KR20170076661A - 합성 양방향성 식물 프로모터 - Google Patents

Abstract

본 개시내용은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴-10 유전자 프로모터 또는 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus) 프로모터로부터의 최소 코어(core) 프로모터 요소, 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터로부터의 전장 뉴클레오티드 서열 요소를 사용하여 식물 또는 식물 세포에서의 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 2개의 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하도록 식물에서 기능하는 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 관한 것이다.

Description

합성 양방향성 식물 프로모터{SYNTHETIC BI DIRECTIONAL PLANT PROMOTER}

우선권 주장

본 출원은 "합성 양방향성 식물 프로모터(SYNTHETIC BI-DIRECTIONAL PLANT PROMOTER)"에 대해 2014년 11월 11일에 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/078,205의 출원일의 이익을 주장한다.

기술 분야

일반적으로 본 개시내용은 식물 또는 식물 세포에서의 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태는 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 촉진하도록 식물에서 기능하는 합성 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus) (CsVMV) 양방향성 프로모터에 관한 것이다. 특정 실시양태는 합성 프로모터를 포함하는 방법 (예를 들어, 핵산 분자를 세포 내로 도입하기 위해), 및 합성 프로모터를 포함하는 세포, 세포 배양물, 조직, 생물 및 생물의 일부분, 뿐만 아니라 이로부터 생산된 생성물에 관한 것이다.

배경

예를 들어, 영양가 품질을 개선하고/하거나, 수율을 증가시키고/시키거나, 해충 또는 질환 저항성을 부여하고/하거나, 가뭄 및 스트레스 내성을 증가시키고/시키거나, 원예학적 품질 (예컨대 착색 및 성장)을 개선하고/하거나, 제초제 저항성을 부여하고/하거나, 식물로부터 산업적으로 유용한 화합물 및/또는 물질을 생산하는 것을 가능하게 하고/하거나, 제약물질의 생산을 가능하게 하는, 농경학적으로 바람직한 형질 또는 특성을 도입하기 위해 다수의 식물 종이 다른 종으로부터의 트랜스진(transgene)으로 형질전환될 수 있다. 식물 세포 내로 트랜스진을 도입하고, 이어서 트랜스진의 안정적으로 통합된 카피를 함유하는 번식성 트랜스제닉(transgenic) 식물을 회수하는 것은 바람직한 형질 또는 특성을 보유하는 트랜스제닉 식물의 생산을 초래할 수 있다.

수많은 메커니즘을 통해 유전자 발현의 제어 및 조절이 발생할 수 있다. 유전자의 전사 개시는 유전자 발현의 우세한 제어 메커니즘이다. 일반적으로 전사 개시는 전사되는 유전자의 5'-측면 또는 상류 영역에 위치하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제어된다. 이러한 서열은 총괄적으로 프로모터로 지칭된다. 일반적으로 프로모터는 메신저 RNA (mRNA)가 생산될 수 있도록 전사를 개시시키는 RNA 중합효소에 대한 신호를 함유한다. 성숙 mRNA가 리보솜에 의해 전사되고, 이에 의해 단백질을 합성한다. DNA-결합 단백질이 프로모터 DNA 서열과 특이적으로 상호작용하여 전사 복합체의 형성을 촉진하고 유전자 발현 프로세스를 개시시킨다. 식물에서의 트랜스진의 발현을 구동시키는 것에 대해 기능성인 다양한 진핵생물 프로모터가 식물로부터 단리 및 특성화되어 있다. 환경 자극, 영양소 이용가능성, 또는 열 충격, 혐기성 생활 또는 중금속의 존재를 포함하는 유해한 조건에 반응하여 유전자 발현에 영향을 미치는 프로모터가 단리 및 특성화되었다. 발달 동안 또는 조직 또는 기관 특이적 방식으로 유전자 발현을 제어하는 프로모터도 있다. 또한, 식물에서의 트랜스진의 발현을 구동시키는 것에 대해 기능성인, 박테리아 및 바이러스로부터 단리된 원핵생물 프로모터가 단리 및 특성화되었다.

진핵생물에서의 발현이 가능한 전형적인 프로모터는 최소 프로모터 및 기타 시스(cis)-요소로 이루어진다. 본질적으로 최소 프로모터는 RNA 중합효소 II (polII), TATA-결합 단백질 (TBP), 및 TBP-연관 인자 (TAF)가 결합하여 전사를 개시시킬 수 있는 TATA 박스 영역이다. 그러나, 대부분의 경우에, TATA 모티프 이외의 서열 요소가 정확한 전사에 요구된다. 이같은 서열 요소 (예를 들어, 인핸서)가, 종종 위치- 및/또는 배향-독립적 방식으로, 가까운 유전자의 전체적인 발현 수준을 상승시키는 것으로 발견되었다. 일부 polII 유전자의 전사 개시 부위 근처의 기타 서열 (예를 들어, INR 서열)이 전사 활성화에 또한 기여하는 인자에 대한 대안적인 결합 부위를 제공할 수 있고, 심지어, 기능성 TATA 요소가 결여된 프로모터에서의 전사를 위한 코어(core) 프로모터 결합 부위를 대안적으로 제공한다. 문헌 [Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2823-30].

기타 유전자 조절 요소는 특이적 DNA-결합 인자와 상호작용하는 서열을 포함한다. 이러한 서열 모티프는 때때로 시스-요소로 지칭되고, 유전자의 코딩 서열에 대해 5' 또는 3'에서 또는 인트론에서 발견될 수 있지만, 일반적으로는 위치- 및 배향-의존적이다. 조직-특이적 또는 발달-특이적 전사 인자가 결합하는 이같은 시스-요소들이, 개별적으로 또는 조합되어, 전사 수준에서 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 결정할 수 있다. 상류 시스-요소에 이어서 최소 프로모터가 배열되는 것이 전형적으로 특정 프로모터의 극성을 확립한다. 클로닝되었고 기초 연구 및 생명공학 용도 양쪽 모두에 널리 사용되는 식물에서의 프로모터는 일반적으로 단방향성이어서, 이의 3' 끝부분 (즉, 하류)에 융합된 1개의 유전자만 지시한다. 문헌 [Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9]; 미국 특허 6,388,170을 참조한다.

다수의 시스-요소 (또는 "상류 조절 서열")가 식물 프로모터에서 확인되었다. 이러한 시스-요소들은 작동가능하게 연결된 유전자에 발휘하는 제어 유형 면에서 크게 다르다. 일부 요소는 환경 반응 (예를 들어, 온도, 습도, 및 상처 형성)에 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시킨다. 다른 시스 요소는 발달 신호 (예를 들어, 발아, 종자 성숙, 및 개화) 또는 공간 정보 (예를 들어, 조직 특이성)에 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23]을 참조한다. 특정 프로모터 요소의 제어 유형은 전형적으로 프로모터의 고유한 특질이고, 즉 이같은 프로모터의 제어 하에 있는 이종 유전자는 프로모터 요소가 단리된 천연 유전자의 제어에 따라 발현될 것이다. 동일 문헌. 이러한 요소들은 또한 전형적으로 다른 요소로 교환될 수 있고, 유전자 발현에 대한 이들의 특징적인 고유한 제어를 유지할 수 있다.

대사 조작 및 형질 스태킹(stacking)을 위해 다중 유전자를 식물 내로 도입하는 것이 종종 필요하고, 이러한 유전자들은 빈번하게 동일하거나 상동성인 프로모터에 의해 제어된다. 그러나, 도입된 다중 트랜스진에 이들을 구동시키는 상동성 프로모터들이 있는 경우 상동성-기반 유전자 침묵화 (HBGS)가 일어날 가능성이 있다. 문헌 [Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94]. 따라서, HBGS가 트랜스제닉 식물에서 광범위하게 발생하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35]를 참조한다. HBGS 현상을 설명하기 위해 여러 메커니즘이 제안되었고, 이들 모두 프로모터 내의 서열 상동성이 반복 유전자의 침묵화를 초래하는 세포 인식 메커니즘을 유발한다는 특색을 포함한다. 문헌 [Matzke and Matzke (1995 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63]; [Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2]; [Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78]. 또한, 상이한 트랜스진들의 유사한 수준의 발현 패턴을 수득하기 위해 동일한 프로모터를 반복하여 사용하는 것은 반복된 프로모터 내의 과다한 경쟁성 전사 인자 (TF)-결합 부위를 초래할 수 있고, 이는 내인성 TF의 고갈을 야기하여 전사 하향 조절에 이를 수 있다.

단일 유전자좌의 트랜스제닉 이벤트 내의 다유전자 형질을 강건하게 발현시키는 통합이 더 크게 요구된다는 것을 고려하면; 이같은 트랜스제닉 이벤트를 생성시키는 것과 연관된 기술적 난점을 감소시키는 해법이 중요하다. 더욱 구체적으로, 기능적으로 동등하지만 서열 상동성이 최소인 합성 프로모터의 개발을 수반하는, 트랜스제닉 식물에서 HBGS를 방지하는 전략이 바람직하다. 이같은 합성 프로모터가 작물 식물에서 트랜스진을 발현시키는데 사용되면, 이는 HBGS를 방지하거나 감소시키는 것을 도울 수 있다. 문헌 [Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79]; [Bhullar et al. (2003) Plant Physiol. 132:988-98].

개시내용

대상 개시내용의 실시양태에서, 개시내용은 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴-10 프로모터 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터로부터의 복수의 프로모터 요소를 포함하는 합성 카사바 베인 모자이크 바이러스 (CsVMV) 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터에 관한 것이다. 추가 실시양태에서, 대상 개시내용은 다양한 프로모터 요소를 포함한다. 따라서, 프로모터 요소는 인트론을 포함한다. 일부 경우에, 프로모터 요소는 5'-UTR을 포함한다. 또한, 프로모터 요소는 상류 프로모터 요소를 포함한다. 추가로, 프로모터 요소는 최소 코어 프로모터를 포함한다. 대상 개시내용의 실시양태에서, 개시내용은 a) 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트로 식물 세포를 형질전환시키는 단계; b) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하는 단계; 및 c) 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 단계를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법에 관한 것이다. 대상 개시내용의 실시양태에서, 개시내용은 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 세포에서 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 대상 개시내용의 실시양태에서, 개시내용은 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포에 관한 것이다.

상기 특색 및 다른 특색이 여러 실시양태에 대한 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이고, 이는 첨부된 도면을 참조로 진행된다.

도면의 간단한 설명
도 1: 이러한 도면은 길이가 517 bp인 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 ("CsVMV")의 개략도이다. 최소 코어 프로모터 ("CsVMV 코어 프로모터")가 123 bp 영역으로서 확인되었고, 프로모터의 5' 끝부분으로부터 약 320 bp 하류에 위치한다. 길이가 74 bp인 5' UTR 영역 ("CsVMV 5' UTR")이 CsVMV 프로모터의 개략도 내에 포함된다.
도 2: 이러한 도면은 길이가 1,332 bp인 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 프로모터 ("AtUbi10")의 개략도이다. 최소 코어 프로모터 ("AtUbi10 코어 프로모터")가 140 bp 영역으로서 확인되었고, 프로모터의 5' 끝부분으로부터 836 bp 하류에 위치한다. 길이가 74 bp인 5' UTR 영역("AtUbi10 5'UTR") 및 길이가 304 bp인 인트론 ("AtUbi10 인트론")이 AtUbi10 프로모터의 개략도 내에 포함된다.
도 3: 이러한 도면은 GFP 및 RFP 단백질의 발현에 대한, 입자가 포격된 대두 미성숙 배아의 현미경 영상을 제공한다. 대두 식물 세포에서의 pDAB113198 (198 GFP 및 198 RFP), pDAB113199 (199 GFP 및 199 RFP), pDAB113192 (192 GFP 및 192RFP), 및 pDAB113194 (194 GFP 및 194 RFP) 내의 gfp 및 rfp 트랜스진의 일시적인 발현이 대조군 구축물인 pDAB113188 (188 GFP 및 188 RFP) 및 pDAB113190 (190 GFP 및 190 RFP) 내의 gfp 및 rfp 트랜스진의 발현과 동등한 수준의 녹색 형광 단백질 및 적색 형광 단백질의 발현 수준을 초래하였다
도 4: 이러한 그래프는 단방향성 극성 프로모터에 비교된 CsVMV 및 AtUbi10 양방향성 프로모터로부터 수득된 RFP/GFP 포커스 카운트이다.
도 5: 이러한 도면은 GFP 및 RFP 발현에 대한, 입자가 포격된 옥수수 배아의 현미경 영상을 제공한다. 옥수수 식물 세포에서의 pDAB113198, pDAB113199, pDAB113192, pDAB113194, pDAB113193, pDAB113196, 및 pDAB113197 내의 gfp 및 rfp 트랜스진의 일시적인 발현이 녹색 형광 단백질 (패널 A) 및 적색 형광 단백질 (패널 B)의 발현을 초래하였다.
도 6: 이러한 그래프는 양방향성 프로모터에 의한 RFP 및 GFP 단백질의 발현에 대한 형광 강도에 상관되는, 상대적인 발현 부피를 도해한다.

