SA112340162B1 - جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه - Google Patents

جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه Download PDF

Info

Publication number
SA112340162B1
SA112340162B1 SA112340162A SA112340162A SA112340162B1 SA 112340162 B1 SA112340162 B1 SA 112340162B1 SA 112340162 A SA112340162 A SA 112340162A SA 112340162 A SA112340162 A SA 112340162A SA 112340162 B1 SA112340162 B1 SA 112340162B1
Authority
SA
Saudi Arabia
Prior art keywords
sequence
gene
lah
mother
yah
Prior art date
Application number
SA112340162A
Other languages
English (en)
Inventor
ار. ريت تيرى
الابيد ديا
كومار سانديب
جوبتا مانجو
Original Assignee
دو اجروسينسيس ال ال سي
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by دو اجروسينسيس ال ال سي filed Critical دو اجروسينسيس ال ال سي
Publication of SA112340162B1 publication Critical patent/SA112340162B1/ar

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Abstract

يتعلق الاختراع بتقديم تركيبات ‏constructs‏ وطرق ‏methods‏ للتعبير الجيني ‏expressing‏ ‏لجينات ‏genes‏ متعددة لخلايا نبات ‏plant cells‏ و/ أو أنسجة النبات ‏plant tissues‏. تشتمل ‏التركيبات المقدمة على معزز ثنائي الاتجاه ‏bi directional promoter‏ على الأقل متصل ‏بمجموعات تعبير جيني ‏expression cassettes‏ للجين ‏gene‏ متعددة. في بعض التجسيمات، ‏تستخدم التركيبات والطرق المقدمة معزز ثنائي الاتجاه يعتمد على عنصر معزز أساسي أدنى ‏minimal core promoter element‏ من جين يوبيكويتين-1 ‏Ubiquitin-1‎‏ للذرة الشامية ‏Zea mays، أو مكافئ وظيفي منه. في بعض التجسيمات، تسمح التركيبات والطرق المقدمة ‏بالتعبير الجيني لجينات ‏genes‏ بين ثلاثة وعشرون.‏ شكل‎ ‎‏2 ‏

