチーフとの配列類似
性によって同定することができる。シスエレメントの微細構造は、エレメントの
１個又はそれ以上のヌクレオチドの突然変異誘発（又は置換）によって、又は他
の従来の方法によって（例えば、「植物生化学及び分子生物学における方法（Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｄａｓｈｅｋ編集、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，
１９９７，ｐ．３９７−４２２；及び「植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｍａｌ
ｉｇａら編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９５
，ｐ．２３３−３００参照）さらに検討することができる。
【００７０】 シスエレメントは化学合成によって又はそのようなエレメントを含むプロモー
ターからのクローニングによって入手することができる。シスエレメントはまた
、配列操作を容易にする有用な制限酵素部位を含む付加隣接配列を用いて合成す
ることもできる。１つの実施形態では、プロモーターは多数の異なる「シスエレ
メント」から成る。好ましい実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番
号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号
２５及び配列番号２６の核酸配列の「シスエレメント」を含む配列領域を、シス
エレメント、又は配列内のドメイン又はモチーフを同定するために特に設計され
たＭＥＭＥ又はＳＩＧＮＡＬＳＣＡＮを含むがこれらに限定されないコンピュー
タプログラムを使用して同定する。
【００７１】 本発明は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番
号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の断片又
はシスエレメント、あるいは本発明の核酸配列と相同性を示す、遺伝子調節を生
じさせることが知られているシスエレメントの同族体を含む。そのような核酸断
片は開示される配列のいかなる領域も含みうる。配列番号９、配列番号１０、配
列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列
番号２５及び配列番号２６に示すような本発明プロモーター領域又は部分プロモ
ーター領域は、「シスエレメント」又は雄性生殖組織におけるような作動可能に
連結されたＤＮＡ配列の発現を調節することができるドメインを含むがこれらに
限定されない、少なくとも１個の調節エレメントを含みうる。
【００７２】 植物プロモーターはまた、合成、キメラ又はハイブリッドプロモーターを生成
するように既知のプロモーターを操作することを通して作製されたプロモーター
を含みうる。そのようなプロモーターはまた、例えば活性プロモーターに異種調
節配列を付加することによって、１個又はそれ以上のプロモーターからのシスエ
レメントをそれ自体の部分又は完全調節配列と組み合わせることができる（Ｅｌ
ｌｉｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１１−１６，１９８７；Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅ
ｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８９８６
−８９９０，１９８７；ＰｏｕｌｓｅｎとＣｈｕａ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ
ｔ．２１４：１６−２３，１９８８；Ｃｏｍａｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．１５：３７３−３８１，１９９１）。キメラプロモーターはまた、不活性
のトランケートされたプロモーター、すなわちコアＴＡＴＡと、任意にＣＣＡＡ
Ｔエレメントだけを含むプロモーターの５’上流領域に異種調節配列を付加する
ことによっても開発されてきた（Ｆｌｕｈｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１１
０６−１１１２，１９８６；ＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒとＣｈｕａ，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：８９８６−８９９０，１９８７；Ａ
ｒｙａｎら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２５：６５−７１，１９９１）。
【００７３】 本発明に従ったキメラ又はハイブリッドプロモーターは、光、熱又はストレス
のような数多くの環境因子によって調節されるエレメント；病原体又は化学物質
等によって調節される又は誘発されるエレメントのような、少なくとも１個の既
知のシスエレメントを含みうる。そのようなエレメントは、条件に依存して遺伝
子発現を正又は負のいずれかに調節しうる。シスエレメントの例は、酸素反応性
エレメント（Ｃｏｗｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（３６）：２６９
０４，１９９３）、光調節エレメント（例えば、ＢｒｕｃｅとＱｕａｉｌ，Ｐｌ
ａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１０８１，１９９０及びＢｒｕｃｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．
１０：３０１５，１９９１参照）、メチルジャスモネート処理に対して反応性の
シスエレメント（ＢｅａｕｄｏｉｎとＲｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ
．Ｂｉｏｌ．３３：８３５，１９９７）、サリチル酸反応性エレメント（Ｓｔｒ
ａｎｇｅら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１１：１３１５，１９９７）、熱ショック反応性
エレメント（Ｐｅｌｈａｍら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１：３１，１９８５
）、創傷及び非生物ストレスに対して反応性のエレメント（Ｌｏａｃｅら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：９２３０，１９９２；
Ｍｈｉｒｉら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３：２５７，１９９７）、低
温反応性エレメント（Ｂａｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：７
０１，１９９４；Ｊｉａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０：６７９
，１９９６；Ｎｏｒｄｉｎら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１：６４１，
１９９３；Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２３５１５，１９９
２）、及び干ばつ反応性エレメント（Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅ
ｌｌ ６：２５１−２６４，１９９４；Ｗａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．２８：６０５，１９９５；Ｂｒａｙ Ｅ．Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌ
ａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２：４８，１９９７）を含むが、これらに限定されな
い。
【００７４】 もう１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すよう
なヌクレオチド配列は、作動可能に連結されたＤＮＡ配列を調節することができ
る、あらゆる長さの上記ヌクレオチド配列を含む。例えば、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号
２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２
９及び配列番号３０に開示するような配列は、トランケートされているか又は欠
失した部分を持つが、まだ作動可能に連結されたＤＮＡ配列の転写を調節するこ
とができるものでありうる。関連実施形態では、開示配列のシスエレメントは、
特定の組織において作動可能に連結されたＤＮＡ配列の発現増強をもたらすよう
な、特定の特異性を付与しうる。その結果として、配列番号９、配列番号１０、
配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配
列番号３０の開示配列のいかなる配列断片、部分又は領域も、開示配列のシスエ
レメント又はモチーフを含むがこれらに限定されない調節配列として使用するこ
とができる。また、１個又はそれ以上の塩基対をプロモーター配列の内部に挿入
する、欠失させる又は置換することもできる。プロモーターは、プロモーター断
面又はエレメントを、例えばそのような断片を最小プロモーターの上流に置くこ
とによって、作動可能に連結するように構築することができる。最小又は基本プ
ロモーターは、基本転写機構を動員し、結合することができる一片のＤＮＡであ
る。真核細胞における基本転写機構の１つの例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合
体及びその付属蛋白質である。基本転写機構の酵素成分は、最小又は基本プロモ
ーターを使用して、所与の遺伝子の転写を開始させ、延長させることができる。
すなわち、プロモーター領域内には、転写を調節する、例えば増強する、抑制す
る、転写ホルモン依存性にする、等々の転写因子を動員し、結合することができ
る付加的なシス作用性配列は存在しない。置換、欠失、挿入又はそれらの何らか
の組合せを用いて最終構築物を作製することができる。
【００７５】 本発明のプロモーター配列は、例えば他の植物系における発現のために修飾す
ることができる。もう１つのアプローチでは、いくつかの方法によって新規ハイ
ブリッドプロモーターを設計する又は構築することができる。多くのプロモータ
ーは、プロモーターの強さ及び／又は特異性を活性化する、増強する又は規定す
る上流配列を含む（Ａｔｃｈｉｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．
４：１２７，１９８８）。Ｔ−ＤＮＡ遺伝子は、例えば転写開始部位に結合する
「ＴＡＴＡ」ボックスを含み、転写開始部位の上流に位置する他の上流エレメン
トは転写レベルを調節する（Ｇｅｌｖｉｎ、「トランスジェニック植物（Ｔｒａ
ｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ）」、Ｋｕｎｇ，Ｓ．−Ｄ．及びＵｓ，Ｒ．編集
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐ．４９−８７，１９
８８）。もう１つ別のキメラプロモーターは、オクトパインシンターゼ（ｏｃｓ
）活性化因子のトリマーをマンノパインシンターゼ（ｍａｓ）活性化因子プラス
プロモーターに結合し、レポーター遺伝子の発現の上昇が報告された（Ｍｉｎ
Ｎｉら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：６６１，１９９５）。本発
明の上流調節配列は、そのようなキメラ又はハイブリッドプロモーターの構築の
ために使用することができる。本発明の変異体プロモーターの構築のための方法
は、種々のプロモーターの制御エレメントを結合する又はプロモーターの部分又
は領域を重複させることを含むが、これらに限定されない（例えば米国特許第５
，１１０，７３２号及び米国特許第５，０９７，０２５号参照）。当業者は、高
分子（例えばＤＮＡ分子、プラスミド、等々）の構築、操作及び単離、組換え生
物の生成ならびに遺伝子のスクリーニングと単離のための詳細な条件及び手順に
精通している（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験室マニュア
ル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｍ
ａｉｌｇａら、植物分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎ
ｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，１９９５；Ｂｉｒｒｅｎら、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ
Ａｎａｌｙｓｉｓ）：１巻、ＤＮＡの分析（Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ＤＮＡ）（１
９９７）、２巻、遺伝子の検出（Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ）（１９９８
）、３巻、クローニング系（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１９９９）、
４巻、遺伝子マッピング（Ｍａｐｐｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅｓ）（１９９９）、Ｃ
ｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
【００７６】 作動可能に連結された核酸配列の発現を変調する又は調節するための、配列番
号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２
３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の１個又はそれ以上のシスエ
レメントを含むキメラ又はハイブリッドプロモーターの設計、構築及び使用もま
た、本発明に包含される。
【００７７】 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配
列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列
番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のプロモーター配列、その断片、領域
又はシスエレメントは、多数の組織において作動可能に連結されたＤＮＡ配列を
転写することができ、それ故多数の組織において遺伝子の発現を選択的に調節す
ることができる。
【００７８】 いくつかの物栽培学的形質については、対象とする１個又はそれ以上の遺伝子
の転写が多くの組織において所望する特性を付与することが望ましい。あらゆる
組織で遺伝子を発現することが望ましいのではなく、特定の組織においてのみ発
現することが望ましいと考えられるので、対象とする選択された標的組織におい
て、作動可能に連結された遺伝子の転写を調節する適当なプロモーターが使用可
能であることが望ましい。例えば、除草剤耐性についての遺伝子発現のために標
的遺伝子を選択的に発現することを所望する場合、栄養及び生殖組織における除
草剤耐性遺伝子の発現が望ましいであろう。本発明のプロモーター配列は、速や
かに成長する分裂組織、花粉、葯及び花糸のような雄性生殖組織（雄ずい群、ａ
ｎｄｒｏｅｃｉｕｍ）、柱頭、花柱及び子房のような雌性生殖組織（雌ずい群、
ｇｙｎｏｅｃｉｕｍ）、葉、がく片、ならびに花弁を含むがこれらに限定されな
い多数の組織において遺伝子発現を調節するために有用である。本発明のプロモ
ーターは、それ故、例えば多数の組織で及び植物成長の多くの段階で耐性が所望
される場合に、除草剤耐性遺伝子の発現のために有用性を持つ。本発明のプロモ
ーター配列は、受精能、収率、昆虫耐性、菌類耐性、除草剤耐性、又は対象とす
る何らかの望ましい形質の制御のための遺伝子を含むがこれらに限定されない、
あらゆる標的遺伝子の転写を調節するために有用性を持つ。
【００７９】 １つの実施形態では、本発明のプロモーターは、多数の組織における遺伝子の
発現を所望する場合に、除草剤耐性遺伝子の発を調節するために特に有用性を持
つ。例えば、除草剤耐性遺伝子はグリホセート除草剤に対する耐性を付与しうる
。適当なグリホセート耐性遺伝子の例は、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ
遺伝子、又はグリホセートオキシドレダクターゼ及びホスホネートＮ−アセチル
トランスフェラーゼのようなグリホセートを分解する遺伝子産物を含むが、これ
らに限定されない。所望する発現プロフィールにとって最も効率的である適当な
調節エレメントを得るためには、あらゆる植物バイオテクノロジー戦略のために
５’調節エレメントの広い範囲の選択肢を持つことが重要である。
【００８０】 もう１つの実施形態では、本発明のプロモーターは遺伝子機能を決定する上で
有用性を持つ。多くの遺伝子の機能は不明であり、本発明のプロモーターは、セ
ンス又はアンチセンス方向で発現される１個又はそれ以上の遺伝子の表現型評価
を可能にする構築物において遺伝要素として使用することができる。本発明のプ
ロモーターは、構成及び生殖組織での高レベルの遺伝子発現を所望する場合に、
高流量アッセイのために開発された植物発現構築物における成分となりうる。
【００８１】 遺伝子及び調節配列の同定のためにいかなる植物も選択できる。遺伝子及び調
節配列の単離のための適当な植物標的の例は、アルファルファ、リンゴ、アンズ
、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、アーティチョーク（チョウセン
アザミ）、ａｒｕｇｕｌａ（？）、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ
、マメ類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ
、キャベツ、キャノーラ、カンタループ（メロンの一種）、ニンジン、キャッサ
バ、ヒマ種子、カリフラワー、セロリ、サクランボ、チコリ、ｃｉｌａｎｔｒｏ
（？）、柑橘類、クレメンタイン（ｃｌｅｍｅｎｔｉｎｅｓ）、クローバー、コ
コヤシ、コーヒー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、ダグラスモミ
、ナス、アンディーブ、エスカロール（キクヂシャの一種）、ユーカリノキ、ウ
イキョウ、イチジク、ニンニク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、蜜、
ｊｉｃａｍａ（？）、キウイフルーツ、レタス、ニラネギ、レモン、ライム、ロ
ブロリーパイン（マツの一種）、アマニ、マンゴー、メロン、マッシュルーム、
ネクタリン、ナッツ、カラスムギ、油ヤシ、油料種子アブラナ、オクラ、オリー
ブ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、オランダボウフ
ウ、エンドウ、モモ、落花生、セイヨウナシ、コショウ、カキ、マツ、パイナッ
プル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、
ｒａｄｉａｔａ ｐｉｎｅ、ｒａｄｉｓｃｃｈｉｏ、ハツカダイコン、ナタネの
種子、ラズベリー、イネ、ライムギ、モロコシ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｐｉｎｅ、
ダイズ、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワ
リ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライ小麦
、芝生、カブ、ブドウの木、スイカ、コムギ、ヤマノイモ、及びズッキーニを含
むが、これらに限定されない。調節配列の同定のために特に好ましい植物は、シ
ロイヌナズナ、トウモロコシ、コムギ、ダイズ、及び綿である。
【００８２】 本発明のプロモーター配列は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植
物ＤＮＡから単離した。好ましい実施形態では、構築物は、適当なターミネータ
ー及び調節エレメントと共に転写可能配列に作動可能に連結された本発明のプロ
