CN105993932A - 树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种树兰蒴果60Co‑γ射线辐射诱变方法，选择树兰属的树兰种子，确定培养基和培养条件，分组用60Co‑γ射线进行辐射处理后，统计确定半致死剂量LD50，并用相关软件拟合为直线方程；将种子萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标，分析不同剂量辐射组与对照组的差异。在组织培养条件下利用60Co‑γ进行诱变处理，观察不同辐射剂量对树兰种子的诱变效应，确定适宜辐射剂量。建立树兰蒴果60Co‑γ射线辐射诱变育种技术，为其辐射诱变育种适宜剂量的选择和确定提供依据，并选育获得新品种。方便取材、可以降低污染率、节约时间成本。

Description

树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法

技术领域

本发明涉及一种树兰蒴果的辐射诱变技术，尤其涉及一种树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法。

背景技术

辐射诱变又称物理诱变，利用辐射诱变技术进行育种工作是目前育种领域所常用且效率较高的技术，主要是指用一定剂量的射线辐射处理材料，从而诱发材料发生突变，引发变异(基因的突变或染色体的畸变)，进而经筛选、测定、选择，最终从突变体中选育出对科研或生产上有可利用价值新品种的育种过程[1]。目前，在辐射诱变研究中，常用的辐射源包括：γ和X射线、中子、电子束、离子束等,此外还包括非电离辐射(紫外线和激光)，这些辐射源能够获得有利用价值的突变体，其中最常用的射线主要是γ射线[2]。γ射线作为一种物理诱变射线，其辐射源为60Co和137Cs，在育种工作中具有辐射条件易于控制、效果显著等优点。此外，γ射线是一种中性射线，穿透能力较强，辐射剂量均匀且一次能够处理大量的材料，是辐射育种的首选，本试验即使用60Co-γ射线用于材料的辐射源。近年来，国内外在辐射诱变领域不断尝试新的技术、方法等，并取得了巨大的成就，辐射诱变不仅在辐射效应研究中举足轻重，也在新品种选育方面广泛应用。

辐射诱变育种相比其它的几种育种方法(杂交育种、基因工程育种等)具有的优势有：突变率较高、变异的范围较大、变异谱较广等；此外，射线的辐射能够打破基因的连锁进而能够提高基因的重组率；在保持品种优良性状上还具有较稳定、速度快等特点，大大缩短了育种的周期。

树兰(Epidendrum secundum)属兰科(Orchidaceae)树兰属。树兰属植物原产于美洲大陆的热带和亚热带地区，有超过1125种。根据生活习性，有附生、地生和岩生，多分布于安第斯山脉海拔1000～3000m的区域。树兰花色鲜艳花型优美，易于种植，在温室中可常年开花。开展树兰育种工作，为丰富兰花种质资源，发展我国的兰花产业具有重要的意义。目前，树兰育种研究工作甚少。

诱变育种已成为花卉育种的主要手段，为花卉育种提供了全新的思路，展现出广阔的前景。辐射诱变育种在我国兰科植物育种中有所应用，但在树兰属植物中的应用尚未见报道。且在兰科植物的辐射诱变中，多数学者选择根状茎、类原球茎、试管苗的完整植株或无根苗等作为辐射材料，尚未出现使用完整蒴果进行60Co-γ射线辐射处理的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种萌发率高、方便取材、可以降低污染率、节约时间成本的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，选择树兰蒴果，包括步骤：

A、培养基和培养条件：

用于胚的萌发实验的培养基：MS、1/2MS、1/4MS；

种子萌发培养基：1/2MS；

原球茎分化培养基：MS；

原球茎繁殖培养基：花寳1号改良培养基；

以上培养基pH 5.8-6.0，121℃恒温灭菌20min，培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600-2000lx、光照时间为14h/d；

B、辐射处理：

取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰蒴果为试验材料，分组用60Co-γ射线进行辐射处理；