Description

— \ — جزء ‎Line‏ وطريقة لمعزز النبات 811ل التصنيعي ثنائي الاتجاه ‎Construct and method for synthetic bidirectional plant promoter 1‏ الوصف الكامل خلفية الاختراع يتعلق الاختراع عامة بمجال ‎field‏ البيولوجيا الجزيئية للنبات ‎plant molecular biology‏ « وبخاصة أكثر ‎Jae‏ التعبير الثابت للجينات ‎genes‏ المتعددة في النباتات المعدلة وراثياً ‎transgenic plants‏ 0 تعد كثير من أنواع النباتات ‎plant species‏ قادرة على أن تتحول بجينات التحوير من أنواع أخرى لتدخل صفات مرغوبة محصولياً أو خصائص؛ على سبيل المثال؛ تحسين نوعية القيمة الغذائية ‎nutritional value quality‏ » أو زيادة الغلة ‎increasing yield‏ « أو نقل الآفات ‎conferring pest‏ أو مقاومة الأمراض ‎disease resistance‏ « أو زيادة الجفاف ‎increasing drought‏ وتحمل الضغط ‎stress tolerance‏ أو تحسين الصفات ‎٠‏ البستانية ‎horticultural qualities‏ (مثل الصبغ ‎«(growth ally pigmentation‏ أو إضفاء 9 القدرة على مقاومة مبيدات الأعشاب ‎herbicide resistance‏ « أو أن تكون لها القدرة على إنتاج مركبات مفيدة صناعياً و/ أو مواد 013181215 من النبات 01801 و/ أو أن تكون لها القدرة على إنتاج المركبات الصيدلية ‎pharmaceuticals‏ يمكن لإدخال الجينات المتحورة وراثياً إلى خلايا النبات ‎plant cells‏ والاستخلاص التالي للنباتات المخصبة المعدلة وراثياً ‎fertile‏ ‎transgenic plants Yo‏ التي تحتوي على نسخة متكاملة ‎integrated copy‏ بشكل ثابت لجين التحوير ‎transgene‏ وراثياً أن تستخدم في إنتاج نباتات معدلة وراثياً والتي تمتلك الصفات المرغوبة. يمكن أن يحدث التحكم والتنظيم 8901811017" لتعبير الجين ‎gene expression‏ من خلال طرق متعددة. ويُعد بدء النسخ ‎Transcription initiation‏ للجين طريقة تحكم سائدة لتعبير الجين. ويتم ‎Yo‏ التحكم عامة في بدء النسخ بواسطة تتابعات البولي نيوكليوتيد ‎polynucleotide‏ الواقعة في ال '5- المتاخمة ‎flanking‏ -'5 أو المنطقة فى عكس الاتجاه ‎upstream region‏ للجين المراد ملا
ا
نسخه ‎Jtranscribed gene‏ وتشير هذه التتابعات مجتمعة إلى كونها كمعززات ‎promoters‏ ‏وتحتوي المعززات عامة على إشارات ‎RNAL signals‏ بوليميراز ‎polymerase‏ لبدء النسخ ولذلك يمكن أن يتكون ‎RNAY‏ الناقل ‎(MRNA) messenger‏ ويتم ترجمة ‎MRNA‏ الناضج ‎daily Mature‏ الريبوسوم ‎ribosome‏ ؛ وبالتالي تخليق البروتينات ‎synthesizing‏ ‎proteins ©‏ وتتفاعل البروتينات المرتبطة ‎DNA, binding proteins‏ بشكل خاص مع تتابعات ‎DNA‏ المعززة لتعزز تكوين معقد النسخ ‎transcriptional complex‏ وتقوم ببدء عملية التعبير الجيني ‎.gene expression process‏ وهناك معززات مختلفة حقيقية النواة ‎eukaryotic‏ ‏635 منفصلة ومتصفة عن النباتات التي تعد وظيفية لتدفع بالتعبير للجينات المتحورة وراثياً في النباتات. ويتم فصل ووصف المعززات التي تؤثر على تعبير الجين كرد فعل على ‎٠‏ المؤثرات البيئية ‎environmental stimuli‏ « أو إتاحة المواد الغذائية ‎nutrient availability‏ « أو الظروف المضادة ‎adverse conditions‏ والتي تشمل الصدمة الحرارية ‎heat shock‏ ؛ أو اللاهوائية ‎anaerobiosis‏ ؛ أو وجود معادن ثقيلة ‎heavy metals‏ وهناك أيضاً المعززات التي تتحكم في تعبير الجين أثناء التطور أو في نسيج ‎tissue‏ أو عضو 02980 معين. بالإضافة إلى انه يتم فصل ووصف معززات بدائيات النواة ‎prokaryotic promoters‏ المعزولة من البكتيريا
‎bacteria vo‏ والفيروسات ‎virus‏ التي تعد وظيفية للدفع بتعبير الجين المتحور وراثياً في النباتات. ويتكون معزز حقيقيات النواة ‎eukaryotic promoter‏ النموذجي من معزز أدنى ‎minimal‏ ‎promoter‏ وعناصر_سيس ‎.Cis-elements‏ ويُعد المعزز الأدنى هو في الأساس منطقة صندوق ‎TATA box region‏ حيث ‎Lay‏ ترتبط ‎RNA‏ بوليميراز ‎o(POlll) ١١‏ وبروتين الارتباط ‎TATA, binding protein‏ (180)؛ والعوامل المرتبطة ‎TBP. associated factors‏ ‎(TAFS) ٠‏ لبدء النسخ. بالرغم من أنه في معظم الأمثلة يتطلب عناصر تتابع غير باعث ‎Motif‏ ‎TATA‏ للنسخ المضبوط. وقد وجد مثل هذه التتابع من العناصر (مثل؛ المحسنات ‎(enhancers‏ ‏للتخلص من مستوى التعبير الكلي للجينات المجاورة؛ غالباً في طريقة ‎manner‏ لا تعتمد على الموضع ‎position‏ و/ أو الاتجاه ‎orientation‏ وربما تمد التتابعات الأخرى والتي بالقرب من مكان بدء النسخ ‎transcription start site‏ (مثل؛ تتابعات ‎(INR‏ لبعض جينات ‎Poll‏ بمكان ‎Yo‏ ارتباط بديل للعوامل التي تساهم أيضاً في النشاط النسخي ‎transcriptional activation‏ ؛ ‎i>‏
‏ملا
وه أنها تمد بديلاً عن ذلك بأماكن ارتباط المعزز الأساسي ‎core promoter‏ للنسخ في المعززات التي تفتقد عناصر ‎TATA‏ الوظيفية. انظر ‎Zenzie-Gregory et al. (1992) J.
Se‏ ‎.Biol.
Chem. 267: 2823-30‏ تشمل عناصر تنظيمية للجين ‎gene regulatory elements‏ أخرى على تتابعات التي تتفاعل © مع عوامل ارتباط ‎DNA‏ الخاصة. ويتم الإشارة لبواعث ‎motifs‏ التتابع تلك إلى عناصر سيس؛ وغالباً موضع وتوجه مستقل؛ بالرغم من أنه ربما يتم إيجاد '5 أو 3 إلى تتابع ترميز ‎coding‏ ‎3d sequence‏ الجين؛ أو في إنترون ‎intron‏ . وربما تحدد ‎Jie‏ عناصر سيس» والتي يرتبط بها عوامل نسخ ‎transcription factors‏ خاصة بالنسيج أو خاصة بالتطوير؛ بصفة فردية أو في مجموعة؛ نمط التعبير الزماني المكاني ‎spatiotemporal expression pattern‏ للمعزز عند ‎٠‏ المستوى النسخي ‎transcriptional level‏ وبشكل نموذجي تؤسس ترتيب عناصر _ سيس الصاعدة والتالي لها من المعزز الأدنى القطبية ‎promoter jd polarity‏ خاص. وتعد المعززات في النباتات التي تم وضعها في مستعمرات ‎cloned‏ والمستخدمة بشكل واسع لكل من البحث الأساسي والتطبيق البيوتكنولوجي ‎biotechnological application‏ بصفة عامة أحادية الاتجاه ‎Unidirectional‏ ؛ موجهة فقط جين ‎gene‏ واحد الذي يتم دمجه عند نهايته 3 (أي؛ فى ‎Vo‏ نفس الاتجاه ‎(downstream‏ انظر على سبيل المثال ‎Xie et al. (2001) Nat.‏ ‎.Biotechnol. 19(7):677-9; U.S.
Patent No. 6,388,170‏ وقد تم التعرف على العديد من عناصر سيس ‎J)‏ "تتابعات تنظيمية ضد الاتجاه ‎upstream‏ ‎regulatory sequences‏ ") في معززات النبات ‎plant promoters‏ وتختلف بشكل واسع عناصر سيس تلك في طريقة التحكم التي تنفذها على الجينات المرتبطة بإجراء العملية. وبعض ‎٠‏ العناصر تعمل على ‎sab)‏ النسخ للجينات المرتبطة بإجراء العملية كاستجابة ‎response‏ ‏للاستجابات البيئية ‎(Jie) environmental responses‏ درجة الحرارة ‎temperature‏ « والرطوبة ‎moisture‏ « والإصابة ‎(wounding‏ وربما تستجيب عناصر سيس إلى الجدائل التطورية ‎developmental cues‏ (مثل؛ التجرثم ‎germination‏ ؛ ونضوج البذور ‎seed‏ ‎maturation‏ « والتزهر ‎(flowering‏ أو إلى معلومة مكانية ‎spatial information‏ (مثل؛ ‎Yo‏ خصوصية النسيج ‎(tissue specificity‏ انظر على سبيل المثال» ‎Langridge et al.‏ ملا
—o- ‏وتُعد نوع التحكم لعناصر المعزز‎ (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23 ‏للمعزز بشكل نموذجي؛ أي يتم التعبير على الأرجح‎ intrinsic quality ‏الخاص ذا جودة ذاتية‎ ‏تحت التحكم لمثل هذه المعزز وفقاً للتحكم‎ heterologous gene ‏عن جين غير متجانس‎ ‏عنصر المعزز. وربما يتم التبديل لتلك‎ Jie ‏منها تم‎ lly native gene ‏للجينات الأصلية‎ ‏التعبير‎ intrinsic control ‏العناصر أيضاً بعناصر أخرى والحفاظ على قدرتهم بالتحكم الذاتى‎ 5 ‏الجيني.‎ ‎metabolic ‏إنه من الضروري غالباً إدخال جينات متعددة في النباتات من أجل الهندسة الآيضية‎ ‏؛ التي يتم التحكم فيها مراراً بمعززات متطابقة‎ trait stacking ‏وتجميع الصفات‎ 9 ‏على أساس التجانس‎ gel GY ‏أو متجانسة. _ بالرغم من أنه على الأرجح‎ ‏عندما تمتلك الجينات المتحورة‎ Lam oN (HBGS) homology-based gene silencing ٠ ‏تقوم بدفعهم. انظر على‎ homologous promoters ‏والتي تم إدخالها معززات متجانسة‎ ays
HBGS ‏وقد تم تسجيل‎ .Mol et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:287-94 ‏سبيل المثال‎
Vaucheret 800 ‏أن تحدث بشكل كبير في النباتات المعدلة وراثياً. انظر على سبيل المثال‎ ‏وفقد تم اقتراح العديد من الآليات لشرح‎ .29800 (2001) Trends Genet. 17:29-35 cellular ‏وتشمل كل منها على الخاصية التي تحفز آليات تعرف خلوي‎ (HBGSH ‏ظاهرة‎ Vo repeated genes ‏التي تؤدي إلى إسكات الجينات المتكررة‎ recognition mechanisms
Matzke and Matzke (1995) Plant ‏لتتابع متجانس في المعزز. انظر على سبيل المثال‎
Physiol. 107:679-85; Meyer and Saedler (1996) Ann. Rev. Plant Physiol.
Plant Mol. Biol. 47:23-48; Fire (1999) Trends Genet. 15:358-63;
Hamilton and Baulcombe (1999) Science 286:950-2; and Steimer etal. Y. .(2000) Plant Cell 12:1165-78 ‏في النباتات المعدلة وراثياً مراراً على تطور المعززات‎ HBGS ‏وتشمل الاستراتيجيات لتجنب ال‎ minimal sequence ‏المخلقة الني تُعد مكافئة وظيفياً ولكن تمتلك التمائل الأدنى للتتابع‎ ‏لتعبر للجينات‎ 57/016116 promoters ‏وعندما يستخدم مثل تلك المعززات المخلقة‎ .homology ‏؛ فربما تساعد في تجنب أو تقليل 11865. انظر‎ crop plants ‏المتحورة في نباتات المحاصيل‎ Yo nq
Mourrain et al. (2007) Planta 225(2):365-79; Bhullar et al. ‏على سبيل المثال‎ ‏ويمكن لهذه المعززات ان تتولد بإدخال عناصر‎ .(2003) Plant Physiol. 132:988-98 ‏سيس المعروفة في امتداد ال5/لا0 الجديد أو المُخلق؛ أو بديلاً عن ذلك بواسطة 'مبادلة النطاق‎ ‏يتم استبدال مجالات المعزز الواحد بمجالات مكافئة وظيفياً من‎ dua ‏.؛"‎ domain swapping heterologous promoters ‏المعززات الغير متجانسة الأخرى‎ © ‏للتعبير الجيني المستقر عن‎ methods ‏وطرق‎ constructs ‏بالتالي؛ تبقى هناك حاجة لتركيبات‎ ‏تمحورات وراثية متعددة بأدنى خطورة بشكل فعّال لناتج عودة الارتباط الجيني أو فقط تمحور وراثي‎ ‏أو الأجيال المتعددة في نباتات معدلة وراثياً.‎ breeding dsl ‏من خلال‎ ‏العام للاختراع‎ ua olf ‏إلى‎ Ubil polar promoter ‏قطبي‎ Ubil ‏ثم في هذه الوثيقة الكشف عن طرق لتحويل معزز‎ ٠ ‏؛ بحيث يمكن لمعزز‎ synthetic bidirectional promoters ‏معززات ثنائية الاتجاه تخليقية‎ ‏توجيه جينين ترافق المعزز. في بعض التجسيمات؛ يمكن أن‎ synthetic promoter ‏تخليقي‎ ‏لتحويل معزز 011لا قطبي إلى معزز تخليقي ثنائي الاتجاه. على سبيل‎ method ‏تشتمل طريقة‎ ‏عنصر أدنى معزز‎ nucleotide sequence ‏المثال و بدون تقييد؛ على تعريف تتابع نيوكليوتيد‎ ‏يشتمل على تتابعي نيوكليوتيد‎ nucleic acid ‏ا لمعزز 1أطلا؛ و/ أو توفير حمض نووي‎ ‏_عنصر أدنى معزز 011لا موجهة في اتجاهات متقابلة. في‎ Nucleotide sequences ‏يشتمل حمض نيوكليوتيد على تتابعي نيوكليوتيد عنصر أدنى معزز‎ of ‏تجسيمات خاصة؛ يمكن‎ ‏بحيث تكون نهاية كل عنصر أدنى‎ opposite directions ‏موجهة في اتجاهات متقابلة‎ 1 ‏أدنى معزز عن نهاية‎ element ‏الأصلي المقابل أبعد من عنصر‎ Ubi] ‏معزز القريبة من جين‎ ‏متصلة بشكل عملي‎ coding sequence ‏حمض النيوكليوتيد التي تكون قريبة من تتابع ترميز‎ Yo
Ubil ‏في بعض الأمثلة؛ يتم فصل عنصر أدنى معزز‎ promoter element ‏بعنصر المعزز‎
Ubil ‏من معزز‎ Additional elements ‏عن الذرة 0181268. يمكن تعديل عناصر إضافية‎ ‏1أطلاء‎ introns ‏أصلي وراثياً ليتم تضمينها في معزز تخليقي ثنائي الاتجاه يشتمل على إنترونات‎ upstream ‏ضد الاتجاه‎ jee ‏1أطلاء و/ أو كل أو جزء من منطقة‎ exons ‏إكسونات‎
—y—
‎Ubil promoter region‏ .3 بعض ‎ABN)‏ يمكن أن يشتمل معزز تخليقي ثنائي الاتجاه على
‏أكثر من أي مما سبق.
‏يتم في هذه الوثيقة أيضاً الكشف عن أدنى معززات ‎Ubi‏ التي تكون مفيدة في تركيب
‏9 معززات تخليقية (على سبيل المثال؛ معززات تخليقية ثنائية الاتجاه)؛ و معززات تخليقية خاصة ناتجة بواسطة الطرق المذكورة. في بعض التجسيمات؛ يكون معزز تخليقي ثنائي
‏الاتجاه ‎Ble‏ عن معزز يكون قادر على التحكم في انتساخ ‎transcription‏ تتابع نيوكليوتيد
‏متصلة ‎Tle‏ في خلية نبات. على سبيل المثال» يمكن أن يكون معزز تخليقي ثنائي الاتجاه قادر
‏في تجسيمات خاصة على التحكم في الانتساخ في خلية نبات ‎plant cell‏ من تتابعي نيوكليوتيد
‏متصلة عملياً تجاور المعزز.
‎(plant cells ‏خلايا نبات‎ (JB ‏سبيل‎ Jo) WIA ‏تشتمل تجسيمات خاصة من الاختراع على‎ ٠ ‏يمكن أن تشتمل التجسيمات‎ (Jd) ‏يتضمن معزز أدنى 811ل أو مكافئ وظيفي منه. على سبيل‎ ‏الخاصة على خلية تتضمن معزز تخليقي (على سبيل المثال معزز ثنائي الاتجاه تخليقي‎ ‏يتضمن معزز أدنى 811لا أو مكافئ وظيفي‎ (Synthetic bidirectional promoter ‏نبات وفقاً لتجسيمات خاصة في مزرعة‎ WIA ‏منه. يمكن أن توجد‎ functional equivalent
‎whole ‏أو كامل النبات‎ [5 » plant part ‏؛ جزء نبات‎ tissue ‏؛ نسيج‎ cell culture ‏خلية‎ vo ‏أو ثنائية الفلقة‎ monocot ‏بالتالي؛ يتم تضمين نباتات (على سبيل المثال؛ أحادية الفلقة‎ .4 ‏يتضمن خلية تتضمن معزز أدنى 811ل أو مكافئ وظيفي منه في بعض التجسيمات.‎ (dicot ‏لبداية الانتساخ بطريقة مستقلة الاتجاه.‎ means ‏تشتمل بعض تجسيمات الاختراع على وسائل‎ .١ ‏تشتمل وسائل لبداية الانتساخ بطريقة مستقلة الاتجاه على أدنى معزز 011لا بهوية تتابع رقم:‎
‎٠‏ تشتمل بعض تجسيمات من الاختراع على وسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام. تشتمل وسائل بداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على معزز 511لا ثنائي الاتجاه التخليقي لهوية تتابع رقم: #. سوف تتضح الخواص المذكورة وخواص أخرى بشكل أكثر من الوصف المفصل التالي للتجسيمات المتعددة؛ التي تتعامل مع مراجع الأشكال الملحقة.
‏ملا
“A ‏و/ أو‎ 01301 cells ‏يتم أيضاً تقديم تركيبات وطرق للتعبير الجيني عن جينات متعددة خلايا نبات‎ ‏تشتمل التركيبات المقدمة على معزز ثنائي الاتجاه على الأقل‎ .018071 tissues ‏النبات‎ dal ‏متصل بمجموعات تعبير جيني للجين متعددة. في بعض التجسيمات؛ تستخدم التركيبات والطرق‎ minimal core promoter ‏المقدمة معزز ثنائي الاتجاه يعتمد على عنصر معزز أساسي أدنى‎ ‏أو مكافئ وظيفي منه. في بعض التجسيمات؛‎ Zea mays Ubiquitin—1 ‏من جين‎ 81600801 ه٠‎ ‏تسمح التركيبات وطرق المقدمة بالتعبير الجيني عن جينات بين ثلاثة وعشرون.‎ ‏معزز أساسي أدنى من جين‎ pale ‏في أحد السمات؛ يتم تقديم عديد النيوكليوتيد تخليقي يتضمن‎ ‏في أحد التجسيمات؛ يشتمل العنصر‎ Zea luxurians ‏أو‎ Zea mays ‏من‎ Ubiquitin—1 9670 9665 ‏المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل‎ ‏أو تكملتها. في‎ ١ ‏مطابقة لهوية تتابع رقم:‎ 96٠00 ‏أو‎ F090 966 PAS 68.2 967/5 ٠ ‏تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد‎ ‏في تجسيم إضافي؛‎ .39-١5و‎ ١ ‏منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام:‎ ‏أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛‎ ١ ‏يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على هوية تتابع رقم:‎ ‏أو تكملتها. في‎ ١ ‏يتكون العنصر المعزز الأساسي الأدنى بشكل أساسي من هوية تتابع رقم:‎
Ubiquitin—1 ‏تجسيم آخر؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي مقدم أيضاً على إكسون من جين‎ ١ ‏وإنترون من جين 0190100-1لا. في تجسيم إضافي؛ يكون الإكسون أو الإنترون من جين‎
Zea luxurians J Zea mays ‏من‎ Ubiquitin—1 ‏يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع تنظيمي ضد اتجاه الجين‎ AT ‏في تجسيم‎ ‏حيث يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على تتابع عديد‎ AT ‏تجسيم‎ 3.Ubiquitin-1 gene ‏دلافىك يفك ددم 966 %90 أو‎ (KY. ‏النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل د3فى‎ ٠ ‏مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ حيث يشتمل تتابع تنظيمي‎ 0) ‏ضد الاتجاه على هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ حيث يتكون التتابع التنظيمي‎ ‏ضد الاتجاه بشكل أساسي من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها.‎ ‏على عنصر واحد على الأقل منتقى من‎ Load ‏في تجسيم آخر؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي‎ «(URS) upstream regulatory sequence ‏قائمة تتضمن تتابع تتظيمي ضد الاتجاه‎ Yo ‏م‎
عنصر محسّن ‎enhancer element‏ ؛ إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية استنساخ» صندوق ‎TATA‏ ‏وعنصر اتفاق صدمة الحرارة ‎heat shock‏ في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بعنصر معزز أساسي أدنى. في تجسيم ‎AT‏ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أضاً على عنصر منتقى من المجموعة التي تشتمل ‎٠‏ .على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه (88ا)؛ عنصر محسّن؛ إكسون؛ إنترون» موقع بداية استتساخ؛ صندوق ‎(TATA‏ عنصر اتفاق صدمة ‎dal‏ وتوليفات منها. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالعنصر المعزز الأساسي الأدنى. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على عنصر معزز أساسي أدنى ثاني من ‎Zea‏ ‎mays).‏ أو ‎Zea luxurians‏ حيث يكون عنصري معزز أساسي أدنى في اتجاه تكامل عكسي ‎reverse complimentary orientation‏ بالنسبة لإحداهم الأخر في عديد النيوكليوتيد. في تجسيم ‎AT‏ أو بديل؛ يشتم عديد النيوكليوتيد التخليقي أيضاً على إكسون من جين ‎Ubiquitin—1‏ ‏وانترون من جين ‎A.
Ubiquitin=1‏ تجسيم إضافي؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على تتابع عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل ‎YoYo (KV.
Yo‏ .مك ‎Yoho‏ حمق ‎P30‏ ‎١‏ أو 916900 مطابقة لهوية تتابع رقم: 9 أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ على هوية تتابع رقم: أو تكملتها. في تجسيم إضافي؛ يتكون عديد النيوكليوتيد التخليقي بشكل أساسي من هوية تتابع رقم © أو تكملتها. في تجسيم ‎AT‏ أو بديل؛ يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎Load‏ على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين 0190100-1لا. في تجسيم آخرء حيث يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على تتابع ‎٠‏ عديد النيوكليوتيد حيث تكون على الأقل ‎YAS FAs Vo (KY. (Plo‏ .61ت ‎P30‏ ‏أو ‎60٠‏ مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه على هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم ‎AT‏ يتكون تتابع تنظيمي ضد الاتجاه ‎Jay‏ أساسي من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي الذي يتضمن عنصري معزز أساسي أدنى ‎Lad Yo‏ على عنصر واحد على الأقل منتقى من القائمة التي تتضمن تتابع تنظيم ضد الاتجاه ملا yam ‏عنصر توافق صدمة حرارة» و‎ (TATA ‏إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية انتساخ؛ صندوق‎ (URS) ve ‏أو بديل؛ يشتمل‎ AT ‏ترجمي. في تجسيم‎ STOP ‏و/ أو‎ START ‏نيوكليوتيد‎ als ‏النيوكليوتيد التخليقي الذي يتضمن عنصري معزز أساسي أدنى أيضاً على عنصر منتقى من‎ ‏إكسون؛ إنترون؛ موقع بداية‎ (URS) ‏المجموعة التي تشتمل على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه‎ « heat shock consensus element ‏عنصر توافق صدمة حرارة‎ TATA ‏انتساخ؛ صندوق‎ © ‏يشتمل عديد‎ AT ‏ترجميء وتوليفات منها. في تجسيم‎ STOP ‏و/ أو‎ START ‏نيوكليوتيد‎ als ‏يتكون عديد النيوكليوتيد‎ OAT ‏النيوكليوتيد التخليقي على هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم‎ ‏التخليقي بشكل أساسي من هوية تتابع رقم: © أو تكملتها.‎ ‏في تجسيم آخرء يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على عنصري معزز أساسي أدنى تتضمن تتابع‎ ‏أول محل الاهتمام متصل عملياً بأحد عناصر معزز أساسي أدنى. في تجسيم آخرء‎ aisles ٠ ‏يشتمل عديد النيوكليوتيد التخليقي على تتابع نيوكليوتيد ثاني محل الاهتمام متصل عملياً بعنصر‎ ‏معزز أساسي أدنى الذي لا يكون متصلاً عملياً بتتابع النيوكليوتيد الأول محل الاهتمام.‎ ‏من‎ UbiqUItin=1 ‏في أحد تجسيمات عديد النيوكليوتيد التخليقي المقدم؛ يكون الإكسون من جين‎ ‏في أحد تجسيمات عديد النيوكليوتيد التخليقي المقدم؛ يكون الإكسون من جين‎ .288 spp ‏تجسيم آخرء يكون الإنترون من جين‎ 4. Zea luxurians ‏أو‎ Zea mays _Ubiquitin-1 Yo ‏من‎ Ubiquitin—1 ‏يكون الإنترون من جين‎ « AT ‏في تجسيم‎ Zea spp Ubiquitin—1
Zea mays ‏هو‎ Zea ‏يكون نوع‎ «ay ‏في تجسيم آخر أو‎ .2698 luxurians ‏أو‎ Zea mays
Zea luxurians ‏هو‎ Zea ‏يكون نوع‎ ¢ AT ‏في تجسيم‎ ‏تشتمل الطريقة على‎ transgene cell ‏يتم تقديم طريقة لإنتاج خلية جين تحوير‎ og Al ‏في سمة‎ ‏باستخدام عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه‎ transforming cell ‏تحويل الخلية‎ ٠ ‏يتم تقديم خلية‎ oA) ‏الوثيقة. في أحد التجسيمات؛ تكون الخلية عبارة عن خلية نبات. في سمة‎ ‏نبات يتضمن عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم‎ ‏نبات يتضمن خلية نبات تشتمل على عديد النيوكليوتيد التخليقي الموصوف في هذه الوثيقة.‎ ‏م‎
-١١- ‏في سمة أخرىء يتم تقديم طريقة للتعبير الجيني عن تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام في خلية نبات.‎ ‏تشتمل الطريقة على إدخال في خلية النبات تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي‎ ‏يتم تقديم طريقة للتعبير عن تتابع‎ opal ‏بوسائل لبداية استنساخ بطريقة مستقلة الاتجاه. في سمة‎ ‏نيوكليوتيد محل الاهتمام في خلية نبات. تشتمل الطريقة على إدخال خلية النبات بتتابع النيوكليوتيد‎ ‏محل الاهتمام المتصلة بشكل عملي بوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي‎ © ‏تشتمل الطريقة المقدمة على إدخال في خلية النبات حمض نووي‎ AT ‏محل الاهتمام. في تجسيم‎ ‏يتضمن (أ) تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي‎ ‏نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام؛ و(ب) تتابع نيوكليوتيد ثانية محل الاهتمام متصلة‎ ‏بشكل عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام.‎ ‏أو بديل؛ تشتمل الوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي‎ AT ‏في تجسيم‎ ‏أو بديل؛ تشتمل وسائل بداية‎ AT ‏محل الاهتمام على هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم‎ ‏استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على هوية تتابع رقم ©. في تجسيم‎ ‏آخرء؛ تشتمل الوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام على‎ ‏التكامل لهوية تتابع رقم: ©. في تجسيم آخرء يتم إدخال الحمض النووي في خلية النبات حتى‎ ‏بخلية النبات تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل‎ DNA ‏تستهدف موقع سابق التحديد في‎ 10 ‏عملي بالوسائل لبداية استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام. في تجسيم‎ ‏إضافي أو بديل؛ تستهدف تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بالوسائل لبداية‎ ‏استنساخ تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام الموقع سابق التحديد باستخدام ناتج‎
Zinc finger ‏ناتج عن نيوكلياز إصبع زنك‎ mediated recombination ‏اتحاد‎ sale) .nuclease ٠ ‏في أحد السمات؛ يتم تقديم تركيب حمض نووي للتعبير الجيني عن جينات متعددة خلايا و/ أو‎ ‏أنسجة نبات. يشتمل تركيب الحمض النووي على (أ) معزز ثنائي الاتجاه؛ و(ب) مجموعتين تعبير‎ ‏جيني للجين على النهايات المتقابلة للمعزز ثنائي الاتجاه؛ حيث تشتمل واحدة على الأقل من‎ ‏مجموعات التعبير الجيني للجين على اثنين أو أكثر من الجينات متصلة عن طريق محول ترجمة‎ translation switch ٠٠ tive yy ‏على تتابع‎ nucleic acid construct ‏في أحد التجسيمات؛ لا يشتمل تركيب الحمض النووي‎ viral sequence ‏فيروسي. في تجسيم آخرء لا يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع فيروسي‎ ‏في تجسيم آخر لا يشتمل تركيب الحمض النووي على تتابع فيروسي. في تجسيم آخرء لا يشتمل‎ ‏المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع فيروسي. في تجسيم آخرء يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على‎ ‏يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على معزز. في تجسيم‎ VAT ‏معزز واحد على الأقل. في تجسيم‎ © ‏للتحول الناتج عن الأجرعية‎ 51081/ vector ‏ثنائي‎ Jib ‏يشتمل تركيب الحمض النووي على‎ «AT .Agrobacterium-mediated transformation ‏في أحد التجسيمات؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عنصر منتقى من المجموعة التي تشتمل‎ ‏إكسون؛ إنترون؛ موقع‎ (ana ‏عنصر‎ (URS) ‏تنظيمي ضد الاتجاه‎ lis ‏أو‎ Cis ‏على عنصر‎ ‏عنصر اتفاق صدمة الحرارة؛ وتوليفات منها. في تجسيم آخر أو‎ TATA ‏بداية استنساخ» صندوق‎ Ve
Ubiquitin ‏من جين‎ (URS) ‏بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع تنظيمي ضد الاتجاه‎
Ubiquitin ‏معزز يختلف عن معزز جين‎ (i) ‏في تجسيم آخرء يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على‎
Ubiquitin ‏من جين‎ (URS) ‏تتابع تنظيمي ضد الاتجاه‎ (ii) ‏و‎ ‏يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عنصر معزز أساسي أدنى من جين‎ OAT ‏في تجسيم‎ ‏يشتمل المعزز ثنائي‎ « AT ‏في تجسيم‎ .Zea luxurians ‏أو‎ Zea mays ‏من‎ Ubiquitin-1 Yo ‏عنصري‎ Cus Zea luxurians ‏أو‎ Zea mays ‏الاتجاه أيضاً على معزز أساسي أدنى من‎ ‏معزز أساسي أدنى في اتجاه تكميلي عكسي بالنسبة لبعضها البعض. في تجسيم إضافي أو بديل؛‎ 9670 9675 ‏يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد على الأقل‎ ‏أو تكملتها. في‎ ١ ‏مطابقة لهوية تتابع رقم:‎ 96٠00 ‏أو‎ 695 966 HAS 96/00 (VO ‏يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد‎ chy ‏تجسيم إضافي أو‎ Yo ‏في تجسيم إضافي؛‎ .39-١5و‎ ١ ‏منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام:‎ ‏يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي‎ ‏في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز‎ .7؛-١5و‎ ١ ‏على هويات تتابع أرقام:‎ das ‏الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع‎ ye ‏في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع‎ .؟9-١5و‎ ١ ‏أرقام:‎ Yo tive
س١‏ النيوكليوتيد منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: ‎١‏ و١١-؟7.‏ في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد منتقى من المجموعة التي تشتمل على هويات تتابع أرقام: ‎١‏ و١١-9١.‏ في تجسيم إضافي؛ يشتمل العنصر المعزز الأساسي الأدنى على تتابع عديد النيوكليوتيد بهوية تتابع رقم: ‎.١‏ ‏© في تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على إكسون من جين ‎Ubiquitin=1‏ و/ أو إنترون من جين ‎Ubiquitin‏ في تجسيم ‎AT‏ في تجسيم ‎AT‏ يشتمل معزز ثنائي الاتجاه على عديد نيوكليوتيد على الأقل 96975 ‎KoA‏ 96/85 960 9645 أو ‎96٠00‏ مطابقة لهوية تتابع رقم ؟ أو تكملتها. في تجسيم ‎AT‏ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على عديد نيوكليوتيد بهوية تتابع رقم © أو تكملتها. في يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على إنترون من جين كحول نازع ‎Ys‏ للهيدروجين. في أحد التجسيمات؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل ‎Why‏ بشكل مستقر إلى نباتات معدلة وراثياً. في أحد التجسيمات؛ تكون النباتات عبارة عن نباتات أحادية الفلقات ‎-monocotyledons plants‏ في تجسيم ‎AT‏ تكون النباتات عبارة عن نباتات ثنائية الفلقة ‎dicotyledons plants‏ .3 تجسيم آخرء لا تكون النباتات عبارة عن نباتات أحادية الفلقة. في تجسيم آخرء لا تكون النباتات عبارة عن نباتات ثنائية الفلقة. ‎Vo‏ في تجسيم ‎AT‏ أو بديل؛ يشتمل المعزز ثنائي الاتجاه على تتابع تنظيم ضد الاتجاه من جين 0 . في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين ‎Ubiquitin‏ على عديد نيوكليوتيد من تتابع على الأقل 9675 9680 96/5 9690 9695 أو ‎96٠0٠0‏ مطابقة لهوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم آخرء يشتمل تتابع تنظيمي ضد الاتجاه من جين ‎Ubiquitin‏ ‏على عديد نيوكليوتيد من هوية تتابع رقم: ؛ أو تكملتها. في تجسيم ‎«AT‏ المعزز ثنائي الاتجاه ‎Ye‏ تشتمل على عديد نيوكليوتيد من على الأقل 9675 .9684 ‎YAS‏ 960 9615 أو ‎96٠٠١‏ ‏مطابقة لهوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في تجسيم ‎OAT‏ المعزز ثنائي الاتجاه تشتمل على ‎ye‏ ‏نيوكليوتيد من هوية تتابع رقم: © أو تكملتها. في أحد التجسيمات؛ تشتمل كلا مجموعتي التعبير الجيني للجين على اثنين أو أكثر من الجينات متصلة عن ‎Gob‏ محول ترجمة. في تجسيم إضافي أو بديل؛ يتم اختيار محول الترجمة من ‎Yo‏ المجموعة التي تشتمل على موقع دخول ريبوزوم داخلي ‎internal ribosome entry site‏ ‎tive‏
-؟١-‏ (5ع4١)؛‏ موقع تضفير بديل ‎alternative splicing site‏ ؛ موقع شطر ريبوزوم ‎ribozyme‏ ‎cleavage site‏ ؛ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز ببتيد ‎2A peptide‏ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز ‎ay polynucleotide sequence coding‏ مشابه ‎like peptide‏ ل ‎2A‏ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز إنتين 101610 ؛ تتابع عديد النيوكليوتيد ترمز موقع شطر بروتياز ‎protease‏ ‎cleavage site ©‏ ؛ وتوليفات منها. في تجسيم إضافي أو بديل؛ يشتمل محول الترجمة على عنصر هيدرولياز بتأثير سيس ‎cis-acting hydrolase element‏ (اع01175). في تجسيم إضافي؛ يكون ‎CHYSEL‏ عبارة عن تتابع ببتيد ‎2A‏ أو مشابه ل 28. في تجسيم آخرء لا يشتمل على جين ضد الاتجاه ‎gene upstream‏ بمحول الترجمة على كودون توقف ترجمة ‎translation stop codon‏ في تجسيم آخرء ‎Ray‏ تركيب الحمض النووي من أو يسمح ‎٠‏ بالتعبير الجيني على الأقل أربع جينات. في تجسيم إضافي؛ تكون كل الجينات الأربعة محورة وراثياً. في تجسيم ‎AT‏ يمكّن تركيب الحمض النووي من التعبير الجيني عن جينات بين ثلاثة وعشرون. في تجسيم آخرء يمكّن تركيب الحمض النووي من التعبير الجيني عن جينات بين أربعة وثمانية. في تجسيم إضافي أو بديل؛ تكون الجينات محورة وراثياً. في تجسيم آخرء على الأقل تشتمل أحد مجموعات التعبير الجيني ‎gene expression cassette‏ للجين على تتابع عديد ‎Vo‏ النيوكليوتيد يقوم بترميز بروتين دمج ‎fusion protein‏ في ‎aad‏ إضافي؛ يشتمل البروتين المندمج على ثلاث إلى خمس جينات. في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني عن جينات من المعزز ثنائي الاتجاه أعلى أربع أضعاف على الأقل مقارنة بمعزز موحد الاتجاه. في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني عن جينات من المعزز ثنائي الاتجاه من ثلاثة إلى عشرة أضعاف أعلى مقارنةً بمعزز موحد الاتجاه. ‎Ye‏ في بعض التجسيمات؛ يكون التعبير الجيني لجينات من المعزز ثنائي الاتجاه من أربعة إلى ثمانية أضعاف أعلى مقارنة بمعزز موحد الاتجاه. في بعض التجسيمات؛ يتم وضع جين واصم ‎Marker‏ ‏6 للاختيار عند نهاية بعيدة من المعزز (أي؛ عند نهاية '3 بجين مجموعة تعبير جيني ‎gene expression cassette‏ فى اتجاه ‎downstream‏ جين ‎(AT‏ ‏في أحد السمات؛ يتم تقديم طريقة لتوليد نبات معدّل وراثياً يتضمن التعديل الوراثي لخلية نبات ‎Yo‏ باستخدام تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم طريقة لتوليد خلية ملا yo ‏معدلة وراثياً يتضمن التعديل الوراثي للخلية باستخدام تركيب الحمض النووي المقدم في هذه الوثيقة.‎ ‏يتم تقديم خلية نبات يتضمن تركيب الحمض النووي المقدم في هذه الوثيقة. في‎ (Al ‏في سمة‎ ‏تجسيم إضافي أو بديل؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل وراثياً بشكل مستقر إلى خلية النبات.‎ ‏في سمة أخرى» يتم تقديم نبات معدّل وراثياً يتضمن تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة.‎ ‏في تجسيم إضافي أو بديل؛ يكون تركيب الحمض النووي محوّل وراثياً بشكل مستقر إلى خلايا من‎ 5 ‏يتم في هذه الوثيقة تقديم طريقة للتعبير الجيني عن جينات‎ (al ‏النبات المعدل وراثياً. في سمة‎ ‏متعددة خلايا و/ أو أنسجة نبات؛ يتضمن إدخال في خلايا و/ أو أنسجة النبات تركيب الحمض‎ ‏النووي مقدم في هذه الوثيقة. في تجسيم إضافي أو بديل؛ تكون خلايا و/ أو أنسجة النبات محولة‎ ‏وراثياً بشكل مستقر باستخدام تركيب الحمض النووي مقدم في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم‎ ‏تقديم ناقل ثنائي للتحول الوراثي الناتج عن الأجرعية. في أحد التجسيمات؛ يشتمل الناقل الثنائي‎ Ve ‏يشتمل الناقل الثنائي على‎ OAT ‏في هذه الوثيقة. في تجسيم‎ ade ‏على تركيب الحمض النووي‎ ‏عديد النيوكليوتيد التخليقي المتوفر في هذه الوثيقة. في سمة أخرى؛ يتم تقديم استخدام المعزز‎ ‏ثنائي الاتجاه المقدم في هذه الوثيقة للتعبير الجيني متعدد التمحور في النباتات.‎ ‏شرح مختصر للرسومات‎ ‏الوصف المختصر للرسومات والتتابعات‎ ١ ‏حيث يشتمل على‎ ((ZmUbil) ‏يوضح معزز نموذجي (ليس بمقياس الرسم) لذرة 511لا‎ ١ ‏الشكل‎ ‏تقريباً 9060 زوج قاعدة عنصر ضد الاتجاه عند الموضع ”5 من موقع بداية الاستتساخ‎
TATA ‏يحتوي العنصر ضد الاتجاه على صندوق‎ .)155( transcription start site ‏وعنصري اتفاق صدمة حرارة متداخلين (موضوعة‎ (TSS ‏زوج قاعدة من‎ Tom ‏(موضوع تقريباً‎ ‏زوج قاعدة‎ ٠١١١ ‏يشتمل ذلك المعزز أيضاً على حوالي‎ (TSS ‏زوج قاعدة من‎ Yoon ‏تقريباً‎ Yo adjacent leader ‏عند '3 من منطقة 155. تحتوي منطقة 37 هذه على تتابع موجه مجاور‎ ‏تمثل عناصر متوافقة للصدمة‎ )١( ؛١ ‏وانترون. فى شكل‎ «(ZmUbil ‏(إكسون‎ sequence ‏تمتل عنصر ضد الاتجاه؛ )0( تمثل‎ (£) «TSS Jia (7) (TATA ‏مربع‎ Jia )7( ‏الحرارية؛‎ ‏إكسون 511لا200؛ 5 )1( تمثل إنترون.‎ ‏دما‎
-؟١-‏ ‎١ JRE‏ يوضح تجسيم نموذجي لمعزز 011لا التخليقي ثنائي الاتجاه ‎adie‏ حيث يتضمن عنصر ‎df‏ لب 00100050110 مستنسخ ضد الاتجاه (في اتجاه التكامل العكسي | ‎reverse‏ ‎(complementary orientation‏ من معزز ‎.ZmUbil‏ فى شكل ‎ov‏ 0 تمثل عناصر ‎.minUbiP1‏ ‏© الشكل ؟ يوضح رسم تخطيطي نموذجي ل ‎GUS‏ ثنائي الاتجاه و مجموعات التعبير الجيني 10لا
تحتوي على 10لا و مجموعات التعبير الجيني عن جين ‎(GUS‏ حيث يتصل كل منها بشكل عملي بمعزز 511لا تخليقي ثنائي الاتجاه. فى شكل ‎)١( oF‏ تمثل ‎(Y) ¢ZmPer5 3' UTR‏ تمثل ‎(V) «GUS‏ تمثل تتابعات موجهة فى نفس الاتجاه؛ )£( تمثل ‎¢yfp‏ و(١)‏ تمثل '3 ‎ZmLip‏ ‎UTR‏
() PDABI05801 ‏نموذجية من‎ plasmid map ‏بلازميد‎ iad ‏الشكل ؛ يوضح‎ ٠ ‏(د)‎ ¢ZmUbil ‏(ج) تمثل المعزز‎ ¢ZmUbil ‏(ب) تمثل إكسون‎ of ‏فى شكل‎ (bpYYIVY) (GUS ‏تمثل إنترون 011ل207؛ (ه) تمثل توقف إطار-؟؛ (و) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (ز) تمتل‎ ‏تمثل‎ (J) ¢kanR ‏(ى) تمثل 00014؛ (ك) تمثل‎ ¢attl] ‏(ط) تمثل‎ ¢ZmPer5 3' UTR ‏(ح)‎ ‏(ع) تمثل 710؛‎ ¢ZmLip 3' UTR ‏(ص) تمثل‎ tattRS ‏(ن) تمثل‎ ¢gentR ‏(م) تمثل‎ ¢«ChIR
‎Vo‏ (ف) تمثل تتابع توافق للذرة؛ (س) تمثل توقف إطار-؟؛ (ق) تمثل إنترون 011ل2010؛ (ر) تمثل إكسون 511لا200؛ و (ش) تمثل عنصر ‎Min-UbiPl‏ ‏الشكل © يوضح خريطة بلازميد نموذجية من ‎pDABLOBTO6‏ (أ) (47 + ‎Va‏ 0ط). فى شكل © ‎Jia (Y) «GUS Jia )١(‏ تتابع توافق للذرة؛ ‎Jia (YF)‏ توقف إطار-؟؛ )8( تمثل إنترون 1 )؛ )©( ‎Jia‏ معزز ‎¢ZmUbil‏ )1( تمثل إكسون ‎Jd )7( ¢ZmUbil‏ عنصر
‎٠‏ | 0101لا 10/ا؛ ‎(A)‏ تمثل ‎sus)‏ 011ل2000؛ )3( ‎Jia‏ إنترون 511ل20؛ ‎)٠١(‏ تمثل توقف إطار-؟؛ ‎(VY)‏ تتابع توافق للذرة؛ ‎(VY)‏ تمثل ‎(VF) ¢yfp‏ تمثل ‎«ZmLip 3' UTR‏ (؟٠)‏ تمثل ‎)٠١( «T-DNA Border B‏ تمثل استياق مفرط؛ ‎)١١(‏ تمثل تضارب ‎(VV) FY‏ تمثل ‎¢SPNR‏ ‎(VA)‏ تمثل ‎(V4) «trfA‏ تمثل 011؛ ‎(YY) T-DNA Border As Ji (YY)5¢(YV) )٠١(‏ تمثل منطقة تماثل )¢ ‎(Y¢)‏ تمثل ‎Jia (Yo) «ZmLip 3' UTR‏ 880-1؛ ‎(Y1)‏ تمثل تتابع
‎Yo‏ توافق للذرة؛ ‎Jia (YY)‏ توقف إطار-؟؛ ‎Jia (YA)‏ إنترون ‎(YA) ¢ZmUbi‏ تمثل معزز
‎gaye yy
ELP1 ‏تمثل‎ (YY) ¢) ‏تمثل منطقة تماثل‎ (VY) ¢ZmUbil ‏تمثل إكسون‎ (V+) ¢ZmUbil .ZmPer5 3' UTR ‏تمثل‎ (Y¢) 5 ¢ELP1 HRI ‏تمل‎ (YY) ¢HR2 ‏فى شكل‎ (bp YY AY) ‏(ب)‎ PDABIO1S56 ‏الشكل 1 يوضح خريطة بلازميد نموذجية من‎ coriV Jia 0 ‏011؛‎ Rep ‏تمتل‎ ( coriT ‏مضل خطت؛ )7( تمثل‎ 0 sspecR ‏تمثل‎ (0 ) a
Jig (V+) «ZmLip 3' UTR ‏تمثل‎ (1) «T-DNA Border As ‏تمثل‎ (A) «(Y) «(1) © ‏تمثل إنترون‎ (VY) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ (VY) ‏تمثل تتابع توافق للذرة؛‎ (VY) sadd-l 2010615 ‏تمثل‎ (V1) ‏تمثل إكسون 01[1ل200؛‎ (V0) ‏:+؛ )£ )( تمثل معزز 511ل200؛‎ 1 (Yo) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ (V4) ‏تمثل تتابع توافق للذرة؛‎ (VA) ‏تمثل 0آل7ا؛‎ (VY) ‏'3؛‎ UTR (YY) ‏تمثل إكسون 011لا20؛‎ (YY) ‏تمثل معزز 011لا200؛‎ (YY) ‏تمثل إنترون 511ل200؛‎ ‏و(؛ 7) تمثل استياق مفرط.‎ «T-DNA Border 8 ‏تمثل‎ ٠ ‏زوج قاعدة من منطقة معزز أساسي‎ VV ‏حيث تشتمل على‎ ٠ ‏الشكل "أ يوضح هوية تتابع رقم:‎ ‏حيث تشتمل على‎ oF ‏(50110لا010). الشكل اب يوضح هوية تتابع رقم:‎ Zea mays ‏أدنى‎ ‎.2. mays Ubil ‏إنترون‎ ‎reverse ‏حيث يشتمل على التكامل العكسي‎ oF ‏يوضح هوية تتابع رقم:‎ A ‏الشكل‎ ‎Z. mays minUbilP ‏لعديد النيوكليوتيد الذي يتضمن معزز أساسي أدنى‎ complement Yo ¢(bold font ‏خط سميك‎ ¢ZmUDbIl ‏(إكسون‎ 2. mays Ubi] ‏قائد‎ ¢(underlined ‏(تحته خط‎ ‏حيث يشتمل‎ of ‏(حالة سفلية). الشكل 4ب يوضح هوية تتابع رقم:‎ 2. mays ‏و إنترون 011لا‎ ‏حيث يمكن أن يكون العنصر (و/ أو‎ 2. mays Ubil ‏على قطعة من عنصر ضد الاتجاه‎ ‏تكامله العكسي) موضعاً في معزز 511لا تخليقي مع عنصر 0010105116 مجاور لنهايته '5 أو‎ 3 ٠ ‏الشكل 95 يوضح هوية تتابع رقم: 5؛ الذي يشتمل على معزز 011ل تخليقي ثنائي الاتجاه‎ ‏نموذجي؛ حيث يكون التكامل العكسي ل 0010100110 أولء و 001000116 ثاني؛ تحته خط.‎ ‏يوضح هوية تتابع رقم: 6؛ الذي يشتمل على حمض نووي نموذجي يتضمن مجموعات‎ ٠١ ‏الشكل‎ ‏المشتقة بواسطة معزز 011لا ثنائي الاتجاه تخليقي.‎ GUS ‏جينية للتعبير الجيني عن 10لا و‎ ‏د‎
-م١-‏ هوية ‎١7 od) oi‏ يشتمل على ‎YFP Zab‏ تقدمية ‎GATGCCTCAG‏ -3 : ‎A cd) ol Le TGGGAAAGG-3‏ يشتمل على بادئة ‎YFP‏ عكسية: -5 ‎.CCATAGGTGA GAGTGGTGAC AA-3'‏ هوية تتابع رقم: 9 يشتمل على بادئة إنقيرتاز تقدمية ‎TGGCGGACGA CGACTTGT-3' :Invertase Forward Primer‏ -'5. هوية تتابع رقم: ‎٠١‏ يشتمل على بادئة إنقيرتاز عكسية ‎Invertase Reverse Primer‏ : ='5 ‎GGCTGCCGT-3‏ 11166 خلط. ‎dye‏ تتابع رقم: ‎١١‏ يشتمل على مسبار إنقيرتاز ‎CGAGCAGACC GCCGTGTACT TCTACC-3' : Invertase Probe‏ -ا5. هوية تتابع )8 ‎١١‏ يشتمل على بادثة ‎AAD] Primer‏ تقدمية: ‎TGTTCGGTTC‏ -5 ‎LCCTCTACCAA-3'‏ هوية_تتابع رقم: ‎dak ١١‏ على بادئة 1(امطعكسية: -5 ‎٠‏ 3ححق ‎(CAACATCCAT CACCTTGACT‏ هوية تتابع رقم: ‎VE‏ يشتمل على مسبار ‎CACAGAACCG TCGCTTCAGC AACA-3' :AAD1 Probe‏ -5 (انظر أيضاً الجدول 7). الشكل ‎١١‏ يوضح تحليل ‎Western dai;‏ نموذجي يؤكد تعبير جيني عن 7 و ‎GUS‏ مستقر المشتق بواسطة تركيب معزز ‎Promoter construct‏ 01010001لا ‎Z. mays‏ ثنائي الاتجاه ‎(pDAB108706) ١٠‏ في نباتات ‎TO‏ ذرة. أظهرت النباتات التمثيلية تعبير جيني ل ‎YFP‏ مستقر في الورق ‎leaf‏ المشتق بواسطة عنصر معزز أساسي أدنى 5101لا-1/10. تمت الإشارة إلى كمية البروتين ‎protein‏ التي تم إنتاجها كأجزاء بالمليون ‎(PPM)‏ ‏الشكل ‎١١‏ يوضح تحليل ‎Western blot analysis dai‏ نموذجي يوضح تعبير جيني عن ‎YFP‏ و ‎GUS‏ مستقر من التركيب ‎construct‏ المقارن الذي يحتوي على معزز ‎ZmUbil‏ الذي ‎٠‏ - يحرّك فقط التعبير الجيني ل ‎¢(PDABIOLSS56) YFP‏ لا تكون تتابع ترميز ‎GUS‏ متضمنة في التركيب هذا. يتم الإشارة إلى كمية البروتين التي تم إنتاجها كأجزاء بالمليون ‎(PPM)‏ ‏الشكل ‎DY‏ يوضح تركيبات نموذجية لتراصات ‎stacks‏ مجموعة_ من أربع جينات 83 () [توضح مجموعتين من ‎(Phiyfp J) AAD1-2A-YFP‏ زائد -00/34 ‎[2A-cry35‏ و 00008105846 (ب) [توضح مجموعتين من ‎2A——(Phiyfp 5) YFP‏ ‎Yo‏ 01ل زائد 007/34-2-0/35]._تشير الأسهم المظللة ‎Shaded arrows‏ إلى اتجاه
-١4- ‏زوج قاعدة ضد الاتجاه تتابع‎ Yoo ‏على‎ Ubil-minP ‏الاتجاه. تشتمل‎ SW ‏الانتساخ من المعزز‎ ‏على منطقة منظمة لضد الاتجاه‎ Ubil-URS ‏من موقع بداية الانتساخ لمعزز 011لا. تشتمل‎ ‏زوج قاعدة من‎ ٠٠١ ‏معزز ذرة 511لا تتكون من ضد الاتجاه تتابع موقع بداية انتساخ باستثناء‎ ‏على إنترون من معزز ذرة‎ Ubil-Int Jai (arrow sew ‏أدنى معزز (موضحة في صورة‎ ‏الشكل ١١ب يوضح تركيبات ثنائية نموذجية إضافية لتراص مجموعة من أربع جينات من‎ WUBI © (Y) ‏'3-نا؛‎ UTR ‏تمثل‎ )١( VY ‏(ج) و 008108718 (د). فى شكل‎ 7
OS) Jia (0) ‏تمثل 73 01ل (لا توقف)؛ )2( تمثل إنترون 011لا؛‎ )( «YFP ‏تمثل‎ ‎(2) ‏(لا توقف)؛‎ Cry34 ‏تمثل‎ (A) ‏تمثل 45الا-011ل؛‎ (VY) ¢Ubil-minP ‏1)؛ )1( تمثل‎ (VV) ‏نلفلظ؛‎ 1 v3 Jia (VY) ¢Per5 3' UTR ‏تمثل‎ (VV) «Cry35 ‏تمثل‎ (V+) 2A ‏تمثل‎ ‏(لا توقف).‎ YFP ‏تمثل‎ Vs ‏مقدمة هنا‎ multi-gene ‏يوضح عروض تخطيطية نموذجية لتركيبات متعددة الجينات‎ VE ‏الشكل‎ ‏تمثل إنترون» (7) تمثل‎ )١( ‏حيث‎ cola) ‏(أ) تمثل معزز 511لا اصطناعي ثنائي‎ »٠4 ‏فى شكل‎ ‏تمثل عنصر ضد الاتجاه؛ (4؛ وكل هذه الرموز) تمثل محولات‎ )١(و‎ (MinUDIIP ‏عنصر‎ ‏ترجمة؛ (ب) تمثل جين ١؛ (ج) تمثل جين ؟؛ (د) تمثل جين ؟؛ (ه) تمثل جين ؟؛ (و) تمثل‎ .6 ‏جين ©؛ و(ز) تمثل جين‎ 5
VAATY (1) pDAB105818 plasmids ‏تمثيلية لبلازميدات‎ maps ‏يوضح خرائط‎ Vo ‏الشكل‎ ‏تمثل‎ (Y) ¢SpnR ‏تمثل‎ (V) «Vo ‏فى شكل‎ (bp YYAT.) ‏و 00008105748 (ب)‎ (bp
ZmLip 3' ‏تمتل‎ (V) «T-DNA Border As ‏(د) )1( تمثل‎ )4( ¢oriT ‏تمت‎ (¥) <trfA ‏منطقة معزز‎ Jia (Vr) v2 ZmUDbI] ‏تمثل معزز‎ (1) ¢AAD-1 v3 ‏تمثل‎ (A) UTR ‏1ب‎ ‎¢«Cry35 ‏1ط‎ v6 ‏تمثل‎ (VY) ¢StPinll 3" UTR v2 ‏تمثل‎ (VV) v2 ZmUbil ‏ضد الاتجاه‎ ٠ ‏تمثل‎ (Vo) «ZmUbiIl ‏تمثل معزز ضد الاتجاه‎ (VE) v2 ZmUbil ‏تمثل معزز‎ (VY) (YA) v2 2000011 ‏تمثل معزز‎ (VV) ¢Cry34Abl v2 ‏تمثل‎ (V7) ¢StPinll 3" UTR v2 ‏تمثل‎ (Y ٠ ) «T-DNA Border B ‏تمثل‎ (0 1) «v2 ZmUDbil ‏تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه‎ ‏(مع إنترون).‎ PhiYFP v3 ‏تمثل‎ (YY), ‏2000615؛‎ 3' UTR v2 ‏تمثل‎ (YV) PAT vO gv
‏و‎ (bp ١7٠5( )( pDAB105803 ‏لبلازميدات‎ Alia ‏يوضح خرائط‎ ١6 ‏الشكل‎ ‎(*) AMPR ‏تمثل‎ (Y) atl] ‏تمثل‎ )١( 16 ‏شكل‎ (bp YTV) ‏م ر(ب)‎ 60
ZmPer5 3' ‏تمثل‎ (V) ‏تمثل 8812؛‎ (1) sgentR ‏تمثل‎ (0) ¢ChIR ‏تمثل‎ (¢) tkanR ‏تمثل‎ ‏تمثل‎ (V1) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ )٠١( ‏تمثل تتابع توافق للذرة؛‎ (1) $GUS ‏تمثل‎ (A) (UTR ‏تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه 511لا207‎ (VF) ‏تمثل 510لا0!؛‎ (VY) v2 ZmUbil ‏معزز‎ © ؛)١١١7(‎ BamHI ‏تمثل توقف إطار-؟؛ )11( تمثل موقع‎ (V0) ‏تمثل ©51لا00!؛‎ (1) v2 ‏تمثل توقف ترجمة‎ (V4) PEPP1141 ‏من‎ YFP v2 ‏تمثل‎ (VA) ‏تمثل تتابع توافق للذرة؛‎ (VY) ‏تمثل موقع‎ (YY) ‏200118؛‎ 3' UTR 1 ‏تمثل‎ (Y)) ‏(780)؛‎ Sacl ‏تمثل موقع‎ )7١( ‏إطار -7؛‎ (Yo) ‏(717)؛‎ Notl ‏موقع‎ (ici (Y£) §(YY0)) Xbal ‏تمثل موقع‎ (YF) ‏(1714)؛‎ Xbal «Cry35Ab1 v5 ‏تمثل‎ (YY) ¢StPinll 3' UTR (isi (YT) ¢(Y+1Y) Xbal ‏تثل موقع‎ ٠ ‏تمثل‎ (FV) ‏(777)؛‎ Notl ‏تمثل موقع‎ (T+) ‏(لا توقف)؛‎ 8V6 Jia (Y3) 2A Jia (YA) ‏كاثاة.‎ Jia (YY); ¢()1¢) Xbal ‏موقع‎ ‏و‎ (bp £1¢Y) (I) pDAB105841 ‏يوضح خرائط تمثيلية لبلازميدات‎ ١١7 ‏الشكل‎ ‎(Y) ‏(3877)؛‎ Pstl ‏تمثل موقع‎ )١( OY ‏فى شكل‎ (bp ٠77 ١تد( ‏رب)‎ 2
PhiYFP ‏(17773))؛ )1( تمثل‎ Sacl ‏تمثل أصل 060151؛ )0( تمثل موقع‎ )3©( tkanR fic Vo ‏(بدون توقف)؛ (1) تمثل تتابع توافق‎ AAD-T v3 Jia (A) ‏/2؛‎ Jia )7( ‏إنترون)؛‎ ae) V3 sattL] ‏تمثل‎ (VY) «ZmLip 3' UTR vl ‏تمثل‎ (VV) ¢(YVYo) Pstl ‏تمثل موقع‎ (V+) ‏للذرة؛‎ ‏تمثل‎ (VV) sattl2 ‏تمثل‎ (V1) gentR ‏تمثل‎ (10) ¢ChIR (isi (1) $AmpR ‏تمثل‎ (17) ¢ZmPer5 3' UTR v2 Jia (14) ¢(Vo r+) Notl ‏موقع‎ Jici (YA) ¢(Vo VA) Spel ‏موقع‎ ‏تمثل توقف إطار-؟؛ (13) تمثل‎ (YY) (YY) Notl ‏تمثل موقع‎ (Y)) (GUS ‏تمثل‎ (Yi) Yo ‏تمثل‎ (Yo) v2 ZmUbil ‏تمثل منطقة معزز ضد الاتجاه‎ (YE) v2 ZmUbil ‏معزز‎ ‎.MinUbiP ‏و‎ (bp YYATY) (1) pDAB105843 ‏لبلازميدات‎ Alia ‏يوضح خرائط‎ ٠١8 ‏الشكل‎ ‎tkanR (ic (Y) tAMPR ‏تمثل‎ )١( «VA ‏فى شكل‎ .(bp ١ ¢01) ‏ر(ب)‎ 7 (V) ¢StPinll 3' UTR v2 ‏تمتل‎ (1) ¢attl2 Ji (0) ¢gentR Jisi (¢) «ChIR ‏تمثل‎ (¥) Yo ‏م‎ yy ‏تمثل تتابع توافق‎ )٠١( ‏(بدون توقف)؛‎ 87/6 Jia (3) $2A ‏تمثل‎ (A) «Cry35Abl ‏تمثل 5لا‎ ‏تمثل منطقة معزز‎ (VF) v2 ‏معزز 511لا200‎ iss (VY) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ )١١( ‏للذرة؛‎ ‏تمثل‎ (V1) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ (V0) ‏تمثل ©511ل101/!؛‎ (V¢) ‏72؛‎ ZmUbil ‏ضد الاتجاه‎
Jig (V4) 2A ‏تمثل‎ (VA) ‏(بدون توقف)؛‎ AAD-1 73 ‏تمثل‎ (VV) ll ‏تتابع توافق‎ ‏تمثل‎ (YY) sattl1 ‏تمثل‎ (YY) ‏منا200؛‎ 3' UTR ‏تمثل 1لا‎ )٠١( ‏3لا ©0017 (مع إنترون)؛‎ © «T-DNA Border 8 (isi (Yo) ¢attR1 ‏تمثل موقع‎ (Y£) ‏كلورامفينيكول؛ (77) تمثل 6008؛‎ ‏تمثل‎ )3١( ‏تمثل 007؛‎ )19( trfA ‏تمثل‎ (YA) ¢SpnR ‏تمثل‎ (YV) ‏تمثل استياق مفرط؛‎ )77( attR2 Jia (VV) «PAT ‏ول‎ Jia (TV) «T-DNA Border A 11 ‏شكل‎ a. (bp YIATY) (1) pDABL08717 ‏يوضح خريطة تمثيلية لبلازميد‎ ١9 ‏الشكل‎ ‏تمثل‎ (V) 5 (1) ‏تمثل 007؛ (د)؛‎ )4( ¢trfA ‏تمثل‎ )©( ¢SpnR (Y) ‏تمثل استياق مفرط؛‎ )١( ٠ (V+) PAT ‏تمثل ول‎ (3) «ZmLip 3' UTR v1 Jia (A) T-DNA Border A ‏عناصر‎ ‎Jig (VY) ¢StPinll 3' UTR v2 ‏تمثل‎ (VY) attB2 ‏تمتل‎ (1) «v2 ZmUbil ‏تمثل معزز‎ ‏تتابع توافق‎ Jia (V7) ‏(بدون توقف)؛‎ 87/6 Jia (Vo) 2A Jia (V¢) ¢«Cry35Abl v5 ‏تمثل منطقة معزز‎ (V4) v2 ZmUbIL ‏تمثتل معزز‎ (VA) ‏تمثل توقف إطار-؟؛‎ (VY) ‏للذرة؛‎ ‏تمثل‎ (YY) v= jl) ‏تمثل توقف‎ (YY) ‏تمثل ©511ل001/!؛‎ )٠١( v2 ZmUbil ‏ضد الاتجاه‎ 5
Jia (Yo) 2A (ia ‏(بدون توقف)؛ (؟7)‎ AAD-1 v3 Jia (YY) ‏تتابع توافق للذرة؛‎ (YA) sattBl ‏تمثل‎ (YV) eZmLip 3' UTR v1 ‏تمثل‎ (Y1) ‏(مع إنترون)؛‎ PhiYFP v3 .T-DNA Border B ‏تمتل‎ ‎(bp £1¢Y) (I) pDAB105844 ‏تمثيلية لبلازميدات‎ Lila ‏يوضح‎ 70 JS ‏تمثل موقع‎ (Y) kanR ‏تمثل‎ )١( ٠١ ‏فى شكل‎ (bp ٠37١ 5( ‏(ب)‎ pDAB105845, ٠
AAD-1 ici (0) ‏(1777)؛‎ Sacl gis ‏7)؛ )1( تمثل أصل 060151؛ (4) تمثل‎ 5 +) Neol ‏تمثل تتابع توافق‎ (A) ‏(مع إنترون) (بدون توقف)؛‎ ©1750 v3 ‏تمثل‎ (V) ‏تمثل 28؛‎ ) v3 ‏تمثل‎ (VY) ¢ChIR ‏تمثل‎ (VV) ¢AmPR ‏تمثل‎ )٠١( ‏(777)؛‎ BamHI ‏للذرة؛ )3( تمثل موقع‎
Notl ads ‏تمثل‎ (V0) ¢(A+23) Spel ‏تمثل موقع‎ (V¢) ‏تمثل 8112؛‎ (VV) ¢gentR
Notl ‏تمثل موقع‎ (VA) (GUS ‏تمثل‎ (VY) «ZmPer5 3' UTR v2 ‏تمثل‎ (V1) ¢(ArAY) 5 tive
— \ \ — ‎(V4) ¢(0AVY)‏ تمثل توقف إطار-؟؛ ‎(Yo)‏ تمثل معزز ‎Jia (YY) v2 ZmUDIlL‏ منطقة معزز ضد الاتجاه ‎(YY) «v2 ZmUDbil‏ تمثل 5 ‎(YY) «MinUbiP+H‏ تمثل ‎¢ZmLip 3' UTR v1‏ ‎(Y¢)‏ تمثل ‎attll‏ ‏الشكل ‎7١‏ يوضح ‎Lila‏ تمثيلية لبلازميدات ‎(bp YYATY) (I) pDABL05846‏ ‎pDAB108718, ©‏ (ب) ‎(bp YTAAY)‏ فى شكل ‎«YY‏ )1( تمثل ‎(Y) ¢AmpR‏ تمثل ‎tkanR‏ ‎«ChIR Jia (TV)‏ (4) تمتل ‎«attl2 Jis (0) tgentR‏ )1( تمثل ‎(V) ¢StPinll 3" UTR v2‏ تمثل ‎Jia (1) 2A Jia (A) «Cry35Abl v5‏ 87/6 (بدون توقف)؛ ‎Jia (Vo)‏ تتابع توافق للذرة؛ ‎Jia (VY)‏ توقف إطار-؟؛ ‎(VY)‏ تمثل معزز ‎Jia (VY) v2 ZmUbil‏ منطقة معزز ضد الاتجاه ‎(Y ¢) ¢ZmUbil‏ تمثل 5 ‎(Vo) ¢Min—-UbiP+H‏ تمثل ‎ae) PRIYFP v3‏ إنترون) ‎٠‏ (بدون توقف)؛ ‎(V1)‏ تمثل ‎Jic (VA) ¢ZmLip 3' UTR vl Jia (VV) ¢AAD-1 v3‏ 1 ؛ ‎(V4)‏ تمثل ‎)٠١( ¢SpnR‏ تمثل ‎(YV) ¢trfA‏ تمثل ‎(YY) ¢oriT‏ تمثل ‎T-DNA‏ ‎(Y¢) «PAT v9 Ji (YY) «Border A‏ تمثل ‎(Y1) eMin=UbilP Jis (Yo) «attB2‏ تمثل ‎(YV) ¢attBl‏ تمثل ‎(YA) 5 «T-DNA Border B‏ تمثل استياق مفرط. الشكل ‎YY‏ يوضح بيانات التعبير الجيني عن بروتين نموذجية (نانوجرام) ل ‎Cry34‏ )1( مرسوم ‎yo‏ كدالة ل ‎(Y) Cry35‏ من ‎pDAB108717‏ (الشكل ‎(Ivy‏ و ‎pDAB108718‏ (الشكل ١7"ب).‏ الشكل ‎YY‏ يوضح تتابع حمض نووي ‎acid sequence‏ 0101616 لمجموعات جينية للتعبير الجيني عن 0105108717؛ حيث تم توضيح كل جين و عنصر ‎element‏ ‏الأشكال ‎YE‏ أ-ه توضح معززات أساسية أدنى إضافية ‎min-UbilP)‏ أو ‎(Ubil-minP‏ من هوية تتابع أرقام: 31-1. ‎٠‏ الشكل ‎Yo‏ يوضح تتابعي نموذجيتين لبروتينات التفلور الصفراء ‎yellow fluorescent‏ من 51-2003 ‎a.a., GenBank (Phiyfp) Phialidium sp.‏ 234 1 (هوية تتابع رقم: ‎٠‏ #)؛ و ‎Phiyfpv3‏ ,.8.8 234 هوية تتابع رقم: )0( الشكل 7 يوضح تجسيمات نموذجية من معزز ‎Ubil‏ التخليقي ثنائي الاتجاه و تركيبات مقدمة؛ بما في ذلك ‎A ZMUbi) 0 pDAB108706‏ الاتجاه ‎))٠٠١-(‏ و 0008108707 (ب) ملا
_ \ —
‎ZMUbi)‏ ثنائي الاتجاه )-:3((. ‎ZmUbil-YFP) (x) pDABL01556‏ 8( و
‏6 رد) ‎ZMUDIL)‏ بدون أدنى معزز) تعمل على هيئة تركيبات مقارنة مع معززات
‏موحدة الاتجاه ‎promoters‏ [001-016011008. فى شكل 76 ‎)١(‏ تمثل ‎UTR‏ '3-منا؛ ‎(Y)‏
‏تمتل 70؛ (©) تمثل إنترون 011لا؛ )£( تمثل ‎Ubil-minP‏ عند الموضع =+ + 5¢¥ )0( تمثتل
‏ه ‎Ubil-minP‏ عند الموضع -90؛ )1( تمثل 511-0045لا؛ ‎(V)‏ تمثل ‎Jig (A) «GUS‏
‎UTR‏ '08+5-3؛ )4( تمثل 1-0أطالا؛ و ‎)٠١(‏ تمثل 45ل011-1لا بدون ‎Ubil-minP‏ (السهم
‏الأيسر للعنصر غير وظيفى).
‏الشكل 7١؟أ‏ يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في
‏الشكل 776 لبروتين ‎(LCMS) YFP‏ في نانو جرام/ ‎Yan‏ الشكل ‎VY‏ يوضح نتائج تعبير جيني ‎٠‏ نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ‎YT‏ ل ‎YFP RNA‏
‏الشكل ‎TYA‏ يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في
‏الشكل 776 لبروتين ‎(LCMS) GUS‏ في نانو جرام/ سم؟. الشكل ‎OYA‏ يوضح نتائج تعبير جيني
‏نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ¥1 ل ‎.GUS RNA‏
‏الشكل ‎TY‏ يوضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في ‎١‏ الشكل ‎YT‏ لبروتين 01ث// ‎(LCMS)‏ في نانو جرام/ ‎Yau‏ الشكل 79ب يوضح نتائج تعبير
‏جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ‎YT‏ ل ‎AAD] RNA‏
‏الشكل ١؟أ‏ يوضح تحليل إحصائي ‎statistical analysis‏ لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من أربع
‏تركيبات موضحة في الشكل 76 لبروتين ‎(LOCMS) YFP‏ في نانو جرام/ ‎Yau‏ تكون القيم
‏المتوسطة ‎mean values‏ ل ‎«pDAB101556 «pDAB108706 pDAB108707‏ و ‎pDAB108716 Yo‏ هي 7 ‎(oY.‏ 44.0 وصفر على التوالي. الشكل ‎٠‏ ؟"ب يوضح
‏تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل 776 ل
‎«pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 ‏تكون القيم المتوسطة ل‎ YFP RNA
‏و ‎pDAB108716‏ هي 1.7 أخصى ¢1.40 و ‎١٠.١١‏ على التوالي.
‎tive
و الشكل ١؟أ‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(VO)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 لبروتين ‎(LCMS) GUS‏ في ‎Yau faba gl‏ تكون_القيم المتوسطة ل 6 ,م ‎pDAB108707‏ 088101556م و ‎pDAB108716‏ هي .٠ف‏ 7" > و 71.17 على التوالي. الشكل ١ب‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير © الجيني النسبية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل ‎GUS RNA‏ تكون القيم المتوسطة ل ‎pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706‏ و 008108716 هي ‎YoY gon VA Ge‏ على التوالي. الشكل ‎IVY‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(VO)‏ من أربع تركيبات موضحة في ‎Jal‏ 776 لبروتين 8801م ‎(LCMS)‏ في نانو ‎Yau [aa‏ تكون_القيم المتوسطة ل ‎YY.
AA» pDABI08716 5 «pDAB101556 pDAB108707 «pDAB108706 ٠‏ .لال مدع و ‎١75.47‏ على التوالي. الشكل ‎FY‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل هل ‎AADT‏ تكون القيم المتوسطة ‎J‏ 088108706م ‎«pDAB108707‏ 088101556م ر 0/8108716م هي 1.77 ‎LTV‏ 1.47ء و 7.97 على التوالي. ‎١‏ الأشكال ‎oY (FY‏ و 77ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(VI0)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ‎YT‏ ل ‎AAD] YFP‏ و بروتين ‎(LCMS) GUS‏ في نانو جرام/ ‎Yau‏ على التوالي. الأشكال ‎cae (Ire‏ و ‎VE‏ 2 توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V10)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ‎YT‏ ل ‎«GUS YFP‏ و بروتين ‎(LCMS) AAD]‏ في نانو جرام/ ‎le Yau Yo‏ التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎pDABL108706‏ 088108707 6م ر 088108716م ل ‎YFP‏ (الشكل ‎(fe‏ هي لألا اث الى حمفكك و 7.00 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎«pDAB108707 pDAB108706‏ ‎pDAB108716 5 pDAB101556‏ ل ‎Jal) GUS‏ ؛آب) هي اتيك ‎ser AYO‏ ‎de ٠7‏ _التوالي. ‎adll os‏ المتوسطة ل ‎«pDAB108707 pDABL08706‏ ‎tive‏
اج \ _ 6م ر 088108716 ل ‎AAD]‏ (الشكل ‎(VE‏ هي ‎١‏ فتتت ‎GAYA‏ ‏ا دده و ‎٠١ ٠١6‏ على التوالي. الأشكال ‎(Yo‏ 5؟ب؛ و 75ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(R3)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل 76 ل ‎«GUS YFP‏ و بروتين ‎(LCMS) AAD]‏ في نانو جرام/ ‎You‏ على التوالي. الأشكال ‎ea (FT‏ و 17ج توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(R3)‏ من أربع تركيبات موضحة في الشكل ‎«GUS YFP 1 v1‏ و بروتين ‎(LCMS) AAD]‏ في نانو جرام/ ‎Yau‏ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎«pDAB108707 (pDAB108706‏ 6م ر ‎pDAB108716‏ ل ‎YFP‏ (الشكل 6؟) هي الى £9.69( تلت ‎١١‏ و 26 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ‎«pDAB108706 J‏ 7 تنام ‎«pDAB101556‏ و ‎pDAB108716‏ ل ‎GUS‏ (الشكل ١آب)‏ هي عدف الضصستلف املف و 0 على ‎dll ge Nah‏ المتوسطة ل ‎«pDAB108707 pDAB108706‏ 6م ر ‎pDAB108716‏ ل ‎Jal) AAD]‏ ١أج)‏ هي انتم 64م 068 و دل اخحك ‎١‏ على التوالي. ‎Yo‏ الشكل أ يوضح نتائج تعبير جيني نسبية ‎(V6) dad gal‏ من ‎Cry34 RNA‏ من أربع تركيبات ‎ZMUbi]~-/ZMUbil1-Cry34) pDAB105818 «(ZMUbil-YFP) pDAB105748‏ ‎AW YFP/AAD-1-ZMUbil) pDAB108717 «(ZMUbil-AAD1/Cry35‏ الاتجاه - ‎«(Cry34-Cry35‏ و ‎YFP-ZMUbi1/AAD1) pDAB108718‏ ثنائي الاتجاه ‎Cry34—‏ ‎.(Cry35‏ الشكل ‎aly‏ يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من بروتين ‎Cry34‏ ‎(LCMS) ٠‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎«pDAB108717 pDAB105818 pDAB105748‏ و ‎.pDAB108718‏ ‎«pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748‏ و ‎«VA Jal .pDAB108718‏ م
_ أ \ _
يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(VO)‏ من بروتين ‎(LCMS) AADT‏ من نفس التركيبات
.pDAB108718 ‏و‎ «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 ‏الأربعة‎
«¥4 ‏الشكل‎ .pDAB108718 ‏و‎ «pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748
© يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(VO)‏ من بروتين ‎(LOCMS) YFP‏ من نفس التركيبات
