TW201619386A - 合成性雙向植物啓動子 - Google Patents

合成性雙向植物啓動子 Download PDF

Info

Publication number
TW201619386A
TW201619386A TW104135238A TW104135238A TW201619386A TW 201619386 A TW201619386 A TW 201619386A TW 104135238 A TW104135238 A TW 104135238A TW 104135238 A TW104135238 A TW 104135238A TW 201619386 A TW201619386 A TW 201619386A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
promoter
sequence
identification number
polynucleotide
plant cell
Prior art date
Application number
TW104135238A
Other languages
English (en)
Inventor
山迪普 庫瑪
托比 席夏克
海瑟Ｌ 羅賓森
達耶卡Ｒ 帕萊迪
陳偉
Original Assignee
陶氏農業科學公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 陶氏農業科學公司 filed Critical 陶氏農業科學公司
Publication of TW201619386A publication Critical patent/TW201619386A/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07047—Streptomycin 3''-adenylyltransferase (2.7.7.47)

Abstract

本揭露內容考慮用於促進一核苷酸序列在植物或植物細胞中之轉錄的組成物及方法，其採用源自擬南芥(Arabidopsis thaliana)泛素10基因啟動子或木薯葉脈嵌紋病毒(Cassava Vein Mosaic Virus)啟動子之最小核心啟動子元素，及源自一木薯葉脈嵌紋病毒元素啟動子之該全長核苷酸序列元素。一些實施例有關一合成性CsVMV雙向啟動子，該者在植物中作用，以促進兩個操縱鏈接核苷酸序列的轉錄。