モーター配列を含む。そのような構築物を、対象とする適当な標的植物に形質転
換することができる。いかなる植物も、本発明のプロモーター配列を含む核酸構
築物のための適当な宿主として使用することができる。対象とする適当な標的植
物の例は、アルファルファ、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、カリフラワ
ー、トウモロコシ、綿、クランベリー、キュウリ、レタス、エンドウ、ポプラ、
マツ、ジャガイモ、タマネギ、イネ、ラズベリー、ダイズ、サトウキビ、テンサ
イ、ヒマワリ、トマト及びコムギを含むが、これらに限定されない。
【００８３】 プロモーターの単離及び修飾方法 ここで開示するプロモーター配列の断片を単離するために多くの方法が使用で
きる。公的に入手可能な配列情報を使用して、植物のゲノムライブラリーから隣
接領域を増幅するためにＰＣＲに基づくアプローチが使用できる。既知の配列の
コア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅するには、多くの方法が当業者に既
知である。かかる方法は、逆ＰＣＲ、ベクトレットＰＣＲ、Ｙ字型ＰＣＲ及びゲ
ノム歩行アプローチを含むが、これらに限定されない。本発明のために、使用可
能な配列情報に基づいてＰＣＲプライマーを設計することにより、シロイヌナズ
ナから核酸分子を単離した。
【００８４】 核酸断片はまた、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いて一般的に実
施されるように、化学的手段によって断片を直接合成することのような他の手法
によっても入手できる。断片はまた、分子生物学の当業者には一般的に知られる
組換えＤＮＡ手法によるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）テクノロジーのような
、核酸再生テクノロジーの適用によっても入手することができる。特定の増幅プ
ライマー対を用いた標的核酸配列の増幅（例えばＰＣＲによる）に関して、「ス
トリンジェントＰＣＲ条件」は、プライマー対が、対応する野生型配列（又はそ
の補体）を持つプライマーが結合する標的核酸配列にだけハイブリダイズして、
好ましくはユニーク増幅産物を生成することができる条件を指す。
【００８５】 当業者は、植物ゲノムＤＮＡの調製のための方法を認知している。１つのアプ
ローチでは、制限酵素による部分的消化と特定サイズ範囲内のＤＮＡ断片をサイ
ズ選択することにより、選択した種からゲノムＤＮＡライブラリーを調製するこ
とができる。ゲノムＤＮＡは、バクテリオファージを含むがこれに限定されない
適当な構築物にクローン化し、多くの販売業者（例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ，
Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ又はＧｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，
ＭＤ参照）からの適当なクローニングキットを使用して、バクテリオファージの
ような適当な構築物を用いて調製することができる。
【００８６】 もう１つの実施形態では、ここで開示するプロモーターのヌクレオチド配列を
修飾することができる。当業者は、ヌクレオチド配列に変異を有するＤＮＡ分子
を創造することができる。配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号
１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２
６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すような
本発明のヌクレオチド配列を、それらの制御特性を増強するように修飾する又は
変化させることができる。例えば、ＰＣＲベースのＤＮＡ修飾アプローチにおい
て鋳型配列の挿入、欠失又は置換によって配列を修飾することができる。「変異
体」ＤＮＡ分子は、好ましくはプロモーター機能を実質的に保持しながら、天然
配列の１個又はそれ以上のヌクレオチドが欠失、付加及び／又は置換されている
、変化を含むＤＮＡ分子である。プロモーター断片の場合には、「変異体」ＤＮ
Ａは、それが作動可能に連結されている最小プロモーターの転写に影響を及ぼす
変化を含みうる。変異体ＤＮＡ分子は、例えば標準的ＤＮＡ突然変異誘発手法に
よって又は変異体ＤＮＡ分子又はその部分を化学合成することによって作製する
ことができる。
【００８７】 遺伝子発現を調節する際の使用に加えて、本発明のプロモーター配列はまた、
核酸ハイブリダイゼーション実験におけるプローブ又はプライマーとしても有用
性を持つ。本発明の核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェント条件下で
標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる。「ストリンジェントハイブ
リダイゼーション条件」の語は、経験的に決定できるような、プローブ又はプラ
イマーが標的配列と特異的にハイブリダイズし、非標的配列とはハイブリダイズ
しない条件と定義される。「ストリンジェント条件」は、特異的ハイブリダイゼ
ーション手順（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５２−９．５５、Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．４７−９．５２、９．５６−９．５８；Ｋａ
ｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３−２１３、１９８
４；及びＷｅｔｍｕｒとＤａｖｉｄｓｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：３４
９−３７０，１６８参照）による標的核酸（すなわち対象とする特定核酸配列）
への核酸プローブのハイブリダイゼーションに関して機能的に定義される。ＤＮ
Ａハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェント条件は、例えば約
４５℃で６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで５０
℃で２．０×ＳＳＣの洗浄であり、当業者に既知であるか若しくは「分子生物学
における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，
Ｎ．Ｙ．，１９８９，６．３．１−６．３．６を含むがこれに限定されない実験
室マニュアルに認めることができる。例えば、洗浄段階の塩濃度は、５０℃で約
２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高スト
リンジェンシーまで選択できる。さらに、洗浄段階の温度は、約２２℃の室温で
の低ストリンジェンシー条件から約６５℃の高ストリンジェンシー条件まで上昇
させることができる。温度及び塩の両方を変化させることができ、あるいは温度
又は塩濃度のいずれかを一定に保持しながら他方の変数を変えることもできる。
例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡプローブ又はプライマーを用いるハイブリダイゼーシ
ョンは、高ストリンジェンシーについては、６５℃での０．５×ＳＳＣ、０．５
％ＳＤＳでの洗浄を伴って、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ，５×デンハルト溶液
、１００μｇ／ｍＬの非特異的ＤＮＡ（例えば音波処理サケ精子ＤＮＡ）中６５
℃で実施することができる。
【００８８】 核酸分子は、完全な相補性を示す場合にもう１つの核酸分子の「補体」である
と称される。ここで使用するとき、分子は、その分子の１個のあらゆるヌクレオ
チドが他方のヌクレオチドと相補的であるとき「完全な相補性」を示すと称され
る。２個の分子が少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにア
ニーリングしたままでありうる十分な安定性を備えて互いにハイブリダイズする
ことができる場合、それらは「最小限に相補的」であると称される。同様に、分
子が従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングしたままであ
りうる十分な安定性を備えて互いにハイブリダイズすることができる場合、それ
らは「相補的」であると称される。標的配列へのプローブ又はプライマーの結合
特異性が保存されている場合、より低い度合の配列類似性を持つ関連配列を同定
するためには、より低いハイブリダイゼーション及び／又は洗浄条件のようなよ
り低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件が使用できると想定さ
れる。従って、本発明のヌクレオチド配列は、ＤＮＡ断片の相補的伸長による二
重鎖分子を選択的に形成する能力のために使用することができる。ハイブリダイ
ゼーションによるＤＮＡセグメントの検出は当業者には周知であり、それ故想定
される適用に依存して、標的配列に対する様々な度合のプロモーターの選択性を
達成するために様々なハイブリダイゼーション条件を用いることが所望され、選
択方法は所望する結果に依存するであろう。従来のストリンジェンシー条件は、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、及びＨａｙｍｅｓら、「核酸ハイブリダイゼーシ
ョン、実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ、１９８５に述べられている。
【００８９】 本発明の１つの実施形態では、密接に関連する又は相同な遺伝子及び関連調節
配列を同定するために、他の植物組織のハイブリダイゼーションアッセイにおい
て核酸配列、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番
号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６、又はこ
れらの配列の断片、領域、シスエレメント又はオリゴマーを使用する。これらは
、適切に調製された植物組織、セルロース、ナイロン、又はコンビネーションフ
ィルター、チップ又はスライドガラスを含むがこれらに限定されない基質上での
サザン又はノーザンハイブリダイゼーションアッセイを含むが、これらに限定さ
れない。そのような方法論は当該技術において周知であり、営利販売業者によっ
て供給されうるキット又は製剤において入手可能である。
【００９０】 ここで使用するとき核酸の断片は、完全長未満の核酸の部分である。例えば、
本発明のためには、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２６の
開示ヌクレオチド配列未満のあらゆる長さのヌクレオチド配列が断片とみなされ
る。断片はまた、上記に定義したようなストリンジェントハイブリダイゼーショ
ン条件下で天然核酸に特異的にハイブリダイズすることができる最小限の長さを
含みうる。そのような最小断片の長さは、好ましくは天然核酸配列の少なくとも
８個のヌクレオチド、より好ましくは１５個のヌクレオチド、さらに一層好まし
くは少なくとも２０個のヌクレオチド、最も好ましくは３０個のヌクレオチドで
ある。
【００９１】 「プローブ」は、従来の検出可能な標識又はレポーター分子、例えば放射性同
位体、リガンド、化学発光物質又は酵素が結合する単離核酸である。「プライマ
ー」は、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的標的ＤＮＡ鎖にアニーリン
グされて、プライマーと標的ＤＮＡ鎖の間でハイブリッドを形成し、その後ポリ
メラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼにより標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長する単離
核酸である。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は従来
の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために使用できる。
【００９２】 プローブ及びプライマーは一般に１１個のヌクレオチド又はそれ以上の長さ、
好ましくは１８個のヌクレオチド又はそれ以上、より好ましくは２５個のヌクレ
オチド、最も好ましくは３０個のヌクレオチド又はそれ以上の長さである。その
ようなプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーショ
ン条件下で標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列に特異的にハイブリダイズし、低ストリン
ジェンシー条件下でもう１つ別の種の標的天然配列に特異的にハイブリダイズす
る。好ましくは、本発明に従ったプローブ及びプライマーは天然配列と完全な配
列類似性を持つが、天然配列とは異なるが標的天然配列にハイブリダイズする能
力を保持するプローブが従来の方法によって設計しうる。プローブ及びプライマ
ーを調製し、使用するための方法は、例えば、「分子クローニング：実験室マニ
ュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ）」、第２版、１から３巻、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９
８９」）；「分子生物学における現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｕｓｕｂｅｌ
ら編集、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅ
ｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２（定期的最新化）（以下、「Ａ
ｕｓｕｂｅｌら、１９９２」）；及びＩｎｎｉｓら、「ＰＣＲプロトコール：方
法と適用への手引き（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９０に述べられている。ＰＣＲ−プライマ
ー対は、例えばＰｒｉｍｅｒ（バージョン０．５、ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ１９９１
、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）のようなそのために用意されて
いるコンピュータプログラムを使用して、既知の配列から誘導することができる
。ここで開示する天然プロモーター配列に基づくプローブ及びプライマーは、従
来の方法、例えば再クローニングと再配列決定によって開示配列を確認し、必要
に応じて修飾するために使用できる。
【００９３】 構築物及び発現構築物 本発明に従った天然又は合成核酸は、宿主細胞に導入して複製することができ
る組換え核酸構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組み込むことができる。好まし
い実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配
列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列
番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すような本発明の
ヌクレオチド配列又はその断片、変異体又は誘導体を、選択可能、スクリーニン
グ可能、又はスコアリング可能なマーカー遺伝子のような遺伝成分に作動可能に
連結された本発明のプロモーター領域を含む発現カセットに組み込む。
【００９４】 もう１つの実施形態では、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番
号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号
２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に示すよう
な本発明の開示核酸配列を、植物の形態、生理、成長及び生育、収率、栄養強化
、病害又は害虫抵抗性、あるいは環境又は化学耐性に結びつく望ましい特性を付
与する核酸のような遺伝成分に作動可能に連結する。対象とするマーカー遺伝子
又は作物栽培学的遺伝子のような遺伝成分は、形質転換植物細胞又は植物、ある
いは作物栽培学的有用性を持つ産物又はその生産の同定において機能しうる。
【００９５】 もう１つの実施形態では、１個の遺伝成分は、選択デバイスとして役立つ産物
を生成し、再生植物組織において、さもなければ有害な化合物に対する耐性を植
物組織に付与する化合物を産生するように機能する。選択可能、スクリーニング
可能、又はスコアリング可能なマーカーとして使用するための対象遺伝子は、Ｇ
ＵＳ（β−グルクロニダーゼについてのコード配列）、ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質
についてのコード配列）、ＬＵＸ（ルシフェラーゼについてのコード遺伝子）、
抗生物質耐性マーカー遺伝子、又は除草剤耐性遺伝子を含むであろうが、これら
に限定されない。トランスポゾン及び関連抗生物質耐性遺伝子の例は、トランス
ポゾンＴｎｓ（ｂｌａ）、Ｔｎ５（ｎｐｔＩＩ）、Ｔｎ７（ｄｈｆｒ）、ペニシ
リン、カナマイシン（及びネオマイシン、Ｇ４１８，ブレオマイシン）；メトト
レキセート（及びトリメトプリム）；クロラムフェニコール；カナマイシン及び
テトラサイクリンを含む。
【００９６】 植物における選択マーカーにとって有用な特性は、微生物の使用に関する報告
書に概説されている（Ａｄｖｉｓｏｒｙ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｎｏｖｅ
ｌ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，１９９４年７月）。これらは、
最小数の非形質転換組織に関する厳密な選択、再生に関する有意の干渉を伴わな
い多数の独立形質転換事象、多数の種への適用、そしてマーカーの存在に関して
組織をスコアリングするためのアッセイの使用可能性を含む。
【００９７】 多くの選択マーカー遺伝子が当該技術で知られており、カナマイシン（ｎｐｔ
ＩＩ）、ヒグロマイシンＢ（ａｐｈ ＩＶ）及びゲンタマイシン（ａａｃ３及び
ａａｃＣ４）に耐性であるものを含めて、いくつかの抗生物質耐性遺伝子はこれ
らの判定基準を満たしている。有用な優性選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性
遺伝子（例えばヒグロマイシン、カナマイシン、ブレオマイシン、Ｇ４１８、ス
トレプトマイシン又はスペクチノマイシンに対して耐性）、及び除草剤耐性遺伝
子（例えばホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）をコードする遺伝
子を含む。除草剤耐性に関する形質転換体を選択するための有用な戦略は、Ｖａ
ｓｉｌ、「植物の細胞培養と体細胞遺伝学（Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ
Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ）」、Ｉ
−ＩＩＩ巻、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉ
ｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏ
ｒｋ，１９８４に述べられている。本発明において使用するための特に好ましい
選択マーカー遺伝子は、カナマイシンのような抗生物質及びグリホセートのよう
な除草剤などの化合物に対する耐性を付与する遺伝子であろう（Ｄｅｌｌａ−Ｃ
ｉｏｐｐａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５（６），１９８７，米国特許
第５，４６３，１７５号、米国特許第５，６３３，４３５号）。他の選択デバイ
スも供給可能であり、やはり本発明の範囲内である。
【００９８】 本発明の実施のために、ＤＮＡ構築物及び宿主細胞を調製し、使用するための
従来の組成物及び方法を、中でも特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９に述べら
れているように使用する。好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞である。