.pDAB108718 ‏و‎ «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748 ‏الأربعة‎
الشكل 180 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من ‎Cry35 RNA‏ من أربع تركيبات
«f+ ‏و 088108718م. الشكل‎ «pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748
يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(VO)‏ من بروتين ‎(ELISA) Cry35‏ من نفس التركيبات ‎٠‏ الأربعة ‎«pDAB108717 «pDAB105818 (pDAB105748‏ و ‎.pDAB108718‏
.pDAB108718 ‏و‎ «pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748
الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من ‎Cry34 RNA‏ من أربع
تركيبات ‎(pDAB105748‏ 0/8105818ام؛ ‎«pDAB108717‏ و 0108108718 بمتوسط ‎Yo‏ قيم ‎on‏ قات ‎YAY‏ و ‎Y.Yo‏ على التوالي. الشكل كب يوضح تحليل ‎(ban)‏ لنتائج التعبير
الجيني ‎(V6)‏ من بروتين ‎Cry34‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎PDAB105748‏
047.9¢ «+ ‏قيم‎ Luge pDABIO8718 ‏و‎ «pDAB108717 +8
‎٠١ 4.7/7‏ و 4.18 1لا على التوالي.
‏الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من ‎AAD] RNA‏ من أربع ‎٠‏ تركيبات ‎«pDAB108717 «pDAB105818 (pDAB105748‏ و 0108108718 بمتوسط
‏قيم للخ لف اتات و ‎٠.١‏ على التوالي. الشكل ‎«ty‏ يوضح تحليل ‎(ban)‏ لنتائج التعبير
‏الجيني ‎(V6)‏ من بروتين 8001م من نفس التركيبات الأربعة ‎PDAB105748‏
‎777.54 66 ad ‏و 008108718 بمتوسط‎ «pDAB108717 +8
‏هل 1لا و 7714.19 على التوالي.
‎tive
ل الشكل ؛4؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من ‎YFP RNA‏ من أربع تركيبات ‎(pDAB105748‏ 105818 08م ‎«pDAB108717‏ و 008108718 بمتوسط قيم 7.549 660 1.748 و 1.90 على التوالي. الشكل ؛ ‎of‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من بروتين ‎YFP‏ من نفس التركيبات الأربعة 088105748 هه ‎5<pDAB108717 (pDAB105818‏ 08108718 بمتروسط قيم 7.24 لف ‎(YO TA‏ 354 و 16.04 على التوالي. الشكل ‎Teo‏ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(V6)‏ من ‎Cry35 RNA‏ من أربع تركيبات ‎(pDAB105748‏ 105818 08م ‎«pDAB108717‏ و 008108718 بمتوسط ‎OLY © ad‏ 74 و ‎YY‏ على التوالي. الشكل 45 ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير ‎٠‏ الجيني ‎(V6)‏ من بروتين ‎Cry35‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎PDAB105748‏ ‎«pDAB108717 «pDAB105818‏ و ‎pDAB108718‏ بمتوسط قيم +« ‎(YAV.0f‏ ‏277 و 90.497 على التوالي. الشكل £7 يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎)٠/6(‏ من ‎PAT RNA‏ من أربع تركيبات ‎«pDAB108717 pDAB105818 «pDAB105748‏ و ‎ad Lusi pDAB108718‏ ‎٠.١٠١ SOLE Gy det 5‏ على التوالي. الأشكال ‎Jey‏ /اكبء 97؛5ج؛ و 7؛د توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي (10/) من ‎«Cry34 (AADL YFP‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات 088105748 58 قم ‎(pDAB108717‏ و ‎.pDAB108718‏ ‏الأشكال 8؛أ ‎tA‏ 4؛ج؛ و ‎aA‏ توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين ‎(VIO) ٠‏ من © 1ناظهل ‎«Cry34‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات ‎pDAB105818 «pDAB105748‏ 0088108717 و 08108718م._تكون_القيم المتوسطة ل ‎YFP‏ (الشكل ‎(TEA‏ هي ‎YY.) OTLEY‏ 1.14 و ‎١١.035‏ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎AAD‏ (الشكل ‎(fA‏ هي ‎(AVA‏ ناكا لتتت طم و ‎AvY.on‏ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎Cry34‏ (الشكل 48؛ج) هي 6 ‎YET.00‏ ‏دما
“YA
داكا و 74.80 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎Cry35‏ (الشكل ‎(tA‏ هي ٠؛‏
دلا ‎Ted‏ و ‎AAA‏ على التوالي.
الأشكال 149 ‎cat d‏ 49ج و 089 توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي ‎(R3)‏ من
088105748 ‏على التوالي من أربع تركيبات‎ Cry35 ‏و‎ «Cry34 (AADL YFP
.pDAB108718 ‏0/8108717م؛ و‎ «pDAB105818 ©
الأشكال ‎con Jon‏ 5200 ١٠د‏ توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين
‎(R3)‏ من ‎«Cry34 (AAD1 YFP‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات
‎8 os .pDAB108718 ‏و‎ «pDABI08717 «pDAB105818 ‏ها‎ 68
‏المتوسطة ل ‎YFP‏ (الشكل ‎(fon‏ هي تنكمت ‎(EYLTY‏ 7.7 و ‎١777.45‏ على ‎٠‏ التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎AAD]‏ (الشكل ‎١‏ دب) هي 24ت ‎ATA‏ لفاكت
‏و ‎١774.997‏ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎Cry34‏ (الشكل ‎(zo‏ هي 477.5
‏2710 7/5.94 و 154.720 على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎Cry35‏ (الشكل
‏200( هي 6 777.75 41.11 و 0.45 على التوالي.
‎(z=) ©) Jal‏ يوضح نتائج مثالية لبقعة ‎Western‏ للتعبير الجيني عن بروتين ‎Cry34‏ (شكل ‎Cry35 (ley ٠‏ (شكل )© ب) و ‎AADL‏ (شكل ١دج)‏ من 008108718 و
‎pDAB108717.
‏الوصف التفصيلي:
‏أصبح تطوير المنتجات المعدلة وراثياً ‎transgenic products‏ معقد بشكل كبير؛ التي تتطلب
‏تهريم ‎pyramiding‏ جينات متعددة متحورة إلى مكان واحد ‎single locus‏ ويتطل كل جين ‎٠‏ متحور ‎We‏ بشكل تقليدي معزز فريد ‎Unique promoter‏ للتعبير؛ وبذلك فإنه يتطلب معززات
‏متعددة لتعبر عن جينات متحورة مختلفة خلال مجموعة جين ‎gene stack‏ واحد.بالإضافة إلى
‏زيادة حجم مجموعة الجين؛ فهذا يؤدي ماراً إلى الاستخدام المتكرر لنفس المعزز للحصول على
‏مستويات متشابهة من أنماط التعبير الجينى ‎expression pattems‏ المختلفة المتحكمة في نفس
‏الصفة ‎trait‏ ومن المعروف أن بنيات متعددة الجينات مدفوعة بنفس المعزز تسبب إسكات الجين
‏ملا
—vq-
‎gene silencing‏ ؛ وبهذا تعمل على أن تكون المنتجات الوراثية أقل كفاءة في المجال. ويمكن للكثير من مواقع الربط ‎Jalal‏ النسخ ‎(TF) transcription factor‏ بسبب تكرار المعزز أن تسبب
‏استتفاذ ‎TFs]‏ الداخلي مؤدياً إلى تخميد لعملية النسخ ‎transcriptional inactivation‏ يتم توفير تركيبات وطرق تقوم بتجميع نظام المعزز ثنائي ‎bidirectional promoter system‏ الاتجاه مع تنظيم ثنائي السيسترونات ‎bicistronic organization‏ للجينات على إما نهاية واحدة أو كلا النهايتين للمعززء على سبيل المثال مع استخدام تتابع ‎2A‏ من فيروس زوثيا أسيجنا ‎asigna)‏ 170568). ويشق بروتين ‎2A‏ الذي فقط يتكون من = "حمض ‎ad‏ البولي بروتين ‎polyprotein‏ عند نهايته الكربوكسيلية ‎.carboxyl-terminus‏ ويمكن لهذا "الانشقاق الذاتي ‎self-cleavage‏ " أو خاصية 'تخطي الريبوسوم ‎ribosome skip‏ ” لببتيد ‎2A‏ أو سبيه ‎٠‏ الببتيد ‎2A‏ أن يستخدم في معالجة البولي بروتينات المنتجة الصناعية في النباتات المعدلة وراثياً. وفي تجسيم واحد يتم دمج كل من الجينات ‎Cry34‏ و35/© في مجموعة تعبير جيني واحدة؛ بينما يتم دمج جينات ‎AAD] (Phiyfp S)YFP‏ في مجموعة تعبير جيني أخرى (مع إطار قراءة مفتوح ‎(ORF) open reading frame‏ مع نسخة ‎COPY‏ من جين بروتين ‎protein‏ ‎2A gene‏ موضوعة ما بين جينين في كل التثام). وعلى سبيل المثال يمكن لكل من مجموعات ‎١‏ التعبير الجيني تلك (أو أزواج جينية ‎(gene pairs‏ أن يتم وضعها على أي من النهايتين للمعزز ‎ALS‏ الاتجاه ليدفع ؛ جينات متحورة وراثياً باستخدام معزز فردي. وبذلك البنايات والطرق المقدمة هنا مفيدة لتجنب الاستخدام المتكرر لنفس المعزز ويقلل حجم التركيبات التجارية ‎commercial‏ ‏05 بوضوح. بالإضافة تمد أيضاً الأربع جينات أو أكثر المدفوعة بمعزز واحد القدرة
‏على التعبير المشترك للجينات ‎co—-express genes‏ المتحكمة في صفة ‎trait‏ واحدة. ‎xb; ٠‏ معززات النباتات ‎Plant promoters‏ المستخدمة لأجل البحث الأساسي أو التطبيق البيوتكتولوجي ‎biotechnological application‏ بصفة عامة أحادية الاتجاه ‎unidirectional‏ ‎٠‏ موجهةً فقط جين واحد الذي يتم دمجه عند نهايته '3 (أي؛ فى نفس الاتجاه ‎(downstream‏ ‏وإنه من الضروري غالباً إدخال جينات متعددة في النباتات من أجل الهندسة الآيضية ‎metabolic‏ ‏9 وتجميع الصفات ‎trait stacking‏ وبذلك يتطلب هذا معززات متعددة بشكل ‎YO‏ نموذجي في محاصيل ‎Crops‏ المستقبل المتحورة وراثياً لتدفع التعبير للجينات المتعددة. وإنه من
‏ملا
ل
المرغوب فيه تصميم الاستراتيجيات التي يمكن أن تحفظ رقم المعززات المنتشرة وتسمح بتعبير منتظم مشترك 00-16918180 في نفس الوقت لتهريم الجين ‎Ay .gene pyramiding‏ بعض التجسيم؛ يمكن للمعززات الثنائية الاتجاه أن تدفع نسخ وحدات النسخ المتعددة؛ مشتملة على ‎(RNA‏ أو ‎MIRNA‏ المصطنع ‎cartificial‏ أو تتابعات حلقة الهايبن ‎RNA haipin-loop‏ © تتمثل إحدى طرق خفض عدد المعززات المنتشرة في استخدام محولات تنشيط ‎activating‏ ‏5 انتساخ حرجة ‎critical transcription‏ يمكن أن تنقل الانتساخ في كلا الاتجاهين. يتم تسمية تلك المعززات بالمعززات ثنائية الاتجاه. ‎(Say‏ تصميم معززات تخليقية ‎Synthetic‏ ‎Lull promoters‏ = بمستوى متجانس ‎homology‏ بين معززات متعددة يتم استخدامها للتعديل الجيني الوراثي في نباتات المحاصيل ‎crop plants‏ ؛ حيث يمكن تجنب صمت الجين بأساس متجانس. يمكن أن تكون المعززات ثنائية الاتجاه المصممة بشكل صناعي عبارة عن أدوات ذات قيمة لتطوير النباتات المعدلة وراثياً. تم تقرير أن وظيفة ثنائية الاتجاه للمعززات في النباتات في بعض الحالات؛ بما في ذلك 355 ‎CaMV‏ و معززات معزز تخليق مانوبين ‎(Mas)‏ مع ذلك؛ لم يتم فحص قابلية استخدام تلك المعززات للتعبير القابل ‎sill‏ والمستقر ‎stable‏ والمتزامن
‎simultaneous‏ للجينات في الاتجاهين.
‎١‏ تتمثل طريقة أخرى للتعبير الجيني المتساهم ‎coordinate expression‏ للجينات المتعددة في ترميز إطار قراءة ‎reading frame‏ واحد منفرد في مادة بادئة عديدة البروتين ‎polyprotein‏ ‎precursor‏ تتضمن دافع تداخل 17161760109 قصير بخواص معالجة ذاتية ‎self processing‏ بين تتابعي ترميز ‎coding sequences‏ تؤدي معالجة ذاتية التحفيز لمادة بادئة عديدة البروتين إلى إطلاق بروتينات مستقلة ‎independent proteins‏ متعددة مما يؤدي إلى تعبير جيني
‎2A ‏تم استخدام تتابع ببتيد‎ .57/0001001280 coordinated expression ‏تساهمي متزامن لها‎ ٠ ‏في كلا من النظام النباتي والحيواني‎ synthetic self-hydrolyzing ‏ذاتي التحلل المائي تخليقي‎ ‏ببتيد بواسطة فيروسات معروفة متعددة وتتكون‎ 2A ‏للتعبير عن جينات معدلة. يتم استخدام تتابع‎ self-cleaves ‏ببتيد ذاتي الشق‎ 2A ‏يكون تتابع‎ .amino acids ‏حمض أمينو‎ Yo -١١ ‏من‎ ‏بشكل مشترك التحول عن طريق تعديل نشاط الريبوزوم‎ (ribosome skip ‏(أو خروج ريبوزوم‎
‏ملا
“yy ‏بين البروتينين مما يؤدي إلى إطلاق منتجين بروتين‎ 2A ‏ل‎ hydrolysis ‏للسماح بالتحلل المائي‎ .protein products ‏يتم تقديم تركيبات وطرق تجميع معزز ثنائي الاتجاه تتعامل مع بولي بروتين معالج باستخدام‎ ‏؛ حيث يمكن تحقيق التعبير الجيني عن ؛ جينات‎ synthetic motifs ‏تداخل دوافع تخليقية‎
YFP ‏و 00/35؛ و جينات من‎ ©0734 clin ‏معدلة على الأقل باستخدام معزز واحد. تم دمج‎ © ‏و 001 في صورة مجموعات جينية للتعبير الجيني عن أو أزواج جينات في‎ (Phiyfp J) protein ‏بنسخة من جين بروتين‎ (ORF) open reading frames ‏إطارات قراءة مفتحة منفردة‎
SE ‏الموضوع بين الجينات. يمكن وضع أزواج الجين على أي نهاية من المعزز‎ 2A gene ‏الاتجاه لنقل أربع جينات معدلة باستخدام معزز منفرد واحد. تكون التركيبات و/ أو الطرق المقدمة‎ ‏في هذه الوثيقة مفيدة لتجنب استخدام متكرر لنفس المعزز لتجنب مشاكل صمت الجين المعدل‎ Ve ‏المحتمل. بالإضافة إلى ذلك؛ يمكن أن تؤدي طريقة تصميم ذلك الجين المعدل بشكل كبير إلى‎ ‏خفض حجم تراص الجين المعدل التي تحتوي على الجينات المعدلة المتعددة. يؤدي نقل أربع‎ ‏جينات أو أكثر بمعزز واحد أيضاً إلى توفير قابلية للتعبير المشترك عن جينات تتحكم في صفة‎ transgenic products ‏منفردة تضمن كفاءة طويلة المدى للمنتجات المعدلة جينياً‎ ‏ونمطياً يتطلب تراص جينات معدلة‎ (Jolie ‏أصبح تطوير النباتات المعدلة وراثياً معقداً بشكل‎ ١ ‏بما‎ Xie et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19(7):677-9 ‏متعددة في موقع واحد. انظرء»‎ ‏يتطلب معزز فريد للتعبير الجيني؛ يكون المطلوب معززات متعددة للتعبير‎ Sale ‏أن كل جين معدل‎ ‏عن جينات معدلة مختلفة داخل تراص جين واحد. بالإضافة إلى زيادة حجم تراص الجين؛ يؤدي‎ ‏ذلك بشكل متكرر إلى الاستخدام المتكرر لنفس المعزز للحصول على مستويات مماثلة لأنماط‎ ‏التعبير الوراصي للجينات المعدلة المختلفة. يصاحب تلك الطريقة في الغالب مشاكل؛ حيث يمكن‎ Yo
HBGS ‏أن يؤدي التعبير عن جينات متعددة مشتقة بواسطة نفس المعزز إلى صمت الجين أو‎ ‏في معززات‎ (TF) binding sites ‏يمكن أن تؤدي زيادة منافسة عامل انتساخ مواقع ارتباط‎ transcriptional ‏وتؤدي إلى توقف تنظيم انتساخي‎ Laid) ‏داخلي‎ TFs ‏متكررة إلى إضعاف‎ ‏سوف يؤثر صمت الجينات المعدلة بشكل محتمل إلى تأثير غير مرغوب‎ .0014/0 regulation ‏ناتج للتعبير للجينات المعدلة. يمكن أن تؤدي تتابعات تكرارية‎ Why ‏فيه على كفاءة نبات معدل‎ Yo ‏ملا‎
و داخل جين معدل إلى ‎sale)‏ اتحاد متجانس ‎Jala homologous recombination‏ موقع الجين مما يؤدي إلى إعادات لترتيب ‎rearrangements‏ عديد النيوكليوتيد. تكون معززات النبات المستخدمة للبحث الأساسي أو التطبيق التقني الحيوي بصفة عامة موحدة الاتجاه؛ وتنظم جين واحد فقط تم دمجه عند نهايتها '3 (فى نفس الاتجاه). حتى يتم إنتاج نباتات © معدلة ‎Wh‏ ذات صفات أو خصائص مرغوب فيها متعددة؛ يمكن أن يكون من ‎add)‏ خفض عدد المعززاتا لتي تنتشر لتنقل التعبير الجيني للجينات المعدلة التي ترمز الصفات والخصائص المرغوب ‎led‏ يكون من الضروري في الغالب إدخال جينات معدلة متعددة في النباتات للتعديل الوراتي الأيضي وتراص الصفات؛ بالتالي تستلزم المعززات المتعددة التي تحرك التعبير الجيني للجينات المعدلة المتعددة. بالتالي تطوير معزز ثنائي الاتجاه تخليقي منفرد الذي يمكن أن يحرك ‎٠‏ تعبير جيني لجينين معدلين تجاور ‎dl‏ يمكن خفض الأعداد الإجمالية للمعززات الضرورية لتطوير المحاصيل المعدلة وراثياً ‎transgenic crops‏ بالتالي لتقليل الاستخدام المتكرر لنفس المعزز؛ خفض حجم التركيبات المعدلة ‎lily‏ و/ أو خفض إمكانية ‎HBGS‏ ‏تستخدم التجسيمات هنا عملية حيث ‎lod‏ معزز أحادي الاتجاه من جين الذرة يوبيكويتن -1 ‎maize ubiquitin—1 gene‏ (مثلء ‎(ZmUDil‏ ومعزز 811لا لتصميم معزز مخلق ثنائي ‎١‏ _ الاتجاه ؛ ومثل هذا المعزز المخلق يمكن له مباشرة التعبير للجينين الاثنين حيث يوجد واحد عند كل نهاية من المعزز. يمكن أن تشتمل عملية مستخدمة في هذه الوثيقة على تعريف عنصر معزز أساسي أدنى ‎Ubil‏ (0110ل00101) من جين ‎ZmUbIL‏ و تعديل هندسة ذلك العنصر في سياقات جديدة لتكوين معززات ثنائية الاتجاه التخليقية المعينة. يمكن أن تسمح معززات ثنائية الاتجاه مخلقة؛ ‎Jie‏ التي يمكن تكوينها بواسطة عملية وفقاً لبعض تجسيمات الاختراع في المجال ‎٠‏ ليتجميع الجينات المتحورة وراثياً في خلايا النبات والنباتات بينما يقوم بالتقليل الاستخدام المتكرر لنفس المعزز ويقلل من حجم البنايات المتحورة وراثياً. وعلى نحو أكثر من ذلك ربما أيضاً يمد تنظيم التعبير للجينين الاثنين مع معزز مخلق ثنائي الاتجاه بالقدرة على التعبير المشترك للجينين الاثنين تحت نفس الظروف؛ مثل هذا ربما يكون مفيد؛ فعلى سبيل المثال عندما يساهم كلا الجينين الاثنين في صفة واحدة في المضيف. وقد تم تسجيل استخدام معززات ثنائية الاتجاه من حيث ‎Yo‏ الوظيفة في نباتات في بعض الحالات؛ مشتملة على ‎CaMV 35 promoters (Barfieldand‏ ‎tive‏
_ ‏انام‎ ‎Pua (1991) Plant Cell Rep. 10(6-7):308-14; Xie et al. (2001)), and the mannopine synthase promoter (mas) promoters (Velten et al. (1984)
EMBO J. 3(12):2723-30; Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:3219-23) © يتم توجيه بدء النسخ وتنظيم تعبير الجين في جينات النبات بواسطة عناصر مختلفة لتتابع ‎DNA‏ ‏والتي مجتمعة تم ترتيبها خلال المعزز. تتكون معززات حقيقيات النواة من عنصر قلب معزز أدنى رظمام) وتتابعات تنظيمية أكثر ضد الاتجاه ‎upstream regulatory sequences‏ ‎.(URSS)‏ ويُعد عنصر قلب المعزز امتداد أدني لتتابع ‎DNA‏ المجاورة التي تُعد كافية لتوجه بدء مضبوط لعملية النسخ. ويضم أيضاً معززات القلب في النباتات على مناطق مقبولة مرتبطة بالبدء ‎٠‏ في النسخ؛ ‎Jie‏ صناديق ‎TATA; CAAT‏ ويقع عنصر الصندوق ‎We TATA‏ تقريباً ‎٠‏ إلى ‎Yo‏ نيكليوتيدات ضد الاتجاه لمكان البدء في النسخ. يُعد تنشيط ‎MINPY‏ معتمداً على ال45الا؛ والتي بها يرتبط العديد من البروتينات ويتفاعل لاحقاً مع معقد بدء النسخ. ويضم ال455الا على تتابعات ال/لا(ا التي تحدد نمط التعبير الزمني المكاني للمعزز المشتمل على 45الا. ويتم تحديد القطبية للمعزز ‎We‏ بواسطة اتجاه ال0100؛ بينما يُعد ‎URSY ١٠‏ ثنائي القطبية (أي أنه يقوم بوظيفته مستقلاً عن اتجاهه). على سبيل المثال؛ ربما يتم تحويل المعزز الأحادي الاتجاه القطبي المخلق 355 ‎CaMV‏ إلى معزز ثنائي الاتجاه بواسطة دمج ‎MINP‏ عند نهاية '3 من المعزز في الاتجاه المقابل. انظر على سبيل المثال» ‎Xie et al.‏ ‎Nat. Biotechnol. 19(7):677-9‏ (2001). ويتم سرد بعض الاختصارات المعينة التي أفصح عنها في الجدول رقم ‎.١‏ ‎Yo‏ جدول ‎.١‏ الاختصارات المستخدمة في الإفصاح حمض ثنائى سينكونينك ‎bicinchoninic acid‏ فيروس القرنبيط الفسيفسائي ‎cauliflower mosaic‏ ‏م
_ اذ اس ببتيد عبور البلاستيدات الخضراء ‎CTP | chloroplast‏ ‎transit peptide‏ إسكات .| الجين | على أساس متجانس | ‎HBGS‏ ‎homology-based gene silencing‏ قلب معزز أدنى ‎minUbi1P ZmUbil‏ تضخيم قلة الربط ‎oligo ligation amplification‏ المحلول الملحي المنظم بالفوسفات ‎PBS | phosphate‏ ‎buffered saline‏ المحلول الملحي المنظم بالفوسفات ‎PBST | phosphate‏ ‎buffered saline‏ ب9660..0 خلال (توين) ‎٠١‏ ‏تفاعل سلسلة بوليميراز ‎PCR | polymerase chain‏ ‎reaction‏ ‏تضخيم دائرة التدوير ‎RCA | rolling circle‏ ‎amplification‏ ‎PCR‏ بإنزيم ترانسكريبتاز العكسي ‎RT-PCR | reverse‏ ‎transcriptase PCR‏ امتداد بادئة النيكليوتيد المفردة ‎SNuPE | single nucleotide‏ ‎primer extension‏ ‎i il‏ 0 = جين يوبيكوتين -1 ‎ZmUbil Zea mays‏ g1ve
—yvo- (ZMmUbi1) ‏ذرة‎ Ubil ‏في أمثلة خاصة لبعض التجسيمات يتم استخدام عناصر معدلة من معزز‎ ‏لهندسة معززات مخلق ثنائي الاتجاه التي ربما‎ (B73 Z. mays ‏مشتق من السلالة الطبيعية‎ ‏تقوم بوظيفة في النباتات لتقدم خصائص التحكم بالتعبير التي تُعد فريدة مع الأخذ في الاعتبار‎ ‏أصلاً المشتق من 873 تتابعات تقع‎ ZmUDBIT ‏معززات ثنائية الاتجاه متاحة سابقاً. يضم معزز‎ ‏فيما يقرب من 899 قاعدة من موقع بدء النسخ ل5؛ وفيما‎ Maize genome ‏الذرة‎ agua ‏على‎ ©
Christensen et al. (1992) Plant Mol. ‏قاعدة من موقع بدء النسخ ل39.‎ ٠٠١57 ‏يقرب من‎
ZmUbil ‏ويُعد معزز‎ .8101. 18(4):675-89 (describing a B73 ZmUbil gene) ‏معزز ما يقرب من ؟كيلو قاعدة والذي‎ ABN ‏المعدل المشتق من 873 والذي يستخدم في بعض‎ ‏وتقود عناصر إجماع لاثنين متداخلين من الصدمات الحرارية؛ 47 أو‎ (TATA ‏يحتوي صندوق‎ ‏نيكليوتيد (معتمداً على مرجعية الجديلة) التتابع القريبة بالفعل من موقع بدء النسخ؛ التي يمكن‎ 87 ٠ ‏على سبيل‎ ١ ‏نيكليوتيد (انظر شكل‎ ٠١٠-١٠١٠١١5 ‏الإشارة إليها هنا كإكسون 011ل200؛ وإنترون‎
Zea ‏المشتق من أنواع‎ (ubiquitin) ‏وربما تبرز بدائل أخرى لمعزز الذرةٍ اليوبيكويتن‎ «(JE ‏المتكون من‎ MNP ‏68>تتابع عالية البقاء حول عنصر‎ mays ‏ل‎ genotypes ‏والأنواع الوراثية‎ ‏وعناصر مجتمعة ضد الاتجاه للصدمة الحرارية. وبذلك يتم توضيح تجسيمات‎ TATA ‏عنصر‎ ‎SEQ ID NO: ‏(متلء‎ )-200 nt) ‏الاختراع بالأمثلة باستخدام تلك المنطقة عالية البقاء القصيرة‎ ve ‏لمعزز 5011لا207 كعنصر قلب معزز أدنى لإنشاء معززات نبات ثنائية الاتجاه مخلقة.‎ (1 ‏كالمستخدم هنا في أدوات التنكير والتعريف فإنها تشمل مرجعيات جمع إلا إذا كان السياق يملي‎ ‏إلى غير ذلك بوضوح وبدون لبس فيه.‎ ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح "تزاوج تبادلى 58001055109 " إلى عملية والتي فيها يتخطى‎
Jia ‏على سبيل‎ ¢ parents ‏راجعاً إلى أحد الأبوين‎ hybrid progeny ‏المُولد ذرية الهجين‎ ٠ parental ‏مع واحد من الأنواع الوراقية الأبوية‎ F1 generation hybrid ‏أول جيل مهجن‎ hybrid ‏الهجين‎ F1 ‏ل‎ genotypes ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح "إنترون" إلى أي تتابع حمض نووي مشتمل في جين (أو تتابع‎ ‏نيكليوتيد معبر عنها للفائدة) التي يتم نسخها ولا يتم ترجمتها. يكون الإنترون مختلف عن نهاية‎ ‏تتابع‎ Introns ‏لا يتم اعتبارها كجزء من جين. تشمل الانترونات‎ Cua ‏بتتابع غير مترجمة قائدة‎ YO ‏ملا‎
1+ ‎(ass‏ نووي ‎nucleic acid sequence‏ غير مترجمة ‎untranslated‏ خلال تتابع ‎DNA‏ ‏معبر عنهاء بالإضافة إلى التتابع المقابل ‎corresponding sequence‏ .في جزيئات ‎RNAS molecules‏ المنسوخة من ذلك. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "معزول ‎"isolated‏ إلى مكون حيوي ‎biological component‏ ° (مشتملاً على حمض أو بروتين) قد تم فصله فعلياًء تم إنتاجه ‎(ope‏ تنقيته بعيداً عن المكونات البيولوجية ‎biological components‏ الأخرى في خلية اا66 الكائن ‎organism all‏ التي فيها يحدث المكون ‎component‏ بصورة طبيعية (أي ‎RNA 3 DNA‏ الكروموسومي ‎chromosomal‏ ‏والفوق كروموسومي ‎cextra-chromosomal‏ والبروتينات)؛ بينما تؤثر على تغير وظيفي ‎functional change‏ أو كيميائي في المكون ‎component‏ (مثل؛ ربما يتم ‎Jie‏ الحمض ‎٠‏ النووي من كروموسوم ‎chromosome‏ بكسر الروابط الكيميائية ‎chemical bonds‏ التي تربط الحمض النووي إلى ‎DNA‏ المتبقي في الكروموسوم). يشمل جزيئات الحمض النووي ‎nucleic‏ ‎acid molecules‏ والبروتينات التي قد تم "عزلها" جزيئات حمض نووي وبروتينات تم تنقيتها بواسطة طرق التنقية القياسية ‎standard purification methods‏ ويحتوي أيضاً المصطلح 'معزول ‎"isolated‏ إلى الأحماض النووية والبروتينات المعدة بواسطة التعبير المؤتلف في خلية ‎Vo‏ المضيف ‎host cell‏ ؛ بالإضافة إلى جزيئات الحمض النووي المخلق كيميائياً؛ والبروتينات؛ والببتيدات ‎peptides‏ ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'التعبيرالجيني” إلى عملية بها يتم تحويل المعلومات المرمزة ‎coded information‏ على وحدة النسخ للحمض النووي (مشتملاً؛ ‎Sie‏ اللا الجينومي ‎(genomic‏ إلى جزء عملي أو جزء غير عملي أو جزء تركيبي ‎part‏ 5171010181 من الخلية ‎cell‏ ‎٠‏ ء ‎We‏ مشتملاً على تخليق البروتين. يمكن أن يتم حث التعبير الجيني بالإشارات الخارجية ‎external signals‏ ؛ على سبيل ‎(JB)‏ تعرض خلية؛ أو نسيج؛ أو كائن حي إلى العامل الذي يزيد أو يقلل من التعبير الجيني. ويمكن أيضاً للتعبير للجين أن يتم تنظيمه في أي مكان في الطريق من ‎DNA‏ إلى ‎RNA‏ إلى بروتين. ويحدث تنظيم التحكم الجيني على سبيل المثال خلال التحكمات التي تحدث على النسخ؛ والترجمة؛ ونقل ‎(RNA‏ والمعالجة؛ وتفسخ الجزيئات الوسطية ‎«MRNA (fie Yo‏ أو من خلال التنشيط ‎activation‏ ؛ أو الإخماد ‎inactivation‏ ؛ أو التقسيم ملا
الا ‎compartmentalization‏ « أو تفسخ ‎degradation‏ جزيئات البروتين الخاصة بعد بعد ما تم صناعتهم؛ أو بمجموعات من ذلك كله. ويمكن أن يتم قياس التعبير الجيني عند مسترى ‎RNA‏ ‏أو مستوى البروتين بواسطة أي طريقة معروفة في المجال؛ مشتملاً على وليس الحصر تبقيع نورثرن ‎(RT-PCR; « Northern blot‏ وتبقيع ويسترن ‎Western blot‏ « أو فحص 0 أوفحوصات نشاط البروتين في خارج الخلايا الحية ‎vitro‏ ؛ أو في مكانها ‎situ‏ أو في داخل الخلايا الحية ‎Vivo‏ ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح "إسكات جين على أساس التجانس ‎homology—based gene‏ ‎(HBGS) "silencing‏ إلى مصطلح عام الذي يشمل كل من إسكات الجين النسخي واسكات الجين بعد النسخي ‎posttranscriptional‏ ويمكن أن ينتج إسكات مكان الهدف ‎target locus‏ - بواسطة مكان إسكات غير مرتبط من تثبيط النسخ (إسكات الجين النسخي ‎transcriptional‏ ‎gene silencing‏ ؛ ‎(TGS‏ أو تفسخ ‎MRNA‏ (إسكات الجين بعد النسخي؛ ‎(RTGS‏ مدينة بإنتاج ‎RNA‏ المزدوج الجديلة ‎(dsRNA)‏ متناظر للمعزز أو تتابعات منسوخة كل على حدى. ويقترح اشتمال المكونات الخلوية المميزة في كل عملية أن ال165 ‎PTGS;‏ التي يسببها ‎dSRNAY‏ تنتج من تنويع آلية مشهورة قديمة. بالرغم من أنه تعد المقارنة الدقيقة ما بين ‎TGS‏ ‎Vo‏ و0165 صعبة التحقيق بسبب أنها تعتمد عامة على تحليل أماكن الإسكات ‎Sead)‏ ويمكن لمكان الجين المتحور الواحد أن يتم توضيحه ليحفز كل من ‎PTGS, TGS‏ مدينة إلى إنتاج ‎dsRNA‏ المتناظر للمعزز والتتابعات المنسوخة للجينات المستهدفة المختلفة. انظر على سبيل المثال 225:365-79 ‎Mourrain et al. (2007) Planta‏ إنها أكثر أن عد ‎siRNAs‏ ‏الجزيئات الحقيقية التي تحفز 165 ‎PTGS;‏ على التتابعات المتجانسة: يحتمل أن تحفز ‎٠‏ ال5ظلظة 5 في هذا النموذج إسكات واضافة الميثيل ‎methylation‏ _لتتابعات متجانسة في سيس وفي ترانس خلال انتشار إضافة الميثيل في الجين المتحور إلى المعزز الداخلي ‎endogenous‏ ‎.promoter‏ ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح ”جزئ حمض نووي” (أواحمض نووي” أو "بولي نيوكليوتيد") إلى هيئة البوليميرية ‎cpolymeric form‏ التي ربما تشتمل كل من جديلات ‎RNA strands‏ في ‎Yo‏ اتجاه وعكس اتجاه ‎DNA «cDNA 5 mull‏ الجينوم؛ والأشكال المخلقة ‎synthetic forms‏ ملا
م والبوليميرات المختلطة ‎Mixed polymers‏ من السابق. وربما يشير النيكليوتيد إلى ريبونيوكليوتيد ‎ribonucleotide‏ ؛ أو دي أوكسي ريبونيوكليوتيد ‎deoxyribonucleotide‏ ؛ أو شكل معدل ‎modified form‏ من أي نوع من النيوكليوتيد. ويستخدم ”"جزئ الحمض النووي" هنا كمترادف ل"الحمض النووي" و"البولي نيوكليوتيد”. ويتكون الحمض النووي ‎We‏ على الأقل من ‎٠١‏ قواعد في © الطولء ما أن يذكر غير ذلك. ‎Lay‏ يشير المصطلح إلى جزئ ‎RNA‏ أو ‎DNA‏ غير محدد الطول. ويشمل المصطلح ‎DNAN cilia‏ المفرد الجديلة ‎single‏ أو المزدوج الجديلة ‎double-stranded‏ وربما يشمل جزئ الحمض النووي ‎nucleic acid molecule‏ على إما أو كل من النيوكلوتيدات المعدلة ‎modified nucleotides‏ والتي تحدث طبيعياً والمتصلة ببعضها بواسطة روابط نيوكليوتيد طبيعية الحدوث و/ أو غير طبيعية الحدوث.
‎٠‏ _ربما يتم تعديل جزيئات الحمض النووي كيميائياً أو بيوكيميائياً. أو ربما يحتوي قواعد نيوكليوتيد ‎nucleotide bases‏ غير طبيعية ‎non-natural‏ أو مشتقة ‎derivatized‏ كالذي سوف يتم اختصاره بالفعل من هؤلاء من ذوي المهارة في المجال. وتشتمل مثل هذه التعديلات على سبيل ‎JE‏ على علامات ترقيمية ‎labels‏ « أو إضافة الميثيل ‎methylation‏ « أوتبديل واحد أو أكثر من النيوكليوتيدات الطبيعية الحدوث بمتمائل؛ أو تعديلات بين النيوكليورتيدات ‎internucleotide‏
‎modifications ١٠‏ (مثل؛ الروابط ‎pall‏ مشحونة ‎uncharged linkages‏ على سبيل المثال؛ الميتيل فوسفات ‎methyl phosphonates‏ ؛ وفوسفوتراي استرات ‎phosphotriesters‏ « والفوسفوأميدات ‎phosphoramidates‏ « والكربامات ‎carbamates‏ ؛ وهكذا؛ والروابط المشحونة ‎:charged linkages‏ على سبيل المثال» فوسفوروثيوات ‎phosphorothioates‏ « والفسفورود ايقيوات ‎phosphorodithioates‏ ؛ وهكذا؛ وأشطار معلقة ‎pendent moieties‏ فيها:
‎Ji ‏؛ والمقحمات 1716081810+5: على سبيل‎ peptides ‏على سبيل المثال: الببتيدات‎ Yo ‏؛ والعوامل القلوية‎ chelators ‏؛ وهكذا؛ والخالبات‎ psoralen ‏وسورالين‎ » acridine ‏اكريدين‎ ‏أحماض نووية‎ (JED ‏على سبيل‎ : modified linkages ‏؛ والروابط المعدلة‎ alkylators ‏؛ هكذا). ويشمل‎ alpha anomeric nucleic acids ‏للمصاوغ الكربونيلى فى الموضع الفا‎ ‏على أي تكيف طوبولوجي‎ La" nucleic acid molecule ‏المصطلح ”جزئ الحمض النووي‎
‎¢ single-stranded ‏؛ مشتملة على تكيفات أحادي الجديلة‎ topological conformation Yo
‏ملا
4+ وثنائي الجديلة» ومضاعف ‎SB‏ جزئياً ‎partially duplexed‏ « ومضاعف ثلاثي جزئياً ‎Ay « triplexed‏ شكل دبوس الشعر ‎circular aay « hairpinned‏ ؛ والمقفلة ‎.padlocked‏ ‏يجرى النسخ في اتجاه نمط من "5 إلى '3 بطول جديلة الظلاانا. ويعني هذا أن ‎RNA‏ مصنوعة © بواسطة ‎LEH Ala)‏ من ريبونيوكليوتيد “5 -تراي فوسفات ‎ribonucleotide‏ -5- ‎J) triphosphates‏ النهاية 3 من السلسلة المتكونة (مع النهاية الضرورية للبيروفوسفات ‎Ly, (pyrophosphate‏ تشير العناصر المنفصلة في أي من جزئ الحمض النووي الخطي ‎linear‏ الدائري ‎(Jig) circular‏ تتابعات نيوكليوتيد خاصة) إلى أن تكون ‎am’‏ الاتجاه" بالتناسب إلى عنصر أخر لو كانوا مرتبطين أو ربما تكون مرتبطة إلى نفس الحمض النووي في اتجاه 5 من هذا العنصر. ومشابهاً لذلك ربما تكون العناصر المنفصلة 'في فى نفس الاتجاه" بالتناسب إلى عنصر أخر لو كانوا مرتبطين أو ربما يتم ارتباطهم بنفس الحمض النووي في اتجاه '3 من هذا العنصر. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "موضع القاعدة ‎J)" base position‏ مكان قاعدة معينة ‎given‏ ‎J base‏ باقي النيوكليوتيد خلال حمض نووي مصمم. وربما يتم التعرف على الحمض النووي ‎Vo‏ المصمم بالمحاذاة (انظر أدناه) مع الحمض النووي بمرجعية. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "تهجين ‎hybridization‏ " إلى عملية التي ‎led‏ يتهجن السلاسل القليلة من النيوكليوتيدات وأمثالها عن طريق الرابطة الهيدروجينية ‎hydrogen bonding‏ ؛ التي تشتمل واطسن -كريك ‎((Watson—Crick)‏ أو هوجستين ‎((Hoogsteen)‏ أو هوجستين العكسي ‎(reversed Hoogsteen)‏ للرابطة الهيدروجينية ما بين قواعد مكملة. وبصفة عامة يتكون ‎Yo‏ جزيئات الحمض النووي من قواعد نيتروجينية ‎nitrogenous bases‏ والتي إما من البريميدينات (سيتوزين ‎cytosine‏ ()؛ يوراسيل ‎uracil‏ (لا)؛ وثايمين ‎thymine‏ (1)) أو البيورينات ‎purines‏ (أدينين ‎(A) adenine‏ وجوانين ‎guanine‏ (©)). وتكون هذه القواعد النتروجينية روابط هيدروجينية ما بين البيريميدين والبيورين» ويشير الترابط ما بين البريميدين 0686 والبيورين ‎purine‏ إلى 'تزاوج القواعد ‎base pairing‏ ". وبشكل خاص أكثر ‎A‏ ‎Yo‏ سوف ترتبط هيدروجينياً ‎To‏ أو ‎GU‏ سوف ترتبط ب©. ويشير "المكمل” إلى تزاوج القواعد الذي ملا
مو يحدث ما بين تتابعي معروفتين اثنتين للحمض النووي أو منطقتين معروفتين اثنتين لنفس تتابع الحمض النووي. كالمستخدم هنا تشير المصطلحات 'من الممكن تهجينه بشكل خاص” وامكمل بشكل خاص” إلى درجة كافية من التكامل مثل هذ الترابط الخاص والثابت يحدث ما بين قليل من النيوكليوتيد © والظللة أو ‎DNA‏ المستهدف. ولا تحتاج سلسلة النيوكليوتيد القليلة أن تكون ‎96٠0٠0‏ متكاملة إلى التتابع المستهدفة لها لكي تكون من الممكن تهجينها بشكل خاص. وتتدخل سلسلة النيوكليوتيد القليلة التي من الممكن تهجينها بشكل خاص عندما ترتبط سلسلة النيوكليوتيد القليلة إلى جزئ ‎RNA, DNAY‏ المستهدف مع الوظيفة الطبيعية لل/لا0 المستهدف أو ‎RNA‏ المستهدف؛ وهناك درجة كافية من التكامل لتجنب الترابط الغير خاص لسلسلة النيوكليوتيد القليلة إلى تتابعات ‎٠‏ غير مستهدفة تحت الظروف التي فيها يُعد الترابط الخاص مرغوباً؛ على سبيل المثال تحت الظروف الفسيولوجية ‎Physiological conditions‏ في حالة الفحوصات داخل الخلايا الحية أو الأنظمة. ويشار إلى مثل هذا الترابط كونه تهجين خاص. سوف تختلف ظروف التهجين التي تؤدي إلى درجات ‎degrees‏ خاصة من الصرامة معتمدة على طبيعة طريقة التهجين ‎hybridization method‏ المختارة وتركيبة وطول تتابعات الأحماض ‎١‏ النووية المهجنة. بصفة عامة سوف تساهم درجة الحرارة ‎temperature‏ للتهجين والقوة الأيونية ‎ionic strength‏ (خاصة تركيز ‎Na+‏ و/ أو تركيز ‎(Mg2+‏ لمنظم التهجين ‎hybridization‏ ‏)آنا في صرامة التهجين؛ بالرغم من أن أوقات الغسيل ‎Leaf wash times‏ تؤثر في الصرامة ‎stringency‏ وقد تم شرح الحسابات التي تتعلق بظروف التهجين ‎hybridization conditions‏ المطلوبة للحصول على درجات خاصة من الصرامة في ‎Sambrook et al. (ed.),‏ ‎Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring ٠٠‏ ‎Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, chs. 9‏ ‎.and 11‏ كالمستخدم هنا يشمل المصطلح "ظروف الصارمة ‎"stringent conditions‏ الظروف التي تحتها ‎Cage‏ تحدث التهجين فقط لو كان هناك أقل من 9650 متصل ‎lal‏ ما بين جزئ التهجين ‎hybridization molecule Yo‏ وال/لانا المستهدف. وتشمل " الظروف الصارمة" على مستويات ملا
_— \ _ خاصة أكثر من الصرامة. وبذلك كالمستخدم هناء سوف لا يتم التهجين في ظروف "الصرامة المتوسطة ‎moderate stringency‏ " هي التي تحتها الجزيئات التي فيها أكثر من ‎٠‏ 965 متصل ‎sadly‏ وسوف لا يتم التهجين في ظروف من "الصرامة العالية ‎high stringency‏ " التي فيها تتابعات بأكثر من 9670 اتصال بالخطاً؛ وظروف "الصرامة العالية ‎las‏ هي تلك التي ‎led‏ ‏© تتابعات بأكثر من ‎96٠0‏ اتصال بالخطأً والتي لا يتم ‎led‏ التهجين. في تجسيمات خاصة يمكن للظروف الصارمة أن تشمل التهجين عند 15 درجة مئوية؛ وتالياً لذلك بعمليات غسيل عند 10 درجة مئوية ب505 556/0.196 0.1% لمدة £4 دقيقة. وتعد ‎Jl‏ ظروف تهجين ممثلة غير قاصرة: صرامة عالية جداً: التهجين في محلول منظم ‎5X SSC buffer‏ عند 15 درجة مئوية لمدة ‎٠١‏ room ‏في درجة حرارة الغرفة‎ 2X SSC ‏الغسل في محلول منظم‎ Lhe ‏ساعة؛ وتتم‎ ٠ 0.5«* ‏في محلول منظم‎ wash ‏دقيقة لكل واحدة؛ وتتم عملية الغسل‎ Yo ‏لمدة‎ temperature ‏دقيقة لكل واحدة.‎ ٠٠ ‏عند 15 درجة مثوية لمدة‎ SSC
Yo) ‏عند 0-75 درجة مئوية لمدة‎ 5X-6X SSC ‏صرامة عالية: التهجين في محلول منظم‎ ‏دقيقة‎ 7 ١-ه‎ sad ‏في درجة حرارة الغرفة‎ 2X SSC ‏ساعة؛ وتتم عملية الغسل في محلول منظم‎ ١ ٠ ‏لمدة‎ a she ‏درجة‎ Y.—00o ‏عند‎ 17» SSC ‏عملية الغسل في محلول منظم‎ als ‏لكل واحدة؛‎ Yo ‏دقيقة لكل واحدة.‎ ‏الغرفة إلى 00 درجة مئوية‎ sha ‏في درجة‎ 6X SSC ‏صرامة متوسطة: التهجين في محلول منظم‎ ‏في‎ 27-3«* SSC ‏ساعة؛ وتتم عملية الغسل على الأقل مرتين في محلول منظم‎ 70-١7 ‏لمدة‎ ‏؟ دقيقة لكل واحدة.‎ >-٠١ ‏درجة مئوية لمدة‎ oo ‏درجة حرارة الغرفة إلى‎ ‎Ka ٠٠‏ أن يتبقى في بعض التجسيمات الخاصة جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين صرامة عالية جداً. ويمكن أن يتبقى في تلك التجسيمات وغيرها جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين صرامة عالية جداً. ‏دما
وه وربما يمكن أن يتبقى في تلك التجسيمات وغيرها جزيئات الحمض النووي الممكن تهجينها بخاصة مرتبطة تحت ظروف تهجين متوسطة الصرامة. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "قليل النيوكليوتيد ‎"oligonucleotide‏ إلى بوليمير ‎polymer‏ ‏حمض نووي قصير. وربما يتم تكوين قليل النيوكليوتيدات بكسر ‎cleavage‏ أجزاء الأحماض ‎oo‏ النووية الطويلة؛ أو ببلمرة ‎polymerizing‏ المواد السابقة للنيوكليوتيد الفردي. وتسمح المخلقات الآلية ‎Automated synthesizers‏ بتخليق قليل النيوكليوتيدات إلى العديد من مئات أزواج القواعد ‎base pairs‏ في الطول. ‎lays‏ يتم استخدام قليل النيوكليوتيد كمجسات للكشف عن الهلا والظل!»_لأنها_ربما ترتبط إلى تتابع نيوكليوتيد مكمل. ‎lays‏ يتم استخدام قليل النيوكليوتيدات . المتكون .من ال8ل08 . (أوليجو دي أوكسي. ريبونيوكليوتيدات ‎(oligodeoxyribonucleotides | ٠‏ في ‎«PCR‏ والذي يُعد تقنية لتضخيم تتابعات ‎DNA‏ الصغيرة. وفي ‎PCR‏ تشير قليل النيوكليوتيد بشكل نموذجي إلى "البادئ” الذي يسمح ‎DNAT‏ بوليميراز ‎polymerase‏ ليطيل من قليل النيوكليوتيد وينسخ الجديلة المكملة ‎.complementary strand‏ كالمستخدم هنا يشير المصطلح ‎Cay pd‏ التتابع” أو "التعريف” إلى سياق فيه ربما تشير تتابعي حمض نوي اثنتين أو بولي ببتيد ‎polypeptide‏ اثنتين إلى المتبقي من التتابعي الاثنتين واللتان ‎١‏ يُعدا نفس التتابعي عندما يتم التراص لأجل تطابق أقصى على شباك مقارنة خاص. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "نسبة تعريف التتابع" إلى القيمة التي يتم تحديدها بمقارنة تتابعي بمحاذاة قصوى (مثل؛ تتابعات حمض نووي ‎nucleic acid sequences‏ ؛ وتتابعات حمض أميني ‎(amino acid sequences‏ من خلال شباك مقارنة حيث ‎la)‏ يضم جزء التتابع في شباك المقارنة على إضافات أو حذوفات (أي؛ فجوات ‎(gaps‏ بالمقارنة إلى التتابع المرجعية (التي ‎٠‏ لا تضم إضافات أو حذوفات) لأجل تراص أقصى للتتابعي الاثنتين. ويتم حساب النسبة بتحديد رقم المواضع التي عندها يحدث النيوكليوتيد المطابق أو متبقى الأحماض النووية في كلا المتواليتن لإنتاج عدد من المواضع المتصلة؛ وبقسمة رقم مواضع الاتصال على الرقم الكلي للمواضع في شباك المقارنة؛ ويتم ضرب النتيجة في ‎٠٠١‏ لإنتاج النسبة المثوية لتعريف التتابع. ملا
اسه وتعد الطرق لتراص التتابعات للمقارنة معروفة جيداً في المجال. ويتم توضيح البرامج ولوغاريتمات التراص في على سبيل المثال: ‎Smith and Waterman (1981) Adv.
Appl.‏ ‎Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J.
Mol.
Biol. 48:443;‏ ‎Pearson and Lipman (1988) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
U.S.A. 85:2444;‏ ‎Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) ©‏ ‎CABIOS 5:151-3; Corpet etal. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90;‏ ‎Huang et al. (1992) Comp.
Appl.
Biosci. 8:155-65; Pearson etal. (1994)‏ ‎Methods Mol.
Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol.‏ ‎.Lett. 174:247-50‏ ويمكن أن يوجد اعتبار مفصل لطرق التراص للتتابع وحسابات التجانس ‎Altschul et al. (1990) J.
Mol.
Biol.
Sis homology calculations A‏ 215:403-10. يُتاح المركز القومي للمعلومات الحيوية التكنولوجية ‎National Center for Biotechnology‏ ‎Altschul <BLAST™) Basic Local Alignment Search Tool (NCBI) Information‏ ‎(et al. (1990)‏ من العديد من ‎plead)‏ بما في ذلك المركز القومي للمعلومات الحيوية ‎١‏ التكنولوجية ‎(Bethesda, MD)‏ وعلى شبكة الإنترنت؛ للاستخدام ‎Lad‏ يتعلق بالعديد من برامج تحليل التتابعات. يُتاح وصف لكيفية تحديد تطابق تتابع مستخدمًا هذا البرنامج على الإنترنت بموجب القسم 'مساعدة" ل "818517. من أجل مقارنات وظيفة تتابعات الحمض النووي؛ فإنه يمكن استخدام وظيفة 'تتابعات 2 ‎‘Blast‏ لبرنامج ‎(Blastn) BLAST™‏ مستخدماً المتغيرات الافتراضية. سوف تؤدي تتابعات الحمض النووي ذات التشابه الأكبر للتتابعات المرجعية إلى نسبة ‎٠‏ تطابق زائدة عند قياسها بهذه الطريقة. كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'مرتبط عملياً” إلى سياق حيث يكون تتابع الحمض النووي الأولي مرتبطة عملياً بتتابع الحمض النووي الثانية عندما يكون تتابع الحمض النووي الأول في علاقة مع تتابع الحمض النووي الثانية. فعلى سبيل المثال؛ يكون المعزز مرتبط عملياً بتتابع الترميز عندما يؤثر المعزز على النسخ أو التعبير لتتابع الترميز. وعندما تنتج بإعادة الالتثام؛ فإنه تعد تتابعات ‎YO‏ الأحماض النووية المرتبطة عملياً بصفة عامة متماس وحيث يكون من الضروري لربط منطقتين م1
وه اثنتين لترميز البروتينات في نفس إطار القراءة. بالرغم من أنه لا تحتاج العناصر أن تكون متماسة لكي تكون مرتبطة عملياً. كما هو مستخدم في هذه الوثيقة يشير المصطلح ‎"jad‏ إلى منطقة من ‎DNAY‏ التي تقع بصفة عامة ضد الاتجاه (في اتجاه منطقة '5 من الجين) التي يتم احتياجها في عملية النسخ. وربما تتيح 0 المعززات التنشيط الكافي أو كبت ‎gall‏ التي تتحكم فيه. ‎lays‏ يحتوي المعزز على تتابعات خاصة التي يتم معرفتها بواسطة عوامل النسخ. وتلك العوامل ربما ترتبط إلى تتابعات معزز الهلا وتؤدي إلى إعادة توظيف الظلاا» بوليميراز» والذي عبارة عن إنزيم يخلق ‎RNA‏ من منطقة الترميز ‎coding region‏ للجين. كالمستخدم هنا يشير المصطلح "يحول ‎"transforms‏ أو 'يقوم بتنبيغ ‎transduces‏ " إلى عملية ‎٠‏ حيث ينقل الفيروس أو الناقل ‎vector‏ جزيئات الحمض النووي إلى الخلية. والخلية التي "يتم تحويلها" بواسطة جزئ حمض نووي "يتم نقله" إلى الخلية عندما يصبح جزئ الحمض النووي يمكن مضاعفته بثبات بواسطة الخلية؛ إما بواسطو دمج جزئ الحمض النووي إلى جينوم خلوي ‎cellular‏ ‎genome‏ أو بمضاعفة يصبوغية ‎episomal replication‏ (جرثومية). وكالمستخدم هنا يشمل المصطلح 'تحويل” كل التقنيات التي بيها يمكن لجزئ الحمض النووي إدخاله في مثل هذه الخلية. ‎Vo‏ وتشمل ‎AEN‏ وليس الحصر: تقل ‎sold)‏ الوراثقية بنواقل فيروسية ‎viral vectors‏ ؛ وتحويل باستخدام نواقل بلازميدية ‎plasmid vectors‏ ؛ وعملية كهربية ‎(Fromm et electroporation‏ ‎cal. (1986) Nature 319:791-3)‏ ونقل الشحم ‎(Felgner et al. lipofection‏ ‎cally ¢(1987) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 84:7413-7)‏ المجهري ‎¢(Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85) microinjection‏ ونقل بوساطة أجروباكتيريم ‎¢(Fraley et al. (1983) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 80:4803-7) ٠‏ وارتشاف ‎DNAD‏ المباشر؛ وتحويل بوساطة ويسكرز ‎whiskers—mediated transformation‏ « وانفجار بمقذوف مجهري ‎(Klein et al. (1987) microprojectile bombardment‏ ‎Nature 327:70)‏ كالمستخدم هنا يشير المصطلح "جين معدل وراثياً” إلى تتابع حمض نووي خارجية. في مثال واحد؛ ‎Why dad gel Yo‏ هو تتابع جين ‎Ji)‏ جين مقاوم لمبيدات الأعشاب ملا
هه ‎(herbicide-resistance gene‏ وجين يشفر لمركب مفيد صناعياً أو صيدلياً؛ أو جين يشفر لصفة مرغوبة زراعياً. وفي مثال أخرء يعد الجين المعدل وراثياً تتابع حمض نووي ضد الإحساس؛ حيث يثبط التعبير عن منوالية الحمض النووي ضد الإحساس تعبير تتابع الحمض النووي المستهدف. وربما يحتوي الجين المعدل وراثياً على تتابعات تنظيمية مرتبطة عملياً بالجين المعدل ‎Sg) Ty 5‏ معزز). وفي بعض التجسيمات يعد الجين المعدل وراثياً عبارة عن تتابع حمض نووي للفائدة. بالرغم من إنه في تجسيمات أخرى يعد تتابع الحمض النووي للفائدة تتابع حمض نووي داخلي؛ حيث تكون النسخ الإضافية من الجينوم لتتابع الحمض النووي الداخلية مرغوبة؛ أو تتابع الحمض النووي التي تكون في اتجاه ضد الإحساس مع الأخذ في الاعتبار إلى تتابع جزئ الحمض النووي المستهدف في ‎AK‏ الحي المضيف ‎host organism‏ ‎٠‏ كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'ناقل" إلى جزئ حمض نووي يمكن إدخاله إلى الخلية؛ وبذلك يتم إنتاج خلية متحولة ‎transformed cell‏ وربما يشمل الناقل على تتابعات حمض نووي تُتيح لها المضاعفة في الخلية المضيفة؛ حيث تكون ‎dual‏ المضاعفة. وتشمل الأمثلة على وليس الحصرء بلازميد ‎plasmid‏ ؛ أو كوزميد ‎cosmid‏ ؛ وباكتيريوفاج ‎bacteriophage‏ « أو فيروس ‎Virus‏ ‏الذي يحمل ‎DNA‏ خارجي إلى داخل خلية. ويمكن أيضاً للناقل أن يشمل على واحد أو أكثر من ‎Vo‏ الجينات؛ و/ أو جزيئات مضادة للانتساخ ‎antisense molecules‏ و/ أو جينات واصمة منتقاه ‎selectable marker genes‏ ووالعناصر الجينية الأخرى المعروفة في المجال. وربما ينقل؛ أو يحول؛ أو يصيب الناقل الخلية؛ وبذلك يجعل الخلية تعبر عن جزيئات الحمض النووي و/ أوالبروتينات المرمزة ‎proteins encoded‏ بواسطة الناقل. ‎Lays‏ يشمل الناقل اختيارياً على المواد التي تساعد على تحقيق دخول جزئ الحمض النووي ‎nucleic acid molecule‏ إلى داخل الخلية ف (مثلاًء ليبوسوم ‎.(liposome‏ ‏كالمستخدم هنا ‎Jody‏ المصطلح "نبات" على النباتات وأجزاء النبات ‎plant parts‏ مشتملاً وليس الحصر على ‎WIA‏ النبات وأنسجة النبات ‎Jie‏ الأوراق ‎leaves‏ ؛ والسيقان ‎stems‏ « والجذور ‎roots‏ « والأزهار 5 + وحبوب اللقاح ‎pollen‏ ؛ والبذور 56605. ويُعد صنف النباتات التي يمكن استخدامها في الاختراع الحالي بصفة عامة بشكل واسع كصنف النباتات الأعلى أو ‎vo‏ الأقل ‎All‏ من الممكن تعرضها للطفرة ‎mutagenesis‏ مشتملة على كاسيات البذور
(نباتات مونوكوتيليدونس ‎monocotyledonous‏ وداي كوتيليدونس ‎«(dicotyledonous‏ وعاريات البذور ‎gymnosperms‏ » والسرخسيات ‎ferns‏ والطحالب متعددة الخلايا ‎multicellular algae‏ وبذلك تشمل "نبات" على نباتات مونوكوتيليدونس ونباتات
داي كوتيليدونس. وتشمل أمثلة نباتات داي كوتيليدونس على التبغ ‎tobacco‏ ؛ وأرابيدوبسيس
‎Arabidopsis ©‏ ؛ وفول الصويا ‎soybean‏ ؛ والطماطم ‎tomato‏ ؛ والبابايا ‎papaya‏ ؛ والكانولا ‎canola‏ « والقطن ‎cotton‏ ؛ وعباد الشمس ‎sunflower‏ ؛ والبرسيم ‎«alfalfa‏ والبطاطس ‎potato‏ ؛ والعنب ‎grapevine‏ » والبسلة ‎pigeon pea‏ ؛ والبازلاء ‎pea‏ ؛ والكرنب ‎Brassica‏
‎٠‏ والحمص ‎chickpea‏ ؛ وبنجر السكر ‎sugar beet‏ ؛ وبذور اللفت ‎rapeseed‏ ؛ والبطيخ ‎watermelon‏ ؛ والشمام ‎melon‏ ؛ والفلفل ‎pepper‏ ؛ والفول السوداني ‎peanut‏ « والقرع
‎« broccoli ‏؛ والبروكلي‎ squash ‏والكوسا‎ « spinach ‏؛ والسبانخ‎ radish ‏؛ والفجل‎ 0000001600 | ٠ ‏والكرنب‎ » celery ‏؛ والكرفس‎ cauliflower ‏؛ والقرنبيط‎ carrot ‏؛ والجزر‎ cabbage ‏والملفوف‎ ‏والباذنجان 69901801 ؛ والخس‎ ¢ cucumber ‏والخيار‎ Chinese cabbage ‏الصيني‎ ‏وقصب السكر‎ rice ‏والأرز‎ » corn ‏وتشمل أمثلة نباتات مونوكوتيليدونس على الذرة‎ lettuce ‏؛ وبساتين الفاكهة‎ sorghum ‏؛ والذرة الرفيعة‎ rye ‏والجاودار‎ » barley ‏؛ والشعير‎ sugarcane
‎orchids Vo‏ ؛ والخيزران ‎bamboo‏ « والموز ‎banana‏ ؛ وأعشاب الأحواض ‎cattails‏ ؛ والزنابق ‎lilies‏ ؛ والشوفان 081 ؛ والبصل ‎onion‏ ؛ والذرة العويجة ‎millet‏ (دخن)؛ والتريتيكال ‎triticale‏ ‏كالمسنخدم هنا يشير المصطلح ‎sal‏ نبات ‎plant material‏ " إلى الأوراق» والسيقان» والجذورء والأزهار» أو أجزاء الزهرة؛ والفاكهة؛ وحبوب اللقاح؛ والبويضات ‎egg cells‏ ؛ وخلايا الزيجوت ‎zygotes‏ والبذور؛ والقصاصات ‎cuttings‏ ؛ استنباتات الخلايا أو الأنسجة؛ أو أي جزء أو
‎leaf ‏أو ورقة‎ cotyledon ‏النبات على كوتيليدون‎ sale ‏منتج نبات. وفي بعض التجسيمات يشمل‎ Yo ‏إلى آلية عند نهاية جين تسمح بالترجمة لجين‎ engl ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح 'مفتاح‎
‏حالي في فى نفس الاتجاه. ويمكن لآلية مفتاح الترجمة أن يتم توظيفه عند مستوى الحمض النووي
‎eukaryotic internal ‏سبيل المثال؛ مكان دخول الريبوسوم الداخلي لحقيقيات النواة‎ Je)
‎alternative ‏أو مكان تضفير بديل‎ ((IRES) viral ‏أو الفيروسى‎ ribosome entry site ‏أو مستوى ببتيد/ بروتين‎ (ribozyme cleavage site ‏أو مكان كسر ريبوزيم‎ «splicing site Yo
‏ملا
- (على سبيل ‎JE‏ ببتيد ‎QA‏ شبيه البببتيد ‎QA‏ أوببتيد إنتاين؛ أو مكان كسر البروتياز ‎.(protease cleavage site‏ تكون تلك الآليات لمحول ترجمة عند مستوى حمض نيكولوتيد أو عند مستوى ببتيد/ بروتين معروفة جيداً في الفن. انظرء على سبيل المثالء ‎li, Z., H.
M.
Schumacher, et al.‏ ‎J Biotechnol 145(1): 9-16; Chen, Y., K.
Perumal, et al. (2000) ©‏ )2010( ‎Gene Expr 9(3): 133-143; Dinkova, T.
D., H.
Zepeda, et al. (2005) Plant‏ ‎J 41(5): 722-731; Dorokhov, Y.
L., M.
V.
Skulachev, et al. (2002) Proc‏ ‎Natl Acad Sci U S A 99(8): 5301-5306; Fernandez-Miragall, 0. and C.‏ ‎Hernandez (2011) PLoS One 6(7): 622617: Groppelli, E., 6. J.
Belsham,‏ ‎etal. (2007) J Gen Virol 88(Pt 5): 1583-1588; Ha, 5. H., Y.
S.
Liang, et ٠‏ ‎al. (2010) Plant Biotechnol J 8(8): 928-938; Karetnikov, A. and K.
Lehto‏ ‎Lehto‏ .ا ‎J Gen Virol 83(Pt 1): 286-297; Karetnikov, A. and‏ )2007( ‎Virology 371(2): 292-308; Khan, M.
A., H.
Yumak, et al. (2009) J‏ )2008( ‎Biol Chem 284(51): 35461-35470; and Koh, D.
C., S.
M.
Wong, et al.‏ ‎Alls (2003) J Biol Chem 278(23): 20565-20573 ١‏ تم تضمين محتواها في هذه الوثيقة كمراجع. ووقد تم إفشاء بنايات التعبير المتعدد الجيني المحتوي إنتينات معدلة في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 7,073,577 ء و 7,751,530 بالإضافة إلى طلب براءة الاختراع الأمريكية 47 ‎٠٠١/١٠١7‏ ‏كالمستخدم هنا يشير المصطلح "علامة من الممكن انتقائها” أو "جين علامة من الممكن انتقائه" ‎Ye‏ إلى جين يتم استخدامه اختيارياً في تحويل النبات ‎eed‏ سبيل المثال؛ حماية ‎WDA‏ النبات من العامل المختار ‎selective agent‏ أو يمد بمقاومة/تحمل إلى العامل المختار ‎selective‏ ‏14. وتستقبل فقط هذه الخلايا أو النباتات علامة وظيفية من الممكن انتقائها والتي تعد قادرة على القسمة أو النمو تحت ظروف تشمل على عامل مختار. وتشمل أمثلة العوامل المختارة ‎selective agents‏ على سبيل المثال؛ المضادات الحيوية ‎antibiotics‏ ؛ والمشتملة على ‎Yo‏ سبيكتينوميسين ‎spectinomycin‏ » ونيوميسين 060017617 » وكاناميسين ‎kanamycin‏ « ذا
A
وباروميسين ‎paromomycin‏ ؛ وجنتاميسين ‎gentamicin‏ ¢ وهجيرومايسن ‎hygromycin‏ ‏وتشمل العلامات التي يمكن ‎WE‏ على جين لإنزيم نيوميسين فوسفوترانسفيراز ‎NEOMYCIN‏ ‎phosphotransferase‏ (١١001)؛‏ التي تعبر عن إنزيم ‎Jody enzyme‏ مقاومة ‎resistance‏ ‏إلى المضاد الحيوي ‎antibiotic‏ كاناميسين؛ والجينات للمضادات المتعلقة كالنيوميسين ‎neomycin ©‏ « والباروميسين؛ والجنتاميسين؛ ‏ و6418؛ ‏ أو_الجين الإنزيم هيجروميسين فوسفوترانسفيراز ‎(NPE)‏ التي تعبر عن إنزيم مشتمل على مقاومة للهيجرومايسين. ويمكن أن تشمل جينات يتم انتقائها أخرى على جينات ترميز ‎encoding‏ لمقاومة مبيد الأعشاب ‎herbicide‏ ‎resistance‏ مشتملة على بار ‎Bar‏ (مقاومة ‎aa‏ 551/8 (جلوفوسينات أمونيوم ‎«(glufosinate ammonium‏ أو فوسفينوترايسين ‎«((PPT) phosphinothricin‏ واسيتولاكتات ‎ALS) acetolactate synthase jin Ve‏ مقاومة ‏ ضد المثبطات ‎inhibitors‏ مثل سلفونيل يوريا ‎(USs) sulfonylureas‏ واميدازولينونات ‎«(IMIs) imidazolinones‏ وتراي زولوبيريميدينات ‎«(TPs) triazolopyrimidines‏ وبيريميدنيل أوكسيبنزوات ‎pyrimidinyl‏ ‎((POBs) oxybenzoates‏ وسلفونيل ‎sid‏ كربونيل تراي أزولينونات ‎sulfonylamino‏ ‎carbonyl triazolinones‏ التي تمنع الخطوة الأولى من تخليق الأحماض الأمينية متفرحة ‎١٠‏ السلسلة ‎amino acids‏ 51800080-0080)» والجليفوسات ‎«D-£.Y 5 « glyphosate‏ ومقاومة المعدن ‎metal resistance‏ أو الحساسية ‎sensitivity‏ ويشير المصطلح "علامة إيجابية ‎marker—positive‏ " إلى النباتات التي قد تم تحويلها لتشمل جين العلامة الذي من الممكن انتقائه. يمكن أن يتم دمج العديد من العلامات التي يمكن كشفها وانتقائها إلى ناقل التعبير المختار ليسمح ‎٠‏ بالتعرف وانتقاء النباتات المتحولة ‎transformed plants‏ ؛ أو المتحولين ‎transformants‏ ‏وهناك العديد من الطرق المتاحة للتأكد من التعبير لعلامات ‎markers‏ الانتقاء في النباتات المتحولة؛ والتي تشتنل على سبيل المثال توالي اللا( ‎PCRIs‏ (تفاعل سلسلة بوليميراز ‎«(polymerase chain reaction‏ وتبقيع ‎Southern blotting i$‏ « وتبقيع ‎«(RNAI‏ ‏والطرق المناعية ‎immunological methods‏ للكشف عن البروتين المعبر عنه من ‎BUN‏ ‎Sie vector Yo‏ البروتين المترسب ‎precipitated protein‏ الذي يتوسط لمقاومة فوسفوينوثرسين ملا
‎<phosphinothricin‏ أو بروتينات أخرى ‎Jie‏ جينات المسجل بيتا-جلوكرونيداز ‎«(GUS) B-glucuronidase‏ ولسيوفيراز ‎luciferase‏ ؛ وبروثين الضوء الأخضر ‎green‏ ‎(DsRedy (GFP) fluorescent protein‏ وبيتا -جالاكتوسيداز ‎B-galactosidase‏ « وكلورامفينيكول أسيتل ترانسفيراز ‎((CAT) chloramphenicol acetyltransferase‏ وألكالين © فوسفاتيز ‎alkaline phosphatase‏ ؛ وأمثال ذلك (انظر ‎Sambrook, et al., Molecular‏ ‎Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press,‏
‎-(N.Y., 2001‏ وتستخدم جينات العلامة التي من الممكن انتقائها لاختيار الخلايا المتحولة أو الأنسجة. وتشمل جينات العلامة التي من الممكن انتقائها على جينات مرمزة لمقاومة المضاد الحيوي؛ ‎Jie‏ هؤلاء ‎٠‏ المشفرين لإتزيم نيوميسين فوسفوترانسفيراز ‎(NEO) neomycin phosphotransferase ١١ ١١‏ وهيجروميسين فوسفوترانسفيراز ‎(HPT) hygromycin phosphotransferase‏ بالإضافة إلى جينات مائحة مقاومة لمركبات مبيدات الأعشاب ‎herbicidal compounds‏ وترمز جينات مقاومة لمبيد الأعشاب ‎Herbicide resistance genes‏ بصفة عامة لبروتين معدل مستهدف غير حساس إلى مبيد الأعشاب ‎herbicide‏ أو لإنزيم ‎enzyme‏ الذي يحلل أو يزيل سمية ‎detoxifies ١٠‏ مبيد الأعشاب في النبات قبل أن يعمل. على سبيل المثال مقاومة إلى جليوفوسات ‎glyphosate‏ أو التي تم الحصول عليها باستخدام جينات مرمزة لإنزيمات مستهدفة مطفرة ‎Sie « mutant target enzymes‏ © -إينوبيروفيل شيكيمات-؟-فوسفات سنسيز ‎(EPSPS) 5—enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase‏ وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات ‎EPSPS)‏ في براءة الاختراع الأمريكية أرقام 4,5407875 + و 8,1048147 و ‎TY Yo‏ 0 ارقو 4750 17,رو 17,444 ره و 1,271,247 . وقد تم الحصول على مقاومة لجليوفوسينات أمونيوم ‎glufosinate ammonium‏ « وبروموأوكسينيل ‎bromoxynil‏ « و07:؟- داي كلوروفينوأوكسي أسيتات ‎(D-£0Y) 2,4-dichlorophenoxyacetate‏ باستخدام جينات بكتيرية ‎bacterial genes‏ مرمزة لفوسفينوثريسن أستيل ترانسفيراز ‎phosphinothricin‏ ‎acetyltransferase‏ » أو نيترايليز 01071856 + أو 407 -داي كلوروفينوكسي أسيتات ‎YO‏ مونوأوكسجينيز ‎2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase‏ ¢ التي تزيل سمية
‏ملا
مه مبيدات الأعشاب ‎herbicides‏ كل على حدى. وقد تم إفشاء إنزيمات ‎Enzymes‏ /جينات لمقاومة/تحمل ‎tolerance‏ جلوفوسينات ‎glufosinate‏ في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 54 و ‎YYT,YTA‏ 50 خلا 560,00 2,211,7771. وقد تم إفشاء الإنزيمات/ الجينات سابقاً لمقاومة 0-47 في براءات الاختراع أرقام 657 ‎Ve‏ و0 :بقارت © بالإضافة إلى طلبات براءات الاختراع الامريكية رقم 097717 ‎٠009/6‏ و براءة الاختراع الدولية رقم 47 707/057. وقد تم إفشاء الإنزيمات/ الجينات للنيتريليز 01011856 سابقاً في براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎AY TEA‏ يمكن لمبيدات الأعشاب الأخرى تثبيط نقطة النمو ‎growing point‏ أو النسيج الإنشائي ‎meristem‏ « مشتملة على إيميدازولينوان ‎imidazolinone‏ أو سلفونيل يوريا ‎sulfonylurea‏ « ‎٠‏ ووتم توضيح جينات للمقاومة/التحمل لحمض أسيتوهيدروكسي سنسيز ‎acetohydroxyacid‏ ‎(AHAS) synthase‏ وأسيتولاكتات سنسيز ‎(ALS) acetolactate synthase‏ لمبيدات الأعشاب تلك. وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات ‎AHAS] mutants‏ والمطفرات في براءات الاختراع ‎LE)‏ 77ر51 الى "الأكارف ‎FTN NY‏ و لافار و ,2,47 . وقد تم إفشاء الجينات والمطفرات ‎ALS]‏ في براءة الاختراع أرقام 9,017,184 ؛ و ‎OY EY, AY Yo‏ تشمل جينات مقاومة لجليوفوسات ‎Glyphosate resistance genes‏ جينات * -إينوبيروفيل شيكيمات -؟ -فوسفات سنسيز ‎S5—enolpyruvylshikimate—3—-phosphate synthase‏ ‎(EPSPS)‏ المطفرة (بواسطة إدخال حمض نووي معاد الاتحاد و/ أو هيئات متعددة لتخليق الطفرة في الخلايا الحية لجينات ‎EPSPs‏ الأصلية)؛ وجينات 230/8 وجينات جليوفوسات أستيل ‎٠‏ ترانسفيراز ‎(GAT) glyphosate acetyl transferase‏ كل على حدى). وتشمل جينات المقاومة لمركبات الفوسفونو ‎phosphono compounds‏ الأخرى على جلوفوسينات ‎glufosinate‏ (جينات فوسفينوثريسن أسيتل ترانسفيراز ‎phosphinothricin acetyl‏ 086 ) من أنواع الستربتوميسات ‎Streptomyces species‏ ؛ مشتملة على ستربتوميسات هيجروسكوبيكس ‎hygroscopicus‏ 516010777065 وستريبتوميسيس ‎Yo‏ فيريديكروماجينات ‎Streptomyces viridichromogenes‏ (« وأحماض 5 بيريدينوكسي ملا