辐射处理后树兰蒴果的处理如下：

使用蘸有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍；

移入超净工作台后，再用同样的方法擦拭3遍；

将消毒后的材料播入无菌三角瓶中，加入无菌水并加入一滴吐温80制成100ml均匀的悬浮液，再用移液枪吸取约700μl，播入1/2MS培养基中，每个剂量处理有4组，每组为5瓶。用血球计数板法统计各剂量悬浮液的种子密度，每个剂量10次重复；

C、统计萌发时间、萌发率及相对成活率：

观察统计每个剂量处理开始萌发的时间及60天内的萌发种子数：计算种子的萌发率和相对成活率，萌发率＝萌发的个数/接种的个数×100％；相对成活率＝萌发率/对照萌发率×100％。

D、半致死剂量的确定：

确定半致死剂量LD50：以辐射剂量作为自变量x，不同剂量辐射后种子的相对成活率y作为因变量，应用直线回归方程y＝a+bx和下式(1)、(2)来计算60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50；

$b=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}}$

$a=\frac{\Σy-b\·\Σx}{N}$

$x=\frac{50-a}{b}---\left(1\right);$

式中：a是常数，b是回归系数，x是半致死量；

相关系数公式：

$r=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{\sqrt{\[{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}\]}\[{\mathrm{\Σy}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}y\right)}^2}{N}\]}---\left(2\right);$

利用上述公式计算相对萌发率与辐射剂量之间的相关系数，使用相关软件拟合为直线方程；

E、辐射处理对树兰再生植株产生的辐射效应：

将种子萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化及形态学指标，包括叶宽、叶长、叶片数、株高，比较不同剂量辐射组与对照组的差异；

F、数据处理与统计方法：

利用Excel软件、SPSS 22.0软件、DPS软件对试验数据绘制图表、方差分析、相关分析、回归分析及Duncan多重比较。

由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，在组织培养条件下利用60Co-γ进行诱变处理，观察不同辐射剂量对树兰种子的诱变效应，确定适宜辐射剂量，建立树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变育种技术，为其辐射诱变育种适宜剂量的选择提供依据并选育获得具有科研价值和商业价值的新品种。萌发率高、方便取材、可以降低污染率、节约时间成本。

附图说明

图1为本发明实施例中剂量和相对成活率的相关性分析示意图。

图2为本发明实施例中辐射处理对株高的影响示意图。

图3为本发明实施例中辐射处理对叶片数的影响示意图。

图4为本发明实施例中辐射处理对叶长的影响示意图。

图5为本发明实施例中辐射处理对叶宽的影响示意图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。

本发明的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，其较佳的具体实施方式是：

选择树兰蒴果，包括步骤：

A、培养基和培养条件：

用于胚的萌发实验的培养基：MS、1/2MS、1/4MS；

种子萌发培养基：1/2MS；

原球茎分化培养基：MS；

原球茎繁殖培养基：花寳1号改良培养基；

以上培养基pH 5.8-6.0，121℃恒温灭菌20min，培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600-2000lx、光照时间为14h/d；

B、辐射处理：

取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰蒴果为试验材料，分组用60Co-γ射线进行辐射处理；

辐射处理后树兰蒴果处理如下：

使用蘸有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍；

移入超净工作台后，再用同样的方法擦拭3遍；

将消毒后的材料播入无菌三角瓶中，加入无菌水并加入一滴吐温80制成100ml均匀的悬浮液，再用移液枪吸取约700μl，播入1/2MS培养基中，每个剂量处理有4组，每组为5瓶。用血球计数板法统计各剂量悬浮液的种子密度，每个剂量10次重复；

C、统计萌发时间、萌发率及相对成活率：

观察统计每个剂量处理开始萌发的时间及60天内的萌发种子数：计算种子的萌发率和相对成活率，萌发率＝萌发的个数/接种的个数×100％；相对成活率＝萌发率/对照萌发率×100％。