植物細胞の安定なトランスフェクション又はトランスジェニック植物の確立のた
めの適当なＤＮＡ構築物は、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、「クローニングベクタ
ー：実験室マニュアル（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、１９８５、補遺１９８７）；Ｗｅｉｓｓｂａｃｈと
Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、「植物分子生物学のための方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ
Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ｇｅｌｖｉｎら、「植物分子生物学マニュアル（Ｐｌａ
ｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｋｌｕｗｅｒ
Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９０；及びＲ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒ
ｏｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ，ＢＩ
ＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３に記述されてい
る。植物発現構築物は、例えば５’及び３’調節配列の転写制御下で１個又はそ
れ以上のクローン化植物遺伝子を含みうる。それらはまた、発現構築物を含む宿
主細胞を選択するための上述したような選択マーカーを含みうる。そのような植
物発現構築物はまた、プロモーター調節領域（例えば誘導的又は構成的、環境又
は発生調節的、あるいは細胞又は組織特異的発現を制御する調節領域）、転写開
始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終了部位、及
びポリアデニル化シグナルも含む。構築物を細菌宿主においてクローン化できる
ように細菌由来の他の配列も含まれる。構築物はまた、典型的には広い範囲の宿
主原核細胞複製起点を含む。特に好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞で
あり、植物発現構築物は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号
１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２
６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０に開示される
ようなプロモーター領域、作動可能に連結された転写可能配列、及び転写終止配
列を含む。発現構築物中の遺伝成分として考慮される他の調節配列は、プロモー
ターと結合することができる非翻訳リーダー配列を含むがこれに限定されない。
特に好ましい実施形態では、宿主細胞は植物細胞であり、植物発現構築物は、配
列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番
号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号
２８、配列番号２９及び配列番号３０に開示されるようなプロモーター領域、作
動可能に連結された転写可能配列、及び転写終止配列を含む。植物発現構築物は
また、クローニングのために有用な制限酵素部位を含むポリリンカー配列を含む
がこれに限定されない付加配列を含みうる。
【００９９】 植物発現構築物中の遺伝エレメント 植物発現構築物は、各々が異なるプロモーターに作動可能に連結された２個以
上の発現可能遺伝子配列を含みうる。多くのプロモーターが、選択可能マーカー
、スコアリング可能マーカー、害虫耐性、病害耐性、栄養強化に関する遺伝子及
び作物栽培学的利益を持つ他の遺伝子を含むがこれらに限定されない対象遺伝子
に関して、植物遺伝子発現のために有用性を持つ。植物遺伝子発現のために有用
な構成的プロモーターの例は、単子葉植物を含めて（例えばＤｅｋｅｙｓｅｒら
、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：５９１，１９９０；ＴｅｒａｄａとＳｈｉｍａｍ
ｏｔｏ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２０：３８９，１９９０参照）大部分
の植物組織において構成的な高レベルの発現をもたらすカリフラワーモザイクウ
イルス（ＣａＭＶ）Ｐ−３５Ｓプロモーター；ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターの
縦列反復バージョンである強化３５Ｓプロモーター（Ｐ−ｅ３５Ｓ）、ノパリン
シンターゼプロモーター（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８：５４７
，１９８８）、オクトパインシンターゼプロモーター（Ｆｒｏｍｍら、Ｐｌａｎ
ｔ Ｃｅｌｌ １：９７７，１９８９）、及び米国特許第５，３７８，６１９号
に述べられているようなゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルス（Ｐ
−ＦＭＶ）プロモーター及びＰ−ＦＭＶのプロモーター配列が縦列に反復されて
いるＦＭＶプロモーターの強化バージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）、カリフラワーモザ
イクウイルス１９Ｓプロモーター、サトウキビ杆状ウイルスプロモーター、コメ
リナイエローモットルウイルスプロモーター、及び植物細胞において発現するこ
とが知られている他の植物ＤＮＡウイルスプロモーターを含むが、これらに限定
されない。
【０１００】 環境、ホルモン、化学物質、及び／又は発生シグナルに応答して調節される多
様な植物遺伝子プロモーターが、（１）熱（Ｃａｌｌｉｓら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．８８：９６５，１９８８）、（２）光（例えばエンドウｒｂｃＳ−
３Ａプロモーター、Ｋｕｈｌｅｍｅｉｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：４７
１、１９８９；トウモロコシｒｂｃＳプロモーター、ＳｃｈａｆｆｎｅｒとＳｈ
ｅｅｎ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：９９７，１９９１；又はクロロフィルａ／
ｂ−結合蛋白質プロモーター、Ｓｉｍｐｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．４：２７２３
，１９８５）、（３）アブシジン酸のようなホルモン（Ｍａｒｃｏｔｔｅら、Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９６９、１９８９）、（４）創傷（例えばｗｕｎＩ、
Ｓｉｅｂｅｒｔｚら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：９６１，１９８９）；又は（
５）メチルジャスモネート、サリチル酸、又はＳａｆｅｎｅｒのような化学物質
によって調節されるプロモーターを含めて、植物細胞における作動可能に連結さ
れた遺伝子の発現のために使用できる。また、（６）器官特異的プロモーター（
例えばＲｏｓｈａｌら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：１１５５、１９８７；Ｓｃｈｅｒｎ
ｔｈａｎｅｒら、ＥＭＢＯ Ｊ．７：１２４９、１９８８；Ｂｕｓｔｏｓら、Ｐ
ｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８３９，１９８９）を用いることも有益であろう。
【０１０１】 本発明のプロモーターは、速やかに成長する分裂組織及び生殖組織において作
動可能に連結されたＤＮＡ配列を転写することができ、発現構築物中で対象遺伝
子に作動可能に連結することができる植物プロモーターである。
【０１０２】 植物発現構築物は、トランスジーンにおいてポリペプチドコード配列の上流又
は下流に位置づけることができるＲＮＡプロセシングシグナル、例えばイントロ
ンを含みうる。さらに、発現構築物は、植物遺伝子の３’非翻訳領域からの付加
調節配列（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８４：７４４（１９８７）；Ａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：１１５
（１９８９））、例えば、ジャガイモのＰＩ−ＩＩターミネーター領域あるいは
オクトパイン又はノパリンシンターゼ３’ターミネーター領域のような、ｍＲＮ
ＡのｍＲＮＡ安定性を高める３’ターミネーター領域を含みうる。ｍＲＮＡの５
’非翻訳領域は翻訳の開始において重要な役割を果たすことができ、また植物発
現構築物における遺伝成分でもありうる。例えば、熱ショック蛋白質遺伝子から
誘導される非翻訳５’リーダー配列は、植物における遺伝子発現を増強すること
が明らかにされている（例えば米国特許第５，３６２，８６５号参照）。これら
の付加上流及び下流調節配列は、発現構築物上に存在する他のエレメントに関し
て天然又は異種であるソースから誘導されうる。
【０１０３】 本発明のプロモーター配列は、植物細胞における遺伝子発現を制御するために
使用される。開示するプロモーター配列は、植物形質転換において使用される構
築物の部分である遺伝成分である。本発明のプロモーター配列は、特定の望まし
い形質を付与するのに十分であるように発現される１個又はそれ以上の核酸と共
に、上述したような選択可能又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子と関連調
節エレメントを含む適当な植物形質転換プラスミド又は構築物に関して使用する
ことができる。本発明によって想定される、作物栽培学的利益を持つ適当な構造
遺伝子の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂ．ｔ．）遺
伝子のような昆虫耐性、菌類病防除に関する遺伝子のような害虫耐性、グリホセ
ート耐性を与える遺伝子のような除草剤耐性に関する１個又はそれ以上の遺伝子
、及び収率、栄養増強、環境又はストレス耐性のような品質向上、あるいは植物
の生理、成長、生育、形態又は植物産物における何らかの望ましい変化に関する
遺伝子を含むであろうが、これらに限定されない。例えば、構造遺伝子は、その
全体が参照してここに組み込まれるＷＯ ９９３１２４８号、その全体が参照し
てここに組み込まれる米国特許第５，６８９，０５２号、その全体が参照してこ
こに組み込まれる米国特許第５，５００，３６５号及び５，８８０，２７５号に
述べられているようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）昆虫防除蛋白質遺伝子を
含むがこれに限定されない、昆虫耐性を与えるあらゆる遺伝子を含むであろう。
もう１つの実施形態では、構造遺伝子は、その全体が参照してここに組み込まれ
る米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているようなアグロバクテリウム
属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株ＣＰ４グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ遺伝
子（ａｒｏＡ：ＣＰ４）、又はその全体が参照してここに組み込まれる米国特許
第５，４６３，１７５号に述べられているようなグリホセートオキシドレダクタ
ーゼ遺伝子（ＧＯＸ）を含むがこれらに限定されない遺伝子によって付与される
ような、除草剤グリホセートに対する耐性を与えることができる。
【０１０４】 代替的に、ＤＮＡコード配列は、例えばアンチセンス又はコサプレッションを
介した機序を通して、内因性遺伝子の発現の標的抑制を引き起こす非翻訳ＲＮＡ
分子をコードすることによってこれらの表現型を生じさせることができる（例え
ばＢｉｒｄら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｇｅｎ．Ｅｎｇｉｎ．Ｒｅｖ．９：２０７，１
９９１参照）。ＲＮＡはまた、所望する内因性ｍＲＮＡ産物を開裂するように設
計された触媒ＲＮＡ分子（例えばライボザイム）でありうる（例えばＧｉｂｓｏ
ｎとＳｈｉｌｌｉｔｏｅ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１２５，１９９７参照
）。それ故、対象とする表現型又は形態学的変化を発現する蛋白質又はｍＲＮＡ
を生じる遺伝子は、本発明の実施のために有用である。
【０１０５】 ＤＮＡ配列の上流（５’側）又はＤＮＡ配列内に位置する調節エレメント又は
配列に加えて、遺伝子発現に影響を及ぼす下流（３’側）配列が存在する。それ
故、ここで使用するとき調節配列の語は、細胞の蛋白質合成装置と共に遺伝子産
物の発現を制御する、仲介する又は影響を及ぼす、ＤＮＡ配列の上流、ＤＮＡ配
列内又は下流に位置するあらゆるヌクレオチド配列を指す。
【０１０６】 当業者は植物形質転換に適した構築物を認識している。本発明のプロモーター
配列を、好ましくは上述したようなスクリーニング可能又はスコアリング可能な
マーカーを使用して発現構築物に組み込み、一過性分析で試験して形質転換植物
における遺伝子発現の指標を提供する。一過性アッセイにおいて遺伝子発現を試
験する方法は当業者に既知である。マーカー遺伝子の一過性発現は様々な植物、
組織及びＤＮＡ送達システムにおいて報告されている。例えば、一過性分析の種
類は、何らかの対象植物種を用いた一過性植物アッセイにおいて組織のエレクト
ロポレーション又はパーティクルボンバードメント（粒子衝撃）を通して遺伝子
送達を指令することを含みうるが、これらに限定されない。そのような一過性シ
ステムは、コムギにおける懸濁培養からのプロトプラスト（Ｚｈｏｕら、Ｐｌａ
ｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：６２１，１９９３）、小麦の葉のプロ
トプラストのエレクトロポレーション（Ｓｅｔｈｉら、Ｊ．Ｃｒｏｐ Ｓｃｉ．
５２：１５２，１９８３）、トウモロコシ組織から調製したプロトプラストのエ
レクトロポレーション（Ｓｈｅｅｎ、Ｊ．Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：
２２５，１９９１）、あるいは対象とする特定組織のパーティクルボンバードメ
ントを含むが、これらに限定されない。本発明は、選択されたレポーター遺伝子
、マーカー遺伝子又は対象とする作物栽培学的遺伝子に作動可能に連結された調
節配列を評価するためのあらゆる一過性発現系の使用を包含する。適切な送達シ
ステムを通して一過性アッセイで試験することが考慮される植物組織の例は、葉
脚組織、カルス、子葉、根、内質、胚芽、花組織、花粉、及び表皮組織をふくむ
であろうが、これらに限定されない。
【０１０７】 いかなるスクリーニング可能又はスコアリング可能なマーカーも一過性アッセ
イにおいて使用できる。本発明のプロモーター又は５’調節配列の一過性分析の
ための好ましいマーカー遺伝子は、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子又は
緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）遺伝子を含む。マーカー遺伝子に作動可能に連結され
た５’調節配列を含む発現構築物を組織に送達し、マーカーに依存して適切な機
序によって組織を分析する。安定な植物において作物栽培学的利益を有する遺伝
子に作動可能に連結されたときの５’調節配列の潜在的発現プロフィールを評価
するためのツールとして、定量的及び定性的分析が使用される。最終的には、転
写可能な対象ＤＮＡ配列に作動可能に連結された５’調節配列を含む適当な植物
形質転換発現構築物に本発明の５’調節配列を直接組み込み、植物に形質転換し
て、安定に形質転換された植物及びその子孫を、５’調節配列によって付与され
た所望する発現プロフィールに関して分析する。
【０１０８】 植物細胞に外因性ＤＮＡを導入するための適当な発現構築物は、アグロバクテ
リウム菌を介した方法のための非武装化（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミドを
含むであろうが、これに限定されない。これらの構築物は、対象とする１個又は
それ以上の遺伝子及び関連調節領域と共に、耐性マーカー、１−２ Ｔ−ＤＮＡ
ボーダー、及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びアグロバクテリウム菌の複製起点を
含みうる。当業者は、アグロバクテリウム菌仲介のアプローチのために多くの菌
株と方法が使用可能であることを認識している。そのような菌株は、アグロバク
テリウム菌株Ｃ５８、ＬＢＡ４４０４、ＥＨＡ１０１及びＥＨＡ１０５を含むが
、これらに限定されない。特に好ましい菌株は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ菌株である。
【０１０９】 本発明に包含される方法によって導入しうる例示的核酸は、例えば、もう１つ
別の種からのＤＮＡ配列又は遺伝子、あるいはさらに同じ種から生じる又は同じ
種内に存在するが、古典的生殖又は育種手法ではなく遺伝子工学的方法によって
レシピエント細胞に組み込まれている遺伝子又は配列を含む。しかしながら、「
外因性」の語はまた、形質転換した細胞には通常存在しない、又はおそらく単に
形質転換したＤＮＡセグメント又は遺伝子で認められるような形態、構造、等々
では存在しない遺伝子、あるいは通常存在するが、自然の発現パターンとは異な
るように発現する、例えば過剰発現することを所望する遺伝子を指すことが意図
されている。それ故、「外因性」遺伝子又はＤＮＡの語は、同様の遺伝子が既に
レシピエント細胞内に存在するかどうかには関わりなく、そのような細胞に導入
されるあらゆる遺伝子又はＤＮＡセグメントを指すことが意図されている。外因
性ＤＮＡに含まれるＤＮＡの種類は、植物細胞内に既に存在するＤＮＡ、もう１
つ別の植物からのＤＮＡ、異なる生物からのＤＮＡ、あるいは遺伝子のアンチセ
ンスメッセージを含むＤＮＡ配列又は遺伝子の合成又は修飾バージョンをコード
するＤＮＡ配列のような外的に生成されるＤＮＡを含みうる。
【０１１０】 本発明のプロモーター配列を含む植物形質転換構築物は、何らかの植物形質転
換法によって植物に導入しうる。ＤＮＡ配列を植物細胞に導入するためのいくつ
かの方法が使用可能であり、当該技術において周知である。適当な方法は、細菌
感染（例えば上述したようなアグロバクテリウム琴による、バイナリー細菌人工
染色体構築物、ＤＮＡの直接送達（例えばＰＥＧ仲介の形質転換、乾燥／抑制仲
介のＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション、炭化ケイ素ファイバーによる攪
拌を通して）、及びＤＮＡ被覆パーティクルの加速（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ，Ａｎｎ
．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４
２：２０５，１９９１の中で検討されている）を含むが、これらに限定されない
。
【０１１１】 双子葉植物を特異的に形質転換するための方法は、主としてＡｇｒｏｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用する。例えば、報告されているトラ
ンスジェニック植物は、綿（米国特許第５，００４，８６３号；米国特許第５，
１５９，１３５号；米国特許第５，５１８，９０８号、ＷＯ９７／４３４３０号
）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号；米国特許第５，４１６，０１１
号；ＭｃＣａｂｅら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：９２３，１９８８；
Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８７：６７１，１９８８
）；アブラナ（米国特許第５，４６３，１７４号）、及び落花生（Ｃｈｅｎｇら
、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、１５：６５３，１９９６）を含むが、これ
