CN103224953B - 人工合成的抗虫相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人工合成的抗虫相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所公开的抗虫相关蛋白是sNTL，是a）或b）的蛋白质：a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与抗虫相关的由a）衍生的蛋白质。导入SEQ ID No.2所示的sNTL的编码基因的转基因小麦与受体小麦相比，单分蘖蚜虫的平均发生量降低45%-87%。

Description

人工合成的抗虫相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及人工合成的抗虫相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

小麦蚜虫又名腻虫，是小麦生产中的主要害虫，以成虫、若虫吸取小麦汁液危害小麦，再加上蚜虫排出的蜜露，落在麦叶片上，严重地影响光合作用，造成小麦减产，而且能够传播多种病毒病，包括大麦黄矮病毒，最终导致小麦严重减产。调查显示，在小麦幼穗期每穗有蚜虫10-20头，千粒重降低10.4%；每穗有蚜虫21-40头，千粒重降低12.3%。因此，防治虫害对保证小麦稳产具有重要意义。前期危害可造成麦苗发黄，影响生长，后期危害被害部分出现黄色小斑点，麦叶逐渐发黄，麦粒不饱满，严重时麦穗枯白，不能结实，甚至整株枯死，严重影响产量。小麦蚜虫分布极广，几乎遍及世界各产麦国，我国为害小麦的蚜虫有多种，通常较普遍而重要的有：麦长管蚜、麦二叉蚜、黍缢管蚜、无网长管蚜。

近年来随着麦田水肥条件的改善和农业生态环境的改变，蚜虫对小麦的生产影响越来越重，据相关统计报道，可使小麦减产10—30%。目前防治小麦蚜虫或者其他害虫主要还是依靠化学杀虫剂，虽然在一定程度上能够减少虫害所带来的产量下降，但是长期的使用化学杀虫剂不但费用较高而且容易使蚜虫产生相应的抗性，同时导致蚜虫天敌杀伤严重，环境污染加剧，进而影响人类的健康安全的生活。因此转基因抗蚜虫的研究便成了解决虫害的“绿色、安全、环境友好”途径之一。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一个合成植物抗虫性的蛋白质及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为sNTL，是人工合成基因表达的如下a）或b）的蛋白质：

a）氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质；

b）将SEQ ID No.2经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且与抗虫相关的由a）衍生的蛋白质。

其中，SEQ ID No.2由106个氨基酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的sNTL可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的sNTL的编码基因可通过将SEQ ID No.1的第15-335位核苷酸所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码sNTL的核酸分子也属于本发明的保护范围。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

所述核酸分子具体可为如下1）-5）中任一所示的基因：

1）编码sNTL的DNA分子；

2）其编码序列是SEQ ID No.1第15-335位的DNA分子；

3）在严格条件下与1）限定的DNA分子杂交且编码sNTL的DNA分子；

4）与1）限定的DNA分子具有90％以上的一致性且编码sNTL的DNA分子；

5）与1）至4）中任一所述DNA分子反向互补的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，SEQ ID No.1由351个核苷酸组成，其编码序列是第15-335位，编码SEQID No.2所示的蛋白质。

下述1）-4）中的任一种生物材料也属于本发明的保护范围：

1）含有编码sNTL的核酸分子的表达盒；

2）含有编码sNTL的核酸分子的重组载体；

3）含有编码sNTL的核酸分子的重组微生物；

4）含有编码sNTL的核酸分子的转基因细胞系。

上述生物材料中，1）所述的含有编码sNTL的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达sNTL的DNA，该DNA不但可包括启动sNTL基因转录的启动子，还可包括终止sNTL转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（Small subunit of ribulose-1,5-bisphospate carboxylase,rbcs）基因启动子、花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S;来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人（1999)Plant Physiol120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128（CN101063139B(中国专利200710099169.7)），种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子（Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：根癌农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell等人（I⁹⁸⁵)Nature313:810；Rosenberg等人（1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141;Proudfoot(1991)Cell,64:671;Sanfacon等人Genes Dev.,5:141;Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人（1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic AcidRes.,15:9627)。在本发明的实施例中，所述sNTL基因表达盒中启动所述sNTL基因转录的启动子为番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（Small subunit of ribulose-1,5-bisphospate carboxylase,rbcs）基因启动子，终止所述sNTL基因转录的终止子为NOS终止子。所述番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因启动子的核苷酸序列具体可为SEQ ID No.3，NOS终止子的核苷酸序列具体可为SEQ ID No.4。其中SEQ ID No.3由1920个核苷酸组成，SEQ ID No.4由265个核苷酸组成。

