KR20140107334A - 합성 양방향성 식물 프로모터 ｕｂｉ１을 위한 구축물 및 방법 - Google Patents

합성 양방향성 식물 프로모터 ｕｂｉ１을 위한 구축물 및 방법 Download PDF

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샌디프 쿠마
다이아 알라베드
테리 라이트
만주 굽타
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

식물 세포 및/또는 식물 조직에서 다중 유전자를 발현시키기 위한 구축물 및 방법이 제공된다. 제공되는 구축물은 다중 유전자 발현 카세트에 연결된 적어도 하나의 양방향성 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 구축물 및 방법은 제아 메이즈 (Zea mays) 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소, 또는 그의 기능성 동등체를 기초로 한 양방향성 프로모터를 이용한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 구축물 및 방법은 3 내지 20개의 유전자의 발현을 허용한다.

Description

합성 양방향성 식물 프로모터 ＵＢＩ１을 위한 구축물 및 방법{CONSTRUCT AND METHOD FOR SYNTHETIC BIDIRECTIONAL PLANT PROMOTER UBI1}
우선권
본원은 2011년 12월 30일 출원된 미국 특허 가출원 61/582,138의 출원일의 이익을 주장한다. 본원은 또한 2012년 3월 29일 출원된 미국 특허 가출원 61/617,252의 출원일의 이익을 주장한다.
기술 분야
본 발명은 일반적으로 식물 분자 생물학 분야, 및 보다 구체적으로 트랜스제닉 (transgenic) 식물에서 다중 유전자의 안정한 발현 분야에 관한 것이다.
많은 식물 종은 작물학상 바람직한 형질 또는 특성, 예를 들어, 영양가 품질 개선, 수율 증가, 해충 또는 질환 내성 부여, 가뭄 및 스트레스 내성 증가, 원예학적 품질 (예컨대 착색 및 성장) 개선, 제초제 내성 부여, 식물로부터 산업적으로 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산 가능, 및/또는 제약물질의 생산 가능을 도입하기 위해 다른 종으로부터의 도입유전자 (transgene)로 형질전환될 수 있다. 도입유전자의 식물 세포 내로의 도입 및 안정하게 통합된 도입유전자의 카피 (copy)를 함유하는 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 후속 회수는 바람직한 형질을 갖는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 발현의 제어 및 조절은 수많은 메카니즘을 통해 발생할 수 있다. 유전자의 전사 개시는 유전자 발현의 우세한 제어 메카니즘이다. 전사의 개시는 일반적으로 전사되는 유전자의 5'-인접 (flanking) 또는 상류 영역에 위치한 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 제어된다. 이들 서열을 종합적으로 프로모터로 언급된다. 프로모터는 일반적으로 메신저 RNA (mRNA)가 생산될 수 있도록 RNA 중합효소가 전사를 개시시키는 신호를 함유한다. 성숙 mRNA는 리보좀에 의해 번역되어 단백질을 합성한다. DNA-결합 단백질은 전사 복합체의 형성을 촉진하고 유전자 발현 과정을 개시시키기 위해 프로모터 DNA 서열과 특이적으로 상호작용한다. 식물 내에서 도입유전자의 발현을 유도하기 위해 기능성인, 식물로부터 단리되고 특성화된 다양한 진핵 프로모터가 존재한다. 환경 자극, 영양물질 이용성, 또는 열 충격, 혐기성 생활 (anaerobiosis), 또는 중금속의 존재를 비롯한 유해한 조건에 반응하여 유전자 발현에 영향을 주는 프로모터가 단리되고 특성화되었다. 또한, 발달 동안 또는 조직 또는 기관 특이적 방식으로 유전자 발현을 제어하는 프로모터가 존재한다. 또한, 식물 내에서 도입유전자의 발현을 유도하기 위해 기능성인, 박테리아 및 바이러스로부터 단리된 원핵 프로모터가 단리되고 특성화되었다.
일반적인 진핵 프로모터는 최소 프로모터 및 다른 시스 (cis)-요소로 이루어진다. 최소 프로모터는 본질적으로 RNA 중합효소 II (polII), TATA-결합 단백질 (TBP), 및 TBP-회합 인자 (TAF)가 전사를 개시시키기 위해 결합할 수 있는 TATA 박스 영역이다. 그러나, 대부분의 경우에, TATA 모티프 (motif) 이외의 다른 서열 요소가 정확한 전사를 위해 필요하다. 상기 서열 요소 (예를 들어, 인핸서)는 종종 위치- 및/또는 배향-비의존성 방식으로 가까운 유전자의 전체 발현 수준을 상승시키는 것으로 밝혀졌다. 일부의 polII 유전자의 전사 개시 부위 (예를 들어, INR 서열) 근처의 다른 서열이, 전사 활성화에 또한 기여하는 인자에 대한 대체 결합 부위를 제공할 수 있고, 심지어 별도로 기능성 TATA 요소가 결여된 프로모터에 전사를 위한 코어 프로모터 결합 부위를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zenzie-Gregory et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 2823-30]을 참조한다.
다른 유전자 조절 요소는 특이적 DNA-결합 인자와 상호작용하는 서열을 포함한다. 이들 서열 모티프는 때때로 시스-요소로 언급되고, 대체로 위치- 및 배향-의존성이지만, 이것은 유전자의 코딩 서열의 5' 또는 3'에서, 또는 인트론 내에서 발견될 수 있다. 상기 조직-특이적 또는 발달-특이적 전사 인자가 결합하는 시스-요소는 개별적으로 또는 조합하여 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 전사 수준에서 결정할 수 있다. 상류 시스-요소, 이어서 최소 프로모터의 정렬이 일반적으로 특정 프로모터의 극성을 확립한다. 클로닝되고 기본적인 연구 및 생명공학적 적용 둘 모두에 널리 사용된 식물 내의 프로모터는 일반적으로 단방향성으로서, 그의 3' 단부 (즉, 하류)에 융합된 하나의 유전자만을 유도한다. 예를 들어, 문헌 [Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9]; 미국 특허 6,388,170을 참조한다.
많은 시스-요소 (또는 "상류 조절 서열")가 식물 프로모터에서 확인되었다. 상기 시스-요소는 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 발휘하는 제어 유형에서 크게 상이하다. 일부의 요소는 환경 반응 (예를 들어, 온도, 습기, 및 상처 형성)에 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시킨다. 다른 시스-요소는 발달 신호 (예를 들어, 발아, 종자 성숙, 및 개화) 또는 공간 정보 (예를 들어, 조직 특이성)에 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23]을 참조한다. 특정 프로모터 요소의 제어의 유형은 일반적으로 프로모터의 고유한 특질이고; 즉, 상기 프로모터의 제어 하의 이종 유전자는 프로모터 요소가 그로부터 단리된 천연 유전자의 제어에 따라 발현될 것으로 보인다. 이들 요소는 또한 일반적으로 다른 요소로 교환되고 유전자 발현에 대한 그의 특징적인 고유한 제어를 유지할 수 있다.
동일한 또는 상동성 프로모터에 의해 자주 제어되는 다중 유전자를 대사 조작 및 형질 집적 (stacking)을 위해 식물 내로 도입하는 것이 종종 필요하다. 그러나, 상동성-기반 유전자 침묵화 (silencing) (HBGS)는 도입된 다중 도입유전자가 이를 유도하는 상동성 프로모터를 가질 때 발생하는 것 같다. 예를 들어, 문헌 [Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94]을 참조한다. HBGS는 트랜스제닉 식물에서 광범위하게 발생하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Vaucheret and Fagard (2001) Trends Genet. 17:29-35]을 참조한다. 여러 메카니즘이 HBGS의 현상을 설명하기 위해 제시되었고, 이들은 모두 프로모터 내의 서열 상동성이 반복된 유전자의 침묵화를 유발하는 세포 인식 메카니즘을 촉발한다는 특징을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol. 107:679-85]; [Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47:23-48]; [Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63]; [Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2]; 및 [Steimer et al. (2000) Plant Cell 12:1165-78]을 참조한다.
트랜스제닉 식물에서 HBGS를 방지하기 위한 전략은 기능적으로 동등하지만 최소 서열 상동성을 갖는 합성 프로모터의 개발을 자주 수반한다. 상기 합성 프로모터가 도입유전자를 작물 식물에서 발현시키기 위해 사용될 때, 이 프로모터는 HBGS의 방지 또는 감소를 도울 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79]; [Bhullar et al. (2003) Plant Physiol. 132:988-98]을 참조한다. 상기 프로모터는 DNA의 신규한 또는 합성 스트레치 (stretch) 내에 공지의 시스-요소를 도입함으로써, 또는 별법으로 하나의 프로모터의 도메인이 다른 이종 프로모터로부터의 기능적으로 동등한 도메인으로 교체되는 "도메인 교환 (swapping)"에 의해 생성될 수 있다.
따라서, 트랜스제닉 식물에서 육종 또는 여러 세대를 통한 도입유전자의 재조합 또는 손실 위험을 최소로 하면서 다중 도입유전자의 효과적인 안정한 발현을 위한 구축물 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.
하나의 합성 프로모터가 프로모터에 인접하는 2개의 유전자의 발현을 유도할 수 있도록 Ubi1 극성 프로모터를 합성 양방향성 프로모터로 전환하는 방법이 본원에서 설명된다. 일부 실시양태에서, Ubi1 극성 프로모터를 합성 양방향성 프로모터로 전환하는 방법은 예를 들어 Ubi1 프로모터의 최소 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열의 확인; 및/또는 반대 방향으로 배향된 2개의 최소 Ubi1 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산의 제공을 비제한적으로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 핵산은 상응하는 천연 Ubi1 유전자에 가장 가까운 각각의 최소 프로모터 요소의 단부가 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 코딩 서열에 가장 가까운 핵산의 단부 이외의 다른 최소 프로모터 요소로부터 추가로 유래되도록, 반대 방향으로 배향된 2개의 최소 Ubi1 프로모터 요소 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부의 예에서, 최소 Ubi1 프로모터 요소는 옥수수로부터 단리된다. 합성 양방향성 프로모터에 포함되도록 조작될 수 있는 천연 Ubi1 프로모터의 추가의 요소는 Ubi1 인트론, Ubi1 엑손, 및/또는 Ubi1 상류 프로모터 영역의 전부 또는 일부를 포함한다. 일부 예에서, 합성 양방향성 프로모터는 하나 초과의 임의의 상기한 것을 포함할 수 있다.
또한, 합성 프로모터 (예를 들어, 합성 양방향성 프로모터) 구축에 유용할 수 있는 Ubi1 최소 프로모터, 및 상기 방법에 의해 생산된 특정 합성 프로모터가 본원에서 설명된다. 일부 실시양태에서, 합성 양방향성 프로모터는 식물 세포에서 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어할 수 있는 프로모터이다. 예를 들어, 합성 양방향성 프로모터는 특정 실시양태에서 식물 세포 내에서 프로모터에 인접하는 2개의 작동가능하게 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 제어할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태는 Ubi1 최소 프로모터 또는 그의 기능성 동등체를 포함하는 세포 (예를 들어, 식물 세포)를 포함한다. 예를 들어, 구체적인 실시양태는 Ubi1 최소 프로모터 또는 그의 기능성 동등체를 포함하는 합성 프로모터 (예를 들어, 합성 양방향성 프로모터)를 포함하는 세포를 포함한다. 특정 실시양태에 따른 식물 세포는 세포 배양액, 조직, 식물의 일부, 및/또는 전체 식물에 존재할 수 있다. 따라서, Ubi1 최소 프로모터 또는 그의 기능성 동등체를 포함하는 세포를 포함하는 식물 (예를 들어, 외떡잎 또는 쌍떡잎)이 일부 실시양태에 포함된다.
본 발명의 일부 실시양태는 전사를 방향-비의존성 방식으로 개시시키기 위한 수단을 포함한다. 전사를 방향-비의존성 방식으로 개시시키기 위한 수단은 서열 1의 Ubi1 최소 프로모터를 포함한다. 본 발명의 일부 실시양태는 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단을 포함한다. 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단은 서열 5의 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함한다.
상기 및 다른 특징은 첨부 도면을 참고로 하여 다음 몇몇 실시양태의 상세한 설명으로부터 보다 분명해질 것이다.
또한, 식물 세포 및/또는 식물 조직에서 다중 유전자를 발현시키기 위한 구축물 및 방법이 제공된다. 제공되는 구축물은 다중 유전자 발현 카세트에 연결된 적어도 하나의 양방향성 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 구축물 및 방법은 제아 메이즈 (Zea mays) 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소, 또는 그의 기능성 동등체를 기초로 한 양방향성 프로모터를 이용한다. 일부 실시양태에서, 제공되는 구축물 및 방법은 3 내지 20개의 유전자의 발현을 허용한다.
하나의 측면에서, 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스 (Zea luxurians)의 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 한 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 또는 그의 상보체에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 본질적으로 서열 1 또는 그의 상보체로 이루어진다. 또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및 유비퀴틴-1 유전자로부터의 인트론을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 엑손 또는 인트론은 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된다.
또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴-1 유전자로부터의 상류 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 서열 4 또는 그의 상보체에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 서열 4 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 본질적으로 서열 4 또는 그의 상보체로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 상류 조절 서열 (URS), 인핸서 요소, 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 및 열 충격 컨센서스 (consensus) 요소를 포함하는 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 최소 코어 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 상류 조절 서열 (URS), 인핸서 요소, 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 최소 코어 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스로부터의 제2 최소 코어 프로모터 요소를 추가로 포함하고, 여기서 2개의 최소 코어 프로모터 요소는 폴리뉴클레오티드에서 서로에 대해 역 상보성 배향으로 존재한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및 유비퀴틴-1 유전자로부터의 인트론을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열 3 또는 그의 상보체에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열 3 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 서열 3 또는 그의 상보체로 이루어진다.
추가의 또는 대체 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 유비퀴틴-1 유전자로부터의 상류 조절 서열을 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 서열 4 또는 그의 상보체에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 서열 4 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상류 조절 서열은 본질적으로 서열 4 또는 그의 상보체로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드는 상류 조절 서열 (URS), 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 및 번역 개시 및/또는 중지 뉴클레오티드 서열을 포함하는 목록으로부터 선택되는 적어도 하나의 요소를 추가로 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 2개의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드는 상류 조절 서열 (URS), 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 번역 개시 및/또는 중지 뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 서열 5 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 본질적으로 서열 5 또는 그의 상보체로 이루어진다.
또 다른 실시양태에서, 2개의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드는 최소 코어 프로모터 요소 중 하나에 작동가능하게 연결된 관심 제1 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 합성 폴리뉴클레오티드는 관심 제1 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되지 않은 최소 코어 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 관심 제2 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
제공되는 합성 폴리뉴클레오티드의 한 실시양태에서, 엑손은 제아 종의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된다. 제공되는 합성 폴리뉴클레오티드의 한 실시양태에서, 엑손은 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 인트론은 제아 종의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에서, 인트론은 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 제아 종은 제아 메이즈이다. 또 다른 실시양태에서, 제아 종은 제아 룩수리안스이다.
또 다른 측면에서, 도입유전자 세포의 생산 방법에 제공된다. 이 방법은 세포를 본원에서 설명되는 합성 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 세포는 식물 세포이다. 또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포가 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에서 설명되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포를 포함하는 식물이 제공된다.
또 다른 측면에서, 식물 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 방향-비의존성 방식으로 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 식물 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 이 방법은 식물 세포 내로 (a) 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열; 및 (b) 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다.
추가의 또는 대체 실시양태에서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단은 서열 5 또는 그의 상보체를 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단은 서열 5를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단은 서열 5의 상보체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 DNA 내의 미리 결정된 부위로 표적화하기 위해 식물 세포 내에 도입된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열은 징크 핑거 (Zinc finger) 뉴클레아제-매개 재조합을 이용하여 미리 결정된 부위로 표적화된다.
또 다른 측면에서, 식물 세포 및/또는 조직에서 다중 유전자를 발현시키기 위한 핵산 구축물이 제공된다. 핵산 구축물은 (a) 양방향성 프로모터; 및 (b) 양방향성 프로모터의 마주보는 말단부 상의 2개의 유전자 발현 카세트를 포함하고; 여기서 적어도 하나의 유전자 발현 카세트는 번역 스위치 (switch)를 통해 연결된 2개 이상의 유전자를 포함한다.
한 실시양태에서, 핵산 구축물은 바이러스 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 바이러스 서열을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 적어도 하나의 인핸서를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 인핸서를 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 아그로박테리움 (Agrobacterium)-매개 형질전환을 위한 2성분 (binary) 벡터를 포함한다.
한 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 시스-요소 또는 상류 조절 서열 (URS), 인핸서 요소, 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열 (URS)을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 (i) 유비퀴틴 유전자의 프로모터와 상이한 프로모터 및 (ii) 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열 (URS)을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스로부터의 제2 최소 코어 프로모터를 추가로 포함하고, 2개의 최소 코어 프로모터 요소는 서로에 대해 역 상보성 배향으로 존재한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 또는 그의 상보체에 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-34로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-29로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-24로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1 및 15-19로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 최소 코어 프로모터 요소는 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가의 또는 대체 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및/또는 유비퀴틴 유전자로부터의 인트론을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 서열 3 또는 그의 상보체에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 서열 3의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 알콜 데히드로게나제 유전자로부터의 인트론을 포함한다. 한 실시양태에서, 핵산 구축물은 안정하게 트랜스제닉 식물 내로 형질전환된다. 한 실시양태에서, 식물은 외떡잎 식물이다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 쌍떡잎 식물이다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 외떡잎 식물이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 식물은 쌍떡잎 식물이 아니다.
추가의 또는 대체 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열은 서열 4 또는 그의 상보체에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 서열의 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 실시양태에서, 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열은 서열 4의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 서열 5 또는 그의 상보체에 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 양방향성 프로모터는 서열 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함한다.
한 실시양태에서, 두 유전자 발현 카세트는 모두 번역 스위치를 통해 연결된 2개 이상의 유전자를 포함한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 번역 스위치는 내부 리보좀 진입 부위 (IRES), 선택적 스플라이싱 (alternative splicing) 부위, 리보자임 (ribozyme) 절단 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 2A-유사 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 인테인 (intein)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 번역 스위치는 시스-작용성 히드롤라제 요소 (CHYSEL)를 포함한다. 추가의 실시양태에서, CHYSEL은 2A 또는 2A-유사 펩티드 서열이다. 또 다른 실시양태에서, 번역 스위치의 상류의 유전자는 번역 중지 코돈을 포함하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 적어도 4개의 유전자의 발현을 가능하게 하거나 허용한다. 추가의 실시양태에서, 모든 4개의 유전자는 도입유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 3 내지 20개의 유전자의 발현을 허용한다. 또 다른 실시양태에서, 핵산 구축물은 4 내지 8개의 유전자의 발현을 허용한다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 유전자는 도입유전자이다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 하나의 유전자 발현 카세트는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 융합 단백질은 3 내지 5개의 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, 양방향성 프로모터로부터의 유전자의 발현은 단방향성 프로모터에 비해 적어도 4배 더 높다. 일부 실시양태에서, 양방향성 프로모터로부터의 유전자의 발현은 단방향성 프로모터에 비해 3 내지 10배 더 높다. 일부 실시양태에서, 양방향성 프로모터로부터의 유전자의 발현은 단방향성 프로모터에 비해 4 내지 8배 더 높다. 일부 실시양태에서, 선택 마커 유전자는 프로모터로부터 먼 단부에 (즉, 또 다른 유전자의 하류의 유전자 발현 카세트의 3' 단부에) 위치한다.
또 다른 측면에서, 식물 세포를 본원에서 제공되는 핵산 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 식물의 생성 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 세포를 본원에서 제공되는 핵산 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 세포의 생성 방법이 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 핵산 구축물을 포함하는 식물 세포가 제공된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 핵산 구축물은 안정하게 식물 세포 내로 형질전환된다. 또 다른 측면에서, 본원에서 제공되는 핵산 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물이 제공된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 핵산 구축물은 안정하게 트랜스제닉 식물의 세포 내로 형질전환된다. 또 다른 측면에서, 식물 세포 및/또는 조직 내로 본원에서 제공되는 핵산 구축물을 도입하는 것을 포함하는, 식물 세포 및/또는 조직에서 다중 유전자의 발현 방법이 제공된다. 추가의 또는 대체 실시양태에서, 식물 세포 및/또는 조직은 안정하게 본원에서 제공되는 핵산 구축물로 형질전환된다. 또 다른 측면에서, 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 2성분 벡터가 제공된다. 한 실시양태에서, 2성분 벡터는 본원에서 제공되는 핵산 구축물을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 2성분 벡터는 본원에서 제공되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 측면에서, 식물에서 다중 도입유전자 발현을 위한, 본원에서 제공되는 양방향성 프로모터의 용도가 제공된다.
도 1은 전사 개시 부위 (TSS)의 5'에 위치하는 약 900 bp 상류 요소를 포함하는, 예시적인 (일정 비례가 아닌) 옥수수 Ubi1 (ZmUbi1) 프로모터를 보여준다. 상류 요소는 TATA 박스 (TSS의 약 -30 bp에 위치), 및 2개의 겹치는 열 충격 컨센서스 요소 (TSS의 약 -200 bp에 위치)를 포함한다. 상기 프로모터는 또한 TSS 영역의 3'에 약 1100 bp를 포함한다. 상기 3' 영역은 인접하는 리더 서열 (ZmUbi1 엑손), 및 인트론을 포함한다.
도 2는 ZmUbi1 프로모터의 상류에 (역 상보성 배향으로) 클로닝된 minUbi1P 최소 코어 요소를 포함하는, 제공된 합성 Ubi1 양방향성 프로모터의 예시적인 실시양태를 보여준다.
도 3은 합성 Ubi1 양방향성 프로모터에 각각 작동가능하게 연결된 yfp 및 GUS 유전자 발현 카세트의 예시적인 개략도를 보여준다.
도 4는 pDAB105801의 대표적인 플라스미드 지도를 보여준다.
도 5는 pDAB108706의 대표적인 플라스미드 지도를 보여준다.
도 6은 pDAB101556의 대표적인 플라스미드 지도를 보여준다.
도 7a는 제아 메이즈 Ubi1 최소 코어 프로모터 (minUbi1P)의 215 bp 영역을 포함하는 서열 1을 보여준다. 도 7b는 제아 메이즈 Ubi1 인트론을 포함하는 서열 2를 보여준다.
도 8a는 제아 메이즈 minUbi1P 최소 코어 프로모터 (밑줄친)를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역 상보체; 제아 메이즈 Ubi1 리더 (ZmUbi1 엑손; 굵은 서체); 및 제아 메이즈 Ubi1 인트론 (소문자)을 포함하는 서열 3을 보여준다. 도 8b는 제아 메이즈 Ubi1 상류 요소의 분절을 포함하는 서열 4를 보여주고, 여기서 요소 (및/또는 그의 역 상보체)는 합성 Ubi1 프로모터 내에 위치하고, minUbi1P 요소는 그의 5' 또는 3' 단부에 인접한다.
도 9는 예시적인 합성 Ubi1 양방향성 프로모터를 포함하는 서열 5를 보여주고, 여기서 제1 minUbi1P, 및 제2 minUbi1P의 역 상보체는 밑줄로 표시한다.
도 10은 합성 Ubi1 양방향성 프로모터에 의해 유도되는 yfp 및 GUS 유전자 발현 카세트를 포함하는 예시적인 핵산을 포함하는 서열 6을 보여준다.
서열 7은 YFP 정방향 프라이머 5'-GATGCCTCAG TGGGAAAGG-3'을 포함한다. 서열 8은 YFP 역방향 프라이머 5'-CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3'을 포함한다. 서열 9는 인버타제 정방향 프라이머 5'-TGGCGGACGA CGACTTGT-3'을 포함한다. 서열 10은 인버타제 역방향 프라이머 5'-AAAGTTTGGA GGCTGCCGT-3'을 포함한다. 서열 11은 인버타제 프로브 5'-CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3'을 포함한다. 서열 12는 AAD1 정방향 프라이머 5'-TGTTCGGTTC CCTCTACCAA-3'을 포함한다. 서열 13은 AAD1 역방향 프라이머 5'-CAACATCCAT CACCTTGACT GA-3'을 포함한다. 서열 14는 AAD1 프로브 5'-CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3'을 포함한다 (또한 표 7 참조).
도 11은 옥수수 T0 식물에서 양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물 (pDAB108706)에 의해 유도된 안정한 YFP 및 GUS 발현을 확인하는 대표적인 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석을 보여준다. 대표적인 식물은 Min-UbiP1 최소 코어 프로모터 요소에 의해 유도되는 잎 내의 안정한 YFP 발현을 보였다. 생산된 단백질의 양은 백만분율 (ppm)로 표시한다.