らに限定されない。
【０１１２】 同様の方法が単子葉植物の形質転換において報告されている。これらの方法を
用いた形質転換と植物再生は、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃ
ｉｎａｌｉｓ；Ｂｙｔｅｂｉｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．，８４：５３４５，１９８７）；オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕ
ｌｇａｒａｅ；ＷａｎとＬｅｍａｕｘ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０４
：３７，１９９４）；トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ；Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ
．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：２０４，１９８８；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら
、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３，１９９０；Ｆｒｏｍｍｒａ，Ｂｉｏ／Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：８３３，１９９０；Ｋｏｚｉｅｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ，１１：１９４，１９９３）；カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓａｔ
ｉｖａ；Ｓｏｍｅｒｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１５８９，１
９９２）；ｏｒｃｈａｒｄｇｒａｓｓ（？）（Ｄａｃｔｙｌｉｓ ｇｌｏｍｅｒ
ａｔａ；Ｈｏｒｎら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：４６９，１９８８
）；イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、インディカ及びジャポニカ品種を含む、
Ｔｏｒｉｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６：１０，１９８８；Ｚ
ｈａｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．、７：３７９，１９８８；Ｌｕｏ
とＷｕ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，６：１６５，１９８８；Ｚ
ｈａｎｇとＷｕ，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７６：８３５，１９８
８；Ｃｈｒｉｓｔｏｕら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９５７，１９９
１）；モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ；Ｃａｓａｓ，Ａ．Ｍ．ら、
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１１２１２，１
９９３）；サトウキビ（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ ｓｐｐ．；ＢｏｗｅｒとＢｉｒｃ
ｈ，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２：４０９，１９９２）；ｔａｌｌ ｆｅｓｃｕｅ（ウ
シノケグサ）（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ；Ｗａｎｇ，Ｚ．Ｙ．
ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６９１，１９９２）；芝生（Ａｇｒ
ｏｓｔｉｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ；Ｚｈｏｎｇら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅ
ｐ．、１３：１，１９９３）；コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ；
Ｖａｓｉｌら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：６６７，１９９２；Ｗｅ
ｅｋｓ Ｔ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１０２：１０７７，１９９３
；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．，５：２９９，１９９４）、及びアルファ
ルファ（Ｍａｓｏｕｄ，Ｓ．Ａ．ら、Ｔｒａｎｓｇｅｎ．Ｒｅｓ．，５：３１３
，１９９６）を含むがこれらに限定されない多くの作物について記述されている
。対象とする数多くの標的作物から安定なトランスジェニック植物を生産するた
めに多くの形質転換法が使用でき、修正できることは当業者には明白である。
【０１１３】 植物の分析方法 形質転換植物を、本発明のプロモーター配列によってもたらされる対象遺伝子
の存在及び発現レベル及び／又はプロフィールに関して分析する。当業者は、形
質転換植物の分析のために使用できる数多くの方法を認知している。遺伝子発現
を評価し、導入した遺伝子が組み込まれ、適切に機能して、予想されたように遺
伝するかどうかを調べるために様々な方法が用いられる。本発明のために、プロ
モーターが作動可能に連結されている遺伝子の発現レベルを調べることによって
プロモーターを評価することができる。レポーター遺伝子を用いた一過性アッセ
イ法によってプロモーター機能の予備的評価を調べることができるが、より決定
的なプロモーター評価は安定な植物の分析から決定できる。植物分析のための方
法は、サザンブロット又はノーザンブロット、ＰＣＲベースのアプローチ、生化
学的分析、表現型スクリーニング法、圃場評価、及び免疫診断アッセイを含むが
、これらに限定されない。
【０１１４】 ＰＣＲテクノロジー、ゲノムＤＮＡの単離、発現構築物の構築、一過性アッセ
イ、及び植物形質転換法を含むがこれらに限定されない本発明の方法は当業者に
周知であり、標準手法又はその修正を用いて実施される。
【０１１５】 グリホセート散布試験 １つの実施形態では、グリホセート耐性に関する温室又は圃場評価を実施する
。「グリホセート」の語は、ここでは、親除草剤Ｎ−ホスホノメチルグリシン（
グリホセート酸としても知られる）、その塩又はエステル、又は植物組織中でＮ
−ホスホノメチルグリシンに変換される又はＮ−ホスホノメチルグリシンをイオ
ン形態で（グリホセートイオンとしても知られる）提供する化合物を集合的に表
わすために使用される。例示的に、ここで有用な水溶性グリホセート塩が、その
開示が参照してここに組み込まれる、Ｆｒａｎｚへの米国特許第３，７９９，７
５８号及び第４，４０５，５３１号に開示されている。本発明に従って使用でき
るグリホセート塩は、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム塩；アンモ
ニウム塩；Ｃ１−１６アルカリアンモニウム、例えばジメチルアンモニウム及び
イソプロピルアンモニウム塩；Ｃ１−１６アルカノアンモニウム、例えばモノエ
タノールアンモニウム塩；Ｃ１−１６アルキルスルホニウム、例えばトリメチル
スルホニウム塩；それらの混合物等を含むが、これらに限定されない。グリホセ
ート酸分子は、異なるｐＫａ値を持つ３個の酸部位を備える；従って一塩基、二
塩基及び三塩基酸、又はそれらの混合物、又はあらゆる中間レベルの中和の塩が
使用できる。
【０１１６】 グリホセート塩は水溶性であるので、一部では商業的に重要である。多くのア
ンモニウム、アルキルアンモニウム、アルカノアンモニウム、アルキルスルホニ
ウム及びアルカリ金属塩が高度に水溶性であり、使用の時点で水に希釈すること
ができる高度濃縮水溶液として製剤することができる。
【０１１７】 そのような濃縮水溶液は、酸当量（ｇ ａ．ｅ．／ｌ）で表わすと、グリホセ
ート１リットル当たり約５０から約５００グラムを含みうる。より高いグリホセ
ート濃度、例えば約３００から約５００ｇ ａ．ｅ．／ｌが好ましい。
【０１１８】 グリホセート塩は代替的に、例えば粉末、顆粒、ペレット又は錠剤の形態で、
水溶性又は水分散性組成物として製剤される。そのような組成物はしばしばドラ
イ製剤として知られるが、「ドライ」の語はここでは完全に水分が存在しないこ
とを意味すると理解すべきではない。典型的にはドライ製剤は約５重量％未満の
水分、例えば約０．５重量％から約２重量％の水分を含む。そのような製剤は、
使用時に水に溶解する又は分散することが意図されている。
【０１１９】 想定されるドライグリホセート製剤は、酸当量（％ａ．ｅ．）で表わすと、約
５重量％から約８０重量％のグリホセートを含みうる。上記の範囲内のより高い
グリホセート濃度、例えば約５０％から約８０％ａ．ｅ．が好ましい。ドライ製
剤を製造するために特に有用なグリホセートの塩はナトリウム及びアンモニウム
塩である。
【０１２０】 本発明の植物処理組成物ならびに液体及びドライ濃縮物組成物は、任意に１つ
又はそれ以上の所望する賦形剤成分を含みうる。グリホセート組成物のための特
に有用な賦形剤成分は界面活性剤であり、これは植物の葉の比較的疎水性の表面
に水性散布液を保持するのに役立ち、またグリホセートが葉のろう様の外層クチ
クラに浸透し、それによって葉の内部の生体組織に接触するのを助ける。界面活
性剤は他の有用な機能も果たすことができる。
【０１２１】 本発明のグリホセート組成物において使用できる界面活性剤の種類又は化学分
類に制限はない。非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び両性型、又はこれら
のタイプの２つ以上の組合せがすべて、個々の状況において有用である。しかし
一般には、少なくとも１つの界面活性剤が存在する場合には、陰イオン性以外で
ある、すなわち少なくとも１つの界面活性剤は非イオン性、陽イオン性又は両性
であることが好ましい。
【０１２２】 ここで有用な多くの界面活性剤は、各々が１個のＣ２−４アルキレンオキシド
単位あるいはＣ２−４アルキレンオキシド単位の重合又は共重合鎖から成る、１
つ又はそれ以上の部分を含む化学構造を備える。そのような界面活性剤はポリオ
キシアルキレン界面活性剤と称され、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性及び
両性型を含む。現在考慮される組成物において有用なポリオキシアルキレン界面
活性剤は、約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位を含む。好
ましいポリオキシアルキレン界面活性剤においては、アルキレンオキシド単位が
、エチレンオキシド又は共重合エチレンオキシドのいずれかとプロピレンオキシ
ドの１つ又はそれ以上の鎖を形成し、アルキレンオキシド単位の各々の鎖は末端
ヒブリド基又はＣ１−４アルキル又はＣ１−４アルカノイル末端キャップを備え
る。
【０１２３】 本発明の組成物において有用な界面活性剤の疎水性部分は基本的に炭化水素ベ
ースであり、この場合疎水性部分は典型的にはＣ８−２４、好ましくはＣ１２− １８ 、アルキル、アルケニル、アルキルアリール、アルカノイル又はアルケノイ
ル鎖である。これらの鎖は直鎖又は分枝でありうる。代替的には、疎水性部分は
、例えばヘプタメチルトリシロキサン基のようなシロキサン基の形態でのシリコ
ン原子、又は例えば部分的フッ素化アルキル又はペルフルオロアルキル鎖のよう
なフッ素原子を含みうる。
【０１２４】 非イオン性界面活性剤の中で、特に好ましいクラスは、ポリオキシエチレンア
ルキル、エトキシル化第一級又は第二級アルコール又はアルキルフェノールのよ
うなアルケニル又はアルキルアリールエーテル、エトキシル化脂肪酸のようなポ
リオキシエチレンアルキル又はアルケニルエステル、ポリオキシエチレンソルビ
タンアルキルエステル、グリセリルアルキルエステル、スクロースエステル、ア
ルキルポリグリコシド、等を含む。そのような非イオン性界面活性剤の代表的な
特定例は、ポリオキシエチレン（９）ノニルフェノール、ＳｈｅｌｌのＮｅｏｄ
ｏｌ（商標）２５−７（ポリオキシエチレン（７）Ｃ１２−１５直鎖第一級アル
コール）、Ｕｎｉｏｎ ＣａｒｂｉｄｅのＴｅｒｇｉｔｏｌ（商標）１５−Ｓ−
９（ポリオキシエチレン（９）Ｃ１２−１５直鎖第二級アルコール）、ＩＣＩの
Ｔｗｅｅｎ（商標）２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレー
ト及びＨｅｎｋｅｌのＡｇｒｉｍｕｌ（商標）（Ｃ９−１１アルキルポリグルコ
シド）を含む。
【０１２５】 陽イオン性界面活性剤の中で、特に好ましいクラスは、エトキシル化脂肪アミ
ンのようなポリオキシエチレン第三アルキルアミン又はアルケニルアミン、第四
アンモニウム界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテルアミン、等を含
む。そのような陽イオン界面活性剤の代表的な特定例は、ポリオキシエチレン（
５）ココアミン、ポリオキシエチレン（１５）獣脂アミン、塩化ジステアリルジ
メチルアンモニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、メチルビス（２−ヒ
ドロキシエチル）ココアンモニウムクロリド、Ｎ−ドデシルピリジンクロリド及
びポリオキシプロピレン（８）エトキシトリメチルアンモニウムクロリドを含む
。特に好ましいポリオキシエチレンアルキルエーテルアミンは、ＰＣＴ特許公開
第ＷＯ９６／３２８３９号に開示されているものである。様々な構造の多くの陽
イオン性第四アンモニウム界面活性剤がグリホセートとの組合せで有用であるこ
とが当該技術において知られており、ここで考慮する組成物において使用できる
；そのような第四アンモニウム界面活性剤は、式 （ＮＲａＲｂＲｃＲｄ）ｍＡｎ ［式中、Ａは、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、硫酸塩又はリン酸塩のよう
な適当な陰イオンであり、ｍとｎは、陽イオン（ＮＲａＲｂＲｃＲｄ）の正電荷
が陰イオンＡの負電荷と釣り合うような整数であり、そしてＲａ、Ｒｂ、Ｒｃ及
びＲｄについての選択肢は、限定を伴わずに： （ｉ）Ｒａはベンジル又はＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又
はアルケニルであり、そしてＲｂ、Ｒｃ及びＲｄは独立してＣ１−４アルキル、
好ましくはメチルである； （ｉｉ）ＲａとＲｂは独立してＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキ
ル又はアルケニルであり、そしてＲｃとＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ま
しくはメチルである； （ｉｉｉ）ＲａはＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケ
ニルであり、Ｒｂは約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド単位、
好ましくはエチレンオキシド単位を備えるポリオキシアルキレン鎖であり、そし
てＲｃとＲｄは独立してＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである； （ｉｖ）ＲａはＣ８−２４、好ましくはＣ１２−１８、アルキル又はアルケニ
ルであり、ＲｂとＲｃは合計で約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキ
シド単位、好ましくはエチレンオキシド単位を備えるポリオキシアルキレン鎖で
あり、そしてＲｄはＣ１−４アルキル、好ましくはメチルである；若しくは （ｖ）Ｒａは、Ｃ３−４アルキレンオキシド単位、好ましくはプロピレンオキ
シド単位が支配的である、約２個から約１００個のＣ２−４アルキレンオキシド
単位を備えるポリオキシアルキレン鎖であり、そしてＲｂ、Ｒｃ及びＲｄは独立
してＣ１−４アルキル、好ましくはメチル又はエチルである］、を含む。
【０１２６】 このタイプの特に好ましい第四アンモニウム界面活性剤は、Ｃｌａｕｄｅらへ
の米国特許第５，４６４，８０７号に開示されている。
【０１２７】 １つの実施形態では、そのような第四アンモニウム界面活性剤と結合する陰イ
オンはグリホセート陰イオンでありうる。
【０１２８】 両性界面活性剤の中で、より正確には双性イオン性界面活性剤と称される当該
技術において慣例的なものを含めて、特に好ましいクラスは、ポリオキシエチレ
ンアルキルアミンオキシド、アルキルベタイン、アルキル置換アミノ酸、等を含
む。そのような両性界面活性剤の代表的な例は、ドデシルジメチルアミンオキシ
ド、ポリオキシエチレン（２）ココアミンオキシド及びステアリルジメチルベタ
インを含む。
【０１２９】 上述したクラスに限定されることなく、当業者が適当な界面活性剤を選択する
ことができる標準的な参考文献ソースは、「工業界面活性剤ハンドブック（Ｈａ
ｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）」、第
２版（１９９７）、Ｇｏｗｅｒ発行、「マッカチョンの乳化剤と界面活性剤（Ｍ
ｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ
ｓ）」、北米及び国際版（１９９７）、ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐ
ａｎｙ発行、及び「国産化粧品成分ディクショナリー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）」、
第６版（１９９５）、１及び２巻、ｔｈｅ Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒ
ｙ ａｎｄ Ｆｒａｇｒａｎｃｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ発行を含む。
【０１３０】 本発明の組成物の他の任意成分は、色、粘度、ゲル特性、凝固点、吸湿性、固
化挙動、溶解速度、分散性、又は他の製剤特性を変化させるための作用物質を含
む。
【０１３１】 グリホセートの市販製剤の例は、限定を伴わずに、すべてがグリホセートをそ
のイソプロピルアンモニウム塩として含む、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標）、ＲＯ
ＵＮＤＵＰ（登録商標） ＵＬＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標） ＣＴ、
ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標） ＥＸＴＲＡ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標） ＢＩ
ＡＣＴＩＶＥ、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標） ＢＩＯＦＯＲＣＥ、ＲＯＤＥＯ（
登録商標）、ＰＯＬＡＲＩＳ（登録商標）、ＳＰＡＲＫ（登録商標）及びＡＣＣ
ＯＲＤ（登録商標）除草剤のようなＭｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏｍｐａｎｙによって
市販されているもの；グリホセートをそのアンモニウム塩として含む、ＲＯＵＮ
ＤＵＰ（登録商標） ＤＲＹ及びＲＩＶＡＬ（登録商標）除草剤のようなＭｏｎ
ｓａｎｔｏ Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているもの；グリホセートをその
ナトリウム塩として含む、ＲＯＵＮＤＵＰ（登録商標） ＧＥＯＦＯＲＣＥのよ
うなＭｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏｍｐａｎｙによって市販されているもの；ならびに
グリホセートをそのトリメチルスルホニウム塩として含む、ＴＯＵＣＨＤＯＷＮ
（登録商標）除草剤のようなＺｅｎｅｃａ Ｌｉｍｉｔｅｄによって市販されて
いるものを含む。
【０１３２】 生物学的に有効なグリホセート製剤の施用率の選択は、通常の農業技術者の技