D、半致死剂量的确定：

确定半致死剂量LD50：以辐射剂量作为自变量x，不同剂量辐射后种子的相对成活率y作为因变量，应用直线回归方程y＝a+bx和下式(1)、(2)来计算60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50；

$b=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}}$

$a=\frac{\Σy-b\·\Σx}{N}$

$x=\frac{50-a}{b}---\left(1\right);$

式中：a是常数，b是回归系数，x是半致死量；

相关系数公式：

$r=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{\sqrt{\[{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}\]}\[{\mathrm{\Σy}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}y\right)}^2}{N}\]}---\left(2\right);$

利用上述公式计算相对萌发率与辐射剂量之间的相关系数，使用相关软件拟合为直线方程；

E、辐射处理对树兰再生植株产生的辐射效应：

将种子萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标，包括叶宽、叶长、叶片数、株高，比较不同剂量辐射组与对照组的差异；

F、数据处理与统计方法：

利用Excel软件、SPSS 22.0软件、DPS软件对试验数据绘制图表、方差分析、相关分析、回归分析及Duncan多重比较。

所述步骤B中，辐射剂量梯度见下表：

本发明的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，利用60Co-γ进行诱变处理，在组织培养条件下观察不同辐射剂量对树兰种子的诱变效应，确定适宜辐射剂量。建立树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变育种技术，为其辐射诱变育种适宜剂量的选择确定提供依据，并选育获得具有科研价值和商业价值的新品种。

本发明首次选用重要兰科观赏植物树兰为研究材料，对树兰属植物蒴果进行辐射诱变试验。60Co-γ射线辐射育种具有穿透力强，突变率高、变异的范围大、变异谱广等优点，因此，使用60Co-γ射线对树兰属植物蒴果进行辐射诱变，有利于获得具有适宜观花观叶的新品种。

辐射诱变材料取自林科院温室栽培植株未完全成熟的完整蒴果，对辐射具有较高的敏感性。通常兰科植物种子萌发率极低，而一个蒴果内所含种子数量众多，因此，选择蒴果作为辐射育种研究对象，便于组织培养条件下种子的成功萌发且具有较高的萌发率，为通过辐射育种高萌发率条件下成功筛选得到变异植株奠定基础；且树兰植株可常年开花，方便取材，同时，使用完整蒴果进行辐射可以极大降低污染率；此外，采用种子萌发，组培条件下仅需30d左右，可以大大节约萌发时间成本。

具体实施例：

1、材料：

树兰(Epidendrum secundum)种子取自中国林业科学研究院的温室，为树兰属的一个种，产自巴西；

2、方法：

(1)培养基和培养条件

用于胚的萌发实验的培养基：MS、1/2MS、1/4MS。

种子萌发培养基：1/2MS

原球茎分化培养基：MS

原球茎繁殖培养基：花寳1号改良培养基

以上培养基pH 5.8-6.0，121℃恒温灭菌20min。培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600-2000lx、光照时间为14h/d。

(2)辐射处理

在北京市辐射中心进行辐射处理。取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰蒴果为试验材料，分组用60Co-γ射线进行辐射处理，剂量梯度见表1。

表1辐射剂量梯度

Tab.1The degrees of radiation dose

辐射处理后树兰蒴果的处理如下：使用蘸有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍；移入超净工作台后，再用同样的方法擦拭3遍；将消毒后的材料播入无菌三角瓶中，加入无菌水制成100ml均匀的悬浮液(加入一滴吐温80)，再用移液枪吸取约700μl，播入1/2MS培养基中，每个剂量处理有4组，每组为5瓶。用血球计数板法统计各剂量悬浮液的种子密度，每个剂量10次重复。

(3)统计萌发时间、萌发率及相对成活率

观察统计每个剂量处理开始萌发的时间及萌发种子数(60d内)，计算种子的萌发率。萌发率＝(萌发的个数/接种的个数)×100％；相对成活率＝(萌发率/对照萌发率)×100％。