-١ه-‏ ‎pyridinoxy‏ أو فينوكسي بروبيونيك 010800016 ‎phenoxy‏ وسيكلوهيكسونات ‎cyclohexones‏ (جينات ترميز متبط ‎.(ACCasell inhibitor-encoding genes‏ وقد تم توضيح جينات المقاومة/التحمل ‎ad‏ الأعشاب لأستيل كوانزيم ‎A‏ كربوكسيليز ‎acetyl‏ ‎(ACCase) coemzyme A carboxylase‏ في براءات الاختزراع الأمريكية أرقام 5117 ‎.0,84A,08¢ 4 ©‏
يمكن الحصول على جزئ ‎DNA‏ مشفر ‎@roA (pal‏ مطفر تحت انضمام ‎ATCC‏ رقم 4755 ويتم إفشاء تتابع النيوكليوتيد للجين المطفر في براءة الاختراع الأمريكية رقم 4,714,051 ‎to‏ ‏[20008؛ والطلب الأوروبي لبراءة الاختراع رقم ‎to Kumada et 81. . YYY YY‏ ؛ وبراءة الاختراع رقم 5,974/أ5,كال8 ‎to Goodman et‏ ؛ وافشاء تتابعات نيوكليوتيد لجينات إنزيم ‎Ve‏ جلوتامين سنستايز ‎glutamine synthetase genes‏ التي تمنح مقاومة لمبيدات الأعشاب ‎Jie‏ ‏٠-فوسفينوثريسن ‎.L—phosphinothricin‏ وتم تقديم تتابع النيوكليوتيد لجين ‎PAT‏ في الطلب الوروبي رقم ‎to Leemans et al. 9 Y¢‏ « وتصف ‎DeGreef et al., laf‏ )1989( 7:61 لا09ا810/180000إنتاج نباتات معدلة وراثياً التي تعبر عن جينات خيمرية بار ‎chimeric bar genes‏ مرمزة إلى نشاط ‎ahs PAT‏ من ‎BN‏ التي توضح الجينات المائحة ‎٠‏ المقاومة إلى أحماض فينوكسي بروبيونيك ‎phenoxy proprionic acids‏ وسيكلوهيكسونات ‎cyclohexones‏ ؛ مشتملة على سيزوكسيدم (561107/017 وهالوكسيفوب ‎haloxyfop‏ ؛ جينات ال[001-5؛ و001-52؛ و0001-53؛ والجينات الموضحة بواسطة ‎Marshall et al.,‏ ‎Appl.
Genet. 83:435 (1992)‏ .115600. وتم توضيح جينات ‎GAT‏ القادرة على منح مقاومة جليفوسات في براءة الاختراع الدولية 81009017819 ‎.to Castle et‏ وتم توضيح ‎٠‏ الجينات المائحة مقاومة لمبيدات الأعشاب 47 -0؛ وفوب. ‎fop‏ وبيريديل أوكسي أوكسين ‎pyridyloxy auxin‏ في ‎WO 2005107437 and U.S. patent application Ser.‏
53 .ملا يمكن لمبيدات الأعشاب الأخرى تثبيط التخليق الضوئي ‎photosynthesis‏ « ومنها تراي أزين ‎psbA)‏ و+15) أو بنزونيتريل ‎benzonitrile‏ (جين نيتريليز ‎gene‏ 11011856 ). وتصف ‎Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991) vo‏ تحويل الكلاميدوموناس ‎Chlamydomonas‏
ملا
وه بالبلازميدات المرمزة لجينات ‎PSDA‏ المطفرة. ويتم إفشاء تتابعات النيوكليوتيد لجينات النيتريليز في براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,870,744 إلى ستوكر ‎«Stalker‏ وجزيئات ‎DNAY‏ المحتوية على تلك الجينات تعد متاحة تحت انضمام ‎ATCC‏ للأرقام 27475 )و 29451و 17447 وتم وصف تكون نسائل أو التعبير لل/لا00 المشفر لجلوتاثيون 5 -ترانسفيراز ‎glutathione‏ ‎S-transferase ©‏ بواسطة )1992( 285:173 ‎.Hayes et al., Biochem.
J.‏ لأغراض الاختراع الحالي تشمل جينات العلامات المنتقاه وليس الحصر على جينات الترميز: نيوميسن فوسفوترانسفيراز ‎Il (Fraley et al. (1986) neomycin phosphotransferase Il‏ ‎¢CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1-25)‏ وسيانميد هيدراتيز ‎cyanamide‏ ‎(Maier—Greiner et al. (1991) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA hydratase‏ ‎٠‏ )¢88:4250-4264 واسبرتات كيناز ‎aspartate kinase‏ ¢ وداي هيدروداي بيكولينات سنسيز ‎(Perl et al. )1993( dihydrodipicolinate synthase Bio/Technology‏ (11:715-718؛ وتريبتوفان ديك ربوكسيلاز ‎(Goddiin etal. tryptophan decarboxylase‏ ‎gly (1993) Plant Mol.
Bio. 22:907-912)‏ هيدرو _داي بيكولينات سنسيز ‎dihydrodipicolinate synthase‏ واستيرتاد كيناز ‎kinase‏ 350811806 المنزوع الحساسية ‎¢(Perl et al. (1993) Bio/Technology 11:715-718( ١٠‏ وجين بار ‎(Toki bar gene‏ ‎et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503-1507; and Meagher et al. (1996),‏ ‎«Crop Sci. 36:1367)‏ وتريبتوفان ديكربوكسيلاز ‎tryptophan decarboxylase‏ ‎¢(Goddijn et al. (1993) Plant Mol.
Biol. 22:907-912)‏ ونيوميسن فوسفوترانسفيراز ‎(Southern et al. (1982) J.
Mol. (NEO) neomycin phosphotransferase (‏ ‎$Appl.
Gen. 1:327 | ٠‏ وهيجروميسين فوسفوترانسفيراز ‎hygromycin phosphotransferase‏ ‎HPT)‏ أو ‎«(Shimizu et al. (1986) Mol.
Cell Biol. 6:1074) (HYG‏ وداي هيدرو فولات ريداكتاز ‎(Kwok et al. (1986) PNAS (DHFR) dihydrofolate reductase‏ ‎(USA 4552)‏ وفوسفينوتزيسين استيل ترانسفيراز ‎phosphinothricin acetyltransferase‏ ‎¢(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513)‏ وحمض ‎١7‏ 7- داي كلوروبروبيونيك ‎Yo‏ دييالوجيناز ‎(Buchanan-Wollatron 2,2-dichloropropionic acid dehalogenase‏ ‎gv‏
ارج ‎tet al. (1989) J.
Cell.
Biochem. 13D:330)‏ وحمض أسيتوهيدروكسي سنسيز ‎(Anderson et al., U.S.
Pat.
No. 4,761,373; acetohydroxyacid synthase‏ ‎tHaughn et al. (1988) Mol.
Gen.
Genet. 221:266)‏ و © -إينوبيروفيل -شيكيمات - فوسفات مسنسيز ‎(Comai (aroA) 5-enolpyruvyl-shikimate—phosphate synthase‏ ‎al. (1985) Nature 317:741) ©‏ )©؛ وهالو آريلنيتريليز ‎(Stalker et haloarylnitrilase‏ ‎published PCT application WO87/04181)‏ ,.ل8؛ واستيل -كوانزيم / كربوكسيليز ‎(Parker et al. (1990) Plant Physiol. acetyl-coenzyme A carboxylase‏ ‎glas ¢92:1220)‏ هيدرو بتيورات سنسيز ‎(sul I) dihydropteroate synthase‏ ‎kD 5 ¢(Guerineau et al. (1990) Plant Mol.
Biol. 15:127)‏ 32 نظام ضوئي ‎١|‏ بولي ‎٠‏ ببتيد ‎(Hirschberg et al. (1983) (psbA) 32 kD photosystem ١١ polypeptide‏ ‎.Science 222:1346)‏ وأيضاً المشتمل هو عبارة عن جينات ترمز لمقاومة إلى: الكلورامفينيكول ‎chloramphenicol‏ ‎¢(Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987-992)‏ والميثوتركسات ‎(Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 303:209-213; Meijer methotrexate‏ ‎cet al. (1991) Plant Mol Bio. 16:807-820 (1991) Ye‏ وهيجروميسين ‎hygromycin‏ ‎(Waldron et al. (1985) Plant Mol.
Biol. 5:103-108; Zhijian et al. (1995)‏ ‎Plant Science 108:219-227; and Meijer et al. (1991) Plant Mol.
Bio.‏ )¢16:807-820 وستربتوميسين ‎(Jones et al. (1987) Mol.
Gen. streptomycin‏ ‎«Genet. 210:86-91)‏ والسبيكتوميسين ‎(Bretagne-Sagnard et al. spectinomycin‏ ‎Transgenic Res. 5:131-137) ٠‏ )1996(¢ والبليوميسين ‎(Hille et al. bleomycin‏ ‎Plant Mol.
Biol. 7:171-176)‏ )1986(¢ والسلفوناميد ‎(Guerineau et sulfonamide‏ ‎tal. (1990) Plant Mol.
Bio. 15:127-1306)‏ والبروموكسونيل ‎(Stalker bromoxynil‏ ‎D (Streber et al. (1989) —¢,Y, cet al. (1988) Science 242:419-423)‏ ‎«Bio/Technology 7:811-816)‏ والجليفوسات ‎(Shaw et al. (1986) glyphosate‏ ‎gv‏
— جم
(DeBlock et al. phosphinothricin ‏والفسفينوتريسين‎ «Science 233:478-481)
.(1987) EMBO J. 6:2513-2518)
وليس تعني قائمة الجينات السابقة التي يمكن انتقائها كعلامات والمسجلة أنها قاصرة عليهم. ويتم
شمول أي جين يمكن انتقائه أو مسجل بواسطة الاختراع الحالي. ولو من الضروري فمثل هذه
0 الجينات بمكن أن تتوالى بالطرق المعروفة في المجال.
ويتم تخليق جينات العلامات التي يمكن أنتقائها أو المسجل لأجل تعبير أقصى في النبات. ولأجل
ليصبح معبراً عنه في النباتات في مستوى أعلى مؤدياً إلى كفاءة تحويل أعلى.وتعد الطرق متاحة
في المجال لأجل تحسين أقصى للجينات المخلقة. وفي الحقيقة قد تم تحسين أقصى للعديد من ‎٠‏ الجينات لزيادة التعبير لمنتج الجين في النباتات.
يمكن أن يتم تحسين تتابع جين العلامة بشكل أقصى للتعبير في أنواع نبات خاصة أو ‎Sy‏ عن
ذلك يمكن أن تكون معدلة للتعبير الأقصى في عائلات النبات.وربما يتم تحديد روامز النبات
المفضلة من الروامز ذات التردد العالي في البروتينات المعبر عنها بالكمية الكبرى في أنواع نبا
خاصة للفائدة. انظر على سبيل المثال براءةالاختراع الدولية رقم ‎1١164177‏ /٠1وبراءة‏ الاختراع ‎Vo‏ الأوربية رقم 788437 ررقم 764417 ‎Perlak eta |. (1991) Proc.
Natl.
Acad.‏ :
(1989) Nucleic Acids ~~ 88:3324-3328; and Murray et . 5 Sci.
USA
‎¢Research 17: 477-498‏ وبراءة الاختراع الأمريكية رقم 0,786,871 ؛ وبراءة الاختراع
‏الأمريكية رقم ‎ETT YAY‏ ,0 وربما في هذه الطريقة يمكن أن يتم تحسين تتابعات النيوكليوتيد
‎J,‏ أقصى للتعبير في أي نبات ‎٠.‏ وقد ثم التعرف على أن كل أو أي جزء من تتابع الجين ربما ‎٠‏ يتم تحسينها بشكل أقصى أو تخليقها. وبهذا أيضاً ربما يمكن استخدام تتابعات محسنة كلياً أو
‏الجينات التي تمنح مقاومة إلى مبيد الأعشاب:
‎acetohydroxyacid synthase ‏المقاومة/التحمل لحمض أسيتو هيدروكسي سنسيز‎ A
‎(AHAS)‏ وأسيتلاكتيت سنسيز ‎(ALS) acetolactate synthase‏ ضد مبيدات الأعشاب
‏م
هه إميدازولينوان ‎imidazolinone‏ أو سلفونيل يوريا ‎sulfonylurea‏ وقد تم إفشاء الجينات والطفرات ‎AHAS)‏ والطفرات في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 711,777 عر ‎OX EVYY‏ و/١٠,5,771؛‏ و ‎A0F, AVY‏ ,0 و 2,178,977. وتم إفشاء الجينات والطفرات ‎ALS]‏ في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 1184 رف و ‎VEY, AY‏ ‎wo ©‏ جينات المقاومة/التحمل لأستيل كوانزيم ‎A‏ كربوكسيليز ‎(ACCas)‏ ضد مبيدات الأعشاب سيكلوهكسان دايونات ‎cyclohexanediones‏ و أو حمض آريل فينوكسي بروبانويك ‎aryloxyphenoxypropanoic acid‏ (مشتملاً هالوكسيفوب ‎Haloxyfop‏ « ديكلوفوب ‎Diclofop‏ + فينوكسيبروب ‎Fluazifop «aisle +» Fenoxyprop‏ »+ كوازالوفوب ‎(Quizalopfop‏ تم توضيحها في براءات الاختراع أرقام 117,107رف و 2,894,088 ‎aa ٠‏ جينات لأجل جليفوسات مقاومة/تحمل. جين ل -إينوبيروفيل-؟-فوسفوشكيمات سنسيز ‎ES3P)5—enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase‏ سنسيز) تم توضيحه في براءة الاختراع الأمريكية رقم 5,7719,109. وجينات له -إينوبيروفيل-7-فوسفوشكيمات سنسيز ‎(ES3PS)‏ والطفرات تم توضيحها في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 4,555,872 ؛ و الكتأخارف و ‎TTY‏ ,0 تارف و رارف و ‎LOTT,0AY 50 TFT EEA‏ ‎Vo‏ ث. ‏ جينات لجلوسينات (بايالافوس ‎bialaphos‏ ؛ فوسفوفينوثريسن ‎phosphinothricin‏ ‏(001)) مقاومة/تحمل. جينات لفوسفينوثريسن أستيل ترانسفيراز ‎phosphinothricin‏ ‎(Pat) acetyltransferase‏ تم توضيحها في براءات الاختراع الأمريكية أرقام د ال 2,711,114 و ‎7١6‏ 95,©؛ وتم توضيح جين لجين المقاومة بايالافوس ‎(Bar) bialaphos‏ في براءات الاختراع الأمريكية أرقام ‎YE « 0,0) YT‏ تكارف و ‎OTENEYY‏ ‎Yo‏ و©117,171,. وتم توضيح جين لجلوتامين سينستاز ‎(GS) glutamine synthetase‏ في براءة الاختراع الأمريكية رقم 975,377,؛والطلب الأوروبي لبراؤة الاختراع الأوبية أ١‏ الف اضر ‎x‏ جينات المقاومة/التحمل لهيدروكسي فينيل بيروفات داي أوكسجينز ‎hydroxy phenyl‏ ‎(HPPD)pyruvate dioxygenase‏ ضد مبيدات الأعشاب ايزوأوكسازول ‎isoxazole‏ ‏ملا
-1ه- ودايكيتونيتريلات ‎diketonitriles‏ ؛ و/ أو ترايكيتونات ‎ctriketones‏ و/ أو مشتملاً سالكوترايوان ‎sulcotrione‏ وميزوترايوان ‎mesotrione‏ والذي تم توضحيهم في براءات الاختراع الأمريكية أرقام 089 ‎TA‏ ارتو 0 ‎SLT‏ ‏ح. ‏ جينات ‎D-$0Y)‏ مقاومة/تحمل. وتم توضيح جين ‎DEY‏ -مونوأوكسيجنيز ‎2,4-D-monooxygenase ©‏ في براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎Ve EET‏ و ‎SLYOY EY‏ وتم إفشاء ‎cla‏ إضافية ل07؛-0 مقاومة/تحمل في براءة الاختراع ‎AS‏ رقم ‎٠١ 73‏ » و براءة الاختراع الدولية رقم 487 ‎٠٠١/67‏ ‏خ. تم توضيح جين لإميدازول جليسرول فوسفات ديهيداتاز ‎imidazoleglycerol phosphate‏ ‎(IGPD) dehydratase‏ ضد مبيدات الأعشاب ‎imidazole sad‏ و/ أو ترايأزول ‎triazole‏ ‎٠‏ في براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎51,7٠١‏ 2,5. وتم إفشاء الجينات لإنزيمات التفسخ دايكامبا 38 (اوكسجينز ‎OXygenase‏ ؛ وفيرودوكسين ‎ferredoxin‏ ؛ وريدكتاز ‎(reductase‏ ‏ضد مبيدات الأعشاب دابكامبا في براءات الاختراع أرقام 7,847 لأ وى 4 ‎VOY‏ ‎La‏ جينات لمبيدات الأعشاب التي تثبط التخليق الضوئي؛ مشتملاً ترايأزين ‎triazine‏ (جينات ‎psbA‏ و+15) أو بينزونيتريل ‎benzonitrile‏ (جين نيتريليز ‎.(nitrilase gene‏ انظر ‎Se‏ ‎Przibila et al, Plant Cell 3:169 (1991) ١٠‏ _لإفشاء ‏ تحول الكلاميدوموناس ‎Chlamydomonas‏ 4 البلازميدات المرمزة لجينات ‎psbA‏ المطفرة. ويتم الإفشاء لتتابعات النيوكليوتيد لجينات نيتريليز ‎nitrilase genes‏ في البراءة الأمريكية رقم 5,8951544 وعد جزيئات اللا المحتوية على تلك الجينات متاحة تحت ملكية ‎ATCC‏ للأرقام 57175و ‎AVES)‏ و 17447. ويتم توضيح إنشاء نسائل والتعبير عن ترميز ‎DNA‏ لجلوتاثايون 5- ‎٠‏ ترانسفيراز ‎glutathione S-transferase‏ بواسطة ‎Hayes et al., Biochem.
J.‏ )1992( 285:173. تمتلك كل التقنيات والمصطلحات المستخدمة هنا نفس المعنى كالمفهوم بشكل واسع من هؤلاء من ذوي المهارة العادية في المجال والتي ينتمي إليها هذا الإفشاء ما أن يتم شرح غير ذلك بصفة خاصة. ويمكن أن توجد التعريفات للمصطلحات المشهورة في البيولوجية الجزيئية ‎molecular‏ ‏ملا
له ‎biology‏ على سبيل المثال: 1994 ‎Lewin, Genes V, Oxford University Press,‏ ‎(ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of‏ ‎Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9);‏ ‎and Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A‏ ‎Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN ٠‏ )1-56081-569-8. يتم تقديم تتابع نيكوليوتيد تخليقي يمكن أن تعمل في صورة معزز ثنائي الاتجاه. وربما يكون المعزز ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات عملياً مرتبط بواحد أو اثنين من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة. على سبيل المثال؛ ربما يكون المعزز ثنائي الاتجاه المخلق عملياً مرتبط بواحد ‎٠‏ . أو اثنين من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة ‎edie)‏ جينين؛ واحد عند كل نهاية من المعزز)؛ وبذلك لتنظيم النسخ على الأقل واحدة (مثل؛ واحدة أو كليهما) من تتابعات النيوكليوتيد للفائدة. ربما يتم تحقيق تعبير خاص وأنماط تنظيمية ‎Jie (Jie)‏ تلك التي يتم عرضها بواسطة الجينات تحت تحكم المعزز الأصلي) بدمج ال45الا من معزز في المعزز ثنائي الاتجاه المخلق مع الأخذ في الاعتبار إلى تتابع النيوكليوتيد للفائدة التي تكون عملياً مرتبطة بمعزز ثنائي الاتجاه مخلق. ‎VO‏ يتم توضيح بعض التجسيمات للاختراع بالأمثلة هنا بدمج عنصر قلب معزز أدنى من معزز جين يوبيكويتن -1 الأحادي الاتجاه للذرة ‎(ZmUbil) unidirectional maize ubiquitin—1 gene‏ إلى سياق جزيئي مختلف عن ذلك المعزز الأصلي لهندسة المعزز ثنائي الاتجاه المخلق. ويشير عنصر قلب معزز أدنى هنا إلى ”5115ل0101؛ ويساوي تقريباً ‎(aisle Yoo‏ في الطول. وقد تم التعرف من التوالي والتحليل لعناصر 0010100115 من أنواع ‎Zeal‏ المتعددة والتركيبات ‎٠‏ الجينية ل5/ا008 .2 على أن تكون عناصر ©011ل010 الوظيفية عالية الحفاظء ‎Jie‏ عنصر ‎minUbilP‏ هذا ‎Lay‏ يحتفظ بوظيفته كبادئ لعملية النسخ لو شارك؛ على سبيل ‎JE‏ على الأقل ما يقرب من 9675؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9680؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 6 و/ أو على الأقل ما يقرب من 9691؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9647؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9697؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9644؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من ‎Yo‏ 96950؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 9697؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 96997؛ و/ أو على ملا
-مه- الأقل ما يقرب من 9694؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من 96949؛ و/ أو على الأقل ما يقرب من + تعريف تتابع إلى عنصر 010105116 ل110:1 ‎SEQ ID‏ وتشمل خصائص عناصر ال©511لا010 التي ربما تكون مفيدة في بعض التجسيمات للاختراع على سبيل المثال وليس الحصر على التتابع عالية الحفاظ من النيوكليوتيد سالفة الذكر؛ و/ أو وجود على الأقل صندوق ‎TATA ©‏ واحد؛ و/ أو وجود على الأقل واحد ‎OQ)‏ اثنين) من عناصر إجماع الصدمة الحرارية. وبالأخص عناصر 5116ل00101؛ ربما يتم تداخل عناصر إجماع أكثر من صدمة حرارية واحدة خلال تتابع ‎.minUbilP‏ ‏يمكن أن تشتمل عملية دمج عنصر 00100110 في سياق جزيئي مختلف عن ذلك المعزز الأصلى لهندسة معزز ثنائي الاتجاه مخلق على عكس اتجاه عنصر ال 10010105115 في حمض ‎Ve‏ نووي مع الأخذ في الاعتبار إلى التتابع المتبقية من المعزز؛ بما في ذلك معزز أساسي أدنى أصلي منه. وبالتالي؛ يمكن أن يشتمل معزز ثنائي الاتجاه تخليقي على عنصر 0010105116 أول يتضمن ”5 من عنصر معزز أساسي أدنى ثاني ‎Jo)‏ سبيل المثال عنصر 0010100116 ثاني) في المعزز في الاتجاه العكسي؛ لتتابع النيوكليوتيد للفائدة والواقعة على '5 من عنصر ‎minUbilP‏ الأول. على سبيل ‎JE‏ يمكن تضمن عنصر ‎minUBIIPY‏ الأول عند نهاية ‎Vo‏ "كمن المعزز 2000811 في الاتجاه العكسي ‎orientation‏ 616156؟]. ‎Ly)‏ يضم أيضاً معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق على واحد أو أكثر من إضافية لواحدة على الأقل من التتابع بالإضافة إلى عنصر ‎.MINUDITP‏ في بعض التجسيمات يمكن أن يشتمل معزز 1 ثنائي الاتجاه في بعض التجسيمات على معزز 45الا؛ واإكسون (مثل؛ إشارة ‎signal‏ أو قائد ‎leader‏ ببتيد)؛ وانترون؛ وتتابع فراغ؛ و/ أو مجموعات من واحد أو أكثر من أي مما سبق. ‎Yo‏ وربما يضم ‎jee‏ 811ل ثنائي الاتجاه المخلق على سبيل المثال وليس الحصر على توالية ‎URS‏ ‏من معزز 811لا (على سبيل المثال معزز 33 511لا)؛ واكسون يشفر لببتيد قائد من جين 011لا؛ وانترون من جين 011لا؛ ومجموعات من هذا كله. في بعض تلك الأمثلة المشتملة على معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق المشتمل على معزز ‎(URS‏ ربما يتم انتقاء ال 45لالتمنح خصائص تنظيمية خاصة على المعزز المخلق. وتختلف ‎YO‏ المعززات المعروفة بشكل واسع في نوع التحكم التي تبذله على الجينات المرتبطة عملياً ‎(Ji)‏ ‏دما
-4ه- الاستجابات البيئيةة ‎environmental responses‏ ؛ والضفائر التطورية ‎developmental‏ ‎cues‏ والمعلومات المكانية ‎(spatial information‏ ويحافظ ال5+الا المدمج في معزز غير متجانس ‎heterologous promoter‏ نموذجياً على نوع التحكم الذي يعرضه ال5+الا مع الأخذ في الاعتبار إلى معززه الأصلي والجين أو الجينات المرتبطة عملياً. ‎Langridge et al.‏ ‎supra ©‏ ,(1989). وتشكل أمثلة عن معززات حقيقيات النواة التي قد تم وصفها وربما تحتوي على ‎URS‏ مشتمل خلال معزز 5811لا ثنائي الاتجاه المخلق وفقاً لبعض التجسيمات على سبيل ‎JE‏ ‏وليس الحصر: تلك المعززات الموضحة في براءات الاختراع أرقام 1,577,711 (معزز 581 للذرة)؛ و 9,141,897 (معزز أكتين للأرز ‎¢(rice actin promoter‏ و571 117 ‎Ja)‏ ‏4 للذرة)؛ و 1,475,717 (معزز ‎PR-1‏ للذرة)؛ 1,777,577 (معزز ‎AZ‏ للذرة)؛ و ‎٠١‏ الفح (معززات بنيوية للذرة ‎1,EYY,Yo¥ ¢(constitutive maize promoters‏ (معزز أوليسين ‎L3‏ للذرة ‎(maize L3 oleosin promoter‏ 1,571,701 (معزز أكتين ‎١ actin 2 promoter‏ وانترون أكتين ‎١‏ للأرز ‎«(rice actin 2 intron‏ و لكل ,لاتاره (معزز خاص بالجذر ‎¢(root—specific promoter‏ و 795,714 (معززات محرضة للضوء ‎¢(light-inducible promoters‏ و ‎1٠5.014‏ (معززات محرضة للملح ‎salt-inducible‏ ‎١٠‏ 010001815)؛ و 1,707,178 (معززات محرضة للكائنات الممرضة ‎pathogen-inducible‏ ‎¢(promoters‏ و 1,175,610 (معززات ‎dame‏ لنقص الفوسفور ‎phosphorous‏ ‎lies) 717١و ¢(deficiency-inducible promoters‏ ثنائية الاتجاه)؛ و 17 (معزز جاما- كويكسين ‎¢(gamma—coixin promoter‏ وطلب براءة الاختراع الأمريكية تسلسل ‎AS)‏ ,5/789 (معزز كلوروبلاست ألدولاز للذرة ‎maize chloroplast‏ .(aldolase promoter ٠٠ nopaline ‏وتشمل أمثلة موضحة إضافية لمعززات بدائيات النواة على معزز إنزيم نوبالين سنسيز‎ (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA (NOS) synthase ‏(الذي‎ (OCS) octopine synthase ‏(64)16(:5745-9؛ ومعزز إنزيم أوكتوبين سنسيز‎
Agrobacterium ( ‏يحمل على بلازميدات تحدث أوراماً لأجروباكتيريم تيوميفاشينس‎ ‏ومعززات كوليموفيروس (681110007/10115) مثل فيروس القرنبيط الفسيفسائي‎ (tumefaciens Yo ملا qa 19S(Lawton et al. (1987) j=; ¢(the cauliflower mosaic virus (CaMV)) 355 CaMV(Odell et al. (1985) Nature ‏ومعزز‎ «Plant Mol. Biol. 9:315-24) 35S(Walker et al. (1987) Proc. ‏ومعزز فيروس فيجورت الفسيفسائي‎ ¢313:810-2 (Yang and ‏ومعزز سكروز سينيز‎ (Natl. Acad. Sci. USA 84(19):6624-8)
R ‏ومعزز معقد الجين‎ (Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-8) ٠ ‏و 081/1/355 (براءات الاختراع‎ «(Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-83) (0,074,147 ‏و‎ (0,¥04,1 EY ‏ار منترتدارف و‎ Oo FYVAYA LB) ‏الأمريكية‎ ‏(براءات_ الاختراع الأمريكية أرقام: 1,051,757 + و 77/,119,)؛ ومعزز‎ FMV3SS ‏(براءة الاختراع الأمريكية رقم 0,014 2,85)؛ ومعزز 5001 (براءة الاختراع الأمريكية‎ 06117
AGRtu.nos (GenBank Accession No. VO0087; ‏1)؟ ومعززات‎ 17/6 ٠ ‏رقم‎ ٠
Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan et al. ‏وأمثال ذلك.‎ (1983) Nature 304:184-7) ‏ثنائي الاتجاه المخلق أكثر في بعض التجسيمات على إكسون بالإضافة‎ UBITY ‏ربما يضم معزز‎ ‏ربما يكون من المرغوب في تجسيمات‎ JB ‏على سبيل‎ .minUDILP ‏إلى عنصر (عناصر)‎ ‏خاصة لاستهداف أو نقل بولي ببتيد المرمزة بتتابع النيوكليوتيد للفائدة والمرتبطة عملياً بالمعزز‎ ٠5 ‏لمكان خاص تحت مستوى الخلية و/ أو المقسم. في تلك التجسيمات وغيرها؛ ربما يتم دمج تتابع‎ ‏مرمزة (إكسون) إلى جزئ حمض نووي ما بين عنصر 010100115 وتتابع نيوكليوتيد مرمزة بولي‎ ‏ببتيد. وربما يتم تنظيم تلك العناصر وفقاً إلى حسن التصرف من الممارسين المهرة حيث أنه يعزز‎ ‏المعزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق التعبير للبولي ببتيد (أو واحد أو كل من متواليتي ترميز‎ ‏البولي ببتيد الاثنتين التي تعد عملياً متصلة بالمعزز) المشتمل على الببتيد المشفر بواسطة تتابع‎ ٠ ‏الترميز المدمجة في علاقة زظيفية مع المتبقي من البولي ببتيد. وفي الأمثلة بالأخص ربما يتم‎ ‏قائد).‎ UbIT ‏ببتيد‎ (Jig) ‏دمج إكسون مشفر لقائد؛ أو ناقل؛ أو إشارة ببتيد‎ ‏في معزز‎ exon incorporated ‏وتشمل الببتيدات التي ربما يتم ترميزها بواسطة إكسون المدمج‎ ‏؛‎ leader exon ‏الاتجاه المخلق؛ على سبيل المثال وليس الحصر: إكسون قائد‎ AU Ubil ‏ال‎ ‎chloroplast transit ‏البلاستيدات الخضراء‎ Ja ‏ببتيد‎ ¢(Ubil ‏(مثل؛‎ Ubiquitin ‏ويوبيكويتن‎ YO gv
-١؟-‏ ‎(CTP) peptide‏ مف ‎the A. thaliana EPSPS CTP (Klee et al. (1987) Mol.‏ ‎Gen.
Genet. 210:437-42), and the Petunia hybrida EPSPS CTP‏ ‎«((della-Cioppa et al. (1986) Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 83:6873-7)‏ كالموضح بالأمثلة لتهديف البلاستيدات الخضراء لإنزيم داي كامبا مونوأوكسيجنيز ‎dicamba‏ ‎(DMO) monooxygenase ©‏ في منشور ‎PCT‏ دولي رقم براءة الاختراع الدولية ‎Noe AN «OA.‏ ربما أيضاً يتم دمج الانترونات في معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات للاختراع على سبيل المثال ما بين عنصر 010105110 وتتابع النيوكليوتيد للفائدة التي يتم ارتباطها عملياً بالمعزز. في بعض الأمثلة ربما يكون الانترون المدمج في المعزز 811ل ثنائي الاتجاه ‎٠‏ المخلق وليس الحصر ‎UTR‏ 5 التي تعمل كتتابع قائدة للترجمة وظيفياً التي توجد في ‎mRNA‏ ‏معالج تماماً ضد الاتجاه لتتابع بدء الترجمة (مثل التتابع القائدة للترجمة ربما تؤثر على معالجة المنسوخ المبتدئ ‎dMRNAD‏ و/ أو ثبات ‎MRNA‏ و/ أو كفاءة الترجمة). وتشمل تتابعات قائدة للترجمة على قادة بروتين الذرة والبتونيا للصدمة الحرارية (البراءة الأمريكية رقم 5,317,875)؛ وقادة البروتين غلاف الفيروس نباتى ‎plant virus coat protein leaders‏ ؛ وقادة روبيسكو ‎plant rubisco leaders cial ٠‏ ؛ وأخرين. انظر ‎Turner and Foster (1995) Sie‏ ‎Molecular Biotech. 3(3):225-36‏ وتشمل أمثلة غير محدودة ‎UTRsl‏ "5 على ‎GmHsp‏ (البراءة الأمريكية رقم ‎PhDnaK 5¢(2,109,) YY‏ (البراءة الأمريكية رقم 5,767,875 ‎¢TEV (Carrington and Freed (1990) J.
Virol. 64:1590-7( ¢AtAntl 5 ¢(5‏ ر )1983( ‎AGRtu.nos (GenBank Accession No.
VO0087; and Bevan et al.‏ ‎Nature 304:184-7) ٠‏ تشمل تتابعات إضافية والتي ربما تكون تم دمجها اختيارياً إلى معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق على سبيل المثال وليس الحصر: تتابعات /3 غير مترجمة؛ مناطق انتهاء النسخ ل3؛ ومناطق تذييل بعديد الادينيلات. ويوجد عناصر وراثية تقع في فى نفس الاتجاه لتتابع النيوكليوتيد للفائدة ‎(ie)‏ تتابع للفائدة التي تعد مرتبطة ‎ble‏ بمعزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق)؛ وتشمل على ‎dn Yo‏ نيوكليوتيدات التي تمد بإشارة تذييل بالبولي أدينيل» و/ أو إشارات تنظيمية أخرى قادرة على د
١ ‏أو التعبير الجيني. وربما توظف إشارة تذييل البولي أدينيل‎ cMRNA ‏التأثير على النسخ؛ معالجة‎ ‏في النباتات لتسبب إضافة نيوكليوتيدات البولي أدينيلات إلى النهاية '3 من المادة السابقة‎ ‏لل/ل014. وربما يتم اشتقاق تتابع التذييل بالبولي أدينيل من الجين الطبيعي؛ ومن مختلف جينات‎ 3' ‏للمنطقة‎ 0008106 synthase ‏ويُعد إنزيم نوبالين سينسيز‎ T-DNA ‏النباتات؛ أو من جينات‎ ‏مثال‎ (nos 3’; Fraley et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803-7( © ‏مترجمة‎ pall ‏غير محدود لمنطقة نهاية النسخ '3. ويتم تقديم مثال الاستخدام للمناطق المختلفة‎ ‏وتشمل أمثلة غير محدودة‎ .Ingelbrecht et al. (1989), Plant Cell 1:671-80 ‏في‎ 31
Pisum sativum ‏واحد من جين‎ polyadenylation signals ‏لإشارات تذييل البولي أدينيلات‎
RbcS2 (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et al. (1984) EMBO ‏.ل‎ 3:1671-9) and
AGRtu.nos (GenBank Accession No. EQ1312) ٠ ‏يضم معزز 811ل ثنائي الاتجاه المخلق في بعض التجسيمات على واحد أو أكثر من تتابعات‎ ‏النيوكليوتيد التي تشمل تهديف الحمض النووي المشتمل على المعزز إلى مكان مخصص في‎ ‏وربما تشمل واحد أو أكثر من‎ target organism ‏للكائن الحي المستهدف‎ genome ‏الجينوم‎ ‏في الجينوم في المضيف‎ DNAY ‏التتابعات على سبيل المثال التي تعد متجانسة إلى أجزاء تتابع‎ ‏ترشد في بعض الأمثلة تلك‎ Les ‏في الجينوم نادرة أو مميزة).‎ DNA ‏تتابعات‎ (Jig) host Yo ‏التتابعات المتجانسة على عملية إعادة الالتثام والتكامل للحمض النووي المشتمل على معزز‎ ‏المتجانس في الجينوم المضيف. يضم المعزز‎ DNAD ‏ثنائي الاتجاه المخلق عند مكان‎ 1 ‏ثنائي الاتجاه المخلق في أمثلة بالأخص على واحد أو أكثر من تتابعات النيوكليوتيد التي‎ 1 ‏تسهل تهديف الحمض النووي المشتمل على المعزز إلى مكان نادر أو فريد في جيتوم المضيف‎ engineered nuclease enzymes ‏مستخدماً إنزيمات نيوكلييز المهندّسة‎ 10519600006 ٠ ‏التي تتعرف على التتابع عند مكان نادر أو فريد وتسهل التكامل عند هذا المكان النادر أو الفريد.‎ ‏اصبع زنك إندونيوكلييز‎ Glad) ‏مثل نظام التكامل المستهدف هذا والذي يقوم بتوظيف‎ ‏موضح في براءة‎ 01016856 enzyme ‏كإنزيم نيوكلييز‎ 2106-1098 endonucleases .3/011,7758 ‏الاختراع الأمريكية رقم‎ ‏ملا‎
اس ‎Ly)‏ يتم إنتاج الأحماض النووية المشتملة على معزز 811لا ثنائي الاتجاه ‎Gl‏ باستخدام أي تقنية معروفة في المجال؛ مشتملة على سبيل المثال وليس الحصر على: ‎(RCA‏ وتضخيم ‎(PCR‏ ‏وتضخيم ‎(OLA; (RT-PCR‏ وع0دل50. وتُعد هذه التقنية والتقنيات المكافئة الأخرى معروفة ‎Tam‏ لهثلاء ذوي المهرة في المجال؛ وتم توضيحها أكثر بالتفصيل على سبيل المثال وليس © الحصر: ‎Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.,‏ ‎Cold Spring Harbor Laboratory, 2001; and Ausubel et al., Current‏ ‎(Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1998‏ تشتمل كل المراجع المذكورة أعلاه على الكتيبات المذكورء بما في ذلك أي رسومات؛ الأشكال؛ و/ أو الجداول المقدمة بها.
‎٠‏ التوصيل ‎Delivery‏ و/ أو التحول ‎stransformation‏ يمد أيضاً الإفشاء الحالي الطرق لأجل تحويل خلية بما تحتويه من جزئ حمض نووي مشتمل على معزز 811لا ثمائي الاتجاه المخلق. ربما يتم استخدام أي عدد كبير من التقنيات المعروفة في المجال لإدخال جزيئات الحمض النووي إلى النباتات لتحويل النبات بما يحتويه من جزئ الحمض النووي المشتمل على معزز 811لا ثنائي الاتجاه المخلق وفقاً لبعض التجسيمات؛ فعلى سبيل المثال؛ لإدخال واحد أو أكثر من معززات
‎٠‏ 811ل ثنائية الاتجاه المخلقة إلى جينوم نبات مضيف؛ و/ أو لإدخال أكثر واحد أو أكثر من جزئ أو جزيئات الحمض النووي للفائدة والتي عملياً مرتبطة بالمعزز. تشمل طرق مناسبة لتحويل النباتات على أي طريقة بها يمكن أن يتم إدخال ‎DNAD‏ إلى الخلية؛ على سبيل المثال وليس الحصر: عملية كهربية (انظر على سبيل المثال براءة الاختراع رقم 5,707 70,)؛ وقصف مقذوف مجهري ‎microprojectile bombardment‏ (انظر على سبيل
‎٠‏ المثال براءات الاختراع الأمريكية رقم برقم و حا قرف و بأخرخ قرف و ‎TT YA‏ و ترق ة ارات و ‎dials ¢(TL,YALTOY‏ بوساطة الأجروباكتيريم ‎Agrobacterium-mediated transformation‏ (انظر على سبيل المثال براءات الاختراع رقم 0 دقرف و ‎AVE,AVY‏ ,0 و ‎0,AA Afr 500,08), T)T‏ و ل ابكتخغارة)؛ وتحويل البروتوبلاست ‎hail) protoplast transformation‏ على سبيل المثال براءة الاختراع
‎Yo‏ الأمريكية رقم ‎AV AE‏ 5,5). وخلال طلب التقنيات مثل السالف ذكره؛ فإنه يتم تحويل الخلايا من
‏ملا
أنواع النباتات الافتراضية؛ ومثل هذه الخلايا ربما يتم تطويرها إلى نباتات معدلة وراثياً بواسطة تقنيات معروفة إلى هؤلاء من ذوي المهارة في المجال. على سبيل المثال التقنيات التي ربما تكون مفيدة بالأخص في سياق تحول القطن الموصوف في براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎COAETYAY‏ ‏و 1595,175,؛ و 17 .,2؛» و 4,744 17,؛ والتقنيات لتحول نباتات البراسكا ‎Brassica plants ©‏ بالأخص والموصوفة على سبيل المثال في براءة الاختراع الأمريكية رقم ‎«AVY‏ €0,¥0 والتقنيات لتحول نبات الصويا 8/ا50 كالموضح على سبيل المثال براءة الاختراع الأمريكية رقم 1,784,709 ؛ والتقنيات لأجل تحول الذرة كالموضحة على سبيل المثال في براءات الاختراع الأمريكية رقم 1,050,897 » و 2,241,115؛ ومنشور ‎PCT‏ دولي رقم براءة الاختراع الدولية ‎Af TVYY‏ ‎Ve‏ بعد تأثير توصيل حمص نووي خارجي إلى خلية مستقبلة ‎«recipient cell‏ فإنه يتم التعرف على بصفة عامة الخلية المتحولة من أجل زرع وتوليد أكثر للنبات. ولكي يحسن من القدرة على التعرف على المتحولين» فإنه ‎Lay‏ يرغب أحدانا لتوظيف جين ذو علامة من الممكن انتقائه أو فحصه مع ناقل التحول ‎transformation vector‏ المستخدم لتوليد المتحول. في هذه الحالة يمكن معايرة التكتل الخلوي المتحول فعلياً بتعرض الخلايا إلى عامل أو عوامل منتقاه؛ أو يمكن أن يتم فحص ‎Vo‏ الخلايا لجين الصفة المرغوبة ذي العلامة. ربما يتم زرع الخلايا التي تنجو من التعرض لعامل الانتقائية؛ أو الخلايا التي تم وسجلت إيجابية في تجربة الفحص في الوسط الذي تدعم توليد النباتات. في بعض التجسيمات ربما يتم تعديل أي وسط زرع ‎culture media‏ ملاثم لنسيج النبات ‎plant tissue‏ (مثل» ‎MS‏ ووسط ‎(N6‏ بأن يشمل على مواد أكثر ‎Jie‏ منظمات النمو. ربما يتم الحفاظ على النسيج على وسط قاعدي مع ‎Yo‏ منظمي النمو حتى يكون هناك نسيج كاف متاح لبدء جهود توليد النبات؛ أو الجولات المتكررة المتتابعة للاختيار اليدوي ‎Sa manual selection‏ يكون شكل النسيج مناسب للتوليد ‎(Ji) regeneration‏ على الأقل أسبوعين)؛ ثم يتم النقل إلى وسط توصيل لتكوين النبتة. يتم ‎JB‏ الزروع دورياً حتى يحدث تكوين كافي للنبتة. ما أن تتكون النبتات فإنه يتم نقلهم إلى وسط موصل لتكوين النبتة. وما أن تكونت الجذور الكافية يمكن أن يتم نقل النباتات إلى التربة ‎soil‏ ‎Yo‏ لنمو ونضج ‎maturity‏ أكثر.
هم ربما يتم إجراء تجارب متعددة للتأكد من وجود جزئ الحمض النووي المرغوب المشتمل على معزز 1 المُخلق ثنائي الاتجاه في النباتات المتولدة. وتشمل ‎Jie‏ هذه التجارب على سبيل المثال: المقايسات البيولوجية ‎biological assays‏ مثل تبقيع نورثرن وويسترن ‎PCR,‏ وتجارب بيوكيميائية ‎Jie‏ استكشاف وجود منتج بروتيني ‎protein product‏ ؛ على سبيل المثال بوسائل ‎ELISA) immunological means dela ©‏ رو( أو تبقيع ويسترن الجنوبي ‎(Western blots‏ أو بوظيفة إنزيمية ‎enzymatic function‏ ؛ وتجارب أجزاء النبات؛ مثل تجارب الورقة ‎leaf‏ أو الجذر ‎root‏ وتحليل النمط الظاهري ‎phenotype‏ للنبات ‎SK‏ المتولد ‎whole regenerated‏ .plant ‏باستخدام؛‎ PCR ‏يمكن فحص الحالات التكامل المستهدفة؛. على سبيل المثال؛ بواسطة تضخيم‎ ‏محددة لجزيئات حمض‎ oligonucleotide primers ‏بوادئ أوليجونيوكليوتيد‎ JE ‏على سبيل‎ ٠ ‏يتضمن؛ وليس على سبيل الحصرء‎ PCR ‏نووي محل الاهتمام. من المفهوم أن التنميط الجيني ل‎ ‏مشتقة من‎ DNA ‏لجينومي‎ (PCR) polymerase—chain reaction ‏تفاعل سلسلة بوليميراز‎ ‏نسيج خلين من النبات المضيف المفصول من المتوقع أن يتضمن جزيء حمض نووي محل‎ ‏تم‎ PCR ‏الاهتمام متكامل داخل الجينوم؛ يلي ذلك استنساخ عياري وتحليل تتابع منتجات تضخيم‎
Rios et al. (2002), ‏جيداً (انظرء على سبيل المثال»‎ PCR ‏وصف طرق التنميط الجيني ل‎ V0 ‏مشتقة من أي أنواع نباتات أو‎ DNA ‏01801)؛ ويمكن أن تنطبق على جينومي‎ J. 32:243-3 ‏نوع نسيج؛ بما في ذلك استنبات الخلايا. يمكن استخدام توليفات من بوادئ أوليجونيوكليوتيد التي‎ ‏ترتبط بكلاً من تتابع الهدف والتتابع الداخلة تتابعياً أو بشكل متعدد التضفير في تفاعلات تضخيم‎ ‏يمكن إنتاج بوادئ الأوليجونيوكليوتيد المصممة لتتصلب في الموقع المستهدف؛ تتابعات‎ PCR ‏يمكن أن تشتمل استراتيجيات التنميط‎ JBL ‏حمض نوي الداخلة؛ و/ أو توليفات من اثنين منها.‎ Yo ‏وبدون حصر: تخضيم تتابعات معينة في جينوم النبات؛‎ JE ‏الجيني ل 04 على؛ على سبيل‎ ‏تخضيم تتابعات متعددة معينة في جينوم النبات؛ تخضيم تتابعات غير معينة في جينوم النبات؛‎ ‏وتوليفات من أي مما سبق. يمكن أن يحدد أحد المهرة في الفن توليفات إضافية من بوادئ‎ ‏يمكن تصميم مجموعة من بوادئ‎ (JE ‏وتفاعلات تضخيم _ لفحص الجينوم. على سبيل‎ ملا
أوليجونيوكليوتيد التقدمية والعكسية لتتصلب إلى تتابع (تتابعات) حمض نووي محددة للهدف خارج حدود تتابع الحمض النووي المقدمة. يمكن تصميم بوادئ أوليجونيوكليوتيد ‎oligonucleotide primers‏ تقدمية ‎Forward‏ وحكسية 6 لتتصلب بشكل خاص بجزيء حمض نيوكليوتيد مقدم؛ على سبيل المثال؛ عند تتابع © تقابل لنطاق ترميز داخل تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متضمنة بهاء أو أجزاء أخرى من جزيء الحمض النووي. يمكن استخدام تلك البوادئ بالترافق مع البوادئ الموصوفة أعلاه. يمكن تخليق بوادئ الأوليجونيوكليوتيد وفقاً لتتابع مرغوب فيها؛ وتكون متاحة تجارياً (على سبيل ‎JE‏ من ‎.(Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA‏ يمكن استتساخ التضخيم بعد ذلك وتسلسله؛ أو بواسطة منتجات تضخيم تحليل تتابع مباشر. يمكن أن يتصور أحد المهرة في الفن طرق بديلة لتحليل منتجات التضخيم المتولدة أثناء التنميط الجيني ‎.PCR 1 genotyping‏ في أحد التجسيمات؛ يمكن استخدام بوادئ أوليجونيوكليوتيد محددة لهدف الجين في تضخيمات ‎.PCR‏ ‏تنص بعض التجسيمات الخاصة بالاختراع الحالي أيضاً على خلايا يتضمن معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي؛ على سبيل المثال؛ كما يمكن أن يوجد في تركيب حمض نووي. في أمثلة خاصة؛ ‎Vo‏ _يمكن استخدام معزز 0811 ثنائي الاتجاه تخليقي وفقاً لبعض التجسيمات كتتابع منظمة لتنظيم التعبير الجيني عن ‎DA‏ نبات ونباتات محورة وراثياً. في بعض من تلك الأمثلة؛ يمكن أن يؤدي استخدام معزز 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي متصلة بشكل عملي بتتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام ‎eo)‏ سبيل المثال؛ طفرة وراثية) إلى خفض عدد المعززات المتطابقة المطلوبة لتنظيم التعبير الجيني عن عدد ‎are‏ من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام» و/ أو خفض حجم جزء (أجزاء) ‎line YL‏ للحمض النووي مطلوبة لإدخال عدد معطى من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام. علاوة على ذلك؛ يمكن أن يسمح استخدام معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي ب التعبير المشترك عن تتابعي نيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام تحت نفس الظروف (أي؛ الظروف التي تحتها يتم تنشيظ المعزز 811ل). يمكن أن تكون تلك الأمثلة مفيدة بشكل ‎(pala‏ على سبيل ‎(JB)‏ عندما يساهم كلا متواليتي النيوكليوتيد متصلة بشكل عملي محل الاهتمام إلى صفة واحدة ‎YO‏ في مضيف معدل ‎Gauls Wily‏ تتابعات النيوكليوتيد محل الاهتمام؛ والتعبير الجيني المشترك عن ‎tive‏
تتابعات النيوكليوتيد محل الاهتمام الآثار المفيدة للتعبير الجيني عن الصفة في المضيف المعدل ‎transgenic host Lil,‏ في بعض التجسيمات؛ يمكن أن يكون لنبات معدّل ‎Wh‏ يتضمن واحد أو أكثر من معزز (معززات) 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي و/ أو تتابع (تتابعات) نيوكليوتيد محل الاهتمام به واحدة أو أكثر من الصفات المرغوب فيها ممنوحة (على سبيل المثال؛ متقدمة؛ معززة؛ أو مساهمة في) عن طريق التعبير (التعبيرات) الوراثقي عن تتابع النيوكليوتيد محل الاهتمام في النبات. يمكن أن تشتمل تلك الصفات على؛ على سبيل ‎JE‏ وبدون حصر: مقاومة الحشرات ‎«insects‏ الآأفات 15 الأخرى؛ وعوامل مسببة للمرض ‎disease-causing agents‏ ؛ التحمل لمبيدات الأعشاب؛ وتعزيز الاستقرارء والغلة ‎yield‏ ؛ أو العمر الافتراضي ‎shelf-life‏ ؛ التحمل البيثي ‎environmental tolerances ٠٠‏ « وانتاج الأدوية ‎pharmaceutical production‏ ؛ الإنتاج الصناعي ‎industrial product production‏ ؛ والتحسينات الغذائية ‎nutritional‏ ‎.enhancements‏ في بعض الأمثلة؛ يمكن منح سمة مرغوب فيها بواسطة تحول نبات باستخدام جزيء حمض نووي يتضمن معزز 811ل ثنائي الاتجاه تخليقي متصلة بشكل عملي بتتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام. في بعض ‎AB)‏ يمكن منح سمة مرغوب ‎led‏ إلى نبات منتج في صورة نبات ‎AD‏ عن طريق ‎cpl‏ حيث يمكن منح تلك الصفة بواسطة واحد أو أكثر من تتابعات نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بمعزز 511لا ثنائي الاتجاه تخليقي الذي/ ألتي تمر إلى النبات من النبات الأصلي الذي يتضمن تتابع نيوكليوتيد محل الاهتمام متصلة بشكل عملي بمعزز 811لا ‎AW‏ الاتجاه تخليقي. يمكن أن أي نبات ‎Jie‏ وراثياً وفقاً لبعض التجسيمات عبارة عن أي نبات يمكن أن يكون محول ‎٠‏ باستخدام جزيء حمض نووي للاختراع؛ أو تكون مولدة باستخدام نبات المحولة باستخدام جزيء حمض نووي للاختراع. وفقاً لذلك؛ يمكن أن يكون النبات ثنائي أو أحادي الفلقة. تشتمل الأمثلة غير المقيدة للنباتات ثنائية الفلقة للاستخدام في بعض الأمثلة على: البرسيم؛ الفول؛ القرنبيط؛ الملفوف»؛ زيت الكانولاء والجزر؛ القرنبيط؛ الكرفس؛ الملفوف الصيني؛ القطن؛ الخيار؛ الباذنجان؛ الخس؛ البطيخ؛ البازلاء؛ الفلفل؛ الفول السوداني؛ البطاطا؛ اليقطين؛ الفجل؛ اللفت؛ السبانخ؛ فول ‎Yo‏ الصوياء الكوساء بنجر السكر؛ عباد الشمس؛ التبغ؛ الطماطم؛ والبطيخ. تشتمل الأمثلة غير المقيدة ملا
‎A —‏ أ — للنباتات أحادية الفلقة للاستخدام في بعض الأمثلة على: الذرة؛ البصلء والأرزء الذرة؛ القمح؛ الجاودار؛ الدخن؛» قصب السكرء الشوفان؛ التريتيكال» التبن ‎switchgrass‏ ؛ والمروج ‎turfgrass‏ ‏في بعض التجسيمات؛ يمكن استخدام أو زراعة نبات ‎Jie‏ وراثياً بأي طريقة؛ حيث يكون من المرغوب فيه وجود معزز 811لا ثنائي الاتجاه تخليقي و/ أو تتابع نيوكليوتيد متصلة عملياً محل الاهتمام. وفقاً لذلك؛ يمكن تعديل تلك النباتات المعدلة وراثياً هندسياً؛ في مجمل ‎se)‏ ليكون بها واحدة أو أكثر من الصفات المرغوب فيها؛ من خلال تحويلها باستخدام جزيئات حمض نووي وفقاً ‎op lanl‏ ويمكن اقتصاصها و/ أو زراعتها بواسطة أي طريقة معروفة لأولئك المهرة في الفن. في حين تم وصف الاختراع بالإشارة إلى الطرق والتجسيمات الخاصة؛ فإنه سوف يتم إدراك أنه يمكن إجراء التعديلات والتغيرات المختلفة بدون الحيود عن مجال الاختراع. تتم تقديم الأمثلة التالية لتوضيح السمات و/ أو التجسيمات الخاصة. يجب عدم اعتبار الأمثلة مقيدة للكشف بالسمات المحددة أو التجسيمات النموذجية. الأمثلة تحول الأجرعية المورمة ‎:Agrobacterium tumefaciens‏ يتم تحويل ناقل ‎pDAB108706‏ ‎Vo‏ ثنائي إلى الأجرعية المورمة صبغة 0/8813192 ثلاثي (براءة اختراع أمريكية مؤقتة رقم ‎/1١‏ ‏458)؟). تم فصل مستعمرات باكتيرية ‎Bacterial colonies‏ وبلازميد ثنائي ‎binary‏ ‎DNA plasmid‏ وتأكيدها عن طريق تصميم إنزيم تقييد ‎restriction enzyme‏ تحويل الذرة ‎:Corn Transformation‏ تعقيم كوز الذرة ‎Ear Sterilization‏ وفصل الأجنة ‎[Embryo Isolation‏ للحصول على أجنة ذرة غير ناضجة ‎immature embryos‏ 008126 ‎Yo‏ تتم إنماء نباتات من ‎(c.v. 8104( Zea mays‏ في الصوبة ‎greenhouse‏ وتلقيح ذاتي أو أشقائي لإنتاج السنبلة . تم تجميع السنابل ‎ears‏ تقريباً ‎١7-١‏ يوم بعد التلقيح. في يوم التجربة؛ يتم تعقيم سطح السنابل عن طريق الغمر ‎immersion‏ محلول ‎9067١0 solution‏ من ‎ane‏ ‏صوبة ‎household bleach‏ حيث يحتوي على 900 هيبوكلوريت صوديوم ‎sodium‏ ‏ملا
-١4-
‎chypochlorite‏ والهز لمدة ‎0-7١‏ دقيقة؛ يلي ذلك ثلاث شطفات ‎rinses‏ في ماء معقم ‎aay sterile water‏ التعقيم ‎«sterilization‏ & تشريح الأجنة الملقحة غير الناضجة ‎Y.Y=).0) immature zygotic embryos‏ مم) في جو معقم من كل سنبلة وتوزيعها بشكل عشوائي في أنابيب طرد مركزي ‎tubes‏ ©71010-081011109 دقيقة تتضمن وسط إصابة سائل ‎(LS Basal Lug) ©‏ 47.؛ جم/ لتر؛ محلول قيتامين ‎«[Xy +++] N6 Vitamin Solution‏ ‎[de ٠‏ لتر؛ ا- برولين ‎Vero c proline‏ مجم/ لتر؛ سكروز ‎[o> 16.2 «sucrose‏ لتر؛ جلوكوز ‎faa 71.0 (glucose‏ لتر؛ ‎oY‏ ؛- ‎٠.5٠0 lf‏ مجم/ لتر. بالنسبة لمجموعة معطاة من التجارب؛ وسحب الأجنة ‎embryos‏ من ‎YY‏ ستابل تم استخدام لكل معالجة
‎treatment
‎Glycerol ‏يتم تخطيط جليسرول‎ :Agrobacterium Culture Initiation ‏ددء مزرعة الأجرعية‎ ٠ ‏الموصوفة أعلاه على أطباق أدنى وسط‎ binary vectors ‏من الأجرعية تتضمن النواقل الثنائية‎ ‏أيام. تم التقاط‎ =F ‏درجة مئوية لمدة‎ ٠١ ‏تتضمن مضادات حيوية ملائمة وتم إنماءها عند‎ AB ‏تتضمن نفس المضادات الحيوية وتم احتضانها عند‎ YEP ‏مستعمرة واحدة وتبقيعها على أطباق‎ ‏يوم.‎ 7-١ ‏درجة مئوية لمدة‎ YA
‏5 ثم أخذ مزرعة الأجرعية ‎Agrobacterium Culture‏ والاستنبات المشترك ‎:Co—cultivation‏ ‏في يوم التجربة؛ المستعمرات الأجرعية من ‎YEP Gila‏ معلق في ‎٠١‏ مل من وسط إصابة في أنبوب ‎tube‏ يمكن التخلص ‎dle‏ سعة ‎cde 5٠0‏ وتم تعديل كثافة الخلية ‎cell density‏ إلى ‎4١.7 = OD600‏ نانو ‎je‏ باستخدام مقياس طيف ضوئي ‎.spectrophotometer‏ تم وضع استنباتات الأجرعية على هزاز دوار ‎rotary shaker‏ عند ‎٠٠١‏ لفة بالدقيقة؛ درجة حرارة
‎٠‏ الغرفة ‎room temperature‏ ؛ أثناء تشريح الجنين ‎.embryo dissection‏ تم فصل الأجنة الملقحة غير الناضجة بين ‎7.7-٠.9‏ مم في الحجم من حبات الذرة المعقمة ‎sterilized maize‏ ‎kernels‏ ووضعها في ‎١‏ مل من وسط الإصابة وغسلها مرة واحدة في نفس الوسط. تمت إضافة معلق الأجرعية ‎Y) Agrobacterium suspension‏ مل) إلى كل أنبوب وتم قلب الأنابيب حوالي ‎Yeo‏ مرة ثم هزها لمدة ‎١5-٠١‏ دقيقة. تم نقل الأجنة على وسط الاستنبات المشترك
‎co—cultivation media Yo‏ (أملاح ‎(MS‏ 77.؛ _جم/_لتر؛ ‎—L‏ برولين» ‎7٠٠0.٠‏ مجم/ لتر؛
‏ملا
Vm casein ‏إنزيمى للكازين‎ Sle ‏مجم/ لتر؛ ناتج تحلل‎ ٠٠٠.١ » myo=inositol ‏إنوسيتول عضلي‎ ‏جم/‎ ٠٠٠١ ‏مجم/ لتر؛ سكروز»‎ 7.٠١ - ‏مجم/ لتر؛ ديكامبا‎ ٠٠٠.١ enzymatic hydrolysate
AgNO3 ‏لتن‎ [de ٠٠٠١ [XV ov] ‏معدل‎ MS - ‏لتر ؛ قيتامين‎ [aa ٠.٠١ (Gelzan™ ‏لتر ؛‎ ‏ميكرو مولار)؛ موجه باستخدام‎ ٠٠١ ‏؛‎ Acetosyringone ‏مجم/ لتر؛ أسيتو سيرينجون‎ ٠ ‏درجة مئوية.‎ Yo ‏عند‎ light ‏أيام في الضوء‎ 6-7 sad ‏قصيغة موجهة لأعلى؛ والاحتضان‎ © يمكن ملاحظة ‎GUS‏ والتعبير الجيني العابر ‎YFP/Phiyfp :YFP/Phiyfp‏ عابر والتعبير عن ‎GUS‏ في الأجنة المحولة وبعد ؟ أيام من الاستنبات المشترك باستخدام الأجرعية. تمت ملاحظة الأجنة تحت ميكروسكوب مجسم ‎(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)‏ باستخدام مرشح ‎YFP filter‏ ومصدر ضوء ‎5٠0 light source‏ نانو متر. يتم اختيار الأجنة التي تعرض ‎٠‏ التعبير الجيني عن 70/001710 لتجربة نسيجية ‎GUS‏ يتم تحضير محلول تلطيخ ‎staining‏ ‎GUS solution‏ كما هو موصوف في )1989( ‎Maniatis etal.‏ ويتم احتضان ‎incubated‏ ‏الأجنة في ‎١‏ مل من محلول لمدة ‎YE‏ ساعة عند ‎YY‏ درجة مئوية. تمت ملاحظة الأجنة للتعبير الجيني ‎GUS‏ العابر تحت المجهر. اختيار واعادة توليد كالس ‎ge Callus‏ حالات مفترضة: _بعد فترة الاستنبات المشترك ‎co—cultivation period Yo‏ ؛ تم نقل الأجنة إلى وسط استقرار ‎resting media‏ (أملاح ‎MS‏ ‎£.7Y‏ جم/ لتر؛ ا- برولين» ‎7٠0000‏ مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ ‎MES ¢ il‏ ‎(aes)‏ 7-(0- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)» حمض حر] 500060 مجم/ لتر؛ تحلل ‎le‏ ‏لكازين إنزيمي ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ديكامبا؛ ‎7.٠١‏ مجم/ لتر؛ سكروز» ‎٠٠٠١‏ جم/ لتر؛ ‎Gelzan‏ ‎faa ٠‏ لتر؛ قيتامين- ‎MS‏ معدل ‎[de ٠٠٠١ »]24٠٠0[‏ لتر؛ 891103 ‎١5.١‏ مجم/ لتر؛ ‎٠‏ كاربينيسيلين ‎Carbenicillin‏ ؛ 150.0 ‎[ase‏ لتر) بدون عامل انتقائي والاحتضان في ‎YE‏ ساعة تعرض للضوء بشدة ضوء ‎5٠0 light intensity‏ ميكرو مول. متر-؟.ثانية-١‏ لمدة 7 ‎all‏ عند ‎YA‏ درجة مئوية. تم نقل الأجنة على وسط اختيار ‎١‏ (أملاح ‎(MS‏ 77.؛ ‎fan‏ لتر؛ 1- برولين؛ ‎٠6‏ مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ‎MES‏ [بحمض ‎—N)=Y‏ مورفولينو)- إيثان سلفونيك ‎acid‏ 10016ا18065©-(0-0001000100)-2) حمض حر ‎[free acid‏ 58 .2060.2 مجم/ لتر؛ تحلل ‎Sle‏ لكازين إنزيمي ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ‎7.٠١ Lala‏ مجم/ لتر؛ ملا
VI
سكروزء ‎2٠0١‏ جم/ لتر؛ ‎Gelzan™‏ 7.30 جم/ لتر؛ قيتامين - ‎٠٠٠١ [XY 000] Jae MS‏ ‎[a‏ لتر؛ ‎١5.٠ (AgNO3‏ مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» 790.0 مجم/ لتر) تتضمن ‎٠٠١‏ نانو ‎Jie‏ ‏هالوكسيفوب ‎haloxyfop‏ والاحتضان في ‎YE‏ ساعة ضوء بكثافة ضوء ‎٠ ٠‏ ميكرو مول دقيقة- ".ثانية ‎١-‏ لمدة 7 أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. ‎ao‏ نقل الأجنة ذات كالس تخلقي تكاثري ‎embryogenic calli‏ على وسط اختيار ؟ (أملاح ‎(MS‏ 5.77 جم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ا- ‎Yorn colon‏ مجم/ لتر؛ ‎MES‏ [(حمض 7-(”- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر] ‎5000٠‏ مجم/ لتر؛ تحلل مائي لكازين إنزيمي ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ديكامبا؛ ‎7.7٠0‏ مجم/ لتر؛ سكروز؛ ‎fan ٠٠٠٠١‏ لتر؛ ‎[aa 1.30 Gelzan™‏ لتر؛ شيتامين- ‎[da ٠.٠١ [XY eu] Jie MS‏ لترء؛ ‎AGNO3‏ ‎Your)‏ مجم/_لتر؛ كاربينيسيلين»؛ 9080.0 مجم/ لتر) تتضمن 0860© نانو متر هالوكسيفوب واحتضانها في ؛ 7 ساعة ضوء بكثافة ضوء ‎٠٠‏ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ‎sad ١-‏ أخرى ‎VE‏ ‏أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. تسمح خطوةٍ الاختيار هذه للنسيج اللين المعدل الوراثياً بتكاثر وتمايز إضافي. يستغرق اختيار النسيج اللين مدة ثلاث أسابيع. تم نقل كالس تخلقي تكاثري على وسط ‎sale)‏ توليد ‎١‏ (أملاح ‎MS‏ 77.؛ ‎fan‏ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ ا- برولين؛ ‎You. No‏ مجم/ لتر؛ ‎MES‏ [إ(حمض ‎—N)=Y‏ مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض ‎٠75٠٠0 [a‏ مجم/ لتر؛ تحلل ‎Ale‏ لكازين إنزيمي 5000 مجم/ لتر ؛ ‎٠.503٠ NAA‏ مجم/ لتر ؛ ‎٠.٠٠١ ABA‏ مجم/_لتر؛ /8 ‎٠..١‏ مجم/ ‎Al‏ ¢ سكروزء ..45 ‎faa‏ لتر؛ ‎Yoo Gelzan™‏ جم/_لتر؛ قيتامين - ‎MS‏ معدّل ‎٠.٠١ (XY ni]‏ مل/ لتر؛ ‎٠.٠١ AGNO3‏ مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين؛ ‎٠‏ ؟ مجم/ لتر) تتضمن ‎©٠0٠0‏ نانو ‎jie‏ هالوكسيفوب والاستنبات في ‎YE‏ ساعة ضوء بكثافة ‎Yo‏ ضوء ‎٠٠‏ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ‎١-‏ لمدة 7 أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. تم نقل كالس تخلقي مع براعم ‎buds‏ الفسيلة ‎shoot‏ على وسط إعادة توليد ‎١‏ (أملاح ‎A) fan 5.77 (MS‏ فيتامين - ‎MS‏ معدّل [000٠6ل]» ‎٠٠٠١‏ مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎٠٠٠٠١‏ مجم/ لتر؛ سكروز؛ ‎٠٠٠٠‏ جم/ لتر؛ ‎faa ٠.٠١ Gellan Gum G434™‏ لتر؛ كاربينيسيلين» ‎75٠8.0‏ مجم/ ‎(A‏ ‏تتضمن ‎©٠0٠0‏ نانو متر هالوكسيفوب. تم احتضان الاستنبات تحت الضوء لمدة ‎Yi‏ ساعة بكثافة ‎YO‏ ضوء ‎٠‏ ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ‎١-‏ لمدة ‎٠١-١‏ أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. تم نقل الفسائل ما shoot elongation ‏لإطالة الفسيلة‎ primary roots ‏بجذور أساسية‎ Small shoots ‏الصغيرة‎ ل٠٠٠‎ ١[ ‏معدّل‎ MS - ‏لتر ؛ قيتامين‎ [ox 7١ (MS ‏(أملاح‎ rooting media ‏ووسط تجذيري‎
Gellan Gum ‏لتر ؛‎ [aa ٠٠٠١ ‏مجم/ لتر؛ سكروز»‎ ٠٠٠٠١ ‏مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي»‎ ٠
MAGENTA™ ‏مجم/ لتر) في صناديق‎ 75900.٠0 ‏جم/_لتر؛ كاربينيسيلين»‎ 2... G434™ ‏ساعات ضوء/ ظلام لمدة لا‎ A /١١ ‏واحتضانها تحت‎ (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ه٠‎ أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. تم تحليل الشتلات المعدلة وراثياً المطنونة لتحديد عدد النسخ المعدلة ‎Ls‏ ونقل إلى الصوبة. ‏المثال ‎:١‏ تكوين معزز 511لا ‎AUS‏ الاتجاه تخليقي وناقل ‎pPDAB108706‏ ‏تم عرض رسم تخطيطي نموذجي لمعزز ‎Ubiquitin—1‏ للذرة ‎(Ubil)‏ في ‎.١ Jal‏ تم استنساخ ‎PCR ‏لبلازميد تتضمن المعزز باستخدام نظام تضخيم‎ PCR ‏معزز 011لا من الذرة. تم تضمين‎ ٠ ‏منطقة نيوكليوتيد من معزز 53 511لا في صورة معزز أساسي‎ Yoo ‏عالي الدقة. تم تعريف تقريباً‎ ‏بعد ذلك تمت إضافة‎ .)١ ‏(©5011لا10) (هوية تتابع رقم:‎ Zea mays Ubil ‏أدنى‎ ‎Zea ‏يتضمن إكسون‎ (Y ‏إلى بولي نيوكليوتيد (هوية تتابع رقم:‎ ١ ‏بهوية تتابع رقم:‎ 0100011 ‏(إنترون‎ Zea mays Ubiquitin—1 ‏وانترون‎ (ZmUbil ‏(إكسون‎ mays Ubiquitin—1 ‎(ZmUDbIT ١٠‏ باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في الفن لإنتاج عديد النيوكليوتيد بهوية تتابع رقم: ‎LY‏ بعد ذلك تم استنساخ ضد الاتجاه عديد النيوكليوتيد الناتج في اتجاه عكسي لحمض نووي يتضمن معزز الذرة 011لا (بما في ذلك تتابع 511لا المنظمة للضد الاتجاه (5+الا))؛ (هوية تتابع رقم: 4) لإنتاج معزز 011لا ثنائي الاتجاه التخليقي بهوية تتابع رقم: © (انظر على سبيل المثال الشكل 0( ‎٠‏ تتم استتساخ تتابعات ترميز جين مراسل بعد كل نهاية من معزز 011لا ‎SU‏ الاتجاه التخليقي. تم إدخال تتابع ترميز بروتين تفلور أصفر ‎(YIP)‏ بعد شظية عديدة النيوكليوتيد حيث تتضمن عناصر معزز ‎aminUbilP‏ إكسون ‎ZmUbIL‏ وانترون 011ل200. بالإضافة لذلك؛ تتابع قائدة تالية تتضمن تتابع توقف عديدة النيوكليوتيد ذات 7 إطارات وتم إضافة تتابع عديدة النيوكليوتيد ‎(Koza)‏ تتوافق مع الذرة إلى شظية عناصر معزز 0115ل00101؛ إكسون 011ل2000؛ وانترون ‎.ZmUbil 5‏ تم إدخال تتابع ترميز ‎(GUS)‏ انا بعد معزز 011لا ‎AW‏ الاتجاه التخليقي في ‏ملا
اتجاه عكسي بالنسبة لتتابع ‎Yip‏ (هوية تتابع رقم: 6؛ انظر الشكل ‎١‏ على سبيل المثال). يتم استنساخ عديد النيولوكتيد الناتج يتضمن معزز 011لا ثنائي الاتجاه التخليقي متصلة بشكل عملي .pDAB105801 ‏إلى بلازميد‎ GUS, yfp ‏بجينات‎ تم استكمال الناقل الثنائي الذي يتضمن مجموعات التعبير الجيني للجين ‎YFP GUS‏ من
GATEWAY L-R CLONASETM ‏عن طريق تفاعل‎ pDAB105801 ‏بلازميد‎ © ‎(Invitrogen, Carlsbad, CA)‏ يحتوي الناقل الناتج» ‎pDABI08706‏ على مجموعات ‏التعبير الجيني للجين ‎GUS‏ 0لا و880-1 داخل منطقة سلالة ‎T‏ (انظر الشكل ‎eco‏ سبيل ‏المثال). ‏المثال ؟: التعبير الجيني عن جينات عابرة متصلة بشكل عملي بمعزز 1 ‎Ubiquitin‏ ثنائي ‎١ ٠‏ الاتجاه تخليقي ‏يمكن تصوير الأمثلة النموذجية للتعبير الجيني العابر عن ‎GUS, YFP‏ في أجنة ‎Zea mays‏ ‏محولة باستخدام 00/85108706. يمكن أن يحرّك كلا جانبي معزز 011لا20 ثنائي الاتجاه ‏التعبير الجيني القوي عن تتابعات ترميز ‎GUS 5 YFP‏ المرتبطة عملياً. يكون التعبير الجيني عن ‏مستويات 10لا مقارناً ب التعبير عن مستويات ‎GUS‏ تؤكد تلك الملاحظات أن كلا من جانبي ‎VO‏ معزز 70011 ثنائي الاتجاه تكون بوظيفة بيولوجية. علاوة على ذلك ¢ ‎Sas‏ أن يعبر عنصر ‎minUbilP‏ لمعزز 811لا ثنائي الاتجاه التخليقي عن ‎Yip‏ عند مستويات تعبير مشابه مقارنة ‏بنسيج ‎Zea mays‏ لين محول باستخدام بلازميد ثنائي (00/8101556) التي تتضمن معزز ‏معزز ‎ZmUbil‏ ثنائي الاتجاه لتتابع ترميز 0]لا. لا يتم كشف التعبير الجيني عن 775 أو ‎binary ‏في أجنة غير ناضجة مقارنة سالبة التي لا تكون محولة باستخدام تركيب ثنائى‎ GUS
GUS ‏؛ ولا تحتوي على تتابعات ترميز 10لا أو‎ construct. ‏المثال ؟: التعبير الجيني المستقر عن جينات متصلة بشكل عملي بمعزز 1 ‎Ubiquitin‏ ‏الاتجاه تخليقي ‏يمكن ملاحظة صور ‎WIA‏ نسيج ‎Zea mays‏ لين التي تكون مستقرة المحولة باستخدام ناقل ‏م