발명을 수행하는 모드(들)

I. 여러 실시양태의 개관

트랜스제닉 식물의 개발은 점점 더 복잡해지고 있고, 전형적으로 다중 트랜스진을 단일 유전자좌 내로 스태킹하는 것을 필요로 한다. 문헌 [Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9] 참조. 일반적으로 각각의 트랜스진이 발현을 위해 독특한 프로모터를 요구하기 때문에, 하나의 유전자 스택 내의 상이한 트랜스진들을 발현시키기 위해 다중 프로모터가 요구된다. 유전자 스택의 크기를 증가시키는 것에 더하여, 이는 빈번하게 상이한 트랜스진들의 유사한 수준의 발현 패턴을 수득하기 위해 동일한 프로모터를 반복하여 사용하는 것에 이른다. 이러한 접근법은 종종 문제가 되는데, 동일한 프로모터에 의해 구동되는 다중 트랜스진의 발현이 유전자 침묵화 또는 HBGS에 이를 수 있기 때문이다. 반복된 프로모터 내의 과다한 경쟁성 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 고갈을 야기하여 전사 하향조절에 이를 수 있다. 트랜스진 침묵화는 트랜스진을 발현하도록 생산된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 않다. 트랜스진 내의 반복 서열은 종종 유전자좌-내 상동 재조합에 이르러, 폴리뉴클레오티드 재배열 및 바람직하지 않은 표현형 또는 농경학적 성능을 초래한다.

기초 연구 또는 생물공학 용도에 사용되는 식물 프로모터는 일반적으로 단방향성이고, 이의 3' 끝부분 (하류)에 융합된 1개의 유전자만 조절한다. 다양한 원하는 형질 또는 특성이 있는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해, 원하는 형질 및 특성을 코딩하는 트랜스진의 발현을 구동시키도록 배치되는 프로모터의 수를 감소시키는 것이 유용할 것이다. 특히, 대사 조직 및 형질 스태킹을 위해 다중 트랜스진을 식물 내로 도입하는 것이 필요하고, 이에 의해 다중 트랜스진의 발현을 구동시키기 위해 다중 프로모터가 필요한 용도에서 그러하다. 프로모터의 측면에 있는 2개의 트랜스진의 발현을 구동시킬 수 있는 단일한 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 개발함으로써, 트랜스제닉 작물의 개발에 필요한 프로모터의 총 개수를 감소시키고, 이에 의해 동일한 프로모터의 반복 사용을 줄이고/줄이거나, 트랜스제닉 구축물의 크기를 감소시키고/감소시키거나, HBGS 가능성을 감소시킬 수 있다. 이같은 프로모터는 공지된 시스-요소를 신규 또는 합성 DNA 신장물 내에 도입함으로써, 또는 대안적으로 하나의 프로모터의 도메인이 다른 이종 프로모터로부터의 기능적으로 동등한 도메인으로 대체되는 "도메인 교체"에 의해 생성될 수 있다.

본원에서의 실시양태는 하나의 프로모터가 이러한 프로모터의 각각의 끝부분에 하나씩 있는 2개의 유전자의 발현을 지시할 수 있도록, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 유전자 (예를 들어, AtUbi10) 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (예를 들어, CsVMV)로부터의 단방향성 프로모터가 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 디자인하는데 사용된 프로세스를 이용한다. 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 관련 분야의 기술자가 동일한 프로모터의 반복 사용을 줄이고 트랜스제닉 구축물의 크기를 감소시키면서 트랜스진들을 식물 세포 및 식물 내에 스태킹시키게 할 수 있다. 더욱이, 2개의 유전자의 발현을 단일한 합성 CsVMV 양방향성 프로모터로 조절하는 것은, 예를 들어, 2개의 유전자 각각이 숙주에서의 단일 형질에 기여할 때 유용할 수 있는 바와 같이, 2개의 유전자를 동일한 조건 하에 공동-발현시키는 능력을 또한 제공할 수 있다. 제아 메이스(Zea mays) 유비퀴틴 1 프로모터 (국제 특허 공개 번호 WO2013101343 A1), CaMV 35 프로모터 (Barfield and Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14; Xie et al. (2001), 상기 문헌), 및 mas 프로모터 (Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12):2723-30; Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23)를 포함하여, 식물에서 프로모터의 양방향성 기능을 사용하는 것이 일부 사례에서 보고되었다.

프로모터 내에 총괄적으로 배열된 다양한 DNA 서열 요소에 의해 식물 유전자에서의 전사 개시 및 유전자 발현의 조정이 지시된다. 진핵생물 프로모터는 최소 코어 프로모터 요소 (minP), 및 추가적인 상류 조절 서열 (URS)로 이루어진다. 코어 프로모터 요소는 정확한 전사 개시를 지시하는데 충분한 인접한 DNA 서열의 최소 신장물이다. 식물에서의 코어 프로모터는 전사 개시와 연관된 정규 영역, 예컨대 CAAT 및 TATA 박스를 또한 포함한다. TATA 박스 요소는 일반적으로 전사 개시 부위로부터 뉴클레오티드 약 20 내지 35개의 상류에 위치한다.

minP의 활성화는 URS에 의존적이고, 다양한 단백질이 URS에 결합한 후 전사 개시 복합체와 상호작용한다. URS는 URS를 포함하는 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 결정하는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터의 극성이 종종 minP의 배향에 의해 결정되는 한편, URS는 양극성이다 (즉, 이는 이의 배향과 독립적으로 기능한다).

일부 실시양태의 구체적 예에서, 아라비돕시스 탈리아나로부터 최초로 유래된 아라비돕시스 탈리아나 Ubi10 프로모터 (AtUbi10)의 최소 코어 프로모터 요소 (minUbi10P)가 앞서 기술된 양방향성 프로모터와 관련하여 독특한 발현 제어 특성을 제공하도록 식물에서 기능하는 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 조작하는데 사용된다. 실시양태는 천연 CsVMV 프로모터로부터 유래된 최소 코어 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열 (minCsVMVP)을 추가로 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 카사바 베인 모자이크 바이러스로부터 최초로 유래된 변형된 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 (CsVMV)의 최소 코어 프로모터 요소가 앞서 이용가능한 양방향성 프로모터와 관련하여 독특한 발현 제어 특성을 제공하도록 식물에서 기능할 수 있는 합성 양방향성 아라비돕시스 탈리아나 Ubi10 프로모터를 조작하는데 사용된다. 실시양태는 천연 AtUbi10 프로모터로부터 유래된 최소 코어 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 합성 양방향성 AtUbi10 프로모터를 포함한다.

AtUbi10 프로모터는 아라비돕시스 탈리아나 게놈에서 기원하는 서열을 포함한다. 일부 예에서 사용되는 변형된 AtUbi10 프로모터는 TATA 박스; 5'UTR; 및 인트론을 함유하는 약 1.3 kb의 프로모터이다. 아라비돕시스((Arabidopsis) 종 및 아라비돕시스 탈리아나 유전자형으로부터 유래되는 다른 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 프로모터 변이체들이 TATA 요소로 이루어지는 minP 요소 주변에서 높은 서열 보존을 나타낼 수 있다. 따라서, AtUbi10 프로모터의 이러한 짧고 고도로 보존된 영역 (예를 들어, 서열식별번호(SEQ ID NO): 1)을 합성 양방향성 식물 프로모터를 구축하기 위한 최소 코어 프로모터 요소로서 사용하는 것에 의해 본 발명의 실시양태가 예시된다.

CsVMV 프로모터는 카사바 베인 모자이크 바이러스 게놈에서 기원하는 서열을 포함한다. 일부 예에서 사용되는 변형된 CsVMV 프로모터는 TATA 박스; 및 5'UTR을 함유하는 약 0.5 kb의 프로모터이다. 카사바(Cassava) 바이러스 종 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 변이체로부터 유래되는 다른 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터 변이체들이 TATA 요소로 이루어지는 minP 요소 주변에서 높은 서열 보존을 나타낼 수 있다. 따라서, CsVMV 프로모터의 이러한 짧고 고도로 보존된 영역 (예를 들어, 서열식별번호: 5)을 합성 CsVMV 양방향성 식물 프로모터를 구축하기 위한 최소 코어 프로모터 요소로서 사용하는 것에 의해 본 발명의 실시양태가 예시된다.

II. 약어

AtUbi10 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10

BCA 비신코닌산

CaMV 콜리플라워 모자이크 바이러스

CsVMV 카사바 베인 모자이크 바이러스

CTP 엽록체 수송 펩티드

HBGS 상동성-기반 유전자 침묵화

minUbi1P 최소 코어 프로모터

OLA 올리고 라이게이션 증폭

PCR 중합효소 연쇄 반응

RCA 롤링 서클(rolling circle) 증폭

RT-PCR 역전사효소 PCR

SNuPE 단일 뉴클레오티드 프라이머 연장

URS 상류 조절 서열

III. 용어

출원 전반에 걸쳐, 다수의 용어가 사용된다. 이같은 용어에 제공되는 범주를 포함하여 명세서 및 특허청구범위의 명확하고 일관적인 이해를 제공하기 위해, 하기의 정의가 제공된다.

인트론: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인트론"은 전사되지만 번역되지 않는 유전자 (또는 발현되는 관심 폴리뉴클레오티드 서열) 내에 포함된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 인트론은 발현되는 DNA 서열 내의 비번역 핵산 서열, 뿐만 아니라 이로부터 전사된 RNA 분자 내의 상응하는 서열을 포함한다.

단리됨: "단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질)은 이러한 성분에서 화학적 또는 기능적 변화를 일으키지 않으면서 이러한 성분이 천연적으로 발생하는 생물의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)로부터 실질적으로 분리되거나, 이와 분리되어 생산되거나, 또는 이로부터 정제되었다 (예를 들어, 핵산이 이러한 핵산을 염색체 내의 나머지 DNA에 연결하는 화학 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있다). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법으로 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 이러한 용어는 숙주 세포에서의 재조합 발현으로 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 또한 포함한다.

유전자 발현: 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA를 포함함)의 코딩된 정보가 세포의 작동성, 비-작동성, 또는 구조적 부분으로 전환되는 프로세스이고, 종종 단백질 합성을 포함함. 유전자 발현은 외부 신호, 예를 들어, 세포, 조직 또는 생물이 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 노출되는 것에 영향을 받을 수 있다. 유전자 발현은 또한 DNA → RNA → 단백질 경로의 임의의 곳에서 조절될 수 있다. 예를 들어, 전사, 번역, RNA 운반 및 프로세싱, 중간체 분자 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 만들어진 후 이의 활성화, 불활성화, 구획화, 또는 분해를 통해, 또는 이들의 조합에 의해 유전자 발현의 조절이 발생한다. 노던 블롯, RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 원위치 또는 생체 내 단백질 활성 검정법(들)을 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 유전자 발현을 측정할 수 있다.

