CN101351555A - 用于小麦的新选择系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于D－丙氨酸选择或D－丝氨酸选择，用于将DNA引入小麦植物基因组的改进的方法。优选地，转化由农杆菌介导。

Description

用于小麦的新选择系统
发明背景
发明领域
本发明涉及基于D-丙氨酸选择或D-丝氨酸选择的用于将DNA引入小麦植物基因组的改进的方法。优选地，转化由农杆菌属(Agrobacterium)介导。
对相关技术的描述
在过去十年间，已经有可能通过重组DNA技术将来自众多种类生物的基因转移至作物植物。这种进步为改善植物对害虫、疾病和除草剂的抗性，和改变生物合成过程以改变植物产物的品质提供了巨大机会。已有众多旨在转化单子叶植物的方法得到尝试。“生物射弹法”是应用最广泛的转化方法之一。在“生物射弹”(微轰击粒子介导的DNA递送)方法中，微轰击粒子以DNA包被并通过机械装置加速到如此速度，其高到足以穿透植物细胞壁和细胞核(WO91/02071)。外源DNA被引入宿主DNA并且产生转化细胞。存在“生物射弹”方法的众多改变方法(Sanford 1990；Fromm1990；Christou 1988；Sautter 1991)。
尽管在双子叶植物中广泛使用，然而农杆菌介导的基因转移在改造用于单子叶植物中时，常常令人失望，但是近来已经对单子叶植物采用该方法(Ishida等1996；WO95/06722；EP-A1672752；EP-A10709462)。
对于小麦转化，使用微轰击粒子轰击法已经在数十年间由数位作者报道(Vasil等1992，1993，Zhou等1993；Becker等1994、Nehra等1994、Zhou等1995、Altpeter等1996、Ortiz等1996、Lazzeri等1997、Barro等1998、Witrzens等1998、Cheng等1998、Bliffeld等1999、Uze等1999、Srivastava等1999、Rasco-Gaunt等2001、Varshney和Altpeter 2001、Huber等2002、Pellegrineshi等2002、Rasco-Grunt等2003、Patniaik和Khurana 2004)。在全部这些实验中，采用基于除草剂的选择作用。
主要使用编码膦丝菌素-N-乙酰转移酶(PAT)的两种基因pat和bar来在转基因小麦植物中产生对PPT(草铵膦)的耐受性。bar和pat基因赋予对除草剂双丙氨膦和Basta的抗性(Thomson等1987；Wohlleben等1988)。其它两种除草剂抗性基因是CP4和GOX(编码来自节杆菌(Achrobacter sp.)的草甘膦氧化还原酶；Barry等1992和Kishore等1992)。CP4和GOX均通过将草甘膦转变成对物细胞无毒的氨甲基膦酸而使草甘膦脱毒。这两种基因赋予对草甘膦的抗性并且它们也用于选择转基因小麦植物(Zhou等1995)，其中所述草甘膦为除草剂中象Roundup的一种活性化合物(US6,689,880)。
有效作为抗生素抗性的来源并作为转基因植物的选择性标记基因所用的全部基因均具有细菌性起源，即大肠杆菌(Echerichia coli)Tn5转座子(Fraley等1983，Waldron等1985)。氨基糖甙类抗生素包括对植物、真菌和动物细胞有毒的多种分子(例如卡那霉素、新霉素、庆大霉素、衍生物G418和巴龙霉素)(Nap等1992)。证实细菌的新霉素磷酸转移酶II(nptII)可有效在碧冬茄属(petunia)和烟草属(tobacco)中作为选择性标记基因(Bevan等1983，Herrera-Estrella等1983)并且受遗传霉素G418选择的首个小麦转基因植物由Nehra等(1994)获得。大肠杆菌hpt基因(编码潮霉素磷酸转移酶)有效地作为选择性标记基因用于稳定转化小麦(Ortiz等1996)。用nptII及bar基因转化普通小麦(Triticum aestivum L.)及硬粒小麦(T.turgidum ssp.durum Desf.)以及对抗生素和除草剂选择的应用近来得到发表(Goodwin等2005)。Freeman和Bowden(1998)使用修饰的磺酰胺(DHPS)抗性基因在小麦中作为选择标记。另一种在小麦转化中所用的选择剂是氨甲蝶呤，它以二氢叶酸还原酶(DHFR)为靶。产生氨甲蝶呤抗性的dhfr基因已经得到鉴定并且在小麦转化实验中作为选择性标记基因使用(Kemper等1992)。氨腈水合酶(来自土壤真菌疣孢漆斑菌(Myrotheciumverracaria)的基因产物，将氨腈转变成脲)在转基因小麦细胞中赋予对氨腈的抗性(Week 2005；US6,268,547)。
在九十年代早期发表了使用小穗(Hess等1990)、叶鞘基(Deng等1990)或不成熟胚(Mooney等1991)，通过农杆菌介导的转化方法转化小麦的数个尝试，但是仅得到数个抗卡那霉素的愈伤组织集落。导致转基因小麦植物产生的方法由Cheng等(1997)发表并且以nptII作为选择标记基因。产生高水平渗透保护剂脯氨酸的转基因小麦植物基于卡那霉素上选择(Sawahel和Hassan 2002)并且Przetakiewitcz等(2004)使用卡那霉素以及用作为选择化合物的PPT进行bar选择。公开了改良的转化方法，如采用某些物理因子如农杆菌感染后的植物组织脱水(Cheng等2003)。应用基于通过农杆菌介导的转化导入CP4基因和bar基因的除草剂选择作用并且已经使用选择性底物如草甘膦(Hu等2003)或PPT(Iser等1999，Khana和Daggar 2003，Wu等2003)来选择转基因小麦植物。描述了使用ahas基因的玉米(maize)XI12突变体的抗咪唑啉酮除草剂的小麦植物(美国专利6,653,529)。影响农杆菌介导的转化的数个因素受到评估(Cheng等2004)。小麦转化方面的最新进展由Sahravat等(2003)和Jones(2005)综述。
近来报道基于D-氨基酸的新选择系统并且证明它在拟南芥(Arabidopsis)中是有效的(WO03/060133；Erikson等2004)。迄今在单子叶植物如小麦中未见该系统的使用或采纳。
以多于一种的构建体多重依次转化小麦植物(这对某些更复杂的高价值的性状以及对于基因堆叠是必需的)是复杂的，原因在于可获得的合适选择标记是有限的。此情况日益变得严峻，因为抗生素抗性标记(如潮霉素抗性或卡那霉素抗性)由于严厉的管理要求和环境顾虑变得较不适合选用。因此用于小麦的选择系统基本上限于bar选择系统。
因此，本发明的目的是提供基于D-氨基酸选择的用于转化小麦植物的改良、高效的方法。此目的通过本发明得以实现。
发明简述
本发明的第一实施方案涉及用于产生转基因小麦植物的方法，包括步骤
a.向小麦细胞或组织导入包含至少一种第一表达构建体的DNA构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b.将步骤a)的所述小麦细胞或组织在包含总浓度约3mM至约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物的选择培养基上孵育至少5天时间(优选至少14天)，和
c.转移步骤b)的所述小麦细胞或组织至再生培养基并且再生和选择包含所述DNA构建体的小麦植物。
在一个优选的实施方案中，导入所述的小麦细胞或组织中的DNA构建体还包含赋予该小麦植物有农学价值的性状的至少一种第二表达构建体。然而其它基因(例如报道基因)也可以与用于表达能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶(即选择性标记)的表达盒组合而转化至小麦植物。
优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.18)，D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)。更优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.18)和D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)。对于本发明方法甚至更优选的能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，和
ii)具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：2编码的序列具有至少80％同一性的酶，和
iii)由能够与SEQ ID NO：1所示序列的互补物杂交的核酸序列所编码的酶，
并且其中选择是在包含浓度约3mM至约100mM的D-丝氨酸的培养基上进行的。
对于本发明方法还更优选的能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：4编码的瘦弱红酵母(Rhodotorula Gracilis)D-氨基酸氧化酶，和
ii)具有相同的酶活性并且与SEQ ID NO：4编码的序列具有至少80％同一性的酶，和
iii)由能够与SEQ ID NO：3所示序列的互补物杂交的核酸序列所编码的酶，
并且其中选择在包含总浓度约3mM至约100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
在所述小麦植物中有活性的启动子优选是遍在蛋白启动子，更优选单子叶植物的遍在蛋白启动子，最优选玉米遍在蛋白启动子。甚至更优选地，遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：5所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：5所示序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列具有至少60％同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性。
由SEQ ID NO：5描述的序列是玉米遍在蛋白启动子的核心启动子。在一个优选的实施方案中，启动子区域和5’-非翻译区和/或内含子均用作转录调节序列。更优选使用跨越玉米遍在蛋白基因的启动子、5’-非翻译区和第一内含子的区域，甚至更优选使用由SEQ ID NO：6所描述的区域。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明方法中所用的遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：6所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：6所述序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所述序列具有至少60％同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所述序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤b)的选择使用约3mM至约15mM的D-丙氨酸或约3mM至约30mM的D-丝氨酸进行。在去分化条件下的总选择时间是约3周至4周。
更优选地，步骤b)的选择以两个步骤进行，使用第一选择步骤持续约14至约20日，随后转移存活的细胞或组织至与第一选择培养基具有基本上相同组分的第二选择培养基中持续额外的约14至约20日。
可以采用多种方法来将本发明的DNA构建体导入玉米植物。优选地，所述DNA构建体的导入由选自根瘤菌科(Rhizobiaceae)介导的转化法和粒子轰击介导的转化法的方法介导。更优选地，转化由选自卸甲的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogene)细菌菌株的根瘤菌科细菌介导。在另一个优选的实施方案，土源性细菌是发根农杆菌菌株K599(NCPPB2659)的卸甲菌株变体。此类菌株在2004年9月2日提交的美国临时专利申请号60/606789中描述，该文献在本文中完整地引用作为参考。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的方法包括如下步骤
a.分离小麦植物的不成熟胚，和
b.将未受去分化处理的所述分离的不成熟胚与属于根瘤菌科的包含至少一种转基因T-DNA的细菌共培养，所述的T-DNA包含至少一种第一表达构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
c.转移已共培养的不成熟胚至恢复培养基，所述的恢复培养基缺少毒害植物有效量的D-丝氨酸或D-丙氨酸，和
d.在培养基上诱导胚发生愈伤组织的形成并且选择转基因愈伤组织，其中该培养基包含
i)有效量的至少一种植物生长素化合物，和
ii)总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，和
e.自所述转基因愈伤组织再生并选择含有转基因T-DNA的植物。
在一个优选的实施方案中，T-DNA还包含赋予所述小麦植物有农学价值的性状的至少一种第二表达构建体。
在所述优选的方法中，步骤d)的选择使用约3mM至约15mM的D-丙氨酸或约3mM至约30mM的D-丝氨酸进行。更优选地，步骤d)的选择以两个步骤进行，使用第一选择步骤持续约14至20日，随后转移存活的细胞或组织至与第一选择培养基具有基本上相同组分的第二选择培养基中持续额外的约14至约20日。
再生步骤e)中所用的培养基优选地包含：
i)有效量的至少一种细胞分裂素化合物，和/或
ii)总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
在步骤c)的所述优选的恢复培养基中，植物生长素化合物的有效量优选地等同于浓度约0.2mg/l至约6mg/l的2，4-D。
实际上，任何小麦植物均可以充当用于转化的靶材料的来源。优选地，所述的小麦植物、不成熟胚、细胞或组织来自于选自小麦属(Triticum)植物中的植物。更优选地，所述的小麦细胞或组织或所述的不成熟胚来自(例如分离自)选自小麦属的植物物种：普通小麦(T.aestivum)、硬粒小麦(T.durum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、双粒小麦(Triticum dicoccum)(Emmer小麦)、圆柱小麦(Triticum turgidum)和一粒小麦(Triticummonococcum)(Einkorn小麦)。
本发明的方法(尤其当与D-氨基酸氧化酶一起使用时)可以有利地与利用D-氨基酸氧化酶的双功能特性的标记切除技术联合。因此，本发明的一个实施方案涉及这样的方法，该方法包括步骤：
i)将小麦植物细胞用第一DNA构建体转化，其中第一DNA构建体包含
a)至少一种第一表达构建体，其包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述的第一表达盒的侧翼为允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，和
b)适用于赋予所述植物农学上有价值的性状的至少一种第二表达盒，其中所述第二表达盒不位于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述序列间，以及
ii)将步骤i)的所述已转化的小麦植物细胞以毒害植物浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一化合物处理并且选择这样的植物细胞，在其基因组中包含所述第一DNA构建体，并通过所述D-氨基酸氧化酶的表达而赋予所述经转化植物细胞对所述第一化合物的抗性，和
iii)诱导从所述经转化植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒并且将所述的植物细胞用如此浓度的选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物处理，其中所述浓度对仍含有所述第一表达盒的植物细胞有毒，从而选择出包含所述第二表达盒而缺少所述第一表达盒的植物细胞。
在小麦植物中有活性的启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。
本发明的另一个实施方案涉及这样的小麦植物或细胞，其包含在所述小麦植物或细胞中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，其中该启动子相对于所述编码酶的序列是异源性的。优选地，启动子和/或能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文定义。更优选地，小麦植物还包含赋予所述小麦植物农学上有价值性状的至少一种第二表达构建体。在一个优选的实施方案中，小麦植物选自小麦属的植物。更优选来自小麦属的植物物种：普通小麦(T.aestivum)、硬粒小麦(T.durum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、双粒小麦(Emmer小麦)、圆柱小麦和一粒小麦(Einkorn小麦)，最优选地来自普通小麦的品种。本发明的其它施方案涉及本发明小麦植物的部分、器官、细胞、果实和其它繁殖材料。优选的部分是选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养体部分。
本发明的方法和组合物可以有利地在基因堆叠方法(gene stackingapproaches)(即用于依次多重转化(subsequent multiple transformation))中使用。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含至少一种表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用包含第二选择标记基因的第二构建体进行转化，其中所述第二选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地所述的第二标记基因赋予对选自草铵膦、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。在小麦植物中有活性的启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。
还包含由此方法提供的小麦植物，因此，另一个实施方案涉及小麦植物，该小麦植物包含
a)第一表达构建体，其包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用于选择标记基因的第二构建体，其中所述选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
此外，下文中提供的dsdA基因和dao基因也可以在依次转化(subsequent transformation)中使用。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，该表达构建体包含植物启动子和与其有效连接的编码dsdA酶(D-丝氨酸脱水酶)的核酸序列，和用D-丝氨酸选择，以及
b)用第二构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，该表达构建体包含植物启动子和与其有效连接的编码dao酶(D-氨基酸氧化酶)的核酸序列，和用D-丙氨酸选择。
在小麦植物中有活性的启动子和/或D-氨基酸氧化酶如上文定义。本发明的其它目标涉及小麦的春季型、冬季型及备选型的模式种和原种。优选的部分选自组织、细胞、花粉、胚珠、小孢子、花序、根、叶、种子和分生组织。
附图简述
图1含有dsdA基因的构建体：pRLM167。
图2含有dsdA基因的构建体：
I)pRLM166
II)pRLM179
III)pRLM151
图3含有Dao1基因的构建体：
I)pRLM205 dao1original
II)pRLM226 dao1/ko
图4dsdA基因的表达测定为T1不成熟胚在含D-丝氨酸的培养基上的萌发：
I)T1转基因及非转基因体外幼苗的分离
II)T1 dsdA转基因幼苗在选择下的生根。与转基因植物对比，非转基因性分离子以白色圈标记。
图5带dsdA/PAT基因的转基因植物具有正常的表型、旺盛的生长和完整的种子结实(full seed set)
图6A-B在含有不同浓度D-丝氨酸或D-丙氨酸的培养基上的再生(杀伤曲线(killing curves))：
I)在D-丝氨酸上的Canon
II)在D-丝氨酸上的BW-56
III)在D-丙氨酸上的BW-56
图7Canon植物在含D-丝氨酸的培养基上的生根和生长(杀伤曲线)
图8非转基因的不成熟胚在含D-丝氨酸的培养基上的萌发(杀伤曲线)
图9持续选择压力(5mM D-丝氨酸)下生根的转基因植物
图10由pScBV启动子驱动的gusINT基因在胚乳、不成熟胚、叶、根和花药中的表达
图11D-异亮氨酸对T1 dao1转基因幼苗和非转基因植物的负选择作用
图12对具有dsdA基因的转基因小麦植物的DNA印迹分析：
I)具有pRLM166的转化体。基因组DNA用EcoRV消化并且与dsdA基因的847bp片段杂交。泳道：(1-3)转基因性T0和T1事件4；(4-5)转基因的T0和T1事件5；(6-8)转基因的T0和T1事件6；(9-11)转基因T0植物314、313、315；(12)转基因T0植物242；(13)转基因T0植物244；(14))转基因T0植物250；(C)Canon非转基因植物；(M)λHindIII。
II)具有pRLM151的转化体。基因组DNA用BamHI消化并且与dsdA基因的847bp片段杂交。泳道：(M)λHindIII；(1-2)转基因的T0和T1事件385；(3-4)转基因的T0和T1事件406；(C)Canon非转基因植物
III)具有pRLM179并在D-丝氨酸上受到选择的转化体。基因组DNA用BamHI消化并且与dsdA基因的847bp片段杂交。泳道：(M)λHindIII；(1-5)转基因的T0和T1事件2258；(6-10)转基因的T0和T1事件2256；(11-15)转基因的T0和T1事件2263；(C)Canon非转基因植物
图13对具有dao1的转基因小麦植物的DNA印迹分析：
具有pRLM205的转化体。基因组DNA用BamHI消化并且与gus基因的1156bp片段杂交。泳道：(M)λHindIII；(1-3)转基因的T0和T1事件51；(5-6)转基因的T0和T1事件52；(7-9)转基因的T0和T1事件91；(10-12)转基因的T0和T1事件26；(13-14)转基因的T1事件9；(C)Canon非转基因植物
图14在19个转基因品系中的D-丝氨酸脱氨酶活性。DSD活性由所产生丙酮酸mM/mg/h定义。作为对照：C-Canon；VC05-载体对照bar转基因植物以及DAO1-具有dao1基因的转基因植物
图15D-丝氨酸对水栽中(in hydroponics)培育的转基因植物和非转基因植物的影响测定为14日龄幼苗的dray小麦(dray wheat；DW)：
I)来自事件2256、2258和2263的转基因dsdA/ahas T2子代；
II)来自如下事件：(1)Canon；(2)事件1；(3)事件3；(4)事件4；(5)事件15的转基因的dsdA/gus和dsdA/pat T2子代。
一般定义
国际专利申请WO03/004659(用于从真核生物基因组去除核酸序列的重组系统和方法)、WO03/060133(用D-氨基酸选择植物生长)、国际专利申请PCT/EP 2005/002735、国际专利申请PCT/EP 2005/002734、2004年9月23日提交的美国临时专利申请号60/612,432中所采用和描述的教授内容、方法、序列等因而引用作为参考。
应当理解本发明不受如所述的具体方法学、方案、细胞系、植物物种和植物属、构建体和试剂限制。还应当理解本文中所用术语的目的仅在于描述实施方案，和不意图限制本发明的范围，其中本发明仅受后附的权利要求书限制。必须指出如本文中所用及在后附的权利要求书中，单数形式“一”和“该”包括复数指称，除非上下文清楚地说明。因此，对一个载体的指称是对一个和多个载体的称谓并且包括本领域技术人员已知的其等效物等。
术语“约”用于本文中来意指大致、大体、左右和在范围内。当术语“约”与数字范围一起使用时，它通过使界限延伸高于及低于该数字值而修饰此范围。通常，术语“约”用于本文中以高于及低于一个数字值达20％、优选10％、更优选5％上下(更高或更低)的变化而修饰该数字值。
如本文中所用，用语“或”意指特定列中的任一成员并包括该列成员的任意组合。
“农学上有价值的性状”包括植物生物体(包括植物部分和植物产物)对食物生产或食物产品有用或有利的任何表型。还包括非食物的农业产物，如纸等。农学上有价值的性状的部分列项包括病虫害抗性、生活力、发育时间(收获时间)、增加的营养物含量、新生长模式、风味或颜色、耐盐性、耐热性、耐干旱性和耐寒性等。优选地，农学上有价值的性状不包括选择性标记基因(例如仅用于促进检测或选择转化细胞的编码除草剂抗性或抗生素抗性的基因)、导致产生植物激素(例如仅用于选择的植物生长素、赤霉酸、细胞分裂素、脱落酸和乙烯)的激素生物合成基因或报道基因(例如萤光素酶、葡糖醛酸糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT等)。此类农学上有价值的重要性状可以包括改善病虫害抗性(例如Melchers 2000)、生活力、发育时间(收获时间)、增加的营养物含量、新生长模式、风味或颜色、耐盐性、耐热性、耐干旱性和耐寒性(例如Sakamoto 2000；Saijo 2000；Yeo 2000；Cushman 2000)等。技术人员知道存在从其中选择旨在赋予这些性状及农学上有价值的其它性状的众多多核苷酸。
如本文中所用，术语“氨基酸序列”指代表氨基酸残基的缩写、字母、字符和词汇的描述。氨基酸可以在本文中由它们通常已知的三字母符号或由UPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号提及。类似地，核苷酸可以通常所接受的单字母编码提及。本文中所用的缩写是氨基酸的常规单字母编码：A，丙氨酸；B，天冬酰胺或天冬氨酸；C，半胱氨酸；D，天冬氨酸；E，谷氨酸；F，苯丙氨酸；G，甘氨酸；H，组氨酸；I，异亮氨酸；K，赖氨酸；L，亮氨酸；M，甲硫氨酸；N，天冬酰胺；P，脯氨酸；Q，谷氨酰胺；R，精氨酸；S，丝氨酸；T，苏氨酸；V，缬氨酸；W，色氨酸；Y，酪氨酸；Z，谷氨酰胺或谷氨酸(见L.Stryer，Biochemistry，1988，W.H.Freeman和Company，纽约，本文在氨基酸序列中所用的字母“x”可以代表任何氨基酸残基。
术语“核酸”指处于单链或双链、有义或反义形式的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其聚合物或杂交体。
短语“核酸序列”如本文中所用指代表核苷酸的缩写、字母、字符或词汇的连续描述。在一个实施方案中，核酸可以是作为相对短的核酸的“探针”，通常小于100个核苷酸长度。核酸探针往往是约50个核苷酸长度至约10个核苷酸长度。核酸的“靶区域”是核酸中作为目的受到鉴定的部分。核酸的“编码区”是核酸的部分，当将该部分置于合适的调节序列控制下时，它以序列特异性方式受到转录并翻译产生特定的多肽或蛋白质。称该编码区编码此多肽或此蛋白质。除非另外说明，具体核酸序列还暗含它的保守性修饰变体(例如简并密码子替换)和互补序列，以及清晰予以说明的序列。术语“核酸”在本文中可与“基因”、“cDNA”、“mRNA”、“寡核苷酸”和“多核苷酸”交换使用。
术语“目的核苷酸序列”指任何核苷酸序列，其中对所述核苷酸序列操作可以因本领域普通技术人员所认为的任何原因(例如赋予改良的品质)而需要。此类核苷酸序列包括，但不限于结构基因(例如报道基因、选择标记基因、癌基因、抗药基因、生长因子等)的编码序列和不编码mRNA或蛋白质产物的非编码的调节序列(例如启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。目的核酸序列可以优选地编码农学上有价值的性状。
术语“反义”理解为意指具有与靶序列互补的序列的核酸，例如信使RNA(mRNA)序列，其中通过与靶序列杂交而设法启动对所述信使RNA序列表达的阻断。
术语“有义”理解为意指具有与靶序列同源或同一的序列的核酸，例如与蛋白质转录因子结合并且参与给定基因表达的序列。根据优选的实施方案，核酸包含目的基因和允许所述目的基因表达的元件。
如本文中所用，使用术语“互补的”或“互补性”指通过碱基配对原则建立联系的核苷酸序列。例如序列5′-AGT-3′与序列5′-ACT-3′互补。互补性可以是“部分的”或“完全的”。“部分”互补性是其中一个或多个核酸碱基没有根据碱基配对原则匹配的情况。核酸间的“完全”或“完整”互补性是其中每个核酸碱基在碱基配对原则下与另一个核酸碱基匹配的情况。核酸链间的互补程度对核酸链间杂交的效率和强度有明显影响。核酸序列的“互补物”如本文中所用指这样的核苷酸序列，其相应的核酸对于所述核酸序列的核酸显示完全互补性。
术语“基因组”或“基因组DNA”是宿主生物的可遗传信息。所述的基因组DNA包含胞核DNA(也称作染色体DNA)以及质体(例如叶绿体)和其它细胞器(例如线粒体)的DNA。优选地，术语“基因组或基因组DNA”指胞核的染色体DNA。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA-序列”应当理解为与细胞周期状态无关的细胞核的基因组DNA。染色体DNA因此可以在染色体或染色单体中被组织，它们可以是压缩的或解螺旋状的。对染色体DNA的插入可以通过本领域已知的多种方法加以证实并分析，例如聚合酶链反应(PCR)分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
优选地，在谈及核酸时使用的术语“分离的”(如在“分离的核酸序列”中使用)指受到鉴定并与至少一种杂质核酸分开的核酸序列，其中该核酸序列通常在其天然来源中与所述杂质核酸相结合。分离的核酸是在如此形式或环境中存在的核酸，其中所述的形式或环境与该核酸在自然界中存在的形式或环境不同。相反，未分离的核酸是以其在自然界中存在的状态下被发现的核酸，如DNA和RNA。例如，给定的DNA序列(例如基因)在宿主细胞染色体上接近毗邻的基因处存在；RNA序列，如编码特定蛋白质的特定mRNA序列，在细胞中作为与编码多种蛋白质的众多其它mRNA混合在一起的混合物而存在。然而，包含SEQ ID NO：1的分离的核酸序列包括例如在通常含有SEQ ID NO：1的细胞中的如此核酸序列，其中该核酸序列所处的染色体位置或染色体外位置与天然细胞的染色体位置或染色体外位置不同，或在侧翼还具有与自然界中存在的核酸序列不同的核酸序列。分离的核酸序列可以以单链形式或双链形式存在。当分离的核酸序列用于表达蛋白质时，核酸序列将最低程度地含有至少部分的有义链或编码链(即核酸序列可以是单链的)。或者，它可以含有有义链和反义链这两者(即核酸序列可以是双链的)。
如本文中所用，术语“纯化的”指从其天然环境中移出、分离或分开的分子，为核酸序列或氨基酸序列。“分离的核酸序列”因此是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％、优选至少75％、并且更优选至少90％地与其它成分分开，其中所述的其它成分与所述分子天然地结合。
“多核苷酸构建体”指至少部分地通过重组方法产生的核酸。术语“DNA构建体”指由脱氧核糖核苷酸组成的多核苷酸构建体。构建体可以是单链的或优选是双链的。构建体可以环形的或线形的。技术人员熟悉获得一种DNA构建体的多种途径。构建体可以可以借助如在例如Maniatis1989、Silhavy 1984并在Ausubel 1987中描述的常见重组和克隆技术制备。
术语“野生型”、“天然的”或“天然来源的”意指相对于生物、多肽或核酸序列而言，所述的生物没有被人予以改变、突变或其它操作的至少一种天然存在的生物中是天然存在的或是可得到的。
术语“外源基因”指任何核酸(例如基因序列)，此核酸由实验操作导入细胞基因组并且可以包括存在于该细胞中的基因序列，只要所导入基因相对于天然存在的基因而含有某种修饰(例如点突变、存在选择性标记基因等)。
术语“异源的核酸序列”或“异源的DNA”可交换地用来指与核酸序列连接或受到操作而与之连接的核苷酸序列，其中所述的核酸序列在自然界中与所述核苷酸序列不连接或在自然界中与所述核苷酸序列在不同的位置处连接。异源的DNA对于导入它的细胞而言不是内源的，但是它已经从另一种细胞中获得。通常，尽管不是必需，此类异源的DNA编码正常情况下细胞所不产生的RNA和蛋白质，其中所述的细胞表达所述RNA和蛋白质。如果所述的两类序列在其天然环境下不连接或以不同方式有效连接，则启动子、转录调节序列或其它遗传元件相对于(例如编码标记序列或农学相关性性状的)其它序列认为是“异源的”。优选地，所述序列在其天然环境下不是有效连接的(即来自不同基因)。最优选地，所述调节序列共价地连接到并且毗邻于如此的核酸，其中所述调节序列在其天然环境中不毗邻于此核酸。
术语“转基因”如本文中所用指已导入细胞基因组的或已经由人通过实验操作加以操纵的任何核酸序列。优选地，所述序列产生与天然存在的生物不同的基因组(例如若该序列对该生物是内源的，将此序列导入与其天然位置相异的位置，或此序列的拷贝数提高或降低)。转基因可以是“内源的DNA序列”、“外源的DNA序列”(例如外源基因)或“异源的DNA序列”。术语“内源的DNA序列”指如此的核苷酸序列，其中该核苷酸序列天然存在于导入它的细胞中，只要该核苷酸序列相对于天然存在的序列不含有某种修饰(例如点突变、存在选择性标记基因等)。
在谈及细胞或生物(例如就小麦植物或植物细胞而言)时使用术语“转基因的”或“重组”，指含有转基因的或其基因组已经通过导入转基因而受到改变的细胞或生物。转基因的生物或组织可以包含一个或多个转基因的细胞。优选地、生物或组织基本上由转基因的细胞组成(即该生物或组织中大于80％、优选90％、更优选95％、最优选99％的细胞是转基因的)。
“重组多肽”是在序列上与天然存在的多肽相异至少一个氨基酸残基的非天然存在的多肽。用于产生所述的重组多肽和/或核酸的优选方法可以包括定向诱变或非定向诱变、DNA改组或其它的递归重组方法。
当谈及核酸时使用术语“同源性”或“同一性”是指互补程度。两种核酸间的同源性或同一性理解为意指核酸序列在每一情况下在序列全长范围内的同一性，其中所述的同一性借助具有如下所设置参数的程序算法GAP(WisconsinPackage第10.0版，威斯康辛大学，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison，美国)，通过比较进行计算：
空位权重：12       长度权重：4
平均匹配：2.912    平均非匹配：-2.003
例如，将与序列SEQ ID NO：1在核酸水平上具有至少95％同源性(或同一性)的序列理解为意指如此序列，当通过具有所设置参数的以上程序算法与序列SEQ ID NO：1比较时，该序列具有至少95％的同源性。可以存在部分的同源性(即少于100％的部分同一性)或完全的同源性(即100％的完全同一性)。
术语“杂交”如本文中所用包括“任何过程，其中通过该过程核酸的链经碱基配对作用与互补链结合”(Coombs 1994)。杂交和杂交的强度(即核酸间结合的强度)受这些因素的影响，如核酸间的互补程度、涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm以及核酸中G∶C比率。如本文中所用，术语“Tm”用来指“解链温度”。解链温度是这样的温度，在此温度上双链核酸分子群体的一半解离成为单链。用于计算核酸Tm的等式是本领域内众所周知的。作为标准参考文献提及，对Tm值的简单估计可以由如下等式计算：Tm＝81.5+0.41(％G+C)，此时核酸处于1M NaCl的水溶液中[见例如Anderson和Young(1985)]。其它参考文献包括考虑结构特征和序列特征来计算Tm的更复杂的计算。
高度严格洗涤条件的实例是0.15M NaCl在72℃持续约15分钟。严格洗涤条件的实例是0.2×SSC洗涤在65℃持续15分钟(见Maniatis，见下文对SSC缓冲液的描述)。高严格洗涤之前往往低严格洗涤，其目的在于去除背景探针信号。用于双链体的(例如超过100个核苷酸)中等严格洗涤的实例是1×SSC在45℃持续15分钟。用于双链体的(例如超过100个核苷酸)低严格洗涤的实例是4至6×SSC在40℃持续15分钟。对于短探针(例如约10个至50个核苷酸)，严格条件通常涉及在pH7.0至8.3，Na离子浓度(或其它盐)小于约1.5M，更优选约0.01至1.0M盐浓度，温度通常是至少约30℃和对长探针(例如＞50个核苷酸)至少约60℃。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺而实现。通常在特定杂交测定法中的信噪比高出对不相关性探针所观察到的信噪比2倍(或更高)，则表明检测到特异性杂交。如果在严格条件下彼此不杂交的核酸所编码的蛋白质基本上同一，则在严格条件下彼此不杂交的核酸基本上仍是同一的。当利用遗传密码所允许的最大密码子简并性产生核酸拷贝时，这种情况会出现。
选择了与特定探针的Tm等同的非常严格条件。Southern或Northern印迹法中用于杂交在滤膜上的互补性核酸的高度严格条件的实例是50％甲酰胺、例如在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS在37℃杂交并且在0.1×SSC中于60℃至65℃洗涤，其中所述的互补性核酸具有大于100个互补性残基。示例性的低严格条件包括用含30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交并且在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)于50至55℃洗涤。示例性中等严格条件包括在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS内于37℃杂交并且0.5×至1×SSC中于55至60℃洗涤。
当因与目的杂交条件相关而提及一种杂交条件时，术语“等同”意指该杂交条件和目的杂交条件均引起具有相同范围的同源性百分数的核酸序列杂交。例如若目的杂交条件引起第一核酸序列与对于第一核酸序列具有80％至90％同源性的其它核酸序列杂交，则如果另一种杂交条件也引起第一核酸序列与对于第一核酸序列具有80％至90％同源性的其它核酸序列杂交，称另一种杂交条件等同于目的杂交条件。
当谈及核酸杂交使用时，本领域众所周知可以采用众多等同条件以包含低严格条件或高严格条件；考虑如此因素，如探针的长度和性质(DNA、RNA、碱基组成)和靶的性质(DNA、RNA、碱基组成、存在于溶液中或被固定等)以及盐与其它成分的浓度(例如甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚乙二醇的存在或不存在)，并且杂交溶液可以改变以产生异于以上所列条件的低严格杂交条件或高严格杂条件。本领域技术人员知道虽然可以优选较高的严格性以减少或消除非特异性结合，但可以优选较低的严格性来检测较大数目的具有不同同源性的核酸序列。
术语“基因”指与能够以某种方式调节多肽表达的适宜的调节序列有效连接的编码区。基因包括位于编码区(开方读码框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的非翻译的DNA调节区(例如启动子、增强子、抑制子等)，以及合适时包括在各个编码区(即外显子)间的间插序列(即内含子)。术语“结构基因”如本文中所用意指被转录成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA随后翻译成表征特定多肽的氨基酸序列。
如本文中所用，术语“编码区”在谈及结构基因而使用时，指编码在通过mRNA分子翻译所产生的新生多肽中存在的氨基酸的核苷酸序列。编码区在真核生物中由编码起始甲硫氨酸的核苷酸三联体“ATG”在5′侧限定并由指示终止密码子(即TAA、TAG、TGA)的3个三联体之一在3′侧限定。除含有内含子之外，基因的基因组形式还包括如此序列，其位于在RNA转录物上存在的序列的5′-端及3′-端。这些序列称作“侧翼”序列或区域(这些侧翼序列位于在mRNA转录物上存在的非翻译序列的5′或3′)。5′侧翼区域可以含有控制或影响基因转录的调节序列，如启动子和增强子。3′侧翼区域可以含有指导转录终止、转录后切割或多腺苷酸化作用的序列。
术语“多肽”、“肽”、寡肽”、“基因产物”、“表达产物”和“蛋白质”在本文中可交换地用来指连续氨基酸残基的聚合物或寡聚物。
术语“分离”如本文中所用意指一种材料已经从其原初环境中取出。例如存在于活动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，而与自然系统中某些或全部共存性物质分开的相同多核苷酸或多肽是分离的。此类多核苷酸可以是载体的部分和/或此类多核苷酸或多肽可能是组合物的部分，并且是受到分离的，因为该载体或组合物不再是其原初环境的部分。
术语“经遗传修饰的生物”或“GMO”指包含转基因DNA的任何生物。示例性生物包括植物、动物和微生物。
术语“细胞”或“植物细胞”如本文中所用指单个细胞。术语“多细胞”指细胞的群体。群体可以是包含一种细胞类型的纯群体。类似地，群体可以包含多于一种的细胞类型。在本发明中，不限制可以包含的细胞类型的数目。细胞可以是同步的或不是同步的。本发明含义范围内的植物细胞可以是分离的(例如在悬浮培养中)或包含在植物组织、植物器官或任何发育期的植物中。
就植物而言术语“器官”(或“植物器官”)，意指植物的部分并可以包括(但不应当限于)例如根、果实、苗、茎、叶、花药、萼片、花瓣、花粉、种子等。
就植物而言术语“组织”(或“植物组织”)意指多个植物细胞的排布，包括植物已分化的和未分化的组织。植物组织可以构成植物器官的部分(例如植物叶的表皮)，不过也可以构成肿瘤组织和培养物中的多种类型细胞(例如单个细胞、原生质体、胚芽、愈伤组织、原胚体样体等)。植物组织可以在植物原位(in planta)、在器官培养物、组织培养物或细胞培养物中。
术语“植物”如本文中所用指多种植物细胞大量分化成处于植物任何发育期的结构。此类结构包括一种或多种植物器官，包括但不限于果实、苗、茎、叶、花瓣等。
术语“染色体DNA”或“染色体DNA-序列”应当理解为与细胞周期状态无关的细胞核的基因组DNA。染色体DNA因此可以在染色体或染色单体中受到组织，它们可以是压缩的或解螺旋状的。对染色体DNA的插入可以通过本领域已知的多种方法加以证实并分析，例如聚合酶链反应(PCR)分析、DNA印迹分析、荧光原位杂交(FISH)和原位PCR。