도 12는 YFP의 발현만을 유도하는 ZmUbi1 프로모터를 포함하는 대조 구축물 (pDAB101556) (GUS 코딩 서열은 상기 구축물 내에 함유되지 않는다)로부터의 안정한 YFP 및 GUS 발현을 보여주는 대표적인 웨스턴 블롯 분석을 보여준다. 생산된 단백질의 양은 백만분율 (ppm)로 표시한다.
도 13a는 4개-유전자 카세트 스택 pDAB105843 [AAD1-2A-YFP (또는 Phiyfp) + Cry34-2A-Cry35의 2개의 카세트를 보여줌] 및 pDAB105846 [YFP (또는 Phiyfp)-2A-AAD1 + Cry34-2A-Cry35의 2개의 카세트를 보여줌]의 예시적인 구축물을 보여준다. 음영진 화살표는 양방향성 프로모터로부터의 전사 방향을 나타낸다. Ubi1-minP는 옥수수 Ubi1 프로모터의 전사 개시 부위의 상류의 200nt 서열을 포함한다. Ubi1-URS는 200nt 최소 프로모터 (화살표로 제시됨)를 제외한 전사 개시 부위 사류의 서열로 이루어진 옥수수 Ubi1 프로모터 상류 조절 영역을 포함한다. Ubi1-Int는 옥수수 Ubi1 프로모터의 인트론을 포함한다. 도 13b는 pDAB108717 및 pDAB108718로부터의 4개-유전자 카세트 스택의 추가의 예시적인 2성분 구축물을 보여준다.
도 14는 본원에서 제공되는 다중 유전자 구축물의 예시적인 개략도를 보여준다. 번역 스위치는 특수 기호를 사용하여 제시된다.
도 15는 플라스미드 pDAB105818 및 pDAB105748의 대표적인 지도를 보여준다.
도 16은 플라스미드 pDAB105803 및 pDAB105840의 대표적인 지도를 보여준다.
도 17은 플라스미드 pDAB105841 및 pDAB105842의 대표적인 지도를 보여준다.
도 18은 플라스미드 pDAB105843 및 pDAB101917의 대표적인 지도를 보여준다.
도 19는 플라스미드 pDAB108717의 대표적인 지도를 보여준다.
도 20은 플라스미드 pDAB105844 및 pDAB105845의 대표적인 지도를 보여준다.
도 21은 플라스미드 pDAB105846 및 pDAB108718의 대표적인 지도를 보여준다.
도 22는 pDAB108717 (도 22a) 및 pDAB108718 (도 22b)의 Cry35에 대한 예시적인 단백질 발현 데이타를 보여준다.
도 23은 pDAB108717의 유전자 발현 카세트에 대한 핵산 서열을 보여주고, 여기서 각각의 유전자 및 요소가 제시된다.
도 24a-e는 서열 15-39의 추가의 최소 코어 프로모터 (min-Ubi1P 또는 Ubi1-minP)를 보여준다.
도 25는 피알리듐 (Phialidium) 종 SL-2003으로부터의 황색 형광 단백질에 대한 2개의 예시적인 서열 (Phiyfp, 서열 50; 및 Phiyfpv3, 서열 51)을 보여준다.
도 26은 pDAB108706 (ZMUbi 양방향 (-200)) 및 pDAB108707 (ZMUbi 양방향 (-90))을 비롯하여, 제공되는 합성 Ubi1 양방향성 프로모터 및 구축물의 예시적인 실시양태를 보여준다. pDAB101556 (ZmUbi1-YFP 대조군) 및 pDAB108716 (최소 프로모터가 없는 ZMUbi1)은 단방향성 프로모터를 갖는 대조 구축물로 기능한다.
도 27a는 YFP 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 27b는 YFP RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 28a는 GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 28b는 GUS RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 29a는 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 29b는 AAD1 RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 30a는 YFP 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108707, pDAB108706, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 57.63, 52.66, 49.75, 및 0이다. 도 30b는 YFP RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 9.96, 8.07, 6.95, 및 1.01이다.
도 31A는 GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 151.27, 143.22, 0, 및 213.17이다. 도 31B는 GUS RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 0.65, 0.78, 0, 및 3.03이다.
도 32A는 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 710.88, 1417.01, 856.58, 및 1795.43이다. 도 32B는 AAD1 RNA에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 1.33, 1.37, 1.93, 및 2.93이다.
도 33a, 33b, 및 33c는 각각 YFP, AAD1, 및 GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (V10)를 보여준다.
도 34a, 34b, 및 34c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (V10)의 통계적 분석을 보여준다. YFP (도 34a)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 71.77, 81.81, 49.58, 및 23.01이다. GUS (도 34b)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 109.63, 98.25, 0, 및 138.02이다. AAD1 (도 34c)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 666.11, 597.80, 715.12, 및 1002.84이다.
도 35a, 35b, 및 35c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (R3)를 보여준다.
도 36a, 36b, 및 36c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 도 26에 제시된 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (R3)의 통계적 분석을 보여준다. YFP (도 36a)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 91.38, 49.49, 21.67, 및 0.40이다. GUS (도 36b)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 5.52, 16.81, 1.07, 및 46.60이다. AAD1 (도 36c)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 156.71, 153.44, 165.40, 및 197.80이다.
도 37a는 4개의 구축물 pDAB105748 (ZMUbi1-YFP), pDAB105818 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1), pDAB108717 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 양방향-Cry34-Cry35), 및 pDAB108718 (AAD1/YFP-ZMUbi1 양방향-Cry34-Cry35)로부터의 Cry34 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 37b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 38a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 38b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 39a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 39b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 40a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 40b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 단백질 (ELISA)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 41은 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 PAT RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 42A는 평균값이 각각 0, 2.42, 2.67, 및 2.25인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 42B는 평균값이 각각 0, 596.94, 2044.73, 및 719.18인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 43a는 평균값이 각각 0, 1.98, 2.68, 및 2.03인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 43b는 평균값이 각각 0, 2237.54, 5763.88, 및 2379.15인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 44a는 평균값이 각각 3.59, 0, 2.78, 및 1.95인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 44b는 평균값이 각각 1420.69, 251.68, 1154.04, 및 706.04인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 45a는 평균값이 각각 0, 1.12, 3.74, 및 3.20인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 45b는 평균값이 각각 0, 283.54, 635.83, 및 90.97인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 46은 평균값이 각각 1.56, 0.07, 1.46, 및 1.01인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 PAT RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 47a, 47b, 47c, 및 47d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 예시적인 단백질 발현 결과 (V10)를 보여준다.
도 48a, 48b, 48c, 및 48d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 단백질 발현 결과 (V10)의 통계적 분석을 보여준다. YFP에 대한 평균값 (도 48a)은 각각 1033.47, 27.51, 136.18, 및 119.06이다. AAD1에 대한 평균값 (도 48b)은 각각 80.89, 1323.80, 1544.69, 및 802.50이다. Cry34에 대한 평균값 (도 48c)은 각각 0, 246.05, 1089.18, 및 769.81이다. Cry35에 대한 평균값 (도 48d)은 각각 0, 90.75, 106.09, 및 88.80이다.
도 49a, 49b, 49c, 및 49d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 예시적인 단백질 발현 결과 (R3)를 보여준다.
도 50a, 50b, 50c, 및 50d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 단백질 발현 결과 (R3)의 통계적 분석을 보여준다. YFP에 대한 평균값 (도 50a)은 각각 2589.63, 43.62, 1305.27, 및 1727.96이다. AAD1에 대한 평균값 (도 50b)은 각각 244.41, 1803.99, 1642.44, 및 1279.17이다. Cry34에 대한 평균값 (도 50c)은 각각 422.45, 7258.15, 9285.74, 및 7544.75이다. Cry35에 대한 평균값 (도 50d)은 각각 0, 373.35, 441.11, 및 348.45이다.
도 51은 pDAB108718 및 pDAB108717로부터 Cry34, Cry35, 및 AAD1의 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯의 예시적인 결과를 보여준다.
트랜스제닉 생성물의 개발은 더욱 복잡해지고 있고, 다중 도입유전자를 단일 유전자좌 내에 쌓을 것을 필요로 한다. 전통적으로 각각의 도입유전자는 대체로 발현을 위한 특유한 프로모터를 필요로 하고, 따라서 하나의 유전자 스택 내의 상이한 도입유전자를 발현시키기 위해 다중 프로모터가 요구된다. 유전자 스택의 크기를 증가시키는 것에 추가로, 이것은 동일한 형질을 제어하는 상이한 도입유전자의 유사한 수준의 발현 패턴을 얻기 위해 동일한 프로모터의 반복된 사용을 야기한다. 동일한 프로모터에 의해 유도되는 다중 유전자 구축물은 유전자 침묵화를 야기하고, 따라서 트랜스제닉 생성물의 효능이 보다 작게 만드는 것으로 당업계에 알려져 있다. 프로모터 반복에 의한 과잉의 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 고갈을 야기하여 전사 불활성화를 유도한다.
예를 들어 토세아 아시그나 (Thosea asigna) 바이러스로부터의 2A 서열을 사용하여 프로모터의 한 단부 또는 두 단부 상에서 유전자의 바이시스트론성 (bicistronic) 구조와 양방향성 프로모터 시스템을 조합하는 구축물 및 방법이 제공된다. 길이가 16-20개 아미노산에 불과한 2A 단백질은 다기능단백질 (polyprotein)을 그 자신의 카르복실-말단에서 절단한다. 2A 또는 2A-유사 펩티드의 상기 "자가-절단" 또는 "리보좀 스킵 (skip)" 특성은 트랜스제닉 식물에서 생산된 인공 다기능단백질을 프로세싱하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, Cry34 및 Cry35 유전자는 하나의 유전자 발현 카세트에서 융합되고, 여기서 YFP (또는 Phiyfp) 및 AAD1 유전자는 또 다른 유전자 발현 카세트 (각각의 조합에서 2개의 유전자 사이에 배치된 2A 단백질 유전자의 카피와 단일 개방 해독 프레임 (ORF)으로 존재함) 내로 융합된다. 예를 들어, 각각의 상기 유전자 발현 카세트 (또는 유전자 쌍)는 단일 프로모터를 사용하여 4개의 도입유전자를 유도하기 위해 양방향성 프로모터의 어느 한 단부에 배치할 수 있다. 따라서, 본원에서 제공되는 구축물 및 방법은 동일한 프로모터의 반복 사용을 방지하고 시판 구축물의 크기를 유의하게 감소시키기에 유용하다. 또한, 4개 이상의 유전자를 하나의 프로모터로 유도하는 것은 또한 단일 형질을 제어하는 유전자의 동시 발현 능력을 제공한다.
기본적인 연구 및 생명공학적 적용 둘 모두를 위해 사용된 식물 프로모터는 일반적으로 단방향성으로서, 그의 3' 단부 (즉, 하류)에서 융합된 하나의 유전자만을 유도한다. 다중 유전자를 대사 조작 및 형질 집적을 위해 식물 내로 도입하는 것이 종종 필요하고, 따라서, 다중 프로모터가 일반적으로 다중 유전자의 발현을 유도하기 위해 장래의 트랜스제닉 작물에 필요하다. 이용되는 프로모터의 수를 절감하고 유전자 집적을 위한 동시-조절된 동시 발현을 허용할 수 있는 전략을 설계하는 것이 바람직하다. 일부의 실시양태에서, 제공되는 양방향성 프로모터는 RNAi, 인공 miRNA, 또는 헤어핀 (hairpin)-루프 RNA 서열을 포함하는 다중 전사 단위의 전사를 유도할 수 있다.
이용되는 프로모터의 수를 감소시키기 위한 하나의 방안은 두 방향으로 전사를 유도할 수 있는 중요한 전사-활성화 스위치의 사용이다. 상기 프로모터는 양방향성 프로모터로 언급된다. 합성 프로모터는 상동성 기반 유전자 침묵화를 방지할 수 있는, 작물 식물에서 유전자 조작을 위해 사용되는 다중 프로모터 사이의 상동성의 수준을 제한하도록 설계될 수 있다. 인공적으로 설계된 양방향성 프로모터는 트랜스제닉 식물의 개발을 위한 유용한 도구일 수 있다. CaMV 35S 및 만노핀 합성효소 프로모터 (mas) 프로모터를 비롯한, 식물에서의 프로모터의 양방향성 기능이 일부 경우에 보고된 바 있다. 그러나, 상기 프로모터의 사용 적합성은 2개의 방향에서 유전자의 예측가능하고 안정한 동시 발현에 대해 조사되지 않았다.
다중 유전자의 대등한 (coordinate) 발현을 위한 또 다른 방법은 2개의 코딩 서열들 사이에 자가 프로세싱 특성을 갖는 짧은 개재 모티프를 함유하는 다기능단백질 전구체로 단일 개방 해독 프레임을 코딩하는 것이다. 다기능단백질 전구체의 자가촉매적 프로세싱은 비의존성 다중 단백질을 그의 동기화된 (synchronized) 대등 발현으로 방출시킨다. 합성 자가 가수분해성 2A 펩티드 서열은 2개의 도입유전자를 발현시키기 위해 식물 및 동물 시스템 둘 모두에서 이용되었다. 2A 펩티드 서열은 몇몇 공지의 바이러스에 의해 이용되고, 16-20개의 아미노산으로 이루어진다. 상기 2A 펩티드 서열은 2개의 단백질 사이의 2A를 가수분해하여 2개의 단백질 생성물을 방출시키기 위해 리보솜의 활성을 변형함으로써 동시 번역에 의해 자가-절단 (또는 리보좀 스킵)한다.
양방향성 프로모터 방안을 개재 합성 모티프를 사용하는 다기능단백질 프로세싱과 조합하는 구축물 및 방법이 제공되고, 여기서 단일 프로모터를 사용한 적어도 4개의 도입유전자의 발현은 쉽게 달성될 수 있다. Cry34 및 Cry35 유전자, 및 YFP (또는 Phiyfp) 및 AAD1의 유전자는 유전자 사이에 배치된 2A 단백질 유전자의 카피와 단일 개방 해독 프레임 (ORF)으로 유전자 발현 카세트 또는 유전자 쌍으로서 융합된다. 유전자 쌍은 하나의 단일 프로모터를 사용하여 4개의 도입유전자를 유도하기 위해 양방향성 프로모터의 어느 한 단부에 배치할 수 있다. 본원에서 제공되는 구축물 및/또는 방법은 동일한 프로모터의 반복 사용을 방지하여 잠재적인 도입유전자 침묵화 문제를 방지하기에 유용하다. 또한, 상기 도입유전자 설계 방안은 다중 도입유전자를 함유하는 도입 유전자 스택의 크기를 유의하게 감소시킬 수 있다. 4개 이상의 유전자를 하나의 프로모터로 유도하는 것은 또한 트랜스제닉 생성물의 장기간에 걸친 효능을 보장하는, 단일 형질을 제어하는 유전자의 동시 발현 능력을 제공한다.
트랜스제닉 식물의 개발은 더욱 복잡해지고 있고, 일반적으로 다중 도입유전자를 단일 유전자좌 내에 집적할 것을 필요로 한다. 문헌 [Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9]을 참조한다. 각각의 도입유전자는 대체로 발현을 위한 특유한 프로모터를 필요로 하기 때문에, 하나의 유전자 스택 내의 상이한 도입유전자를 발현시키기 위해 다중 프로모터가 요구된다. 유전자 스택의 크기를 증가시키는 것에 추가로, 이것은 상이한 도입유전자의 유사한 수준의 발현 패턴을 얻기 위해 동일한 프로모터의 반복된 사용을 자주 야기한다. 동일한 프로모터에 의해 유도되는 다중 유전자의 발현은 유전자 침묵화 또는 HBGS를 야기할 수 있기 때문에 상기 방안은 종종 문제가 된다. 반복된 프로모터 내에서 과잉의 경쟁하는 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 고갈을 야기하여 전사 하향 조절을 유도한다. 도입 유전자의 침묵화는 도입유전자를 발현시키기 위해 생산된 트랜스제닉 식물의 특성에 바람직하지 않은 영향을 줄 것으로 보인다. 도입유전자 내의 반복적인 서열은 유전자의 유전자좌내 상동성 재조합을 야기하여 폴리뉴클레오티드 재배열을 유발할 수 있다.
기본적인 연구 및 생명공학적 적용 둘 모두를 위해 사용된 식물 프로모터는 일반적으로 단방향성이고, 그의 3' 단부 (즉, 하류)에서 융합된 하나의 유전자만을 조절한다. 다양한 요구되는 형질 또는 특성을 갖는 트랜스제닉 식물을 생산하기 위해서, 요구되는 형질 및 특성을 코딩하는 도입유전자의 발현을 유도하기 위해 이용되는 프로모터의 수를 감소시키는 것이 유용할 것이다. 다중 유전자를 대사 조작 및 형질 집적을 위해 식물 내로 도입하는 것이 종종 필요하고, 이것은 다중 도입유전자의 발현을 유도하기 위한 다중 프로모터를 필요로 한다. 프로모터에 인접한 2개의 도입유전자의 발현을 유도할 수 있는 단일 합성 양방향성 프로모터를 개발함으로써, 트랜스제닉 작물의 개발을 위해 필요한 프로모터의 총수가 감소될 수 있고, 이에 의해 동일한 프로모터의 반복 사용의 감소, 트랜스제닉 구축물의 크기 감소, 및/또는 HBGS 가능성의 감소가 가능하다.
본원의 실시양태는 프로모터의 각각의 단부 상에 하나씩 존재하는 2개의 유전자의 발현을 하나의 프로모터가 유도할 수 있도록 하는 합성 양방향성 프로모터를 설계하기 위해 옥수수 유비퀴틴-1 유전자 (예를 들어, ZmUbi1)로부터의 단방향성 프로모터가 사용되는 방법을 이용한다. 본원에서 시용되는 방법은 ZmUbi1 유전자로부터 Ubi1 최소 코어 프로모터 요소 (minUbi1P)를 확인하고, 특정 합성 양방향성 프로모터를 구축하기 위해 상기 요소를 새로운 환경 (context)으로 조작하는 것을 포함할 수 있다. 예컨대 본 발명의 일부 실시양태에 따른 방법에 의해 생성될 수 있는 합성 양방향성 프로모터는 당업자가 동일한 프로모터의 반복 사용을 줄이고 트랜스제닉 구축물의 크기를 감소시키면서 식물 세포 및 식물에 도입유전자를 집적할 수 있도록 한다. 추가로, 2개의 유전자의 발현을 단일 합성 양방향성 프로모터로 조절하면, 동일한 조건 하에 2개의 유전자를 동시에 발현하는 능력을 제공할 수도 있고, 예컨대 이것은 예를 들어 2개의 유전자가 각각 숙주의 단일 형질에 기여할 때 유용할 수 있다. 식물에서 CaMV 35 프로모터 ([Barfield and Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14]; [Xie et al. (2001)], 및 만노핀 합성효소 프로모터 (mas) 프로모터 ([Velten et al. (1984) EMBO J. 3(12):2723-30]; [Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23])를 비롯한 양방향성 프로모터의 사용이 일부 경우에 보고되었다.
식물 유전자에서 전사 개시 및 유전자 발현의 조절은 집단적으로 프로모터 내에 배열된 다양한 DNA 서열 요소에 의해 이루어진다. 진핵 프로모터는 최소 코어 프로모터 요소 (minP), 및 추가의 상류 조절 서열 (URS)로 이루어진다. 코어 프로모터 요소는 정확한 전사의 개시를 유도하기에 충분한 인접한 DNA 서열의 최소 스트레치이다. 또한, 식물에서 코어 프로모터는 전사 개시와 연관된 인정된 영역, 예컨대 CAAT 및 TATA 박스를 포함한다. TATA 박스 요소는 대체로 전사 개시 부위의 약 20 내지 35개 뉴클레오티드 상류에 위치한다.
minP의 활성화는 다양한 단백질이 그에 대해 결합하고 후속적으로 전사 개시 복합체와 상호작용하는 URS에 의존한다. URS는 URS를 포함하는 프로모터의 시공간적 발현 패턴을 결정하는 DNA 서열을 포함한다. 프로모터의 극성은 종종 minP의 배향에 의해 결정되는 반면, URS는 양극성이다 (즉, 이것은 그의 배향과 무관하게 기능한다). 예를 들어, CaMV 35S 합성 단방향성 극성 프로모터는 minP를 프로모터의 5' 단부에 반대 배향으로 융합시킴으로써 양방향성 프로모터로 전환될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9]을 참조한다.
개시된 특정 약어를 표 1에 제시한다.
본 명세서에서 사용된 약어
문구 약어
비신코닌산 BCA
콜리플라워 모자이크 바이러스 CaMV
엽록체 CTP
상동성 기반 유전자 침묵화 HBGS
ZmUbi1 최소 코어 프로모터 minUbi1
올리고 라이게이션 증폭 OLA
포스페이트 완충 염수 PBS
0.05% 트윈 (Tween) 20이 존재하는 포스페이트 완충 염수 PBST
중합효소 연쇄 반응 PCR
롤링 서클 (rolling circle) 증폭 RCA
역전사효소 PCR RT-PCR
단일 뉴클레오티드 프라이머 연장 SNuPE
상류 조절 서열 URS
제아 메이즈 유비퀴틴-1 유전자 ZmUbi1
일부 실시양태의 구체적인 예에서, 제아 메이즈 순계 (inbred line)인 B73으로부터 유래된 옥수수 Ubi1 (ZmUbi1) 프로모터의 변형된 요소가, 이전에 이용가능한 양방향성 프로모터에 대해 특유한 발현 제어 특성을 제공하기 위해 식물에서 기능할 수 있는 합성 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 사용된다. 원래 B73으로부터 유래된 상기 ZmUbi1 프로모터는 전사 개시 부위의 5'의 약 899개 염기 내에, 및 추가로 전사 개시 부위의 3'의 약 1093개 염기 내에서 옥수수 게놈에 위치하는 서열을 포함한다 (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18(4):675-89 (B73 ZmUbi1 유전자를 설명함)). 일부의 예에서 사용되는 B73으로부터 유래된 변형된 ZmUbi1 프로모터는 TATA 박스; 2개의 겹치는 열 충격 컨센서스 요소; 본원에서 ZmUbi1 엑손으로 언급되는 전사 개시 부위에 바로 인접하는 82 또는 83개 뉴클레오티드 (참조 가닥에 따라) 리더 서열; 및 1015-1016개 뉴클레오티드 인트론을 함유하는 약 2 kb 프로모터이다 (예를 들어 도 1 참조). 제아 종 및 제아 메이즈 유전자형으로부터 유래된 다른 옥수수 유비퀴틴 프로모터 변이체는 TATA 요소 및 상류 열 충격 컨센서스 요소로 이루어지는 minP 요소 주위에 높은 서열 보존성을 보일 수 있다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 합성 양방향성 식물 프로모터를 구축하기 위한 최소 코어 프로모터 요소로서 ZmUbi1 프로모터의 상기 짧은 (~200 nt) 고도로 보존된 영역 (예를 들어, 서열 1)의 사용에 의해 예시된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 부정관사 ("a", "an"), 및 정관사 ("the")는 문맥상 명백하고 분명하게 단수를 표시하지 않으면, 복수의 참조물을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "역교배"는 재배자가 잡종 자손체를 다시 모체 중의 하나에, 예를 들어, 제1 세대 잡종 F1을 F1 잡종의 모 유전자형 중의 하나와 교배하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "인트론"은 전사되지만 번역되지 않는 유전자 (또는 발현되는 관심 뉴클레오티드 서열)에 포함된 임의의 핵산 서열을 의미한다. 인트론은 유전자의 일부로서 고려되지 않는 5' 단부 비번역 리더 서열과 상이하다. 인트론은 DNA의 발현된 서열 내의 비번역 핵산 서열, 및 그로부터 전사된 RNA 분자 내의 상응하는 서열을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "단리된"은 생물학적 성분 (핵산 또는 단백질 포함)이, 성분의 화학적 또는 기능적 변화에 영향을 주지 않으면서, 성분이 천연적으로 발생하는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 및 단백질)으로부터 실질적으로 분리되거나, 별개로 생산되거나 또는 정제됨을 의미한다 (예를 들어, 핵산은 핵산을 염색체 내의 나머지 DNA에 연결하는 화학적 결합을 파괴함으로써 염색체로부터 단리될 수 있다). "단리된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 문구 "단리된"은 또한 숙주 세포에서 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 및 화학적으로-합성된 핵산 분자, 단백질, 및 펩티드를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "유전자 발현"은 종종 단백질의 합성을 비롯하여, 핵산 전사 단위 (예를 들어, 게놈 DNA 포함)의 코딩 정보가 세포의 작동, 비-작동, 또는 구조적 부분으로 전환되는 과정을 의미한다. 유전자 발현은 외부 신호; 예를 들어 유전자 발현을 증가시키거나 감소시키는 작용제에 대한 세포, 조직, 또는 유기체의 노출에 의해 영향받을 수 있다. 유전자의 발현은 또한 DNA로부터 RNA 및 단백질로 이어지는 경로의 임의의 위치에서 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 대한 제어를 통해, 또는 제조 후의 특정 단백질 분자의 활성화, 불활성화, 구획화 (compartmentalization), 또는 분해를 통해, 또는 이들의 조합에 의해 이루어진다. 유전자 발현은 노던 블롯 (Northern blot), RT-PCR, 웨스턴 블롯, 또는 시험관 내, 계내 (in situ), 또는 생체 내 단백질 활성 검정(들)을 포함하고 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "상동성-기반 유전자 침묵화" (HBGS)는 전사 유전자 침묵화 및 전사후 유전자 침묵화 둘 모두를 포함하는 포괄적인 용어를 의미한다. 비연결된 침묵화 유전자좌에 의한 표적 유전자좌의 침묵화는 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 대응하는 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 의한 전사 억제 (전사 유전자 침묵화; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사후 유전자 침묵화; PTGS) 때문에 발생할 수 있다. 각각의 과정에서 별개의 세포 성분의 관여는 dsRNA-유도 TGS 및 PTGS가 아주 오래된 통상적인 메카니즘의 다양화에 의한 것일 수 있음을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS의 엄격한 비교는 달성하기 어렵고, 그 이유는 비교가 일반적으로 별개의 침묵화 유전자좌의 분석에 의존하기 때문이다. 단일 도입유전자 유전자좌는 상이한 표적 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 대응하는 dsRNA의 생산에 의해 TGS 및 PTGS 둘 모두를 촉발하는 것으로 설명될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mourrain et al. (2007) Planta 225:365-79]을 참조한다. siRNA가 상동성 서열에 대한 TGS 및 PTGS를 촉발하는 실제 분자인 것으로 보이고: siRNA는 상기 모델에서 도입유전자 서열의 메틸화의 내인성 프로모터 내로의 확산을 통해 상동성 서열의 침묵화 및 메틸화를 시스로 (in cis)로 및 트랜스로 (in trans)로 촉발할 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "핵산 분자" (또는 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드")는 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 및 이들의 합성 형태 및 혼합된 중합체의 센스 및 안티센스 (antisense) 가닥을 모두 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시뉴클레오티드, 또는 어느 한 종류의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 의미할 수 있다. 본원에서 사용되는 "핵산 분자"는 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"와 동의어이다. 핵산 분자의 길이는 달리 명시하지 않으면, 대체로 적어도 10개 염기이다. 이 용어는 불확실한 길이의 RNA 또는 DNA의 분자를 의미할 수 있다. 이 용어는 단일- 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다. 핵산 분자는 천연 생성 및/또는 비-천연 생성 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 천연 생성 및 변형된 뉴클레오티드 중의 하나 또는 둘 모두를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 당업자가 쉽게 이해할 수 있는 바와 같은 비-천연 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 상기 변형은 예를 들어 표지, 메틸화, 하나 이상의 천연 생성 뉴클레오티드의 유사체를 사용한 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 매달린 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제 (intercalator): 예를 들어, 아크리딘, 소랄렌 등; 킬레이트, 알킬화제, 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분적으로 이중체화, 삼중체화, 헤어핀, 원형 및 자물쇄 (padlocked) 입체형태를 비롯한 임의의 위상 (topological) 입체형태를 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5'에서 3' 방식으로 진행된다. 이것은 RNA가 성장하는 사슬의 3' 말단에 대한 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트의 연속적인 첨가 (피로포스페이트의 필수적인 제거와 함께)에 의해 제조됨을 의미한다. 선형 또는 환상 핵산 분자에서, 별개의 요소들 (예를 들어, 특정 뉴클레오티드 서열)은 이들이 추가의 요소로부터 5' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 추가의 요소에 대해 "상류(upstream)"인 것으로 언급될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소들은 이들이 추가의 요소로부터 3' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 추가의 요소에 대해 "하류(downstream)"인 것으로 언급될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "염기 위치"는 지정된 핵산 내의 제시된 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 의미한다. 지정된 핵산은 참조 핵산과 정렬시킴으로써 규정될 수 있다 (아래 참조).