상동성-기반 유전자 침묵화: 본원에서 사용된 바와 같이, "상동성-기반 유전자 침묵화" (HBGS)는 전사 유전자 침묵화 및 전사-후 유전자 침묵화 양쪽 모두를 포함하는 포괄적인 용어이다. 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 상응하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 의해, 전사 억제 (전사 유전자 침묵화; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사-후 유전자 침묵화; PTGS)로부터 연결되지 않은 침묵화 유전자좌에 의한 표적 유전자의 침묵화가 초래될 수 있다. 각각의 프로세스에서 별개의 세포 성분이 수반되는 것은 dsRNA-유도 TGS 및 PTGS가 고대의 공통 메커니즘의 다양화로부터 초래되었을 것임을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS의 엄격한 비교를 달성하기가 어려웠는데, 비교가 일반적으로 별개의 침묵화 유전자좌의 분석에 의존하기 때문이다. 상이한 표적 유전자들의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 생산에 의해, TGS 및 PTGS 양쪽 모두를 유발하는 단일 트랜스진 유전자좌가 기술되었다. 문헌 [Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79]. siRNA가 상동성 서열 상에서 TGS 및 PTGS를 유발하는 실제 분자일 가능성이 있다; 이러한 모델에서 siRNA는 내인성 프로모터 내로의 트랜스진 서열의 메틸화의 확산을 통해 시스 및 트랜스(trans)로 상동성 서열의 침묵화 및 메틸화를 유발할 것이다. 동일 문헌.

핵산 분자: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자" (또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드")는 중합체 형태의 뉴클레오티드를 지칭할 수 있고, 이는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 이들의 합성 형태 및 혼합 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 양쪽 모두를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 양쪽 뉴클레오티드 유형의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. "핵산 분자"는, 본원에서 사용된 바와 같이, "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 달리 상술되지 않는 한, 핵산 분자는 일반적으로 적어도 10개의 염기의 길이이다. 이러한 용어는 정해지지 않은 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 이러한 용어는 단일- 및 이중-가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 발생 및/또는 비-천연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연-발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 하나 또는 양쪽 모두를 포함할 수 있다.

관련 기술 분야의 기술자가 쉽게 이해할 바와 같이, 핵산 분자가 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-천연이거나 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이같은 변형은, 예를 들어, 표지, 메틸화, 천연 발생 뉴클레오티드 중 하나 이상이 유사체로 치환되는 것, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 하전되지 않은 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 인터칼레이터(intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이터; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적 듀플렉스, 트리플렉스, 헤어핀, 원형 및 자물쇠(padlocked) 형상을 포함하는 임의의 위상학적 형상을 또한 포함한다.

DNA 가닥을 따라 5' → 3' 방식으로 전사가 진행된다. 이는 성장 중인 쇄의 3' 말단에 (피로포스페이트가 필수적으로 제거되면서) 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트가 순차적으로 부가되는 것에 의해 RNA가 만들어진다는 것을 의미한다. 선형 또는 원형 핵산 분자에서, 별개의 요소 (예를 들어, 특정 뉴클레오티드 서열)가 추가 요소로부터 5' 방향으로 동일한 핵산에 결합되거나 또는 결합될 것이면 별개의 요소가 추가 요소에 대해 "상류" 또는 "5'"인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소가 이들의 추가 요소로부터 3' 방향으로 동일한 핵산에 결합되거나 또는 결합될 것이면 별개의 요소가 추가 요소에 대해 "하류" 또는 "3'"인 것으로 지칭될 수 있다.

염기 "위치"는, 본원에서 사용된 바와 같이, 지정된 핵산 내의 소정의 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 장소를 지칭한다. 지정된 핵산은 기준 핵산과의 정렬 (하기 참조)에 의해 규정될 수 있다.

혼성화: 상보적인 염기들 사이의 수소 결합 (왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 포함함)에 의해 올리고뉴클레오티드 및 이의 유사체가 혼성화한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소 염기로 이루어진다. 이러한 질소 염기들은 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하고, 피리미딘 대 퓨린의 결합이 "염기 쌍 형성"으로 지칭된다. 더욱 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합하고, G는 C에 수소 결합할 것이다. "상보적"은 2개의 별개의 핵산 서열, 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에서 발생하는 염기 쌍 형성을 지칭한다.

"특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정적이고 특이적인 결합이 발생하도록 하기에 충분한 정도의 상보성을 가리키는 용어이다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하기 위해 이의 표적 서열에 100％ 상보적일 필요는 없다. DNA 또는 RNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적 결합을 원하는 조건 하에, 예를 들어, 생체 내 검정법 또는 시스템의 경우에서의 생리학적 조건 하에 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 피하기에 충분한 정도의 상보성이 있을 때, 올리고뉴클레오티드가 특이적으로 혼성화가능하다. 이같은 결합은 특이적 혼성화로 지칭된다.

특정한 정도의 엄격성을 초래하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질, 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg2+ 농도)가 혼성화의 엄격성에 기여할 것이지만, 세정 시간 또한 엄격성에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격성을 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산이 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11]에 논의되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 50％ 미만의 미스매치(mismatch)가 있는 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정 수준의 엄격성을 포함한다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, "중등도 엄격성" 조건은 서열 미스매치가 50％를 초과하는 분자들이 혼성화하지 않을 조건이고; "높은 엄격성"의 조건은 미스매치가 20％를 초과하는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이며; "매우 높은 엄격성"의 조건은 미스매치가 10％를 초과하는 서열들이 혼성화하지 않을 조건이다.

특정 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 혼성화 후에 65℃에서 0.1× SSC/0.1％ SDS로 40분 동안 세정하는 것을 포함할 수 있다.

하기는 대표적인, 비제한적인 혼성화 조건이다:

매우 높은 엄격성: 65℃에서 16시간 동안의 5× SSC 완충제에서의 혼성화; 실온에서 각각 15분 동안의 2× SSC 완충제에서의 2회 세정; 및 65℃에서 각각 20분 동안의 0.5× SSC 완충제에서의 2회 세정.

높은 엄격성: 65-70℃에서 16-20시간 동안의 5×-6× SSC 완충제에서의 혼성화; 실온에서 각각 5-20분 동안의 2× SSC 완충제에서의 2회 세정; 및 55-70℃에서 각각 30분 동안의 1× SSC 완충제에서의 2회 세정.

중등도 엄격성: 실온 내지 55℃에서 16-20시간 동안의 6× SSC 완충제에서의 혼성화; 실온 내지 55℃에서 각각 20-30분 동안의 2×-3× SSC 완충제에서의 적어도 2회의 세정.

특정 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 매우 높은 엄격성의 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 이러한 실시양태 및 추가 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 높은 엄격성의 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 이러한 실시양태 및 추가 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 중등도 엄격성의 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다.

올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드는 짧은 핵산 중합체이다. 더 긴 핵산 분절의 절단에 의해 또는 개별적인 뉴클레오티드 전구체들을 중합시킴으로써 올리고뉴클레오티드가 형성될 수 있다. 자동 합성기는 염기 쌍 수백 개까지의 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성을 허용한다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이를 DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. DNA로 구성된 올리고뉴클레오티드 (올리고데옥시리보뉴클레오티드)를 소형 DNA 서열의 증폭을 위한 기술인 PCR에서 사용할 수 있다. PCR에서, 전형적으로 올리고뉴클레오티드는 DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적인 가닥을 복제하게 허용하는 "프라이머"로 지칭된다.

서열 동일성: 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서의 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정 비교 윈도우에서 최대의 상응도로 정렬되었을 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 지칭할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭할 수 있고, 여기서 비교 윈도우 내의 서열의 일부분은 기준 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)에 비교했을 때 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 부가 또는 결실 (즉, 갭(gap))을 포함할 수 있다. 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 양쪽 서열에서 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭되는 위치의 개수를 산출하고, 매칭되는 위치의 개수를 비교 윈도우 내의 위치의 총 개수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로서 백분율이 계산된다.

비교를 위해 서열들을 정렬하는 방법이 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어, 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기술되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산에 대한 상세한 고찰을, 예를 들어, 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 확인할 수 있다.

국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information) (NCBI)의 베이직 로컬 얼라인머트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST®; Altschul et al. (1990))이 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 국립 생물공학 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다) 및 인터넷을 포함하는 여러 출처로부터 입수가능하다. 이러한 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명이 인터넷 상에서 BLAST®에 대한 "도움" 섹션 하에 입수가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, BLAST® (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능을 디폴트 파라미터를 사용하여 이용할 수 있다. 기준 서열에 대한 유사성이 더 큰 핵산 서열은 이러한 방법에 의해 평가되었을 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.

작동가능하게 연결됨: 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적인 관계에 있을 때 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미칠 때 프로모터가 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 재조합에 의해 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열들은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하는 것이 필요한 경우에는 동일한 리딩 프레임 내에 있다. 그러나, 작동적으로 연결되기 위해 요소들이 인접할 필요는 없다.

프로모터: 전사에 요구되는, 일반적으로 상류에 (유전자의 5' 영역을 향해) 위치하는 DNA의 영역. 프로모터는 자신이 제어하는 유전자의 적합한 활성화 또는 억제를 허용할 수 있다. 프로모터는 전사 인자가 인식하는 특이적인 서열을 함유할 수 있다. 이러한 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합하여, RNA 중합효소 (유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소)의 동원을 초래할 수 있다.

형질전환됨: 세포 게놈 내로의 핵산 분자의 혼입에 의해 또는 에피솜 복제에 의해 핵산 분자가 세포에 의해 안정적으로 복제될 때, 세포 내로 도입된 핵산 분자에 의해 세포가 "형질전환된다". 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 이같은 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다. 예는 바이러스 벡터로의 형질감염; 플라스미드 벡터로의 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션(lipofection) (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주입 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접적인 DNA 흡수; 위스커(whisker)-매개 형질전환; 및 미세발사체 포격 (Klein et al. (1987) Nature 327:70)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

트랜스진: 외인성 핵산 서열. 한 예에서, 트랜스진은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-저항성 유전자), 산업적으로 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자이다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 안티센스 핵산 서열이고, 안티센스 핵산 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 트랜스진은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 내인성 핵산 서열 (이러한 내인성 핵산 서열의 추가적인 게놈 카피가 요구되는 경우), 또는 숙주 생물 내의 표적 핵산 분자의 서열에 대해 안티센스 배향으로 있는 핵산 서열이다.

트랜스제닉 이벤트: 이종 DNA, 즉 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물로 식물 세포를 형질전환시키고, 식물 게놈 내로의 트랜스진 삽입으로부터 초래되는 식물의 집단을 재생시키고, 특정 게놈 위치 내로의 삽입에 의해 특성화되는 특정 식물을 선택하는 것에 의해 트랜스제닉 "이벤트"가 생산된다. 용어 "이벤트"는 이종 DNA를 포함하는 원래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 형질전환체와 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 변종 사이의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친으로의 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 부모로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 측면의 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 동일한 염색체 위치에서 교배 자손 내에 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접하는 측면의 게놈 서열을 포함하는 원래의 형질전환체 및 이의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭하고, 이는 삽입된 DNA를 포함하는 한 친계(parental line) (예를 들어, 원래의 형질전환체 및 자식(selfing)으로부터 초래된 자손)와 삽입된 DNA를 함유하지 않는 친계의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA가 제공되는 자손으로 전달될 것으로 예상될 것이다.

벡터: 세포 내로 도입됨으로써, 형질전환된 세포를 생산하는 핵산 분자. 벡터는 자신이 숙주 세포 내에 복제되게 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기원을 포함할 수 있다. 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 바이러스를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 벡터는 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택 마커 유전자, 및 관련 기술 분야에 공지된 기타 유전 요소를 또한 포함할 수 있다. 벡터는 세포에 형질도입되거나, 세포를 형질감염시키거나, 또는 세포를 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하게 할 수 있다. 벡터는 세포 내로의 핵산 분자의 진입을 달성하는 것을 돕는 물질 (예를 들어, 리포솜, 단백질 코딩 등)을 임의적으로 포함한다.

달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자생물학에서의 통상적인 용어의 정의를, 예를 들어, 문헌 [Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)]에서 확인할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 관사 "a", "an", 및 "the"는 문맥이 명확하고 명백하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다.

IV. CsVMV 또는 AtUBI10 합성 양방향성 프로모터, 및 이를 포함하는 핵산

본 개시내용은 양방향성 프로모터로서 기능할 수 있는 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 1개 또는 2개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 관심 뉴클레오티드 서열(들) 중 적어도 하나 (예를 들어, 하나 또는 양쪽 모두)의 전사를 조절하도록, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터가 유전자를 코딩하는 1개 또는 2개의 관심 폴리뉴클레오티드 서열(들) (예를 들어, 프로모터의 각각의 끝부분에 하나씩 있는 2개의 유전자)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내에 CsVMV 프로모터로부터의 URS를 혼입함으로써, 특정한 발현 및 조절 패턴 (예를 들어, CsVMV 프로모터의 제어 하에 유전자가 나타내는 것)이 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 달성될 수 있다. 다른 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내에 AtUbi10 프로모터로부터의 URS를 혼입함으로써, 특정한 발현 및 조절 패턴 (예를 들어, AtUbi10 프로모터의 제어 하에 유전자가 나타내는 것)이 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열과 관련하여 달성될 수 있다.