Description

合成性雙向植物啟動子 優先權主張
本申請案主張2014年11月11日以“合成性雙向植物啟動子”提申之美國專利臨時申請案序號62/078,205之提申日利益。
發明領域
本揭露內容一般地有關用於促進一核苷酸序列在植物或植物細胞中之轉錄的組成物及方法。一些實施例有關一合成性木薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)雙向啟動子，該者在植物中作用，以促進一操縱鏈接核苷酸序列的轉錄。特定實施例有關於包括一合成性啟動子(例如，引入一核酸分子至一細胞內)之方法，及包含一合成性啟動子之細胞、細胞培養物、組織、生物體及生物體部件，以及由此產生的產物。
發明背景
許多植物物種能夠以來自其它物種的轉基因轉形，以引入農藝上所欲的性狀或特徵，舉例而言，改善營養價值品質、提高產量、賦予害蟲或疾病之抗性、提高乾旱與壓力耐受性、改善園藝品質(諸如色素沈著與生長)、 授予除草劑抗性、使從植物生產工業上有用的化合物及/或材料成為可能，及/或使藥物生產成為可能。引入轉基因至植物細胞內及隨後重獲含有一穩定併入之轉基因拷貝的可孕性轉基因植物，可以引致擁有所欲性狀或特徵之轉基因植物的生產。
基因表現的控制與調控可以透過眾多機制發生。一基因之轉錄起始為基因表現之主要控制機制。轉錄的起始一般係藉由位於轉錄基因之5’-側面或上游區域的聚核苷酸序列控制。這些序列全體意指為啟動子。啟動子一般含有RNA聚合酶開始轉錄的訊號，使得傳訊RNA(mRNA)可以生產。成熟的mRNA係藉由核糖體轉譯，從而合成蛋白質。DNA結合蛋白質與啟動子DNA序列特異性地交互作用，以促進轉錄複合體的形成並起始該基因表現進程。其係有各式各樣由植物分離並表徵的真核啟動子，該等啟動子對驅動一轉基因在植物中的表現為有功能的。影響基因表現對環境刺激、營養可利用性，或是不利情況，包括熱休克、厭氧、或重金屬存在，之因應的啟動子已經分離並表徵了。亦有在發育期間或在一組織、或器官特異性方式中控制基因表現的啟動子。此外，從細菌及病毒分離的原核啟動子已經經分離並表徵，該等對於驅動轉基因在植物中的表現為有功能的。
一種能夠在一真核生物中表現的典型啟動子係由一最小啟動子與其它順式元素所組成。該最小啟動子實質上為一TATA盒(TATA box)區域，於該處，RNA聚合酶 II(polII)、TATA結合蛋白質(TBP)、及TBP關聯因子(TAFs)可能結合以起始轉錄。然而，在大部分情形下，對於準確的轉錄，除了TATA模體(motif)外的序列元素係要求的。此等序列元素(例如，增強子)已經發現常常在一位置及/或方向無關性的方式中提升鄰近基因之整體表現水平。靠近一些polII基因之轉錄開始位點的其它序列(例如，INR序列)可能對亦促成轉錄活化的因子提供一替代的結合位點，甚至替代地對缺少功能性TATA元素之啟動子中之轉錄提供該核心啟動子結合位點。Zenzie-Gregory等人於”(1992)J.Biol.Chem.267：2823-30”。
其它基因調控元素包括與特異性DNA結合因子交互作用的序列。這些序列模體有時意指為順式元素，且通常為位置及方向取決的，雖然它們可能於一基因編碼序列的5’或3’發現，或在一內含子中。此等組織特異性或發育特異性轉錄因子結合的順式元素，個別地或組合地，可能於轉錄水平決定一啟動子的時空表現模式。上游順式元素，繼之一最小啟動子的配置，典型地建立一特定啟動子的極性。已經選殖且廣泛地用於基礎研究與生物科技應用兩者之植物內啟動子一般為單向的，僅僅主導已經融合於其3’端(亦即，下游)的一個基因。參閱，Xie等人於”(2001)Nat.Biotechnol.19(7)：677-9”；美國專利第6,388,170號。
植物啟動子中已經辨識出許多的順式元素(或“上游調控序列”)。這些順式元素在其等運用於操縱鏈接基 因上的控制類型中廣泛地變化。一些元素作用以因應環境回應(例如，溫度、濕度、及受傷)提高操縱鏈接基因的轉錄。其它順式元素可能回應發育信號(例如，發芽、種子成熟及開花)或空間資訊(例如，組織特異性)。參閱，例如，Langridge等人於”(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-23”。特異性啟動子元素之控制類型典型地係為該啟動子之固有品質；亦即，在此一啟動子控制之下的異源性基因很可能會依據該啟動子元素從其分離出之該原生基因的控制而表現。Id.這些元素典型地亦可能與其它元素交換並在基因表現上維持其特有的固有控制。
對於代謝工程與性狀堆疊(trait stacking)，其係通常必需引入多重基因至植物內，該等基因頻繁地係藉由一致的或同源的啟動子控制。然而，當多重引入的轉基因具有同源啟動子驅動其等時，基於同源性的基因靜默(homology based gene silencing)(HBGS)很可能會出現。Mol等人於”(1989)Plant Mol.Biol.13：287-94”。因此，HBGS已經被報導大規模地發生於轉基因植物內。參閱，例如，Vaucheret及Fagard於”(2001)Trends Genet.17：29-35”。數個機制已被暗示，以解釋HBGS現象，其等全部包括下列特性，啟動子中的序列同源性觸發引致該等重複基因之靜默的細胞識別機制。Matzke及Matzke於”(1995 47：23 48；Fire於”(1999)Trends Genet.15：358-63”；Hamilton及Baulcombe於”(1999)Science 286：950-2”；Steimer等人於”(2000)Plant Cell 12：1165-78”。更進一 步，重複使用相同的啟動子，以獲得不同轉基因之類似水平的表現模式可以引致在重複啟動子中轉錄因子(TF)結合位點的過量競爭，且可以造成內源性TFs的耗盡並導致轉錄的向下調控。
鑑於對在一轉基因事件之單一基因座內併入強勁表現多基因性狀係有一越來越大的需求；提供降低關聯於創建此種轉基因事件的技術挑戰之解決方案係重要的。更具體地，在轉基因植物內避免HBGS的策略係為所欲的，該者涉及發展功能上等效但是具有最小序列同源性之合成性啟動子。當此種合成性啟動子係使用以在作物植物內表現轉基因時，其等可能輔助避免或是降低HBGS。Mourrain等人於”(2007)Planta 225(2)：365-79”；Bhullar等人於”(2003)Plant Physiol.132：988-98”。
發明概要
在本主體揭露內容之實施例中，該揭露內容有關一合成性木薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)雙向聚核苷酸啟動子，該者包含源自一擬南芥泛素10啟動子及一木薯葉脈嵌紋病毒啟動子的數個啟動子元素。在一進一步實施例中，本主體揭露內容包含各種啟動子元素。相應地，該等啟動子元素包含一內含子。在一些情形下，該等啟動子元素包含一5'-UTR。此外，該等啟動子元素包含一上游啟動子元素。更進一步，該等啟動子元素包含一最小核心啟動子。在本主體揭露內容之實施例中，該揭露內容有關用於產生 一轉基因植物細胞的方法，其包含下列步驟：a)以包含一操縱鏈接到至少一感興趣聚核苷酸序列之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的基因表現卡匣轉形一植物細胞；b)分離包含該基因表現卡匣的轉形植物細胞；及，c)產生包含該操縱鏈接到至少一感興趣聚核苷酸序列之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的一轉基因植物細胞。在本主體揭露內容之實施例中，該揭露內容有關用於在一植物細胞中表現一感興趣聚核苷酸序列的方法，該方法包含引入操縱鏈接到一合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的感興趣聚核苷酸序列至一植物細胞中。在本主體揭露內容之實施例中，該揭露內容有關包含該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的一轉基因植物細胞。
前述及其它特性從下面數個實施例之詳細說明，其等藉由參照至該等附圖進行，將變得更明顯。
圖1：此圖係為長度517bp的木薯葉脈嵌紋病毒啟動子(“CsVMV”)之示意圖。該最小核心啟動子(“CsVMV核心啟動子”)已辨識為一123bp之區域，並位於該啟動子5'端下游大概320bp處。包括在該CsVMV啟動子之示意圖中的是長度74bp之5'UTR區域(“CsVMV 5' UTR”)。
圖2：此圖係為長度1,332bp的擬南芥泛素10啟動子(“AtUbi10”)之示意圖。該最小核心啟動子(“AtUbi10核心啟動子”)係辨識為140bp之區域，且位於該啟動子5'端下游836bp處。包括在該AtUbi10啟動子示意圖中的是長度 74bp之該5'UTR區域(“AtUbi10 5'UTR”)，及長度304bp之該內含子(“AtUbi10內含子”)。
圖3：此圖提供經粒子轟擊、用於GFP與RFP蛋白質表現之大豆未成熟胚的顯微鏡影像。gfp與rfp轉基因pDAB113198(198 GFP及198 RFP)、pDAB113199(199 GFP及199 RFP)、pDAB113192(192 GFP及192RFP)、及pDAB113194(194 GFP及194 RFP)在大豆植物細胞中的瞬時表現引致綠色螢光蛋白質與紅色螢光蛋白質表現水平其相當於在gfp與rfp轉基因於該等對照構建體pDAB113188(188 GFP及188 RFP)及pDAB113190(190 GFP及190 RFP)中之表現水平者。
圖4：此圖係為從CsVMV與AtUbi10雙向啟動子獲得的RFP/GFP焦點計數，相較於該單向極性啟動子。
圖5：此圖提供經粒子轟擊、用於GFP與RFP表現之玉米胚的顯微鏡影像。gfp與rfp轉基因pDAB113198、pDAB113199、pDAB113192、pDAB113194、pDAB113193、pDAB113196、及pDAB113197在玉米植物細胞中的瞬時表現引致綠色螢光蛋白(圖A)與紅色螢光蛋白(圖B)的表現。
圖6：此圖例示相對表現量，相關於由該雙向啟動子之RFP及GFP蛋白質表現的螢光強度。
較佳實施例之詳細說明 I.數個實施例之綜述
轉基因植物的發展變得越來越複雜，且典型地要求堆疊多重轉基因至一單一基因座之內。參閱Xie等人於”(2001)Nat.Biotechnol.19(7)：677-9”。由於每一轉基因通常要求一獨特的啟動子用於表現，多重啟動子係要求的，以在一基因堆疊內表現不同的轉基因。除了提高基因堆疊的大小外，此頻繁地導致重複使用相同的啟動子以獲得不同轉基因類似的表現模式水平。這方法常常是有問題的，因為由相同啟動子所驅動的多重轉基因表現可能導致基因靜默或HBGS。在重複啟動子中轉錄因子(TF)結合位點的過量競爭可以造成內源性TFs的耗盡，而導致轉錄之向下調控。轉基因靜默對生產以表現該等轉基因之轉基因植物的性能係非所欲的。在一轉基因內的重複序列常常導致基因座內同源重組，該者引致聚核苷酸重新配置及非所欲的表型與農藝性能。
使用於基礎研究或是生物科技應用之植物啟動子一般為單向的，且僅僅調控已經融合於其3’端(下游)的一個基因。為了產生具各種所欲性狀或特徵的轉基因植物，降低部署以驅動編碼所欲性狀及特徵之轉基因表現的啟動子數目將為有用的。尤其是在引入多重轉基因至植物內用於代謝工程及性狀堆疊係為必需的應用中，從而迫使多重啟動子以驅動多重轉基因的表現。藉由發展一種可以驅動夾擊該啟動子之兩個轉基因表現的單一合成性CsVMV雙向啟動子，轉基因作物發展所需要的啟動子總數目可能降低的，從而減少重複使用相同的啟動子、降低 轉基因構建體的大小，及/或降低HBGS的可能性。此一啟動子可以藉由在一新穎的或合成性DNA拉伸(stretch)中引入已知的順式元素而生成，或是替代地藉由“結構域調換(domain swapping)”而生成，結構域調換中一啟動子之結構域係以來自其它異源性啟動子之功能上等效的結構域代替。
於此實施例利用一方法，其中源自擬南芥泛素10基因的單向啟動子(例如，AtUbi10)及木薯葉脈嵌紋病毒啟動子(例如，CsVMV)，來設計一合成性CsVMV雙向啟動子，使得一啟動子可以主導二個基因的表現，一者於該啟動子的每一端上。合成性CsVMV雙向啟動子可能允許該項技藝者在植物細胞與植物中堆疊轉基因，且同時減少相同啟動子的重複使用並降低轉基因構建體的大小。更進一步，藉由一單一合成性CsVMV雙向啟動子調控二個基因的表現亦可能提供在相同條件下共表現該二個基因的能力，如此可能為有用的，舉例而言，當該二個基因每一者於宿主內促成一單一性狀時。在一些事例中，於植物中使用雙向功能之啟動子已經報導了，包括玉米泛素1啟動子(國際專利公開案WO2013101343 A1)、CaMV 35啟動子(Barfield及Pua於”(1991)Plant Cell Rep.10(67)：308-14”；Xie等人(2001)，同上)、及該mas啟動子(Velten等人於”(1984)EMBO J.3(12)：2723-30”；Langridge等人於”(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：3219-23”)。
植物基因中之基因表現的轉錄起始與調變係由 全體配置於該啟動子內的各式各樣DNA序列元素主導。真核啟動子由最小核心啟動子元素(minP)，及進一步上游調控序列(URSs)所組成。該核心啟動子元素係為足以主導轉錄之準確起始的最小的連續DNA序列拉伸。植物中的核心啟動子亦包含與轉錄起始有關聯的正準區域，諸如CAAT與TATA盒。TATA盒元素通常位於轉錄起始位點上游大概20至35個核苷酸處。
minP之活化取決於URS，各種蛋白質結合至URS且隨後與該轉錄起始複合體交互作用。URSs包含DNA序列，此DNA序列決定包含該URS之啟動子的時空表現模式。啟動子的極性常常由minP之方向決定，而URS為雙極性的(亦即，其作用與其方向無關)。
在一些實施例之具體例子中，一最初源自擬南芥的擬南芥Ubi10啟動子(AtUbi10)之最小核心啟動子元素(minUbi10P)，係使用以工程化一合成性CsVMV雙向啟動子，該者在植物中作用，以提供相對於先前描述之雙向啟動子獨特的表現控制特徵。實施例包括一合成性CsVMV雙向啟動子其進一步包括衍自一原生CsVMV啟動子的一最小核心啟動子元素(minCsVMVP)核苷酸序列者。在其它實施例中，最初衍自該木薯葉脈嵌紋病毒的一經修飾木薯葉脈嵌紋病毒啟動子(CsVMV)之一最小核心啟動子元素，係使用以工程化一合成性雙向擬南芥Ubi10啟動子，該者可能在植物中作用，以提供相對於先前可獲得之雙向啟動子獨特的表現控制特徵。實施例包括一合成性雙向 AtUbi10啟動子其進一步包括衍自一原生AtUbi10啟動子的一最小核心啟動子元素核苷酸序列者。
該AtUbi10啟動子包含起源於該擬南芥基因組的序列。在一些例子中使用的經修飾AtUbi10啟動子係為大概1.3kb之一啟動子，其含有一TATA盒；一5'UTR；及一內含子。衍自擬南芥屬物種與擬南芥基因型之其它擬南芥泛素啟動子變體在由TATA元素組成之該minP元素附近可能展現高序列保守性。因此，本發明之實施例係藉由使用AtUbi10啟動子此短的、高度保守區域(例如序列辨識編號：1)做為一最小核心啟動子元素，用於構建合成性雙向植物啟動子而示範。
該CsVMV啟動子包含起源於該木薯葉脈嵌紋病毒基因組的序列。在一些例子中使用的經修飾CsVMV啟動子係為大概0.5kb之一啟動子，其含有一TATA盒；及一5'UTR。衍自木薯病毒物種與木薯葉脈嵌紋病毒變體之其它木薯葉脈嵌紋病毒啟動子變體在由TATA元素組成之該minP元素附近可能展現高序列保守性。因此，本發明之實施例係藉由使用CsVMV啟動子此短的、高度保守區域(例如序列辨識編號：5)做為一最小核心啟動子元素，用於構建合成性CsVMV雙向植物啟動子而示範。
II.縮寫
AtUbi10 擬南芥泛素10
BCA 二喹啉甲酸
CaMV 花椰菜嵌紋病毒
CsVMV 木薯葉脈嵌紋病毒
CTP 葉綠體轉運胜肽
HBGS 基於同源性的基因靜默
minUbi1P 最小核心啟動子
OLA 寡連接擴增法(oligo ligation amplification)