上述生物材料中，2）所述的含有编码sNTL的核酸分子的重组载体具体可为在现有的植物表达载体的多克隆位点插入上述sNTL基因表达盒和标记基因表达盒得到的sNTL基因表达载体。所述标记基因可为赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因。所述标记基因表达盒的定义同所述sNTL基因表达盒。在本发明的一个实施例中，所述标记基因为bar基因，来源于吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus），编码Phosphinothricin乙酰转移酶（PAT），可以使除草剂Basta（草丁膦），或Glufosinateammomum（草氨膦），或Bialaphos的有效成分PPT（Phosphinothricin）乙酰化而解毒。其序列如SEQ ID No.5，由552个核苷酸组成。在本发明的一个实施例中，所述标记基因表达盒包括启动所述标记基因转录的启动子、所述标记基因、终止子。启动所述标记基因转录的启动子具体可为来源于玉米的启动子Ubi，其序列如SEQ ID No.6，由2010个核苷酸组成；所述终止子为上述Nos。

可用现有的表达载体构建上述sNTL基因表达载体。如pSP72、pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。sNTL基因表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。2）所述的含有编码sNTL的核酸分子的重组载体具体可为在载体pSP72的多克隆位点插入sNTL基因表达盒和标记基因表达盒得到的sNTL基因表达载体pBAC-sNTL。

上述生物材料中，3）所述重组微生物具体可为细菌,酵母,藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia）,欧文氏菌(Erwinia),根癌农杆菌属（Agrobacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）,产碱菌属（Alcaligenes）,假单胞菌属（Pseudomonas）,芽胞杆菌属（Bacillus）等。4）所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明还保护编码sNTL的核酸分子、编码sNTL的核酸分子或上述任一种生物材料在调控植物抗虫性中的应用。

上述应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。在本发明的实施例中，所述单子叶植物为小麦。

本发明还提供了一种利用上述sNTL的核酸分子培育抗蚜虫的转基因小麦的方法。

本发明所提供的培育抗蚜虫的转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入所述sNTL基因得到抗蚜虫能力高于所述受体小麦的转基因小麦的步骤。

其中，所述sNTL基因可先进行如下修饰，再导入受体小麦中，以达到更好的表达效果：

1）根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述sNTL基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2）修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3）与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；

4）与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5）引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel）和病毒前导序列（例如来源于TMV,MCMV和AMV）。

上述方法中，所述sNTL基因可通过sNTL基因表达盒或含有所述sNTL基因表达盒的sNTL基因表达载体导入目的植物。

上述方法中，所述sNTL基因可通过sNTL基因表达载体导入所述受体小麦；所述sNTL基因表达载体中启动所述sNTL基因转录的启动子是番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因启动子。所述sNTL基因表达载体具体可为上述sNTL基因表达载体pBAC-sNTL。

所述sNTL基因表达载体可通过使用Ti质粒，植物病毒栽体，直接DNA转化，微注射，电穿孔等常规生物技术方法导入小麦细胞（Weissbach,1998，Method forPlant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463;Geiserson andCorey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

所述方法还包括从导入SEQ ID No.2所示的sNTL的编码基因的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到所述转基因小麦的步骤。

所述转基因小麦理解为不仅包含将所述基因转化受体小麦得到的第一代转基因小麦，也包括其子代。对于转基因小麦，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因小麦包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

实验证明，导入SEQ ID No.2所示的sNTL的编码基因的转基因小麦与受体小麦相比，单分蘖蚜虫的平均发生量降低45%-87%。

附图说明

图1为pBAC202的物理图谱。

图2为pBAC-sNTL的物理图谱。

图3为部分T0代转pBAC-sNTL植株PCR检测结果。

M:D2000,1:水对照,2:pBAC-sNTL质粒,3:阴性对照(未转基因的受体小麦),4-24泳道分别为T0代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图4为部分T1代转pBAC-sNTL植株PCR检测结果。