術範囲内である。当業者は同様に、個々の植物条件、気象条件及び生育条件が本
発明の方法を実施する際に達成される結果に影響を及ぼしうることを認識するで
あろう。２０年以上にわたるグリホセートの使用とそのような使用に関する公表
試験は、雑草防除実施者が個々の環境条件において個々の生育段階で個々の種に
対して除草剤として有効なグリホセート施用率を選択することができる豊富な情
報を提供してきた。
【０１３３】 本発明の方法は、グリホセートが除草剤又は植物成長調整剤として生物学的に
有効であるあらゆる種に適用できる。これは世界中の極めて多様な植物種を包含
する。同様に、本発明の組成物は、グリホセートが生物学的に活性であるあらゆ
る植物種に適用できる。
【０１３４】 １つの実施形態では、本発明のＤＮＡ構築物を含む植物にグリホセート含有除
草剤を施用し、グリホセート除草剤に対する耐性に関して植物を評価する。あら
ゆるグリホセート製剤が本発明のＤＮＡ構築物を含む植物を試験するために使用
できる。例えば、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）のようなグリホセート組
成物が使用できる。植物のグリホセート耐性の評価のための試験パラメータは、
多くの因子に依存して変化するであろう。因子は、グリホセート製剤の種類、製
剤中で使用されるグリホセートの濃度と量、植物の種類、施用期間中の植物の生
育段階、環境条件、施用方法、及び個々の製剤を施用する回数を含むが、これら
に限定されない。例えば、散布施用法を用いて温室環境で植物を試験することが
できる。Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）を使用する試験範囲は、８オンス
／エーカーから２５６オンス／エーカーを含むが、これらに限定されない。好ま
しい市販の有効範囲は、作物及び植物の生育段階に依存して、Ｒｏｕｎｄｕｐ
Ｕｌｔｒａ（商標）の１６オンス／エーカーから６４オンス／エーカーでありう
る。グリホセート製剤の少なくとも１回の施用により作物に散布することができ
る。綿の試験については、３葉期に３２オンス／エーカーを１回施用し、後期生
育段階で追加施用することができる。コムギについては、３−５葉期にＲｏｕｎ
ｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）の３２オンス／エーカーを１回施用し、試験するコ
ムギの種類に依存して、収穫前又は収穫後施用を実施することができる所望する
商業的に有効なグリホセート耐性レベルを与える本発明の構築物を含む特定植物
を見出すために、各々の作物について試験パラメータを至適化することができる
。
【０１３５】 下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明らかにするために提示するも
のである。当業者は、下記の実施例に開示されている手法は、本発明を実施する
際に良好に機能するように発明者が発見した手法であることを認識するであろう
。しかし当業者は、本開示に照らして、開示されている特定実施形態に多くの変
更を加えることができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様の又は類
似の結果を得られることを認識するはずであり、それ故記述されている又は添付
の図面に示されている事柄はすべて例示と解釈すべきであり、制限的な意味に解
釈してはならない。
【０１３６】 （実施例） 実施例１ 使用するプラスミド構築物は、ｐＵＣクローニング構築物、又はｏｒｉ３２２
のような大腸菌複製起点、ｏｒｉＶ又はｏｒｉＲｉのような広い宿主レンジの複
製起点、及びスペクチノマイシン又はストレプトマイシンに対する耐性を与える
、Ｔｎ７アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼ（ａａｄＡ）をコードす
るＳｐｃ／Ｓｔｒのような選択マーカー又はゲンタマイシン（Ｇｍ、Ｇｅｎｔ）
選択マーカーのコード領域を含む二重ボーダー植物形質転換構築物のいずれかで
ある。植物形質転換については、宿主細菌株はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔ
ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＡＢＩ又はＬＢＡ４４０４であった。
【０１３７】 遺伝子エレメントは次のように説明される：Ｐ−ｅ３５Ｓは、その全体が参照
してここに組み込まれる米国特許第５，４２４，４００号に述べられているよう
な、−９０−３００領域の重複を含むＣａＭＶからの３５Ｓ ＲＮＡである；Ｐ
−ＦＭＶは、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，３７８，６
１９号に述べられているような、ゴマノハグサ（ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイ
ルスからの３４Ｓプロモーターである；Ｐ−ｅＦＭＶは、ＦＭＶプロモーターの
重複エンハンサー領域を含むＦＭＶプロモーターの誘導体である；ＣＴＰ２は、
米国特許第５，６３３，４３５号に述べられているようなシロイヌナズナ（Ａｒ
ａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＥＰＳＰシンターゼのシグナルペプチド領域である；ａｒ
ｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ（ａｒｏＡ：ＣＰ４）は、米国特許第５，６３３，４３５号
に述べられているような又は特定植物種のコドン使用に基づいて植物における発
現のためにさらに修飾されたＣＰ４ ＥＰＳＰのコード領域（合成配列）である
；Ｅ９ ３’は、ポリアデニル化シグナルとして機能するエンドウＲｂｃＳ遺伝
子の単離物の３’末端である；ｎｏｓは、ポリアデニル化シグナルとして機能す
るノパリンシンターゼ遺伝子の３’末端である；Ｈｓｐ７０は、その全体が参照
してここに組み込まれる米国特許第５，３６２，８６５号に述べられているよう
なＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａからの非翻訳リーダー配列である；ＧＵＳは
、大腸菌からのβ−グルクロニダーゼコード配列である（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，
Ｒ．Ａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８３：８４４
７−８４５１、１９８７）；右ボーダー（ＲＢ）及び左ボーダー（ＬＢ）は、Ａ
ｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓオクトパイン及びノパリン
菌株のＴｉプラスミドからである。Ｐ−ＡｔＡｃｔ２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃｔ
２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン２遺伝子の５’非
翻訳領域（ＵＴＲ）内のイントロンである；ＡｔＡｃｔ８は、Ａｒａｂｉｄｏｐ
ｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡ
ｃｔ２ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン８遺伝子の５
’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子からのプロモーターである；ＡｔＡｃ
ｔ１１ｉは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１１遺伝子の
５’ＵＴＲ内のイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ａ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−Ａ
ｔＡｃｔ１ａは、アクチン１ａ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ
−ＡｔＡｃｔ１ａはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂは、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン１ｂ遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ
−ＡｔＡｃｔ１ｂは、アクチン１ｂ遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー
、Ｉ−ＡｔＡｃｔ１ｂはイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ３は、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン３遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ
−ＡｔＡｃｔ３は、アクチン３遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ
−ＡｔＡｃｔ３はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ７は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ ｔｈａｌｉａｎａアクチン７遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−Ａｔ
Ａｃｔ７は、アクチン７遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−Ａｔ
Ａｃｔ７はイントロンである；Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａアクチン１２遺伝子からのプロモーターであり、Ｌ−ＡｔＡ
ｃｔ１２は、アクチン１２遺伝子のゲノムＤＮＡからの非翻訳リーダー、Ｉ−Ａ
ｔＡｃｔ１２はイントロンである；Ｐ−ＡｔＥＦ１α（Ｐ−ＡｔＥＦ１又はＥＦ
１α）は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αから
のプロモーターであり、ＡｔＥＦ１α−ｉ（ＡｔＥＦ１−ｉ）は、Ａｒａｂｉｄ
ｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ延長因子遺伝子１αの５’ＵＴＲ内のイントロン
である。
【０１３８】 図１から１８は、１個から３個の植物発現カセットを含む植物形質転換構築物
の例を示す。植物分子生物学の当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の
プロモーターと遺伝エレメントを含む植物発現カセットの多くの組合せを構築し
、作物において試験することができる。図面に例示する構築物は作製しうる唯一
の構築物と解釈すべきではなく、当業者にとっての例示としてのみ使用されるも
のである。図１（ｐＣＧＮ８０８６）は、対象とする１個の遺伝子（ＣＴＰ２−
ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター
（Ｐ−ＡｔＡｃｔ８）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の
例を提供する。図２（ｐＭＯＮ４５３２５）は、対象とする少なくとも１個の遺
伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少
なくとも１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１）を備える２個の発現カセッ
トを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図３（ｐＭＯＮ４５３３１）は、
対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作
動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイント
ロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。
図４（ｐＭＯＮ４５３３２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２
−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の少なくとも１個の
プロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン）を備える２個の発現カセット
を含む植物形質転換構築物の例を提供する。図５（ｐＭＯＮ９１９０）は、本発
明の少なくとも２個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＥＦ１プラスイントロン、ＡｔＥ
Ｆ１α−ｉ；Ｐ−ＡｔＡｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ）が対象とす
る少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に
連結されており、Ｐ−ｅＦＭＶプロモーターがＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙ
ｎに作動可能に連結されている、３個の発現カセットを含む植物形質転換構築物
の例を提供する。図６（ｐＭＯＮ９１５３）の植物発現カセットは図４（ｐＭＯ
Ｎ４５３３２）に例示したものと同じであり、このプラスミドマップは、明細書
に示すデータ表の中の植物表現型に関して表示したデータの発現カセットの同定
のために例示している。図７（ｐＣＧＮ８０９９）は、対象とする遺伝子（ａｒ
ｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモーター、
Ｐ−ｅＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発
現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図８（ｐＣＧＮ８０８８
）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明
の１個のプロモーター、Ｐ−ＡｔＡｃｔ８プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ８ｉ及
びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備える２個の発現カセットを含む植物形質転換構
築物の例を提供する。図９（ｐＣＧＮ８０６８）は、対象とする遺伝子（ａｒｏ
Ａ：ＣＰ４ｓｙｎ）の発現を推進する、本発明の１個のプロモーター、Ｐ−Ａｔ
Ａｃｔ２プラスイントロン、ＡｔＡｃｔ２ｉ及びＰ−ｅＦＭＶプロモーターを備
える２個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１０（ｐ
ＣＧＮ８０９６）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推
進する、本発明のハイブリッドプロモーター、Ｐ−ｅＦＭＶ／−ＡｔＡｃｔ１１
及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ８を備える２個の発現カセットを含む植物形質転
換構築物の例を提供する。図１１（ｐＣＧＮ９１５１）は、対象とする遺伝子（
ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）の転写を推進する、本発明のハイブリッドプロモータ
ー、Ｐ−ｅＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α及びＰ−ｅ３５Ｓ−ＡｔＡｃｔ２を備える２個
の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１２（ｐＭＯＮ１
０１５６）は、対象とするａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ遺伝子の発現を推進するＰ−
ｅＦＭＶプロモーターを備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の
例を提供し、このベクターは本発明のプロモーター配列との比較のために使用す
る。図１３（ｐＭＯＮ５２０５９）は、対象とする遺伝子（ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓ
ｙｎ）の発現を推進するハイブリッドプロモーター（Ｐ−ｅＦＭＶ−ＡｔＥＦ１
α）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図
１４（ｐＭＯＮ５４９５２）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２
−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモータ
ー（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ａプラスＡｔＡｃｔ１ａイントロン）を備える１個の発現
カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１５（ｐＭＯＮ５４９５
３）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙ
ｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂ
プラスＡｔＡｃｔ１ｂイントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質
転換構築物の例を提供する。図１６（ｐＭＯＮ５４９５４）は、対象とする少な
くとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結さ
れた本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３プラスＡｔＡｃｔ３イント
ロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。
図１７（ｐＭＯＮ５４９５５）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ
２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモー
ター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ７プラスＡｔＡｃｔ７イントロン）を備える１個の発現カ
セットを含む植物形質転換構築物の例を提供する。図１８（ｐＭＯＮ５４９５６
）は、対象とする少なくとも１個の遺伝子（ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４ｓｙｎ
）に作動可能に連結された本発明の１個のプロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２プ
ラスＡｔＡｃｔ１２イントロン）を備える１個の発現カセットを含む植物形質転
換構築物の例を提供する。
【０１３９】 実施例２ クローニング構築物及びＧＵＳ構築物を表１に列挙する。シロイヌナズナアク
チン２プロモーター及びイントロン（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．１０：１０７−
１２１，１９９６に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ４１９
９８）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ
ｅｒｅｃｔａ ＤＮＡを鋳型として使用し（ＲｏｇｅｒｓとＢｅｎｄｉｃｈ，Ｐ
ｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：６９，１９９８）、配列番号１（正プライマ
ー）及び配列番号２（逆プライマー）を反応において次のように用いて単離した
：０．５μｇ鋳型ＤＮＡ、各プライマー２５ｐｍｏｌｅ、「ホットスタート」Ｐ
ＣＲのためのワックスビーズを使用するｔａｑポリメラーゼ（ＢＭＢ，Ｉｎｄｉ
ａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）。ＰＣＲ熱循環器条件は次のとおりであった：９４℃
で１分間；９２℃で４０秒間、５５℃で１分間、７２℃で１分３０秒間の３０サ