术语“结构基因”如本文中所用意指被转录成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA随后翻译成表征特定多肽的氨基酸序列。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录成mRNA以及任选地mRNA随后翻译成一种或多种多肽。
术语“表达盒”或“表达构建体”如本文中所用意指与启动子序列和(任选地)额外元件(例如终止子和/或聚腺苷酸化序列)有效连接的待表达的任何核酸序列的组合，其中所述启动子序列和(任选地)额外元件促进所述核酸序列的表达。
“启动子”、“启动子元件”或“启动子序列”如本文中所用，指位于一种核苷酸序列5′端的能够启动转录(即能够控制该核苷酸序列转录成mRNA)的核苷酸序列。启动子通常(尽管不是必须)位于目的核苷酸序列的5′(即上游)(例如接近结构基因的转录起点)，其中该启动子控制目的核苷酸序列转录成mRNA；并为RNA聚合酶及启动转录的其它转录因子的特异性结合提供位点。启动子序列对于驱动下游基因表达是必需的，但并不总是充分的。通常，启动子可以是组织特异性的或细胞特异性的。术语“组织特异性”在应用于启动子时指这样的启动子，该启动子能够在特定类型的组织(例如花瓣)中指导目的核苷酸序列的选择性表达，而在不同类型的组织(例如根)中则相对缺乏相同目的核苷酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可调节的。通常，真核生物启动子包括距离转录起点(加帽位点)5′末端(按惯例编号为+1)约10-30bp的与共有序列5′-TATAAT-3′(TATA)盒同源的特征性DNA序列。对加帽位点3′的碱基赋予正编号，而在加帽位点5′的碱基接受负编号，这反映它们与加帽位点的距离。另一个启动子成分CAAT盒常在距离TATA盒5′约30至70bp处存在并且与标准形式5′-CCAAT-3′具有同源性(Breathnach 1981)。在植物中，CAAT盒有时候由称作AGGA盒的序列替换，其中所述序列是具有对称分布在三联体G(或T)NG两侧的腺嘌呤残基的区域(Messing 1983)。对转录赋予调节性影响的其它序列可以在启动子区域内找到并从加帽位点的5′延伸远及1000bp或更远。术语“组成型的”当指启动子时，意指该启动子能够在缺乏刺激物(例如热休克、化学品、光等)时指导有效连接的核酸序列转录。通常，组成型启动子能够指导转基因在基本上任何细胞及任何组织中表达。
调节性控制指调节受DNA序列元件诱导的基因表达，其中所述的DNA序列元件主要(但不是仅)位于转录起点上游(5′端)。调节可以引起对环境刺激物的全或无应答，或它可以引起基因表达水平变化。在本发明中，热休克调节元件起到在应答于温度突升时瞬时增强下游基因表达水平的作用。
聚腺苷酸化信号指能够实施mRNA加工的任何核酸序列，其中所述的mRNA加工通常以添加多个聚腺苷酸至mRNA前体3′末端为特征。聚腺苷酸化信号DNA节段本身可以是从数个(天然或合成的)来源中衍生的节段的组合，并且可以来自于基因组DNA衍生的或基因组RNA衍生的cDNA。尽管距离的变化、部分“通读”和多重串联，聚腺苷酸化信号通常因存在与规范形式5′-AATAA-3′同源性而得到识别，其中所述规范序列并非少见(Messing 1983)。应当认识到规范的“聚腺苷酸化信号”实际上可以引起转录的终止而不是聚腺苷酸化作用本身(Montell 1983)。
热休克元件指在应答温度突升的胁迫下调节基因表达的DNA序列。观察到该应答立即(尽管短暂地)增强下游基因的表达水平。对热休克基因的最初研究工作是用果蝇(Drosophila)完成的，但是包括植物在内的众多其它物种(Barnett 1980)表现出类似的胁迫应答。描述在果蝇中的热休克元件的必需主要成分具有共有序列5′-CTGGAATNTTCTAGA-3′(其中N＝A、T、C或G)并且位于转录起点上游的残基-66至-47bp之间的区域内(Pelham1982)。该共有序列的化学合成性寡核苷酸拷贝可以在赋予热休克诱导性方面替代天然序列。
前导序列指包含位于转录起点和翻译起点间约100核苷酸的DNA序列。前导序列的具体例子是指定核糖体结合位点的区域。
内含子或间插序列在本文中指DNA序列的这些区域，它们随编码序列(外显子)一起转录，但随后在成熟mRNA形成期间被去除。内含子可以存在于已转录序列中的任何位置-在相同基因或不同基因的编码序列间，在基因的编码序列中破坏并分割编码序列的氨基酸序列，以及在启动子区域(翻译起点的5′)中。初级转录物中的内含子被切除并且编码序列同时而精确地得到连接，形成成熟的mRNA。内含子与外显子的汇合处形成剪接位点。内含子的碱基序列以GU开始并以AG结束。相同的剪接信号存在于众多的高等真核生物中。
术语“有效连接”或”有效连接的”将理解为意指例如调节元件(例如启动子)与待表达的核酸序列和根据需要与其它调节元件(如例如终止子)以如此方式的依次排列，以致于每种调节元件均可以实现它的预期功能以允许、调节、促进或否则影响所述核酸序列的表达。取决于与有义RNA或反义RNA相关的核酸序列的排列，可以导致表达。为此目的，实际上不需要化学意义上的直接连接。遗传控制序列例如增强子序列还可以从距离更远处，或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥作用。优选的排列是其中待重组表达的核酸序列位于作为启动子的序列之后，以至于这两种序列彼此共价连接。启动子序列与待重组表达的核酸序列之间的距离优选小于200碱基对，尤其优选小于100碱基对，更尤其优选小于50碱基对。有效连接以及表达盒可以通过如(例如在Maniatis 1989；Silhavy 1984；Ausubel 1987；Gelvin 1990内)所述的常用重组技术及克隆技术产生。然而，例如作为带限制酶的特异性切割位点的接头或作为信号肽发挥作用的其它序列也可以位于这两种序列之间。序列的插入还可以导致融合蛋白表达。优选地，由启动子与待表达核酸序列的连接所组成的表达盒可以以载体整合的形式存在并被插入植物基因组，例如通过转化。
术语“转化”如本文中所用指导入遗传材料(例如转基因)至细胞中。细胞的转化可以是稳定的或瞬时的。术语“瞬时转化”或“瞬时地转化”指在没有转基因整合入宿主细胞基因组情况下导入一种或多种转基因至细胞中。瞬时转化可以通过例如检测一种或多种多肽的存在的酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测，其中所述的多肽由转基因编码。或者，瞬时转化可以如本文中所示[例如通过用X-gluc染色对GUS酶活性的组织化学测定，其中所述的X-gluc在GUS酶存在下产生蓝色沉淀物；以及使用GUS-光试剂盒(Tropix)对GUS酶活性的化学发光测定]通过检测由转基因(例如uidA基因)所编码的蛋白质(例如β-葡糖醛酸糖苷酶)的活性加以检测。术语“瞬时转化体”指短暂地包含一种或多种转基因的细胞。相对而言，术语“稳定转化”或“稳定地转化”指一种或多种转基因导入并整合入细胞基因组中，优选地经减数分裂产生染色体整合和稳定的遗传力。细胞的稳定转化可以通过细胞的基因组DNA与核酸序列的DNA印迹杂交受到检测，其中所述的核酸序列能够与一种或多种转基因稳定结合。备选的，细胞的稳定转化还可以通过对细胞基因组DNA进行聚合酶链反应以扩增转基因序列而受到检测。术语“稳定转化体”指这样的细胞，该细胞已经稳定整合一种或多种转基因至基因组DNA(包括质体和细胞核的DNA)，优选地整合入细胞核的染色体DNA中。因此，稳定转化体与瞬时转化体的区别在于其中来自稳定转化体的基因组DNA含有一种或多种转基因，而来自瞬时转化体的基因组DNA不含有转基因。转化还包括将遗传材料以植物病毒载体的形式导入植物细胞，包括染色体外复制和基因表达，这可能表现出相对于减数分裂稳定性的可变特性。优选地，术语“转化”包括将遗传材料导入植物细胞中，导致染色体整合和经减数分裂的稳定的可遗传性。
术语用细菌“感染”和“感染过程”指将靶生物样品(例如细胞、组织等)与细菌在如此条件下共孵育，以至将细菌中所含的核酸序列导入靶生物样品的一种或多个细胞。
术语“农杆菌”指引起冠瘿的土源性革兰氏阴性棒杆状的植物病原菌。术语“农杆菌”包括，但不限于根癌农杆菌菌株(它通常在感染植物中引起冠瘿)和发根农杆菌菌株(它在感染植物中引起毛发状根病)。用农杆菌感染植物细胞通常引起感染的细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱、农杆碱、章鱼碱等)。因此，以及将引起胭脂碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)称作“胭脂碱型”农杆菌；将引起章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)称作“章鱼碱型”农杆菌，以及将引起农杆碱产生的农杆菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、A281)称作“农杆碱型”农杆菌。
术语“进行轰击”、“轰击”和“生物射弹轰击”指这样的过程，该过程使粒子向靶生物样品(例如细胞、组织等)作加速运动以造成靶生物样品中细胞的细胞膜损伤和/或使粒子穿入靶生物样品。用于生物射弹轰击的方法在本领域是已知的(例如US5,584,807，其内容在本文引用作为参考)，和是可商业获得的(例如氦气驱动的微抛射体加速仪(PDS-1000/He)(BioRad)。
术语“显微致伤”当指植物组织时，意指在该组织中导入微小创伤。显微致伤可以例如通过如本文中所述的粒子轰击法实现。
“转化效率”或”转化频率”如本文中所用可以由在标准实验条件下(即在与外源DNA接触的细胞的量、递送的DNA的量、类型、DNA递送条件、一般培养条件等方面进行标准化或归一化)所回收的转化细胞(或从单个转化细胞中培育出的转基因生物)的数目。例如当分离的不成熟胚用作转化的起始材料时，转化频率可以表达为每100个分离的不成熟胚转化所得到的转基因植物品系的数目。
发明详述
本发明的第一实施方案涉及用于产生转基因植物的方法：
a.向小麦细胞或组织导入包含至少一种第一表达构建体的DNA构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b.将步骤a)的所述小麦细胞或组织在包含总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物的选择培养基上孵育至少5天时间(优选至少14天)，和
c.转移步骤b)的所述小麦细胞或组织至再生培养基并且再生和选择包含所述DNA构建体的小麦植物。
在一个优选的实施方案中，导入所述的小麦细胞或组织中的DNA构建体还包含赋予该小麦植物有农学价值的性状的至少一种第二表达构建体。然而其它基因(例如报道基因)也可以与用于表达能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶(即选择性标记)的表达盒组合而转化至小麦植物。
本发明提供了用于小麦的新选择系统，该选择系统提供在不干扰胚发生愈伤组织形成下的最小逃逸率和在小麦中高数量的转基因的苗的再生。此外，该选择作为选择标记与先前所述的基于抗生素和/或除草剂的系统相比，具有有效的优势：
■定义的体外毒性表型。
■对其它生物无毒。
■对自然界中的转基因植物无选择优势。
■天然存在于细菌、真菌和动物中。
本文中位于来自细菌或酵母的序列之后的所用标记通常存在于人及动物的食物或饲料中。在优选的实施方案中，本文提供的标记和方法允许轻易地去除标记序列。此外，本文中提供用于小麦的详细的优化转化方法，该方法允许高效的农杆菌介导的转化。通过本发明方法得到的植物是能育的，具有正常表型。
如下描述本发明方法的其它要求。因此在一个实施方案中，本发明的方法包括导入如下文定义的DNA构建体，还包括如下文定义的选择和/或还包括如下文定义的再生。
1.DNA构建体
在本发明的另一个实施方案中，DNA构建体包含至少一种第一表达盒，其中所述第一表达构建体包含在小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列。
在一个实施方案中，本发明的方法包括导入例如在第一DNA构建体或第二DNA构建体中包含的第二表达盒。因此，第二表达盒可以作为独立的DNA构建体的部分而被导入所述的细胞或组织，例如通过共转化或例如育种或细胞融合步骤。
在一个优选的实施方案中，根据本发明方法导入所述小麦细胞或组织的DNA构建体还包含赋予该小麦植物有农学价值的性状的至少一种第二表达构建体。不过其它基因(例如报道基因)也可以与用于表达能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶(即选择性标记)的表达盒组合而转化至小麦植物。在一个实施方案中，DNA构建体是T-DNA，更优选卸甲的T-DNA(例如无致瘤生长诱导特性)。
在小麦植物中有活性的启动子和/或D-氨基酸氧化酶以下详细定义。
1.1第一表达构建体
在本发明的一个实施方案中，重组表达构建体包含在小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，其中所述的启动子相对于所述编码酶的序列是异源的。在小麦植物中有活性的启动子和/或D-氨基酸氧化酶以下详细定义。
1.1.1能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶
本领域技术人员知道合适于代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的众多序列。术语“能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶”优选地意指转变和/或代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶，其中该酶的活性是转化(L--丙氨酸和/或L--丝氨酸)相应的L-氨基酸的活性以及更优选还是转化任何其它D-氨基酸和/或L-氨基酸或非手性氨基酸的活性的至少2倍(至少高于100％)、优选至少3倍、更优选至少5倍、甚至更优选至少10倍、最优选至少50倍或100倍。
优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18；先前的EC4.2.1.14)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)。更优选地，能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18；先前的EC4.2.1.14)和D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)。
术语“D-丝氨酸脱氨酶”(D-丝氨酸脱水酶；EC4.3.1.18；先前的EC4.2.1.14)意指催化D-丝氨酸转化成丙酮酸和氨的酶。所催化的反应可能涉及水的初始消除(因此酶的最初分类为EC4.2.1.14)，随后是异构化和产物的水解，伴随C-N键断裂。合适的酶实例见http://www.expasy.org/enzyme/4.3.1.18。
术语“D-丙氨酸转氨酶”(EC2.6.1.21)意指催化D-丙氨酸与2-氧代戊二酸反应成为丙酮酸和D-谷氨酸的酶。D-谷氨酸对植物的毒性比D-丙氨酸低得多。http://www.expasy.org/enzyme/2.6.1.21。
术语“D-氨基酸氧化酶”(EC1.4.3.3；缩写DAAO、DAMOX或DAO)指这样的酶，该酶通过(优选地)采用氧(O2)作为底物，将D-氨基酸转变成2-氧代酸并且产生过氧化氢(H2O2)作为共同产物(Dixon 1965a、b、c；Massey1961；Meister 1963)。DAAO可以由国际生物化学与生子生物学联合学会命名委员会(IUBMB)描述，具有EC(酶委员会)编号EC1.4.3.3。通常EC1.4.3.3类的DAAO酶是催化中性D-氨基酸及碱性D-氨基酸氧化成相应酮酸的FAD黄素酶。AAO已经在真菌和脊椎动物中表征并测序，其中已知它们位于过氧化物酶体中。在DAAO中，已经证实一个保守的组氨酸(Miyano 1991)对酶的催化活性是重要的。在本发明的优选实施方案中，DAAO指包含如下共有序列基序的蛋白质：
[LIVM]-[LIVM]-H＊-[NHA]-Y-G-x-[GSA]-[GSA]-x-G-x5-G-x-A
其中括号内给出的氨基酸残基代表对相应位置的备选残基，x代表任何氨基酸残基并且下标数字表示相应的连续氨基酸残基数目。各氨基酸残基的缩写具有它们以上定义的标准IUPAC含义。D-氨基酸氧化酶(EC编号1.4.3.3)可以分离自多种生物，包括但不限于猪、人、大鼠、酵母、细菌或真菌。举例的生物是热带假丝酵母(Candida tropiealis)、三角酵母(Trigonopsis variabilis)、粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)、小球藻(Chlorellavulgaris)和瘦弱红酵母。代谢D-氨基酸的合适多肽可以是真核生物的酶，例如来自酵母(例如瘦弱红酵母)、真菌或动物，或它可以是原核生物的酶，例如来自细菌如大肠杆菌(Escherichia coli)。合适的酶实例见http://www.expasy.org/enzyme/1.4.3.3。
代谢D-氨基酸的合适多肽的实例示于表1。编码所述酶的核酸序列可从数据库中获得(例如在下Genbank登录号U60066、A56901、AF003339、Z71657、AF003340、U63139、D00809、Z50019、NC_003421、AL939129、AB042032)。如上所示，来自数个不同物种的DAAO已经得到表征并证实在底物亲和性方面略微相异(Gabler 2000)，然而它们通常表现广的底物特异性，使全部D-氨基酸氧化脱氨。
表1：适用于代谢D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的酶。特别优选的酶以及优选的底物以粗体字母表示。
  酶   EC编号   来源生物的实例   底物
  D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸氨解酶、D-丝氨酸脱氨酶)   EC4.3.1.18(最初为EC4.2.1.14)   P54555枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)P00926大肠杆菌DSDAQ9KL72霍乱弧菌(Vibriocholera)VCA0875Q9KC12嗜碱芽孢杆菌(Bacillushalodurans)   D-SerD-ThrD-别苏氨酸
  D-氨基酸氧化酶D-氨基酸氧化酶   EC1.4.3.3EC1.4.3.3   JX0152腐皮镰刀菌(Fusarium solani)O01739秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)O33145麻风分支杆菌(Mycobacteriumleprae)AAOO35078褐家鼠(Rattus norvegicus)(大鼠)O45307秀丽隐杆线虫P00371猪(Sus scrofa)(猪)P14920智人(Homo sapiens)(人)P14920智人(人)P18894小家鼠(Musmusculus)(小鼠)P22942穴兔(Oryctolagus cuniculus)(兔)P24552腐皮镰刀茵(豌豆亚种)(Fusariumsolani)(subsp.pisi)(血红丛赤壳(Nectriahaematococca)P80324红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)(酵母)(瘦弱红酵母)Q19564秀丽隐杆线虫Q28382猪(猪)Q7SFW4粗糙脉孢霉(Neurospora   大部分D-氨基酸
  酶   EC编号   来源生物的实例   底物
  crassa)Q7Z312智人(人)Q82MI8阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)Q8P4M9野油菜黄单胞菌(Xanthomonascampestris)Q8PG95地毯草黄单胞菌(Xanthomonas axonopodis)Q8R2R2小家鼠(小鼠)Q8SZN5黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)Q8VCW7小家鼠(小鼠)Q921M5豚鼠(Cavia parcellus)(豚鼠)Q95XG9秀丽隐杆线虫Q99042三角酵母(Trigonopsis variabilis)Q9C1L2粗糙脉孢霉Q9JXF8脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(血清组B)NMB2068Q9V5P1黑腹果蝇(果蝇)Q9VM80黑腹果蝇(果蝇)Q9X7P6天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)Q9Y7N4粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)SPCC1450Q9Z1M5豚鼠(Cavia porcellus)(豚鼠)Q9Z302黑线仓鼠(Cricetulus griseus)
  酶   EC编号   来源生物的实例   底物
  U60066红冬孢酵母(瘦弱红酵母)菌株TCC26217
  D-丙氨酸转氨酶   EC  编号2.6.1.21   P54692地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)P54693球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)P19938芽孢杆菌(Bacillussp.)(YM-1菌株)007597枯草芽孢杆菌085046单核细胞增多李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)P54694溶血葡萄球菌(Staphylococcushaemolyticus)   D-AlaD-ArgD-AspD-GluD-LeuD-LysD-MetD-PheD-正缬氨酸
在本文中特别优选来自瘦弱红酵母(红冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides))的dao1基因(EC:1.4.3.3:GenBank登录号：U60066)和大肠杆菌基因dsdA(D-丝氨酸脱水酶(D-丝氨酸脱氨酶)[EC:4.3.1.18；GenBank登录号：J01603)。dao1基因具有特别的优势，因为它可以用作双功能标记(见国际专利申请PCT/EP 2005/002734)。
在优选的实施方案中，本发明的方法包括利用以上提及的优选的酶，尤其利用特别优选的酶连同作为优选底物而提及的底物。
合适的D-氨基酸代谢酶还包括以上所例举的多肽的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因。合适的片段、突变体、衍生物、变体和等位基因是保留如上所定义的D-氨基酸代谢酶的功能性特征的那些片段、突变体、衍生物、变体和等位基因。序列可以受到如此改变以产生突变体、变体或衍生物，即通过在核酸中一次或多次地添加、插入、缺失或替换一个或多个核苷酸，导致在所编码的多肽中添加、插入、缺失或替换一个或多个氨基酸。当然，还包括使核酸变化而对所编码的氨基酸序列不作改动的改变。
对于本发明的方法，能够代谢D-丙氨酸的酶选自
i)如表1中所示的D-丙氨酸转氨酶，和
ii)与如表1中所示的D-丙氨酸转氨酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其与如表1中所示的D-丙氨酸转氨酶具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与编码如表1中所示的D-丙氨酸转氨酶的核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如表1所示D-丙氨酸转氨酶的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含总浓度约1mM至100mM(更优选地约2mM至约50mM、甚至更优选地约3mM至约20mM、最优选地约5至15mM)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
更优选地对于本发明的方法，能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶，
ii)与如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其与如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与编码如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶的核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如表1所示D-丝氨酸脱氨酶的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含浓度约1mM至100mM(更优选地约5mM至约50mM、甚至更优选地约7mM至约30mM、最优选地约10至20mM)的D-丝氨酸的培养基上进行。
更优选地对于本发明的方法，能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，
ii)与如SEQ ID NO：2所示的D-丝氨酸脱氨酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与SEQ ID NO：1所示的核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与SEQ ID NO：1所示的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含浓度约1mM至100mM(更优选地约5mM至约50mM、甚至更优选地约7mM至约30mM、最优选地约10至20mM)的D-丝氨酸的培养基上进行。
在D-丝氨酸脱氨酶的上下文中“相同的活性”意指代谢D-丝氨酸、优选地代谢作为最优选底物的D-丝氨酸的能力。代谢意指以上所述的裂解酶反应。iii)中的杂交意指优选在低严格条件下杂交(使用含30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液在37℃杂交，和在1×至2×SSC中在50℃至55℃洗涤)、更优选在中等严格条件下杂交(在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃洗涤)并且最优选在非常严格条件下杂交(在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.1×SSC中在60至65℃洗涤)。
还更优选地对于本发明的方法，能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)如表1中所示的D-氨基酸氧化酶，和
ii)与如表1中所示的D-氨基酸氧化酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其与如表1中所示的D-氨基酸氧化酶具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与编码如表1中所示的D-氨基酸氧化酶的核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如表1所示D-氨基酸氧化酶的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含总浓度约1mM至100mM(更优选地约2mM至约50mM、甚至更优选地约3mM至约20mM、最优选地约5至15mM)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
还更优选地对于本发明的方法，能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：4编码的瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶，和
ii)酶，与如SEQ ID NO：4中所示序列具有相同的酶活性并且与如SEQ ID NO：4中所示序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性；
iii)酶，具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与如SEQ ID NO：3中所示的核酸序列具有至少80％(优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如SEQ ID NO：3中所述序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含总浓度约1mM至100mM(更优选地约2mM至约50mM、甚至更优选地约3mM至约20mM、最优选地约5至15mM)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
所述序列的突变体及衍生物还可以包含这样的酶，其在一个或多个特征(Ki，底物特异性等)方面得以改进，但仍包含涉及D-丝氨酸和/或D-丙氨酸的代谢活性。此类序列和蛋白质还包括自诱变方法和重组方法(如DNA改组)所衍生的序列和蛋白质。用这种方法，可以操作一种或多种不同的编码序列以产生具有所需特性的新多肽。以这种方式，从包含如此序列区的相关多核苷酸序列的群体中生成重组多核苷酸的文库，其中所述序列区包含具有大量序列同一性并可以在体外或体内进行同源重组。编码候选酶的多核苷酸可以例如用DNA改组方法进行修饰。DNA改组是在DNA分子内快速、容易及高效地、优选随机地导入突变和重排的方法，或是在两种或多种DNA分子之间产生、优选随机产生DNA序列交换的方法。因DNA改组产生的DNA分子是改组的DNA分子，其中所述的改组DNA分子是衍生自至少一种模板DNA分子的非天然存在的DNA分子。改组DNA编码这样的酶，其中该酶相对于模板DNA所编码的酶而受到修饰并且优选相对于模板DNA所编码酶具有改变的生物学活性。DNA改组可以基于递归重组和突变过程，通过使相关基因的集合随机性片段化而开展，随后通过类聚合酶链反应过程组装片段。见例如Stemmer 1994a，b；Crameri1997；Moore 1997；Zhang 1997；Crameri 1998；US5,605,793、US5,837,458、US5,830,721和US5,811,238。由改组DNA所编码的所得dsdA样酶或dao样酶可以拥有异于原始形式酶的氨基酸序列。序列同一性的示例性范围如上所述。
在D-氨基酸氧化酶的上下文中“相同的活性”意指代谢广泛类型的D-氨基酸(优选地是至少D-丝氨酸和/或D-丙氨酸)的能力。代谢意指以上所述的氧化酶反应。iii)中的杂交意指优选在低严格条件下杂交(使用含30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液在37℃杂交，和在1×至2×SSC中在50℃至55℃洗涤)、更优选在中等严格条件下杂交(在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃洗涤)并且最优选在非常严格条件下杂交(在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.1×SSC中在60至65℃洗涤)。
优选地，用于选择的浓度和时间以下详述。优选地，使用约3mM至约15mM D-丙氨酸或约7mM至约30mM D-丝氨酸完成选择。在去分化条件下的总选择时间优选地约3周至4周。
本发明的D-氨基酸代谢酶可以在植物细胞的细胞质、过氧化物酶体或其它细胞区室内表达。D-氨基酸代谢酶的区室化可以通过将编码DAAO多肽的核酸序列与编码转运肽的序列融合以生成融合蛋白而实现。表达出的没有这种转运肽的基因产物通常在细胞质中累积。
在一个实施方案中，D-氨基酸代谢酶功能性地连接于启动子，尤其连接到(与其它相应的表达调节信号一起)导致所控制的基因在小麦植物中表达的启动子上。此类启动子可以是例如组成型启动子、受调节的启动子或在合适的组织或器官中有活性的启动子。
1.1.2用于小麦植物的启动子
术语“启动子”如本文中所用将意指指导DNA序列(例如结构基因)转录的DNA序列。通常，启动子位于基因的5′区，接近于结构基因的转录起点。若启动子是诱导型启动子，则转录速率对诱导剂应答而增加。相反，若启动子是组成型启动子，则转录速率不受诱导剂调节。另外，启动子可以以组织特异性方式或组织优选方式受到调节，以至于该启动子仅在特定组织类型如叶、根或分生组织中有转录所连接的编码区的活性。
术语“在小麦植物中有活性的启动子”意指能够诱导有效连接的核苷酸序列在处于发育的至少一个时间点上或在去分化条件下的至少一种小麦细胞、组织、器官或植物中转录的任何启动子，无论其是否为植物来源。此类启动子可以是非植物启动子(例如衍生自植物病毒或农杆菌)或是植物启动子，优选是单子叶植物启动子。
本领域技术人员知道可能适用于小麦植物中的数种启动子。在本上下文中，表达可以是例如组成型的、诱导型的或发育依赖型的。优选如下启动子：
a)组成型启动子
“组成型启动子”指这些启动子，它们确保在种类众多的组织、优选在全部组织中，在植物发育的广泛时间段中、优选在植物发育的全部时间的表达。优选：CaMV(花椰菜花叶病毒)35S转录物的启动子(Franck 1980；Odell 1985；Shewmaker 1985；Gardner 1986)、尤其优选19S CaMV启动子(US5,352,605；WO84/02913；Benfey 1989)、稻肌动蛋白启动子(McElroy1990)、Rubisco小亚基(SSU)启动子(US4,962,028)、来自农杆菌的胭脂碱合酶启动子、来自农杆菌的OCS(章鱼碱合酶)启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(US5,683,439)、液泡ATP酶亚基启动子、pEMU启动子(Last 1991)、MAS启动子(Velten 1984)和玉米H3组蛋白启动子(Lepetit1992；Atanassova 1992)、玉米ahas启动子(US5,750,866)或ScBV启动子(US6,489,462)。
b)组织特异的或组织优选的启动子
进一步优选的启动子是允许在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中种子特异性表达的那些启动子。可以有利地采用lpt2或lpt1基因的启动子(WO95/15389、WO95/23230)或WO99/16890中所述的启动子(麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。还优选叶特异的和光诱导的启动子如来自cab或rubisco的启动子(Simpson 1985；Timko 1985)；花药特异性启动子如来自LAT52的启动子(Twell 1989b)；花粉特异性启动子如来自Zml3的启动子(Guerrero 1993)和小孢子优选的启动子如来自apg的启动子(Twell 1993)。
c)化学诱导型启动子
表达盒还可以含有化学诱导型启动子(综述文章：Gatz 1997)，其中植物中外源基因的表达可以通过化学诱导型启动子在特定时间点上进行控制。此类启动子例如PRP1启动子(Ward 1993)、水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、苯磺酰胺诱导型启动子(EP0388186)、四环素诱导型启动子(Gatz 1991，1992)、脱落酸诱导型启动子EP0335528)或乙醇-环己酮诱导型启动子(WO93/21334)可以类似地得到使用。谷胱苷肽-S转移酶同工型II基因(GST-II-27)的启动子也是合适的，该启动子可以是由外源施加的安全剂例如N，N-二烯丙基-2，2-二氯乙酰胺(W093/01294)激活并且在单子叶植物和双子叶植物的大多数种类组织中是可操作的。可以用于本发明中的其它示例性诱导型启动子包括应答于铜的来自ACE1系统的启动子(Mett 1993)；或应答于苯磺酰胺除草剂安全剂的来自玉米的In2启动子(Hershey 1991；Gatz 1994)。可以使用对植物通常不作应答的诱导剂作出应答的启动子。示例性诱导型启动子是来自类固醇激素基因的诱导型启动子，这种启动子的转录活性由糖皮质激素诱导(Schena 1991)。
特别优选组成型启动子，最优选遍在蛋白启动子(详见下文见)如遍在蛋白启动子(Holtorf 1995)和遍在蛋白1启动子(Christensen 1989，1992；Bruce 1989)。
1.1.2.1遍在蛋白启动子
在本发明的一个优选实施方案中，在小麦植物中有功能的启动子是遍在蛋白启动子、优选衍生自单子叶植物的遍在蛋白启动子，例如玉米(Zeamaize)遍在蛋白启动子。遍在蛋白启动子的使用始终导致高转化效率。遍在蛋白启动子优异性能的原因未知。然而，已知最佳选择需要选择标记在靶组织的相关细胞(所述细胞稍后去分化并且再生成转基因植物)中，在恰当时间并对恰当浓度(高到足以确保高效选择，但不过高以防止对细胞的潜在不利效应)发生表达。玉米遍在蛋白启动子的优异功能及有效性特别还可以表明小麦转基因的细胞需要具有充足量的对小麦为外源(非天然)的代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶(例如DSDA或DAO蛋白质)，以便在应用于这些细胞上的选择压力下存活。这些效应可以是启动子依赖性和/或标记依赖性的，以至于启动子与标记的某些组合胜过其它组合。遍在蛋白启动子因此可以用作驱动小麦中D-氨基酸代谢酶表达的标准启动子。
因此，在本发明的优选实施方案中，将编码代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列偶联至遍在蛋白启动子，优选是植物遍在蛋白启动子，更优选是单子叶植物遍在蛋白启动子，甚至更优选是玉米(Zea mays)遍在蛋白启动子。
术语“遍在蛋白启动子”如本文中所用意指距离遍在蛋白基因或遍在蛋白样基因的起始密码子或图谱上绘制的转录起点的上游至多到5000个碱基对(bp)的基因组DNA区。遍在蛋白是存在于全部真核生物细胞中丰富的含76个氨基酸的多肽。存在编码遍在蛋白的数种不同基因并且它们的同源性在氨基酸水平上极高。例如，人和小鼠具有编码遍在蛋白的众多不同基因，每种基因位于不同的染色体基因座位上。从功能上讲，所有遍在蛋白基因均在细胞的遍在蛋白依赖性蛋白裂解机制中发挥重要作用。每种遍在蛋白基因与驱动该基因表达的启动子连接。遍在蛋白启动子是距离遍在蛋白基因或遍在蛋白样基因的起始密码子或图谱上绘制的转录起点的上游至多到5000个碱基对(bp)的基因组DNA区。
术语“植物遍在蛋白调节系统”指距植物(优选玉米)遍在蛋白基因翻译起点5′端大约2kb的核苷酸序列并且包含这样的序列，其指导转录的启动、转录的调节、表达水平的控制、胁迫基因的诱导以及表达在应答胁迫下的增强。该调节系统(包括启动子和调节功能)是提供对基因表达的调节性控制或调节的DNA序列。
描述了多种植物遍在蛋白基因及其启动子(Callis 1989，1990)。描述了来自双子叶植物如马铃薯(Garbarino 1992)、烟草(Genschick 1994)、番茄(Hoffman 1991)、欧芹(Kawalleck 1993；WO03/102198，本文中引用作为参考)、拟南芥(Callis 1990；Holtorf 1995；UBQ8，GenBank登录号：NM_111814；UBQ1，GenBank登录号：NM_115119；UBQ5，GenBank登录号：NM_116090)的启动子。
因此，本发明的遍在蛋白启动子是包含植物遍在蛋白调节系统的DNA片段(优选长大约2kb)，其中所述的调节系统含有启动子(包含转录起点)和优选地位于所述转录起点5′的一个或多个热休克元件，以及优选地位于所述转录起点3′的内含子，其中该调节系统能够在玉米中调节表达。优选地，表达是组成型和诱导型的基因表达，以至于单子叶植物中的所述组成型基因表达的水平是在单子叶植物中所得到的该诱导型基因表达水平的约三分之一。
优选来自单子叶植物的遍在蛋白启动子。对玉米(Christensen 1992，1996)，稻(RUBQ1，RUBQ2，RUBQ3和RUBQ4；来自RUBQ1和RUBQ2的启动子适用于组成型表达；US6,528,701)描述了此类启动子。
最优选如美国专利号5,614,399、5,510,474、6,020,190、6,054,574和6,068,994中所述的来自玉米的遍在蛋白启动子。此启动子调节含有7个串联重复序列的玉米聚遍在蛋白基因的表达。这种玉米遍在蛋白基因的表达在25℃是组成型的并且在42℃是诱导性的。这种启动子成功地用于数种单子叶植物(Christensen 1996)。在玉米ubil启动子区中，TATA盒位于-30位置并且两个重叠的热休克序列5′-CTGGTCCCCTCCGA-3′及CTCGAGATTCCGCT-3′位于位置-214和-204。规范的CCAAT盒及GC盒存位于启动子区内，但是序列5-CACGGCA-3′(功能未知)出现四次，即在启动子区的位置-236、-122、-96及-91(Christensen 1992)。对小麦的Ubi-1和Ubi-2描述了启动子及它们的表达模式(US6,054,574；Christensen 1992)。
更优选地，遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：5所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：5所示序列的至少50个(优选至少100个、更优选至少250个、甚至更优选至少500个、最优选至少1000个)连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列具有至少60％(优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％)同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性.