M:D2000,1:水对照,2:pBAC-sNTL质粒,3:阴性对照(未转基因的受体小麦),4-24泳道分别为T1代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图5为部分T2代转pBAC-sNTL植株PCR检测结果。

M:D2000,1:水对照,2:pBAC-sNTL质粒,3:阴性对照(未转基因的受体小麦),4-24泳道分别为T2代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图6为部分T3代转pBAC-sNTL植株PCR检测结果。

M:D2000,1:水对照,2:pBAC-sNTL质粒,3:阴性对照(未转基因的受体小麦),4-24泳道分别为T3代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图7为部分T4代转pBAC-sNTL植株PCR检测结果。

M:D2000,1:水对照,2:pBAC-sNTL质粒,3:阴性对照(未转基因的受体小麦),4-24泳道分别为T4代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图8为部分T0代转pBAC-sNTL植株RT-PCR检测结果。

M:D2000,1:pBAC-sNTL质粒,2:阴性对照(未转基因的受体小麦),3-17泳道分别为T4代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

图9为部分T4代转pBAC-sNTL植株RT-PCR检测结果。

M:D2000,1:pBAC-sNTL质粒,2:阴性对照(未转基因的受体小麦),3-13泳道分别为T4代转pBAC-sNTL植株，目的基因sNTL大小为321bp。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的表达载体pBAC202(高泽发，陈旭清，杨凤萍，梁荣奇，张立全，张晓东。人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究,农业生物技术学报，2006,14(4):559-564)，小麦中优9507（中优9507优质面包小麦。河北农业科技，2000年08期，第36页）、小麦丰优6号（石明，刘婷婷，查仕莲。小麦新品种丰优6号的选育。种子(Seed)，第25卷第5期，第88-89页），公众可从商业途径获得，也可从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

实施例1、培育抗蚜虫的转基因小麦

质粒的构建方法及后续的筛选鉴定过程参见文献（Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning–A laboratory Mauual,2^nd ed.,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989.）。具体方法如下：

1）将图1所示的表达载体pBAC202(高泽发，陈旭清，杨凤萍，梁荣奇，张立全，张晓东。人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究,农业生物技术学报，2006,14(4):559-564)用SacⅠ酶切，回收4.3Kb载体片段，用T₄DNA连接酶自连，得到中间载体pBAC202-V。

2）由上海捷瑞生物工程有限公司人工化学合成sNTL基因全长（5’端加上BamHⅠ酶切位点,3’端加上SacⅠ酶切位点）,经过DNA测序证明正确。sNTL基因全长如SEQ ID No.1所示。SEQ ID No.1由351个核苷酸组成，其编码序列是第15-335位，编码SEQ ID No.2所示的蛋白质。

3）BamHⅠ和SacⅠ双酶切SEQ ID No.1所示的sNTL基因片段和pBAC202-V，用sNTL基因片段替换掉pBAC202-V中的sGNA基因片段，得到中间载体pBAC202-sNTL。

4）将用SacⅠ酶切载体pBAC202得到的2.8kb片段和用SacⅠ酶切载体pBAC202-sNTL得到的4.2kb载体片段连接后，选择sNTL方向和Ubi启动子方向一致的重组载体，命名为pBAC-sNTL（图2）。

酶切鉴定和DNA测序证明，pBAC-sNTL中的sNTL基因的核苷酸序列是SEQ ID No.1。SEQ ID No.1所示的sNTL基因编码SEQ ID No.2的蛋白sNTL。pBAC-sNTL中启动sNTL基因转录的启动子是为番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基（Small subunit ofribulose-1,5-bisphospate carboxylase,rbcs）基因启动子，其序列如SEQ ID No.3，大小为1.9kb，在叶肉细胞特异启动该亚基编码基因的表达，来自于番茄（Solanumlycopersicum L.）。pBAC-sNTL中终止sNTL基因转录的终止子为Nos，来源于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens），为胭脂碱合成酶基因的终止子（NOS terminator）序列，其序列如SEQ ID No.4，大小265bp。pBAC-sNTL中的筛选标记基因为bar基因，大小552bp，来源于Streptemyces hygroscopies，编码Phosphinothricin乙酰转移酶（PAT），可以使除草剂Basta（草丁膦），或Glufosinateammomum（草氨膦），或Bialaphos的有效成分PPT（Phosphinothricin）乙酰化而解毒。pBAC-sNTL中终止bar基因转录的终止子为为Nos，来源于根癌农杆菌，为胭脂碱合成酶基因的终止子序列，大小265bp，启动bar基因转录的启动子来源于玉米的启动子Ubi，其序列如SEQ IDNo.6，由2010个核苷酸组成。