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "혼성화"는 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 왓슨-크릭 (Watson-Crick), 훅스틴 (Hoogsteen) 또는 역 (reversed) 훅스틴 수소 결합을 포함하는, 상보성 염기 사이의 수소 결합에 의해 혼성화하는 과정을 의미한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U), 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소 염기로 이루어진다. 이들 질소 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에서 수소 결합을 형성하고, 퓨린에 대한 피리민딘의 결합을 "염기 쌍형성"으로 언급한다. 보다 구체적으로, A는 T 또는 U와 수소 결합하고, G는 C에 결합할 것이다. "상보성"은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에서 발생하는 염기 쌍형성을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보성인"은 안정하고 특이적인 결합이 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에서 발생하도록 하기에 충분한 정도의 상보성을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하기 위해 그의 표적 서열에 100% 상보성일 필요는 없다. 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 올리고뉴클레오티드의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에, 예를 들어 생체 내 검정 또는 시스템의 경우에 생리적 조건 하에 비-표적 서열에 대한 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 결합을 방지하기에 충분한 정도의 상보성이 존재하면, 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능한 것이다. 상기 결합은 특이적 혼성화로 언급된다.
특정 정도의 엄격도를 생성하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 상이할 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히 Na+ 및/또는 Mg2+ 농도)가 혼성화의 엄격도에 기여할 것이지만, 세척 시간도 엄격도에 영향을 준다. 특정 정도의 엄격도를 얻기 위해 필요한 혼성화 조건에 대한 계산은 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9 and 11]에 논의되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 50% 미만의 미스매치 (mismatch)가 존재할 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포함한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, "중등도의 엄격도" 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자가 혼성화하지 않을 조건이고; "높은 엄격도"의 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화하지 않을 조건이고; "매우 높은 엄격도"의 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화하지 않을 조건이다.
특정 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 혼성화, 이어서 65℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS로 40분 동안 세척하는 것을 포함할 수 있다.
다음은 대표적인, 비-제한적인 혼성화 조건이다:
매우 높은 엄격도: 5x SSC 완충제 내에서 65℃에서 16시간 동안의 혼성화; 2x SSC 완충제 내에서 실온에서 각각 15분 동안 2회 세척; 및 0.5x SSC 완충제 내에서 65℃에서 각각 20분 동안 2회 세척.
높은 엄격도: 5x-6x SSC 완충제 내에서 65-70℃에서 16-20시간 동안의 혼성화; 2x SSC 완충제 내에서 실온에서 각각 5-20분 동안 2회 세척; 및 1x SSC 완충제 내에서 55-70℃에서 각각 30분 동안 2회 세척.
중등도의 엄격도: 6x SSC 완충제 내에서 실온 내지 55℃에서 16-20시간 동안의 혼성화; 2x-3x SSC 완충제 내에서 실온 내지 55℃에서 각각 20-30분 동안 적어도 2회 세척.
특정 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 매우 높은 엄격도 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 이들 및 추가의 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 높은 엄격도 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다. 상기 및 추가의 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 중등도의 엄격도 혼성화 조건 하에 결합된 상태로 유지될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산 중합체를 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 분절의 절단에 의해, 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동 합성기는 수백 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드의 합성이 가능하다. 올리고뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, 이들은 DNA 또는 RNA의 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오티드)로 이루어진 올리고뉴클레오티드는 PCR (작은 DNA 서열의 증폭을 위한 기술)에서 사용될 수 있다. PCR에서, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 DNA 중합효소가 올리고뉴클레오티드를 연장하고 상보성 가닥을 복제할 수 있도록 하는 "프라이머"로 언급된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 2개의 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 특정 비교 창에 걸쳐 최대 대응도로 정렬될 때 동일한 2개의 서열 내의 잔기를 나타낼 수 있는 맥락을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "서열 동일성 비율"은 비교 창에 걸쳐 2개의 최적으로 정렬된 서열 (예를 들어, 핵산 서열, 및 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 의미하고, 여기서 비교 창 내의 서열의 일부는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않는)에 비해 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비율은 일치된 위치의 수를 생성하기 위해 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하고, 일치된 위치의 수를 비교 창 내의 위치의 총수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 비율을 생성함으로써 계산된다.
비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이 예를 들어 문헌 [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482]; [Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]; [Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444]; [Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44]; [Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3]; [Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90]; [Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65]; [Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31]; [Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50]에 기재되어 있다. 서열 정렬 방법 및 상동성 계산의 상세한 고려 사항은 예를 들어 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]에서 볼 수 있다.
내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) 베이식 로컬 얼라인먼트 써치 툴 (Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™; [Altschul et al. (1990)])은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위해 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (미국 메릴랜드주 베데스다)을 포함하는 여러 공급원으로부터 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 서열 동일성을 상기 프로그램을 사용하여 결정하는 방법에 대한 설명은 BLAST™의 "help" 섹션 하에 인터넷 상에서 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능은 디폴트 (default) 파라미터를 사용하여 이용될 수 있다. 참조 서열에 대한 훨씬 더 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 상기 방법에 의해 평가될 때 동일성 비율의 증가를 보일 것이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "작동가능하게 연결된"은 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 기능적 관계로 존재할 때 제1 핵산 서열이 제2 핵산 서열과 작동가능하게 연결되는 상황을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 프로모터가 코딩 서열의 전사 또는 발현에 영향을 줄 때 코딩 서열과 작동가능하게 연결된 것이다. 재조합 방식으로 생산될 때, 작동가능하게 연결된 핵산 서열은 일반적으로 인접하고, 2개의 단백질-코딩 영역을 연결하기 위해 필요한 경우에 동일한 해독 프레임에 존재한다. 그러나, 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "프로모터"는 전사를 위해 필요한, 일반적으로 상류에 (유전자의 5' 영역을 향해) 위치하는 DNA의 영역을 의미한다. 프로모터는 프로모터가 제어하는 유전자의 적합한 활성화 또는 억제를 허용할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특정 서열을 함유할 수 있다. 상기 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합할 수 있고, 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 중합효소의 동원을 유발한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "형질전환하다" 또는 "형질도입하다"는 바이러스 또는 벡터가 핵산 분자를 세포 내로 전달하는 과정을 의미한다. 세포는 핵산 분자가 핵산 분자의 세포 게놈 내로의 도입에 의해 또는 에피좀 복제에 의해 세포에 의해 안정하게 복제될 때 세포 내로 "형질도입"된 핵산 분자에 의해 "형질전환"된 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환"은 핵산 분자가 상기 세포 내로 도입될 수 있는 모든 기술을 포함한다. 그 예는 다음을 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 바이러스 벡터를 사용한 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용한 형질전환; 전기천공 (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-3); 리포펙션 (lipofection) (Feigner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7); 미세주입 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달 (Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7); 직접 DNA 흡수; 위스커 (whisker)-매개 형질전환; 및 미세주입 폭격 (microprojectile bombardment) (Klein et al. (1987) Nature 327:70).
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "도입유전자"는 외인성 핵산 서열을 의미한다. 하나의 예에서, 도입유전자는 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-내성 유전자), 산업적으로 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자이다. 또 다른 예에서, 도입유전자는 안티센스 핵산 서열이고, 안티센스 핵산 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 도입유전자는 도입유전자에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 핵산 서열은 도입유전자이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 핵산 서열은 내인성 핵산 서열의 추가의 게놈 카피가 요구될 경우 내인성 핵산 서열, 또는 숙주 유기체에서 표적 핵산 분자의 서열에 대해 안티센스 배향으로 존재하는 핵산 서열이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "벡터"는 세포 내로 도입되어 형질전환된 세포를 생성하는 핵산 분자를 의미한다. 벡터는 숙주 세포에서 그의 복제를 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 그 예는 외인성 DNA를 세포 내로 수송하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 벡터는 또한 하나 이상의 유전자, 안티센스 분자, 및/또는 선택가능 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전적 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입하거나, 형질전환시키거나, 또는 감염시켜, 세포가 벡터에 의해 코딩되는 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 만들 수 있다. 벡터는 임의로 핵산 분자가 세포 내로 도입되는 것을 돕는 물질 (예를 들어, 리포좀)을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "식물"은 식물 세포 및 식물 조직, 예컨대 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 꽃가루, 및 종자를 포함하고 이로 제한되지 않는 식물 및 식물의 일부를 포함한다. 본 발명에서 사용될 수 있는 식물의 클래스는 일반적으로 피자식물 (외떡잎 및 쌍떡잎 식물), 나자식물, 양치식물 및 다세포 조류를 포함하는, 돌연변이 유발에 적용될 수 있는 고등 및 하등 식물의 클래스만큼 넓다. 따라서, "식물"은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물을 포함한다. 쌍떡잎 식물의 예는 담배, 아라비돕시스 (Arabidopsis), 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 면화, 알팔파, 감자, 포도덩굴, 비둘기 콩 (pigeon pea), 콩, 브라시카 (Brassica), 이집트콩 (chickpea), 사탕무, 평지씨, 수박, 멜론, 후추, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 호박속 (squash), 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 오이, 가지, 및 상추를 포함한다. 외떡잎 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 수수, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장, 및 라이밀를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "식물 물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃 부분, 열매, 꽃가루, 난세포, 접합자, 종자, 삽목 (cutting), 세포 또는 조직 배양액, 또는 식물의 임의의 다른 부분 또는 생성물을 의미한다. 일부 실시양태에서, 식물 물질은 떡잎 및 잎을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "번역 스위치"는 바로 하류의 유전자의 번역을 허용하는, 유전자의 단부에서의 메카니즘을 나타낸다. 번역 스위치의 메카니즘은 핵산 수준 (예를 들어, 바이러스 또는 진핵 내부 리보좀 진입 부위 (IRES), 선택적 스플라이싱 부위, 또는 리보자임 절단 부위)에서 또는 펩티드/단백질 수준 (예를 들어, 2A 펩티드, 2A-유사 펩티드, 인테인 펩티드, 또는 프로테아제 절단 부위)에서 기능할 수 있다.
핵산 수준에서 또는 펩티드/단백질 수준에서 번역 스위치의 상기 메카니즘은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Li, Z., H. M. Schumacher, et al. (2010) J Biotechnol 145(1): 9-16]; [Chen, Y., K. Perumal, et al. (2000) Gene Expr 9(3): 133-143]; [Dinkova, T. D., H. Zepeda, et al. (2005) Plant J 41(5): 722-731]; [Dorokhov, Y. L., M. V. Skulachev, et al. (2002) Proc Natl Acad Sci U S A 99(8): 5301-5306]; [Fernandez-Miragall, O. and C. Hernandez (2011) PLoS One 6(7): e22617]; [Groppelli, E., G. J. Belsham, et al. (2007) J Gen Virol 88(Pt 5): 1583-1588]; [Ha, S. H., Y. S. Liang, et al. (2010) Plant Biotechnol J 8(8): 928-938]; [Karetnikov, A. and K. Lehto (2007) J Gen Virol 88(Pt 1): 286-297]; [Karetnikov, A. and K. Lehto (2008) Virology 371(2): 292-308]; [Khan, M. A., H. Yumak, et al. (2009) J Biol Chem 284(51): 35461-35470]; 및 [Koh, D. C, S. M. Wong, et al. (2003) J Biol Chem 278(23): 20565-20573]을 참조하고, 그 내용은 전체를 본원에 참고로 포함된다. 변형된 인테인을 함유하는 다중 유전자 발현 구축물은 미국 특허 7,026,526 및 7,741,530, 및 미국 특허 출원 2008/0115243에 개시되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 문구 "선택가능 마커" 또는 "선택가능 마커 유전자"는 예를 들어 식물 세포를 선택적인 작용제로부터 보호하거나 또는 선택적인 작용제에 대한 내성/저항성을 제공하기 위해 식물 형질전환에 임의로 사용되는 유전자를 의미한다. 기능성 선택가능 마커를 보유한 세포 또는 식물만이 선택적인 작용제를 갖는 조건 하에서 분열하거나 성장할 수 있다. 선택적인 작용제의 예는 예를 들어 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 히그로마이신을 포함하는 항생제를 포함할 수 있다. 상기 선택가능 마커는 항생제 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II)의 유전자, 및 관련 항생제 네오마이신, 파로모마이신, 겐타미신, 및 G418의 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)의 유전자를 포함한다. 다른 선택가능 마커 유전자는 Bar (BASTA® (글루포시네이트 암모늄), 또는 포스피노트리신 (PPT)에 대한 내성), 아세토락테이트 합성효소 (ALS; 억제제, 예컨대 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB), 및 분지쇄 아미노산의 합성의 제1 단계를 억제하는 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논에 대한 내성), 글리포세이트, 2,4-D, 및 금속 내성 또는 감수성을 비롯한 제초제 내성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 문구 "마커-양성"은 선택가능 마커 유전자를 포함하도록 형질전환된 식물을 나타낸다.
다양한 선택가능 또는 검출가능한 마커가 형질전환된 식물, 또는 형질전환체의 확인 및 선택을 허용하기 위해 선택된 발현 벡터 내로 도입될 수 있다. 예를 들어 DNA 서열 결정 및 PCR (중합효소 연쇄 반응), 서던 (Southern) 블로팅, RNA 블로팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예를 들어 포스피노트리신 내성을 매개하는 침전된 단백질, 또는 다른 단백질, 예컨대 리포터 유전자 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시퍼라제, 초록 형광 단백질 (GFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등의 검출을 위한 면역학적 방법을 비롯하여 형질전환된 식물에서 선택 마커의 발현을 확인하기 위해 많은 방법이 이용가능하다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] 참조).
선택가능 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택을 위해 이용된다. 선택가능 마커 유전자는 항생제 내성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자 및 제초제 화합물에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로 제초제에 불감성인 변형된 표적 단백질 또는 제초제가 작용할 수 있기 전에 식물 내에서 제초제를 분해하거나 해독하는 효소를 코딩한다. 예를 들어, 글리포세이트에 대한 내성은 돌연변이체 표적 효소인 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 얻었다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 미국 특허 4,940,835, 5,188,642, 5,310,667, 5,633,435, 5,633,448, 및 6,566,587에 개시되었다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐, 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 내성은 각각의 제초제를 해독하는 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 니트릴라제 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제를 코딩하는 박테리아 유전자를 사용함으로써 얻었다. 글루포시네이트 내성/저항성을 위한 효소/유전자는 미국 특허 5,273,894, 5,276,268, 5,550,318, 및 5,561,236에 개시되었다. 2,4-D 내성을 위한 효소/유전자는 이전에 미국 특허 6,100,446 및 6,153,401, 및 특허 출원 US 2009/0093366 및 WO 2007/053482에 개시되었다. 니트릴라제에 대한 효소/유전자는 이전에 미국 특허 4,810,648에 개시되었다.
이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 비롯한 다른 제초제는 생장점 또는 분열 조직을 억제할 수 있고, 이들 제초제에 대한 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS) 및 아세토락테이트 합성효소 (ALS)의 내성/저항성을 위한 유전자가 설명되었다. AHAS 및 돌연변이체에 대한 유전자 및 돌연변이체는 미국 특허 4,761,373, 5,304,732, 5,331,107, 5,853,973, 및 5,928,937에 개시되었다. ALS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 미국 특허 5,013,659 및 5,141,870에 개시되었다.
글리포세이트 내성 유전자는 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSP) 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자의 다양한 형태의 생체 내 돌연변이 유발을 통해), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자를 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 내성 유전자는 글루포시네이트 (스트렙토마이세스 히그로스코피쿠스 (Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토마이세스 비리디크로모게네스 (Streptomyces viridichromogenes)를 비롯한 스트렙토마이세스 종으로부터의 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (PAT) 유전자), 및 피리디녹시 또는 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 (ACCas)의 제초제 내성/저항성 유전자는 미국 특허 5,162,602 및 5,498,544에 설명되어 있다.
돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 기탁 번호 39256 하에 얻을 수 있고, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 제초제, 예컨대 L-포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 글루타민 합성효소 유전자의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 4,769,061 (코마이 (Comai)), 유럽 특허 출원 0 333 033 (쿠마다 (Kumada) 등), 및 미국 특허 4,975,374 (굿맨 (Goodman) 등)에 개시되어 있다. PAT 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 특허 출원 0 242 246 (리만스 (Leemans) 등)에 제시되어 있다. 또한, 문헌 [DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)]에서는 PAT 활성을 코딩하는 키메릭 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산을 설명하고 있다. 세톡시딤 및 할록시폽을 비롯하여 페녹시 프로피온산 및 시클로헥손에 대한 내성을 부여하는 예시적인 유전자는 문헌 [Marshall et al., Theon. Appl. Genet. 83:435 (1992)]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다. 글리포세이트 내성을 부여할 수 있는 GAT 유전자는 WO 2005012515 (Castle 등)에 기재되어 있다. 2,4-D, 폽 (fop) 및 피리딜옥시 옥신 제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자는 WO 2005107437 및 미국 특허 출원 11/587,893에 기재되어 있다.
트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)를 비롯한 다른 제초제는 광합성을 억제할 수 있다. 문헌 [Przibila et al., Plant Cell 3: 169 (1991)]에서는 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스 (Chlamydomonas)의 형질전환)을 설명하고 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648 (스톨커 (Stalker))에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 기탁 번호 53435, 67441, 및 67442 하에 이용가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에 기재되어 있다.
본 발명의 목적에서, 선택가능 마커 유전자는 다음을 코딩하는 유전자를 포함하고, 이로 제한되지 않는다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25); 시안아미드 히드라타제 (Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264); 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 합성효소 (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); 트립토판 데카르복실라제 (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912); 디히드로디피콜리네이트 합성효소 및 탈감작화된 (desensitized) 아스파르테이트 키나제 (Perl et al. (1993) Bio/Technology, 11:715-718); bar 유전자 ([Toki et al. (1992) Plant Physiol., 100: 1503-1507] 및 [Meagher et al. (1996), Crop Sci., 36: 1367]); 트립토판 데카르복실라제 (Goddijn et al. (1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO) (Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG) (Shimizu et al. (1986) Mol. Cell Biol., 6: 1074); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHF) (Kwok et al. (1986) PNAS USA 4552); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513); 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제 (Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochem. 13D:330); 아세토히드록시산 합성효소 (앤더슨 (Anderson) 등, 미국 특허 4,761,373; [Haughn et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266]); 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 합성효소 (aroA) (Comai et al. (1985) Nature 317:741); 할로아릴니트릴라제 (스톨커 등, PCT 출원 공개 WO87/04181); 아세틸-보조효소 A 카르복실라제 (Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92: 1220); 디히드로프테로에이트 합성효소 (sulI) (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15: 127); 및 32 kD 광시스템 II 폴리펩티드 (psbA) (Hirschberg et al. (1983) Science, 222: 1346).
또한, 다음에 대한 내성을 코딩하는 유전자가 포함된다: 클로람페니콜 (Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J., 2:987-992); 메토트렉세이트 ([Herrera-Estrella et al. (1983) Nature, 303:209-213]; [Meijer et al. (1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)]); 히그로마이신 ([Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol., 5: 103-108]; [Zhijian et al. (1995) Plant Science, 108:219-227] 및 [Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820]); 스트렙토마이신 (Jones et al. (1987) Mol. Gen. Genet., 210:86-91); 스펙티노마이신 (Bretagne-Sagnard et al. (1996) Transgenic Res., 5: 131-137); 블레오마이신 (Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol., 7: 171-176); 술폰아미드 (Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio., 15: 127-136); 브로목시닐 (Stalker et al. (1988) Science, 242:419-423); 2,4-D (Streber et al. (1989) Bio/Technology, 7:811-816); 글리포세이트 (Shaw et al. (1986) Science, 233:478-481); 및 포스피노트리신 (DeBlock et al. (1987) EMBO J., 6:2513-2518).
선택가능 마커 및 리포터 유전자의 상기 목록은 제한적인 의미로 의도되지 않는다. 임의의 리포터 또는 선택가능 마커 유전자가 본 발명에 포함된다. 필요하다면, 상기 유전자는 당업계에 공지된 방법에 의해 서열이 결정될 수 있다.
리포터 및 선택가능 마커 유전자는 식물에서의 최적 발현을 위해 합성된다. 즉, 유전자의 코딩 서열은 식물에서 발현을 향상시키기 위해 변형된다. 합성 마커 유전자는 식물에서 보다 높은 수준으로 발현되어 보다 높은 형질전환 효율을 보이도록 설계된다. 유전자의 합성 최적화를 위한 방법은 당업계에서 이용가능하다. 실제로, 여러 유전자가 식물 내에서 유전자 생성물의 발현을 증가시키도록 최적화되었다.