كلا أجنة ‎mays‏ .2 التي تم نشرها على وسط اختيار ‎oY‏ يمكن أن يحرّك معزز 20100811 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن تتابعات ترميز 10لا. تؤكد تلك النتائج أن عنصر أدنى معزز ‎Min-UbilP‏ من معزز 20000811 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين مبلْغْ في خلايا نسيج ‎MAYS‏ .> لين محولة بشكل مستقر. تكون مستويات التعبير الجيني عن بروتين ‎Yio‏ ‏© متشابهة مقارنةٌ بالتعبير عن ‎YFP‏ أو ‎GUS‏ في نسيج ‎mays‏ .2 اللين المحول باستخدام ناقل ثنائي مقارن الذي يحتوي على معزز ‎ZmUbil‏ موحد الاتجاه تتابع ترميز ‎YFP‏ ‏(00/88101556). لا يتم كشف التعبير الجيني عن 10لا أو ‎GUS‏ في النسيج اللين المقارن السالب الذي لا يكون ‎Yona‏ باستخدام تركيب ثنائى ولا يحتوي على تتابع ترميز ‎yfp‏ أو ‎GUS‏ ‎ro JE‏ تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً باستخدام ‎Real Time TagMan® PCR‏ ‎٠‏ تم تحويل أجنة ‎Zea mays‏ باستخدام ناقل ثنائي تتضمن ‎ire‏ 20000811 ثنائي الاتجاه؛ 6هه وتم تحويل نباتات أخرى باستخدام ناقل ثنائي ‎«lie‏ 00/8101556. تم تأكيد وجود ‎yp‏ محورة وراثياً داخل جينوم لكل مجموعة من نباتات ‎Mays‏ .2 عن طريق مقايسة ‎probe assay lw‏ للتحلل المائي. تم الحصول على شتلات ‎Z. mays‏ معدلة ‎Lily‏ محولة بشكل مستقر نمت من النسيج اللين وتحليلها لتعريف الحالات التي تحتوي على عدد نسخ منخفض ‎7-١( ١‏ نسخة) لوليجات جديلة-1 ‎T-strand inserts‏ بطول كامل من ناقل ‎PDAB108706‏ ‏ثنائي وناقل 000/8101556 ‎SUS‏ مقارن. تم نقل الشتلات المعرفة إلى الصوبة وانماءها. تم استخدام نظام ‎Roche‏ للضوء "07201624807 لتحديد عدد النسخ المعدلة وراثياً للحالات التي تكون محولة باستخدام ناقل 0008108706 ثنائي؛ و لأحداث مقارنة تكون محولة باستخدام ناقل 6 ثائي. تستخدم الطريقة تفاعل ‎TaqMan®‏ ثنائي الضفيرة الذي يستخدم ‎٠‏ . أوليجونيوكليوتيدات محددة للجين 10لا وإلى جين مرجعي ‎mays‏ .2 داخلي ‎laid‏ إنقيرتاز 6 (رقم الانضمام لبنك الجينات: 16123.1لا)؛ في تجربة واحدة. تم تحديد عدد النسخ والتلقيح ‎Zygosity‏ عن طريق قياس شدة ‎—yfp‏ المحددة لتفلور ‎fluorescence‏ بالنسبة لتفلور الإنقيرتاز النوعي؛ مقارنةً بمعايير عدد النسخ المعروف.
اج 7 _ في ‎mays‏ .2 المحولة باستخدام ناقل 0100/8108706 ثنائي؛ يتم تضخيم شظية جين 10لا - محدد 1 ‎DNA‏ باستخدام مجموعة_بادئة/_مسبار ‎TAQMAN®‏ واحدة ‎Jae est‏ مرقم باستخدام ‏ صبغة تفلور ‎FAM‏ .وتم تضخيم إنقيرتاز باستخدام مجموعة ‎De [Ral‏ ‎TAQMAN®‏ ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام ‎HEX‏ تفلور (الجدول 7). يتم تحضير خليط © تفاعل ‎PCR‏ كما هو مذكور في الجدول ‎oF‏ وتم تضخيم ‎DNA Las‏ المحدد للجين وفقاً للظروف المذكورة في الجدول 4. تم تحديد عدد النسخ لقاحات العينات عن طريق قياس الكثافة النسبية للتفلور المحدد للجين المراسل؛ 10لا؛ إلى تفلور محددة للجين المرجعي؛ ‎lx‏ مقارنة بمعايير عدد النسخ المعروف. الجدول ‎LY‏ بادئ نيوكليوتيد تقدمي وعكسي ومسبارات تفلور ‎fluorescent probes‏ (مخلقة ‎٠‏ بواسطة ‎(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA‏ بادئة ‎YFP‏ تقدمية هوية تتابع رقم: ‎GATGCCTCAGTGGGAAAGG | V‏ بادئة ‎YFP‏ عكسية هوية تتابع رقم: ‏ | ‎CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA‏ ‏مسبار ‎ROCHE UPL jl YFP‏ رقم ‎١١١‏
CTTGGAGC
Roche, ) Cat 04693604001 ‏رقم‎ (Indianapolis, IN
TGGCGGACGACGACTTGT | 4 ‏هوية تتابع رقم:‎
AAAGTTTGGAGGCTGCCGT | ٠١ ‏هوية تتابع رقم:‎ 5'HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTAC | ١١ ‏مسبار إنقيرتاز هوية تتابع رقم:‎
TTCTACC/3BHQ_1/3'
TGTTCGGTTCCCTCTACCAA | ١١ ‏هوية تتابع رقم:‎ دما
‎h —‏ 7 — معزز ‎AADT‏ عكسي | هوية تتابع رقم: ‎CAACATCCATCACCTTGACTGA | ٠١‏ مسبار ‎AAD]‏ هوية تتابع رقم: ‎CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA | ١4‏ تم تكوين المعايير عن طريق تخفيف الناقل» 0108108706 في 5104 ‎mays‏ .2 جينومي ‎(9DNA) DNA‏ للحصول على معايير بعلاقة معروفة ل ‎.gDNA :pDAB108706‏ على سبيل المثال؛ تم تحضير العينات التي بها نسخة واحدة؛ نسخيتن؛ أربع نسخ لناقل ‎DNA‏ لكل نسخة من ‎mays 8104 gDNA‏ .2. تم تقييم تخفيفات نسخة واحدة ونسختين من 8108706نام © المختلطة باستخدام معيار ‎mays 8104 gDNA‏ .2 مقابل حالة ‎Zo mays‏ مقارن تكون معروفة بأنها أحادية التلقيح» وحالة ‎mays‏ .2 مقارن تكون معروفة بأنها ثنائية التلقيح (حالة ‎Z.‏ ‎¢YVA mays‏ انظر منشور براءة الاختراع الدولي ‎PCT‏ رقم ‎(WO 2011/ 022469 A2‏ تم إجراءة تجربة ‎TagMan®‏ ثنائية الضفيرة باستخدام أوليجونيوكليوتيدات محددة لجين ‎AAD]‏ ‏وأوليجونيوكليوتيدات محددة لجين مرجع ‎mays‏ .2 داخلي ‎Gla andl‏ عن طريق تضخيم ‎Vo‏ وكشف شظية ‎DNA‏ محددة للجين ل 01 باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار ‎TAQMAN®‏ ‏واحدة تتضمن مسبار مرقم باستخدام صبغة تفلور ‎FAM‏ وعن طريق تضخيم وكشف شظية ‎DNA‏ محددة للجين لإنقيرتاز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار ‎TAQMAN®‏ ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام ‎HEX‏ تفلور (الجدول 7). تم تحضير خليط تفاعل ‎AAD] TagMan®‏ كما هو مذكور في الجدول 7 وتم تضخيم الشظايا المحددة وفقاً للظروف المذكورة في الجدول ‎cE‏ ‎١٠‏ الجدول ؟. خليط تفاعل ‎.JTAQMAN® PCR‏ عدد التفاعلات ميكرو لتر لكل | التركيز النهائي منها " م
— 7 7 — تم تحليل مستوى التفلور المولد لكل تفاعل باستخدام ™480 ‎Roche LightCycler‏ ‎Thermocycler‏ وفقاً لتوجيهات المصنّع ‎.manufacturer’s directions‏ تم تنفيذ شق التفلور ‎FAM fluorescent moiety‏ بكثافة بصرية ‎density‏ 001108 تبلغ ¢70[ ‎oY.‏ نانو مترء وتم © إثارة جزيء الفلور ‎HEX‏ بكثافة بصرية تبلغ ‎OA [OV‏ نانو متر. تم تحديد عدد النسخ عن
طريق مقارنة قيم مستهدفة/ مرجعية للعينات غير المعروفة (حصيلة بواسطة ‎LightCycler‏ ‎JY) (480™‏ قيم مستهدفة/ مرجعية لأربع معايير عدد النسخ المعروف ‎-١ Null)‏ نسخة ‎(hemi)‏ 7- نسخة ‎(homo)‏ و؟ -نسخ). الجدول 4. ظروف الدورة الحرارية ‎Thermocycler conditions‏ لتضخيم ‎PCR‏
درجة الحرارة خطوات ‎PCR‏ الزمن عدد الدورات
(درجة مثوية)
ملا
‎A —_‏ 7 _ ‎A q0‏ ثواني 4 تم عرض النتائج من تحليل عدد النسخ المعدلة وراثياً لنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيب ثنائي الاتجاه معزز ‎«(PDAB108706) ZmUbil construct‏ ونباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام معزز موحد الاتجاه مقارن تركيب ‎(pPDABL101556) ZmUbil YFP‏ في الجدول ©. تم نقل النباتات فقط باستخدام ١-؟‏ © نسخة من تحويل ‎Yip‏ إلى الصوبة لتحليلات التعبير الجيني الإضافي. الجدول 0 تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً للنباتات المعدلة وراثياً التي تم الحصول عليها من تركيب معزز ثنائي الاتجاه وتركيب ‎construct‏ مقارن. . عدد الحالات تركيب عدد الأجنة المحولة ‎7-١‏ نسخة من ‎yp‏ ‏الموجبة ‏المثال 6: التعبير الجيني المستقر للنبات بالكامل عن جينات متصلة بشكل عملي بمعزز 81 ثنائي الاتجاه تخليقي. كل النباتات التي ‎gga‏ على عدد ‏ نسخ منخفض ‎aed ge T-DNA‏ الثنائي 6ه والنباتات التي تحتوي على عدد نسخ منخفض من البلازميد الثنائي المقارن 6ه تم إنماء في صوبة. تم تحليل الأمثلة النموذجية للتعبير الجيني المستقر عن ‎YFP‏ في الورق ونسيج جذر نباتات ذرة ‎TO‏ مطفرة تم الحصول عليها من أجنة ‎Z. mays‏ دما
-"١74- ‏ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن 10لا ترمز تتابعات في كلا من أنسجة الورق‎ 1 ‏في معزز‎ Min-UbiP1 ‏وأنسجة الجذر. يؤكد التحليل المجهري أيضاً أن عنصر أدنى معزز‎ ‏ثنائي الاتجاه يمكن أن يحرّك بلازميد ثانوي مقارن (00/8101556) يحتوي على‎ 1 ‏توضح النباتات المقارنة أيضاً‎ YD ‏ثنائي يحرّك التعبير الجيني عن تتابع ترميز‎ ZmUDIT ‏معزز‎ ‎root tissues ‏وأنسجة الجذر‎ leaf tissues ‏في أنسجة الورق‎ YFP ‏تعبير مستقر عن‎ © ‏ثنائي الاتجاه‎ Ubiquitin] ‏لجينات متصلة بشكل عملي بمعزز‎ Western ‏تحليل بقعة‎ :١ ‏المثال‎ ‏ذرة‎ TO ‏تم أخذ عينات من نباتات‎ :Total Soluble Protein ‏إجمالي بروتين قابل للذوبان‎ ‏تم أخذ عينات من إجمالي أربع‎ ./6 developmental stage ‏محولة عند المرحلة التنموية‎ matrix ‏الأصغر في أنبوبة مصفوفة‎ unfolded leaf ‏ورقات مشتراة من الورق غير المطوي‎ ٠ negative ‏بالنسبة للضابط السلبى‎ .01811* box ‏ووضعها داخل صندوق مصفوفة‎ tube ‏تم أخذ عينات من أربع ورقات مشتراة من نبتتين من ذرة 8104 غير محولة عند‎ ¢ control ‏في أنابيب‎ steel bead ‏في أنبوب مصفوف. يتم وضع كرية صلبة‎ ١/6 ‏المرحلة النموية‎ ‏إلى كل أنبوب. تم تغطية‎ PBST ‏المصفوفة مع العينات؛ وبعد ذلك يتم إضافة 50860 ميكرو لتر‎ ‏لفة بالدقيقة لمدة‎ ١٠5٠١ ‏عند‎ bead ‏الأنابيب؛ واستخلاص البروتين عن طريق تحويل إلى كريات‎ Yo ‏عن طريق الطرد المركزي‎ Debris ‏في مطحنة أنسجة 6600. يتم وضع البقايا‎ Go .centrifugation ‏في طبق بقياس‎ PBST ‏ميكرو لتر باستخدام‎ Yo ‏تم تخفيف عينة © ميكرو لتر من كل أنبوب إلى‎ ‏دقيق ذو 97 عين. تم تحليل تلك العينات للبروتين القابل للذوبان الإجمالي باستخدام أداة اختبار‎ ‏تم‎ pad) ‏وفقاً لتوجيهات‎ (Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL) BCA ‏بروتين‎ ٠ ‏معايير مجهزة في الأداة بصورة‎ (BSA) Bovine serum albumin ‏تحليل ألبومين مصل بقري‎ ‏متكررة؛ وتم استخدام متوسط القيم لتوليد منحنى قياسي حيث يتم استخدام بشكل متكرر لاحتساب‎ ‏إجمالي البروتين القابل للذوبان لكل عينة. تم معادلة إجمالي البروتين القابل للذوبان لكل عينة إلى‎ ‏مجم/ ميكرو لتر.‎ ‏ملا‎
‎A «=‏ — الجدول 1 بروتوكول ‎Western daa‏ ¥ ميكرو جم/ مل مضاد - ‎PhiYFP‏ لأرنب ) ‎Axxora, San‏ التهجين ‎(Diego, CA‏ في 120 ‎٠١| Thermo ( StartingBlock™‏ دقائق الأسا ‎١‏ ‏سبي ‎(Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 0‏ بيروكسيداز ‎Jad‏ لحصان ‎—(HRP)‏ مقترن مضاد-106 لأرنب التهجين الثانوي © دقائق وعنزة تحليلة بقعة ‎Western‏ ل 70/201710: في طبق بقياس دقيق ذو ‎AT‏ عين؛ تم تخفيف كل 0 ميكرو لتر من عينة البروتين المستخلص باستخدام 0 ميكرو لتر ‎XY‏ محلول منظم ‎Laemmli‏ + 0-7 -ميركابتو إيثانول ا10610850م0061068-]-2. تم شراء عينات المقارنة من ‎YFP/Phiyfp‏ ‏© منقاة في محلول منظم ‎HEPES‏ (50 مم ‎Yoo (HEPES‏ مم ‎960٠ KCI‏ جليسرول) من ‎(San Diego, CA) Axxora‏ تم تحضير العينات في نفس الطبق عن طريق تخفيف ‎diluting‏ ‎١:١‏ باستخدام محلول منظم ‎Laemmli‏ لإنشاء منحنى عياري ‎standard curve‏ للتركيزات التالية: ‎٠.‏ نانو جم/ ميكرو لترء ‎YO‏ نانو جم/ ميكرو ‎evo se al‏ نانو جم/ ميكرو لتر. تم تسخين العينات في ‎Thermocycler‏ عند 90 درجة مئوية لمدة ‎٠١‏ دقيقة؛ ‎٠‏ وبعد ذلك ‎bas‏ إلى 4 درجة مئوية. تم تجميع ‎Bio-Rad Criterion gel™‏ بعد ذلك مع محلول منظم ‎.SDS/MES‏ تم ترك العينات لتدفاً إلى درجة حرارة الغرفة؛ وتم تحميل ‎٠١‏ ميكرو لتر من ‎dual)‏ على كل عين من المركبين الهلاميين. بالإضافة ذلك؛ تم تحميل عينات من ‎YFP/Phiyfp‏ المنقاة لمنحنى عياري؛ ومرمز عقدة بروتين»؛ في العيون من الجل. تم إدخال ملا
‎“AY —‏ المركبات الهلامية بشكل رحلاني عند ‎١5١‏ قولط و١5٠١‏ مللي أمبير لمدة 0 دقائق بعد الدخول؛ تم فتح أغطية الجل ‎Jay‏ البروتينات إلى غشاء نيترو سيلولوز باستخدام ‎Blot System™‏ ‎(Invitrogen)‏ تم نقل البروتين من الجل إلى الغشاء عن طريق مرور تيار ‎٠١0‏ قولط لمدة ‎٠١‏ ‏دقائق. تم إزالة غشاء النيترو سيلولوز ووضعه في محلول احتجاز منظم ‎StartingBlock‏ ‎T20™ | 5‏ طوال الليل عند ؛ درجة ‎Aggie‏ تم فصل محلول الاحتجاز المنظم بعد ذلك؛ ومعالجة الغشاء باستخدام البروتوكول المذوكر في الجدول 6. تم كشف ارتباط الجسم المضاد ‎Antibody‏ باستخدام نظام كشف تألق كيميائي ‎Amersham ECL™ plus chemiluminescent‏ بإتباع توجيهات ‎ahead)‏ تم تعريض الرقاقة ‎٠١‏ دقائق ‎Vey‏ دقيقة. تم استخدام الرقاقة المكشوفة ‎exposed film‏ لمدة ‎٠١‏ دقائق ‎٠‏ ا لتحديد كمية البروتين» وتم استخدام الرقاقة المكشوفة بشكل زائد لمدة ‎9٠0‏ دقيقة لتأكيد ‎Cle‏ ‏البروتين في 8104 وعينات المقارنة الأخرى. تم تسجيل الغشاء ‎membrane‏ على خلفية الرقاقة المعرضة؛ وتم تحديد كمية البروتين بواسطة تحليل الكثافة بالبكسل ‎.pixel density analysis‏ تم أولاً استخدام الكثافة بالبكسل ‎pixel density‏ لمعايير البروتين المنقاة ‎purified protein‏ لإنشاء منحنى عياري تم استخدامه لتحديد كمية البروتين في العينات. بالرغم من أن الغشاء يعرض ‎Ll) Yo‏ بمونومر ‎monomer‏ ودايمير ‎dimer‏ 001770 حتى في المعيار المنقّى؛ يتم استخدام مونومر 001770 فقط لتحديد كمية التعبير الزائد عن البروتين. بعد ذلك تمت معادلة قيم البروتين إلى انو جم/ ميكرو لتر. تم احتساب نسبة البروتين القابل للذوبان الإجمالية المعادلة ‎(TSP)‏ ‎PhiYFP‏ إلى وحدات من نانو جم من ‎[YFP‏ مجم ‎(TSP‏ أو على نحو بديل» أجزاء بالمليون ‎(PPM)‏ ‎٠‏ تحليل ‎GUS‏ لبقعة ‎:Western‏ يتم تحديد مقدار التعبير الجيني عن بروتين ‎GUS‏ بطريقة مماثلة ل ‎(PhiYFP‏ بالاستثناء التالي: يتم تخفيف ‎٠١‏ ميكرو لتر من عنية من مستخلص ‎١ :١‏ باستخدام ‎x ¥‏ 2-8 + 86001 - ميركابتو إيثانول ‎2—-f—mercaptoethanol‏ ؛ محرفة عند 90 درجة ‎Adie‏ لمدة ‎٠‏ دقيقة؛ وبعد ذلك يتم تحميل ‎١١‏ ميكرو لتر في الجل. تم تغطية الأغشية المعالجة ‎Processed membranes‏ باستخدام رقاقة (تعرض لمدة دقيقة واحدة) باستخدام غشاء لتحليل ‎vo‏ -كثافة البكسل. ملا
تم عرض نتائج تحليل بقعة ‎VY Western‏ نبات ذرة ‎TO‏ مطفرةٍ تم الحصول عليها من أجنة ‎Z.‏ ‏5 المحولة باستخدام الناقل الثنائي؛ ‎(pDABI08706‏ في الشكل ‎.١١‏ يوضح معزز 1 ثائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن ‎GUS, Yip‏ ترمز تتابعات من نسيج الورق ‎leaf tissue‏ تؤكد تلك الملاحظات أن عنصر أدنى معزز 5:01ل1/10-1 من 2000511 ثنائي ‎٠‏ الاتجاه معبر عن ‎YFP‏ عند نفس مستويات التعبير الجيني ‎Lae‏ بالنسيج اللين من ‎Z. mays‏ المحول باستخدام بلازميد ثنائي يتضمن معزز ‎ZMUDIL‏ متحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز ‎YIP‏ ‏(00/8101556؛ انظر الشكل ‎(VY‏ ‏المثال ‎tA‏ تركيب لتراص مجموعة من أربع جينات تم استخدام تركيب ‎pDABL05803‏ بلازميد كبلازميد البداية لتوليد تراص مجموعة من أربع ‎٠‏ جينات ‎AAD1-2A-Phiyfp)‏ و ‎(cry34-2A-cry35‏ المشتق بواسطة معزز ‎Zea mays‏ 100-1و01لا ثنائي الاتجاه. تم عرض خريطة تمثيلية لبلازميد 0088105803 في الشكل ‎١‏ يحتوي على معزز ‎Zea mays Ubiquitin—1‏ ثنائي الاتجاه. يتم استنساخ شظية ‎AAD] -2A-Phiyfp fragment‏ المشتقة من بلازميد 0088105841 إلى هيكل ناقل قطع ‎BamHI cut vector backbone‏ و ‎Sacl‏ البلازميد 88105803نام ‎١‏ باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في المجال. يدي ذلك إلى إنتاج البلازميد الوسيط 2 و(الشكل ‎.)١١7‏ يتم استنساخ ‎Notl/Xbal‏ يهضم شظية ‎cry34(8V6)—2A-‏ ‏5 ناتج من البلازميد 0008105840 بين مواقع ‎Notl/Spel‏ _من _ بلازميد 2 إلى تركيب بلازميد ‎.pDAB105843‏ يحتوي البلازميد ‎PDABI05843‏ على مجموعات ‎cry34(8V6)-2A-cry35‏ و ‎AADI-2A-Phiyfp‏ جينية على كل جانب من ‎Yo‏ معزز 011لا200 ثنائي الاتجاه (الشكل ‎(OA‏ ‏تم توليد ناقل ثنائي يحتوي على معزز 511ل200 ‎SE‏ الاتجاه؛ و مجموعات جينية للتعبير الجيني عن ‎;cry34(8V6)-2A-cry35‏ 3801-/001710-2 من بلازميد 088105842ام عن طريق فاعل ‎(Invitrogen, Carlsbad, CA) GATEWAY L-R CLONASE‏ من وجهة بلازميد ‎.pDAB101917‏ الناقل الناتج ‎pDAB108717 « resulting vector‏ يحتوي م
‎A Ad —‏ — على مجموعات التعبير الجيني عن ‎«AAD1-2A-Phiyfp «cry34(8V6)-2A-cry35‏ و جين ‎PAT‏ داخل حدود ‎T-DNA‏ (الشكل ‎(V4‏ ‏المثال 9: تركيب لتراص مجموعة أربع جينات ثناية يتم استخدام تركيب 0108105803 بلازميد لتوليد تراص مجموعة أربع جينات ثناية ‎Phiyfp-)‏ ‏© 2-8801 و ‎(cry34-2A-cry35‏ المشتق بواسطة معزز ‎Zea mays Ubiquitin—1‏ ثنائي الاتجاه. يتم استنساخ شظية ‎Phiyfp—2A-aad]‏ مشتقة من بلازميد 008105844 إلى سلسلة ناقل قطع 8800111 و ‎Sacl‏ البلازميد 0105105803 باستخدام طرق استنساخ معروفة بشكل شائع في المجال. يؤدي ذلك إلى إنتاج البلازميد الوسيط 0105105845 ‎(Yr Jal)‏ يتم استنساخ ‎sag Notl/Xbal‏ شظية 01735-/2-(7/34)81/6©_ناتجة_من_البلازميد ‎٠‏ 008105840 بين مواقع ‎Notl/Spel‏ من بلازميد ‎pDABI05845‏ إلى تركيب بلازميد 6 ور(الشكل ‎(YY‏ يحتوي البلازميد 1088105846م على مجموعات جينية من --/2-(34)81/6/ و ‎Phiyfp-2A-aadl‏ على كل جانب من معزز ‎ZmUbil‏ ثنائي الاتجاه. ثم توليد ناقل ثنائي يحتوي على معزز 2001 ثنائي ‎cola‏ و مجموعات جينية ‎cry34(8V6)-2A—cry35 ١٠‏ و 3801-/0017/10-2 من بلازميد ‎PDAB105846‏ عن طريق تفاعل ‎(Invitrogen, Carlsbad, CA) GATEWAY L-R CLONASE‏ من وجهة بلازميد ‎«Phiyfp-2A-aadl «cry34(8V6)-2A-cry35‏ و جين ‎PAT‏ داخل حدود ‎T-DNA‏ ‎NARS A)‏ ‎٠‏ المثال ‎:٠١‏ تحول الأجرعية المورمة صبغة ‎DAt13192‏ ‏تم تحويل النواقل الثنائية ‎pDABI08717‏ و 008108718 إلى صبغة الأجرعية المورمة الثلاثية ‎DAE13192‏ (انظر طلب براءة الاختراع المؤقت الأمريكي رقم 11/7714897). تم فصل مستعمرات باكتيرية ‎colonies‏ 88016118 وتم استخلاص ‎DNA‏ بلازميد ثنائي والتحقق منها عن طريق عمليات هضم إنزيمية ‎.enzyme digestions‏ ملا
Af ‏التحول إلى الذرة‎ :١١ JE ‏للحصول على أجنة‎ :Embryo Isolation ‏وفصل الأجنة‎ Ear Sterilization ‏تعقيم كوز الذرة‎ ‏في الصوبة وتلقيح ذاتي أو‎ (Cv. 8104( Zea mays ‏ذرة غير ناضجة؛ تم إنماء نباتات من‎ ‏يوم بعد التلقيح. في يوم التجربة؛ يتم تعقيم‎ ١-4 ‏أشقائي لإنتاج السنبلة. تم تجميع السنابل تقريباً‎ 1765 ‏صوبة؛ حيث يحتوي على‎ Gane ‏مطح السنابل عن طريق الغمر في محلول 90780 من‎ 5 ‏دقيقة؛ يلي ذلك ثلاث شطفات في ماء معقم. بعد‎ 70-7١ sad ‏صوديوم هيبوكلوريت؛ والهز‎ ‏مم) في جو معقم من كل سنبلة‎ 7.7-٠١١5( ‏التعقيم؛ تم تشريح الأجنة الملقحة غير الناضجة‎
LS ‏وتوزيعها بشكل عشوائي في أنابيب طرد مركزي دقيقة تتضمن وسط إصابة سائل (وسط‎ 7٠٠٠١ ‏لتر؛ ا- برولين»‎ [de ٠٠٠١ »]6٠0609[ NE ‏لتر؛ محلول قيتامين‎ [an 47 (Basal ‏مجم/ لتر.‎ ٠.5٠0 Gl ‏لتر؛ جلوكوزء 7100 جم/ لتر؛ 7 ؛-‎ faa 18.0 ‏مجم/ لتر؛ سكروزء‎ ٠ ‏بالنسبة لمجموعة معطاة من التجارب؛ تم استخدام الأجنة المسحوبة من 7-؟ سنابل لكل معالجة.‎ ‏بداية استنبات الأجرعية: تم تبقيع مخزون جليسرول من سلالات الأجرعية تتضمن النواقل الثنائية‎ ٠١ ‏تتضمن مضادات حيوية ملائمة وتم إنماءها عند‎ AB ‏الموصوفة أعلاه على أطباق أدنى وسط‎ ‏تتضمن نفس‎ YEP ‏؟"-؟؛ أيام. تم التقاط مستعمرة واحدة وتبقيعها على أطباق‎ sad ‏درجة مئوية‎ ‏يوم.‎ 7-١ ‏درجة مئوية لمدة‎ YA ‏المضادات الحيوية وتم احتضانها عند‎ Vo ‏استنبات الأجرعية والاستنبات المشترك: في يوم التجربة؛ تم التقاط مستعمرات الأجرعية من طبق‎ ‏مل؛ وتم تعديل‎ ٠٠ ‏مل من وسط إصابة في أنبوب يمكن التخلص منه سعة‎ ٠١ ‏معلق في‎ (YEP ‏نانو متر باستخدام مقياس طيف ضوئي. تم وضع‎ ..4-١.7 = 000600 ‏كثافة الخلية إلى‎ ‏لفة بالدقيقة؛ درجة حرارة الغرفة؛ أثناء إجراء تشريح‎ ١١١ ‏استنباتات الأجرعية على هزاز دوار عند‎ ‏مم في الحجم من حبات الذرة‎ 7.7-٠.5 ‏للجنين. تم فصل الأجنة الملقحة غير الناضجة بين‎ - ٠ ‏مل من وسط الإصابة وغسلها مرة واحدة في نفس الوسط. تمت إضافة‎ ١ ‏المعقمة ووضعها في‎ ١5-٠١ ‏مرة ثم هزها لمدة‎ Vo ‏مل) إلى كل أنبوب وتم قلب الأنابيب حوالي‎ Y) ‏معلق الأجرعية‎ ‏برولين؛‎ —L ‏جم/ لتر؛‎ 5.737 (MS ‏دقيقة. تم نقل الأجنة على وسط الاستنبات المشترك (أملاح‎ ٠٠٠٠١ ‏لكازين إنزيمي‎ Sle ‏مجم/ لتر؛ تحلل‎ ٠٠٠٠١ ‏مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛‎ Yeon ‏جم/ لتر؛‎ ٠.٠١ (Gelzan™ ‏مجم/ لتر؛ سكروزء 0.0 جم/ لتر؛‎ 7.٠١ ‏مجم/ لتر؛ ديكامبا‎ YO tive
اج - قيتامين - ‎MS‏ معدّل ] ‎Yoon JX veo‏ مل لتر؛ ‎Yo.
Ag No3‏ مجم/ لتر؛ أسيتو سيرينجون»؛ ‎٠٠٠0‏ ميكرو مولار)؛ موجه باستخدام قصيغة موجهة لأعلى؛ والاحتضان ‎sad‏ £07 أيام في الضوء عند ‎Yo‏ درجة ‎REP‏ ‏يمكن ملاحظة التعبير الجيني العابر عن ‎Phiyfp‏ /75: التعبير الجيني عن ‎YFP/ Phiyfp‏ 0 العابر في الأجنة المحولة بعد ؟ أيام من الاستنبات المشترك باستخدام الأجرعية. تمت ملاحظة الأجنة تحت ميكروسكوب مجسم ‎(Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL)‏ باستخدام مرشح ‎YFP‏ ومصدر ضوء ‎Owe‏ نانو متر. اختيار واعادة توليد نسيج لين من حالات مفترضة: بعد فتزة الاستنبات المشترك؛ تم نقل الأجنة إلى وسط استقرار (أملاح ‎(MS‏ £77 جم/ لتر؛ 1- برولين» 70000 ‎fame‏ لتر؛ إنوسيتول ‎Ye‏ عضلي؛ ‎٠١١.٠‏ مجم/ ‎asa] MES ¢ yl‏ ¥ -(0- مورفولينو))- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر]؛ 27.6 مجم/ لتر ؛ تحال ماني لكازين إنزيمي» ‎١٠١١.٠‏ مجم/ لتر ¢ ‎7.٠١ Lelia‏ مجم/ ‎yl‏ ¢ سكروزء 7.6 جم/ لتر؛ ا ‎٠.١١‏ جم/ لتر؛ قيتامين - ‎MS‏ معدّل ] ‎Yoon JX veo‏ مل ‎Yo.
AgNO3 ¢ yl‏ مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» 6 مجم/ لتر) بدون عامل انتقائي والاحتضان في ‎YE‏ ساعة ضوء بكثافة ضوء ‎٠٠‏ ميكرو مول دقيقة-؟.ثانية ‎sad ١-‏ 7 أيام عند ‎YA VO‏ درجة ‎Ade‏ تم نقل الأجنة على وسط اختيار ‎١‏ (أملاح ‎fan FY (MS‏ لتر؛ ‎—L‏ برولين؛ م يلا مجم/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎Yeon‏ مجم/ لتر؛ ‎Y asa] MES‏ -(0- مورفولينو))- إيثان سلفونيك)؛ حمض حر]؛ 27.6 مجم/ لتر ؛ تحال ماني لكازين إنزيمي» ‎١٠١١.٠‏ مجم/ لتر؛ ‎٠.٠١ cella‏ مجم/ لتر؛ سكروز» ‎٠٠٠.١‏ جم/ لتر؛ ‎٠.٠١ (Gelzan™‏ جم/ لتر؛ قيتامين - ‎MS‏ معدل ] ‎Yor JX va‏ مل لتر؛ ‎٠ AgNO3‏ مجم/ لتر؛ كاربينيسيلين» ‎Yous‏ ‎Ye.‏ مجم/ لتر) تتضمن 7 مجم/ لتر بايالافوس والاحتضان في ‎Y¢‏ ساعة ضوء بكثافة ضوء ‎On‏ ‏ميكرو مول دقيقة-7.ثانية ‎١-‏ لمدة 7 أيام عند ‎YA‏ درجة مئوية. تم نقل الأجنة ذات كالس تخلقي تكاثري على وسط اختيار ؟ (أملاح ‎fan 5.77 MS‏ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛ ‎١٠١١.٠‏ مجم/ ‎-L ¢ yl‏ برولين ل يلا مجم/ لتر ¢ ‎Y asa] MES‏ -(0- مورفولينو)- إيثان سلفونيك)؛ حمض ‎over a‏ مجم/ لتر؛ تحلل مائي لكازين إنزيمي؛ ‎٠١١.١ Yo‏ مجم/ لتر؛ ‎١.٠١ lela‏ مجم/ لتر؛ ‎٠٠.٠١ gS‏ جم/ لتر؛ ‎٠.٠١ Gelzan™‏ جم/ ‎tive‏
At ‏_مجم/_لتر؛‎ 5.0 AgNO3 ‏_مل/_لتر؛‎ ٠.٠١ (XVeid] Jie MS ‏ثيتامين-‎ ؛رتل‎ ‏ضوء‎ dela YE ‏مجم/ لتر)؛ تتضمن © مجم/ لتر بايالافوس واحتضانها في‎ 790.٠0 ‏كاربينيسيلين؛‎ ‏تسمح‎ Asie ‏درجة‎ YA ‏أيام عند‎ VE ‏لمدة أخرى‎ Y= ‏ميكرو مول دقيقة-؟.ثانية‎ ٠٠ ‏بكثافة ضوء‎ ‏خطوة الاختيار هذه للنسيج اللين المعدل الوراثياً بتكاثئر وتمايز إضافي. يجب أن يستغرق اختيار‎ ١ ‏النسيج اللين فترة لا تقل عن ثلاثة أسابيع. تم نقل كالس تخلقي تكاثري على وسط إعادة توليد‎ 0 ‏مجم/ لتر؛ ا- برولين» 250800 مجم/‎ ٠٠٠٠١ (lime ‏77.؛ جم/ لتر؛ إنوسيتول‎ (MS ‏(أملاح‎ ‏مجم/ لتر؛‎ 75000 [a ‏مورفولينو)- إيثان سلفونيك)» حمض‎ —N)=Y ‏[إ(حمض‎ MES ‏لتر؛‎ ‏مجم/‎ ٠.٠١ (ABA ‏مجم/ لتر ؛‎ ٠.503٠ (NAA ‏تحلل مائي لكازين إنزيمي» 5000 مجم/ لتر ؛‎ - ‏_لتر؛ قيتامين‎ faa 7.5١ Gelzan™ ‏جم/ لتر؛‎ 55.٠ ‏مجم/ لتر؛ سكروزء‎ ٠.٠١ (BA ‏لتر؛‎ ‎750500 ‏مجم/_لتر؛ كاربينيسيلين»‎ ٠.٠١ (AGNO3 ‏لتر؛‎ [de ٠.٠١ (XV 00h] Jee 05 ٠
Or ‏ساعة ضوء بكثافة ضوء‎ YE ‏مجم/ لتر)؛ تتضمن 7 مجم/ لتر بايالافوس والاستنبات في‎ ‏درجة مئوية.‎ YA ‏لمدة 7 أيام عند‎ ١- ‏ميكرو مول دقيقة-7.ثانية‎ ‏لتر؛‎ fan 5.77 (MS ‏تم نقل كالس تخلقي مع الفسيلة/ البراعم على وسط إعادة توليد 7 (أملاح‎ ‏مجم/ لتر؛ سكروز؛‎ ٠٠٠٠١ ‏مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛‎ ٠٠٠١ »]6٠00٠[ ‏معدّل‎ MS - ‏قيتامين‎ ‏لتر؛ كاربينيسيلين» 750030 مجم/ لتر)؛‎ faa ٠.٠٠ (Gellan Gum 64347 ‏لتر؛‎ faa Tele No ‏ساعة بكثافة ضوء‎ VE ‏تتضمن ؟ مجم/ لتر بايالافوس. تم احتضان الاستنبات تحت الضوء لمدة‎ ‏درجة مئوية. تم نقل الفسائل الصغيرة‎ YA ‏أيام عند‎ ٠١-١ ‏ميكرو مول دقيقة-7.ثانية-١ لمدة‎ ٠
NG ‏لتر؛ محلول قيتامين‎ fan 5.77 145 ‏الفسيلة ووسط تجذيري (أملاح‎ AY ‏بجذور أساسية‎ ‏جم/ لتر؛‎ 7٠00 gf ‏مجم/ لتر؛‎ ٠٠٠٠١ ‏مل/ لتر؛ إنوسيتول عضلي؛‎ ٠.٠١ (XY 0] 0 ‏ساعات ضوء/ ظلام عند‎ A NT ‏لتر؛ في طبق نبات واحتضانها تحت‎ faa 50.56 ‏آجار‎ ٠ ‏درجة مئوية. تم اختيار الشتلات المعدلة وراثياً‎ YA ‏أيام عند‎ ١7 sad ١- ‏ميكرو مول دقيقة-7.ثانية‎ ‏ميكرو مول دقيقة-‎ Yoo ‏ساعات ضوء/ ظلام عند‎ A VT ‏المطنونة السليمة ثم احتضانها في‎ ‏درجة مئوية وتم تحليلها لتحديد عدد النسخ المعدلة‎ Yo ‏أخرى 7-ه أيام عند‎ sad ١- ‏".ثانية‎ ‏ونقل إلى الصوبة.‎ Ls ‏العابر‎ Phiyfp ‏التعبير الجيني عن‎ VY ‏_المثال‎ Yo tive
-/- تم إجراء التعبير الجيني العابر عن ‎Phiyfp‏ من أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام 7 . يمكن لمعزز ‎ZmUbil‏ ثنائي الاتجاه أن يعبر عن ‎Phiyfp‏ من مجموعة التعبير الجيني عن جين 710أ8801-28-00؛ عندما لا يوضح جنين غير محول أي تفلور 0 . يمكن ملاحظة مستوى مشابه للتعبير الجيني عن ‎Phiyfp‏ من أجنة ‎Zea mays‏ محولة © باستخدام بلازميد 0100/5105748 ثنائي (الشكل ‎(Yo‏ تتضمن ‎Zea mays‏ موحد الاتجاه معزز ‎(Zm) 1‏ يحرّك تتابع ترميز ‎Phiyfp‏ أحادية تعرض مستوى متوقع من العبير ‎Shall‏ ل ‎[YFP‏ 10لا1ا. يمكن ملاحظة التعبير الجيني العابر عن ‎Phiyfp‏ من أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام 00/8108718؛ حيث يمكن أن يعبر معزز 011لا ‎Zm‏ ثنائي الاتجاه عن ‎Phiyfo‏ ‏من مجموعة التعبير الجيني عن جين ‎.Phiyfp—2a-aadl‏ ‎٠‏ المثال ‎YF‏ التعبير الجيني عن ‎Phiyfp‏ في ذرة محولة بشكل مستقر التعبير الجيني عن 7017/10 في نسيج ‎Zea mays‏ لين محوّل بشكل مستقر محرك بواسطة معزز ‎Zm 1‏ ثنائي الاتجاه: توضح أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام ناقل 0/8108717م الثنائي تتضمن مجموعة التعبير الجيني عن جين ]8801-28-07 تعبير ‎Phiyfp‏ جيد. يمكن أن يحرّك ‎jee‏ 511لا ‎Zm‏ ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن ‎Phiyfp‏ تؤكد تلك النتائج أن ‎Vo‏ عنصر أدنى معزز 5101لا-10// لمعزز ‎Ubil‏ 207 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين ‎cali‏ على سبيل المثال ‎Phiyfp‏ أو ‎YFP‏ مستويات التعبير الجيني عن بروتين ‎Phiyfp‏ متشابهة مقارنةً بنسيج ‎Zea mays‏ لين محول باستخدام ناقل ثنائي مقارن حيث يتضمن ‎Zm Ubil jee‏ موحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز 150 (00/8105748). لا يتم كشف التعبير الجيني عن ‎Phiyfp‏ في النسيج اللين المقارن السالب الذي لا يكون محولاً باستخدام تركيب ‎Vo‏ ثنائى ولا يحتوي على تتابعات ترميز ‎Phiyfp‏ ‏توضح أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام الناقل الثنائي 00/8108718 حيث يحتوي على مجموعة التعبير الجيني عن جين ‎Phiyfp-2a-aadl‏ تعبير ‎Phiyfp‏ جيد. يمكن أن يحرّك معزز 811لا 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن 051710. تؤكد تلك النتائج أن عنصر أدنى معزز ‎Min-UbiP1‏ لمعزز 811ل 200 ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين ‎cali Yo‏ على سبيل المثال ‎Phiyfp‏ أو ‎YFP‏ ‏دما
— A A —
المثال ‎:٠6‏ تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً
تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً باستخدام ‎:Real Time TagMan™ PCR‏ تم تحويل نباتات
‎Zea mays‏ باستخدام نواقل ثنائية تتضمن معزز 011لا 200 ثنائي الاتجاه؛ 008108717 و
‏8ه وتم تحويل نباتات أخرى باستخدام ناقل ثنائي مقارن» 00/8105748. تم
‎Z. «bls ‏داخل جينوم‎ (Pat Phiyfp, 2801, cry34, cry35) ‏تأكيد وجود تتابع ترميز‎ ©
‏5 المعدلة وراثياً إلى 0088108717 و 0088108718 بواسطة مقايسة مسبار تحلل
‎TaqMan hydrolysis probe assay Ak‏ تم تحليل النباتات المعدلة ‎Lays‏ إلى ناقل مقارن
‏8 لتحديد وجود تتابع ‎Phiyfp‏ تم الحصول على شتلات ‎mays‏ .2 المعدلة
‏وراثياً المحولة بشكل مستقر التي نمت من النسيج اللين وتحليلها لتعريف الحالات التي تحتوي على ‎٠‏ عدد ‎Aud‏ منخفض ‎7-١(‏ نسخة) لوليجات تضفير ‎T=‏ بطول كامل من النواقل الثنائية
‏7 و ‎«pDAB108718‏ وناقل ثنائي مقارن 010/5105748. تم تقديم الشتلات
‏المؤكدة إلى الصوبة وانماءها.
‏تم استخدام نظام ‎Roche‏ ضوء ‎Cyclerd80™‏ لتحديد عدد النسخ المعدلة وراثياً للحالات التي
‏تكون محولة باستخدام الناقل الثنائي 00085108717 و 00/8108718. الطريقة التي تستخدم ‎Vo‏ تفاعل ‎TagMan®‏ ثنائي الضفيرة التي تستخدم أوليجونيوكليوتيدات خاصة لتتابع الترميز وجين
‎mays‏ 2.2 مرجعي داخلي المنشاًء إنقيرتاز (رقم الانضمام لبنك الجينات: 16123.1لا)؛ في
‏تجربة واحدة. تم تحديد عدد النسخ والتلقيح عن طريق قياس شدة تفلور تتابع الترميز الخاصة؛
‏بالنسبة لتفلور الإنقيرتاز النوعي؛ مقارنةٌ بمعايير عدد النسخ المعروف.
‏الجدول 7. بادئ نيوكليوتيد تقدمي وعكسي ومسبارات تفلور (مخلقة براسطة ‎Integrated DNA‏ ‎¥Y.‏ ذخا ‎.(Technologies, Coralville,‏
‏بادئة ‎YFP‏ تقدمية ‎GATGCCTCAGTGGGAAAGG‏ (هوية تتابع رقم: ‎(V‏
‏ملا
بادئة ‎YFP‏ عكسية ‎CCATAGGTGAGAGTGGTGACAA|‏ (هوية تتابع رقم: ‎(A‏ ‏مسبار ‎YFP‏ مسبار ‎ROCHE UPL‏ رقم ‎CTTGGAGC ١75‏ (هوية تتابع رقم: "(
(Roche, Indianapolis, IN) Cat 04693604001 ‏رقم‎ ‎(3 ‏(هوية تتابع رقم:‎ TGGCGGACGACGACTTGT (V+ ‏تتابع رقم:‎ dyn) AAAGTTTGGAGGCTGCCGT 5'HEX/CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC/3B ‏مسبار إنقيرتاز‎
10_13 (هوية تتابع رقم: ‎)١١‏ ‎TGTTCGGTTCCCTCTACCAA‏ (هوية تتابع رقم: ‎(VY‏
(VY ‏(هوية تتابع رقم:‎ CAACATCCATCACCTTGACTGA| ‏عكسي‎ 001 jin
مسبار 801م ‎CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA‏ (هوية تتابع رقم: ¢) (
بادئة ‎Cry34‏ تقدمية | ‎GCCAACGACCAGATCAAGAC‏ (هوية تتابع رقم: )£(
بادئة 00/34 عكسية | ‎ali dyn) GCCGTTGATGGAGTAGTAGATGG‏ رقم: ‎tA‏ (
مسبار 00/34 ‎CCGAATCCAACGGCTTCA‏ (هوية تتابع رقم: £7(
بادئة 00/35 تقدمية | ‎CCTCATCCGCCTCACCG‏ (هوية تتابع رقم: %£(
بادئة ‎Cry35‏ عكسية | ‎GGTAGTCCTTGAGCTTGGTGTC‏ (هوية تتابع رقم: £9(
مسبار ‎CAGCAATGGAACCTGACGT Cry35‏ (هوية تتابع رقم: £7(
بادئة ‎PAT‏ تقدمية | ‎ ACAAGAGTGGATTGATGATCTAGAGAGGT‏ (هوية
{ive
‎q «=‏ _ بادئة ‎PAT‏ عكسية | ‎CTTTGATGCCTATGTGACACGTAAACAGT‏ (هوية تتابع رقم: ‎A‏ 0 مسبار ‎iu») GGTGTTGTGGCTGGTATTGCTTACGCTGG PAT‏ تتابع رقم: £9 ( ‎Zo mays clued dually‏ المحولة باستخدام النواقل الثنائية ‎PDAB108717‏ و 8 يتم تضخيم شظية ‎DNA‏ خاصة بتتابع ترميز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار ‎TagMan®‏ تتضمن مسبار مرقّم باستخدام صبغة تفلور ‎FAM‏ ويتم تضخيم إنقيرتاز باستخدام © مجموعة بادئة/ مسبار ‎TagMan®‏ ثانية تتضمن مسبار مرقّم باستخدام تفلور ‎HEX‏ (الجدول ‎.)١‏ تم تحضير خليط تفاعل ‎PCR‏ كما هو مذكور في الجدول ‎A‏ وتم تضخيم قظايا ‎DNA‏ ‏المحدد للجين وفقاً للظروف المذكورة في الجدول 9. تم تحديد عدد نسخ وتلقيح العينات عن طريق قياس الكثافة النسبية للتفلور المحدد لتتابع الترميز للتفلور المحدد للجين المرجعي؛ إنقيرتازء مقارنة بمعايير عدد النسخ المعروف. تتم تكوين المعايير عن طريق تخفيف الناقل (0108108717 و ‎Z.
Jala (pDAB108717‏ ‎mays B104‏ جينومي ‎(GDNA) DNA‏ للحصول على معايير بعلاقة معروفة للناقل: ‎(IDNA‏ ‏على سبيل ‎(Jal‏ يمكن تحضير العينات التي بها نسخة ‎sans‏ ونسختين وأربع نسخ لناقل ‎DNA‏ ‏لكل نسخة من ‎mays 8104 gDNA‏ .2. تم التحقق من تخفيفات نسخة واحدة ونسختين من الناقل المختلط مع معيار ‎mays 8104 gDNA‏ .2 مقابل حالة ‎mays‏ .2 مقارنة التي تكون ‎Vo‏ معروفة بأنها أحادية اللواقح» وحالة ‎mays‏ .2 مقارنة التي تكون معروفة بأنها ثنائية اللواقح ‎Ala)‏ ‎Z. mays‏ 77/8؛ انظر منشور براءة الاختراع الدولي ‎PCT‏ رقم ‎.)٠١١/١ 774314 YT‏ تم ‎shal‏ ‏تجربة ‎SE TagMan®‏ الضفيرة التي تستخدم أوليجونيوكليوتيدات محددة لجين تتابع الترميز وأوليجونيوكليوتيدات محددة لجين مرجع ‎mays‏ .2 داخلي ‎Gla andl‏ عن طريق تضخيم وكشف شظية ‎DNA‏ محددة للجين لتتابع الترميز باستخدام مجموعة بادئة/ مسبار ‎TAQMAN®‏ ‎tive‏
‎q \ —_‏ _ واحدة تتضمن مسبار مرقم باستخدام صبغة تفلور ‎FAM‏ وعن طريق تضخيم وكشف شظية ‎DNA‏ محددة للجين لإنفيرتاز باستخدام ‎de gene‏ بادئة/ مسبار ‎TAQMAN®‏ ثانية تتضمن مسبار مرقم باستخدام ‎HEX‏ تفلور. وفقاً للجدول 7؛ تم تحضير خليط تفاعل تتابع الترميز ‎TagMan®‏ ‏كما هو مذكور في الجدول ‎A‏ وتم تضخيم الشظايا المحددة وفقاً للظروف المذكورة في الجدول ‎A‏ ‏٠ه‏ الجدول ‎(A‏ خليط تفاعل ‎.JTAQMAN® PCR‏ م ‎vot‏ ميكرو بادئة تتابع ترميز تقدمية ‎٠١(‏ ميكرو ‎١ (Me‏ ؛-؛ ميكرو لتر مولار ‎vot‏ ميكرو بادئة تتابع ترميز عكسية ‎٠١(‏ ميكرو ‎١ (se‏ ؛-؛ ميكرو لتر مولار مسبار تتابع ترميز 0018125 )0 ميكرو ميكرو ‎ut‏ ميكرو لتر مولار) مولار ‎vot‏ ميكرو معزز إنقيرتاز تقدمي ‎٠١(‏ ميكرو مولار) ؛. ميكرو لتر مولار ‎vot‏ ميكرو معزز إنثيرتاز عكسي ‎٠١(‏ ميكرو مولار) ‎se et‏ مولار لدي ميكرو مسبار إنقيرتاز )© ميكرو مولار) ‎nt‏ ميكرو لتر مولار ‎£1ve‏
تم تحليل مستوى التفلور المتولد لكل تفاعل باستخدام 4801 ‎Roche LightCycler‏ ‎Thermocycler‏ وفقاً لتوجيهات المصنّع. تم إثارة جزيء الفلورة ‎FAM‏ بكثافة بصرية تبلغ ‎[E70‏ ‎9٠‏ نانو مترء وتم إثارة جزيء الفلورة ‎HEX‏ بكثافة بصرية تبلغ 0/577 8560© نانو متر. يمكن ‎(LightCycler 480™ ©‏ إلى قيم مستهدفة/ مرجعية لأربع معايير عدد النسخ المعروف (على سبيل المثال؛ ‎-١ (Null‏ نسخة ‎(hemi)‏ 7- نسخة ‎(homo)‏ و4 - نسخ). الجدول 9. ظروف الدورة الحرارية لتضخيم ‎PCR‏ ‎dann‏ الحرارة خطوات ‎PCR‏ "0 الزمن عدد الدورات (درجة مثوية) 2 تم تلخيص النتائج من تحليل عدد النسخ المعدلة وراثياً لنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيبات معزز ‎ZmUbil‏ ثنائي الاتجاه ‎PDABI08717)‏ ‎٠‏ و00/88108718) ولنباتات معدلة وراثياً تم الحصول عليها عن طريق التحويل باستخدام تركيب معزز موحد الاتجاه [01ل2000 مقارن ‎(pDAB105748) Phiyfp‏ في الجدول ‎.٠١‏ تم ‎Ju‏ ‏النباتات فقط ذات ‎7-١‏ نسخة من كل المحورة ‎hy‏ إلى الصوبة لتحليلات التعبير الجيني ‎expression analyses‏ الأخرى. ‎gv‏
‎q Ad —_‏ _ الجدول ‎.٠١‏ تقدير عدد النسخ المعدلة وراثياً للنباتات المعدلة وراثياً التي تم الحصول عليها من معزز ثنائي الاتجاه وتركيبات مقارنة. . عدد الحالات البنية عدد الأجنة المحولة ‎7-١‏ نسخة من كل الجينات الموجبة المثال ‎:١5‏ التعبير الجيني المستقر عن ‎Phiftp‏ في ‎«lily‏ ذرةٍ ‎TO‏ ‏يمكن ملاحظة التعبير الجيني المستقر عن ‎APhiftp‏ نباتات ‎Zea mays TO‏ المحركة بواسطة © معزز ‎Ubil‏ 200 ثنائي الاتجاه: أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام ‎PDAB108717 Jil‏ ‎ALE‏ تتضمن مجموعة التعبير الجيني عن جين 8801-28-017]0. يمكن أن يحرّك معزز 1 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن ‎Phiftp‏ في 98 من الفسيلة وأنسجة الجذر. تؤكد النتائج أن عنصر أدنى معزز 5101لا-10// لمعزز ‎Zm Ubil‏ ثنائي الاتجاه يكون قادراً على التعبير عن جين ‎cides‏ على سبيل المثال ‎Phiftp‏ أو ‎YFP‏ التي تكون مندمجة بشكل ثنائي ‎٠‏ السيسترونيك ‎bicistronically‏ مع ‎AAD]‏ باستخدام تتابع ‎2A‏ تكون مستويات التعبير الجيني عن بروتين ‎Phiftp‏ مشابهة لأجنة ‎mays‏ .2 المحولة باستخدام ناقل ثنائي مقارن حيث يحتوي على معزز ‎Ubil‏ 200 موحد الاتجاه يحرّك تتابع ترميز ‎Phiftp‏ (00/88105748). لا يتم كشف التعبير الجيني عن ‎Phiftp‏ في النباتات المقارنة ‎LL‏ التي لا تكون محولة باستخدام تركيب ثنائى ولا تحتوي على تتابعات ترميز ‎Phiftp‏ ‎(Kay V0‏ ملاحظة التعبير الجيني عن ‎APhiftp‏ الورق وأنسجة جذر نباتات ‎Zea mays TO‏ معدلة ‎ia),‏ إلى ناقل ثنائي 0088108718 حيث يحتوي على مجموعة التعبير الجيني عن جين ‎.Phiyfp—2a-aadl‏ يمكن أن يحرّك معزز 011لا 200 ثنائي الاتجاه التعبير الجيني القوي عن ‎.Phiftp‏ تؤكد النتائج أن عنصر أدنى معزز 5101لا-1/10 لمعزز ‎Zm Ubil‏ ثنائي الاتجاه دما
يكون قادراً على التعبير عن جين مبلْغْ؛ على سبيل المثال ‎Phiftp‏ أو ‎YFP‏ مندمج ب 8680-1 مع تتابع /2. المثال ‎:١١‏ تحليل 07/34» ‎«Cry35‏ وبروتين ‎AAD]‏ ‏تم أخذ عينات منا لنباتات في الأعمدة ‎٠١-١‏ من مصفوفة صناديق ‎matrix box‏ في ‎V.0‏ مل © أنابيب مخروطية ‎conical tubes‏ إليها تمت إضافة ‎١‏ كرية صلبة يليها ‎PBST‏ + 96.2.5 ‎BSA‏ )7+ مل). بعد ذلك تمت سحن الصندوق إلى كريات لطحن 97110109 العينة في ‎Geno‏ ‎sad Grinder‏ © دقائق عند ‎Ad ١٠5٠0‏ بالدقيقة ثم الطرد المركزي عند ‎YY ev‏ لفة بالدقيقة لمدة ‎١‏ ‏دقائق عند ؛ درجة مثوية. تجربة ‎:Cry34/ 35 ELISA‏ في طبق عميق الفتحات ‎deep well plate‏ منفصل ذو 6 ‎Vo‏ عين؛ تم تخفيف عينة من المستخلص ‎5٠00 :١‏ في ‎96١ + PBST‏ 510110. تم نقل الحجمين من ‎YO‏ ميكرو لتر من العينة المخففة إلى أطباق منفصلة ذات 976 عين تم ترتيبها باستخدام مضاد - 4 ومضاد - ‎(Meso Scale Discovery) Cry35‏ في العمود ‎١١‏ و١١‏ من كل طبق تمت إضافة تركيزات عيارية من 0107/34 و1735 في ‎Yo) 010116 96١ + PBST‏ ميكرو لتر). بعد ذلك تم احتضان الأطباق أثناء الهز عند ‎dap‏ حرارة الغرفة ‎sad‏ ساعة واحدة. تم غسل ‎١‏ الأطباق بعد ذلك باستخدام ‎Xx 3©( PBST‏ 200 ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة ‎YO‏ ميكرو لتر من محلول من مضاد- ‎Cry34‏ متقارن مع ‎SulfoTAG‏ ومضاد- ‎Cry35‏ إلى كل عين والاحتضان مع الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق بعد ذلك باستخدام ‎Teo XY) PBST‏ ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة مقدار من ‎You‏ ميكرو لتر ‎(Meso Scale Discovery) Read Buffer T‏ وقراءة الطبق مباشرةً على قارئ ‎SECTOR®‏ ‎٠‏ 6000. يمكن احتساب تركيزات البروتينات في العينة باستخدام المنحنى العياري للبروتين الخاص المولد من نفس الطبق. تجربة ‎ELISA‏ 10-1//: في طبق عميق منفصل ذو ‎AT‏ عين؛ تم تخفيف عينة من المستخلص ‎0:١‏ في ‎PBST‏ + 966.5 85/8. تم نقل الحجمين من ‎Yoo‏ ميكرو لتر من العينة المخففة بعد ذلك إلى أطباق ذات 97 عين منفصلة تم تغطيتها باستخدام مضاد ‎AAD]‏ (متوفرة بواسطة
ه40 ‎(Acadia Bioscience LLC‏ في العمود ‎١١‏ و١١‏ من كل طبق تمت إضافة تركيزات عيارية ‎standard concentrations‏ من ‎AAD]‏ في ‎Yeo) BSA 976..5 + PBST‏ ميكرو ‎(A‏ ‏بعد ذلك تمت إضافة مقدار من ‎5٠‏ ميكرو لتر من مضاد ‎AAD]‏ بمجموعة بيوتين إلى كل عين وتم احتضان الأطباق أثناء الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. تم غسل الأطباق بعد © ذلك باستخدام ‎x 0) PBST‏ 00 ميكرو لتر). بعد ذلك تمت إضافة ‎٠٠١‏ ميكرو لتر من محلول مقترن ‎conjugate solution‏ ستيبتاقيدين- فوسفات قلوي ‎steptavidin-alkaline‏ ‎J phosphate‏ كل عين والاحتضان مع الهز عند درجة حرارة الغرفة لمدة ‎Te‏ دقيقة. تم غسل الأطباق بعد ذلك باستخدام ‎x 5( PBST‏ 200 ميكرو لتر). تمت إضافة مقدار من ‎٠٠١‏ ميكرو لتر من ركيزة ‎substrate‏ (م- نيترو فينيل فوسفات ‎(PNPP « p-nitrophenylphosphate‏ ‎٠‏ بعد ذلك والاحتضان مع ‎Gell‏ عند درجة حرارة الغرفة لمدة £0 دقيقة. بعد ذلك تم قراءة الأطباق ‎A405 xe plates‏ على قارئ أطباق ‎.(Molecular Devices) SpectraMax M5‏ يمكن احتساب تركيزات البروتينات في العينة باستخدام المنحنى العياري المولد من نفس الطبق. المثال ‎:١١‏ تحليل بروتين نباتات ذرة ‎TO‏ ‏تحليل بروتين نباتات ‎TO‏ ذرة مشتقة بواسطة تركيب معزز ‎Zea mays Ubiquitin]‏ ثنائي ‎Veo‏ الاتجاه (00/88108717): تم تليخص تحليل ‎ELISA‏ تمثيلي ل ‎١١‏ نبات ذرة ‎TO‏ معدل وراثياً ‎mils‏ من أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام 00/8108717 الذي يحتوي على -/01/34-2 5و 17/]0-/01-2ل// في الجدول ‎.١١‏ يوضح معزز 011ل 200 ثنائي الاتجاه تعبير جيني قوي عن ‎IS‏ من تتابعات ترميز 617/34 و 01/35 في الورق. على نحو غير متوقع؛ تشير بيانات البروتين إلى ما يصل إلى ؛ أضعاف تعبير جيني أعلى ل ‎Cry34‏ من تركيب ثنائي ‎٠‏ الاتجاه 008108717 مقارنة بتركيب محرّك ل 511لا 200 ثنائي الاتجاه. تمت ملاحظة تعبير جيني مشابه ‎٠١-8‏ أضعاف ‎Jef‏ لبروتينات ‎Cry35‏ و 2801 ‎Lal‏ بشكل غير متوقع من تركيب ثنائي الاتجاه ‎pDABLO8T17‏ مقارنةٌ بتركيب محرّك ل ‎Zm Ubil‏ ثنائي الاتجاه. توضح تلك الملاحظات أن معزز 2000510011001 ‎ASW‏ الاتجاه منفرد في تركيب ‎PDAB108717‏ ‏يمكن أن يعبر عن جينات متعددة (على سبيل ‎Cry34 (Jal‏ 00/35؛ و ‎(AADL‏ عند ‎Yo‏ مستويات أعلى بشكل غير متوقع ‎Lhe‏ بنباتات ‎Zea mays‏ محولة باستخدام بلازميد ثنائي ملا
يحتوي على معزز 1 200 موحد الاتجاه ‎Sa‏ نفس الجينات؛ حيث يتم اشتقاق كل تتابع ترميز بواسطة معزز 011لا ‎Zm‏ مستقل. يُشتق التعبير الجيني عن ‎Cry34‏ و ‎Cry35‏ الذي يربط نباتات )3 ‎dad gs TO‏ تركيب معزز ‎Zea mays Ubiquitinl‏ ثنائي الاتجاه (60085108717). تم عرض تحليل العلاقة بين © بروتينات ‎Cry34‏ و ‎Cry35‏ في ‎١١‏ نبات ذرة ‎TO‏ معدل ‎ays‏ ناتج من أجنة ‎Zea mays‏ محولة باستخدام 0008108717 الذي يحتوي على 017/34-2/8-017/35 في الشكل ‎Jv‏ تشير علاقة عالية جداً (مربع ‎R‏ = 094( إلى تعبير جيني قوي عن تنظيم مشترك بين 607/34 و ‎Cry 35‏ من مجموعة التعبير الجيني عن جين 01735-/007/34-2 المشتق بواسطة معزز ‎Zm‏ ‏1لا ثنائي الاتجاه. ‎٠‏ الجدول ‎.١١‏ التعبير الجيني عن ‎Cry34/Cry35/AAD]‏ في نباتات ‎TO‏ ذرة ‎pDAB108717‏ ‏معدلة ‎ays‏ ‏هوية ‎Cry35| sb Cry34 lll‏ ثانو | ‎AADL‏ نانو ‎[da‏ ‏جرام/ ‎You‏ جرام/ ‎Yo Yous‏ ‎IE‏ ‎gv‏
YA 13% YY oe | Zm Ubi-
Cry34/Cry35 ‏ثنائي‎ Zea mays Ubiquitin] ‏ذرة مشتقة بواسطة تركيب معزز‎ TO ‏تحليل بروتين نباتات‎ ‏معدل وراثياً‎ TO 33 ‏نبات‎ ١١ ‏تمثيلي ل‎ ELISA ‏الاتجاه (00/88108718): تم تلخيص تحليل‎ 01/34-2/- ‏محولة باستخدام 00/8108718 الذي يحتوي على‎ Zea mays ‏ناتج من أجنة‎ ‏ثنائي الاتجاه تعبير جيني قوي عن كلا من‎ ZmUDIT ‏أوضح معزز‎ AY ‏في الجدول‎ 0/35 oe ‏في الورق. تشير بيانات البروتين إلى عدة أضعاف من التعبير‎ Cry35 ‏تتابعات ترميز 0734© و‎ ‏و 1 نلق من تركيب ثنائي الاتجاه‎ 0/35 Cry34 ‏الجيني العالي عن بروتينات‎ ‏ثنائي الاتجاه. تؤكد تلك الاختصارات أن‎ Zm Ubil ‏مقارنة بتركيب محرّك ل‎ 8 ‏ثنائي الاتجاه في تركيب 00085108718 يعبر عن عدة‎ Zea mays Ubiquitin ‏معزز‎ ‏بشكل غير متوقع‎ lel ‏عند مستويات‎ (AAD ‏010/34؛ 00/35؛ و‎ (Jia ‏جينات (على سبيل‎ ٠ ‏موحد‎ 201 Ubi ire ‏محولة باستخدام بلازميد ثنائي يحتوي على‎ Zea mays ‏مقارنةً بنباتات‎ ‏مستقل.‎ Zm Ubi] ‏معزز‎ dad gs ‏كل تتابع ترميز تتحرك‎ Cua ‏الاتجاه يحرّك نفس الجينات‎ ‏تركيب معزز‎ dad gs TO 3) ‏الذي يربط نباتات‎ Cry35 ‏و‎ Cry34 ‏يُشتق التعبير الجيني عن‎ ‏تم عرض تحليل العلاقة بين‎ (PDABIO8718) ‏ثنائي الاتجاه‎ Zea mays Ubiquitinl
Zea mays ‏ناتج من أجنة‎ ays ‏معدل‎ TO ‏نبات ذرة‎ ١١ ‏في‎ Cry35 ‏و‎ Cry34 ‏بروتينات‎ Veo ‏في الشكل ؟"ب.‎ ery34-2A-cry35 ‏محولة باستخدام 01008108718 الذي يحتوي على‎ ‏مشترك‎ abi ‏إلى تعبير جيني قوي عن‎ (A = R ‏علاقة عالية جداً (مربع‎ pa ‏د‎
-م؟- 60-007 بين ‎Cry34‏ و 35 ‎Cry‏ من مجموعة التعبير الجيني عن جين ‎cry34-2A-‏ ‏5 المشتق بواسطة معزز 511لا 200 ‎AW‏ الاتجاه. الجدول ‎OY‏ التعبير الجيني عن ‎AADL [Cry35 [Cry34‏ في ذرة ‎TO‏ نباتات هوية ‎AAD] | sl Cry35| sb Cry34 lll‏ نانو ‎lL‏ ‎I‏ ‏المثال ‎A‏ )0 تكدس التطفير: معززات ثنائية الاتجاه التخليقية (بيانات ‎(T1‏
ما
‎q q —_‏ _ التعبير الجيني عن نباتات 11 المحركة بواسطة تركيبات المعزز ‎Zea mays Ubiquitin]‏ ثنائي الاتجاه: تم اختيار عشر إلى إثنى ‎de‏ حالة نسخة منفردة لكل تركيب للتحليل باستثناء أن التركيب المقارن 01008108716 يكون به ‎Ala‏ واحدة فقط. تم اختبار خمس نباتات/ الحالات لمرحلة ‎V6‏ وتم اختبار ثلاث نباتات/ الحالات لمراحل 10-12 و/ 43. تم إجراء تجارب © بروتين باستخدام ‎ELISA J LCMS‏ تم عرض التركيبات في ذلك المثال في الشكل 776. تكون ‎ZMUbi) pDABL08706‏ ثنائي الاتجاه ‎))٠٠١-(‏ و 0088108707 ‎ZMUbi)‏ ثنائي الاتجاه (-90)) هي تركيبات بمعزز ثنائي اتجاه نموذجي من الاختراع الحالى؛ ‎ZmUbi1-YFP) pDABL01556‏ مقارن) و ‎ZMUDi1) pDAB108716‏ بدون أدنى معزز) تعمل في صورة تركيبات مقارنة بمعززات موحدة
‎٠‏ الاتجاه. تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات لبروتين ‎(LCMS) YFP‏ في نانو جرام/ ‎You‏ في الشكل 7؟أ؛ و تم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات ل ‎YFP RNA‏ في الشكل ل١اب.‏ تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات لبروتين ‎(LCMS) GUS‏
‎Vo‏ في نانو جرام/ سم ‎Y‏ في الشكل ‎JYA‏ و ثم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات ل ‎GUS RNA‏ في الشكل 8 اب. تم عرض نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(V6)‏ من أربع تركيبات لبروتين ‎(LCMS) AAD]‏ في نانو جرام/ ‎You‏ في الشكل 9؟أ؛ و تم عرض نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من أربع تركيبات ل ‎AAD] RNA‏ في الشكل 4 "ب.
‎(LCMS) YFP ‏من أربع تركيبات لبروتين‎ (V6) ‏تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ ٠ «pDAB108706 ‏؟أ؛ و القيم المتوسطة ل 08108707م‎ ٠ ‏في الشكل‎ Yau [aha ‏في نانو‎ ‏على التوالي. تم‎ ٠ ‏هي 17./ا 7.17 9.920 و‎ pDABI08716 ‏6ه و‎ ‏في‎ YFP RNA ‏من أربع تركيبات ل‎ (V6) ‏عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية‎
‎tive
A
‏و‎ PDAB101556 pDAB108707 pDAB108706 ‏و القيم المتوسطة ل‎ «Fe ‏الشكل‎ ‏على التوالي.‎ ٠٠١١ ‏دحت و‎ Aly 4.47 ‏هي‎ 6
GUS ‏من أربع تركيبات لبروتين‎ (V6) ‏تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ 0088108706 ‏و القيم المتوسطة ل‎ (YY ‏في الشكل‎ Yau [da sb ‏في‎ (LCMS) ser 57.77 ‏ر 088108716ام هي اكتف‎ «pDAB101556 «pDAB108707 © ‏من أربع‎ (V6) ‏على التوالي. تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية‎ 7.7 088108706 ‏و القيم المتوسطة ل‎ «FY Jal ‏.في‎ GUS RNA 1 ‏تركيبات‎ ‏هي .ىب لخلاب بو .ا‎ pDABIOS716 ‏ر‎ «pDABI01556 7 ‏على التوالي.‎
AAD] ‏من أربع تركيبات لبروتين‎ (VO) ‏تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ 0088108706 ‏و القيم المتوسطة ل‎ (YY ‏الشكل‎ 3 Yau [da sb ‏في‎ (LCMS)
AOT ‏الكت‎ (VY LAA ‏ر 088108716ام هي‎ «pDAB101556 ‏,م‎ 7 (V6) ‏على التوالي. تم عرض تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني النسبية‎ ١795.49 ‏و‎ 0A ‏في الشكل 7”ب؛ و القيم المتوسطة ل 0/88108706م؛‎ AAD] RNA ‏من أربع تركيبات ل‎ ‏و‎ «VAY ‏هي اف ات‎ pDABI08716 ‏و‎ «pDAB101556 ‏088108707م‎ ٠ ‏على التوالي.‎ 7.7 ‏من أربع‎ (VI0) ‏و 77ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن‎ eT (FY ‏الأشكال‎ ‏على التوالي.‎ Yau ‏في نانو جرام/‎ (LCMS) GUS ‏و بروتين‎ AADL YFP ‏تركيبات ل‎ ‏من أربع‎ (V10) ‏توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ 2 VE ‏و‎ cae (Ire ‏الأشكال‎ ‏على التوالي. تكون‎ Yau ‏في نانو جرام/‎ (LCMS) ‏و بروتين 01ل‎ «GUS YFP ‏تركيبات ل‎ ٠ pDAB108716 ‏ر‎ «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 ‏القيم المتوسطة ل‎ ‏على التوالي. تكون القيم‎ 77.0٠ ‏هي 170لا ل.ل .ةك و‎ (ITE Jal) YFP ‏ل‎ ‏ل‎ pDAB108716 ‏و‎ «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706 ‏المتوسطة ل‎ ‏على التوالي. تكون القيم‎ ١8.07 ‏داءخاء > و‎ OY ‏(لشكل ؛آب) هي‎ GUS tive
‎-١ ٠ \ —_‏ المتوسطة ل ‎pDAB108716 «pDAB101556 «pDAB108707 «pDAB108706‏ ل ‎AAD]‏ (الشكل ‎(zV¢‏ هي فتكت ند,اأاكم لقملا و ‎٠٠١١6‏ على التوالي. الأشكال ‎(Yo‏ 5؟ب؛ و 75ج توضح نتائج التعبير الجيني النموذجي عن ‎(R3)‏ من أربع تركيبات ل ‎«GUS (YFP‏ و بروتين ‎(LCMS) AAD]‏ في نانو ‎Yau faa‏ على التوالي. © الأشكال 97 ‎af‏ و 71ج توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎(R3)‏ من أربع تركيبات ل ‎«GUS YFP‏ و بروتين 801 ‎(LCMS)‏ في ‎sil‏ جرام/ ‎Yau‏ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل ‎pDAB108716 5 «pDAB101556 «pDAB108707 pDAB108706‏ ‎YFP‏ (الشكل ‎(fF‏ هي 31.78 4.44 17.اء و 40 على التوالي. تكون _القيم المتوسطة ل 108706طانام ‎«pDAB108707‏ 85101556منام؛ و 85108716منام ل ‎٠‏ 65 (الشكل ‎(FT‏ هي 5.87 ‎OY OTA)‏ و 1.360؛ على التوالي. تكون القيم المتوسطة ل 108706طانام ‎«pDAB108707‏ 85101556منام؛ و 85108716منام ل ‎AAD]‏ (الشكل 71ج( هي فحتمل لل أماد ‎No ge‏ و د ‎YAY.‏ على التوالي. توضح النتائج أن معززات )3 011لا ثنائي الاتجاه وفقاً للاختراع الحالي يمكن أن تحرك تعبير جيني قوي عن 5لا6 و ‎YFP‏ حيث يكون التعبير الجيني عن ‎YFP‏ من معزز 53 ‎UDIL‏ ثنائي ‎Yo‏ الاتجاه مشابهاً لذرة موحدة الاتجاه ‎Ubil‏ المحركة ل ‎YFP‏ تقترح النتائج ‎Lad‏ أن الاستتساخ ثنائي الاتجاه ‎bidirectional transcription‏ لا يكون له تأثير كبير على التعبير الجيني عن (تعبير جيني عن ‎GUS‏ مقارنة بالتركيبات التي تفتقر لأدنى معزز بدون التعبير الجيني عن ‎(YFP‏ ‎JE‏ 4 توليفة من معزز ثنائي الاتجاه وتتابع ‎AY‏ ثنائية السيسترون لتحريك أربع محورات ‎٠‏ وراثية من معزز منفرد واحد (بيانات 11) التعبير الجيني عن نباتات 11 المحركة بواسطة تركيبات المعزز 06100111101 ‎Zea mays‏ ثنائي الاتجاه: تم اختيار عشر إلى إثنى ‎de‏ حالة نسخة منفردة لكل تركيب للتحليل باستثناء أن التركيبات المقارنة يكون بها أربع أو خمس حالات لكل تركيب. تم اختبار خمس نباتات/ الحالات ‎tive‏
-١ ٠ Y-— ‏وتم اختبار ثلاث نباتات/ الحالات لمراحل 10-12/ 5[ 83. تم إجراء تجارب‎ V6 ‏لمرحلة‎ ‎ELISA ‏أو‎ LCMS ‏بروتين باستخدام‎
ZMUbi1-/ZMUbi1-Cry34) ‏088105818م‎ «(ZMUbil-YFP) pDAB105748 - ‏ثنائي الاتجاه‎ YFP/AAD-1-ZMUbil) pDAB108717 «(ZMUbil-AAD1/Cry35 ٠
Cry34— ‏ثنائي الاتجاه‎ YFP-ZMUbi1/AAD1) pDAB108718 ‏و‎ «(Cry34-Cry35
Cry34 ‏من بروتين‎ (V6) ‏يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية‎ aly ‏الشكل‎ .(Cry35 088108717 088105818 pDAB105748 ‏من نفس التركيبات الأربعة‎ (LCMS) ‏و 88108718م0م.‎ أ الشكل 7 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من ‎AAD1 RNA‏ من أربع تركيبات ‎pDAB105818 pDAB105748‏ 0088108717 و ‎.pDAB108718‏ الشكل ‎LTA‏ ‏يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من بروتين ‎(LOMS) ABDI‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎«pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748‏ و ‎.pDAB108718‏ ‎«pDAB108717 pDAB105818 pDAB105748 ٠‏ و ‎.pDAB108718‏ الشكل 1ب يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من بروتين ‎(LEMS) YFP‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎«pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748‏ و ‎.pDAB108718‏ ‏الشكل 180 يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من ‎Cry35 RNA‏ من أربع تركيبات ‎pDAB105818 pDAB105748‏ 0088108717 و 088108718م. الشكل ‎wt.‏ ‎Yo‏ يوضح نتائج تعبير جيني نسبية نموذجية ‎(V6)‏ من بروتين ‎(ELISA) Cry35‏ من نفس التركيبات الأربعة ‎«pDAB108717 «pDAB105818 «pDAB105748‏ و ‎.pDAB108718‏ ‎«pDAB105818 «pDAB105748‏ 01088108717 و ‎.pDAB108718‏ ‏دما yrs ‏من أربع‎ Cry34 RNA ‏من‎ (V6) ‏الشكل 7؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ ‏بمتوسط‎ pDAB108718 ‏و‎ 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 ‏تركيبات‎ ‏على التوالي. الشكل 7؛ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير‎ YoYo ‏و‎ 7.797 7.47 oo ‏قيم‎ ‎PDAB105748 ‏من نفس التركيبات الأربعة‎ Cry34 ‏من بروتين‎ (V6) ‏الجيني‎ ‎©47.9¢ 6 ‏088108718م_بمتوسط اقيم‎ pDAB108717 008105818 © ‏و 21.148 على التوالي.‎ ٠١577 ‏من أربع‎ AAD] RNA ‏من‎ (V6) ‏الشكل 7؟أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ ‏بمتوسط‎ pDAB108718 ‏و‎ 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 ‏تركيبات‎ ‏يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير‎ oF ‏و 7.07 على التوالي. الشكل‎ 1.14 OLA 66 ‏قيم‎ ‎PDAB105748 ‏من نفس التركيبات الأربعة‎ AADL ‏من بروتين‎ (V6) ‏الجيني‎ ٠ 777.54 626 ad ‏و 008108718 بمتوسط‎ «pDAB108717 pDAB105818 ‏هل 1لا و 7714.19 على التوالي.‎ ‏من أربع‎ YFP RNA ‏من‎ (V6) ‏الشكل ؛4؛أ يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ ‏بمتوسط‎ pDAB108718 ‏و‎ 008108717 «pDAB105818 (pDAB105748 ‏تركيبات‎ ‏على التوالي. الشكل ؛ ؛ ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير‎ ٠.90 ‏و‎ 1.28 6 Fed ‏.اقيم‎ ‎088105748 ‏من نفس التركيبات الأربعة‎ YFP ‏من بروتين‎ (V6) ‏الجيني‎ ‏بمترسط قيم 5734ل متامت‎ pDAB108718 ‏088108717مر‎ «pDAB105818 ‏و 3.04 على التوالي.‎ 84 ‏من أربع‎ Cry35 RNA ‏من‎ (V6) ‏يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني‎ Teo ‏الشكل‎ ‏و 0088108718 بمتوسط‎ 0088108717 «(pDAB105818 (pDAB105748 ‏تركيبات‎ ٠ ‏4لا.؟؛ و 2.70 على التوالي. الشكل 5 ب يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير‎ OLY 86 ‏قيم‎ ‎PDAB105748 ‏من نفس التركيبات الأربعة‎ Cry35 ‏من بروتين‎ (V6) ‏الجيني‎ ‎(YAY.0f «+ ‏قيم‎ luge pDABL08718 ‏088108717م؛ و‎ pDAB105818 ‏و 0.997 على التوالي.‎ 2707 ‏دما‎
‎-١ ٠ ¢—‏ الشكل £7 يوضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني ‎)٠/6(‏ من ‎PAT RNA‏ من أربع تركيبات 8 هم ‎«pDAB108717 pDAB105818‏ 5 0088108718 _بمتوسط ‎ad‏ ‏تمل خم ف لكا و ‎Yoo‏ على التوالي. الأشكال 7 ‎cat 7 Js‏ ا ‎Xd‏ اد توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي ‎(V10)‏ من ‎YFP ٠‏ 1نطظظ 060/34؛ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات 088105748 ‎pDAB105818‏ 8108717م0م و ‎.pDAB108718‏ ‏الأشكال 8؛أ ‎tA‏ 4؛ج؛ و ‎aA‏ توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين ‎(V10)‏ من ‎«Cry34 (AAD1 (YFP‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات ‎«pDAB105818 «pDAB105748‏ 01088108717 و ‎.pDAB108718‏ ‎٠‏ الأشكال 44أء 4؛كب»؛ £9 ‎5x‏ 089 توضح نتائج تعبير جيني عن بروتين نموذجي ‎(R3)‏ من ‎«Cry34 (AADL YFP‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات 088105748 ‎pDAB105818‏ 8108717م0م و ‎.pDAB108718‏ ‏الأشكال ‎On Jo‏ 94ج)و 26د توضح تحليل إحصائي لنتائج التعبير الجيني عن بروتين ‎(R3)‏ من ‎Cry34 (AAD1 YFP‏ و ‎Cry35‏ على التوالي من أربع تركيبات ‎pDAB108717 «pDAB105818 pDAB105748 eo‏ رو ‎.pDAB108718‏ ‏الشكل )0 يوضح نتائج مثالية لبقعة ‎juaill Western‏ الجيني عن بروتين ‎5«Cry35 Cry34‏ ‎AAD]‏ من 008108718 و ‎.pDAB108717‏ ‏توضح النتائج أن الأربع محورات الوراثية كلها في تركيبات مشتقة من المعزز المنفرد تكون وظيفية بمستويات تعبير جيني جيد. توضح الجينات الثلاثة ‎(AADL [Cry35 [Cry34)‏ في مستويات ‎Yo‏ تعبير جيني قوي يوضح تكدس ‎Ubil‏ ثنائي الاتجاه في صورة مشابهة لمستويات التعبير الجيني المقدمة بواسطة تكدس الجين المشتق من ‎(DEXT) Ubil‏ بالرغم من مناقشة عدد من السمات والتجسيمات النموذجية أعلاه؛ سوف يدرك أولئك المهرة في الفن أنه يمكن إجراء تعديلات؛ وتبديلات؛ وإضافات معينة وتوليفات ثانوية منها. بالتالي يكون من ‎tive‏
مج \ _ المقرر تفسير عناصر الحماية الملحقة وعناصر الحماية المقدمة في هذه الوثيقة فيما بعد بأنها تتضمن كل تلك التعديلات ‎modifications‏ « والتبديلات ‎permutations‏ « والإضافات والتوليفات الثانوية كما لو كانت ضمن مجالها وفحواها الحقيقي. ملا