二、培育抗蚜虫转基因小麦

1、受体小麦品种

中优9507、丰优6号和AF9这三个品种（品系）。

2、表达载体pBAC-sNTL转化小麦

选择受体小麦品种的幼胚愈伤组织，利用Bio-Rad的PDS1000/He系统，按照文献（张晓东，梁荣奇，陈旭清，杨凤萍，张立全。优质HMW谷蛋白亚基转基因小麦的获得及其遗传稳定性和品质性状分析，科学通报）进行转化，具体方法如下：

1)植物材料的准备：选取开花后12-15天的小麦幼胚，在含有2mg/L2,4-D的N6培养基上诱导愈伤组织，4周后取愈伤组织。

2)质粒DNA的提取和纯化：质粒的提取采用碱性裂解方法，纯化用PEG方法(Sambrook等，1989)。

3)转化程序：愈伤组织放入6cm直径的培养皿中培养基上，用包裹质粒DNA的金粉进行轰击，每皿轰击1次。

金粉微粒子弹的制作方法如下：称取60mg金粉(BioRad，1μm直径)于1.5ml离心管中，加lmL70％乙醇，用旋涡混合器或超声波充分震荡混合，10000rpm离心5分钟，去上清，用无菌重蒸水重复洗3次，加入lmL50％的无菌甘油，并用涡旋混匀。取50μL上述制备的金粉或钨粉颗粒至无菌离心管中顺序加入5μL质粒DNA(1μg／μL)、50μL2.5M CaCl₂和50μL0.1M亚精胺(现配)；将混合物涡旋10分钟，10000rpm离心5分钟，去上清液。用70％乙醇和100％乙醇各洗沉淀1次，最后用60μL100％乙醇重新悬浮颗粒并用超声波粉碎仪处理5秒，分散颗粒。该制备用于6次轰击。

轰击后的小麦材料在培养基上暗培养2-3天，然后转入含有5-10mg／L PPT的MS培养基上进行选择。以后，每3—4周转移一次。经5-6次选择后，将抗性愈伤组织转入含有0.5mg／L PPT的MS分化培养基(添加玉米素10mg／L，IAA lmg／L，糖30g／L，琼脂粉7g／L；pH5.8)上。3-4周后，将分化形成的芽点或小植株放到生根培养基与壮苗培养基，待根系齐全，生长健壮后移栽到温室。将转pBAC-sNTL当代植株称为T0代，T0代植株自交所结的种子及由它长成的植株称为T1代，T1代植株自交所结的种子及由它长成的植株称为T2代，T2代植株自交所结的种子及由它长成的植株称为T3代，T3代植株自交所结的种子及由它长成的植株称为T4代。

3、转pBAC-sNTL小麦的分子检测

1）PCR检测

以pBAC-sNTL载体质粒作为阳性对照，未转基因植株作为阴性对照，对三个小麦品种的T0-T4代转pBAC-sNTL植株利用5’引物P1和3’引物P2进行PCR扩增检测，检测基因为sNTL（321bp）基因。根据sNTL基因的序列设计上下游特异引物序列如下：

5’引物P1为5’-ATG GAC AAC ATC CTG TAT ATG-3’，

3’引物P2为5’-TTAT CCG GTG GCC CACAGC GAA C-3’。

PCR反应体系如下：

反应条件：95℃变性5min；94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸35s，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明三个小麦品种均得到了T0代转pBAC-sNTL的阳性植株（得到321bp的扩增产物），三个小麦品种均得到了T1代、T2代、T3代和T4代转pBAC-sNTL的阳性植株（得到321bp的扩增产物）（图3-图7）。