마커 유전자 서열은 특정 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나 또는 별법으로 식물 패밀리에서의 최적 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물에 바람직한 코돈은 관심 특정 식물 종에서 최대량으로 발현되는 단백질의 최고 빈도의 코돈으로부터 결정할 수 있다. 예를 들어, EPA 0359472; EPA 0385962; WO 91/16432; 문헌 [Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328]; 및 [Murray et al. (1989) Nucleic Acids Research, 17: 477-498]; 미국 특허 5,380,831; 및 미국 특허 5,436,391을 참조한다. 상기 방식에서, 뉴클레오티드 서열은 임의의 식물에서의 발현을 위해 최적화될 수 있다. 유전자 서열의 모든 또는 임의의 부분이 최적화되거나 또는 합성될 수 있음이 인정된다. 즉, 완전히 최적화되거나 부분적으로 최적화된 서열도 사용될 수 있다.
제초제에 대한 내성을 부여하는 유전자:
A. 제초제 이미다졸리논 또는 술포닐우레아에 대한 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS) 및 아세토락테이트 합성효소 (ALS)의 내성/저항성. AHAS 및 돌연변이체에 대한 유전자 및 돌연변이체는 미국 특허 4,761,373, 5,304,732, 5,331,107, 5,853,973, 및 5,928,937에 개시되었다. ALS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 미국 특허 5,013,659 및 5,141,870에 개시되었다.
B. 제초제 시클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로판산 (할록시폽, 디클로폽, 페녹시프롭, 플루아지폽, 퀴잘로폽 포함)에 대한 아세틸 보조효소 A 카르복실라제 (ACCas)의 내성/저항성 유전자는 미국 특허 5,162,602 및 5,498,544에 설명되어 있다.
C. 글리포세이트 내성/저항성을 위한 유전자. 5-에놀피루빌-3-포스포쉬키메이트 합성효소 (ES3P 합성효소)의 유전자는 미국 특허 4,769,601에 설명되어 있다. 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소 (EPSPS) 및 돌연변이체의 유전자는 미국 특허 4,940,835, 5,188,642, 5,310,667, 5,633,435, 5,633,448, 및 6,566,587에 설명되어 있다.
D. 글루포시네이트 (비알라포스, 포스피노트리신 (PPT)) 내성/저항성을 위한 유전자. 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (Pat)에 대한 유전자는 미국 특허 5,273,894, 5,276,268, 및 5,550,318에 설명되어 있고; 비알라포스 내성 (Bar)에 대한 유전자는 미국 특허 5,561,236 및 5,646,024, 5,648,477, 및 7,112,665에 설명되어 있다. 글루타민 합성효소 (GS)에 대한 유전자는 미국 특허 4,975,372 및 유럽 특허 출원 EP 0333033 A1에 설명되어 있다.
E. 술코트리온 및 메소트리온을 비롯한 제초제 이속사졸, 디케토니트릴, 및/또는 트리케톤에 대한 히드록시 페닐 피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)의 내성/저항성 유전자는 미국 특허 6,268,549 및 6,069,115에 설명되어 있다.
F. 2,4-D 내성/저항성을 위한 유전자. 2,4-D-모노옥시게나제의 유전자는 미국 특허 6,100,446 및 6,153,401에 설명되어 있다. 2,4-D 내성/저항성을 위한 추가의 유전자는 US 2009/0093366 및 WO 2007/053482에 개시되어 있다.
G. 제초제 이미다졸 및/또는 트리아졸에 대한 이미다졸글리세롤 포스페이트 데히드라타제 (IGPD)의 유전자는 미국 특허 5,541,310에 설명되어 있다. 제초제 디캄바에 대한 디캄바 분해 효소 (옥시게나제, 페레독신, 및 리덕타제)의 유전자는 미국 특허 7,022,896 및 7,105,724에 개시되었다.
H. 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자). 예를 들어, 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드를 사용한 클라미도모나스의 형질전환을 개시하고 있는 문헌 [Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)]을 참조한다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 기탁 번호 53435, 67441, 및 67442 하에 이용가능하다. 또한, 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현은 문헌 [Hayes et al., Biochem. J. 285:173 (1992)]에 설명되어 있다.
달리 구체적으로 설명하지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 학술 용어는 본 명세서가 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 분자 생물학에서 통상적인 용어의 정의는 예를 들어 다음 문헌에서 볼 수 있다: [Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)].
양방향성 프로모터로서 기능할 수 있는 합성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다. 일부 실시양태에서, 합성 양방향성 프로모터는 하나 또는 2개의 관심 뉴클레오티드 서열(들)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 합성 양방향성 프로모터는 관심 뉴클레오티드 서열(들)의 적어도 하나의 (예를 들어, 하나의 또는 둘 모두의) 전사를 조절하도록 하나의 또는 2개의 관심 뉴클레오티드 서열(들) (예를 들어, 프로모터의 각각의 단부 상에 하나씩 2개의 유전자)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 특정 프로모터로부터의 URS를 합성 양방향성 프로모터에 도입함으로써, 특정 발현 및 조절 패턴 (예를 들어, 천연 프로모터의 제어 하에 유전자에 의해 보이는 것과 같은)은 합성 양방향성 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열에 대해 달성될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태는 합성 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 단방향성 옥수수 유비퀴틴-1 유전자 (ZmUbi1) 프로모터로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 천연 프로모터의 것과 상이한 분자 환경 내로 도입함으로써 본원에서 예시된다. 상기 최소 코어 프로모터 요소는 본원에서 "minUbi1P"로서 언급되고, 약 200 nt의 길이를 갖는다. 다수의 제아 종 및 제아 메이즈 유전자형으로부터로의 minUbi1P 요소의 서열 결정 및 분석은 기능성 minUbi1P 요소가 고도로 보존됨으로써, minUbi1P 요소는 예를 들어 서열 1의 minUbi1P 요소에 대해 적어도 약 75%; 적어도 약 80%; 적어도 약 85%; 적어도 약 90%; 적어도 약 91%; 적어도 약 92%; 적어도 약 93%; 적어도 약 94%; 적어도 약 95%; 적어도 약 96%; 적어도 약 97%; 적어도 약 98%; 적어도 약 99%; 및/또는 적어도 약 100% 서열 동일성을 공유할 경우 그의 전사 개시제로서의 기능을 보존할 수 있음을 보여주었다. 본 발명의 일부 실시양태에서 유용할 수 있는 minUbi1P 요소의 특성은 비제한적인 예를 들어, 앞서 언급된 뉴클레오티드 서열의 높은 보존성; 적어도 하나의 TATA 박스의 존재; 및/또는 적어도 하나 (예를 들어, 2개)의 열 충격 컨센서스 요소(들)의 존재를 포함할 수 있다. 특정 minUbi1P 요소에서, 하나 초과의 열 충격 컨센서스 요소는 minUbi1P 서열과 겹칠 수 있다.
합성 양방향성 프로모터를 조작하기 위해 천연 프로모터와 상이한 분자 환경 내로 minUbi1P 요소를 도입하는 방법은 그의 천연 최소 코어 프로모터를 포함하는 프로모터의 나머지 서열에 대해 핵산 내의 minUbi1P 요소의 배향을 역전시키는 것을 포함할 수 있다. 따라서, 합성 양방향성 프로모터는 제1 minUbi1P 요소의 5'에 위치하는 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있도록 프로모터 내의 제2 최소 코어 프로모터 요소 (예를 들어, 제2 minUbi1P 요소)의 5'에 반대 배향으로 도입된 제1 minUbi1P 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 minUbi1P 요소는 ZmUbi1 프로모터의 5' 단부에 반대 배향으로 도입될 수 있다.
합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 또한 적어도 하나의 minUbi1P 요소 이외에 하나 이상의 추가의 서열 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 프로모터 URS; 엑손 (예를 들어, 리더 또는 신호 펩티드); 인트론; 스페이서 (spacer) 서열; 및/또는 하나 이상의 임의의 상기한 것의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 Ubi1 프로모터 (예를 들어, 옥수수 Ubi1 프로모터)로부터의 URS 서열; Ubi1 유전자로부터의 리더 펩티드를 코딩하는 엑손; Ubi1 유전자로부터의 인트론; 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
프로모터 URS를 포함하는 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 일부의 예에서, URS는 합성 프로모터에 특정 조절 특성을 부여하도록 선택될 수 있다. 공지의 프로모터는 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 발휘하는 제어 유형 (예를 들어, 환경 반응, 발달 신호, 및 공간 정보)에서 크게 상이하고, 이종 프로모터 내에 도입된 URS는 일반적으로 URS가 그의 천연 프로모터 및 작동가능하게 연결된 유전자(들)에 대해 보이는 제어 유형을 유지한다 (Langridge et al. (1989), 상기 문헌). 특성화되고 일부 실시양태에 따라 합성 양방향성 Ubi1 프로모터 내에 포함되는 URS를 함유할 수 있는 진핵 프로모터의 예는 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 미국 특허 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 5,641,876 (벼 액틴 프로모터); 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 6,177,611 (구성적 옥수수 프로모터); 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터); 6,429,357 (벼 액틴 2 프로모터, 및 벼 액틴 2 인트론); 5,837,848 (뿌리-특이적 프로모터); 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 6,388,170 (양방향성 프로모터); 6,635,806 (감마-코익신 프로모터); 및 미국 특허 출원 09/757,089 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터)에 설명된 프로모터.
추가의 예시적인 원핵 프로모터는 노팔린 합성효소 (NOS) 프로모터 (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(16):5745-9); 옥토핀 합성효소 (OCS) 프로모터 (아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 종양-유도성 플라스미드 상에 보유됨); 콜리모바이러스 (caulimovirus) 프로모터, 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 19S 프로모터 (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); CaMV 35S 프로모터 (Odell et al. (1985) Nature 313:810-2); 현삼 모자이크 바이러스 35S-프로모터 (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8); 수크로스 합성효소 프로모터 (Yang and Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8); R 유전자 복합체 프로모터 (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83); CaMV35S (미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142, 및 5,530,196); FMV35S (미국 특허 6,051,753, 및 5,378,619); PC1SV 프로모터 (미국 특허 5,850,019); SCP1 프로모터 (미국 특허 6,677,503); 및 AGRtu.nos 프로모터 (젠뱅크 (GenBank) 기탁 번호 V00087; [Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73]; [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7]) 등을 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 minUbi1P 요소(들) 이외에 엑손을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 특정 세포내 소기관 (subcellular) 위치 및/또는 구획으로 표적화하거나 수송하는 것이 바람직할 수 있다. 상기 및 다른 실시양태에서, 코딩 서열 (엑손)은 minUbi1P 요소와 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 사이에서 핵산 분자 내에 도입될 수 있다. 상기 요소는 합성 양방향성 Ubi1 프로모터가, 폴리펩티드의 나머지와 기능적 관계로 도입된 코딩 서열에 의해 코딩되는 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 (또는 프로모터에 작동가능하게 연결된 2개의 폴리펩티드 중의 하나 또는 둘 모두를 코딩하는 서열)의 발현을 촉진하도록 당업자의 판단에 따라 배열될 수 있다. 특정 예에서, 리더, 수송, 또는 신호 펩티드 (예를 들어, Ubi1 리더 펩티드)를 코딩하는 엑손이 도입될 수 있다.
합성 양방향성 Ubi1 프로모터 내로 도입되는 엑손에 의해 코딩될 수 있는 펩티드는 예를 들어 제한적으로 다음을 포함한다: 유비퀴틴 (예를 들어, Ubi1) 리더 엑손; 및 엽록체 수송 펩티드 (CTP) (예를 들어, 에이. 탈리아나 (A. thaliana) EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 210:437-42), 및 국제 PCT 공개 WO 2008/105890에서 디캄바 모노옥시게나제 (DMO)의 엽록체 표적화에 대해 예시된 페튜니아 하이브리다 (Petunia hybrida) EPSPS CTP (della-Cioppa et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6873-7)).
인트론이 또한 본 발명의 일부 실시양태에서, 예를 들어 minUbi1P 요소와 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열 사이에서 합성 양방향성 Ubi1 프로모터에 도입될 수 있다. 일부 예에서, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터 내에 도입된 인트론은 비제한적으로, 번역 개시 서열의 완전히 프로세싱된 mRNA 상류에 존재하는 번역 리더 서열로서 기능하는 5' UTR일 수 있다 (그러한 번역 리더 서열은 mRNA로의 1차 전사체의 프로세싱, mRNA 안정성, 및/또는 번역 효율에 영향을 줄 수 있다). 번역 리더 서열의 예는 옥수수 및 페튜니아 열 충격 단백질 리더 (미국 특허 5,362,865), 식물 바이러스 코트 단백질 리더, 식물 루비스코 리더 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Turner and Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36]을 참조한다. 비-제한적인 5' UTR의 예는 GmHsp (미국 특허 5,659,122); PhDnaK (미국 특허 5,362,865); AtAnt1; TEV (Carrington and Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); 및 AGRtu.nos (젠뱅크 기탁 번호 V00087; 및 [Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7])를 포함한다.
합성 양방향성 Ubi1 프로모터 내로 임의로 도입될 수 있는 추가의 서열은 예를 들어 비제한적으로 3' 비-번역 서열; 3' 전사 종결 영역; 및 폴리아데닐화 영역을 포함한다. 이들은 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 서열)의 하류에 위치하는 유전적 요소이고, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 전사, mRNA 프로세싱, 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 다른 조절 신호를 제공하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 식물에서 mRNA 전구체의 3' 단부에 대한 폴리아데닐레이트 뉴클레오티드의 부가를 유도하는 기능을 수행할 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 천연 유전자, 다양한 식물 유전자, 또는 T-DNA 유전자로부터 유래될 수 있다. 3' 전사 종결 영역의 비-제한적인 예는 노팔린 합성효소 3' 영역 (nos 3'; [Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7])이다. 상이한 3' 비번역 영역의 용도의 예는 문헌 [Ingelbrecht et al., (1989) Plant Cell 1:671-80]에 제시되어 있다. 폴리아데닐화 신호의 비-제한적인 예는 피숨 사티붐 (Pisum sativum) RbcS2 유전자 (Ps.RbcS2-E9; [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-9]) 및 AGRtu.nos (젠뱅크 기탁 번호 E01312) 중의 하나를 포함한다.
일부 실시양태에서, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 표적 유기체의 게놈 내의 특정 유전자좌에 프라이머를 포함하는 핵산의 표적화를 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 숙주 내의 게놈 DNA 서열 (예를 들어, 드문 또는 특유한 게놈 DNA 서열)의 분절에 상동성인 하나 이상의 서열이 포함될 수 있다. 일부 예에서, 상기 상동성 서열은 숙주 게놈 내의 상동성 DNA의 부위에 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 핵산의 재조합 및 통합을 지시할 수 있다. 특정 예에서, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 드문 또는 특유한 위치에서 서열을 인식하는 조작된 뉴클레아제 효소를 이용하는 숙주 게놈 내의 드문 또는 특유한 위치로 프로모터를 포함하는 핵산의 표적화를 용이하게 하고 상기 드문 또는 특유한 위치에서의 통합을 용이하게 하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레아제 효소로서 징크-핑거 엔도뉴클레아제를 이용하는 상기 표적화된 통합 시스템은 미국 특허 출원 13/011,735에 설명되어 있다.
합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 핵산은 예를 들어 비제한적으로 RCA; PCR 증폭; RT-PCR 증폭; OLA; 및 SNuPE를 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 이들 및 다른 동등한 기술은 당업자에게 잘 공지되어 있고, 예를 들어 비제한적으로 문헌 [Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, 2001]; 및 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998]에 추가로 상세하게 설명되어 있다. 문헌에서 제공되는 임의의 그림, 도면, 및/또는 표를 비롯하여 상기 인용된 모든 참조문은 상기한 매뉴얼을 모두 포함한다.
전달 및/또는 형질전환: 본원은 또한 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 세포를 형질전환시키는 방법을 제공한다. 식물 내로 핵산 분자의 도입을 위한 임의의 매우 많은 당업계에 공지된 기술이, 예를 들어 하나 이상의 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 숙주 식물 게놈 내로 도입하고/하거나, 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심 핵산 분자(들)을 추가로 도입하기 위해서, 일부 실시양태에 따른 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시키기 위해 사용될 수 있다.
식물의 형질전환에 적합한 방법은 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함하는, DNA가 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 방법을 포함한다: 전기천공 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조); 미세주입 폭격 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580, 5,550,318, 5,538,880, 6,160,208, 6,399,861, 및 6,403,865 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,635,055, 5,824,877, 5,591,616; 5,981,840, 및 6,384,301 참조); 및 원형질체 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조). 상기한 바와 같은 기술의 적용을 통해, 실질적으로 임의의 식물 종의 세포가 안정하게 형질전환될 수 있고, 이들 세포는 당업자에게 공지된 기술에 의해 트랜스제닉 식물로 발달할 수 있다. 예를 들어, 면화 형질전환에 특히 유용할 수 있는 기술은 미국 특허 5,846,797, 5,159,135, 5,004,863, 및 6,624,344에 설명되어 있고; 브라시카 식물을 형질전환시키기 위한 기술은 특히 예를 들어 미국 특허 5,750,871에 설명되어 있고; 대두를 형질전환시키기 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 6,384,301에 설명되어 있고; 옥수수를 형질전환시키기 위한 기술은 예를 들어 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616, 및 국제 특허 PCT 공개 95/06722에 설명되어 있다.
외인성 핵산의 수용 세포로의 전달을 수행한 후, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환체를 확인하는 능력을 개선하기 위해, 선택가능 또는 스크리닝가능 마커 유전자를 형질전환체를 생성하기 위해 사용된 형질전환 벡터에 사용하는 것을 원할 수 있다. 이 경우에, 잠재적으로 형질전환된 세포 집단은 세포를 선택적인 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 검정될 수 있거나, 또는 세포는 요구되는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝될 수 있다.
선택적인 작용제에 대한 노출에서 생존하는 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 평가된 세포는 식물의 재생을 지지하는 배지 내에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지 (예를 들어, MS 및 N6 배지)는 추가의 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함함으로써 변형될 수 있다. 조직은 식물 재생을 개시하기 위해 충분한 조직이 이용가능할 때까지, 또는 반복된 수동 선택 후에 조직의 형태가 재생 (예를 들어, 적어도 2주)에 적합할 때까지 성장 조절제를 함유하는 기초 배지에 유지한 후, 새싹 (shoot) 형성에 좋은 배지로 옮길 수 있다. 충분한 새싹이 형성될 때까지 배양액을 주기적으로 옮긴다. 새싹이 형성되면, 뿌리 형성에 좋은 배지로 옮긴다. 충분한 뿌리가 형성되면, 식물을 추가의 성장 및 성숙을 위해 토양으로 이식한다.
재생하는 식물에서 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 요구되는 핵산 분자의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정을 수행할 수 있다. 상기 검정은 예를 들어 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블로팅 및 PCR; 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA 및/또는 웨스턴 블롯) 또는 효소적 기능에 의한 단백질 생성물의 존재 검출과 같은 생화학적 검정; 식물의 일부 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및 재생된 전체 식물의 표현형의 분석을 포함한다.
예를 들어, 표적화된 통합 이벤트 (event)는 예를 들어 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 결정 (genotyping)은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유할 것으로 예상되는 단리된 숙주 식물 캘러스 (callus) 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 중합효소-연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하고 이로 제한되지 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 문헌에 잘 설명되었고 (예를 들어, 문헌 [Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양액을 비롯한 임의의 식물 종 또는 조직형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 둘 모두에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합물을 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용하거나 또는 다중으로 사용될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열, 및/또는 이 둘의 조합물에 어닐링하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 생산될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 결정 전략은 예를 들어 비제한적으로 식물 게놈 내에서 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내에서 다수의 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 내에서 비-특이적 서열의 증폭; 및 임의의 상기한 것의 조합을 포함할 수 있다. 당업자는 게놈의 정보를 얻기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 도입된 핵산 서열의 경계 외부의 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머의 세트가 설계될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들어 그 내에 포함된 관심 뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역에 대응하는 서열에서 도입된 핵산 분자, 또는 핵산 분자의 다른 부분에 특이적으로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 이들 프라이머는 상기 설명한 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 요구되는 서열에 따라 합성될 수 있고, 상업적으로 이용가능하다 (예를 들어, 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크. (Integrated DNA Technologies, Inc., 미국 아이오와주 코랄빌)로부터). 증폭 후에, 증폭 생성물의 클로닝 및 서열 결정, 또는 직접적인 서열 분석이 수행될 수 있다. 당업자는 PCR 유전자형 결정 동안 생성된 증폭 생성물의 분석을 위한 다른 방법을 구상할 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
본 발명의 일부 실시양태는 또한 예를 들어 핵산 구축물에 존재할 수 있는 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 세포를 제공한다. 특정 예에서, 일부 실시양태에 따른 합성 양방향성 Ubi1 프로모터는 식물 세포 및 식물에서 도입유전자의 발현을 조절하기 위한 조절 서열로서 이용될 수 있다. 일부의 상기 예에서, 관심 뉴클레오티드 서열 (예를 들어, 도입유전자)에 작동가능하게 연결된 합성 양방향성 Ubi1 프로모터의 사용은 제시된 수의 관심 뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하기 위해 필요한 상동성 프로모터의 수를 감소시키고/시키거나 제시된 수의 관심 뉴클레오티드 서열을 도입하기 위해 필요한 핵산 구축물(들)의 크기를 감소시킬 수 있다. 또한, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터의 사용은 동일한 조건 하에 (즉, 프로모터가 활성인 조건 하에) 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 동시-발현을 허용할 수 있다. 상기 예는 예를 들어 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열이 각각 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 숙주에서의 단일 형질에 기여하고, 관심 뉴클레오티드 서열의 동시-발현이 트랜스제닉 숙주에서 형질의 발현에 유리한 영향을 줄 때 특히 유용할 수 있다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 합성 양방향성 Ubi1 프로모터(들) 및/또는 관심 뉴클레오티드 서열(들)을 포함하는 트랜스제닉 식물은 식물 내에서 관심 뉴클레오티드 서열(들)의 발현에 의해 부여된 (예를 들어, 도입된, 향상된, 또는 기여된) 하나 이상의 바람직한 형질을 가질 수 있다. 상기 형질은 예를 들어 비제한적으로 곤충, 다른 해충, 및 질환-유발제에 대한 내성; 제초제에 대한 저항성; 향상된 안정성, 수율, 또는 저장 수명; 환경 저항성; 제약물질 생산; 산업적 생성물 생산; 및 영양가 향상을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 바람직한 형질은 관심 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 핵산 분자로 식물을 형질전환시킴으로써 부여될 수 있다. 일부 예에서, 바람직한 형질은 육종을 통해 자손체 식물로서 생산된 식물에 부여될 수 있고, 여기서 형질은 합성 양방향성 Ubi1 프로모터에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 포함하는 모 식물로부터 식물로 전달된 합성 양방향성 Ubi1 프로모터에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 관심 뉴클레오티드 서열에 의해 부여될 수 있다.
일부 실시양태에 따른 트랜스제닉 식물은 본 발명의 핵산 분자로 형질전환될 수 있거나 또는 본 발명의 핵산 분자로 형질전환된 식물과 교배될 수 있는 임의의 식물일 수 있다. 따라서, 식물은 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물일 수 있다. 일부의 예에서 사용하기 위한 쌍떡잎 식물의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 알팔파; 콩; 브로콜리; 카놀라, 양배추; 당근; 콜리플라워; 셀러리; 배추; 면화; 오이; 가지; 상추; 멜론; 콩; 후추; 땅콩; 감자; 호박; 무; 평지씨; 시금치; 대두; 호박속; 사탕무; 해바라기; 담배; 토마토; 및 수박. 일부의 예에서 사용하기 위한 외떡잎 식물의 비-제한적인 예는 다음을 포함한다: 옥수수; 양파; 벼; 수수; 밀; 호밀; 기장; 사탕수수; 귀리; 라이밀; 스위치그래스 (switchgrass); 및 터프그래스 (turfgrass).
일부 실시양태에서, 트랜스제닉 식물은 임의의 방식으로 사용되거나 재배될 수 있고, 여기서 합성 양방향성 Ubi1 프로모터 및/또는 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 존재가 바람직하다. 따라서, 상기 트랜스제닉 식물은 특히 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용하여 형질전환됨으로써 하나 이상의 요구되는 형질을 갖도록 조작될 수 있고, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 경작 및/또는 재배될 수 있다.
본 발명은 구체적인 방법 및 실시양태를 참조하여 설명하지만, 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
다음 실시예는 몇몇 특정 특징 및/또는 실시양태를 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 개시문을 예시된 특정 특징 또는 실시양태로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 형질전환 및 발현
아그로박테리움 투메파시엔스의 형질전환: pDAB108706 2성분 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 3성분 (ternary) 내로 형질전환시켰다 (미국 특허 가출원 61/368965). 박테리아 콜로니를 단리하고, 2성분 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한 효소 소화를 통해 확인하였다.
