CN102439156A - 来自玉米的双向启动子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提供用于基因表达的手段和方法。具体而言，涉及包含表达控制序列的多核苷酸，所述表达控制序列允许以相反方向与其有效连接的两条目标核酸的双向表达。此外，还提供了基于所述多核苷酸的载体、宿主细胞、非人转基因生物体和用于表达目标核酸的方法。

Description

来自玉米的双向启动子

本发明涉及提供用于基因表达的手段和方法。具体而言，涉及包含表达控制序列的多核苷酸，所述表达控制序列允许彼此以相反方向有效连接的两条目标核酸的双向表达。此外，还提供了基于所述多核苷酸的载体、宿主细胞、非人转基因生物体和用于表达目标核酸的方法。

生产转基因植物是植物生物技术的基础技术，因而是植物基础研究不可或缺的先决条件，用于生产具有改善的、新的农业特性的植物，和用于增加人类食物的质量或用于生产特定的化学品或药品。在植物中转基因表达特定基因的基本先决条件是提供植物特异性启动子。已知多种植物启动子。目前在植物中主流使用的组成型启动子几乎是都是专门的病毒启动子或分离自农杆菌的启动子，例如，花椰菜花叶病毒启动子CaMV355(Odell等，(1985)Nature 313：810-812)。植物生物技术日益增加的复杂性通常需要用复数的表达构建体转化。多次使用一种和相同的启动子是有问题的，尤其是在植物中，因为多处存在的相同的调控序列可能导致基因活性的关闭(沉默)(Kumpatla等，(1998) TIBS 3：97-104；Selker (1999) Cell 97：157-160)。因而日益需要新的启动子。处理该问题的备选方式是使用所谓的“双向”启动子，即，导致两个方向的上游和下游DNA序列转录的调控序列。在此情况下，可以将处于一条DNA序列控制下的靶基因和标志物基因导入细胞中。

迄今为止，很少描述过处于双向启动子控制下的转基因表达。已描述了通过与其他转录元件融合的手段，从极性启动子生产双向启动子用于在植物中表达核酸(Xie M (2001) Nature Biotech19：677-679)。类似的，已将35S启动子转化为双向启动子(DongJ Z等，(1991)BIO/TECHNOLOGY 9：858-863)。WO 02/64804描述了基于各种病毒(CaMV 35S，CsVMV)和植物(Act2，PRb1b)序列的增强子和核启动子元件的融合，构建双向启动子复合物。US20020108142描述了来自百脉根(Lotus japonicus)的磷脂酰肌醇转移酶样蛋白IV的内含子的调控序列(PLP-IV；GenBank登录号：AF367434)，及其作为双向启动子的用途。该内含子片段仅在根瘤的感染区域具有转录活性。其他的组织、根、叶或花没有显示出着色。迄今为止，尚未公开过在植物中允许双向的、遍在的(即，基本无组织特异性)和组成型的表达的植物启动子。WO 03/006660描述了假定的铁氧还蛋白基因的启动子，和包含该启动子的表达构建体、载体和转基因植物。与葡糖醛酸酶基因融合的该分离的836 bp 5’侧翼序列令人惊讶的表现出在转基因烟草中的组成型表达模式。所述序列对应于拟南芥的4号染色体上的序列片段，以登录号Z97337储存在GenBank中(版本Z97337.2；碱基对85117至85952；用与灰色念珠藻(Nostoc muscorum)铁氧还蛋白[2Fe-2S]I强烈相似来注释该起始于bp 85953的基因)。在闭合的花蕾的花药/花粉中可检测到的活性仅为微弱，而在成熟的花中为零。与来自这样的文献发现的偏见相反，所述文献是针对有效表达选择标志物(例如，基于假设的叶特异性或者在光合电子传递中的功能)的启动子的适合性的，通过与例如卡那霉素抗性基因(nptII)的组合，能够展示高效的选择。WO 03/006660仅描述了作为“普通”组成型启动子的用途。没有公开作为双向启动子的用途。为了通过转运复合体将最大数量的基因整合到植物基因组中，必须限制用于表达转基因核酸的调控序列的数量和大小。双向作用的启动子为实现该目标作出了贡献。当双向启动子的活性以相同的强度协调存在并位于短的DNA片段上时，使用所述双向启动子是特别有利的。由于在转基因植物中表达难以接受病毒序列，故有利的使用同样来自植物的调控序列。WO2005/019459描述了来自拟南芥的双向启动子，其允许在转基因烟草或油菜籽(canola)植物的多种组织中的双向表达。

然而，对转基因以时间限制性或组织特异性的方式进行双向表达具有明确的需求。具体而言，双向表达系统允许以化学计量学的方式控制转基因的表达。此外，由于双向表达系统的缘故，一个表达控制序列控制两条目标核酸的表达，可以降低待导入生物体中进行异源基因表达的表达盒数量。

因而，本发明解决的技术问题可视为提供允许满足上述需求的手段和方法。所述技术问题是通过权利要求和下文表征的实施方案解决的。

因此，本发明涉及包含表达控制序列的多核苷酸，所述多核苷酸优选的允许与其以相反的方向有效连接的两条目标核酸的双向表达，所述表达控制序列选自：

(a)具有如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列的表达控制序列；

(b)具有与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列至少80％相同的核酸序列的表达控制序列；

(c)具有在严格条件下与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(d)具有与位于SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列上游的核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(e)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于编码如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交；

(f)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于和SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列至少80％相同的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；

(g)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于和SEQ ID NO：5所示开放阅读框序列至少80％相同的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；

(h)在基因组DNA上从如SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列的第一外显子开始通过5’基因组步行(genome walking)或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列；和

(i)在基因组DNA上从与如SEQ ID NO：4所示开放阅读框至少80％相同的开放阅读框序列的第一外显子开始，通过5’基因组步行或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；和

(j)在基因组DNA上从编码与如SEQ ID NO：5所示开放阅读框所编码的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的开放阅读框序列的第一外显子开始，通过5’基因组步行或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3。

如本文中使用的，术语“多核苷酸”指线性的或环状的核酸分子。它涵盖了DNA以及RNA分子。本发明的多核苷酸的特征是它应该包含如本说明书任何别处定义的表达控制序列。除表达控制序列外，本发明的多核苷酸优选的进一步包含至少一种与表达控制序列和/或与至少一种终止序列或转录有效连接的目标核酸。因而，本发明的多核苷酸优选的包含用于至少一种目标核酸表达的表达盒。更优选的，多核苷酸包含至少一种这样的表达盒，所述表达盒包含在两种方向上的目标核酸和/或终止序列，即，可以有效连接于所述表达控制序列。所述表达盒更优选的与至少一种表达盒的表达两端有效连接，所述表达盒的转录受反方向的所述表达控制序列掌控，即，从一条DNA链的一个方向，和相反的方向从另一DNA链。可以理解所述多核苷酸还优选的可以包含一种以上的用于两种方向的表达盒。因此，本发明也考虑了具有至少2、3、4或5或者甚至更多个表达盒用于目的核酸的包含表达盒的多核苷酸。进一步的，两个方向的每一个并不必须具有相等数量的表达盒，例如，一个方向可包含2个表达盒，而从表达控制序列的另一转录方向可包含仅1个表达盒。

除目标核酸外，至少一种表达盒还可以包含多克隆位点和/或用于转录的终止序列。在此情况下，多克隆位点优选的以这样的方式排列，所述方式允许待导入多克隆位点的核酸与表达控制序列的有效连接。除上述组分外，本发明的多核苷酸优选的可以包含同源重组所需的组分，即，来自靶基因座的基因组侧翼序列。然而，还可以预期的是基本由所述表达控制序列组成的多核苷酸。

如本文中使用的，术语“表达控制序列”指能够掌控与其有效连接的另一种核酸，例如本说明书任何别处详细指代的目标核酸的表达的核酸。根据本发明指代的表达控制序列优选的包含被多肽，即，转录因子识别和结合的序列基序。所述转录因子应该基于结合而募集RNA聚合酶，优选RNA聚合酶I、II或III，更优选RNA聚合酶II或III，最优选RNA聚合酶II。从而，可以起始与表达控制序列有效连接的核酸的表达。可以理解，依赖于待表达的核酸即目标核酸的类型，表达在本文中意味着可以包含从核酸序列转录RNA多核苷酸(如适合例如反义方法或RNAi方法)，或者可以包含在RNA多核苷酸的转录之后将所述RNA多核苷酸翻译成多肽(如适合例如基因表达和重组多肽生产方法)。为了掌控核酸的表达，表达控制序列可以位于紧靠待表达核酸的附近，即，与所述核酸在其5’端物理的相连。可选的，它可以位于物理的近距离上。然而，在后一种情况下，序列必须位于能够与待表达的核酸功能性相互作用的位置。本文所指的表达控制序列优选的包含在200和5,000个核苷酸之间的长度。更优选的包含在500和2,500个核苷酸之间，更优选的至少1,000个核苷酸。如上所述，表达控制序列优选的包含转录因子结合所需的或者使包含所述表达控制序列的多核苷酸产生某种结构所需的复数的序列基序。序列基序有时也称为顺式调控元件，如本文意指的，包括启动子元件和增强子元件。本发明的表达控制序列允许双向表达，因而包含这样的顺式调控元件，所述顺式调控元件可以在两个不同的位点募集RNA聚合酶，并以相反的方向释放，使得与所述表达控制序列有效连接的核酸能够双向的转录。因而，一种表达控制序列可以有效地驱动与其有效连接的两条核酸的转录。包括在本发明的多核苷酸中的优选的表达控制序列具有如SEQ ID NO：1至3的任一条所示的核酸序列。

进一步优选的，本发明的多核苷酸所包含的表达控制序列具有这样的核酸序列，所述核酸序列与位于如SEQ ID NO：4的任一条所示的开放阅读框序列的上游的核酸序列杂交，即，变体表达控制序列。可以理解，由于等位突变，所述表达控制序列的序列可以轻微的差异。因此，本发明还预期了这样的表达控制序列，所述表达控制序列可源自如SEQ ID NO：1至3的任一条所示的表达控制序列。所述表达控制序列能够与SEQ ID NO：4的任一条所示的开放阅读框的上游序列，即，与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示的表达控制序列杂交，优选在严格的条件下。严格的杂交条件在本文中意味着这样的条件，优选的在约45℃下的6x氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中，之后在0.2×SSC中进行一个或多个洗涤步骤，在53至65℃下的0.1％SDS中，优选在55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃或65℃。熟练的技术人员已知这类杂交条件根据核酸的类型以及例如当存在有机溶剂时，相对于温度和缓冲液的浓度而改变。例如，在“标准的杂交条件下”，根据核酸的类型，在含浓度为0.1至5×SSC(pH 7.2)的含水缓冲液中，温度在42℃和58℃之间变化。如果上述缓冲液中存在有机溶剂，例如50％甲酰胺，在标准条件下的温度是约42℃。用于DNA:DNA杂交体的杂交条件优选的是例如0.1×SSC和20℃至45℃，优选在30℃和45℃之间。用于DNA:RNA杂交体的杂交条件优选的是例如0.1×SSC和30℃至55℃，优选在45℃和55℃之间。上述杂交温度是根据例如在缺少甲酰胺的条件下，具有长度约100bp(＝碱基对)和50％的G+C含量的核酸来确定的。此类杂交的表达控制序列更优选的与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示的表达控制序列至少70％、至少80％、90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％相同。百分比同一性值优选的是根据整个核酸序列区计算的。本领域技术人员可获得基于多种算法的一系列程序，用于比较不同的序列。在上下文中，Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法产生特别可靠的结果。为了进行序列比对，使用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 1989，CABIOS，5：151-153)或者程序Gap和BestFit(Needleman 1970J.Mol.Biol.48；443-453和Smith 1981，Adv.Appl.Math.2；482-489)，上述程序是GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711 version 1991)的一部分。确定上述以百分比叙述的序列同一性值，优选的对整个序列区域使用GAP程序，使用下来设定：空位权重：50，长度权重：3；平均匹配：10,000和平均错配：0.000，除非另外说明，应该一直使用标准的设定进行序列比对。

此外，允许双向表达的表达控制序列不仅可见于上述具有如SEQ ID NO.4的任一条所示核酸序列的开放阅读框的上游。更确切的说，允许种子特异性表达的表达控制序列还可见于直系同源物、旁系同源物或同源基因(即，开放阅读框)的上游。因而，本发明的多核苷酸包含的变体表达控制序列还优选的具有这样的核酸序列，所述核酸序列与位于开放阅读框序列上游的核酸序列杂交，所述开放阅读框与SEQ ID NO.4的任一条所示序列至少70％，更优选至少80％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％相同。所述变体开放阅读框应该编码这样的多肽，所述多肽具有由SEQID NO.4的任一条所示开放阅读框编码的相应多肽的生物学活性。在上下文中，应该提及SEQ ID NO.4所示开放阅读框编码具有SEQID NO.5所示氨基酸序列的多肽，且优选的编码60S酸性核糖体蛋白P3。

本发明的多核苷酸包含的变体表达控制序列还优选的是(i)通过从如SEQ ID NO.4的任一条所示开放阅读框序列的5’基因组步行或TAIL PCR可获得的，或者(ii)通过从与如SEQ ID NO.4的任一条所示开放阅读框至少80％相同的开放阅读框序列的5’基因组步行或TAIL PCR可获得的。通过基因组步行技术或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)而无须进一步操作，即可获得变体表达控制序列，所述基因组步行技术或TAIL-PCR可以如所附实施例所述进行，通过使用例如可商购的试剂盒。

本说明书中指代的、关于SEQ ID NO：1至3所示表达控制序列的变体表达控制序列优选的包含至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个或者所有的表3所述的序列基序。更优选的，变体表达控制序列包含SEQ ID NO：54至76的任一条所示的序列基序。

本发明的多核苷酸包含的变体表达控制序列还优选的允许组织特异性表达。表达控制序列允许双向特异性表达的组织是下列所示的组织和细胞：1)5-叶阶段的根和叶，2)V-7阶段的茎，3)开花阶段(在首次出现穗丝时)的叶、外壳和穗丝，4)授粉时的小穗/穗须，5)授粉后5、10、15、20和25天时的谷穗或果核(kernel)。

更优选的，本发明的表达控制序列以正向方向的特异性表达是在种子中，优选的在整个种子中，和茎中。还更优选的，本发明的表达控制序列以反向方向的特异性表达可见于叶和根中。

如本文中使用的，术语“特异性”意指与本文指代的表达控制序列有效连接的目标核酸当存在于植物中时，将在指定的组织或细胞中主导性的表达。本文中意指的主导性的表达其特征是相对于其他的植物组织，在所述组织或细胞中可检测的转录处于统计学显著更高的量。统计学显著更高的量的转录优选是这样的量，相比在具有可检测的转录的至少一种其他组织中可见的量，所述量是至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍、500倍或1000倍。可选的，在指定组织或细胞中的表达是这样的表达，在其他组织或细胞中的转录的量少于所述表达的整体(完整植物)的量的1％、2％、3％、4％或最优选的少于5％。转录的量与细胞或组织中存在的转录物(即，RNA)或由转录物编码的多肽的量直接相关。基于RNA或多肽的用于测量转录的合适技术是本领域普遍已知的。除上述之外，组织或细胞特异性可选的和优选的意指所述表达限于或几乎限于所指示的组织或细胞，即，在其他组织中基本没有可检测的转录。几乎限于在本文中意指在少于10、少于5、少于4、少于3、少于2或1种其他组织中可检测到非特异的表达。本文中使用的组织或细胞特异性表达包括在所指示的组织或细胞中，以及在发育的胚胎中的前体组织或细胞中的表达。