在小麦中的“启动子活性”意指实现有效连接的核酸序列在小麦植物中或在衍生自小麦植物的至少一种细胞或组织中转录的能力。优选地，它意指允许在绝大多数组织中及绝大部分发育期中表达的组成型转录活性。玉米遍在蛋白启动子的热休克元件相关性活性可以存在，但非必需。
d)中的杂交意指优选在低严格条件下杂交(使用含30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液在37℃杂交，和在1×至2×SSC中在50℃至55℃洗涤)、更优选在中等严格条件下杂交(在40至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃洗涤)并且最优选在非常严格条件下杂交(在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.1×SSC中在60至65℃洗涤)
由SEQ ID NO：5描述的序列是玉米遍在蛋白启动子的核心启动子。在一个优选的实施方案中，启动子区域和5’-非翻译区和/或内含子均用作转录调节序列。遍在蛋白启动子优选地与内含子、更优选与增强表达的内含子联合使用。这种内含子可以是ubiI基因的天然内含子1(MubG1含有在它5′非翻译区中的1004-碱基对(bp)内含子；Liu 1995)。更优选地，遍在蛋白启动子系统以长度大约2kb为特征，还以如下顺序包含始于5′最末端元件并直至所述DNA片段3′末端的：
a.一个或多个热休克元件，所述元件可以重叠或可以不重叠；
b.包含转录起点的启动子；和
c.长度约1kb的内含子。
更优选使用跨越玉米遍在蛋白基因的启动子、5’-非翻译区和第一内含子的区域，甚至更优选使用由SEQ ID NO：6描述的区域。因此，在另一个优选的实施方案中，本发明方法中所用的遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：6所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：6所述序列的至少50个(优选至少100个、更优选至少250个、甚至更优选至少500个、最优选至少1000个)连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所述序列具有至少60％(优选至少70％，更优选至少80％，甚至更优选至少90％，最优选至少95％)同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所述序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性。
d)中的杂交意指优选在低严格条件下杂交(使用含30％至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液在37℃杂交，和在1×至2×SSC中在50℃至55℃洗涤)、更优选在中等严格条件下杂交(在40至45％甲酰胺、1.0MNaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.5×至1×SSC中在55℃至60℃洗涤)并且最优选在非常严格条件下杂交(在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中37℃杂交，和在0.1×SSC中在60至65℃洗涤)。
因此，本发明所用的遍在蛋白启动子还可以是由SEQ ID NO：5或6所述的启动子的片段或其衍生物。片段可以包括如SEQ ID NO：5或6所述启动子的截短形式，其中已去除非必需序列。缩短的启动子序列具有强大优势，因此它们更易操作并且有时更易优化其基因表达谱。一种制备缩短或截短的启动子的高效及靶向性方法取决于鉴定启动子序列中推测的调节元件。这可以始于同已知的以相似组织特异性方式或发育独特性方式得到表达的启动子序列进行比较。在具有相似表达模式的启动子间共有的序列有可能是用于结合转录因子的候选者并且可能是赋予表达模式的元件。对这些推测性调节元件的证实可以如此实现，即通过对每个推测的调节区进行缺失分析，随后通过测定报道基因而对缺失构建体进行功能性分析，其中所述的报道基因功能性地与每种构建体连接。如此，一旦提供初始启动子序列，则可以轻易制备初始启动子的任何数目的不同缺失突变体。
(例如SEQ ID NO：5或6描述的)遍在蛋白启动子的功能等同片段还可以通过去处或缺失非必需序列而不缺失必需序列来得到。缩减转录调节性核苷酸序列至其必需的转录介导的序列可以在体外通过追踪缩减性(trial-and-arrow)缺失突变，或使用启动子元件搜索途径的硅片上方法(insilico)实现。对启动子活性必需的区域往往表现出成簇的某些已知的启动子元件。此分析可以使用可获得的计算机算法如PLACE(“植物顺式作用的调节性DNA元件”；Higo 1999)、BIOBASE数据库“Transfac”(BiologischeDatenbanken GmbH，Braunschweig；Wingender 2001)或数据库PlantCARE(Lescot 2002)开展。优选地，本发明的转录调节性核苷酸序列之一的功能等同片段包含如SEQ ID NO：5或6所述的转录调节性核苷酸序列的至少100碱基对，优选至少200碱基对，更优选至少500碱基对。更优选地，该片段始于所述序列的3’端。
特别优选通过如此方式得到的转录调节性核苷酸序列的等同片段，即缺失mRNA的编码5’-非翻译区的区域，因而仅提供(非转录的)启动子区。5’-非翻译区可以通过本领域已知的方法(如5’-RACE分析)确定。因此。如SEQ ID NO：5描述的核心启动子区是如SEQ ID NO：6所述序列的片段，其还包含5’-非翻译区和内含子。
衍生物可以还包括例如修饰的小麦启动子序列，该小麦启动子序列例如不包括两个重叠的热休克元件。此类序列例如在美国专利申请20030066108(W001/18220)中描述。
1.1.3其它的元件
表达盒(或其中包含这些表达盒的载体)可以包含除在小麦植物中有活性的启动子(例如遍在蛋白启动子)之外的其它功能性元件和遗传控制序列。术语“功能性元件”或“遗传控制序列”将作广义理解并且指这样的全部序列，它们影响本发明表达盒的实现或功能。例如遗传控制序列调节转录和翻译。描述了遗传控制序列(例如Goeddel 1990；Gruber 1993并且该参考文献在本文中引用)。
优选地，表达盒包含在(例如编码D-氨基酸代谢酶的)核酸序列5’上游的在小麦植物中有活性的启动子(例如遍在蛋白启动子)，和该核酸序列3’下游的终止子序列及聚腺苷酸化信号以及根据需要的其它常用调节元件，在任何情况下它们均与待表达的核酸序列有效连接。
遗传控制序列和功能性元件进一步还包含基因的5’-非翻译区、内含子或非编码3’区，例如肌动蛋白-1内含子或Adh1-S内含子1、2及6(一般性参考：The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot编辑，Springer，纽约(1994))。已经证实它们可以在调节基因的表达中发挥重要作用。因此，已经证实5’-非翻译序列可以增强异源基因的瞬时表达。可以提到的翻译增强子的实例是烟草花叶病毒5’前导序列(Gallie 1987)等。另外，它们可以促进组织特异性(Rouster 1998)。
适合作为遗传控制序列的聚腺苷酸化信号是植物聚腺苷酸化信号、优选与来自根癌农杆菌的T-DNA聚腺苷酸化信号基本上对应的那些植物聚腺苷酸化信号。特别合适的终止子序列的实例是OCS(章鱼碱合酶)终止子和NOS(胭脂碱合酶)终止子。
可以包含在载体中的功能性元件包括
i)确保本发明的表达盒或载体在例如大肠杆菌中复制的复制起点。可以提及的实施例是ORI(DNA复制起点)、pBR322ori或P15A ori(Maniatis，1989)，
ii)使一个或多个核酸序列能够插入并利于其插入的多克隆位点(MCS)，
iii)使同源重组、标记缺失或插入宿主生物基因组成为可能的序列。基于cre/lox(Sauer 1998；Odell 1990；Dale 1991)、FLP/FRT(Lysnik 1993)或Ac/Ds系统(Wader 1987；US5,225,341；Baker 1987；Lawson 1994)的方法允许-根据需要组织特异性地和/或诱导性地-从宿主生物基因组中去除特定DNA序列。控制序列在此上下文中可以意指稍后(例如通过cre重组酶)允许去除的特定侧翼序列(例如lox序列)(也见国际专利申请PCT/EP 2005/002734)，
iv)在用于转移的植物细胞中使农杆菌介导的转移和整合入植物基因组中成为可能的元件，例如边界序列，例如T-DNA或vir区的右边界或左边界。
1.2.第二表达盒
优选地，插入靶植物基因组的DNA构建体包含向小麦植物赋予农学上重要的性状的至少一种第二表达盒。这可以通过表达选择标记、性状基因、反义RNA或双链RNA而实现。本领域技术人员知道可在此上下文中使用的众多序列，例如以提高食物和饲料的品质、产生化学品、精细化学品或药物(例如维生素、油、糖类；Dunwell 2000)、赋予除草剂抗性或造成雄性不育性。此外，生长、产量和对非生物性胁迫因子及生物性胁迫因子(比如真菌、病毒或昆虫)的抗性可以得到增强。可以如此赋予有利的特性，即通过过量表达蛋白质，或通过例如因表达相应的反义RNA而减少内源蛋白质的表达(Sheehy 1988；US4,801,340；Mol 1990)或双链RNA(Matzke2000；Fire 1998；Waterhouse 1998；WO99/32619；WO99/53050；WO00/68374；WO00/44914；WO00/44895；WO00/49035；WO00/63364)而赋予有利的特性。
为表达这些序列，可以使用适合在小麦中使基因表达的所有启动子。优选地，所述的第二表达构建体不包含与用以表达D-氨基酸代谢酶的启动子相同的启动子。表达可以是例如组成型的、诱导型的或发育依赖性的。已知多种启动子用于单子叶植物如小麦中的表达(详见上文)，如稻肌动蛋白启动子(McElroy 1990)、玉米H3组蛋白启动子(Lepetit 1992；Atanassova1992)、来自小麦的富脯氨酸的蛋白质的启动子(WO91/13991)。进一步优选的启动子是在单子叶植物中允许种子特异性表达的那些启动子，如WO99/16890中所述的启动子(麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、水稻素基因、醇溶蛋白基因、麦醇溶蛋白基因、谷蛋白基因、玉米醇溶蛋白基因、casirin基因或裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。
2.本发明的转化和选择方法
2.1植物材料的来源及制备。
多种植物材料可以用于本文中所公开的转化方法。此类植物材料可以包括但不限于例如叶、根、不成熟胚和成熟胚、花粉、分生组织、花序、愈伤组织、原生质体或植物细胞悬浮培养物。优选地，植物材料是不成熟胚。该材料可以受到预处理(例如转化前通过诱导去分化)或未受到预处理。
用于转化的植物材料(例如不成熟胚)可以从几乎任何小麦品种或植物中得到或分离。尤其优选所有小麦物种，尤其是小麦属(包括冬小麦、春小麦和备选型小麦)，更尤其是小麦属中的种：普通小麦(T.aestivum)、硬粒小麦(T.durum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、双粒小麦(Emmer小麦)、圆柱小麦和一粒小麦(Einkorn小麦)，以普通小麦为特别优选。本发明的方法可以用于从春小麦品种(例如Bobwhite和Canon)，以及从冬小麦品种(例如Florida)以及从备选小麦品种(例如Corinto)产生转基因植物。然而，应当指出，本发明的方法不限于某些品种，反而具有高度的基因型非依赖性。如本领域已知、优选如以下实施例所述，将用于分离不成熟胚的小麦植物进行培育并授粉。供体植物优选地通过减少分蘖而为转化做好准备。
在本发明的一个优选实施方案中，方法包括如下步骤
a.分离小麦植物的不成熟胚，和
b.将未受去分化处理的所述分离的不成熟胚与属于根瘤菌属(Rhizobiaceae)的包含至少一种转基因T-DNA的细菌共培养，所述的T-DNA包含至少一种第一表达构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，
并且
c.转移已共培养的不成熟胚至恢复培养基，所述的恢复培养基缺少毒害植物有效量的D-丝氨酸或D-丙氨酸，和
d.在培养基上诱导胚发生愈伤组织的形成并且选择转基因愈伤组织，其中该培养基包含
i.有效量的至少一种植物生长素化合物，和
ii.总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，和
e.自所述转基因愈伤组织再生并选择含有转基因T-DNA的植物。
在一个优选的实施方案中，T-DNA还包含赋予所述小麦植物有农学价值的性状至少一种第二表达构建体，然而其它基因(例如报道基因)也可以与用于能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶(即选择标记)的表达盒组合而转化至小麦植物中。
因此在一个实施方案中，本发明也涉及细胞培养物，该细胞培养物包含从不成熟的小麦胚中衍生的一种或多种胚发生愈伤组织、至少一种植物生长素(其优选地处于以下所述的浓度)和总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。在一个实施方案中，细胞培养物还包含属于根瘤菌属的细菌。
术语“不成熟胚”如本文中所用意指不成熟种子的胚，其中不成熟的种子处于发育早期并且授粉后成熟。不限制待经本发明方法处理的不成熟胚发育期并且所采集的胚可以处在授粉后的任何阶段。优选的胚是在受精后不超过2日时采集的那些胚。还优选在不成熟胚内能够诱导去分化愈伤组织的小盾片，其中所述的去分化愈伤组织通过以下提及的方法加以转化后，具有再生出正常植物的能力。
在优选的实施方案中，不成熟胚是处于授粉后不超过10日期间的不成熟胚。更优选地，不成熟胚分离自授粉后(DAP)12至14日的花穗。收获的确切时间根据生长条件和小麦品种变化。不成熟胚的大小是其发育期的良好指示。用于转化的不成熟胚的最佳长度是约1mm至1.2mm，包括小盾片的长度。胚应当是透明的，而非不透明。
在本发明中，不成熟胚可以在液体感染培养基中分离、在相同培养基中洗涤两次以清洁胚表面并为农杆菌感染准备好细胞。在感染后，将外植体并排放置在小盾片侧部以共培养。然而，感染还可以通过本领域技术人员已知的多种其它方法完成，例如用小量的农杆菌混悬液直接接种分离的胚，随后将胚放置在固化的共培养的培养基表面。
优选地，不成熟胚接受转化(共培养)处理，无需去分化的预处理。优选用细胞壁降解酶或致伤法(例如用小刮刀切割或用针头扎孔)处理不成熟胚。然而，这种降解作用和致伤步骤不是必需的并且在本发明的优选实施方案中被省略。
术语“去分化”、“去分化处理”或“去分化的预处理”意指通过在去分化培养基上培养植物组织的已分化细胞而得到表现出未组织化生长的细胞团如愈伤组织的过程。更具体地，术语“去分化”如本文中所用将意指形成在植物体范围内无特定功能的快速分裂性细胞。这些细胞常常具有在发育成多种植物组织的能力方面增加的潜能。优选地，该术语将意指已分化或特化的组织逆转成多能性或全能性更强的形式(例如胚)。去分化可以导致植物组织的重编程(首先逆转成未分化的非特化细胞，随后进入新的不同途径)。术语“全能性(totipotency)”如本文中所用将意指含有形成完整植物所需要的全部遗传信息和/或细胞信息的植物细胞。去分化可以由某些植物生长调节物(例如植物生长素和/或细胞分裂素化合物)、尤其由它们的某些组合和/或浓度启动。
2.2转化方法
2.2.1一般技术
DNA构建体可以根据本发明使用其中插入该DNA构建体的载体而有利地导入细胞。载体的实例可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒、逆转录病毒或农杆菌。在有利的实施方案中，将表达盒通过质粒载体导入。优选的载体是能够使表达盒稳定整合入宿主基因组的那些载体。
DNA构建体可以通过本领域技术人员已知的数种方法中的任意方法(即所谓转化法)导入靶植物细胞和/或靶生物(也见Keown 1990)。已经描述了适用于小麦的多种转化方法。
例如DNA构建体可以使用发射方法如DNA粒子轰击法直接导入植物细胞或DNA构建体可以使用技术如细胞的电穿孔和显微注射法导入。粒子介导的转化技术(又称作“生物射弹”)在例如EP-A1270,356；US5,100,792、EP-A-444882、EP-A-434616；Klein 1987；Vasil 1993以及Becker 1994中描述。这些方法涉及借助在小珠或小粒子基质中或表面的具有核酸的小颗粒穿入细胞。生物射弹PDS-1000基因枪(Biorad，Hercules，CA)使用氦压来使涂有DNA层的金微载体或钨微载体向靶细胞加速。该方法可用于来自生物(包括植物)的广泛类型的组织和细胞。其它转化方法也为本领域技术人员所知。
其它技术包括显微注射(WO92/09696、WO94/00583、EP-A331083、EP-A175966、Green 1987)、聚乙二醇(PEG)介导的转化(Paszkowski1984；Lazzeri 1995)、基于脂质体的基因递送(WO93/24640；Freeman1984)、电穿孔(EP-A290395、WO87/06614；Fromm 1985；Shimamoto1992)。
在使DNA注射或电穿孔至植物细胞的情况下，待转化的DNA构建体不需要满足任何特殊要求(实际上可以使用“裸”表达盒)。可以使用简单质粒，如pUC系列质粒。
除了这些“直接”转化技术之外并且优选地，转化还可以借助土源性细菌如根癌农杆菌或发根农杆菌通过细菌感染加以实施。这些菌株含有一种质粒(Ti质粒或Ri质粒)。该质粒的称作T-DNA的部分(转移的DNA)在农杆菌感染后被转移至植物中并且整合到植物细胞的基因组中。虽然最初研发用于双子叶植物，农杆菌介导的转化已经用于单子叶植物的转化方法(Hiei 1994)。已描述例如用于稻、玉米、小麦、燕麦和大麦的转化(综述见Shimamoto 1994；Vasil 1992，1996；Vain 1995；Wan和Lemaux 1994)。
对于植物的农杆菌介导的转化，本发明的DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区域连接并被导入常用根癌农杆菌宿主载体。当细胞受细菌感染时，根癌农杆菌宿主的毒力功能将指导转基因及毗邻标记基因(若存在)插入植物细胞DNA。因此，将本发明的DNA构建体优选地整合入适用于农杆菌介导的转化的特定质粒内，即整合入穿梭载体或中介载体或至双元载体内。例如若Ti质粒或Ri质粒待用于转化，将Ti质粒或Ri质粒的T-DNA的至少右边界，不过大多数情况下它们的右边界和左边界作为侧翼区域与待导入的表达盒连接。优选使用能够在大肠杆菌内和农杆菌内复制的双元载体。双元载体可以直接转化至农杆菌内(Holsters1978)。
2.2.2农杆菌介导的转化(共培养)
用于转移T-DNA至不成熟胚内的土源性细菌可以是根瘤菌科的任何物种。根瘤菌科所包含的农杆菌属、根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)和另类根瘤菌属(Allorhizobium)是本细菌科中的属并且基于核糖体特征已经纳入变形杆菌门菌(Proteobacteria)的α-2亚类。根瘤菌科成员是需氧革兰氏阴性菌。细胞通常呈短杆状(0.6-1.0μm×1.5-3.0μm)，单在或成对存在，无内生孢子并且通过1条至6条周鞭毛运动。庞大的细胞外多糖粘液通常在含糖类培养基上的生长期间产生。特别优选根瘤菌科(Rhizobiaceae)如苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、Sinorhizobiummedicae、弗氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)、根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、根瘤菌BR816(Rhizobium sp.BR816i)、根瘤菌N33(Rhizobium sp.N33)、根瘤菌GRH2(Rhizobium sp.GRH2)、萨赫勒中华根瘤菌(Sinorhizobium saheli)、适宜中华根瘤菌(Sinorhizobiumterangae)、豌豆根瘤菌(三叶草生物型)(Rhizobium leguminosarum biovartrifolii)、豌豆根瘤菌(蚕豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovarviciae)、豌豆根瘤菌(菜豆生物型)(Rhizobium leguminosarum biovarphaseoli)、热带根瘤菌(Rhizobium tropici)、埃特里根瘤菌(Rhizobium etli)、山羊豆根瘤菌(Rhizobium galegae)、高卢根瘤菌(Rhizobium gallicum)、贾氏根瘤菌(Rhizobium giardinii)、海南根瘤菌(Rhizobium hainanense)、内蒙古根瘤菌(Rhizobium mongolense)、羽扇豆根瘤菌(Rhizobium lupini)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、华癸中生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)、鹰嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobium ciceri)、地中海中生根瘤菌(Mesorhizobium mediterraneium)、天山中生根瘤菌(Mesorhizobiumtianshanense)、埃氏慢生根瘤菌(Bradyrhizobium elkanni)、日本慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)、辽宁慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、Allobacteriumundicola、Phyllobacterium myrsinacearum、根癌农杆菌、放射状农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、发根农杆菌、葡萄农杆菌(Agrobacteriumvitis)和悬钩子农杆菌(Agrobacterium rubi)。还优选Broothaerts(2005)中所述的菌株和方法。
农杆菌属、另类根瘤菌属和根瘤菌属的单系特点(monophyletic nature)及它们的共同表型类属性范围支持将它们合并成一个单一属，即根瘤菌属。对农杆菌菌株的分类和表征(包括区分根癌农杆菌与发根农杆菌以及其多种冠瘿碱型分组)是本领域众所周知的惯例(见例如Laboratory guide foridentification of plant pathogenic bacteria，第3版(2001)Schaad、Jones和Chun(编者)ISBN 0890542635；例如Moore等在其中所发表的文章)。最近分析证实通过它们的植物致病特性分类可能是不合理的。因此采用基于基因组分析和比较(如16S rRNA测序；RFLP、Rep-PCR等)的更先进方法来阐明多种菌株的关系(见例如Young 2003、Farrand 2003、deBruijn 1996、Vinuesa 1998)。Llob 2003描述通过两种方法所确定的农杆菌属成员系统发生关系与农杆菌菌株K599的关系。
本领域已知农杆菌和其它土源性细菌均能够介导T-DNA转移，只要它们具有用于Ti质粒或Ri质粒的T-DNA转移的相关功能元件(Klein和Klein 1953；Hooykaas 1977；vanVeen 1988)。
优选地，土源细菌属于农杆菌属。术语“农杆菌”如本文中所用指土源性、革兰氏阴性、短杆状的植物致病菌。比较的16S rDNA分析，农杆菌属中的种：根癌农杆菌(同义于放射状农杆菌)、发根农杆菌、葡萄农杆菌和悬钩子农杆菌以及Allorhizobium undicola一同形成含有根瘤菌属全部物种的单系分组(Sawada 1993，Young 2003)。农杆菌是包含植物致病物种的一个人工属。
术语Ti质粒如本文中所用指这样的质粒，它能够在农杆菌中复制并处于能够在农杆菌感染植物中介导冠瘿形成的天然的“带甲(armed)”形式中。用农杆菌Ti质粒的天然的“带甲”形式感染植物细胞，通常导致感染细胞产生冠瘿碱(例如胭脂碱，农杆碱，章鱼碱等)。因此，将引起胭脂碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4301、C58、A208)称作“胭脂碱型”农杆菌；将引起章鱼碱产生的农杆菌菌株(例如菌株LBA4404、Ach5、B6)称作“章鱼碱型”农杆菌，以及将引起农杆碱产生的农杆菌菌株(例如菌株EHA105、EHA101、A281)称作“农杆碱型”农杆菌。将卸甲的Ti质粒理解为这样的Ti质粒，该质粒缺少介导冠瘿形成的特性，但提供用于植物感染的功能。优选地，所述“卸甲(disarmed)”Ti质粒的T-DNA区以如此方式受到修饰，以至于除边界序列之外，功能性内部Ti-序列均不能转移至植物基因组中。在优选的实施方案中一当与双元载体系统共用时一整个T-DNA区(包括T-DNA边界)被缺失。
术语Ri质粒如本文中所用指这样的质粒，它能够在农杆菌中复制并处于能够在农杆菌感染植物中介导毛根病的天然的“带甲”形式中。用农杆菌Ri质粒的天然的“带甲”形式感染植物细胞，通常导致感染细胞产生冠瘿碱(在转化的植物细胞中产生特殊的氨基糖衍生物，例如农杆碱、南瓜氨酸、章鱼碱、mikimopine等)。发根农杆菌菌株通常以根癌农杆菌菌株那样的相同方式划分成亚类。最常见的菌株是农杆碱型菌株(例如以Ri质粒pRi-A4为特征)、甘露氨酸型菌株(例如以Ri质粒pRi8196为特征)和南瓜氨酸型菌株(例如以Ri质粒pRi2659为特征)。某些其它菌株是mikimopine型(例如以Ri质粒pRi1723为特征)。Mikimopine与南瓜氨酸是立体异构体，但是在诸pRi质粒间不存在核苷酸上的同源性(Suzuki 2001)。将卸甲的Ri质粒理解为这样的Ri质粒，该质粒缺少介导毛根病的特性，但提供用于植物感染的功能。优选地，所述“卸甲”Ri质粒的T-DNA区以如此方式得到修饰，以至于除边界序列之外，功能性内部Ri-序列均不能转移至植物基因组中。在优选的实施方案中-当与双元载体系统共用时-整个T-DNA区(包括T-DNA边界)被缺失。
根癌农杆菌及发根农杆菌的Ti质粒和Ri质粒分别携带负责遗传转化植物的基因(Kado 1991)。载体以农杆菌Ti质粒或Ri质粒为基础并且利用DNA转移至植物基因组中的天然系统。作为高度发达的寄生生活的部分，农杆菌转移其基因组信息的经定义的部分(T-DNA；在两侧具有约25bp重复序列，称作左边界和右边界)至植物细胞的染色体DNA(Zupan 2000)。通过所谓vir基因(原始Ti质粒的部分)的联合作用，介导所述的DNA转移。为利用这种天然系统，开发了缺失原始的肿瘤诱导性基因的Ti质粒(“卸甲载体”)。在进一步改进即所谓“双元载体系统”中，将T-DNA通过导入允许更易操作的穿梭载体内而与Ti质粒的其它功能性元件(例如vir基因)物理性地开分(EP-A120516；US4,940,838)。这些双元载体(除了带有边界序列的卸甲T-DNA之外)还包含用于在农杆菌及大肠杆菌中复制的原核序列。农杆菌介导的转化的有利之处在于通常在两侧翼具有边界的DNA才被转移至基因组中并且优选地仅插入一个拷贝。对用于农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在本领域是已知的(Miki 1993；Gruber 1993；Moloney 1989)。
因此对于农杆菌介导的转化，将遗传组合物(例如包含表达盒)整合入特定质粒，或整合入穿梭载体或中间载体或整合入双元载体。若Ti质粒或Ri质粒将用于转化，将Ti质粒或Ri质粒的T-DNA的至少右边界，不过大多数情况下它们的右边界和左边界以侧翼区域形式连接至待导入的表达盒。优选使用双元载体。双元载体能够在大肠杆菌中并在农杆菌中复制。它们可以包含在两翼具有T-DNA右边界序列和T-DNA左边界序列的选择标记基因和接头或多接头(用于插入例如待转移的表达盒)。双元载体可以直接转化至农杆菌中(Holsters 1978)。选择标记基因允许对转化的农杆菌选择并且是例如赋予卡那霉素耐药性的nptII基因。在此情况下充当宿主生物的农杆菌应当已经含有带vir区的质粒。vir区是T-DNA转移至植物细胞中所需要的。以如此方式所转化的农杆菌可以用来转化植物细胞。T-DNA转化植物细胞的用途已经得到充分研究和描述(EP120516；Hoekema 1985；An 1985)。
常用双元载体基于“广宿主范围”质粒如衍生自P型质粒RK2的pRK252(Bevan 1984)或pTJS75(Watson 1985)。这些载体大部分是pBIN19的衍生物(Bevan 1984)。多种双元载体是已知的，其中某些双元载体是可商业获得的，例如pBI101.2或pBIN19(ClontechLaboratories，Inc.USA)。其它载体在大小和操作性方面得到改良(例如pPZP；Hajdukiewicz 1994)。改良的载体系统也在WO02/00900中描述。
优选地，土源性细菌是属于农杆菌科的细菌，更优选卸甲的根癌农杆菌或发根农杆菌菌株。在优选的实施方案中，用于实施本发明的农杆菌菌株包括章鱼碱菌株例如LBA4404，或农杆碱菌株例如EHA101或EHA105。用于DNA转移的合适根癌农杆菌菌株是例如EHA101[pEHA101](Hood1986)、EHA105[pEHA105](Li 1992)、LBA4404[pAL4404](Hoekema 1983)、C58C1[pMP90](Koncz和Schell 1986)和C58C1[pGV2260](Deblaere1985)。其它合适的菌株是根癌农杆菌C58(胭脂碱菌株)。其它合适的菌株是根癌农杆菌C58C1(Van Larebeke 1974)、A136(Watson 1975)或LBA4011(Klapwijk 1980)。在另一个优选的实施方案中，土源性细菌是发根农杆菌菌株K599的卸甲变体(NCPPB 2659)。此类菌株在2004年9月2日提交的美国专利临时申请号60/606,789中描述，该文献在本文中完整引用作为参考。
优选地，这些菌株包含Ti质粒或Ri质粒的卸甲质粒变体，该卸甲质粒变体提供将T-DNA转移至植物细胞中所需的功能(例如vir基因)。在优选的实施方案中，用来转化与植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有L，L-琥珀碱型Ti质粒、优选是卸甲的L，L-琥珀碱型Ti质粒，如pEHA101。在另一个优选的实施方案中，用来转化与植物酚类化合物预培养的植物组织的农杆菌菌株含有章鱼碱型Ti质粒，优选地是卸甲的章鱼碱型Ti质粒，如pAL4404。当使用章鱼碱型Ti质粒或辅助质粒时，virF基因优选地被缺失或失活(Jarschow 1991)。
本发明方法还可以与特定的农杆菌菌株联合使用，如其中vir基因表达和/或vir基因表达的诱导因存在突变的或嵌合的virA基因或virG基因而受到改变的农杆菌菌株(例如Hansen 1994；Chen和Winans 1991；Scheeren-Groot，1994)，以便进一步增加转化效率。优选根癌农杆菌菌株LBA4404(Hiei 1994)与超强毒性质粒的其它组合。这些超强毒性质粒优选地是基于pTOK246的载体(Ishida 1996)。
双元载体或其它任何载体可以通过常规的DNA重组技术加以修饰，在大肠杆菌中增殖并通过例如电穿孔法或其它转化技术(Mozo 1991)导入农杆菌。
农杆菌优选地以类似于Ishida(Ishida 1996)所述的方式加以培养和使用。包含农杆菌菌株的载体例如可以在补充适宜的抗生素(例如50mg/L壮观霉素)的YP培养基(5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、5g/L NaCl、15g/L琼脂、pH6.8)上培育3日。细菌用接种环从固体培养基上收集并重悬。在本发明的优选实施方案中，农杆菌培养以使用在-80℃冷冻的等分试样开始。
通过农杆菌对不成熟胚的转化可以通过仅使不成熟胚与农杆菌接触而实施。用于感染和共培养的农杆菌浓度可能需要变动。例如制备农杆菌的细胞混悬液，其中所述的细胞混悬液具有群体密度约105至1011个、优选106至1010个、更优选约108个细胞或菌落形成单位/ml，并将不成熟胚在这种混悬液内在26℃浸泡约3分钟至5小时，优选约1小时。得到的不成熟胚随后在固体培养基上与农杆菌一起培养数日(共培养)。
在用于感染和共培养步骤的另一个优选实施方案中，将共培养性培养基或感染培养基中的土源性细菌(例如农杆菌)混悬液直接应用至每一胚上并且去除覆盖胚的过量液体。液体的去除可以通过多种方法完成，优选地通过空气干燥法或吸收法。这节省劳动和时间并且减少因过量使用农杆菌所致的非预期的农杆菌介导的损伤。在优选的实施方案中，采用约1μl至约10μl的土源性细菌(例如农杆菌)混悬液。优选地，不成熟胚直接用农杆菌在共培养性培养基上感染。优选地，使用浓度106至1011个菌落形成单位/ml的细菌。
对于农杆菌处理分离的不成熟胚，将细菌重悬于植物兼容的共培养性培养基中。用可减少因植物防御应答(如酚氧化作用)所致的组织坏死的乙烯抑制物(例如硝酸银)、酚吸收性化合物(如聚乙烯吡咯烷酮，Perl 1996)或抗氧化剂(如巯基化合物，例如二硫苏糖醇、L-半胱氨酸，Olhoft 2001)对共培养性培养基进行补充可以进一步改善农杆菌介导的转化的效率。在另一个优选的实施方案中，共培养性培养基包含至少一种巯基化合物，该巯基化合物优选地选自硫代硫酸钠、二硫苏糖醇(DTT)和半胱氨酸。优选地，浓度是约1mM至10mM间的L-半胱氨酸、0.1mM至5mM DTT和/或0.1mM至5mM硫代硫酸钠。优选地，在共培养期间所用的培养基包含约1μM至约10μM硝酸银和/或(优选“和”)约50mg/L至约1,000mg/L的L-半胱氨酸。这导致高度降低不成熟胚对农杆菌介导的损伤(如诱导的坏死)的脆弱性并高度改善整体转化效率。
可以采用从数小时至10日的一系列共培养时间。农杆菌与分离的不成熟胚的共培养通常在26℃实施约12小时至约7日，优选约5日至约6日(更优选在如以下实施例中所述的培养基PAW-1中)。
在本发明的改良的实施方案中，分离的不成熟胚和/或农杆菌可以在农杆菌共培养之前或期间用酚类化合物处理。在本发明范围内适用的“植物酚类化合物”或“植物酚类”是能够诱导阳性趋化应答的那些分离的经取代的酚分子，尤其能够在含Ti质粒的农杆菌物种、尤其含Ti质粒的根癌农杆菌中诱导vir基因表达增加的那些酚分子。测量对植物酚类化合物趋化应答的方法已经得到描述例如(Ashby 1988)并且测量对vir基因表达的诱导的方法也是众所周知的(Stachel 1985；Bolton 1986)。农杆菌共培养期间的预处理和/或处理具有至少两种有益效应：诱导Ti质粒或辅助质粒的vir基因(Van Wordragen 1992；Jacq 1993；James 1993；Guivarc′h 1993)并增强引入外源DNA至植物细胞基因组中的能力。
因此，在一个实施方案中，本发明还涉及细胞培养物，其包含从不成熟的小麦胚衍生的一种或多种胚发生愈伤组织、至少一种植物生长素(其优选地处于如下所述的浓度)、总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和至少一种植物酚类化合物，例如下文所列的一种或多种植物酚类化合物。在一个实施方案中，细胞培养物还包含属于根瘤菌属的细菌。
优选的植物酚类化合物是在植物细胞的伤口溢泌物中发现的那些植物酚类化合物。最知名的植物酚类化合物之一是乙酰丁香酮，其存在于多种植物的许多受损伤细胞及完整细胞中，尽管浓度不同。然而，乙酰丁香酮(3，5-二甲氧基-4-羟基苯乙酮)不是可以诱导vir基因表达的唯一植物酚。其它实施例是羟基-乙酰丁香酮、芥子酸(3，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)、丁香酸(4-羟基-3，5二甲氧基苯甲酸)、阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸)、儿茶酚(1，2-二羟基苯)、对羟基苯甲酸(4-羟基苯甲酸)、间-雷琐酸(2，4-二羟基苯甲酸)、原儿茶酸(3，4-二羟基苯甲酸)、焦性没食子酸(2，3，4-三羟基苯甲酸)、没食子酸(3，4，5-三羟基苯甲酸)和香草醛(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，并且已知或预期这些酚类化合物能替换栽培培养基中的乙酰丁香酮，并具有相似结果。如本文中所用，将所提及的分子称作植物酚类化合物。
植物酚类化合物可以单独或与其它植物酚类化合物联合而添加至植物培养基中。特别优选的植物酚类化合物的组合至少包含乙酰丁香酮及对羟基苯甲酸，但是预期两种或多种植物酚类化合物的其它组合也将在增进转化效率方面协同地发挥作用。
此外，某些化合物如渗透保护剂(例如L-脯氨酸，优选浓度约200-1000mg/L，或甜菜碱)、植物激素(尤其NAA)、冠瘿碱或糖在与植物酚类化合物联合添加时协同地发挥作用。
在本发明的一个实施方案中，优选在分离的不成熟胚与农杆菌接触之前，将植物酚类化合物、尤其是乙酰丁香酮添加至培养基中(优选地持续约1小时至约24小时)。认为培养细胞在含有植物酚类化合物如乙酰丁香酮的培养基中孵育的确切时间长短不是关键性的并且仅受不成熟胚开始分化的时间所限。
认为培养基中植物酚类化合物的浓度也对整合性转化的胜任性的发展有影响。培养基中植物酚类化合物的最佳浓度可以根据从中衍生不成熟胚的小麦品种变化，但是预期约100μM至700μM是对众多目的适合的浓度。然而，可以使用低达大约25μM的浓度以在转化效率上得到良好效果。类似地，预期至多到约1000μM的更高浓度将产生类似效果。可比较的浓度适用于其它植物酚类化合物，且最佳浓度可以通过本发明的实验轻易建立。
待与分离的不成熟胚共培养的农杆菌在从农杆菌培养基中分离后可以如本领域技术人员所知与乙酰丁香酮或其它植物酚类化合物进行预孵育，或直接使用。对根癌农杆菌特别适合的诱导条件已由Vernade等(1988)描述。用农杆菌的转化效率可以通过本领域已知的其它方法例如真空浸润法(WO 00/58484)、热休克法和/或离心、添加硝酸银、超声波处理等予以增强。
在本发明中已观察到农杆菌对分离的不成熟胚的转化效率通过将共培养性培养基的pH维持在5.4至6.4、优选5.6至6.2、尤其优选5.8至6.0而得到显著改善。在本发明的改良实施方案中，由MES及磷酸氢钾缓冲液的组合介导而使pH稳定在该范围内。
2.3恢复
转化细胞，即包含整合入宿主细胞DNA中的DNA的那些细胞，可以从未转化细胞中选择出来，优选地使用本发明的选择方法。
在转移至恢复培养基和/或选择培养基之前，尤其在农杆菌介导的转化的情况下，可以采用某些其它的中间步骤。例如自共培养步骤中仍存在的任何农杆菌可以予以除去(例如通过洗涤步骤)。为防止所述细菌的再生长，随后采用的恢复培养基和/或选择培养基优选地包含适用于防止农杆细菌生长的杀菌剂(抗生素)。优选待用的杀菌抗生素是例如头孢噻肟(例如浓度约500mg/l)或特美汀TM(例如浓度约160mg/l；GlaxoSmithKline；替卡西林二钠与克拉维酸钾的混合物；0.8g特美汀TM含有50mg克拉维酸及750mg替卡西林。在化学上，替卡西林二钠是N-(2-羧基-3，3-二甲基-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚-6-基)-3-噻吩丙酰胺酸二钠盐。化学上，克拉维酸钾是钾(Z)-(2R，5R)-3-(2-羟基亚乙基)-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂二环[3.2.0]庚-2-羧酸盐)。
优选紧随转化过程后的步骤(例如共培养)不包含毒害植物有效量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物(它们随后用于转化)。因此，该步骤将允许转化组织再生，促进在农杆菌感染的胚中启动胚发生愈伤组织的形成并且杀死剩余的农杆菌细胞。因此，在优选的实施方案中，本发明的方法包括将转化的靶组织(例如共培养的不成熟胚)转移至(步骤c中使用的)恢复培养基中的步骤，其中该恢复培养基包含
i.阻止或抑制土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素，和/或(优选“和”)
ii.浓度约1g/l至约10g/l的L-脯氨酸，和/或(优选“和”)
iii.浓度约1μM至约50μM的硝酸银。
因此在一个实施方案中，本发明涉及恢复培养基，该恢复培养基包含阻止或抑制土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素和/或(优选“和”)浓度约1g/l至约10g/l的L-脯氨酸和/或(优选“和”)浓度约0μM至约50μM的硝酸银。优选地，培养基还包含转化的靶组织(例如共培养的不成熟胚)。
优选地，所述恢复培养基不包含毒害植物有效量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。恢复培养基还可以包含有效量的至少一种植物生长调节物(例如有效量的至少一种植物生长素化合物)。因此，步骤c)的恢复培养基优选地包含
i.阻止或抑制土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素，和
ii.浓度约1g/l至约10g/l的L-脯氨酸，和
iii.浓度约0μM至约50μM的硝酸银，优选不使用硝酸银；
iv.有效量的至少一种植物生长素化合物。
优选的恢复培养基的实例在下文实施例(A-4或A-5)中给出。恢复时间(即没有由毒害植物量的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸所产生的选择压力的去分化条件下的时间段)可以持续约1日至约30日、优选约5日至约20日、更优选约14日。优选地，恢复时间(愈伤组织启动并增殖)在黑暗中持续约7日并在半照明13.2μmol/m-2/sec-1下持续另外7日。培养基如PAW-2(见实施例)可以用于此目的。优选地，小盾片侧部在此期间保持朝上，且不埋入培养基中。
2.4选择