PCR 聚合酶鏈反應
RCA 滾動循環擴增法(rolling circle amplification)
RT PCR 反轉錄酶PCR
SNuPE 單核苷酸引子延伸法
URS 上游調控序列
III.術語
貫穿本申請案，許多術語係使用。為了提供本說明書及請求項一清楚且一致的理解，包括給予此類術語之範圍，下列定義係提供的。
內含子：如於此所使用，該術語”內含子”意指包含在一基因(或有興趣的表現核苷酸序列)中、經轉錄但未轉譯的任何核酸序列。內含子包括在一表現的DNA序列內之未轉譯核酸序列，以及從其轉錄的RNA分子內之對應序列。
分離的：一“分離的”的生物組分(諸如核酸或蛋白質)本質上已與該組分天然發生的該生物細胞中之其它生物組分(意即，其它染色體及染色體外的DNA及RNA，及蛋白質)分隔、分開製造或純化開來，而同時達到該組分中化學或功能性改變(例如一核酸可能藉由打斷連結核 酸至該染色體中剩餘DNA的化學鍵而從染色體分離開來)。已經“分離的”核酸分子與蛋白質包括藉由標準純化方法純化的核酸分子及蛋白質。該術語亦含括藉由在一宿主細胞中重組表現而製備的核酸及蛋白質，以及化學合成的核酸分子、蛋白質及胜肽。
基因表現：一核酸轉錄單元(包括，例如基因組DNA)的編碼資訊轉換成細胞之一操作的、非操作的或結構部件的一過程，常常包括蛋白質合成。基因表現可以藉由外部訊號左右；舉例而言，曝露一細胞、組織或生物至提高或減低基因表現的一藥劑。基因表現亦可以在從DNA至RNA至蛋白質該途徑中之任意處調控的。基因表現調控發生，舉例而言，透過在轉錄、轉譯、RNA運輸及加工、中間分子諸如mRNA降解上作用的控制，或透過特定蛋白質分子在它們被製造之後的活化、去活化、分室作用(compartmentalization)或降解，或藉由其之組合。基因表現可以藉由該技藝中已知的方法於RNA水平或蛋白水平上測量，包括但不限於，北方墨點法、RT-PCR、西方墨點法，或體外、原位或體內蛋白質活性檢測(等)。
基於同源性的基因靜默：如於此所使用，“基於同源性的基因靜默”(HBGS)係為包括轉錄基因靜默與轉錄後基因靜默兩者的通稱。標靶基因座藉由一未鏈接的靜默基因座之靜默可以起因於轉錄抑制(轉錄基因靜默；TGS)或mRNA降解(轉錄後基因靜默；PTGS)，歸因於對應於啟動子或經轉錄序列之雙股RNA(dsRNA)的產生。在每一過 程中相異細胞組分的涉及暗示著dsRNA誘導的TGS與PTGS很可能起因於古老的共同機制之多樣化。然而，TGS與PTGS之一嚴格比較已經難以實現的，因為其一般依賴相異的靜默基因座之分析。我們描述一單一轉基因基因座觸發TGS與PTGS兩者，歸因於對應於不同標靶基因之啟動子及轉錄序列之dsRNA的生產。Mourrain等人於”(2007)Planta 225：365-79”。SiRNAs為同源序列上觸發TGS與PTGS的實際分子係很有可能的：於此模式中，該siRNAs將透過散布甲基化之轉基因序列至該內源性啟動子內而觸發順式及反式同源序列之靜默及甲基化。Id.核酸分子：如於此所使用，該術語“核酸分子”(或“核酸”或“聚核苷酸”)可能意指核苷酸的聚合物形式，該者可能包括RNA之正義與反義股兩者、cDNA、基因組DNA、及上述的合成形式與混合聚合物。一核苷酸可能意指一核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、或任一類型核苷酸的修飾形式。如於此所使用，一“核酸分子”係同義於“核酸”及“聚核苷酸”。一核酸分子通常長度至少10個鹼基，除非另有指明。該術語可能意指不定長度的RNA或DNA分子。該術語包括單股及雙股形式之DNA。一核酸分子可能包括由天然發生及/或非天然發生核苷酸鏈結鏈接在一起的天然發生及修飾核苷酸兩者或兩者任一的。
核酸分子可能化學或生物化學修飾的，或可能含有非天然或衍生的核苷酸鹼基，如熟習該項技藝者將容易體會的。此種修飾包括，舉例而言，標示、甲基化、以 一類似物取代一或多個天然發生的核苷酸、核苷酸間修飾(例如不帶電荷的鏈結：舉例而言，甲基膦酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯(phosphoramidates)、胺基甲酸酯......等等；帶電鏈結：舉例而言，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯......等等；懸垂(pendent)部分：舉例而言，胜肽；插入劑：舉例而言，吖啶、補骨脂素......等等；螯合劑；烷化劑；及修飾鏈結：舉例而言，α-變旋異構體核酸......等等)。該術語“核酸分子”亦包括任何拓撲構形，包括單股、雙股、部分雙聯體、三聯體、髮夾形、圓形及掛鎖構形。
轉錄以5’至3’的方式沿著DNA股進行。此意謂RNA係藉由相繼的添加核醣核苷酸-5’-三磷酸至生長鏈的3’末端(伴隨必要的焦磷酸鹽消去)來實行。於線狀或環狀核酸分子任一中，離散元素(例如，特定的核苷酸序列)相對於一進一步元素可能意指為“上游的”或”5’”，假若它們係結合至或將結合至從該元素在5'方向中之相同核酸。類似地，離散元素相對於一進一步元素可能為“下游的”或”3’”，假若它們係結合至或將結合至從該元素在3'方向中之相同核酸。
如於此所使用，一“鹼基位置”意指一給定鹼基或核苷酸殘基在一指定核酸內的位置。該指定核酸可能藉由與一參考核酸對準(參閱下文)而界定。
雜交：寡核苷酸與其類似物藉由介於互補鹼基之間的氫鍵結而雜交，氫鍵結包括華生-克立克(Watson-Crick)、胡思町(Hoogsteen)或反向胡思町氫鍵 結。一般地，核酸分子由嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、及胸嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)與鳥糞嘌呤(G))兩者任一的含氮鹼基所組成。這些含氮鹼基形成嘧啶與嘌呤之間的氫鍵，而嘧啶與嘌呤的鍵結係意指為“鹼基配對”。更具體地，A將氫鍵結至T或U，而G將鍵結至C。“互補的”意指在二個相異核酸序列之間或相同核酸序列之二個相異區域之間發生的鹼基配對。
“可特異性雜交的”與“特異性互補的”係為術語其指出足夠程度的互補性，使得寡核苷酸與該DNA或RNA標靶之間發生穩定且特異性的結合。該寡核苷酸不須要100%互補於其之標靶序列以特異性雜交的。一寡核苷酸係可特異性雜交，當該寡核苷酸至標靶DNA或RNA分子之結合干擾該標靶DNA或RNA正常的功能，且其係有足夠程度的互補性以在特異性結合係為所欲的條件下避免寡核苷酸對非標靶序列的非特異性結合，舉例而言，就體內的檢測或系統來說為生理條件下。此種結合係意指為特異性雜交。
引致特定程度嚴苛性的雜交條件將變化，取決於該所抉擇的雜交方法的本性及該雜交核酸序列的組成物與長度。一般地，雜交溫度及雜交緩衝液的離子強度(尤其是Na+及/或Mg2+濃度)將促成雜交的嚴苛性，雖然洗滌次數亦左右嚴苛性。考慮用於得到特定程度嚴苛性所要求之雜交條件的計算係討論於，舉例而言，Sambrook等人(編輯)之”Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版.， 卷1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989，第9及第11章”。
如於此所使用，“嚴苛條件”含括條件，在該條件下雜交將僅發生於如果該雜交分子與該DNA標靶之間有小於50%的失配時。“嚴苛條件”包括進一步特定程度的嚴苛性。因此，如於此所使用，“中度嚴苛性”條件係為那些在其下具超過50%序列失配的分子將不會雜交的；“高嚴苛性”條件係為那些在其下具超過20%失配的序列將不會雜交；而“非常高嚴苛性”條件係為那些在其下具超過10%失配的序列將不會雜交。
在特定實施例中，嚴苛條件可以包括於65℃下雜交，繼之於65℃下以0.1X SSC/0.1%SDS清洗計40分鐘。
下列為代表性、非限制性的雜交條件：
非常高嚴苛性：於5x SSC緩衝液中在65℃下雜交計16小時；在2x SSC緩衝液中於室溫清洗2次，每次計15分鐘；且在0.5x SSC緩衝液中於65℃清洗2次，每次計20分鐘。.
高嚴苛性：於5x-6x SSC緩衝液中在65-70℃下雜交計16-20小時；在2x SSC緩衝液中於室溫清洗2次，每次計5-20分鐘；且在1x SSC緩衝液中於55-70℃清洗2次，每次計30分鐘。
中度嚴苛性：於6x SSC緩衝液中在室溫至55℃下雜交計16-20小時；在2x-3x SSC緩衝液中於室溫至55℃ 清洗至少2次，每次計20-30分鐘。
在特定實施例中，可特異性雜交的核酸分子可以於非常高嚴苛性雜交條件下依然結合的。在這些及進一步實施例中，可特異性雜交的核酸分子可以於高嚴苛性雜交條件下依然為結合的。在這些及進一步實施例中，可特異性雜交的核酸分子可以於中度嚴苛性雜交條件下依然為結合的。
寡核苷酸：“寡核苷酸”係為一種短的核酸聚合物。寡核苷酸可能藉由較長的核酸區段之裂斷而形成，或藉由聚合個別的核苷酸前驅物而形成。自動合成儀允許高達數百個鹼基對長度的寡核苷酸之合成。因為寡核苷酸可能結合至一互補的核苷酸序列，其等可能使用做為偵測DNA或是RNA的探針。由DNA構成的寡核苷酸(寡去氧核醣核苷酸)可能於PCR中使用，PCR為用於擴增小的DNA序列之技術。在PCR中，該寡核苷酸典型地意指為一“引子”，其允許DNA聚合酶延伸該寡核苷酸並複製該互補股。
序列一致性：如於此所使用，該術語“序列一致性”或“一致性”在兩個核酸或多胜肽序列之場合中，可能意指當橫跨一具體比較窗口針對最大對應對準時，在該兩個序列中係為相同的殘基。
如於此所使用，該術語“序列一致性百分比”可能意指藉由跨越一比較窗口比較兩個最佳對準序列(例如核酸序列及胺基酸序列)而決定的值，其中在該比較窗口 中的該部分序列針對該兩序列的最佳對準可能包含添加或缺失(意即，間隙)，當相較於該參考序列時(該者不包含添加或缺失)。該百分比之計算係藉由確定在該兩者序列中一致的核苷酸或胺基酸殘基發生的位置數目，以產生匹配位置的數目，將該匹配位置的數目除以該比較窗口中的位置總數，並將該結果乘以100，以產生序列一致性的百分比。
用於對準序列以比較的方法在該技藝中係眾所周知的。各種程式及比對演算法係描述的，舉例而言，於：Smith及Waterman之”(1981)Adv.Appl.Math.2：482”；Needleman及Wunsch之”(1970)J.Mol.Biol.48：443”；Pearson及Lipman之”(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444”；Higgins及Sharp之”(1988)Gene 73：237-44”；Higgins及Sharp之”(1989)CABIOS 5：151-3”；Corpet等人之”(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90”；Huang等人之”(1992)Comp.Appl.Biosci.8：155-65”；Pearson等人之”(1994)Methods Mol.Biol.24：307-31”；Tatiana等人之”(1999)FEMS Microbiol.Lett.174：247-50”。序列比對方法及同源性計算之一詳細的考量可以於，舉例而言，Altschul等人之”(1990)J.Mol.Biol.215：403-10”中找到的。
美國國家生物技術資訊中心(NCBI)基本局部比對搜尋工具(BLASTTM；Altschul等人(1990))可從數個來源獲得，包括國家生物技術資訊中心(Bethesda,MD)，及在 網際網路上，用於與數個序列分析程式聯合使用。使用此程式如何決定序列一致性之一說明係可從網際網路上在BLAST® "help"一節上獲得。對於核酸序列之比較，BLAST®(Blastn)程式的"Blast 2 sequences"功能可能使用預設的參數採用的。當藉由此方法評估時，對參考序列具更大相似度的核酸序列將顯示提高的一致性百分比。
操縱鏈接：一第一核苷酸序列係與一第二核酸序列操縱地鏈接，當該第一核酸序列與該第二核酸序列係在一功能關係中時。譬如，一啟動子係操縱地鏈接至一編碼序列，當該啟動子影響該編碼序列的轉錄或表現時。當重組製造時，操縱鏈接的核酸序列一般係連續的，且在必要時鄰接兩個蛋白質編碼區域，在相同的讀取框架中。然而，元素不需要被連續地操縱鏈接。
啟動子：一DNA區域，其一般位於(基因)上游(朝向基因之5’區域)，為轉錄作用所需要的。啟動子可能准許其控制之基因適當的活化或壓制。一啟動子可能含有由轉錄因子所識別的特異性序列。這些因子可能結合至該啟動子DNA序列，並引致RNA聚合酶之招回，該者係為從基因編碼區域合成RNA之酵素。
轉形：藉由轉導至一細胞內的一核酸分子，當該核酸分子變成穩定的由該細胞複製時，無論是藉由將該核酸分子合併入該細胞基因組中，或藉由游離基因體複製，一細胞係“轉形”的。如於此所使用，該術語“轉形”含括所有的技術，藉由該等技術，一核酸分子可以引入至此 一細胞中。例子包括但不限於：以病毒載體轉染；以質體載體轉形；電穿孔(Fromm等人於”(1986)Nature 319：791-3”)；脂質體轉染法(Felgner等人於”(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：7413-7”)；顯微注射(Mueller等人於”(1978)Cell 15：579-85”)；農桿菌介導轉移(Fraley等人於”(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7)”；直接DNA攝取；晶鬚(whiskers)介導之轉形；及微粒轟擊(microprojectile bombardment)(Klein等人於”(1987)Nature 327：70)”。
轉基因：一外源性核酸序列。在一例子中，一轉基因係為一基因序列(例如，一除草劑抗性基因)、編碼工業上或是藥學上有用化合物之基因，或編碼所欲農業性狀之基因。在又另一例子中，該轉基因係為一反義核酸序列，其中該反義核酸序列的表現抑制一標靶核酸序列的表現。一轉基因可能含有操縱鏈接至該轉基因的調控序列(例如，一啟動子)。於一些實施例中，一感興趣聚核酸序列係為一轉基因。然而，於其它實施例中，一感興趣的聚核酸序列係為一內源性核酸序列，其中該內源性核酸序列之額外的基因組拷貝為所欲的，或是一個核酸序列，其相對於該宿主生物體中一標靶核酸分子之序列係於反義方向中。
轉基因事件：一轉基因“事件”係產生的，藉由以一異源性DNA，例如，包括一感興趣轉基因之一核酸構建體，轉形植物細胞；再生得自於插入該轉基因至該植物 細胞基因組的植物族群；並選擇藉由插入至一特定基因組位置而表徵化的一特定植物。該術語“事件”意指包括該異源性DNA的原始轉形體及該轉形體子代。該術語“事件”亦意指由該轉形體與包括該基因組/轉基因DNA之另一品種間藉由一有性遠系雜交所產生的子代。即使在重複回交至一輪迴親代(recurrent parent)，源自該轉形親代的插入DNA及夾擊基因組DNA(基因組/轉基因DNA)係於相同的染色體位置存在於該雜交子代中。術語“事件”亦意指源自該原始轉形體及其包含該插入DNA及緊鄰該插入DNA之夾擊基因組序列之子代的DNA，該DNA係預期被轉移至一子代，該子代做為包括該插入DNA之一親代品系(例如，原始轉形體與得自自交的子代)與不含有該插入DNA之一親代品系之有性雜交的結果，接收包括該感興趣轉基因之插入DNA。
載體：引入至一細胞之內的核酸分子，從而產生一轉形的細胞。一載體可能包括准許其於宿主細胞內複製的核酸序列，諸如複製起點。例子包括，但不限於，攜帶外源性DNA至一細胞內的質體、黏接質體(cosmid)、噬菌體、或病毒。一載體亦可以包括一或多個基因、反義分子、及/或可選標記基因及本技藝已知的其它遺傳元素。一載體可以轉導、轉形，或感染一細胞，從而造成細胞表現該載體編碼的核酸分子及/或蛋白質。一載體可能任選地包括協助實現該核酸分子進入細胞的材料(例如，脂質體、蛋白質編碼……等等)。