可以通过确定目标核酸(例如，编码报告蛋白如GFP的核酸)在转基因植物中的表达模式，来测试表达控制序列的组织或细胞特异性表达。可以通过本领域熟练的技术人员普遍已知的技术，或如本说明书别处所讨论的技术，来产生转基因植物。上述量或表达模式优选的是由如WO 02/102970所述的Northern印迹或原位杂交技术来确定的。用于根据本发明的表达控制序列的优选表达模式显示在附图中，或描述在下文所附实施例中。

术语“目标核酸”指应该在本文所指的表达控制序列的控制下表达的核酸。优选的，目标核酸编码这样的多肽，在本文所指的细胞或非人生物中，特别是在植物种子中，所述多肽的存在是期望的。此类多肽可以是种子储存化合物的合成所需的酶，或者可以是种子储存蛋白质。可以理解，如果目标核酸编码多肽，则必需所述核酸转录为RNA，和所转录的RNA翻译成多肽。目标核酸还优选的包括生物学活性的RNA分子，和更优选的反义RNA、核酶、微RNA或siRNA。所述生物学活性的RNA分子可用于修饰细胞或非人生物体中存在的靶多肽的量。例如，由于反义RNA、核酶、微RNA或siRNA的种子特异性表达，可以降低种子中不期望的酶活性。上述生物学活性RNA分子的潜在生物学作用原则是本领域普遍已知的。此外，本领域熟练的技术人员普遍了解如何获得编码此类生物学活性RNA分子的核酸。可以理解，可以通过转录目标核酸，即，在不翻译成多肽的条件下，直接获得所述生物学活性RNA分子。优选的，在本发明的表达控制序列的控制下表达的至少一种目标核酸相对于所述表达控制序列是异源的，即，不是天然的处于它的控制下，而是以非天然的方式(例如，通过遗传工程方法)产生所述控制。

如本文中使用的，术语“有效连接”意指本发明的表达控制序列和目标核酸的连接使得所述表达受所述表达控制序列的掌控，即，表达控制序列应该与所述待表达的核酸序列功能性的连接。因此，表达控制序列和待表达的核酸序列可以是彼此物理性连接的，例如通过在待表达的核酸序列的5’端插入表达控制序列。可选的，表达控制序列和待表达的核酸序列可以仅仅是物理近距离的，使得表达控制序列能够掌控至少一种目标核酸序列的表达。表达控制序列和待表达的核酸序列优选的通过不超过500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp或5bp分隔。关于本发明的双向表达控制序列，可以理解上述定义适用于两条有效连接的目标核酸。可以理解，可以删除一条本发明的表达控制序列的非必需序列而不显著损伤所述特性。在计算机程序如PLACE程序(“植物顺式调控DNA元件(Plant Cis-actingRegulatory DNA Elements)”)(Higo K等，(1999) Nucleic AcidsRes 27：1，297-300)或BIOBASE数据库“Transfac”(BiologischeDatenbanken GmbH，Braunschweig)的帮助下，还可以进行表达控制序列与特别必需的调控区的界定。诱变核酸序列的方法是熟练的技术人员已知的，且作为示例包括使用在待突变的区域(例如，在定点诱变的框架内)具有一个或多个突变的寡核苷酸。典型的使用位于待修饰的序列两侧的、具有约15至约75个或更多个核苷酸，优选约10至约25或更多个核苷酸残基的引物。关于所述诱变方法的细节和程序对本领域技术人员而言是熟知的(Kunkel等，(1987) Methods Enzymol 154：367-382；Tomic等，(1990) Nucl Acids Res 12：1656；Upender等，(1995)Biotechniques 18(1)：29-30；美国专利号4,237,224)。还可以通过用诱变剂如羟胺处理例如包含本发明的一条核酸序列的载体，来实现诱变。

有利的，在本发明的潜在研究中发现，可以通过表达处于玉米的表达控制序列或上述变体表达控制序列控制下的所述目标核酸，来实现两条目标核酸的双向表达。由本发明提供的表达控制序列允许目标核酸的可靠的双向表达。由于本发明，能够(i)特异的操作特定组织中的生物化学过程，例如，通过表达异源性酶或生物学活性RNA，或者(ii)在所述组织中生产异源性蛋白质，或者(iii)以化学计量学比例提供目标核酸。原则上，本发明预计多核苷酸、载体、宿主细胞或非人转基因生物用于表达目标核酸的用途。本发明能够使用降低数量的启动子序列而增加转录单位的数量。在翻译融合体的情况下，还可以调控两种以上的蛋白质。本发明的特别的优势是这类多重转基因的表达是处于双向启动子的控制下同时和同步进行的。所述启动子特别适合协调核酸的表达。因而，可以同时表达：(i)靶蛋白和选择标志物或报告蛋白，ii)选择标志物和报告蛋白，iii)两种靶蛋白，例如来自相同的代谢通路，iii)有义和反义RNA，iv)由于抵抗病原体和其他对象的各种蛋白质，和v)在植物中产生改善的效果。

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸的载体。

术语“载体”优选的涵盖了噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体，以及人工染色体，例如细菌的或酵母的人工染色体。此外，术语还涉及这样的靶向构建体，所述构建体允许将靶向构建体随机或定点整合至基因组DNA中。此类靶构建体优选的包含的DNA的长度足以进行下文详述的同源或异源重组。包含了本发明的多核苷酸的载体优选的进一步包含可选择的标志物，用于在宿主中进行繁殖和/或选择。可以通过本领域普遍已知的多种技术将载体整合到宿主细胞中。如果导入到宿主细胞中，则载体可以停留在细胞质中，或者可以整合到基因组中。在后一情况下，可以理解载体可进一步包含允许同源重组或异源插入的核酸序列。载体可通过传统转化或转染方法引入原核或真核细胞。如本上下文中使用的，术语“转化”和“转染”、接合和转导意在包含用于将外来核酸(例如DNA)导入宿主细胞的多种现有技术领域的方法，包括磷酸钙、氯化铷或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染、天然感受态、基于碳原子的粒子簇(carbon-basedcluster)、化学介导的转移、电穿孔或颗粒轰击(例如，“基因枪”)。用于转化或转染宿主细胞(包括植物细胞)的合适方法可见于Sambrook等(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和其他的实验室手册中，例如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，编著：Gartland and Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey。可选的，可以通过热激或电穿孔技术导入质粒载体。载体如果是病毒，则可以在应用于宿主细胞之前，使用合适的包装细胞系在体外进行包装。逆转录病毒载体可以是有复制活性的或复制缺陷的。在后一种情况下，病毒增殖一般仅发生在互补的宿主/细胞中。

优选的，本文所称的载体适合作为克隆载体，即，在微生物系统中可复制的。此类载体确保在细菌中，优选在酵母或真菌中有效的克隆，且能够稳定的转化植物。尤其必须提到的是适合T-DNA-介导的转化的各种二元的和共整合的载体系统。照惯例，此类载体系统的特征是至少含有vir基因，所述基因是农杆菌介导的转化所必需的，以及限定T-DNA的序列(T-DNA边界)。这类载体系统优选的也包含进一步的顺式调控区，例如启动子和终止子和/或选择标志物，使用所述选择标志物可以鉴别适当转化的宿主细胞或生物体。当共整合的载体系统具有排列在同一载体上的vir基因和T-DNA序列时，二元系统是基于至少2种载体的，一种具有vir基因但没有T-DNA，而第二种具有T-DNA但没有vir基因。作为结果，最后提及的载体是相对小的、易于操作并在大肠杆菌和农杆菌中均可以复制。这类二元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明优选使用的是Bin19、pBI101、pBinAR、pGPTV、pSUN和pCAMBIA。二元载体的概述及其用途可见于Hellens等，Trends in Plant Science(2000)5，446-451中。此外，通过使用合适的克隆载体，本发明的多核苷酸可以导入宿主细胞或生物体中，例如植物或动物，并因而用于植物的转化，例如在：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in HigherPlants；in：Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编著：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，in：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编著：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225中公开和引用的。

更优选的，本发明的载体是表达载体。在此类表达载体中，多核苷酸包含如上说明的、允许在真核细胞或其分离的部分中表达的表达盒。除本发明的多核苷酸外，表达载体还包含进一步的调控元件，包括转录和翻译增强子。优选的，表达载体也是基因转移或靶向载体。源自病毒如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛宫颈癌病毒的表达载体可用于递送本发明的多核苷酸或载体到靶细胞群体中。可以使用本领域技术人员普遍已知的方法构建重组病毒载体，见例如Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in MolecularBiology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)中描述的技术。

合适的表达载体骨架优选的源自本领域已知的表达载体，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogene)或pSPORT1(GIBCO BRL)。典型的融合表达载体的其他实例是pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其中，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E-结合蛋白和蛋白A分别与编码待表达的目标核酸融合。pTrc载体的靶基因表达是基于宿主RNA聚合酶对杂交的trp-lac融合启动子的转录的。pET 11d载体的靶基因表达是基于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7 gn1)介导的T7-gn10-lac融合启动子的转录的。该病毒聚合酶是由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从驻留的λ-原噬菌体中提供的，所述原噬菌体将T7 gn1置于lacUV 5启动子的转录控制下。用于在酵母酿酒酵母(S.cerevisiae)中表达的载体的实例包括pYepSecl(Baldari等，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan 和 Herskowitz(1982)Cell30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。载体和用于构建载体的方法包括在van den Hondel，C.A.M.J.J.，&Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vector developmentfor filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics offungi，J.F.Peberdy等，编著，第1-28页，Cambridge UniversityPress：Cambridge中，或在More Gene Manipulations in Fungi(J.W.Bennett & L.L.Lasure，编著，第396-428页：AcademicPress：San Diego中详细描述的，所述载体是适合用于其他真菌的，例如丝状真菌。其他合适的酵母载体是例如pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。作为备选，本发明的多核苷酸还可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达。可用于在培养的昆虫细胞(例如sf9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。本发明的多核苷酸可通过使用植物表达载体，用于在单细胞的植物细胞(例如，藻类)中表达目标核酸，见Falciatore等，1999，Marine Biotechnology1(3)：239-251及其中引用的参考文献，以及来自更高等植物的植物细胞(例如种子植物，如农作物)。植物表达载体的实例包括在Becker，D.，Kemper，E.，Schell，J.和Masterson，R.(1992)“New plant binary vectors with selectable markers locatedproximal to the left border”，Plant Mol.Biol.20：1195-1197；和Bevan，M.W.(1984)“Binary Agrobacterium vectors forplant transformation”，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；in：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编著：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中详细描述的。植物表达盒优选的包含能够控制植物细胞中的基因表达，且功能性相连的调控序列，使得每种序列可以完成它的功能，例如转录终止，如多聚腺苷酸化信号。优选的多聚腺苷酸化信号是源自根癌农杆菌T-DNA的，例如Ti质粒pTiACH5的基因3，其被称为章鱼肉碱合酶(Gielen等，EMBO J.3(1984)835参照以下)或其功能性等价物，但在植物中有功能活性的所有其他的终止子也是合适的。由于植物基因表达通常不限于转录水平，故植物表达盒优选的包含其他功能性相连的序列，如翻译增强子，例如超载(overdrive)序列，其包含5’非翻译的烟草花叶病毒前导序列，所述序列增加蛋白质/RNA比例(Gallie等，1987，Nucl.AcidsResearch 15：8693-8711)。其他用于植物基因表达盒中功能性连接的优选序列是将基因产物靶向到其相关的细胞区室中所需的靶向序列(综述参见Kermode，Crit.Rev.Plant Sci.15，4(1996)285-423及其中引用的参考文献)，例如到液泡、核、所有类型的质体如淀粉体、叶绿体、有色体、胞外空间、线粒体、内质网、油体、过氧化物酶体和植物细胞的其他区室中。

上述载体只是对根据本发明使用的载体的小概述。其他载体是熟练的技术人员已知的，并描述在例如Cloning Vectors(编著：Pouwels，P.H.等，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中。关于用于原核和真核细胞的其他合适的表达系统，参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989的第16和17章。

本发明还考虑了保护本发明的多核苷酸或载体的宿主细胞。

宿主细胞是源自多细胞生物体，例如植物或动物的原代细胞或细胞系。此外，宿主细胞涵盖了原核或真核的单细胞生物体(也称为微生物)。用作根据本发明的宿主细胞的原代细胞或细胞系可以源自下文所称的多细胞生物体。此外可以利用的宿主细胞还提及在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中。可以使用的特定表达菌株，例如具有较低蛋白酶活性的菌株描述在Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，California(1990)119-128中。这包括植物细胞和植物的某些组织、器官和部分，其所有表型例如花药、纤维、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获的材料、植物组织、繁殖组织，以及源自实际的转基因植物和/或可用于产生转基因植物的细胞培养物。优选的，宿主细胞可以获得自植物。更优选的，考虑油料作物，所述油料作物包含大量的脂类化合物，例如油菜、月见草、大麻、蓟、花生、油菜籽、亚麻籽、大豆、红花、向日葵、琉璃苣，或者植物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、水稻、大麦、棉花、木薯、胡椒、万寿菊、茄科植物例如土豆、烟草、茄子和西红柿、蚕豆属物种、豌豆、苜蓿、灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属物种、木本(油棕、椰子)和多年生草本和饲料作物。根据本发明特别优选的植物是油料作物，例如大豆、花生、油菜、油菜籽、亚麻籽、大麻、月见草、向日葵、红花、木本(油棕、椰子)。用于从下文所指的多细胞生物体中获得宿主细胞的合适方法以及用于培养这类细胞的条件是本领域普遍已知的。