합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 단방향성 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 유전자 (AtUbi10) 프로모터로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 환경 내로 혼입함으로써 본 발명의 일부 실시양태가 예시된다. 이러한 최소 코어 프로모터 요소는 본원에서 "minUbi10P"로 지칭되고, 약 140 bp의 길이이다. minUbi10P 요소의 시퀀싱 및 분석은 서열식별번호: 1의 minUbi10P 요소에 대해, 예를 들어, 적어도 약 75％; 적어도 약 80％; 적어도 약 85％; 적어도 약 90％; 적어도 약 91％; 적어도 약 92％; 적어도 약 93％; 적어도 약 94％; 적어도 약 95％; 적어도 약 96％; 적어도 약 97％; 적어도 약 98％; 적어도 약 99％; 및/또는 적어도 약 100％의 서열 동일성을 공유하면, 전사 개시제로서의 이의 기능을 보존할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 minUbi10P 요소의 특성은, 예를 들어, 비제한적으로, 상기 언급된 고도의 뉴클레오티드 서열 보존; 적어도 하나의 TATA 박스의 존재를 포함할 수 있다. 특히, minUbi10P 요소들이 minUbi10P 서열 내에서 중첩될 수 있다.

실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 minUbi10P 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 환경 내로 혼입하는 방법은 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터의 천연 서열에 대해 minUbi10P 요소의 배향을 역전시키면서 minUbi10P 요소를 CsVMV 프로모터 핵산 또는 AtUbi10 프로모터 핵산 내로 혼입하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 합성 CsVMV 또는 AtUbi10 양방향성 프로모터는 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있도록, CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터 뉴클레오티드 서열의 5'에 이에 대해 역배향으로 위치하는 minUbi10P 최소 코어 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, minUbi10P 요소가 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터의 5' 끝부분에 역배향으로 혼입될 수 있다.

합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 단방향성 카사바 베인 모자이크 바이러스 유전자 (CsVMV) 프로모터로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 환경 내로 혼입함으로써 본 발명의 일부 실시양태가 예시된다. 이러한 최소 코어 프로모터 요소는 본원에서 "minCsVMVP"로 지칭되고, 약 123 bp의 길이이다. minCsVMVP 요소의 시퀀싱 및 분석은 서열식별번호: 5의 minCsVMVP 요소에 대해, 예를 들어, 적어도 약 75％; 적어도 약 80％; 적어도 약 85％; 적어도 약 90％; 적어도 약 91％; 적어도 약 92％; 적어도 약 93％; 적어도 약 94％; 적어도 약 95％; 적어도 약 96％; 적어도 약 97％; 적어도 약 98％; 적어도 약 99％; 및/또는 적어도 약 100％의 서열 동일성을 공유하면, 전사 개시제로서의 기능을 보존할 수 있다. 본 발명의 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 minCsVMVP 요소의 특성은, 예를 들어, 비제한적으로, 상기 언급된 고도의 뉴클레오티드 서열 보존; 적어도 하나의 TATA 박스의 존재를 포함할 수 있다. 특히, minCsVMVP 요소들이 minCsVMVP 서열 내에서 중첩될 수 있다.

실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 minCsVMVP 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 환경 내로 혼입하는 방법은 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터의 나머지 서열에 대해 minCsVMVP 요소의 배향을 역전시키면서 minCsVMVP 요소를 CsVMV 프로모터 핵산 또는 AtUbi10 프로모터 핵산 내로 혼입하는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 합성 CsVMV 또는 AtUbi10 양방향성 프로모터는 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있도록, CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터 뉴클레오티드 서열의 5'에 이에 대해 역배향으로 위치하는 minCsVMVP 최소 코어 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, minCsVMVP 요소가 CsVMV 또는 AtUbi10 프로모터의 5' 끝부분에 역배향으로 혼입될 수 있다.

합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 minUbi10P 요소, 및 minCsVMVP를 포함하는 천연 CsVMV 프로모터의 요소에 더하여 하나 이상의 추가적인 서열 요소를 또한 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 프로모터 URS; 엑손 (예를 들어, 리더 또는 신호 펩티드); 인트론; 스페이서 서열; 및/또는 하나 이상의 상기 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 CsVMV 프로모터로부터의 URS 서열; ADH 유전자로부터의 인트론; AtUbi10 유전자로부터의 리더 펩티드를 코딩하는 엑손; AtUbi10 유전자로부터의 인트론; 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

합성 양방향성 AtUbi10 프로모터는 minCsVMVP 요소, 및 minUbi10P를 포함하는 천연 AtUbi10 프로모터의 요소에 더하여 하나 이상의 추가적인 서열 요소를 또한 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 양방향성 AtUbi10 프로모터는 프로모터 URS; 엑손 (예를 들어, 리더 또는 신호 펩티드); 인트론; 스페이서 서열; 및/또는 하나 이상의 상기 중 임의의 것의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 합성 양방향성 AtUbi10 프로모터는 AtUbi10 프로모터로부터의 URS 서열; ADH 유전자로부터의 인트론; AtUbi10 유전자로부터의 리더 펩티드를 코딩하는 엑손; AtUbi10 유전자로부터의 인트론; 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.

프로모터 URS를 포함하는 프로모터의 일부 실시양태에서, 합성 프로모터에 특정한 조절 성질을 부여하도록 URS가 선택될 수 있다. 공지된 프로모터들은 작동가능하게 연결된 유전자에 발휘하는 제어의 유형 (예를 들어, 환경 반응, 발달 신호, 및 공간 정보) 면에서 크게 다르고, 이종 프로모터 내로 혼입된 URS는 URS가 이의 천연 프로모터 및 작동가능하게 연결된 유전자(들)와 관련하여 나타내는 제어 유형을 전형적으로 유지한다. [Langridge et al. (1989), 상기 문헌]. 특성화되었고, 일부 실시양태에 따른 합성 양방향성 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 내에 포함되는 URS를 함유할 수 있는 진핵생물 프로모터의 예는, 예를 들어, 비제한적으로, 하기에 기술된 프로모터를 포함한다: 미국 특허 번호 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 5,837,848 (뿌리-특이적 프로모터); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 출원 일련 번호 09/757,089 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터).

추가적인 예시적인 원핵생물 프로모터는 노팔린 신타제 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 신타제 (OCS) 프로모터 (아그로바게리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도 플라스미드 상에 보유됨); 콜리모바이러스 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 현삼 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 신타제 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); CaMV35S (미국 특허 번호 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 번호 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 번호 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 번호 6,677,503); 및 아그로박테리움 투메파시엔스 Nos 프로모터 (진뱅크(GenBank) 등록 번호 V00087; 문헌 [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73]; [Bevan et al. (1983) Nature 304: 184-7]) 등을 포함한다.

일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 엑손을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 특정한 세포내 위치 및/또는 구획으로 표적화하거나 수송하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 실시양태 및 다른 실시양태에서, 코딩 서열 (엑손)이 나머지 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 서열과 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이에서 핵산 분자 내로 혼입될 수 있다. 이러한 요소들은 합성 CsVMV 양방향성 프로모터가 혼입된 코딩 서열에 의해 코딩되는 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드-코딩 서열 중 하나 또는 양쪽 모두)의 발현을 폴리펩티드의 나머지 부분과의 기능적인 관계로 촉진하도록 통상의 기술자의 판단에 따라 배열될 수 있다. 특정 예에서, 리더, 수송 또는 신호 펩티드 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 Ubi10 리더 펩티드)를 코딩하는 엑손이 혼입될 수 있다.

합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내로 혼입되는 엑손에 의해 코딩될 수 있는 펩티드는, 예를 들어, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 유비퀴틴 (예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나 Ubi10) 리더 펩티드; 엽록체 수송 펩티드 (CTP) (예를 들어, 에이. 탈리아나(A. thaliana) EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), 및 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida) EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)) (국제 PCT 공개 번호 WO 2008/105890에서 디캄바 모노옥시게나제 (DMO)의 엽록체 표적화에 대해 예시됨).

인트론이, 예를 들어, 나머지 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 서열과 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열 사이에서, 본 발명의 일부 실시양태에서 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내에 또한 혼입될 수 있다. 일부 예에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내로 혼입되는 인트론은, 비제한적으로, 완전히 프로세싱된 mRNA 내에 번역 개시 서열의 상류에 존재하는 번역 리더 서열로서 기능하는 5' UTR일 수 있다 (이같은 번역 리더 서열은 1차 전사체가 mRNA로 프로세싱되는 것, mRNA 안정성, 및/또는 번역 효율에 영향을 미칠 수 있다). 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 충격 단백질 리더 (미국 특허 번호 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 5' UTR의 비제한적인 예는 GmHsp (미국 특허 번호 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 번호 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtunos (진뱅크 등록 번호 V00087; 및 문헌 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다. 특정 예에서, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 인트론이 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내에 혼입될 수 있다.

합성 CsVMV 양방향성 프로모터 내로 임의적으로 혼입될 수 있는 추가적인 서열은, 예를 들어, 비제한적으로, 3' 비번역 서열; 3' 전사 종결 영역; 및 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 유전자 서열)의 하류에 위치하는 유전 요소이고, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사, mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 기타 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드를 mRNA 전구체의 3' 끝부분에 부가하는 것을 야기하는 기능을 할 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 천연 유전자로부터, 다양한 식물 유전자로부터, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비제한적인 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7)이다. 상이한 3' 비번역 영역을 사용하는 예가 문헌 [Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell 1:671-80]에서 제공된다. 폴리아데닐화 신호의 비제한적인 예는 피숨 사티붐(Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 Nos 유전자 (진뱅크 등록 번호 E01312)로부터의 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 프로모터를 포함하는 핵산을 표적 생물의 게놈 내의 특정 유전자좌로 표적화하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 예를 들어, 숙주의 게놈 DNA 서열 (예를 들어, 희귀하거나 독특한 게놈 DNA 서열)의 분절에 대해 상동성인 하나 이상의 서열이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 이러한 상동성 서열은 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 서열이 숙주 게놈 내의 상동성 DNA 부위에서 재조합 및 통합되는 것을 유도할 수 있다. 특정 예에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터는 희귀하거나 독특한 위치의 서열을 인식하고 이러한 희귀하거나 독특한 위치에서의 통합을 용이하게 하는 조작된 뉴클레아제 효소를 이용하여 프로모터를 포함하는 핵산을 숙주 게놈 내의 희귀하거나 독특한 위치로 표적화하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 아연-핑거 엔도뉴클레아제를 뉴클레아제 효소로서 사용하는 이같은 표적화된 통합 시스템이 미국 특허 출원 번호 13/011,735에 기술되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.

다른 실시양태에서, 본 개시내용은 형질을 포함하는 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 실시양태로서 추가로 포함한다. 형질은 살곤충제 저항성 형질, 제초제 내성 형질, 질소 사용 효율 형질, 용수 효율 형질, 영양 품질 형질, DNA 결합 형질, 선택 마커 형질, 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.

추가 실시양태에서, 형질이 트랜스제닉 이벤트로서 트랜스제닉 식물 세포 내에 통합된다. 추가적인 실시양태에서, 트랜스제닉 이벤트는 상품을 생산한다. 따라서, 조분, 미분, 단백질 농축물, 또는 오일로 이루어진 군으로부터 선택되는 상품인 조성물이 대상 개시내용의 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된다. 추가 실시양태에서, 상품이 검출가능한 양의 본 발명의 핵산 서열을 포함하는, 형질전환된 식물 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물에 의해 생산된 상품이 포함된다. 일부 실시양태에서, 예를 들어, 트랜스제닉 식물을 수득하고, 이로부터 식품 또는 사료를 제조함으로써, 이같은 상품이 생산될 수 있다. 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 상품은, 예를 들어, 비제한적으로, 식물의 조분, 오일, 분쇄 곡립 또는 전곡립 또는 종자, 및 본 발명의 핵산 서열 중 하나 이상을 포함하는 재조합 식물 또는 종자의 임의의 조분, 오일, 또는 분쇄 곡립 또는 전곡립을 포함하는 임의의 식품을 포함한다. 하나 이상의 원자재 또는 상품 내에서 본 발명의 서열 중 하나 이상이 검출되는 것은 이러한 원자재 또는 상품이 하나 이상의 농경학적 형질을 발현하도록 디자인된 트랜스제닉 식물로부터 생산되었다는 사실 상의 증거이다.