除非另有具體解釋，於此所使用的所有技術與科學術語具有相同的含義，如此揭露內容所屬之該技藝的一般技藝人士所普遍理解者。分子生物學常用術語的定義可以找到，舉例而言，於”Lewin B.,Genes V,Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9)”；Kendrew等人(編輯)之”The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994(ISBN 0-632-02182-9)”；及Meyers R.A.(編輯)之”Molecular Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference,VCH Publishers,Inc.,1995(ISBN 1-56081-569-8)”。
如於此所使用，冠詞，“一(a)”、“一個(an)”、及“該(the)”包括複數參考物，除非上下文另有清楚且不含糊地指出。
IV.合成性雙向啟動子，CsVMV或AtUBI10，及包含該者之核酸
此揭露內容提供核酸分子，其包含可能作用為一雙向啟動子的一合成性核苷酸序列。在一些實施例中，一合成性CsVMV雙向啟動子可能操縱地鏈接至一或二個感興趣的聚核苷酸序列(等)。舉例而言，該合成性CsVMV雙向啟動子可能操縱鏈接至一或二個編碼一基因(例如，兩個基因，一者在該啟動子的每一端)的感興趣聚核苷酸序列(等)，以便調控該(等)感興趣核苷酸序列中至少一者(例如，一或兩者)的轉錄。在一些實施例中，藉由在該合成性CsVMV雙向啟動子中合併入源自CsVMV啟動子之一 URS，特定的表現及調控模式(例如，諸如在CsVMV啟動子控制下之基因所展示者)可能實現，就操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向啟動子之感興趣的聚核苷酸序列而言。在其它實施例中，藉由在該合成性CsVMV雙向啟動子併入源自AtUbi10啟動子之一URS，特定的表現及調控模式(例如，諸如在AtUbi10啟動子控制下之基因所展示者)可能實現，就操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向啟動子之感興趣的聚核苷酸序列而言。
本發明之一些實施例係於此示範，藉由合併來自單向擬南芥泛素10基因(AtUbi10)啟動子之最小核心啟動子元素至不同於該原生啟動子的分子環境(molecular context)內以工程化一合成性CsVMV雙向啟動子。此最小核心啟動子元素於此係意指為“minUbi10P”，且長度大概為140bp。minUbi10P元素之定序及分析可能保存做為轉錄起始子的功能，假若其與序列辨識編號：1之minUbi10P元素共享，舉例而言，至少約75%；至少約80%；至少約85%；至少約90%；至少約91%；至少約92%；至少約93%；至少約94%；至少約95%；至少約96%；至少約97%；至少約98%；至少約99%；及/或至少約100%的序列一致性。於本發明之一些實施例中可能有用的minUbi10P元素之特徵可能包括，舉例而言且不限於，前述的核苷酸序列高保守性；存在至少一TATA盒。特別的，minUbi10P元素可能在minUbi10P序列內重疊。
在一實施例中，合併一minUbi10P元素至不同於 一原生啟動子之分子環境內以工程化一合成性CsVMV雙向啟動子的方法可能包含合併該minUbi10P元素至一CsVMV啟動子核酸或一AtUbi10啟動子核酸，同時相對於該CsVMV或AtUbi10啟動子之原生序列，反轉該minUbi10P元素的方向。因此，一合成性CsVMV或AtUbi10雙向啟動子可能包含一minUbi10P最小核心啟動子元素，其位於CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列之5’處，且相對於CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列係於反向的，使得其可能操縱地鏈接位於該CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列之5’處的一感興趣聚核苷酸序列。舉例而言，該minUbi10P元素可能以反向合併至一CsVMV或AtUbi10啟動子之5’端。
本發明之一些實施例係於此示範，藉由合併來自單向木薯葉脈嵌紋病毒基因(CsVMV)啟動子之最小核心啟動子元素至不同於該原生啟動子的分子環境內以工程化一合成性CsVMV雙向啟動子。此最小核心啟動子元素於此係意指為“minCsVMVP”，且長度大概為123bp。minCsVMVP元素之定序及分析可能保存做為轉錄起始子的功能，假若其與序列辨識編號：5之minCsVMVP元素共享，舉例而言，至少約75%；至少約80%；至少約85%；至少約90%；至少約91%；至少約92%；至少約93%；至少約94%；至少約95%；至少約96%；至少約97%；至少約98%；至少約99%；及/或至少約100%的序列一致性。於本發明之一些實施例中可能有用的minCsVMVP元素之特徵 可能包括，舉例而言且不限於，前述的核苷酸序列高保守性；存在至少一TATA盒。特別的，minCsVMVP元素可能在minCsVMVP序列內重疊。
在一實施例中，合併minCsVMVP元素至不同於一原生啟動子之分子環境內以工程化一合成性CsVMV雙向啟動子的方法可能包含合併該minCsVMVP元素至一CsVMV啟動子核酸或一AtUbi10啟動子核酸，同時相對於該CsVMV或AtUbi10啟動子之剩餘序列，反轉該minCsVMVP元素的方向。因此，一合成性CsVMV或AtUbi10雙向啟動子可能包含一minCsVMVP最小核心啟動子元素，其位於CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列之5，處，且相對於CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列係於反向的，使得其可能操縱地鏈接位於該CsVMV或AtUbi10啟動子核苷酸序列之5’處的一感興趣聚核苷酸序列。舉例而言，該minCsVMVP元素可能以反向合併至一CsVMV或AtUbi10啟動子之5’端。
一合成性CsVMV雙向啟動子除了一minUbi10P元素及包括該minCsVMVP的一原生CsVMV啟動子之元素外，亦可能包含一或多個額外的序列元素。在一些實施例中，一合成性CsVMV雙向啟動子可能包含一啟動子URS；一外顯子(例如，一前導子或一訊號胜肽)；一內含子；一間隔子序列；及或前述任一者之一或多個的組合。舉例而言且不限於，一合成性CsVMV雙向啟動子可能包含一來自CsVMV啟動子的URS序列；一來自ADH基因的內含 子；一編碼來自AtUbi10基因之一前導子胜肽的外顯子；一來自AtUbi10基因的內含子；及這些之組合。
一合成性雙向AtUbi10啟動子除了一minCsVMVP元素及包括該minUbi10P的一原生AtUbi10啟動子之元素外，亦可能包含一或多個額外的序列元素。在一些實施例中，一合成性雙向AtUbi10啟動子可能包含一啟動子URS；一外顯子(例如，一前導子或一訊號胜肽)；一內含子；一間隔子序列；及或前述任一者之一或多個的組合。舉例而言且不限於，一合成性雙向AtUbi10啟動子可能包含一來自AtUbi10啟動子的URS序列；一來自ADH基因的內含子；一編碼來自AtUbi10基因之一前導子胜肽的外顯子；一來自AtUbi10基因的內含子；及這些之組合。
在啟動子包含一啟動子URS之一些實施例中，該URS可能經選擇以賦予特定的調控性質在該合成性啟動子上。已知的啟動子在其等運用於操縱鏈接基因上的控制類型係廣泛地變化(例如，環境回應、發育信號、及空間資訊)，且合併至一異源性啟動子內的URS典型地維持URS就其原生啟動子及操縱鏈接基因所展現的控制類型。Langridge等人(1989)，同上。已經表徵化且可能含有包含在依據一些實施例之合成性雙向玉米泛素1啟動子內之URS的真核啟動子之例子包括，舉例而言且不限於：於美國專利第6,437,217號(玉米RS81啟動子)；第5,641,876號(水稻肌動蛋白啟動子)；第6,426,446號(玉米RS324啟動 子)；第6,429,362號(玉米PR-1啟動子)；第6,232,526號(玉米A3啟動子)；第6,177,611號(持續型玉米啟動子)；第6,433,252號(玉米L3油體膜蛋白(oleosin)啟動子)；第6,429,357號(水稻肌動蛋白2啟動子，及水稻肌動蛋白2內含子)；第5,837,848號(根專一性啟動子)；第6,294,714號(光可誘導啟動子)；第6,140,078號(鹽可誘導啟動子)；第6,252,138號(病原體可誘導啟動子)；第6,175,060號(缺磷可誘導啟動子)；第6,388,170號(雙向啟動子)；第6,635,806號γ-薏苡醇溶蛋白(coixin)啟動子；及美國專利申請案序號09/757,089(玉米葉綠體醛醇酶啟動子)內所描述的那些啟動子。
額外的示範性原核啟動子包括胭脂鹼合成酶(NOS)啟動子(Ebert等人於”(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(16)：5745-9”)；章魚鹼合成酶(OCs)啟動子(該者係於攜帶於農桿腫瘤菌(Agrobacterium tumefaciens)之腫瘤誘導質體上)；花椰菜嵌紋病毒屬啟動子諸如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)19S啟動子(Lawton等人於”(1987)Plant Mol.Biol.9：315-24”)；CaMV 35S啟動子(Odell等人於”(1985)Nature 313：810-2”；玄參花嵌紋病毒35S-啟動子(Walker等人於”(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(19)：6624-8”)；蔗糖合成酶啟動子(Yang及Russell之”(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：4144-8)”；R基因複合體啟動子(Chandler等人於”(1989)Plant Cell 1：1175-83”；葉綠素a/b結合蛋白質基因啟動子；CaMV35S啟動子(美國專利 第5,322,938號、第5,352,605號、第5,359,142號及第5,530,196號)；FMV35S(美國專利第6,051,753號及第5,378,619號)；PC1SV啟動子(美國專利第5,850,019號)；SCP1啟動子(美國專利第6,677,503號)；及農桿腫瘤菌Nos啟動子(基因資料庫登錄碼V00087；Depicker等人於”(1982)J.Mol.Appl.Genet.1：561-73”；Bevan等人於”(1983)Nature 304：184-7”)、及之類。
於一些實施例中，一合成性CsVMV雙向啟動子可能進一步包含一外顯子。舉例而言，其可能所欲的是，靶定或運輸由操縱鏈接至該啟動子的一感興趣聚核苷酸序列所編碼的一多胜肽至特定的次細胞位置及/或隔室。於這些及其它實施例中，一編碼序列(外顯子)可能合併至一核酸分子內、介於該剩餘合成性CsVMV雙向啟動子序列及編碼一多胜肽的核苷酸序列之間。這些元素可能依據熟練的從事者之判斷力來配置，使得該合成性CsVMV雙向啟動子促進一多胜肽(或操縱鏈接至該啟動子之二個多胜肽編碼序列之一者或兩者)的表現，該多胜肽包含由該合併入之編碼序列所編碼的胜肽，與該多胜肽的剩餘部分在一功能性關係中。在特定例子中，編碼一前導子、轉運子(transit)、或訊號胜肽(例如，一擬南芥Ubi10前導子胜肽)的一個外顯子可能合併的。
可能由合併至一合成性CsVMV雙向啟動子內之一外顯子所編碼的胜肽包括，舉例而言且不限於：泛素(例如，擬南芥Ubi10)前導子胜肽；葉綠體轉運胜肽 (CTP)(例如，擬南芥EPSPS CTP(Klee等人於”(1987)Mol.Gen.Genet.210：437-42”)；及矮牽牛(Petunia hybrida)EPSPS CTP(della-Cioppa等人於”(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：6873-7)”)，如同於國際PCT公開案號WO 2008/105890中示範之葉綠體靶定麥草畏單氧化酶(DMO)。
在本發明之一些實施例中，內含子亦可能合併至一合成性CsVMV雙向啟動子內，舉例而言，介於該剩餘合成性CsVMV雙向啟動子序列及操縱鏈接至該啟動子之感興趣聚核苷酸序列之間。於一些例子中，合併至一合成性CsVMV雙向啟動子內的內含子可能為，不限於，一作用為轉譯前導子序列的5’UTR，其存在於完全加工之mRNA的轉譯開始序列上游(此一轉譯前導子序列可能影響一初級轉錄體加工成mRNA、mRNA穩定性、及/或轉譯效率)。轉譯前導子序列之例子包括玉米與牽牛花熱休克蛋白前導子(美國專利第5,362,865號)、植物病毒外殼蛋白前導子、植物1,5-二磷酸核酮糖羧化酶(rubisco)前導子、及其它。參閱，例如，Turner及Foster於”(1995)Molecular Biotech.3(3)：225-36”。5’UTRs之非限制性例子包括GmHsp(美國專利第5,659,122號)；PhDnaK(美國專利第5,362,865號)；AtAntl；TEV(Carrington及Freed”(1990)J.Virol.64：1590-7)”；及AGRtunos(基因資料庫登錄碼V00087；及Bevan等人於”(1983)Nature 304：184-7)”。在特定例子中，擬南芥泛素10內含子可能合併至一合成性CsVMV雙向啟動子中。
可能任擇地合併至一合成性CsVMV雙向啟動子內的額外序列包括，舉例而言且不限於：3’非轉譯序列；3’轉錄終止區；及聚腺苷酸化區域。這些係為位於一感興趣聚核苷酸序列(例如，操縱鏈接至一合成性CsVMV雙向啟動子的感興趣基因序列)下游的遺傳元素，且包括聚核苷酸其提供聚腺苷酸化訊號，及/或其它能夠影響轉錄、mRNA加工、或基因表現的調控訊號。一聚腺苷酸化訊號於植物內可能作用而造成mRNA前驅物3’端的聚腺苷酸核苷酸添加。該聚腺苷酸化序列可能衍自於天然基因、衍自各式各樣植物基因、或是衍自T-DNA基因。3’轉錄終止區之一非限制性例子為胭脂鹼合成酶3’區域(nos 3’；Fraley等人於”(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：4803-7”)。不同的3’非轉譯區域之使用的例子係於Ingelbrecht等人之”(1989)，Plant Cell 1：671-80”提供。聚腺苷酸化訊號之非限制性例子包括來自豌豆(Pisum sativum)RbcS2基因之一者(Ps.RbcS2-E9；Coruzzi等人於”(1984)EMBO J.3：1671-9”)及農桿腫瘤菌Nos基因(基因資料庫登錄碼E01312)。
在一些實施例中，一合成性CsVMV雙向啟動子包含一或多個核苷酸序列(等)，其促進包含該啟動子的一核酸靶定至一標靶生物體基因組中之特定基因座。舉例而言，同源於宿主中基因組DNA序列之區段的一或多個序列可能包括的(例如，稀有或獨特的基因組DNA序列)。在一些例子中，這些同源序列可能引導包含一合成性CsVMV 雙向啟動子之核酸在宿主基因組內之同源DNA位點的重組及併入。在特定例子中，一合成性CsVMV雙向啟動子包含一或多個核苷酸序列，該(等)核苷酸序列利用識別在稀有或獨特位置處之序列的工程化核酸酶酵素促進包含該啟動子的核酸靶定至宿主基因組中之稀有或獨特的位置，並促進於該稀有或獨特位置處之併入。採用鋅指核酸內切酶做為核酸酶酵素之此一靶定併入系統係於美國專利申請案第13/011,735號中描述，該者之整體內容係合併於此以做為參考。
在其它實施例中，該揭露內容進一步包括該感興趣聚核苷酸序列包含一性狀之一實施例。該性狀可以為殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮使用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、可選擇標記性狀、及其之任何組合。