微生物优选的是细菌或真菌，包括酵母。根据本发明使用的优选的真菌选自毛壳菌科(Chaetomiaceae)、笄霉科(Choanephoraceae)、隐球酵母科(Cryptococcaceae)、小克银汉霉科(Cunninghamellaceae)、暗色孢科(Demetiaceae)、丛梗孢科(Moniliaceae)、被孢霉科(Mortierellaceae)、毛霉科(Mucoraceae)、腐霉科(Pythiaceae)、酵母科(Sacharomycetaceae)、水霉科(Saprolegniaceae)、裂殖酵母科(Schizosacharomycetaceae)、Sodariaceae或瘤座孢科(Tuberculariaceae)。其他优选的微生物选自：笄霉科例如布拉霉属(Blakeslea)、笄霉属(Choanephora)，如物种三孢布拉霉(Blakeslea trispora)、瓜笄霉(Choanephoracucurbitarum)、漏斗笄霉瓜变种(Choanephora infundibuliferavar.cucurbitarum)，被孢霉科例如被孢霉属(Mortierella)，如物种深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、多头被孢霉(Mortierella polycephala)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanniana)、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)、(Mortierella zonata)，腐霉科例如腐霉属(Phytium)、疫霉属(Phytophthora)，如物种德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、间型腐霉(Pythium intermedium)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、Pythium megalacanthum、侧雄腐霉(Pythiumparoecandrum)、Pythium sylvaticum、终极腐霉(Pythiumultimum)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、樟疫霉(Pytophthora cinnamomi)、柑橘生疫霉(Phytophthoracitricola)、柑橘褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)、隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)、掘氏疫霉(Phytophthoradrechsleri)、(Phytophthora erythroseptica)、雪松根腐疫霉(Phytophthora lateralis)、大豆疫霉(Phytophthoramegasperma)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)、烟草疫霉寄生变种(Phytophthora nicotianae var.parasitica)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)、(Phytophthora syringae)，酵母科例如汉森酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、酵母菌属(Saccharomycodes)、耶氏酵母属(Yarrowia)，如物种异常汉森酵母(Hansenula anomala)、加州汉森酵母(Hansenula californica)、加拿大汉森酵母(Hansenula canadensis)、碎囊汉森酵母(Hansenulacapsulata)、西弗汉森酵母(Hansenula ciferrii)、(Hansenulaglucozyma)、(Hansenula henricii)、(Hansenula holstii)、小汉森酵母(Hansenula minuta)、(Hansenula nonfermentans)、(Hansenula philodendri)、多形汉森酵母(Hansenulapolymorpha)、土星汉森酵母(Hansenula saturnus)、亚膜汉森酵母(Hansenula subpelliculosa)、魏氏汉森酵母(Hansenulawickerhamii)、温奇汉森酵母(Hansenula wingei)、嗜酒毕赤酵母(Pichia alcoholophila)、安格斯毕赤酵母(Pichiaangusta)、铵毕赤酵母(Pichia anomala)、双孢毕赤酵母(Pichiabispora)、伯顿毕赤酵母(Pichia burtonii)、加拿大毕赤酵母(Pichia canadensis)、碎囊毕赤酵母(Pichia capsulata)、卡氏毕赤酵母(Pichia carsonii)、(Pichia cellobiosa)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)、粉状毕赤酵母(Pichiafarinosa)、发酵毕赤酵母(Pichia fermentans)、芬兰毕赤酵母(Pichia finlandica)、(Pichia glucozyma)、季氏毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、嗜盐毕赤酵母(Pichiahaplophila)、(Pichia henricii)、(Pichia holstii)、(Pichiajadinii)、杰丁毕赤酵母(Pichia jadinii)、(Pichia lindnerii)、膜醭毕赤酵母(Pichia membranaefaciens)、甲醇毕赤酵母(Pichiamethanolica)、小毕赤酵母小型变种(Pichia minuta var.minuta)、小毕赤酵母非发酵型变种(Pichia minuta var.nonfermentans)、挪威毕赤酵母(Pichia norvegensis)、奥默毕赤酵母(Pichia ohmeri)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、(Pichia philodendri)、(Pichia pini)、多形毕赤酵母(Pichiapolymorpha)、栎柱毕赤酵母(Pichia quercuum)、(Pichiarhodanensis)、(Pichia sargentensis)、树干毕赤酵母(Pichiastipitis)、(Pichia strasburgensis)、亚膜汉森酵母(Pichiasubpelliculosa)、(Pichia toletana)、(Pichia trehalophila)、(Pichia vini)、木糖毕赤酵母(Pichia xylosa)、酸酒酵母(Saccharomyces aceti)、鲁氏接合酵母(Saccharomycesbailii)、贝酵母(Saccharomyces bayanus)、双孢酵母(Saccharomyces bisporus)、好望角酵母(Saccharomycescapensis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、酿酒酵母椭圆变种(Saccharomyces cerevisiae var.ellipsoideus)、薛瓦酵母(Saccharomyces chevalieri)、德氏酵母(Saccharomyces delbrueckii)、果蝇酵母(Saccharomycesdrosophilarum)、线虫酵母(Saccharomyces elegans)、葡萄酒酵母(Saccharomyces ellipsoideus)、发酵酵母(Saccharomycesfermentati)、(Saccharomyces florentinus)、脆壁酵母(Saccharomyces fragilis)、异质酵母(Saccharomycesheterogenicus)、(Saccharomyces hienipiensis)、(Saccharomyces inusitatus)、意大利酵母(Saccharomycesitalicus)、克鲁维酵母(Saccharomyces kluyveri)、克鲁斯酵母(Saccharomyces krusei)、乳酸酵母(Saccharomyceslactis)、马克思酵母(Saccharomyces marxianus)、小椭圆酵母(Saccharomyces microellipsoides)、(Saccharomycesmontanus)、(Saccharomyces norbensis)、(Saccharomycesoleaceus)、奇异酵母(Saccharomyces paradoxus)、巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)、(Saccharomycespretoriensis)、罗斯酵母(Saccharomyces rosei)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)、葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，裂殖酵母科，例如裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，如物种日本裂殖酵母日本变种(Schizosaccharomyces japonicus var.japonicus)、日本裂殖酵母易变变种(Schizosaccharomyces japonicus var.versatilis)、解苹果酸裂殖酵母(Schizosaccharomycesmalidevorans)、八孢裂殖酵母(Schizosaccharomycesoctosporus)、粟酒裂殖酵母解苹果酸变种(Schizosaccharomycespombe var.malidevorans)、粟酒裂殖酵母pombe变种(Schizosaccharomyces pombe var.pombe)，瘤座孢科，例如Althornia、Aplanochytrium、Japonochytrium、裂殖壶菌属(Schizochytrium)、破囊壶菌属(Thraustochytrium)，如物种聚生裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、(Schizochytriumlimacinum)、(Schizochytrium mangrovei)、微小裂殖壶菌(Schizochytrium minutum)、八孢裂殖壶菌(Schizochytriumoctosporum)、聚生破囊壶菌(Thraustochytrium aggregatum)、(Thraustochytrium amoeboideum)、南极破囊壶菌(Thraustochytrium antacticum)、(Thraustochytriumarudimentale)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、(Thraustochytrium benthicola)、(Thraustochytriumglobosum)、靛蓝色破囊壶菌(Thraustochytrium indicum)、克革伦破囊壶菌(Thraustochytrium kerguelense)、金尼破囊壶菌(Thraustochytrium kinnei)、动孢破囊壶菌(Thraustochytrium motivum)、(Thraustochytriummultirudimentale)、厚棘破囊壶菌(Thraustochytriumpachydermum)、增殖破囊壶菌(Thraustochytrium proliferum)、蔷薇色破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)、(Thraustochytriumrossii)、纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)或(Thraustochytrium visurgense)。进一步优选的微生物是细菌，选自芽孢杆菌科(Bacillaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriacae)或根瘤菌科(Rhizobiaceae)。此类微生物的实例可以选自：芽孢杆菌科，例如芽孢杆菌属(Bacillus)，如物种酸热环脂芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)、酸土环脂芽孢杆菌(Bacillusacidoterrestris)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、溶淀粉芽孢杆菌(Bacillus amylolyticus)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、凝固芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、球形芽孢杆菌纺锤变种(Bacillus sphaericus subsp.fusiformis)、嗜半乳糖芽孢杆菌(Bacillus galactophilus)、球孢芽孢杆菌(Bacillus globisporus)、球孢芽孢杆菌海洋亚种(Bacillusglobisporus subsp.marinus)、嗜盐芽孢杆菌(Bacillushalophilus)、缓病芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)、冷解糖芽孢杆菌(Bacilluspsychrosaccharolyticus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)、枯草芽孢杆菌spizizenii亚种(Bacillus subtilis subsp.spizizenii)、枯草芽孢杆菌枯草亚种(Bacillus subtilis subsp.subtilis)或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)；肠杆菌科，例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、埃希氏菌属(Escherichia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙门氏菌属(Salmonella)或赛氏杆菌属(Serratia)，如物种非丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)、差异柠檬酸杆菌(Citrobacter diversus)、弗劳地柠檬酸杆菌(Citrobacterfreundii)、(Citrobacter genomospecies)、(Citrobactergillenii)、中间柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedium)、柯氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、(Citrobacter murliniae)、柠檬酸杆菌(Citrobacter sp.)，保科爱德华氏菌(Edwardsiellahoshinae)、鲶鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、桤木爱德华氏菌(Erwiniaalni)、解淀粉爱德华氏菌(Erwinia amylovora)、Erwiniaananatis、蚜虫爱德华氏菌(Erwinia aphidicola)、Erwiniabillingiae、灭仙人掌欧文氏菌(Erwinia cacticida)、Erwiniacancerogena、大仙人掌欧文氏菌(Erwinia carnegieana)、胡萝卜软腐欧文氏菌黑腐亚种(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、胡萝卜软腐欧文氏菌维管束亚种(Erwiniacarotovora subsp.betavasculorum)、胡萝卜软腐欧文氏菌气味亚种(Erwinia carotovora subsp.odorifera)、胡萝卜软腐欧文氏菌山嵛菜亚种(Erwinia carotovora subsp. wasabiae)、菊果胶欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)、杓兰欧文氏菌(Erwiniacypripedii)、溶解欧文氏菌(Erwinia dissolvens)、草生欧文氏菌(Erwinia herbicola)、食毛欧文氏菌(Erwiniamallotivora)、Erwinia milletiae、流黑欧文氏菌(Erwinianigrifluens)、超压欧文氏菌(Erwinia nimipressuralis)、桃红色欧文氏菌(Erwinia persicina)、番石榴欧文氏菌(Erwiniapsidii)、Erwinia pyrifoliae、栎欧文氏菌(Erwinia quercina)、大黄冠腐病欧文氏菌(Erwinia rhapontici)、生红欧文氏菌(Erwinia rubrifaciens)、柳欧文氏菌(Erwinia salicis)、斯氏欧文氏菌(Erwinia stewartii)、嗜管欧文氏菌(Erwiniatracheiphila)、噬夏孢欧文氏菌(Erwinia uredovora)、非脱羧埃希氏菌(Escherichia adecarboxylata)、Escherichiaanindolica、金色埃希氏菌(Escherichia aurescens)、蟑螂埃希氏菌(Escherichia blattae)、大肠杆菌(Escherichia coli)、大肠埃希氏菌共生变种(Escherichia coli var.communior)、大肠可变埃希氏菌(Escherichia coli-mutabile)、弗格森埃希氏菌(Escherichia fergusonii)、Escherichia hermannii、埃希氏菌(Escherichia sp.)、伤口埃希氏菌(Escherichiavulneris)、产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)、爱氏克雷伯氏菌大西洋亚种(Klebsiella edwardsii subsp.atlantae)、解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiella ornithinolytica)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、特氏克雷伯氏菌(Kleb-siella planticola)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)、土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)、植生克雷伯氏菌(Klebsiellatrevisanii)、奥博尼杆菌(Salmonella abony)，亚利桑那沙门菌(Salmonella arizonae)，Salmonella bongori，猪霍乱沙门氏菌亚利桑那亚种(Salmonella choleraesuis subsp.Arizonae)，Salmonella choleraesuis subsp.bongori，Salmonella choleraesuis subsp.cholereasuis，Salmonellacholeraesuis subsp.diarizonae，Salmonella choleraesuissubsp.houtenae，Salmonella choleraesuis subsp.indica，Salmonella choleraesuis subsp.salamae，Salmonelladaressalaam，Salmonella enterica subsp.houtenae，Salmonella enterica subsp.salamae，肠炎沙门菌Salmonellaenteritidis，鸡沙门氏菌Salmonella gallinarum，海德尔堡沙门氏菌Salmonella heidelberg，巴拿马沙门氏菌Salmonellapanama，桑夫顿堡沙门氏菌Salmonella senftenberg，鼠伤寒沙门氏菌Salmonella typhimurium，嗜虫沙雷氏菌Serratiaentomophila，无花果沙雷氏菌Serratia ficaria，居泉沙雷氏菌Serratia fonticola，格氏沙雷氏菌Serratia grimesii，液化沙雷氏菌Serratia liquefaciens，粘质塞氏杆菌Serratiamarcescens，Serratia marcescens subsp.marcescens，海红沙雷氏菌Serratia marinorubra，气味沙雷氏菌Serratiaodorifera，Serratia plymouthensis，普利茅斯沙雷菌Serratiaplymuthica，变形斑病沙雷氏菌Serratia proteamaculans，Serratia proteamaculans subsp.quinovora，Serratiaquinivorans)或深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)，根瘤菌科，例如农杆菌属Agrobacterium，嗜碳菌属Carbophilus，螯合杆菌属Chelatobacter，剑菌属Ensifer，根瘤菌属Rhizobium，中华根瘤菌属Sinorhizobium，如物种大西洋土壤杆菌Agrobacterium atlanticum，锈色土壤杆菌Agrobacteriumferrugineum，食明胶土壤杆菌Agrobacterium gelatinovorum，Agrobacterium larrymoorei，梅氏土壤杆菌Agrobacteriummeteori，放射形土壤杆菌Agrobacterium radiobacter，发根土壤杆菌Agrobacterium rhizogenes，悬钩子癌肿病土壤杆菌Agrobacterium rubi，星斑土壤杆菌Agrobacterium stellulatum，根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens，葡萄土壤杆菌Agrobacterium vitis，Carbophilus carboxidus，何氏螯合杆菌Chelatobacter heintzii，粘着剑菌Ensifer adhaerens，Ensiferarboris，Ensifer fredii，Ensifer kostiensis，Ensiferkummerowiae，Ensifer medicae，Ensifer meliloti，Ensifersaheli，Ensifer terangae，Ensifer xinjiangensis ,鹰嘴豆根瘤菌Rhizobium ciceri，菜豆根瘤菌Rhizobiumetli，Rhizobiumfredii，山羊豆根瘤菌Rhizobium galegae，Rhizobium gallicum，Rhizobium giardinii，Rhizobium hainanense，华癸根瘤菌Rhizobium huakuii，Rhizobium huautlense，Rhizobiumindigoferae，Rhizobium japonicum，豌豆根瘤菌Rhizobiumleguminosarum，Rhizobium loessense，Rhizobiumlo loti，羽扇豆根瘤菌Rhizobium lupini，Rhizobium mediterraneum，苜蓿根瘤菌Rhizobium meliloti，Rhizobium mongolense，菜豆根瘤菌Rhizobium phaseoli，放射根瘤菌Rhizobium radiobacter，Rhizobium rhizogenes，Rhizobium rubi，Rhizobium sullae，Rhizobium tianshanense，三叶草根瘤菌Rhizobium trifolii，热带根瘤菌Rhizobium tropici，Rhizobium undicola，葡萄根瘤菌属Rhizobium vitis，Sinorhizobium adhaerens，Sinorhizobiumarboris，费氏中华根瘤菌Sinorhizobium fredii，Sinorhizobium kostiense，Sinorhizobium kummerowiae，Sinorhizobium medicae，苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)，Sinorhizobium morelense，萨赫勒中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)或(Sinorhizobium xinjiangense)。