RCA; PCR 증폭; RT-PCR 증폭; OLA; 및 SNuPE를 예를 들어 비제한적으로 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산을 생산할 수 있다. 이러한 기술 및 다른 동등한 기술이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 비제한적으로, 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001]; 및 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998]에 추가로 상세하게 기술되어 있다. 상기 안내서 양쪽 모두를 포함하여 상기 언급된 모든 참고문헌은 문헌에서 제공된 임의의 도면, 도 및/또는 표를 포함하여 전문이 본원에 참고로 포함된다.

V. CsVMV 합성 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산 분자의 세포 전달

본 개시내용은 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 방법을 또한 제공한다. 핵산 분자를 식물 내로 도입하기 위한 관련 기술 분야에 공지된 다수의 기술 중 임의의 것을 사용하여, 예를 들어, 하나 이상의 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 숙주 식물 게놈 내로 도입하고/하거나 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심 뉴클레오티드를 추가로 도입하도록, 일부 실시양태에 따른 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시킬 수 있다.

식물의 형질전환을 위한 적절한 방법은 DNA가 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 방법, 예를 들어, 비제한적으로, 전기천공 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조); 미세발사체 포격 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,635,055, 5,824,877, 5,591,616; 5,981,840, 및 6,384,301 참조); 및 원형질체 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조)을 포함한다. 상기와 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 모든 식물 종의 세포가 안정적으로 형질전환될 수 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 기술에 의해 이러한 세포가 트랜스제닉 식물로 발달될 수 있다. 예를 들어, 목화 형질전환의 맥락에서 특히 유용할 수 있는 기술이 미국 특허 5,846,797, 5,159,135, 5,004,863, 및 6,624,344에 기술되어 있고; 특히 브라시카(Brassica) 식물을 형질전환시키기 위한 기술이, 예를 들어, 미국 특허 5,750,871에 기술되어 있으며; 대두를 형질전환시키기 위한 기술이, 예를 들어, 미국 특허 6,384,301에 기술되어 있고; 옥수수를 형질전환시키기 위한 기술이, 예를 들어, 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616, 및 국제 PCT 공개 WO 95/06722에 기술되어 있다.

외인성 핵산을 수용자 세포에 전달한 후, 일반적으로, 형질전환된 세포가 추가적인 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환체를 확인하는 능력을 개선하기 위해, 선별성 또는 스크리닝성 마커 유전자를 형질전환체를 생성시키는데 사용된 형질전환 벡터와 함께 사용하는 것을 원할 수 있다. 이러한 경우에, 잠재적으로 형질전환된 세포 집단을 세포를 선별 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 평가할 수 있거나, 또는 원하는 마커 유전자 형질에 대해 세포를 스크리닝할 수 있다.

선별 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정법에서 양성으로 채점된 세포를 식물 재생을 지지하는 배지에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함하는 것에 의해 임의의 적절한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)가 변형될 수 있다. 식물 재생 작업을 시작하도록 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 반복된 횟수의 수동 선별 후에, 조직의 형태가 재생에 적절할 때까지 (예를 들어, 적어도 2주), 조직을 성장 조절제가 있는 기본 배지에서 유지시킨 후, 출아물(shoot) 형성에 도움이 되는 배지로 옮길 수 있다. 충분한 출아물 형성이 발생했을 때까지 배양물을 주기적으로 옮긴다. 출아물이 형성되면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물을 추가 성장 및 성숙을 위해 토양으로 옮길 수 있다.

재생 식물에 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 원하는 핵산 분자가 존재하는 것을 확인하기 위해, 다양한 검정법을 수행할 수 있다. 이같은 검정법은, 예를 들어, 분자생물학적 검정법, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅 및 PCR; 생화학적 검정법, 예컨대, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯)에 의해 또는 효소 기능에 의해, 단백질 생성물의 존재를 검출하는 것; 식물 일부분 검정법, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정법; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.

표적화된 통합 이벤트를, 예를 들어, 관심 핵산 분자에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 예를 들어 사용하는 PCR 증폭에 의해, 스크리닝할 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스(callus) 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소-연쇄 반응 (PCR) 증폭에 이어지는 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하지만 이에 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법이 잘 기술되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 포함하여 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 양쪽 모두에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 조합물이 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나 또는 다중화될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 이 둘의 조합에 어닐링(annealing)하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 생산될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 결정 전략은, 예를 들어, 비제한적으로, 하기를 포함할 수 있다: 식물 게놈 내의 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 다중 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내의 비-특이적 서열의 증폭; 및 상기 중 임의의 것의 조합. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 게놈을 조사하기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가적인 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 표적에 대해 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트가 디자인될 수 있다.

예를 들어, 내부에 포함된 관심 폴리뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역에 상응하는 서열에서, 또는 핵산 분자의 다른 부분에서, 도입된 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머가 디자인될 수 있다. 이러한 프라이머가 상기 기술된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 원하는 서열에 따라 올리고뉴클레오티드 프라이머가 합성될 수 있고, 시판된다 (예를 들어, 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스 인크(Integrated DNA Technologies, Inc.), 아이오와주 코랄빌). 증폭에 클로닝 및 시퀀싱, 또는 증폭 생성물의 직접적인 서열 분석이 이어질 수 있다. 통상의 기술자는 PCR 유전자형 결정 동안 생성된 증폭 생성물의 분석을 위한 대안적인 방법을 구상할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에서 사용된다.

VI. CsVMV 합성 양방향성 프로모터를 포함하는 세포, 세포 배양물, 조직, 및 생물

본 발명의 일부 실시양태는, 예를 들어, 핵산 구축물 내에 존재할 수 있는 것과 같이, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 세포를 또한 제공한다. 특정 예에서, 일부 실시양태에 따른 합성 CsVMV 양방향성 프로모터가 식물 세포 및 식물에서의 트랜스진의 발현을 조절하는 조절 서열로서 이용될 수 있다. 일부 이같은 예에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 트랜스진)에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 프로모터의 사용은 소정의 개수의 관심 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는데 필요한 상동성 프로모터의 개수를 감소시키고/시키거나 소정의 개수의 관심 뉴클레오티드 서열을 도입하는데 요구되는 핵산 구축물(들)의 크기를 감소시킬 수 있다. 추가로, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터의 사용은 동일한 조건 (즉, CsVMV 프로모터가 활성인 조건) 하에서의 2개의 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 공동-발현을 허용할 수 있다. 이같은 예는, 예를 들어, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열 각각이 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 숙주에서의 단일 형질에 기여하고, 관심 뉴클레오티드 서열의 공동-발현이 트랜스제닉 숙주에서의 형질의 발현에 유리하게 영향을 미칠 때 특히 유용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 하나 이상의 합성 CsVMV 양방향성 프로모터(들) 및/또는 관심 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 트랜스제닉 식물은 식물에서의 관심 뉴클레오티드 서열(들)의 발현에 의해 부여된 (예를 들어, 도입된, 강화된 또는 기여된) 하나 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다. 이같은 형질은, 예를 들어, 비제한적으로 하기를 포함할 수 있다: 곤충, 기타 해충 및 질환 유발제에 대한 저항성; 제초제에 대한 내성; 강화된 안정성, 수율 또는 저장 수명; 환경 내성; 제약물질 생산; 공산품 생산; 및 영양 강화. 일부 예에서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시키는 것에 의해 바람직한 형질이 부여될 수 있다. 일부 예에서, 바람직한 형질이 육종을 통해 자손 식물로서 생산되는 식물에게 부여될 수 있고, 이러한 형질은 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 부모 식물로부터 이러한 식물에게 전달되는 합성 CsVMV 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 부여될 수 있다.

일부 실시양태에 따른 트랜스제닉 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있거나 또는 본 발명의 핵산 분자로 형질전환된 식물과 교배될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍자엽 또는 단자엽일 수 있다. 일부 예에서 사용하기 위한 쌍자엽 식물의 비제한적인 예는 알팔파; 콩; 브로콜리; 양배추; 카놀라; 당근; 콜리플라워; 셀러리; 배추; 목화; 오이; 가지; 상추; 멜론; 완두콩; 후추; 땅콩; 감자; 펌프킨(pumpkin); 무; 유채; 시금치; 대두; 호박; 사탕무; 해바라기; 담배; 토마토; 및 수박을 포함한다. 일부 예에서 사용하기 위한 단자엽 식물의 비제한적인 예는 브라키포디움(Brachypodium); 옥수수; 양파; 벼; 수수; 밀; 호밀; 기장; 사탕수수; 귀리; 라이밀; 스위치그래스(switchgrass); 및 잔디를 포함한다.

일부 실시양태에서, 합성 CsVMV 양방향성 프로모터 및/또는 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열의 존재가 바람직한 경우에 트랜스제닉 식물이 임의의 방식으로 사용 또는 재배될 수 있다. 따라서, 이같은 트랜스제닉 식물은, 특히, 본 발명에 따른 핵산 분자로 형질전환됨으로써 하나 이상의 바람직한 형질 또는 트랜스제닉 이벤트를 갖도록 조작될 수 있고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 방법으로 경작 또는 재배될 수 있다.

특정의 특별한 특색 및/또는 실시양태를 예시하도록 하기의 실시예가 제공된다. 이러한 실시예는 본 개시내용을 예시된 특별한 특색 또는 실시양태로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.

실시예

실시예 1: 카사바 베인 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터 요소의 주해

CsVMV 프로모터 (서열식별번호: 9; 도 1)는 517 bp 폴리뉴클레오티드 서열이다 (미국 특허 번호 7,053,205). 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 3개의 부분으로 나뉠 수 있다. 제1 부분은 320 bp의 5' 상류 프로모터 폴리뉴클레오티드 단편이다. 제2 부분은 이에 인접하여 5' 상류 프로모터 부분 (URS)의 하류에 위치한다. 제2 부분은 123 bp 코어 프로모터 (minCsVMVP)를 함유한다. 이러한 2개의 폴리뉴클레오티드 단편의 확인이 미국 특허 출원 번호 2005/0118432 A1에서 최초로 기술되었다. 이러한 2개의 부분에 제3 부분이 추가로 부착된다. 제3 부분은 5' 상류 프로모터 및 123 bp 코어 프로모터의 하류에 추가로 위치하는 74 bp의 5' 비번역 영역 (UTR)이다.

517 bp CsVMV 프로모터 단편의 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 9로서 제공된다. 320 bp의 5' 상류 프로모터 폴리뉴클레오티드 단편은 이탤릭체로 표시되고, 서열식별번호: 7로서 제시된다. 123 bp 코어 프로모터는 밑줄체로 표시되고, 서열식별번호: 5로서 제시된다. 74 bp 5' UTR은 볼드체로 표시되고, 서열식별번호: 6으로서 제시된다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 9가 제공된다:

실시예 2: 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴 10 (AtUBI10) 프로모터 요소의 주해

AtUbi10 프로모터 (서열식별번호: 8; 도 2)는 1,322 bp 폴리뉴클레오티드 서열이다 (Callis, J., et al., (1995) Structure and evolution of genes encoding polyubiquitin and ubiquitin-like proteins in Arabidopsis thaliana ecotype columbia, Genetics, 139(2), 921-39). 이러한 폴리뉴클레오티드 서열은 3개의 부분으로 나뉠 수 있다. 제1 부분은 812 bp의 5' 상류 프로모터 폴리뉴클레오티드 단편 (URS)이다. 제2 부분은 이에 인접하여 5' 상류 부분의 하류에 위치한다. 제2 부분은 140 bp 최소 코어 프로모터 (minUbi10P)를 함유한다. 이러한 2개의 부분에 인트론 및 5' UTR로 구성된 제3 부분이 추가로 부착된다. 5' UTR은 5' 상류 프로모터 및 140 bp 코어 프로모터의 바로 하류에 위치하는 66 bp의 5' 비번역 영역 (UTR)이다. 304 bp 인트론은 이러한 폴리뉴클레오티드 서열의 가장 하류의 끝부분에 위치한다.