イクル；そして５分間の７２℃伸長。ＰＣＲ反応物をＧｅｎｅＣｌｅａｎＩＩ（
Ｂｉｏ１０１ Ｉｎｃ．，Ｖｉｓｔａ，ＣＡ）を用いて精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ
及びＮｃｏＩで消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化した構築物ｐＭＯ
Ｎ２６１４９（表１）にライゲートした。プロモータークローンを配列確認し、
生じた構築物をｐＭＯＮ２６１７０（表１）と称した。
【０１４０】
【表１】
【０１４１】 実施例３ シロイヌナズナアクチン８プロモーター及びイントロン（Ａｎら、Ｐｌａｎｔ
Ｊ．１０：１０７−１２１，１９９６に述べられているようなＧｅｎｂａｎｋ
アクセス番号Ｕ４２００７）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ
Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ ＤＮＡを鋳型として使用し、配列番号３（
正プライマー）及び配列番号４（逆プライマー）を用いて実施例２で述べたＰＣ
Ｒ条件と精製法によって単離した。実施例２で述べたように制限酵素を用いてプ
ロモーターをクローン化し、配列確認して、生じた構築物をｐＭＯＮ２６１７１
（表１）と称した。
【０１４２】 実施例４ シロイヌナズナアクチン１１プロモーター及びイントロン（Ｈｕａｎｇら、Ｐ
ｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３３：１２５−１３９，１９９７に述べられて
いるようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｕ２７９８１）を、Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ ＤＮＡを鋳型と
して使用し、配列番号５（正プライマー）及び配列番号６（逆プライマー）を用
いて実施例２で述べたＰＣＲ条件と精製法によって単離した。制限酵素ＥｃｏＲ
Ｖ及びＮｃｏＩを用いてプロモーターをクローン化し、ｐＭＯＮ８６７７（表１
）にライゲートして、配列確認し、生じた構築物をｐＭＯＮ４８４０７（表１）
と称した。
【０１４３】 実施例５ シロイヌナズナ延長因子１α（ＡｔＥＦ１α）プロモーター及びイントロン（
Ａｘｅｌｏｓら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１９：１０６−１１２，１９
８９；Ｃｕｒｉｅら、ＮＡＲ １９：１３０５−１３１０；Ｃｕｒｉｅら、Ｐｌ
ａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１０８３−１０８９，１９９２；Ｃｕｒｉｅ
ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３８：４２８−４３６，１９９３に述べら
れているようなＧｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｘ１６４３０）を、Ａｒａｂｉｄｏ
ｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ ｅｒｅｃｔａ ＤＮＡを鋳
型として使用し、配列番号７（正プライマー）及び配列番号８（逆プライマー）
を用いて実施例２で述べたＰＣＲ条件と精製法によって単離した。実施例２で述
べたように制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｃｏＩを用いてプロモーターをクロー
ン化し、ｐＭＯＮ２６１５２（表１）にライゲートして、配列確認し、生じた構
築物をｐＭＯＮ２６１７７（表１）と称した。
【０１４４】 実施例６ 上述した植物形質転換構築物をＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに交配した。綿の
形質転換を、基本的に、その全体が参照してここに組み込まれるＷＯ／００３６
９１１号に述べられているように実施した。シロイヌナズナの形質転換を、Ｙｅ
ら、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １９：２４９−２５７，１９９９に述べられ
ているように実施した。トマトの形質転換を、その全体が参照してここに組み込
まれる米国特許第５，５６５，３４７号に述べられているように実施した。
【０１４５】 実施例７ ＤＮＡ構築物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介した形質転換法のような適
切な送達システムを通して対象とする標的作物に形質転換した（例えば、その全
体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，５６９，８３４号、その全体が
参照してここに組み込まれる米国特許第５，４１６，０１１号、その全体が参照
してここに組み込まれる米国特許第５，６３１，１５２号、その全体が参照して
ここに組み込まれる米国特許第５，１５９，１３５号、その全体が参照してここ
に組み込まれる米国特許第５，００４，８６３号、及びその全体が参照してここ
に組み込まれる米国特許仮出願第６０／１１１７９５号参照）。代替的には、パ
ーティクルボンバードメント法が使用できる（例えば、すべてその全体が参照し
てここに組み込まれる、特許願第ＷＯ９２／１５７６５号、ＷＯ９７／４８８１
４号及び欧州特許願第５８６，３５５号、米国特許第５，１２０，６５７号、５
，５０３，３９８号、５，８３０，７２８号及び５，０１５，５８０号参照）。
【０１４６】 数多くの形質転換及び再生システムと方法が使用可能であり、当業者に周知で
ある。安定に形質転換された植物と子孫を、生育室又は圃場環境で実施される商
業的に有効な濃度のグリホセート製剤による散布試験を含むがこれに限定されな
い、当業者に既知の多くの分子、免疫診断、生化学及び／又は圃場評価法によっ
て、対象組織における遺伝子の発現に関して分析する。
【０１４７】 実施例８ ＧＵＳアッセイを、当業者に既知の常套的な方法によって実施する（例えばＪ
ｅｆｆｅｒｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊ．６：３９０１，１９８７参照）。綿につい
ては、Ｒ０植物を試験した。生育の様々な段階で組織をサイズ選別し、標本を分
析用に保存した。めんの花蕾を採集し、雄性生殖組織標本（葯及び花糸）、雌性
生殖組織標本（柱頭全体、花柱及び子房）、及び花冠（がく片及び花弁）を採取
した。サイズ選別のために、各段階から小（０．５ｃｍ未満）、中（０．５から
０．７ｃｍ）及び大（キャンドル段階又は開花）を含めたいくつかのサイズを含
む３つの花蕾を選択した。葉の標本は綿植物を温室においてから約１から２週間
後に採集し、他の標本は約１から２ヵ月後に採集した。最初の花は採集しなかっ
た（最初の５つの結果位置は無傷のまま残した）。
【０１４８】 シロイヌナズナについては、Ｖ１植物を分析し、同型接合及び異型接合分離個
体だけを試験した。構築物につき８から１０の事象を分析した（１事象につき５
植物）。シロイヌナズナについてのＧＵＳ結果は８−１０事象の保存標本を表わ
す。開示した表（表２及び表３）中の数値は指定組織についての平均ＧＵＳ発現
を表わす（ｐｍｏｌ／ＭＵ／分／ｍｇ）。
【０１４９】 実施例９ 葉組織及び未成熟花蕾と花を含めた生殖組織におけるＧＵＳ発現に関して植物
を分析した。結果を表２に示す。試験した構築物は、ｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−
ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７０（Ｐ−Ａ
ｔＡｃｔ２＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７１（Ｐ−ＡｔＡ
ｃｔ８＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ１１７５０（ｅ３５Ｓ／ＧＵ
Ｓ／ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７７（Ｐ−ＥＦ１α＋イントロン／ＧＵＳ／ｎｏ
ｓ）、及びｐＭＯＮ１５７３７（Ｐ−ＦＭＶ／ＧＵＳ／ｎｏｓ）を含んだ。アク
チン及び延長因子プロモーターは、生殖組織を含めた多くの組織において高いレ
ベルのＧＵＳ発現をもたらした。
【０１５０】
【表２】
【０１５１】 実施例１０ Ｒ０綿植物を、様々な生育段階にある選択組織においてＧＵＳレポーター遺伝
子の発現に関して試験した。花蕾をサイズによって段階付けた（小、中及び大；
大＝キャンドル及び開花）。雄ずい群は、花床全体（柱頭、花柱及び子房）を含
む雄性生殖組織であった。花冠標本はがく片と花弁で構成された。組織を調製し
、実施例８で述べたようにＧＵＳアッセイを実施した。結果を表３に要約する。
試験した構築物は、ｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＥＦ１α＋イントロン／ｇｕｓ／
ｎｏｓ）、ｐＭＯＮ２６１７０（Ｐ−ＡｔＡｃｔ２＋イントロン／ｇｕｓ／ｎｏ
ｓ）、及びｐＭＯＮ４８４０７（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ｇｕｓ／ｎ
ｏｓ）を含んだ。
【０１５２】 ｐＭＯＮ２６１７７については６つの植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。ｐ
ＭＯＮ２６１７０については２０の植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。ｐＭＯ
Ｎ４８４０７については８つの植物を試験し、平均ＧＵＳ値を得た。結果は、ア
クチン及び延長因子プロモーターが、特に生殖組織において、作動可能に連結し
た遺伝子の有効な発現のために使用できることを明らかにしている。
【０１５３】
【表３】
【０１５４】 実施例１１ 形質転換植物を、Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）グリホセート製剤を使
用し、Ｔｒａｃｋ Ｓｐｒａｙｅｒ装置を用いて温室でも試験した（Ｒｏｕｎｄ
ｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）はＭｏｎｓａｎｔｏ Ｃｏｍｐａｎｙの登録商標であ
る）。植物は「２」本葉又はそれ以上の生育期にあり、葉を乾燥した後ＲＯＵＮ
ＤＵＰ（登録商標）散布を施用した。使用した製剤は、３ポンド（ｌｂ）／ガロ
ンａ．ｅ．（酸当量）製剤としてのＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）であっ
た。使用した検定は次のとおりであった： ２０ガロン／エーカー散布量について： ノズル速度： ９５０１均一流量（ｅｖｅｎｆｌｏｗ） 散布圧： ４０ｐｓｉ 散布高さ： 天蓋（ｃａｎｏｐｙ）の上部からノズルの先端まで１８インチ
トラック速度： １．１フィート／秒、１９５０−１．０の読み取りに相当する
製剤： Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）（３ポンドａ．ｅ．／ガ
ロン） 散布濃度は所望する試験幅に依存して変化する。例えば、８オンス／エーカー
の所望率の場合には、３．１ｍｌ／Ｌの作業液を使用し、６４オンス／エーカー
の所望率の場合には２４．８ｍｌ／Ｌの作業幅を使用する。
【０１５５】 評価期間は、作物、植物の生育段階及び所望する耐性レベルに依存して変化す
る。
【０１５６】 実施例１２ トマトの形質転換に使用した植物発現構築物を表４に列挙する。ａｒｏＡ：Ｃ
Ｐ４グリホセート耐性遺伝子に作動可能に連結された少なくとも１個のアクチン
又は延長因子プロモーター（イントロンを伴う）を備える構築物を含むトマト植
物（Ｔ０）を、トランスジェニックトマト植物にグリホセート耐性を付与する効
率に関して、グリホセート（Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標））製剤による
温室グリホセート散布試験においてスクリーニングする。任意に、トマト植物に
形質転換した、ａｒｏＡ：ＣＰ４グリホセート耐性遺伝子に作動可能に連結され
た少なくとも１個のアクチン又は延長因子プロモーター配列及びａｒｏＡ：ＣＰ
４に作動可能に連結されたｅＦＭＶカリモウイルスプロモーターを、グリホセー
ト（Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標））の散布施用によってスクリーニング
する。トマト植物に４８オンス／エーカーを散布し、施用後２週間目に栄養耐性
分析のため、施用後６０日目までに生殖耐性分析のために評価した。結果を表４
に示し、生殖耐性系統を選択する効率に従ってランク付けている。栄養耐性パー
セントは、スクリーニングした中で、商業的候補として製剤中で作物栽培学的形
質をさらに検討するのに十分とみなされるグリホセート被害に対する栄養耐性を
示した系統のパーセンテージである。パーセント生殖耐性は、さらなる作物栽培
学的評価のために十分とみなされる生殖耐性も同時に示した栄養耐性系統のパー
センテージである。すべての構築物が、トランスジェニックトマト植物に栄養耐
性及び生殖耐性を与える上で機能的であることが証明された。プロモーターの様
々な組合せは、この実験において栄養及び生殖耐性系統をスクリーニングによっ
て選択しうる効率を高めることができる。シロイヌナズナＥＦ１αプロモーター
を含む構築物は、栄養耐性系統の高いパーセンテージとより特異的に結びつく。
Ｐ−ｅＦＭＶ及びＰ−ＡｔＥＦ１αと組み合わせたＰ−Ａｃｔ２プロモーター（
ｐＣＧＮ９１９０）は、この方法によってスクリーニングされる生殖耐性系統の
パーセンテージ上昇をもたらした。
【０１５７】
【表４】
【０１５８】 トマト種子の収率を、トランスジェニックトマト植物にグリホセート耐性を与
える上での、本発明において使用する様々なプロモーター配列及び発現カセット
の組合せの効率の測定値として使用する。表５に、グリホセート耐性についての
ａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進する本発明のプロモーターを備える構
築物を含むトランスジェニックトマト植物に関する３つの圃場実験の結果を示し
ている。実験１は、天然及び重複強化バージョン（Ｐ−ｅＦＭＶ）中にゴマノハ
グサモザイクウイルスプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ）及び本発明のプロモーター配
列を試験するために使用する構築物においても認められる構築物中の付加遺伝エ
レメントを含む構築物から生産される植物の試験である。５’非翻訳配列及び葉
緑体シグナルペプチドのソースのような付加遺伝エレメントも試験する。構築物
ｐＭＯＮ２０９９８は、ペチュニアＨｓｐ７０ ５’ＵＴＲに連結されたＰ−ｅ
ＦＭＶ、Ｅ９ ３’終結領域に連結された、シロイヌナズナＥＰＳＰＳ葉緑体シ
グナルペプチドに連結されたリーダーを含む。構築物ｐＭＯＮ２０９９９は、プ
ロモーターがＰ−ＦＭＶであるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異な
る。構築物ｐＭＯＮ１０１５６は、ＣＴＰがＰｅｔｕｎｉａ ＥＰＳＰＳ葉緑体
シグナルペプチド（ＣＴＰ４）からのものであるという点においてのみｐＭＯＮ
２０９９８と異なる。構築物ｐＭＯＮ４５３１２は、リーダー配列が天然ＦＭＶ
リーダー配列であるという点においてのみｐＭＯＮ２０９９８と異なる。
【０１５９】 トマト植物を圃場に列条に移植する。植物を圃場でＲｏｕｎｄｕｐ除草剤によ
り４８オンス／エーカーの割合で散布処理する。果実からトマト種子を採集し、
計量する。散布していないトマト系統を比較のための対照として使用し、各構築
物の効率を対照のパーセンテージで表わす。実験１の結果（表５の欄１）は、Ｆ
ＭＶプロモーター及びＰ−ｅＦＭＶが非散布対照の５から１１％の種子産生だけ
をもたらすことを示している。実験２及び３は、様々な場所で本発明の構築物を
試験している（表５の欄２及び３）。実験２は、実験１と同じ場所で試験してお
り、構築物ｐＣＧＮ８０９９（図７）、ｐＣＧＮ９１５１（図１１）及びｐＣＧ
Ｎ９１９０（図５）は非散布対照に比べて２５から４６％の種子を提供し、良好
に機能した。より低温の生育期を有する、異なる場所で実施した実験３は、ｐＣ
ＧＮ８０６８（図９）、ｐＣＧＮ８０８８（図８）、ｐＣＧＮ９１５３（図６）
及びｐＭＯＮ４５３２５（図２）が、非散布対照に比べて３４−７７％の正常な
種子を結実させる十分なグリホセート耐性を付与しうることを明らかにした。
【０１６０】
【表５】
【０１６１】 実施例１３ 配列番号１から８及び配列番号１３−２１は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈ
ａｌｉａｎａ Ａｃｔ１、Ａｃｔ２（Ｇｅｎｂａｎｋ ＃Ｕ４１９９８）、Ａｃ
ｔ３、Ａｃｔ７、Ａｃｔ８（Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ＡＴＵ４２００７）、Ａｃｔ１
１（Ｇｅｎｂａｎｋ ＃ＡＴＵ２７９８１）、Ａｃｔ１２及びＥＦ１α（Ｇｅｎ
ｂａｎｋ ＃Ｘ１６４３０）に関する公的に入手可能な配列情報から設計したＰ
ＣＲプライマーである。これらの配列を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）手法を用いて核酸配列を伸長する（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓ
ｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３，
１９８６；Ｅｒｌｉｃｈら、欧州特許願第５０，４２４号、欧州特許願第８４，
７９６号、欧州特許願第２５８，０１７号、欧州特許願第２３７，３６２号；Ｍ
ｕｌｌｉｓら、欧州特許願第２０１，１８４号；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４
，６８３，２０２号、米国特許第４，５８２，７８８号；及びＳａｉｋｉら、米
国特許第４，６８３，１９４号参照）。多くのＰＣＲ増幅法が当業者に既知であ
り、既知配列に隣接する核酸配列を同定するために使用される。例えば、既知配
列のコア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅するために使用される逆ＰＣＲ
（ＩＰＣＲ）が記述されている。捕獲ＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ Ｍ．ら、
ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１，１９９１）及び歩行ＰＣ
Ｒ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：３０５５，
１９９１）のような他の方法も使用可能である。また多くの製造業者が、対象と
する配列を同定するためにこれらの方法の修正に基づくキットを開発している。
プライマー及びアダプター設計における改善、ポリメラーゼ酵素の改善、そして
熱循環器の能力を含めた技術的進歩が、対象とする配列を単離するためのより迅
速で効率的な方法を容易にした。
【０１６２】
【表６】
【０１６３】 Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａの幼植物の葉（１ｇ）をＣＴＡＢ
緩衝液（Ｓａｇｈａｉ−Ｍａｒｏｏｆら、１９８４、ＰＮＡＳ ８１：８０１４
−８０１８）９ｍｌ中で均質化した。ＣＴＡＢ緩衝液は、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ、ｐＨ７．８、７００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ＣＴＡ
Ｂ（アルキルトリメチルアンモニウムブロミド）及び１４０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノールを含んだ。６５℃で９０分間インキュベートした後、クロロホルム
：イソアミルアルコール（２４：１）４．５ｍｌを加え、試料を１０分間混合し
た。１５００ｇで１０分間遠心分離して水相を分離し、クロロホルム：イソアミ
ルアルコールで再抽出した。２回目の遠心分離後、水相を、１０ｍｇ／ｍｌ Ｒ
Ｎａｓｅ Ａ ５０ｍｌの入った（ＤＮａｓｅ不含）試験管に移し、室温で３０
分間インキュベートしてＲＮＡを除去した。イソプロパノール６ｍｌでＤＮＡを
沈殿させ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．５ １ｍｌに再懸濁した