(4)半致死剂量的确定

半致死剂量LD50的确定见式(1)、(2)。以辐射剂量作为自变量(x)，不同剂量辐射后种子的相对成活率(y)作为因变量，应用直线回归方程(y＝a+bx)和下列公式来计算60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50。

$b=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}}$

$a=\frac{\Σy-b\·\Σx}{N}$

$x=\frac{50-a}{b}---\left(1\right)$

(a是常数；b是回归系数；x是半致死量)

相关系数公式：

$r=\frac{\mathrm{\Σ}xy-\frac{\mathrm{\Σ}x\·\mathrm{\Σ}y}{N}}{\sqrt{\[{\mathrm{\Σx}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}x\right)}^2}{N}\]}\[{\mathrm{\Σy}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\Σ}y\right)}^2}{N}\]}---\left(2\right);$

利用上述公式计算相对萌发率与辐射剂量之间的相关系数，使用相关软件拟合为直线方程。

(5)辐射处理对树兰再生植株产生的辐射效应

将种子萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标(叶宽、叶长、叶片数、株高)，分析不同剂量辐射组与对照组的差异。

(6)数据处理与统计方法

利用Excel软件、SPSS 22.0软件、DPS软件对试验数据绘制图表、方差分析、相关分析、回归分析及Duncan多重比较等。

本发明的有益效果：

1.辐射处理后树兰种子萌发的时间和萌发率

接种后50d内观察统计树兰种子的萌发时间和萌发率。由表2可以得出：从萌发时间上来看，20Gy处理的种子，萌发所需时间最短，约20d，其次为40Gy约22d；从萌发率上来看，辐射剂量为20Gy时种子萌发率最高，约为0.2％，比空白对照高出0.01％。当辐射剂量为60Gy时，种子相对成活为52.37％，而当剂量达到100Gy时，为28.94％，结果表明，巴2种子半致死的剂量在60Gy-100Gy之间。当剂量达200Gy时，种子已不再萌发，说明在高剂量辐射下，种子受到不可逆的损伤，失去生理活性。

表2辐照处理后树兰种子的萌发率

Tab.2Germination rate of Epidnedium sp.seeds after radiation treatment

2.辐射后种子的致死率

由表3可以得出，随着辐射剂量的增加，树兰种子致死率呈上升的趋势，各辐射处理致死率均大于99％。由表4可知，不同剂量辐射后，各个处理组的种子致死率存在显著差异，说明不同辐射剂量对种子致死率有较大的影响。

表3辐射后种子的致死率

Tab.3The fatality rate of seeds after radiation

注:表中小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著，大写字母表示在P<0.01水平上差异显著。

Note：Lowercase letters in the table indicate significant difference at P<0.05levelamong treatments,The capital letters indicate at P<0.01level.

表4辐射后种子的致死率方差分析

Tab.4Variance of analysis of the death rate of seeds after radiation

3.半致死剂量的确定

对辐射剂量与相对成活率进行相关和回归分析可知(图1)，两者的标准曲线方程是y＝﹣0.461x+86.07，F＝45.375**，相关系数：R＝0.721**，P＝0.000＜0.01。

从上述方程可以求得，当y＝50时，x＝69.34，即60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50＝69.34Gy。

4.辐射处理对树兰再生植株的辐射效应

(1)辐射处理对树兰再生植株株高的辐射效应

对原球茎分化出的实生苗株高进行测量，研究辐射处理对实生苗株高的辐射效应。由表5和图2所示，通过辐射处理后，各处理的再生植株的株高都低于对照，且随着辐射剂量增加，植株不断矮化，只在40Gy处理的株高略高于20Gy的处理，但还是低于10Gy；当辐射剂量高于120Gy时，部分原球茎出现褐化现象，未能发育成完整植株。总体来看，株高与辐射剂量呈负相关，说明辐射对植株生长有一定抑制作用。不同剂量辐射后，各个处理组的再生植株的株高存在显著的差异，表明辐射剂量对株高有明显影响(表6)。

表5辐射处理对株高的影响

Tab.5The effects of radiation treatment on plant height

注:表中小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著，大写字母表示在P<0.01水平上差异显著。

Note：Lowercase letters in the table indicate significant difference at P<0.05levelamong treatments,the capital letters indicate at P<0.01level.