옥수수 형질전환: 이삭 멸균 및 배아 (embryo) 단리. 옥수수 미성숙 배아를 얻기 위해, 제아 메이즈 (c.v. B104)의 식물을 온실에서 성장시키고, 자가 또는 동계-수분시켜 이삭을 생산하였다. 이삭을 수분 약 9-12일 후에 수거하였다. 실험일에, 이삭을 5% 하이포염소산나트륨을 함유하는 가정용 표백제의 20% 용액에 침액시켜 표면-멸균하고, 20-30분 동안 진탕한 후, 멸균수 내에 3회 세정하였다. 멸균 후에, 미성숙 접합 배아 (1.5-2.2 mm)를 각각의 이삭으로부터 무균적으로 절개하고, 액체 감염 배지 (LS 기초 배지, 4.43 gm/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 mL/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 수크로스, 68.5 gm/L; 글루코스, 36.0 gm/L; 2,4-D, 1.50 mg/L)를 담은 마이크로-원심분리관 내로 무작위로 분포시켰다. 주어신 실험 세트에 대해, 2-3개의 이삭으로부터의 모아진 배아를 각각의 처리에 대해 사용하였다.
아그로박테리움 배양 개시: 상기 설명된 2성분 벡터를 함유하는 아그로박테리움의 글리세롤 원액을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트리킹하고, 20℃에서 3-4일 동안 성장시켰다. 단일 콜로니를 집어내고, 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 상으로 스트리킹하고, 28℃에서 1-2일 동안 인큐베이팅하였다.
아그로박테리움 배양 및 동시-배양: 실험일에, 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 취하고, 50 ml 일회용 튜브 내에서 10 ml의 감염 배지 내에 현탁시키고, 분광광도계를 이용하여 세포 밀도를 OD600 = 0.2-0.4 nm로 조정하였다. 아그로박테리움 배양액을 실온에서 100 rpm의 회전식 진탕기에 넣은 한편, 배아 절개를 수행하였다. 크기 1.5-2.2 mm의 미성숙 접합 배아를 멸균 옥수수 알맹이로부터 단리하고, 1 ml의 감염 배지에 넣고, 동일한 배지 내에 1회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액 (2 ml)을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 약 20회 뒤집은 후 10-15분 동안 진탕하였다. 배아를 동시-배양 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔 (Gelzan)™, 3.00 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L, AgNO3, 15.0 mg/L; 아세토시링온, 100 μM)에 옮기고, 소순판 (scutellum)을 위로 대면하도록 배향하고, 3-4일 동안 명소에서 25℃에서 인큐베이팅하였다.
GUS 및 YFP/Phiyfp 일시적 발현: 일시적 YFP/Phiyfp 및 GUS 발현이 아그로박테리움과의 3일의 동시-배양 후에 형질전환된 배아에서 관찰될 수 있다. 배아를 YFP 필터 및 500 nm 광원을 이용하여 입체현미경 (레이카 마이크로시스템즈 (Leica Microsystems, 미국 일리노이주 버팔로 그루브)) 하에 관찰하였다. YFP/Phiyfp 발현을 보이는 배아를 GUS 조직화학 검정을 위해 선택하였다. GUS 염색 용액을 문헌 [Maniatis et al. (1989)]에 설명된 바와 같이 제조하고, 배아를 1 ml 용액 내에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이팅하였다. 배아를 현미경 후에 GUS 일시적 발현에 대해 관찰하였다.
캘러스 선택 및 추정 이벤트의 재생: 동시-배양 기간 후에, 배아를 선택적인 작용제를 함유하지 않은 휴지 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 배아를 100 nM 할록시폽을 함유하는 선택 1 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다.
증식하는 배발생 캘러스를 갖는 배아를 500 nM 할록시폽을 함유하는 선택 2 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 gm/L; 겔잔™ 2.30 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 추가의 14일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 상기 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화하도록 한다. 캘러스 선택 기간은 3주 동안 지속하였다. 증식하는 배발생 캘러스를 500 nM 할록시폽을 함유하는 재생 1 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 250.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 50.0 mg/L; NAA 0.500 mg/L; ABA 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 수크로스, 45.0 gm/L; 겔잔™ 2.50 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광에서 배양하였다. 새싹/새순 (bud)을 갖는 배발생 캘러스를 500 nM 할록시폽을 함유하는 재생 2 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 (Gellan Gum) G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겼다. 배양액을 28℃에서 7-10일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 1차 뿌리를 갖는 작은 새싹을 마겐타 (MAGENTA)™ 박스 (시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스) 내에서 새싹 연장 및 발근 배지 (MS 염, 4.33 gm/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 수크로스, 60.0 gm/L; 겔란 검 G434™ 3.00 gm/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)에 옮기고, 28℃에서 7일 동안 16/8시간 명/암 하에 인큐베이팅하였다. 추정 트랜스제닉 묘목을 도입유전자 카피수에 대해 분석하고, 온실로 옮겼다.
실시예 2: 합성 양방향성 Ubi1 프로모터 및 pDAB108706 벡터의 제작
옥수수 유비퀴틴-1 프로모터 (Ubi1)의 예시적인 개략도를 도 1에 제시한다. Ubi1 프로모터를 옥수수로부터 클로닝하였다. Ubi1 프로모터를 함유하는 플라스미드를 고충실도 (high-fidelity) PCR 증폭 시스템을 이용하여 PCR 증폭하였다. 옥수수 Ubi1 프로모터의 약 200 nt 영역이 제아 메이즈 Ubi1 최소 코어 프로모터 (minUbi1P) (서열 1)로서 확인되었다. 이어서, 서열 1의 minUbi1P를 당업계에 일반적으로 공지된 클로닝 방법을 이용하여 제아 메이즈 유비퀴틴-1 엑손 (ZmUbi1 엑손) 및 제아 메이즈 유비퀴틴-1 인트론 (ZmUbi1 인트론)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 (서열 2)에 첨가하여, 서열 3의 폴리뉴클레오티드를 생산하였다. 이어서, 생성되는 폴리뉴클레오티드를 옥수수 Ubi1 프로모터 (Ubi1 상류 조절 서열 (URS) 포함); 서열 4)를 포함하는 핵산의 반대 배향으로 상류에서 클로닝하여, 서열 5의 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 생산하였다 (예를 들어, 도 5 참조).
리포터 유전자 코딩 서열을 합성 양방향성 Ubi1 프로모터의 각각의 단부의 하류에 클로닝하였다. 황색 형광 단백질 (yfp) 코딩 서열을 minUbi1P, ZmUbi1 엑손, 및 ZmUbi1 인트론 프로모터 요소를 함유하는 폴리뉴클레오티드 단편의 하류에 삽입시켰다. 또한, 3-프레임 중지 폴리뉴클레오티드 서열 및 옥수수 컨센서스 폴리뉴클레오티드 (Kozak) 서열을 함유하는 하류 리더 서열을 minUbi1P, ZmUbi1, 엑손 및 ZmUbi1 인트론 프로모터 요소 단편에 첨가하였다. uidA (GUS) 코딩 서열을 yfp 서열에 관하여 반대 배향으로 합성 양방향성 Ubi1 프로모터의 하류에 삽입하였다 (서열 6; 예를 들어, 도 3 참조). yfp 및 GUS 유전자에 작동가능하게 연결된 합성 양방향성 Ubi1 프로모터를 포함하는 생성되는 폴리뉴클레오티드를 플라스미드 pDAB105801 내로 클로닝하였다.
플라스미드 pDAB105801로부터 GUS 및 yfp 유전자 발현 카세트를 함유하는 2성분 벡터를 게이트웨이(GATEWAY)™ L-R 클로나제 (CLONASE)™ 반응 (인비트로겐 (Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 완성하였다. 생성되는 벡터 pDAB108706은 T-가닥 영역 내에 GUS, yfp, 및 aad-1 유전자 발현 카세트를 함유한다 (예를 들어, 도 5 참조).
실시예 3: 합성 양방향성 유비퀴틴 1 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 일시적 발현
pDAB108706을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아에서 YFP 및 GUS 일시적 발현의 대표적인 예를 영상화한다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터의 양 방향 모두는 작동가능하게 연결된 yfp 및 GUS 코딩 서열의 강력한 발현을 유도할 수 있다. YFP 발현 수준은 GUS 발현 수준과 대등하다. 이들 관찰은 양방향성 ZmUbi1 프로모터의 양 방향 모두가 생물학적으로 기능성임을 확인한다. 또한, 합성 양방향성 Ubi1 프로모터의 minUbi1P 요소는 YFP를 yfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 ZmUbi1 프로모터를 함유한 2성분 플라스미드 (pDAB101556)를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 캘러스와 유사한 발현 수준으로 발현할 수 있다. YFP 또는 GUS의 발현은 2성분 구축물을 사용하여 형질전환되지 않고 yfp 또는 GUS 코딩 서열을 함유하지 않은 음성 대조군 미성숙 배아에서 관찰되지 않았다.
실시예 4: 합성 양방향성 유비퀴틴 1 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 안정한 발현
yfp 코딩 서열을 함유하는 pDAB108706 2성분 벡터를 사용하여 안정하게 형질전환된 제아 메이즈 캘러스 세포의 영상을 관찰할 수 있다. 이들 세포는 선택 2 배지 상에서 번식한 제아 메이즈 배아로부터 얻었다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터는 yfp 코딩 서열의 강력한 발현을 유도할 수 있다. 이들 결과는 양방향성 ZmUbi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 안정하게 형질전환된 제아 메이즈 캘러스 세포 내에서 리포터 유전자를 발현할 수 있음을 확인한다. YFP 단백질의 발현의 수준은 yfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 ZmUbi1 프로모터를 함유한 대조군 2성분 벡터 (pDAB101556)를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 캘러스 내의 YFP 발현과 유사하다. YFP 또는 GUS의 발현은 2성분 구축물을 사용하여 형질전환되지 않고 yfp 또는 GUS 코딩 서열을 함유하지 않은 음성 대조군 캘러스 내에서 검출되지 않는다.
실시예 5: 실시간 TaqMan ® PCR 을 이용하는 도입유전자 카피수 추정
제아 메이즈 배아를 양방향성 ZmUbi1 프로모터를 함유하는 2성분 벡터 (pDAB108706)를 사용하여 형질전환시키고, 다른 식물을 대조군 2성분 벡터 pDAB101556으로 형질전환시켰다. 두 세트의 제아 메이즈 식물의 게놈 내에서 yfp 도입유전자의 존재는 가수분해 프로브 검정을 통해 확인된다. 캘러스로부터 발달한 안정하게 형질전환된 트랜스제닉 제아 메이즈 묘목을 얻고 분석하여, pDAB108706 2성분 벡터 및 pDAB101556 대조군 2성분 벡터로부터의 낮은 카피수 (1-2 카피)의 전장 T-가닥 삽입물을 함유한 이벤트를 확인하였다. 확인된 묘목을 온실에 보내서 성장시켰다.
로슈 (Roche) 라이트사이클러 (LightCycler)480™ 시스템을 이용하여, pDAB108706 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 이벤트에 대한, 및 pDAB101556 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 대조군 이벤트에 대한 도입유전자 카피수를 결정하였다. 방법은 단일 검정으로 yfp 유전자에 및 내인성 제아 메이즈 참조 유전자, 인버타제 (젠뱅크 기탁 번호: U16123.1)에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 바이플렉스 (biplex) TaqMan® 반응을 이용한다. 카피수 및 접합성은 공지의 카피수 표준물에 비교할 때, 인버타제-특이적 형광에 상대적인 yfp-특이적 형광의 강도를 측정함으로써 결정하였다.
pDAB108706 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈에서, yfp 유전자-특이적 DNA 단편은 FAM 형광 염료로 표지한 프로브를 함유하는 하나의 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하고, 인버타제는 HEX 형광으로 표지한 프로브를 함유하는 제2 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하였다 (표 2). PCR 반응 혼합물을 표 3에 기재된 바와 같이 제조하고, 유전자-특이적 DNA 단편을 표 4에 기재된 조건에 따라 증폭하였다. 샘플의 카피수 및 접합성은 공지의 카피수 표준물에 비교할 때, 참조 유전자, 인버타제에 대해 특이적인 형광에 대한 리포터 유전자, yfp에 특이적인 형광의 상대적인 강도를 측정함으로써 결정하였다.
Figure pct00001
표준물은 벡터 pDAB108706을 제아 메이즈 B104 게놈 DNA (gDNA) 내로 희석시켜 pDAB108706:gDNA의 공지의 관계를 갖는 표준물을 얻음으로써 생성하였다. 예를 들어, 하나의 카피의 제아 메이즈 B104 gDNA당 1; 2; 및 4개의 카피의 벡터 DNA를 갖는 샘플을 제조하였다. 제아 메이즈 B104 gDNA 표준물과 혼합된 pDAB108706의 하나 및 2개의 카피 희석물을 반접합성인 것으로 공지된 대조군 제아 메이즈 이벤트, 및 동종접합성인 것으로 공지된 대조군 제아 메이즈 이벤트 (제아 메이즈 이벤트 278; PCT 국제 특허 공개 WO 2011/022469 A2 참조)에 대해 입증하였다. AAD1 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 및 내인성 제아 메이즈 참조 유전자, 인버타제에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 이용하는 TaqMan® 바이플렉스 검정은, FAM 형광 염료로 표지한 프로브를 함유하는 하나의 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 AAD1에 대한 유전자-특이적 DNA 단편을 증폭하고 검출함으로써, 및 HEX 형광으로 표지한 프로브를 함유하는 제2 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 인버타제에 대한 유전자-특이적 DNA 단편을 증폭하고 검출함으로써 수행하였다 (표 2). AAD1 TaqMan® 반응 혼합물을 표 3에 기재된 바와 같이 제조하고, 특이적 단편을 표 4에 기재된 조건에 따라 증폭하였다.
Figure pct00002
각각의 반응에 대해 생성된 형광의 수준을 제조자의 지시에 따라 로슈 라이트사이클러 480™ 써모사이클러 (Thermocycler)를 사용하여 분석하였다. FAM 형광 모이어티 (moiety)는 465/510 nm의 광학 밀도에서 여기하고, HEX 형광 모이어티는 533/580 nm의 광학 밀도에서 여기하였다. 카피수는 미지의 샘플에 대한 표적/참조 값 (라이트사이클러 480™에 의한 출력)을 4개의 공지의 카피수 표준물 (Null, 1-카피 (hemi), 2-카피 (homo) 및 4-카피)의 표적/참조 값에 비교하여 결정하였다.
PCR 증폭을 위한 써모사이클러 조건
PCR 단계 온도 (℃) 시간 사이클의 수
단계-1 95 10분 1
단계-2 95 10초 40
59 35초
72 1초
단계-3 40 10초 1
양방향성 ZmUbi1 프로모터 구축물 (pDAB108706)을 사용한 형질전환을 통해 얻어진 트랜스제닉 식물의, 및 대조군 단방향성 ZmUbi1 프로모터 YFP 구축물 (pDAB101556)을 사용한 형질전환을 통해 얻어진 트랜스제닉 식물의 도입유전자 카피수 분석으로부터 결과를 표 5에 제시한다. 1-2 카피의 yfp 도입유전자를 갖는 식물만을 추가의 발현 분석을 위해 온실로 옮겼다.
양방향성 프로모터 구축물 및 대조 구축물로부터 얻어진 트랜스제닉 식물의 도입유전자 카피수 추정.
구축물 형질전환된 배아의 수 양성 이벤트의 수 1-2 카피의 yfp
pDAB101556 100 31 13
pDAB108706 110 29 12
실시예 6: 합성 양방향성 유비퀴틴1 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 전체 식물 안정한 발현
낮은 카피 T-DNA 수의 2성분 플라스미드 pDAB108706을 함유한 전체 식물, 및 낮은 카피수의 대조군 2성분 플라스미드 pDAB101556를 함유한 식물을 온실에서 성장시켰다. pDAB108706을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 트랜스제닉 T0 옥수수 식물의 잎 및 뿌리 조직 내에서 YFP의 안정한 발현의 대표적인 예를 분석하였다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터는 잎 조직 및 뿌리 조직 모두에서 yfp 코딩 서열의 강력한 발현을 유도할 수 있다. 현미경 분석은 또한 yfp 코딩 서열의 발현을 유도하는 단방향성 ZmUbi1 프로모터를 함유하는 양방향성 ZmUbi1 프로모터 내의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 대조군 2성분 플라스미드 (pDAB101556)를 유도할 수 있음을 확인한다. 이들 대조 식물은 또한 잎 조직 및 뿌리 조직에서 안정한 YFP 발현을 보여준다.
실시예 7: 합성 양방향성 유비퀴틴1 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자의 웨스턴 블롯 분석
총 가용성 단백질: 형질전환된 T0 옥수수 식물을 V6 발달기에서 샘플링하였다. 가장 어린 접히지 않은 잎으로부터 총 4개의 잎 펀치 (punch)를 매트릭스 (matrix) 튜브 내로 샘플링하고, 매트릭스 박스 내에 넣었다. 음성 대조군으로서, V6 발달기에서 2개의 형질전환되지 않은 B104 옥수수 식물의 4개의 잎 펀치를 매트릭스 튜브 내로 샘플링하였다. 강철 비드를 매트릭스 튜브 내에 넣은 후, 400 ㎕ PBST를 각각의 튜브에 첨가하였다. 튜브를 마개를 닫고, Kleco™ 조직 분쇄기 (grinder) 내에서 5분 동안 1500 rpm에서 비드 비팅 (beating)을 통해 단백질을 추출하였다. 파편은 원심분리를 통해 펠렛화하였다.
각각의 튜브로부터 5 ㎕ 샘플을 96-웰 마이크로역가 플레이트 내에서 PBST로 25 ㎕로 희석하였다. 이들 샘플을 제조자의 지시에 따라 BCA 단백질 검정 키트 (써모 사이언티픽 피어스 (Thermo Scientific Pierce, 미국 일리노이주 록포드))를 사용하여 총 가용성 단백질에 대해 분석하였다. 키트 내에 제공된 소 혈청 알부민 (BSA) 표준물을 이중으로 분석하고, 값의 평균을 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 이것을 각각의 샘플에 대한 총 가용성 단백질을 계산하기 위해 후속적으로 사용하였다. 이어서, 각각의 샘플에 대한 총 가용성 단백질을 mg/㎕로 표준화하였다.
웨스턴 블롯 프로토콜.
단계 조건 시간
제1 세척 PBST 5분
1차 혼성화 스타팅블록(StartingBlock)™ T20 (써모 피셔 사이언티픽 인크. (Thermo Fisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월덤)) 내의 2 ㎍/ml 토끼 항-PhiYFP (악소라 (Axxora, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 60분
세정 PBST 3x5분
2차 혼성화 호스 래디시 페록시다제 (HRP)-접합된 염소 항-토끼 IgG 30분
제2 세척 PBST 3x5분
세정 PBS 3x2분
YFP/Phiyfp 웨스턴 블롯 분석: 96-웰 마이크로역가 플레이트에서, 추출된 단백질의 각각의 5 ㎕ 샘플을 5 ㎕의 2x 래믈리 (Laemmli) 완충제 + 2-β-머캅토에탄올로 희석하였다. HEPES 완충제 (50 mM HEPES, 200 mM KCl, 10% 글리세롤) 내의 정제된 YFP/Phiyfp의 대조군 샘플을 악소라 (미국 캘리포니아주 샌디에고)로부터 구입하였다. 샘플을 다음 농도의 표준 곡선을 생성하기 위해 래믈리 완충제로 1:1 희석함으로써 동일한 플레이트에서 제조하였다: 0.5 ng/㎕, 0.25 ng/㎕, 및 0.125 ng/㎕. 샘플을 써모사이클러 내에서 95℃에서 30분 동안 가열한 후, 4℃로 냉각시켰다. 이어서, 바이오-라드 (Bio-Rad) 크리테리언 겔 (Criterion Gel)™을 MES/SDS 완충제를 사용하여 조립하였다. 샘플을 실온으로 가온시키고, 10 ㎕의 샘플을 2개의 겔의 각각의 웰에 로딩하였다. 또한, 표준 곡선에 대해 사용된 정제된 YFP/Phiyfp의 샘플, 및 단백질 래더 (ladder) 마커를 겔의 웰 내로 로딩하였다. 겔을 150 V 및 150 mA에서 90 min 동안 전기영동에 의해 진행시켰다. 진행 후에, 겔 케이스를 열고, iBlot System™ (인비트로겐)을 이용하여 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 20 V의 전류에서 10분 동안 진행시킴으로써 단백질을 겔로부터 막으로 옮겼다. 니트로셀룰로스 막을 제거하고, 스타팅블록 T20™ 차단 완충제 내에 4℃에서 밤새 넣었다. 이어서, 차단 완충제를 폐기하고, 막을 표 6에 제시된 프로토콜을 이용하여 처리하였다.
항체 결합은 제조자의 지시에 따라 아머샴 (Amersham) ECL™ + 화학발광 검출 시스템을 이용하여 검출하였다. 필름을 10분 및 30분에서 노출시켰다. 10분 노출시킨 필름을 사용하여 단백질을 정량하고, 30분 과다노출 필름을 사용하여 B104 및 다른 대조군 샘플 내에 단백질의 부재를 확인하였다. 막을 노출된 필름의 이면에 붙이고, 단백질을 픽셀 밀도 분석을 통해 정량하였다. 먼저, 정제된 단백질 표준물의 픽셀 밀도를 사용하여 표준 곡선을 생성하고, 이를 사용하여 샘플 내의 단백질을 정량하였다. 막은 밴드를 심지어 정제된 표준물 내에서 PhiYFP 단량체 및 이량체에 대한 보여주지만, 단백질 발현을 정량하기 위해 PhiYFP 단량체만이 사용된다. 이어서, 단백질에 대한 값을 ng/㎕로 표준화하였다. 표준화된 총 가용성 단백질 (TSP) 대 PhiYFP의 비는 ng YFP/mg TSP의 단위, 또는 별법으로 백만분율 (ppm)로 계산하였다.
GUS 웨스턴 블롯 분석: GUS 단백질의 발현을 다음을 제외하고는 PhiYFP와 유사한 방식으로 정량하였다: 추출물의 10 ㎕ 샘플을 2x 래믈리 + 2-β-머캅토에탄올로 1:1 희석하고, 95℃에서 30분 동안 변성시킨 후, 15 ㎕을 겔에 로딩하였다. 필름 (1분 노출)을 갖는 처리된 막을 픽셀 밀도 분석을 위한 막과 중첩시켰다.
2성분 벡터 pDAB108706을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 12개의 트랜스제닉 T0 옥수수 식물의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 도 11에 제시한다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터는 잎 조직으로부터 yfp 및 GUS 코딩 서열의 강력한 발현을 보여준다. 이들 관찰은 양방향성 ZmUbi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 yfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 ZmUbi1 프로모터를 함유하는 2성분 플라스미드 (pDAB101556; 도 12 참조)를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 캘러스와 유사한 발현 수준으로 YFP를 발현하였음을 확인한다.
실시예 8: 4-유전자 카세트 스택의 제작
플라스미드 pDAB105803 구축물을 출발 플라스미드로서 사용하여, 단일 제아 메이즈 유비퀴틴-1 양방향성 프로모터에 의해 유도된 4-유전자 카세트 스택 (aad1-2a-Phiyfp 및 cry34-2a-cry35)을 생성하였다. 플라스미드 pDAB105803의 대표적인 지도를 도 16에 제시하고, 이것은 제아 메이즈 유비퀴틴-1 양방향성 프로모터를 함유한다.
플라스미드 pDAB105841로부터 유래된 aad1-2a-Phiyfp 단편을 당업계에 일반적으로 공지된 클로닝 방법을 이용하여 플라스미드 pDAB105803의 BamHI 및 SacI 절단 벡터 백본 내로 클로닝하였다. 이것은 중간 플라스미드 pDAB105842를 생성시켰다 (도 17). 플라스미드 pDAB105840으로부터 얻어진 NotI/XbaI 소화된 cry34(8V6)-2a-cry35 단편을 플라스미드 pDAB105842의 NotI/SpeI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pDAB105843을 제작하였다. 플라스미드 pDAB105843은 ZmUbi1 양방향성 프로모터의 각각의 측면 상에 cry34(8V6)-2a-cry35 및 aad1-2a-Phiyfp 유전자 카세트를 함유한다 (도 18).
ZmUbi1 양방향성 프로모터, 및 플라스미드 pDAB105842로부터 유전자 발현 카세트 cry34(8V6)-2a-cry35 및 Phiyfp-2a-aad1을 함유하는 2성분 벡터를 목적지 (destination) 플라스미드 pDAB101917을 사용하는 게이트웨이 L-R 클로나제 반응 (인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 생성하였다. 생성되는 벡터 pDAB108717은 T-DNA 경계 내에 cry34(8V6)-2a-cry35, aad1-2a-Phiyfp, 및 PAT 유전자 발현 카세트를 함유하였다 (도 19).