如何培养上述微生物是本领域技术人员普遍已知的。

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸或载体的非人转基因生物，优选植物或其种子。

术语“非人转基因生物”优选的涉及植物、植物种子、非人动物或多细胞微生物。多核苷酸或载体可以存在于生物的细胞质中，或者可以异源的或通过同源重组整合到基因组中。为了获得镶嵌的或嵌合的生物体，即包含本发明的宿主细胞的非人转基因生物，可以将宿主细胞，特别是从植物或动物获得的宿主细胞，可以导入发育的胚胎中。合适的转基因生物优选的是适合重组基因表达的所有生物。

用于制造根据本发明的非人转基因生物的优选的植物是所有的双子叶或单子叶植物、藻类或苔藓类。有利的植物选自以下植物科：Adelotheciaceae、漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、隐甲藻科(Crypthecodiniaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、牛毛藓科(Ditrichaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、胡桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、Prasinophyceae或蔬菜植物或观赏植物，如万寿菊(Tagetes)。可能提及的实例是下列植物，选自：Adelotheciaceae，例如Physcomitrella属，如小立碗藓(Physcomitrella patens)的属和种；漆树科，例如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)，如阿月浑子(Pistacia vera)[阿月浑子实]、芒果(Mangiferindica)[芒果]或腰果(Anacardium occidentale)[腰果]的属和种；菊科，例如金盏花属(Calendula)、红花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、新缬草属(Locusta)、万寿菊属(Tagetes)、缬草属(Valeriana)，如金盏花(Calendulaofficinalis)[大金盏花]、红花(Carthamus tinctorius)[红花]、矢车菊(Centaurea cyanus)[矢车菊]、野苦苣(Cichoriumintybus)[菊苣]、朝鲜蓟(Cynara scolymus)[洋蓟]、向日葵(Helianthus annus)[向日葵]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、芋(Lactuca esculenta)、毒莴苣的某些种(Lactuca scariola L.ssp.Sativa)、Lactucascariola L.var.integrata、Lactuca scariola L.var.integrifolia、莴苣romana亚种(Lactuca sativa subsp.Romana)、Locusta communis、莴苣缬草(Valeriana locusta)[沙拉蔬菜]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tageteserecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[非洲或法国金盏花]的属和种；伞形科，例如胡萝卜属(Daucus)，如胡萝卜(Daucus carota)[胡萝卜]的属和种；桦木科，例如榛属(Corylus)，如欧洲榛(Corylus avellana)或榛子(Coryluscolurna)[榛子]的属和种；紫草科，例如琉璃苣属(Borago)，如(Borago officinalis)[琉璃苣]的属和种；十字花科，例如芸苔属(Brassica)、Melanosinapis、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabadopsis)，如欧洲油菜(Brassica napus)、芫菁属的某些种(Brassica rapa ssp.)[油菜]、野生欧白芥(Sinapisarvensis)、芥菜(Brassica juncea)、Brassica juncea var.juncea、皱叶芥菜(Brassica juncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、Brassica sinapioides、芥菜(Melanosinapis communis)[芥菜]、甘蓝(Brassica oleracea)、[饲用甜菜]或拟南芥(Arabidopsisthaliana)的属和种；凤梨科，例如凤梨属(Anana)，菠萝属(Bromelia)(菠萝)，如菠萝(Anana comosus)、Ananas ananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科，例如番木瓜属(Carica)，如番木瓜(Carica papaya)[番木瓜]的属和种；大麻科，例如大麻属(Cannabis)，如大麻(Cannabis sativa)[大麻]的属和种；旋花科，例如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)，如甘薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、Convolvulus batatas、 Convolvulus tiliaceus、Ipomoeafastigiata、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯(Ipomoea triloba)或Convolvulus panduratus[甜薯、番薯]的属和种；藜科，例如甜菜属(Beta)，如甜菜(Beta vulgaris)、Beta vulgaris var.altissima、甜菜普通变种(Beta vulgaris var.Vulgaris)、Betamaritima、甜菜宿根变种(Beta vulgaris var.perennis)，Betavulgaris var.conditiva或Beta vulgaris var.esculenta[甜菜]的属和种；隐甲藻科，例如隐甲藻属(Crypthecodinium)，如寇氏隐甲藻(Cryptecodinium cohnii)的属和种；葫芦科，例如南瓜属(Cucurbita)，如笋瓜(Cucurbita maxima)、灰子南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[西葫芦/南瓜]的属和种；桥弯藻科(Cymbellaceae)，例如双眉藻属(Amphora)、桥弯藻属(Cymbella)、Okedenia、褐指藻属(Phaeodactylum)、Reimeria，如三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)的属和种；牛毛藓科，例如Astomiopsis、角齿藓属(Ceratodon)、Chrysoblastella、牛毛藓属(Ditrichum)、对叶藓属(Distichium)、Eccremidium、Lophidion、Philibertiella、Pleuridium、Saelania、毛齿鱼属(Trichodon)、Skottsbergia，如Ceratodon antarcticus、Ceratodon columbiae、Ceratodon heterophyllus、Ceratodonpurpureus、Ceratodon purpureus、Ceratodon purpureusssp.convolutus、Ceratodon、purpureus spp.stenocarpus、Ceratodon purpureus var.rotundifolius、Ceratodon ratodon、Ceratodon stenocarpus、Chrysoblastella chilensis、Ditrichum ambiguum、Ditrichum brevisetum、Ditrichumcrispatissimum、Ditrichum difficile、Ditrichumfalcifolium、Ditrichum flexicaule、Ditrichum giganteum、Ditrichum heteromallum、Ditrichum lineare、Ditrichumlineare、Ditrichum montanum、Ditrichum montanum、Ditrichum pallidum、Ditrichum punctulatum、Ditrichumpusillum、Ditrichum pusillum var.tortile、Ditrichumrhynchostegium、Ditrichum schimperi、Ditrichum tortile、Distichium capillaceum、Distichium hagenii、Distichiuminclinatum、Distichium macounii、Eccremidium floridanum、Eccremidium whiteleggei、Lophidion strictus、Pleuridiumacuminatum、Pleuridium alternifolium、Pleuridiumholdridgei、Pleuridium mexicanum、Pleuridium ravenelii、Pleuridium subulatum、Saelania glaucescens、Trichodonborealis、Trichodon cylindricus or Trichodon cylindricusvar.oblongus的属和种；胡颓子科，例如胡颓子属(Elaeagnus)，如油橄榄(Olea europaea)[橄榄]的属和种；杜鹃花科，例如山月桂属(Kalmia)，如阔叶山月桂(Kalmia latifolia)、狭叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmiamicrophylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、西洋山月桂(Kalmia occidentalis)、Cistus chamaerhodendros或山月桂(Kalmia lucida)[山月桂]的属和种；大戟科，例如木薯属(Manihot)、Janipha、麻风树属(Jatropha)、油菜籽属(Ricinus)，如木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatrophamanihot、Manihot aipil、甜木薯(Manihot dulcis)、Manihotmanihot、Manihot melanobasis、木薯(Manihot esculenta)[木薯]或比马(Ricinus communis)[油菜籽油植物]的属和种；豆科，豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、Inga、Pithecolobium、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、Medicajo、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、Soja，如豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisumarvense)、Pisum humile[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、阔叶合欢(Albizia lebbeck)、Acaciaberteriana、Acacia littoralis、Albizia berteriana、Albizziaberteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobiumfragrans、Pitbecolobium berterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleea julibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、阔英金合欢(Acacia lebbeck)、Acaciamacrophylla、大叶合欢(Albizia lebbek)、Feuilleea lebbeck、大叶含羞草(Mimosa lebbeck)、Mimosa speciosa[木棉]、紫苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[紫花苜蓿]、大豆(Glycine max)、镰扁豆(Dolichos soja)、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、大豆(Glycine hispida)、大菜豆(Phaseolus max)、Soja hispida或Soja max[大豆]的属和种；葫芦藓科(Funariaceae)，例如Aphanorrhegma、Entosthodon、葫芦藓属(Funaria)、Physcomitrella、立碗藓属(Physcomitrium)，如Aphanorrhegmaserratum、Entosthodon attenuatus、Entosthodon bolanderi、Entosthodon bonplandii、Entosthodon californicus、Entosthodon drummondii、Entosthodon jamesonii、Entosthodonleibergii、Entosthodon neoscoticus、Entosthodon rubrisetus、Entosthodon spathulifolius、Entosthodon tucsoni、Funariaamericana、Funaria bolanderi、Funaria calcarea、Funariacalifornica、Funaria calvescens、Funaria convoluta、Funariaflavicans、Funaria groutiana、Funaria hygrometrica、Funariahygrometrica var.arctica、Funaria hygrometrica var.calvescens、Funaria hygrometrica var.convoluta、Funariahygrometrica var.muralis、Funaria hygrometrica var.utahensis、Funaria microstoma、Funaria microstoma var.obtusifolia、Funaria muhlenbergii、Funaria orcuttii、Funariaplano-convexa、Funaria polaris、Funaria ravenelii、Funariarubriseta、Funaria serrata、Funaria sonorae、Funariasublimbatus、Funaria tucsoni、Physcomitrella californica、Physcomitrella patens、Physcomitrella readeri、Physco-mitrium australe、Physcomitrium californicum、Physcomitriumcollenchymatum、Physcomitrium coloradense、Physcomitriumcupuliferum、Physcomitrium drummondii、Physcomitriumeurystomum、Physcomitrium flexifolium、Physcomitriumhookeri、Physcomitrium hookeri var.serratum、Physcomitriumimmersum、Physcomitrium kellermanii、Physcomitriummegalocarpum、Physcomitrium pyriforme、Physcomitrium pyri-forme var.serratum、Physcomitrium rufipes、Physcomitriumsandbergii、Physcomitrium subsphaericum、Physcomitriumwashingtoniense的属和种；牻牛儿苗科，例如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum属，如椰子(Cocosnucifera)、茶麋子天竺葵(Pelargonium grossularioides)或椰子油(Oleum cocois)[椰子]的属和种；禾本科，例如甘蔗属(Saccharum)，如甘蔗(Saccharum officinarum)的属和种；胡桃科，例如胡桃属(Juglans)、Wallia属，如胡桃(Juglansregia)、Juglans ailanthifolia、山胡桃(Juglans sieboldiana)、灰胡桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑胡桃(Juglans californica)、印度黑户套(Juglanshindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大胡桃(Juglans major)、Juglans microcarpa、黑胡桃(Juglans nigra)或胡桃(Wallia nigra)[胡桃]的属和种；樟科，例如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)，如月桂(Laurus nobilis)[bay]、鳄梨(Persea americana)、鳄梨油(Persea gratissima)或Perseapersea[avocado]的属和种；豆科，例如落花生属(Arachis)，如落花生(Arachis hypogaea)[花生]的属和种；亚麻科，例如亚麻属(Linum)、Adenolinum，如亚麻(Linum usitatissimum)、Linum humile、奥地利亚麻(Linum austriacum)、Linum bienne、窄叶亚麻(Linum angustifolium)、泻亚麻(Linum catharticum)、金黄亚麻(Linum flavum)、大花亚麻(Linum grandiflorum)、Adenolinum grandiflorum、刘易斯亚麻(Linum lewisii)、那旁亚麻(Linum narbonense)、宿根亚麻(Linum perenne)、宿根亚麻刘易斯变种(Linum perenne var.lewisii)、Linumpratense或亚麻子(Linum trigynum)[亚麻子]的属和种；Lythrarieae，例如石榴属(Punica)，如石榴(Punica granatum)[石榴]的属和种；锦葵科(Malvaceae)，例如棉属(Gossypium)，如陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypium barbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯棉(Gossypium thurberi)[棉]的属和种；地钱科(Marchantiaceae)，例如地钱属(Marchantia)，如Marchantiaberteroana、Marchantia foliacea、Marchantia macropora的属和种；芭蕉科(Musaceae)，例如芭蕉属(Musa)，如香蕉(Musanana)、小果野蕉(Musa acuminata)、大蕉(Musa paradisiaca)、芭蕉属的某些种(Musa spp.)[香蕉]的属和种；柳叶菜科(Onagraceae)，例如Camissonia属、月见草属(Oenothera)，如月见草(Oenothera biennis)或夜来香(Camissonia brevipes)[月见草]的属和种；棕榈科(Palmae)，例如油棕属(Elacis)，如油棕(Elaeis guineensis)[油棕]的属和种；罂粟科(Papaveraceae)，例如罂粟属(Papaver)，如东方罂粟(Papaverorientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长荚罂粟(Papaverdubium)[罂粟]的属和种；胡麻科(Pedaliaceae)，例如胡麻属(Sesamum)，如胡麻(Sesamum indicum)[胡麻]的属和种；胡椒科(Piperaceae)，例如胡椒属(Piper)、Artanthe属、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia属，如树胡椒(Piper aduncum)、Piper amalago、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、大胡椒(Piperauritum)、萎叶胡椒(Piper betel)、荜澄茄(Piper cubeba)、荜茇(Piper longum)、胡椒(Piper nigrum)、假荜茇(Piperretrofractum)、Artanthe adunca、长胡椒(Artanthe elongata)、Peperomia elongata，Piper elongatum、Steffensia elongata[辣椒]的属和种；禾本科，例如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高良恕(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea(玉米))、小麦属(Triticum)，如大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeum jubatum)、鼠大麦草(Hordeum murinum)、短芒大麦草(Hordeum secalinum)、栽培二棱大麦(Hordeumdistichon)、Hordeum aegiceras、六列大麦(Hordeumhexastichon)、六棱大麦(Hordeum hexastichum)、不规则大麦(Hordeum irregulare)、大麦(Hordeum sativum)、短芒大麦草(Hordeum secalinum[大麦])、黑麦(Secale cereale[黑麦])、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、地中海红燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida[燕麦])、二色高粱(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、二色绒毛草(Holcus bicolor)、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、Sorghum caffrorum、垂穗高粱草(Sorghumcernuum)、工艺高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghumlanceolatum、多脉高粱草(Sorghum nervosum)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、Sorghum subglabrescens、垂叶高粱草(Sorghumverticilliflorum)、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcushalepensis)、Sorghum miliaceum、黍栗(Panicum militaceum[黍])、稻(Oryza sativa)、Oryza latifolia[稻]、玉米(Zeamays[玉米])、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或Triticum vulgare[小麦]的属和种；紫球藻科(Porphyridiaceae)，例如Chroothece属、Flintiella属、Petrovanella属、紫球藻属(Porphyridium)、Rhodella属、Rhodosorus属、Vanhoeffenia属，如紫球藻(Porphyridiumcruentum)的属和种；山龙眼科(Proteaceae)，例如澳洲坚果属(Macadamia)，如全缘叶澳洲坚果(Macadamia intergrifolia[macadamia])的属和种；青绿藻科(Prasinophyceae)，例如肾藻属(Nephroselmis)、青绿球藻属(Prasinococcus)、Scherffelia属、扁藻属(Tetraselmis)、Mantoniella属、Ostreococcus属，如绿肾藻(Nephroselmis olivacea)、碎囊青绿球藻(Prasinococcus capsulatus)、Scherffelia dubia、周氏扁藻(Tetraselmis chui)、Tetraselmis suecica、Mantoniellasquamata、Ostreococcus tauri的属和种；茜草科(Rubiaceae)，例如咖啡属(Cofea)，如咖啡属的某些种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]的属和种；玄参科(Scrophulariaceae)，例如毛蕊花属(Verbascum)，如毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、东方毛蕊花(Verbascum chaixii)、密叶毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、Verbascum nigrum、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、Verbascum phlomoides、紫毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus[毛蕊花])的属和种；茄科(Solanaceae)，例如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)，如属和种辣椒(Capsicum annuum)、彩椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、五色椒(Capsicum frutescens[胡椒])、红礁(Capsicum annuum[红辣椒])、烟草(Nicotiana tabacum)、花烟草(Nicotiana alata)、长头烟草(Nicotiana attenuata)、光烟草(Nicotiana glauca)、Nicotiana langsdorffii、Nicotianaobtusifolia、Nicotiana quadrivalvis、Nicotiana repanda、黄花烟草(Nicotiana rustica)、Nicotiana sylvestris[烟草]、马铃薯(Solanum tuberosum[土豆])、茄(Solanum melongena[茄子])、番茄(Lycopersicon esculentum)、Lycopersiconlycopersicum、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanum lycopersicum[西红柿])；梧桐科(Sterculiaceae)，例如可可树属(Theobroma)，如属和种可可树(Theobroma cacao)[可可]，或者山茶科(Theaceae)，例如山茶属(Camellia)，如属和种大叶茶(Camelliasinensis)[茶]。用作根据本发明的转基因植物的特别优选的植物是包含大量脂类化合物的油料植物，例如花生、油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、油菜籽、橄榄、芝麻、金盏花、石榴、月见草、毛蕊花、大蓟、野玫瑰、榛子、杏仁、欧洲坚果、鳄梨、月桂、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、阿月浑子、琉璃苣、木本植物(油棕、椰子、胡桃树)，或作物例如玉米、小麦、黑麦、燕麦、黑小麦、稻、大麦、棉、木薯、胡椒、万寿菊、茄科植物如土豆、烟草、茄子和西红柿、蚕豆属的种、豌豆、紫花苜蓿或灌木植物(咖啡、可可、茶)、柳属的种，和多年生草本和饲料作物。根据本发明有利的植物是油料作物植物，例如花生、油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、罂粟、芥菜、大麻、油菜籽、橄榄、金盏花、石榴、月见草、西葫芦/南瓜、亚麻子、大豆、琉璃苣、木本植物(油棕、椰子、胡桃树)。尤其优选的是富含C18:2-和/或C18:3-脂肪酸的植物，例如向日葵、红花、烟草、毛蕊花、芝麻、棉、西葫芦/南瓜、罂粟、月见草、胡桃树、亚麻子、大麻、大蓟或红花。非常尤其优选的植物是红花、向日葵、罂粟、月见草、胡桃树、亚麻子或大麻。