在進一步實施例中，該等性狀係以轉基因事件併入至該轉基因植物細胞內。在額外實施例中，該轉基因事件產生一種商品產品。相應地，一種組成物係衍自本主體揭露內容之轉基因植物細胞，其中該組成物係為選自由膳食、麵粉、蛋白質濃縮物、或油所組成之該群組的一商品產品。在進一步實施例中，由衍自轉形植物細胞之轉基因植物所生產的商品產品係包括的，其中該等商品產品包含本發明一可偵測數量之核酸序列。在一些實施例中，此種商品產品可能生產，舉例而言，藉由獲得轉基因植物並從其製備食物或飼料。包含本發明一或多個核酸序列的商 品產品包括，舉例而言但不限於：一植物之膳食、油、粉碎或全穀物或種子，及任何食品產品其包含重組植物或種子之任何膳食、油、粉碎或全穀物者，其中該重組植物或種子包含本發明一或多個核酸序列。在一或多個商品或商品產品中偵測本發明之一或多個序列係為該商品或商品產品係產自於設計以表現一或多個農藝學性狀之一轉基因植物的一事實上證據。
包含一合成性CsVMV雙向啟動子的核酸可能使用本技藝中已知的任何技術生產，包括舉例而言且不限於：RCA；PCR擴增；RT-PCR擴增；OLA；及SNuPE。這些及其它等效技術為熟習該項技藝者所廣為知悉的，且係進一步詳細地描述於，舉例而言且不限於：Sambrook等人之”Molecular Cloning：A Laboratory Manual,3rd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,2001”；及Ausubel等人之”Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,1998”。上文列舉的所有參考文獻，包括前述的兩者手冊，係以其整體合併於此以做為參考，包括其內所提供的任何圖式、圖、及/或表格。
V.遞送包含合成性雙向啟動子CsVMV之核酸分子至一細胞
本揭露內容亦提供用包含一合成性CsVMV雙向啟動子之一核酸分子轉形細胞的方法。本技藝中已知用於引入核酸分子至植物內之大量技術之任一者可能使用以用包含依據一些實施例的一合成性CsVMV雙向啟動子之核酸分子來轉形植物，舉例而言，以引入一或多個合成性 CsVMV雙向啟動子至該宿主植物基因組內，及/或進一步引入一或多個操縱鏈接至該啟動子的感興趣核苷酸。
適合用於植物轉形的方法包括可以引入DNA至一細胞內的任何方法，舉例而言且不限於：電穿孔法(參閱，例如，美國專利第5,384,253號)；微粒轟擊法(參閱，例如，美國專利第5,015,580號、第5,550,318號、第5,538,880號、第6,160,208號、第6,399,861號及第6,403,865號)；農桿菌介導的轉形(參閱，例如，美國專利第5,635,055號、第5,824,877號、第5,591,616號；第5,981,840號、及第6,384,301號)；及原生質體轉形(參閱，例如，美國專利第5,508,184號)。透過應用諸如前述的技術，幾乎任何植物物種的細胞可能穩定地轉形，且這些細胞可能藉由熟習該項技藝者已知的技術發展成轉基因植物。舉例而言，於棉花轉形場合中可能特別有用的技術係描述於美國專利第5,846,797號、第5,159,135號、第5,004,863號、及第6,624,344號中；用於轉形蕓薹屬植物的技術特別地於，舉例而言，美國專利第5,750,871號中描述；用於轉形大豆的技術係於，舉例而言，美國專利第6,384,301號中描述；而用於轉形玉米的技術係於，舉例而言，美國專利第7,060,876號與第5,591,616號、及國際PCT公開案WO 95/06722中描述。
在達到遞送一外源性核酸至一受體細胞後，該經轉形細胞一般係辨識的，用於進一步培養及植物再生。為了改善辨識轉形體的能力，可能希望採用一可選擇或可 篩選標記基因伴隨該用來產生該轉形體的轉形載體。在此事例中，該潛在地經轉形細胞族群可以藉由將該等細胞曝露於一選擇劑或選擇劑等而檢測，或是該等細胞可以針對所欲的標記基因性狀篩選。
曝露於選擇劑而存活的細胞，或是在一篩選檢測中已經評分為陽性的細胞，可能培養於支持植物再生的培養基中。在一些實施例中，任何適合的植物組織培養基(舉例而言，MS與N6培養基)可能藉由包括進一步物質，諸如生長調控劑，而修飾。組織可能維持於一帶有生長調控劑的基礎培養基上，直到足夠的組織可得到以開始植物再生努力為止，或是繼之重複手工選擇回合，直到該組織之形態適合用於再生為止(舉例而言，至少2週)，然後轉移至有助於莖形成的培養基。培養物係週期性地轉移，直到足夠的莖形成已發生為止。一旦莖形成，其等係轉移至有助於根形成的培養基。一旦足夠的根形成，植物可以轉移至土壤為了進一步的生長與成熟。
為了確認在該再生植物中包含一合成性CsVMV雙向啟動子的所欲核酸分子之存在，各式各樣檢測可能執行。此等檢測包括，舉例而言：分子生物檢測，諸如南方墨點與北方墨點及PCR；生化檢測，諸如，例如藉由免疫學手段(ELISA及/或西方墨點)或是藉由酵素功能來偵測蛋白質產物的存在；植物部分的檢測，諸如葉子或根檢測；及全株再生植物之表現型的分析。
靶定併入事件可能經篩選的，舉例而言，藉由 使用，例如，對感興趣核酸分子特異性的寡核苷酸引子之PCR擴增。瞭解到PCR基因型分型包括，但不限於，衍自預期含有併入至該基因組內之一感興趣核酸分子的經分離宿主植物癒合組織的基因組DNA之聚合酶鏈反應(PCR)擴增，繼之PCR擴增產物之標準選殖與序列分析。PCR基因型分型的方法已經充分地描述(參閱，例如，Rios等人於”(2002)，Plant J.32：243-53”)，且可能應用至衍自任何植物物種或組織類型，包括細胞培養物，的基因組DNA。結合至標靶序列與引入序列兩者之寡核苷酸引子的組合可能在PCR擴增反應中相繼地或是多工的使用。設計以黏合該標靶位點、經引入核酸序列、及/或二者之組合的寡核苷酸引子可能生產。因此，PCR基因型分型策略可能包括，舉例而言且不限於：該植物基因組中特異性序列之擴增；於植物基因組中多重特異性序列之擴增；該植物基因組中非特異性序列之擴增；及前述任一者之組合。熟習該項技藝者可能策劃額外的引子組合與擴增反應以訊問該基因組。舉例而言，一組順向及反向寡核苷酸引子可能設計以黏合對於該引入核酸序列邊界外部的標靶特異性的核酸序列。
順向與反向寡核苷酸引子可能設計以特異性地黏合至一經引入的核酸分子，舉例而言，在對應於其內所含括的一感興趣聚核苷酸序列之內的編碼區域之序列處，或是該核酸分子之其它部分。這些引子可能結合上述該等引子使用。寡核苷酸引子可能依據一所欲序列合成，且係 為商業上可得到的(例如，從Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。選殖和定序可能繼之擴增之後，或是直接序列分析擴增產物。熟習該項技藝者可能展望替代的方法用於分析PCR基因型分型期間所生成的擴增產物。在一實施例中，對該基因標靶特異性的寡核苷酸引子在PCR擴增中係採用的。
VI.包含合成性雙向啟動子CsVMV的細胞、細胞培養物、組織及生物體
本發明之一些實施例亦提供包含一合成性CsVMV雙向啟動子，舉例而言如可能存在於一核酸構建體中，的細胞。在特定例子中，依據一些實施例的一合成性CsVMV雙向啟動子可能利用做為一調控序列，以調控植物細胞與植物中的轉基因表現。在此種例子之一些中，操縱鏈接至一感興趣聚核苷酸序列(例如，一轉基因)的一合成性CsVMV雙向啟動子之使用可能降低調控一給定數目感興趣核苷酸序列之表現所需要的同源啟動子的數目，及/或降低引入一給定數目感興趣核苷酸序列所要求的該(等)核酸構建體的大小。更進一步，使用一合成性CsVMV雙向啟動子可能允許於相同條件下共表現二個操縱鏈接的感興趣聚核苷酸序列(亦即，於該CsVMV啟動子活化的條件下)。此等例子可能特別有用的，例如，當該二個操縱鏈接的感興趣核苷酸序列每一者在包含該感興趣核苷酸序列之轉基因宿主中促成一單一性狀時，及共表現該等感興趣核苷酸序列有利地衝擊該性狀在轉基因宿主中之表現 時。
在一些實施例中，包含一或多個合成性CsVMV雙向啟動子及/或感興趣核苷酸序列(等)的轉基因植物可能具有藉由於植物中表現該(等)感興趣核苷酸序列而賦予(例如，引入、增強、或促成)之一或多個所欲的性狀。此等性狀可能包括，舉例而言且不限於：對昆蟲、其它害蟲、及致病劑之抗性；除草劑耐受性；增強的穩定性、產量、或儲放壽命；環境耐受性；藥學上的生產；工業產物之生產；及營養增強。在一些例子中，一所欲的性狀可能藉由以包含操縱鏈接至一感興趣聚核苷酸序列之合成性CsVMV雙向啟動子的一核酸分子轉形植物而賦予。在一些例子中，一所欲的性狀可能賦予給經由育種以一子代植物產生的植物，該性狀可能藉由操縱鏈接至一合成性CsVMV雙向啟動子之感興趣一或多個核苷酸序列而賦予，該序列係從包含操縱鏈接至一合成性CsVMV雙向啟動子之感興趣聚核苷酸序列的親代植物傳遞至一植物。
依據一些實施例的一種轉基因植物可能為能夠以本發明之一核酸分子轉形的任何植物，或是能與以本發明之一核酸分子轉形的一植物育種的任何植物。相應地，該植物可能為一雙子葉植物或一單子葉植物。在一些例子中使用的雙子葉植物的非限制性例子包括：苜蓿；豆子；青花菜；甘藍菜；油菜；胡蘿蔔；花椰菜；芹菜；大白菜(Chinese cabbage)；棉花；黃瓜；茄子；萵苣；甜瓜；豌豆；胡椒；花生；馬鈴薯；南瓜(pumpkin)；蘿蔔；油菜 子；菠菜；大豆；櫛瓜(squash)；甜菜；葵花；煙草；番茄；及西瓜。在一些例子中使用的單子葉植物的非限制性例子包括：短柄草屬(Brachypodium)；玉米；洋蔥；水稻；高梁；小麥；黑麥；粟；甘蔗；燕麥；黑小麥；柳枝稷(switchgrass)；以及草坪草(turfgrass)。
在一些實施例中，一轉基因植物可能以任何方式使用或栽培，其中存在一合成性CsVMV雙向啟動子及/或操縱鏈接感興趣之聚核苷酸序列係為所欲的。相應地，此等轉基因植物可能藉由用依據本發明的核酸分子轉形而工程化，尤其，以具有一多個所欲性狀或轉基因事件，且可能藉由熟習該項技藝者已知的任何方法來種植或栽培。
下列例子係提供以例示某些具體特性及/或實施例。該等例子不應被解釋為限制本揭露內容至該等舉例說明的具體特性或實施例。
例子 例子1：木薯葉脈嵌紋病毒(CsVMV)啟動子元素的註解
該CsVMV啟動子(序列辨識編號：9；圖1)係為一517bp的聚核苷酸序列(美國專利第7,053,205號)。該聚核苷酸序列可以劃分成三部分。該第一部分係為一320bp、5'上游啟動子聚核苷酸片段。該第二部分係位於該5'-上游啟動子部分(URS)的近側下游。該第二部分含有一123bp的核心啟動子(minCsVMVP)。這兩種聚核苷酸片段的辨識係於美國專利申請案2005/0118432 A1號中最初描述地。該兩個部分進一步附接到一第三部分。該第三部分係為一 74bp、5'非轉譯區域(UTR)，其進一步位於該5'上游啟動子與該123bp核心啟動子之下游。
該517bp的CsVMV啟動子片段之聚核苷酸序列係以序列辨識編號：9提供的。該320bp、5'-上游啟動子聚核苷酸片段係於斜體字體中顯示並以序列辨識編號：7呈現。該123bp的核心啟動子係於下劃線字體中顯示，且係以序列辨識編號：5呈現。該74bp的5' UTR係於粗體字體中顯示，並以序列辨識編號：6呈現。相應地，序列辨識編號：9係提供為：
例子2：擬南芥泛素10(AtUBI10)啟動子元素之註解
該AtUbi10啟動子(序列辨識編號：8；圖2)係為 一1,322bp的聚核苷酸序列(Callis,J.等人於”(1995)Structure and evolution of genes encoding polyubiquitin and ubiquitin-like proteins in Arabidopsis thaliana ecotype columbia,Genetics,139(2),921-39”)。該聚核苷酸序列可以劃分成三部分。該第一部分係為一812bp、5'上游啟動子聚核苷酸片段(URS)。該第二部分係位於該5'上游部分的近側下游。該第二部分含有一140bp的最小核心啟動子(minUbi10P)。該兩個部分進一步附接到由一內含子及5' UTR構成之一第三部分。該5' UTR係為一66bp、5'非轉譯區域(UTR)，其係直接位於該5'上游啟動子與該140bp核心啟動子之下游。該304bp之內含子係位於該聚核苷酸序列之最遠下游端。
該1,332bp的AtUBi10啟動子片段之聚核苷酸序列係以序列辨識編號：8提供的。該812bp、5'上游啟動子聚核苷酸片段係於斜體字體中顯示並以序列辨識編號：4呈現。該140bp的最小核心啟動子係於下劃線字體中顯示，且係以序列辨識編號：1呈現。該66bp的5' UTR係於粗體字體中顯示，並以序列辨識編號：3呈現。該304bp的內含子係於小寫字體中顯示，並以序列辨識編號：2呈現。相應地，序列辨識編號：8係提供為：
例子3：雙向啟動子之設計
含有源自該CsVMV及AtUbi10啟動子之基因調控元素的一第一雙向啟動子係設計並以序列辨識編號：10呈現。此雙向啟動子含有局部的CsVMV啟動子序列(鹼基對1-197)，該者在反向互補方向融合至該全長AtUbi10啟動子(鹼基對198-1,519)的5'端。該局部CsVMV啟動子之組分含有一123bp的CsVMV最小核心啟動子區域(下劃線字體於鹼基對75-197；序列辨識編號：5)，及該CsVMV 5'非轉譯區域(粗體字體於鹼基對1-74；序列辨識編號：7)。該全長AtUbi10啟動子之組分含有一上游啟動子區域(斜體字體於鹼基對198-1009；序列辨識編號：4)、AtUbi10最小核心啟動子(雙下劃線字體於鹼基對1,010-1,149；序列辨識編號：1)、該AtUbi10 5'非轉譯區域(粗體及下劃線字體於鹼基對1,150-1,215；序列辨識編號：3)、及AtUbi10內含子(小寫字體於鹼基對1,216-1519；序列辨識編號：2)。相應地，序列辨識編號：10係提供為：
含有源自該AtUbi10啟動子之基因調控元素的一第二雙向啟動子係設計並以序列辨識編號：11呈現。此雙向啟動子含有局部的AtUbi10啟動子序列(鹼基對1-510)，該者在反向互補方向融合至該全長AtUbi10啟動子(鹼基對511-1,832；序列辨識編號：4)的5'端。該局部AtUbi10啟動子之組分含有一140bp的AtUbi10最小核心啟動子區域(下劃線字體於鹼基對371-510；序列辨識編號：1)、該AtUbi10 5'非轉譯區域(粗體字體於鹼基對305-370；序列辨識編號：3)、及該AtUbi10內含子(小寫字體於鹼基對1-304；序列辨識編號：2)。該全長AtUbi10啟動子之組分含有一上游啟動子區域(斜體字體於鹼基對511-1,322；序列辨識編號：4)、AtUbi10最小核心啟動子(雙下劃線字體於鹼基對1,323-1,462；序列辨識編號：1)、該AtUbi10 5'非轉譯區域(粗體及下劃線字體於鹼基對1,463-1,528；序列辨識編號：3)、及AtUbi10內含子(小寫字體於鹼基對1,529-1,832；序列辨識編號：2)。相應地，序列辨識編號：11係提供為：
含有源自該CsVMV及AtUbi10啟動子之基因調控元素的一第三雙向啟動子係設計並以序列辨識編號：12呈現。此雙向啟動子含有局部的AtUbi10啟動子序列(鹼基對1-510)，該者在反向互補方向融合至該全長CsVMV啟動子(鹼基對511-1,027)的5'端。該局部AtUbi10啟動子之組分含有一140bp的AtUbi10最小核心啟動子區域(下劃線字體於鹼基對371-510；序列辨識編號：1)、該AtUbi10 5'非轉 譯區域(粗體字體於鹼基對305-370；序列辨識編號：3)、及該AtUbi10內含子(小寫字體於鹼基對1-304；序列辨識編號：2)。該CsVMV啟動子之組分含有該上游啟動子區域(斜體字體於鹼基對511-830；序列辨識編號：7)、CsVMV最小核心啟動子(雙下劃線字體於鹼基對831-953；序列辨識編號：5)及該CsVMV 5'非轉譯區域(粗體及下劃線字體於鹼基對954-1,027；序列辨識編號：6)。相應地，序列辨識編號：12係提供為：