表6辐射处理对株高的方差分析

Tab.6Variance of analysis of radiation treatment on plant height

(2)辐射处理对树兰再生植株叶片数的辐射效应

对原球茎分化出的实生苗叶片数进行统计，研究辐射处理对实生苗叶片数的辐射效应。由表7所示，经辐射处理后，再生植株叶片数与对照组相比，都有不同程度的减少。表8的方差分析也显示，不同辐射剂量处理后各处理组再生植株叶片数之间存在显著差异，说明不同辐射剂量对叶片数有显著影响。但由图3所示，当辐射剂量为20Gy时，叶片数明显增加，此后呈下降趋势，而当辐射剂量达120Gy时，叶片数又明显上升，且上升幅度较大，这又说明虽然辐射处理对再生植株叶片数有影响，但无一定规律性，需要进一步进行研究。

表7辐射处理对叶片数的影响

Tab.7The effects of radiation treatment on leaf number

注:表中小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著，大写字母表示在P<0.01水平上差异显著。

Note：Lowercase letters in the table indicate significant difference at P<0.05levelamong treatments,The capital letters indicate atP<0.01level.

表8辐射处理对叶片数的方差分析

Tab.8Variance of analysis of radiation treatment on leaf number

(3)辐射处理对树兰再生植株叶长的辐射效应

对原球茎分化出的实生苗叶长进行测量，研究辐射处理对实生苗叶长的辐射效应。由表9所示，经辐射处理后，各处理再生植株叶长均低于对照，且随着辐射剂量的增加，叶片长度逐渐减小，叶长与辐射剂量呈显著的负相关，说明辐射处理对叶片长度有一定的抑制作用。由表10方差分析结果可知，不同剂量辐射后各个处理组再生植株叶长之间存在显著的差异，说明辐射剂量对叶长有显著影响(图4)。

表9辐射处理对叶长的影响

Tab.9The effects of radiation treatment on leaf length

注:表中小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著，大写字母表示在P<0.01水平上差异显著。

Note：Lowercase letters in the table indicate significant difference at P<0.05levelamong treatments；The capital letters indicate at P<0.01level.

表10辐射处理对叶长的方差分析

Tab.10Variance of analysis of radiation treatment on leaf length

(4)辐射处理对树兰再生植株叶宽的辐射效应

对原球茎分化出的实生苗叶宽进行测量，研究辐射处理对实生苗叶宽的辐射效应。由表11和表12所示，经辐射处理后，各处理组的再生植株叶宽之间存在显著差异，除200Gy无植株萌发外，辐射剂量为60Gy时，叶的宽度最低，而剂量在5Gy时最高，为5.03mm。由图5可知，当辐射剂量低于120Gy时，叶宽整体下降幅度不大，仅为1.4mm，说明叶片宽度对辐射剂量不很敏感。

表11辐射处理对叶宽的影响

Tab.11The effects of radiation treatment on leaf width

注:表中小写字母表示处理间在P<0.05水平上差异显著，大写字母表示在P<0.01水平上差异显著。

Note：Lowercase letters in the table indicate significant difference at P<0.05levelamong treatments,The capital letters indicate atP<0.01level.