1,332 bp AtUBi10 프로모터 단편의 폴리뉴클레오티드 서열이 서열식별번호: 8로서 제공된다. 812 bp의 5' 상류 프로모터 폴리뉴클레오티드 단편은 이탤릭체로 표시되고, 서열식별번호: 4로서 제시된다. 140 bp 최소 코어 프로모터는 밑줄체로 표시되고, 서열식별번호: 1로서 제시된다. 66 bp 5' UTR은 볼드체로 표시되고, 서열식별번호: 3으로서 제시된다. 304 bp 인트론은 소문자체로 표시되고, 서열식별번호: 2로서 제시된다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 8이 제공된다:

실시예 3: 양방향성 프로모터의 디자인

CsVMV 및 AtUbi10 프로모터로부터의 유전자 조절 요소를 함유한 제1 양방향성 프로모터를 디자인하였고, 이는 서열식별번호: 10으로서 제시된다. 이러한 양방향성 프로모터는 전장 AtUBI10 프로모터 (염기쌍 198-1,519)의 5' 끝부분에 역 상보적 배향으로 융합된 부분적 CsVMV 프로모터의 서열 (염기쌍 1-197)을 함유한다. 부분적 CsVMV 프로모터의 성분은 CsVMV 최소 코어 프로모터의 123 bp 영역 (염기쌍 75-197의 밑줄체; 서열식별번호: 5), 및 CsVMV 5' 비번역 영역 (염기쌍 1-74의 볼드체; 서열식별번호: 7)을 함유한다. 전장 AtUbi10 프로모터의 성분은 상류 프로모터 영역 (염기쌍 198-1009의 이탤릭체; 서열식별번호: 4), AtUbi10 최소 코어 프로모터 (염기쌍 1,010-1,149의 이중 밑줄체; 서열식별번호: 1), AtUbi10 5' 비번역 영역 (염기쌍 1,150-1,215의 밑줄친 볼드체; 서열식별번호: 3) 및 AtUbi10 인트론 (염기쌍 1,216-1519의 소문자체; 서열식별번호: 2)을 함유한다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 10이 제공된다:

AtUbi10 프로모터로부터의 유전자 조절 요소를 함유한 제2 양방향성 프로모터를 디자인하였고, 이는 서열식별번호: 11로서 제시된다. 이러한 양방향성 프로모터는 전장 AtUbi10 프로모터 (염기쌍 511-1,832; 서열식별번호: 4)의 5' 끝부분에 역 상보적 배향으로 융합된 AtUbi10 프로모터의 부분적 서열 (염기쌍 1-510)을 함유한다. 부분적 AtUbi10 프로모터의 성분은 AtUbi10 최소 코어 프로모터의 140 bp 영역 (밑줄체, 염기쌍 371-510; 서열식별번호: 1), AtUbi10 5' 비번역 영역 (볼드체, 염기쌍 305-370; 서열식별번호: 3), 및 AtUbi10 인트론 (소문자체, 염기쌍 1-304; 서열식별번호: 2)을 함유한다. 전장 AtUbi10 프로모터의 성분은 상류 프로모터 영역 (이탤릭체, 염기쌍 511-1,322; 서열식별번호: 4), AtUbi10 최소 코어 프로모터 (이중 밑줄체, 염기쌍 1,323-1,462; 서열식별번호: 1), AtUbi10 5' 비번역 영역 (밑줄친 볼드체, 염기쌍 1,463-1,528; 서열식별번호: 3), 및 AtUbi10 인트론 (밑줄친 소문자체, 염기쌍 1,529-1,832; 서열식별번호: 2)을 함유한다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 11이 제공된다:

CsVMV 및 AtUbi10 프로모터로부터의 유전자 조절 요소를 함유한 제3 양방향성 프로모터를 디자인하였고, 이는 서열식별번호: 12로서 제시된다. 이러한 양방향성 프로모터는 전장 CsVMV 프로모터 (염기쌍 511-1,027)의 5' 끝부분에 역 상보적 배향으로 융합된 부분적 AtUbi10 프로모터의 서열 (염기쌍 1-510)을 함유한다. 부분적 AtUbi10 프로모터의 성분은 AtUbi10 최소 코어 프로모터의 140 bp 영역 (밑줄체, 염기쌍 371-510; 서열식별번호: 1), AtUbi10 5' 비번역 영역 (볼드체, 염기쌍 305-370; 서열식별번호: 3), 및 AtUbi10 인트론 (소문자체, 염기쌍 1-304; 서열식별번호: 2)를 함유한다. CsVMV 프로모터의 성분은 상류 프로모터 영역 (이탤릭체, 염기쌍 511-830; 서열식별번호: 7), CsVMV 최소 코어 프로모터 (이중 밑줄체, 염기쌍 831-953; 서열식별번호: 5), 및 CsVMV 5' 비번역 영역 (밑줄친 볼드체, 염기쌍 954-1,027; 서열식별번호: 6)을 함유한다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 12가 제공된다:

CsVMV 프로모터로부터의 유전자 조절 요소를 함유한 제4 양방향성 프로모터를 디자인하였고, 이는 서열식별번호: 13으로서 제시된다. 이러한 양방향성 프로모터는 전장 CsVMV 프로모터 (염기쌍 198-714)의 5' 끝부분에 역 상보적 배향으로 융합된 CsVMV 프로모터의 부분적 서열 (염기쌍 1-197)을 함유한다. 부분적 CsVMV 프로모터의 성분은 CsVMV 최소 코어 프로모터의 123 bp 영역 (밑줄체, 염기쌍 75-197; 서열식별번호: 5), 및 CsVMV 5' 비번역 영역 (볼드체, 염기쌍 1-74; 서열식별번호: 6)을 함유한다. 전장 CsVMV 프로모터의 성분은 상류 프로모터 영역 (이탤릭체, 염기쌍 198-518; 서열식별번호: 7), CsVMV 코어 프로모터 (이중 밑줄체, 염기쌍 519-640; 서열식별번호: 5), 및 CsVMV 5' 비번역 영역 (밑줄친 볼드체, 염기쌍 641-714; 서열식별번호: 6)을 함유한다. 따라서, 하기와 같이 서열식별번호: 13이 제공된다:

실시예 4: 식물 형질전환 구축물

식물 내(in planta)에서의 양방향성 프로모터의 발현을 테스트하기 위해 식물 형질전환 구축물을 디자인하였다. 하나의 리포터 유전자를 구동시키는 최소 프로모터를 제2 리포터 유전자를 구동시키는 제1 프로모터의 상류에 제1 프로모터의 역 상보적 배향으로 삽입함으로써 최종 양방향성 프로모터 구축물이 생성되었다. 8개의 플라스미드 pDAB113192, pDAB113193, pDAB113194, pDAB113195, pDAB113196, pDAB113197, pDAB113198, 및 pDAB113199가 녹색 형광 단백질 (gfp; 에브로젠(Evrogen), 러시아 모스코바) 및 적색 형광 단백질 (rfp; 클론텍(Clontech), 캘리포니아주 마운틴뷰) 트랜스진 양쪽 모두를 구동시키는 CsVMV 및 AtUbi10 프로모터로부터의 유전자 조절 요소를 함유하도록 구축되었고, 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF 23/24 3' UTR (Barker et al., Plant Molecular Biology 1983, 2(6), 335-50) 또는 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 신타제 3' UTR로 종결되었다 (표 1). 생성된 구축물은 양방향성 프로모터의 5' 및 3' 끝부분에 작동가능하게 연결된 2개의 상이한 트랜스진을 구동시킨 단일한 양방향성 프로모터를 함유하였다. 인-퓨전(IN-FUSION)® 클로닝 프로세스를 사용하여 구축물을 조립하였고, 이는 클로닝 동안 올바른 단편 정렬을 허용하기 위해 15-20 bp 상동체가 적합한 단편 끝부분에 부가되는 것을 필요로 하였다. 이러한 식물 발현 구축물을 피엔트리11(PENTRY11)™ 선형 백본(backbone) (라이프 테크놀로지스, 캘리포니아주 칼스배드) 내로 클로닝하였다. 하이 피델리티 퓨전(High Fidelity PHUSION)® PCR (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입스위치)를 사용하여 단편을 증폭시켰다. 인퓨전® HD 에코드라이(IN-FUSION® HD ECODRY™ 클로닝 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하였고, LB (50 ㎍/ml 카나마이신) 배지에서 콜로니를 선별하였다. 퀴아젠 미니프렙 스핀 키트(Qiagen MINIPREP SPIN KIT)™ (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아) 및 퀴아젠 엔도프리® 플라스미드 맥시 키트(Qiagen ENDOFREE® Plasmid Maxi Kit) (퀴아젠)로의 미니-프렙(mini-prep) 및 맥시-프렙(maxi-prep) DNA 추출을 사용하여 플라스미드 구축물을 확인하였다.

<표 1>

rfp 및 gfp 트랜스진의 발현을 구동시키도록 구축된 양방향성 프로모터를 함유하는 구축물 (예를 들어, pDAB113192-113199)의 설명

실시예 5: 대두 식물 형질전환

상기 기술된 구축물을 사용하여 대두 식물을 형질전환시켰다. 대두 식물 (글리신 맥스 재배종 매버릭(Glycine max c.v. Maverick))을 온실에 식재하고, 26.7-30℃ 온도로 12/12 낮/밤 광주기 하에 재배하였다. 식재 5주 후 (개화 약 7일 내지 14일 후), 폭이 0.9 cm를 초과하는 대두 꼬투리를 수확하였다.

부드럽게 진탕하면서 꼬투리를 70％ 에탄올로 30초 동안 세정한 후 2방울의 트윈(TWEEN)®-20을 함유하는 10％ 표백제로 10분 동안 세정하여, 수확된 꼬투리의 표면을 멸균하였다. 표백제를 따라내고, 부드럽게 진탕하면서 외식체를 멸균수로 각각 5분 동안 3회 헹궜다. 멸균 꼬투리를 7-8일 동안 4℃에서 보관하였다.

투조(trans-illuminated) 입체경에서 꼬투리에 백라이트를 조사하여 꼬투리 내의 미성숙 배아의 위치를 결정하였다. 3 mm 내지 5 mm 길이의 배아를 형질전환에 사용하였고, 과대크기 또는 과소크기의 배아는 폐기하였다. 꼬투리의 양쪽 끝부분에서 2회 절단하고, 꼬투리의 세로로 구부러진 부분을 따라 1회 절단하였다. 세로로 절단할 때, 꼬투리 공간의 내부가 노출되도록 충분한 식물 조직을 절단해냈다. 그 후, 꼬투리를 열고, 미성숙 배아를 제거하였다. 단리된 배아를 포격 전에 4시간 동안 원형질분리(plasmolysis) 배지 (4.4 g/L MS 기본 배지 + 비타민 (M519), 73 g/L 만니톨, 73 g/L 소르비톨, 2.3 g/L 겔잔(gelzan) (겔라이트(GELRITE)®), 1 g/L 염화마그네슘) 상에 놓았다.

금 마이크로캐리어(microcarrier)를 실리콘 처리된 2 ml 튜브에서 준비하였다. 약 50 mg의 0.6 ㎛ 금 마이크로캐리어 (바이오-래드(Bio-Rad), 캘리포니아주 허큘리즈) 및 1 ml의 100％ 에탄올을 첨가하고, 2분 동안 와동시켰다. 이러한 단계 후에 1,000×g에서 4분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 그 다음, 1 ml의 70％ 에탄올을 첨가하고, 2분 동안 와동시킨 후, 때때로 와동시키면서 튜브를 15분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 제제를 1분 동안 1000×g에서 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 1분 동안 와동시키면서 1 ml의 멸균수를 첨가하고, 1분 동안 입자가 침강되게 한 후, 1800×g에서 1분 동안 원심분리하여, 입자를 헹궜다. 세정 단계를 추가로 2회 반복하였다. 생성된 펠릿 식물 물질을 50％ 멸균 글리세롤에 재현탁시켰다.