优选的苔藓植物是立碗藓(Physcomitrella)或角齿藓(Ceratodon)。优选的藻类是等鞭藻(Isochrysis)、Mantoniella、Ostreococcus或隐甲藻(Crypthecodinium)，以及绿藻/硅藻(diatoms)，如褐指藻或破囊壶菌。更优选的，所述藻类或苔藓类选自：希瓦氏菌属(Shewanella)、立碗菌属(Physcomitrella)、Thraustochytrium、镰刀霉属(Fusarium)、疫霉属(Phytophthora)、角齿藓属(Ceratodon)、等鞭金藻属(Isochrysis)、Aleurita、Muscarioides、被孢霉属(Mortierella)、褐指藻属(Phaeodactylum)、Cryphthecodinium，尤其是来自属和种Thallasiosira pseudonona、小眼虫(Euglenagracilis)、小立碗县(Physcomitrell apatens)、晚疫病(Phytophtora infestans)、Fusarium graminaeum、Cryptocodinium cohnii、角齿县(Ceratodon purpureus)、球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、Aleurita farinosa、Thraustochytrium属的种、Muscarioides viallii、高山被孢霉(Mortierella alpina)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)或秀丽杆线虫(Caenorhabditis elegans)，或者尤其有利的是Phytophtora infestans、Thallasiosirapseudonona和Cryptocodinium cohnii。

可以通过公开的和在以下文献中引用的转化技术获得转基因植物：Plant Molecular Biology and Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编注：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38中；B.Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编注：Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)，128-143中；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225。优选的，可以通过T-DNA介导的转化获得转基因植物。照惯例，此类载体系统的特征是其至少含有农杆菌介导的转化所需的vir基因，以及限定T-DNA(T-DNA边界)的序列。合适的载体另外详细描述在说明书的别处。

优选的，本文使用的多细胞微生物指原生生物或硅藻。更优选的，选自横裂甲藻科(Dinophyceae)、Turaniellidae或尖毛虫科(Oxytrichidae)，例如属和种：寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、贻贝棘尾虫(Stylonychia mytilus)、鬃棘尾虫(Stylonychiapustulata)、污棘尾虫(Stylonychia putrina)、背状棘尾虫(Stylonychia notophora)、棘尾虫属的某些种(Stylonychiasp.)、弯豆形虫(Colpidium campylum)或豆形虫属的某些种(Colpidium sp.)。

本发明还涉及在宿主细胞中表达目标核酸的方法，包括：

(a)将本发明的多核苷酸或载体导入宿主细胞中；和

(b)在所述宿主细胞中表达至少一种目标核酸。

可以通过如本说明书别处所述的合适的转染或转化技术，将本发明的多核苷酸或载体导入宿主细胞中。目标核酸将在合适的条件下在宿主细胞中表达。为此目的，宿主细胞原则上可培养在允许核酸转录的条件下。此外，宿主细胞优选的包含外源提供的或内源存在的转录机制，所述转录机制是表达控制序列表达目标核酸所需的。更优选的，本发明方法中的表达指至少一种目标核酸在表达控制序列的两个方向中的每一个方向上的双向表达。

此外，本发明涵盖了用于在非人生物中表达目标核酸的方法，包括：

(a)将本发明的多核苷酸或载体导入非人生物中；和

(b)在所述非人转基因生物中表达至少一种目标核酸。

可以通过如本说明书别处所述的合适的技术，将本发明的多核苷酸或载体导入非人转基因生物中。非人转基因生物优选的包含外源提供的或内源存在的转录机制，所述转录机制是表达控制序列表达目标核酸所需的。更优选的，本发明方法中的表达指至少一种目标核酸在表达控制序列的两个方向中的每一个方向上的双向表达。

在下文中，更详细地描述了属于本发明的一些优选的实施方案。

在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸还包括进一步的遗传控制序列。根据本发明所指的遗传控制序列是广义的理解的，意指对本发明的转基因表达盒的功能成立具有影响的所有序列。遗传控制序列修饰例如原核或真核生物中的转录和翻译。本发明的表达盒优选的在待转基因表达的特定核酸序列的5’上游包含本发明的启动子之一和3’下游的终止序列作为额外的遗传控制序列，以及恰当时，还包含进一步的常见调控序列，在各种情况下，都与待转基因表达的核酸序列功能性连接。

遗传控制序列还包含能够修饰表达控制特性的进一步的启动子、启动子元件或最小启动子。因而能够例如通过遗传控制序列额外的进行依赖于特定的胁迫因子的组织特异性表达。描述了例如与水胁迫、脱落酸(Lam E和Chua N H，(1991) J Biol Chem266(26)：17131-17135)和热胁迫(

等，(1989) Mol GenGenetics 217(2-3)：246-53)相应的元件。另一可能性是使得能够在其他组织或其它生物体(例如大肠杆菌细菌)中表达的其他启动子，与待表达的核酸序列功能性连接。合适的植物启动子原则上是所有的上述启动子。可以预计，例如，特定的核酸序列由启动子(例如，本发明的一种启动子)在一种植物组织中转录为正义RNA，并翻译成相应的蛋白质，同时相同的核酸序列由具有不同特异性的另一启动子在不同的组织中转录成反义RNA，并下调相应的蛋白质。这可以通过本发明的表达盒来执行，通过将一种启动子放置在待转基因表达的核酸序列之前，而另一启动子置于之后。

遗传控制序列还进一步包含基因的5’非翻译区、内含子或非编码的3’区，优选其属于pFD基因和/或OASTL基因。已显示非翻译区可以在基因表达的调控中发挥重要功能。因而，已显示5’非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。它们还可以促进组织特异性(Rouster J等，(1998) Plant J.15：435-440)。相反，opaque-2基因的5’非翻译区抑制表达。相应区域的删除导致基因活性的增加(Lohmer S等，(1993) Plant Cell 5：65-73)。其它5’非翻译序列和具有表达促进功能的内含子是本领域技术人员已知的。McElroy及同事(McElroy等，(1991) Mol Gen Genet231(1)：150-160)报道了基于水稻肌动蛋白1(Act 1)启动子的构建体，用于转化单子叶植物。Act 1内含子与35S启动子在转基因水稻细胞中的组合使用导致相比分离的35S启动子增加10倍的表达速率。报告基因(GUS)的翻译起始位点的序列环境的优化导致在转化的水稻细胞中GUS表达增加4倍。优化的翻译起始位点和Act 1内含子的组合，导致通过CaMV35S启动子在转化的水稻细胞中GUS表达增加40倍；用转化的玉米细胞已获得相似的结果。总之，根据上述研究得出结论，即基于Act 1启动子的表达载体适合充分的控制外源DNA在单子叶植物的转化细胞中的强且组成型的表达。

表达盒可以包含一种或多种与启动子功能性连接的所谓的增强子序列，所述序列使得能够增加核酸序列的转基因表达。还可以在将待转基因表达的核酸序列的3’端插入额外的有利序列，例如其他的调控元件或终止子。

控制序列额外的意指那些能够使宿主生物的基因组产生同源重组或插入的序列，或者允许基因组删除的序列。在同源重组中能够例如用本发明的启动子之一替换特定基因的天然启动子。方法如creaox技术允许从宿主生物的基因组中组织特异性的删除表达盒，所述技术在一些情况下是可诱导的(Sauer B.(1998)Methods.14(4)：381-92)。在此情况下，向靶基因附加特定的侧翼序列(lox序列)，然后通过cre重组的手段使得能够进行删除。可以通过在靶基因之前的同源重组的手段，替换待导入的启动子，所述靶基因是通过将启动子与DNA序列连接而转基因表达的，而所述DNA序列是例如与在靶基因的阅读框前方的内源序列同源的。这样的序列被视作遗传控制序列。在用适当的DNA构建体转化细胞后，两条同源序列可以相互作用，从而在靶基因之前的期望位点处放置启动子序列，使得启动子序列目前与靶基因功能性连接，并形成本发明的表达盒。同源序列的选择决定启动子的插入位点。在此情况下，能够通过单交叉或双交叉重组的手段，由同源重组产生表达盒。在单交叉重组中，仅使用单个重组序列，插入完整导入的DNA。在双交叉重组中，待导入的DNA两侧是两条同源序列，插入的是侧翼区域。如上所述，后一种方法适用于通过本发明的启动子之一来替换特定基因的天然启动子，因而修饰基因表达的分布和时间。该功能性连接代表了本发明的表达盒。为了选择成功的同源重组的或者转化的细胞，通常必须额外的导入可选择的标志物。下文提及了各种合适的标志物。选择标志物允许从未转化的细胞中选择转化的细胞。在高等的真核细胞中，尤其是植物中，同源重组是相对罕见的事件。主导的是随机整合到宿主基因组中。对整合序列进行随机删除，因而富集具有正确的同源重组的细胞克隆的一种可能性包括使用序列特异性重组系统，如美国专利号6,110,736中描述的。

适合作为遗传控制序列的多聚腺苷酸信号是植物多聚腺苷酸信号和优选来自根癌农杆菌中的。

在特别优选的实施方案中，表达盒包含在植物中有功能的终止子序列。在植物中有功能的终止子序列一般意指能够在植物中产生DNA序列的转录终止的序列。合适的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂氨酸合酶)终止子。然而，植物终止子序列是特别优选的。植物终止子序列一般意指是天然的植物基因的构件的序列。在本上下文中所指的特别优选的是马铃薯组织蛋白酶D抑制剂基因(GenBank登录号：X74985)的终止子或芸豆储存蛋白基因VfLEIB3(GenBank登录号：Z26489)的终止子。这类终止子至少与本领域所述的病毒或T-DNA终止子是等价的

本领域技术人员还了解大量的核酸和蛋白质，其在本发明的表达盒控制下或方法中的重组表达是有利的。技术人员进一步了解大量的基因，通过所述基因的抑制或者用表达恰当的反义RNA的手段来关闭，同样能够获得有利的效果。可能提及的有利效果的非限制性实例是：促进转基因生物的生产，例如通过可选择标志物的表达，获得对非生物胁迫因素(热、冷、干旱、增加的湿度、环境毒素、UV辐射)的抗性，获得对生物胁迫因素(病原体、病毒、昆虫和疾病)的抗性，改善在人或动物食物中的特性，改善产量的生长速率。其表达提供了期望的有利效果的一些特定实例可论述如下：

1、选择标志物。选择标志物包括赋予对抗生素、除草剂或杀生剂的抗性的正选择标志物，和赋予对后者精确的敏感性的负选择标志物，以及为转化的生物体提供生长优势的标志物(例如，通过表达细胞因子生物合成的关键基因；Ebinuma H等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121)。在正选择的情况下，仅表达相应的选择标志物的生物体存活，而在负选择的情况下，却是上述生物体死亡。在生产转基因植物中，使用正选择标志物是优选的。

