CN115777530A - 物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法 - Google Patents
物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法 Download PDFInfo
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Abstract
物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，本发明的目的是为了解决复合诱变育种过程中以发芽率为指标筛选半致死剂量与实际田间实验效果相差较大的问题。筛选方法：一、采用等离子体离子注入设备对直根系作物休眠种子进行氮离子注入；二、对氮离子注入后的种子进行60Co‑γ射线照射；三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽；四、设置对照实验组；五、选取根结构完整的复合诱变幼苗，以对照组幼苗与复合诱变处理组幼苗的根长或侧根数量中差异更为明显的性状为复合诱变半致死剂量的筛选指标。本发明用主根伸长和侧根发生的受抑制程度来预测种子复合诱变适宜剂量，有效避免由于采用发芽率为剂量筛选指标所造成的实验误差。
Description
技术领域
本发明涉及一种直根系植物种子的物理复合诱变育种中半致死剂量的筛选方法，复合诱变处理具体为对菜豆、汉麻等植物休眠种子进行N+离子注入后再进行60Co-γ射线辐照处理。
背景技术
辐射诱变技术是利用各种射线(如X射线、γ射线、重离子、中子等)照射农作物的种子、植株、器官和组织等，促使它们产生各种变异，再从中筛选出目标突变体，直接或间接培育成新品种的技术。
辐射诱变育种技术因其突变频率高、突变谱宽、变异稳定快和能产生新基因型等特点，在创制种质资源方面具有独特的优势；同时，进一步提高诱变频率，拓展突变谱和引导基因变异方向等成为辐射诱变技术的重要发展目标。开发新的高效诱变源和通过复合诱变方式提高变异频率等是目前解决上述问题的主要措施。复合诱变技术有理化复合和物理复合等，由于不同诱变因素间的协同效应，诱变率更高，诱变谱更宽。
辐射诱变育种技术中半致死剂量(LD50：辐射后引起50％植株死亡的辐射剂量)是重要参考性技术指标。半致死剂量与品种的辐射敏感性相关，品种间的辐射敏感性差异较大，又因在研究中要保障足够数量的成活植株，所以直接在田间开展研究不确定性大，成本过高。因此，开展育种研究前一般开展室内指标测定预实验作为筛选适宜剂量的基础。室内指标测定没有统一标准，可采用的指标包括种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、幼苗全长和鲜重等等，最常采用的指标为发芽率。
在物理复合诱变，具体为N+离子注入与60Co-γ射线辐照复合诱变育种过程中，由于存在不同诱变因素间的协同作用，以常规实验室发芽率为指标筛选半致死剂量与实际田间实验效果相差较大，实验室发芽率虽为50％，但田间成活率过低，对实验效果影响严重。
发明内容
本发明的目的是为了解决复合诱变育种过程中以发芽率为指标筛选半致死剂量与实际田间实验效果相差较大的问题，而提供一种物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法。
本发明物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法按照以下步骤实现：
一、采用等离子体离子注入设备对直根系作物休眠种子进行氮离子注入，控制不同的氮离子注量，得到氮离子注入后的种子；
二、对氮离子注入后的种子进行60Co-γ射线照射，控制不同的照射剂量，得到复合诱变处理的休眠种子；
三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，即先用培养皿或发芽盒作为苗床进行种子萌发，培养后选取胚根长度为2±0.10cm的发芽种子转移至种子生长袋，继续培养，获得复合诱变处理组幼苗；
四、设置对照实验组，即对未经过复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，得到对照组幼苗；
五、选取根结构完整的复合诱变幼苗，以对照组幼苗与复合诱变处理组幼苗的根长或侧根数量中差异更为明显的性状为复合诱变半致死剂量的筛选指标；即当以根长为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的根长为对照组平均幼苗根长的49％～51％，确定半致死剂量；当以须根数量为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的须根数量为对照组平均幼苗须根数量的49％～51％，确定半致死剂量。
根系是植物生存所必需的重要器官之一，植物依靠根系吸收水分和营养物质。直根系植物根结构主要有主根、侧根和根毛等；如果根结构不完整，对植株的生长产生直接的影响。直根系植物菜豆在苗期根的生长速度较地上部快，在子叶刚露出土面时，主根已生出7～8条侧根。汉麻侧根多，细根上密布根毛，幼苗期根系生长快。本发明在直根系植物的种子复合诱变领域，保障根结构完整的基础上，用主根伸长和侧根发生的受抑制程度来预测种子复合诱变适宜剂量，在保障物理复合诱变的协同效应优势的基础上，有效避免由于采用发芽率为剂量筛选指标所造成的实验误差，可有效保障诱变育种实验效果。