在恢复步骤后，将靶组织(例如不成熟胚)转移至并在选择培养基上孵育。选择培养基包含毒害植物浓度(即终止或至少迟滞非转化细胞生长的浓度)的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。术语“毒害植物的”、“植物毒性”或“毒害植物的效应”如本文中所用将意指对植物或植物细胞的生理学的任何可测量的不利影响，包括(但不限于)例如减少或受损的生长、减少或受损的光合作用、减少或受损的细胞分裂、减少或受损的(例如来自细胞培养、愈伤组织或苗等的成熟植物的)再生、减少或受损的可育性等。植物毒性还可以包括以下效应，例如坏死或凋亡。在优选的实施方案中与未用所述毒害植物的化合物处理的植物相比，导致生长或再生能力减少至少50％，优选至少80％，更优选至少90％。
因此在一个实施方案中，本发明涉及选择培养基，该选择培养基包含靶组织(例如胚性小麦愈伤组织，即上文所述的已转化并再生的小麦不成熟胚)和处于如下文所述的毒害植物浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。
用于选择的特定化合物根据表达哪种标记蛋白质进行选择。例如在其中采用大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶的情况下，选择在包含D-丝氨酸的培养基上完成。在其中采用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶的情况下，选择在包含D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
事实是采用D-氨基酸并不排除L-氨基酸结构或L-氨基酸的存在。对于某些应用，可以优选(例如出于成本原因)使用D-氨基酸与L-氨基酸的外消旋混合物(或具有丰富含量D-氨基酸的混合物)。优选地，D-氨基酸与相应L-对映体的比率是至少1∶1、优选2∶1、更优选5∶1、最优选10∶1或100∶1。使用D-丙氨酸的有利之处在于可以应用D-氨基酸与L-氨基酸的外消旋混合物而不干扰或消减L-对映体的效果。因此在改良实施方案中，采用D/L-丙氨酸的外消旋混合物作为复合物。
术语“衍生物”就D-丙氨酸或D-丝氨酸而言，意指包含D-丙氨酸或D-丝氨酸的各自D-氨基酸结构，但是受到化学修饰的化学化合物。如本文中所用，术语“D-氨基酸结构”(如“D-丝氨酸结构”)旨在包括D-氨基酸，以及保留D-氨基酸化合物的功能活性的D-氨基酸类似物、衍生物和模拟物。如本文中所用，“衍生物”还指D-丝氨酸或D-丙氨酸的如此形式，其中该形式中的一个或多个反应基团已经用取代基进行衍生化。所有的D-氨基酸可以由氨基末端修饰基团或羧基末端修饰基团修饰或由侧链修饰作用修饰。氨基末端修饰基团可以例如选自苯乙酰基、二苯乙酰基、三苯乙酰基、丁酰基、异丁酰基、己酰基、丙酰基、3-羟基丁酰基、4-羟基丁酰基、3-羟基丙酰基、2，4--二羟基丁酰基、1-金刚烷基羰基、4-甲基戊酰基、2-羟苯基乙酰基、3-羟苯基乙酰基、4-羟苯基乙酰基、3，5-二羟基-2-萘酰基、3，7-二羟基-2-萘酰基、2-羟肉桂酰基、3-羟肉桂酰基、4-羟肉桂酰基、氢化肉桂酰基、4-甲酰肉桂酰基、3-羟基-4-甲氧基肉桂酰基、4-羟基-3-甲氧基肉桂酰基、2-羧基肉桂酰基、3，4-二羟基氢化肉桂酰基、3，4-二羟肉桂酰基、反-肉桂酰基、(±)-扁桃酰基、(±)-扁桃酰基-(±)-扁桃酰基、乙醇酰基、3-甲酰苯甲酰基、4-甲酰苯甲酰基、2-甲酰苯氧乙酰基、8-甲酰-1-萘酰基、4-(羟甲基)苯甲酰基、3-羟基苯甲酰基、4-羟基苯甲酰基、5-乙内酰脲代乙酰基(5-hydantoinacetyl)、L-hydroorotyl、2，4-二羟基苯甲酰基、3-苯甲酰基丙酰基、(±)-2，4-二羟基-3，3-二甲基丁酰基、DL-3-(4-羟苯基)乳酰基、3-(2-羟苯基)丙酰基、4-(2-羟苯基)丙酰基、D-3-苯基乳酰基、3-(4-羟苯基)丙酰基、L-3-苯基乳酰基、3-吡啶乙酰基、4-吡啶乙酰基、异烟酰基、4-喹啉羧基、1-异喹啉羧基和3-异喹啉羧基。羧基末端修饰基团可以例如选自酰胺基、烷基酰胺基、芳基酰胺基和羟基。如本文中所用的“衍生物”旨在包括模拟各自的D-氨基酸结构并保留D-氨基酸结构的功能特性的化学结构。设计氨基酸或肽的类似物、衍生物和模拟物的方法是本领域已知的(例如见Farmer 1980；Ball 1990；Morgan 1989；Freidinger 1989；Sawyer 1995；Smith 1995；Smith 1994；Hirschman 1993)。其它可能的修饰包括N-烷基(或芳基)取代物或主链交联以构造内酰胺和其它环状结构。其它衍生物包括羧基末端的羟甲基衍生物、O-修饰的衍生物(例如羧基末端的羟甲基苄基醚)，氨基末端修饰的衍生物包括取代的酰胺如烷基酰胺和酰肼。此外，可以采用包含D-氨基酸结构的杀菌化合物。此类化合物例如在US5,059,239中描述，并且可以包括(但不应当限于)N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-DL-丙氨酸乙酯、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸、N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸甲酯或N-苯甲酰基-N-(3-氯-4-氟苯基)-D-丙氨酸异丙酯。
选择化合物可以与其它物质联合使用。为本申请的目的，选择化合物还可以与制剂领域内通常采用的辅料一起使用，并因此以已知的方式配制成例如可乳化性浓缩剂、可包衣性糊剂、可直接喷雾或溶解的溶液剂、稀薄乳剂、可湿性散剂、可溶性散剂、粉剂、颗粒剂以及在例如聚合物物质中的胶囊剂。如就待使用的组合物的性质而言，应用的方法根据预期目标和主导条件进行选择，如喷雾、雾化、撒粉、分散、包衣或倾倒。然而，更优选将选择化合物直接应用至培养基。有利的是可以产生选择化合物的贮存液并将贮存液在室温储藏持续延长的时间段而不丧失选择效率。
选择化合物(即D-丙氨酸、D-丝氨酸、其衍生物或其任何组合)的最佳浓度可以根据转化所用的靶组织而变化，但是通常(并且对于不成熟胚的转化而言优选)D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的总浓度(即混合物情况下的总量)是范围约3mM至约100mM。例如当采用大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶的情况下，选择在包含D-丝氨酸(其例如被掺入琼脂固化的MS培养基平板中)、优选地包含浓度约3mM至约100mM、更优选约4mM至约50mM、甚至更优选约4.5mM至约30mM、最优选约5mM至约10mM的D-丝氨酸的培养基上进行。例如当采用瘦弱红酵母D-氨基酸氧化酶的情况下，选择在包含D-丙氨酸和/或D-丝氨酸(其例如被掺入琼脂固化的MS培养基平板中)、优选包含总浓度约3mM至约100mM、更优选约4mM至约50mM、甚至更优选约4.5mM至约20mM、最优选约5mM至约10mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行。
选择时间也可以根据所用的靶组织和所用的再生方法而变化。通常，选择时间是至少约5日，优选至少约14日。更具体地，总选择时间在去分化条件下(即愈伤组织诱导)是约1周至约10周、优选约3周至7周、更优选约3周至4周。然而，优选是采用在去分化条件下的选择不超过70日。在选择时间段之间，愈伤组织可以转移至新鲜选择培养基中一次或多次。对于本文中提供的具体方法，优选采用两个选择培养基步骤(例如转移至新的选择培养基一次)。优选地，选择步骤以两个步骤进行，使用第一选择步骤持续约14日至20日，随后转移存活的细胞或组织至与第一选择培养基具有基本上相同组分的第二选择培养基中持续额外14日至约20日。然而，还可能采用单步骤选择。
优选地，所述选择培养基-对部分的选择期间而言-也是去分化培养基，其中所述去分化培养基包含至少一种适合用于诱导胚发生愈伤组织形成的植物生长调节物。术语“植物生长调节物”(PGR)如本文中所用意指可以调节植物生长和发育的天然存在的或合成的(非天然存在的)化合物。PGR可以单独地或彼此或与其它化合物(例如糖、氨基酸)一起协调地发挥作用。更具体地，用于诱导和选择胚发生愈伤组织的培养基包含
i.有效量的至少一种植物生长素化合物，和
ii.允许选择包含转基因的细胞的有效量的选择剂。
此外，胚发生愈伤组织诱导培养基可以任选地包含阻止或抑制(如上所定义的)土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素。
术语“植物生长素”或”植物生长素化合物”包含刺激细胞伸长与分裂、液泡组织分化、果实发育、不定根形成、乙烯产生及在高浓度下诱导去分化(愈伤组织形成)的化合物。最常见的天然存在的植物生长素是在根和茎中极性运输的吲哚乙酸(IAA)。合成的植物生长素在现代农业中广泛使用。合成的植物生长素化合物包含吲哚-3-丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。
优选地，当作为唯一的植物生长素化合物使用时，使用浓度为约0.2mg/l至约6mg/l、更优选约0.3至约5mg/l、最优选约2mg/l的2，4-D。在采用其它植物生长素化合物或其组合的情况下，以如此方式选出优选的组合，即它们的去分化效应等同于用以上所述浓度的2，4-D在作为唯一的植物生长素化合物使用时所实现的效应。因此，有效量的植物生长素化合物优选地等同于浓度为约0.2mg/l至约6mg/l(更优选约0.3至约4mg/l、最优选约2mg/l)的2，4-D。
此外，可以采用不同植物生长素的组合，例如2，4-D与氨氯吡啶酸(Picloram)的组合。优选地，浓度约0.5至2mg/l的2，4-D可以与一种或多种其它类型的植物生长素化合物例如浓度约1至约2.5mg/l的氨氯吡啶酸联合，以改善胚发生愈伤组织形成的质量和数量。
培养基可以任选地还用一种或多种额外的植物生长调节物例如细胞分裂素化合物(例如6-苄氨基嘌呤)和/或其它植物生长素化合物加以补充。此类化合物包括，但不限于、IAA、NAA、IBA、细胞分裂素、植物生长素、激动素、草甘膦和噻苯隆(Thiadiazuron)。细胞分裂素化合物包含例如玉米素、6-异戊烯基腺嘌呤(IPA)和6-苄基腺嘌呤/6-苄氨基嘌呤(BAP)。
D-氨基酸代谢酶的存在不排除采用额外的标记。
选择(选择化合物的应用)可以在去分化及选择期间后结束。然而，优选还在随后的再生期间(部分或自始至终)，和甚至在生根期间应用选择。在一个一般选择计划中，可以应用如下条件：
选择I：选择在去分化条件(愈伤组织增殖)下持续约7日至约50日、优选约14日至约21日。选择可以优选地在光照下用培养基如PAW-2sel(见实施例)完成。
选择II：选择在再生条件(见下文)下持续约7日至约50日、优选约3周(21日)。再生可以用培养基如PAW-4sel(见实施例)完成。
选择III：选择在苗伸长条件(见下文)下持续约7日至约50日、优选约3周(21日)。苗伸长可以在平板中用培养基如PAW-5sel(见实施例)选择完成。
选择IV：选择在苗生长和生根条件下持续约7日至约50日、优选约3周(21日)。苗生长和生根可以在盒中用培养基如PAW 5选择(见实施例)完成。
2.5再生
可以以已知方式诱导从去分化细胞中形成苗与根。得到的苗可以受到栽植和培养。通过上述任意转化技术所衍生的转化小麦植物细胞、优选转化的小麦胚发生愈伤组织可以受到培养以再生完整植物，其中所述的完整植物拥有转化的基因型并因此具有目的表型。此类再生技术取决于在组织培养生长培养基中对某些植物激素的操作。描述了来自所培养原生质体中的植物再生(例如Evans 1983；Binding 1985)。还可以从植物愈伤组织、外植体、体细胞胚(Dandekar 1989；McGranahan 1990)、器官或其部分中得到再生。已总体上描述了此类再生技术(例如Klee 1987)。可用的其它再生技术综述于Vasil 1984和Weissbach 1989。
在(如上所述的)去分化期和选择期后，将产生的细胞(例如成熟的胚发生愈伤组织)转移至允许转基因小植物转变的培养基中。优选地，此类培养基不包含处于导致去分化的浓度上的植物生长素如2，4-D。
在优选的实施方案中，此类再生培养基可以包含一种或多种选自如下的化合物：
i)细胞分裂素例如玉米素，优选地浓度是约0.5至约10mg/L、更优选是约1.5至约5mg/L，
ii)阻止或抑制(如上所定义的)土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素，和
iii)允许选择转基因细胞(例如包含转基因T-DNA)的有效量的选择剂(例如D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物)。
更优选地，再生步骤e)中采用的培养基优选地包含：
i)有效量的至少一种细胞分裂素化合物，和/或
ii)总浓度约3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸。
胚发生愈伤组织优选地在这种培养基上孵育直至苗形成，并随后转移至(优选无激素的)伸长培养基。该孵育过程可以持续1周至5周、优选2周至3周。把再生的苗或小植物(即带根的苗)转移至含有生根培养基(如在PAW-5中的所述培养基)的Phytatray、Magenta盒或Sky-Light塑料盒中并且孵育直至生根的小植物已经发育(通常1周至4周，优选2周)。生根的幼苗转移至Jiffy以适应气候(通常持续10日)。在分析后，将转基因植物转移至sil K-Jord并且如本领域所述培育为成熟的植物(见实施例)。
通过对全部花穗在它们从剑叶中冒出时逐个套袋而对产生的转基因植物进行自我授粉。将T1种子象花穗那样(spikewise)收获、干燥并合适地贮存，在种袋上充分标记。应当培育两个或三个世代以确保基因组整合是稳定和遗传性的。例如T1或T2世代中的转基因事件可能涉及旨在组合不同转基因(基因堆叠)的前育种杂交计划。
本发明的其它重要方面包括通过已公开的方法制备的转基因植物的子代以及从如此子代中衍生的细胞和从如此子代中得到的种子。
2.6后代的产生
在转化、选择并再生(包含本发明DNA构建体的)转基因植物后，产生这样的后代，该后代因切除启动子的活性而经历切除过程并且不包含标记序列及用于表达内切核酸酶的表达盒。
后代可以通过有性繁殖或无性繁殖产生。无性繁殖可以通过本领域众所周知的技术导入体细胞性胚发生而实现。优选地，后代通过有性繁殖/受精产生。受精可以通过自交(自我授粉)或与其它转基因植物或非转基因植物杂交而实现。本发明的转基因植物因此可以作为母本植物或父本植物发挥作用。在受精过程后，收获种子，使之萌发并生长为成熟植物。对经历切除过程的后代的分离和鉴定可以在任何的植物发育期中完成。用于所述鉴定的方法是本领域众所周知的并且可以包括例如PCR分析、RNA印迹法、DNA印迹法或表型筛选法(例如对负选择标记)。
后代可以包含一个或多个拷贝的农学上有价值的性状基因。优选地，分离仅包含一个拷贝的所述性状基因的后代。
还符合本发明的是衍生自上述转基因生物的细胞、细胞培养物、部分(例如在转基因植物生物的情况下，为根、叶等)和转基因繁殖材料(如种子或果实)。
可以由人或动物消费的本发明的遗传改良植物还可以例如直接地或在人所共知的加工作用后作为食物或饲料使用。因此使例如产生转基因植物时经常导入的抗生素抗性和/或除草剂抗性缺失出于消费者接受程度和产品安全的原因而变得有意义。
本发明的又一主题涉及上述转基因生物、从其中衍生的细胞、细胞培养物和/或部分(例如在转基因植物生物的情况下，为根、叶等)及转基因繁殖材料如种子或果实用于产生食物或饲料、药物或精细化学品的用途。
本发明的又一主题涉及用于选择、再生、生长、栽培或维持转基因小麦植物细胞、转基因小麦植物组织、转基因小麦植物器官或转基因小麦植物或其部分的组合物，其中所述组合物包含允许选择转基因小麦植物细胞、转基因小麦植物组织、转基因小麦植物器官或转基因小麦植物或其部分以及上述转基因小麦生物、从其衍生的转基因小麦细胞、转基因小麦细胞培养、转基因小麦植物和/或其部分(例如在转基因植物生物的情况下，为根、叶等)的有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物。
本发明的另一个实施方案涉及这样的小麦植物或细胞，其包含在所述小麦植物或细胞中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，其中该启动子相对于所述编码酶的序列是异源的。更优选地，启动子和/或能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如上文定义。更优选地，小麦植物还包含赋予所述小麦植物农学上有价值性状的至少一种第二表达构建体。在一个优选的实施方案中，小麦植物选自小麦属的植物。更优选来自选自小麦属的植物物种：普通小麦(T.aestivum)、硬粒小麦(T.durum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、双粒小麦(Emmer小麦)、圆柱小麦和一粒小麦(Einkorn小麦)，最优选地来自普通小麦的品种。本发明的其它施方案涉及本发明小麦植物的部分、器官、细胞、果实和其它繁殖材料。优选的部分是选自组织、细胞、花粉、胚珠、根、叶、种子、小孢子和营养体部分。
精细化学品理解为意指酶、维生素、氨基酸、糖、脂肪酸、天然香料和合成香料、芳香物质和色料。特别优选产生生育酚和生育三烯酚，以及产生类胡萝卜素。通过技术人员已知的方法开展对转化宿主生物的培养以及从宿主生物中或从培养基中的分离。描述了药物例如抗体或疫苗的产生(例如Hood 1999；Ma 1999)。
3.进一步的修饰
3.1反选择(counter selection)和后续的标记缺失
用于D-氨基酸代谢酶的第一表达构建体可以优选地以如此方式构建，以至于允许后续的标记缺失，尤其当所述酶是可以用于负选择和反选择(即作为双功能标记)的D-氨基酸氧化酶。此类方法在PCT/EP 2005/002734中详细描述，该文献在本文中完整引用作为参考。
为此目的，第一表达盒优选地在侧翼为允许特异性缺失所述第一表达盒的序列。本发明的这个实施方案利用D-氨基酸氧化酶(DAAO)的特性来作为双功能标记发挥作用，即允许作为负选择标记和反选择标记(取决于所用的底物)的标记。与D-氨基酸如D-丝氨酸和D-丙氨酸(它们对植物有高度植物毒性并且由D-氨基酸氧化酶“脱毒”)不同，D-缬氨酸和D-异亮氨酸对野生型植物无毒，但被表达D-氨基酸氧化酶(DAAO)的植物转变成有毒化合物。发现DAAO表达减轻D-丝氨酸和D-丙氨酸的毒性，但诱导了使D-异亮氨酸和D-缬氨酸有毒的代谢改变，这个发现表明D-氨基酸氧化酶可能在植物中提供底物依赖性的双功能选择标记。
因此，本发明的另一个实施方案涉及用于产生转基因小麦植物的方法，包括：
i)将小麦植物细胞用第一DNA构建体转化，其中第一DNA构建体包含
a)至少一种第一表达构建体，其包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述第一表达盒的侧翼为具有允许特异性缺失此第一表达盒的序列，和
b)适用于赋予所述植物农学上有价值的性状的至少一种第二表达盒，其中所述的第二表达盒不位于允许特异性缺失所述第一表达盒的序列之间，和
ii)将步骤i)的所述已转化的小麦植物细胞以毒害植物浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一化合物处理并且选择这样的植物细胞，在其基因组中包含所述第一DNA构建体，并通过所述D-氨基酸氧化酶的表达而赋予所述经转化植物细胞对所述第一化合物的抗性，
以及
iii)诱导从所述经转化植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒并且将所述的植物细胞用如此浓度的选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物处理，其中所述浓度对仍含有所述第一表达盒的植物细胞有毒，从而选择出包含所述第二表达盒而缺少所述第一表达盒的植物细胞。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上所述。
优选地，第一表达盒的缺失可以通过本领域已知的多种方法实现，包括但不限于如下方法中的一种或多种：
a)通过序列特异性重组酶诱导的重组，其中所述的第一表达盒以如此方式在侧翼具有相应的重组位点，以至在所述侧翼重组位点之间的重组导致从基因组中缺失位于侧翼重组位点之间的序列，
b)在所述第一表达盒侧翼分布的同源序列A与A’之间的同源重组，其中所述的同源重组优选受到在所述同源序列间的由序列特异性内切核酸酶所致的序列特异性双链断口诱导，其中所述的同源序列A和A’具有确保A与A’之间同源重组的足够长度和同源性，并具有这样的方向，即当A与A’之间重组时，所述的方向将导致从所述植物的基因组中切除所述的第一表达盒。
本领域技术人员可获得多种方法以将缺失/切除诱导机制与本发明包含D-氨基酸氧化酶双功能选择标记的DNA构建体结合起来。优选地，在本发明方法中可采用的重组酶或内切核酸酶可以通过选自如下的方法表达：
a)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异性内切核酸酶的第二表达盒引入所述的DNA构建体，优选地与在侧翼为允许特异性缺失的序列的所述第一表达盒一起引入，
b)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异性内切核酸酶的第二表达盒引入作为转化的靶材料使用的植物细胞或植物，因而产生主细胞系或主细胞，
c)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异性内切核酸酶的第二表达盒引入分别的DNA构建体，其中所述分别的DNA构建体通过与所述第一DNA构建体共转化的方式而被转化至所述的植物细胞中。
d)将与植物启动子有效连接的用于表达重组酶或序列特异性内切核酸酶的第二表达盒引入随后与包含本发明DNA构建体的植物杂交的植物细胞或植物。
在另一个优选的实施方案中，可以以如此方式诱导或激活缺失/切除机制，以防止过早缺失/切除双功能标记。优选地，被优选采用的序列特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可以因此受到诱导和/或激活，优选通过选自如下的方法：
a)通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列有效连接至诱导型启动子的诱导型表达，
b)通过采用包含配体结合结构域的改良重组酶或内切核酸酶的诱导型激活，其中所述的改良重组酶或内切核酸酶的活性可以通过用对所述配体结合结构域具有结合活性的化合物处理进行调节。
因此优选地，本发明的方法产生无选择标记的植物细胞或植物。
本发明的又一个主题涉及适合在本发明方法中使用的DNA构建体。适用于本发明中的DNA构建体优选地包含
a)第一表达盒，包含与在小麦植物中有活性的启动子(其如上所定义；优选是遍在蛋白启动子)有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述第一表达盒的侧翼为允许特异性缺失该第一表达盒的序列，和
b)适合向所述的植物赋予农学上有价值的性状的至少一种第二表达盒，其中所述第二表达盒不位于允许特异性缺失所述第一表达盒的所述序列之间。
优选的启动子和D-氨基酸氧化酶序列如上所述。
为了确保标记缺失/外切，在以上提及的DNA构建体中包含的用于D-氨基酸氧化酶的表达盒(第一表达构建体)以如此方式在侧翼具有序列特异性重组酶的重组位点，以至于在所述侧翼重组位点之间所诱导的重组导致从基因组中缺失所述第一表达盒。优选地，允许特异性缺失所述第一表达盒的所述序列选自如此序列，其由如下部分构成：
a)以如此方式排列的序列特异性重组酶的重组位点，以至于在所述的侧翼重组位点之间的重组导致从基因组中缺失位于侧翼重组位点之间的序列，
b)同源序列A和A’，其中所述同源序列A和A’具有确保A与A’之间同源重组的足够长度和同源性，并具有这样的方向，即当A与A’之间重组时，所述的方向导致从基因组中缺失位于同源序列A和A’之间的序列。
优选地，构建体包含位于所述序列之间的至少一个序列特异性核酸酶识别位点，其允许特异性缺失所述第一表达盒(尤其对以上的变例b)。
存在本领域已知的可以用于本发明目的多种重组位点及相应的序列特异性重组酶。本领域技术人员熟悉用于位点定向地去除已重组导入的核酸序列的多种系统。这些系统主要基于序列特异性重组酶的用途。描述了多种序列特异性重组系统，如噬菌体P1的Cre/lox系统(Dale 1991；Russell1992；Osborne 1995)、酵母FLP/FRT系统(Kilby 1995；Lyznik 1996)、Mu噬菌体Gin重组酶、大肠杆菌Pin重组酶或质粒pSR1的R/RS系统(Onouchi1995；Sugita 2000)。也可以采用基于attP位点和噬菌体λ重组酶的系统(Zubko 2000)。适合于本文中所述方法组合的其它方法在WO97/037012和WO02/10415中描述。
在优选的实施方案中，双标记序列的缺失/切除通过由序列特异性双链断口诱导的同源重组开展。主要原理在WO03/004659中公开，该文献因而引用作为参考。为此目的第一表达构建体(编码双功能标记)在侧翼具有同源序列A和A’，其中所述同源序列具有足够的长度和同源性以便确保A与A’之间的同源重组，并具有这样的方向，即当A与A’之间重组时，所述的方向将导致从基因组中切除第一表达盒。此外，在侧翼具有所述同源序列的序列还包含至少10碱基对的至少一种识别序列，其用途是通过序列特异性DNA双链断口诱导酶位点定向地诱导DNA双链断口，其中所述序列特异性DNA双链断口诱导酶优选是序列特异性DNA内切核酸酶，更优选是归巢内切核酸酶，最优选是选自I-SceI、I-CeuI、I-CpaI、I-CpaII、I-CreI和I-ChuI的内切核酸酶或其具有配体结合结构域的嵌合体。
可以在本发明的DNA构建体中包括用于内切核酸酶或重组酶的表达盒(包含与植物启动子有效连接的编码序列特异性重组酶或内切核酸酶的序列)。优选地，所述的第二表达盒与所述第一表达盒在一起，其侧翼具有允许特异性缺失的所述序列。
在另一个优选的实施方案，所述序列特异性重组酶或内切核酸酶的表达和/或活性可以受到诱导和/或激活，以避免在仍需要双功能标记作为负选择标记发挥作用的时间期间过早缺失/切除双功能标记，优选地，诱导/激活可以通过选自如下的方法实现：
a)通过将编码所述重组酶或内切核酸酶的序列有效连接至诱导型启动子的诱导型表达，
b)通过采用包含配体结合结构域的改良重组酶或内切核酸酶的诱导型激活，其中所述的改良组酶或内切核酸酶的活性可以通过用对所述配体结合结构域具有结合活性的化合物处理进行调节。
本发明的又一实施方案涉及包含本发明DNA构建体的转基因载体、包含本发明的DNA构建体或载体的转基因细胞或转基因非人类生物。优选地，所述的细胞或非人类生物是有农学用途的植物细胞或植物，优选有农学用途的植物。
本发明能够以可精确预测的方式高效率地产生无标记的转基因细胞和转基因生物，优选是植物。
对反选择步骤(ii)的优选性就化合物、浓度、对D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的应用模式的选择方面如上在一般选择方法的环境下加以描述。
对于反选择步骤(iii)，化合物选自包含D-异亮氨酸结构或D-缬氨酸结构的化合物。更优选地，化合物选自D-异亮氨酸和D-缬氨酸。最优选地，用于反选择的化合物或组合物包含D-异亮氨酸。
当通过细胞培养基(例如被掺入琼脂固化的MS培养平板)应用时，D-异亮氨酸应用的浓度可以为约0.5mM至约100mM，优选约1mM至约50mM，更优选约10mM至约30mM。当通过细胞培养基(例如被掺入琼脂固化的MS培养平板)应用时，D-缬氨酸应用的浓度可以为约1至约100mM，优选约5至50mM，更优选约15mM至约30mM。
因此使用上述方法，有可能产生无标记的小麦植物。术语“无标记的”或“无选择标记的”如本文中就细胞或生物方面所用，意指不能够表达(如上所定义；由表达盒b编码的)功能性标记蛋白质的细胞或生物，其中所述的表达盒b连同编码农学上有价值性状的基因一起被插入所述的细胞或生物中。编码该选择标记蛋白质的序列可以部分丢失或优选地完全丢失。此外，与该序列有效连接的启动子可以因部分丢失或完全丢失而发生功能障碍。然而，产生的植物可以包含可作为选择标记发挥作用的其它序列。例如植物可以包含赋予作为农学上有价值性状的除草剂抗性的基因。然而最优选产生的植物不包含任何选择标记。
本发明的多种其它方面和实施方案对于浏览本公开的本领域技术人员而言将是显而易见的。本说明书中提及的全部文献在本文中完整地引用作为参考。本发明的某些方面和实施方案例如现在将通过实施例并参考下文所述的图进行说明。
3.2基因堆叠
本发明的方法和组合物允许依次转化。D-丝氨酸代谢酶和/或D-丙氨酸代谢酶是兼容性的并且不干扰其它选择标记及选择系统。因此有可能用本发明的构建体转化现有的包含其它选择标记的转基因植物或有可能随后用其它标记转化通过本发明方法所得到的(并包含用于D-丝氨酸代谢酶和/或D-丙氨酸代谢酶的表达构建体的)植物。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含至少一种表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用包含第二选择标记基因的第二构建体进行转化，其中所述第二选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述的第二标记基因是赋予对杀生物性化合物(如非-D-氨基酸)、代谢抑制物(例如2-脱氧葡萄糖-6-磷酸，WO98/45456)、抗生素(例如卡那霉素、G418、博莱霉素或潮霉素)或除草剂(例如膦丝菌素或草甘膦)的抗性的负选择标记。负选择标记的实例是：
-膦丝菌素乙酰转移酶(PAT；又名双丙氨
Figure A20068003373600821
抗性；bar；deBlock 1987；Vasil 1992，1993；Week 1993；Becker 1994；Nehra 1994；Wan和Lemaux1994；EP0333033；US4，975，374)
-5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)赋予草甘膦抗(N-(膦酰甲基)甘氨酸)(Shah 1986；Della-Cioppa 1987)
-草甘
Figure A20068003373600823
降解酶(草甘
Figure A20068003373600824
氧化还原酶；gox)，
-失活茅草
Figure A20068003373600825
的脱卤素酶(deh)
-失活磺酰脲和/或咪唑啉酮的乙酰乳酸合酶(ahas或ALS；例如突变的ahas/ALS变体，具有例如S4、XI12、XA17和/或Hra突变)
-降解溴苯
Figure A20068003373600826
的腈水解酶(bxn)
-卡那霉素或遗传霉素(G418)抗性基因(NPTII；NPTI)，其编码例如新霉素磷酸转移酶(Fraley 1983；Nehra 1994)
-潮霉素磷酸转移酶(HPT)，其介导潮霉素耐受性(Vanden Elzen 1985)。
-二氢叶酸还原酶(Eichholtz 1987)
多种时间方案可以用于多种负选择标记基因。在抗性基因情况下(例如抗除草剂)，选择优选地贯穿愈伤组织诱导过程而施加约4周并且超出至少4周进行再生。这种选择方案可以适用于全部选择方案。还有可能(虽然明显不优选)在整个再生计划(包括生根)期间保留选择。例如以膦丝菌素抗性基因(bar、PAT)作为选择标记，培养基中可以包括浓度约1mg/l至50mg/l的膦丝菌素或双丙氨膦。
优选地，所述的第二标记赋予对选自膦丝菌素、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。
本发明的另一个实施方案涉及小麦植物，该小麦植物包含
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含至少一种表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子(优选是如上所定义的遍在蛋白启动子)和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用包含第二选择标记基因的第二构建体进行转化，其中所述第二选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
优选地，所述的第二标记基因如上文定义。并且最优选地赋予对选自膦丝菌素、草甘膦、磺酰脲和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。
尤其优选如下组合：
-第一转化用赋予膦丝菌素抗性的选择标记，随后第二转化用dsdA选择标记基因；
-第一转化用赋予膦丝菌素抗性的选择标记，随后第二转化用dao1选择标记基因；
-第一转化用用dsdA选择标记基因，随后第二转化用赋予膦丝菌素抗性的选择标记；
-第一转化用dao1，随后第二转化用赋予膦丝菌素抗性的选择标记；
除与不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性的选择标记基因的第二表达构建体堆叠之外，也可以堆叠dsdA基因与dao1基因。例如可以使用dsdA基因和作为选择剂的D-丝氨酸进行第一选择，并且可以使用dao1基因和作为选择剂的D-丙氨酸进行第二选择。因此，本发明的另一个实施方案涉及用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，所述的表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子(优选是如上所定义的遍在蛋白启动子)和与其有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，并用D-丝氨酸选择，和
b)用第二构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，所述的表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dao酶的核酸序列，并用D-丙氨酸选择。
本发明的另一个实施方案涉及用上述方法产生的小麦植物。因此，本发明还涉及小麦植物，其包含
a)第一构建体，所述的构建体包含表达构建体，所述的表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，和
b)第二构建体，所述的构建体包含表达构建体，所述的表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dao酶的核酸序列。
在以上提及的包含两种表达盒的构建体中，优选在小麦植物中有活性的两种启动子是不相同的启动子。优选地，一种启动子(例如用于表达D-丙氨酸代谢酶和/或D-丝氨酸代谢酶的启动子)是如上所定义的遍在蛋白启动子)，而另一种启动是不同的启动子(例如ScBV启动子或ahas启动子)。
序列
1.SEQ ID NO：1核酸序列，编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]基因
2.SEQ ID NO：2氨基酸序列，编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]
3.SEQ ID NO：3核酸序列，编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶基因
4.SEQ ID NO：4氨基酸序列，编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶
5.SEQ ID NO：5核酸序列，编码玉米遍在蛋白核心启动子区
6.SEQ ID NO：6核酸序列，编码玉米遍在蛋白启动子，还包含5’-非翻译区和第一内含子
7.SEQ ID NO：7核酸序列，编码甘蔗杆状病毒核心启动子区
8.SEQ ID NO：8核酸序列，编码甘蔗杆状病毒启动子，还包含5’-非翻译区
9.SEQ ID NO：9核酸序列，编码pRLM175，为抗卡那霉素的pSB11型双元载体
10.SEQ ID NO：10核酸序列，编码pRLM166的T-DNA区，所述pRLM166为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体
11.SEQ ID NO：11核酸序列，编码pRLM167的T-DNA区，所述pRLM167为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS和p-ZmUBI+I::c-PAT::t-OCS盒的pRLM175衍生的双元载体。
12.SEQ ID NO：12核酸序列，编码pRLM179的T-DNA区，所述pRLM179为含有ZmAHASL2/Xi12和p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS盒的自pRLM175衍生的双元载体.
13.SEQ ID NO：13核酸序列，编码pRLM205的T-DNA区，所述pRLM205为含有p-ZmUBI+I::c-dao1::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体.
14.SEQ ID NO：14核酸序列，编码pRLM226的T-DNA区，所述pRLM226为含有p-ZmUBI+I::l-PsFed1::c-dao1/ko::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体
15.SEQ ID NO：15核酸序列，编码玉米密码子优化的红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS
16.SEQ ID NO：16氨基酸序列，编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶
17.SEQ ID NO：17核酸序列，编码qPCR引物GUSCommon-341F：5′CCGGGTGAAGGTTATCTCTATGA3′
18.SEQ ID NO：18核酸序列，编码qPCR引物GUSCommon-414R：5′CGAAGCGGGTAGATATCACACTCT3′
19.SEQ ID NO：19核酸序列，编码qPCR  探针GUSCommon-366FAM：5′TGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGA3′
20.SEQ ID NO：20核酸序列，编码qPCR引物EcdsdA-860F：5′TCGCATTCGGGCTTAAACTG3′
21.SEQ ID NO：21核酸序列，编码qPCR引物EcdsdA-922R：5′GCGTTGGTTCGGCAAAAA3′
22.SEQ ID NO：22核酸序列，编码qPCR探针EcdsdA-883FAM：5′TTTGGCGATCATGTTCACTGC3′
23.SEQ ID NO：23核酸序列，编码qPCR引物TaGBSS：1-F：5′TTCTGCATCCACAACATCTCGTA3′
24.SEQ ID NO：24核酸序列，编码qPCR引物TaGBSS：1-R：5′TAGCCGTCGATGAAGTCGAA3′
25.SEQ ID NO：25核酸序列，编码qPCR探针TaGBSS：1-TET：5′CGACGACTTCGCGCAGCTCAAC3′
26.SEQ ID NO：26核酸序列，编码qPCR引物dao1/pa-285F：5′GTTCGCGCAGAACGAAGAC3′
27.SEQ ID NO：27核酸序列，编码qPCR引物dao1/pa-349R：5′GGCGGTAATTTGGCGTGA3′
28.SEQ ID NO：28核酸序列，编码qPCR探针dao1/pa-308FAM：5′TCCTTGTACCAGTGCCCGAGCA3′
29.SEQ ID NO：29核酸序列，编码用于gusINT基因的正向PCR引物：5′-ACCGTTTGTGTGAACAACGA-3′
30.SEQ ID NO：30核酸序列，编码用于gusINT基因的反向PCR引物：5′-GGCACAGCACATCAAAGAGA-3′
31.SEQ ID NO：31核酸序列，编码用于dsdA基因的正向PCR引物：5′-GCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTG-3′
32.SEQ ID NO：32核酸序列，编码用于dsdA基因的反向PCR引物：5′-TCAATAATCCCCCCAGTGGC-3′
33.SEQ ID NO：33核酸序列，编码用于dao1基因的正向PCR引物：5′-GACAAGCAAAATGGGAAGAATC-3′
34.SEQ ID NO：34核酸序列，编码用于dao1基因的反向PCR引物：5′-TCGGGGAATGATGTAGGC-3′
35.SEQ ID NO：35核酸序列，编码用于dao1/ko基因的正向PCR引物：5′-AAGCAGGCCTTCTCACACTTGA-3′
36.SEQ ID NO：36核酸序列，编码用于dao1/ko基因的反向PCR引物：5′-TTCCAACAAAGCCCGATGCG-3′
37.SEQ ID NO：37核酸序列，编码用于PAT基因的正向PCR引物：5’-ATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGAT-3’
38.SEQ ID NO：38核酸序列，编码用于PAT基因的反向PCR引物：5′-GCCAAAAACCAACATCATGCCATCCA-3’
39.SEQ ID NO：39核酸序列，编码pRLM151的T-DNA区，所述pRLM151为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS的pRLM175衍生的双元载体.
40.SEQ ID NO：40合成的构建体大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶[dsdA]CDS
41.SEQ ID NO：41核酸序列，编码用于ahas基因的正向PCR引物：F：5’-TGACTTTGGCTCARGGAACG-3’
42.SEQ ID NO：42核酸序列，编码用于ahas基因的反向PCR引物：R：5’-ATCTCACTTTCATTCTCTGGGTTT-3’
实施例
一般方法
除非另外说明，实施例中的化学品和试剂从Sigma-Aldrich AB，Sweden得到。用于细胞培养基的材料从GIBCO Invitrogene AB，Sweden、Duchefa SAVEEN Sweden或DIFCO NordicaBiolabs，Sweden得到。如Maniatis(1989)所述，实施用于本发明目的克隆步骤例如转化大肠杆菌细胞、培养细菌、增殖噬菌体和重组DNA的序列分析。如下实施例仅以例举方式而不以限制性方式提供。
用于转化的培养基
PAW-Inf.