Claims (1)

  1. -١.1- ‏عناصر الحماية‎
    ‎.١‏ عديد نيوكليوتيد تخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ يشتمل على: ‏أدنى عنصر معزز لب ‎core promoter element‏ 17171118 من جين ‎Ubiquitin—1 gene‏ ‎«Zea luxurians J Zea mays ‏من‎ ‎gene ‏من جين‎ JB minimal core promoter element i ‏أدنى عنصر معزز‎ ‏هه ‎Ubiquitin-1‏ من ‎Zea mays‏ أو ‎Zea luxurians‏ حيث يكون عنصري معزز أدنى لب ‎reverse complimentary ‏في اتجاه تكامل عكسي‎ minimal core promoter elements ‏07 بالنسبة لإحداهم الأخر في عديد النيوكليوتيد ‎.polynucleotide‏
    ‏". عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ‎dua)‏ ‎٠‏ تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب ‎minimal core promoter elements‏ على متوالية ‏عديد نيوكليوتيد ‎polynucleotide sequence‏ التي تكون على الأقل 9675 مطابقة لهوية ‏متوالية رقم: ‎١‏ أو تكملتها. ‎dua) ‏وفقا لعنصر الحماية‎ synthetic polynucleotide ‏عديد النيوكليوتيد التخليقي‎ WY ‏على متوالية‎ minimal core promoter elements ‏تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب‎ ١ ‏عديد نيوكليوتيد ‎polynucleotide sequence‏ منتقاة من المجموعة التي تشتمل على هويات ‏متوالية أرقام: ‎١‏ و31-159.
    ‏؛. عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ‎dua)‏ ‎٠‏ تشتمل كل من عناصر معزز أدنى لب ‎minimal core promoter elements‏ على هوية ‏متوالية رقم: ‎١‏ أو تكملتها. ‎Lo‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل ‏كذلك على إكسون ‎exon‏ من جين ‎Ubiquitin—1 gene‏ وانترون ‎intron‏ من جين ‎gene‏
    ‎.Ubiquitin—-1 Yeo‏ ‏ملا
    ل ‎-١‏
    ‏7. عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ١؛‏ يشتمل كذلك على متوالية تنظيمية في الاتجاه الصاعد ‎Upstream regulatory sequence‏ من جين
    ‎.Ubiquitin—1 gene‏ ‎WV ©‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية 7؛ حيث ‎Jails‏ المتوالية التنظيمية في الاتجاه الصاعد ‎upstream regulatory sequence‏ على هوية متوالية رقم: ؛ أو تكملتها. ‎LA‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل ‎٠‏ كذلك على عنصر ‎element‏ منتقى من المجموعة التي تتكون من متوالية تنظيمية في الاتجاه الصاعد ‎(URS) upstream regulatory sequence‏ عنصر محسن ‎enhancer‏ ‎element‏ إكسون ‎cexon‏ إنترون ‎cintron‏ موقع بداية الاستتساخ ‎«transcription start site‏ صندوق ‎(TATA‏ عنصر اتفاق صدمة ‎cheat shock consensus element 3) all‏ وتوليفات منها. ‎Vo ‏وفقا لعنصر الحماية ) يشتمل‎ synthetic polynucleotide ‏عديد النيوكليوتيد التخليقي‎ .4 ‏محل اهتمام متصلة عملياً بأحد عناصر‎ Nucleotide sequence ‏كذلك على متوالية نيوكليوتيد‎ .minimal core promoter elements ‏معزز أدنى لب‎
    ‎.٠١ Yo‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ‎٠‏ يشتمل على هوية متوالية رقم: * أو تكملتها.
    ‎.١‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ‎«A‏ يشتمل على هوية متوالية رقم: © أو تكملتها. ‎Yo ‏ملا
    “VW ‏حم‎
    ‎VY‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية ‎٠‏ يشتمل على تتضمن متوالية نيوكليوتيد أولى ‎nucleotide sequence‏ 1151 محل الاهتمام متصلة عملياً بأحد عناصر معزز أدنى لب ‎core promoter elements‏ 1010121؛ ويشتمل كذلك على تتضمن متوالية نيوكليوتيد ثانية ‎second nucleotide sequence‏ محل الاهتمام متصلة عملياً © بأدنى عنصر معزز اللب ‎minimal core promoter element‏ لا يكون متصلاً عملياً بمتوالية
    ‏النيوكليوتيد الأول ‎first nucleotide sequence‏ محل الاهتمام. ‎VY‏ عديد النيوكليوتيد التخليقي ‎synthetic polynucleotide‏ وفقا لعنصر الحماية © حيث يكون الإكسون ‎€Xon‏ من جين ‎Ubiquitin—1 gene‏ من ‎luxurians J Zea mays‏ 268.
    ‎ye ‏ملا‎
    _ \ ٠ q — y 3 ¥ 3 ْ . ‏ذا‎
    =« \ \ — وبال لل ‎i i‏ ‎yd‏ ب بل للممق#('إلتل+”نبي , 1 5" ش شكل ‎Y‏ ‎{ive‏
    ARR Es x N ; ky v 9 1 3 Y 3 0 0 0 LEE of Hie ‏ا‎ a. fi 2 ‏كل م‎ = ps 2 ‏الله‎ 0 2 ~ ae Wo 3 ‏بت د‎ 2 No ‏اي‎ ha ST ser, * Ay LN > ‏من‎ ‎* ‏اح ها بي‎ ‏ان‎ A ‏اد أن‎ do ‏برا ا ض‎ KE : EN bos PE ‏يت‎ Hi BERR 4 A Pd = 7 : _ > = gay SA > 3 ‏شكل ؛‎ ‏د‎ ri H 3 To } 1 1 1 1 ~ > " ‏ل‎ bi er CIA 5 3 3 * ‏ب ااا ؛ الل‎ = 3 ‏ب ا‎ RR A 3 ++ FRAY oT RN Ne, NAY 0 ‏ك ام اي ا‎ ‏ا الاح كذ‎ AT ay YE IY : ‏ناد ل«‎ ‏يل“ ال‎ ‏تح اتح‎ $Y Ng ‏ا‎ “es [Ree We RAT 0 ‏الل‎ ‎a oN PANE ERY hd SVN ‏برا‎ ‎5 Hig PERANG Fala SN SN TY : a 1 ‏م حل‎ X Loam ae % \ > 1 : 6 \ 5 Ta Qo iS a Tr A A 3 -
    Ye. cst . ‏يم‎ A E Fy, ‏د‎ ‎rE ‏ا‎ ‏ص‎ A - ON Xe & ~~ sR ~ 1x , Lo = ‏ب‎ aR A 1 ‏يحل‎ ‎ER ; § PRN y = t rt iF i ‏لخلا انآ + ل‎ ‏أ‎ a H SN ‏ا‎ Ny ‏اا ا‎ a . om gal geet , bE ood \ nN 1 FO FE : 1 5 ‏ال‎ ‎[I ‏دما‎
    “Ayo
    + ‏خوية متوالية رقم‎ CTHGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCHTTGGACTTOUTCCGCTGTCGGCATNICAG AAATTGLGTGGUGGAGCGGCAGACHTGAGCCGHUADGGCAGGLGGCUTOUTC OTT CTCACGGCACUGBHECAGETACGOGGGATTCOTTTUCCCACCGCTOETTCGC TTTCCCTICC TOGCCCGCOGTAATAAATAGACACCOCCTCCACACCCTCT
    ا ‎pes‏ م \ &
    by ‏شكل رقم‎ * ‏حوية متوالية رقم‎ 01 ‏خثاناتان "الخ دم لمكن ناف د ناوا ذخان اانا طاقن ااا‎ ‏ما امنا 0 لتاونل سرد رفكب ] تمان الخ 0ن جات رات اضرا‎ TCTCTACCTICTCTAGATCOLCGITCCHGTCCATOCATGG TT AGHGCCUGGTAGTICTA CTTCTGTTCATGTITGTGI TAGATCCGTETTTG TG TTAGATCCGTGUTGCTAGUGTICGT ACACOGATGUGACCTETACGTCAGACACOTICTGAT TGC AACT 03101111 TTIGGOGAATOCTGGOATGOU TCT AGOCGTTCCGCAGALGOGATCGATTICATGATTITTY TTIGTTICGTTGCATAGGGITTGO TTTGCCCTITTCC TI TAT TTC AA TATATGOCGTGCA CTIGTTIGTCGOGTCATCT TTTCATGO TT TTT ITT GTOTIGGTTGTCATG ATG TGGTCTG GTTGGGOGOTCOTTCTAGATCGGAGTAGAATTCTOTTTCAAACTACCTGGTGGATTTAT TAATTTTGGATCTGTATHTGTGTGOCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATGATG GATGGAAATATCGATCTAGGATAGGTATACATGYTGATGCGGGTTTTACTGATGUATA TACAGAGATQUTTITTGTTCGUTTIGGTTOTGATGATGTGE TG TOG TTGOGCGETOGTTC ATTCGTTCTAGATCGOAGTAGAATACTGTITCAAACTACCTGGTOTATITATTAATTTI GOAACTGTATGETOTOTGTCATACATCTICATAGTTACGAGTTTAAGATGGATGGAAAT ATCGATCTAGGATAGETATACATG I TGATGIGGHT TT TAC THATGUATATACATGATEG GUATATOCAGCATCTATICATATOU TO TAACT TTOAGTALITATCTATTATAATAAACA AGTATGTTITATAATTATTTCGATUTTGATATACTTOGATGATGGUATATECAGUAGET ATATETGEATTITTITAGECCTGCOTICATACGCTATITATTIGLI TOG TACTRTTICTY TIGTCGATGOTCACCCTERTTOTTTIGE GT TACTTOTGUAG
    شكل رقم ‎١‏ ب
    دي
    -١؟-‎
    هوية متوالية رقم * المممهممه اعوج ع معوج ممع ماج مع متفعفته مصدج هه عماج ده مجمع مم عه موه المج مع امع معد عد ممه ماج مممععوأد ‎glactcaagettag‏ ممتمع دلمه أماتماتتويتاك قتدة ممما الماع مع هتمع مه ‎cearallagoigatgostatgoeateatosastalalc‏ ‎gatopatattecatooatetta‏ 0ه ممتماع ‎apcatalgaatagatgol peatatpocatoat glalatgeateagtanaaceeacate aaa‏ ‎agctoptaaciaigaagatgiatgacacacacatacagitceaanattantaantacaccagptagiiteaascaptaftetacioopatciagaace‏ ‎aatgaacgacegoacaacacaceacateatoacaaccaape gaacaaaaapaatcictgtatatgratoagiasaacec goaicaacatgtata‏ ‎colatoctagate gatatifecatecateatoticaaitogtaactatgantatplatgpeacacacalacagatecaanattasiaantceaccag gta‏ مم مجم اتج ‎gral aga‏ ممه مم مه ال سج ‎aca aCe Aa‏ عام اودوع عه عو ‎gate‏ ممع تمع أو مهس توالا لمعت ‎aac saancaaaaaaaatcat gaaste‏ مع نمه مجو مج مه عجطربيع ممسمعي مما ًممع ا تما فاج عاج ع ع ايه سمتلت د10 1-1 ممع امواج مممعه متفقه مات مومع تت بع للج عد مم اتج مود لجع ع نج عقت مع ‎goat‏ 011 21301000001 الا م نج اتلمعممدمه مما عتموع لمعه معد موه مادج وممعج ممع عه لعفا ‎PGC‏ )4 1 ماوع برو موه ونوج مو مع وري لجعي اوري مع اانا اموه عو عمموينت ‎TET TCI GTC TCCGUTOUGAAUAALAL‏ 1001- 710411106000041
    GAGGTTGGGGAGOTACCAAGAGGHTCTGURAGGGGETOTC TATT TATTACGGUGGOT GAGOAAGGOAANCOAAGTAGTUGETOGOAMSAGOAA TCC GALT TGCCOG IGE GPGAGAGUAGGAGCGAGOGCUGCCTOOCGTGUUGGUTCACGTC TOUCH ICOOCCATTC ‏واه دلخ انان لضان ا الغ‎ AGCAAGTCUAACHGTUOAGLUGG AACTCICHGAGAGO GOGTCCAG
    8 جم 1
    شكل رقم ‎FA‏
    هوية متوائية رقم ؛ ‎TU TAGAGA TAN TGAGCATIGUATOTCTAAGT‏ 1001200001 واو الك اااي ‎TATAAAAAATTACCACATATTITTTTTIGTCACACTIGTITGAAGTGCAGTTTATCTATUT‏ ‎TTATACATATATITAAACT TT ACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATA‏ لخدا انمه ‎TCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGO TOT‏ ‎GTATTTTGACAACAGGACTOTACAG TT TTATCT TT ITAGTG TGUATGTG 10111‏
    TUITCCAAATAGCTICACCTATATAATACTTICATCCA TTI TAT TAGTACATCCATITAG GOTTTAGOGTTAATGGTT 11 TATAGAUTAATTITTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTT TAGCCTCTAAATTAAGAASACTAAAACTCTATTITAGT TTI TITATTTAATAGTTTAGA TATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATT AAAAAAACTAAGGAAACATTITTTCT TG TT TCGAGTAGATAATOCCAGCCTGTTAAALG COGTCGACGAGTCTAACGRACACCAACCAGLGAACCAGCAGOGTCGOGTCGOGGCCAA GUGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGUTGCCT ow A ‏شكل رقم‎
    د
    — \ \ ‏اج‎ ‏هوبة متوالية رقم‎ CTECAGAAGTAACACCAAACAACAGOGTGAGCATCGAC AA ‏مخ نجه تمد ف خم‎ CAAATAAATAGCOTATGAAGOCAGGGCTAAANAAATCCACATATAGCTGCTGCATAT GCCATCATCCAAGTATATCAAGATCGAAATAAT TATAAAACATACTTOTTTATTATAX TAGATAGGTACTCAAGGTTAGAGCATATGAATAGATGCTGUATATGCCATCATG TATA TGCATCAGTAAAACCCACATCAALATETATACCTATCCTAGATCGATATTTCCATCCAT CTTAAACTCGTAACTATCAAGATOTATGACACACACATACAGTICCAAAATTAATAAA TACACCAGGTAGTTTGAAACAGTATICTACTCOGATCTAGAACGAATGAACGACCGCT CAACCACACCACATCATCACAACCAAGCE AACAAAAAGCATCTOTOTATATGCATCAG TAAAACCCGCATCAACATOTATACCTATCCTAGATCGATATT INC ATCCATCATCT TCA ATTCCTAACTATGAATATGTATGGC ACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCAL CAGGTAGTTIGAAACAGAATTCTACTOCGATCTAGAACGACCOULCAALCAGACCALA.
    TEATCACAACCAAGACAASAAANAGUATOAAAAGATOACCCHACAAADAAGTHCAL GUCATATATIGAAATAAAGOAAAAQEGCAAATCAAACCCTATECAACGAA AC AAAAA AAATCATCAAATCOATCCCHTUTGCOGAACGOGUT AGAGCCATCLCAGGATTCCCC AAA GAGAAACACTOGUAAGTTAGCAATCAGAACGTOTCTGACGTATAGH CGO ATCOGTAET ACCAACGUTAGCAGCACCOATCTAAIACAAACACGHATC TAA ACAAAT ATG AATAG AAGTAGAALTACCOGGOLCTAACCATGCATOGAICGEAALGOCOATCTAGAGAAGHT ACAGAGGGGOLGOHGGOGOHAGGACGAGOGOCGTACCTTIGAAGUGGAGG TGCCGACH GHIGGATTIGGGHGGAGATC TOOT TGTGTOTH TH TGCOUTUCGAACA ACA AGG 3 GGAGGTACCAAGAGGOTETGG AGOGO CET TC TAT TTATTACGOCOUGCOAGUAAGOS AAAGCGAAGGAGCGUTGGGAAAGGAATCCCCCGTAGCTHCCGHTGCCETGAGAGGA GOAGGAGOUCGCLTOCOQTGUCGGUTCACOTCTOCCGUICOGCCAL GC AATTTOTOGA TGCCGACAGOGUAGUAAUTCCAACGH ‏اموت ميمه لفيا مخفو‎ TCCAGUCG CUGAGTGIGUAGEGTOAUCCOHTCUTGLOCU TU 1 AGAGA TAATGAUCATHRATGT CTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTITTGTCACACTTGITTGAAGTOCAGTITA TCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTAL AATAATATCAGTOTTTTAGAGAATCATATAAATCAACAGTTAGACATGG TUT AAAGGA CAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTC TACAGTTTTATCTTITTAGTG TGC ATGIGTIC TCCTITTITTITGCAAATAGUTTCACCTATATAATACTTICATCCATETTATTAGTACATC CATTTAGGGTTTAGGGTTAATGOT TT TTATAGACTAAT TTTTTTAGTACATOTATTITTAT TOTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTPAGTITTTITTATITAATAG TTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAANTTAAACAAATACCOTITAAG ASATTAAAAAAACTAAGO ARACATTTTICTTGTTTC GACT AGATAATGLCAGCCTGTT AMACGUCGTCOACGAGTCTAACGOACALCAACCAGTGAACCAGCAGCGTCOUG TCO GCCAAGCHEAAMICAGACGECAUGGUATUCTUTETCGUTHCCTEIOGGACCCCTCTCRAGAG TICCOGCTCCACCOTIOEACT TOU TOCGUTOICOGCATCOAQGAAATIGCG TOGCGHART GGCAGACGTCAGCCHGCATGUUAGOUGHUUTCCTCCTCCTCTCACGOCACCOECAGLT ALCOA TT TTC CCACCOU TINCT CGC TT ICCC TOC ‏لمخم لخت‎ AGALACCULUTOCACACCCTE TTIUCCCAACCTCOG TG PRAT HE ‏من ؟)‎ ١ ‏شكل رقم 4 (صفحة‎ ‏دي‎
    -١ ١ -
    1000001-11 تنان ادم الفكريض ااا د الم“خر خخ لاض ذل رماوا أ ‎TAGATCGGCGT‏ ا فى ربترتنبن لعجي نان عع عع وب لوت ال لخر ‎TOCGGICCATGCATEOTTAGGOUUUGGTAGT ITC TACT ICTGTICATGTTIGTGTTAGAT‏
    CCOTOTTTGTOTTAGATCCOGTGUTGCTAGCGTTCGTACACGGATGCGALTTGTACGTCA GACACOTTICTGATIGUT AAT TOCCOA TG TTTCICTTTGUGOGGAATCOTGGOATGGITUT AGCCGTTICCGCAGACGGGATCGATTITCATGATTEITITIGTI TCG TTGCATAGGGTTIG
    GTTTGCCOTTTTCC TT TATTTCAATATATGCCOTGCACTIGTTTGTCGGGTEATCTTTIC
    ATGETITTTTTTGTCTTGGETTGTGATGATOGTGOTCTGOGTIGGOGOGGTCOTICTAGATCG
    GAGTAGAATTCTOTTTCAAACTACCTGGTOGATTPATTAATI TIGGATCTGTATGTGTG TGUCATACATATTCATAGTTACGAATTGAAGATOGATGOGATGGAAATATCGATCTAGGA TAGGHTATACATGT TGA TOCGBGTTTTACTGATGCATATACAGAGATGOTT TTR TTEGO TTGGTTGTCATOATGTGE TG TOO TTGGECOGRTCGTTCATTCGTICTAGATCGGAGTAGA ATACTETTTCAAACTACCTGO TE TAT T TAT TAA TIT TGGAACTOTATG IO TETGTCATA
    CATCTTCATFTTACGAGT ITAA TGUHATGHEAAATATCOATCTAGIHATALGTATACA TCTTGATGTGOG TT TTACTGATOUATATACATOATGGCATATGCAGCATCTATICATAT GCTCTAACTT TGAGTACCTATCTATTATAATAAACAAGTATGTITTATAATTATITCGA
    TCTTGATATACT PGOATGATGGCATATGCAGCAGC TATA TG ‏ما 111111 تلخ ا‎ CCTTUATACGUTAT TAT TIGOTTGOTACTE IT ICT TT TG TOGA 00]
    TGHTGTTACTICTGCAG
    شكل رقم § ( صفحة ¥ من ؟) دما
    -١١- ‏وية متواليةرقية‎ AGCACTTAAAGATCTTITAGAAGAAAGUAAAGCATTTATTAATACATAACAATOTOCAG GTAGCCCAGCTGAATTACAATACGUCAAUTGCTCATAATAA TTC AAC AAACCCAAGTAG TACACAACATCCAGAAGU AAA TAAAGOCCATACGTACCAAAGCCTACATAAGCAGCA ACACTCACTOCCAGTGCCOGTGOGTUTTTAAAGCALACGGGCCTTIGACCAUGCGATCC ACCTTOAAACAAAUTTOG TAMA AATTAAAGUAAACCAGAAGCACACACALGLUA ATG AACGUTTICTOA TCGUGUGLLCCAAGGCCCHGGOOGGCCAGAACGTACGACGGACALGCA CACGUTGOGACCHGAGCTCTAGGTGATTAAGC TAACTACTCAAAGGTAGGTCTTGU GAD AGTCAACAGUTCTGACAGTTICTTTCAAGGACATGTTGICTOTGTGGTCTGTCACATCT TTGGAAAGTITCACATOOTAAGACATETGATOATACTCTGGAACATGAACTGGALLTC CACCAATOLGGATTGTICATCTGOOGTETGH TC AGC ACTATGAAGTCGIC TT 000 AGTAATCTCATGACAGATOTTIGAADGETGACTTGAGACCHTGOTTIGOCTTGG TC ACC CAGATGTAGAGGCAGTOGOGAGTOGAAUT IGAAUTCCAAGTTCTTICCC AACATATGAC CATUTTTCTTGAAGUUTTGACCATTIGAGTTIGACCCTATTIGTAGACAGACCCATTCTCA AAGGTGACTTC AGU TAGTCTTGAAGTTGUCATCTCOT YC AAAGGF GAT 000] TTGCACATAGCUCATCTOOUATACAGUHACTTIGTAGAAGTCCTTICAACTCTGGACCATAC TTOGCAAAGQCACTOTRCTCCATAGGTOAGAG TGOTGACAAGTUTGCTCCAAGHCACA GUAATCATCACCAGTIOTGCAGATGAACTGTOUATCAACCTTTUCCACTGAGGUATCIC CETAGUOTTIOCCACGTATGCTAAAGETGTGHCCATCAACATECCUTTOUATOTCCAL A AEGTAAGGAATOTTCCCATOAAAGAGAAGTGU TCL ‏خرن توا غود‎ 110101 ‏امت بود اتنا رم دعساي ا امون‎ TE AAC TAA TAU TGC AGAAGTAACACLAAAL AACAGGOTOAGCATCOATAAAAGAAACAGTACCAAGC AAA ‏يك انه امنا لضا‎ GCAGGOUTAAAAAAATCCACATATAGCTGCTOUATATOUUATCATCCAAGTATATCAA GATCOAAATAATTATAAAACATACTTGTTTATTATAATAGATAGGTACTCAAGGTTAG AGCATATGAATAGATGCTOUATATOCCATCATGTATATOCATCAGTAAAACCCACATC AACATGTATACCTATCUTAGATCGATATTICCATUCATCT TAAACTCG TAACTATGAAG ATCTATOACACACATATACAGT ICCAAAATIAATAAATACACCAGUTAGT TIGA AACA GTATTCTACTOCGATCTAGAACGAATOAACGALCOUCCAACCACACCACATCATCACA ACCAAGCGAACAAAAAGCATCTCTOTATATGCATCAGTAAAACCUGC ATCAACATGTA TACCTATCOTAGATCGATATTTCCATCCATCATCTTCAATTOCG TAACTATOAATATGTA TGGCACACACATACAGATCCAAAATTAATAAATCCACCAGGTAGTTITOAAACAGAATT CTACTCCGATCTAGAACGACCOGOUCAACCAGACCACATCATCACAACC AAGATAAKA AAAAGCATGAAAAGATGACCLCGACAAACAAGTGOCACGGCATATATICAAATAAAGTGA.
    AAMAGGGUAAACCAAACCUTATGCAACGAAACAAAAAAANTCATGAAATOGATCOTGT CTOGUGGAACOQGCTAGAGCCATCCCAGOATICODCAAAGAGAAACACTGRUAAGTTAG CAATCAGAACGTGTETGACETACAGG TCOUATCCOTETACG AACGUTAGEAGU SLOG ATCTAACALAXACACGGATCTAACATAAACATOAACAGAAGTAGAAUTACCOGGULC TAACCATGCATEGAICUGAACGICGATUTAGCAGAAGGTAGAGADGGHGGGGHOGGE GAGGACGAGCGGUATACCTTOAAGOGG AGG TOUIGALGOG TGGATTTGGGGGAGATC TEGTTGTOTETEFTGTGULECTCOGAACAACADGAGOTIGGGG AGGTACCAAGAGORTGT GUAGGGGGTGTCTATT TAT ACGGUGGHUGALGGAAGGOAANAGUGAA 0 AAAGOAATCOCCLG TAGUIGCCOGTOGUMHFTOHAGAGEAGOAGGAGOOUGCCTOUUGTG CCOUCTCALCGTCTCOCOCTUCOUIACGUAATTTCTGHATGCOUGACAGCEGAGCAAGTC CAACGOTOEALGUGOAACTCTCHAGAGGGO TCC AGROGCGH AGTH TGLAGCH THACCT GIFTUGTOCLUCO TU TCTAGAGATAATGAGCATIGUATGTOTAAGT TATAAAAANTTALC ACATATITTTTTTUTCACAUTTUTTIGAAGTGCAG { ‏(صفحة 1 من ؟‎ Ya ‏شكل رقم‎ ‏ذا‎
    - ‏حا‎ ‎TTEATCTATCTITATACATATATITAAACTITACTCTACGAATAATATAATCTATAGTAL ‎TACAATAATATCAFTETTITAGAGAATUATATAAATGAACAGT TAGACATOGTCTAAA GGACAATIOAGTATTITGACAACAOGACTCLACAG TIT TATC TT TTT AG TG TGUATGTG TICTCCTTIITTTTFGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTICATCCATITTATTAGTAC ATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTITTTATAGACTAA TUTTI TTAGT ‏د‎ ‎TATTCTATITTAGCCTCTAAATTAAG AAAACTAAAACTOTATTITAGTTTTITTATITAA TAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAACTGAC TAA AAATTANACAAATACCUTTT AAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTITICTIOTTITCGAGTAGATAATGUCAGOCT GTTARACGLOGTOGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGUGAACCAGCABCGTCHCGT CHOGCCAAGCOAAGCAGACGGCACGOCATCTCTGTCGC TOU ‏خا ال‎ GAGTTCCOOTRCACCHTTOGACTTOUTCCOGOTATOGGUATCCAGAAATTGCO THON AGCGGCAGACGTGAGCCHGCACGGCAGROGGCCTCCTCCTCCTCTCACGHCACCGOT AGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGUTCCTTCGOTTICCCT TCU TOGCCOGCOGTAAT AAATAGACACCOUUTOCACACCCTCTTTOCCCAACCICGTE TTA TICHGAGCOUACAL ACACACAACCAGATUTOLCCCAAATCCACCCOGTCOGCALCTUCGUTIC AAG TACGUD GCTCOTCOTOONCCCCCCOCUUCTCTCTACCT IC TCTAGATCGUCH TICC GG TCC ATS CATGGTTAGGGUUCGGTAGTTUTACTICTGTTCATE TT TG TUT ] ‏)نا مه‎ TTAGATCCHTOCTOCTAGCOQTTICGTACALGCATGCOACCTOTALGTCALACACGTICT GATTIGCTAACTIOCCAGTETITIC TCT TIGEGGAATCCTIRGOGATCGCTCTAGCCHGTICCG CAGACGOGATOGATITCATOATTTITITTTGTTICGTTGCATAGHG TT TCG TIYGOCUT IT TCCTTTATTTCAATATATGCOHEIGCACTTICTTTGTICGGH TCATCTTTTCATGET TET T 010171001101404 31001 101 1000001100110 TAGATCGGAGTAGAATTCT 5111 ‏ادم 01010101000 1 خم الفا 1001001 ففخ‎ ‏فخة0 او رض المتاهضفت 1 | تالكر 1 1 ا الخ‎ TATCUATCTAGOATAGUTATALATG 111000511171 ‏ا فته اذ اننتامغان الغا اعد‎ 11111101 102001100110165 ‏ت04] 00110000001001 00و41‎ 06116 AGATCGGAGTAGANTAGTOTIICAA ‏اي االختذة 11151010101011 الهخا 14 01613411 ناد ا اخ‎ ‏م‎ ‎TTTTACTGATGCATATACATOATGOCATATOCCAGCATCTATICATATCOTCTAACCTTG ‎AGTACCTATCTATTATAATASACAAGTATO TI TTATAATTATITCGATCTTGATATACT TGGATGATGGCATATGUAGCAGCTATATGTGGATT TTT TAGCOCTGCUTTCATACGCT ATTFATTIGCTTGOTACTG TT ICTTTTOTCGATGUICACCCTG ITT TOG TGTTACTTCT GCAGGTACAGTAGTTAGTTOAGOTACAGCGGCCGOAGGOCACCATGGTCCGTUCTGTA GAAACCCCAACCCATAAAATCAAAASACTCOACGHCCTETGHGCA TIC AGTCTGEA TC GCOAAAACTGTGHAATIGATCAGCGTTOGTGGGAAAGCROGT ‏تعد‎ ‎CAATIGCTGTOUCAGGCAG TIT TAACGATCAGTTORCCGA TGCAGATATTCG TANT TAT GOGGGCAACOTCTGOTATCAGCOUGAAGTCTTTATACCGAAAGITIGOOUAGHOCAL COTATCGTOCTGOGTTICGATGCGRTUACTCAT TACGOUCAAAGTGTGHEGTCAATAATL AGGAAGTGATOGAGCATCAGHRCGOUTATACGOCATTTGAAGCUGATGTT ‏د‎ ‎ATGTTATHICCOGGAAARGTGTACGTATCACCGTI TG IG TGA ACAACGEA AL TGAACTG GOAGACTATOUCGCOLGG AATGUTGAT TACUGALGAAAACGOU AMARA AAGCALTC TTACTICCATGATTTCTTTAACTATOCCGGAATCCATCGCAGCOTAA TOU TUTACALCA CGCCOAACACCTGLOTGUACGATATCALUGTGHETGACGCATETCGCGUAAGACTETA ALTACE TCIGTTOACTGOUAGH IEG TGHCCAATGUTOA TO TC AGCO TIGAACTENG TEATGCOGGATCAACAGOTGGTTGCAXCTOUACAAGGCACTAGCGGGACTTTECAAGT GUGTGAAT
    شكل رقم ‎٠١‏ (صفحة ؟ من ) طحا
    -١١- CUGCACCTCTGOUAATCOGHETGAAGGT TATUTCTATGAAUTG ‏فاضا مأرعمنل امعان‎ ‏لفقم د ااا‎ TEATATCTACCCOUTTOGCGTCGGCATCCGHTCAGTOGUAGTGAA GGGCGAACACGTTCCTGATTAACCACAAACCGTTCTACT TTACTGGO TT TCH TOG TCATG AAGATOCOGACTIGOG TOC AXNAGOATTCUATAACG TOU TOATOOTOC ATGATC ALE CATTAATGOACTGOATTOGOGCCAACTCCTACCOTACCTCGCATTACCCT TACGOTGA AGAGATGCTCCACTOOOUAGATCAACATOGUATCHTGOTOATTGATEAAACTGCTGCT GTCGGOTTTAACCTCTCTITAGGCATIGGTTTCGAAGCGGOCAACAAGUCTAAAGAAL TGTACAGCGAAGAGGCAGTCAACGHGEARACTCAGEAAGCGCACTTACAGOOGATTA AAGAGCTGATAGERIGTGACAAAAACCACCCAAGCOTEGTGATETGOAGTATTGCCA ACGAACCOGATACCCOTOCGUAAGGTGCACGGRAATATTTOGUGCCACTGROGGAAG CAACGLOTARACTCGACCCGACGUETCCOATCACCTOUG TCAA TG TATE TIUTGCGA COCTCACACCGATACCATCAGUGATCICTTTGATETGCTGTGUCTGAACCGTTATTACG GATGGTATEFICCAAAGOGGCOATT IGOAAACGGCAGAGAAGETACTGOAAAAAGAAC TICTOOCCTOLCAGGAGAAACTGCATCAGUUGATTATCATCACCEAATACGOOGTGIEA TACGTTAGCCHGGOUTGCAUTUAATGTACACCGAC ATG TOGOAGTUAAGAGTATTEAGTGT GOATGOCTGGATATGTA TCACCECGTCTTIGATOHOGTCAGCGLCE 101061] AGGTATGHAANTTOGECCOGAT TI TOUGACU TC GCAAGGUATATTIGUGCOTIGGCGH PAA CANGAAAGGGATCTICATTUGCOACCGUARACCG AAGTUGOGUGGCTITIUTGCTGCAA AXACGUTGGACTUOUATGAAC TEOGH TEAAA SACCGUAGCAGGUAGGC AA ACAXTGA GACGTCCGGTAANCCTTTAAACTGAGGGCAUTGAAGTCGCTTGATGIGUT GAA TTGETT GTGATGTTGGTGOEGTATTTTGTTTAAATAAGTAAGCATGGUTGTGATITTATCATATG ATCGATCTTTGLGUTTTTATITAACACATIOTAAARTGTGTATCTATTAATAACTCAAT GTATAAGATGIGTTCATICTICOGTTGCOCATAGATUTGCT TAT TTGACUTGIGATGTITIT GACTCCAAAAACCAAAATCACAACTCAATAAACTCATOCAA TATG TCC ACCTOTTICT TGAAGAGTTCATCTALCATTCCAGTTOOC ATT TATCAGTGTTGCAGCGGCGCTGTGCTT TCTAACATAACAATTGTTACGGCATATATOCAA
    (Oa © ‏(صفحة‎ ٠١ ‏شكل رقم‎ {ive
    “AY. — NN : 1 8 i I ْ 8 x X 8 1 : YN N ¥ § . wi 8 N 8 N 8 H 8 N § ‏اي 8 خ‎ NR} 1 8 ‏لي‎ © BB ‏يي‎ ¥ NN 1 i X ‏؟‎ § 3 ¥ Ni XR 1 = i nN Ne : Ya, a \ 0 : 0 3 . 3 : x 3 0 3 werent ٠ WW 8 NN aN 4 8 ‏الخ‎ MW ‏زم‎ ‎8 N N N 2 ‏الم‎ BEY AE REE 3 N NN aN RNR Nd RN NA i 8] NN 8 88 3 ‏ج88 اللخ‎ 8 H 8 8 N 8 8 ME 8 8 i SOUT TU: SONU. SUUURE SONU. AUN == SE So So SO 8 * 8 8 88 N NN a3 8 FER SE : NE SE BE BB {RB BB 8 FY « EE § B B HOR AR 1 NN 8 Nu SIE BE B OB a BY AN OE 1 N ONE OBE OB OB SN 1
    +. IY ‏إٍْ لذن 1 نا اذ‎ ME NE ‏حنج‎ © §B FB BN AR OB 1
    >. OR, BY OB BNE OB 8 NEN i 53 ‏المحم‎ EW 2 2 ‏م ا ل‎ a 8 H 8 ‏الخ‎ A 8 ‏خخ ا‎ BN RR = SR 3 , COENEN BNL BN OBN BB NEE 0 ... NNN 1 1 rg 0 a o> pea Nd rd i rs iS pe ~ SF 3 : & & & oF ‏م‎ oF ‏م‎ A oF ‏سي‎ 5 oF oF > & I A ‏الى اي أي‎ CL CG 1 HEC: ‏ب ان الي #ى ا ئى آي مم له‎ i شكل رقم ‎٠١‏ ‎N !‏ : ‎n = 1‏ 0 : ‎Yas 8 1‏ ‎"XR |‏ ‎n = 1‏ ‎i‏ ا ا ‎Poe 3 0 E }‏ ‎EERE ; |‏ إٍْ 8 ‎ROR N‏ ءا ‎AN I \ \‏ إ 3 : 8 ‎XS Y‏ ‎N 88 8 : 3 ْ:‏ ا 8 ¥ ِ: ‎eed‏ ل ا : 3 ‎RB‏ § ءا ال ال ‎NOR RR‏ ل 1 ‎N 3 8 N 1‏ 8 8 8 8 : ‎A a N N N 8 8 :‏ : ‎a NY Nd 8 8 8 0‏ 8 1 إٍْ ل ا 8 3 ل ‎RB‏ ل ,د ‎a 8 8 N N 1 aN 1‏ 1 ا 1 ا ا ا ‎Fb SS‏ ا ا ا ٍ]
    ‎BR. ٍْ‏ نحن ‎OER‏ § اننا نا ‎FE FR‏ ‎BL BE. 1‏ لد ال»»دة ‎BBB.‏ عا ا ‎CR BY Be BLURS‏ وك : إٍْ ِ > ان نب 8" > ‎oF ra SF BS > CS 8 JE oF‏ ل > ٍْ ‎ol 1‏ ال ‎ACI Ww‏ = اا ال + ‎od i‏ : 1 الى الى لخن الى الى ا ني لكين الى الى الى إٍْ أن امن كن لخن ان أ ام ا ‎FF 8 1‏ ا ا حي اتا أ خم الل ايب شكل رقم ‎VY‏ ‏¥ ‎tive‏
    -١١١- ‏لبت 1 ا أ ا ا ا دا اا ا اس‎ ‏؛ ؟ 1 1 را ا‎ As te 1 a @ 3 1 ¥ ; ERS ASS i ’ Ti Ay ‏ا‎ AR NY ‏شكل‎ ‏بج‎ ‏اللي‎ ١ Vo. ‏تسبي يا‎ VEY PIES £1 N Ag ٠ LR ~ 1 1 ‏سس سم‎ ‏للمسهام‎ i | ‏ل ال“‎ ' ْ ١ Y Rhy op aw : ١ PAAR TL ‏شكل كاب‎ ‏دي‎
    -\YY-—- Bb » +H \ I 4 ro. __ eal Ee + ‏بوسر سه‎ a ‏رتح‎ 7 7 ‏ااا اسن إسيهر د ا را‎ ‏دأ‎
    —\YY- 4 3 0 YA Se i ‏ب ب‎ ‏ا‎ ‎0 ‏اد ب‎ ‏رحبا 1 ا‎ ag ‏تن‎ ‎7 ‏اي‎ ‎od Ia CH TTR i ‏بن اا‎ : 1 i 1 § 1 ‏ا‎ 7 ~ 7 ‏الي لجا مهل‎ do = 5 ‏نال با‎
    TIN. 9 A Pie Ya % \ «a ER SITs ١ rE ‏بد ب‎ 8 ‏يبا‎ AS 1 0 [ 3 * ‏ب‎ 1 0 ِ ‏د‎ ‎ne » ‏كا‎ 4 0 ‏إلا‎ JES EE ‏وا لين‎ > Forges om 0 2 N v ‏و‎ ‎Yo ‏شكل‎ ‏همات‎ i : 5 ‏ع ال‎ ¥ \ 0 2 5 Ned ‏هنا‎ ‎F K Mi 7 f Na ‏ا‎ RL 8 - ‏ميل‎ ~ ‏جر ب‎ ‏ا‎ 0" ‏اح يلعا نّْ‎ 0 ‏اا‎ is ١ ‏ا‎ Y 8“ FRE 3 FH AN “ Nu. . sd EE SE i 5 + “a pH key ‏جب‎ in 8 ٍٍ > Y Les ee eb 5 ‏مإ‎ ‎ea ‎Yh ‎\ IG Ta ‏ب‎ ‏بل‎ ‎8 mM Was hd “8 ‏ال آي سني‎ +1 3 ‏ب‎ Wd : ‏وين اي‎ a TIE Pe Te 0 ١1 ‏شكل‎ ‎1 0 ‏دما‎
    — \ \ ‏اج‎ ‎to 8 [I i ST JERR TEE 2 ~ GE Ngo & 2 A h Fan La Be A 3 E we. ‏ب"‎ ‏اللي 0000 د‎ ‏مومس‎ 1 of AD 3> 1 ٍٍ 0 v oe INN - 1 0 2 "7 A > ‏ا الموج جح‎ 0 2 ‏ا ا‎ NL ‏اشيج‎ 5 Y ‏الا ص‎ 0 ‏ا‎ 8 yd EY & 1 2 8 oo . R Yio ot rs IE - A oR 3 ‏ال‎ ‎8 0 + ‏ب ل‎ Tag 7 6... ‏ب‎ ‏الست ااانا‎ "".. BRS 7 RN : TR 8 Fa Ty SE § «> 0 HE \ 3 YA 3 7 ‏ب‎ ْ LY HE VY ‏شكل‎ ‎tive a 0 ‏ب‎ 0 ages drag” LA ¥ Ne 7 ‏اااي‎ 5 ‏اج‎ - en 1 ‏ل“‎ ‎* - ‏ب‎ hs ti ‏ام‎
    ‎. 3 ‏ااا‎ 1 1 i : a 0 ky 4 Vi % iN { 3, NF JN No Ei ST ~ Eh ag or
    <<. ‏الا‎ ‏دخ ححا 2 ن‎ 0 ‏حا‎ ‎VA ‎AN ‎H 5 A TY YY 1 ‏وي‎ ie YT & ‏ا مم الل‎ ‏ا # ا‎ Aa - : © 2 Ah 1 We ve 3 aN . ¥ RA AN ed ‏ا‎ rl ‏و‎ 3 Ta A 8 > YA S83 ‏دما‎
    ERS Vode x Fi xy EON WE ‏ب‎ 3 eg ‏ل‎ ‎pe ‏الها ا‎ iY = ‏ل اا‎ ‏م‎ 1 3 ‏و جع ب‎ > > + by i ‏ل‎ : BR nde ]
    3 . + i Tree z 3 ‏ال‎ ‎eee Ae ‏ل‎ ‎: © 5 ‏كل اليا‎ a vo “Na ‏حا‎ R a Ty fo A $ ‏ا‎ 5 ~ = oo RN ‏ين 0 ب‎ "4 > hk} > a 7 Slane E NN ٠ Ei Yvon ‏مد اح‎ /ً ‏ذا ححا‎ Ta YS AL Loa H ‏ب‎ ‎٠١ ‏شكل‎ ‎tive nag eb 0 ‏ا‎ A Na Si Xe 1 3 Ev 8 1 ; oe Fd > َ ! ‏اي اياج‎ "ool 1 2 a Le na 0 ‏ب‎ 0 xr 8 ‏ا أ اه‎ ge ® 0 ‏»مع‎ ‏اانا ب‎ 4 A Seman, WEIL = AA hid TY ‏ل‎ ‎— ‏ب‎ 0 : i e ww bY ae AR RY % 4 iY i % 1 ‏ل ؟‎ CAN ‏ن‎ « ‏ا اي‎ EN ‏ع‎ : ‏الاح : فى 7 كلا‎ i ET \ A Te on Ye as tive
    تي د 8 = ‎al . be‏ 8 7< مني + ا »> ‎ae‏ لت ‎i ka‏ ‎Ys‏ ال ل و 3 ‎ee 0 1‏ § 1 4 ‎a‏ 3 2 "م 8 ‎ra 1:‏ ا - ا ‎LS‏ حال الى ‎IB‏ ‎a 6 Wit 0 wo 5‏ . ‎FAIRS‏ 7 : لح 2 ‎bt { TUN ey‏
    اذ . ‎FERRE‏ ‎Vos‏ ‎vos‏ ‏8 ‎oy‏ ‎TA Dw‏ ‎EA‏ ‎vo Ni RR‏ ‎“a Sage‏ الج ب ‎x. oF‏ 0 / - ا ٍِ ا لا ب ‎yo‏ ‏1 % 4 ‎Ee‏ 8 ‎yy = Toe‏ 7 ل" ‎A oF‏ خا ‎NN‏ ‏ً كل من .اا ا نينا ‎TR‏ ‏ا ال نر 0 2 ? “1# .7 3 اجا ب ب ‎ION,‏ ااا = دا ل“ 2ح ; ‎Yr‏ ‏* \ \ \ 5 8 ‎Vy N IS‏ 0 ‎FRY‏ 5 ‎bt‏ ‏+ ‏\ ‎AES‏ ‎yrs‏ ‏شكل ١؟‏ دما
    ١م‎ ‏للح و وال‎ ea ‏بت‎ ‏ب ا‎ A = Yo ‏ب‎ ‎Yow oT = 2 + 3 Yer ‏ب‎ Yee Ton Bo, Eis Ean Ta ¥ LAY B ‏د د مريع‎ sla 2] Fy CARY YRS ‏أ‎ ‏اي .آلا‎ 1 8 1 3 aed PE 1 5 1 ad - 1 EAR ‏ب‎ 1 1 ~ 1 : is 3 1 oo 1 ‏ب اا‎ : Yoo ‏ب‎ i 1 A : Yad FR i 1 ‏ا‎ 1 3 oe : Po 1 Bt aan teas te Steer] Poe Yaa Yea¥L at, 2a Nen YW, v 1 ‏لمجم‎ ‎Roope ‏يموق‎ ‎& ‎+ CARY ‏مريع م مجاور‎ ١ 1 ‏ع اضرع‎ ‏دما‎
    3 AEB FEA EE mT Bo TL BL nnd Bf RATTFRCONAOE SERTNTATOLY ‏اا مقا لتر الت لا الم تت لاوا‎ GROUCOENRTR ER ‏واج ارج وا‎ TA TY STR ROTATING eR TOTTI LIOTTA RII RR ATION NTR ‏لووك راف اج اير‎ * STTTHASATT SS3AJENTIE CAATITEGHRIAT ‏الاق مواد‎ AXTTIGITIT ‏مسح تدج دسا‎ . a ‏اح اراح بع زر جاه‎ NRT ‏الح ان جو اجا لحني ماحد واس لحرت لاد ل ا دج لجا‎ ANT ‏اا لح جد ب‎ 11 ‏الامو د جوتو عيماجم عدن ممع هته‎ CHATTRASAS ‏وجوت ود‎ YAY ‏ادا ا ا‎ ATUEEGTTNY ‏اا ان‎ TR AARCEASIUDT FRR ISTE ssa sAasy 2 ‏مهاج ا تمي لعجي زج ال جيه لمجا وين ريجات يجيي اجو ااي اجا خا‎ TI Ry TR. ‏لمعا لاجر اجا تجو‎ CT RTO ‏المج مدي‎ x bd 3 ‏تساكة اناا‎ GTTTHTEILR ASAE THRETARTTOR UTAUSETAGT SCRTORATHY : ‏الي الج تي را رديه الح ير جام لج الجر حا ال الج لاي ااي اليا‎ NTI A ‏مسد ال ا اتوي اح‎ ‏لاضن قر لام بجع‎ URHRITADNY ‏يق ارا ورا وبق لا اباد الا اا اماي لبا لمر الي‎ ‏واج اح ددجيو احرج ميا ا‎ NTS ‏ليوات اللي ميات دوت اراح‎ GOUT ‏ل جو مض ات لوس د المج لي سيو اي حوس زا لدميين عي‎ ‏اولتقت االر ام عات ام طعا الأتمداالرااناحتقة الا‎ REINITTAAR ‏رقت دم قتااواة اوضا الا باقر‎ ‏اي اه براه نيه و اداه لاه لامي ليج جايح‎ RN ‏حي ايا يه دياه ا رد عي ابه ليه يجيه‎ et ‏لط‎ AY ‏الحم‎ apd $Y PRIS IRR WEE Wa x ‏واي و‎ ETE.
    STAC LTERAD RTECS EINGT SUTRA TTA ERROR Du ‏اب وري اح‎ ‏لمتكم لاه تالالد دام مالالا‎ ANNIE NGT Re iIA Ny ABT ‏لمتكم اله‎ anal ‏ااي يجيد‎ Ne Tl Sa ET ‏اي‎ RS XE NTE ‏را‎ 8 NE a ‏وام بي‎ ST ‏ب ور ابه‎ ae YIN ‏اه‎ SA ‏تو عي بام باح اه‎ a a ae ‏ليرا ال ان لح م‎ ‏لقت‎ 3 EER owl CER TI ENTE ONIN EATER ‏الاي اح‎ Tenor Eat NE SATIN ‏لمن‎ ST ETT ‏ال‎ ate rR ‏مدر‎ ‎AY CRETARTHEATT ‏وسح ا بق اماق لمق معت ا ات الم يع الوق العم اع‎ ‏ايا لاي لم بيجا يالا ايج يه‎ A ‏في‎ St ‏في لاد‎ NE Se ‏عي ياه مره بيه‎ 3 NAS ‏ب لعي باه فر ااي عه ادرو فيا رجاه م ولاه عي هام يه ايا مه ناه‎ NE ‏مر ميا فرع دي‎ ‏ل‎ 3 OTTER wl PR RRR TROT RRA ARR, CRIT RTL ‏العم د ماج داه‎ Re ‏ل‎ RS A tol 3 ١ ‏تمض لوست سكعي لوا ال ار الما اقم ارا لتقت لاص‎ ‏ما متحي ليلا أ اي يي لها ايه لاجر متها با اي لخدي تاماه كرجه هر يلاك مايه اال بار ول اماو ايك أ مايا دييكا ملح اك وكا رح يا ري بقار كناك لجيه ايج ايه اماه لمر اميه‎ ‏ا دوا ادح ا اا‎ ‏ال‎ WAN Wa ‏اضرع‎ TON ‏جين ا‎ A ‏تاي جور اجو أ‎ TI ‏الاح بتاورو حي اه‎ TD BEIT ARS ATER A TT RE Re RIED a i ‏خوج اتا تن‎ UQANGRAATY UROOTOSASR JRARCTTERAT ARAATCIALE ‏مس المحم‎ ‏ل‎ ‏ص‎ YS Ss hr RR ae Fa vi LSA he A Se NERA ee ‏لعجا ال الحا مات‎ Th ‏اح اح ال واد‎ 3 A ‏اج ان اا ل‎ ATR ‏لا اي‎ IRR ‏ادي لي الجا رح الجاع عد م ا حي ا ل ا ال‎ ‏اتات لات الكت بكست د القن ماقا‎ CElErelind, ‏لشم اس لجنا رضنا‎ ‏اح لح ا ل ل‎ A ‏حا ا‎ RN A ‏حا ا ا ا د‎ SR SA ‏حا اح‎ RSA ‏ا‎ A ‏اج ا ما‎ HO ‏ما‎ avd ‏جمت‎ ١ك‎ WIE wi xX \ TR OY EL fT TY EE cE CVI RT, ‏ا‎ Oe A TE ATTY ‏را ا ل‎ I ‏ال‎ hv ant a ‏ل‎ EL ¥ * ‏اممو متي ممح ماع الس تق ااا‎ CTUTCARART TROEUTUTTRY ‏ممع جيم ع‎ ‏افر بم اه نيا و ياي بي ا رحا‎ Ne ‏ل ل مع ا وا قي جا في رياه مه تراه نيا ا بابو لاه‎ HT Ted ‏ا«‎ TER ‏عم‎ DEA ‏الم ا ال اجا اللا الاح‎ Lm 2 WER WL FRATTE OWE IWATE ‏مسد‎ ‎SLIT ‏ل‎ LIT NA NE TIAN ‏ا‎ SANT, IMRT VAT YR AY ‏ا‎ IR MRD VAN AINA ‏الما الا تيه‎ ASOT GUNNING ‏للم ع ل اتا‎ ‏ل ل ل‎ RT ‏د‎ Re ‏د د ا‎ ee Ka NR ‏ا‎ a ‏ا‎ ‏الجموي جا لد‎ 0 Sav ‏الم وا ا‎ TRAYFD {with ‏ممح‎ ‎TIEN ‏اضرو جو‎ RR RT ACN TORT VRE RRA INNA IR NORTON, RTT RON ‏يود اجون‎ ER ey NEY ‏ماما اساي رالا‎ TRAREATATAT ‏كت كان نض امت ااال تعض ان حت مضت‎ ARS Te ‏ترجاه‎ RSE ‏براي تيح او اه الا ايج‎ Ne TY ne eT Fre Pa Ses eo ae he re ne ae ‏رحا واه‎ A ‏ركه لل را مراك‎ a ‏ادام ايها واه ذا‎ ‏مح‎ TIRE 2 ‏لطا حو عم‎ 0 ‏تع مع ال اط ات مطظ‎ intron) EER SOTTO ‏يت و الا م سات حور‎ RITA SARITA ‏ا تت يا‎ TL ROTORT ‏تباصا م مضه لصا الست م حدق لزنام قت الج ا صو جم ا ا‎ ‏جاه قا رجه وا ااه ما اا وأ يا لاي جاه ار ا برجا لكي ب 7 حاط ا‎ EN A ‏واه‎ ae SS Se ‏إلا يه رهام ل يها‎ A ‏ليوا جل وا‎ a Se ‏جل عي‎ Nr a ‏بح واه‎ PIER ‏ييا‎ Fart ‏دجوا الكال‎ ‏الممحة كتوم 3 مسحي‎ > ‏كر لي الا را ل ا‎ CANA ‏ال ا را‎ SN ‏الا اي‎ a SAAR ‏ال رات ل‎ 5 x RURTATOTDN ‏الا لاسا لنت ا ااا الس لاقي‎ DUPCOTICASE.
    PETAGABICR ‏يداي جاه اا لي له اماه ايا ره‎ A ‏الاين يهل‎ Sr ‏ماع ييه‎ A SA A ‏تايا‎ A ‏جيه ايا يا ا وار دجي ير جيه لاوا‎ Be A ‏بجا‎ ‎TI ‏لحي حلا اي يي الاير المموعةة‎ a FRIVETE WE OWI ‏مح‎ ‎SATE ES A CTY NSO ‏تجا‎ ONE SR ITI NO SN ‏مويو‎ NE YR OA SOIR WINER ST RT ‏مت جا لماح تت التاق ماما الام د تمستا الامو تتم ال تتا خخ ولا‎ ‏ل‎ ee A ‏لح اح ل‎ Rr Fe ‏سح د‎ Ne A ‏الح اد ووو ال العا وا الاي اللممموميدة مت‎ § ‏ا‎ BRAVES ©F ‏متاح اندج‎ + AY ‏جات اللا ل‎ a ‏لاسا‎ i ‏دحت الكو ري الوا را تلب وي ديات اموت لمي لمتحي وري اند لوالاو تن مور‎ TOR IER Cie ‏ادج يج تاف‎ ‏تان ا اليا اتات ااا ليعش اااي الماع الم فالتا‎ ‏ند ا ل د ا ل‎ AN ‏ا الحا ا ا‎ RN ‏نه‎ NAN Re NT ‏الح تحن ناد ا‎ NASER ‏الي‎ Jada ‏الج ل جام‎ 8 FRITER ‏عمجو معدا اا‎ ARES] DETTE ‏الج‎ TREN R RTT ITT BN ET ‏ا يجيو روي الاي ايب يروي ا‎ RT RT ‏ااي لجيج لج عا لاض ا‎ ‏ال ماياو وا وان لاماي ارت لاما اا ملاعم لماك لالم ما‎ SETIFIS ‏امه واب وا تماد املكو اماج اماي‎ Sr a eR Nee ‏حت اح ا د ا ا ا‎ Sin ‏اح ا ا‎ ‏الت اللا اا‎ Sand eh Sew ‏ال‎ ‏مح كد تح متت‎ CRT ‏اب‎ STII ‏ايه‎ TUSTIN RTI ‏م‎ ATO ‏ضع وج لواب‎ Et RE IN ET RT ‏عاض العا ضر ال ب لماوعل‎ eee YAY ‏لمعم وا محفت موا شعت اناد التق وم الوا لتحت اتا‎ AUTEN ‏ا ل‎ NR ‏ا ل ا ا‎ NATED wl ‏ل ل‎ ‏لماعم جد‎ WF ‏ممع حو عدج‎ bd ‏كم‎ ‎3 ‏شك ) رقم‎
    يي رجن اك جو الجا ‎EN‏ اموا ربوج اج ‎St SANE‏ حر اح ‎NS NSN et Sy‏ اد مي وح حي الا الات ‎A \ BOVIS REND SUN‏ ‎USTROALGRY‏ ا حار ا ا ده لد ما اك لحل لوج ‎Rela aR AS‏ الما وح الاق د الي يي ¥ ‎bi‏ ‎NT‏ فيل يها عي واه ايه نبا ‎Tn We eS SNe Se‏ ةيا عا اماي لاه ‎NS er Pa SL‏ هيارم احا ‎ie‏ ااا ‎AE‏ يميه جاه ار ليا موا يم يح نا ال اي تاي لاجراي لماعم ‎SREYED EEE AR IR a‏ ‎angen‏ معدي ‎FREYEPD wd‏ ‎ASTRA TALID‏ اماد حا لجرو يداوو الود اضرو باورا مج بو اج حي ‎TOASTS‏ انو مر اي يا ‎xe‏ ‎SO ATTAGASA ARTTATASRTY‏ لالجا يديد جديتك ا تخدة راض تتا مخضا امسا ةلالا ٍ اي ا يا حي ا ‎Ae Re‏ ييه ‎A ES‏ جاه اهاوه ا يرا به ‎Re‏ ب اها رجاه ‎SS Sh A‏ لجار ل ال اما لاي لا ‎ie‏ لجال ره يكاج مايه ل ا ل اما ‎TIE aw‏ ا اي اسمخ تكد كب تيتا ‎ee re‏ مره لمجاام بج ‎ir‏ لكاو بي ‎Ne 1 in‏ فيه لاي ميا مي يم مال ل ا مااي لام انح ايه ااا ‎Somme rR Sr Pa Ha‏ ابه الح يداد ‎DFT A wm‏ ‎ES SE SSCS SION‏ حرا ‎SX AY‏ ‎FEAR‏ ‎Sed‏ اه و طاح جضت م الا لاحل اي الج احا يج الاح الاك اج ا ايض ا ايع ال ايع اضرا ا رج ا روا ‎TEAR‏ ااه ما اح الح مون اج تاج ‎SAE‏ ‏لل ميد ما الاي هاعر ارات رارح الاناستة الاق اجن ‎AUTATAGASA‏ عصرم كراد راي يا ‎TEASATATRD‏ ‎a Re ae Fe ee RY a a‏ ل ‎wl Gelrh otras‏ ال ممح عد ‎PRITEFP v3 {with‏ ‎AS A Se ee Se‏ ا ‎i eA Ye ATA Te Sr A he ee‏ ا ‎Ne A‏ م ‎St eA NT A eh‏ ‎UM TT Aga aes or‏ ‎SW~LEL andron IX‏ ‎sd‏ ‎ATOR T TE TL LT ATR‏ اج او ‎ATR‏ الوم ‎MR‏ لا معي عدا لمجي ‎RT‏ اط يسا لدي ‎NLD‏ ا ‎NEE TAAL‏ ‎TATETATATR‏ ات لتحم كما لمات لحم لمجم توج التقممي لأسو امت تفص تتا نا جاه م ‎SR‏ يام مي به ماه الك يرط بيدأو ل وا بهاو ‎ae‏ وليه ‎aa,‏ ار ياه برح ‎a SAS‏ وام با ماكر وام وام ل خاي ااي ‎A‏ كير يه لكا مايا ‎ae‏ بالا لحا مضي الواحم لهالل ‎wat San‏ لامها ‎WEY‏ ل الل بجممعجة تعودم ‎SHAVED wi‏ ا ل ‎A‏ ا د ل ‎he‏ سح لح اح ل اح ا ل ‎RE Se Sy‏ احا ‎An‏ ‎RMA WS‏ ا وس ‎IT TS RAT NI A RT‏ جمد الح اعت ‎RAT ITE AUR ROSATI ST RNIN‏ ال م اجو ام ‎SEEN‏ ‏د ل ل ‎ALOE SRA‏ ا ال ‎a‏ يد الل ا ماع تدا د ا تع المت ا د ا ا لضا ‎NS‏ يد د حت ضاي اد الاي ضاي ا اي ا ا كاد د ات 0 ‎NR‏ كا كان ا حا حي ند د ا ا ‎NNN‏ ‎DRIVER vd {with intron}‏ ارح اا ‎SA SAY SAA NT‏ ترايت ايت ديه لجا لجيه ايه عم مممعجة ‎STEEL‏ ‎Yay‏ ‎a‏ ‎OR NY TE Se a i‏ راي اج ‎Nt RR‏ اوماد ‎AT ENN CAN SIA‏ اومن ‎to NRA TIN SR ON TOA EI NR BE‏ ا ‎ATASCOTRAS‏ الو ال ل اللا ات التق لاما اانا القت عع اا ‎v‏ ‎oN‏ حي د دن اا ا ان ‎NS‏ ا د ا ا ‎IN‏ اه م ا اا كاد قا اد كيد ما لاد اد ‎NINE‏ ‎fed An Hw temas)‏ للحي لجعي مج ممع وي ‎PRATER v8 {wily‏ ‎Te TN Va SO ay‏ لمر لماعي اسح ‎eC ER a NCP TO Th ha ee AAT A‏ ا للحي ‎oy TON IY‏ ‎RR Ys ERY‏ حا شن م ادي ل دن كا الكت سا نت كدي ال تا ات لا ا ‎h iY hi‏ اح ا جا د مد م اد د د د ل ل > ‎pan‏ ‎i a ne‏ ا د ‎NAH NSN A a A SN‏ ل ‎Tod WED ar Tent AE % aw mie mia‏ اح ‎YAK TRAY a WiLL‏ ‎A A t i‏ ‎IE rT‏ الاح دراج لسو ‎LONE By OVE RTE, SN BUR‏ الجاع جام توج جف ‎ER BC ECT‏ ‎THRIGRETUAA‏ الجا تياد ارقم اد انح الت ارات الست الا ات دانسا تاليا ‎TROABERCDT‏ ‏ا ‎Se Ye NS Sa‏ ل ‎A AL‏ ‎“in‏ ‎WR‏ ‏جا ع جا ‎Ri AR a‏ يا ‎A a RR‏ بوره ‎AR‏ ياه اه جه ‎AA TN A‏ يله ‎ne a mR‏ ‎SRNL ow fag snap‏ ل اع ا ل اح جح حم يعم ‎A SUR er‏ ل ل ل ‎AVS TR Ta ES‏ ‎Art‏ ل ب اي امد ار ا ا را بي الا الما ل ل و ا الور م جه با تي الات ا ا ا ا الما الي لايم ‎BEOGRAD AGREEMENT‏ مستت با ‎١ + Y FTATCTREAD‏ ا ل ل ‎i‏ ا ا د ا ‎Ee‏ ل ا ‎RE‏ ل د ‎RS‏ ا ل ‎Ee ah]‏ اضرا ‎ENS a‏ ‎BR WE IR SNR‏ ‎ATEN RONAN Ha SONS RIT A ROIS BR MONS ON INES TOR TA‏ الدج احج تتام اج ‎RAI A‏ اح ل ودج جود ‎ARSTURANTY‏ موجمج م جب مودي ‎TACTUTTICY‏ ود ات نا لجرا ا ويه ياد وا لخدام ‎TALS‏ يله ا ‎SR A‏ ايه و ايا م يا ليد ياي ل ره ‎A‏ ويه لايد جا ودار ‎AYA A‏ ليا اك اياك جيه ‎A‏ ري ايه ريا ‎AS IR‏ يايد يها رتت ياج ‎A AY AE‏ اماه كني ‎A‏ ‏كي ‎REDD WE dm‏ لكي ارد راي لاا اي ركم لاد لاا اتا الا الاير ولتت الضف عدم بقارن اللا ‎XY ASN‏ لدت حت ‎Ae‏ حك ‎AE‏ دا ‎a‏ لح لح لح ‎SER‏ تت ات ل ات حا د ل د ا د د ل ا ب ‎an 2 Bed me‏ تمك ‎ARTI v3 {mo‏ ‎TY RS TRC Sr Sn Be NR‏ ا اع ا و ادي ‎Ae‏ اللا ايه ا ار ‎IVA BR‏ ل اد ‎TT‏ اريت الاح الي ‎N AER‏ ‎HIARARTERS TUANASNRA‏ ال د ل كان ‎EE RAY AUCAGTERRNT TRATTIANAT BRAGRUITTY‏ ‎TR TN A Ra NA TNS A Ti fm TR A a‏ ل ‎SS YR‏ ا د ‎te Se Se Ra‏ ل ‎HR men A‏ ‎BARI WI inl RRR)‏ ‎RN EINES MONO 3 FUE‏ لماجي ‎PNA NNN TON ON MAR MXN‏ لجيج جرح جع رحد الح لب جرح حا ادي ‎J‏ ‏وديم اموه لدي مجه ديع ‎STUDUIUDTST CAUNASUSTS‏ مموجوج | لمحا ‎YA‏ ل ل ماي ‎Added WE fm‏ شكل رف *؟ رقم ّ
    ممست ‎SUTARAGHER AUDTGRAIRIA COHTHTHI0ASE ADR‏ الات ارا الأو لقتال سا فش ‎Yi‏ ‏اح حا د ا ل ا ند د اد د ل ل د ا ‎eR‏ ل ا ل ب ‎Te oe‏ امج لاا ا ‎IRS SRO‏ اانا ‎Foie‏ ‎TT NN RIT‏ وا ‎IAT SRT‏ جو وض ‎COTTON TTL TE EUR OE RT.‏ نجام لوجع ادن ا يع ا ‎TT‏ ا الاج تخ ار الاب اام قات الات اراي ‎TERRIERS‏ امام ا ار ‎Xho STTERAGOT DUGRTEETERY‏ ‎A‏ وي ‎SA‏ لد ري لياوع لوا ‎ARS‏ حيار يلا اتا ‎SA A A SA‏ ل ول اتاد بلا حي يلاجر ايا بايا ‎AA A A‏ ياي ا وا ‎A AC‏ يل اج ‎Aah AY‏ يجا ياه وله تيار ويه ‎NA‏ ‎ON 3 orm Sema saan‏ ‎Agatl WR IWR RT)‏ ‎TOTO RINE ERO RAN YY ROTI ANY ROY R COR‏ ريت اليه د ات مات لحل لت الل د لم اا ‎ATCT‏ الاو اف انق الي ارق ال اا ال تي لمق ارات لاطعا ‎Yay‏ ‏بحل كالسا احا ا الجا لداجي واد اج لضن ل حي ل اي أجل اا رح اج الا ااا احا اح اد حم ا حي سحي الس ااا ساح لاد حي رادي دا اتات لاح اده لحت اخ ال ‎ER‏ ا ا اا ا ب بم ‎{gd‏ دب مهمع مج اشر المت ما ادا نات سا ايا وتاي لازا بثك ارما لفت الما الاش لساري 771 ا ‎nl‏ باج بر يواه ليا يام ا ليا وها كاي بام يد باجا با لاه بي تي ب ما ‎Fa‏ ب بي ‎ST‏ اما بل لاا أ اجا ا اج بيدا لي بحاو بي ايا تيه لجيه اااي لا ‎A‏ جا له لعا ايه ‎RET any Toe, anne)‏ ‎Wns sna‏ تابخ ‎Sassi‏ ‎SI Re‏ حم عي ‎A TR NOR A‏ لتو صا ‎Wd‏ المج لي و مرا لع ع دحي مص اج ‎xX AR INTACT‏ ‎Y A \ EE 2 TE A EE SE TE a‏ ا ‎A‏ اريك ‎AL‏ ار ايام ‎ASA MAS‏ رياه ‎CA Se A A Se Aus A PS Va A‏ يجا ‎be‏ ايا ريه ‎CAIN Se NA A SA Se A ACA Meh Sa A eh‏ جمدي مو ‎AED-D WE‏ ‎EASE WNT SY SATIN On et ATO‏ مج ‎ART CATR EI SINT TET RR RIN‏ حي ل ا ‎SES‏ ‏ل ا ‎GUAATETSIY‏ لاق ماب وي لصوام نرت اس مد تور سم "متمق ‎Yi‏ ‏يام وي ايا واي لا و ايه با ‎A‏ يجيه ايه جا اي ‎AsV es‏ ل ديا ‎SR SR‏ الاي براي حيار يلا ادي لجيه أي اريك اي ييه ا ‎VA‏ بد ينا يا تحبا رلا ‎A SA RS A SS AS‏ ريا ل م ‎ey‏ حراج لاا اج ا ا ‎SE‏ د اجا الا اس ‎Ee‏ ‎ine‏ جد دج ‎MIND ANNES‏ ند مجع ‎SURI ITER ATE A UTILITY, A‏ ا جو ‎TUNING SONATE A‏ ا بر اساي ‎SETTING OOASRAALST AGATEROTTS STRASTATES ARGUIRTUNA‏ في ‎WN Ne NN A NS Ve AH NS AS AY AS A Fe ese A A AR 94 A SN re SX ae A a A A SA a‏ يدي ‎RAEL-L wd dw‏ عأ وى اي ‎SYN A WS‏ حوري لماع لمجا ‎SY SINS‏ لمي ند ‎BN RANE NY OTE NN‏ الاي الاج ‎VTA SNR‏ ‎ARES‏ سك لحك ل ‎A‏ ال ل ل كد ‎BT‏ ‏ا ا ‎A‏ اح حت ل ا ‎SA‏ د ا ‎AE AAR SA i‏ ل ا ‎WE fo‏ الس : > ‎TNT IL ot Nr NN CRATES Bihar RN‏ نر لاني اي ات ‎ENTE TINT CYT rN STATED ND er‏ & جيم امعد لسلست مد الج ا ةقحالتم لأسي لاما ابمهقة 3 01 ‎Ye SA A‏ ل ل ‎AAR Re‏ ل ‎SR‏ لد ل لح ل ل ل حجن لج اوم ا 2 8 بجوي جد ‎SADIE‏ ‏اليف ‎A‏ و ينور ‎SR‏ اوحض ‎TR TE NN‏ د خم ماس حي ‎DARN IN NY‏ لماو ‎NT ATTITUDE‏ ا م وا ا ا لرجم م دة معد #لجوو تود تست عق امت ود زاتما الاي متمد قات 3 ‎Yo A‏ ا ‎rN‏ ‎RRR‏ لدو يح انمو جنيو البق كه لور الدج يي الجا جم الوصو ‎RI RINT‏ الو حا حب يج يا لجو لوجتي ا احج ريد جع رمات الات اااي اج ماتيا ررمي رم اضر الما ‎A‏ الات تيك نكاما انار ‎NEY I‏ ‎ARS‏ ‎A‏ ل ‎eA A No A A Kn A SA A A AN ur A SN Ave Re A A A re rn‏ الا ادج ا اا ‎Taw]‏ ‏يا مم تقض تست ‎ND‏ كايح ا ا ‎IRN REN‏ رحج حك اح الم احا ‎NEN‏ يح ضحت ا ‎SR ERE‏ اهرت لحي الل اح ‎RPT REN‏ ا اج ‎TNE‏ ‏اويح تح ييا المت ا ليق معدت مج امم عق تاد متمق لمجم محف 7 ات و يا اي ‎LAER eS 8 A PEA a‏ ‎Tatil] Tate wd‏ ‎vo‏ ولد دكت ‎Sulina‏ ‎N= 2 0‏ ‎LD LEE TON SORT UII aera mM ATA MR nee‏ عب ماج ‎TN DANE‏ م حا ان ‎AEN BUTT NR‏ و ‎SRALSCATENTT STTTESTTATA ATHCATAREST‏ المج لتم تضم ‎YY TOURACSTATRE TOASSETOLNE‏ ‎Ne‏ د ‎SN ST‏ ا ا ا ما كا فا ‎SS‏ ااي الا ا م ا ا ا ايد د ‎SN NN a NPR YN Pe INS‏ ‎wn‏ ال ا ل جل تم تمت اتيت اد ا لاا الا ا الا ماري التي لاشيم وام اوس م الام لماو ‎RUTURASEDT‏ ذا ‎RE A‏ لوا ‎NN 2 ER‏ ااه ااه نح ار جا عي بجا يي ‎A‏ اله جيه با ياه الا اموه ا جا لا جا ‎ARR KTR‏ يا ليا ياي لاه تاي لاا يا ل يد د ‎UY Tid aes wd‏ . ‎X And ARENT GES RE Sr Se]‏ ‎A Ny SNe‏ ا ‎TNE EN MEANT ht NN NAN‏ ا ‎A ON INN‏ لج ‎Ba SAIN RN ENS NN MANTEL TEN‏ ‎MTOEATATIY QCATOIETOT FARR ITIETA‏ جرم اا ا ود امام ال لمع الاسام سد ‎A‏ د ا ‎A‏ امات لما د ا ‎Ne‏ ا اما اد ات ات د د اي ا لدت د ا ‎NR Ne‏ ا ل ل د الا لب ا ‎YE salina d dnyren va‏ لم يرت ‎A‏ احاح ا صرت الماح اح ااي ا لاع ات ‎NAST‏ 2 لتحم حي الا مس لح ا الض ‎TIARA‏ احص كم لاتحي ا ‎ETD‏ اح ا اتج جر اماد مت ابجع تقض مجم لضع ‎AOTRTEAAGA TOTETGACRD‏ ‎er Te ae SN PS A Se ea‏ ا ‎Ln SALE SR SR, AT‏ ع ‎AWRY AWNTAGN‏ ‎SR INE NE‏ الت لسكا راج ‎TITRA‏ وياد ‎OTR BEY‏ الج رج ‎SIND‏ الجر الجر الج ‎Tt‏ ال دانم لسن لم لمات اا الى الس كم ‎ATUTRGARCES‏ اود لا اللاي حمسا ‎Yas‏ ‎SAAN Ta A aT A a‏ ل ل د ‎AAS AS‏ ل ل د ‎ASA To A TNS‏ ا ‎Sd‏ ات ع ا ب ‎wa‏ تلد ‎ARERR L‏ ‎yy 3 ig ES‏ &
    وما الا يج م اك العم اي دي مح اي لدي مما حي كوج د ا وج اح حا لت ني ا حا ل ما اح ‎٠‏ ‎THYADEIATD AGTAARADUD SIATUARIARY‏ الأ ممم ‎TORTARUIAS SUCRADARNNAS‏ 4 اك ب ‎TE RR SR Sa SR Sa Se ee‏ ل وه ‎SS A‏ ب جه تجاه لاه ا يه اديه ايه ‎TR‏ انيه ل ‎NAAN IR‏ د ‎ay‏ يك 0 ‎SAE TL‏ كا لحت تيناد ‎SWEDAL‏ 73 متي بجيال ‎TAT‏ الوح ودج جود اتوي جاده مدن وى اندو قي وب و ‎TITTTACATD‏ دلجي ان حجار جايو اليه لبي جين جني مجاه ‎ne‏ اي المت الا ايت لا اس اند ال م ا الا ال م سد الا ل ا ا حي ءاج جه عا ااا جا ا اا جا ياه قي اديه ع وماج بيه ايم ع تيا نيار ‎EE‏ ‎wel‏ المح ‎A Tanti dL Tse‏ ‎wa‏ تكد ‎TYAY SMU yd‏ ‎XA Tt Be A NT‏ لمحو جا ‎SR RA RTO AN, IIR A TAY Ra‏ الام ا مات ا ‎TEIN TRY‏ ! ‎A ME IRIN IR‏ لال لاما تالالا ‎SA a Se A AS ASE, ae he TAN A Se A A‏ د ‎a Se hee SR SAN A a Pe A A SA Ae‏ ‎Ea YN ean re‏ ‎TE |‏ ‎ARNIS WE‏ المت اا ‎vig‏ ‏م خط مرح خا اهما راضخ ةا اتنا تطعا اانا لمانا اباد الجا ‎COVA ILI RRR‏ + م ‎AR‏ ماه وي ‎ee‏ بج م ع مي الجا ياه ماج اما ا دكا ‎SA a Nu‏ يلم ماه ‎a‏ ديح توا قي مايرا بحام احا إل اي ياه مي د وتيت ‎SANE‏ اه اتوم بح الج ااا ماه الوا مي ‎I‏ ‏ا جوم ةا © لمتحت خاي اس الا د ا اب اجن واب ‎SN‏ ا اناجيت اجا لصا وين ‎SIR NITRA OTT ORIN TAT ٠‏ لاض وج جه مداو مضي ‎Xd LOTTE IR RAD‏ ‎¥oa 3 J RE I EE SHEE A RA TE EE I FRE SER‏ ا يا ام ‎A A Aen ae re A A‏ و روا وا واه واه جا أيهم له لهام ينا ‎A‏ واه جا واوا تار ‎Sh A SAY 5 ur‏ وه اهام واه ‎Aa RL AY Se Se Ne A A‏ ‎Tan weer ed‏ د ‎Genii‏ ‎AWD SL RTE Ta‏ ‎VR RCN RE BY SEIT EY INRA RA RS ARERR BT BINA ENT AN YN RS BT‏ الم ا ا ‎RUDE‏ ا مر التق لحت اع المع لكي ل ادي ل لضفت تفع ‎er‏ ‎By‏ ٍ ‎ara SPARE Ne eS nN Fin RAN eR 1 eae Ne ene a RE‏ ا اا ‎MAL NS‏ ا ‎TN NER‏ اا ا لالم ع 0 ‎RR I‏ ام ‎ie‏ كلد الخد متا ‎Se‏ ل ل ‎RvR ONT NAR IT RE‏ ل و ل ‎RA NAAN NR‏ يا الا ا ‎NRTA‏ ‏ادي اي الام تدس الوق ادب لا لقف مدت ‎TENE‏ التاق عات اه ‎SETHE‏ ‏يد با وي ري بكتري وا ب ااي ‎A a‏ أ يجا ل 1 ميد ‎REAR] NN‏ ‎YW atone: ard‏ ل ‎SMUIMLL ARITA WE‏ ‎RE Ny Are NI Bn AD‏ ب نكري ‎$A ANN SE DV SERA‏ ‎AURIMANIAD‏ سالاد الست لاسن ما الود الما اما اراد المي اماي ‎TEA FIUDESIETA‏ اح حا اح د ا ا ل ل ‎SU‏ ا ا ل ا ا ا لح ل ل ‎ard‏ الماح + اج ييه $8 الحا اكد لخ مالك اال ري الجا ا لني ‎NE Tr RANT‏ الماع اين ‎STATE ESE‏ الت حي حا يي ل ا ني لال اوري ا ع 8 م تدا لام التق افا اا ‎TREE MUTACGGRC‏ لفت ا تفع فوع التالفضاات لاما ا اح لس حت حا حر حت حا دا د د لاد حا ل حا ‎SA Te‏ ل ا ‎A BAA‏ ل 282 لمك ل اليه دي ممح ‎Fell‏ ويم ‎TE 2 eT A‏ حجانو ا الجا ب ‎en‏ لحرت ‎ae etm it‏ ا ‎NES‏ ايحا جم اعد ‎A‏ اجا ب ماتيا اس لمت شتا .الت زان تاي لتم لمم ‎FROEOCGRTD TROMGAAGHY‏ ‎me‏ ‎RO‏ ل ‎BE TI‏ ‎WL‏ الات تناد ‎SWELL‏ ‎AE A a‏ ماري ‎AVA A‏ ايا جا ا يه ‎AR RS‏ رياه رد اا ‎A SA A ME SR Ath‏ تا رك ‎RSA SE A‏ مد رجاه ‎A AN AA‏ ايج ‎Tend weer ww‏ اانا م ما وجح تج لمتضخصة ‎Tell‏ حت و لجا ‎ie‏ لمجا يرج لاج جاع م يض الفا ليجو و ‎NR‏ ارد لون جوري مي الجن عدا ‎NE‏ بتاع دحج دوي دكات ممت اا دار الاو امار ارت لاس اتا الت لاصوا لاتوت نا تاهالا ‎Se sn fe‏ عبار ‎SA A SS‏ لاه حيار يد جيه ااا ل يا ‎SR SA‏ رايا يه لمانا ل ااه ‎SA A‏ يه ابا يح اوكا بال ب متي ‎A Aa‏ ‎Can mete +‏ ل اعم ار ‎PERERA SIE SA‏ ب ‎LE‏ ‎mes pe‏ يي ‎PRATT‏ لعن بام ‎Re No sen‏ امارج ا ‎TE EE TES TA Nn RUNGE‏ ‎SE Satta‏ كماما الجاع د ‎lala‏ اج انكر ماله ‎Da‏ ات اط لماحم رار انع ااانا كد لاوا ىل اذا جاجتط ارات الاي ‎Pa Sr ne ve se Sr Ee Se ee $e‏ رد الا مجاه لايد هركا لمكي حي ري ‎A ATTRA YT‏ ‎aA LE‏ ‎Se‏ ل ويم المت بوي ام تي و لل عي ‎a‏ حم الام ‎IEE‏ اا ال ا اران لتقا الفا مستا ا تاماك لكات اماف اا الم تت لا ااا وداج ‎AT‏ واد ريه هيل لحا ريك ‎Ae‏ وه با وي يك ري جار ايه ا ‎Ae‏ لاا ييا اه وله روا ‎tr A Te‏ تحر كا ‎Ae AA‏ كاين ايه ‎SA‏ لايك ‎a AS‏ لجيه كحي بحاو ‎wifi TE‏ ام ‎Minh ily‏ ‎AN nt RAE Ry ASS NAY reas SN Et SRR oR SN Ry SNR,‏ ا ‎ah NNR An ger anaes Sn EN are‏ را ‎ChE a tA‏ مكح ‎SIRI TY GNI RR‏ مضي أي ا ابا ‎ARAGON‏ جد توي بض § ‎Ack‏ 5 ا ا ا ا ا لا ا ‎ea NE‏ اي ا تح لا ا ا ‎NE‏ ا ‎a NS‏ ل ا لمتحت الاح بج عات معو بلط ‎BN NT RTS,‏ الح اوت بص واي محم ام ‎RAT‏ لكا عو ‎A‏ اليه حجرو ا ا ل ل و ا اا ‎ARGTIURADG ATHREREOIER RUDITIIERGS‏ ا م حا ا كك ال ا ا ‎q PR‏ ل وا ءام او ب اليم د ايه ‎Pe‏ ياو مي ‎ang mn AN‏ ال بيه لاير ‎A‏ ول بيع اا يها د ا أ ‎ARR A‏ ما ‎A‏ ا ع اا ييه ‎a‏ يا ‎Ha‏ ل اماه ا ‎AE‏ جه لاي لاني يه جا ‎EE WYER‏ د تسن حا الاي لاسرا وجي 2 لكات يه الم ت مع الل تتم ‎he Aes‏ اد و عي ا ةا نيه فز اا ره جو ‎SAS AA‏ نوا ذاه ‎IR‏ ام ره وده ‎Si‏ فا ‎Tae‏ ارده عي جاع فا اول فيكتي ور ‎Sa‏ فر اي رماي اما ‎TA‏ راي اماه ايم ‎y‏ 4%" ‎nae‏ يحي وم م ردح الححراي لاع لو اله ‎ROTA‏ اصرح حرم عورا اك يم ‎SNCS ITO SIAN A PISMO ST SIAN NY‏ لامكا عدم ‎QUITITUTAR‏ لأسا تا لاا . اندي اتاد لاس مستا اا سن الاي اح الج جاع لسر الكو اك ا ‎poms wi‏ تست ا ‎A She SR SA Sh RS ate SA A A A Se AR‏ ا ‎SA ER SSR a A‏ ل ‎a A A‏ 0 = شكل 1 قم ‎AVY‏
    وجا ميج رض ‎ANTE‏ يات اتج مجر اام ان ‎ND‏ و جل ‎NUT‏ جورت ال ‎BRANT NN rN RRR‏ اح جردي ‎SCTE‏ ار 2 ‎i‏ ‏ا ا ا ا ل ل الما لاريم اع برق فق امح ااا 8 ‎X‏ اج ‎wl‏ موده ‎Tali‏ ‏مي ‎a‏ عي اه ميلا وك ‎A‏ داه ‎A‏ اها جيه لام ااه ‎AAR + AR A An Ne in Ae‏ جا ليح ‎AE Ae‏ ايه فيه أيه ار عاك اه عي ‎ES SC AE‏ بيجا تايا ‎AY ite ATE A RT ES A A‏ £0 ثم ‎AR‏ اك ال مرح ‎OTR‏ الصاح اصح الج سا ال حو ار ام اك اج ‎I‏ اميد اع صرح ايج الاي المج د اج الاب الاح ا صا ال ا لمكت اراد ‎a RS SLT IR SS RA‏ ااا - امه نه الم ممعت ‎Sealed‏ ‏ل ‎iy A A RAAT RA NTR REE NA SN TI RR SAT TR RR AT RS RAT SRST ATT NS A A SS RAT ATR SA Si A A‏ ار اي الاح م حاو ل ا ا ادح ‎Ett‏ حك اح وات ماخر اج اي الي يج ال احج ‎WITT ROE‏ المح ماح ‎١ z ° MA NTL TOT SATII NTT A‏ £ ممت مسأمة لسلس مقي لملسمفقة مقدحق محم ‎GUTITASSPE‏ اعتمم كع ‎mae‏ حا عابني اا اتوي
    ةا الم تتا مستت 0 x hy PI pa AEN a ele ‏وام بيك‎ ER SAT ‏يلل‎ a a SA Se aa A ‏بيهام ما مجاه واد‎ Se ‏جام‎ San aes A A RX ‏ويه بحام ام ياه ام قبا لام‎ Ss as ‏ام‎ Xe ‏امهم‎ a ‏ادام احج الماح الما‎ PRET RR STAN VOTH NIE IR TOT SNORE ONTO BORO SEIN IR ‏لوجاك‎ Sn TERFTATTIY ‏اتا اقم وق‎ TIITRCRSTT TTRTOTYTTY AGTETEORTSY TeRrrdoyy
    اا الو اجر ا المت لك لدعا اتاج تار
    ل
    ¥ YY a RIN AL ‏تحت خا دا‎ i Sv Se I ‏كاج‎ el Am EEA ve i SA a a Na RR a ‏لجو اجن ا وعد‎ RAO RAISIN ORR ORION ATH BION RL ONIN RO ‏لمجم‎ SI ROTI TN ‏اود انك الما انما اراد مجان لخادلل‎ TANT ‏امالك كارن ناكرب ام الما الماك الما مالي راجا اعبات اضيا د لالض‎
    Walling 3 ‏ل ا‎ ey ar
    SENSE ‏تدس تمع‎ VS FY See ‏ل‎ Rae RF A Se ve a Fr aR ‏حي حا‎ See Rf Sn SE Se fe I Fe ASI ee eS ge See Ae * " ‏و اللي اح اج ال لاحت ال رم اا‎ A ‏امح حي‎ NE ‏سروت لاح د ل الموج جا‎ NIN ETI ‏الي اديت‎ TE ‏لوجم الا ا‎ AATTARTET ‏ا ال اا و الف حلا ميق الاي‎
    ‎ae wel‏ الا ا جا الل ا ا
    ‎wk‏ للع كم ‎SER‏ كا تاج الاين كما رز
    ‎SORA CO‏ الما م
    ‎an ot fA ‏ا‎ A A Ae Ae re OE Sn Ea Se Na NF YN Bh a A Se HE eR
    ‎Ba
    ‎x ¥ ‏د و‎ IONE EERO RD ENTER BITRE ‏لجح ا حت جو اد‎ CORE IIR ‏واج وري الح‎ TN ‏الت رواحت لاوجت‎ SY ‏ا ل الا ع ا ا الا ا ا ال تام عن 2 الف لمحت اح لالد فت الا تاراق ااا‎
    ‏للحي لايع ‎sas‏ اد اج لاتحي نالعال تاد تب ‎HENNE‏ ‎A A‏ ليع جيه ‎A AA AT A A SA‏ ونه كيار ‎SAN SS AS‏ بيه ‎NS‏ كا يحاي اما ديه ‎A‏ يه ا ‎Be‏ ليه ‎TASS‏ ويه ‎A EA‏ يتات ين ‎AA Say STN‏ ويح لاحو ل ص ‎A UR‏ المح حاتت اح دا ريع ‎NNER‏ ا ‎RASTER‏ ا الاج تكح ص حا لم المح اه عاج اا مح مج ا ‎AXRETTREADES ABTHOUOTIE ARMAAATTAR‏ مس لماوعو ‎ATATRAZATR SAATIHNIATR‏ 3 £ ا الي ‎BL‏ حر ل ‎AE IR‏ ‎Wa‏ اللو ات نح ‎SWNRSLE‏ ‏م الك نواه ‎ye‏ بوتا اجا مسي مايه ملم ماكو لا ‎vn‏ اجا ليح ديه به لي بيه وا بي يه عي لا مايا عا ناه مايا ولاب ‎MN‏ ايه نيل ‎en‏ ابي اليا بي ايا ياه له الا ايحا لا ااا يه امج جيه حت تم حي ‎TR BR‏ المحم وجي تاي اا عي ‎RITTER BT‏ الحم تح ‎mone‏ لمجي نصح ع د ‎NNT‏ خضي مع َ مسمس قد وماج واد ‎AGTRINRTALT‏ الت ارم المج ققد سعد لقمقهة ‎x‏ جا اب اعد ايحي عملت حمر جح ارح 20 اماد حت ‎Wi‏ لتم ا المتشياناه اد جه ايا ‎ae‏ اجا ‎aN‏ عد ااه ‎Sem‏ اااي يا ‎a ae Se Se‏ ليه اله ايا وا اجا جني يا يه اك ايا وا ايه ‎TR‏ با وا يا ءاي ‎RE‏ يه ‎ER Sa‏ بي ‎PB a a‏ الل ا ا ا ال ات رات يات اا ‎SS‏ ا ما سا ا ا ا ا ل د ار ا ‎NT RN ONT‏ ل امات اتا امتومانا ‏ ناكاتك كان لمارالا لان ماكر كران امات امل ‎a‏ ‏- ¥ الي يد ‎Fea lilnd ¥ woven‏ ‎SRWUTEL SL PIONS Wo‏ ‎Ae A‏ ا ‎Sir eRe NN A RL YA Rr A vi AI Sr‏ ام ‎Re‏ ا ‎Ne‏ ا ‎NE a rN IN Sr Sr ENS‏
    ‎Coma
    ‎< ) AAA AA mts Sea SA An ‏ابردم رم‎ A ‏تاي‎ ARIAS ‏احاح حي‎ CANTEEN NANA ‏دعي بعر‎
    ‏يميت اي الو ويوون ومع روي التو ون بويد مس مجر ‎EY‏
    ‏الها الحو واج جرجع لاوا ا ‎LS‏ عي انا لمحب تيتا دمج ‎SRUTNL DL‏ ‎Nn‏ ا ا ا ا لح ا م ا ا رت ا ا ‎Re a ES Se‏ ا ‎TS‏ حم بعر هي ايحي م حير كر جر اع اراي انم ‎IAS SAAT AE‏ ل د حص وت لحي لاسرا تي تر كر ب لمحي حل يايد لتر ين 9 ود مد ددن امد اد الك السلا الم شم ان اا لجرا ا الي الأ الا ارا فخ ‎OE IEE Ee a‏ ‎SENSEI SL EDONMSTeY Vi‏
    ‎PE AN Be NN RD ‏يه دي‎ NS SEN SN ‏ا ايا وه اتيك الاين‎ TR SH SR Si YE SRSA Se A SR TY Se Se SR SA ‏ا‎
    ‎TVX ‎EN ACN Te NSN TRAIN ANN ‏يح اي‎ RY ‏قات ل‎ SN TL UE Sy AE NN ‏اكيت الم‎ ROTTED ‏سس ل انتم يات سهدت مالسا سي‎
    ‎An nT‏ ار عام جام وا ا اع ‎wl‏ ا ل
    ‏ا ا ال اتاج ل ا تح ‎Re aH‏ ا اد ا ا ‎Fen‏ د ا ا 0
    ‎* 3
    ‎ori Ae‏ ل ل ل ا ‎ee‏ ل ‎ERE REE SCA‏ الا اه لمحا ا ‎AR‏ العا اانا ‎FE EE I‏
    ‎Beal nh wean ‏مراع ايم ا‎ an gat ‏ااا عتمتا‎ VL ‏ا ا ا ا ا ا ل‎ NA ‏ا ا‎ Re re NH ‏م ا‎ A ‏تمه‎ 3 T ‏احجيية‎ myd SIENA ‏لد‎ VL FT VIF ‏ا‎ ‎PAE ARTI, NONE IN ONTO ‏اي ار وى‎ RATS ‏الم م لمن يع الحا الب ايد الج الات‎ AN EN ‏لمي‎ RT ‏أ‎ “TY TETRIS ‏ممح ب مت الا امو ال لضن لاديس بات ايان يعي لي اساي الاو الي‎ Sail ll fumes wd ATA AT SAA ‏ل د اله ل ال‎ RN AS AS SAT Sa ‏لاحو‎ SCN NE CA SWELL PAWEL WE AA SN ‏اا لحا‎ A Nn NN ‏با‎ TN ‏جره ا‎ Se TR ‏عا لياه‎ NSA ‏اد ايم اا اه‎ A SA TN SAAS ‏ع جا عي‎ Sa ‏و‎ a ‏ءاج‎ ‏ا‎ Isader vl SRURLL LBadal Vi Sr NN NN IR Si Se a A ve ‏ولا‎ RS Se ¥ v 3 { ‏شك‎
    ‎SA AT ATA En gt RE‏ ل ل ل ل احا ‎ONY‏ متت واي لام ‎UALS WINERIES Wr ONEONTA‏ المح ل أ انا ماي مك 3 الك الات لمات رات ل 5 معدي ‎we‏ لمجلا رمع لالتلا ‎ee‏ ع ا ‎Fn‏ با فاه ‎en Re‏ مي باه ‎Na Sr‏ ا لما ‎PE‏ ا ‎ae a‏ وا اه عي ا مي ماه جا روا لا ا با ماي أ ايا واه ا ليا به قي يا ا وا بالا ااا ييا دا ااا نيلا لا نا بابر أي ل و سام ‎A a‏ عا ‎SARA L INT VW‏ ‎a STARS Ne Van NERY‏ لحا ‎ONY, MRT SANIT ONE rN‏ يوا ايت لبي ا اع رد ا جيني أ ري رح ‎TAYE SN‏ الال اي ل م احا امات ع ا ف مد اا ا عاش م ‎ER UE RRS IE‏ الاح ل وار ال لاح ا ا أ ‎A‏ £4 ‎Ty .‏ ‎NE‏ الماع لات ‎STIG TE geen‏ ‎JE RR IE EE XR A RS‏ ‎Pa‏ جا بو اا وكا بجا مر با ‎in ef Sa AT‏ ماد ‎ae Yin Yi‏ زه اه ‎Yin Yn a a en Sa‏ ب ‎SRS‏ لييح و ‎Tne‏ بي ‎A‏ ره ‎a Ne‏ 8 اضاعه ‎ER RE Ca‏ زا متت اكت امتاخ ‎Ne Nr nN Re ir Hi ene Pe‏ ل ا ا ا ل ا ا ل ات اح ل لضو ميحد حضو المع ‎SIA‏ ري ‎NS‏ د ‎RRR AA‏ لمحو جد ميا ‎TNL AAT ANA‏ درو ايداع ‎A‏ و جه دي 4 الا ‎SH‏ له اتا الماك ‎RIA SCR EW RF.‏ تارك اماما الل لاله الما اذا اود ال ااال الك ‎A I‏ الح ل ‎FAL‏ ل لي لك م اللا ري يه ‎wl‏ الس لشي عامتسا ا ‎nme a ER ma Ne 7 Ne re fe Re‏ ل« بلي ‎WATE TY INA ge‏ ‎SRNL INTE ve‏ مله قي زاك فيا يواه مهاد واه لا مي تور تعد مزه لماعي ب عي لاك عي ياه قا_ بوه فل فاه دبا هه بحا ع نيام عي يام قي يخا مي رالا ما للا مزكاميات وه لبه ‎Ne Fr‏ عه بايا ‎NE nN He NE‏ تبحا لماه بح ‎SS‏ يه ‎aT‏ جين دي مهدي ‎CR TRIN AND. ERIN RIOT‏ يي ورب ‎SS‏ ا ‎IIT‏ رام اج ‎OATS RN‏ ¥ > اما ‎Te A A ESE RCE ERR‏ مضا اماما ‎Al id‏ = ‎TRUELY Wa‏ جاه ‎AA A A ARIA Se et A Te he A eS‏ يلاج نيك بيع ‎A Se‏ بيهر ول لجيه ايها ل ‎A Sethe SS Ae ee A a She‏ لا ‎en‏ ‏ا راع اجاح له + انددع تان لمشت كيج ‎SWELL‏ ‏الاي وري وا ‎rin A‏ أ ف ‎a‏ ناه ‎Nr NP Ke‏ اها وا بام كايا ما به يا ‎Nr Sr‏ اجا ب اج يا ‎SN Yn vi <r Nin AX‏ الاي كي انيح لت با لا الج يحاي له يات ااه ‎ST‏ دجت دحوت المع نوجي حت د رمع اح المج مدي ‎TN I‏ اضر ‎RATTLER SNS NY‏ اله موا لي مد ‎CON‏ ‏ارالك دالت ‎EO RC ARR A‏ للدي عه ‎FE SR‏ مان لانت كرات ‎BR A a‏ لما ارج % ‎ok ht‏ ‎ae end‏ ان حاف لبي نيام ‎Saati TT‏ ‎Wa‏ الم اام تا ‎SRL,‏ ‎ARS Sv a‏ ل ا ل لح ل ا ا لتحت ل د اح د د ‎Ne A SN‏ ل ا ‎wl‏ المصض عض العصيا ‏ ‎x a A me Ru en Ne Se Se Sie oS ars Se wh ela wn er Sma ne a i Se ee SA Sn na Au re Se‏ 51 1 5 ان ار جر ‎SNe Sten‏ رواج ‎SION‏ حو تدر ‎TRIOS‏ ايد ‎ANC RENIN ND, re IONE COTTE MeN‏ 3 ‎ROA YER‏ الاج املد ‎Slap TNE TUE TERE SE‏ الا مالك باه اماد