含有源自該CsVMV啟動子之基因調控元素的一第四雙向啟動子係設計並以序列辨識編號：13呈現。此雙向啟動子含有局部的CsVMV啟動子序列(鹼基對1-197)，該者在反向互補方向融合至該全長CsVMV啟動子(鹼基對198-714)的5'端。該局部CsVMV啟動子之組分含有一123bp的CsVMV最小核心啟動子區域(下劃線字體於鹼基對75-197；序列辨識編號：5)及該CsVMV 5'非轉譯區域(粗體字體於鹼基對1-74；序列辨識編號：6)。該全長CsVMV啟動子之組分含有該上游啟動子區域(斜體字體於鹼基對198-518；序列辨識編號：7)、CsVMV核心啟動子(雙下劃線字體於鹼基對519-640；序列辨識編號：5)、及該CsVMV 5'非轉譯區域(粗體及下劃線字體於鹼基對641-714；序列辨識編號：6)。相應地，序列辨識編號：13係提供為：
例子4：植物轉形構建體
植物轉形構建體係設計以測試該雙向啟動子在植物中的表現。該最終雙向啟動子構建體係藉由插入一驅動上游一報告基因之最小啟動子，並在反向互補於驅動該第二報告基因之初級啟動子的方向而生成。八種質體， pDAB113192、pDAB113193、pDAB113194、pDAB113195、pDAB113196、pDAB113197、pDAB113198與pDAB113199係建造以含有源自CsVMV及AtUbi10啟動子基因調控元素，其驅動該綠色螢光蛋白(gfp；Evrogen,Moscow,Russia)與紅色螢光蛋白(rfp；Clontech,Mountain View,CA)兩轉基因，且係由農桿腫瘤菌ORF 23/24 3'UTR(Barker等人之”Plant Molecular Biology 1983,2(6),335-50”)或農桿腫瘤菌胭脂鹼合成酶3'UTR兩者任一所終止(表1)。該所得到的構建體含有一單一的雙向啟動子，其驅動操縱鏈接至該雙向啟動子5'及3'端的兩個不同轉基因。該構建體係使用IN FUSION®選殖方法組裝，該者使加入15-20bp同源性至適當的片段末端，以允許選殖期間適當的片段對準為有必要的。該植物表現構建體係選殖到一PENTRY11TM線性骨架內(Life Technologies,Carlsbad,CA)。片段係使用High Fidelity PHUSION® PCR(New England Biolabs,Ipswich,MA)擴增。IN FUSION® HD ECODRYTM選殖系統(Life Technologies)係利用，且選殖體係於LB(50μg/ml卡那黴素)培養基上選擇。質體構建體係藉由Qiagen MINIPREP SPIN KITTM(Qiagen,Valencia,CA)及Qiagen ENDOFREE® Plasmid Maxi Kit(Qiagen)，使用最小製備與最大製備DNA萃取而確認。
例子5：大豆植物轉形
上述該等構建體係使用以轉形大豆植物。大豆植物(Glycine max c.v.Maverick)係於溫室中種植，並在12/12日/夜光週期、溫度26.7-30℃下栽培。種植後五週(大約開花後7至14天)寬度大於0.9cm的大豆豆莢係收穫。
該收穫的豆莢係藉由以70%乙醇清洗豆莢30秒，繼之以含有2滴TWEEN® 20之10%漂白劑伴隨溫和攪拌清洗10分鐘，而表面滅菌。該漂白劑係輕輕倒出，而該培植體係以無菌水清洗3次，每次5分鐘伴隨溫和攪拌。無 菌豆莢係儲存於4℃達7-8天。
未成熟胚在該豆莢內的位置係藉由在一透射立體顯微鏡上背光照明該豆莢而確定。長度3mm到5mm的胚係使用於轉形，而過大或過小的胚係丟棄的。兩個切口係於豆莢兩端製成，而一個切口係沿著該豆莢之縱向彎曲部製成。在製造該縱向切口時，充份的植物組織係切開以曝露該豆莢腔室的內部。該豆莢然後係打開且未成熟胚係移除。先於轟擊之前，經分離的胚係放置於質壁分離培養基(plasmolysis media)(4.4g/L MS基礎維生素(M519)、73g/L甘露糖醇、73g/L山梨醇、2.3g/L結冷膠(gelzan)(GELRITE®)、1g/L氯化鎂)上達四小時。
黃金微載體係於一矽化的2ml管子中製備。約50mg的0.6μm黃金微載體(Bio Rad,Hercules,CA)及1ml的100%乙醇係加入並旋盪達2分鐘。此步驟後繼之於1000xg離心計4分鐘，丟棄該上清液。接著，1ml的70%乙醇係加入，旋盪達2分鐘，然後該管子係於室溫下培育15分鐘伴隨偶爾的旋盪。培育後，該製備物係於1000×g下離心1分鐘，丟棄該上清液。該等顆粒係藉由加入1ml無菌水伴隨旋盪1分鐘，允許該等顆粒沉降1分鐘，然後以1800×g離心1分鐘而洗滌。該清洗步驟係重複額外兩次。該所得到之丸狀植物材料係再懸浮於50%無菌甘油中。
經製備的黃金微載體係塗覆以DNA，用於轟擊，藉由首先經由旋盪2分鐘而再懸浮，並轉移50μl溶液至一矽化管子內。當旋盪時，試劑係依下列順序加入：5μl of DNA、50μl的2.5M CaCl2及20μl的0.1M亞精胺。該管子係蓋上蓋子並於4℃下旋盪計20分鐘。旋盪後，將200μl的100%乙醇係加入、旋盪達1分鐘，並於1000×g下離心1 分鐘。上清液係移除，且乙醇清洗係再重複兩次。該最終丸狀物係再懸浮於50μl的100%乙醇中。
在轟擊哪一刻，9μl的旋盪DNA/黃金微載體混合物係於放置在該大載體保持器中該大載體中心上之一均勻塗層中散布，此步驟係重複，直到所有轟擊的大載體係經塗覆。未成熟胚係於一質壁分離培養基上定向，使得背面側向上並集中於該平板中。樣品係使用63.3kg/cm爆破片(rupture disks)於距該標靶9cm處以Biorad PDS 1000/HETM基因槍轟擊。胚係轉移到SE40培養基(4.3g/L之MS基礎鹽(M524)、1ml/L之Gamborg B5維生素(G249)、30g/L之蔗糖、4ml/L之2,4-D(10mg/ml)、2g/L之LGELRITE®)。
該經轟擊大豆植物材料係於轟擊後24-48個小時成像，在具DFC310FX相機的Leica M165FCTM立體顯微鏡(Leica,Wetzlar,Germany)上使用RFP與GFP濾鏡組。影像係使用IMAGEJTM(W.S.Rasband,ImageJ,U.S.National Institutes of Health,Bethesda,Maryland,USA,http：//imagej.nih.gov/ij/,19972014)分割成紅、綠、藍通道，而該所分析的通道係針對選擇呈現焦點之最佳通道而抉擇。閾值係使用該棒追踪工具(wand tracing tool)優化，以確定總面積。焦點係使用IMAGEJTM中的Find Maxima功能定量。背景焦點係使用未經轟擊及沒有DNA之經轟擊植物材料對照平板從實驗總數中減去。
例子6：大豆中瞬時基因表現
大豆未成熟胚係使用顆粒轟擊如上述轉形。轟擊後，該植物材料係培養24-48個小時，且該等樣品係使用具DFC310FX相機的Leica M165FCTM立體顯微鏡顯現(圖 3)，並使用ImageJTM針對焦點計數分析(圖4及表2)。
圖3中提供的顯微鏡影像及圖4與表2中提供的定量蛋白質表現水平指出pDAB113198(序列辨識編號：13之雙向啟動子)、pDAB113199(序列辨識編號：13之雙向啟動子)、pDAB113192(序列辨識編號：11之雙向啟動子)及pDAB113194(序列辨識編號：10之雙向啟動子)之含有CsVMV與AtUbi10基因調控元素的雙向啟動子驅動GFP & RFP兩種蛋白質的表現。該等雙向啟動子之表現水平係可比擬驅動GFP(pDAB113188)或RFP(pDAB113190)兩者任一之表現的單一啟動子對照組。此外，pDAB113198、pDAB113192及pDAB113194之雙向啟動子於一可比擬水平下驅動GFP的表現，當相較於該對照構建體pDAB113188時。
例子7：玉米轉形
上述該等構建體係使用以轉形玉米細胞。未成熟的玉米胚係從生長在溫室中的玉米(品種B104)獲得的。該玉米植物係自花或近緣授粉，且該等穗係於授粉後9-12 天收穫。實驗前一天，穗係藉由浸入在20%的家用漂白劑溶液，該者含有5%次氯酸鈉，並振盪計20-30分鐘，繼之在無菌水中洗滌三次而表面滅菌。滅菌後，未成熟的合子胚(大小2.0-2.4mm)係從每一穗無菌解剖，並收集在含有滲透培養基的2ml管子中。一旦分離完成，該滲透培養基係移除，而胚係隨機轉移到半固體滲透培養基上。該等胚係配置在用於生物彈道學轉形之適當標靶格式中。平板係於27.5℃在一持續50μM的低光室中培養過夜。
在實驗當天，藉由在冰上解凍黃金微載體、旋盪並等分50μl的懸浮黃金至一滅菌的2ml管子內，經滅菌的黃金微載體係製備用於轉形。當旋盪時，下列組分係依序加入；黃金微載體，5μl的1.0μg/μl存料、50μl的2.5M CaCl2及20μl的0.1M亞精胺。該所得到的懸浮液係於4℃下旋盪計20分鐘、以乙醇清洗三次，並再懸浮於30μl的100%乙醇。該經製備懸浮液係儲存於冰上，直至轟擊。
在轟擊哪一刻，大載體係製備，藉由在該大載體的中心均勻地散布5μl的經旋盪DNA/黃金微載體混合物，對每一樣品，此步驟係重複，而該複合物係允許讓其乾燥計約10分鐘。轟擊係使用一Biorad Biolistic PDS 1000/HE PARTICLE DELIVERY SYSTEMTM於6cm處使用滅菌的63.3kg/cm爆破片而進行。
轟擊後，平板係以3M TAPETM包裹，並在連續、50μM低光條件下於27.5℃中於一托盤上儲存過夜。24小時後，使用TYPHOON® IMAGING SYSTEM(GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,United Kingdom)觀察瞬時表現。
例子8：玉米中瞬時基因表現
玉米未成熟胚係如上述使用微粒轟擊轉形。培育24小時後，樣品係使用TYPHOON® IMAGER SYSTEM顯現(圖5)。圖5中提供的顯微鏡影像及圖6與表3中提供的定量蛋白質表現水平指出pDAB113198(序列辨識編號：13之雙向啟動子)、pDAB113199(序列辨識編號：13之雙向啟動子)、pDAB113192(序列辨識編號：11之雙向啟動子)、pDAB113194(序列辨識編號：10之雙向啟動子)、pDAB113193(序列辨識編號：11之雙向啟動子)、pDAB113196(序列辨識編號：12之雙向啟動子)、及pDAB113197(序列辨識編號：12之雙向啟動子)之含有CsVMV與AtUbi10基因調控元素的雙向啟動子驅動GFP & RFP兩種蛋白質的表現。該表現數據進一步暗示，與CsVMV或AtUbi10極性啟動子兩者任一偶合之該AtUbi10最小啟動子給予在相反方向中之轉基因高的表現。相較而言，CsVMV最小啟動子顯示一相對較低的表現(圖6)。用於GFP或RFP兩者任一之表現的該等雙向啟動子的表現水平係定量。如圖5中所顯示，pDAB113199、pDAB113198、pDAB113197、pDAB113196、pDAB113194、pDAB113193及pDAB113192之雙向啟動子於高表現水平下驅動GFP的表現。此外，pDAB113199、pDAB113198、pDAB113197、pDAB113196、pDAB113193及pDAB113192之雙向啟動子於高表現水平下驅動RFP的表現。
總之，該AtUbi10與CsVMV啟動子已經轉換成新的合成性CsVMV雙向啟動子，其包含在大豆與玉米兩者中皆有功能的、源自擬南芥泛素10啟動子及木薯葉脈嵌紋病毒啟動子的數個啟動子元素。從雙向啟動子獲得之該感興趣第一與第二核苷酸的表現水平似乎可比擬單向啟動子基因構建體。該等雙向啟動子強勁驅動融合至該雙向啟動子任一端之多重轉基因序列的表現。
雖然許多示範性觀點與實施例已於上文中討論，熟習該項技藝者將識別其之某些修飾、置換、添加及次組合。所以，其係意欲的是，下面所附的請求項與此後引入的請求項係解釋為包括所有此種修飾、置換、添加及次組合在其等之真實精神與範圍內。
<110> 陶氏農業科學公司
<120> 合成性雙向植物啟動子
<130> 75377
<160> 23
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 140
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 1
<210> 2
<211> 304
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 2
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 3
<210> 4
<211> 812
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 4
<210> 5
<211> 123
<212> DNA
<213> 木薯葉脈嵌紋病毒
<400> 5
<210> 6
<211> 74
<212> DNA
<213> 木薯葉脈嵌紋病毒
<400> 6
<210> 7
<211> 320
<212> DNA
<213> 木薯葉脈嵌紋病毒
<400> 7
<210> 8
<211> 1322
<212> DNA
<213> 擬南芥
<400> 8
<210> 9
<211> 517
<212> DNA
<213> 木薯葉脈嵌紋病毒
<400> 9
<210> 10
<211> 1519
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子
<400> 10
<210> 11
<211> 1832
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子
<400> 11
<210> 12
<211> 1027
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子
<400> 12
<210> 13
<211> 714
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子
<400> 13
<210> 14
<211> 1789
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113190之基因表現卡匣
<400> 14
<210> 15
<211> 1523
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB1131888之基因表現卡匣
<400> 15
<210> 16
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113192之基因表現卡匣
<400> 16
<210> 17
<211> 4101
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113193之基因表現卡匣
<400> 17
<210> 18
<211> 3797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113194之基因表現卡匣
<400> 18
<210> 19
<211> 3788
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113195之基因表現卡匣
<400> 19
<210> 20
<211> 3296
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113196之基因表現卡匣
<400> 20
<210> 21
<211> 3305
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113197之基因表現卡匣
<400> 21
<210> 22
<211> 2992
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113198之基因表現卡匣
<400> 22
<210> 23
<211> 2992
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> pDAB113199之基因表現卡匣
<400> 23