준비된 금 마이크로캐리어를 포격용 DNA로 코팅하였고, 먼저 2분 동안 와동을 통해 재현탁시키고, 50 ㎕ 용액을 실리콘 처리된 튜브 내로 옮겼다. 튜브를 와동시키면서, 하기 순서로 시약을 첨가하였다: 5 ㎕의 DNA, 50 ㎕의 2.5 M CaCl, 및 20 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘. 튜브를 닫고, 4℃에서 20분 동안 와동시켰다. 와동 후, 200 ㎕의 100％ 에탄올을 첨가하고, 1분 동안 와동시키고, 1000×g에서 1분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 에탄올 세정을 2회 더 반복하였다. 최종 펠릿을 50 ㎕의 100％ 에탄올에 재현탁시켰다.

포격 시, 9 ㎕의 와동된 DNA/금 마이크로캐리어 혼합물을 마크로캐리어(macrocarrier) 홀더 내에 위치하는 마크로캐리어의 중앙부 상에 균일한 코트로 도포하였고, 모든 포격 마크로캐리어가 코팅되었을 때까지 이러한 단계를 반복하였다. 배축면이 위를 향하고 플레이트의 중앙에 있도록 미성숙 배아를 원형질분리 배지 상에 배향시켰다. 표적으로부터 9 cm에서 63.3 kg/cm 파열 디스크를 사용하여 바이오래드 PDS-1000/HE™ 유전자 총으로 샘플을 포격하였다. 배아를 SE40 배지 (4.3 g/L MS 기본 염 (M524), 1 ml/L 감보르그(Gamborg) B5 비타민 (G249), 30 g/L 수크로스, 4 ml/L 2,4-D 10 mg/ml, 2 g/L 겔라이트®)로 옮겼다.

포격된 대두 식물 물질을 포격 후 24 내지 48시간 동안 RFP 및 GFP 필터 세트를 사용하여 DFC310FX 카메라가 있는 라이카(Leica) M165FC™ 입체경 (라이카, 독일 베츨라어)에서 영상화하였다. 이미지J(IMAGEJ)™ (W.S. 라스밴드(W.S. Rasband), 이미지J, 미국 국립 보건원(U.S. National Institutes of Health) (미국 메릴랜드주 베데스다), http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2014)를 사용하여 영상을 적색, 녹색 및 청색 채널로 분할하였고, 이때 포커스를 제시한 최상의 채널을 선택함으로써 분석 채널이 선택되었다. 원드(wand) 트레이싱 툴(tracing tool)을 사용하여 총 면적을 결정하도록 역치를 최적화하였다. 이미지J™ 내의 파인드 맥시마(Find Maxima) 기능을 사용하여 포커스를 정량하였다. 비포격 식물 물질 및 DNA 부재 하의 포격 식물 물질 대조군 플레이트를 사용하여 실험 합계로부터 배경 포커스를 차감하였다.

실시예 6: 대두에서의 일시적인 유전자 발현

대두 미성숙 배아를 상기 기술된 바와 같이 입자 포격을 사용하여 형질전환시켰다. 포격 후, 식물 물질을 24-48시간 동안 인큐베이션하고, 샘플을 DFC310FX 카메라가 있는 라이카 M165FC™ 입체경을 사용하여 가시화하고 (도 3), 이미지J™을 사용하여 포커스 카운트에 대해 분석하였다 (도 4 및 표 2).

<표 2>

대두에서의 상대적 형광 강도

도 3에서 제공된 현미경 영상 및 도 4 및 표 2에서 제공된 정량된 단백질 발현 수준은 pDAB113198 (서열식별번호: 13의 양방향성 프로모터), pDAB113199 (서열식별번호: 13의 양방향성 프로모터), pDAB113192 (서열식별번호: 11의 양방향성 프로모터), 및 pDAB113194 (서열식별번호: 10의 양방향성 프로모터)의 CsVMV 및 AtUbi10 유전자 조절 요소를 함유하는 양방향성 프로모터가 GFP & RFP 단백질 양쪽 모두의 발현을 구동시켰음을 가리킨다. 양방향성 프로모터의 발현 수준이 GFP (pDAB113188) 또는 RFP (pDAB113190)의 발현을 구동시킨 단일 프로모터 대조군에 필적한다. 또한, pDAB113198, pDAB113192, 및 pDAB113194의 양방향성 프로모터는 대조군 구축물 pDAB113188과 비교했을 때 필적하는 수준으로 GFP 발현을 구동시켰다.

실시예 7: 옥수수 형질전환

상기 기술된 구축물을 사용하여 옥수수 세포를 형질전환시켰다. 미성숙 옥수수 배아를 온실에서 성장된 제아 메이스 (재배종 B104)로부터 수득하였다. 옥수수 식물을 자가 또는 형매-수분시키고, 수분 9-12일 후에 이삭을 수확하였다. 실험 전날, 5％ 차아염소산나트륨을 함유한 가정용 표백제의 20％ 용액에 침지시켜 이삭의 표면을 멸균시키고, 20-30분 동안 진탕한 후, 멸균수로 3회 헹궜다. 멸균 후, 미성숙 접합 배아 (크기 2.0-2.4 mm)를 각각의 이삭으로부터 무균적으로 절제하고, 삼투 배지를 함유하는 2 ml 튜브 내에 수집하였다. 단리를 완료했을 때, 삼투 배지를 제거하고, 배아를 무작위로 반고체 삼투 배지로 옮겼다. 배아를 바이오리스틱(biolistic) 형질전환을 위한 적합한 표적 형식으로 배열하였다. 플레이트를 27.5℃의 연속 50 μM 저광 챔버에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

실험일에, 금 마이크로캐리어를 얼음 상에서 해동시키고, 와동시키고, 50 ㎕의 현탁된 금을 멸균된 2 ml 튜브 내로 분취함으로써, 멸균된 금 마이크로캐리어를 형질전환용으로 준비하였다. 와동시키면서, 하기의 성분을 순서대로 첨가하였다; 금 마이크로캐리어, 5 ㎕의 1.0 ㎍/㎕ 모액, 50 ㎕의 2.5 M CaCl₂, 및 20 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘. 생성된 현탁액을 4℃에서 20분 동안 와동시키고, 에탄올로 3회 세정하고, 30 ㎕의 100％ 에탄올에 재현탁시켰다. 준비된 현탁액을 포격할 때까지 얼음 상에서 보관하였다.

포격 시, 마크로캐리어의 중앙부 상에 5 ㎕의 와동된 DNA/금 마이크로캐리어 혼합물을 균일하게 도포하여 마크로캐리어를 준비하였고, 이러한 단계를 각각의 샘플에 대해 반복하였으며, 복합체를 약 10분 동안 건조시켰다. 멸균된 63.3 kg/cm 파열 디스크를 사용하여 6 cm에서 바이오래드 바이오리스틱 PDS-1000/HE 파티클 딜리버리 시스템(Biorad Biolistic PDS-1000/HE PARTICLE DELIVERY SYSTEM)™을 사용하여 포격을 행하였다.

포격 후, 플레이트를 3M 테이프(3M TAPE)™로 감싸고, 트레이 상에서 하룻밤 동안 27.5℃의 연속 50 μM 저광 조건에서 보관하였다. 24 시간 후, 타이푼® 이미징 시스템(TYPHOON® IMAGING SYSTEM (GE 헬스케어(GE Healthcare), 영국 버킹엄셔주 리틀 챌폰트)를 사용하여 일시적인 발현을 관찰하였다.

실시예 8: 옥수수에서의 일시적인 유전자 발현

옥수수 미성숙 배아를 상기 기술된 바와 같이 입자 포격을 사용하여 형질전환시켰다. 포격 24시간 후, 샘플을 타이푼® 이미징 시스템을 사용하여 가시화하였다 (도 5). 도 5에서 제공된 현미경 영상 및 도 6 및 표 3에서 제공된 정량된 단백질 발현 수준은 pDAB113198 (서열식별번호: 13의 양방향성 프로모터), pDAB113199 (서열식별번호: 13의 양방향성 프로모터), pDAB113192 (서열식별번호: 11의 양방향성 프로모터), pDAB113194 (서열식별번호: 10의 양방향성 프로모터), pDAB113193 (서열식별번호: 11의 양방향성 프로모터), pDAB113196 (서열식별번호: 12의 양방향성 프로모터), 및 pDAB113197 (서열식별번호: 12의 양방향성 프로모터)의 CsVMV 및 AtUbi10 유전자 조절 요소를 함유하는 양방향성 프로모터가 GFP & RFP 단백질 양쪽 모두의 발현을 구동시켰음을 가리킨다. 발현 데이터는 CsVMV 또는 AtUbi10 극성 프로모터와 커플링된 AtUbi10 최소 프로모터가 반대 배향에서 트랜스진의 높은 발현을 제공한다는 것을 추가로 시사한다. 이에 비해, CsVMV 최소 프로모터는 상대적으로 더 낮은 발현을 나타냈다 (도 6). GFP 또는 RFP의 발현에 대한 양방향성 프로모터의 발현 수준을 정량하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, pDAB113199, pDAB113198, pDAB113197, pDAB113196, pDAB113194, pDAB113193 및 pDAB113192의 양방향성 프로모터가 높은 발현 수준으로 GFP 발현을 구동시켰다. 또한, pDAB113199, pDAB113198, pDAB113197, pDAB113196, pDAB113193 및 pDAB113192의 양방향성 프로모터가 높은 발현 수준으로 RFP 발현을 구동시켰다.

<표 3>

옥수수에서의 상대적 형광 강도

요약하면, AtUbi10 및 CsVMV 프로모터가 대두 및 옥수수 양쪽 모두에서 기능성인 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 프로모터 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터로부터의 복수의 프로모터 요소를 포함하는 신규 합성 CsVMV 양방향성 프로모터로 전환되었다. 양방향성 프로모터로부터 수득된 제1 및 제2 관심 뉴클레오티드의 발현 수준이 단방향성 프로모터 유전자 구축물에 필적하는 것으로 보인다. 이러한 양방향성 프로모터는 양방향성 프로모터의 양쪽 끝부분에 융합된 다중 트랜스진 서열의 발현을 강건하게 구동시킨다.