。ＤＮＡ溶液を等量のフェノールで１回、等量のクロロホルム：イソアミルアル
コールで１回抽出した。遠心分離後、１／１０容の酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ
５．２）を水層に加え、次いで２．５容のエタノールを加えた。ＤＮＡをフック
し（ｈｏｏｋ）、７０％エタノールで洗って、空気乾燥し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ緩衝液０．２ｍｌに再懸濁した。
【０１６４】 シロイヌナズナゲノムＤＮＡ（１００ｎｇ）をＰＣＲ反応物５０ｍｌにおいて
使用した。表５に示すプライマーを備える反応物は、０．２ｍＭ逆及び正プライ
マー溶液、２００ｎＭ ｄＮＴＰ及びマグネシウムを含むＰＣＲ緩衝液、ならび
にＥｘｐａｎｄ（商標） Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ
（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）からのＤＮＡ
ポリメラーゼ混合物を含んだ。９４℃での最初の２分間の変性後、反応物を９４
℃で０．５分間、５５℃で０．５分間、及び７２℃で１．５分間の３５回のサイ
クルに供した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって分析した
。アクチン１ａ、アクチン１ｂ、アクチン７、及びアクチン１２配列を表わすゲ
ル単離ＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡキナーゼでリン酸化し、脱リン酸化したＳｍａ
Ｉ切断ｐＵＣ１９クローニング構築物にライゲートした。コロニーを適切な挿
入物の存在に関してスクリーニングし、Ｍ１３で配列決定してアクチンプロモー
ターの存在を確認した。選択したクローンをｐＭＯＮ５４９４１（Ｐ−ＡｔＡｃ
ｔ１ａ）、ｐＭＯＮ５４９４２（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１ｂ）、ｐＭＯＮ５４９４３（
Ｐ−ＡｔＡｃｔ７）及びｐＭＯＮ５４９４４（Ｐ−ＡｔＡｃｔ１２）と称した。
その後、アクチンプロモーターのＤＮＡ断片を、挿入配列を含むｐＵＣ１９構築
物のＨｉｎｄ ＩＩＩ及びＮｃｏＩ消化によって遊離し、ＤＮＡ断片をゲル単離
して、同じ制限酵素で消化しておいたｐＭＯＮ２６１６５にライゲートした。ア
クチン３プロモーター（Ｐ−ＡｔＡｃｔ３）についてのＰＣＲ産物をＨｉｎｄ
ＩＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＭＯＮ２６１６５に直接クローン化してｐＭＯ
Ｎ５４９５１を形成した。ｐＭＯＮ２６１６５はＧＵＳ／ｎｏｓターミネーター
遺伝子セグメントを含む。プロモーターセグメントとのライゲーションは、植物
細胞でのβ−グルクロニダーゼ酵素の発現により各プロモーターを機能的活性に
関して検定することを可能にする。植物細胞、例えばタバコの葉のプロトプラス
トを単離することができる、若しくは植物細胞を葉、根、子葉、胚軸、胚芽、花
又は貯蔵器官のような植物組織又は器官に含めることができる。
【０１６５】 これらのプロモーターによって推進されるＧＵＳの発現レベルを、Ｐ−ｅ３５
Ｓプロモーターによって推進されるＧＵＳと比較してダイズ胚軸において検定す
る（表６）。プラスミドＤＮＡ／金粒子でダイズ胚軸に衝撃を与え、４８時間後
にＧＵＳ活性を組織化学的に検定した。このアッセイで試験したすべてのアクチ
ンプロモーターが胚軸組織において機能的活性を示し、異種作物種でのトランス
ジーン発現のための有用性を明らかにしている。本発明のシロイヌナズナアクチ
ン１ａ（ｐＭＯＮ５４９５２）、アクチン１ｂ（ｐＭＯＮ５４９５３）、アクチ
ン３（ｐＭＯＮ５４９５４）、アクチン７（ｐＭＯＮ５４９５５）及びアクチン
１２（ｐＭＯＮ５４９５６）プロモーターによって推進されるａｒｏＡ：ＣＰ４
ＥＰＳＰＳを含む構築物を、作物におけるグリホセート耐性ＥＰＳＰＳの安定
な発現のためにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍバイナリー植物形質転換構築物にお
いて調製した。これらの構築物をダイズ及び綿細胞に形質転換し、細胞を選択し
て、グリホセートを含む組織培養基上で植物に再生し、その後ａｒｏＡ：ＣＰ４
蛋白質の発現及びグリホセート施用に対する耐性に関して検定する。商業的に許
容されるグリホセート耐性を示す植物を、培養に適合させた生殖質にグリホセー
ト耐性形質を転移するために従来の育種法によってさらに生育させる。
【０１６６】
【表７】
【０１６７】 実施例１４ 綿の収率は、スクエアリング（ｓｑｕａｒｉｎｇ）の最初の４から５週間のス
クエアセットの数と相関する。さく（ｂｏｌｌ）を成熟させるためのこれらのス
クエアの保持及び綿毛の収穫へのそれらの寄与が収率の鍵となる構成要素である
。綿において除草剤耐性を与えるためのトランスジーン構築物の効果を調べると
きには、さくの保持量が効果の測定値であり、望ましい形質である。本発明のプ
ロモーターを含むトランスジェニック綿植物（表７）を温室環境においてさく保
持に関して検定した。プロモーターは、グリホセート耐性表現型についてのａｒ
ｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を指令した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介す
る方法又はパーティクルガン法によって植物を形質転換した。パーティクルガン
構築物は、本発明のプロモーターからのβ−グルクロニダーゼ活性の組織化学的
局在のために有用な付加ＧＵＳ含有発現カセットを含んだ。トランスジェニック
植物をグリホセート含有培地で再生し、活着培地で植物を発根させた。発根した
小植物を鉢の土壌に植え付け、ハードニングオフ期間（ｈａｒｄｅｎｉｎｇ ｏ
ｆｆ ｐｅｒｉｏｄ、徐々に寒気に当てて強くする期間）中生育室に移した。こ
れらの植物系統からの種子を採集し、植え付けた。各系統から１５の植物に、４
葉期に４８オンス／エーカーのグリホセートを散布した。各系統から少なくとも
８の生存植物に、８葉期に再び４８オンス／エーカーのグリホセートを散布した
。成熟時に、最初の５つのさくについて最初の位置のさくの数を計数した。グリ
ホセート散布後に最初の位置のさくの３又はそれ以上が保持されていた系統（植
物マップ≧３）はさらなる試験へと進んだ。表７はこの試験から得られたデータ
を示す。マッピングした系統の数は、１回目のグリホセート散布施用に耐えて生
存した系統の数を示す。商業的基準は、ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４遺伝子／Ｅ
９ ３’の発現を推進するＰ−ＦＭＶプロモーターを含む１４４５系統（ｐＭＯ
Ｎ１７１３６）である。構築物ｐＣＧＮ８０９９、ｐＣＧＮ９１５３、ｐＣＧＮ
８０８８、ｐＣＧＮ８０６８は、これらの構築物から試験した系統の１４−３５
％が、さらなる作物栽培学試験へと進むのに十分な綿における生殖グリホセート
耐性をもたらした。
【０１６８】
【表８】
【０１６９】 実施例１５ 綿の収率は、スクエアリングの最初の４から５週間のスクエアセットの数と相
関する。さくを成熟させるためのこれらのスクエアの保持及び綿毛の収穫へのそ
れらの寄与が収率の鍵となる構成要素である。綿において除草剤耐性を与えるた
めのトランスジーン構築物の効果を調べるときには、さくの保持量が効果の測定
値であり、望ましい形質である。本発明のプロモーターを含むトランスジェニッ
ク綿植物を、さく保持に関して２つの場所において圃場条件で検定した。トラン
スジェニック綿系統５０２−２５４−２（ｐＣＧＮ８０６８）、７０１−１７８
−２（ｐＣＧＮ８０６８）、５３−２（ｐＣＧＮ８０８８）、１７８−１（ｐＣ
ＧＮ９１５３）及び６０−１（ｐＣＧＮ９１５３）を、構築物ｐＭＯＮ１７１３
６（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含む１４４５（グ
リホセート耐性系統）及びＰＭ１２１８ＢＲ（Ｐａｙｍａｓｔｅｒ１２１８交配
母本）と比較し、野生型非トランスジェニック系統、Ｃｏｋｅｒ１３０を含めた
。圃場デザインは、２うね×２０から３０フィート×３反復試験区から成る任意
配列完全ブロック法である。グリホセートは、綿植物生育の８葉期に、１．１２
ポンドａｉ／Ａ＝４８オンス製品及び１．５ポンドａｉ／Ａ＝６４オンス製品の
割合のＲｏｕｎｄｕｐ Ｕｌｔｒａ（商標）製剤として施用する。綿試験区はす
べて、雑草及び害虫防除に関して、ならびに植付け時期、受精、灌漑、ＰＧＲ使
用及び摘葉のような作物栽培学的投入要素に関して積極的に管理する。マッピン
グする各試験区の中央の２つのうねのまん中から１０の植物（各うねから５ずつ
）を無作為に選んで、保持されているさくの各々の位置をマッピングしてさく保
持パーセントを決定する。最初のマッピングは最初の開花後４週間目（中間シー
ズンマップ）に実施し、２回目のマッピングは収穫時に実施すべきである。収集
したデータは、トランスジェニック綿系統のグリホセートに対する生殖耐性の指
標として計数する，下部の５つの開花節（ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ ｎｏｄｅ）上の
最初の位置のさくの数を含む。表８は、本発明のプロモーターがさく保持に関し
てトランスジェニック綿植物に付与した利益を示す。この増強された生殖耐性は
、綿毛収率の上昇（図９）及び種子収率の上昇（図１０）ももたらした。
【０１７０】
【表９】
【０１７１】
【表１０】
【０１７２】
【表１１】
【０１７３】 実施例１６ ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４コード配列の発現を推進するハイブリッドプロモ
ーターＰ−ｅＦＭＶ−ＡｔＥＦ１α（図１３、ｐＭＯＮ５２０５９）及びＰ−Ｆ
ＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’（ｐＭＯＮ１５７３７）の効果を
トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａにおいて比較し
た。トランスジェニックＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ植物を真空
浸透によって生成し（Ｂｅｃｈｔｏｌｄら、Ｃ Ｒ Ａｃａｄ Ｐａｒｉｓ Ｌ
ｉｆｅ Ｓｃｉ ３１６：１１９４−１１９９）、種子を、植物の正常な成長と
発育を可能にする２４℃、１６時間光（１２０μＥｍ−２ｓ−１）サイクルに調
整した生育室のトレー上で鉢の土壌に植え付けた。ｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１事
象グリホセート耐性トランスジェニックシロイヌナズナ植物を２４オンス／エー
カーの割合のグリホセート除草剤散布施用によって選択し、生存植物を個々の鉢
に移植した。８つのｐＭＯＮ５２０５９ Ｖ１植物と８つのｐＭＯＮ１５７３７
同型接合植物に、抽台所見に対応して、約１６日後に２４オンス／エーカーの割
合で２回目の散布を行った。２回目の散布は、生殖耐性を与える２つの構築物の
効果を測定するものである。グリホセート施用の栄養作用に関して植物を観察し
た。すべての植物が完全な栄養耐性を有しており、異常な花は認められなかった
。しかし、長角果の発育停止の発生は、発育停止した長角果においては種子が定
植していなかったことを示唆した。各々の植物が産生した長角果と種子を含む長
角果（稔性長角果）の総数を計数し、表にまとめた。結果を表９に示すが、ハイ
ブリッドプロモーターｐＭＯＮ５２０５９は稔性長角果の１０倍以上の改善を明
らかにし、ｐＭＯＮ１５７３７の８％に対して８９％であったことが認められる
。稔性結果構造の数は生産されうる種子の量に関係し、これは収率が種子数に関
連する作物において特に重要である。綿、ダイズ、キャノーラ、コムギ及びトウ
モロコシなどの作物は、グリホセートに対する生殖耐性が良好な収率にとって不
可欠である作物である。
【０１７４】
【表１２】
【０１７５】 実施例１９ ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｕｕｓ Ｌ．）は油及び食品として作
物栽培学的に重要な作物である。本発明の構築物ｐＭＯＮ４５３２５（図２）、
ｐＭＯＮ４５３３２（図４）及びｐＭＯＮ４５３３１（図３）をヒマワリに形質
転換した。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを介したヒマワリの形質転換が報告され
ている（Ｓｃｈｒａｍｍｅｉｊｅｒら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ
，９：５５−６０，１９９０；ＥＰ ０ ４８６ ２３４号）。トランスジーン
発現構築物による植物形質転換の当業者に既知の方法は、胚軸、頂端分裂組織、
原形質、及び他のヒマワリ組織を含みうる。トランスジェニックヒマワリ系統Ｓ
ＦＢ２５０−２７は、ｐＭＯＮ２０９９９（Ｐ−ＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：
ＣＰ４／Ｅ９３’）発現カセット；ＳＦＢ２８８−０１を含み、ＳＦＢ２９５−
０９はｐＭＯＮ４５３２５（Ｐ−ｅＦＭＶ／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９
３’：：Ｐ−ＡｔＡｃｔ１１＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９
３’）を含み；ＳＦＢ２８９−０１はｐＭＯＮ４５３３２（Ｐ−ＡｔＥＦ１α＋
イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’：：Ｐ−ｅＦＭＶ／ＣＴＰ
２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９３’）を含み；ＳＦＢ３０３−０８、ＳＦＢ３０３
−０９、ＳＦＢ３０３−１１及びＨＡ３００Ｂは、ｐＭＯＮ４５３３１（Ｐ−Ａ
ｔＥＦ１α＋イントロン／ＣＴＰ２−ａｒｏＡ：ＣＰ４／Ｅ９）を含む。これら
の系統をグリホセート耐性に関して試験し、図１２に示している。
【０１７６】 ヒマワリにおけるグリホセートへの生殖耐性は、正常穂のパーセント、パーセ
ント正常穂サイズ及び花粉産生の関数として測定できる。これらの植物にＶ−４
及びＶ−８葉期に０．３２オンス／エーカー又は６４オンス／エーカーの割合で
グリホセートを散布する。ヒマワリ植物をグリホセートに対する栄養耐性に関し
て評価する。栄養耐性は、植物生育のＶ４及びＶ８の両方の段階で３２及び６４
オンス／エーカーレベルのグリホセート産婦に達する。
【０１７７】 栄養グリホセート耐性トランスジェニックヒマワリ系統を、穂の数、パーセン
ト正常穂、パーセント正常穂サイズ、及びパーセント正常放出花粉に関してスコ
アリングする。これらの形質を１つの場所での圃場試験において採点する。穂の
スコアと花粉産生をまとめたものを表１２に示す。本発明の構築物から選択され
た系統はより高いパーセントの正常穂、概してより高いパーセントの正常穂サイ
ズ及びより良好な放出花粉を示す。
【０１７８】
【表１３】
【０１７９】 実施例１８ 適切なプロモーター調節に必要なシス作用性調節エレメントは多くの手段によ
って同定することができる。１つの方法では、プロモーターの領域を取り除く欠
失分析を実施し、断片をプロモーター活性に関して検定する。トランケートされ
たプロモーターの活性が元のプロモーター断片に比べて変化している場合には、
ＤＮＡ断片はプロモーター領域にとって必要とみなされる。この欠失分析を通し
て、転写の正又は負の調節に必要なＤＮＡの小さな領域を同定することができる
。プロモーター配列モチーフも同定でき、作動可能に連結された転写可能配列の
発現を調節するためこれらのシスエレメントを含むように新規プロモーターを設
計することができる。例えば、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許
第５，２２３，４１９号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第４
，９９０，６０７号、その全体が参照してここに組み込まれる米国特許第５，０
９７，０２５号参照。
【０１８０】 代替的なアプローチは、同様の発現プロフィールを持つプロモーター間で類似
配列を捜すことである。活性の重複パターンを備えるプロモーターは共通調節機
序を有しうる。ＭＥＭＥ、ＳＩＧＮＡＬ ＳＣＡＮ又はＧＥＮＥ ＳＣＡＮを含
むがこれらに限定されないいくつかのコンピュータプログラムが、プロモーター
間で保存された配列モチーフを同定するために使用できる。これらのモチーフは
、プロモーターを調節するように働く転写因子の結合部位でありうる。ひとたび
配列モチーフが同定されれば、それらの機能を検定することができる。例えば、
モチーフが正しいプロモーター機能にとって必要であるかどうかを調べるために
モチーフ配列をプロモーターから欠失させることができる。代替的に、モチーフ
を最小プロモーターに付加して、それが転写を活性化するのに十分であるかどう
かを調べることもできる。疑わしい負の調節エレメントを、活性プロモーターに
付加してプロモーター活性の低下を調べることにより、その能力を試験すること
ができる。一部のシス作用性調節エレメントは機能するための他のエレメントを
必要とすると考えられる。それ故、当業者に既知の数多くの方法によって多数の
エレメントを様々な組合せで試験することができる。
【０１８１】 ひとたび機能的プロモーターエレメントが同定されれば、蛋白質結合に影響を
及ぼすようにヌクレオチドレベルで修飾することができる。修飾は、そのプロモ
ーターからの転写レベルに影響を及ぼすより高い又はより低い親和性結合を生じ
させることができる。
【０１８２】 プロモーターエレメントは付加的に又は共力作用的にプロモーター活性に影響
を及ぼすように働きうる。これに関して、異なる５’調節領域からのプロモータ
ーエレメントを縦列に配置して、異なる活性スペクトル又は異なる発現プロフィ
ールを持つプロモーターを得ることができる。従って、異種ソースからのプロモ
ーターエレメントの組合せあるいは同様のエレメント又は同じエレメント重複は
、作動可能に連結された転写可能配列のより高いレベルの発現をもたらすことが
できる。例えば、プロモーターエレメントを多量体化して、そのプロモーターエ
レメントによって影響されるパターンでの発現レベルを特異的に高めることがで
きる。
【０１８３】 新規設計された５’調節エレメントを備える発現構築物を構築するために必要
な技術的方法は当業者に既知である。設計されたプロモーターを発現構築物にお
いて試験し、新規プロモーターをＧＵＳのような適当なレポーター遺伝子に作動
可能に連結して、一過性植物アッセイにおいて検定することにより、一過性に試
験する。新規プロモーターを対象とする１個又はそれ以上の遺伝子に作動可能に
連結し、１個又はそれ以上の付加調節エレメントと共に植物形質転換構築物に組
み込んで、適当なＤＮＡ送達システムにより対象とする標的植物に形質転換する
。安定形質転換された植物とその後の子孫を、所望する特性を評価するために適
当な数多くの分子、免疫診断、生化学、表現型、又は圃場方法によって評価する
。
【０１８４】 本発明の原理を例示し、説明したが、そのような原理から逸脱することなく本
発明をそのアレンジと詳細において変更しうることは当業者には明白であろう。
我々は、付属の特許請求の範囲の精神と範囲内にあるすべての変更を特許請求す
る。
【０１８５】 この明細書の中で引用したすべての公表文献及び公開特許資料は、個々の公表
文献又は特許願が参照して組み込まれることを個別に示唆されているのと同じよ
うに、参照してここに組み込まれるものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ｐＣＧＮ８０８６のプラスミドマップである。
【図２】 ｐＭＯＮ４５３２５のプラスミドマップである。
【図３】 ｐＭＯＮ４５３３１のプラスミドマップである。
【図４】 ｐＭＯＮ４５３３２のプラスミドマップである。
【図５】 ｐＣＧＮ９１９０のプラスミドマップである。
【図６】 ｐＣＧＮ９１５３のプラスミドマップである。
【図７】 ｐＣＧＮ８０９９のプラスミドマップである。
【図８】 ｐＣＧＮ８０８８のプラスミドマップである。
【図９】 ｐＣＧＮ８０６８のプラスミドマップである。
【図１０】 ｐＣＧＮ８０９６のプラスミドマップである。
【図１１】 ｐＣＧＮ９１５１のプラスミドマップである。
【図１２】 ｐＭＯＮ１０１５６のプラスミドマップである。
【図１３】 ｐＭＯＮ５２０５９のプラスミドマップである。
【図１４】 ｐＭＯＮ５４９５２のプラスミドマップである。
【図１５】 ｐＭＯＮ５４９５３のプラスミドマップである。
【図１６】 ｐＭＯＮ５４９５４のプラスミドマップである。