pH＝5.2；用前添加的化合物：乙酰丁香酮(300μM)。
PAW-1(共培养用培养基)
Figure A20068003373600882
Figure A20068003373600891
pH＝5.65；高压灭菌后添加的化合物：乙酰丁香酮(300μM)。
PAW-2(愈伤组织诱导-恢复培养基)
pH＝5.65；高压灭菌后添加的化合物：特美汀(160mg/l)。
PAW-2(愈伤组织增殖-选择培养基)
Figure A20068003373600901
pH＝5.65；高压灭菌后添加的化合物：特美汀(160mg/l)和相应的选择剂：D-丝氨酸(3mM、5mM、10mM)、D-丙氨酸(3mM、5mM、10mM)、双丙氨膦(3mg/l)。
PAW-4(再生培养基)
Figure A20068003373600902
Figure A20068003373600911
pH＝5.65；高压灭菌后添加的化合物：特美汀(160mg/l)和相应的选择剂：D-丝氨酸(3mM、5mM、10mM)；D-丙氨酸(3mM、5mM、10mM)；双丙氨膦(3mg/l)。
PAW-5(用于苗伸长、生根和胚萌发的无激素培养基)
Figure A20068003373600912
pH＝5.65.高压灭菌后添加的化合物：特美汀(160mg/l)和相应的选择剂：D-丝氨酸(3mM、5mM、10mM)、D-丙氨酸(3mM、5mM、10mM)、双丙氨膦(3mg/l)。
供应商指定的补充物
  成分   贮存液   供应商
  特美汀   160mg/ml   Duchefa T0190
  双丙氨膦   3mg/ml   Duchefa B0178
  乙酰丁香酮   100mM(MW 196.0g)   Aldrich D13，440-6
  D-丝氨酸   1M(MW 105.1g)   Sigma S4250
  D-丙氨酸   1M(MW 89.1g)   Sigma A7377
TaqMan PCR引物/探针
GUSCommon-341F    5′CCGGGTGAAGGTTATCTCTATGA3′(SEQ IDNO：17)
GUSCommon-414R 5′CGAAGCGGGTAGATATCACACTCT3′(SEQ IDNO：18)
GUSCommon-366FAM 5′TGTGCGTCACAGCCAAAAGCCAGA3′(SEQID NO：19)
EcdsdA-860F′5′TCGCATTCGGGCTTAAACTG3′(SEQ ID NO：20)
EcdsdA-922R  5′GCGTTGGTTCGGCAAAAA3′(SEQ ID NO：21)
EcdsdA-883FAM  5′TTTGGCGATCATGTTCACTGC3′(SEQ ID NO：22)
TaGBSS：1-F  5′TTCTGCATCCACAACATCTCGTA3′(SEQ IDNO：23)
TaGBSS：1-R  5′TAGCCGTCGATGAAGTCGAA3′(SEQ ID NO：24)
TaGBSS：1-TET  5′CGACGACTTCGCGCAGCTCAAC3′(SEQ IDNO：25)
dao1/pa-285F  5′GTTCGCGCAGAACGAAGAC-3′(SEQ ID NO：26)
dao1/pa-349R  5′GGCGGTAATTTGGCGTGA-3′(SEQ ID NO：27)
dao1/pa-308FAM 5′TCCTTGTACCAGTGCCCGAGCA-3′(SEQ  IDNO：28)
PCR引物/探针
用于gusINT基因
正向5′-ACCGTTTGTGTGAACAACGA-3′(SEQ ID NO：29)
反向5′-GGCACAGCACATCAAAGAGA-3′(SEQ ID NO：30)
用于dsdA基因
正向5′-GCTTTTTGTTCGCTTGGTTGTG-3′(SEQ ID NO：31)
反向5′-TCAATAATCCCCCCAGTGGC-3′(SEQ ID NO：32)
用于dao1基因
正向5′-GACAAGCAAAATGGGAAGAATC-3′(SEQ ID NO：33)
反向5′-TCGGGGAATGATGTAGGC-3′(SEQ ID NO：34)
用于dao1/ko基因
正向5′-AAGCAGGCCTTCTCACACTTGA-3′(SEQ ID NO：35)
反向5′-TTCCAACAAAGCCCGATGCG-3′(SEQ ID NO：36)
用于PAT基因
正向5’-ATGTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGAGAT-3’(SEQ IDNO：37)
反向5′-GCCAAAAACCAACATCATGCCATCCA-3’(SEQ ID NO：38)
用于ahas基因：
正向：5’-TGACTTTGGCTCARGGAACG-3’(SEQ ID NO：41)
反向：5’-ATCTCACTTTCATTCTCTGGGTTT-3’(SEQ ID NO：42)
实施例1：小麦转化方法
1.1制备用于转化的组织
植物材料
供体植物自普通小麦的春小麦品种Canon，在具有的环境控制生长箱内以16/8小时光周期在300μmol m-2s-1强度和70％湿度上产生。昼夜温度是20/16℃。每个4.21方形花钵(8∶1∶1土壤(K-jord)∶珍珠岩∶粘土)(Weibulls，Sweden)2株良好发育的幼苗，每日浇水并且在生长期间受精6次，包括用Superba vit(38mg N每钵)(Weibulls，Sweden)进行基础施肥(basicfertilization)。接近分蘖结束至抽穗前，除去侧轴(aside axe)以致选择每株植物5个强壮均一的分蘖用于转化。当第一花药伸出时，将单个花穗用色带标记并通过除去顶花和底花而为转化做好准备。随后，将来自花穗中间部分的不成熟胚用于转化。在花期后13-14日收集不成熟的颖果。
种子消毒和不成熟胚的分离
如此对不成熟的种子消毒，即在96％EtOH中洗涤30秒，随后在10％商业漂白剂(
Figure A20068003373600941
)+0.1％吐温20中在摇床上搅动10分钟并用无菌蒸馏水淋洗5次。将不成熟胚在立体显微镜下作无菌剖分并且收集在添加300μg/l乙酰丁香酮的1ml PAW-感染培养基中。每微管收集最佳大小是长度1.0-1.2mm的大约100个胚，具有良好发育的乳白小盾片并且仍然是中心透明的。
1.2构建体
转化实验中使用超级双元系统(WO94/00977)。克隆载体pSB11通过以Km基因替换Sp基因而受到修饰，得到中间克隆载体pRLM175。将具有dsdA、dao1和dao1修饰的密码子基因的克隆表达盒克隆在中间克隆载体pRLM175中的T-DNA的RB与LB之间。表2中描述了所产生的并用于转化的构建体。构建体图谱示于图1-3。
表2描述了转化载体，其中所述转化载体在以dsdA基因及dao1基因作为选择标记建立转化的实验中使用。(EcdsdA＝大肠杆菌dsdA；dao1＝D-氨基酸氧化酶基因；p-ScBV＝ScBV启动子；p-ZmUbi＝玉米ubi启动子；t-OCS’＝OCS’终止子；t-NOS＝nos终止子；PsFed1＝翻译前导序列)
  载体   LB-选择标记   报道基因/选择标记-RB   SEQ ID NO：
  pRLM166   p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS   p-ScBV::c-gusINT::t-NOS   10
  pRLM167   p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS   p-ZmUBI+I::c-PAT::t-OCS   11
  pRLM179   ZmAHASL2/Xi12   p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS   12
  pRLM205   p-ZmUBI+I::c-dao1::t-OCS   p-ScBV::c-gusINT::t-NOS   13
  pRLM226   p-ZmUBI+I::l-PsFed1::c-dao1/ko   p-ScBV::c-gusINT::t-NOScas   14
  pRLM151   p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS   39
整合入携带超级双元载体的农杆菌菌株
通过三亲交配杂交法(Ditta等1980)导入产生的中间质粒。三亲交配是本领域已知的术语并且涉及与在宿主细菌LBA4404(pSB1)中的3个交配者交配的细菌，其中宿主细菌LBA4404具有辅助质粒pAL4404(具有完整vir区域)和通过强侵入性根癌农杆菌菌株A281的virB、virC和virG基因插入pRK2复制子所得的超强毒力质粒pSB1。毒力质粒与中间质粒共有同源性区域并且在农杆菌中重组。转基因在所得重组超级双元载体系统中的存在通过使用(例如SEQ ID NO.：29至41中所示)特异性引物进行PCR在农杆菌中予以证实。
PCR反应使用设计旨在扩增1000bp gusINT片段、500bp ahas片段和442bp pat片段，485bp dao1片段；700bp dsdA片段的引物开展。用于扩增来自pRLM166的gusINT片段和dsdA片段的反应条件如下：“热启动”(95℃5分钟)，随后30个循环的变性(94℃30秒)、复性(62℃30秒)、延伸(72℃30秒)，随后1个循环的72℃(5分钟)并保持在4℃。来自pRLM167的片段pat和来自pRLM179的片段ahas在相似条件下扩增，除复性温度分别是63℃和65℃以外。用于扩增来自pRLM205的gusINT片段和dao1片段的反应条件如下：“热启动”(95℃5分钟)，随后35个循环的变性(94℃45秒)、复性(66℃30秒)、延伸(72℃45秒)，随后1个循环的72℃(5分钟)并保持在4℃。
制备用于转化的农杆菌接种物
细菌培养始于来自单菌落的甘油贮藏物，其中所述的单菌落生长在分别含有50mg/l壮观霉素或50mg/l卡那霉素和60mg/l利福平(rifamlicin)的AB(Chilton等1974)培养基上。将平板在28℃黑暗下温育3日或直到可见单菌落。对于转化，新鲜的农杆菌培养始于琼脂平板上的单菌落，其中该琼脂平板具有分别含10g/l蛋白胨、5g/l酵母提取物、5g/L NaCl、15g/lOXOID琼脂、50mg/l壮观霉素或50mg/l卡那霉素的YEP培养基基。细菌培养在26℃黑暗下培育2-3日。通过将农杆菌细胞(2mm接种环在5ml培养基中蘸取5次)分散至PAWInf中而启动接种。培养基Murashige&Skoog(1962)补充以300μM乙酰丁香酮，使培养管颠倒并涡旋混合5分钟。将细菌混悬液放置在21℃每分钟200转的摇床上在黑暗下持续3小时。在感染前，将细胞群体的密度调节至分光光度计在λ660所测量的1.0-1.2O.D.。
1.3转化
用农杆菌接种以及共培养
外植体用PAW-Inf培养基洗涤并且浸泡在上述细菌混悬液内于26℃持续2小时。在感染结束时，将外植体放置在PAW-1培养基上，小盾片侧朝上。残余细菌混悬液通过吸出和通过在无菌柜内打开平板15分钟使感染胚空气干燥而予以除去。平板用石蜡膜(Parafilm)密封并放置在恒温箱内在26℃黑暗下共培养5-6日。
转基因愈伤组织和组织的选择
在共培养时段后，外植体用无菌水和500mg/L头孢噻肟洗涤并且用滤纸吸干，随后转移至含有160mg/l特美汀的PAW-2愈伤组织诱导-恢复培养基持续14日(7日为黑暗/7日为半明亮；13.2μmol m-2s-1)。将含有胚愈伤组织的外植体继代培养至含有160mg/l特美汀和相应选择剂5mM D-丝氨酸或5mM D-丙氨酸或3mg/l双丙氨膦的PAW-2愈伤组织-增殖培养基。在一些实验中，从共培养后0、7、14及21日在PAW-2愈伤组织诱导培养基上开始在D-氨基酸上的选择。胚愈伤组织在新鲜的选择性培养基上继代培养两次用于维持愈伤组织并在具有相应选择剂的PAW-4培养基上再生。培养物在23℃在光照60.2μmol m-2s-1下维持。将再生的苗继代培养至具有相应选择剂(5mM D-丝氨酸或5mM D-丙氨酸或3mg/l双丙氨膦)的PAW-5无激素培养基以进一步生长并生根。将转化实验中所用的全部培养基过滤消毒并且如上列出。在分析后，将转基因植物转移至土壤和放置在温室内进一步生长。
1.4转基因植物的分子研究和表达研究
TaqMan PCR
将叶材料收集在96孔板中，冷冻干燥并且使用Wizard Magnetic 96DNA植物系统(Promega，Cat NoFF3760)提取DNA。使用实时PCRTaqMan化学(Ingham等2001)以及对转基因特异的引物和探针：SEQID NO：17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28，对转基因植物主要分析基因整合。
用于评估小麦中拷贝数的Southern杂交
按照来自Carlson等(1991)的改良方法从经硅胶干燥的叶材料中提取基因组DNA。将25μg gDNA用BamHI、EcoRV或EcoRI消化并随后通过电泳在0.8％琼脂糖凝胶上分开。在0.25N HCl中去嘌呤化25分钟后，使用0.4N NaOH作为印迹溶液，将DNA通过毛细管印迹法从凝胶中过夜转移到Hybond-N+膜上。
使用以ZymocleanTM Gel DNA Recovery Kit(Zymo Research，CA USA)自凝胶回收的PCR扩增片段来利用RediprimeTM Random Prime LabellingSystem(Amersham Biosciences)产生32p-dCTP放射标记探针。将dsdA基因的847bp片段作为探针用于以pRLM151所转化的植物。将gusINT的884bp片段和dsdA的1023bp片段作为探针用于以pRLM166所转化的植物。将dsdA的844bp片段和ahasL2的828bp片段作为探针用于以pRLM179所转化的植物。将gusINT的1156bp片段作为探针用于以pRLM205所转化的植物。
如Sambrook等(1989)中所述开展膜的预杂交、杂交和洗涤以及信号检测。
用于D-丝氨酸抗性的萌发作用生物测定法
将良好发育的完整T1不成熟胚(2.0-2.5mm)从T0植物的幼小颖果中无菌性剖分出来并在24℃于补充1mM D-丝氨酸的1/2MS(PAW5培养基)培养基上培养以萌发。作为对照，还包括非转基因Canon的不成熟胚。将萌发后14日评分的在选择培养基上生长并发育出强壮生根系统的幼苗视为转基因幼苗。
pat基因和gus基因的表达
GUS表达研究根据Jefferson等(1987)方法进行并将20％甲醇添加到混合物中。pat基因的表达使用根据Kramer等(1993)的氯酚红试验进行评估。
转基因植物中的D-丝氨酸脱氨酶表达和活性
通过定量ELISA测定法对代表T0植物或T1子代的携带dsdA基因的总共19个事件分析D-丝氨酸脱氨酶。根据Glick和Thompson(1993)，从100mg幼小叶组织中提取蛋白质。在用山羊IgG单克隆抗体(Harlow和Lane 1998)的夹心ELISA中使用每反应约20μg提取的蛋白质。DSD活性根据改良方法(Szamosi等1993)测定。
D-丝氨酸作为水栽培中的氮源
T1和T2转基因的子代在水栽培系统中培育，其中水栽培溶液(Gamborg和Wetter、1975)通过将氮替换为5个不同浓度(20、30、50、70和100mM)的D-丝氨酸受到调整。转基因的子代与对照幼苗也在标准水栽培溶液培育作为对照。测量全部14日龄幼苗的干重。
实验使用带3个重复的随机区组设计实施。得到的数据使用GLMANOVA(Statgraphics Plus，Manugistics，Maryland，USA)进行统计学分析。有性子代中转基因的分离通过χ2检验分析距离单基因座整合的孟德尔比率的标准差。
1.5杀伤曲线
不成熟胚
为了建立D-丝氨酸和D-丙氨酸在抑制组织培养的小麦细胞的生长方面的有效浓度，应用了采用不成熟胚的生物测定系统。将长度2mm的不成熟胚剖分到具有选择剂的萌发培养基上，并在27℃在光照下温育。在14日后记录具有发育良好的苗和分支苗的萌发胚的数目。
愈伤组织和再生
为了在D-丝氨酸和D-丙氨酸作为选择剂存在时确定小麦组织在转化期间的敏感性，设计具有不成熟胚的再生实验。将不成熟胚浸泡在PAWinf培养基中并接受在以上转化方法中的愈伤组织诱导、愈伤组织维持和再生的全部步骤处理。
使用浓度0.5mM、1mM、3mM、5mM、10mM、25mM、50mM评估愈伤组织在稳定选择压力下的敏感性。一式三份开展试验。记录在PAW-4再生培养基上形成胚发生愈伤组织的胚的百分数。在苗伸长结束时，将愈伤组织的再生能力记录为再生出苗的愈伤组织和每个愈伤组织的苗数目。
体外苗
为确定完整再生体的敏感性，评估了D-丝氨酸和D-丙氨酸的数个浓度：0.25mM、0.5mM、1mM、5mM、10mM。体外再生苗并且当根出现时，转移苗以选择。2周和3周后观察选择剂的效应。记录具有生长的根和绿叶的小植物的数目。
实施例2：再生使用具有dsdA和PAT基因的双选择构建体的转基因植物并在D-丝氨酸和双丙氨膦上选择转基因植物
来自Canon的新鲜分离的不成熟胚用农杆菌接种。在全部实验中，使用根癌农杆菌LBA4404(pSB1/pRLM167)(SEQ ID NO：11)。pRLM167是在表达盒中含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS和p-ZmUBI+I::c-PAT::t-OCS选择性标记基因的超级双元载体(图1)。在共培养后，使外植体在含有抑制细菌生长的160mg/l特美汀的无愈伤组织诱导选择剂的培养基上恢复14日。在这些条件下，59％至76％的胚发生愈伤组织发育遍及不成熟胚的全部表面。将胚发生愈伤组织分成两份并转移至含有5-mM D-丝氨酸或3mg/l双丙氨膦的两种相应选择培养基中。在随后愈伤组织生长、小植物再生、苗伸长和根形成期间，在相应的每种培养基中维持相应的选择压力。在选择7周后，当分别在双丙氨膦或在D-丝氨酸上选择时，38％-47％的胚发生愈伤组织再生出植物。在再生体的伸长和生根期间进一步对再生体选择额外3周。在共培养10-12周后选择完整的体外转基因的苗。
表3.使用农杆菌介导的转化方法、构建体pRLM167和在D-丝氨酸或双丙氨膦上的选择作用，对含有dsdA/PAT选择性标记基因的转基因植物的选择
  实验重复数 构建体 目的基因 外植体数   推定的转基因 Q-PSR(+)   TE/ER(％)＊
  2(D-丝氨酸)  pRLM167   dsdA/pat   481   12   10   2.1/17
  2(双丙氨膦)  pRLM167   dsdA/pat   470   24   10   2.1/59
＊TE-转化效率计算为外植体(新鲜分离的不成熟胚)中的转基因植物％。
＊ER-逃逸率计算为全部所选择植物中非转基因的再生体％。
与在D-丝氨酸上选择的植物相比，更多在双丙氨膦中的植物能够生根和生长。在选择剂存在下使具有枝状根系统和旺盛生长的推定的转基因植物接受气候驯化并通过PCR或TaqMan PCR分析它们的转基因特点。
使用这种方法，当D-丝氨酸用作选择剂时，以平均2.1％的频率和逃逸率17％得到独立的转化事件(表3)。当双丙氨膦用作选择剂时，实现相同的转化效率2.1％，然而逃逸率更高达59％。这种趋势在我们先前使用双丙氨膦选择和所述转化方法的实验(数据未显示)中观察到。
选择的全部转基因植物通过氯酚红试验测试PAT表达。转基因植物将培养基的颜色改变成指示PPT酶活性的黄色(数据未显示)。DsdA基因表达通过对萌发于D-丝氨酸选择性培养基上的T1不成熟胚使用生物测定法而得到检测(图4)(在实施例4中讨论)。此外在选择培养基上萌发的幼苗通过TaqMan PCR加以测试，以证明它们的转基因特点。
培育至成熟的携带dsdA/PAT基因的转基因T0植物显示正常的形态学、旺盛的生长和完整的种子结实(图5)。
来自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的PAT基因(赋予对基于膦丝菌素(PPT)的除草剂双丙氨膦及
Figure A20068003373601001
的抗性)已经成功用作小麦的选择标记(Jones 2005)。然而认识到pat基因作为选择性标记基因导致选择出高数量的非转化植物(逃逸)，其原因在于组织培养基中氨基酸的存在或允许非转化细胞再生的“交叉保护作用”(Christou等1991)。
我们的数据表明在产生效率方面，基于D-氨基酸的选择系统在小麦中与基于膦丝菌素型除草剂的选择系统是可比较的。就逃逸率而言，基于D-氨基酸的选择系统产生数目有限的逃逸。所选择的植物表现出明显的中毒表型外观，以至于在选择结束时，将数目有限的植物送入温室并分析，这样节省产生转基因植物的空间和成本。显示在T-DNA中整合连接的两种选择性标记基因dsdA和PAT在被导入小麦细胞时是有活性的，这对于实施基因堆叠技术和得到无标记转基因植物是有利的。
实施例3    D-丝氨酸和D-丙氨酸杀伤曲线LD50和LD100
3.1愈伤组织启动、愈伤组织维持及再生期间D-丝氨酸和D-丙氨酸的剂量曲线和稳定选择压力
在重复的再生实验中评估测试的浓度范围0.5-50mM D-ser和D-ala。在转化方法之后的愈伤组织生长和苗形成期间，于具有D-丝氨酸和D-丙氨酸的培养基上评估选择性化合物的影响(表4)。
表4.D-丝氨酸和D-丙氨酸对小麦愈伤组织生长和再生的影响
Figure A20068003373601011
D-丝氨酸的0.5mM低浓度表现明显增加再生能力，该能力测定为每个愈伤组织系的再生体数目(图6A-B)。在选择培养基上6周的再生植物呈绿色并且有活力。在具有3mM D-丝氨酸的培养基上，再生出植物的愈伤组织的数目减少50％，但是再生性愈伤组织的能力是明显的并且再生出的苗呈绿色。愈伤组织的再生能力在5mM D-丝氨酸和D-丙氨酸上已经减少70％。在选择培养基上7周的再生苗没有有活力，叶黄，具有特异性”鹿茸”表型。尽管有全部这些观察，仍将单个植物在具有10mM和15mM D-丝氨酸的培养基上进行再生。愈伤组织坏死也在这些浓度和更高浓度上观察到。愈伤组织再生应答的致死剂量(LD100)对于D-丝氨酸和D-丙氨酸分别是25mM和15mM(在这两种变量上测试)。在具有25mM D-丝氨酸和D-丙氨酸的培养基上没有植物再生且愈伤组织坏死。仍未彻底认识D-氨基酸对愈伤组织的致死效应。然而作为选择剂所施加的D-丝氨酸和D-丙氨酸可以以与双丙氨膦可比较的方式影响愈伤组织增殖并进一步影响再生。
3.2D-丝氨酸和D-丙氨酸对体外苗生根的影响
收集体外再生的来自缺少选择化合物的培养基中的苗并将其转移到用于生根的培养基上(1/2MS盐，无激素)。在将这些苗继代培养至补充D-氨基酸的培养基中2周和4周后，记录根形成、苗生长和叶伸长(表5)。
表5.D-丝氨酸和D-丙氨酸对体外苗的生根期的影响
Figure A20068003373601021
对苗在具有选择剂的培养基上生根和生长的不利应答在2周后显而易见。在具有3mM D-丝氨酸的培养基上，根分枝受到影响，但是植物仍然呈绿色并且其中部分植物继续生长。通常，非转基因的苗不能够在具有5mM D-丝氨酸和D-丙氨酸的培养基上形成根。植物的剑叶显示出特异性“针”样性状，变黄，坏死和死亡。全部植物显出”鹿茸”表型并且叶变成淡黄色。在个别情况下，植物显出短粗的绿色根、矮壮茎和短阔剑叶，具有过度含水的叶组织。D-氨基酸对植物形态学、生长和生根的影响明显(图7)。
3.3D-丝氨酸D-丙氨酸对体外条件下不成熟胚萌发和幼苗生长的影响
从消毒的颖果分离出大小2mm的不成熟胚。将胚在PAW-5无激素培养基上在黑暗下培养以萌发。在2周后观察在D-氨基酸选择剂上生长的幼苗。大部分胚萌发，但是当根出现并且选择化合物的摄取直接来自培养基幼苗时，生长受到抑制。受测试的这两种D-氨基酸对幼苗萌发和生长的致死剂量(LD100)是1mM浓度(表6)。源自分离自无胚乳的不成熟颖果的胚的幼苗易受浓度超过1mM的选择剂损害(图8)。
表6.不成熟胚在含有D-丝氨酸及D-丙氨酸的培养基上的体外萌发
通过小盾片并稍后借助根对选择化合物的摄取能够迅速在组织中聚集选择剂并在一周内在不成熟胚类上造成致死效应。当用1mM选择化合物实施生物测定时，证明两种化合物对不成熟胚的萌发有致死效应。
实施例4：使用D-丝氨酸的选择作用，再生出具有dsdA基因的转基因小麦植物
来自Canon的新鲜分离的不成熟胚用农杆菌接种。在全部实验中，使用基于LBA4404(pSB1)的根癌农杆菌超级双元载体系统。将仅含有dsdA选择性标记基因或还有第二种基因(ahas或gusINT)的构建体pRLM179、pRLM166、pRLM151(图2.I、II和III)用于转化。在与农杆菌共培养后，外植体立即在选择培养基上培养或在仅含有用于抑制细菌的160mg/l特美汀的培养基上培养7日、14日和21日。此外，将愈伤组织继代培养至用于增殖的新鲜PAW-2选择培养基。转化后，将胚愈伤组织转移到PAW-4选择培养基上以再生5-6周。使出现的小植物进一步在无激素的PAW-5选择培养基上培育并生根。在选择培养基上良好发育并生根的推定的转基因再生体在9周内，更好在10-12周内受到体外选择。
小试转化实验用共培养后7日、14日和21日施加选择压力来进行。转化后，再生出植物的愈伤组织的总数在补充3mM D-丝氨酸的培养基上不受影响。分别的愈伤组织系显示高的再生潜能。根生长和分枝受到轻微影响。证明在该浓度上选择的全部再生体是逃逸体。在补充5mM D-丝氨酸的培养基上，转基因愈伤组织系未受到选择但是愈伤组织的再生能力受到抑制。当10mM D-丝氨酸掺入培养基时，观察到多水性愈伤组织和具有单个苗再生的胚发生愈伤组织坏死。当将5mM和10mM D-丝氨酸纳入培养基时，以可比较的效率得到转基因植物。当在10mM D-丝氨酸上选择苗时，逃逸率缩减到0(表7)。
表7.用pRLM179(dsdA/AHAS)转化Canon并以浓度3、5和10mM的D-丝氨酸选择。选择在共培养后21日开始。
  实验编号   D-丝氨酸(mM) 外植体数   推定的再生体   TaqMan阳性 TE(％)＊ ER(％)＊
  1   3   236   24   0 0 100
  2   5   215   12   3 1.39 25
  3   10   257   2   2 0.77 0
＊TE-转化效率计算为外植体中转基因植物的％。
＊ER-逃逸率计算为全部所选择植物中非转基因的再生体％。
大量的愈伤组织接受了3mM D-丝氨酸的选择，再生出大量的苗。然而使用这个特定浓度，未鉴定到转基因植物。最佳转化浓度是5mM D-丝氨酸，因为这可以从杀伤曲线再生实验中得出结论(实施例2)。
对转化期间应用选择压力的精确时间的定义需要进一步的实验来测试先前实验中定义的5mM D-丝氨酸浓度。将具有胚发生组织的胚在共培养后立即转移到用于愈伤组织增殖的选择培养基上或者在7日、14日和21日后导入选择培养基。当胚在共培养后立即转移到选择培养基上时，形成胚的胚发生组织数目减少。推迟应用选择压力7日、14日和21日则支持细胞与农杆菌共培养后的恢复。胚发生愈伤组织增殖时，外植体进入选择过程。在D-丝氨酸上选择了5-6周的愈伤组织是具有绿色结构的已经出现在表面的松散类型愈伤组织并且是与在双丙氨膦上选择到的愈伤组织类型可比较的。因此在D-丝氨酸上选择到的愈伤组织没有特定的形态学。当在共培养后14或21日导入5mM D-丝氨酸时，用不同构建体得到了转基因植物(表8)。
表8.使用D-丝氨酸作为选择化合物、dsdA基因和小麦品种Canon，评估不同的选择方案
转化编号 构建体   开始选择(日) 选择   外植体数   推定的转基因 Q-PCR(+)   TE(％)
  WO04-46   pRLM179   21  D-ser   112   4   2   1.78
  WF04-52   pRLM179   21  D-ser   286   2   1   0.35
  WO04-63   pRLM166   14  D-ser   79   3   3   3.80
  WO04-72   pRLM166   14  D-ser   90   1   1   1.10
  WO04-69   pRLM166   21  D-ser   144   2   1   0.69
  WO05-28   pRLM166   14  D-ser   280   3   2   0.71
  WF04-71   pRLM166   14  D-ser   312   1   1   0.32
  WF05-28   pRLM166   14  D-ser   199   1   1   0.50
  WO05-28   pRLM166   14  D-ser   345   5   5   1.40
 WO05-38  pRLM151   14  D-ser  373  6  6   1.60
 W005-36  PRLM151   14  D-ser  300  2  2   0.66
 WF05-38  pRLM151   14  D-ser  176  9  2   1.10
 WF05-39  PRLM151   14  D-ser  314  2  2   1.00
＊TE-转化效率计算为外植体中的转基因植物％
＊ER-逃逸率计算为全部所选择植物中非转基因的再生体％
转基因植物使用具有dsdA基因和第二选择性标记基因ahas或标记基因gusINT的两种不同构建体得到。转基因植物在D-丝氨酸上以0.35至3.8％的效率受到选择。对于两种构建体而言，平均转化效率均是约1％。
当在共培养后立即应用选择时，得不到转基因植物。接受农杆菌转化处理的不成熟胚在进行选择前需要时间以恢复。当在共培养后7日应用选择时，个体转基因植物均得以恢复。推迟14日和21日选择导致可再现转基因植物(表8)。
就逃逸率而言，在D-丝氨酸上的选择因选择结束时展现的清晰表型比在双丙氨膦上的选择更好。在一些实验中显示的逃逸率高度地依赖于选择在生根时的持续期(2-4周)，在此间植物显现明确的D-氨基酸中毒症状。在显示这些症状前受到气候驯化的体外再生体在转移至土壤后能够恢复。应用严格的选择标准可能产生零逃逸率，如在一些实验中所证实。
此外，减少生根培养基(PAW-5)中的氮源4倍至8倍对转基因植物的旺盛生长是极有利的，因此这彻底消除逃逸。非转基因植物生长更缓慢并且中毒效应发展得更快。转基因植物是健壮的并且生长极好，最有可能使用D-氨基酸作为营养源(数据未显示)。
在选择作用下的再生体具有明显不同的表型。转移至用于生根的选择培养基中时，体外转基因植物长出茂盛的绿色叶和强壮分枝的生根系统(图9)。培育至成熟的转基因T0植物显示正常的形态学、旺盛的生长和完整的种子结实。
通过组织化学gus染色法在不同的组织中测量报道基因的表达。几乎检测不到在愈伤组织和体外叶组织中的表达。对温室内培育的总共16个T0事件在抽穗期和种子成熟期进行分析。观察到在组织特异性和表达模式上的变化，对应于植物/组织的如下分布：胚乳中88％、胚中56％、根中38％、子房中25％、叶中19％和花药中13％。在我们的构建体中，gusINT基因受产生多种强度的表达模式的SCBV启动子驱动。
实施例5：使用在D-丝氨酸和D-丙氨酸上的选择，再生使用dao1基因的转基因小麦植物。
来自Canon的新鲜分离的不成熟胚用农杆菌接种。在全部实验中，使用基于LBA4404(pSB1)的根癌农杆菌超级双元载体系统。构建体pRLM205含有原始的dao1基因并且pRLM226携带修饰的Dao1。两种构建体均含有gusINT报道标记基因(图3，I和II)。在共培养后，外植体转移到含有抑制细菌生长的160mg/l特美汀的无愈伤组织诱导剂的PAW-2选择培养基上持续14日。为了选择，将胚发生愈伤组织转移至分别含有5mM D-丝氨酸或5mM D-丙氨酸的PAW-2选择培养基。此外，将愈伤组织继代培养至新鲜的相应的PAW-2选择培养基以维持。在转化后，将胚发生愈伤组织转移到PAW-4选择培养基上以再生5-6周。将出现的小植物进一步在无激素的PAW-5选择培养基上培育并生根。在选择培养基上充分发育并生根的推定的转基因再生体进行体外选择。当D-丙氨酸用作选择化合物时，在D-丝氨酸上选择的转基因植物或无转基因的逃逸体的愈伤组织生长、苗再生及生根方面观察到相似影响。两种选择剂均产生1.1％至1.2％转化效率和零逃逸率(表9)。转基因植物在选择压力下显示正常的旺盛生长，而非转基因植物显现如上所述的表型。用(优化的密码子)修饰的dao1基因的转化实验以与其中使用原始基因的实验可比较的效率，产生转基因植物(表9)。
表9.使用dao1原始基因和修饰的基因和小麦品种Canon评估D-丝氨酸和D-丙氨酸选择化合物。
 转化体编号   构建体   重复   选择   外植体数目   推定的转基因   转基因的Q-PCR(+)   TE(％)   ER(％)
 WO04-78   pRLM205   2   D-ser   279   3   3   1.1   0
 WF04-84   pRLM205   2   D-ala   298   2   2   1.27   0
 WO05-03   pRLM226   2   D-ser   275   2   2   0.72   0
使用dao1基因和在D-丝氨酸和D-丙氨酸上的选择，基于D-氨基酸的选择系统成功地用于小麦中的转化。两种选择性化合物均产生转基因植物。用不同构建体和选择性标记基因dao1及修饰的dao1/ko所实现的转化效率是可比较的。来自该实验的全部转基因植物被培育至成熟，显示正常的形态学、旺盛的生长和完整的种子结实。使用TaqMan测定法和组织化学染色法，对T0转基因植物评估第二基因的存在。虽然如叶、根和花药中的组织化学反应测定所发现的那样，gusINT基因在个体植物中表达(图10)，然而在全部转基因的dao1植物中检测到选择性标记基因。
对T1不成熟胚用生物测定法测定不成熟胚在选择培养基上的萌发。通过TaqMan证明在选择培养基上生长的全部植物是转基因的。此外，使用含有D-异亮氨酸和D-缬氨酸的培养基对转基因的T1幼苗测试负选择作用。转基因的T1dao1幼苗对浓度范围10mM至30mM的D-异亮氨酸和15-20mM的D-缬氨酸敏感(图11)。
实施例6：对转基因整合和遗传的分析
将T0植物在温室内培育成熟。通过对全部花穗分别套袋确保植物自我授粉。全部T0植物具有正常的表型、旺盛的生长和完整的种子结实。在户外(in vitro)和在温室内产生T1幼苗。通过TaqMan PCR测定法对幼苗检测基因整合作用并检测作为氯酚红试验或除草剂抗性测量的PAT转基因表达及ahas转基因表达，通过萌发生物测定法检测dsdA和dao1基因，通过组织化学染色法检测gusINT报道基因。
通过PCR对总共21个转基因事件(5个PAT/dsdA、6个dsdA/GUS、2个dsdA、5个dao1/GUS、3个dsdA/ahas)分析拷贝数和在T1中的分离。
对用构建体pRLM166、179、151、167转化的植物使用dsdA探针并且对用构建体pRLM205和226转化的植物使用GUS探针，通过Southern杂交测试T0植物和它们的T1子代的拷贝数。
通过酶测定法研究DSD(D-丝氨酸脱氨酶)酶的表达和酶活性。
使用水栽培培养法，还评估转基因植物在D-丝氨酸作为唯一氮源存在下的生长能力。
6.1.dsdA/PAT基因在双丙氨膦选择的T1子代中的遗传
评估转基因植物中PAT基因的表达并将其测量为氯酚红试验中培养基pH和颜色(红色至黄色)的改变和用
Figure A20068003373601091
喷洒后的除草剂耐受性。对相同的转基因植物测定在T1不成熟胚内由萌发生物测定法所测量的DsdA表达。T1子代中的分离分析以培养基中包含1mM D-丝氨酸时转基因植物萌发、生长和生根的能力为基础。因此，所提出的体外生物测定法是筛选携带dsdA选择性标记基因的分离性转基因群体的便利工具，其中所述测定法以选择性培养基上正在萌发的脱离胚乳的不成熟胚为基础，因为该测定法已报道为用于双丙氨膦的bar选择(Stoger等1998)。
来自3个事件的子代显示3∶1分离比，表明单基因座整合。其它两个事件证实15∶1分离比，表明两个基因座中的整合(表10)。
表10.T1世代中dsdA/PAT转基因的遗传
Figure A20068003373601092
χ2值没有显著不同于在0.1的显著性水平上测试的比率。
与拟南芥(Ericson等2004a)不同，在小麦中用D-丝氨酸对5日龄的对照幼苗和转基因幼苗喷雾不是高效率的。浓度是50-300mM的D-丝氨酸不足以在对照幼苗中激发中毒症状(数据未显示)。对植物的浇水也不足以激发中毒症状。因为摄取、土壤内流动和微生物脱毒均是土壤中D-丝氨酸发挥作用的潜在障碍，故期望在土壤内的选择似乎是前景不佳的。因此，在土壤中无法实现使转基因植物利用来自D-丝氨酸的脱毒产物作为额外的氮供应。
6.2.T1子代中dsdA，dsdA/gusINT和dsdsA/ahas基因的遗传
在温室内培育2个dsdA事件、6个dsdA/gasINT事件和3个dsdA/ahas事件的T1子代。基于TaqMan分析计算分离比率。对dsdA阳性的全部转基因植物也对第二基因呈阳性。证实所分析的子代中7个子代具有两种转基因并显示分离比率3∶1，表明为单基因座整合。4个事件显示比率15∶1，表明为两个基因座的整合(表11)。通过TaqMan估计(通过Southern验证)的拷贝数是1至3。以组织化学方式在全部T0阳性子代和T1阳性子代中检测到GUS表达，证实两种转基因的完全转化、整合和遗传。
6.3.T1子代中dao1/GUSint基因的遗传
在温室内培育5个dao1/gasINT事件的T1子代。基于TaqMan分析计算分离比率。对dao1阳性的全部转基因植物均对第二基因呈阳性。证实所分析的全部子代具有两种转基因，并且在3个事件中显示分离比率3∶1，表明为单基因座整合，而2个子代显示比率15∶1，表明为两个基因座的整合(表11)。以组织化学方式在全部阳性子代中检测到GUS表达。
表11.T1世代中dsdA基因和dao1基因的遗传
Figure A20068003373601111
χ2值没有显著不同于在0.1的显著性水平上测试的比率。
＊由TaqMan估计的拷贝数未用真实校验器(true alibrator)验证
Nd：未检测
所分析的全部转基因的子代均表达dsdA和dao1基因，如在1mM D-丝氨酸上不成熟T2胚萌发的生物测定法所测量(数据未显示)。
6.4.对T0和T1植物的分子分析
在代表12个事件的33份样品中分析dsdA基因拷贝数。来自T0原代转化体及其T1子代的基因组DNA用与构建体对应的BamHI或EcoRV消化。选择在T-DNA中的dsdA基因编码区之外切割的限制酶，从而因基因组DNA中存在的切割位点导致产生不同的片段。独特的组装杂交模式与独立事件相对应并且也显示选择性标记基因的拷贝数(图12I、II、III)。借助所测试的每个构建体回收具有单拷贝数和多重拷贝数的植物。
dsdA基因在T1子代中的遗传由相同的T0和T1Southern杂交图形揭示(图12I，II)。在具有2个拷贝和3个拷贝的株系2258和2256中分别观察到条带分离，证实在两个独立基因座处的整合(图12III)。
在代表T0和T1子代的5个事件的14份样品中分析dao1基因拷贝数。来自T0原代转化体及其T1子代的基因组DNA用与检测gus或dao1基因对应的BamHI或EcoRV消化。选择在T-DNA中的所探测的基因编码区之外切割的限制酶，从而因基因组DNA中存在的切割位点导致产生不同的片段。独特的组装杂交模式与独立事件相对应并且也显示选择性标记基因的拷贝数(图13)。回收具有1个至4个拷贝数的植物。事件51、52和91的T1植物中gus的条带与T0中gus的那些条带对应。事件26的T0具有3个拷贝，它们在分别具有1个拷贝和2个拷贝的T1子代中分离，表明存在两个位置的整合(图13)。
当通过TaqMan PCR对全部53个转基因事件分析dsdA拷贝数时，检测到如下分布：60％单拷贝；12％双拷贝和27％超过两个的拷贝。
6.5.DsdA选择性标记基因表达
通过夹心ELISA方法评估来自以3不同构建体所转化的并具有不同转基因拷贝数(CN)的数个T0和T1转基因植物的叶材料以检测D-丝氨酸脱氨酶表达(表12)。
发现转基因植物具有各异的DSD表达水平，而与所用的构建体及检测到的拷贝数无关。第3、4、385和423号植物显示30-45ng/mg蛋白质的高表达水平，而在第10、14、413和463号植物的叶中检测不到DSD(表12)。DSD在对照即非转基因植物和具有bar基因及dao1基因的转基因植物中不存在。当测量酶活性时，得到一致的数据(图14)。
表12 T0和T1转基因小麦植物，其中拷贝数由TaqMan PCR表征并且D-丝氨酸脱氨酶活性由ELISA表征。
植物编号 子代 构建体 基因1 基因2 CN dsdA   DSD(ng/mg)
  1  T1  pRLM166   dsdA   gus   1   24.89
  2  T1  pRLM166   dsdA   gus   1   24.35
  3  T1  pRLM166   dsdA   gus   1   32.71
  4  T1  pRLM166   dsdA   gus   2   40.70
  5  T1  pRLM166   dsdA   gus   1   20.48
  10  T1  pRLM167   dsdA   pat   1   0.00
  11  T1  pRLM167   dsdA   pat   1   19.49
  13  T1  pRLM167   dsdA   pat   1   8.78
  14  T1  pRLM167   dsdA   pat   3   0.00
  15  T1  pRLM167   dsdA   pat   3   28.50
  385  T0  pRLM151   dsdA   -   1   47.57
  413  T0  pRLM166   dsdA   gus   2   0.00
  423  T0  pRLM166   dsdA   gus   3   33.74
  429  T0  pRLM166   dsdA   gus   1   23.86
  431  T0  pRLM151   dsdA   -   1   5.21
  449  T0  pRLM151   dsdA   -   1   9.87
  450  T0  pRLM151   dsdA   -   1   18.57
  451  T0  pRLM151   dsdA   -   2   18.77
  463  T0  pRLM151   dsdA   -   1   0.00
  dao126  T1   dao1   gus   2   0.00
  对照C  Canon   -   -   0.00
  VC-05   bar   1   0.00
6.6.D-丝氨酸作为水栽培系统中的氮源
D-丝氨酸脱氨酶的异化产物是植物代谢中重要的化合物-铵和丙酮酸。理论上，配有功能性dsdA基因的转基因植物预期可利用D-丝氨酸作为氮源。我们通过用D-丝氨酸替换氮供给在水栽培生长系统中研究此现象。代表数个独立转基因事件的T2子代接受两组水栽培实验处理。
第一水栽培实验用来自携带dsdA和ahas选择性标记基因的3个独立转基因株系2256、2258和2264的植物和D-丝氨酸浓度范围来开展(图15I)。因D-丝氨酸的聚集，非转基因植物的生长在全部的测试浓度上受到完全抑制。在D-丝氨酸的相应浓度上检测到对照植物与转基因植物之间的统计学显著差异。这些转基因株系中的两个株系在D-丝氨酸的全部测试浓度上受到抑制。株系号2256的T2幼苗在D-丝氨酸的全部测试浓度上生长，其表现与标准水栽培溶液中培育的幼苗可比较，从而证实利用D-丝氨酸作为氮源的能力。
在补充30、50和70mM D-丝氨酸的水栽培溶液中培育具有携带dsdA基因和gusINT基因的4个株系的第二组实验(图15II)。结果证实非转基因对照植物在测试的浓度上不能够生长。转基因事件3和15对D-丝氨酸的全部浓度敏感，而来自事件1和4的子代在30mM的D-丝氨酸存在下生长。来自事件编号4的转基因的子代在至多到70mM D-丝氨酸(达到对照值)的水栽培中生长。
结论：
1.转基因小麦植物用基于D-氨基酸的选择系统以与pat/双丙氨膦选择可比较的频率得到选择。PAT基因和dsdA基因当在一个T-DNA中转移到小麦植物中时不起干扰作用。
2.使用dsdA和dao1的选择系统提供关键性优势以使逃逸率最小化至零并降低产生转基因植物的成本。
3.选择效应在生根期是明显的，其中非转基因植物显现异常的叶和根表型，导致以极低或为零的逃逸率选择了转基因植物。
4.两种选择剂D-丝氨酸和D-丙氨酸均适用于选择小麦转基因植物。
5.所选的带dsdA基因和dao1基因的转基因植物具有以孟德尔方式在T1子代中遗传的正常表型、生长性能、种子结实。
6.基于D-氨基酸的选择系统是通过再转化或杂交方法在小麦中进行基因堆叠的工具。
7.基于D-氨基酸的选择系统提供了通过利用负选择作用产生“无标记”转基因植物的可能性。
8.D-丝氨酸作为水栽培系统中氮的替代物显示出在植物生长上的抑制效应和个体株系生长的能力。
参考文献
以下所列的参考文献和文中提及的全部参考文献在本文中通过引用而参考到如此程度，以至于它们补充了、解释了、提供了用于本文中所采用方法学、技术和/或组合物的背景或教授了本文中所采用的方法学、技术和/或组合物。
1.Altpeter等(1996)Plant Cell Rep 16：12-17
2.Anderson和Young，定量滤膜杂交，在Nucleic AcidHybridization(1985)一书中；
3.Ashby等(1988)J.Bacteriol.170：4181-4187
4.Atanassova等(1992)Plant J 2(3)：291-300
5.Ausubel FM等(1987)Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience
6.Baker等(1987)EMBO J 6：1547-1554
7.Ball.J.B.和Alewood，P.F.(1990)J.Mol.Recognition 3：55
8.Barnett T.等(1980)Dev.Genet.1：331-340
9.Barro等(1998)TAG 97：684-695
10.Barry等(1992)第139-145页，在：B.K.Singh等(编辑)Biosynthesys andMolecular Regulation of Amino Acids in Plants的一书中，Am.Soc.Plant Physiologists，Rockville，MD
11.Becker等(1994)Plant J.5：299-307
12.Benfey等(1989)EMBO J 8：2195-2202
13.Bernnasconi P等(1995)J.Biochem.Chem.29：17381-17385
14.Bevan等(1983)Nature 304：184-187
15.Bevan等(1984)Nucl Acid Res 12，8711-8720
16.Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，第21-73页，CRCPress，Boca Raton(1985)
17.Bliffeld等(1999)TAG 98：1079-1086
18.Bolton等(1986)Science 232：983-985；
19.Breathnach R.和P.Chambon(1981)Ann.Rev.Biochem.50：349-383
20.Broothaerts W等(2005)Nature 433：629-633
21.Bruce等(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86：9692-9696
22.Callis等(1990)J Biol Chem 265(21)：12486-12493
23.Callis等，“在高等植物中的遍在蛋白和遍在蛋白基因”，OxfordSurveys of Plant Molecular&Cell Biology，第6卷，第1-30页(1989)
24.Carlson等(1991)Theor.Appl.Genet.83，194-200.
25.Chen和Winans(1991)J.Bacteriol.173：1139-1144
26.Cheng等(1997)Plant Physiol.115：971980
27.Cheng等(1998)TAG 97：1269-1306
28.Cheng等(2003)In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 39：595-604
29.Cheng等(2004)In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant 40：31-45
30.Chilton等(1974)Proc.Natl Acad.Sci.USA 71，3672-6
31.Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632
32.Christensen等(1992)Plant Mol Biol，18：675-689
33.Christensen等(1996)Transgenic Res 5：213-218
34.Christou等(1988)Plant Physiol 87：671-674
35.Christou等(1991)Biotechnology 9：957-962
36.Crameri等(1997)Nature Biotech.15：436
37.Crameri等，Nature，391：288(1998)
38.Cushman等(2000)Curr Opin Plant Biol 3(2)：117-24
39.Dale和Ow(1991)Proc Nat′l Acad Sci USA 88：10558-10562
40.Dandekar等(1989)J Tissue Cult Meth 12：145
41.de Block等(1987)EMBO J 6：2513-2518
42.de Bruijn等(1996)植物相关的细菌的和计算机辅助的系统发生分析，在Biology of Plant-Microbe Interaction；Proceedings of the 8thInternational Congress of Molecular Plant-Microbe Interactions(G.Stacey，B.Mullin和P.Gresshoff编者)中，APS Press，497-502
43.Deblaere等(1985)Nucl Acids Res 13：4777-4788
44.Della-Cioppa等(1987)Plant Physiology 84：965-968
45.Della-Cioppa等Bio/Technology 5：579-584(1987)
46.Deng等(1990)Science in China(Series B)33：27-33
47.Ditta等(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：747-751
48.Dixon M和Kleppe Biochim.Biophys.Acta 96(1965c)383-389
49.Dixon M和Kleppe K Biochim.Biophys.Acta 96(1965b)368-382
50.Dixon M和Kleppe K.Biochim.Biophys.Acta 96(1965a)357-367
51.Dunwell JM(2000)J Exp Bot 51Spec No：487-96
52.Eichholtz等(1987)Somatic Cell and Molecular Genetics 13：67-76
53.EP-A 0 120 516
54.EP-A 0 175 966
55.EP-A 0 270 356
56.EP-A 0 290 395
57.EP-A 0 331 083
58.EP-A 0 333 033
59.EP-A 0 335 528
60.EP-A 0 388 168
61.EP-A 0 434 616
62.EP-A 0 444 882
63.EP-A 0 672 752
64.EP-A 0 709 462
65.EP-A 0 991 765
66.Erikson等(2004)Nature Biotechnology 22：455-458
67.Evans等，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant CellCulture，第124176页，Macmillian Publishing Company，NewYork(1983)
68.Farmer，P.S.在Drug Design(E.J.Ariens编辑)Academic Press，NewYork，1980，第10卷，第119-143页
69.Farrand等(2003)Int.J.Systematic&Evolutionary Microbiology53：1681-1687
70.Fedoroff NV和Smith DL(1993)Plant J 3：273-289
71.Fire A.等(1998)Nature 391：806-811
72.Fraley等Proc Natl Acad Sci USA 80：4803(1983)
73.Frame等(2002)Plant Physiol.129：13-22
74.Franck等(1980)Cell 21：285-294；
75.Freeman等(1984)Plant Cell Physiol 29：1353
76.Freidinger，R.M.(1989)Trends Pharmacol.Sci.10：270
77.Fromm等(1985)Proc Natl Acad Sci USA 82：5824
78.Fromm等(1990)Bio/Technology 8：833-839
79.Gabler M等(2000)Enzyme Microb.Techno.27，605-611
80.Gallie等(1987)Nucl Acids Res 15：8693-8711
81.Gamborg and Wetter(1975)Plant Tissue Culture Methods.Saskatoon：Natl.Res.Council of Canada.