通过上述常规PCR检测，可知sNTL基因已经完整的整合到小麦基因组中，随着转基因小麦T0-T4代的自交，选取目的基因sNTL为阳性的植株。

2）RT-PCR检测

对三个小麦品种的T0代-T4代转pBAC-sNTL的PCR检测阳性植株用上述5’引物P1和3’引物P2进行RT-PCR检测，结果表明三个小麦品种的T0代转pBAC-sNTL植株均得到RT-PCR检测阳性植株（得到321bp的扩增产物）（图8）。对该RT-PCR检测阳性的T4代植株利用5’引物P1和上述3’引物P2进行RT-PCR检测，结果表明三个小麦品种均得到RT-PCR检测阳性（得到321bp的扩增产物）的T4代转pBAC-sNTL植株（图9）。

其中，T0代转pBAC-sNTL植株的RT-PCR检测反应体系：

反应条件：95℃变性5min；94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸35s，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。

T4代转pBAC-sNTL植株的RT-PCR检测反应体系如下：

反应条件：95℃变性5min；94℃变性40s，55℃复性40s，72℃延伸35s，共35个循环；最后72℃延伸7min。反应产物在1%琼脂糖凝胶电泳上检测。

根据T0、T4代转基因小麦RT-PCR的检测结果，可以看出，sNTL基因在部分转基因后代中已经能够稳定的表达。

4、转基因小麦的抗蚜虫效果

供试小麦：

转基因株系：选取T0代-T4代sNTL基因均表达的转pBAC-sNTL的T4代株系进行抗蚜虫实验。其中，转pBAC-sNTL的中优9507选取9-4和9-8这两个株系的T4代、转pBAC-sNTL的丰优6号选取4-4、4-5、4-10和4-19这四个株系的T4代、转pBAC-sNTL的AF9选取7-7、7-8和7-23这三个株系的T4代。

对照品种：同时，将受体品种（未转基因的中优9507、丰优6号、AF9）作为对照。

供试小麦蚜虫：麦二叉蚜的一龄若虫。

实验方法如下：

各转基因株系的每个株系种植3行（行长2m，行间距25cm），每行30-35个单株，并且每个对照品种也种植同样的3行。在小麦完成拔节期后，用高1.8m的网室将实验材料与外界隔离起来，实验材料之间不进行隔离。在隔离当天进行蚜虫数目的第一次调查，第一次调查记为0天，在各转基因株系及其相应的对照品种中随机选取10个单株并挂牌标记，记录整株的蚜虫数目，并记录该株的分蘖数，之后每隔2天对这些单株进行一次蚜虫数目的调查，共进行5次。每个转基因株系的单分蘖蚜虫发生量等于该株系各个单株的单分蘖蚜虫发生量的平均值。对照的单分蘖蚜虫发生量等于该对照品种各个单株的单分蘖蚜虫发生量的平均值。通过比较转基因株系与对照的单分蘖蚜虫发生量，并进行单因素方差分析。根据方差分析的结果统计转基因株系的抗虫效果。

受体品种中优9507及9-4和9-8这两个T4代转pBAC-sNTL的中优9507株系的单分蘖蚜虫发生量如表1所示。

表1、中优9507及其转基因株系的单分蘖蚜虫发生量

实验材料	第0天	第3天	第6天	第9天	第12天
						中优9507	7.25(±1.49)	6.95(±1.13)	10.48(±0.84)	8.90(±2.24)	11.33(±1.61)
9-4	2.85(±0.52)**	3.70(±0.75)*	5.38(±0.61)*	5.06(±0.70)*	4.82(±0.42)*
						9-8	2.74(±0.28)**	3.51(±0.51)*	6.49(±0.65)*	7.02(±0.55)	4.92(±1.11)*

注：α0.05=2.306,α0.01=3.355，*表示与受体品种中优9507相比，具有显著差异；**表示与受体品种中优9507相比，具有极显著差异。

T4代转pBAC-sNTL的中优9507株系9-4、9-8每次调查的蚜虫发生量均显著或极显著低于对照品种（表1）。而且，9-4和9-8单分蘖蚜虫5次调查的平均发生量分别为4.36和4.94，同对照中优9507（单分蘖蚜虫5次调查的平均发生量为8.98）相比，单分蘖蚜虫发生量分别降低51.4%、45.1%，达到显著或极显著水平。