    ‎CR.)‏ ا ل ‎LL‏ ‏راي اهار امد عا الم ‎WEAR A‏ وار ‎a BR‏ يع يك و جر يدها وا وله ‎SAS RS‏ اج جيك وتاج ماد ‎A‏ ريا ياه ‎JRA‏ ري ل جلا يك يه الاير اك ايحي يا لاه جر ونه ‎A SR‏ ينايك تجا ‎eT‏ وريه اوت لا ويه ‎ee‏ الاي ‎aE TV andr‏ ‎EGE LL Intra WE‏ ‎HA SA RS Me NS Ten NS Sn‏ ل ‎NS NS SR‏ ل ‎Te SRA TN SRL Se‏ ل ل ‎NY Me AR INA HE EAA AEA A SN VA Se RSS‏ داع ‎i‏ مع رع عن دم دع ‎ERTS AA‏ عر رقع اه م ‎AST TAMIA SATII SEEN STI AT‏ ليمت جاع لعي ‎MAY‏ 0 وجو معر حتت عر جومعيعه ‎SY AY‏ جات يا راجا اناتسا اه ما ‎Ae a‏ لاض رااان العاب يا امام اام سام اه انا ‎ANy‏ انه جام اتاد اليا تاها لماي قي شرع لتحا مدا اجرج ا ‎WAITS‏ ‎Va‏ ارح ست د ‎SMTA‏ ‏خاي حك اج أي كا جد يا ‎AR‏ با ايها متايه ‎Re‏ ار ‎Se AM Fr TE‏ تالا يا مله لايك ‎Ten ER‏ اده جاه واج ولا حجري اميه ايه ‎A‏ دايا اندها ‎SRS‏ وتاي ‎Ti ie‏ تاي ‎Elina intron‏ ‎Fe A SA Ne A Tt A I Sa Te A SS AT eT Sn BN Te‏ ات ا حا ‎A ET Tia SE IN A Se‏ ا ‎te A HI Sheesh‏ اماو و رين ‎A TOR EE EE SY‏ ال ل رد ‎RS Sh‏ د لا ا . ل ل ل ل ال ا ارا لكا ا كرض بترا الاو ا العامة اللاو اح بيه مسي يمس الاي ‎EY‏ 2% ل لد هت ا الما أ و امسج ‎SRUWSLL‏ ‎Ne A XE SA re nr‏ تخ ‎ea A i Ne rN Se 8 re an fre‏ ص ‎THIEN YT Fmt ar‏ ‎Amtren Wd‏ الم ‎IIMUDL‏ ‎A SA A A AA RA A Se AR SA SA SA Ai A A RS Se RS AS A A PR AR TR te A Sh A a A Re A A 2 A‏ . لا )2% ‎DREADGEEARA‏ اج اعامتسا ااانا لاا با لمعا ان تباي الام تتا مااي اتحيى الجا طاحم تح اه تتم ا ل ‎NT Ne‏ اد ا ل ‎Ne‏ لح ل ل ل ا ا ‎I Ne Nn‏ ا ‎NN nN Ne nS‏ ل ‎ard‏ ل ا ا لاا سا جا ‎wd‏ ماكو ‎SMILE‏ ‏أ ‎Ne‏ أي اا الاير اراي ‎NN‏ هام ‎Re a ea NN‏ ااه يا ‎Nr‏ رايا لا خاي يا ‎ie Te FE‏ اليه ‎FE a NN‏ نجنا لام بحا ل مهال اهيا اج لو ‎Be eT A‏ د ‎TON ER RT NOTTS ET‏ اجو أي ‎DNR MOTI IT‏ المع موحي وما ‎ST‏ جروا تو ‎SET k1 SUAS‏ ‎Ry URE ES LE EES‏ لت سس حك لتر ‎RR‏ ا ‎bal‏ ‎ae)‏ لايع الام ا واه ‎AAR ST‏ ‎Yd‏ الدبف لمكت جح الخد اتيم ل ‎a‏ ل ل ا ا ا ا ا ‎in NR Nn TN NR‏ ل ‎wp‏ دده ‎Sead‏ 0ه ‎WAIN‏ ‎Smii Loastron wil‏ ‎NN Nob Sn A Nef ae NBA rh he Pa Fin Nn KES NT NT Re 7 YA Ee Pe Nr A Sa hee SE NY A‏ شكل قم ‎YY‏
    ‎NONE TRON TR AY‏ بحو نج ادير ‎TY‏ حجنو وام ‎TSI‏ م مح ‎CO‏ ماضن مرج ‎NOONE‏ امو ماحد دده دجت ع قلخ لدبتت دا تاه لفان جاردا إتجادا. راجا يجا ا لانتل رجا راجا المحاج دنا باسا باخ لجا دالج د الخ خلج الح يم ا إن ‎ye‏ ا ل ا ‎wi‏ الح وت راح ‎SMAI‏ ‎YE Se A‏ بر وي لا ‎AA‏ يا ا ‎A‏ ول ا أل ‎SRA‏ ري ايا يا ‎AE Ae A‏ لاي اب وله ‎SAT‏ انير ولاب راي أ ايا نر ‎A Tra‏ ول ابكرم يك اه ‎NAA‏ بالج ون ‎Aa‏ لكيه ليع ‎REE OE‏ ‎SMTDI Lanne wa‏ مر ‎Ni Rh ia Ne ae ne EN Re a NR‏ مه ل ‎Re Se‏ و ‎ne he Ne‏ بيه يي ‎NA Ne Ta‏ اماي ‎NA‏ را را مكايا ‎a‏ ‎ACTED A TE‏ لض لاد جع لجو ‎UATE TTR‏ الام جره لمجي اد عو ارج ار يا يي ا ال لع ا ا برا لكر ماد داحك متا 1د امد ها ‎Se lHTa BT‏ ماكر تحكها المكاماتت لزانت ‎AST‏ اانا متت الام ‎oa AS‏ الل الجاع الام حوات ع ‎١ EEE‏ ب ‎promotes‏ تتاتاة ‎A Sh A‏ اااي ‎A SA A‏ نيعا ا لاج ايه ‎AR LS‏ حاار ‎YA SR MR SA‏ را ‎A VR BR‏ بلاج ارا لازي لجار لمعا ريح ‎AS SA‏ رك ‎NA A‏ ‎CH)‏ اب لم 5 4 ‎EE CE‏ ‎EREGERE ERS: RARE EY‏ ا حت ا ‎ve NA Se Ye a a‏ حت ‎TN NL Sr SST aT A NR Xe SY‏ خا حت د ‎NIA SE‏ ابد ممم ات ا عات مي ‎TAIN‏ عا ا ‎IR AT ACTA IT‏ الات جاع ‎EY BN, CHE‏ حي و منج مت وات خا ‎ATUTARGRTA‏ لسارم تنقيا ‎OUIACHEAGTY TRASATOEEAT‏ اتنا الك متتس سات ااا ‎RE SES‏ و مضا ‎we‏ ا لد د ‎Se fa‏ حم حت سا حا ا د تح د ا دح ‎Ne‏ حا ‎Na‏ اح ا ا ‎awl‏ المج اي جا ا الا اج و حا ‎WL‏ لتر ‎SMEAR L‏ وا با ‎AE Gs Pn a‏ مله جه وا باه اك اه ‎sn a Se‏ اوكا اا ‎Se‏ وار ‎Ee ae Ni‏ واوا لا لا ‎rE SE A Fe ne, Si ie‏ ايه اي وكا ‎Nt \ SRCUSR AANA CY ARNT) MANN DR STINTS RT TIT IT TA TIE ME AY ET SIN TI IITA AT SN RT TN‏ ‎GUATNIACRT GATERIATART GUARIRTITR‏ الس ا اا جسني لبج لقالا سات عات الا ‎hl‏ ب ‎WEN‏ ‎Zoe Seed‏ ب ‎NS‏ لالحا اا ‎wi‏ لخدم م العام ميا ياه ‎TE AS TR TER‏ با ااه ادا يا ابيا لا يا نيعا احا ‎RS RE RAR‏ ايب لج ايحا باج ايه ا جه ايده اير يله يا اع ‎AN‏ ياي ‎SR‏ مايا يتاي دي ‎ard‏ اموا د ا 3 ‎WAIVING‏ ‎SMIFRALL Ameen vd‏ ‎Ne AS BT AN I SR Nr AN Ee SER ee RS I i IR a NS RS Re EA Se es a‏ ‎TOT MR ATTY‏ جنوي ودج لجاب اج ‎TREN SMTA ROWENTA, CNA SUNT A NR OR AINA RN‏ ادس جو يتا ‎ATL ASA Ad‏ ال ادك الوا اوقا لجا اناك انا اراد ‎ASIANS AGC‏ ا ارا الراك مالا ما 3 34 ب > لعي مواد الاج احيحاا ايا ادح اج ا ا ‎A Se‏ ل ‎AIA ST SR Se A A‏ ل ‎A SEE‏ ا ا ‎SA SA‏ ل د حا ا ‎A AN‏ ل ار ‎IEFhAL anbrun‏ ا ‎nA eS AS SR Ta re a NS 7A Se Pe TN NS‏ 5 - ‎ESR STERN‏ دا الما كايا تا لاا ايداكا الخلا لجاجة االماحة ااكمة ‎WRN‏ مدت الاك اليف ال اانا لاسا ل ام ال الور لبج ا ا ا ام ال اجاج ‎EH‏ ‎WL‏ ادا كت داح ‎LENA‏ ‏ا ‎Ba a‏ ا ا د ا ‎BE‏ د ‎a‏ اح ا ل ا ‎IR ee A A i‏ ل ا الاي ‎EET‏ ‏ير ليسمتتردد| لما ا ‎TR ae Re Sa Ko Re TT‏ ل ا د م ل ‎NI‏ اك ‎IRANI ATE‏ اجر يد لحري ‎ON‏ ان وجي اتوي يي لضم ‎Se‏ اداه ا ‎VAM NTN‏ ل ‎AY‏ ‏ا ل ل ل ال ا ال لا ال ‎ATRCSITATY‏ اناتسا ااا اينات المي ليح ل ويم ‎ae I SIR‏ ‎We‏ امسا متدرا ‎SEARS‏ ‏والاا ‎Se‏ كاير ‎NS‏ لواب احا لوا رايا ‎NA NN‏ اي ‎SVP‏ للك اجات ‎Wad‏ وج مالدنتيكد لمر كدر ‎A‏ يناي ياه لحي ار ‎Ba Se eA A‏ الاي جلي ‎Ca RENTON CN RR CN‏ لماجا مساج مسج ‎EON TE RTE SIE ROR RCD‏ ار ها . اران ان ان لاا لاي اللاي ‎GUTREIIGRE‏ الت اسايق ‎TERETE‏ ابتار ااانا ‎EES‏ ‎ered‏ ليسا مجع لد ادك اح ايحا عي اباد يه يام اا أل مي بات ‎A PR‏ يها هاه ليا ‎er‏ عي :نوه لا مه أب ‎rr Se‏ با وما وا محا ا ليه ااا + يا اوه أي جام يح لاله اي را اليا م اااي له لم جم د لجال و ‎NY SDE AARNE SRDS OR‏ دي جو وا ‎RUT‏ يي بياج ني الجا يد دج اجون ‎RN‏ ‎SALON, TALLINN UAR‏ العا رخ ‎a Ie BS‏ راك لحتنا ‎Bs x AEE Ra GY‏ ‎Aaah ee‏ مستي ‎WEE In‏ 3 ‎a RE a A‏ ا ‎SR Sn Se SR a‏ ا ‎SN TA RT SR Se‏ د ‎A a NT NT NS‏ اح ‎w N SAN NT SN‏ ‎RTECS COSINE CEA RETR‏ اد لامك ‎SiS UITAERGIY‏ ال ا ل ‎SWE {ae Shon‏ ‎[RACECIINE Pr CORR Rare‏ وا ‎ae‏ مل ره ‎he‏ لوكا ‎i,‏ + باد وا ايحا هك جيك ما ‎he, HA‏ وه واه ‎CE RN Ye ne NS as‏ ور ره ‎Se a FE Pe ee‏ هيه لحري انم امت ان ديم ‎el Pa‏ جد الو الي اد امج الما لاد ات ‎re ra‏ الوا للحي ا ‎ERR!‏ ‏ااال ترا الجا رتت ال مااي لاطا كال ناا ال امات اليه ماما ليما مكب جاه انه اله كان تالت ناا اتا ‎AALS‏ ل ال ‎RIE‏ ‎RNR‏ لج ‎SARE‏ ‎A SSR AN RIN SN Se ThA Sy‏ د د ‎NA A TA NR RR INNS Th RA Sh AIR Sh AR IAN Sn Fo AS SRE SAR‏ ‎SVR RETIN ee‏ لوي ارتعيي جتحا حت ‎NEY A AT SSN‏ يي تي ‎CNN XL SUNS RIT RT‏ لمجي و ‎x RT‏ ب باللا ‎١ A BE Et ER I EE EE‏ \ ‎FO +‏ ‎ans I‏ ‎RE IR Sa‏ ‎NN‏ ل ,2 وب شكل قم ‎TYY‏ ‎SES‏ 0
    اجا مي اللي م الما بتري ‎MURR MTN MUA‏ الولف تحت ال ادج يلجي ‎DIT ASK‏ التو رج ‎SIE‏ > اما اذا ملام ال اياك ارات ااانا لكك لامالا لمانا ‎EE Tl I A‏ ار الود مارت كا اذاه لدان مانالا : 3 ‎i‏ ‏الم وم الما الا لا ‎ANE‏ لخد ا ‎RA‏ ا ل ‎AR FL‏ سن ‎Se a‏ اس اح ا ا حا ا ا ا ا ل ل ل ‎Sn va a‏ ا ل ل ل ا د ‎ST‏ لاج لمجا ب اج ا ال لير الاح ا لا د ‎en‏ لسارت الا لا الا ار ل ا او حا سا ‎RCRA‏ الاق لدنم رقا ‎GENES GUARANTEE OCR CRTRADNT‏ اليا ا 1 ‎RAEN‏ ‎Ne ra mr A a a es a Sa nr en ee ae A ZH a ev AR ve 2 Ae ae ra Re ne oe 0 Ne A ee‏ ‎Se: Sf a‏ الات جيه ‎Si SAA A fA‏ ‎pn‏ ‎XY RE BT CA EEE SI EBT BT A | (A Tf AT‏ ‎ITAL MRA lnm Sami‏ ماتنتماد لم ال اا ‎TTT‏ الكت مادام انك يلاتان الالماضك انك اتا ‎Np‏ ‏لم اااي ‎men‏ ‎Sree RIL veh‏ ‎MENSAANL WR‏ ا ‎a mh Sa ae i‏ ا ‎No Na Nn SN Nh Ar FF a SNR A fn Nn Re SN Ke Sr Xe A‏ ‎BARLEY Se NE‏ م يا د حك ا ‎RT OR‏ اي لج ل الي ا ‎TD‏ تاي ‎AOR‏ ا ولا ادا اندي لالس لتنا انلق لاما ارقت ‎TUGACHITRA‏ لاما لاا ا ‎hy‏ 4[ مه انتج اليك ‎WR‏ المت ا لالد لا ايا ‎RS‏ لوالاب هام ما ادام رجاه ‎a Ae‏ وا بجا وا بها وام بي تاه ‎i Si‏ مالاب تو م لام مي ‎A‏ ارح ااه وا اا ‎SE‏ توا اي ‎a‏ مااي وا لتحا ا ولج تيا ب لجيه لجخي ا م ال ‎DY‏ لج دا التو ‎SIE‏ اي ‎AAS‏ لاو عي لجرت عع جع دوع د كاج المت دا ا مم ري ري لات ‎DIA TERACAR‏ سات بار الات اي ا الا ري الأ اناا ااا 4 ‎a Fa A‏ ال ال ا ‎Swe‏ و ‎VE‏ ا ل ا ا ا بح زياج ارلا اط ريم حي ‎a‏ محا ااي 5 ‎Re‏ مي جا ألا ‎FN‏ مح يا مي ‎a‏ ب اتيك ‎en‏ ب لاا برطي ‎a Nw‏ الحا ‎Nur in‏ لطا ان ةرجا نابا نحا ‎TEE A EN AE RTE ENE To UH RSE RR rh, SE RE Sh IE‏ ‎a A TER SEE CSTE TI EAE, SRR EARP‏ لمكن اشام نغ انيدان الكت لط ‎wl‏ تنعت تي مث ‎We‏ اتنا الإ لعن خا اجام مي جا ا ها وا اه ا با اماه ور قي ‎A AE A‏ وام ا وأ بي اول مااي ره با لح ا وكا متا واي مكاي جيه ل ‎Ae a FS‏ اح لحا ‎An‏ را لت لات الات يي ليه ل جر رج لح لا ‎EVENT RNIN‏ ال خلس« ‎Sel Walia UA‏ لط ‎Wada‏ تداتعا مارجا ‎ah 3 FATAL EASY MARU ag LRALTIERISAl‏ ‎Aen HEARTY eri‏ ‎SRD PRS REC KE‏ ‎fa‏ مي ا عه ‎AR‏ مااي ‎fa‏ مايا مي اكه ‎Ne‏ مي بيج جاه بجا ‎SN‏ اجام ب وا اي ا اا عا ليه مااي 7 لد ا ‎RE‏ مي جا ‎FE Nr SR Re‏ ب ‎A Nr a‏ لكام تالايخ ا ما ل الاي الاج ال اي اليا حر ال ا را ااي أ ‎I‏ ا وا اح ‎Ee‏ ا ا الع الل ا ا ا ا الس امد تمدق اد ميقت امن 7 تق اللا اتيم السام ااا 159“ ‎RINT ell‏ تحن اح مد تك اللمتص تا الإ لدب ليا خا د حت نيد ماح ند اد لتحت حافت ان ‎NEE eS NS‏ دح ‎NVA‏ اد ‎NN CMR aN‏ ‎ea‏ حي حك بوي الا واي ادي اجيج اج الاب ا ‎A AI‏ الاج ‎aE ALTA‏ لحن جع تح لوا ا ل اح الت ا ‎ORG‏ احادة لنتجم تجا انا معنا امريد اجاراجا متو اجاج اللمجرية لمعا ا تج ارده لحار شرا 203 ال تي ‎RA Saver BEART‏ ‎LXE IAS.
    Va‏ باب ‎Be Re a Re‏ اح ا جه ‎Se Re Re re A ne me dn a‏ ا ‎a ly ie va meh TL Se an ha Se nl TR‏ ينه بها ‎a‏ رتح ‎rn‏ ‎ene eg‏ لوي المت يات متا ‎ee SE OR INE,‏ اح ا حي ‎ET‏ اجاج حي ‎TV AY AT NT‏ ‎TI RE I ES SE RE‏ ايان تا ‎RAN cath‏ حي ا ‎WaEEAASL Wa‏ ‎INES SE NS A A Sa NS Se‏ ا ‎SA SR RM A Ya Ne Be‏ ل ا ا ا ‎FI INNA‏ ‎RTT SE NATE Ny a Se oY‏ الاج اين الواح لاوا ‎SOR EY‏ جع ‎ANAS IN‏ راي جرت جا نحن جر حي ا ‎“AS‏ ‎DARKEARITAD‏ اكه حمر ل كم اماد اد لادان ‎ONCE REAS‏ الا اه لاي ري ارد تكب تدا اما ‎TALLY‏ ‏ل ‎WTA‏ ا يا ‎VR‏ اماما ا لام ‎a Tra‏ لاا ا ‎ae‏ ااام يا ا ملكا يله او يكاج يح لخدا نر جيه ‎A‏ يار نا ‎A SA‏ وااو لا ‎Ta Te a INS SN NEY‏ أي جما نه نا تداج ييه ححا ان جح امع ون حو ‎rn TR‏ صا اه الا اكات اي اد الا عضا د د اج ‎CRONE SIT ONIN EN‏ لمجا مد ‎QUSUEMREIT‏ مقي ‎A.) CEREBALTEOT OOUDRSIGEE DRANRTUGAD‏ % ‎A AN att‏ : كي ‎TRIAL‏ ‏را لو ايه اللا نوا الجا را ‎NS‏ ريا لد ميا ‎NN NSN Va‏ ويا اوم ري ‎NR‏ راح تياولا ريك يلا ‎NN VN I NL NE SN RRS NN RR A‏ . ‎THA‏ ‏مفو امد ا اام ب التق انق السام ا قسن نقتت نابت كرد ااانا لاا ااانا ‎a TE A =‏ ‎wh‏ امتح ‎Sec AE‏ ‎VR‏ لالش ال ا ‎Se‏ د ‎ha Aa‏ لاا كد اا سيت ا ‎a‏ تست نه ‎a eS‏ ا ا . 1 1 : اا ‎Je‏ حا ‎NN See 6h et‏ الات يات ‎TI NE NN SNL i‏ ا ‎NEE NE AT‏ ‎GNIAR‏ جد لاي ‎AGLI‏ تدا الابما تسق ‎ROTHER TLLTY CAANASETAD‏ الاج الت ‎Yeh‏ ‎wl‏ ا ل ا م ند ا ند عي يد حا لا ‎SR Yn‏ نت لا ان حا ا ا ‎NY‏ كد د ا ايت احا تي ل ل ل ا ‎VY AS‏ جب ديا لوم جو انحل الي لجسي ‎TTI RNA‏ مواد حي اتوي تداج تاي ‎A NRT‏ ا م 0 ‎GUTHRIE BERGAJETD TRIARIUCATE ACTEREAIAT CERSATIERTY‏ مسلاا ‎A]‏ ا ‎Tey ikali wd‏ ‎Ti A AS Sa Ae‏ ا ‎A TAT Ti Ta AN SL ALORA Sh A‏ ل ‎NEA AAT AT STA Ta RE FRAN SA A‏ ‎RETA NT RIND TS RA Be NITY SVR WT EL oT It eT hae eta‏ نمضي لماجا لمث دار ارماك ادا الام ام عا اماما انا الات امت تام ات ا ‎CAERADALCE‏ 7% ؟ ‎KEN‏ ‎YY RR I. ade a‏ ‎WR‏ اتاد عد اد د ا ‎Tr‏ ما عا اي ميد الي ا ا اي ايد ا ا ما ‎Nm‏ حا كيد كاد ال ا د د ان ا ا ل ‎a &‏
    الجر الت قالطال و ‎SVS A SONNEI en ar nny Gn VSN on ST CN SRNR, SE IN TR‏ لان لوي ‎SVR‏ اسارج ميدن & الوا ‎AF DE BREE NE BEE LE SHEEN S055 CANE POS MOET TIE SEHD SE SC ES DRE SF LOREM FST FDU‏ اع جار لناب شا كوا ا تا اا ‎yy Xx » ١‏ ‎Cre YRERAT wh‏ ‎SEPIA WR‏ ‎SS SR A A SN Ne SR RE Se TA a IN SE Se Ae Te Sa a Se ei Se Ae‏ ا ‎Ch Be‏ الا لا ‎TY SIN Sa dy TRA‏ لحي ل ‎STR EA NEY AT NOT ND ee‏ متكت ال نيتيلاتتم الك أرق ‎NRARSCUIARE MUOATGERES‏ اال تارتم مسترت لشن ان ‎LA Bel‏ ‎aE‏ اتاج ‎Fram‏ ‎GEYER OWE‏ ‎A At A Sa Te AT A A AR TA SA AA A Sa Se A eA A Re SA Sa A Sev Se a A‏ يعاو ‎Ae A A As ARAL Ye A‏ درا ل ا بي ادم ‎SN NI a‏ ادام ريق ‎STR AMINE HEN‏ الل ‎TON NEN SME PMT SST SNE NENA SATS‏ ‎CROIPIOITE‏ ال ال ارا ‎TOURER‏ امف الت مقي لمي الالالال ‎[ho AY‏ ‎i 0 oer OE TAY eal‏ ‎EO ERLL WR‏ ‎A A Se AR TA SA Re Se St RS Tr A Se A‏ د ‎SR Sa RE NN AI RN Set AR‏ ل ‎NA TNA TT‏ ‎RS‏ أي ا ‎SO‏ لاحن ‎MITER TIN ERS‏ لم اجو دجي حي ‎CURIE SN UTR OVE BTS OVER STRICT‏ لكر امد اناا لتقا لاق ‎CROATIAN‏ الالال رمات ااا اليا اق الات د لتقا ال الفط ‎VA‏ ‏ل ارد د ‎AT‏ لكاي لا يدت ‎FeAl‏ لدان لا مان د ا تدان ميد ا د ا ا ا د ‎IN‏ اد د ا ل ‎SR‏ ل ا ل اا ل ‎EI A‏ سا لت ل ا ا التي ‎BIN IN‏ جع ل اله اتام ‎TUTTE ART AGT‏ لاج تاي لت بات ااا “لاس لمكم بات وات الج ترج اا م ااي لجا متا ا لي لين السام ‎Sami WTT ORY‏ ‎RAR oR Sa JAGR I Wa Wa‏ ااا جيم ‎an A Ara‏ يه ايم ‎AN en At Be‏ يا ‎TAA Re‏ ايم المي ‎AR‏ جما لاي ريا ‎AAR‏ با ‎iy Rs‏ 2 ‎A ROE TRY ER TL Th‏ الوح ‎A See ONO TOT,‏ مي تراك وسو ‎KTR RANT ILL‏ لمجت ‎ERR TE‏ ? ‎TTHRATRIRTS‏ امساح لماي ‎TTOTHRGEATIT:‏ ارا تان ان انط عا راض ‎Veh TIRRTUAGDT‏ ‎aed‏ المحم الا لاحي ماخ ‎WE‏ ‎VIR vs‏ اك اتوك اح اح اد الم ا لحا مد م ا ‎i‏ يد ا م ل سر مد ‎TN nN a‏ اح دي اسه ل ا ل ل ا ‎SNE‏ لا ا ‎TANS‏ ار وج ‎AN BEN Te‏ اي ‎SVAN AMINE SVE ST‏ ني ري رن ‎aM WAAR NR NCS‏ ‎aWTRTGEICE TUARMFTIET‏ لمان قفا الست نقتا ‎APRCATACAT‏ افق قغة ‎Yai‏ ‏دود ‎YT IEE‏ الج نا اير ‎WAR‏ ا ا ا اس ‎nN‏ ل ل ‎iar rT Fy SNE TTR CVE rn IE NILE NY I EARN BB RnR Se To Rene ne‏ ‎NEY STETTATETE TRETIAOTRE TTATOTEARY AASAGAGAR:E GREATUADID ST&TINITTE‏ ‎ae‏ الحم ‎WEE ATT TY‏ ‎SEFInII OB Wee Ye‏ ‎Tea Re Se Ta NN NS‏ ا ‎A‏ ال ‎Pa AS a NR hr A A eA Ne SA‏ ا ‎rons RAR‏ خا لا ا التق ا اا ا لزني اي اانا الا الال ‎FOIDARATESE‏ ‏ااي السمجواة الوا ال ‎ne‏ ‏دي ‎EY DIR‏ تتمتقدة مه ابد عي را ‎Se‏ باه ‎SRT Arne he ae a Se‏ ع ‎NA‏ جاع عا ايا هاا جا بر جا اداع بيه يه ‎ee‏ م لاع نيا ‎ta Ri‏ تا ليا متايه لاي ‎$a‏ لكاي له انيه يديه :1 ل ‎¥VEY‏ ‏المحم المع دج المج داتع ما ‎CREQTOORTA TROATATES: TATTIARTOAY‏ ام ‎i‏ لدان لواب لماي ماك ‎WARN‏ 3 كن ا ‎ie A‏ حا ‎eS‏ رايا لح ايا يا وا ازا ولحاي ‎NER‏ مايه خاي ‎NN AR‏ رايا ‎Fey‏ ‎y Ar SURRY UNA STOTT TRON CRITI RT TNR ROTOR IR aOR ANT TR SR Bre‏ تخي ‎SE SEAN RE OSE REE.
    CRRA WEE RA‏ لماداد مرج تل اماك داه الأمالمر ‎I EE‏ لابب ب" ‎ia‏ ‎nti‏ ع جا الات ول ا الح ا يج حو اتروع عمج ‎ta‏ اع اموت حم 2 لمان لمم تجا ااال تيا الما ‎DUTTRARRGY‏ اق لت الاتكتطام ‎AEEIPACENT ATSECRSTRED‏ احم 4 تيا ديدي ‎TURIN A FUR TRATES Re‏ جايح ‎a‏ اساي لعي موا وحمي اوح لد يو ‎ETI RVR NR‏ مدت ملا م يو رود ‎THOSSCOGUT TAMITARATT TSAATGITIO‏ عيضم «مسوموود ١لا‏ كوي رحد ‎ea‏ ححا حي يحم ا المي نيمدح لمتتايت ‎A‏ ل ‎Se A INS‏ ا حت اا اه ا تا ا د ا اح ا ديدي ‎NR‏ اع امن ال ا اتات لجيه وي لانم ا ال رت ار اما ا ‎STERIC‏ لاحن اي اا ار الت الجا ا ل خخ قاب ‎A EE ER‏ لامتكا توا ‎A‏ مضا افكت ‎Sean vet‏ دجم مرح ‎Weta Tw‏ اشاح تدس ست د متهت ‎NN ee‏ اح ا اي اح د ا لي ‎Ne‏ لاا ان ‎RR‏ ل د د ‎Ne‏ ال لح ‎ANN NV RN‏ ‎SR UOTE YY MR ay‏ هوحن لضت رص لوج جود ماي ‎SITAR GL BAD STAM A CNSR ENN‏ ل ‎STON TNO‏ = 8 الجخ مضاعوواج امس مضا ساسا_ لالجب "تتم ممما فعحقع متماتدى مج ااي لما 0 ‎AE‏ ‎nt‏ ل ا الت الم ال ل ل ل ‎STR L‏ اد د لح ا لح حا تت ل اد د ل ادن لحن حت ‎Re‏ د لس ل لد لد ا ل د ل ل اندي اد لوجي جر لني يوا لحي ونا لبو لوو ووس ‎Ee BAY CTR‏ لمجا للدي اي ني اديدج ‎RAT‏ جا اي لوج دج اللا ا ارال اي اانا حم عق ‎ATATTIARMY TIRTARITUIAT‏ لالت تان ااا قتا لحا الا يم كج ححا اع دحوي دادر + لمتحم ‎Fo‏ ل ست دب لمات وح ا م لحي ا ‎a‏ ل اد د د ‎SS‏ لا ااا ل اي د ف ا ا لذي كد ا م ‎NR NT NN TN‏ ل ا 3 ‎A‏ ‏لكاي ري رج لجا ب ا ا ا بل جاه لبر الحا اك ند كردا يد اتاد كك ‎POT‏ ال الك جه اج ارم الح اد اك ايج ‎PTET‏ ارج حي اب ‎NTR‏ ادي يه لكي اا ‎SEE IT‏ 0 مض لامجا باصت ‎TATASRIGAR‏ اا تمي ال الور نا لقم لضا نا اق لمات يدي ادن تا ‎an TY‏ واي ‎Tay‏ ل ‎Su A A NE VA Ve A A A‏ وت هار أرب ‎A‏ نيعم و لج بار ‎NV‏ محا ار ‎A Su‏ ويك ري تاي يه را مار تيك ‎VA‏ رحا ل اريك لا اح يتا لتحا رجاه ‎TVA CITI RT TET TT Se RT me‏ لوجي وجي ‎RAT CNTR‏ أي ارج مم رو ار ا احا و ا ‎LAINE‏ ‏الاج لاما لحتنم د د كنا انمد د لخاد متحااةت حاتي حاتت الت الم انض اا لاض مداه لالت ال 6 0 ب ل ا مي الا ل ا 1م ‎LROWMOTEY WI‏ تتم ‎SN Ye eS a‏ الس م ‎SS TN‏ ا م ‎Fe Pe‏ كي ‎Ne Te i‏ ا حي اي ا ‎Tl‏ اي ‎a Ne TN TN a‏ ا ‎ww‏ 1 شكل رقم *؟ ط
    ‎—\é a —‏ ‎ANN MUN CVMINRNT yh AI INNER AMIN SANK RN NY‏ ا لمجال ‎YS NON ONIN,‏ ناس ‎x ANNISTON I‏ ‎ATAY TRTOTTTOTY TYDHTRANTH.
    GUTTTRCOTR TATAATEITY CATIUATIUY NITAGTALEX‏ المي جحي دجي ‎Eh‏ ‎vd‏ الست دصرت ال تست ااه واج امات وا تار واي اد ميا ‎Fe‏ اير وا اتير و لامي ‎ea Sr a A‏ لاوا يها وا ‎Fe‏ ا اوكا مي ‎SS Ne‏ بير ‎Ae‏ وا تحال مح وا اكه ‎Ve‏ لك ويه اه كاه اجات ‎CROADTR NDE ITE TAY RITE‏ نالمعي ممصي وروم لق , ا ا ا ا ل ال انها ا ان الال راي الوا اد المت رايا لاج ات يق الا لاا لماجا ذا ‎ANGE‏ اا العامة ‎gy‏ ‎AY LH NER :‏ الا الح ‎OO‏ ا 0 ماود تو ا لذ ماع دج ‎SWEAR AL‏ مرح امام ا ديا اما ابي لوا ما ‎Ta Em‏ ماه ابا دايع يها لواب جام م ‎SBA SW‏ باد ‎ee‏ بجا اجا في افيح الم لي ‎A SP‏ بجا يام بي أوام لحا ا ييح ياه ‎Se HS‏ الي الا ايح 0 معدم مي اج جع 6 تنكم ‎NNER STR‏ المي ‎SOY ANH‏ الدج الجا جم ‎RS A‏ الج ال وا د دين المج اوج جم سا ال الج عدت لمج حر ‎TIRTOTRATH‏ الحاث عاك د متك مالالا ‎AASAUTUITAT‏ الها اماما ف الفحض اه ‎TIVTATYONS GIUDUIARAT‏ ااا اليد مجان او لاي الاجر لوا السك الدع ‎SRNL‏ ‏ند اتنب نانج ان ات كانت لج اد عدف جات لدلك ‎rt Th a Th‏ الداتة لست د ند نا تلت د لين لد تند لت ا تدا دا كنت حا لبد حا د تداج داه ‎OCIA‏ لامجو احج حا وي الج وا لتر اح ‎ARLATELEST‏ البو ادي وا وح لواحي ا الج ا الا الم اكه دالا لتاانا ارق خض ‎HARASALASSEY DANIARSANY‏ اام مدت للخت المع ماحم دا يم ' ‎wld‏ ا ا ا ا ل ا ل ا ات د ا د ا ل ا ا ل ‎a‏ د ‎Se Area ee‏ وج ‎SN VINA‏ حي ا و ‎CAMEO Te SEs SATE ATEN NL CVE NIAAA EN REL.
    PI IR‏ : امك جح ‎GATANTRIOR‏ الات الاي تو اا المت الم تدع ممعم مق ‎Ao EY‏ ‎math‏ الى ‎PPL, SR a a‏ 29 احج مجو ‎Ail‏ ‎Wd‏ المج مع تسمه ا ل ا ‎AR Se‏ ل د ‎A SR‏ ل اح د ده د ل ل ا ل ل ا 0 4 1 7 نخمة ‎re NN‏ لجن ل يي اج د لي ري ا ا ا ‎TEN‏ ليح رج ا اي ا ا ا ل ‎A‏ ‏أده الا المتعية لاي صقرم عطي العكة تقد ‎GRETOTARDS‏ متا جا - 1 3 امتح ‎wd‏ اصع : أتنتمة اتات ا م لا ا ‎A‏ يه اه اد ااا ان ا لما دن دا م ام اا اد تا اي ا ا حا ‎AER‏ ا ‎NAN TN‏ ا لاا ل ‎OC INLAY OC EINER‏ ال م د تت اج ا لها م ا را ال الا ا ‎ANY‏ ‏ا ل ان اع الح اا ات وا اس ا ل ل محر ال ادا اح حا لل ا الو لمحا حم امح الت اج ال ا ا ‎wd‏ ا ا * ¥ ‎a Se‏ ل ‎a Sa‏ د ‎NATE A NR AR SS TR RR ST Se‏ ‎PIN rae Rg NARI‏ حي حت ‎MLN SR SS‏ ع جام ‎An ON‏ حرجت ييز الح ‎NA AN‏ الحا ‎RY) A‏ رسكتا ااا ‎TETIEEIATTY CAGRARATTET‏ الا مسالا كاماد لاسا ‎ANY‏ ‏كحو الى ل مي ا ل اتا شاد لسعم مساج الاسم ‎Sie PC Pe re TR SS IN Te PR Re Sad‏ ص ‎I rw.‏ ال ا ا قات ل الا لي ل | ‎Cv‏ ‏بصم را اللمة ااي اويا ااام ماج سات لاا لاوا اماق عات لا الاي ااا اا ا ادن مم ‎Svein dT‏ ‎wi‏ ندر ل ل ا ا ا ا د ‎i‏ ل ا د ‎RL‏ ل ا ا ا ات د ‎TA ST‏ ا ‎SRR‏ ا ا اللي ا ا ال لي اح اب يات ‎SIL AION‏ انه ‎NSTI‏ ملي الي لماجي جه اي لتقا ‎FANE NE‏ ‎ThOQOOITD‏ الم اااي لمان ات امات الما ا مايا وام اماه ماع اناما مام ‎TPDCCCRAOY‏ ا ‎AES WaT Ypres me x‏ ‎LIRA PIOWOTNEL Wa‏ ‎a NA NI Ne fa A SA Nr Nae a NY Bu NS Rr NE Na aes aT Se a Re SN Nr eX a SN‏ ‎ANNAN‏ ‎CRERTIITOIC‏ لتم التق الف ااا ‎GRABER‏ اللا ارا لاا الاي الا الاق ااانا ناتاس اناا ‎AAAS‏ ‏را ال را الا ا م مراك ال سا تكد رن الم تتا الباداجية لوا بي أو ‎A ny‏ ااا بيك واه ‎NE A in‏ الاي ‎rN‏ زوه بيه ‎ae‏ وام ا امل ‎Ne‏ لخدام إل مي اكه وب اذا بادا با الاي يا يا ‎AR‏ يتاي بك يحي اي ‎NT‏ لكاي يحاي ‎TIMELY AR ron wl‏ ‎AMELIE ADVI VL‏ ‎A An‏ لاد يجا جه ‎AS‏ ايع ايحا ‎A NR A SI A‏ يدايع ‎NN SR‏ مي ا ل مره اا حي لسن ا عي ادي ان ‎TE,‏ ا مرا لل لحك واي عي أ حون ا ا ص ‎SRO‏ الأ ات اتح ب تن ‎OTNIGITTOR‏ ال ا اا ‎AEN CUNRATOOAD‏ ‎wR‏ ا ‎Weald‏ ‏ذا ‎RRR Ne‏ دا يه اه لام ‎a‏ اد ماس اتات ‎RET NAR‏ د ا ‎Sa‏ ان ‎NR A NN NN RS RT‏ ‎ATi Rh dg ee a‏ ‎SEED L LWTEIM WL‏ و ا ا ا ع ‎Ne Ti SA Sa NR‏ اد اا الت ‎TN‏ ا و ا ا ب ‎a NN TL‏ ا ل ‎i NR RNA nN‏ ‎SL NO VE Sn‏ ل ‎ERI‏ ‎DUSTRY‏ لاوم داكي لاسا لتر ‎TTP IVITRGES‏ الست الال ‎ER REE ar ra]‏ ‎vd‏ ممع ‎SMTA I‏ ‎A Aa‏ رب اي لز ‎Sh‏ اام ب ارك يي لاع لج ‎NS Ne‏ بام ‎A‏ لمر ‎NS AL eh‏ لاخر يه ‎AA es‏ تج رت حار اتح را ‎Ne‏ حرا ‎NN‏ ‎wd‏ اجو محرة ل اتمرتسةة اتا د اماد ما د ا ارات ما ا اي د لماه أ ما ‎NER‏ ان ااا ما دان ا ا ا ديد ا لي ‎MAE‏ ل ‎Sn‏ صرحي أي حا ‎TE TITTY AON RITTER.
    TO ON eT Oot SA CRASS LENA OL ah‏ عو ‎t ONLINE ١‏ ذا رامال تلا ‎WUT‏ الخالكتالدكانة ارما ل رخ كات داح انرا تتا خياد ‎WAIDNER‏ ماغنا تمه % 54 > 1 ‎RE EE gr ae)‏ ‎Wl‏ ل ل ‎SWMUAL‏ ‎Sa A ar an‏ د ‎Re SAT‏ د ‎i‏ د ل ا ات ‎SN RAR‏ د ‎A SN AAS TR‏ د ل ‎SS NN‏ ‎Tents hd adres ae‏ ‎VL‏ نالحد ‎SWUNAL‏ ‎a‏ مااي وا بحا وه مي ‎NT a‏ وه يح وتم و م ها باحك ‎TE‏ واي ‎YE‏ ايح اه محا محا محا محا لتو ‎NE 8 NE a‏ الحا لجراي تيه ‎NN‏ تاي شكل 0 ‎A‏ ‏رقم ؟1 يي
    ERAS DERISION ‏الل اا د الوكش اي اراي انور ااي نعي اا اتات الما‎ Snip ‏المتاتنتة‎ promoter wl ing ot ie an RF Tn NT ea ‏اد ا‎ Se Sa aan NR Sn A SE eo, Se ee ‏اح‎ ie en ee ee ER rE ‏لاما اج دوه‎ 7 ‏لدبا حت اتات‎ YL TYAS a a rH HE onan Ri He Fa i FT Fa SAA a va NE a I A a Ae ee fa Se a Ne te SD Ar a ha a Se A Se Rex ‏ترا ا‎ RT ‏المح ضح ودج خوج مجح مج جاجح رج عا‎ SONATOGEDTT CANNER TTT ‏ا الل ا الاش كد ان تق ع ال د ا ا ا ال ات ل ير ال ا‎ ‏الاو اجات وات يا الا مكحت‎ wel [Dhl ‏لايد لعي‎ ‏بيع جيك جلي دجي لي بد لاي يايد ماي نواه‎ A Re ‏جيه ا‎ Sa ‏جيه‎ a ‏ور‎ Nf ‏رجاه لد‎ Ia A INN ‏ياه ا يح جا يا بير جه اا يله نا‎ Re man ‏ا جيم ب ا ب يي‎ Ceal¥in dT Sadar we ‏متناو‎ Lowen wa i Re mn HR Fn TR An Be SR ra IN Hn Re Tr Nn Nr Re SR Nee TR Ne a Re Re ae me Rn RE Ee A a ‏ا‎ Ha Fae Se I 3 ¥ i hi IRIN ITI NTT INN ATID AN TO OTT ONTO NPN RII ITS.
    TINT A RT LT AT Teh ‏أت للا متخ اف لمات ليوات لما‎ ard ‏تنخ شال له الام الما الام ام ا ل راتت مرا اا‎ WIR AR AAA TARY SHAN LA ‏الام يدان كا‎ ‏ال اسلا جات‎ ERO SE RTS ‏ا‎ SERIE Wa a Ny Ya a ES SN Nn NG nN Fn Sr Ne NE WE, NN ee SN NE SN RN VR Ya A RE EE EE ‏الجا‎ ey SERIA ART ICR VL SIN RA Se ‏دح‎ es hs Ne Ne oe sa te SrA a a ‏اح‎ a Ne ine ee ev ATCT ‏اود اج نجي‎ BTIOMIIN ‏الج وجوج سيو لحووا لج د لزع رحج ابي اتج‎ SITS TY, TT ean 3 ‏سس ا ساي متا اا الأ لاا راتما وى سس ا‎ ‏ا الح ا م انتج ع‎ 8 ‏قا المسمتمموممج اتات‎ ‏لماي دمحالا امه الحم ايج‎ i de nn Fe ‏لاط محرو‎ a ‏لي يها يا لامي الوا ايد الا يحاي حال باتع يي يا‎ i ‏عع اه عدا‎ rh 0 ‏اماه و رح‎ a ‏ما ب ا‎ ‏بعرو جود تت او لتحي‎ > ‏ال‎ LATER Wa Ay a ar 2 rN a <r Pr PRN SNe Ae in aN Re Pn oN Nea A ‏ا‎ Be a a ‏ا‎ ae ee he ‏اماق مجو مياه اجا ان‎ re ASR rE ‏ا ماي ل ميد حو اكوا‎ TSE SRR ‏جين ا‎ OTT BTR FRR he ‏دام لاي اللا اكيم اذا الماا دالا لاحك كناد مالم ايد ملكت د«نختانتنة الملكمت ييا إكانة لمانا اماس ادام‎ ‏يه الو وجا ني م الم لاتجيد‎ Smidaii ‏الدج الست‎ WL ‏ححا‎ ATA AN ‏د الك اح رايا حا ايد دا الا‎ AR ‏الج حا ات ا‎ SI STI ‏أ ا اج رحد‎ TI ‏يض احا ان لكلا اا رجا‎ TN TIN ‏اي اين رجلا اا رج الما‎ A TA ‏اه أ ا ار‎ SA ‏ابح لح احا راجيا‎ ‏؟ ليتع‎ Fam aren me SLO ‏اح ا ال‎ WO OP ‏ا‎ ‎45 ‏ا الج يودي يا‎ TT ‏لوت لوي له ددن مووي حي )قينا هون حل رابوم نبي تلجياح وي‎ TANI ATTA Ar ANIL TRE ‏الداع ل لأا اله‎ a RE EB I ‏لمجي قا ححمتة حجان خخخ تكد لالط لخاد اغا‎ ‏درجم جد يحي الخ اكت‎ Aa wand ‏درم‎ [£358 i a» > ‏نات‎ ND ‏مل‎ Nd AN ‏وا باد وا يوام با لامالا لإا اميه‎ Sy ‏ادا‎ a ee Pa ‏اي اجام‎ a ‏اجام جا بجا لح توا‎ ea ‏جا تاه م جاه عا أجل‎ eS eB ar ie yr ‏دا يهاه او مواد نواه توا وا مجاه‎ Ne ‏ال تتح‎ 0 Amana ae SILL Antren wd EN Yn Sn rN Xe ys a ‏ا‎ ne rh Se TA us he A a Pie ee se SA ‏ا‎ ee ee ae ee 0 ‏تج ال‎ AVENE ‏ا‎ HEM ‏ا ا ال أ لتر ال فوا الى را كي‎ A ON ‏الا ا‎ SA ‏أدب جد دن اج ا ا ايو‎ A5AY ‏انمق تمستا‎ SATDEFAICAT ‏الدب لماو الو التي لص بترا الا م الم اليم‎ PROATATAROR Went A ‏ا‎ cs WR ‏اليا م‎ Dud ZeTil ‏لوستم سوج‎ wi ea ARR AR AE SAR Sh EA SA SAN SE SA fe SN SRE ‏ل د‎ I RR SE A AY SE A Sh IR bs A VR SARA SA A Eo oS MICE J SPN SUR ‏ب‎ ‏ال‎ RE ‏اا ل‎ 0 ‏لباه دي مايوه له لملا لي دي اهمايا ايا‎ SR ‏اليل ءا يها مكاج جا عا تور فيح ويه لبج‎ rn ‏يفاعي لوا ل يا ما جا عا‎ A ‏ا فيا رو جا جبحا يده عي زه‎ AR ag ‏ليد يع ايا‎ ee ‏جاه جيه امج مه بي‎ Foy SR ‏ادم اج‎ TR VIN ‏سور ا‎ eT ‏اام اجيج الودج اع د وي لاي‎ SR ‏عو الما‎ ‏جا لجا جاد مجاجا :تان امارد ادم نامتك‎ RTI UTES ‏ماية #الماكنا #الجانة‎ Saat AE ae patna ‏يا اع‎ EMILE power wi Ar rr ere Ar A A Se Ae SE Se S70 Arete 8 Ere ne ee ee Sn A Se Se A Sr A re Se A +e Ae A Soe ten Ar Ae ane A a Talini lo oaumiires wi i NY a Ta Sa AY EE a Fn Ee en XE Ne ‏د‎ NAR ‏ا‎ a ‏اح تح حا ا ا‎ NTE - ‏جاع د‎ err ‏اع‎ PAY ‏لد أو ليرا تراج لمجي‎ SR Yt TNA ‏ددمي اليم دي ارم اا تو كرا‎ AY, ‏رميو‎ CA Non ‏مارت م ام كام ما اماما ارك كراد متو اجا سام جتحا 1 ااا‎ OTROITEEDE TRATITATIAR ‏ا اله لماه الم‎ ‏ااا الا مرا تج الما ل م‎ ‏ال ل ل ا‎ ‏ل رايا كاك راي ليجل كدي‎ on a ‏ااي الاي اي لكالا‎ ne ‏لخبي ايا‎ Nein Se Nr me A ‏امائرة كاري ة اا ايه يا زر تايا جا ب يا زعا خاي كي كا بي خاي الخال ااي‎ ‏الم اماج ل لعجت‎ aed ‏ل‎ wd LEY NE AN AR aA a I i re A a NR ee Sn RG SN PRR Ne NR A SN ‏ا‎ AY NS SS AR YO A Nr KY ‏الج رتكا دجوي‎ SARAIVA RITA CUIACTINMTRALY ‏ري لاع در حون روات‎ IRN ‏يح عاج‎ ‏ات ا ال الا را اا م اتام م ا ازا اللا ام الا انو الاو ااا لاا‎ nT SE a ‏اليه الا عم‎ ‏اموه دع اللخطا‎ wd ‏يا اه رايا تحجر ين‎ A ‏يتاه‎ AE A ‏جا‎ SN Th IR Tn A ‏دازي‎ A Sr Ts Sa rr ‏ا واه يع بل ييه بج وال ال ايه‎ A ‏ميا يل ايا يا يل ا مل‎ aT ‏ا‎ 5a ee Ts WARNES RANEY.
    Wa AA A RF AN FAS RR SN A SN EN ‏ا ال ا اد للحن‎ NN TN Vie NA ‏ل د ا د‎ Ya SN A 2 = bt Pn 2 ‏قم‎ : haat ‏يبا 0 ؟‎
    اج ‎ena‏ لدي بجي اي ‎RY,‏ م عير ‎ENN A OR NN‏ وبري ا لجيج مد ميا مي حي و لي ا ص ‎MANOA‏ جو ا اي ‎AYA‏ ‏امتح ماسقا الت .الت دوعي لأسا ساس الى اتات ترا الست تم تاي 1 ¥ ¥ 43 الال الج الي ا يح جح اج حاتجي ‎Va‏ ا ا بماد ع لبا ‎re no ve‏ ما با ‎Se in Ne‏ بجا وي جاه وله ‎a‏ با اا لاوا لاوا نيا ‎a‏ ا بي رجا عر اا ‎en‏ با ايا وه بي الا ليا اااي كلك يد كدي لكالا مكالم الل ار اي مح الا ا ا ‎Wa‏ تشع حر اتات ‎Ne Yr Br Re‏ م ‎Ne Ne‏ مد ا ‎HN Nr Nr a‏ لا ا ‎NN‏ د ا ‎EN Br nN‏ ا ‎aS A NNN‏ ل ‎AVAL NN‏ ‎x3‏ ‎MII‏ لماجي ‎AMR RATTAN RT RD,‏ المي لوج مجحو ‎RIN RTT‏ ضر و تجن يي برعا نو اجاج يد ناه لا تا ‎TRATARKOAR‏ امسج لا الس لتنا انمالسا ‎CHRPITRTICR‏ ‎wn‏ الوا ل رد + ‎Tal‏ ‏ردي لمجت سمج للتمطنا مزه ري بد با ا ايا ا و احا توا ب ‎a Sire,‏ اح ا ل ااه أي ها اه اح وا مايا ‎NR‏ ياي ‎SER NE,‏ يزه ا لاه ايا وا يا لايك ‎RN‏ كاه ‎SA‏ شار يها لا يا ‎wd‏ جم جو تنطاسة لح حا ‎Aa‏ اح ا د د ا ل ‎AEA Sn A San A i Re ah A‏ ‎RT Ren RR‏ حي اج ا ا ‎GAN RN URL TENT RNIN TR ALT NY ETN I MRI hed‏ داه لالتحا الت اكد نات لعا بتكت مادا ‎ALY TEATTATITIC Gaile ts TROTTER y‏ ‎wd‏ اجون عه ‎Soild‏ ‏اد حا ‎ue‏ ا ا ص ا ا اح ا ‎Se ae ve SR‏ د ‎NE eee Ne RG SR‏ ا ‎EN‏ احير ةمتع ‎wR‏ لاجد ‎Sambal‏ ‎A‏ د تمد دن مه لي لد ‎SR AR Sr RN SE‏ د ‎A‏ ا مر ندا الات تدا د ‎IN OA‏ ل ا ‎SoA SN SNA‏ مع وجي ضمي مر مدا اموجن اجججي ادج حون اود أو لحت جا جنم اه ادج جوع الود دوع لضام ام فر يض تف دجي فوا ‎ADA‏ اوج معان ‎STORIE‏ الم دالج جاب د جراد الكت باج لم يجا ‎ZOTETTTATY‏ ملظم اراد اناد اانا لام ال دا 48.3 ‎Cp —‏ جا 0 ؟ لمتحت : ‎Wa‏ الج اتاج انيتا دن ما اما لي اي اد ا د ا ا ل ل ‎wd EXT wd‏ حم كمد التختتاسة الاك ‎a A NA‏ أي يد ‎NN NR SE AN NT SN Sy eR‏ 443% ‎ra aa sae gs he fr‏ ياج ‎erie‏ اميت الا ‎re hes TRS‏ اتن هاي ‎Se cv Sr prs‏ مام اا ‎vy‏ ‎AGSTTGATACE NTATIRTARD‏ لاسا ا اتا تاجات امار م ماي ‎CIETY‏ لماجي لاما اام دي حب ‎Se‏ د ا ‎nN‏ م م مد كا مد اح لكر لضا ان ا كد ا اي د ما ‎Nn‏ ل لضا ل ل ل ب ‎BI eS np‏ حا جات ‎NE Se SA Sn‏ الات ‎NL A SNARE eS TAT‏ اكرات تيم ‎vy‏ 0 اس صا الا العام لضا رن ‎ARITACAGIA‏ اريم ا لجيه ‎DL SS eS AGACTASTTE‏ لا ا ¥ ‎Fay‏ ‏دي جوع ‎SENN‏ و اا يا با وكا كاري لامي جام اي ‎SAT‏ كه مر ااه في باه يا ايا ‎Nr‏ ب ‎Ya‏ ا تاه اا ‎Nr‏ اجا ع كايا با كيرا اا لاا بارا لا ‎A‏ كي لكايه لحي له يه لش اح ا لو ‎RTO‏ ااا دجي الوا ‎TN‏ أو خا مات ‎TTY MRR‏ لاض ضاي امجن الج اوري ‎ASSN‏ لمجا الوح جاجح ‎EA‏ ‏كما لب نك ‎SEE SENS‏ الا نا الوا اذ الما متكي اتا الكوام اناكم لال اك ارايت تمض ال ‎a‏ اما أ ‎bY FP A‏ حي ‎PED‏ ‏الح د ا د يد ند ا ا ا د ا د د م د د ا م ا ا ا د د ا ل 0 كج ‎RET‏ ير ا توم لوعي ااي ‎ATR‏ وا او ‎BTR‏ ا را ال ا ل ياي صا ‎TTY‏ د ‎STR‏ الاي ا ‎ARTI‏ ‏راضخو مرا نا نيا لاه بتكي اماك الل اكيت لاير دام نكرت لضت لضام اماه ترا ممالل ‎Er‏ ‎DED wh‏ ‎YN Ne NS‏ ا م ال م الا امد ‎in INE‏ مما ‎Re,‏ اا ‎NSN A NEN Sn Ne NHN NS NS AN RN‏ ل ا ل ل ا ل ل لاد باد ‎UTA RRA‏ اماقم جا وا اليكل ‎ED WTEREERGITNRD THRILLER‏ م عار متا مات تادامض ‎WE‏ ل ‎A‏ جا يا بد يي نب ايه ‎Sa‏ جاه بات ا جيه عا اجا جات تا يا ‎A SA‏ جد جيه ‎A SS ER‏ ايه با ااا جا د ‎AS‏ اه ‎AT‏ اداه ‎SARA‏ ااه اي ل تجاه به لم لاح ‎Re TY‏ لحي ‎BN‏ اع حر ‎RE St PN RI NR aN TR IT Brn‏ رحج ‎TET‏ لحمب ‎LEY‏ ‏وو لد ‎AGSUATIRSR‏ لمعم لاض ا مااي ‎ADASTTUARS‏ امات قا مار ‎Yay ad‏ ‎PAD wh‏ ‎eee‏ ان ‎a a A a Ra Sr ae Sa he Re fae SN fe Aare‏ تا ‎AN Rei Ae a Sa Nein IN SN AN Sn Si A a A‏ دومج حو مض اب يي ‎NA CT REY TUN RR, USOC RANTES CR RT‏ الم ولحاي لاض ‎BUTE‏ ‎UTRAFNTEY‏ الالتسقة تا ‎UTEFACATAD ATTITUDES SDIUSTAGRS‏ امت اضاتمنة 3 ‎Yo x‏ ‎FRY wi‏ بجا لام رجي حجري ‎TE SLD ATT‏ اجام ‎COTTE RR CIE NAR OR RRS TE TNS RIOT ITER‏ ثرا ‎TWAT INTIS‏ اتيك لاا لاه ‎ATAGRERITTD DAMACEATNY‏ لاتغا الا لتنا ‎YAY‏ ‏حي ‎SEA‏ ا ‎FRE OWE‏ يه ‎A A a‏ ااه ‎Se RE TN A TR A‏ واي ‎TR A Ti i Se‏ لا يا بايا يه ‎NE‏ ال له ‎TN‏ لحا ب اي جاجد ‎AT A Se‏ و ‎ene EE rR‏ لماع ا ‎TS‏ الي ‎AES Cr AEE‏ ‎WLITHEL AIT EET STA UGRRET ERT ATEETLTRSE‏ الا تا لت الت ‎BAD wl‏ ‎a ie‏ ل ‎A ar‏ د د يد د ‎Nea‏ ل ‎eR Si‏ م ‎RN Sn re ne eR i a a‏ ا ‎TN RN‏ ‎JERTRINIA‏ ا لا ل ‎ANRGATTITS SENTENCES‏ ا ‎AEE Th]‏ ‎Toei aed‏ 3 لبا ‎a‏ اميش ‎FART wi TwLay 37 UTE wl‏ ب 2 3 ‎Pw‏ ‏رقم
    ‎A ve Eri 5 .‏ ا ا ‎i.‏ - 5 ال ‎FET‏ عر ‎OE Sa EC‏ جوج ‎PA‏ مدن لجرت مج لان دجي امج موجن ‎Ch‏ وي ارا واد من لمجا ‎IR CT I Lo Np‏ جد عي و حا ‎LRN‏ ‏ترك ‎ECR LER ACPI ST‏ مالا الما لا الزن له للا ترات يا لاه ارا تلات لقال ‎ET‏ 3 ماما تاها لمات ب جمدي ل لمحتي د لاا اد يمسج ان ل زاتما لمان امه لم ارات م ده أيه لحا تيه و اح تي د ماد ترايت اتا حا لا اد مان ‎REN‏ ان حي ا ل ل بام ‎Ye 3 TL TTT Br ROR {Tf hn TV IIE Th SN BY ILS uN I pe‏ ‎WY BR I CR TE At EL Rp te‏ ‎Seat X orem we‏ ‎SALAD ET UTE Ya‏ املا ‎NE‏ ايك بي داه ‎RE ae‏ ا ‎Re NE‏ لماي مل ‎RE Se Fn a Pe A‏ و ايا ‎SE Yl Si Vn‏ بريه ب يخا له يداه ايه ‎RE A NNR‏ ليح ‎NR Sr Se‏ - ‎SAA Sa Ae‏ ايع جيم ا لاجراي اج حم لدابتم اي بي ‎SCARE, YAMA‏ مااي ‎A ACSA EN‏ ري اج ‎Ys AN EAN AON SR ATEN‏ دا دا ادلي الددامة ال ملاتا ا مادا ‎SSN NREL‏ اكالم ‎RU RESIST‏ الماك ااا مدال كاك الك اكات الاي ني 7 ‎wed‏ اماج ‎THE‏ اماي عات ‎WIE Wa‏ تدم ‎Ne NR eR Re ae Re SR Ae Re a RRA ee RS SN Si Sir Sn Sir Tarn fa Ae A NA‏ ا ين ‎NIN EAR ON SAT (AI‏ يت لم ارات ‎Ea) AT NS SAN SUNTAN, YA SN AN AY‏ ‎OTEITTSTETY‏ توج مما تكسا لق عم الست اتام ‎been CTCARGGURT CTEIEITITA‏ ‎Res STII ra‏ اذا كمرح ‎ERGETE SR LOW‏ اد ‎SE‏ ال ل ا الم د ‎A‏ اد اكات ا ود الا ل ان ‎A‏ د ‎IN ATS AT SE A Se SR Se fh A‏ ‎ME A CIN RIE a TT‏ ابنج حو ا وميا لضي لمجي احير واي ا م لوصا الدج مدت ل 0 ‎Veda d‏ ‎I TIRE‏ المالللك لكر اانا لارام اجات ران لا الاباك دا هاج امال ‎RULTRATESRC‏ لاسرا الام ارجات > ‎IR ard‏ اج الاناتمة ‎Gali 3 UTR wid‏ مها ادا ب بها جا وا ‎ns ne Rn en ne‏ أي فم با جرم ‎SS mn Se ne a SN‏ افو اه مايه عرد ‎AR RS‏ تاي بات ل لضي لاا ‎F a : - = ~‏ ع اي ولح اج : ‎TOA‏ ‏الا و ليده لمحم لجخي نجي + الج توي المي ب ضرا مضيو اجا ميجن ‎ATR‏ الما ميدي اوحض اموا در ‎SATA‏ لدج يي مادج اذاي م 0 ‎AR BE RE ER RE SE ASRS SUBIR ASE 3 CR NE SRE LR GOERS‏ ‎BE TIER ad‏ اا ا ‎Cap‏ ‎OE TW WL‏ ا ‎Raa A Ae Sa Kr he Ae 2 A Se Fs‏ ا ا ‎on KE ATE EN NER‏ ال لجا ب ‎COTE R‏ لاح ا اليك ‎SONA‏ بع اك دع دري عل لجيه لتحي ع ‎TINIE‏ لعي يي الاج دج لوج ا لجل 4 ‎ .‏ ‎TOCTARAETE DRIACATAGA‏ اكرات ضار لاني تضم دض نيالنوا الا لزان ‎٠١1 TTRACRIZATEG‏ ا ا لي ‎AO TOO‏ ا ا الس ا ا د ل ا ‎Os I‏ ل ‎RE‏ ال ل ‎NNN‏ 0 3 ‎TAB IMEALaY rated WR LS Wess iaaas ade‏ المااي باكرا عاد ناكا لاما تادالق ‎ALAN,‏ الكت ال ‎A‏ 4 + التو لق لجرا الس با ري اماق عقا لاض ا ‎BATOREIORY‏ ااا المتساقة 111 ‎SUR RRNA NTO‏ ل تت ل ‎WN A EATEN DH‏ الما يا ‎NOIR‏ الج را ا ‎MR TR AVIARY AL‏ 13 3 لاحت لاخر العو ااا ااه ااا امود اا لايق لوا ول لامالا مالا لقم خأو إلا ان ‎aN‏ ا اع ‎Nate‏ الحا و ماي ا لي جار ل رسيي ا ‎TVR‏ الاي ار ا ماي ا م ‎IN‏ ل اي ‎ENTAIL‏ الا بان ‎TSS EIN Ren Ce a‏ شما اشح الخد الام الشركة ‎GID AMER AIRS‏ ما اط 7 3 4 ابد واب ‎BEY ONT AA Sn tS at‏ اد رد ار ‎ENCINITAS‏ اواج ‎WR A WSR‏ الجا ‎a NGS‏ 3 : الم ضمي اال تالاقب موت امم صا ريد ابسحت ور اي اال جرح رجي لاسي لجن 111 ع فعا لات السك قف الكت ااي ‎TARPTIEIYT ATTENDS‏ الم كعة اضيا الس تتا 1 ‎INT TET‏ يجي اليل الوط رن افر واي تاد ‎DE‏ الس ‎AR‏ ارا سر ا رجت ارك موا لجرا ‎NT STIR TONNE,‏ يحت سج جح ا ا ا ا اللا ا اا ا ال مات اللاو رادار ‎TERATTIENNG DITTSTIRAR.‏ ا را ا تام ري ‎CTY AEM‏ لدي ‎SN ENR‏ دتمت مات اجون ‎SOWIE pnd AEA‏ احا د جح زم سمي أ رجي تا خأ ل ال ا الا اتا راتوا امت محقم لامعا اا ‎٠4‏ ‏اجن لو لب اجن ‎ENS SDR‏ ابوت لديم ‎YAR OI OD ORI NAR‏ أنه ‎NOSE A‏ الح حيجن اميه حي المج وجي الدج او ايا الا التي مات ‎RR PS IE 2 RE Re‏ لا مايه ‎A ER tN NIE Ee ENA SS‏ اا 203 تام ممه ‎Prev‏ ‎a‏ 11 شكل .قو ؟؟ 4 1 25 ا للب
    -.6؟1- هوية ‎Youd; ih‏ ‎CTGUALCCCTCTCGAGTH I TCCHUTTCACOGTTGGACT TG TACGUTG TCAGCATCGA‏ “ربا عب ‎GATGTTOCGTOGLGOAGUUGLAGACTICAGCLG TCACGGUAGHCG GCC‏ ‎TCTCACGGCATCTGTAGUTACGGGGGATTCCTTTCHC ACCGCTCGTTCGCTTTCCCTT‏ ‎CCTCOTCIGCCGAAATAATETTACACCCOUTCCATAGLCTCT‏ ‏هوية متوالية ركم 16 ‎CTGOACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCOGTTIGRACTAGCTCTGCTGTCOGUATUCA‏ ‎GAAAATGOTIGGCAGTGUGGCAGACGTGAGLUGGCACGGUAGGGGERCOTCCTCC TG‏ ‎CTOTCACGGOACATOAAGOTACGHGTGATAGCTTGCCCACCHCTCCAACGCTTIOLCC‏ ‎TTACTCTCACGUCOTAATAAATACGAL ACCLCT TCC ACAACCTCT‏ هوية متوالية رقم 17 10100001 تامع ‎CTGEACCTCTCTCOAGAGT HCG ICC ACCGATEOACT TGC‏ ‎ATAATTTCCGTGOCGHAGCGOCAGACOGOAGCCOGCACGOCAGGGAGCLTLGTCOT‏ ‎CCTCTCACGGUACCTOCAACTACGOGUGEATTCCTATCCCADCGUTCCTTCGCTITCAC‏ ‎TRCTTCOOUC TCCTTAA TAAGTAGAC ACCOU ATCC GAGUCC TOY‏ هوية ‎ge‏ الي ‎YA as‏ ‎TCUGCTATCTGLATCC‏ وو ‎CAAGACCCCTCTCOAGAGTICCGCACCACCGTTOHRACG‏ ‎AGAAATTGOOTGHCOGAACGH TAAACGTGAGCCE TCACGGCAGHCGGCCTCCTELT‏ ‎CUTCTCATGACACCGOUAGL TACGHGGUATACCTETCACACAGCTCCTTCEOTTITNT‏ ‎TTCCTCGUCCGUOGTAATATGTATACACTOCCTCCGLACCCTCT‏ ‏هوية متوالية رقم 14 معد دوموك امو اوت الاق و0 ]0011 الوا وخا 1 قا لخم 00010000001001 وا لخ ا لمنقد 000 و ات تاليا الف ‎CTATCACAGCACCGOCAGCTATGGRAGATTCCATTCCCACCGRTCCTGUGCTTTICACT‏ ‎GGOTGGCCCGLCGTEATAGATAGACACTCCOTCUACACCCTICT‏ ‏شكل رقم ‎1Y¢‏ ‏دما
    اج ¢ \ _ جوية متوالية رقم + قات المعوا و0 وعم اق ‎GTTGGCTTCTICTIGTGAFTTCTGCTICACGHATGHACTIUG‏ ‎GAATTTGCOTHGOOTAGCGHCOGACGTGATUCGHCGUGHUAGGCHGCITEC TOO IOC‏ ‎TCTCACTTAAGCGACAGCTACAGGOGATICCTTITCCCACCGCTCOTTCGOTTGCOGTA‏ ‎CUTCGOUCGICGTAATAAATAGACACCCLCTTCCACTCOCTCT‏ ‏هوية مثوالية رقم 7 ناتخ ‎CTGGATCCCTCTICOAGAGTGCGOCTCOGACGTTGGACTTIGUTCCG AAG TEGGC‏ ‎AAAAATTGOGTGOTGGAGAGGCAGACTTRAGCCGOC ACG GCAGGAGHCCTCGTOCT‏ ‎ACTCGCACGUTATCGGCAGLAACGEGAGAATCCTIGCACTCTGUTCCT ICG TG TAL‏ ‎CTTICCTOOCCOROCTOATATTOA TAGACALCCOCOTECATACCOTCY‏ هوية متوالية رقم ‎TX‏ ‏كنا عمقت لمم معان رار غم ‎ATGQACOUTTOICGAGTYGTTCOGCTOC ACOIFT‏ ]00002010 4 )تن ‎AGAAATTOGUGAGACHGAGUTACAAACETAAGARATC‏ ‎CCE‏ لجف 0001010011 101:201 00114000005 00خ تا ‎ACCU CCTCOGC ALTCTCT‏ اح ]نض ا اكه لماعي ااال هوية ‎ge‏ الي قم ون ‎CTGOACCCUTUTAAAGAGTTCCACGUCACCETTATAATOHCTCCOUTGTCHGUATCC‏ ‎AUTAAATTACTTIOGOGOGATCAGUALG ACEH TGAGCCAGE ATGOUTGOUGHGUC TCC TOOT‏ ‎CTUTCALGATOCCOTCAGUTACGGGHOATTCOTTICCCAACGUTCOCTTCGUTTTECTA‏ ‎TOCGCGUOTGCCGGATTAAATAGGCAGCTICTCGTCACCCICT‏ ‏هوية متوالية رقم ‎VE‏ ‏ذعد ا معاماان العف 000 0001 اوعد ]0ن 171 لخر ود تافالا ‎GAAATTGCTTOGCGAAGCOUCAGAL ATGAGCUGEUACGACATGCOTCCTCATTCTOC‏ ‎TOTCATGGCACCGOCAGTTACTGOTGAATCCTATOGCACCGOTCCTTCGUTRTCCCTT‏ ‎AATCGCCCOGUCGAAAATAATTGACACCCCATCCACALCCTICY‏ ‏شكل رقم ‎VE‏ ب همات
    ‎w=‏ 3 متوالية ‎J‏ قم ‎Agel‏ ‎GAGGACCUCTCTCOTOTGTATCGCTCCACCTITOOHAG TI TGOTOCACTATCGHLUGTALA‏ ‎GAAAATTCGTTGLOAAGUGGUAGACGTHAGCCTACACOGCAGTCGGCCTUTACCICE‏ ‎TOACAAGGCACGTGCAGCTACAGATOGATGUCTTTCCC ACCACTCCTTCGCGTTCCTTT‏ ان مكنا نان اكات انخاس ا كاذ اناا انال هوية مثوالية رقم 16 ‎CTGAACCCATCTCGAGTATGCCGCACGATCGATTIGACATGCTCCACTGGLAGUATOC‏ ‎ACGAAATTGCATTGGGHGAGCATCAGGUGTGAGUCTGCACGOGCAGOUGGACTATTCCT‏ ‎COTCGLGUGGCALCOECAACTACGGOGRATRO TTOACCG ALC GOTUCATCOATTICC‏ ‎CAATCTCROTTGOCOTATTAAATAGATAACCCOTTCACACOUTOT‏ ‏هوية متوالية رقم ‎TY‏ ‏خخضب العو ملظت عدوت الت انعا ىق الفقه 0 1 7ن خاي ‎TOUT ATCCAT‏ ون الا وو عفن 00240 )و لاوح وى مضكضرقووو و0 لجان تتاف لمم مااع تنس اععف0 300000310010 الف 0000 تت عضخ ااال مغ وو اف الم مكمه ‎ACCTCGTCTGUCATAT‏ ‏هوية ‎ge‏ الي ‎Tih as‏ و انه هة 001110111001 وو االمافحففقاة ا لانن ا ‎TGC 011‏ “قم ‎AGCGAATTGUGOGLGGUGGAGHGTCAGATGTGTHOCGGCACAGC‏ ‎CUTCACAAGGEACTEECAACTAUGGOTGATTCAT TICOTICAGC ACC TATGCTTACC‏ ‎CTGOCACGCCCTCCOTATTATAATGACACCCCUTCCALUACCTTAT‏ ‏هوية متوالية رقم 4؟ ‎CTGOACCCCACGUGGGOGTTTICETTCCTCOGTTIGOEATAGOICCHG TG TC AGUATAL‏ ‎AGAGAATATATGTCOGOAGCGOAAGACGTGAGCOGACACGGCOGGUTGOOGUCTCET‏ ‎COTGTCACGACACUGLCAGGTACGGUGGGATICCGTTICCCECCGUACAGTCACTTTICG‏ ‎CTTCCTTGUCOGTCOTATT AAA TAGACACCHTGTCCACAGOUTCY‏ شكل رقم ¢¥ ‎z‏ ‏ذا
    —-\¢V- *١ ‏متوالية رقي‎ See CTTGAGOUCACTOTAGAGTTCCHT TTUACCG AN [ ‏خاب لم لتقت رت تالاه الف‎ TTAAGTGOEAGGCAGAACGTUATATGAGAGTCGGUACGGGAGGCOTTCGCCACGTE CHCGCACTACAGLGOGAGUTOCGGAATATACCTGTCCCAATGCTGCTACGCTTITCCC TTCCGCECCCACCHTAGAAANATEACAGTCOUTTCACALCCTICT 77 ‏هوية مثوالية رقم‎ TAGGAGGCCTCTCGAAAGGTCCGGAAUTCCGTAGGACGTGO TCCGOTGACAGCATCC AGGAATATCATGGOGGAGCTGC AGACGAGAGCCTOGACGACAAGOGGTCACCTCGEG CCGUTGACAGUTGCGOCAGUAACGOAGTATROTTTICTCACCGUTCCHGORCTTTCC CTTCGACOLAGGCCAGAATAAGTAGACATCAGCOCCACACOOTEY 7* ‏هوية متوالية رقم‎ 07100101 ‏ده 110101452004 ]0 زرفي 1 ] م اجمعة لالن لالاان4ى‎ GTTATIGGOGOACTOATCHRHCAGAUG TG AGU AGCACTOCA AACGGO CA ADTOCTICE TETOTCGACTAAGQUATTAATTAAGOATACCTTACCCGCOGCTCCTICTOTTICOCTA, CCTAGCCLGCOTTATTAAN TAO AGACCOUUTCCALAGLCGUT vy a. ‏الي‎ ge ‏هوية‎ ‏بصمجنماو ىر لفوت ابوت 01ت تنما اا ممتي مقف 1 اعفان‎ 0 106»: ‏وجمكعواة مقن ا المت 00110060610 عات لاض‎ CGC CTORUICCTC CTUTGGGAGCACCGOC AACAATGOGGGATTCCAAGCCCEC AGG ‏“رعو‎ 61746 GTCUTCGCLCGCCHTAGTATGTAGGUATCCLAGAGATTALCTCT Tid ‏هوية متوالية‎ CAGUAACCOTAACGAGGOTICCGCACGACCASATHEACTIGATCTTCTOTCGOUATCE AGAAATEGOGTGTCAGAGCGGCATOCGTGAGUCOOOGGGLGCOTGCGGOCTCATGOT GOTCTCGUGGGACTAGRAGTTACGOGGGATACCTGTATTGCCGCTCCGACACTETAL CATCCTCTCCCGOCGGAGTATAGAGACACCCOUTCHACGUCATAT ‏شكل رقم 5 هد‎ ‏همأ‎
    -١ 0 Yo ‏جوية متوالية رقم‎ 001104046171 ‏معو 001101001 الالفغانة روما لعفف‎ GAAATTOUG ‏“ووو‎ TGATCTGOTGACGTTAAAGOGCTICTGCAGLGCOGCTTCOTTOGHE TATGAAGOTACTGGUOTCTGOAAGTGATOCTTTTIGE TAACTCGCCTICGATGTCCCTT ‏الغا اتاو انان‎ TAA TAGGTTGTUAGLUUGUTUUAGACCATTT 77 ‏هوية متوالية رقم‎ CTGOTCCCATOGCTAGTGOTACGUTCCACCGOTCGAGTAGUTCAGATHTCTGAAGGEG TGGAATTTAGAGGTGOAGAGACAGACGTOAGUTAGAGCGOGLCATOGGACETGGTOCA CCGOTCOAGUGCAATGGCAACGACTETTGAAACCTTGUCCACCALTCCTGOAATTTIC CATOCCTCACCGOCCGOANTHAATTAARACCCALGTCAC AALCTCT TY ‏هوية ستوالية رقم‎ COTGACAGGROTCGOGTHRTTUGEUTCCATUGTAGTGCATGCOUCGATGTAAGTAT AC AAGAAQTACOTOGCTTGOGOGTUTCACGAGOGGCOG TC AAGORCAGGUOGOOTCCTTICTA.
    AGUTTACGHCGLLGGC ARG TTICOTAGETTACCTTACACTO AAUTCATAGTCTATCTAT TACTOGT ALT ICOTIATAAANTTGTCATUCCOU TUCADACCOC TUT ha as ‏الي‎ ge ‏هوية‎ ‎AGGAACGOCTIC TN GATOOTTOUGCACATAGOAGLGGACTTGATAGTOGOTOGAAANTCT AAGAATTGUATATCAGATETGCAGACGTTAGCCHACATGHU TAG ‏وين عم مقس‎ TICACACGTCAGCHAAAGUGACGOAGGATTTICT TOC UA ‏مجم ممع وان لالد‎ TTCOTCGUCOGTUCOGAAGAAAGATACTCCOCTIGOACACCCTCT ‏هوية متوالية رقم 4؟‎ CTTGACTIGGOTCGAGAGTICTGOGUTIUCATIGTAGTIGCAGUGATGTCOGAG TCC AGGOTTGEGTGOCGETHCHECAGALGTOOGCAGATACGACTOTATGECAGCALCCTA AACATACOGGTACCAGAAGCTGOGUTGUOATACCTTTCCCGACGUATATACGTTITCCG TGQCOTCICACGCCGTAGTAAATAAACTCCCLCTCCTGTTOCTIT A YE ‏شكل رقم‎ ‏همات‎
    Vea or ‏هوية مثوالية رقم‎ MESGALLFHG KIPYYVEMEG NVDGHTFSIR GRGYGDASVG KVDADTICTT GRVPVPWRTL VITLTYGAQU FARYGPELKD FYKSCMPEGY VOQERTITFREG DGVERTRAEV TEENGSVY NR VKLNGQGYRE DGHVLGKNLE FNFTPHCLYL WOEDOANHGLK SAFRKIMHEIT ‏تلخ اموت عرق‎ HTOMNTPIGE GPYVHVPEY HH ITYHVTLSKD VTDHRDMNMSL VETVRAVDCR KTYL 37 A ‏هوية متوالية‎ 155 ‏اا انض‎ KIPYVYEMEG ‏بي‎ 131117511 0010451 0 0100717115711 371 1717 ‏و04‎ FAEYGEELKD ‏لطا قاو امورو وى جاص‎ EG DENFETBRAEV TFENGSVYNR VKLNGOQGFEK DGHVLOGKNLE 210 WODQANHGLE SAFRICHEIT GSKGDRETVAD HTOMNTPIGE GPVHVYPEY HH MSYHVELSKD 17151 KETVRAVDUR KIX 8 0 ‏يج‎ ad) Jed ‏همأ‎
    وج ‎-١‏ ‏- #سس 077 ] ال ا 1 — ا : ب ض > ‎a‏ 1 اس ‎fo JA v‏ 2 #8 ‎TE ١‏ ض ##ااااي» ......... ب" ا ‎Ce A‏ ا بحسب ‎Co : st iilht:‏ ‎You TE ١ ٍ‏ ا - ‎me‏ جه ايج & شكل ‎I‏ م
    _ \ o \ —_ gor (WEI BAVA NAY ean ‏يو‎ ii SRE Re oe ٍ ! See ‏ذا‎ : i ‏إٍْ ; لك وج‎ ‏ف‎ i : 1 3 1 : 1
    ‏.م ل‎ 3 i N i i ‏إْ‎ ‎B Tra 0 : ‏مقع‎ 1 : 1 > 1 1 ‏با‎ 0 0 1 5 : 1 & ‏يخ‎ &£ : 8: 1 ‏ىن‎ : 1 ‏تب ل‎ oo { Po * ‏إٍْ ٍْ ف‎ * ia 1 ‏لأس اااي أ لاجلا‎ ١ 7 ‏شكل رقم‎ : : ; ‏يي 5 ' ل ير 1 1 ا حو‎ ; 0 1 py 1 ‏لش للد‎ TAREE AE 3 i fe i 8 & ! x i & : Eo , 0 8 i Yeo 0 5 & i ‏م م‎ i & 3 £ i ‏س0‎ ْ' ‏ا باعل‎ » حر Yi ® شكل رقم ‎YY‏ ب ذا
    _ \ o \ — ‏لي‎ BRET ‏لضفا‎ Bed¥e¥ RaW H : H H : : H H : : 1 i : : 1 H : 1 Ser 1 H : H H H H H Ere : i 1 i 1 a 1 : 1 4 i : 1 es ‏ل‎ 1 & 1 i 8 ' 3 i : 1 : « H & 1 ْ: . <0 ws You 4 : 3 0 ‏اام‎ ‎= H : 1 Fd : & 1 ; | 0 ' i : $ i Ae * 4 ٍ : 1 1 ‏إٍْ‎ 1 H : H i : 1 : ‏إٍْ‎ ‎i ‎LJ on ~ ~ 1 i : i H H H H i : 1 Yes i 1 1 1 ‏شكل رقم 8؟ أ‎ i 4 § A ¥ BAT BAYS ‏اتدل ادا‎ 3 ts} : " ¢ N wn = : : ‏م ا‎ : 8 :
    & . ¥ ) . 2
    Yo. Fi R 8 # 7 > x LEN oe ‏د‎ : 3 ‏لاا الهم اا كك‎ & ® five
    _ \ o Ad —_ ‏لا اد الما‎ IO WHT ‏ضام‎ BAY warn ¥ LN J, Rest 3 3 ¥ 3 1 i 1 i 1 i i i i i 3 i ow 1 : H 13 i Fd 1 i = 1 Wer ‏ذا‎ E i 1 i 1 ; : 2 3 > 1 > 1 ‏إ‎ ‎x Pos 1 3 HI 1 LN H 3 EY + ~ a x 2 : ‏إْ‎ ‎ُ i : Ld ) OX i $ 5 4 1 ‏ب‎ HN Ek i = i £ § 1 RX 8 1 i i Bes i 1 i 1 i 1 i 1 4 i H 13 i 1 i 1 i 1 i 1 i 1 ‏ان نا‎ 1 i 1 i 1 i 1 i 1 i 13 Frere ree ee ‏لب يي‎
    : . f va ad 3 ‏شكل‎ ‎Gi a i Ro i 1 1 pan a 1 0 : 5 ‏ا ا‎ 5 gin BRIT BAU LARS avn 1 ‏ب‎ : i i 1 ) 7 i i i 0 i i i 1 td i i i 3 i i = i ‏له 0# ا‎ ٍ 8 ‏ل‎ . he § 0 : = i < . Lr 1 N © ‏ن 0 ب‎ a H » 1 1 0 ٍ : - ~ ¥ § 3 0 i R ; 1 ‏ب‎ 5 3 3 & 0 i » 5 ‏م‎ ‏ببس ا‎ 8 ‏“ل‎ > i = & H oo F i \ { i i * I I a ‏شكل قم 4 ؟‎ . ‏رقم‎ \ tive
    — \ o ¢ — + gaan mmm AAA ‏ا‎ Nanay
    YY. i . . i [RE ١ R i Youd 7 ‏إٍْ‎ ‏أ ا‎ ; : i ‏الج‎ 3 § i 43 i i a FURIE SOV SRC oe ‏يي‎ ood ‏ال‎ Es Jove ‏لاا‎ St I HE Sine ‏لأست‎ ‎EE B ١ I v Tol Ja ‏ب زا ا‎ ١ 1 1 - ‏سس‎ ‏به بيات‎ ‏شكل .أ‎ ١ + : ‏يسَعَعْعهستمي لبد٠|[|[|[_ديتت ا‎ ‏ب‎ : : ) i i : ‏إٍ‎ ‏ا‎ H carn, 1 & 0 1 1 == ? Tw do »َ I ‏ا ؛‎ ‏ا م الا مم‎ Ee : ‘ ‏الح‎ ‏ب ا‎ N ‏الب‎ ‏ب‎ ‎PR EA! K ‏تحجر لاحك ب الال"‎ . . ig Re tive
    — 00 \ _ ‎nanan‏ ص3 8 - ‎re‏ 2 ‎SN‏ . 3 ‎Teo 3 2‏ 14 الك .تا 3 مسيم سي ا كحك ‎LAY eT ١‏ الخ اعم ‎IEEE‏ مكب شكل ‎1١‏ ‏1 ‏[ ار ) ‎gt‏ ‏| 2 مج سي 0 . الما . ‎rei 7‏ تسوت ‎ATE‏ ‏ا لد ا نو زاج لك سلا ل شكل ‎TY‏ ‎tive‏
    _ أ ‎o‏ \ _ ‎Yous ee :‏ ‎PR‏ ‏حيبت ‏اميه 0 ا 3 3 5 ‎gens :‏ & الال اا 5 ‎CE 8‏ ا 1 ‎a‏ ‎The sii,‏ > ‎EN =‏ سات تاج ‎oo bat‏ ‎g A 0‏ بي« يأرب ‎١‏ يليا + ملعا الاين شكل رقم ‎PY‏ ‎y 8‏ ك4 : سد ب ‎a‏ ‏ل $ ‎Le 5 Fe‏ . ‎srry‏ - ¥ < ب ‎Ea ENE‏ = ‎wed‏ = #8 إ ‎hook 3 0‏ 0 = م ‎od re 1 1‏ : £3 ‎pr ¥ FERN 8 i‏ ‎wg Tee = > +‏ . ا تحن ال > حا تن لاحت اح ‎RS EN‏ # ا ٍ ‎yoo‏ ‏3 0 ل جو و جا و مج جا وج سه ِ* ‎ASOT ١ LAY PAY RAY‏ =« 8 ير 1 ب ¥ ‎of‏ : شكل رقم ‎١‏ با دما
    _ \ o 7 _ ‏قفا‎ Sant WARY tam gu] 08 5 ‏ب‎ oN x a < The i Yer J 3 * ‏ب‎ ‎1 ‏ا‎ 4, 2 0 . g 4 > ‏هدجلا‎ & 3 08 ٍ 8 x > > ‏ص"‎ 5 5
    A . ‏م‎ « > fo LR 1 ‏موا‎ pS ig ® vad ‏شكل‎ ‏ا لاما كالما لوقا‎ Lav ‏ريو‎ i ds Libalh SRR aR fi TERI i i i i 1 i k| > i i i J i i i E ‏ا‎ ‎| i Ye xv ‏ا‎ i 0 > i i i 3 i 3 > | i 5 4 N i kd 1 . i & i £ * i i | ‏ا ب حمر‎ ‏ب‎ i 0 ‏اب‎ i i . i [ye A ~ : i i i i i i i i i i i i i i i i i 1 i * i i i i i i i i i i i Ed 5 >, 0 ad 3 0 ot vy ‏شكل رقم‎ ‏دما‎
    ‎o A —_‏ \ _ — جر ا ا ب يد 0 ال ا 5 0 ‎TE‏ : م م" ض 0 ‎i | : ٍ‏
    ‎LY. : oF x *®‏ - من ‎as Ws a‏ ينا ‎fee‏ ‏ض ‎Se‏ ‏سمي :8 تب أ اا سحلي رقم ¥ 08 ذا
    _ \ o q —_ ‏ا‎ jt [+N eo ‏وب‎ ‎A ; . PRN . + 4 > 4 on ‏ادا الا‎ SP 8 ‏ناا‎ ‏الات م‎ LANL YY ‏دكا اند‎ AVY 3 3 * 2 = ‏مج‎ 1 ‏ب 4 اي‎ A
    5 . FN
    © x. 1 0 ¢ A ‏اي حي‎ ware ‏اماف‎
    ‎£i.. ‏ل‎ NA 8 > ENE ‏رج‎ ‎0 ™N TT Ta SES 4 ‏شكل‎ ‎tive
    -م7؟5- حيبت ‎ay‏ . 4 ا كا حب : ‎TN‏
    ‎Qa. 2 .‏ شي ‎ERIE‏ ‏لأست ‎FB es Sl‏ ‎NL‏ ‏ٍّ .ام 4 ل ا ‎ta‏
    ‏. 4 0 ‎I TR TN RY ae‏ خا خا ل ‎ind‏ ماج ‎five‏
    -١11- vs BMI BAY BAY han ar 4 DW ‏اكلام‎ W ay fae df ٍْ ‏مو‎ ٍْ ‏إل اوج‎ : 3 ; 3 i ; % We 4 0 4 Lo 1 fF 1 »> Rey ‏ل‎ 3 1 : 8 ‏ال‎ A “© 0
    1 . : & 1 9 J + ‏يك‎ : * ~ - iw " 7 av <* ‏د‎ ~ ٠ ‏شكل رقم‎ {of oe 5 THEL BAG BANE arn 3 Rew & : 2 8 1 0 a : pA =: 2 » a ; i ‏ب‎ ‎PR >. ‏ال" ل‎ ‏جر‎ 0 Ye ‏شكل‎ ‏ب‎ Toad, ‏همات‎
    -١١7- ‏ا ا ل‎ Yie Tin : 5 1 We ‏ض‎ . : i We ‏ض‎ * . « We : ved J 0 ‏اث‎ ‏علا‎ | * : WW ‏ض‎ ‏اا ال امل‎ . : ’ 5 8 a Yo al ‏ذلا‎ sneer ary LP
    Ya. Eos > z 44 ‏؛ رجا‎ 7 , ~ Nin, > Ya ct, 1 SN i = 7 i a Ah EE 7 ICN a LANE em ‏لحل لات سمت بعت سام‎ Vora) AA THAN ‏لحا‎ AVES Sem re ‏م‎ ‎+ ‏كل‎ ‏اس سي أ خخ راعج‎
    VE.
    Sh. teed : :
    904.4 . ERR 4 ‏خض ؛‎ ‏ساسع ا‎ ‏ال درف متا اك ا ا‎ ‏ال 5 ال‎ ‏امس صب د‎ H 3 ‏م‎ Fo, jg ] EN ‏ا‎ i > ‏تع خب‎ ّّ i
    La. tsa ‏الام‎ ‏اا ل ا د ال‎ te a . ‏؟ فب‎ ١ ‏نك‎ ‏دما‎
    دب بريه ا ال أ اي ا 1 ‎Si‏ أ املا ‎you Na‏ ‎Ra ES x,‏ ب ‎١‏ ب 8 3 8 ب & ‎i od it EY‏ ا 8 ‎FEY wad‏ ‎rsd‏ 8 ‎3X 8 3 0‏ ‎RS RY SF‏ 8 ‎x es‏ ‎ge 0 8 8‏ و( ‎x: ey‏ ¥ خا 0 ا ب 8 :8 ‎Haman‏ = + ‎Bi # KC‏ ب : 0 يس ‎YAY‏ 5 8 1 * الاي * يو : ّّ ‎EN‏ ال ‎eg ey‏ ايك 0 غ8 لضن ‎a‏ ‏: ل أ ا امسا ‎a Ts a RN‏ جلا اي ‎os ing & aa‏ ‎Ra =» a ESN‏ 8 تا ‎Vie of Pu Sm Teg =‏ اااي ‎Saosin i E Nie‏ ‎a on‏ م ال ‎EN‏ ‎oF Ty, PE Fe‏ ال اا اي ‎ig wn‏ 1 ‎a HE Na fay a‏ ا بي ل ال مط اين ‎SF‏ ‎EE Fe‏ ا 0 ‎fons TR‏ 1 8 16 ‎TR‏ ور ‎Bm RR EE‏ ¥ % ‎A : 1:‏ ‎F L‏ ب ا 1 1 % 0 2 ‎x S :‏ ا اب 1 ‎MR‏ ‏الخد تداز اا ل 007 ‎ig Se‏ | ا اا ٍ الما 7 ل ال + ذا
    -١؟0-‎ woo ‏للف‎ MAM 0 ‏الما 000 لما‎ ّ 9 a = : on I > BH zt . ; won N 7 3 ‏ب‎ : : : 3 2 ; al 1 ke & & ‏م > د‎ 3 . J #
    ْ . 2 0 ‏ا‎ ‎١ ١ S 3
    ¥. ‏ل‎ ‎$ x Ps PY ‏رقع‎ LA " ‏اللا‎ moa ‏لوهم‎ anh 7 ana ¥ TUN 1 ‏اوددج مسر‎ = . 3 : ‏ل‎ 3 LEE ) . hod Fon ‏ب‎ ‎5 ¥ava | . LER TY . : : ‏م‎ 2: H ¥ a N 4 - ¥ Rew a i KA ‏ا‎ ‎1 | ‏م‎ 8 ‏ب‎ TV ‏شكل رقم‎ ‏همأ‎
    -١١7- RR IR
    + . 4 : ) . 2 2 a > = £ i
    0 . N + ‏ب‎ : 3 x 4 ‏ل“‎ . 0 5
    MN . ¢ , § 5 0 *ِ 0 E 7 y ‏تت م‎ & . . E x = on B FEA ‏شكل رقم‎ 0 ‏لحن اذ‎ 2 4 IIIT
    0 .
    = . C4 Yon uf : ‏مرج‎ : 5 . Ks 0 # 8 é A 0 i : 8 2 , y 3 2 ‏ب‎ TA ‏شكل رقم‎ ‏دما‎
    -أ١-‏ ‎ban GA‏ اانا للف ‎Yo |‏ : 2 ‎g of :‏ - : : 1 = : : :ْ أ & ‎N i‏ 4 ¢ ~ ‎ra ¥ | Ly : 7‏ ‎i N : 0 8‏ سب 3 | ’ ‎SE ¢ F‏ إٍْ مر 0م ض . 6 & : إٍْ ‎ol -‏ لمسممسسساسمسسابلللللسبسسسأة ‎١‏ ‏شكل رقم 4 أ : ام ال ‎on‏ : ا ايل ‎on‏ : ب ل - ; ‎ny ST‏ 1 3 إٍ 8 0 5 0 أ ‎eve‏ ‏* يح ® بيقع » ‎N‏ % »اج & ‎iy‏ ‏ل ‎er‏ ‏3 ‏* ® 1 د ‎LB 8 »‏ ¥
    ‎a. # & &‏ 3 # حلا ‎gene 0‏ § 0 ‎Ax aa ® &‏ : م اليد با ب ‎x‏ ‏ا اجام ملا م ‎{Le‏ ا ا ‎Jed‏ رقم أل ا دما
    -١ ‏حم‎ ‏لاما لضفا 0 للا ل‎ Bana * 4 N "
    te . of : N : = i : 8 0 7 [a] i 3 Fe i + ‘ ¢ 4 $ i Pa : : § O i 3 ; vd 1 0 ‏قْ : إٍْ‎ 0 ‏إٍْ‎ = 3 3 = a ‏نع‎ ‎i N & ‏اي‎ ‎Vo KN N i & CL ‏بتشسس_سس تسسا ل‎ = ‏ب ل‎ ٍ : ‏شكل رقم ف‎ ‏التق الل‎ NMA BAW hav Wes : 3 " 3 : <3 3 1 3 ‏يحل با‎ ‏ا‎ 0 N : : Ses ‏ا‎ H . 0 ; 0 0 0 N 7 ‏م با«‎ pees) : 5 ® ht & ‏شكل رقم‎ ‏همأ‎
    SRLS . BOYER ‏لما هذا‎ BAM 0 ‏ف‎ ‏م‎ \ A J — <I
    0. To ) ‏ض‎ : : ‏ب ؟‎ : H { - & & 0 0 pr] 2 ‏م‎ ‎} ١ £ F & 7 . > * _ od ٠- ‏ض ل‎ 3 ber ‏بم‎ ‎51 ‏رقم‎ ‏ذا‎
    _ \ 7 «= ‏ليميالا لمعا متا لس ما‎ ‏ا‎ ‎1 ‘ ; i
    1 . ٠ ‏وا‎ i 2 Lo : * 8 oy 5 i : Lvs 8 ‏اا‎ H jog a a cad i. >< ‏ادح اللاو مات حت‎ FO B= = == . : H Ae : H H RN 3 vee ‏لاا‎ a Tras VORWEA LY SAYA Xe AVINTLOAVY ‏شكل تا‎ ‏ا‎ re 1 ¥ Noa : - : ‏ع‎ Fee - [3 FENN " .
    Re... ١ . By 4 3 | RRP . pee H Fron A wks SCN AER Do 3 3 a TOTTI TI VEYA VaR A ‏!جح ل تجا‎
    1 . N
    ET. ‏شكل ؟‎ tive
    ل ا : 34 . : - سس 3 ‎LA ١ 4 i‏ ‎FRE S|‏ لي ‎ER I Se ae‏ ‎Ee Sa .‏ لق سس ا ‎i H i‏ ا 3 ; : جم ‎SR iN‏ وان ور ‎I‏ ل يا ‎BRA SR IND A RR RE a‏ ال ‎HIS‏ ‏شكل ؟؟! من د ا أ م , | 2 ‎eid “© :‏ 2 ‎T ] i‏ ‎oo 1‏ الس حا 1 3 ‎R 1 1‏ 4 مم . > - اسن ‎St DU] ACN "7 1‏ ال ا ا شسكل لامب دما
    ‘ I ‏لاا نسي اي‎ ‏ب‎ -
    i! . ad : 5 31 : : & i ta } ‏ارد ع جور لكا‎ 0 : ‏لمجت مها بيع‎ ‏جز‎ 1 ik vill PY = ‏واج اسه سا ؟‎ S| N H td : 1 i ne, : H . rene pT, = ‏توا سار‎ ‏ل تح‎ L.A RA ‏وجرا‎ ١ ‏ذا تكح‎ ‏لشيس اا‎ Daw | > [EI - HY > 0 = : . Son . Trias 1 : . 2 § 3 . < : ّ 8 ‏اا الب‎ : 3 ‏الح‎ 1 H < > oer oe [J EN ag ‏ال‎ ‎ORIEIERRE 3 ‏الاي .ل‎ — ‏امت‎ ١ ‏متم‎ ١ ‏خا خا لطب‎ EPI N wi Sl tive
    الم ا اا اس : 4 ‘ لد ‎H -‏ . = ‎a 8 :‏ ‎Toa 4 : 0‏ ‎H 1‏ 4 2 ‎Fei a i‏ ‎eed Tw‏ ‎SR‏ . 579 : ا مل 3 : 3 7 :0 ‎١ 1 ¥ ,‏
    : . الج حب ‎ha :‏ 3“ 9 ‎Pate‏ ‎I Prana c‏ ‎Sa Seana‏ امف ع ل بارت خب 3 اطي ل لمحتا داك اا = دخ 3 ‎Ie 3‏ ‎BE) 0 8‏ ‎i‏ ‎Fa -‏ ‎SN N‏ أ 1 0 ]8[ ‎R 3‏ = ‎he 2a .‏ 0 3 3 ‎has H‏ اج ‎ae‏ ‏- ب اسح حا ‎SE =i SR‏ الع تحب ب 1 ا ا > لحك ‎١‏ كلاخ محم ا عر اج 8 شي > ‎El‏ ‏دي
    -١١76- 3 - ZV : 2 B . & 00 1 = 1 2 & a : Bo H 1 ‏حم لكت‎ 1 1 Ll : of Po HE acs Fe NAV EA YL 2A LAVIN OY Lay ‏لسك 5ج‎ ٍ ‏دي‎
    -١/ه-‎ ‏لتاق اي‎ MBAR ‏رما‎ tag ‏معجا‎ - : Tuow Yan + ‏دجولا‎ ‎= ea 3 LEE J N - fi XE +: ُّ * : > ) - ‏ب‎ 0 a N i ‏ب ّ با‎ = ‏لق‎ TN TARE SRR, 2 ‏م‎ » EY ad Jed Vas LoTR ‏الها لاد‎ “rey REESE Ras Ea Ra thes ‏د‎ . Fos 0 ; ‘ : ; Ber | , ; & : : p | 9 bey | 1 ٍْ N {ve 4 . . : i seed + = . . om 3 eM ‏نل لسلساة‎ 0 ‏يب‎ ‎LV ‏شكل رقم‎ ‏اب‎ EV aly ‏دما‎
    -\Vi- ree ROMA ‏امامت‎ BAVEY bana Yee 4 : Yoon . . ‏م‎ » 4 ; > fore : : 3 ‏إٍْ‎ : 0 ‏إٍْ جٍ‎ : : L%] Ke > i 0 8 fu TS [3 | rr ‏باجا ات‎ ‏اليب‎ ‎: Ey ‏ج‎ 5١ ‏رقم‎ Jed yoo oo 40 LOAM Wave wav We - ) ‏م‎ ٍْ ‘ 9 . = ‏يهلا‎ wd > N 8 2 H 5 5 S | £3 & 0
    1 . N 8 ٍ ;
    ] . 1 : . pe B 36 ‏شكل رقم‎ ‏ذا‎
    ٍ ابيع ‎١‏ رك « اط > ‎iin‏ ‎ae dE Ee :‏
    ‎a .‏ 1 ‎I 3 8‏ ومس د د ‎a‏ ‏اكد نا ل ل د ال ل ا
    1 . < اس 1 ‎A‏ 1 - 8 انا ‎LJ 5 ١‏ 3 3 ‎N Ba :‏ ‎H‏ ابن اص ا “ با عي : + الف ]= ‎Sar”‏ ب ‎Ly . 9 a‏ ‎To ETE‏ ) ‎AAA SE re‏ ‎dE : 0"‏ ‎Sect‏ ‏أ ‎EA ALI‏ وي ا ا د ل ا ل ‎BUN FS‏ ‎tive‏
    ‎EE‏ نا : 1 ‎Toad .‏ 1 : ٍْ 2 : نارم ‎wT 1‏ ‎J :‏ . 3 : المت 8 ‎Eh 2 2‏ جيه + ل : : 5 = هيا مي الب ‎Pa‏ ‎[REA . B‏ ‎SARA‏ اا 00 الما اماه ‎LLAYEY VLAN iA‏ دحا جه ‎EAS‏ ‏ب ‏سكسس مسسسببسسهاآتآ1 ‎Xa.‏ ‎v‏ * » ‎de, 1‏ : . و اسح ححص مي ‎TT emt‏ لتب ‎RE |‏ 5 ‎z H‏ ‎rT ~~‏ ‎ER‏ ‏سي ‏مليف ‎VAIN ١‏ اممف ؟ املف شكل ‎SEA‏ ‏دما
    -١4- LOMA MAY bavw ‏جيرج‎ ‏جاو‎ ; & Tena ~ : N > N ‏ا م‎ ‏جح‎ 2 50 Ll > 7 0 1 {£4 ‏رقم‎ Jed ones DOVER BAM BAW havi ‏ا 8 8 د وجول‎ ‏تا‎ xe > : : & of Sten * ‏ا‎ ‎A Yo“ Gree UO ‏لمسمسسسس‎ ‎£8 ‏اه‎ tex ‏رقم 8 لبا‎ Jed ‏دما‎
    _ \ A «= eee HONEA BOA BAY AYR i Wass 4 ْ * ‏م‎ 8 by > > ‏كم‎ ‏يريم‎ . 5 N EH i : $ 1 o ] ’ & & ‏ةا‎ i N . $ : : ’ N Os XX 4 : :
    i . i Fa + ‏ب‎ . 1 a & z £8 ‏رقم‎ Jed pees ‏الفلا‎ BOA GARY wav HEL : Yared © i = 1 : Seed N £ 1 3 0 i 0 + 1 08 J & 4 8 8 A El UU UU UE. - ‏شكل رقم 4 د‎ ‏دما‎
    أ فارع ٍ و27 ‎ACIRS BY .‏ ‎i‏ احا لامب
    ‎a. SS 7 3‏ ‎[ral SN 5 ٍ 0‏ ‎aa‏ 58 5 ميت : ا " 1 0 ‎Ne cll i‏ 3 : ‎SIU Se‏ نس تسسا ‎٠٠.١‏ ‏8 ف 0 اا ا ‎Sana‏ م ا ا م الاك ‎LLANE ١‏ زكر اها ‎BS‏ 7 ا نش ‎=e‏ ‎Yau ———‏ ‎١‏ : \ . ا 8 ‎LI LF‏ ‎AD A‏ ز حو »ب ‎y‏ ‏اد د : ل ان لاطا : ‎ERE fre‏ 0 = اك إلا 7 با ‎Saab EAT RANA YL ARI AYA‏ ‎SS‏ .دب ‎tive‏
    SUSU M H : .
    4 . . : H ¥ Ral . a : i R ‏و‎ : & ‏اه‎ 3 =o G Eee TRE ad al . ~. : ON ‏ولحت‎ . TSR ‏ا ا ا‎ as mney ‏كام ولأ‎ EATA ‏ب‎ AVEY Yaa ~~ RS or rt Wo Ta 5 ‏م‎ ‎١ ‎IEE
    ‎© . fe Veo . & ١ i § Fe oie > ‏انق “ته ممم‎ 7 Rai ‏لنت‎ - ee soll 01 ‏اتا ناا سسا ل م‎ Se ‏دا ل‎ ‏ا لجاب تجا‎ ‏م‎ ‏الي ميد‎ 7 1 CLEYEA LEAN YAY yy Lavy SF us 7 tive
    مدة سريان هذه البراءة عشرون سنة من تاريخ إيداع الطلب وذلك بشرط تسديد المقابل المالي السنوي للبراءة وعدم بطلانها أو سقوطها لمخالفتها لأي من أحكام نظام براءات الاختراع والتصميمات التخطيطية للدارات المتكاملة والأصناف النباتية والنماذج الصناعية أو لائحته التنفيذية صادرة عن مدينة الملك عبدالعزيز للعلوم والتقنية ؛ مكتب البراءات السعودي ص ب ‎TAT‏ الرياض 57؟؟١١‏ ¢ المملكة العربية السعودية بريد الكتروني: ‎patents @kacst.edu.sa‏
SA112340162A 2011-12-30 2012-12-30 جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه SA112340162B1 (ar)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161582138P 2011-12-30 2011-12-30
US201261617252P 2012-03-29 2012-03-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SA112340162B1 true SA112340162B1 (ar) 2016-02-22