【図１７】 ｐＭＯＮ５４９５５のプラスミドマップである。
【図１８】 ｐＭＯＮ５４９５６のプラスミドマップである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウイルキンソン，ジヤツク・キユー アメリカ合衆国、カリフオルニア・94065、 レツドウツド・シテイ、シエル・パークウ エイ・505・ナンバー・1107 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA17 CA19 CD03 CD07 CD09 CD21 4B024 AA08 BA07 BA08 CA04 CA05 DA01 EA04 FA02 GA11 HA01

Claims (50)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＤＮＡ構築物であって、配列番号９、配列番号１０、配列番
    号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号
    ２５、配列番号２６から成る群から選択される配列から誘導される少なくとも１
    個のシスエレメント、作物栽培学的に有用な蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列
    、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付
    加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、構造遺伝子がプロモータ
    ー及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、プロモーターＤＮＡ配列が
    構造ＤＮＡ配列に関して異種である、ＤＮＡ構築物。
  2. 【請求項２】 構造ＤＮＡ配列が除草剤耐性遺伝子をコードする、請求項１
    に記載のＤＮＡ構築物。
  3. 【請求項３】 除草剤耐性遺伝子がグリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）
    耐性遺伝子である、請求項２に記載のＤＮＡ構築物。
  4. 【請求項４】 グリホセート耐性遺伝子がＥＰＳＰシンターゼ遺伝子又はグ
    リホセートオキシドレダクターゼ遺伝子である、請求項３に記載のＤＮＡ構築物
    。
  5. 【請求項５】 グリホセート耐性遺伝子がａｒｏＡ：ＣＰ４遺伝子である、
    請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
  6. 【請求項６】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり少
    なくとも５０グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細胞
    に付与する、請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
  7. 【請求項７】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり少
    なくとも３００グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細
    胞に付与する、請求項６に記載のＤＮＡ構築物。
  8. 【請求項８】 植物細胞に導入したとき、１エーカー当たり１６オンスの割
    合のグリホセートの少なくとも１回の施用に対する耐性を植物細胞に付与する、
    請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
  9. 【請求項９】 構造ＤＮＡ配列がＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ
    ｓｉｓ昆虫制御遺伝子である、請求項１に記載のＤＮＡ構築物。
  10. 【請求項１０】 プロモーターＤＮＡ配列が、基本的に、配列番号９、配列
    番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番
    号２４、配列番号２５及び配列番号２６から成る群から選択される配列から誘導
    される、５’調節領域から成る、請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
  11. 【請求項１１】 配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２
    、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６か
    ら成る群から選択される配列から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを
    含み、かかる少なくとも１個のシスエレメントが異種プロモーター配列に作動可
    能に連結されている、キメラプロモーターＤＮＡ配列。
  12. 【請求項１２】 異種プロモーター配列が植物ＤＮＡウイルスプロモーター
    である、請求項１１に記載のキメラプロモーターＤＮＡ配列。
  13. 【請求項１３】 植物ＤＮＡウイルスプロモーターが、カリフラワーモザイ
    クウイルス及びゴマノハグサ（Ｆｉｇｗｏｒｔ）モザイクウイルスから成る群か
    ら選択される、請求項１２に記載のキメラプロモーターＤＮＡ配列。
  14. 【請求項１４】 キメラプロモーターＤＮＡ配列が、配列番号２７、配列番
    号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る群から選択される、請求項１３
    に記載のキメラプロモーターＤＮＡ配列。
  15. 【請求項１５】 ＤＮＡ構築物であって、配列番号９、配列番号１０、配列
    番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番
    号２５、配列番号２６から成る群から選択される配列から誘導される少なくとも
    １個のシスエレメントを備えるキメラプロモーターＤＮＡ配列（かかる少なくと
    も１個のシスエレメントは異種プロモーター配列に作動可能に連結されている）
    ；構造ＤＮＡ配列；及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化
    ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を備える発現カ
    セットを含み、構造遺伝子がプロモーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結
    されており、プロモーターＤＮＡ配列が構造ＤＮＡ配列に関して異種である、Ｄ
    ＮＡ構築物。
  16. 【請求項１６】 構造ＤＮＡ配列が除草剤耐性遺伝子をコードする、請求項
    １５に記載のＤＮＡ構築物。
  17. 【請求項１７】 除草剤耐性遺伝子がグリホセート耐性遺伝子である、請求
    項１６に記載のＤＮＡ構築物。
  18. 【請求項１８】 グリホセート耐性遺伝子がＥＰＳＰシンターゼ遺伝子又は
    グリホセートオキシドレダクターゼ遺伝子である、請求項１７に記載のＤＮＡ構
    築物。
  19. 【請求項１９】 グリホセート耐性遺伝子がａｒｏＡ：ＣＰ４遺伝子である
    、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
  20. 【請求項２０】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり
    少なくとも５０グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細
    胞に付与する、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
  21. 【請求項２１】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり
    少なくとも３００グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物
    細胞に付与する、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
  22. 【請求項２２】 植物細胞に導入したとき、１エーカー当たり１６オンスの
    割合のグリホセートの少なくとも１回の施用に対する耐性を植物細胞に付与する
    、請求項１７に記載のＤＮＡ構築物。
  23. 【請求項２３】 構造ＤＮＡ配列が昆虫制御遺伝子である、請求項１５に記
    載のＤＮＡ構築物。
  24. 【請求項２４】 昆虫制御遺伝子がＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅ
    ｎｓｉｓから誘導される、請求項２３に記載のＤＮＡ構築物。
  25. 【請求項２５】 配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号
    ３０から成る群から選択されるキメラプロモーターＤＮＡ配列、構造ＤＮＡ配列
    、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付
    加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、構造遺伝子がキメラプロ
    モーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、キメラプロモーター
    ＤＮＡ配列が構造ＤＮＡ配列に関して異種である、ＤＮＡ構築物。
  26. 【請求項２６】 構造ＤＮＡ配列が除草剤耐性遺伝子をコードする、請求項
    ２５に記載のＤＮＡ構築物。
  27. 【請求項２７】 除草剤耐性遺伝子がグリホセート耐性遺伝子である、請求
    項２６に記載のＤＮＡ構築物。
  28. 【請求項２８】 グリホセート耐性遺伝子がＥＰＳＰシンターゼ遺伝子又は
    グリホセートオキシドレダクターゼ遺伝子である、請求項２７に記載のＤＮＡ構
    築物。
  29. 【請求項２９】 グリホセート耐性遺伝子がａｒｏＡ：ＣＰ４遺伝子である
    、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
  30. 【請求項３０】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり
    少なくとも５０グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物細
    胞に付与する、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
  31. 【請求項３１】 植物細胞に導入したとき、グリホセート１リットル当たり
    少なくとも３００グラム酸当量を含む水性グリホセート製剤に対する耐性を植物
    細胞に付与する、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
  32. 【請求項３２】 植物細胞に導入したとき、１エーカー当たり１６オンスの
    割合のグリホセート製剤の少なくとも１回の施用に対する耐性を植物細胞に付与
    する、請求項２７に記載のＤＮＡ構築物。
  33. 【請求項３３】 請求項２に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック
    作物植物。
  34. 【請求項３４】 上記作物植物が単子葉植物作物種である、請求項３３に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  35. 【請求項３５】 上記作物植物が双子葉植物作物種である、請求項３３に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  36. 【請求項３６】 除草剤耐性遺伝子がグリホセート耐性遺伝子である、請求
    項３３に記載のトランスジェニック作物植物。
  37. 【請求項３７】 請求項９に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック
    作物植物。
  38. 【請求項３８】 上記作物植物が単子葉植物作物種である、請求項３７に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  39. 【請求項３９】 上記作物植物が双子葉植物作物種である、請求項３７に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  40. 【請求項４０】 請求項１５に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニッ
    ク作物植物。
  41. 【請求項４１】 上記作物植物が単子葉植物作物種である、請求項４０に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  42. 【請求項４２】 上記作物植物が双子葉植物作物種である、請求項４０に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  43. 【請求項４３】 請求項２５に記載のＤＮＡ構築物を含むトランスジェニッ
    ク作物植物。
  44. 【請求項４４】 上記作物植物が単子葉植物作物種である、請求項４３に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  45. 【請求項４５】 上記作物植物が双子葉植物作物種である、請求項４３に記
    載のトランスジェニック作物植物。
  46. 【請求項４６】 第一発現カセットと第二発現カセットを含むＤＮＡ構築
    物であって、上記第一発現カセットが、配列番号９、配列番号１０、配列番号１
    １、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５
    、配列番号２６から成る群から選択される配列から誘導される少なくとも１個の
    シスエレメントを備えるプロモーターＤＮＡ配列、作物栽培学的に有用な蛋白質
    をコードする構造ＤＮＡ配列、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリ
    アデニル化ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含
    み、構造遺伝子がプロモーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており
    、プロモーターＤＮＡ配列が構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、そして上記第
    二発現カセットは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、
    配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６から
    成る群から選択される配列から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備
    えるプロモーターＤＮＡ配列、作物栽培学的に有用な蛋白質をコードする構造Ｄ
    ＮＡ配列、及び植物においてＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオ
    チドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、構造遺伝子がプ
    ロモーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、プロモーターＤＮ
    Ａ配列が構造ＤＮＡ配列に関して異種である、ＤＮＡ構築物。
  47. 【請求項４７】 植物において構造ＤＮＡ配列を発現する方法であって、 （１）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２
    ２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６から成る群から
    選択される配列から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備える、植物
    細胞において機能性であるプロモーター、作物栽培学的に有用な蛋白質をコード
    する構造ＤＮＡ配列、及びＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチ
    ドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、構造遺伝子がプロ
    モーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、プロモーターが構造
    ＤＮＡ配列に関して異種である、ＤＮＡ構築物を提供し、 （２）上記ＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し、そして （３）構造ＤＮＡ配列が植物において発現可能であるように、植物細胞を再生
    して植物を生産する、ことを含む方法。
  48. 【請求項４８】 植物において構造ＤＮＡ配列を発現する方法であって、 （１）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る
    群から選択される配列を備える、植物細胞において機能性であるプロモーター、
    構造ＤＮＡ配列、及びＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの
    付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、構造遺伝子がプロモー
    ター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、プロモーターが構造ＤＮ
    Ａ配列に関して異種である、ＤＮＡ構築物を提供し、 （２）上記ＤＮＡ構築物を植物細胞に導入し、そして （３）構造ＤＮＡ配列が植物において発現可能であるように、植物細胞を再生
    して植物を生産する、ことを含む方法。
  49. 【請求項４９】 雑草を防除する方法であって、 （１）配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２
    ２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６から成る群から
    選択される配列から誘導される少なくとも１個のシスエレメントを備える、植物
    において機能性であるプロモーター、グリホセート耐性遺伝子、及びＲＮＡ配列
    の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチドの付加を生じさせるように機能する
    ３’非翻訳領域を含み、グリホセート耐性遺伝子がプロモーター及び３’非翻訳
    領域に作動可能に連結されており、プロモーターがグリホセート耐性遺伝子に関
    して異種であるＤＮＡ構築物で形質転換した作物植物を提供し、そして （２）作物植物を害することなく雑草を防除するのに十分な量のグリホセート
    を上記作物植物に施用する、ことを含む方法。
  50. 【請求項５０】 雑草を防除する方法であって、 （１）配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０から成る
    群から選択される配列を備える、植物において機能性であるプロモーター、グリ
    ホセート耐性遺伝子、及びＲＮＡ配列の３’末端へのポリアデニル化ヌクレオチ
    ドの付加を生じさせるように機能する３’非翻訳領域を含み、グリホセート耐性
    遺伝子がプロモーター及び３’非翻訳領域に作動可能に連結されており、プロモ
    ーターがグリホセート耐性遺伝子に関して異種であるＤＮＡ構築物で形質転換し
    た作物植物を提供し、そして （２）作物植物を害することなく雑草を防除するのに十分な量のグリホセート
    を上記作物に施用する、ことを含む方法。
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