실시예 9: 제2 4-유전자 카세트 스택의 제작
플라스미드 pDAB105803 구축물을 사용하여 단일 제아 메이즈 유비퀴틴-1 양방향성 프로모터에 의해 유도된 제2 4-유전자 카세트 스택 (Phiyfp-2a-aad1 및 cry34-2a-cry35)을 생성하였다. 플라스미드 pDAB105844로부터 유래된 Phiyfp-2a-aad1 단편을 당업계에 일반적으로 공지된 클로닝 방법을 이용하여 플라스미드 pDAB105803의 BamHI 및 SacI 절단 벡터 백본 내로 클로닝하였다. 이것은 중간 플라스미드 pDAB105845를 생성시켰다 (도 20). 플라스미드 pDAB105840으로부터 얻어진 NotI/XbaI 소화된 cry34(8V6)-2a-cry35 단편을 플라스미드 pDAB105845의 NotI/SpeI 부위 사이에 클로닝하여 플라스미드 pDAB105846을 제작하였다 (도 21). 플라스미드 pDAB105846은 ZmUbi1 양방향성 프로모터의 각각의 측면 상에 cry34(8V6)-2a-cry35 및 Phiyfp-2a-aad1 유전자 카세트를 함유하였다.
ZmUbi1 양방향성 프로모터, 및 플라스미드 pDAB105846으로부터 유전자 카세트 cry34(8V6)-2a-cry35 및 Phiyfp-2a-aad1을 함유하는 2성분 벡터를 목적지 플라스미드 pDAB101917을 사용하는 게이트웨이 L-R 클로나제 반응 (인비트로겐 (미국 캘리포니아주 칼스바드))을 통해 생성하였다. 생성되는 벡터 pDAB108718은 T-DNA 경계 내에 cry34(8V6)-2a-cry35, Phiyfp-2a-aad1, 및 PAT 유전자 발현 카세트를 함유하였다 (도 21).
실시예 10: 아그로박테리움 투메파시엔스 균주 DAt13192 의 형질전환
pDAB108717 및 pDAB108718 2성분 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스 3성분 균주 DAt13192 내로 형질전환시켰다 (미국 특허 가출원 61/368965). 박테리아 콜로니를 단리하고, 2성분 플라스미드 DNA를 추출하고, 제한 효소 소화를 통해 확인하였다.
실시예 11: 옥수수 내로 형질전환
이삭 멸균 및 배아 단리: 옥수수 미성숙 배아를 얻기 위해, 제아 메이즈 (c.v. B104)의 식물을 온실에서 성장시키고, 자가 또는 동계-수분하여 이삭을 생산하였다. 이삭을 수분 약 9-12일 후에 수거하였다. 실험일에, 이삭을 5% 하이포염소산나트륨을 함유하는 가정용 표백제의 20% 용액에 침액시켜 표면-멸균하고, 20-30분 동안 진탕한 후, 멸균수 내에 3회 세정하였다. 멸균 후에, 미성숙 접합 배아 (1.5-2.2 mm)를 각각의 이삭으로부터 무균적으로 절개하고, 액체 감염 배지 (LS 기초 배지, 4.43 g/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 mL/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 수크로스, 68.5 g/L; 글루코스, 36.0 g/L; 2,4-D, 1.50 mg/L)를 담은 마이크로-원심분리관 내로 무작위로 분포시켰다. 주어신 실험 세트에 대해, 2-3개의 이삭으로부터의 모아진 배아를 각각의 처리에 대해 사용하였다.
아그로박테리움 배양 개시: 상기 설명된 2성분 벡터를 함유하는 아그로박테리움 균주의 글리세롤 원액을 적절한 항생제를 함유하는 AB 최소 배지 플레이트 상에 스트리킹하고, 20℃에서 3-4일 동안 성장시켰다. 단일 콜로니를 집어내고, 동일한 항생제를 함유하는 YEP 플레이트 상으로 스트리킹하고, 28℃에서 1-2일 동안 인큐베이팅하였다.
아그로박테리움 배양 및 동시-배양: 실험일에, 아그로박테리움 콜로니를 YEP 플레이트로부터 집어내고, 50 ml 일회용 튜브 내에서 10 ml의 감염 배지 내에 현탁시키고, 분광광도계를 이용하여 세포 밀도를 OD600 = 0.2-0.4 nm로 조정하였다. 아그로박테리움 배양액을 실온에서 115 rpm의 회전식 진탕기에 넣은 한편, 배아 절개를 수행하였다. 크기 1.5-2.2 mm의 미성숙 접합 배아를 멸균 옥수수 알맹이로부터 단리하고, 1 ml의 감염 배지에 넣고, 동일한 배지 내에 1회 세척하였다. 아그로박테리움 현탁액 (2 ml)을 각각의 튜브에 첨가하고, 튜브를 약 20회 뒤집은 후 10-15분 동안 진탕하였다. 배아를 동시-배양 배지 (MS 염, 4.33 g/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 g/L; 겔잔™, 3.00 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L, AgNO3, 15.0 mg/L; 아세토시링온, 100 μM)에 옮기고, 소순판을 위로 대면하도록 배향하고, 3-4일 동안 명소에서 25℃에서 인큐베이팅하였다.
YFP/Phiyfp 일시적 발현: 일시적 YFP/Phiyfp 발현이 아그로박테리움과의 3일의 동시-배양 후에 형질전환된 배아에서 관찰될 수 있다. 배아를 YFP 필터 및 500 nm 광원을 이용하여 입체현미경 (레이카 마이크로시스템즈 (미국 일리노이주 버팔로 그루브)) 하에 관찰하였다.
캘러스 선택 및 추정 이벤트의 재생: 동시-배양 기간 후에, 배아를 선택적인 작용제를 함유하지 않은 휴지 배지 (MS 염, 4.33 g/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 g/L; 겔잔™, 2.30 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 배아를 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 선택 1 배지 (MS 염, 4.33 g/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 g/L; 겔잔™ 2.30 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다.
증식하는 배발생 캘러스를 갖는 배아를 5 mg/L 비알라포스를 함유하는 선택 2 배지 (MS 염, 4.33 g/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; L-프롤린, 700.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산], 500.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 100.0 mg/L; 디캄바, 3.30 mg/L; 수크로스, 30.0 g/L; 겔잔™ 2.30 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 15.0 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 추가의 14일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 상기 선택 단계는 트랜스제닉 캘러스가 추가로 증식하고 분화하도록 한다. 캘러스 선택 기간은 3주 동안 지속할 수 있었다. 증식하는 배발생 캘러스를 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 재생 1 배지 (MS 염, 4.33 g/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; L-프롤린, 350.0 mg/L; MES [(2-(n-모르폴리노)-에탄술폰산), 유리산] 250.0 mg/L; 카제인 효소 가수분해물 50.0 mg/L; NAA 0.500 mg/L; ABA 2.50 mg/L; BA 1.00 mg/L; 수크로스, 45.0 g/L; 겔잔™ 2.50 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; AgNO3, 1.00 mg/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L)로 옮기고, 28℃에서 7일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광에서 배양하였다.
새싹/새순을 갖는 배발생 캘러스를 3 mg/L 비알라포스를 함유하는 재생 2 배지 (MS 염, 4.33 g/L; 변형된 MS-비타민 [1000X], 1.00 ml/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 수크로스, 60.0 g/L; 겔란 검 G434™ 3.00 g/L; 카르베니실린, 250.0 mg/L) 상으로 옮겼다. 배양액을 28℃에서 7-10일 동안 50 μmol m-2s-1의 광 강도로 24시간 광 하에 인큐베이팅하였다. 1차 뿌리를 갖는 작은 새싹을 식물트레이 (phytatray) 내에서 새싹 연장 및 발근 배지 (MS 염, 4.33 g/L; N6 비타민 용액 [1000X], 1.00 ml/L; 미오-이노시톨, 100.0 mg/L; 수크로스, 30.0 g/L; 아가 5.50 g/L)에 옮기고, 28℃에서 7일 동안 90 μmol m-2s-1의 광 강도로 16/8시간 명/암 하에 인큐베이팅하였다. 건강한 추정 트랜스제닉 묘목을 선택한 후, 25℃에서 추가의 2-5일 동안 200 μmol m-2s-1로 16/8시간 광/암에서 인큐베이팅하고, 도입유전자 카피수에 대해 분석하고, 온실로 옮겼다.
실시예 12: 일시적 Phiyfp 발현
pDAB108717을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 Phiyfp의 일시적 발현을 수행하였다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터는 aad1-2a-Phiyfp 유전자 발현 카세트로부터 Phiyfp를 발현할 수 있었고, 여기서 비-형질전환된 배아는 임의의 Phiyfp 형광을 보이지 않았다. 유사한 수준의 Phiyfp 발현이, 예상된 수준의 YFP/Phiyfp 발현을 나타낸 단일 Phiyfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 제아 메이즈 (Zm) Ubi1 프로모터를 함유하는 2성분 플라스미드 pDAB105748 (도 15)로 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 관찰될 수 있었다. Phiyfp의 일시적 발현이 pDAB108718을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 관찰될 수 있었고, 여기서 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 Phiyfp-2a-aad1 유전자 발현 카세트로부터 Phiyfp를 발현할 수 있었다.
실시예 13: 안정하게 형질전환된 옥수수에서 Phiyfp 발현
양방향성 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된 안정하게 형질전환된 제아 메이즈 캘러스에서 Phiyfp 발현: aad1-2a-Phiyfp 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB108717 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아는 우수한 Phiyfp 발현을 보여주었다. 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 Phiyfp의 강력한 발현을 유도할 수 있었다. 이들 결과는 양방향성 Zm Ubi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 리포터 유전자, 예를 들어 Phiyfp 또는 YFP를 발현할 수 있음을 확인한다. Phiyfp 단백질의 발현 수준은 Phiyfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 Zm Ubi1 프로모터를 함유한 대조군 2성분 벡터 (pDAB105748)로 형질전환된 제아 메이즈 캘러스와 유사하였다. Phiyfp의 발현은 2성분 구축물을 사용하여 형질전환되지 않고 Phiyfp 코딩 서열을 함유하지 않은 음성 대조군 캘러스에서 관찰되지 않았다.
Phiyfp-2a-aad1 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB108718 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아는 우수한 Phiyfp 발현을 보여주었다. 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 Phiyfp의 강력한 발현을 유도할 수 있었다. 이들 결과는 양방향성 Zm Ubi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 리포터 유전자, 예를 들어 Phiyfp 또는 YFP를 발현할 수 있음을 확인한다.
실시예 14: 도입유전자 카피수의 추정
실시간 TaqMan™ PCR을 이용하는 도입유전자 카피수 추정: 제아 메이즈 식물을 양방향성 Zm Ubi1 프로모터, pDAB108717 및 pDAB108718을 함유하는 2성분 벡터로 형질전환시키고, 다른 식물을 대조군 2성분 벡터 pDAB105748로 형질전환시켰다. pDAB108717 및 pDAB108718에 트랜스제닉인 제아 메이즈 식물의 게놈 내에 코딩 서열 (Phiyfp, aad1, cry34, cry35, Pat)의 존재는 TaqMan 가수분해 프로브 검정을 통해 확인하였다. 대조군 벡터 pDAB105748에 트랜스제닉인 식물을 Phiyfp 서열의 존재에 대해 분석하였다. 캘러스로부터 발달한 안정하게 형질전환된 트랜스제닉 제아 메이즈 묘목을 얻고 분석하여, pDAB108717 및 pDAB108718 2성분 벡터, 및 pDAB105748 대조군 2성분 벡터로부터 낮은 카피수 (1-2 카피)의 전장 T-가닥 삽입물을 함유한 이벤트를 확인하였다. 확인된 묘목을 온실에 보내서 성장시켰다.
로슈 라이트사이클러 480™ 시스템을 이용하여, pDAB108717 및 pDAB108718 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 이벤트에 대한 도입유전자 카피수를 결정하였다. 방법은 단일 검정으로 코딩 서열에 및 내인성 제아 메이즈 참조 유전자, 인버타제 (젠뱅크 기탁 번호: U16123.1)에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 바이플렉스 TaqMan® 반응을 이용하였다. 카피수 및 접합성은 공지의 카피수 표준물에 비교할 때 인버타제-특이적 형광에 상대적인 코딩 서열-특이적 형광의 강도를 측정함으로써 결정하였다.
Figure pct00003
pDAB108717 및 pDAB108718 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 샘플에 대하여, 코딩 서열-특이적 DNA 단편은 FAM 형광 염료로 표지한 프로브를 함유하는 하나의 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하고, 인버타제는 HEX 형광으로 표지한 프로브를 함유하는 제2 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 증폭하였다 (표 7). PCR 반응 혼합물을 표 8에 기재된 바와 같이 제조하고, 유전자-특이적 DNA 단편을 표 9에 기재된 조건에 따라 증폭하였다. 샘플의 카피수 및 접합성은 공지의 카피수 표준물에 비교할 때 참조 유전자, 인버타제에 특이적인 형광에 대한 코딩 서열에 특이적인 형광의 상대적인 강도를 측정함으로써 결정하였다.
표준물은 벡터 (pDAB108717 및 pDAB108717)를 제아 메이즈 B104 게놈 DNA (gDNA) 내로 희석하여 벡터:gDNA의 공지의 관계를 갖는 표준물을 얻음으로써 생성하였다. 예를 들어, 하나의 카피의 제아 메이즈 B104 gDNA당 1, 2, 및 4개의 카피(들)의 벡터 DNA를 갖는 샘플을 제조하였다. 제아 메이즈 B104 gDNA 표준물과 혼합된 벡터의 하나 및 2개의 카피 희석물을 반접합성인 것으로 공지된 대조군 제아 메이즈 이벤트, 및 동종접합성인 것으로 공지된 대조군 제아 메이즈 이벤트 (제아 메이즈 이벤트 278; PCT 국제 특허 공개 WO 2011/022469 A2 참조)에 대해 입증하였다. 코딩 서열 유전자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 및 내인성 제아 메이즈 참조 유전자, 인버타제에 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하는 TaqMan® 바이플렉스 검정은, FAM 형광 염료로 표지한 프로브를 함유하는 하나의 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 코딩 서열에 대한 유전자-특이적 DNA 단편을 증폭하고 검출함으로써, 및 HEX 형광으로 표지한 프로브를 함유하는 제2 TaqMan® 프라이머/프로브 세트를 사용하여 인버타제에 대한 유전자-특이적 DNA 단편을 증폭하고 검출함으로써 수행하였다. 표 7에 따르면, 코딩 서열 TaqMan® 반응 혼합물을 표 8에 기재된 바와 같이 제조하고, 특이적 단편을 표 9에 기재된 조건에 따라 증폭하였다.
Figure pct00004
각각의 반응에 대해 생성된 형광의 수준을 제조자의 지시에 따라 로슈 라이트사이클러 480™ 써모사이클러를 이용하여 분석하였다. FAM 형광 모이어티는 465/510 nm의 광학 밀도에서 여기하고, HEX 형광 모이어티는 533/580 nm의 광학 밀도에서 여기하였다. 카피수는 미지의 샘플에 대한 표적/참조 값 (라이트사이클러 480™에 의한 출력)을 4개의 공지의 카피수 표준물 (예를 들어, Null, 1-카피 (hemi), 2-카피 (homo) 및 4-카피)의 표적/참조 값에 비교하여 결정할 수 있다.
PCR 증폭을 위한 써모사이클러 조건
PCR 단계 온도 (℃) 시간 사이클의 수
단계-1 95 10분 1
단계-2 95 10초 40
59 35초
72 1초
단계-3 40 10초 1
양방향성 ZmUbi1 프로모터 구축물 (pDAB108717 및 pDAB108718)을 사용한 형질전환을 통해 얻어진 트랜스제닉 식물의, 및 대조군 단방향성 ZmUbi1 프로모터 Phiyfp 구축물 (pDAB105748)을 사용한 형질전환을 통해 얻어진 트랜스제닉 식물의 도입유전자 카피수 분석으로부터 결과를 표 10에 제시한다. 1-2 카피의 모든 도입유전자를 갖는 식물만을 추가의 발현 분석을 위해 온실로 옮겼다.
양방향성 프로모터 및 대조 구축물로부터 얻어진 트랜스제닉 식물의 도입유전자 카피수 추정.
구축물 형질전환된 배아의 수 양성 이벤트의 수 1-2 카피의 모든 유전자
pDAB108717 314 66 14
pDAB108718 252 63 10
pDAB105748 32 8 2
실시예 15: 옥수수 T 0 식물에서 안정한 Phiyfp 발현
양방향성 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된 제아 메이즈 T0 식물 내에서 안정한 Phiyfp 발현: aad1-2a-Phiyfp 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB108717 2성분 벡터를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아를 관찰할 수 있다. 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 새싹 및 뿌리 조직 모두에서 Phiyfp의 강력한 발현을 유도할 수 있었다. 결과는 양방향성 Zm Ubi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 2A 서열을 이용하여 aad1과 바이시스트론성으로 융합된 리포터 유전자, 예를 들어 Phiyfp 또는 YFP를 발현할 수 있음을 확인한다. Phiyfp 단백질의 발현 수준은 Phiyfp 코딩 서열을 유도하는 단방향성 Zm Ubi1 프로모터를 함유하는 대조군 2성분 벡터 (pDAB105748)로 형질전환된 제아 메이즈 배아와 유사하였다. Phiyfp의 발현은 2성분 구축물로 형질전환되지 않고 Phiyfp 코딩 서열을 함유하지 않은 음성 대조군 식물에서 관찰되지 않았다.
Phiyfp-2a-aad1 유전자 발현 카세트를 함유하는 pDAB108718 2성분 벡터에 트랜스제닉인 제아 메이즈 T0 식물의 잎 및 뿌리 조직에서 Phiyfp 발현을 관찰할 수 있었다. 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 Phiyfp의 강력한 발현을 유도할 수 있었다. 이 결과는 양방향성 Zm Ubi1 프로모터의 Min-UbiP1 최소 프로모터 요소가 2A 서열을 사용하여 aad-1에 융합된 리포터 유전자, 예를 들어 Phiyfp 또는 YFP를 발현할 수 있음을 확인한다.
실시예 16: Cry34 , Cry35 , 및 AAD1 단백질 분석
식물을 1개의 강철 비드를 첨가한 후 PBST+0.5% BSA (0.6 mL)를 첨가한 1.5 mL 원추형 튜브 내에서 매트릭스 박스의 컬럼 1-10 내로 샘플링하였다. 이어서, 박스를 1500 rpm에서 5분 동안 제노 (Geno) 분쇄기 내에서 샘플 분쇄를 위해 비드 비팅한 후, 4℃에서 7분 동안 3700 rpm에서 원심분리하였다.
Cry34/35 ELISA 검정: 별개의 96 딥 웰 플레이트에서, 추출물의 샘플을 PBST + 1% 블로토 (blotto) 내에 1:200 희석하였다. 이어서, 2 부피의 25 ㎕의 희석된 샘플을 항-Cry34 및 항-Cry35 (메조 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery))를 배열한 별개의 96-웰 플레이트에 옮겼다. 각각의 플레이트의 11 및 12 컬럼에, PBST+1% 블로토 내의 표준 농도의 Cry34 및 Cry35를 첨가하였다 (25 ㎕). 이어서, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하였다 (3x300 ㎕). 이어서, 술포TAG 접합된 항-Cry34 및 항-Cry35의 용액 25 ㎕을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하였다 (3x300 ㎕). 이어서, 150 ㎕ 부피의 판독 완충제 T (메조 스케일 디스커버리)를 첨가하고, 플레이트를 SECTOR® 6000 판독기 상에서 즉시 판독하였다. 샘플 내의 단백질의 농도는 동일한 플레이트로부터 생성한 각각의 단백질에 대한 표준 곡선을 사용하여 계산할 수 있다.
AAD-1 ELISA 검정: 별개의 96 딥 웰 플레이트에서, 추출물의 샘플을 PBST + 0.5% BSA 내에 1:20 희석하였다. 이어서, 2 부피의 200 ㎕의 희석된 샘플을 항-AAD1 (아카디아 바이오사이언스 엘엘씨 (Acadia Bioscience LLC) 제품)을 코팅한 별개의 96 웰 플레이트에 옮겼다. 각각의 플레이트의 11 및 12 컬럼에, PBST + 0.5% BSA 내의 표준 농도의 AAD1을 첨가하였다 (200 ㎕). 이어서, 50 ㎕ 부피의 비오티닐화 항-AAD1을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하였다 (5x300 ㎕). 이어서, 100 ㎕의 스트렙타비딘-알칼리성 포스페이트 접합체 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 실온에서 30분 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 PBST로 세척하였다 (5x300 ㎕). 이어서, 100 ㎕ 부피의 기질 (p-니트로페닐포스페이트, PNPP)을 첨가하고, 실온에서 45분 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 이어서, 플레이트를 SpectraMax M5 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시즈 (Molecular Devices)) 상에서 A405에서 판독하였다. 샘플 내의 단백질의 농도는 동일한 플레이트로부터 생성된 표준 곡선을 이용하여 계산할 수 있다.
실시예 17: 옥수수 T 0 식물의 단백질 분석
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물 (pDAB108717)에 의해 유도된 옥수수 T0 식물의 단백질 분석: cry34-2a-cry35 및 aad1-2a-Phiyfp를 함유하는 pDAB108717을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 11개의 트랜스제닉 T0 옥수수 식물의 대표적인 ELISA 분석을 표 11에 요약한다. 양방향성 Zm Ubi1 프로모터는 잎에서 Cry34 및 Cry35 코딩 서열 모두의 강력한 발현을 보여주었다. 놀랍게도, 단백질 데이타는 단방향성 Zm Ubi1-유도된 구축물에 비해 양방향성 구축물 pDAB108717로부터 Cry34의 4-배까지 더 높은 발현을 나타냈다. 단방향성 Zm Ubi1-유도된 구축물에 비해 양방향성 구축물 pDAB108717로부터 Cry35 및 AAD1 단백질의 유사한 8-10배 더 높은 발현이 또한 예기치 않게 관찰되었다. 이들 관찰은 구축물 pDAB108717 내의 단일 Zm 유비퀴틴1 양방향성 프로모터가 동일한 유전자를 유도하는 단방향성 Zm Ubi1 프로모터를 함유하는 2성분 플라스미드로 형질전환된 제아 메이즈 식물에 비해 예기치 않게 더 높은 수준으로 다중 유전자 (예를 들어, Cry34, Cry35, 및 AAD1)를 발현할 수 있음을 보여주고, 여기서 각각의 코딩 서열은 독립적인 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된다.
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물 (pDAB108717)에 의해 유도된 옥수수 T0 식물의 Cry34 및 Cry35 발현 상관성: cry34-2a-cry35를 함유하는 pDAB108717을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 11개의 트랜스제닉 T0 옥수수 식물에서 Cry34 및 Cry35 단백질 사이의 상관성 분석을 도 23a에 제시한다. 매우 높은 상관성 (R 제곱 = 0.98)은 양방향성 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된 cry34-2a-cry35 유전자 발현 카세트로부터 Cry34 및 Cry35 사이의 강한 발현 동시-조절을 입증한다.
Figure pct00005
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물 (pDAB108718)에 의해 유도된 옥수수 T0 식물의 단백질 분석: cry34-2a-cry35를 함유하는 pDAB108718을 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 11개의 트랜스제닉 T0 옥수수 식물의 대표적인 ELISA 분석을 표 12에 요약한다. 양방향성 ZmUbi1 프로모터는 잎에서 Cry34 및 Cry35 코딩 서열 모두의 강력한 발현을 보여주었다. 단백질 데이타는 단방향성 Zm Ubi1-구동된 구축물에 비해 양방향성 구축물 pDAB108718로부터 Cry34, Cry35 및 AAD1 단백질의 수배 더 높은 발현을 입증한다. 이들 관찰은 구축물 pDAB108718 내의 제아 메이즈 유비퀴틴1 양방향성 프로모터가 동일한 유전자를 유도하는 단방향성 Zm Ubi1 프로모터를 함유하는 2성분 플라스미드로 형질전환된 제아 메이즈 식물에 비해 예기치 않게 더 높은 수준으로 다중 유전자 (예를 들어, Cry34, Cry35, 및 AAD1)를 발현하였음을 확인하고, 여기서 각각의 코딩 서열은 독립적인 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된다.