附图说明
图1为实施例中辐射诱变菜豆根系及分化情况图，其中A：未进行诱变处理的对照，B：复合诱变剂量低于半致死剂量组，C：复合诱变剂量为半致死剂量组，D：复合诱变剂量过大组。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法按照以下步骤实现：
一、采用等离子体离子注入设备对直根系作物休眠种子进行氮离子注入，控制不同的氮离子注量，得到氮离子注入后的种子；
二、对氮离子注入后的种子进行60Co-γ射线照射，控制不同的照射剂量，得到复合诱变处理的休眠种子；
三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，即先用培养皿或发芽盒作为苗床进行种子萌发，培养后选取胚根长度为2±0.10cm的发芽种子转移至种子生长袋，继续培养，获得复合诱变处理组幼苗；
四、设置对照实验组，即对未经过复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，得到对照组幼苗；
五、选取根结构完整的复合诱变幼苗，以对照组幼苗与复合诱变处理组幼苗的根长或侧根数量中差异更为明显的性状为复合诱变半致死剂量的筛选指标；即当以根长为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的根长为对照组平均幼苗根长的49％～51％，确定半致死剂量；当以须根数量为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的须根数量为对照组平均幼苗须根数量的49％～51％，确定半致死剂量。
本实施方式菜豆种子注量范围为2×1016N+/cm2～4×1016N+/cm2，汉麻种子注量范围为4×1016N+/cm2～20×1016N+/cm2；对菜豆的照射剂量分别为0Gy、50Gy、100Gy、150Gy；对汉麻种子的照射剂量分别为0Gy、50Gy、100Gy、150Gy、200Gy、250Gy和300Gy。
本实施方式对不同梯度处理的种子进行催芽，根据作物发芽和根生长情况分析半致死剂量指标及参数。由于子叶在发芽初期能够给幼苗提供充足的养分，所以种子吸水膨胀后露白和初步发芽是较普遍现象。但是幼苗发芽后，根系开始发挥吸水和吸收营养物质的作用，如果根系因辐射损伤导致功能障碍，发芽后期幼苗将逐渐衰亡。在物理复合诱变处理发芽阶段主要是这种情况占主导地位。因此诱变时以根结构完整，根长为对照的一半或根长变化不大，但须根数量减少为对照一半的处理组合为半致死剂量。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中直根系作物休眠种子为菜豆种子或者汉麻种子。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是当直根系作物休眠种子为菜豆种子时，步骤一中控制氮离子注量为2×1016N+/cm2～4×1016N+/cm2。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二不同的是当直根系作物休眠种子为汉麻种子时，步骤一中控制氮离子注量为4×1016N+/cm2～20×1016N+/cm2。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二不同的是当直根系作物休眠种子为菜豆种子时，步骤二中控制照射剂量分别为0Gy～150Gy。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二不同的是当直根系作物休眠种子为汉麻种子时，步骤二中控制照射剂量分别为0Gy～300Gy。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤二中控制照射剂量率为0.1Gy/min。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤三中用培养皿或发芽盒作为苗床进行种子萌发，培养3～4天(d)后选取胚根长度为2±0.10cm的发芽种子。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤三中发芽种子转移至种子生长袋，继续培养6～8天(d)。
实施例一：本实施例物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法按照以下步骤实现：
一、采用等离子体离子注入设备对菜豆(矮生菜豆青冠)休眠种子进行氮离子注入，控制氮离子注量为3×1016N+/cm2，注入能量为30keV，得到氮离子注入后的种子，每组50粒种子，重复3组；
二、对氮离子注入后的种子进行60Co-γ射线照射，控制照射剂量率为0.1Gy/min，照射剂量为100Gy，得到复合诱变处理的休眠种子；
三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，即先用培养皿作为苗床进行种子萌发，培养3d后选取胚根长度为2.1±0.10cm的发芽种子转移至种子生长袋，继续培养7d，获得复合诱变幼苗，供观察和统计根结构和根系生长状态；