82.Garbarino等(1992)Plant Mol Biol 20：235-244
83.Gardner等(1986)Plant Mol Biol 6：221-228
84.Gatz等(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237
85.Gatz等(1992)Plant J 2：397-404
86.Gatz等(1994)Mol Gen Genetics 243：32-38
87.Gatz等(1997)Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48：89-108
88.Gelvin等(编辑)(1990)Plant Molecular Biology Manual；KluwerAcademic Publisher，Dordrecht，The Netherlands
89.Glick和Thompson(1993)Protein extraction：Methods in plantmolecular biology CRC Press，Boca Raton，USA
90.Genschick等(1994)Gene，148：195-202
91.Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)
92.Goodwin等(2005)第191-201页，在L.Pena(编辑)Transgenic plants，Methods and protocols.Humana press，Totowa，New Jessey
93.Green等(1987)Plant Tissue and Cell Culture，Academic Press
94.Gruber等(1993)“用于植物转化的载体”，在METHODS IN PLANTMOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY一书中；CRCPress，Boca Raton，Florida，编者：Glick和Thompson，第7章，第89-119页.
95.Guerrero等(1993)Mol Gen Genet 224：161-168
96.Guivarc′h等(1993)Protoplasma 174：10-18
97.Hajdukiewicz等(1994)Plant Mol Biol 25：989-994
98.Hansen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：7603-7607
99.Harlow和Lane(1998)Antibodies：A laboratory manual edited by ColdSpring Harbor laboratory Press，New York，USA
100.Herrera-Estrella等(1983)EMBO J.2：987-995
101.Hershey等(1991)Mol Gen Genetics 227：229-237
102.Hess等(19909Plant Sci.72：233-244
103.Hiei等(1994)Plant J 6：271-282
104.Higo等(1999)Nucl Acids Res 27(1)：297-300
105.Hirschman，R.，等(1993)J.Am.Chem.Soc.115：12550-12568
106.Hoekema(1985)在：The Binary Plant Vector System，Offsetdrukkerij Kanters B.V.，Alblasserdam，第V章
107.Hoekema等(1983)Nature 303：179-181
108.Hoffman等(1991)Mol Biol 17：1189-1201
109.Holsters等(1978)Mol Gen Genet 163：181-187
110.Holtorf S等(1995)Plant Mol Biol 29：637-747
111.Hood EE，Jilka JM.(1999)Curr Opin Biotechnol.10(4)：382-386
112.Hood等(1986)J Bacteriol 168：1291-1301
113.Hooykaas PJJ等(1977)J Gen Microbiol 98：477-484
114.Hu等(2003)Plant Cell Rep 21：1010-1019
115.Huber等(2002)Mol Breeding 10：19-30
116.Iser等(1999)J.Plant Physiol.154：509-516
117.Ingham等(2001)BioTechniques 31，132-140.
118.Ishida Y等(1996)Nature Biotech 745-750
119.J.Coombs(1994)Dictionary of Biotechnology，Stockton Press，NewYork
120.Jacq等(1993)Plant Cell Reports 12：621-624
121.James等(1993)Plant Cell Reports 12：559-563
122.Jarchow等(1991)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10426-10430
123.Jefferson等(1987)EMBO J.6：3901-3907
124.Jones，H.D.(2005)J.of Cereal Science 41：137-147
125.Kado(1991)Crit Rev Plant Sci 10：1
126.Kawalleck等(1993)Mol Biol 21：673-684
127.Kemper等(1992)Plant Cell Rep 11：118-121
128.Keown等(1990)Meth Enzymol 185：527-537
129.Khana，H.K.和Daggar，G.E.(2003)Plant Cell Rep 21：429-436
130.Kilby NJ等(1995)Plant J 8：637-652
131.Kishore等(1992)Weed Technol.6：626-634
132.Klapwijk等(1980)J.Bacteriol.，141，128-136
133.Klee等(1987)Ann Rev Plant Physiol 38：467-486.
134.Klein和Klein(1953)J Bacteriol.66(2)：220-228；
135.Klein等(1987)Nature 327：70-73
136.Koncz和Schell(1986)Mol Gen Genet 204：383-396
137.Kramer等(1993)Planta 190：454-458
138.Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81，581-588
139.Lawson等(1994)Mol Gen Genet 245：608-615
140.Lazzeri等(1997)Aspects of Applied Biology 50：1-8
141.Lazzeri P(1995)Methods Mol Biol 49：95-106
142.Lepetit等(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-285
143.Lescot等Nucleic Acids Res 30(1)：325-7(2002)
144.Li等(1992)Plant Mol Biol 20：1037-1048
145.Liu L等(1995)Biochem Cell Biol.73(1-2)：19-30
146.Llob等(2003)Europ J Plant Pathol 109：381-389
147.Lysnik等(1993)NAR 21：969-975
148.Lyznik LA等(1996)Nucleic Acids Res 24：3784-3789
149.Ma JK和Vine ND(1999)Curr Top Microbiol Immunol.236：275-92
150.Maniatis T，Fritsch EF和Sambrook J(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版.，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor(NY)
151.Massey V等Biochim.Biophys.Acta 48(1961)1-9
152.Matzke MA等(2000)Plant Mol Biol 43：401-415
153.McElroy等，Plant Cell 2：163171(1990)
154.McGranahan等(1990)Plant Cell Rep 8：512
155.Meister A和Wellner D，黄素蛋白氨基酸氧化酶，在：Boyer，P.D.，Lardy，H.和
Figure A20068003373601221
K.(编者)，The Enzymes一书中，第二版，第7卷，Academic Press，New York，1963，第609-648页
156.Melchers等(2000)Curr Opin Plant Biol 3(2)：147-52
157.Messing J.等(1983)，，在Genetic Engineering of Plants一书中，T.Kosuge，C.Meredith and A.Hollaender(编者)，Plenum Press，第211-227页
158.Mett等PNAS 90：4567-4571(1993)
159.Miki等(1993)“将外源DNA导入植物中的方法”，在METHODS INPLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY一书中；第67-88页
160.Miyano M等(1991)J Biochem 109：171-177
161.Mol JN等(1990)FEBS Lett 268(2)：427-430
162.Moloney等(1989)Plant Cell Reports 8：238
163.Montell C.等(1983)Nature 305：600-605
164.Mooney等(1991)Plant Cell Tiss Org Cult 25：209-218
165.Moore等(1997)J.Mol.Biol.，272：336
166.Morgan，B.A.和Gainor，J.A.(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24：243；
167.Mozo和Hooykaas(1991)Plant Mol.Biol.16：917-918
168.Murashige，T.和Skoog，F.(1962)Physiologia Pl.15：473-497
169.Nap等(1992)Trans.Res.1：239-249
170.Nehra等(1994)Plant J.5：285-297
171.Nehra等(1994)Plant J.5：285-297
172.Odell等(1985)Nature 313：810-812；
173.Odell等(1990)Mol Gen Genet 223：369-378
174.Olhoft等(2001)Plant Cell Rep 20：706-711
175.Onouchi等(1995)Mol Gen Genet 247：653-660
176.Ortiz等(1996)Plant Cell Rep 15：877-881
177.Osborne等(1995)Plant J.7，687-701
178.Ow等(1986)Science 234：856-859
179.Paszkowski等(1984)EMBO J 3：2717-2722
180.Patnaik，D.和Khurana，P.(2004)MBC Plant Biology 3：1-11
181.Pelham和Bienz(1982)EMBO J.1：1473-1477
182.Pellegrineschi等(2002)Genome 45：421-430
183.Perl A等(1996)Nature Biotechnol 14：624-628
184.Przetakiewicz等(2004)Cellular&Molecular Biology Letters  9：903-917
185.Rasco-Gaunt等(2003)Plant Cell Rep 21：569-576
186.Rasco-Gaunt等(2001)J Experimantal Botany 52：865-874
187.Rouster J等(1998)Plant J 15：435-440
188.Russell等(1992)Mol Gene Genet 234：49-59
189.Sahrawat等(2003)Plant Science 165：1147-1168
190.Saijo等(2000)Plant J 23(3)：319-327
191.Sakamoto等(2000)J Exp Bot 51(342)：81-8
192.Sambrook等(1989)Molecular cloning：A laboratory Manual，第二版.Cold Spring Harbor：Cold Spring Harbor Laboratory Press.
193.Sanford JC(1990)Physiologia Plantarium 79：206-209
194.Sauer B(1998)Methods 14(4)：381-92
195.Sautter等(1991)Bio/Technology，9：1080-1085
196.Sawada等(1993)International Journal of Systematic Bacteriology43(4)：694-702
197.Sawahel，W.和Hassan，A.H.(20029 Biotechnology Letters 24：721-725
198.Sawyer，T.K.(1995)“肽模拟物的设计和肽代谢的化学途径”，在Taylor，M.D.和Amidon，G.L.(编者)Peptide-Based Drug Design：Controlling Transport and Metabolism一书中，第17章
199.Scheeren-Groot等(1994)J.Bacteriol 176：6418-6426
200.Schena等(1991)Proc Nat′l Acad Sci USA 88：10421
201.Shah等(1986)Science 233：478
202.Sheehy等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85：8805-8809
203.Shewmaker等(1985)Virology 140：281-288
204.Shimamoto等(1992)Nature 338：274-276
205.Shimamoto K(1994)Current Opinion in Biotechnology 5：158-162
206.Silhavy TJ，Berman ML和Enquist LW(1984)Experiments with GeneFusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor(NY)
207.Simpson等(1985)EMBO J 4：2723-2729
208.Smith，A.B.3rd，等(1994)J.Am.Chem.Soc.116：9947-9962
209.Smith，A.B.3rd，等(1995)J.Am.Chem.Soc.117：11113-11123
210.Sritastava等(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96：11117-11121
211.Stachel等(1985)Nature 318：624-629
212.Stemmer(1994a)Nature，370：389-391
213.Stemmer(1994b)Proc Natl Acad.Sci USA 91：10747-10751
214.Stoger等(1998)Transgenic Research 7，463-471.
215.Stryer，Biochemistry(1988)W.H.Freeman and Company，NewYorkH
216.Sugita K等(2000)Plant J.22：461-469
217.Suzuki(2001)Gene.Jan 24；263(1-2)：49-58
218.Szamosi等(1993)Plant Phys 101，999-1004
219.The Maize Handbook，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，New York(1994)
220.Thomson等(1987)EMBO J.2519-2523
221.Timko等(1985)Nature 318：579-582
222.Twell等(1983)Sex.Plant Reprod.6：217-224
223.Twell等(1989)Mol Gen Genet 217：240-245
224.Twell等(1993)Sex.plant Reprod.6：217-224
225.Twell等，Plant Physiol.，91：1270(1989)
226.US 20030066108
227.US 4,801,340
228.US 4,940,838
229.US 4,962,028
230.US 4,975,374
231.US 5,059,239
232.US 5,100,792
233.US 5,225,341
234.US 5,352,605
235.US 5,510,474
236.US 5,605,793
237.US 5,614,399
238.US 5,683,439
239.US 5,750,866
240.US 5,811,238
241.US 5,830,721
242.US 5,837,458
243.US 6,020,190
244.US 6,054,574
245.US 6,068,994
246.US 6,268,547
247.US 6,489,462
248.US 6,528,701
249.US 6,653,529
250.US 6,689,880
251.Uze等(1999)TAG 99：487-495
252.Vain等(1995)Biotechnology Advances 13(4)：653-671
253.Van Laerebeke等(1974)Nature 252，169-170
254.van Veen RJM等(1988)Mol Plant Microb Interact 1(6)：231-234
255.Van Wordragen和Dons(1992)Plant Mol.Biol.Rep.10：12-36
256.Vanden Elzen等(1985)Plant Mol Biol.5：299
257.Varshney，A.和Altpeter，F.(2001)Mol.Breeding 8：295-309
258.Vasil(1996)Nature Biotechnology 14：702
259.Vasil等(1992)Bio/Technology，10：667-674
260.Vasil等(1993)Bio/Technology，11：1153-1158
261.Vasil等，Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第I，II和III卷，Laboratory Procedures and Their Applications，AcademicPress，1984，
262.Velten等(1984)EMBO J.3(12)：2723-2730
263.Vernade等(1988)J.Bacteriol.170：5822-5829
264.Vinuesa等(1998)Appl.Envir.Microbiol.64：2096-2104
265.W001/18220
266.Wader等1987Tomato Technology 189-198 Alan R.Liss，Inc.
267.Waldron等(1985)Plant Mol Biol 5：103-108
268.Wan和Lemaux(1994)Plant Physiol.104：3748
269.Ward等(1993)Plant Mol Biol 22：361-366
270.Waterhouse PM等(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95：13959-64
271.Watson等(1975)J.Bacteriol 123，255-264
272.Watson等(1985)EMBO J 4(2)：277-284
273.Weeks等(1993)Plant Physiol 102：1077-1084
274.Weeks等(1993)Plant Physiol.102：1077-1084
275.Weeks T.J.(2005)第157-161页，在Potricus andSpangenberg(eds.)Gene transfer to plants Springer-Verlag，NewYork
276.Weissbach和Weissbach，Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，1989
277.Wingender E等Nucleic Acids Res 29(1)：281-3(2001)
278.Witrzens等(1998)Aust.J.Plant Physiol.25：39-44
279.WO 00/58484
280.WO 02/00900
281.WO 02/10415
282.WO 03/004659
283.WO 03/060133
284.WO 03/102198
285.WO 87/06614
286.WO 89/02913
287.WO 91/02071
288.WO 91/13991
289.WO 92/09696
290.WO 93/01294
291.WO 93/21334
292.WO 93/24640
293.WO 94/00583
294.WO 94/00977
295.WO 95/06722
296.WO 95/15389
297.WO 95/19443
298.WO 95/23230
299.WO 97/037012
300.WO 98/45456
301.WO 99/16890
302.WO 00/44895
303.WO 00/44914
304.WO 00/49035
305.WO 00/63364
306.WO 00/68374
307.WO 99/32619
308.WO 99/53050
309.Wohlleben等(1983)Gene 70：25-37
310.Wu等(2003)Plant Cell Rep 21：659-668
311.Yeo等(2000)Mol Cells 10(3)：263-8
312.Young等(2003)Int.J.Systematic&Evolutionary Microbiology51：89-103
313.Zhang等(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：4504
314.Zhou等(1995)Plant Cell Rep 15：159-163
315.Zubko等(2000)Nature Biotech 18(4)：442-445
316.Zuou等(2002)Plant J.30：349-359
317.Zupan等(2000)Plant J 23(1)：11-2
序列表
<110>巴斯福植物科学有限公司
<120>用于小麦的新选择系统
<130>PF 57113
<160>42
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1329
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1329)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]基因/CDS
<400>1
atg gaa aac gct aaa atg aac tcg ctc atc gcc cag tat ccg ttg gta    48
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1               5                   10                  15
aag gat ctg gtt gct ctt aaa gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg    96
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
            20                  25                  30
acc tca ttg gct gaa ggt tta cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat    144
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
        35                  40                  45
gtt cag gac gcc cat gcg cgc tta tcc cgt ttt gca ccc tat ctg gca    192
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
    50                  55                  60
aaa gca ttt cct gaa act gct gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa    240
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
ctg gtt gcc att cca gct atg caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag    288
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
                85                  90                  95
caa ccg atc agc ggg caa ctg tta ctg aaa aaa gat agc cat ttg ccc    336
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
            100                 105                 110
att tcc ggc tcc ata aaa gca cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gca    384
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
        115                 120                 125
cac gca gaa aaa ctg gct ctg gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat    432
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
    130                 135                 140
gac tac agc aaa ctg ctt tct ccg gag ttt aaa cag ttc ttt agc caa    480
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145                 150                 155                 160
tac agc att gct gtg ggc tca acc gga aat ctg ggg tta tca atc ggc    528
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
                165                 170                 175
att atg agc gcc cgc att ggc ttt aag gtg aca gtt cat atg tct gct    576
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
            180                 185                 190
gat gcc cgg gca tgg aaa aaa gcg aaa ctg cgc agc cat ggc gtt acg    624
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
        195                 200                 205
gtc gtg gaa tat gag caa gat tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt    672
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
    210                 215                 220
aaa gca gcg cag tct gac ccg aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat    720
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225                 230                 235                 240
tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa    768
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
                245                 250                 255
gcg caa ttt gcc cag caa ggc cgt atc gtc gat gct gat aac cct ctg    816
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
            260                 265                 270
ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gca    864
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
        275                 280                 285
ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc    912
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
    290                 295                 300
gaa cca acg cac tcc cct tgt atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta    960
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305                 310                 315                 320
cac gat cag att tct gtt cag gat att ggt atc gac aac ctt acc gca    1008
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
                325                 330                 335
gcg gat ggc ctt gca gtt ggt cgc gca tca ggc ttt gtc ggg cgg gca    1056
Ala Asp 6ly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
            340                 345                 350
atg gag cgt ctg ctg gat ggc ttc tat acc ctt agc gat caa acc atg    1104
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
        355                 360                 365
tat gac atg ctt ggc tgg ctg gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa    1152
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
    370                 375                 380
cct tcg gca ctg gcg ggt atg gcc gga cct cag cgc gtg tgt gca tca    1200
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385                 390                 395                 400
gta agt tac caa cag atg cac ggt ttc agc gca gaa caa ctg cgt aat    1248
Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
                405                 410                 415
acc act cat ctg gtg tgg gcg acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa gaa    1296
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
            420                 425                 430
gag atg aat caa tat ctg gca aaa ggc cgt taa                        1329
Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg
        435                 440
<210>2
<211>442
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
            20                  25                  30
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
        35                  40                  45
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
                85                  90                  95
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
            100                 105                 110
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
        115                 120                 125
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
    130                 135                 140
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
                165                 170                 175
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
            180                 185                 190
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
        195                 200                 205
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
    210                 215                 220
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225                 230                 235                 240
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
                245                 250                 255
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
            260                 265                 270
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
        275                 280                 285
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
    290                 295                 300
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305                 3l0                 315                 320
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
                325                 330                 335
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala
            340                 345                 350
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
        355                 360                 365
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
    370                 375                 380
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385                 390                 395                 400
Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
                405                 410                 415
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
            420                 425                 430
Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg
        435                 440
<210>3
<211>1107
<212>DNA
<213>红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1107)
<223>红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS
<400>3
atg cac tcg cag aag cgc gtc gtt gtc ctc gga tca ggc gtt atc ggt    48
Met His Ser Gin Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
ctg agc agc gcc ctc atc ctc gct cgg aag ggc tac agc gtg cat att    96
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
            20                  25                  30
ctc gcg cgc gac ttg ccg gag gac gtc tcg agc cag act ttc gct tca    144
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
        35                  40                  45
cca tgg gct ggc gcg aat tgg acg cct ttc atg acg ctt aca gac ggt    192
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
    50                  55                  60
cct cga caa gca aaa tgg gaa gaa tcg act ttc aag aag tgg gtc gag    240
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65                  70                  75                  80
ttg gtc ccg acg ggc cat gcc atg tgg ctc aag ggg acg agg cgg ttc    288
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
                85                  90                  95
gcg cag aac gaa gac ggc ttg ctc ggg cac tgg tac aag gac atc acg    336
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
            100                 105                 110
cca aat tac cgc ccc ctc cca tct tcc gaa tgt cca cct ggc gct atc    384
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
        115                 120                 125
ggc gta acc tac gac acc ctc tcc gtc cac gca cca aag tac tgc cag    432
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
    130                 135                 140
tac ctt gca aga gag ctg cag aag ctc ggc gcg acg ttt gag aga cgg    480
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145                 150                 155                 160
acc gtt acg tcg ctt gag cag gcg ttc gac ggt gcg gat ttg gtg gtc    528
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
                165                 170                 175
aac gct acg gga ctt ggc gcc aag tcg att gcg ggc atc gac gac caa    576
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
            180                 185                 190
gcc gcc gag cca atc cgc ggg caa acc gtc ctc gtc aag tcc cca tgc    624
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
        195                 200                 205
aag cga tgc acg atg gac tcg tcc gac ccc gct tct ccc gcc tac atc    672
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
    210                 215                 220
att ccc cga cca ggt ggc gaa gtc atc tgc ggc ggg acg tac ggc gtg    720
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225                 230                 235                 240
gga gac tgg gac ttg tct gtc aac cca gag acg gtc cag cgg atc ctc    768
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
                245                 250                 255
aag cac tgc ttg cgc ctc gac ccg acc atc tcg agc gac gga acg atc    816
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
            260                 265                 270
gaa ggc atc gag gtc ctc cgc cac aac gtc ggc ttg cga cct gca cga    864
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
        275                 280                 285
cga ggc gga ccc cgc gtt gag gca gaa cgg atc gtc ctg cct ctc gac    912
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
    290                 295                 300
cgg aca aag tcg ccc ctc tcg ctc ggc agg ggc agc gca cga gcg gcg    960
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
aag gag aag gag gtc acg ctt gtg cat gcg tat ggc ttc tcg agt gcg    1008
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
                325                 330                 335
gga tac cag cag agt tgg ggc gcg gcg gag gat gtc gcg cag ctc gtc    1056
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
            340                 345                 350
gac gag gcg ttc cag cgg tac cac ggc gcg gcg cgg gag tcg aag ttg    1104
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
        355                 360                 365
tag                                                                1107
<210>4
<211>368
<212>PRT
<213>红冬孢酵母
<400>4
Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Ala Leu lle Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
            20                  25                  30
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
       35                  40                  45
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
    50                  55                  60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
                85                  90                  95
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly Hi s Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
            100                 105                 110
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
        115                 120                 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
    130                 135                 140
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145                 150                 155                 160
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
                165                 170                 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
            180                 185                 190
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
        195                 200                 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
    210                 215                 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225                 230                 235                 240
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
                245                 250                 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
        275                 280                 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
    290                 295                 300
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
                325                 330                 335
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
            340                 345                 350
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
        355                 360                 365
<210>5
<211>275
<212>DNA
<213>玉米(Zea mays)
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(275)
<223>玉米遍在蛋白275bp核心启动子
<220>
<221>misc_signal
<222>(61)..(74)
<223>类似于共有的热休克元件
<220>
<221>misc_signal
<222>(71)..(84)
<223>类似于共有的热休克元件
<220>
<221>TATA_signal
<222>(246)..(254)
<223>TATA盒
<400>5
aaccagcagc gtcgcgtcgg gccaagcgaa gcagacggca cggcatctct gtcgctgcct     60
ctggacccct ctcgagagtt ccgctccacc gttggacttg ctccgctgtc ggcatccaga    120
aattgcgtgg cggagcggca gacgtgagcc ggcacggcag gcggcctcct cctcctctca    180
cggcaccggc agctacgggg gattcctttc ccaccgctcc ttcgctttcc cttcctcgcc    240
cgccgtaata aatagacacc ccctccacac cctct                               275
<210>6
<211>1988
<212>DNA
<213>玉米
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1988)
<223>玉米遍在蛋白启动子区、5’UTR和内含子
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(899)
<223>玉米遍在蛋白启动子区
<220>
<221>misc_signal
<222>(685)..(698)
<223>类似于共有的热休克元件
<220>
<221>misc_signal
<222>(695)..(708)
<223>类似于共有的热休克元件
<220>
<221>TATA_signal
<222>(870)..(878)
<223>TATA盒
<220>
<221>5’UTR
<222>(900)..(1988)
<220>
<221>内含子
<222>(983)..(1988)
<223>玉米遍在蛋白基因内含子MubG1
<400>6
tgcagtgcag cgtgacccgg tcgtgcccct ctctagagat aatgagcatt gcatgtctaa     60
gttataaaaa attaccacat attttttttg tcacacttgt ttgaagtgca gtttatctat    120
ctttatacat atatttaaac tttactctac gaataatata atctatagta ctacaataat    180
atcagtgttt tagagaatca tataaatgaa cagttagaca tggtctaaag gacaattgag    240
tattttgaca acaggactct acagttttat ctttttagtg tgcatgtgtt ctcctttttt    300
tttgcaaata gcttcaccta tataatactt catccatttt attagtacat ccatttaggg     360
tttagggtta atggttttta tagactaatt tttttagtac atctatttta ttctatttta     420
gcctctaaat taagaaaact aaaactctat tttagttttt ttatttaata gtttagatat     480
aaaatagaat aaaataaagt gactaaaaat taaacaaata ccctttaaga aattaaaaaa     540
actaaggaaa catttttctt gtttcgagta gataatgcca gcctgttaaa cgccgtcgac     600
gagtctaacg gacaccaacc agcgaaccag cagcgtcgcg tcgggccaag cgaagcagac     660
ggcacggcat ctctgtcgct gcctctggac ccctctcgag agttccgctc caccgttgga     720
cttgctccgc tgtcggcatc cagaaattgc gtggcggagc ggcagacgtg agccggcacg     780
gcaggcggcc tcctcctcct ctcacggcac cggcagctac gggggattcc tttcccaccg     840
ctccttcgct ttcccttcct cgcccgccgt aataaataga caccccctcc acaccctctt     900
tccccaacct cgtgttgttc ggagcgcaca cacacacaac cagatctccc ccaaatccac     960
ccgtcggcac ctccgcttca aggtacgccg ctcgtcctcc cccccccccc ccctctctac    1020
cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt tagggcccgg tagttctact tctgttcatg    1080
tttgtgttag atccgtgttt gtgttagatc cgtgctgcta gcgttcgtac acggatgcga    1140
cctgtacgtc agacacgttc tgattgctaa cttgccagtg tttctctttg gggaatcctg    1200
ggatggctct agccgttccg cagacgggat cgatttcatg attttttttg tttcgttgca    1260
tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt    1320
catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt    1380
ctagatcgga gtagaattct gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt    1440
atgtgtgtgc catacatatt catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc    1500
taggataggt atacatgttg atgcgggttt tactgatgca tatacagaga tgctttttgt    1560
tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg ggcggtcgtt cattcgttct agatcggagt    1620
agaatactgt ttcaaactac ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca    1680
tacatcttca tagttacgag tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca    1740
tgttgatgtg ggttttactg atgcatatac atgatggcat atgcagcatc tattcatatg    1800
ctctaacctt gagtacctat ctattataat aaacaagtat gttttataat tatttcgatc  1860
ttgatatact tggatgatgg catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct  1920
tcatacgcta tttatttgct tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg  1980
tgttactt                                                           1988
<210>7
<211>275
<212>DNA
<213>甘蔗杆状病毒
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(275)
<223>甘蔗杆状病毒275bp核心启动子
<220>
<221>TATA_signal
<222>(224)..(243)
<223>TATA盒
<400>7
gattgaggag gcattgacgt cagggatgac cgcagcggag agtactgggc ccattcagtg   60
gatgctccac tgagttgtat tattgtgtgc ttttcggaca agtgtgctgt ccactttctt  120
ttggcacctg tgccacttta ttccttgtct gccacgatgc ctttgcttag cttgtaagca  180
aggatcgcag tgcgtgtgtg acaccacccc ccttccgacg ctctgcctat ataaggcacc  240
gtctgtaagc tcttacgatc atcggtagtt cacca                             275
<210>8
<211>1398
<212>DNA
<213>甘蔗杆状病毒
<220>
<221>启动子
<222>(1)..(1398)
<223>甘蔗杆状病毒[ScBV]启动子区
<220>
<221>misc_signal
<222>(98)..(118)
<223>热休克因子
<220>
<221>misc_signal
<222>(365)..(385)
<223>热休克因子
<220>
<221>misc_signal
<222>(606)..(626)
<223>热休克因子
<220>
<221>misc_signal
<222>(705)..(719)
<223>热休克元件
<220>
<221>TATA_signal
<222>(1345)..(1364)
<223>TATA盒
<400>8
aatcctggct agcaacactg aactatgcca gaaaccacat caaagatatg ggcaagcttc     60
ttggcccatt atatccaaag acctcagaga aaggtgagcg aaggctcaat tcagaagatt    120
ggaagctgat caataggatc aagacaatgg tgagaacgct tccaaatctc actattccac    180
cagaagatgc atacattatc attgaaacag atgcatgtgc aactggatgg ggagcagtat    240
gcaagtggaa gaaaaacaag gcagacccaa gaaatacaga gcaaatctgt aggtatgcca    300
gtggaaaatt tgataagcca aaaggaacct gtgatgcaga aatctatggg gttatgaatg    360
gcttagaaaa gatgagattg ttctacttgg acaaaagaga gatcacagtc agaactgaca    420
gtagtgcaat cgaaaggttc tacaacaaga gtgctgaaca caagccttct gagatcagat    480
ggatcaggtt catggactac atcactggtg caggaccaga gatagtcatt gaacacataa    540
aagggaagag caatggttta gctgacatct tgtccaggct caaagccaaa ttagctcaga    600
atgaaccaac ggaagagatg atcctgctta cacaagccat aagggaagta attccttatc    660
cagatcatcc atacactgag caactcagag aatggggaaa caaaattctg gatccattcc    720
ccacattcaa gaaggacatg ttcgaaagaa cagagcaagc ttttatgcta acagaggaac    780
cagttctact ctgtgcatgc aggaagcctg caattcagtt agtgtccaga acatctgcca   840
acccaggaag gaaattcttc aagtgcgcaa tgaacaaatg ccattgctgg tactgggcag   900
atctcattga agaacacatt caagacagaa ttgatgaatt tctcaagaat cttgaagttc   960
tgaagaccgg tggcgtgcaa acaatggagg aggaacttat gaaggaagtc accaagctga  1020
agatagaaga gcaggagttc gaggaatacc aggccacacc aagggctatg tcgccagtag  1080
ccgcagaaga tgtgctagat ctccaagacg taagcaatga cgattgagga ggcattgacg  1140
tcagggatga ccgcagcgga gagtactggg cccattcagt ggatgctcca ctgagttgta  1200
ttattgtgtg cttttcggac aagtgtgctg tccactttct tttggcacct gtgccacttt  1260
attccttgtc tgccacgatg cctttgctta gcttgtaagc aaggatcgca gtgcgtgtgt  1320
gacaccaccc cccttccgac gctctgccta tataaggcac cgtctgtaag ctcttacgat  1380
catcggtagt tcaccaag                                                1398
<210>9
<211>5035
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码pRLM175的核酸序列，卡那霉素抗性的pSB11型双元载体.