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물 (pDAB108718)에 의해 구동된 옥수수 T0 식물의 Cry34 및 Cry35 발현 상관성: cry34-2a-cry35를 함유하는 pDAB108718를 사용하여 형질전환된 제아 메이즈 배아로부터 얻어진 11개의 트랜스제닉 T0 옥수수 식물에서 Cry34 및 Cry35 단백질 사이의 상관성 분석을 도 23b에 제시한다. 매우 높은 상관성 (R 제곱 = 0.98)은 양방향성 Zm Ubi1 프로모터에 의해 유도된 cry34-2a-cry35 유전자 발현 카세트로부터 Cry34 및 Cry35 사이의 강한 발현 동시-조절을 입증한다.
Figure pct00006
실시예 18: 도입유전자 집적: 합성 양방향성 프로모터 ( T1 데이타 )
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물에 의해 유도된 T1 식물의 유전자 발현: 구축물당 10 내지 12개의 단일 카피 이벤트를 분석을 위해 선택하였고, 단, 대조 구축물 pDAB108716은 단지 하나의 이벤트를 가졌다. V6기에 대해 5개의 식물/이벤트를 시험하고, V10-12 및/R3기에 대해 3개의 식물/이벤트를 시험하였다. 단백질 검정을 LCMS 또는 ELISA를 이용하여 수행하였다.
본 실시예에서 사용된 구축물을 도 26에 제시한다. pDAB108706 (ZMUbi 양방향 (-200)) 및 pDAB108707 (ZMUbi 양방향 (-90))은 본 발명의 각각의 양방향성 프로모터를 갖는 구축물이고; pDAB101556 (ZmUbi1-YFP 대조군) 및 pDAB108716 (최소 프로모터가 없는 ZMUbi1)이 단방향성 프로모터를 갖는 대조 구축물로서 역할을 하였다.
YFP 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 발현 결과 (V6)를 도 27a에 제시하고, YFP RNA에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 도 27b에 제시한다.
GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 발현 결과 (V6)를 도 28a에 제시하고, GUS RNA에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 도 28b에 제시한다.
AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 발현 결과 (V6)를 도 29a에 제시하고, AAD1 RNA에 대한 4개의 구축물로부터 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 도 29b에 제시한다.
YFP 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 30a에 제시하고, pDAB108707, pDAB108706, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 57.63, 52.66, 49.75, 및 0이다. YFP RNA에 대한 4개의 구축물로부터 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 30b에 제시하고, pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 9.96, 8.07, 6.95, 및 1.01이다.
GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 31A에 제시하고, pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 151.27, 143.22, 0, 및 213.17이다. GUS RNA에 대한 4개의 구축물로부터 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 31B에 제시하고, pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 0.65, 0.78, 0, 및 3.03이다.
AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대한 4개의 구축물로부터 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 32A에 제시하고, pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 710.88, 1417.01, 856.58, 및 1795.43이다. AAD1 RNA에 대한 4개의 구축물로부터 상대적인 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 도 32B에 제시하고, pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716에 대한 평균값은 각각 1.33, 1.37, 1.93, 및 2.93이다.
도 33a, 33b, 및 33c는 각각 YFP, AAD1, 및 GUS 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (V10)를 보여준다.
도 34a, 34b, 및 34c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (V10)의 통계적 분석을 보여준다. YFP (도 34a)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 71.77, 81.81, 49.58, 및 23.01이다. GUS (도 34b)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 109.63, 98.25, 0, 및 138.02이다. AAD1 (도 34c)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 666.11, 597.80, 715.12, 및 1002.84이다.
도 35a, 35b, 및 35c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 4개의 구축물로부터의 예시적인 발현 결과 (R3)를 보여준다.
도 36a, 36b, 및 36c는 각각 YFP, GUS, 및 AAD1 단백질 (LCMS) (ng/cm2)에 대해 4개의 구축물로부터의 발현 결과 (R3)의 통계적 분석을 보여준다. YFP (도 36a)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 91.38, 49.49, 21.67, 및 0.40이다. GUS (도 36b)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 5.52, 16.81, 1.07, 및 46.60이다. AAD1 (도 36c)에 대한 pDAB108706, pDAB108707, pDAB101556, 및 pDAB108716의 평균값은 각각 156.71, 15.44, 165.40, 및 197.80이다.
결과는 본 발명의 옥수수 Ubi1 양방향성 프로모터가 GUS 및 YFP의 강력한 발현을 유도할 수 있음을 보여주고, 여기서 옥수수 Ubi1 양방향성 프로모터로부터 YFP 발현은 단방향성 옥수수 Ubi1 유도된 YFP와 유사하다. 결과는 또한 양방향 전사가 GUS 발현에 대해 비-유의한 효과를 가짐을 제안한다 (YFP 발현이 없이 최소 프로모터가 결여된 구축물에 비교한 GUS 발현).
실시예 19: 하나의 단일 프로모터로부터 4개의 도입유전자를 유도하기 위해 양방향성 프로모터 및 2A 바이시스트론성 서열의 조합 ( T1 데이타 )
양방향성 제아 메이즈 유비퀴틴1 프로모터 구축물에 의해 유도된 T1 식물의 유전자 발현: 구축물당 10 내지 12개의 단일 카피 이벤트를 분석을 위해 선택하였고, 단, 대조 구축물은 구축물당 4개 또는 5개의 이벤트를 가졌다. V6기에 대해 5개의 식물/이벤트를 시험하고, V10-12 및/R3기에 대해 3개의 식물/이벤트를 시험하였다. 단백질 검정을 LCMS 또는 ELISA를 이용하여 수행하였다.
도 37a는 4개의 구축물 pDAB105748 (ZMUbi1-YFP), pDAB105818 (ZMUbi1-Cry34/ZMUbi1-Cry35/ZMUbi1-AAD1), pDAB108717 (YFP/AAD-1-ZMUbi1 양방향-Cry34-Cry35), 및 pDAB108718 (AAD1/YFP-ZMUbi1 양방향-Cry34-Cry35)로부터의 Cry34 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 37b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 38a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 38b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 39a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 39b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP 단백질 (LCMS)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 40a는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다. 도 40b는 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 단백질 (ELISA)의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 41은 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 PAT RNA의 예시적인 상대적인 발현 결과 (V6)를 보여준다.
도 42A는 평균값이 각각 0, 2.42, 2.67, 및 2.25인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 42B는 평균값이 각각 0, 596.94, 2044.73, 및 719.18인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry34 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 43a는 평균값이 각각 0, 1.98, 2.68, 및 2.03인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 43b는 평균값이 각각 0, 2237.54, 5763.88, 및 2379.15인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 AAD1 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 44a는 평균값이 각각 3.59, 0, 2.78, 및 1.95인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 44b는 평균값이 각각 1420.69, 251.68, 1154.04, 및 706.04인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 YFP 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 45a는 평균값이 각각 0, 1.12, 3.74, 및 3.20인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다. 도 45b는 평균값이 각각 0, 283.54, 635.83, 및 90.97인, 동일한 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 Cry35 단백질의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 46은 평균값이 각각 1.56, 0.07, 1.46, 및 1.01인, 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터의 PAT RNA의 발현 결과 (V6)의 통계적 분석을 보여준다.
도 47a, 47b, 47c, 및 47d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 예시적인 단백질 발현 결과 (V10)를 보여준다.
도 48a, 48b, 48c, 및 48d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 단백질 발현 결과 (V10)의 통계적 분석을 보여준다.
도 49a, 49b, 49c, 및 49d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 예시적인 단백질 발현 결과 (R3)를 보여준다.
도 50a, 50b, 50c, 및 50d는 4개의 구축물 pDAB105748, pDAB105818, pDAB108717, 및 pDAB108718로부터 각각 YFP, AAD1, Cry34, 및 Cry35의 단백질 발현 결과 (R3)의 통계적 분석을 보여준다.
도 51은 pDAB108718 및 pDAB108717로부터 Cry34, Cry35, 및 AAD1의 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯의 예시적인 결과를 보여준다.
결과는 단일 프로모터-유도된 구축물 내의 모든 4개의 도입유전자는 우수한 발현 수준을 가지면서 기능성임을 보여준다. Ubi1 양방향성 스택 내의 3개의 유전자 (Cry34/Cry35/AAD1)은 단일 Ubi1-유도된 유전자 스택 (DExT)에 의해 제공된 발현 수준과 유사한 정도로 강력한 발현 수준을 보여준다.
많은 예시적인 측면 및 실시양태를 위에서 논의하였지만, 당업자는 이들의 특정 변형, 치환, 첨가 및 하위 조합을 알 것이다. 따라서, 다음 첨부된 특허청구범위 및 청구항은 그의 진정한 취지 및 범위 내에 있는 모든 상기 변형, 치환, 첨가 및 하위 조합을 포함하는 것으로 이해되는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Kumar, Sandeep Alabed, Diaa Wright, Terry Gupta, Manju <120> CONSTRUCT AND METHOD FOR SYTHETIC BIDIRECTIONAL PLANT PROMOTER UBI1 <130> 2971-P10695.1US <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 215 <212> DNA <213> Zea mays <400> 1 ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga 60 aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca 120 cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc 180 cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctct 215 <210> 2 <211> 1102 <212> DNA <213> Zea mays <400> 2 gtacctcccc aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa 60 tccacccgtc ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc ccccccctct 120 ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tgcatggtta gggcccggta gttctacttc 180 tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac 240 ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg 300 gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt 360 tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt 420 tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg 480 cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt 540 ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa 600 tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg 660 ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag 720 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt 780 gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata 840 ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta 900 ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta 960 tttcgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag 1020 ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg 1080 ttgtttggtg ttacttctgc ag 1102 <210> 3 <211> 1319 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Reverse complement of polynucleotide comprising Z. mays minUbi1P minimal core promoter; Z. mays Ubi1 leader; and Z mays Ubi1 intron <220> <221> UbiI-Intron <222> (1)..(1015) <220> <221> Ubi1-leader <222> (1016)..(1097) <220> <221> minUbi1P-min_core_promoter <222> (1098)..(1319) <400> 3 ctgcagaagt aacaccaaac aacagggtga gcatcgacaa aagaaacagt accaagcaaa 60 taaatagcgt atgaaggcag ggctaaaaaa atccacatat agctgctgca tatgccatca 120 tccaagtata tcaagatcga aataattata aaacatactt gtttattata atagataggt 180 actcaaggtt agagcatatg aatagatgct gcatatgcca tcatgtatat gcatcagtaa 240 aacccacatc aacatgtata cctatcctag atcgatattt ccatccatct taaactcgta 300 actatgaaga tgtatgacac acacatacag ttccaaaatt aataaataca ccaggtagtt 360 tgaaacagta ttctactccg atctagaacg aatgaacgac cgcccaacca caccacatca 420 tcacaaccaa gcgaacaaaa agcatctctg tatatgcatc agtaaaaccc gcatcaacat 480 gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcatcttc aattcgtaac tatgaatatg 540 tatggcacac acatacagat ccaaaattaa taaatccacc aggtagtttg aaacagaatt 600 ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa 660 agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg 720 caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac 780 ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga gaaacactgg caagttagca atcagaacgt 840 gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga acgctagcag cacggatcta acacaaacac 900 ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga actaccgggc cctaaccatg catggaccgg 960 aacgccgatc tagagaaggt agagaggggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga 1020 agcggaggtg ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa 1080 caacacgagg ttggggaggt accaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg 1140 gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt 1200 gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt 1260 ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccag 1319 <210> 4 <211> 680 <212> DNA <213> Zea mays <400> 4 gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 60 taaaaaatta ccacatattt tttttgtcac acttgtttga agtgcagttt atctatcttt 120 atacatatat ttaaacttta ctctacgaat aatataatct atagtactac aataatatca 180 gtgttttaga gaatcatata aatgaacagt tagacatggt ctaaaggaca attgagtatt 240 ttgacaacag gactctacag ttttatcttt ttagtgtgca tgtgttctcc tttttttttg 300 caaatagctt cacctatata atacttcatc cattttatta gtacatccat ttagggttta 360 gggttaatgg tttttataga ctaatttttt tagtacatct attttattct attttagcct 420 ctaaattaag aaaactaaaa ctctatttta gtttttttat ttaatagttt agatataaaa 480 tagaataaaa taaagtgact aaaaattaaa caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta 540 aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata atgccagcct gttaaacgcc gtcgacgagt 600 ctaacggaca ccaaccagcg aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca 660 cggcatctct gtcgctgcct 680 <210> 5 <211> 3322 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary synthetic Ubi1 bidirectional promoter <220> <221> First_minUbi1P-reverse_complement <222> (1105)..(1319) <220> <221> Second_minUbi1P-reverse_complement <222> (2009)..(2244) <400> 5 ctgcagaagt aacaccaaac aacagggtga gcatcgacaa aagaaacagt accaagcaaa 60 taaatagcgt atgaaggcag ggctaaaaaa atccacatat agctgctgca tatgccatca 120 tccaagtata tcaagatcga aataattata aaacatactt gtttattata atagataggt 180 actcaaggtt agagcatatg aatagatgct gcatatgcca tcatgtatat gcatcagtaa 240 aacccacatc aacatgtata cctatcctag atcgatattt ccatccatct taaactcgta 300 actatgaaga tgtatgacac acacatacag ttccaaaatt aataaataca ccaggtagtt 360 tgaaacagta ttctactccg atctagaacg aatgaacgac cgcccaacca caccacatca 420 tcacaaccaa gcgaacaaaa agcatctctg tatatgcatc agtaaaaccc gcatcaacat 480 gtatacctat cctagatcga tatttccatc catcatcttc aattcgtaac tatgaatatg 540 tatggcacac acatacagat ccaaaattaa taaatccacc aggtagtttg aaacagaatt 600 ctactccgat ctagaacgac cgcccaacca gaccacatca tcacaaccaa gacaaaaaaa 660 agcatgaaaa gatgacccga caaacaagtg cacggcatat attgaaataa aggaaaaggg 720 caaaccaaac cctatgcaac gaaacaaaaa aaatcatgaa atcgatcccg tctgcggaac 780 ggctagagcc atcccaggat tccccaaaga gaaacactgg caagttagca atcagaacgt 840 gtctgacgta caggtcgcat ccgtgtacga acgctagcag cacggatcta acacaaacac 900 ggatctaaca caaacatgaa cagaagtaga actaccgggc cctaaccatg catggaccgg 960 aacgccgatc tagagaaggt agagaggggg ggggggggga ggacgagcgg cgtaccttga 1020 agcggaggtg ccgacgggtg gatttggggg agatctggtt gtgtgtgtgt gcgctccgaa 1080 caacacgagg ttggggaggt accaagaggg tgtggagggg gtgtctattt attacggcgg 1140 gcgaggaagg gaaagcgaag gagcggtggg aaaggaatcc cccgtagctg ccggtgccgt 1200 gagaggagga ggaggccgcc tgccgtgccg gctcacgtct gccgctccgc cacgcaattt 1260 ctggatgccg acagcggagc aagtccaacg gtggagcgga actctcgaga ggggtccagc 1320 cgcggagtgt gcagcgtgac ccggtcgtgc ccctctctag agataatgag cattgcatgt 1380 ctaagttata aaaaattacc acatattttt tttgtcacac ttgtttgaag tgcagtttat 1440 ctatctttat acatatattt aaactttact ctacgaataa tataatctat agtactacaa 1500 taatatcagt gttttagaga atcatataaa tgaacagtta gacatggtct aaaggacaat 1560 tgagtatttt gacaacagga ctctacagtt ttatcttttt agtgtgcatg tgttctcctt 1620 tttttttgca aatagcttca cctatataat acttcatcca ttttattagt acatccattt 1680 agggtttagg gttaatggtt tttatagact aattttttta gtacatctat tttattctat 1740 tttagcctct aaattaagaa aactaaaact ctattttagt ttttttattt aatagtttag 1800 atataaaata gaataaaata aagtgactaa aaattaaaca aatacccttt aagaaattaa 1860 aaaaactaag gaaacatttt tcttgtttcg agtagataat gccagcctgt taaacgccgt 1920 cgacgagtct aacggacacc aaccagcgaa ccagcagcgt cgcgtcgggc caagcgaagc 1980 agacggcacg gcatctctgt cgctgcctct ggacccctct cgagagttcc gctccaccgt 2040 tggacttgct ccgctgtcgg catccagaaa ttgcgtggcg gagcggcaga cgtgagccgg 2100 cacggcaggc ggcctcctcc tcctctcacg gcaccggcag ctacggggga ttcctttccc 2160 accgctcctt cgctttccct tcctcgcccg ccgtaataaa tagacacccc ctccacaccc 2220 tctttcccca acctcgtgtt gttcggagcg cacacacaca caaccagatc tcccccaaat 2280 ccacccgtcg gcacctccgc ttcaaggtac gccgctcgtc ctcccccccc ccccccctct 2340 ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca tgcatggtta gggcccggta gttctacttc 2400 tgttcatgtt tgtgttagat ccgtgtttgt gttagatccg tgctgctagc gttcgtacac 2460 ggatgcgacc tgtacgtcag acacgttctg attgctaact tgccagtgtt tctctttggg 2520 gaatcctggg atggctctag ccgttccgca gacgggatcg atttcatgat tttttttgtt 2580 tcgttgcata gggtttggtt tgcccttttc ctttatttca atatatgccg tgcacttgtt 2640 tgtcgggtca tcttttcatg cttttttttg tcttggttgt gatgatgtgg tctggttggg 2700 cggtcgttct agatcggagt agaattctgt ttcaaactac ctggtggatt tattaatttt 2760 ggatctgtat gtgtgtgcca tacatattca tagttacgaa ttgaagatga tggatggaaa 2820 tatcgatcta ggataggtat acatgttgat gcgggtttta ctgatgcata tacagagatg 2880 ctttttgttc gcttggttgt gatgatgtgg tgtggttggg cggtcgttca ttcgttctag 2940 atcggagtag aatactgttt caaactacct ggtgtattta ttaattttgg aactgtatgt 3000 gtgtgtcata catcttcata gttacgagtt taagatggat ggaaatatcg atctaggata 3060 ggtatacatg ttgatgtggg ttttactgat gcatatacat gatggcatat gcagcatcta 3120 ttcatatgct ctaaccttga gtacctatct attataataa acaagtatgt tttataatta 3180 tttcgatctt gatatacttg gatgatggca tatgcagcag ctatatgtgg atttttttag 3240 ccctgccttc atacgctatt tatttgcttg gtactgtttc ttttgtcgat gctcaccctg 3300 ttgtttggtg ttacttctgc ag 3322 <210> 6 <211> 6698 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary nucleic acid comprising yfp and GUS expression cassettes driven by a synthetic Ubi1 bidirectional promoter <400> 6 agcacttaaa gatctttaga agaaagcaaa gcatttatta atacataaca atgtccaggt 60 agcccagctg aattacaata cgcaactgct cataataatt caacaaaccc aagtagtaca 120 caacatccag aagcaaataa agcccatacg taccaaagcc tacacaagca gcaacactca 180 ctgccagtgc cggtgggtct ttaaagcaca cgggccttga ccacgcgatc caccttgaaa 240 caaacttggt aaaattaaag caaaccagaa gcacacacac gccaacgcaa cgcttctgat 300 cgcgcgccca aggcccggcc ggccagaacg tacgacggac acgcacacgc tgcgaccgag 360 ctctaggtga ttaagctaac tactcaaagg taggtcttgc gacagtcaac agctctgaca 420 gtttctttca aggacatgtt gtctctgtgg tctgtcacat ctttggaaag tttcacatgg 480 taagacatgt gatgatactc tggaacatga actggacctc caccaatggg agtgttcatc 540 tgggtgtggt cagccactat gaagtcgcct ttgctgccag taatctcatg acagatcttg 600 aaggctgact tgagaccgtg gttggcttgg tcaccccaga tgtagaggca gtggggagtg 660 aagttgaact ccaagttctt tcccaacaca tgaccatctt tcttgaagcc ttgaccattg 720 agtttgaccc tattgtagac agacccattc tcaaaggtga cttcagccct agtcttgaag 780 ttgccatctc cttcaaaggt gattgtgcgc tcttgcacat agccatctgg catacaggac 840 ttgtagaagt ccttcaactc tggaccatac ttggcaaagc actgtgctcc ataggtgaga 900 gtggtgacaa gtgtgctcca aggcacagga acatcaccag ttgtgcagat gaactgtgca 960 tcaacctttc ccactgaggc atctccgtag cctttcccac gtatgctaaa ggtgtggcca 1020 tcaacattcc cttccatctc cacaacgtaa ggaatcttcc catgaaagag aagtgctcca 1080 gatgccatgg tgtcgtgtgg atccggtaca cacgtgccta ggaccggttc aactaactac 1140 tgcagaagta acaccaaaca acagggtgag catcgacaaa agaaacagta ccaagcaaat 1200 aaatagcgta tgaaggcagg gctaaaaaaa tccacatata gctgctgcat atgccatcat 1260 ccaagtatat caagatcgaa ataattataa aacatacttg tttattataa tagataggta 1320 ctcaaggtta gagcatatga atagatgctg catatgccat catgtatatg catcagtaaa 1380 acccacatca acatgtatac ctatcctaga tcgatatttc catccatctt aaactcgtaa 1440 ctatgaagat gtatgacaca cacatacagt tccaaaatta ataaatacac caggtagttt 1500 gaaacagtat tctactccga tctagaacga atgaacgacc gcccaaccac accacatcat 1560 cacaaccaag cgaacaaaaa gcatctctgt atatgcatca gtaaaacccg catcaacatg 1620 tatacctatc ctagatcgat atttccatcc atcatcttca attcgtaact atgaatatgt 1680 atggcacaca catacagatc caaaattaat aaatccacca ggtagtttga aacagaattc 1740 tactccgatc tagaacgacc gcccaaccag accacatcat cacaaccaag acaaaaaaaa 1800 gcatgaaaag atgacccgac aaacaagtgc acggcatata ttgaaataaa ggaaaagggc 1860 aaaccaaacc ctatgcaacg aaacaaaaaa aatcatgaaa tcgatcccgt ctgcggaacg 1920 gctagagcca tcccaggatt ccccaaagag aaacactggc aagttagcaa tcagaacgtg 1980 tctgacgtac aggtcgcatc cgtgtacgaa cgctagcagc acggatctaa cacaaacacg 2040 gatctaacac aaacatgaac agaagtagaa ctaccgggcc ctaaccatgc atggaccgga 2100 acgccgatct agagaaggta gagagggggg ggggggggag gacgagcggc gtaccttgaa 2160 gcggaggtgc cgacgggtgg atttggggga gatctggttg tgtgtgtgtg cgctccgaac 2220 aacacgaggt tggggaggta ccaagagggt gtggaggggg tgtctattta ttacggcggg 2280 cgaggaaggg aaagcgaagg agcggtggga aaggaatccc ccgtagctgc cggtgccgtg 2340 agaggaggag gaggccgcct gccgtgccgg ctcacgtctg ccgctccgcc acgcaatttc 2400 tggatgccga cagcggagca agtccaacgg tggagcggaa ctctcgagag gggtccagcc 2460 gcggagtgtg cagcgtgacc cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 2520 taagttataa aaaattacca catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc 2580 tatctttata catatattta aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat 2640 aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat gaacagttag acatggtcta aaggacaatt 2700 gagtattttg acaacaggac tctacagttt tatcttttta gtgtgcatgt gttctccttt 2760 ttttttgcaa atagcttcac ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta 2820 gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt 2880 ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc tattttagtt tttttattta atagtttaga 2940 tataaaatag aataaaataa agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa 3000 aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga gtagataatg ccagcctgtt aaacgccgtc 3060 gacgagtcta acggacacca accagcgaac cagcagcgtc gcgtcgggcc aagcgaagca 3120 gacggcacgg catctctgtc gctgcctctg gacccctctc gagagttccg ctccaccgtt 3180 ggacttgctc cgctgtcggc atccagaaat tgcgtggcgg agcggcagac gtgagccggc 3240 acggcaggcg gcctcctcct cctctcacgg caccggcagc tacgggggat tcctttccca 3300 ccgctccttc gctttccctt cctcgcccgc cgtaataaat agacaccccc tccacaccct 3360 ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc 3420 cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc cccccctctc 3480 taccttctct agatcggcgt tccggtccat gcatggttag ggcccggtag ttctacttct 3540 gttcatgttt gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg 3600 gatgcgacct gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg 3660 aatcctggga tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt 3720 cgttgcatag ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt 3780 gtcgggtcat cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc 3840 ggtcgttcta gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg 3900 gatctgtatg tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat 3960 atcgatctag gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc 4020 tttttgttcg cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga 4080 tcggagtaga atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg 4140 tgtgtcatac atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag 4200 gtatacatgt tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat 4260 tcatatgctc taaccttgag tacctatcta ttataataaa caagtatgtt ttataattat 4320 ttcgatcttg atatacttgg atgatggcat atgcagcagc tatatgtgga tttttttagc 4380 cctgccttca tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt 4440 tgtttggtgt tacttctgca ggtacagtag ttagttgagg tacagcggcc gcagggcacc 4500 atggtccgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 4560 ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 4620 gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 4680 cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 4740 ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 4800 aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 4860 tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 4920 cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 4980 ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 5040 aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 5100 tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 5160 caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 5220 ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 5280 gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 5340 ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 5400 ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 5460 attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 5520 gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 5580 ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 5640 aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 5700 aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 5760 gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 5820 atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 5880 gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 5940 gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 6000 atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 6060 tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 6120 agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 6180 ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 6240 gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 6300 ggcaaacaat gagacgtccg gtaaccttta aactgagggc actgaagtcg cttgatgtgc 6360 tgaattgttt gtgatgttgg tggcgtattt tgtttaaata agtaagcatg gctgtgattt 6420 tatcatatga tcgatctttg gggttttatt taacacattg taaaatgtgt atctattaat 6480 aactcaatgt ataagatgtg ttcattcttc ggttgccata gatctgctta tttgacctgt 6540 gatgttttga ctccaaaaac caaaatcaca actcaataaa ctcatggaat atgtccacct 6600 gtttcttgaa gagttcatct accattccag ttggcattta tcagtgttgc agcggcgctg 6660 tgctttgtaa cataacaatt gttacggcat atatccaa 6698 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> YFP Forward primer <400> 7 gatgcctcag tgggaaagg 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> YFP Reverse primer <400> 8 ccataggtga gagtggtgac aa 22 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Invertase forward primer <400> 9 tggcggacga cgacttgt 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Invertase Reverse primer <400> 10 aaagtttgga ggctgccgt 19 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Invertase probe <400> 11 cgagcagacc gccgtgtact tctacc 26 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAD1 Forward primer <400> 12 tgttcggttc cctctaccaa 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAD1 Reverse primer <400> 13 caacatccat caccttgact ga 22 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> AAD1 probe <400> 14 cacagaaccg tcgcttcagc aaca 24 <210> 15 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter <400> 15 ctggacccct ctcgagtgtt ccgcttcacc gttggacttg ctacgctgtc agcatcgaga 60 tgttgcgtgg cggagcggca gacttgagcc gtcacggcag gcggcctcct cctcctctca 120 cggcatctgt agctacgggg gattcctttc gcaccgctcg ttcgctttcc cttcctcgtc 180 tgccgaaata atgttacacc ccctccacag cctct 215 <210> 16 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 2 <400> 16 ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggactag ctctgctgtc ggcatccaga 60 aaatgcttgg cagtgcggca gacgtgagcc ggcacggcag ggggcctcct cctgctctca 120 cggcacatga agctacgggt gatagcttgc ccaccgctcc aacgctttcc cttactctca 180 cgccgtaata aatagacacc ccttccacaa cctct 215 <210> 17 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 3 <400> 17 ctggacctct ctcgagagtt gcgctccacc gatggacttg ctccgctgtc ggcgtccata 60 atttgcgtgg cggagcggca gacgggagcc ggcacggcag ggagcctcgt cctcctctca 120 cggcacctgc aactacgggg gattcctatc ccaccgctcc ttcgctttca cttcttcgcc 180 ctccttaata agtagacacc ccatccgagc cctct 215 <210> 18 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 4 <400> 18 caagacccct ctcgagagtt ccgcaccacc gttggacgtg ctccgctatc tgcatccaga 60 aattgcgtgg cggaacggta aacgtgagcc gtcacggcag gcggcctcct cctcctctca 120 cgacaccggc agctacgggg gatacctgtc acacagctcc ttcgcttttc tttcctcgcc 180 cgccgtaata tgtatacact ccctccgcac cctct 215 <210> 19 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 5 <400> 19 ctggacccct ctcgagggtt ccgttccacc gttggtcttg gtccgctgtc gggatccaga 60 aatagcgtgg cggagcggca gacgtgatcc ggcacggcat gcggcctcct agtcctatca 120 cagcaccggc agctatggga gattccattc ccaccgctcc tgcgctttca ctggctggcc 180 cgccgtgata gatagacacc ccctccacac cctct 215 <210> 20 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 6 <400> 20 gttggcttct cttgtgagtt ctgcttcacg gatggacttg gtcaacggac ggcatccaga 60 atttgcgtgg cgtagcggcg gacgtgatcc ggcgcggcag gcggcttcct cctcctctca 120 cttaagcgac agctacaggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgcttgcc gtacctcgcc 180 cgccgtaata aatagacacc ccttccactc cctct 215 <210> 21 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 7 <400> 21 ctggatccct ctcgagagtg cggctccgac gttggacttg ctccgaagtc ggcatccaaa 60 aattgcgtgg tggagaggca gacttgagcc ggcacggcag gaggcctcgt cctactcgca 120 cggtatcggc agcaacggga gaatccttgc actctgctcc ttcgctgtac cttcctcgcc 180 cgctgatatt gatagacacc ccctgcatac cctct 215 <210> 22 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 8 <400> 22 atggaccctt ctcgagtgtt cggctccacc gttagacttg ctccacgatc gacatcaaga 60 aattgcgaga cggagctaca aacgtaagaa atctcggtag ggggcctcct cctcctctca 120 cggcaccggc agctacgggg gattcctgtc ccacctctcc ttcacgttcc ctacctcgcc 180 cgccataatt aataagcacc ccctccgcac cctct 215 <210> 23 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 9 <400> 23 ctggacccct ctaaagagtt ccacgccacc gttataatgg ctccgctgtc ggcatccaga 60 aattacttgg cggatcagca gacgtgagcc agcatggctg gcggcctcct cctcctctca 120 cgatgccgtc agctacgggg gattcctttc ccaacgctcc ttcgctttcc tatgcgcgcc 180 tgccggatta aataggcagc ttctcgtcac cctct 215 <210> 24 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 10 <400> 24 caagacacct ctcgattgtt ccgcttcacc gttggacttt ctcctcagtc ggcatacaga 60 aattgcttgg cgaagcggca gacatgagcc ggcacgacat gcgtcctcat tctcctctca 120 tggcaccggc agttactggt gaatcctatc gcaccgctcc ttcgctgtcc cttaatcgcc 180 cgccgaaaat aattgacacc ccatccacac cctct 215 <210> 25 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 11 <400> 25 gaggacccct ctcgtgtgta tcgctccacc tttggagttg gtccactatc ggcgtacaga 60 aaattcgttg cgaagcggca gacgtgagcc tacacggcag tcggcctcta cctcctgaca 120 aggcacgtgc agctacagat gatgcctttc ccaccactcc ttcgcgttcc tttcctcgcc 180 atcagtaatg aatggacacg tcctccagac tctct 215 <210> 26 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 12 <400> 26 ctgaacccat ctcgagtatg ccgcacgatc gattgacatg ctccactggc agcatccaga 60 aattgcattg gggagcatca ggcgtgagcc tgcacggcag gcggactatt cctcctcgcg 120 cggcaccggc aactacgggg gatgcttgac cgaccgctcc atcgatttcc caatctcgct 180 tgccgtatta aatagataac cccttcacac cctct 215 <210> 27 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 13 <400> 27 ctggactcct tacgggagat ccgctccacc gttggactag ctccgttttc ggcttcaata 60 aagggcgtgg gggagcggca gtcgggggca ggcacggcag tggtcctcat ccatatctca 120 cggggccggc agttgagggg gattcctgtc ccacctcacc tactctttcc ctacctcgtc 180 tgccatatta aatagtcacc ccctccacaa ccttt 215 <210> 28 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 14 <400> 28 ttggacccct ctcgaaagtt aggctccgcc gttggactgg tttcgcggtc atcaatcagg 60 aattgcgggg cggagggtca gacgtgtgcc ggcacagcag gtggcctcct catcgtcaca 120 aggcactggc aactacgggt gattcatttc cttcagcacc tacgcttacc ctgccacgcc 180 ctccgtatta taatgacacc ccctccacac cttat 215 <210> 29 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 15 <400> 29 ctggacccca cgcggggttt tcgttcctcc gttgggatag ctccggtgtc agcatacaga 60 gaatatatgt cggagcggaa gacgtgagcc gacacggcgg gctgccgcct cctcctgtca 120 cgacaccggc aggtacgggg gattccgttc ccgccgcaca gtcactttcg cttccttgcc 180 ggtcgtatta aatagacacc gtgtccacag cctct 215 <210> 30 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 16 <400> 30 cttgagccca ctctagagtt ccgtttcacc gaatgactag ctccgctgtc ggtatccatt 60 aagtgggagg cagaacgtca tatgagagtc ggcacgggag gcgttcgcca cgtccgcgca 120 ctacagcggg agctgcggaa tatacctgtc ccaatgctgc tacgctttcc cttccgcgcc 180 caccgtagaa aaatgacagt cccttcacac cctct 215 <210> 31 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 17 <400> 31 taggaggcct ctcgaaaggt ccggaactcc gtaggacgtg ctccgctgac agcatccagg 60 aatatcatgg gggagctgca gacgagagcc tggacgacaa ggggtcacct cggccgctga 120 cagctgcggc agcaacggag tatgcttttc tcaccgctcc ggcgctttcc cttcgacgca 180 ggccagaata agtagacatc agcgccacac cctct 215 <210> 32 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 18 <400> 32 cttgtctcca ctctgatgtt ccgctccaac atttgatttg ctcctctgta ggcatacagt 60 tattggggga ctgatcggca gacgtgagcc agcactgcaa acggccaact cctcctctct 120 cgactaaggg attaattaag gataccttac ccgcggctcc ttctctttcc ctacctagcc 180 cgccttatta aatagagacc gcctccacag ccgct 215 <210> 33 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 19 <400> 33 ctgtaccctt cacaagggtt acacgctacc gatggacttg caccactgtg gggttccaat 60 aattgcgtgg ctgggcgtca gacatattcc ggcatggcaa gcggcctgct cctcctctgg 120 gagcaccggc aacaatgggg gattccaagc ccgcaggtcc ttcgttttac cgtcctcgcc 180 cgccgtagta tgtaggcatc ccagagacta cctct 215 <210> 34 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 20 <400> 34 caggaaccct aacgagggtt ccgcacgacc aaatgacttg atcttctgtc ggcatccaga 60 aatggggtgt cagagcggca tgcgtgagcc ggcggggcgt gcggcctcat gctgctctcg 120 cgggactagg agttacgggg gatacctgta ttgccgctcc gacactgtac catcctctcc 180 cgccggagta tagagacacc ccctcgacgc catat 215 <210> 35 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 21 <400> 35 ctgtgctcct gtatggggtt caactccacc gtgaaatttg cgcctctgtc gtcatccaga 60 aattgcgtgg ttgatctgct gacgttaaag ggctctgcag gcggcttcct tcggctatga 120 aggtactggc gtctgcaagt gatgcttttg ctaactcgcc ttcgatgtcc cttcctcgcg 180 tgctttaata ggttgtcagc cgctccagac cattt 215 <210> 36 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 22 <400> 36 ctggtcccat cgctagtggt acgctccacc ggtggagtag ctcagatgtc tgaagggtgg 60 aatttagagg tggagagaca gacgtgagct agagcggcat gggacctggt ccaccgctcg 120 aggcaatggc aacgactgtt gaaaccttgc ccaccactcc tgcaattttc catcctcacc 180 ggccggaatg aattaaaacc cacgtcacaa cctct 215 <210> 37 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 23 <400> 37 cgtgacaggg ctcgggtgtt cggctccatc gtagtgcatg cgccgatgta agtatacaag 60 aagtacgtgg cttggcgtct gacgagggcc gtcaaggcag gcggcctcct tctaagctta 120 cggcgccggc aggttcgtag gttaccttac actcaactca tagtctatct attactcgta 180 ctgcgttata aattgtcacc ccctccacac cctct 215 <210> 38 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 24 <400> 38 aggaacgctt ctcgatggtt gcgcacatag gagggacttg atagtcggtg gaaatctaag 60 aattgcatat cagatctgca gacgttagcc gacatggcta gcagactact ccgcttcaca 120 cgtcagcgaa agcgacggag gatttcttgc caacggcgcc ttcgcgaacc cttcctcgcc 180 cgtcggaaga aagatactcc ccttgcacac cctct 215 <210> 39 <211> 215 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> min-Ubi1P or Ubi1-min P Minimal core promoter 25 <400> 39 cttgacttgg ctcgagagtt ctgcgcttcc attgtagttg cagcgatgtc ggagtccgag 60 ggttgcgtgg cggtgcggca gacgtgggca gatacgactg tatgccagca cctaaacata 120 cggtaccaga agctgcggtg gatacctttc ccgacgcata tacgttttcc gtgcctctca 180 cgccgtagta aataaactcc ccctcctgtt ccttt 215 <210> 40 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> YFP probe <400> 40 cttggagc 8 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry34 Forward Primer <400> 41 gccaacgacc agatcaagac 20 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry34 Reverse Primer <400> 42 gccgttgatg gagtagtaga tgg 23 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry34 Probe <400> 43 ccgaatccaa cggcttca 18 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry35 Forward Primer <400> 44 cctcatccgc ctcaccg 17 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry35 Reverse Primer <400> 45 ggtagtcctt gagcttggtg tc 22 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Cry35 Probe <400> 46 cagcaatgga acctgacgt 19 <210> 47 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAT Forward Primer <400> 47 acaagagtgg attgatgatc tagagaggt 29 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAT Reverse Primer <400> 48 ctttgatgcc tatgtgacac gtaaacagt 29 <210> 49 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PAT Probe <400> 49 ggtgttgtgg ctggtattgc ttacgctgg 29 <210> 50 <211> 234 <212> PRT <213> Phialidium sp. <400> 50 Met Ser Ser Gly Ala Leu Leu Phe His Gly Lys Ile Pro Tyr Val Val 1 5 10 15 Glu Met Glu Gly Asn Val Asp Gly His Thr Phe Ser Ile Arg Gly Lys 20 25 30 Gly Tyr Gly Asp Ala Ser Val Gly Lys Val Asp Ala Gln Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Asp Val Pro Val Pro Trp Ser Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Tyr Gly Ala Gln Cys Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Phe Tyr Lys Ser Cys Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile 85 90 95 Thr Phe Glu Gly Asp Gly Val Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val Thr Phe 100 105 110 Glu Asn Gly Ser Val Tyr Asn Arg Val Lys Leu Asn Gly Gln Gly Phe 115 120 125 Lys Lys Asp Gly His Val Leu Gly Lys Asn Leu Glu Phe Asn Phe Thr 130 135 140 Pro His Cys Leu Tyr Ile Trp Gly Asp Gln Ala Asn His Gly Leu Lys 145 150 155 160 Ser Ala Phe Lys Ile Met His Glu Ile Thr Gly Ser Lys Glu Asp Phe 165 170 175 Ile Val Ala Asp His Thr Gln Met Asn Thr Pro Ile Gly Gly Gly Pro 180 185 190 Val His Val Pro Glu Tyr His His Ile Thr Tyr His Val Thr Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Val Thr Asp His Arg Asp Asn Met Ser Leu Val Glu Thr Val 210 215 220 Arg Ala Val Asp Cys Arg Lys Thr Tyr Leu 225 230 <210> 51 <211> 234 <212> PRT <213> Phialidium sp. <400> 51 Met Ser Ser Gly Ala Leu Leu Phe His Gly Lys Ile Pro Tyr Val Val 1 5 10 15 Glu Met Glu Gly Asn Val Asp Gly His Thr Phe Ser Ile Arg Gly Lys 20 25 30 Gly Tyr Gly Asp Ala Ser Val Gly Lys Val Asp Ala Gln Phe Ile Cys 35 40 45 Thr Thr Gly Asp Val Pro Val Pro Trp Ser Thr Leu Val Thr Thr Leu 50 55 60 Thr Tyr Gly Ala Gln Cys Phe Ala Lys Tyr Gly Pro Glu Leu Lys Asp 65 70 75 80 Phe Tyr Lys Ser Cys Met Pro Asp Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile 85 90 95 Thr Phe Glu Gly Asp Gly Asn Phe Lys Thr Arg Ala Glu Val Thr Phe 100 105 110 Glu Asn Gly Ser Val Tyr Asn Arg Val Lys Leu Asn Gly Gln Gly Phe 115 120 125 Lys Lys Asp Gly His Val Leu Gly Lys Asn Leu Glu Phe Asn Phe Thr 130 135 140 Pro His Cys Leu Tyr Ile Trp Gly Asp Gln Ala Asn His Gly Leu Lys 145 150 155 160 Ser Ala Phe Lys Ile Cys His Glu Ile Thr Gly Ser Lys Gly Asp Phe 165 170 175 Ile Val Ala Asp His Thr Gln Met Asn Thr Pro Ile Gly Gly Gly Pro 180 185 190 Val His Val Pro Glu Tyr His His Met Ser Tyr His Val Lys Leu Ser 195 200 205 Lys Asp Val Thr Asp His Arg Asp Asn Met Ser Leu Lys Glu Thr Val 210 215 220 Arg Ala Val Asp Cys Arg Lys Thr Tyr Leu 225 230

Claims (66)

  1. 제아 메이즈 (Zea mays) 또는 제아 룩수리안스 (Zea luxurians)의 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소가 서열 1 또는 그의 상보체에 적어도 75% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소가 서열 1 및 15-39로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소가 서열 1 또는 그의 상보체를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항에 있어서, 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및 유비퀴틴-1 유전자로부터의 인트론을 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항에 있어서, 유비퀴틴-1 유전자로부터의 상류(upstream) 조절 서열을 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  7. 제6항에 있어서, 상류 조절 서열이 서열 4 또는 그의 상보체를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  8. 제1항에 있어서, 상류 조절 서열 (URS), 인핸서 요소, 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  9. 제1항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  10. 제1항에 있어서, 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터의 제2 최소 코어 프로모터 요소를 추가로 포함하고, 2개의 최소 코어 프로모터 요소가 폴리뉴클레오티드에서 서로에 대해 역 상보성 배향으로 존재하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및 유비퀴틴-1 유전자로부터의 인트론을 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  12. 제11항에 있어서, 서열 3 또는 그의 상보체를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  13. 제10항에 있어서, 유비퀴틴-1 유전자로부터의 상류 조절 서열을 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항에 있어서, 상류 조절 서열이 서열 4 또는 그의 상보체를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  15. 제10항에 있어서, 상류 조절 서열 (URS), 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 번역 개시 및/또는 중지 뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 추가로 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  16. 제15항에 있어서, 서열 5 또는 그의 상보체를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  17. 제10항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소 중의 하나에 작동가능하게 연결된 관심 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  18. 제17항에 있어서, 관심 제1 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되지 않은 최소 코어 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 관심 제2 뉴클레오티드 서열을 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드.
  19. 세포를 제1항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 세포의 생산 방법.
  20. 세포를 제10항의 폴리뉴클레오티드로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 세포의 생산 방법.
  21. 제18항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
  22. 제19항에 있어서, 세포가 식물 세포인 방법.
  23. 제1항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포.
  24. 제10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포.
  25. 제23항의 식물 세포를 포함하는 식물.
  26. 제24항의 식물 세포를 포함하는 식물.
  27. 방향-비의존성 방식으로 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 식물 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 방법.
  28. 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 식물 세포에서 관심 뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 방법.
  29. 제28항에 있어서, 식물 세포 내로
    (a) 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열; 및
    (b) 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 제2 뉴클레오티드 서열
    을 포함하는 핵산을 도입하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제5항에 있어서, 엑손이 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래되는 것인 합성 폴리뉴클레오티드.
  31. 제29항에 있어서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단이 서열 5 또는 그의 상보체를 포함하는 방법.
  32. 제29항에 있어서, 핵산이, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 DNA 내의 미리 결정된 부위로 표적화하기 위해 식물 세포 내에 도입되는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 2개의 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시시키기 위한 수단에 작동가능하게 연결된 관심 뉴클레오티드 서열이 징크 핑거 뉴클레아제-매개 재조합을 이용하여 미리 결정된 부위로 표적화되는 방법.
  34. (a) 양방향성 프로모터; 및
    (b) 양방향성 프로모터의 마주보는 말단부 상의 2개의 유전자 발현 카세트
    를 포함하고; 적어도 하나의 유전자 발현 카세트가 번역 스위치를 통해 연결된 2개 이상의 유전자를 포함하는, 식물 세포 및/또는 조직에서 다중 유전자를 발현시키기 위한 핵산 구축물.
  35. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 바이러스 서열을 포함하지 않는 핵산 구축물.
  36. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 적어도 하나의 인핸서를 포함하는 핵산 구축물.
  37. 제34항에 있어서, 핵산 구축물이 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 2성분 벡터를 포함하는 핵산 구축물.
  38. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 상류 조절 서열 (URS), 인핸서 요소, 엑손, 인트론, 전사 개시 부위, TATA 박스, 열 충격 컨센서스 요소, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 요소를 포함하는 핵산 구축물.
  39. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스의 유비퀴틴-1 유전자로부터의 최소 코어 프로모터 요소를 포함하는 핵산 구축물.
  40. 제39항에 있어서, 양방향성 프로모터가 제아 메이즈 또는 제아 룩수리안스로부터의 제2 최소 코어 프로모터를 추가로 포함하고, 2개의 최소 코어 프로모터 요소는 서로에 대해 역 상보성 배향으로 존재하는 핵산 구축물.
  41. 제39항에 있어서, 최소 코어 프로모터 요소가 서열 1 또는 그의 상보체에 적어도 70% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 구축물.
  42. 제39항에 있어서, 양방향성 프로모터가 유비퀴틴-1 유전자로부터의 엑손 및/또는 유비퀴틴 유전자로부터의 인트론을 포함하는 핵산 구축물.
  43. 제42항에 있어서, 양방향성 프로모터가 서열 3의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산 구축물.
  44. 제42항에 있어서, 양방향성 프로모터가 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열을 포함하는 핵산 구축물.
  45. 제44항에 있어서, 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열이 서열 4의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산 구축물.
  46. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 서열 5의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보체를 포함하는 핵산 구축물.
  47. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터가 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열 (URS)을 포함하는 핵산 구축물.
  48. 제47항에 있어서, 양방향성 프로모터가
    (i) 유비퀴틴 유전자의 프로모터와 상이한 프로모터 및
    (ii) 유비퀴틴 유전자로부터의 상류 조절 서열 (URS)
    을 포함하는 핵산 구축물.
  49. 제34항에 있어서, 유전자 발현 카세트 둘 모두가 번역 스위치를 통해 연결된 2개 이상의 유전자를 포함하는 핵산 구축물.
  50. 제34항에 있어서, 번역 스위치가 내부 리보좀 진입 부위 (IRES), 선택적 스플라이싱(alternative splicing) 부위, 리보자임 절단 부위, 2A 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 2A-유사 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 인테인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 구축물.
  51. 제34항에 있어서, 번역 스위치의 상류의 유전자가 번역 중지 코돈을 포함하지 않는 핵산 구축물.
  52. 제33항에 있어서, 핵산 구축물이 적어도 4개의 유전자의 발현을 가능하게 하는 핵산 구축물.
  53. 제34항에 있어서, 핵산 구축물이 3 내지 20개의 유전자의 발현을 가능하게 하는 핵산 구축물.
  54. 제53항에 있어서, 핵산 구축물이 4 내지 8개의 유전자의 발현을 가능하게 하는 핵산 구축물.
  55. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터로부터의 유전자의 발현이 단방향성 프로모터에 비해 적어도 4배 더 높은 핵산 구축물.
  56. 제34항에 있어서, 양방향성 프로모터로부터의 유전자의 발현이 단방향성 프로모터에 비해 3 내지 10배 더 높은 핵산 구축물.
  57. 식물 세포를 제34항의 핵산 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 식물의 생성 방법.
  58. 세포를 제34항의 핵산 구축물로 형질전환시키는 것을 포함하는, 트랜스제닉 세포의 생성 방법.
  59. 제34항의 핵산 구축물을 포함하는 식물 세포.
  60. 제59항에 있어서, 핵산 구축물이 식물 세포 내로 안정하게 형질전환되는 식물 세포.
  61. 제34항의 핵산 구축물을 포함하는 트랜스제닉 식물.
  62. 제61항에 있어서, 핵산 구축물이 트랜스제닉 식물의 세포 내로 안정하게 형질전환되는 트랜스제닉 식물.
  63. 식물 세포 및/또는 조직 내로 제34항의 핵산 구축물을 도입하는 것을 포함하는, 식물 세포 및/또는 조직에서 다중 유전자를 발현시키는 방법.
  64. 제63항에 있어서, 식물 세포 및/또는 조직이 제34항의 핵산 구축물로 안정하게 형질전환되는 방법.
  65. 제34항의 핵산 구축물을 포함하는, 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 2성분 벡터.
  66. 제1항의 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 아그로박테리움-매개 형질전환을 위한 2성분 벡터.
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