다수의 예시적인 측면 및 실시양태가 상기에서 논의되었지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 이의 특정한 변형, 치환, 첨가 및 하위-조합을 인지할 것이다. 따라서, 하기의 첨부된 특허청구범위 및 이후에 도입되는 청구항이 이의 진정한 취지 및 범주 내에 있는 모든 이같은 변형, 치환, 첨가 및 하위-조합을 포함하는 것으로 해석되도록 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC <120> Synthetic Bi-Directional Plant Promoter <130> 75377 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 140 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 actttgcgtg taaacaacgc tcaatacacg tgtcatttta ttattagcta ttgcttcacc 60 gccttagctt tctcgtgacc tagtcgtcct cgtcttttct tcttcttctt ctataaaaca 120 atacccaaag cttcttcttc 140 <210> 2 <211> 304 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 gtaaatttct gtgttcctta ttctctcaaa atcttcgatt ttgttttcgt tcgatcccaa 60 tttcgtatat gttctttggt ttagattctg ttaatcttag atcgaagacg attttctggg 120 tttgatcgtt agatatcatc ttaattctcg attagggttt cataaatatc atccgatttg 180 ttcaaataat ttgagttttg tcgaataatt actcttcgat ttgtgatttc tatctagatc 240 tggtgttagt ttctagtttg tgcgatcgaa tttgtcgatt aatctgagtt tttctgatta 300 acag 304 <210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 3 acaattcaga tttcaatttc tcaaaatctt aaaaactttc tctcaattct ctctaccgtg 60 atcaag 66 <210> 4 <211> 812 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 4 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mosaic virus <400> 5 gcggaaagta accttatcac aaaggaatct tatcccccac tacttatcct tttatatttt 60 tccgtgtcat ttttgccctt gagttttcct atataaggaa ccaagttcgg catttgtgaa 120 aac 123 <210> 6 <211> 74 <212> DNA <213> Cassava vein mosaic virus <400> 6 aagaaaaaat ttggtgtaag ctattttctt tgaagtactg aggatacaac ttcagagaaa 60 tttgtaagtt tgta 74 <210> 7 <211> 320 <212> DNA <213> Cassava vein mosaic virus <400> 7 ccagaaggta attatccaag atgtagcatc aagaatccaa tgtttacggg aaaaactatg 60 gaagtattat gtgagctcag caagaagcag atcaatatgc ggcacatatg caacctatgt 120 tcaaaaatga agaatgtaca gatacaagat cctatactgc cagaatacga agaagaatac 180 gtagaaattg aaaaagaaga accaggcgaa gaaaagaatc ttgaagacgt aagcactgac 240 gacaacaatg aaaagaagaa gataaggtcg gtgattgtga aagagacata gaggacacat 300 gtaaggtgga aaatgtaagg 320 <210> 8 <211> 1322 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 8 gtcgacctgc aggtcaacgg atcaggatat tcttgtttaa gatgttgaac tctatggagg 60 tttgtatgaa ctgatgatct aggaccggat aagttccctt cttcatagcg aacttattca 120 aagaatgttt tgtgtatcat 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tgagcatctt cacccaatgg 2460 gagacaatga cctggatggg tcattcacaa gaaccttctc tctgcgtgat ggaggctact 2520 atagctctgt tgtggactca cacatgcact tcaaaagtgc cattcatcct agcatcttgc 2580 agaatggtgg acccatgttt gcctttcgaa gggtggaaga ggatcactca aacaccgaac 2640 ttggcatagt tgagtaccag catgccttca agactcctga tgcagatgct ggggaagagt 2700 gagtagttag cttaatcacc tagagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat 2760 aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 2820 tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 2880 tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 2940 gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cg 2992 <210> 23 <211> 2992 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene expression cassette of pDAB113199 <400> 23 cgatctagta acatagatga caccgcgcgc gataatttat cctagtttgc gcgctatatt 60 ttgttttcta tcgcgtatta aatgtataat tgcgggactc taatcataaa aacccatctc 120 ataaataacg tcatgcatta catgttaatt attacatgct taacgtaatt caacagaaat 180 tatatgataa tcatcgcaag accggcaaca ggattcaatc ttaagaaact ttattgccaa 240 atgtttgaac gatcggggaa attcgagctc taggtgatta agctaactac tcactcttcc 300 ccagcatctg catcaggagt cttgaaggca tgctggtact caactatgcc aagttcggtg 360 tttgagtgat cctcttccac ccttcgaaag gcaaacatgg gtccaccatt ctgcaagatg 420 ctaggatgaa tggcactttt gaagtgcatg tgtgagtcca caacagagct atagtagcct 480 ccatcacgca gagagaaggt tcttgtgaat gacccatcca ggtcattgtc tcccattggg 540 tgaagatgct caacagttgc attggatcta atgatcttgt ctgtgaagat gactgaatct 600 tctggaaagc cagttcccat cactttgaag tctcctatga ccctcccagc ctcgtaacgg 660 taagagaagg agacgtggag cactccacca tcttcatact tctcaattcg tgtgttggtg 720 taacctccat tgttgatggc atgaagaaag ggattctcat agccactcgg ataggtgcca 780 aagtgataga aaccgtaacc catgacatgg ctgagaagat acggagagaa ggtcaatgca 840 cctttggtgg acttcatctt gtttgtcatc ctcccttgtt caggtgtccc ttcgccacct 900 cccaccagtt caaactcaac accgttcaaa gtgccagtga ttctgcattc aatctccata 960 gctgggagac cactctcatc ggactccatg gagatctaac taattataca aacttacaaa 1020 tttctctgaa gttgtatcct cagtacttca aagaaaatag cttacaccaa attttttctt 1080 gttttcacaa atgccgaact tggttcctta tataggaaaa ctcaagggca aaaatgacac 1140 ggaaaaatat aaaaggataa gtagtggggg ataagattcc tttgtgataa ggttactttc 1200 cgcccagaag gtaattatcc aagatgtagc atcaagaatc caatgtttac gggaaaaact 1260 atggaagtat tatgtgagct cagcaagaag cagatcaata tgcggcacat atgcaaccta 1320 tgttcaaaaa tgaagaatgt acagatacaa gatcctatac tgccagaata cgaagaagaa 1380 tacgtagaaa ttgaaaaaga agaaccaggc gaagaaaaga atcttgaaga cgtaagcact 1440 gacgacaaca atgaaaagaa gaagataagg tcggtgattg tgaaagagac atagaggaca 1500 catgtaaggt ggaaaatgta agggcggaaa gtaaccttat cacaaaggaa tcttatcccc 1560 cactacttat ccttttatat ttttccgtgt catttttgcc cttgagtttt cctatataag 1620 gaaccaagtt cggcatttgt gaaaacaaga aaaaatttgg tgtaagctat tttctttgaa 1680 gtactgagga tacaacttca gagaaatttg taagtttgta taattagtta gatctccatg 1740 tctgaactca tcaaagagaa catgcacatg aagttgtaca tggaaggcac agtcaacaat 1800 catcacttca agtgcacatc tgagggagaa ggcaaaccct atgaaggcac tcagaccatg 1860 aagatcaaag ttgtggaagg tggaccactt ccctttgcat tcgacattct tgccacaagt 1920 ttcatgtatg ggtcaaaggc attcatcaac cacacccaag ggataccaga ctttttcaaa 1980 caaagctttc ctgaaggctt cacatgggag aggataacaa cctatgagga tggtggagtt 2040 ctgactgcca ctcaagatac ctctttccag aatggctgca ttatctacaa tgtcaagatc 2100 aatggtgtga actttccgtc caatggtcct gtcatgcaaa agaaaacaag agggtgggaa 2160 gccaacactg agatgttgta cccagctgat ggtggactga gaggacattc acaaatggct 2220 ctgaaactcg ttggtggagg ctacttgcat tgtagtttca agactaccta tcgatccaag 2280 aaaccagcca agaatctcaa gatgcctggg tttcactttg tggatcatcg tttggagagg 2340 attaaggagg ctgacaaaga aacctatgtg gagcagcatg agatggcagt tgctaagtac 2400 tgtgatcttc cgagcaaact tggacaccga tgagtagtta gcttaatcac ctagagctcg 2460 gtcaccagca taatttttat taatgtacta aattactgtt ttgttaaatg caattttgct 2520 ttctcgggat tttaatatca aaatctattt agaaatacac aatattttgt tgcaggcttg 2580 ctggagaatc gatctgctat cataaaaatt acaaaaaaat tttatttgcc tcaattattt 2640 taggattggt attaaggacg cttaaattat ttgtcgggtc actacgcatc attgtgattg 2700 agaagatcag cgatacgaaa tattcgtagt actatcgata atttatttga aaattcataa 2760 gaaaagcaaa cgttacatga attgatgaaa caatacaaag acagataaag ccacgcacat 2820 ttaggatatt ggccgagatt actgaatatt gagtaagatc acggaatttc tgacaggagc 2880 atgtcttcaa ttcagcccaa atggcagttg aaatactcaa accgccccat atgcaggagc 2940 ggatcattca ttgtttgttt ggttgccttt gccaacatgg gagtccaagg tt 2992

Claims (57)

1. 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유비퀴틴-10 프로모터 및 카사바 베인 모자이크 바이러스(Cassava Vein Mosaic Virus) 프로모터로부터의 복수의 프로모터 요소를 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
2. 제1항에 있어서, 프로모터 요소가 최소 코어(core) 프로모터를 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
3. 제2항에 있어서, 최소 코어 프로모터가 서열식별번호(SEQ ID NO): 1에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
4. 제2항에 있어서, 최소 코어 프로모터가 서열식별번호: 5에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
5. 제1항에 있어서, 프로모터 요소가 인트론을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
6. 제5항에 있어서, 인트론이 서열식별번호: 2에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
7. 제1항에 있어서, 프로모터 요소가 5'-UTR을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
8. 제7항에 있어서, 5'-UTR이 서열식별번호: 3에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
9. 제7항에 있어서, 5'-UTR이 서열식별번호: 6에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
10. 제1항에 있어서, 프로모터 요소가 상류 프로모터 요소를 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
11. 제10항에 있어서, 상류 프로모터 요소가 서열식별번호: 4에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
12. 제10항에 있어서, 상류 프로모터 요소가 서열식별번호: 7에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
13. 제1항에 있어서, 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 프로모터가 서열식별번호: 8에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
14. 제1항에 있어서, 카사바 베인 모자이크 바이러스 프로모터가 서열식별번호: 9에 대한 서열 동일성이 적어도 90％인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
15. 제1항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
16. 제1항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 10을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
17. 제1항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 11을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
18. 제1항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 12를 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
19. 제1항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 13을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
20. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 3' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제1 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
21. 제20항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 5' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제2 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 형질을 포함하는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
23. 제22항에 있어서, 형질이 살곤충제 저항성 형질, 제초제 내성 형질, 질소 사용 효율 형질, 용수 효율 형질, 영양 품질 형질, DNA 결합 형질, 선택 마커 형질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
24. a) 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트로 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
    b) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하는 단계; 및
    c) 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 식물 세포를 생산하는 단계
    를 포함하는, 트랜스제닉 식물 세포를 생산하는 방법.
25. 제24항에 있어서, 식물 세포를 형질전환시키는 단계가 식물 형질전환 방법으로 수행되는 것인 방법.
26. 제25항에 있어서, 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱스(biolistics) 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법, 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
27. 제24항에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 트랜스제닉 식물 세포 전반에 걸쳐 구성적으로 발현되는 것인 방법.
28. 제24항에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 트랜스제닉 식물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되는 것인 방법.
29. 제24항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    e) 트랜스제닉 식물 세포를 트랜스제닉 식물로 재생시키는 단계; 및
    f) 트랜스제닉 식물을 수득하고, 이러한 트랜스제닉 식물이 적어도 하나의 관심 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 제1항의 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 단계.
30. 제24항에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포가 단자엽 트랜스제닉 식물 세포 또는 쌍자엽 트랜스제닉 식물 세포인 방법.
31. 제30항에 있어서, 쌍자엽 트랜스제닉 식물 세포가 아라비돕시스(Arabidopsis) 식물 세포, 담배 식물 세포, 대두 식물 세포, 카놀라 식물 세포, 및 목화 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 단자엽 트랜스제닉 식물 세포가 옥수수 식물 세포, 벼 식물 세포, 브라키포디움(Brachypodium) 식물 세포, 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
33. 제24항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
34. 제33항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 3' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제1 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
35. 제33항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 5' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제2 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
36. 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 식물 세포에서 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키는 방법.
37. 제36항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 식물 형질전환 방법에 의해 식물 세포 내로 도입되는 것인 방법.
38. 제37항에 있어서, 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱스 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법, 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
39. 제36항에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 식물 세포 전반에 걸쳐 구성적으로 발현되는 것인 방법.
40. 제36항에 있어서, 관심 폴리뉴클레오티드 서열이 식물 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합되는 것인 방법.
41. 제36항에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포가 단자엽 식물 세포 또는 쌍자엽 식물 세포인 방법.
42. 제41항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포가 아라비돕시스 식물 세포, 담배 식물 세포, 대두 식물 세포, 카놀라 식물 세포, 및 목화 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
43. 제41항에 있어서, 단자엽 식물 세포가 옥수수 식물 세포, 벼 식물 세포, 브라키포디움 식물 세포, 및 밀 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 제36항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
45. 제36항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 3' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제1 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
46. 제36항에 있어서, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택된 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터의 5' 끝부분에 작동가능하게 연결된 제2 관심 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터.
47. 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
48. 제47항에 있어서, 트랜스제닉 이벤트를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
49. 제48항에 있어서, 트랜스제닉 이벤트가 농경학적 형질을 포함하는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
50. 제49항에 있어서, 농경학적 형질이 살곤충제 저항성 형질, 제초제 내성 형질, 질소 사용 효율 형질, 용수 효율 형질, 영양 품질 형질, DNA 결합 형질, 선택 마커 형질, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
51. 제49항에 있어서, 농경학적 형질이 제초제 내성 형질을 포함하는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
52. 제51항에 있어서, 제초제 내성 형질이 aad-1 코딩 서열을 포함하는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
53. 제47항에 있어서, 상품을 생산하는 트랜스제닉 식물 세포.
54. 제53항에 있어서, 상품이 단백질 농축물, 단백질 단리물, 곡립(grain), 조분(meal), 미분(flour), 오일 또는 섬유로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물 세포.
55. 제47항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포 또는 단자엽 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 식물 세포.
56. 제55항에 있어서, 쌍자엽 식물 세포가 대두 식물 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
57. 제47항에 있어서, 합성 CsVMV 양방향성 폴리뉴클레오티드 프로모터가 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 및 서열식별번호: 13으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물 세포.

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