进一步优选的是使用赋予生长优势的选择标志物。如果发明将从生物体删除特定的基因或基因组片段(例如，作为杂交育种方法的一部分)，则可以有利的使用负选择标志物。随表达盒导入的选择标志物赋予成功重组的或转化的细胞对杀生剂(例如，除草剂，如草胺磷、草甘膦或溴苯腈)、代谢抑制剂如2-脱氧葡萄糖6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性。选择标志物允许从未转化的细胞中选择转化的细胞(McCormick等，(1986) Plant Cell Rep 5：81-84)。特别优选的选择标志物是赋予对除草剂抗性的。技术人员了解多种该类型的选择标志物及其编码序列。可提及的非限制性实例如下：

i)正向选择标志物：

随表达盒导入的选择标志物赋予成功转化的细胞对杀虫剂(例如，除草剂，如草胺磷、草甘膦或溴苯腈)、代谢抑制剂如2-脱氧葡萄糖6-磷酸(WO 98/45456)或抗生素例如卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素的抗性。选择标志物允许从未转化的细胞中选择转化的细胞(McCormick等，(1986) Plant Cell Rep5：81-84)。特别优选的选择标志物是赋予对除草剂抗性的。可提及的非限制性实例如下：编码草胺磷乙酰转移酶(PAT；也称为bialophos抗性基因(bar))并产生除草剂草胺磷(PPT)脱毒的DNA序列(de Block等，(1987) EMBO J 6：2513-2518)。合适的bar 基因可分离自例如吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)或产绿链霉菌(S.viridochromogenes)。相应的序列是技术人员已知的(GenBank登录号：X17220、X05822、M22827、X65195；美国专利号5,489,520)。还描述了例如在质体AJ028212中表达的合成基因。合成的Pat基因描述在Becker等，(1994)Plant J 5：299-307中。基因赋予对除草剂bialaphos的抗性，且是转基因植物中广泛使用的标志物(Vickers J E等，(1996)Plant Mol Biol Rep 14：363-368；Thompson C J等，(1987)EMBOJ 6：2519-2523)。5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因(EPSP合酶基因)赋予对草甘膦(N-(磷酰甲基)甘氨酸)的抗性(Steinrucken H C等，(1980) Biochem Biophys Res Commun94：1207-1212；Levin J G和Sprinson D B(1964) J Biol Chem239：1142-1150；Cole D J(1985)Mode of action of glyphosate；A literature analysis，第48-74页，在：Grossbard E andAtkinson D(编著)，The herbicide glyphosate.Buttersworths，Boston中)。草甘膦耐受的EPSPS变体优选的用作选择标志物(Padgette S R等，(1996).New weed control opportunities：development of soybeans with a Roundup Ready(TM) gene.In：Herbicide Resistant Crops(Duke S O编著)，第53-84页。CRCPress，Boca Raton，Fla.；Saroha M K和Malik V S(1998) J PlantBiochem Biotechnol 7：65-72)农杆菌属菌株CP4的EPSPS基因具有天然的草甘膦耐受性，可以转移给恰当的转基因植物(Padgette S R等，(1995) Crop Science 35(5)：1451-1461)。作为草甘膦耐受性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶描述在例如美国专利号5,510,471；美国专利号5,776,760；美国专利号5,864,425；美国专利号5,633,435；美国专利号5,627,061；美国专利号5,463,175；EP 0 218 571中。进一步的序列描述在GenBank登录号X63374中。aroA基因是更优选的(M1 0947)。Gox基因(来自无色杆菌属(Achromobacter sp.)的草甘膦氧化还原酶)编码草甘膦降解性酶。GOX可以赋予对草甘膦的耐受性(Padgette S R等，(1996) J Nutr.126(3)：702-16；Shah D等，(1986) Science 233：478-481)，deh基因(编码失活茅草枯的脱卤素酶)(GenBank登录号：AX022822、AX022820和WO99/27116)，编码降解溴苯腈的腈水解酶的bxn基因。例如，来自Klebsiellaozanenae的腈水解酶。序列可见于GenBank中，例如登录号：E01313和J03196。新霉素磷酸转移酶赋予对抗生素(氨基糖苷类)的抗性，例如新霉素、G418、潮霉素、巴龙霉素或卡那霉素，通过磷酸化反应降低它们的抑制效果。NptII基因是特别优选的。序列可以从GenBank(AF080390微型转座子mTn5-GNm；AF080389微型转座子mTn5-Nm，完整序列)获得。此外，所述基因已经是多种载体的组分，并可以通过使用技术人员熟悉的方法从中分离(例如，聚合酶链式反应)(AF234316 pCAMBIA-2301；AF234315pCAMBIA-2300；AF234314 pCAMBIA-2201)。NPTII基因编码来自大肠杆菌，Tn5的氨基糖苷3′O-磷酸转移酶(GenBank登录号：U00004，位置1401-2300；Beck等，(1982) Gene 19 327-336)，DOG<R>1基因。DOG<R>1基因是从酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中分离的(EP 0 807 836)。它编码2-脱氧葡萄糖-6-磷酸磷酸酶，赋予对2-DOG的抗性(Randez-Gil等，1995，Yeast11，1233-1240；Sanz等，(1994)Yeast 10：1195-1202，序列：GenBank登录号：NC001140，染色体VIII，酿酒酵母位置194799-194056)。磺酰脲-和咪唑啉酮-失活型乙酰乳酸合酶赋予对咪唑啉酮/磺酰脲类除草剂的抗性。合适的实例是以GenBank登录号：X51514储藏的拟南芥(Arabidopsis thaliana)Csr 1.2基因(EC 4.1.3.18)的序列(Sathasivan K等，(1990)NucleicAcids Res.18(8)：2188)。赋予对咪唑啉酮除草剂的抗性的乙酰乳酸合酶也描述在GenBank登录号：AB049823、AF094326、X07645、X07644、A19547、A19546、A19545、I05376、I05373、AL133315中。潮霉素磷酸转移酶(X74325，关于潮霉素磷酸转移酶的类鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei)基因)，赋予对抗生素潮霉素的抗性。所述基因是多种表达载体的组件，并可使用技术人员熟悉的方法从中分离(例如，聚合酶链式反应)(AF294981 pINDEX4；AF234301 pCAMBIA-1380；AF234300 pCAMBIA-1304；AF234299pCAMBIA-1303；AF234298 pCAMBIA-1302；AF354046 pCAMBIA-1305；AF354045 pCAMBIA-1305.1)。关于a)氯霉素(氯霉素乙酰转移酶)、b)四环素的抗性基因，各种抗性基因描述在例如X65876S.ordonez基因族D，teta和tetR关于四环素抗性，而抑制蛋白X51366蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)质粒pBC16四环素抗性基因。此外，所述基因是多种表达载体的组件，并可使用技术人员熟悉的方法从中分离(例如，聚合酶链式反应)。C)链霉素，各种抗性基因用例如GenBank登录号：AJ278607描述，嗜醋酸棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ant基因用于链霉素腺苷转移酶。D)博莱霉素，相应的抗性基因是多种表达载体(例如，L36849克隆载体pZEO)的组件，并可使用技术人员熟悉的方法从中分离(例如，聚合酶链式反应)。E)青霉素([β]-内酰胺酶基因；Datta N，Richmond M H.(1966) Biochem J.98(1)：204-9；Heffron F等，(1975)J.Bacteriol 122：250-256；首次克隆Amp基因制备大肠杆菌载体pBR322；Bolivar F等，(1977)Gene 2：95-114)。所述序列是多种克隆载体的组件，并可使用技术人员熟悉的方法从中分离(例如，聚合酶链式反应)。基因例如来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(菌株：PO22)的异戊烯基转移酶(Genbank登录号：AB025109)。Ipt基因是细胞因子生物合成中的关键酶。其过表达促进植物的再生(例如，在不含细胞因子的培养基上选择)。描述了利用ipt基因的方法(Ebinuma H等，(2000) Proc Natl Acad Sci USA 94：2117-2121；Ebinuma H等，(2000) Selection of Marker-free transgenicplants using the onco-genes (ipt，rol A，B，C) ofAgrobacterium as selectable markers，In Molecular Biologyof Woody Plants.Kluwer Academic Publishers)。相比未转化的植物，赋予转化的植物以生长优势的各种其他的正选择标志物，及其使用方法尤其描述在EP-A 0 601 092中。应提及的实例是[β]-葡萄糖苷酸酶(协同例如细胞分裂素葡萄糖苷酸)、甘露糖-6-磷酸异构酶(协同甘露糖)、UDP-半乳糖-4-表异构酶(协同，例如半乳糖)，特别优选的是甘露糖-6-磷酸异构酶协同甘露糖。

ii)负选择标志物

负选择标志物使得能够选择具有成功删除的序列的生物体，所述序列包含标志物基因(Koprek T等，(1999) Plant J19(6)：719-726)。在负选择的情况下，例如通过导入植物中的负选择标志物，将对植物没有任何不利效果的化合物转化为具有不利效果的化合物。还适合的是，本身具有不利效果的基因，例如胸苷激酶(TK)、白喉毒素A片段(DT-A)、编码细胞因子脱氨酶的codA基因产物(Gleave A P等，(1999) Plant Mol Biol.40(2)：223-35；Perera R J等，(1993)Plant Mol.Biol 23(4)：793-799；Stougaard J (1993) Plant J 3：755-761)、细胞色素P450基因(Koprek等，(1999) Plant J 16：719-726)、编码卤代烷托卤素酶的基因(Naested H(1999) Plant J 18：571-576)、iaaH基因(Sundaresan V等，(1995) Genes & Development9：1797-1810)或tms2基因(Fedoroff N V & Smith D L(1993)Plant J 3：273-289)。

在进行抗生素、除草剂、杀生剂或毒素选择的各种情况下使用的浓度必须适用于特定的测试条件或生物体。对植物可提及的实例是卡那霉素(Km)50mgA、潮霉素B 40mg/l、草胺磷(ppt)6mgA。还可以表达编码选择标志物的所述核酸的功能类似物。在本上下文中，功能类似物意指所有具有基本相同功能的序列，即，能够选择转化的生物体。此外，功能类似物的其他特征完全可以不同。它可以例如具有更高或更低的活性，或者具备其他的功能。

2、对植物抗非生物胁迫因素(如干旱、热或冷)的改善的保护作用，例如通过过表达来自短角床杜父鱼(MyoxocephalusScorpius)(WO 00/00512)多刺床杜父鱼(Myoxocephalusoctodecemspinosus)的抗冻多肽、拟南芥转录因子CBF1、谷氨酸脱氢酶(WO 97/12983、WO 98/11240)、钙依赖性蛋白激酶基因(WO 98/26045)、钙调神经磷酸酶(WO 99/05902)、法呢基转移酶(WO 99/06580，Pei Z M等，Science 1998，282：287-290)、铁蛋白(Deak M等，Nature Biotechnology 1999，17：192-196)、草酸氧化酶(WO 99/04013；Dunwell J M Biotechnology andGenetic Engeneering Reviews 1998，15：1-32)、DREB1A因子(脱水应答元件B 1A；Kasuga M等，Nature Biotechnology 1999，17：276-286)、甘露醇或海藻糖合成的基因如海藻糖磷酸合酶或海藻糖磷酸磷酸酶(WO 97/42326)，或者通过抑制基因，例如海藻糖酶(WO 97/50561)。特别优选的核酸是编码来自拟南芥的转录激活剂CBF1(GenBank 登录号：U77378)、来自多刺床杜父鱼的抗冻蛋白(GenBank登录号：AF306348)的基因，或其功能等价体。

3、表达用于动物和人的食物领域的代谢酶，例如表达植酸酶和纤维素酶。特别优选的涉及核酸，例如编码微生物植酸酶的人工cDNA(GenBank登录号：A19451)，或其功能等价体。

4、通过靶向分泌或在胚胎的表皮积累特定的代谢物或蛋白质，获得对例如真菌、昆虫、线虫和疾病的抗性。可提及的实例是芥子苷(抗食草动物的防御)、几丁质酶或葡聚糖酶，以及其他破坏寄生虫的细胞壁的酶、核糖体失活蛋白(RIP)和其他的植物抗性和胁迫应答蛋白，如在损伤或微生物攻击植物时诱导，或通过例如水杨酸、茉莉酸或乙烯化学诱导的、来自非植物来源的溶菌酶，例如T4溶菌酶或来自各种哺乳动物的溶菌酶、杀虫蛋白如苏云金芽孢杆菌内毒素、[α]-淀粉酶抑制剂或蛋白酶抑制剂(豇豆胰蛋白酶抑制剂)、葡聚糖酶、植物凝聚素如植物血球凝聚素、麦芽凝聚素、RNA酶或核酶。特别优选的核酸是编码哈茨木霉(Trichoderma harzianum)的chit42内切几丁质酶的核酸(GenBank登录号：S78423)、或编码二色高粱的用于N-羟基化的、多功能细胞色素P-450(CYP79)蛋白的核酸，或其功能等价体。

5、已知在Cardales属的植物中，尤其是油料种子中积累葡糖异硫氰酸盐，保护其避开害虫(Rask L等，(2000) Plant Mol Biol42：93-113；Menard R等，(1999) Phytochemistry 52：29-35)，在35S CaMV启动子的控制下表达苏云金芽孢杆菌内毒素(Vaeck等，(1987) Nature 328：33-37)，或者通过在CaMV启动子的控制下表达大豆几丁质酶，保护烟草免受真菌攻击(Broglie等，(1991) Science 254：1194-119)。

合成的cryIA(b)和cryIA(c)基因可以在多种植物中产生对昆虫类害虫的抗性，所述基因编码苏云金芽孢杆菌的鳞翅类特异性δ内毒素。因而，能够在稻中获得对两类主要的稻害虫——二化螟(Chilo suppressalis)和三化螟(Scirpophaga incertulas)的抗性(Cheng X等，(1998) Proc Natl Acad Sci USA95(6)：2767-2772；Nayak P等，(1997) Proc Natl Acad Sci USA94(6)：2111-2116)。

6、表达产生精细化学品积累的基因，精细化学品例如生育酚、生育三烯酚或类胡萝卜素。可以提及的实例是八氢番茄红色去饱和酶。编码来自喇叭水仙(Narcissus pseudonarcissus)的八氢番茄红色去饱和酶的核酸(GenBank登录号：X78815)，或其功能等价体，是优选的。

7、通过表达脂肪酸延伸酶和/或去不饱和酶，生产营养辅助品(neutraceuticals)，例如多不饱和脂肪酸如花生四烯酸或EP(二十碳五烯酸)或DHA(二十二碳六烯酸)，或者生产具有改善的营养价值的蛋白质，例如具有高含量的必需氨基酸(例如，巴西坚果的富含甲硫氨酸的2S白蛋白)。优选的核酸是编码巴西坚果(Bertholletia excelsa)的富含甲硫氨酸的2S白蛋白(GenBank登录号：AB044391)、小立碗藓的[δ]6-酰基脂去饱和酶(GenBank登录号：AJ222980；Girke等，(1998) Plant J 15：3948)、高山被孢霉(Mortierelia alpina)的[δ]6-去饱和酶(Sakuradani等，(1999)Gene 238：445-453)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)的[δ]5-去饱和酶(Michaelson等，1998，FEBS Letters439：215-218)、秀丽隐杆线虫的[δ]5-脂肪酸去饱和酶(des-5)(GenBank登录号：AF078796)、高山被孢霉的[δ]5-去饱和酶(Michaelson等，J Biol Chem 273：19055-19059)、秀丽隐杆线虫的[δ]6-延伸酶(Beaudoin等，(2000) Proc Natl.Acad Sci USA97：6421-6426)、小立碗藓的[δ]6-延伸酶(Zank等，(2000)Biochemical Society Transactions 28：654-657)的核酸，或其功能等价体。

8、生产精细化学品(例如，酶)和药品(例如，抗体或疫苗，如Hood E E，Jilka J M.(1999)Curr Opin Biotechnol.10(4)：382-6；Ma J K，Vine N D (1999) Curr Top MicrobiolImmunol 236：275-92中描述的)。已可以例如在转基因玉米植物中大规模的生产来自鸡蛋蛋白的抗生物素蛋白和细菌的[β]-葡萄糖苷酸酶(GUS) (Hood等，(1999) Adv Exp Med Biol464：127-47)。这类来自玉米植物的重组蛋白作为高纯度的生物化学品由Sigma Chemicals Co.销售。