Claims (57)

  1. 一種合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其包含源自一擬南芥(Arabidopsis thaliana)泛素10啟動子及一木薯葉脈嵌紋病毒(Cassava Vein Mosaic Virus)啟動子的數個啟動子元素。
  2. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該等啟動子元素包含一最小核心啟動子。
  3. 如請求項2之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該最小核心啟動子包含對序列辨識編號：1具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  4. 如請求項2之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該最小核心啟動子包含對序列辨識編號：5具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  5. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該等啟動子元素包含一內含子。
  6. 如請求項5之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該內含子包含對序列辨識編號：2具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  7. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該等啟動子元素包含一5'-UTR。
  8. 如請求項7之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該5'-UTR包含對序列辨識編號：3具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  9. 如請求項7之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該5'-UTR包含對序列辨識編號：6具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  10. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該等啟動子元素包含一上游啟動子元素。
  11. 如請求項10之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該上游啟動子元素包含對序列辨識編號：4具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  12. 如請求項10之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該上游啟動子元素包含對序列辨識編號：7具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  13. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該擬南芥泛素-10啟動子包含對序列辨識編號：8具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  14. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該木薯葉脈嵌紋病毒啟動子包含對序列辨識編號：9具至少90%序列一致性的一聚核苷酸序列。
  15. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  16. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子包含序列辨識編號：10。
  17. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子包含序列辨識編號：11。
  18. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子包含序列辨識編號：12。
  19. 如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子包含序列辨識編號：13。
  20. 如請求項15之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子3’端的一感興趣第一聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  21. 如請求項20之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子5，端的一感興趣第二聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  22. 如請求項20或21之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其中該感興趣之聚核苷酸序列包含一性狀。
  23. 如請求項22之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，其 中該性狀係選自由下列所組成之群組：殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮使用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、可選擇標記性狀、及其之任何組合。
  24. 一種用於產生一轉基因植物細胞的方法，該方法包含：a)以包含一操縱鏈接到至少一感興趣聚核苷酸序列之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的基因表現卡匣轉形一植物細胞；b)分離包含該基因表現卡匣的該經轉形植物細胞；及，c)產生包含該操縱鏈接到至少一感興趣聚核苷酸序列之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的一轉基因植物細胞。
  25. 如請求項24之方法，其中轉形一植物細胞係以一植物轉形方法執行。
  26. 如請求項25之方法，其中該植物轉形方法係選自由下列所組成之群組：農桿菌介導的轉形方法、生物彈道學轉形方法、碳化矽轉形方法、原生質體轉形方法、及脂質體轉形方法。
  27. 如請求項24之方法，其中該感興趣聚核苷酸序列貫穿該轉基因植物細胞係持續地表現。
  28. 如請求項24之方法，其中該感興趣聚核苷酸序列係穩定地併入到該轉基因植物細胞之基因組內。
  29. 如請求項24之方法，該方法進一步包含下列步驟：e)再生該轉基因植物細胞為一轉基因植物；及 f)獲得該轉基因植物，其中該轉基因植物包含該基因表現卡匣，該卡匣包含操縱鏈接到至少一感興趣聚核苷酸序列之如請求項1之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子。
  30. 如請求項24之方法，其中該轉基因植物細胞係為一單子葉轉基因植物細胞或一雙子葉轉基因植物細胞。
  31. 如請求項30之方法，其中該雙子葉轉基因植物細胞係選自由下列所組成之群組：擬南芥屬植物細胞、煙草植物細胞、大豆植物細胞、油菜植物細胞、及棉花植物細胞。
  32. 如請求項30之方法，其中該單子葉轉基因植物細胞係選自由下列所組成之群組：玉米植物細胞、水稻植物細胞、短柄草屬(Brachypodium)植物細胞、及小麥植物細胞。
  33. 如請求項24之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  34. 如請求項33之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子3’端的一感興趣第一聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  35. 如請求項33之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子5’端的一感興趣第二聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  36. 一種用於在一植物細胞中表現一感興趣聚核苷酸序列的方法，該方法包含引入操縱鏈接至一合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子之感興趣聚核苷酸序列至該植物細胞內。
  37. 如請求項36之方法，其中操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子的該感興趣聚核苷酸序列係藉由一植物轉形方法引入到該植物細胞內。
  38. 如請求項37之方法，其中該植物轉形方法係選自由下列所組成之群組：農桿菌介導的轉形方法、生物彈道學轉形方法、碳化矽轉形方法、原生質體轉形方法、及脂質體轉形方法。
  39. 如請求項36之方法，其中該感興趣聚核苷酸序列貫穿該植物細胞係持續地表現。
  40. 如請求項36之方法，其中該感興趣聚核苷酸序列係穩定地併入到該植物細胞之基因組內。
  41. 如請求項36之方法，其中該轉基因植物細胞係為一單子葉植物細胞或一雙子葉植物細胞。
  42. 如請求項41之方法，其中該雙子葉植物細胞係選自由下 列所組成之群組：擬南芥屬植物細胞、煙草植物細胞、大豆植物細胞、油菜植物細胞、及棉花植物細胞。
  43. 如請求項41之方法，其中該單子葉植物細胞係選自由下列所組成之群組：玉米植物細胞、水稻植物細胞、短柄草屬植物細胞、及小麥植物細胞。
  44. 如請求項36之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  45. 如請求項36之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子3，端的一感興趣第一聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  46. 如請求項36之合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子，包含操縱鏈接至該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子5，端的一感興趣第二聚核苷酸序列，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子選自由序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
  47. 一種轉基因植物細胞，其包含一合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子。
  48. 如請求項47之轉基因植物細胞，其中該轉基因植物細胞 包含一轉基因事件。
  49. 如請求項48之轉基因植物細胞，其中該轉基因事件包含一農藝學性狀。
  50. 如請求項49之轉基因植物細胞，其中該農藝學性狀係選自由下列所組成之群組：殺蟲劑抗性性狀、除草劑耐受性性狀、氮使用效率性狀、水分使用效率性狀、營養品質性狀、DNA結合性狀、可選擇標記性狀、及其之任何組合。
  51. 如請求項49之轉基因植物細胞，其中該農藝學性狀包含一除草劑耐受性性狀。
  52. 如請求項51之轉基因植物細胞，其中該除草劑耐受性性狀包含一aad-1編碼序列。
  53. 如請求項47之轉基因植物細胞，其中該轉基因植物細胞生產一商品產品。
  54. 如請求項53之轉基因植物細胞，其中該商品產品係選自由蛋白質濃縮物、蛋白質分離物、穀物、膳食、麵粉、油或纖維所組成之群組。
  55. 如請求項47之轉基因植物細胞，其中該轉基因植物細胞係選自由雙子葉植物細胞或單子葉植物細胞所組成之群組。
  56. 如請求項55之轉基因植物細胞，其中該雙子葉植物細胞係為大豆植物細胞。
  57. 如請求項47之轉基因植物細胞，其中該合成性CsVMV雙向聚核苷酸啟動子係選自由序列辨識編號：10、序列 辨識編號：11、序列辨識編號：12、及序列辨識編號：13所組成之群組。
TW104135238A 2014-11-11 2015-10-27 合成性雙向植物啓動子 TW201619386A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462078205P 2014-11-11 2014-11-11