Family

ID=48698500

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SA112340162A SA112340162B1 (ar) 2011-12-30 2012-12-30 جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه

Country Status (16)

Country Link
US (1) US9422569B2 (ar)
EP (1) EP2797406B1 (ar)
JP (1) JP6220794B2 (ar)
KR (1) KR20140107334A (ar)
CN (1) CN104135851B (ar)
AR (1) AR089510A1 (ar)
AU (1) AU2012363062B2 (ar)
BR (1) BR112014014037B8 (ar)
CA (1) CA2855902C (ar)
HK (1) HK1201121A1 (ar)
IL (1) IL233452A0 (ar)
RU (1) RU2639538C2 (ar)
SA (1) SA112340162B1 (ar)
TW (1) TWI601739B (ar)
WO (1) WO2013101343A1 (ar)
ZA (1) ZA201402992B (ar)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR102014021330A2 (pt) 2013-08-30 2015-09-22 Dow Agrosciences Llc construtos para expressão de transgenes usando elementos reguladores de genes de ubiquitina de panicum
TW201527313A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（二）
TW201527314A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）
TW201527312A (zh) 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（一）
TW201527316A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（五）
TW201619386A (zh) * 2014-11-11 2016-06-01 陶氏農業科學公司 合成性雙向植物啓動子
AR102612A1 (es) * 2014-11-11 2017-03-15 Dow Agrosciences Llc Promotor vegetal bidireccional sintético
US10563220B2 (en) * 2015-12-21 2020-02-18 Monsanto Technology Llc Compositions and methods for efficient targeting of transgenes
CN105624163B (zh) * 2016-04-06 2018-07-06 中国农业科学院生物技术研究所 一种来源于棉花的双向启动子及其应用
CN106676107B (zh) * 2016-04-28 2019-04-05 华中农业大学 水稻内源双向表达启动子的分离克隆及功能分析

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5750866A (en) * 1994-09-08 1998-05-12 American Cyanamid Company AHAS promoter useful for expression of introduced genes in plants
US6072050A (en) 1996-06-11 2000-06-06 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Synthetic promoters
US6388170B1 (en) 2000-04-07 2002-05-14 University Of Kentucky Research Foundation Bidirectional promoters and methods related thereto
EP1360310A2 (en) 2001-02-13 2003-11-12 University Of Florida A bi-directional dual promoter complex with enhanced promoter activity for transgene expression in eukaryotes
AU2004267161B2 (en) 2003-07-22 2009-10-29 Sungene Gmbh & Co. Kgaa Expression cassettes for the bi-directional transgenic expression of nucleic acids in plants
US8344211B2 (en) 2008-08-13 2013-01-01 Ceres, Inc. Plant nucleotide sequences and corresponding polypeptides
CN1886510B (zh) * 2003-12-31 2011-04-06 科学与工业研究委员会 用于基因表达活化的人工双向启动子
US7235652B2 (en) 2004-03-31 2007-06-26 Council Of Scientific And Industrial Research Artificial bidirectional promoter for activation of gene expression
WO2006005023A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 Ceres Inc. Promoter, promoter control elements and combinations, and uses thereof
WO2006013072A2 (en) * 2004-08-02 2006-02-09 Basf Plant Science Gmbh Method for isolation of transcription termination sequences
AU2006274964A1 (en) * 2005-07-27 2007-02-08 Basf Plant Science Gmbh Selection system for maize transformation
TWI361220B (en) 2005-08-02 2012-04-01 Univ Nat Taiwan A plant shsp gene bi-directional promoter and uses thereof
CN101351555A (zh) * 2005-09-13 2009-01-21 巴斯福植物科学有限公司 用于小麦的新选择系统
EP2205749B1 (en) * 2007-09-27 2016-05-18 Dow AgroSciences LLC Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes
CN102439156A (zh) * 2008-12-17 2012-05-02 巴斯夫植物科学有限公司 来自玉米的双向启动子
JP2013526832A (ja) 2009-08-19 2013-06-27 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー Ａａｄ−１イベントｄａｓ−４０２７８−９、関連するトランスジェニックトウモロコシ系統およびそのイベント特異的同定
EP2385129A1 (en) * 2010-05-03 2011-11-09 BASF Plant Science Company GmbH Enhanced methods for gene regulation in plants
CA2798941A1 (en) * 2010-06-09 2011-12-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Regulatory sequences for modulating transgene expression in plants
KR20140109909A (ko) * 2011-12-30 2014-09-16 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 합성 양방향성 ｓｃｂｖ 식물 프로모터를 위한 방법 및 구축물

Also Published As

Publication number Publication date
EP2797406A1 (en) 2014-11-05
CA2855902A1 (en) 2013-07-04
ZA201402992B (en) 2015-11-25
RU2639538C2 (ru) 2017-12-21
EP2797406B1 (en) 2020-01-08
AU2012363062A1 (en) 2014-05-15
EP2797406A4 (en) 2015-07-15
IL233452A0 (en) 2014-08-31
AR089510A1 (es) 2014-08-27
CN104135851B (zh) 2018-05-01
RU2014131448A (ru) 2016-02-20
US9422569B2 (en) 2016-08-23
BR112014014037A2 (pt) 2020-11-03
BR112014014037B1 (pt) 2022-06-21
CA2855902C (en) 2022-06-21
US20130254943A1 (en) 2013-09-26
JP2015503342A (ja) 2015-02-02
JP6220794B2 (ja) 2017-10-25
HK1201121A1 (en) 2015-08-28
AU2012363062B2 (en) 2018-04-12
KR20140107334A (ko) 2014-09-04
CN104135851A (zh) 2014-11-05
BR112014014037B8 (pt) 2023-05-16
WO2013101343A1 (en) 2013-07-04
TW201329097A (zh) 2013-07-16
TWI601739B (zh) 2017-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SA112340162B1 (ar) جزء منشأ وطريقة لمعزز النبات ubi1 التصنيعي ثنائي الاتجاه
Charon et al. enod40 induces dedifferentiation and division of root cortical cells in legumes
AU2017203177B2 (en) Constructs for expressing transgenes using regulatory elements from Setaria ubiquitin genes
DeYoung et al. The CLAVATA1‐related BAM1, BAM2 and BAM3 receptor kinase‐like proteins are required for meristem function in Arabidopsis
Yoon et al. Transgenic study of parallelism in plant morphological evolution
Schaker et al. RNAseq transcriptional profiling following whip development in sugarcane smut disease
Chen et al. Evolutionary and molecular analysis of D of transcription factors identified a conserved motif for intercellular protein trafficking
AU2019246914A1 (en) Plant regulatory elements and uses thereof
KR20080083145A (ko) 구성적 식물 프로모터
SA112340163B1 (ar) طريقة وجزء منشأ لمعزز النبات scbv التخليقي ثنائي الاتجاه
Yoro et al. PLENTY, a hydroxyproline O-arabinosyltransferase, negatively regulates root nodule symbiosis in Lotus japonicus
Royo et al. Two maize END-1 orthologs, BETL9 and BETL9like, are transcribed in a non-overlapping spatial pattern on the outer surface of the developing endosperm
US20230203522A1 (en) Compositions and methods for expressing transgenes using regulatory elements from chlorophyll binding ab genes
Luo et al. The MYB family transcription factor TuODORANT1 from Triticum urartu and the homolog TaODORANT1 from Triticum aestivum inhibit seed storage protein synthesis in wheat
Zhang et al. Genome-wide identification, characterization and expression analysis of TCP transcription factors in Petunia
Yang et al. GRP23 plays a core role in E-type editosomes via interacting with MORFs and atypical PPR-DYWs in Arabidopsis mitochondria
Barrell et al. Minimal T-DNA vectors suitable for agricultural deployment of transgenic plants
CN103255165B (zh) Soar1蛋白及其编码基因在调控植物抗逆境胁迫中的应用
Ma et al. GmTNRP1, associated with rhizobial type‐III effector NopT, regulates nitrogenase activity in the nodules of soybean (Glycine max)
CN103232536B (zh) Soar1蛋白及其编码基因在调控植物对aba耐受性中的应用
Zhang et al. Functional conservation and divergence of five AP1/FUL-like genes in marigold (Tagetes erecta L.)
Sun et al. TsMIP6 enhances the tolerance of transgenic rice to salt stress and interacts with target proteins
Xiao et al. SiPLATZ12 transcript factor regulates multiple yield traits and salt tolerance in foxtail millet (Setaria italica)
EP2363465A1 (en) Transgenic plant of which seed has enlarged size
Atif Dissecting the factors controlling seed development in the model legume Medicago truncatula