9、在增加这类物质的产量的帮助下，例如通过表达乙酰-CoA羧化酶，在通常包含极少储存蛋白或脂类的细胞中获得增加的储存能力。优选的核酸是编码紫花苜蓿(Medicago sativa)的乙酰-CoA羧化酶(accase) (GenBank登录号：L25042)的核酸，或其功能等价体。有利的基因的其他实例提及在例如Dunwell J M(2000) J Exp Bot.51 Spec No：487-96中。

还可以表达所述核酸和蛋白质的功能类似物。在本上下文中，功能类似物意指具有基本相同的功能的所有序列，即，也能够发挥类似通过举例所提及的蛋白质的功能(例如，底物转化或信号转导)。此外，功能类似物的其他特征完全可能不同。它可以例如具有更高或更低的活性，或者具备其他的功能。功能类似物还意指编码这样的融合蛋白的序列，所述融合蛋白由一种优选的蛋白质和其他蛋白质组成，例如其他优选的的蛋白质或者信号肽序列。

处于本发明的启动子控制下的核酸可以在任何期望的细胞区室中表达，例如，内膜系统、囊泡和叶绿体。通过利用分泌通路，可以进行期望的糖基化反应，尤其是折叠等。靶蛋白还可以分泌到细胞表面或分泌到培养基中，例如使用悬浮培养的细胞或原生质体时。因而，用于该目的必需靶序列可以考虑每个载体变体，并通过使用合适的克隆策略，与待克隆的靶基因一起导入载体中。用作靶序列的可以是基因内在的(当存在时)或者是异源的序列。额外的异源序列是保证亚细胞定位于质外体、囊泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、造油体或其他区室的其他靶向序列，所述序列优选进行功能连接，但不限于此；以及翻译增强子，例如烟草花叶病毒的5′前导序列(Gallie等(1987) Nucl Acids Res15 8693-8711)等。已描述了用于以靶向方式将本身不分布于质体中的蛋白质运输到质体中的方法(Klosgen R B & Weil J H(1991)Mol Gen Genet 225(2)：297-304；Van Breusegem F等，(1998) PlantMol Biol 38(3)：491-496)。优选的序列是：

a)豌豆、玉米、向日葵的二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco ssu)的小亚基(SSU)

b)源自植物脂肪酸生物合成基因的转运肽，如质体的酰基载体蛋白(ACP)、硬脂酰基-ACP去饱和酶、[β]-酮脂酰-ACP合酶或酰基-ACP硫酯酶的转运肽

c)GBSSI(淀粉粒结合型淀粉合酶1)的转运肽

d)LHCP II基因。

靶序列可以与其他的靶序列连接，所述其他的靶序列不同于转运肽编码序列，以保证亚细胞定位于质外体、囊泡、质体、线粒体、内质网(ER)、细胞核、造油体或其他区室。还可以使用翻译增强子，如烟草花叶病毒的5′前导序列(Gallie等(1987)Nucl Acids Res 15 8693-8711)等。

技术人员还了解不是必须通过使用编码上述基因的核酸序列来直接表达上述基因，或者通过例如反义来抑制所述基因。还可以使用例如锌指蛋白类型的人工转录因子(Beerli R R等，(2000)Proc Natl Acad Sci USA 97(4)：1495-500)。这类因子结合在待表达或抑制的内源基因的调控区，并根据因子的设计，导致内源基因的表达或抑制。因而，还可以通过表达处于本发明的启动子之一控制下的恰当的锌指转录因子，来实现期望的效果。

本发明的表达盒可以通过基因沉默同样地用于抑制或降低靶基因的复制和/或翻译。

本发明的表达盒还可以表达这样的核酸，所述核酸介导所谓的反义效果，因而能够例如降低靶蛋白的表达。

优选的基因和蛋白质的抑制是有利表型的条件，作为示例但不限于的包括：

a)多聚半乳糖醛酸酶，防止细胞降解和植物和果实(例如，番茄)的糊化。优选用于该目的的是核酸序列如番茄多聚半乳糖醛酸酶基因(GenBank登录号：X14074)或其来自其他属和种的同源物。

b)降低过敏性蛋白质的表达，如例如Tada Y等，(1996)FEBSLett 391(3)：341-345或Nakamura R(1996) Biosci BiotechnolBiochem 60(8)：1215-1221中所述。

c)通过抑制花色素生物合成的酶的表达，改变花的颜色。(在例如Forkmann G，Martens S.(2001) Curr Opin Biotechnol12(2)：155-160中)已描述了相应的方法。优选用于该目的的是核酸序列如类黄酮3′-羟化酶(GenBank登录号：AB045593)的、或二氢黄烷醇4-还原酶(GenBank登录号：AB045593)的、查耳酮异构酶(GenBank登录号：AF276302)的、查耳酮合酶(GenBank登录号：AB061022)的、黄烷酮3-β-羟化酶(GenBank登录号：X72592)的或黄酮合酶II(GenBank登录号：AB045592)的核酸，或其来自其他属和种的同源物。

d)通过抑制负责[α]-1，6-糖苷键的分支酶Q，来改变淀粉种的直链淀粉/支链淀粉含量。(在例如Schwall G P等，(2000)Nat Biotechnol 18(5)：551-554中)已描述了相应的方法。优选用于该目的的是核酸序列如马铃薯的淀粉分支酶II(GenBank登录号：AR123356；美国专利号6,169,226)的核酸，或其来自其他属和种的同源物。

“反义”核酸主要意指与所述靶蛋白的至少一部分正义链完全或部分互补的核酸序列。技术人员了解他可以可选的使用cDNA或相应的基因作为相应反义构建体的起始模板。反义核酸优选的与靶蛋白或其部分的编码区互补。然而，反义核酸还可以与其部分的非编码区互补。根据靶蛋白的序列信息，可以通过考虑Watson和Crick碱基配对原则，以本领域技术人员熟悉的方式设计反义核酸。反义核酸可以与靶蛋白的全部或部分核酸序列互补。在优选的实施方案中，反义核酸是长度为例如15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的寡核苷酸。在优选的实施方案中，反义核酸包含[α]-异头核酸分子。[α]-异头核酸分子特别与互补RNA形成双链杂合体，其中所述链彼此平行，与正常的[β]单元相反(Gaultier等，(1987)Nucleic Acids Res 15：6625-6641)。在正义方向使用上述序列也同样的涵盖在内，并且是技术人员熟知导致共抑制的。内源基因的正义RNA表达可以降低或关闭基因的表达，与反义方法所述相似(Goring等，(1991)Proc Natl AcadSci USA 88：1770-1774；Smith等，(1990) Mol Gen Genet224：447-481；Napoli等，(1990)Plant Cell 2：279-289；Van derKrol等，(1990) Plant Cell 2：291-299)。此外，导入的构建体表示将被完全或仅部分降低的基因。可以不必须翻译。

使用这样的方法也是非常特别优选的，所述方法例如通过双链RNA(双链RNA干扰)的手段进行的基因调控。相应的方法是技术人员已知的并详细描述的(例如，Matzke M A等，(2000)PlantMol Biol 43：401-415；Fire A.等，(1998)Nature 391：806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364)。对所示参考文献中描述的过程和方法进行明示。在此通过同时导入链和互补链产生天然基因的高效抑制。

可以且有利的将反义策略与核酶方法偶联。核酶是催化活性的RNA序列，其与反义序列偶联，催化性的切割靶序列(Tanner NK.FEMS Microbiol Rev.1999；23(3)：257-75)。这可以增加反义策略的效率。表达核酶来降低特定蛋白质是技术人员已知的，并描述在例如EP-A1 0 291 533、EP-A1 0 321 201和EP-A1 0 360257中。可以通过Steinecke所述(Ribozymes，Methods in CellBiology 50，Galbraith等编著，Academic Press，Inc.(1995)，449-460)确定合适的靶序列和核酶，通过对核酶RNA和靶RNA的次级结构计算及其相互作用(Bayley C C等，Plant Mol Biol.1992；18(2)：353-361；Lloyd A M和Davis R W等，Mol Gen Genet.1994March；242(6)：653-657)。应提及的实例是锤头核酶(Haselhoff和Gerlach(1988) Nature 334：585-591)。优选的核酶是基于四膜虫L-19 IVS RNA的衍生物的(美国专利号4,987,071；美国专利号5,116,742)。可以选择对L119 mRNA具有选择性的其他核酶(Bartel D和Szostak J W(1993)Science 261：1411-1418)。

在另一实施方案中，可以通过使用这样的核酸序列降低靶蛋白表达，所述核酸序列与靶蛋白基因的调控元件互补，与后者形成三螺旋结构，因而阻止基因转录(Helene C(1991)AnticancerDrug Des.6(6)：569-84；Helene C等，(1992) Ann NY Acad Sci660：27-36；Maher L J(1992)Bioassays 14(12)：807-815)。

当用于调控代谢通路的两种酶时，本发明的双向启动子是特别有利的。例如，可以通过本发明的双向启动子之一同时表达2′-甲基-6-植基对苯二酚甲基转移酶和尿黑酸植基-焦磷酸转移酶，产生生育酚的增加。此外，尿黑酸加双氧酶的抑制(例如，通过表达相应的dsRNA)和酪氨酸氨基转移酶的过表达导致生育酚含量的增加。在类胡萝卜素代谢中，[α]环化酶的抑制和[β]环化酶的过表达导致[α]-胡萝卜素和[β]-胡萝卜素含量的改变。

可以通过平行的抑制SDE3基因的转录和重组蛋白的过表达，可以阻止转录后沉默效应(WO 02/063039)。

也可以通过使用本发明的启动子有利的表达抗体的免疫学活性部分。因而，例如，可以在一个方向表达IgG1抗体的重链，而在其他方向表达轻链。两者在翻译后形成功能性抗体(WO02/101006)。

另一种可能性是同时表达胁迫相关的离子转运子(WO03/057899)与除草剂基因，从而增加对环境效应的耐受。

许多酶由两个或多个亚基组成，所述亚基都是发挥功能必需的。可以通过本发明的一种双向启动子同时表达两种亚基。一个实例是过表达人卵泡刺激素的[α]和[β]亚基。

当所述基因受该双向启动子调控时，由用于选择标志物的基因和报告基因组成的构建体对建立转化系统是特别有价值的。

本发明的表达盒和源于它的载体可以包括其他的功能元件。术语功能元件作广义的理解，并意指对本发明的表达盒或源于它的载体或生物体的生产、增殖或功能具有影响的所有元件。可提及的非限制性实例是：

a)报告基因或蛋白质编码易于定量的蛋白质，并通过内在颜色或酶活性验证对转化效率或对表达的位置或时间的评估(Schenborn E，Groskreutz D(1999)Mol Biotechnol13(1)：2944)。应提及的实例是：

绿色荧光蛋白(GFP)(Chui W L等，Curr Biol 1996，6：325-330；Leffel S M等，Biotechniques.23(5)：912-8，1997；Sheen等，(1995)Plant Journal 8(5)：777-784；Haseloff等，(1997)ProcNatl Acad Sci USA 94(6)：2122-2127；Reichel等，(1996)ProcNatl Acad Sci USA 93(12)：5888-5893；Tian等，(1997)Plant CellRep 16：267-271；WO 97/41228)；氯霉素转移酶(Fromm等，(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：5824-5828)；荧光素酶(Millar等，(1992)Plant Mol Biol Rep 10：324-414；Ow等，(1986) Science，234：856-859)，允许检测生物荧光；[δ]-半乳糖苷酶，编码可获得多种显色底物的酶；[β]-半乳糖苷酶 (GUS) (Jefferson等，(1987) EMBO J 6：3901-3907)；或编码用于多种显色底物的酶的uidA基因；R-基因座基因产物蛋白，其调控花青素色素(显红色)在植物组织中的生产，因而可以在不添加额外的辅助物质或显色底物的条件下，直接分析启动子的活性(Dellaporta等，在：Chromosome Structure and Function：Impact of New Concepts，18th Stadler Genetics Symposium 11：263-282，1988中)；[β]-内酰胺酶(Sutcliffe(1978)Proc Natl Acad Sci USA75：3737-3741)，用于多种显色底物的酶(例如PADAC，一种显色的头孢菌素)；xyIE基因产物(Zukowsky等，(1983) Proc NatlAcad Sci USA 80：1101-1105)，儿茶酚加双氧酶，其可以转化显色的儿茶酚类；α-淀粉酶(Ikuta等，(1990) Biol Technol.8：241-242)；酪氨酸酶(Katz等，(1983)J Gen Microbiol129：2703-2714)，将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌的酶，所述多巴醌随后形成可易于检测的黑色素；水母发光蛋白(Prasher等，(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3)：1259-1268)，其可用于钙敏感的生物发光检测。

b)复制起点，其保证本方面的表达盒或载体在例如大肠杆菌中的增殖。可提及的实例是ORI(DNA复制的起点)、pBR322 ori或P15A ori(Sambrook等：Molecular Cloning.A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989)。

c)元件，例如“边界序列”，所述元件使农杆菌介导的向植物细胞内的转移能够转移并整合到植物基因组中，例如T-DNA的左侧或右侧边界或vir区。

d)多克隆区域(MCS)允许和促进一种或多种核酸序列的插入。

技术人员了解多种获得本发明的表达盒的方式。例如通过将本发明的一种表达控制序列与待表达的目标核酸序列融合，进行本发明的表达盒的生产，如果恰当的话，使用编码转运肽的序列，优选叶绿体特异性转运肽，所述转运肽优选置于启动子和各种核酸序列之间，并具有终止子或多聚腺苷酸信号。用于该目的，使用重组和克隆的常规技术(如上所述)。

然而，表达盒也意指这样的构建体，其中没有事先与待表达的核酸序列功能连接的启动子被导入宿主基因组中，例如通过靶向同源重组或随机插入，表现出对之后功能连接的核酸序列的调节控制，和控制它的转基因表达。在编码特定的多核苷酸的核酸之前插入启动子——例如通过同源重组——获得了控制特定多肽在植物中表达的本发明的表达盒。启动子的插入还可以通过表达编码特定多肽的核酸的反义RNA来发生。因而下调或关闭了特定多肽在植物中的表达。

通过例如同源重组，还可以类似的放置待转基因表达的核酸序列在内源的、天然的启动子之后，获得本发明的表达盒，所述表达盒控制待转基因表达的核酸序列的表达。

原则上，在转基因植物生物体的情况下本发明还预期源自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、其部分，例如根、叶等，和转基因繁殖材料如种子或果实。

本发明的遗传修饰的植物还可以用作人类食品或动物食品，例如直接的或以本身已知的方式处理后，其中所述植物是可以被人和动物消费的。

因而，本发明的其他方面涉及上述本发明的转基因生物体，以及源自其的细胞、细胞培养物、其部分——在转基因植物生物体的情况下，例如根、叶等——和转基因繁殖材料如种子或果实的用途，用于生产人或动物食品、药品或精细化学品。