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW201619386A true TW201619386A (zh) 2016-06-01

Family

ID=55911753

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW104135238A TW201619386A (zh) 2014-11-11 2015-10-27 合成性雙向植物啓動子

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9988638B2 (zh)
EP (1) EP3218502A4 (zh)
JP (1) JP2017533699A (zh)
KR (1) KR20170076661A (zh)
CN (1) CN108064290A (zh)
AR (1) AR102611A1 (zh)
AU (1) AU2015346375B2 (zh)
BR (1) BR112017007473A2 (zh)
CA (1) CA2964167A1 (zh)
CL (1) CL2017000921A1 (zh)
CO (1) CO2017003499A2 (zh)
IL (1) IL251646A0 (zh)
MX (1) MX2017004455A (zh)
PH (1) PH12017500640A1 (zh)
RU (1) RU2017112856A (zh)
TW (1) TW201619386A (zh)
WO (1) WO2016077465A1 (zh)

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TR200702139T2 (tr) * 1999-12-16 2007-06-21 Monsanto Technology Llc Yeni bitki tanım yapıları
US6388170B1 (en) * 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
CA2443266A1 (en) * 2001-02-13 2002-08-22 University Of Florida A bi-directional dual promoter complex with enhanced promoter activity for transgene expression in eukaryotes
ITUD20020083A1 (it) * 2002-04-12 2003-10-13 Biasizza Spa Metodo di produzione di tessere di mosaico vetroso contenenti una lamina metallica ornamentale, impianto per la produzione di tali tessere
ES2408244T5 (es) * 2004-04-30 2017-08-08 Dow Agrosciences Llc Nuevo gen de resistencia a los herbicidas
CA2777030C (en) * 2009-10-16 2022-06-07 Dow Agrosciences Llc Use of dendrimer nanotechnology for delivery of biomolecules into plant cells
CN104135851B (zh) * 2011-12-30 2018-05-01 陶氏益农公司 合成的双向植物启动子ubi1的构建体和方法
WO2013101344A1 (en) * 2011-12-30 2013-07-04 Dow Agrosciences Llc Method and construct for synthetic bidirectional scbv plant promoter
UA119135C2 (uk) * 2012-09-07 2019-05-10 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб отримання трансгенної рослини

Also Published As

Publication number Publication date
AR102611A1 (es) 2017-03-15
US20160130595A1 (en) 2016-05-12
PH12017500640A1 (en) 2017-09-25
IL251646A0 (en) 2017-06-29
AU2015346375A1 (en) 2017-04-13
CO2017003499A2 (es) 2017-08-31
EP3218502A4 (en) 2018-04-11
CL2017000921A1 (es) 2017-11-10
KR20170076661A (ko) 2017-07-04
BR112017007473A2 (pt) 2017-12-19
WO2016077465A1 (en) 2016-05-19
MX2017004455A (es) 2017-07-10
JP2017533699A (ja) 2017-11-16
RU2017112856A (ru) 2018-12-17
AU2015346375B2 (en) 2018-08-16
CA2964167A1 (en) 2016-05-19
US9988638B2 (en) 2018-06-05
CN108064290A (zh) 2018-05-22
EP3218502A1 (en) 2017-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2017504332A (ja) 植物におけるタンパク質発現増加
AU2017234672B2 (en) Zea mays regulatory elements and uses thereof
CA2933042C (en) Zea mays regulatory elements and uses thereof
AU2017235944B2 (en) Zea mays regulatory elements and uses thereof
EP3052633B1 (en) Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof
TW201617451A (zh) 合成雙向植物啓動子
RU2619178C2 (ru) Конструкт и способ для экспрессии трансгенов с использованием двунаправленного конститутивного промотора brassica
AU2014329590A1 (en) Zea mays metallothionein-like regulatory elements and uses thereof
TW201619386A (zh) 合成性雙向植物啓動子