<220>
<221>misc_structure
<222>(5)..(132)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_binding
<222>(51)..(75)
<223>来自pSB1的左T-DNA边界重复区
<220>
<221>misc_structure
<222>(232)..(376)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_binding
<222>(272)..(295)
<223>来自pSB1的右T-DNA边界重复区
<220>
<221>misc_structure
<222>(777)..(3511)
<223>pSB1重组靶标
<220>
<221>rep_origin
<222>(2654)..(2934)
<223>来自pSB11的ColEI复制起点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3074)..(3334)
<223>来自pSB11的ColEI BOM位点
<220>
<221>misc_feature
<222>(3793)..(4608)
<223>cds，来自Tn903的编码卡那霉素抗性选择基因
<400>9
agtggtgatt ttgtgccgag ctgccggtcg gggagctgtt ggctggctgg tggcaggata    60
tattgtggtg taaacaaatt gacgcttaga caacttaata acacattgcg gacgttttta   120
atgtactgaa ttggatccgc ccgggcggta ccgaattcgc ggccgcaagc ttgtacaacg   180
cgtaccggtt aattaatcta gaggcgcgcc gggcccggcc ggccagatct tgattgtcgt   240
ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt tgacaggata tattggcggg taaacctaag   300
agaaaagagc gtttattaga ataatcggat atttaaaagg gcgtgaaaag gtttatccgt   360
tcgtccattt gtatgtgcat gccaaccaca gggttcccct cgggagtgct tggcattccg   420
tgcgataatg acttctgttc aaccacccaa acgtcggaaa gcctgacgac ggagcagcat   480
tccaaaaaga tcccttggct cgtctgggtc ggctagaagg tcgagtgggc tgctgtggct   540
tgatccctca acgcggtcgc ggacgtagcg cagcgccgaa aaatcctcga tcgcaaatcc   600
gacgctgtcg aaaagcgtga tctgcttgtc gctctttcgg ccgacgtcct ggccagtcat   660
cacgcgccaa agttccgtca caggatgatc tggcgcgagt tgctggatct cgccttcaat   720
ccgggtctgt ggcgggaact ccacgaaaat atccgaacgc agcaagatcg tcgaccaatt   780
cttgaagacg aaagggcctc gtgatacgcc tatttttata ggttaatgtc atgataataa     840
tggtttctta gacgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt     900
tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc     960
ttcaataata ttgaaaaagg aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc    1020
ccttttttgc ggcattttgc cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa    1080
aagatgctga agatcagttg ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg    1140
gtaagatcct tgagagtttt cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag    1200
ttctgctatg tggcgcggta ttatcccgtg ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc    1260
gcatacacta ttctcagaat gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta    1320
cggatggcat gacagtaaga gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg    1380
cggccaactt acttctgaca acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca    1440
acatggggga tcatgtaact cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac    1500
caaacgacga gcgtgacacc acgatgccgg gggggggggg gggggacatg aggttgcccc    1560
gtattcagtg tcgctgattt gtattgtctg aagttgtttt tacgttaagt tgatgcagat    1620
caattaatac gatacctgcg tcataattga ttatttgacg tggtttgatg gcctccacgc    1680
acgttgtgat atgtagatga taatcattat cactttacgg gtcctttccg gtgatccgac    1740
aggttacggg gcggcgacct cgcgggtttt cgctatttat gaaaattttc cggtttaagg    1800
cgtttccgtt cttcttcgtc ataacttaat gtttttattt aaaataccct ctgaaaagaa    1860
aggaaacgac aggtgctgaa agcgagcttt ttggcctctg tcgtttcctt tctctgtttt    1920
tgtccgtgga atgaacaatg gaaccccccc cccccccccc tgcagcaatg gcaacaacgt    1980
tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc ccggcaacaa ttaatagact    2040
ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc ggcccttccg gctggctggt    2100
ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg cggtatcatt gcagcactgg    2160
ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac gacggggagt caggcaacta    2220
tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc actgattaag cattggtaac    2280
tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt aaaacttcat ttttaattta    2340
aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac caaaatccct taacgtgagt    2400
tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa aggatcttct tgagatcctt    2460
tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc accgctacca gcggtggttt    2520
gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt aactggcttc agcagagcgc    2580
agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg ccaccacttc aagaactctg    2640
tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc agtggctgct gccagtggcg    2700
ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt accggataag gcgcagcggt    2760
cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga gcgaacgacc tacaccgaac    2820
tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct tcccgaaggg agaaaggcgg    2880
acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg cacgagggag cttccagggg    2940
gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca cctctgactt gagcgtcgat    3000
ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa cgccagcaac gcggcctttt    3060
tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt ctttcctgcg ttatcccctg    3120
attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga taccgctcgc cgcagccgaa    3180
cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga gcgcctgatg cggtattttc    3240
tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatggtg cactctcagt acaatctgct    3300
ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc    3360
tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc    3420
atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc    3480
gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagcagat cccccgatca agtagataca ctacatatat    3540
ctacaataga catcgagccg gaaggtgatg tttactttcc tgaaatcccc agcaatttta    3600
ggccagtttt tacccaagac ttcgcctcta acataaatta tagttaccaa atctggcaaa    3660
agggttgacc gggggggggg ggaaagccac gttgtgtctc aaaatctctg atgttacatt    3720
gcacaagata aaaatatatc atcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat    3780
acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctcgaggcc gcgattaaat 3840
tccaacatgg atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca 3900
ggtgcgacaa tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctgaaacat 3960
ggcaaaggta gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg 4020
gaatttatgc ctcttccgac catcaagcat tttatccgta ctcctgatga tgcatggtta 4080
ctcaccactg cgatccccgg gaaaacagca ttccaggtat tagaagaata tcctgattca 4140
ggtgaaaata ttgttgatgc gctggcagtg ttcctgcgcc ggttgcattc gattcctgtt 4200
tgtaattgtc cttttaacag cgatcgcgta tttcgtctcg ctcaggcgca atcacgaatg 4260
aataacggtt tggttgatgc gagtgatttt gatgacgagc gtaatggctg gcctgttgaa 4320
caagtctgga aagaaatgca taagcttttg ccattctcac cggattcagt cgtcactcat 4380
ggtgatttct cacttgataa ccttattttt gacgagggga aattaatagg ttgtattgat 4440
gttggacgag tcggaatcgc agaccgatac caggatcttg ccatcctatg gaactgcctc 4500
ggtgagtttt ctccttcatt acagaaacgg ctttttcaaa aatatggtat tgataatcct 4560
gatatgaata aattgcagtt tcatttgatg ctcgatgagt ttttctaatc agaattggtt 4620
aattggttgt aacactggca gagcattacg ctgacttgac gggacggcgg ctttgttgaa 4680
taaatcgaac ttttgctgag ttgaaggatc agatcacgca tcttcccgac aacgcagacc 4740
gttccgtggc aaagcaaaag ttcaaaatca ccaactggtc cacctacaac aaagctctca 4800
tcaaccgtgg ctccctcact ttctggctgg atgatggggc gattcaggga tcacaggcag 4860
caacgctctg tcatcgttac aatcaacatg ctaccctccg cgagatcatc cgtgtttcaa 4920
acccggcagc ttagttgccg ttcttccgaa tagcatcggt aacatgagca aagtctgccg 4980
ccttacaacg gctctcccgc tgacgccgtc ccggactgat gggctgcctg tatcg      5035
<210>10
<211>8269
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码pRLM166的T-DNA区，所述pRLM166为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(162)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(1144)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2192)..(3520)
<223>cds，编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]
<220>
<221>终止子
<222>(3558)..(4270)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>启动子
<222>(4343)..(5740)
<223>甘蔗杆状病毒[ScBV]启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(5772)..(7772)
<223>gusINT cds和内含子
<220>
<221>内含子
<222>(6157)..(6345)
<223>gusINT的PIV2内含子，为经修饰的马铃薯ST-LS1内含子
<220>
<221>终止子
<222>(7843)..(8095)
<223>来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)T-DNA的胭脂碱合酶的3’UTR用作终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(8125)..(8269)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(8165)..(8188)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>10
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt     60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt    120
actgaattgg atccgcccgg gcggtaccaa gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg    180
gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca    240
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa    300
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc    360
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc    420
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct    480
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt    540
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac    600
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag    660
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct    720
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac    780
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc    840
tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat    900
ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc    960
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc   1020
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt   1080
cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc    1140
aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc    1200
cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt    1260
tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt    1320
ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc    1380
gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt    1440
ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt    1500
ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc    1560
tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat    1620
tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt    1680
gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg    1740
tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta    1800
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga    1860
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact    1920
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta    1980
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg    2040
gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc    2100
ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac    2160
ggatcctcat ctaagcgcaa agagacgtac tatggaaaac gctaaaatga actcgctcat    2220
cgcccagtat ccgttggtaa aggatctggt tgctcttaaa gaaaccacct ggtttaatcc    2280
tggcacgacc tcattggctg aaggtttacc ttatgttggc ctgaccgaac aggatgttca    2340
ggacgcccat gcgcgcttat cccgttttgc accctatctg gcaaaagcat ttcctgaaac    2400
tgctgccact ggggggatta ttgaatcaga actggttgcc attccagcta tgcaaaaacg    2460
gctggaaaaa gaatatcagc aaccgatcag cgggcaactg ttactgaaaa aagatagcca    2520
tttgcccatt tccggctcca taaaagcacg cggcgggatt tatgaagtcc tggcacacgc    2580
agaaaaactg gctctggaag cggggttgct gacgcttgat gatgactaca gcaaactgct    2640
ttctccggag tttaaacagt tctttagcca atacagcatt gctgtgggct caaccggaaa    2700
tctggggtta tcaatcggca ttatgagcgc ccgcattggc tttaaggtga cagttcatat    2760
gtctgctgat gcccgggcat ggaaaaaagc gaaactgcgc agccatggcg ttacggtcgt    2820
ggaatatgag caagattatg gtgttgccgt cgaggaagga cgtaaagcag cgcagtctga    2880
cccgaactgt ttctttattg atgacgaaaa ttcccgcacg ttgttccttg ggtattccgt    2940
cgctggccag cgtcttaaag cgcaatttgc ccagcaaggc cgtatcgtcg atgctgataa    3000
ccctctgttt gtctatctgc cgtgtggtgt tggcggtggt cctggtggcg tcgcattcgg    3060
gcttaaactg gcgtttggcg atcatgttca ctgctttttt gccgaaccaa cgcactcccc    3120
ttgtatgttg ttaggcgtcc atacaggatt acacgatcag atttctgttc aggatattgg    3180
tatcgacaac cttaccgcag cggatggcct tgcagttggt cgcgcatcag gctttgtcgg    3240
gcgggcaatg gagcgtctgc tggatggctt ctataccctt agcgatcaaa ccatgtatga    3300
catgcttggc tggctggcgc aggaagaagg tattcgtctt gaaccttcgg cactggcggg    3360
tatggccgga cctcagcgcg tgtgtgcatc agtaagttac caacagatgc acggtttcag    3420
cgcagaacaa ctgcgtaata ccactcatct ggtgtgggcg acgggaggtg gaatggtgcc    3480
ggaagaagag atgaatcaat atctggcaaa aggccgttaa taacgtttca acgcagcatg    3540
gatcgtaccg agctcaatcg atcctgcttt aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca    3600
tgatatttgc tttcaattct gttgtgcacg ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag    3660
atccttaccg ccggtttcgg ttcattctaa tgaatatatc acccgttact atcgtatttt    3720
tatgaataat attctccgtt caatttactg attgtaccct actacttata tgtacaatat    3780
taaaatgaaa acaatatatt gtgctgaata ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc    3840
acaataacaa acaattgcgt tttattatta caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac    3900
cggtcaaacc taaaagactg attacataaa tcttattcaa atttcaaaag tgccccaggg    3960
gctagtatct acgacacacc gagcggcgaa ctaataacgc tcactgaagg gaactccggt    4020
tccccgccgg cgcgcatggg tgagattcct tgaagttgag tattggccgt ccgctctacc    4080
gaaagttacg ggcaccattc aacccggtcc agcacggcgg ccgggtaacc gacttgctgc    4140
cccgagaatt atgcagcatt tttttggtgt atgtgggccc caaatgaagt gcaggtcaaa    4200
ccttgacagt gacgacaaat cgttgggcgg gtccagggcg aattttgcga caacatgtcg    4260
aggctcagca ggatgggccc aggtacagaa ttcgcggccg tacaacgcgt accggttaat    4320
taaggtaccc aattgcatat gtaatcctgg ctagcaacac tgaactatgc cagaaaccac    4380
atcaaagata tgggcaagct tcttggccca ttatatccaa agacctcaga gaaaggtgag    4440
cgaaggctca attcagaaga ttggaagctg atcaatagga tcaagacaat ggtgagaacg    4500
cttccaaatc tcactattcc accagaagat gcatacatta tcattgaaac agatgcatgt    4560
gcaactggat ggggagcagt atgcaagtgg aagaaaaaca aggcagaccc aagaaataca    4620
gagcaaatct gtaggtatgc cagtggaaaa tttgataagc caaaaggaac ctgtgatgca    4680
gaaatctatg gggttatgaa tggcttagaa aagatgagat tgttctactt ggacaaaaga    4740
gagatcacag tcagaactga cagtagtgca atcgaaaggt tctacaacaa gagtgctgaa    4800
cacaagcctt ctgagatcag atggatcagg ttcatggact acatcactgg tgcaggacca    4860
gagatagtca ttgaacacat aaaagggaag agcaatggtt tagctgacat cttgtccagg    4920
ctcaaagcca aattagctca gaatgaacca acggaagaga tgatcctgct tacacaagcc    4980
ataagggaag taattcctta tccagatcat ccatacactg agcaactcag agaatgggga    5040
aacaaaattc tggatccatt ccccacattc aagaaggaca tgttcgaaag aacagagcaa    5100
gcttttatgc taacagagga accagttcta ctctgtgcat gcaggaagcc tgcaattcag    5160
ttagtgtcca gaacatctgc caacccagga aggaaattct tcaagtgcgc aatgaacaaa    5220
tgccattgct ggtactgggc agatctcatt gaagaacaca ttcaagacag aattgatgaa    5280
tttctcaaga atcttgaagt tctgaagacc ggtggcgtgc aaacaatgga ggaggaactt    5340
atgaaggaag tcaccaagct gaagatagaa gagcaggagt tcgaggaata ccaggccaca    5400
ccaagggcta tgtcgccagt agccgcagaa gatgtgctag atctccaaga cgtaagcaat    5460
gacgattgag gaggcattga cgtcagggat gaccgcagcg gagagtactg ggcccattca    5520
gtggatgctc cactgagttg tattattgtg tgcttttcgg acaagtgtgc tgtccacttt    5580
cttttggcac ctgtgccact ttattccttg tctgccacga tgcctttgct tagcttgtaa    5640
gcaaggatcg cagtgcgtgt gtgacaccac cccccttccg acgctctgcc tatataaggc    5700
accgtctgta agctcttacg atcatcggta gttcaccaag ggggtacgat ctccgggtag    5760
gtcagtccct tatgttacgt cctgtagaaa ccccaacccg tgaaatcaaa aaactcgacg    5820
gcctgtgggc attcagtctg gatcgcgaaa actgtggaat tggtcagcgt tggtgggaaa    5880
gcgcgttaca agaaagccgg gcaattgctg tgccaggcag ttttaacgat cagttcgccg    5940
atgcagatat tcgtaattat gcgggcaacg tctggtatca gcgcgaagtc tttataccga    6000
aaggttgggc aggccagcgt atcgtgctgc gtttcgatgc ggtcactcat tacggcaaag    6060
tgtgggtcaa taatcaggaa gtgatggagc atcagggcgg ctatacgcca tttgaagccg    6120
atgtcacgcc gtatgttatt gccgggaaaa gtgtacgtaa gtttctgctt ctacctttga    6180
tatatatata ataattatca ttaattagta gtaatataat atttcaaata tttttttcaa    6240
aataaaagaa tgtagtatat agcaattgct tttctgtagt ttataagtgt gtatatttta    6300
atttataact tttctaatat atgaccaaaa tttgttgatg tgcaggtatc accgtttgtg    6360
tgaacaacga actgaactgg cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg    6420
gcaagaaaaa gcagtcttac ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg    6480
taatgctcta caccacgccg aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg    6540
cgcaagactg taaccacgcg tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg    6600
ttgaactgcg tgatgcggat caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt    6660
tgcaagtggt gaatccgcac ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg    6720
tcacagccaa aagccagaca gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag    6780
tggcagtgaa gggcgaacag ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg    6840
gtcgtcatga agatgcggac ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg    6900
accacgcatt aatggactgg attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg    6960
ctgaagagat gctcgactgg gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg    7020
ctgtcggctt taacctctct ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac    7080
tgtacagcga agaggcagtc aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag  7140
agctgatagc gcgtgacaaa aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac  7200
cggatacccg tccgcaaggt gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta  7260
aactcgaccc gacgcgtccg atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg  7320
ataccatcag cgatctcttt gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc  7380
aaagcggcga tttggaaacg gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg  7440
agaaactgca tcagccgatt atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc  7500
actcaatgta caccgacatg tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc  7560
accgcgtctt tgatcgcgtc agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt  7620
ttgcgacctc gcaaggcata ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg  7680
accgcaaacc gaagtcggcg gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg  7740
gtgaaaaacc gcagcaggga ggcaaacaat gaatcaacaa ctctcctggc gcaccatcgt  7800
cggctacagc ctcgggaatt gctaccgagc tcgaatttcc ccgatcgttc aaacatttgg  7860
caataaagtt tcttaagatt gaatcctgtt gccggtcttg cgatgattat catataattt  7920
ctgttgaatt acgttaagca tgtaataatt aacatgtaat gcatgacgtt atttatgaga  7980
tgggttttta tgattagagt cccgcaatta tacatttaat acgcgataga aaacaaaata  8040
tagcgcgcaa actaggataa attatcgcgc gcggtgtcat ctatgttact agatcgggaa  8100
ttcgggcccg gccggccaga tcttgattgt cgtttcccgc cttcagttta aactatcagt  8160
gtttgacagg atatattggc gggtaaacct aagagaaaag agcgtttatt agaataatcg  8220
gatatttaaa agggcgtgaa aaggtttatc cgttcgtcca tttgtatgt              8269
<210>11
<211>7838
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码pRLM167的T-DNA区，所述pRLM167为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS和p-ZmUBI+I::c-PAT::t-OCS盒的pRLM175衍生的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(162)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(1144)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2192)..(3520)
<223>cds，编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]
<220>
<221>终止子
<222>(3558)..(4270)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>启动子
<222>(4318)..(6305)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(5300)..(6305)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(6335)..(6886)
<223>膦丝菌素乙酰转移酶的合成的基因/CDS，其赋予BASTA/PPT抗性
<220>
<221>终止子
<222>(7009)..(7619)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(7694)..(7838)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(7734)..(7757)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>11
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt   60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt  120
actgaattgg atccgcccgg gcggtaccaa gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg  180
gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca  240
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa  300
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc  360
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc  420
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct  480
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt  540
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac  600
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag  660
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct  720
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac  780
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc  840
tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat  900
ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc  960
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc 1020
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt 1080
cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc 1140
aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc 1200
cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt    1260
tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt    1320
ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc    1380
gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt    1440
ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt    1500
ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc    1560
tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat    1620
tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt    1680
gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg    1740
tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta    1800
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga    1860
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact    1920
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta    1980
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg    2040
gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc    2100
ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac    2160
ggatcctcat ctaagcgcaa agagacgtac tatggaaaac gctaaaatga actcgctcat    2220
cgcccagtat ccgttggtaa aggatctggt tgctcttaaa gaaaccacct ggtttaatcc    2280
tggcacgacc tcattggctg aaggtttacc ttatgttggc ctgaccgaac aggatgttca    2340
ggacgcccat gcgcgcttat cccgttttgc accctatctg gcaaaagcat ttcctgaaac    2400
tgctgccact ggggggatta ttgaatcaga actggttgcc attccagcta tgcaaaaacg    2460
gctggaaaaa gaatatcagc aaccgatcag cgggcaactg ttactgaaaa aagatagcca    2520
tttgcccatt tccggctcca taaaagcacg cggcgggatt tatgaagtcc tggcacacgc    2580
agaaaaactg gctctggaag cggggttgct gacgcttgat gatgactaca gcaaactgct    2640
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tctggggtta tcaatcggca ttatgagcgc ccgcattggc tttaaggtga cagttcatat    2760
gtctgctgat gcccgggcat ggaaaaaagc gaaactgcgc agccatggcg ttacggtcgt    2820
ggaatatgag caagattatg gtgttgccgt cgaggaagga cgtaaagcag cgcagtctga    2880
cccgaactgt ttctttattg atgacgaaaa ttcccgcacg ttgttccttg ggtattccgt    2940
cgctggccag cgtcttaaag cgcaatttgc ccagcaaggc cgtatcgtcg atgctgataa    3000
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ttgtatgttg ttaggcgtcc atacaggatt acacgatcag atttctgttc aggatattgg    3180
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gcgggcaatg gagcgtctgc tggatggctt ctataccctt agcgatcaaa ccatgtatga    3300
catgcttggc tggctggcgc aggaagaagg tattcgtctt gaaccttcgg cactggcggg    3360
tatggccgga cctcagcgcg tgtgtgcatc agtaagttac caacagatgc acggtttcag    3420
cgcagaacaa ctgcgtaata ccactcatct ggtgtgggcg acgggaggtg gaatggtgcc    3480
ggaagaagag atgaatcaat atctggcaaa aggccgttaa taacgtttca acgcagcatg    3540
gatcgtaccg agctcaatcg atcctgcttt aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca    3600
tgatatttgc tttcaattct gttgtgcacg ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag    3660
atccttaccg ccggtttcgg ttcattctaa tgaatatatc acccgttact atcgtatttt    3720
tatgaataat attctccgtt caatttactg attgtaccct actacttata tgtacaatat    3780
taaaatgaaa acaatatatt gtgctgaata ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc    3840
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tatacatata tttaaacttt actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc    4500
agtgttttag agaatcatat aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat    4560
tttgacaaca ggactctaca gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt    4620
gcaaatagct tcacctatat aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt    4680
agggttaatg gtttttatag actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc    4740
tctaaattaa gaaaactaaa actctatttt agttttttta tttaatagtt tagatataaa    4800
atagaataaa ataaagtgac taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact    4860
aaggaaacat ttttcttgtt tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag    4920
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ctctagatcg gcgttccggt ccatggttag ggcccggtag ttctacttct gttcatgttt    5400
gtgttagatc cgtgtttgtg ttagatccgt gctgctagcg ttcgtacacg gatgcgacct    5460
gtacgtcaga cacgttctga ttgctaactt gccagtgttt ctctttgggg aatcctggga    5520
tggctctagc cgttccgcag acgggatcga tttcatgatt ttttttgttt cgttgcatag    5580
ggtttggttt gcccttttcc tttatttcaa tatatgccgt gcacttgttt gtcgggtcat    5640
cttttcatgc ttttttttgt cttggttgtg atgatgtggt ctggttgggc ggtcgttcta    5700
gatcggagta gaattctgtt tcaaactacc tggtggattt attaattttg gatctgtatg    5760
tgtgtgccat acatattcat agttacgaat tgaagatgat ggatggaaat atcgatctag    5820
gataggtata catgttgatg cgggttttac tgatgcatat acagagatgc tttttgttcg    5880
cttggttgtg atgatgtggt gtggttgggc ggtcgttcat tcgttctaga tcggagtaga    5940
atactgtttc aaactacctg gtgtatttat taattttgga actgtatgtg tgtgtcatac    6000
atcttcatag ttacgagttt aagatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt    6060
tgatgtgggt tttactgatg catatacatg atggcatatg cagcatctat tcatatgctc    6120
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tacgctattt atttgcttgg tactgtttct tttgtcgatg ctcaccctgt tgtttggtgt    6300
tacttctgca gggtacggat cctctagagt cgacatgtct ccggagagga gaccagttga    6360
gattaggcca gctacagcag ccgatatggc cgcggtttgt gacatcgtta accattacat    6420
tgagacgtct acagtgaact ttaggacaga gccacaaaca ccacaagagt ggattgatga    6480
cctagagagg ttgcaagata gatacccttg gttggttgct gaggttgagg gtgttgtggc    6540
tggtattgct tacgctgggc cctggaaggc taggaacgct tacgattgga cagttgagag    6600
tactgtttac gtgtcacata ggcatcaaag gttgggccta ggatctacat tgtacacaca    6660
tttgcttaag tctatggagg cgcaaggttt taagtctgtg gttgctgtta taggccttcc    6720
aaacgatcca tctgttaggt tgcatgaggc tttgggatac acagcgcggg gtacattgcg    6780
cgcggctgga tacaagcatg gtggatggca tgatgttggt ttttggcaaa gggattttga    6840
gttgccagct cctccaaggc cagttaggcc agttacccag atctgagtcg acctgcagga    6900
gctcaatcga tcctgcttta atgagatatg cgagacgcct atgatcgcat gatatttgct    6960
ttcaattctg ttgtgcacgt tgtaaaaaac ctgagcatgt gtagctcaga tccttaccgc    7020
cggtttcggt tcattctaat gaatatatca cccgttacta tcgtattttt atgaataata    7080
ttctccgttc aatttactga ttgtacccta ctacttatat gtacaatatt aaaatgaaaa    7140
caatatattg tgctgaatag gtttatagcg acatctatga tagagcgcca caataacaaa    7200
caattgcgtt ttattattac aaatccaatt ttaaaaaaag cggcagaacc ggtcaaacct  7260
aaaagactga ttacataaat cttattcaaa tttcaaaagt gccccagggg ctagtatcta  7320
cgacacaccg agcggcgaac taataacgct cactgaaggg aactccggtt ccccgccggc  7380
gcgcatgggt gagattcctt gaagttgagt attggccgtc cgctctaccg aaagttacgg  7440
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tgcagcattt ttttggtgta tgtgggcccc aaatgaagtg caggtcaaac cttgacagtg  7560
acgacaaatc gttgggcggg tccagggcga attttgcgac aacatgtcga ggctcagcag  7620
gatgggccca ggtacagaat tcgcggccgc ttaattaatc tagaggcgcg ccgggcccgg  7680
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tatattggcg ggtaaaccta agagaaaaga gcgtttatta gaataatcgg atatttaaaa  7800
gggcgtgaaa aggtttatcc gttcgtccat ttgtatgt                          7838
<210>12
<211>8479
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码pRLM179的T-DNA区，所述pRLM179为含有ZmAHASL2/Xi12和p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS盒的pRLM175衍生的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(187)..(986)
<223>玉米乙酰羟酸合酶基因(AHAS108)的AHASL2[XI12]5’/UTR启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(987)..(2903)
<223>玉米乙酰羟酸合酶基因(AHAS108)的AHASL2[XI12]cds，其赋予对IMI除草剂的抗性
<220>
<221>突变
<222>(2847)..(2849)
<223>在玉米乙酰羟酸合酶基因(AHAS108)的AHASL2[XI12]中的S621N突变，其赋予对IMI除草剂的抗性
<220>
<221>终止子
<222>(2902)..(4112)
<223>玉米乙酰羟酸合酶基因(AHAS108)的AHASL2[XI 12]3’/UTR
<220>
<221>启动子
<222>(4152)..(6139)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(5134)..(6139)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(6182)..(7510)
<223>cds，编码大肠杆菌D-丝氨酸脱水酶[dsdA]
<220>
<221>终止子
<222>(7552)..(8260)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(8335)..(8479)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(8375)..(8398)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>12
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt     60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt    120
actgaattgg atccgcccgg gcggtacccg gggatcctct agaactagtg gatcccccgg     180
gctgcaggtc aacggatcac ctatcaacat cccagctaaa aacagtaaaa agggggaaaa     240
cgtgggtgag ttgagtctgt cttgtggaaa aaacgtttta gtttctcctg gaattaacaa     300
taaaaacagt tgaacaagat tgactgttcc tccgggaggg tttggaacat cgttacagat     360
gtgagcgaaa ggtgaggaaa cagagcggag ggcttggagg tgacctcggt agtcgacgcc     420
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ctgaagctgt cgccgccgct gctcatcttg tgggctgtgc ccggtgtccc tgttgcggat     540
tgcgggtggc agcctggcag gtgggtgcga cccgtttgga ctccctgatc tgggcccttt     600
gtgtcagtac cgtctgtact ccgatgacat gcacaccgtc gtccacagtc aagtccacaa     660
tctcccctct ttttttaacg gaatagttca aaatctcctt gacgcacgct atcgtgtacc     720
agcgctcact ggacaccacg tttgtaatcc acgccgacac gtcggtccca cgtcgacagg     780
ccccaccgtc cggtctgtag cgtgtacgta ttcgggcgac ggacgtgtcg tcgtcgtctt     840
gcgagtccca ttcccatcac catctgagcc acacatcctc tgaacaaaag cagggaggcc     900
tctacgcaca tccccctttc tcccactccg tgtccgtggc acccacccca aaccctcgcg     960
ccgcctccga gacagccgcc gcaaccatgg ccaccgccgc cgccgcgtct accgcgctca    1020
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tcgagtccct cgagcgctgc ggcgtccgcg acgtcttcgc ctaccccggc ggcgcgtcca    1260
tggagatcca ccaggcactc acccgctccc ccgtcatcgc caaccacctc ttccgccacg    1320
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gcatcgccac ctccggcccc ggcgccacca accttgtctc cgcgctcgcc gacgcgctgc    1440
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acgccttcca ggagacgccc atcgtcgagg tcacccgctc catcaccaag cacaactacc    1560
tggtcctcga cgtcgacgac atcccccgcg tcgtgcagga ggctttcttc ctcgcctcct    1620
ctggtcgacc ggggccggtg cttgtcgaca tccccaagga catccagcag cagatggcgg    1680
tgcctgtctg ggacaagccc atgagtctgc ctgggtacat tgcgcgcctt cccaagcccc    1740
ctgcgactga gttgcttgag caggtgctgc gtcttgttgg tgaatcccgg cgccctgttc    1800
tttatgttgg cggtggctgc gcagcatctg gtgaggagtt gcgacgcttt gtggagctga    1860
ctggaatccc ggtcacaact actcttatgg gcctcggcaa cttccccagc gacgacccac    1920
tgtctctgcg catgctaggt atgcatggca cggtgtatgc aaattatgca gtggataagg    1980
ccgatctgtt gcttgcactt ggtgtgcggt ttgatgatcg tgtgacaggg aagattgagg    2040
cttttgcaag cagggctaag attgtgcacg ttgatattga tccggctgag attggcaaga    2100
acaagcagcc acatgtgtcc atctgtgcag atgttaagct tgctttgcag ggcatgaatg    2160
ctcttcttga aggaagcaca tcaaagaaga gctttgactt tggctcatgg aacgatgagt    2220
tggatcagca gaagagggaa ttcccccttg ggtataaaac atctaatgag gagatccagc    2280
cacaatatgc tattcaggtt cttgatgagc tgacgaaagg cgaggccatc atcggcacag    2340
gtgttgggca gcaccagatg tgggcggcac agtactacac ttacaagcgg ccaaggcagt    2400
ggttgtcttc agctggtctt ggggctatgg gatttggttt gccggctgct gctggtgctt    2460
ctgtggccaa cccaggtgtt actgttgttg acatcgatgg agatggtagc tttctcatga    2520
acgttcagga gctagctatg atccgaattg agaacctccc ggtgaaggtc tttgtgctaa    2580
acaaccagca cctggggatg gtggtgcagt gggaggacag gttctataag gccaacagag    2640
cgcacacata cttgggaaac ccagagaatg aaagtgagat atatccagat ttcgtgacga    2700
tcgccaaagg gttcaacatt ccagcggtcc gtgtgacaaa gaagaacgaa gtccgcgcag    2760
cgataaagaa gatgctcgag actccagggc cgtacctctt ggatataatc gtcccacacc    2820
aggagcatgt gttgcctatg atccctaatg gtggggcttt caaggatatg atcctggatg    2880
gtgatggcag gactgtgtac tgatctaaaa tccagcaagc aactgatcta aaatccagca    2940
agcaccgcct ccctgctagt acaagggtga tatgttttta tctgtgtgat gttctcctgt    3000
attctatctt tttttgtagg ccgtcagcta tctgttatgg taatcctatg tagcttccga    3060
ccttgtaatt gtgtagtctg ttgttttcct tctggcatgt gtcataagag atcatttaag    3120
tgccttttgc tacatataaa taagataata agcactgcta tgcagtggtt ctgaattggc    3180
ttctgttgcc aaatttaagt gtccaactgg tccttgcttt tgttttcgct atttttttcc    3240
ttttttagtt attattatat tggtaatttc aactcaacat atgatgtatg gaataatgct    3300
agggctgcaa tttcaaacta ttttacaaac cagaatggca ttttcgtggt ttgaggggag    3360
tgaaaaaaaa tgaggcattt gactgaatta gttacctgat ccattttcgt ggtttggatc    3420
attggaatta aattccattc taataatagt aattttggca tatatcaatt aagttaattc    3480
ggttttatgc aaaatatatt tgtatactat tattatcaag atgtcggaga tatttatatg    3540
ctacattttt actatacagg agtgagatga agagtgtcat gtaagttaca cagtagaaac    3600
aaattctatt aatgcataaa atcatttcca tcatccaccc tatgaatttg agatagacct    3660
atatctaaac tttgaaaagt ggttgaatat caaattccaa attaaataag ttattttatt    3720
gagtgaattc taatttctct aaaacgaagg gatctaaacg ccctctaaag ctaatttgga    3780
aactcaaact ttcttagcat tggaggggat tgagaaaaaa tattaattca ttttcatctc    3840
aatcattcaa tctccaaaga gatttgagtt ccttattagt ctgttccatg catcaaatcg    3900
gctcaatgtg tcattatttg ccatgacgat tgacgagttg ttctggggcc tagcgctttc    3960
cacgccgatg tgctggggcc tggtcctgga gaagacagct tgatatttaa agctatcaat    4020
tgtttcaatt gattcccact tcatttttct aaatgtagaa aacggtgacg tataagaaaa    4080
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tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc    4260
agtttatcta tctttataca tatatttaaa ctttactcta cgaataatat aatctatagt    4320
actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc atataaatga acagttagac atggtctaaa    4380
ggacaattga gtattttgac aacaggactc tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt    4440
tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct atataatact tcatccattt tattagtaca    4500
tccatttagg gtttagggtt aatggttttt atagactaat ttttttagta catctatttt    4560
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agtttagata taaaatagaa taaaataaag tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag    4680
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cccctctcta ccttctctag atcggcgttc cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac    5220
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cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt    5340
ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc gcagacggga tcgatttcat gatttttttt    5400
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gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat    5580
tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg    5640
aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag    5700
atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc    5760
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tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg    5880
ataggtatac atgttgatgt gggttttact gatgcatata catgatggca tatgcagcat    5940
ctattcatat gctctaacct tgagtaccta tctattataa taaacaagta tgttttataa    6000
ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg gcatatgcag cagctatatg tggatttttt    6060
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tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt caatttactg  7740
attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt gtgctgaata  7800
ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt tttattatta  7860
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cgttcgtcca tttgtatgt                                               8479
<210>13
<211>8017
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码pRLM205的T-DNA区，所述pRLM205为含有p-ZmUBI+I::c-dao1::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(162)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(1144)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2192)..(3298)
<223>cds，编码红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶(dao1)
<220>
<221>终止子
<222>(3227)..(4035)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>启动子
<222>(4094)..(5491)
<223>甘蔗杆状病毒[ScBV]启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(5523)..(7520)
<223>gusINT cds和内含子
<220>
<221>内含子
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<223>gusINT的PIV2内含子，为经修饰的马铃薯ST-LS1内含子
<220>
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<223>来自根癌农杆菌T-DNA的胭脂碱合酶的3’UTR用作终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(7873)..(8017)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
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<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>13
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt      60
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gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca     240
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa     300
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc     360
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc     420
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct     480
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt     540
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac     600
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag     660
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct     720
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac     780
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc     840
tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat     900
ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc     960
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc    1020
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt    1080
cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc    1140
aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc    1200
cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt    1260
tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt    1320
ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc    1380
gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt    1440
ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt    1500
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tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat    1620
tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt    1680
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tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta    1800
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga    1860
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact    1920
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta    1980
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg    2040
gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc    2100
ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac    2160
ggatccggcg cgccactagt cccgggccac catgcactcg cagaagcgcg tcgttgtcct    2220
cggatcaggc gttatcggtc tgagcagcgc cctcatcctc gctcggaagg gctacagcgt    2280
gcatattctc gcgcgcgact tgccggagga cgtctcgagc cagactttcg cttcaccatg    2340
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caaggggacg aggcggttcg cgcagaacga agacggcttg ctcgggcact ggtacaagga    2520
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gcagaagctc ggcgcgacgt ttgagagacg gaccgttacg tcgcttgagc aggcgttcga    2700
cggtgcggat ttggtggtca acgctacggg acttggcgcc aagtcgattg cgggcatcga    2760
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cgaagtcatc tgcggcggga cgtacggcgt gggagactgg gacttgtctg tcaacccaga    2940
gacggtccag cggatcctca agcactgctt gcgcctcgac ccgaccatct cgagcgacgg    3000
aacgatcgaa ggcatcgagg tcctccgcca caacgtcggc ttgcgacctg cacgacgagg    3060
cggaccccgc gttgaggcag aacggatcgt cctgcctctc gaccggacaa agtcgcccct    3120
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gctcgtcgac gaggcgttcc agcggtacca cggcgcggcg cgggagtcga agttgtaggg    3300
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atttttatga ataatattct ccgttcaatt tactgattgt accctactac ttatatgtac    3540
aatattaaaa tgaaaacaat atattgtgct gaataggttt atagcgacat ctatgataga    3600
gcgccacaat aacaaacaat tgcgttttat tattacaaat ccaattttaa aaaaagcggc    3660
agaaccggtc aaacctaaaa gactgattac ataaatctta ttcaaatttc aaaagtgccc    3720
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tgtcgaggct cagcaggatg ggcccaggta cagaattcgc ggccgcttaa ttaaggtacc    4080
caattgcata tgtaatcctg gctagcaaca ctgaactatg ccagaaacca catcaaagat    4140
atgggcaagc ttcttggccc attatatcca aagacctcag agaaaggtga gcgaaggctc    4200
aattcagaag attggaagct gatcaatagg atcaagacaa tggtgagaac gcttccaaat    4260
ctcactattc caccagaaga tgcatacatt atcattgaaa cagatgcatg tgcaactgga    4320
tggggagcag tatgcaagtg gaagaaaaac aaggcagacc caagaaatac agagcaaatc    4380
tgtaggtatg ccagtggaaa atttgataag ccaaaaggaa cctgtgatgc agaaatctat    4440
ggggttatga atggcttaga aaagatgaga ttgttctact tggacaaaag agagatcaca    4500
gtcagaactg acagtagtgc aatcgaaagg ttctacaaca agagtgctga acacaagcct    4560
tctgagatca gatggatcag gttcatggac tacatcactg gtgcaggacc agagatagtc    4620
attgaacaca taaaagggaa gagcaatggt ttagctgaca tcttgtccag gctcaaagcc    4680
aaattagctc agaatgaacc aacggaagag atgatcctgc ttacacaagc cataagggaa    4740
gtaattcctt atccagatca tccatacact gagcaactca gagaatgggg aaacaaaatt    4800
ctggatccat tccccacatt caagaaggac atgttcgaaa gaacagagca agcttttatg    4860
ctaacagagg aaccagttct actctgtgca tgcaggaagc ctgcaattca gttagtgtcc    4920
agaacatctg ccaacccagg aaggaaattc ttcaagtgcg caatgaacaa atgccattgc    4980
tggtactggg cagatctcat tgaagaacac attcaagaca gaattgatga atttctcaag    5040
aatcttgaag ttctgaagac cggtggcgtg caaacaatgg aggaggaact tatgaaggaa    5100
gtcaccaagc tgaagataga agagcaggag ttcgaggaat accaggccac accaagggct    5160
atgtcgccag tagccgcaga agatgtgcta gatctccaag acgtaagcaa tgacgattga    5220
ggaggcattg acgtcaggga tgaccgcagc ggagagtact gggcccattc agtggatgct    5280
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gcagtgcgtg tgtgacacca ccccccttcc gacgctctgc ctatataagg caccgtctgt    5460
aagctcttac gatcatcggt agttcaccaa gggggtacga tctccgggta ggtcagtccc    5520
ttatgttacg tcctgtagaa accccaaccc gtgaaatcaa aaaactcgac ggcctgtggg    5580
cattcagtct ggatcgcgaa aactgtggaa ttgatcagcg ttggtgggaa agcgcgttac    5640
aagaaagccg ggcaattgct gtgccaggca gttttaacga tcagttcgcc gatgcagata    5700
ttcgtaatta tgcgggcaac gtctggtatc agcgcgaagt ctttataccg aaaggttggg    5760
caggccagcg tatcgtgctg cgtttcgatg cggtcactca ttacggcaaa gtgtgggtca    5820