受体品种丰优6号及4-4、4-5、4-10和4-19这四个T4代转pBAC-sNTL的丰优6号株系的单分蘖蚜虫发生量如表2所示。

表2、丰优6号及其转基因株系的单分蘖蚜虫发生量

实验材料	第0天	第3天	第6天	第9天	第12天
						丰优6号	12.26(±1.64)	13.89(±1.79)	18.69(±3.85)	9.67(±2.13)	30.72(±5.33)
4-4	4.68(±0.80)**	7.06(±0.82)*	6.98(±0.58)*	6.46(±0.48)	10.04(±1.73)**
						4-5	2.72(±0.72)**	5.34(±1.61)**	4.48(±0.83)**	2.61(±0.43)**	4.52(±1.04)**
4-10	4.37(±0.65)**	4.39(±0.63)**	5.58(±1.18)**	3.17(±0.84)*	11.67(±2.54)**
						4-19	4.35(±0.83)**	6.21(±1.10)**	3.14(±0.47)**	1.95(±0.25)**	4.51(±0.43)**

注：α0.05=2.306,α0.01=3.355，*表示与受体品种丰优6号相比，具有显著差异；**表示与受体品种丰优6号相比，具有极显著差异。

T4代转pBAC-sNTL的丰优6号株系4-4、4-5、4-10、4-19每次调查的蚜虫发生量均显著或极显著低于对照品种（表2）。而且，与对照丰优6号相比，4-4、4-5、4-10、4-19这四个株系单分蘖蚜虫5次调查的平均发生量降低，其降低水平分别为58.7%（1-7.04/17.05）、76.9%（1-3.93/17.05）、65.7%（1-5.84/17.05）、76.4%（1-4.03/17.05），分别达到显著或极显著水平。

受体品种AF9及7-7、7-8和7-23这三个T4代转pBAC-sNTL的AF9株系的单分蘖蚜虫发生量如表3所示。

表3、AF9及其转基因株系的单分蘖蚜虫发生量

实验材料	第0天	第3天	第6天	第9天	第12天
						AF9	8.41(±1.32)	10.41(±1.170	28.08(±3.57)	15.10(±2.64)	15.05(±1.51)
7-7	1.59(±0.34)**	1.32(±0.22)**	2.85(±0.50)**	1.76(±0.41)**	1.76(±0.32)**
						7-8	2.31(±0.52)	3.19(±0.91)*	5.29(±0.83)*	3.31(±0.95)*	1.59(±0.52)**
7-23	2.48(±0.44)	1.27(±0.30)**	2.75(±0.60)**	2.54(±0.76)*	2.25(±0.51)*

注：α0.05=2.306,α0.01=3.355，*表示与受体品种AF9相比，具有显著差异；**表示与受体品种AF9相比，具有极显著差异。

T4代转pBAC-sNTL的AF9株系7-7、7-8、7-23每次调查的蚜虫发生量均显著或极显著低于对照品种，除了7-8和7-23的第一次调查外（表3）。而且，与对照AF9相比，这三个株系单分蘖蚜虫的5次调查的平均发生量分别降低了87.6%、79.1%、84.9%，分别达到显著或极显著水平。

Claims (10)

1.培育抗蚜虫的转基因小麦的方法，包括向受体小麦中导入sNTL基因得到抗蚜虫能力高于所述受体小麦的转基因小麦的步骤；所述sNTL是氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述sNTL基因为编码sNTL的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述sNTL基因为编码序列是SEQID No.1第15-335位的DNA分子。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述sNTL基因通过sNTL基因表达载体导入所述受体小麦；所述sNTL基因表达载体中启动所述sNTL基因转录的启动子是番茄核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶小亚基基因启动子。

5.sNTL，是氨基酸序列如SEQ ID No.2所示的蛋白质。

6.编码权利要求5所述sNTL的核酸分子。

7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码sNTL的DNA分子。

8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.1第15-335位的DNA分子。

9.下述1)-4)中的任一种生物材料：

1)含有权利要求6、7或8所述核酸分子的表达盒；

2)含有权利要求6、7或8所述核酸分子的重组载体；

3)含有权利要求6、7或8所述核酸分子的重组微生物；

4)含有权利要求6、7或8所述核酸分子的转基因细胞系。

10.权利要求5所述的sNTL、权利要求6、7或8所述的核酸分子、权利要求9所述的生物材料在调控植物抗虫性中的应用；所述植物抗虫性为小麦对小麦蚜虫的抗性。