四、设置对照实验组，对照实验的催芽条件与诱变处理组相同，均为实验室发芽的常规温度和湿度，得到对照幼苗；
五、经实验室发芽观察和和统计发现，侧根的分化程度受到的诱变影响比根长更为明显，对照组平均侧根数量为14个，复合诱变组侧根数量为对照的50.8％，约为复合诱变的半致死剂量。经田间菜豆M1代培养，验证了此剂量为适宜诱变剂量。
本实施例确定了菜豆3×1016N+/cm2等离子体注入和100Gy射线照射复合剂量是其半致死剂量。
实施例二：本实施例物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法按照以下步骤实现：
一、采用等离子体离子注入设备对汉麻HKY1休眠种子进行氮离子注入，控制氮离子注量为12×1016N+/cm2，注入能量为30keV，得到氮离子注入后的种子，每组50粒种子，重复3组；
二、对氮离子注入后的种子进行60Co-γ射线照射，控制照射剂量率为0.1Gy/min，照射剂量为100Gy，得到复合诱变处理的休眠种子；
三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，即先用培养皿作为苗床进行种子萌发，培养3d后选取胚根长度为1.9±0.10cm的发芽种子转移至种子生长袋，继续培养7d，获得复合诱变幼苗，供观察和统计根结构和根系生长状态；
四、设置对照实验组，对照实验的催芽条件与诱变处理组相同，均为实验室发芽的常规温度和湿度，得到对照幼苗；
五、经实验室发芽观察和和统计发现，复合诱变后根长受到影响程度比侧根分化程度明显。复合诱变处理组根长平均为4.4cm，是对照组根长平均数的49.1％，约为复合诱变的半致死剂量。经田间汉麻M1代培养，验证了此剂量为适宜诱变剂量。
本实施例确定了汉麻12×1016N+/cm2等离子体注入和100Gy射线照射复合剂量是其半致死剂量。
Claims (9)
1.物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于该筛选方法按下列步骤实现：
一、采用等离子体离子注入设备对直根系作物休眠种子进行氮离子注入，控制不同的氮离子注量，得到氮离子注入后的种子；
二、对氮离子注入后的种子进行60Co-γ射线照射，控制不同的照射剂量，得到复合诱变处理的休眠种子；
三、对复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，即先用培养皿或发芽盒作为苗床进行种子萌发，培养后选取胚根长度为2±0.10cm的发芽种子转移至种子生长袋，继续培养，获得复合诱变处理组幼苗；
四、设置对照实验组，即对未经过复合诱变处理的休眠种子进行实验室催芽，得到对照组幼苗；
五、选取根结构完整的复合诱变幼苗，以对照组幼苗与复合诱变处理组幼苗的根长或侧根数量中差异更为明显的性状为复合诱变半致死剂量的筛选指标；即当以根长为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的根长为对照组平均幼苗根长的49％～51％，确定半致死剂量；当以须根数量为指标确定半致死剂量时，复合诱变幼苗的须根数量为对照组平均幼苗须根数量的49％～51％，确定半致死剂量。
2.根据权利要求1所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于步骤一中直根系作物休眠种子为菜豆种子或者汉麻种子。
3.根据权利要求2所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于当直根系作物休眠种子为菜豆种子时，步骤一中控制氮离子注量为2×1016N+/cm2～4×1016N+/cm2。
4.根据权利要求2所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于当直根系作物休眠种子为汉麻种子时，步骤一中控制氮离子注量为4×1016N+/cm2～20×1016N+/cm2。
5.根据权利要求2所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于当直根系作物休眠种子为菜豆种子时，步骤二中控制照射剂量分别为0Gy～150Gy。
6.根据权利要求2所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于当直根系作物休眠种子为汉麻种子时，步骤二中控制照射剂量分别为0Gy～300Gy。
7.根据权利要求1所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于步骤二中控制照射剂量率为0.1Gy/min。
8.根据权利要求1所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于步骤三中用培养皿或发芽盒作为苗床进行种子萌发，培养3～4天后选取胚根长度为2±0.10cm的发芽种子。
9.根据权利要求1所述的物理复合诱变直根系作物休眠种子半致死剂量的筛选方法，其特征在于步骤三中发芽种子转移至种子生长袋，继续培养6～8天。
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