优选的进一步涉及用于在宿主生物体中重组生产药品或精细化学品的方法，其中宿主生物体是用一种上述表达盒或载体转化的，并且该表达盒包含一种或多种结构基因，所述基因编码期望的精细化学品或者催化精细化学品的生物合成，培养所转化的宿主生物体，并从培养基中分离期望的精细化学品。该方法可广泛的应用于精细化学品，例如酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然的和合成的风味剂、芳香底物和着色剂。生育酚和生育三烯酚以及类胡萝卜素的生产是特别优选的。通过技术人员已知的方法手段进行所转化的宿主生物体的培养，以及从宿主生物体中或从培养基中分离。药物的生产，例如抗体或疫苗，描述在Hood E E，Jilka J M(1999).Curr Opin Biotechnol 10(4)：382-6；Ma J K，Vine N D(1999).Curr Top Microbiol Immunol 236：275-92中。

本说明书中引用的所有参考文献都通过引用以其全部公开内容和本说明书具体提及的公开内容整合到本文中。

附图

图1：TaAffx.115437. 1.A1(SEQ ID NO：6)和玉米直系同源物Zm.348.2.A1_a_at(SEQ ID NO：7)的序列。

图2：使用Affymetrix玉米芯片杂交的Zm.348.2.A1_a_at表达谱。组织：1-6：未成熟胚胎；7-14：叶；15-25：幼年谷穗；和26-36：谷粒。

图3：玉米EST ZM03MC02483_60578324(SEQ ID NO：8)的序列。

图4：ZM03MC02483_60578324的qRT-PCR结果。

图5：(A)ZmNP27(SEQ ID NO：4)的相应的CDS序列，和(B)预测的蛋白质(SEQ ID NO：5)。

图6：含有预测的启动子区和部分相应编码序列的ZmGSStuc11-12-04.271010.1的序列(SEQ ID No：9)。

图7：启动子ZmNP27(pZmNP27；SEQ ID NO：1)的序列。

图8：含有由ZmNP27启动子(RLN 88)驱动的GUS表达盒的二元载体。

图9：RLN 88的序列(SEQ ID NO：10)。

图10：在构建体RHF 175中由ZmNP27启动子双向驱动的GUS和DsRed报告基因的表达盒。

图11：载体RHF175的序列(SEQ ID NO：11)。

图12：在含RLN88的转基因玉米中，在不同发育阶段的不同组织中，由ZmNP27正向驱动的GUS表达。

图13：pZmNP27的双向功能。DsRed基因的表达受pZmNP27的反向控制。在含RHF175的转基因玉米中，GUS的表达受pZmNP27的正向控制。

图14：载体pZmNP18的序列(SEQ ID NO：2)。

图15：载体pZmNP18-mini的序列(SEQ ID NO：3)。

图16：在含RLN87的转基因玉米中，在不同发育阶段的不同组织中，由pZmNP18驱动的GUS表达。

图17：在含RHF178的转基因玉米中，在不同发育阶段的不同组织中，由pZmNP27-mini驱动的GUS表达。

实施例

本发明将通过下列实施例示例，所述实施例并非意在以任何方式限制本申请的范围。

实施例1：鉴别NP27的玉米直系同源物

在使用Affymetrix小麦基因组阵列的表达谱分析中，小麦芯片共同序列TaAffx.115437.1.A1表现出组成型的表达。当将TaAffx.115437.1.A1的序列与Affymetrix玉米芯片的序列比对时，玉米芯片共同序列 Zm.348.2.A1_a_at被鉴别为TaAffx.115437.1.A1的直系同源物，在TaAffx.115437.1.A1的前290个核苷酸中具有78％核苷酸序列同一性。图1显示了TaAffx.115437.1.A1和Zm.348.2.A1_a_at的序列。

实施例2：使用Affymetrix玉米基因组阵列分析的Zm.348.2.A1_a_at的表达谱

将从未成熟的胚、叶、幼年谷穗和谷粒中分离的总RNA用于该Affymetrix玉米基因组阵列分析中。杂交了共计36个阵列。结果表示在所有的受试组织中组成型的表达Zm.348.2.A1_a_at(图2)。

实施例3：使用定量的逆转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)验证Zm.348.2.A1_a_at的表达谱数据

实施定量的逆转录酶-聚合酶链式反应(qRT-PCR)来确定Zm.348.2.A1_a_at在各种类型的组织中的表达水平。在 BASFPlant Science专利所有的序列数据库中Blast搜索Zm.348.2.A1_a_at的序列。鉴别出一条玉米ESTZM03MC02483_60578324(745bp)作为Zm.348.2.A1_a_at基因家族的成员。图3显示了ZM03MC02483_60578324的序列。

基于ZM03MC02483_60578324的序列使用VNTI设计 qRT-PCR的引物。将两套引物用于PCR扩增。引物的序列在表1中。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因用作归一化的对照。

表1.RT-QPCR的引物序列

使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)和SYBR Green QPCR Master Mix(Eurogentec，San Diego，CA，USA)，在ABI Prism 7000序列检测系统中实施qRT-PCR。使用2-3μg总RNA和1μL逆转录酶在20μL体积中合成cDNA。将cDNA稀释至一定的浓度范围(15-20ng/μL)。按照生产商的说明，将30至40ng的cDNA用于含SYBR Green QPCR Master Mix的30μL体积中的定量PCR(qPCR)。热循环条件如下：50℃孵育2分钟，95℃变性10分钟，运行40个循环的95℃下15秒和60℃下1分钟，进行扩增。在扩增的最后一个循环后，进行解离曲线分析，验证具体发生的扩增作用以及在扩增过程至没有产生任何的引物二聚体。将管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，表1中的引物序列)用作内源性参照基因，归一化使用相对Ct(阈值循环)值方法的计算。通过从候选基因(ZM03MC02483_60578324)的Ct值中减去GAPDH基因的Ct值，获得ΔC_T值。用2^-ΔCT给出候选基因的相对转录量(表达水平)。图4中概括了qRT-PCR结果。两种引物组合都给出了相似的表达模式，经验证为从图2所示的Affymetrix

玉米基因组阵列分析中获得的表达模式。

实施例4：Zm.348.2.A1_a_at序列的标注

基于计算机结果标注与Zm.348.2.A1_a_at基因对应的编码序列，所述计算机结果是从 EST ZM03MC02483_60578324序列在GenBank蛋白质数据库(nr)和VNTI翻译程序的结果中的BlastX获得的。EST ZM03MC02483_60578324编码玉米中的60S酸性核糖体蛋白P3(GenBank登录：O24413/RLA3_Maize)基因。表2中呈现了BlastX结果的排在最前的15个同源物。

登录号：使用VNTI鉴别的CDS序列(GenBank O24413/RLA3_Maize，玉米60S酸性核糖体蛋白P3基因)显示在图5(A)中，翻译的氨基酸序列显示在图5(B)中。

实施例5：鉴别启动子区

60S酸性核糖体蛋白P3基因的起始密码子的上游序列被定义为启动子。为了鉴别该预测的启动子区，将EST ZM03MC02483_60578324的序列绘制在BASF Plant Science专利所有的基因组DNA序列数据库中。鉴别出一条玉米基因组DNA序列，ZmGSStuc11-12-04.271010.1(880bp)。该880bp序列保留了一部分的EST ZM03MC02483_60578324，并含有基因的部分编码序列(CDS)和起始密码子上游的666bp序列(图6)。通过5’RACE(5’互补DNA末端的快速扩增)确定了5’UTR(81bp)，并在图6中以粗体和斜体字母表示。以下划线的粗体字母表示假设的TATA信号序列(图6)。

实施例6：通过PCR扩增分离启动子区

使用序列特异性正向引物GGCATGTATGGTGGAATTAT(SEQ ID NO：18)和反向引物GTCGCTTGTTCCCTGCGTGC(SEQ ID NO：19)进行PCR，分离启动子区。从玉米基因组DNA中扩增出651bp的片段。该启动子区命名为启动子ZmNP27(pZmNP27)。pZmNP27的序列显示在图7中。

实施例7：PLACE分析和预测双向功能的启动子

ZmNP27

通过Genomatix，使用PLACE(植物顺式作用调控DNA元件的数据库)鉴别在651 bp ZmNP27启动子区中的顺式作用基序。结果列在表3中。假设的TATA盒位于正向链的核苷酸(nt)序列号335和341之间。两个假设的TATA盒位于反向链的核苷酸(nt)序列编号17和23以及25和32之间，两个CCAAT盒位于反向链的核苷酸(nt)序列编号84和88以及108和112之间。该计算机分析的结果表示pZmNP27可能作为双向启动子发挥功能。

表3.651bp ZmNP27启动子的PLACE分析结果

实施例8：用于玉米转化来鉴别pZmNP27正向功能的二元载体构建

将通过PCR扩增的651bp启动子片段克隆到pENTR^TM 5’-TOPO TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中。将BASF Plant Science专利所有的内含子介导的增强(IME)-内含子(BPSI.1)插入到限制性酶BsrGI位点中，所述位点在ZmNP27的3’端下游24 bp。为了生产具有pZmNP27::BPSI.1::GUS::t-NOS盒的最终二元载体RLN 88，将所获得的载体用作Gateway进入载体，进行玉米转化(图8)，以表征pZmNP27正向方向的功能。二元载体RLN 88的序列显示在图9中。

实施例9：用于玉米转化来同时鉴别pZmNP27正向和反向功能的二元载体构建

为了确定pZmNP27是否双向的发挥功能，构建了另一个二元载体RHF175。将与NOS终止子组合的GUS报告基因(GUS::NOS)融合在BPSI.1内含子的下游，成为名为RLN88的构建体。在正向方向上，GUS基因表达受pZmNP27的控制。RLN88还含有在LB和GUS报告基因盒之间的植物可选择标志物盒。将与NOS终止子组合的第二个报告基因DsRed(DsRed::NOS)融合在RLN88中的pZmNP27的5’端上游。在反向方向上，DsRed基因表达受pZmNP27的控制。所获得的构建体名为RHF175。RHF175中的报告基因盒结构如下：t-NOS::DsRed::pZmNP27::BPSI.1::GUS::t-NOS(图10)。RHF175的序列显示在图11中。

实施例10：在含RLN 88的转基因玉米中的启动子特征描述

按照本领域的规程(Jefferson 1987)，使用GUS组织化学分析测量由ZmNP27启动子驱动的表达模式和水平。使用农杆菌介导的转化系统进行玉米转化。在T0和T1植物中挑选10个和5个单拷贝事件进行启动子分析。在各个发育阶段测量GUS表达：

1)在5叶期的根和叶

2)在V-7期的茎

3)在开花期(首次出现须)的叶、外壳和须

4)小穗/穗(授粉时)

5)授粉后5、10、15、20和25天(DAP)时的谷穗或谷粒

结果表示，RHF88的ZmNP27的正向方向组成型的发挥作用，在完整的种子和茎中具有更好的表达(图12)。

实施例11：在含RHF175的转基因玉米中的启动子特征描述

如上所述，使用GUS组织化学分析针对GUS报告子，以及使用荧光扫描仪Typhoon 9400针对DsRed报告子表达，测量两个方向上由ZmNP27启动子驱动的表达模式和水平。组织类型和发育阶段如上文列举的相同。

pZmNP27在反向方向上在叶和根中表达DsRed基因，但不在种子中表达(图13)。pZmNP27在反向方向上在叶和根中表达DsRed基因，但不在种子中表达(图13)。

实施例12：启动子ZmNP27的删除实验，验证关键区的功能

制造两种删除，来鉴别关于启动子功能的关键区：

从pZMNP27的5’端删除159bp片段。包括5’UTR的剩余的492bp的启动子区(图145)被称为pZmNP18。用pZmNP18替换RLN88中的pZmNP27，成为名为RLN87的构建体。

从pZMNP27的5’端删除380bp片段。包括5’UTR的剩余的271bp的启动子区(图15)被称为pZmNP27-mini。用pZmNP27-mini替换RLN88中的pZmNP27，成为名为RLN178的构建体。

在玉米中，pZmNP18和pZmNP27-mini都与全长的正向pZmNP27发挥相似的功能。图16和图17分别显示了在含RLN87和RHF178的转基因植物中的表达结果。

Claims (16)

1.包含表达控制序列的多核苷酸，其优选的允许与其以相反的方向有效连接的两条目标核酸的双向表达，所述表达控制序列选自：

(a)具有如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列的表达控制序列；

(b)具有与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列至少80％相同的核酸序列的表达控制序列；

(c)具有在严格条件下与如SEQ ID NO：1至3的任一条所示核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(d)具有与位于SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列上游的核酸序列杂交的核酸序列的表达控制序列；

(e)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于编码如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交；

(f)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于和SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列至少80％相同的开放阅读框序列上游的核酸序列杂交，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；

(g)具有这样的核酸序列的表达控制序列，所述核酸序列与位于编码和SEQ ID NO：5所示氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的开放阅读框上游的核酸序列杂交，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；

(h)在基因组DNA上从如SEQ ID NO：4所示开放阅读框序列的第一外显子开始通过5’基因组步行(genome walking)或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列；和

(i)在基因组DNA上从与如SEQ ID NO：4所示开放阅读框至少80％相同的开放阅读框序列的第一外显子开始，通过5’基因组步行或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3；和

(j)在基因组DNA上从编码与如SEQ ID NO：5所示开放阅读框所编码的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的开放阅读框序列的第一外显子开始，通过5’基因组步行或者通过热不对称交错聚合酶链式反应(TAIL-PCR)可获得的表达控制序列，其中所述开放阅读框编码60S酸性核糖体蛋白P3。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步包含至少一条与表达控制序列有效连接的目标核酸。

3.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸进一步包含至少一条各自以相反的方向与表达控制序列有效连接的目标核酸。

4.权利要求1至3的任一项的多核苷酸，其中所述目标核酸与表达控制序列是异源的。

5.包含权利要求1至4的任一项的多核苷酸的载体。

6.权利要求5的载体，其中所述载体是表达载体。

7.包含权利要求1至4的任一项的多核苷酸或权利要求5或6的载体的宿主细胞。

8.权利要求7的宿主细胞，其中所述宿主细胞是植物细胞。

9.包含权利要求1至4的任一项的多核苷酸或权利要求5或6的载体的非人转基因生物体。

10.权利要求9的非人转基因生物体，其中所述生物体是植物或者植物种子。

11.用于在宿主细胞中表达目标核酸的方法，包括：

(a)将权利要求1至4的任一项的多核苷酸或权利要求5或6的载体导入宿主细胞中；和

(b)在所述非人转基因生物体中表达至少一种目标核酸。

12.权利要求11的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。

13.用于在非人生物体中表达目标核酸的方法，包括：

(a)将权利要求1至4的任一项的多核苷酸或权利要求5或6的载体导入非人生物体中；和

(b)在所述非人转基因生物体中表达至少一种目标核酸。

14.权利要求13的方法，其中所述非人转基因生物体是植物或其种子。

15.权利要求13或14的方法，其中所述至少一种目标核酸是从表达控制序列的两种方向表达的。

16.权利要求1至4的任一项的多核苷酸，权利要求5或6的载体，权利要求7或8的宿主细胞，或者权利要求9或10的非人转基因生物体的用途，用于表达目标核酸。

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