ataatcagga agtgatggag catcagggcg gctatacgcc atttgaagcc gatgtcacgc    5880
cgtatgttat tgccgggaaa agtgtacgta agtttctgct tctacctttg atatatatat    5940
aataattatc attaattagt agtaatataa tatttcaaat atttttttca aaataaaaga    6000
atgtagtata tagcaattgc ttttctgtag tttataagtg tgtatatttt aatttataac    6060
ttttctaata tatgaccaaa atttgttgat gtgcaggtat caccgtttgt gtgaacaacg    6120
aactgaactg gcagactatc ccgccgggaa tggtgattac cgacgaaaac ggcaagaaaa    6180
agcagtctta cttccatgat ttctttaact atgccggaat ccatcgcagc gtaatgctct    6240
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agtcggcggc ttttctgctg caaaaacgct ggactggcat gaacttcggt gaaaaaccgc    7500
agcagggagg caaacaatga atcaacaact ctcctggcgc accatcgtcg gctacagcct  7560
cgggaattgc taccgagctc gaatttcccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc  7620
ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac  7680
gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg  7740
attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac  7800
taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcgggaatt cgggcccggc  7860
cggccagatc ttgattgtcg tttcccgcct tcagtttaaa ctatcagtgt ttgacaggat  7920
atattggcgg gtaaacctaa gagaaaagag cgtttattag aataatcgga tatttaaaag  7980
ggcgtgaaaa ggtttatccg ttcgtccatt tgtatgt                           8017
<210>14
<211>8102
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>核酸序列，编码pRLM226的T-DNA区，所述pRLM226为含有p-ZmUBI+I::l-PsFed1::c-dao1/ko::t-OCS和p-ScBV::c-gusINT::t-NOS盒的自pRLM175衍生的双元载体
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(162)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白启动子和第一内含子
<220>
<221>内含子
<222>(1144)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白基因第一内含子
<220>
<221>misc_feature
<222>(2167)..(2256)
<223>豌豆Fed1基因的前导片段
<220>
<221>misc_feature
<222>(2280)..(3386)
<223>cds，编码玉米密码子优化的红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶(dao1/ko)
<220>
<221>终止子
<222>(3409)..(4117)
<223>章鱼碱合酶终止子
<220>
<221>启动子
<222>(4176)..(5573)
<223>甘蔗杆状病毒[ScBV]启动子
<220>
<221>misc_feature
<222>(5605)..(7605)
<223>gusINT cds和内含子
<220>
<221>内含子
<222>(5990)..(6178)
<223>gusINT的PIV2内含子，为经修饰的马铃薯ST-LS1内含子
<220>
<221>终止子
<222>(7676)..(7928)
<223>来自根癌农杆菌T-DNA的胭脂碱合酶的3’UTR用作终止子
<220>
<221>misc_feature
<222>(7958)..(8102)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_feature
<222>(7998)..(8021)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>14
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt     60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt    120
actgaattgg atccgcccgg gcggtaccaa gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg     180
gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca     240
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa     300
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc     360
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc     420
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct     480
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt     540
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac     600
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag     660
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct     720
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac     780
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc     840
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ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc     960
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc    1020
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt    1080
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tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt    1680
gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg    1740
tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta    1800
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga    1860
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact    1920
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta    1980
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg    2040
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ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac    2160
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aggaaaaaga agtcacactg gtacatgcat atggttttag tagtgccgga tatcagcaat    3300
catggggtgc tgcagaagat gttgctcagt tggtggacga ggcattccaa agataccacg    3360
gtgcagcgag agagtcaaaa ctttagtgac ctgcaggagc tcaatcgatc ctgctttaat    3420
gagatatgcg agacgcctat gatcgcatga tatttgcttt caattctgtt gtgcacgttg    3480
taaaaaacct gagcatgtgt agctcagatc cttaccgccg gtttcggttc attctaatga    3540
atatatcacc cgttactatc gtatttttat gaataatatt ctccgttcaa tttactgatt    3600
gtaccctact acttatatgt acaatattaa aatgaaaaca atatattgtg ctgaataggt    3660
ttatagcgac atctatgata gagcgccaca ataacaaaca attgcgtttt attattacaa    3720
atccaatttt aaaaaaagcg gcagaaccgg tcaaacctaa aagactgatt acataaatct    3780
tattcaaatt tcaaaagtgc cccaggggct agtatctacg acacaccgag cggcgaacta    3840
ataacgctca ctgaagggaa ctccggttcc ccgccggcgc gcatgggtga gattccttga    3900
agttgagtat tggccgtccg ctctaccgaa agttacgggc accattcaac ccggtccagc    3960
acggcggccg ggtaaccgac ttgctgcccc gagaattatg cagcattttt ttggtgtatg    4020
tgggccccaa atgaagtgca ggtcaaacct tgacagtgac gacaaatcgt tgggcgggtc    4080
cagggcgaat tttgcgacaa catgtcgagg ctcagcagga tgggcccagg tacagaattc    4140
gcggccgctt aattaaggta cccaattgca tatgtaatcc tggctagcaa cactgaacta    4200
tgccagaaac cacatcaaag atatgggcaa gcttcttggc ccattatatc caaagacctc    4260
agagaaaggt gagcgaaggc tcaattcaga agattggaag ctgatcaata ggatcaagac    4320
aatggtgaga acgcttccaa atctcactat tccaccagaa gatgcataca ttatcattga    4380
aacagatgca tgtgcaactg gatggggagc agtatgcaag tggaagaaaa acaaggcaga    4440
cccaagaaat acagagcaaa tctgtaggta tgccagtgga aaatttgata agccaaaagg    4500
aacctgtgat gcagaaatct atggggttat gaatggctta gaaaagatga gattgttcta    4560
cttggacaaa agagagatca cagtcagaac tgacagtagt gcaatcgaaa ggttctacaa    4620
caagagtgct gaacacaagc cttctgagat cagatggatc aggttcatgg actacatcac    4680
tggtgcagga ccagagatag tcattgaaca cataaaaggg aagagcaatg gtttagctga    4740
catcttgtcc aggctcaaag ccaaattagc tcagaatgaa ccaacggaag agatgatcct    4800
gcttacacaa gccataaggg aagtaattcc ttatccagat catccataca ctgagcaact    4860
cagagaatgg ggaaacaaaa ttctggatcc attccccaca ttcaagaagg acatgttcga    4920
aagaacagag caagctttta tgctaacaga ggaaccagtt ctactctgtg catgcaggaa    4980
gcctgcaatt cagttagtgt ccagaacatc tgccaaccca ggaaggaaat tcttcaagtg    5040
cgcaatgaac aaatgccatt gctggtactg ggcagatctc attgaagaac acattcaaga    5100
cagaattgat gaatttctca agaatcttga agttctgaag accggtggcg tgcaaacaat    5160
ggaggaggaa cttatgaagg aagtcaccaa gctgaagata gaagagcagg agttcgagga    5220
ataccaggcc acaccaaggg ctatgtcgcc agtagccgca gaagatgtgc tagatctcca    5280
agacgtaagc aatgacgatt gaggaggcat tgacgtcagg gatgaccgca gcggagagta    5340
ctgggcccat tcagtggatg ctccactgag ttgtattatt gtgtgctttt cggacaagtg    5400
tgctgtccac tttcttttgg cacctgtgcc actttattcc ttgtctgcca cgatgccttt    5460
gcttagcttg taagcaagga tcgcagtgcg tgtgtgacac cacccccctt ccgacgctct    5520
gcctatataa ggcaccgtct gtaagctctt acgatcatcg gtagttcacc aagggggtac    5580
gatctccggg taggtcagtc ccttatgtta cgtcctgtag aaaccccaac ccgtgaaatc    5640
aaaaaactcg acggcctgtg ggcattcagt ctggatcgcg aaaactgtgg aattggtcag    5700
cgttggtggg aaagcgcgtt acaagaaagc cgggcaattg ctgtgccagg cagttttaac    5760
gatcagttcg ccgatgcaga tattcgtaat tatgcgggca acgtctggta tcagcgcgaa    5820
gtctttatac cgaaaggttg ggcaggccag cgtatcgtgc tgcgtttcga tgcggtcact    5880
cattacggca aagtgtgggt caataatcag gaagtgatgg agcatcaggg cggctatacg    5940
ccatttgaag ccgatgtcac gccgtatgtt attgccggga aaagtgtacg taagtttctg    6000
cttctacctt tgatatatat ataataatta tcattaatta gtagtaatat aatatttcaa    6060
atattttttt caaaataaaa gaatgtagta tatagcaatt gcttttctgt agtttataag    6120
tgtgtatatt ttaatttata acttttctaa tatatgacca aaatttgttg atgtgcaggt    6180
atcaccgttt gtgtgaacaa cgaactgaac tggcagacta tcccgccggg aatggtgatt    6240
accgacgaaa acggcaagaa aaagcagtct tacttccatg atttctttaa ctatgccgga    6300
atccatcgca gcgtaatgct ctacaccacg ccgaacacct gggtggacga tatcaccgtg    6360
gtgacgcatg tcgcgcaaga ctgtaaccac gcgtctgttg actggcaggt ggtggccaat    6420
ggtgatgtca gcgttgaact gcgtgatgcg gatcaacagg tggttgcaac tggacaaggc    6480
actagcggga ctttgcaagt ggtgaatccg cacctctggc aaccgggtga aggttatctc    6540
tatgaactgt gcgtcacagc caaaagccag acagagtgtg atatctaccc gcttcgcgtc    6600
ggcatccggt cagtggcagt gaagggcgaa cagttcctga ttaaccacaa accgttctac    6660
tttactggct ttggtcgtca tgaagatgcg gacttgcgtg gcaaaggatt cgataacgtg    6720
ctgatggtgc acgaccacgc attaatggac tggattgggg ccaactccta ccgtacctcg    6780
cattaccctt acgctgaaga gatgctcgac tgggcagatg aacatggcat cgtggtgatt    6840
gatgaaactg ctgctgtcgg ctttaacctc tctttaggca ttggtttcga agcgggcaac    6900
aagccgaaag aactgtacag cgaagaggca gtcaacgggg aaactcagca agcgcactta    6960
caggcgatta aagagctgat agcgcgtgac aaaaaccacc caagcgtggt gatgtggagt    7020
attgccaacg aaccggatac ccgtccgcaa ggtgcacggg aatatttcgc gccactggcg    7080
gaagcaacgc gtaaactcga cccgacgcgt ccgatcacct gcgtcaatgt aatgttctgc    7140
gacgctcaca ccgataccat cagcgatctc tttgatgtgc tgtgcctgaa ccgttattac    7200
ggatggtatg tccaaagcgg cgatttggaa acggcagaga aggtactgga aaaagaactt    7260
ctggcctggc aggagaaact gcatcagccg attatcatca ccgaatacgg cgtggatacg    7320
ttagccgggc tgcactcaat gtacaccgac atgtggagtg aagagtatca gtgtgcatgg    7380
ctggatatgt atcaccgcgt ctttgatcgc gtcagcgccg tcgtcggtga acaggtatgg    7440
aatttcgccg attttgcgac ctcgcaaggc atattgcgcg ttggcggtaa caagaaaggg    7500
atcttcactc gcgaccgcaa accgaagtcg gcggcttttc tgctgcaaaa acgctggact    7560
ggcatgaact tcggtgaaaa accgcagcag ggaggcaaac aatgaatcaa caactctcct    7620
ggcgcaccat cgtcggctac agcctcggga attgctaccg agctcgaatt tccccgatcg  7680
ttcaaacatt tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat  7740
tatcatataa tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac  7800
gttatttatg agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat  7860
agaaaacaaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt  7920
actagatcgg gaattcgggc ccggccggcc agatcttgat tgtcgtttcc cgccttcagt  7980
ttaaactatc agtgtttgac aggatatatt ggcgggtaaa cctaagagaa aagagcgttt  8040
attagaataa tcggatattt aaaagggcgt gaaaaggttt atccgttcgt ccatttgtat  8100
gt                                                                 8102
<210>15
<211>1107
<212>DNA
<213>红冬孢酵母
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1107)
<223>玉米密码子优化的红冬孢酵母D-氨基酸氧化酶CDS
<400>15
atg cac tct caa aaa cgc gtt gta gta ttg ggt tcg gga gtc ata ggt    48
Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
ctt tct tct gct ctt ata ctt gca cgc aag ggc tat tct gtt cat att    96
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
            20                  25                  30
ttg gca cgc gat ctc cca gag gac gta tct agc caa act ttc gct tcc    144
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
        35                  40                  45
ccc tgg gct ggt gcg aat tgg aca cca ttt atg aca ttg act gac ggc    192
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
    50                  55                  60
cct aga cag gca aaa tgg gaa gag agt acc ttt aaa aaa tgg gtt gag    240
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65                  70                  75                  80
ttg gtc cct acc gga cat gct atg tgg ctg aag gga act cgt cgc ttt    288
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
                85                  90                  95
gca cag aat gaa gac ggc ttg ctt gga cat tgg tac aaa gat ata acc    336
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
            100                 105                 110
ccg aat tac cgc ccc ctt ccc tcg tct gaa tgt cca cca ggc gca att    384
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
        115                 120                 125
ggc gtg act tat gac aca ctc tct gta cac gct cct aaa tat tgt cag    432
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
    130                 135                 140
tat ctt gcc aga gaa ctt cag aaa ctc ggt gca act ttt gaa aga cgg    480
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145                 150                 155                 160
acg gtt acc tca ctg gaa cag gca ttc gac ggt gca gac ctc gtg gtg    528
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
                165                 170                 175
aat gca aca gga ctg gga gca aag agc ata gca ggc ata gat gat caa    576
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
            180                 185                 190
gct gcg gag cca att aga ggc cag acc gtg ctg gta aaa tca cca tgc    624
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
        195                 200                 205
aaa aga tgt acg atg gat agt agt gac cca gcg agt cca gct tat att    672
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
    210                 215                 220
ata ccg aga ccg ggt ggc gaa gtt ata tgc gga gga act tac gga gtg    720
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225                 230                 235                 240
ggt gat tgg gat ctt agc gtt aac ccc gaa aca gtc caa cgg att ctg    768
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
                245                 250                 255
aag cat tgc ctc cgc ctt gac cca acc ata tca tct gac gga acc att    816
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
            260                 265                 270
gag gga atc gaa gta ctt agg cat aat gtt ggt ctt agg ccc gct cgt    864
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
        275                 280                 285
aga gga gga cca cgt gta gaa gct gag aga att gta ttg ccc ctc gat    912
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg lle Val Leu Pro Leu Asp
    290                 295                 300
aga acc aaa agc ccc ctt tcg ctt gga aga gga agc gca cgt gca gct    960
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
aag gaa aaa gaa gtc aca ctg gta cat gca tat ggt ttt agt agt gcc    1008
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
                325                 330                 335
gga tat cag caa tca tgg ggt gct gca gaa gat gtt gct cag ttg gtg    1056
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
            340                 345                 350
gac gag gca ttc caa aga tac cac ggt gca gcg aga gag tca aaa ctt    1104
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr His Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
        355                 360                 365
tag                                                               1107
<210>16
<211>368
<212>PRT
<213>红冬孢酵母
<400>16
Met His Ser Gln Lys Arg Val Val Val Leu Gly Ser Gly Val Ile Gly
1               5                   10                  15
Leu Ser Ser Ala Leu Ile Leu Ala Arg Lys Gly Tyr Ser Val His Ile
            20                  25                  30
Leu Ala Arg Asp Leu Pro Glu Asp Val Ser Ser Gln Thr Phe Ala Ser
        35                  40                  45
Pro Trp Ala Gly Ala Asn Trp Thr Pro Phe Met Thr Leu Thr Asp Gly
    50                  55                  60
Pro Arg Gln Ala Lys Trp Glu Glu Ser Thr Phe Lys Lys Trp Val Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Pro Thr Gly His Ala Met Trp Leu Lys Gly Thr Arg Arg Phe
                85                  90                  95
Ala Gln Asn Glu Asp Gly Leu Leu Gly His Trp Tyr Lys Asp Ile Thr
            100                 105                 110
Pro Asn Tyr Arg Pro Leu Pro Ser Ser Glu Cys Pro Pro Gly Ala Ile
        115                 120                 125
Gly Val Thr Tyr Asp Thr Leu Ser Val His Ala Pro Lys Tyr Cys Gln
    130                 135                 140
Tyr Leu Ala Arg Glu Leu Gln Lys Leu Gly Ala Thr Phe Glu Arg Arg
145                 150                 155                 160
Thr Val Thr Ser Leu Glu Gln Ala Phe Asp Gly Ala Asp Leu Val Val
                165                 170                 175
Asn Ala Thr Gly Leu Gly Ala Lys Ser Ile Ala Gly Ile Asp Asp Gln
            180                 185                 190
Ala Ala Glu Pro Ile Arg Gly Gln Thr Val Leu Val Lys Ser Pro Cys
        195                 200                 205
Lys Arg Cys Thr Met Asp Ser Ser Asp Pro Ala Ser Pro Ala Tyr Ile
    210                 215                 220
Ile Pro Arg Pro Gly Gly Glu Val Ile Cys Gly Gly Thr Tyr Gly Val
225                 230                 235                 240
Gly Asp Trp Asp Leu Ser Val Asn Pro Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu
                245                 250                 255
Lys His Cys Leu Arg Leu Asp Pro Thr Ile Ser Ser Asp Gly Thr Ile
            260                 265                 270
Glu Gly Ile Glu Val Leu Arg His Asn Val Gly Leu Arg Pro Ala Arg
        275                 280                 285
Arg Gly Gly Pro Arg Val Glu Ala Glu Arg Ile Val Leu Pro Leu Asp
    290                 295                 300
Arg Thr Lys Ser Pro Leu Ser Leu Gly Arg Gly Ser Ala Arg Ala Ala
305                 310                 315                 320
Lys Glu Lys Glu Val Thr Leu Val His Ala Tyr Gly Phe Ser Ser Ala
                325                 330                 335
Gly Tyr Gln Gln Ser Trp Gly Ala Ala Glu Asp Val Ala Gln Leu Val
            340                 345                 350
Asp Glu Ala Phe Gln Arg Tyr Hi s Gly Ala Ala Arg Glu Ser Lys Leu
        355                 360                 365
<210>17
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物GUSCommon-341F的核酸序列
<400>17
ccgggtgaag gttatctcta tga                                      23
<210>18
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物GUSCommon-414R的核酸序列
<400>18
cgaagcgggt agatatcaca ctct                                     24
<210>19
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR探针GUSCommon-366FAM的核酸序列
<400>19
tgtgcgtcac agccaaaagc caga                            24
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物EcdsdA-860F的核酸序列
<400>20
tcgcattcgg gcttaaactg                                 20
<210>21
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物EcdsdA-922R的核酸序列
<400>21
gcgttggttc ggcaaaaa                                   18
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR探针EcdsdA-883FAM的核酸序列
<400>22
tttggcgatc atgttcactg c                               21
<210>23
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物TaGBSS：1-F的核酸序列
<400>23
ttctgcatcc acaacatctc gta                            23
<210>24
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物TaGBSS：1-R的核酸序列
<400>24
tagccgtcga tgaagtcgaa                                20
<210>25
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR探针TaGBSS：1-TET的核酸序列
<400>25
cgacgacttc gcgcagctca ac                             22
<210>26
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物dao1/pa-285F的核酸序列
<400>26
gttcgcgcag aacgaagac                                 19
<210>27
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR引物dao1/pa-349R的核酸序列
<400>27
ggcggtaatt tggcgtga                        18
<210>28
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码qPCR探针dao1/pa-308FAM的核酸序列
<400>28
tccttgtacc agtgcccgag ca                    22
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码gusINT基因正向PCR引物的核酸序列
<400>29
accgtttgtg tgaacaacga                       20
<210>30
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码gusINT基因反向PCR引物的核酸序列
<400>30
ggcacagcac atcaaagaga                       20
<210>31
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dsdA基因正向PCR引物的核酸序列
<400>31
gctttttgtt cgcttggttg tg                22
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dsdA基因反向PCR引物的核酸序列
<400>32
tcaataatcc ccccagtggc                   20
<210>33
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dao1基因正向PCR引物的核酸序列
<400>33
gacaagcaaa atgggaagaa tc                22
<210>34
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dao1基因反向PCR引物的核酸序列
<400>34
tcggggaatg atgtaggc                     18
<210>35
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dao1/ko基因正向PCR引物的核酸序列
<400>35
aagcaggcct tctcacactt ga            22
<210>36
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码dao1/ko基因反向PCR引物的核酸序列
<400>36
ttccaacaaa gcccgatgcg               20
<210>37
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码PAT基因正向PCR引物的核酸序列
<400>37
atgtctccgg agaggagacc agttgagat     29
<210>38
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>编码PAT基因反向PCR引物的核酸序列
<400>38
gccaaaaacc aacatcatgc catcca        26
<210>39
<211>4503
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>来自PRLM151的T-DNA区，所述PRLM151为含有p-ZmUBI+I::c-dsdA::t-OCS选择盒的RLM175型双元载体
<220>
<221>misc_structure
<222>(1)..(128)
<223>来自pSB11的左T-DNA边界
<220>
<221>misc_binding
<222>(47)..(71)
<223>来自pSB11左T-DNA边界重复
<220>
<221>启动子
<222>(162)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白启动子区和内含子
<220>
<221>内含子
<222>(1144)..(2149)
<223>玉米遍在蛋白内含子MubG1
<220>
<221>CDS
<222>(2192)..(3520)
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶[dsdA]CDS
<220>
<221>终止子
<222>(3562)..(4270)
<223>根癌农杆菌章鱼碱合酶终止子区
<220>
<221>misc_structure
<222>(4359)..(4503)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界
<220>
<221>misc_binding
<222>(4399)..(4422)
<223>来自pSB11的右T-DNA边界重复
<400>39
gtgattttgt gccgagctgc cggtcgggga gctgttggct ggctggtggc aggatatatt     60
gtggtgtaaa caaattgacg cttagacaac ttaataacac attgcggacg tttttaatgt    120
actgaattgg atccgcccgg gcggtaccaa gcttccgcgg ctgcagtgca gcgtgacccg    180
gtcgtgcccc tctctagaga taatgagcat tgcatgtcta agttataaaa aattaccaca    240
tatttttttt gtcacacttg tttgaagtgc agtttatcta tctttataca tatatttaaa    300
ctttactcta cgaataatat aatctatagt actacaataa tatcagtgtt ttagagaatc    360
atataaatga acagttagac atggtctaaa ggacaattga gtattttgac aacaggactc    420
tacagtttta tctttttagt gtgcatgtgt tctccttttt ttttgcaaat agcttcacct    480
atataatact tcatccattt tattagtaca tccatttagg gtttagggtt aatggttttt    540
atagactaat ttttttagta catctatttt attctatttt agcctctaaa ttaagaaaac    600
taaaactcta ttttagtttt tttatttaat agtttagata taaaatagaa taaaataaag    660
tgactaaaaa ttaaacaaat accctttaag aaattaaaaa aactaaggaa acatttttct    720
tgtttcgagt agataatgcc agcctgttaa acgccgtcga cgagtctaac ggacaccaac    780
cagcgaacca gcagcgtcgc gtcgggccaa gcgaagcaga cggcacggca tctctgtcgc    840
tgcctctgga cccctctcga gagttccgct ccaccgttgg acttgctccg ctgtcggcat    900
ccagaaattg cgtggcggag cggcagacgt gagccggcac ggcaggcggc ctcctcctcc    960
tctcacggca ccggcagcta cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc   1020
tcgcccgccg taataaatag acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt   1080
cggagcgcac acacacacaa ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc   1140
aaggtacgcc gctcgtcctc cccccccccc cccctctcta ccttctctag atcggcgttc   1200
cggtccatgg ttagggcccg gtagttctac ttctgttcat gtttgtgtta gatccgtgtt   1260
tgtgttagat ccgtgctgct agcgttcgta cacggatgcg acctgtacgt cagacacgtt   1320
ctgattgcta acttgccagt gtttctcttt ggggaatcct gggatggctc tagccgttcc   1380
gcagacggga tcgatttcat gatttttttt gtttcgttgc atagggtttg gtttgccctt   1440
ttcctttatt tcaatatatg ccgtgcactt gtttgtcggg tcatcttttc atgctttttt   1500
ttgtcttggt tgtgatgatg tggtctggtt gggcggtcgt tctagatcgg agtagaattc   1560
tgtttcaaac tacctggtgg atttattaat tttggatctg tatgtgtgtg ccatacatat   1620
tcatagttac gaattgaaga tgatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt   1680
gatgcgggtt ttactgatgc atatacagag atgctttttg ttcgcttggt tgtgatgatg   1740
tggtgtggtt gggcggtcgt tcattcgttc tagatcggag tagaatactg tttcaaacta   1800
cctggtgtat ttattaattt tggaactgta tgtgtgtgtc atacatcttc atagttacga    1860
gtttaagatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgt gggttttact    1920
gatgcatata catgatggca tatgcagcat ctattcatat gctctaacct tgagtaccta    1980
tctattataa taaacaagta tgttttataa ttatttcgat cttgatatac ttggatgatg    2040
gcatatgcag cagctatatg tggatttttt tagccctgcc ttcatacgct atttatttgc    2100
ttggtactgt ttcttttgtc gatgctcacc ctgttgtttg gtgttacttc tgcagggtac    2160
ggatcctcat ctaagcgcaa agagacgtac t atg gaa aac gct aaa atg aac       2212
                                   Met Glu Asn Ala Lys Met Asn
                                   1               5
tcg ctc atc gcc cag tat ccg ttg gta aag gat ctg gtt gct ctt aaa    2260
Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys
        10                  15                  20
gaa acc acc tgg ttt aat cct ggc acg acc tca ttg gct gaa ggt tta    2308
Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu
    25                  30                  35
cct tat gtt ggc ctg acc gaa cag gat gtt cag gac gcc cat gcg cgc    2356
Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp Val Gln Asp Ala His Ala Arg
40                  45                  50                  55
tta tcc cgt ttt gca ccc tat ctg gca aaa gca ttt cct gaa act gct    2404
Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala
                60                  65                  70
gcc act ggg ggg att att gaa tca gaa ctg gtt gcc att cca gct atg    2452
Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu Leu Val Ala Ile Pro Ala Met
            75                  80                  85
caa aaa cgg ctg gaa aaa gaa tat cag caa ccg atc agc ggg caa ctg    2500
Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu
        90                  95                  100
tta ctg aaa aaa gat agc cat ttg ccc att tcc ggc tcc ata aaa gca    2548
Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala
    105                 110                 115
cgc ggc ggg att tat gaa gtc ctg gca cac gca gaa aaa ctg gct ctg    2596
Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala His Ala Glu Lys Leu Ala Leu
120                 125                 130                 135
gaa gcg ggg ttg ctg acg ctt gat gat gac tac agc aaa ctg ctt tct    2644
Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser
                140                 145                 l50
ccg gag ttt aaa cag ttc ttt agc caa tac agc att gct gtg ggc tca    2692
Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser
            155                 160                 165
acc gga aat ctg ggg tta tca atc ggc att atg agc gcc cgc att ggc    2740
Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly
        170                 175                 180
ttt aag gtg aca gtt cat atg tct gct gat gcc cgg gca tgg aaa aaa    2788
Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys
    185                 190                 195
gcg aaa ctg cgc agc cat ggc gtt acg gtc gtg gaa tat gag caa gat    2836
Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp
200                 205                 210                 215
tat ggt gtt gcc gtc gag gaa gga cgt aaa gca gcg cag tct gac ccg    2884
Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro
                220                 225                 230
aac tgt ttc ttt att gat gac gaa aat tcc cgc acg ttg ttc ctt ggg    2932
Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly
            235                 240                 245
tat tcc gtc gct ggc cag cgt ctt aaa gcg caa ttt gcc cag caa ggc    2980
Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly
        250                 255                 260
cgt atc gtc gat gct gat aac cct ctg ttt gtc tat ctg ccg tgt ggt    3028
Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly
    265                 270                 275
gtt ggc ggt ggt cct ggt ggc gtc gca ttc ggg ctt aaa ctg gcg ttt    3076
Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe
280                 285                 290                 295
ggc gat cat gtt cac tgc ttt ttt gcc gaa cca acg cac tcc cct tgt    3124
Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala Glu Pro Thr His Ser Pro Cys
                300                 305                 310
atg ttg tta ggc gtc cat aca gga tta cac gat cag att tct gtt cag    3172
Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu His Asp Gln Ile Ser Val Gln
            315                 320                 325
gat att ggt atc gac aac ctt acc gca gcg gat ggc ctt gca gtt ggt    3220
Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly
        330                 335                 340
cgc gca tca ggc ttt gtc ggg cgg gca atg gag cgt ctg ctg gat ggc    3268
Arg Ala Ser Gly Phe Val Gly Arg Ala Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly
    345                 350                 355
ttc tat acc ctt agc gat caa acc atg tat gac atg ctt ggc tgg ctg    3316
Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu
360                 365                 370                 375
gcg cag gaa gaa ggt att cgt ctt gaa cct tcg gca ctg gcg ggt atg    3364
Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met
                380                 385                 390
gcc gga cct cag cgc gtg tgt gca tca gta agt tac caa cag atg cac    3412
Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser Val Ser Tyr Gln Gln Met His
            395                 400                 405
ggt ttc agc gca gaa caa ctg cgt aat acc act cat ctg gtg tgg gcg    3460
Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn Thr Thr His Leu Val Trp Ala
        410                 415                 420
acg gga ggt gga atg gtg ccg gaa gaa gag atg aat caa tat ctg gca    3508
Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala
    425                 430                 435
aaa ggc cgt taa taacgtttca acgcagcatg gatcgtaccg agctcaatcg          3560
Lys Gly Arg
440
atcctgcttt aatgagatat gcgagacgcc tatgatcgca tgatatttgc tttcaattct    3620
gttgtgcacg ttgtaaaaaa cctgagcatg tgtagctcag atccttaccg ccggtttcgg    3680
ttcattctaa tgaatatatc acccgttact atcgtatttt tatgaataat attctccgtt    3740
caatttactg attgtaccct actacttata tgtacaatat taaaatgaaa acaatatatt    3800
gtgctgaata ggtttatagc gacatctatg atagagcgcc acaataacaa acaattgcgt    3860
tttattatta caaatccaat tttaaaaaaa gcggcagaac cggtcaaacc taaaagactg    3920
attacataaa tcttattcaa atttcaaaag tgccccaggg gctagtatct acgacacacc    3980
gagcggcgaa ctaataacgc tcactgaagg gaactccggt tccccgccgg cgcgcatggg    4040
tgagattcct tgaagttgag tattggccgt ccgctctacc gaaagttacg ggcaccattc    4100
aacccggtcc agcacggcgg ccgggtaacc gacttgctgc cccgagaatt atgcagcatt    4160
tttttggtgt atgtgggccc caaatgaagt gcaggtcaaa ccttgacagt gacgacaaat    4220
cgttgggcgg gtccagggcg aattttgcga caacatgtcg aggctcagca ggatgggccc 4280
aggtacagaa ttcgcggccg tacaacgcgt accggttaat taatctagag gcgcgccggg 4340
cccggccggc cagatcttga ttgtcgtttc ccgccttcag tttaaactat cagtgtttga 4400
caggatatat tggcgggtaa acctaagaga aaagagcgtt tattagaata atcggatatt 4460
taaaagggcg tgaaaaggtt tatccgttcg tccatttgta tgt                   4503
<210>40
<211>442
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶[dsdA]CDS的合成构建体
<400>40
Met Glu Asn Ala Lys Met Asn Ser Leu Ile Ala Gln Tyr Pro Leu Val
1               5                   10                  15
Lys Asp Leu Val Ala Leu Lys Glu Thr Thr Trp Phe Asn Pro Gly Thr
            20                  25                  30
Thr Ser Leu Ala Glu Gly Leu Pro Tyr Val Gly Leu Thr Glu Gln Asp
        35                  40                  45
Val Gln Asp Ala His Ala Arg Leu Ser Arg Phe Ala Pro Tyr Leu Ala
    50                  55                  60
Lys Ala Phe Pro Glu Thr Ala Ala Thr Gly Gly Ile Ile Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Leu Val Ala Ile Pro Ala Met Gln Lys Arg Leu Glu Lys Glu Tyr Gln
                85                  90                  95
Gln Pro Ile Ser Gly Gln Leu Leu Leu Lys Lys Asp Ser His Leu Pro
            100                 105                 110
Ile Ser Gly Ser Ile Lys Ala Arg Gly Gly Ile Tyr Glu Val Leu Ala
        115                 120                 125
His Ala Glu Lys Leu Ala Leu Glu Ala Gly Leu Leu Thr Leu Asp Asp
    130                 135                 140
Asp Tyr Ser Lys Leu Leu Ser Pro Glu Phe Lys Gln Phe Phe Ser Gln
145                 150                 155                 160
Tyr Ser Ile Ala Val Gly Ser Thr Gly Asn Leu Gly Leu Ser Ile Gly
                165                 170                 175
Ile Met Ser Ala Arg Ile Gly Phe Lys Val Thr Val His Met Ser Ala
            180                 185                 190
Asp Ala Arg Ala Trp Lys Lys Ala Lys Leu Arg Ser His Gly Val Thr
        195                 200                 205
Val Val Glu Tyr Glu Gln Asp Tyr Gly Val Ala Val Glu Glu Gly Arg
    210                 215                 220
Lys Ala Ala Gln Ser Asp Pro Asn Cys Phe Phe Ile Asp Asp Glu Asn
225                 230                 235                 240
Ser Arg Thr Leu Phe Leu Gly Tyr Ser Val Ala Gly Gln Arg Leu Lys
                245                 250                 255
Ala Gln Phe Ala Gln Gln Gly Arg Ile Val Asp Ala Asp Asn Pro Leu
            260                 265                 270
Phe Val Tyr Leu Pro Cys Gly Val Gly Gly Gly Pro Gly Gly Val Ala
        275                 280                 285
Phe Gly Leu Lys Leu Ala Phe Gly Asp His Val His Cys Phe Phe Ala
    290                 295                 300
Glu Pro Thr His Ser Pro Cys Met Leu Leu Gly Val His Thr Gly Leu
305                 310                 315                 320
His Asp Gln Ile Ser Val Gln Asp Ile Gly Ile Asp Asn Leu Thr Ala
                325                 330                 335
Ala Asp Gly Leu Ala Val Gly Arg Ala Set Gly Phe Val Gly Arg Ala
            340                 345                 350
Met Glu Arg Leu Leu Asp Gly Phe Tyr Thr Leu Ser Asp Gln Thr Met
        355                 360                 365
Tyr Asp Met Leu Gly Trp Leu Ala Gln Glu Glu Gly Ile Arg Leu Glu
    370                 375                 380
Pro Ser Ala Leu Ala Gly Met Ala Gly Pro Gln Arg Val Cys Ala Ser
385                 390                 395                 400
Val Ser Tyr Gln Gln Met His Gly Phe Ser Ala Glu Gln Leu Arg Asn
                405                 410                 415
Thr Thr His Leu Val Trp Ala Thr Gly Gly Gly Met Val Pro Glu Glu
            420                 425                 430
Glu Met Asn Gln Tyr Leu Ala Lys Gly Arg
        435                 440
<210>41
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ahas基因的正向PCR引物
<400>41
tgactttggc tcarggaacg                                      20
<210>42
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>ahas基因的反向PCR引物
<400>42
atctcacttt cattctctgg gttt                                      24

Claims (36)

1.用于产生转基因小麦植物的方法，包括步骤
a.向小麦细胞或组织导入包含至少一种第一表达构建体的DNA构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b.将步骤a)的所述小麦细胞或组织在包含总浓度3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸和/或其衍生物的选择培养基上孵育至少5天时间，和
c.转移步骤b)的所述小麦细胞或组织至再生培养基并且再生和选择包含所述DNA构建体的小麦植物。
2.权利要求1所述的方法，其中该方法包括如下步骤：
a.分离小麦植物的不成熟胚，和
b.将未受去分化处理的所述分离的不成熟胚与属于根瘤菌属(Rhizobiaceae)的包含至少一种转基因T-DNA的细菌共培养，所述T-DNA包含至少一种第一表达构建体，其中所述第一表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
c.转移已共培养的不成熟胚至恢复培养基，所述恢复培养基缺少毒害植物有效量的D-丝氨酸或D-丙氨酸，和
d.在培养基上诱导胚发生愈伤组织的形成并且选择转基因愈伤组织，其中所述培养基包含，
i.有效量的至少一种植物生长素化合物，和
ii.总浓度3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，以及
e.自所述转基因愈伤组织再生并选择含有转基因T-DNA的植物。
3.权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的DNA构建体或权利要求3的T-DNA还包含赋予所述小麦植物农学上有价值的性状的至少一种第二表达构建体。
4.权利要求2或3所述的方法，其中植物生长素化合物的有效量等效于浓度0.2mg/l至6mg/l的2，4-D。
5.权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶选自D-丝氨酸脱氨酶(EC4.3.1.18)、D-氨基酸氧化酶(EC1.4.3.3)和D-丙氨酸转氨酶(EC2.6.1.21)。
6.权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶，
ii)与如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其与如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与编码如表1中所示的D-丝氨酸脱氨酶的核酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如表1所示D-丝氨酸脱氨酶的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含浓度3mM至100mM的D-丝氨酸的培养基上进行的；
或其中能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自
i)如表1中所示的D-氨基酸氧化酶，和
ii)与如表1中所示的D-氨基酸氧化酶具有相同的酶活性并且与其氨基酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少98％)同一性的酶；
iii)酶，其与如表1中所示的D-氨基酸氧化酶具有相同的酶活性并且编码其的核酸序列与编码如表1中所示的D-氨基酸氧化酶的核酸序列具有至少80％(优选地至少85％，更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少98％)的同一性，和
iv)酶，其由能够与编码如表1所示D-氨基酸氧化酶的序列的互补物杂交的核酸序列编码，
并且其中选择是在包含总浓度3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行的。
7.权利要求6中任意一项所述的方法，其中能够代谢D-丝氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：2编码的大肠杆菌D-丝氨酸脱氨酶，和
ii)与SEQ ID NO：2编码的序列具有相同的酶活性并且与SEQ IDNO：2编码的序列具有至少80％同一性的酶，和
iii)由能够与SEQ ID NO：1所示序列的互补物杂交的核酸序列所编码的酶，
并且其中选择是在包含浓度3mM至100mM的D-丝氨酸的培养基上进行的；
或其中能够代谢D-丝氨酸和D-丙氨酸的酶选自
i)SEQ ID NO：4编码的瘦弱红酵母(Rhodotorula gracilis)D-氨基酸氧化酶，和
ii)与SEQ ID NO：4编码的序列具有相同的酶活性并且与SEQ IDNO：4编码的序列具有至少80％同一性的酶，和
iii)由能够与SEQ ID NO：3所示序列的互补物杂交的核酸序列所编码的酶，
并且其中选择是在包含总浓度3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸的培养基上进行的。
8.权利要求1至7中任意一项所述的方法，其中在所述小麦植物中有活性的所述启动子是遍在蛋白启动子，优选地是玉米遍在蛋白启动子。
9.权利要求8所述的方法，其中在共培养后应用选择压力7日至21日。
10.权利要求8或9所述的方法，其中遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：5所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：5所示序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列具有至少60％同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：5所示序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性。
11.权利要求8至10中任意一项所述的方法，其中遍在蛋白启动子选自
a)包含如SEQ ID NO：6所示序列的序列，和
b)序列，其包含如SEQ ID NO：6所示序列的至少50个连续碱基对的至少一个片段，并具有在小麦中的启动子活性，
c)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所示序列具有至少60％同一性的序列，并具有在小麦中的启动子活性，
d)序列，其包含与如SEQ ID NO：6所示序列杂交的序列，并具有在小麦中的启动子活性。
12.权利要求1或2所述的方法，其中权利要求1的步骤b)的选择或权利要求2的步骤d)的选择是使用5至10mM D-丙氨酸和/或D-丝氨酸进行的。
13.权利要求1、2或12所述的方法，其中在去分化条件下的总选择时间是从3周至4周。
14.权利要求1、2或13所述的方法，其中权利要求1的步骤b)的选择或权利要求2的步骤d)的选择是以两个步骤进行的，使用第一选择步骤14日至20日，随后转移存活的细胞或组织至与第一选择培养基具有基本上相同组分的第二选择培养基中进行额外的14日至20日。
15.权利要求1至14中任意一项所述的方法，其中所述DNA构建体的导入由选自根瘤菌科菌介导的转化和粒子轰击介导的转化的方法介导。
16.权利要求15所述的方法，其中根瘤菌科细菌是卸甲的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)细菌。
17.权利要求1至16中任意一项所述的方法，其中所述的小麦植物选自小麦属(Triticum)。
18.权利要求17所述的方法，其中所述的小麦细胞或组织或所述的不成熟胚分离自选自小麦属的植物物种：普通小麦(T.aestivum)、硬粒小麦(T.durum)、斯佩尔特小麦(T.spelta)、双粒小麦(Triticum dicoccum)(Emmer小麦)、圆柱小麦(Triticum turgidum)和一粒小麦(Triticum monococcum)(Einkorn小麦)。
19.权利要求1所述的方法，其中所述的方法包括步骤：
i)将小麦植物细胞用第一DNA构建体转化，其中所述第一DNA构建体包含
a)至少一种第一表达构建体，其包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码D-氨基酸氧化酶的核酸序列，其中所述的第一表达盒的侧翼为具有允许特异性缺失所述第一表达盒的序列，和
b)适用于赋予所述植物农学上有价值的性状的至少一种第二表达盒，其中所述第二表达盒不位于允许特异性缺失所述第一表达盒的序列之间，和
ii)将步骤i)的所述已转化的小麦植物细胞用毒害植物浓度的选自D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物的第一化合物处理并且选择这样的植物细胞，在所述植物细胞的基因组中包含所述第一DNA构建体，并通过所述D-氨基酸氧化酶的表达而赋予所述经转化的植物细胞对所述第一化合物的抗性，和
iii)诱导从所述经转化的植物细胞的基因组中缺失所述第一表达盒并且将所述的植物细胞用对仍含有所述第一表达盒的植物细胞有毒的浓度的选自D-异亮氨酸、D-缬氨酸及其衍生物的第二化合物处理，从而选择出包含所述第二表达盒而缺少所述第一表达盒的植物细胞。
20.权利要求19所述的方法，其中
a)启动子如权利要求7至10中任意一项所定义，和/或
b)D-氨基酸氧化酶如权利要求5或7中所定义。
21.小麦植物或细胞，其包含在所述小麦植物或细胞中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，其中所述启动子相对于所述编码酶的序列是异源的。
22.权利要求21所述的小麦植物，其中
a)启动子如权利要求9至11中任意一项所定义，和/或
b)能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶如权利要求6至8中任意一项所定义。
23.权利要求21或22所述的小麦植物，其还包含赋予所述小麦植物农学上有价值的性状的至少一种第二表达构建体。
24.权利要求21至23中任意一项所述的小麦植物，其中所述小麦植物选自小麦属。
25.权利要求21至24中任意一项所述的小麦植物，其中所述植物来自小麦属中的种：普通小麦、硬粒小麦、斯佩尔特小麦、双粒小麦(Emmer小麦)、圆柱小麦和一粒小麦(Einkorn小麦)。
26.权利要求21至25中任意一项所述的小麦植物的部分。
27.用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含至少一种表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用包含第二选择标记基因的第二构建体进行转化，其中所述第二选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
28.权利要求所述27的方法，其中所述的第二标记基因赋予对选自膦丝菌素、草甘膦、磺酰脲型和咪唑啉酮型除草剂的至少一种化合物的抗性。
29.小麦植物，包含
a)第一表达构建体，其包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码能够代谢D-丙氨酸或D-丝氨酸的酶的核酸序列，和
b)用于选择标记基因的第二表达构建体，其中所述选择标记基因不赋予对D-丙氨酸或D-丝氨酸的抗性。
30.用于将至少2种DNA构建体依次转化入小麦植物的方法，包括步骤：
a)用第一构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，以及用D-丝氨酸选择，和
b)用第二构建体进行转化，其中所述构建体包含表达构建体，该表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dao酶的核酸序列，以及用D-丙氨酸选择。
31.小麦植物，包含
a)第一构建体，所述构建体包含表达构建体，其中所述表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dsdA酶的核酸序列，和
b)第二构建体，所述构建体包含表达构建体，其中所述表达构建体包含在所述小麦植物中有活性的启动子和与其有效连接的编码dao酶的核酸序列。
32.用于选择、再生、生长、培育或维持转基因小麦植物细胞、转基因小麦植物组织、转基因小麦植物器官或转基因小麦植物或其部分的组合物，其包含允许选择转基因小麦植物细胞、小麦植物组织、小麦植物器官或小麦植物或其部分的有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物；以及转基因小麦生物体、转基因小麦细胞、转基因的细胞培养物、转基因小麦植物和/或其部分。
33.细胞培养物，其包含自不成熟的小麦胚衍生的一种或多种胚发生愈伤组织、至少一种植物生长素、以及总浓度3mM至100mM的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸，其中植物生长素化合物的有效量等效于浓度0.2mg/l至6mg/l的2，4-D。
34.恢复培养基，其包含阻止或抑制土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素和/或浓度从1g/l至10g/l的L-脯氨酸和/或浓度从0μM至50μM的硝酸银。
35.选择培养基，其包含小麦靶组织和处于毒害植物浓度的D-丙氨酸和/或D-丝氨酸或其衍生物。
36.再生培养基，其包含转化的小麦植物细胞和一种或多种选自以下的化合物：
i)浓度从0.5至10mg/L的细胞分裂素，
ii)阻止或抑制土源性细菌生长的有效量的至少一种抗生素，和
iii)允许选择转基因细胞的有效量的D-丙氨酸、D-丝氨酸或其衍生物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115777530A (zh) * 2022-12-20 2023-03-14 黑龙江省原子能研究院 物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1996712A2 (en) * 2006-03-17 2008-12-03 BASF Plant Science GmbH D-amino acid selection for soybean
KR20140109909A (ko) * 2011-12-30 2014-09-16 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 합성 양방향성 ｓｃｂｖ 식물 프로모터를 위한 방법 및 구축물
CA2855902C (en) * 2011-12-30 2022-06-21 Dow Agrosciences Llc Construct and method for synthetic bidirectional plant promoter ubi1
TW201527314A (zh) * 2013-12-31 2015-07-16 Dow Agrosciences Llc 新穎玉米泛素啓動子（三）

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE68918494T2 (de) * 1988-05-17 1995-03-23 Lubrizol Genetics Inc Pflanzliches Ubiquitinpromotorsystem.
US6068994A (en) * 1989-08-07 2000-05-30 Chiron Corporation Ubiquitin expression system
US6528701B1 (en) * 1999-03-02 2003-03-04 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Rice ubiquitin-derived promoters
GB0201043D0 (en) * 2002-01-17 2002-03-06 Swetree Genomics Ab Plants methods and means
BR0307965A (pt) * 2002-02-26 2005-02-01 Syngenta Ltd Processo para produzir seletivamente plantas masculinas ou femininas estéries
DE10224889A1 (de) * 2002-06-04 2003-12-18 Metanomics Gmbh & Co Kgaa Verfahren zur stabilen Expression von Nukleinsäuren in transgenen Pflanzen
AU2005224324B2 (en) * 2004-03-17 2009-12-24 Basf Plant Science Gmbh Improved constructs for marker excision based on dual-function selection marker

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115777530A (zh) * 2022-12-20 2023-03-14 黑龙江省原子能研究院 物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法
CN115777530B (zh) * 2022-12-20 2023-12-01 黑龙江省原子能研究院 物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法

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