表12辐射处理对叶宽的方差分析

Tab.12Variance of analysis of radiation treatment on leaf width

本发明的技术关键点：

1.以树兰蒴果为研究材料，使用60Co-γ射线进行辐射处理；

2.对树兰的辐射处理研究表明20Gy可促进种子的萌发，缩短萌发时间、提升萌发率，可用于提升再生植株的增殖率；

3.60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50＝69.34Gy，可用于辐射诱变育种；

4.辐射剂量120Gy处理的材料出现花叶植株。

5.在所确定的剂量下进行辐射，诱变率高，且可获得变异植株，有利于观叶观花新品种的选育。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，其特征在于，选择树兰属的树兰蒴果，包括步骤：

A、培养基和培养条件：

用于胚的萌发实验的培养基：MS、1/2MS、1/4MS；

种子萌发培养基：1/2MS；

原球茎分化培养基：MS；

原球茎繁殖培养基：花寳1号改良培养基；

以上培养基pH 5.8-6.0，121℃恒温灭菌20min，培养条件为温度24(±2)℃、光照强度1600-2000lx、光照时间为14h/d；

B、辐射处理：

取同一植株上花期一致、授粉时间一致、长势一致的树兰蒴果为试验材料，分组用60Co-γ射线进行辐射处理；

辐射处理后树兰种子的处理如下：

使用蘸有75％酒精的棉球轻轻擦拭外果皮3遍；

移入超净工作台后，再用同样的方法擦拭3遍；

将消毒后的材料播入无菌三角瓶中，加入无菌水并加入一滴吐温80制成100ml均匀的悬浮液，再用移液枪吸取约700μl，播入1/2MS培养基中，每个剂量处理有4组，每组为5瓶。用血球计数板法统计各剂量悬浮液的种子密度，每个剂量10次重复；

C、统计萌发时间、萌发率及相对成活率：

观察统计每个剂量处理开始萌发的时间及60天内的萌发种子数：计算种子的萌发率和相对成活率，萌发率＝萌发的个数/接种的个数×100％；相对成活率＝萌发率/对照萌发率×100％。

D、半致死剂量的确定：

确定半致死剂量LD50：以辐射剂量作为自变量x，不同剂量辐射后种子的相对成活率y作为因变量，应用直线回归方程y＝a+bx和下式(1)、(2)来计算60Co-γ射线对树兰种子的半致死剂量LD50；

$b=\frac{\mathrm{\&Sigma;}xy-\frac{\mathrm{\&Sigma;}x\&CenterDot;\mathrm{\&Sigma;}y}{N}}{{\mathrm{\&Sigma;x}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\&Sigma;}x\right)}^2}{N}}$

$a=\frac{\&Sigma;y-b\&CenterDot;\&Sigma;x}{N}$

$x=\frac{50-a}{b}---\left(1\right);$

式中：a是常数，b是回归系数，x是半致死量；

相关系数公式：

$r=\frac{\mathrm{\&Sigma;}xy-\frac{\mathrm{\&Sigma;}x\&CenterDot;\mathrm{\&Sigma;}y}{N}}{\sqrt{\&lsqb;{\mathrm{\&Sigma;x}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\&Sigma;}x\right)}^2}{N}\&rsqb;}\&lsqb;{\mathrm{\&Sigma;y}}^2-\frac{{\left(\mathrm{\&Sigma;}y\right)}^2}{N}\&rsqb;}---\left(2\right);$

利用上述公式计算相对萌发率与辐射剂量之间的相关系数，使用相关软件拟合为直线方程；

E、辐射处理对树兰再生植株产生的辐射效应：

将萌发的原球茎接入分化培养基中，培养分化出再生植株，120d后调查再生植株分化的情况及形态学指标，包括叶宽、叶长、叶片数、株高，比较不同剂量辐射组与对照组的差异；

F、数据处理与统计方法：

利用Excel软件、SPSS 22.0软件、DPS软件对试验数据绘制图表、方差分析、相关分析、回归分析及Duncan多重比较。

2.根据权利要求1所述的树兰蒴果60Co-γ射线辐射诱变方法，其特征在于，所述步骤B中，辐射剂量梯度见下表：