CN109984033B - 一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，通过利用重离子束进行诱变，将诱变后的棉花种子覆膜播种，待诱变植株长至2叶1心进行移栽，M1代所有植株进行封花自交处理，成熟后进行单株收获自交铃，采用株系进行播种，M2代植株在生育期内对植株的性状进行分析调查，筛选不同表型变异突变体，按单株收获，并继续按株系种植至获得稳定表型变异的突变体。

Description

一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法

技术领域

本发明涉及棉花突变体，尤其涉及一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法。

背景技术

棉花是我国重要的经济作物之一，不但是纺织工业的重要原料，也是国防、医药等工业的原料，在国民经济体系中占有重要的地位。中国多年来一直是全世界棉花生产和消费大国，而改良棉花品种是提高棉花生产国际竞争力最有效、最根本的途径。棉花种质资源是培育高产优质棉花新品种的物质基础，在棉花育种研究中具有举足轻重的地位。拥有优良的棉花种质越多，研究利用的越广泛，新品种选育的成效就越大，棉花生产的发展就越快。然而，目前我国棉花品种遗传基础狭窄，品种遗传背景同质化现象突出，如何拓宽棉花遗传谱，是棉花品种创新的重要问题之一。

辐射诱变育种可以用来创造遗传性状上的额外变异，获得常规选择育种难以获得的新突变，因而该方法已被用来作为补充现有育种技术的重要工具之一。棉花辐射诱变研究开始于20世纪30年代，我国从20世纪60年代开始主要以γ射线为辐射源对棉花进行研究，并获得了抗草甘膦面花突变体、超鸡脚叶、无棉酚腺体突变体及棉花不育突变体等。随着余增亮等将低能离子束注入技术应用于植物诱变遗传育种后，该技术在棉花新种质创造方面也取得了一定的进展，如纤维品质变化的突变体、棉花矮化突变体等。

目前，棉花辐射育种主要包括以X、γ射线为诱变源的电离辐射获得突变体，以低能离子束辐射(通过离子注入机方式获得)为诱变源获得突变体，以中能离子束辐射(重离子加速器获得)为诱变源获得突变体。X、γ射线传能线密度较低，因而造成X、γ诱变谱相对狭窄，诱变能力低。同时X、γ射线在生物靶体积内其能量的沉积呈现出相对比较均匀的分布，随着剂量的增大，对生物体的损伤加大；而重离子辐射在物质中的射程末端产生相当尖的Bragg峰，使生物体只在峰值处受损伤大而在其他区域受到的影响比较小，可在提高生物体存活率的情况下可获得更多的突变体。

重离子束作为一种新的辐射源，在新种质选育中具有重要的独特地位，该辐射源主要是通过重离子加速器(HIR-FL)将大量重离子加速到很高的速度轰击目标材料并使之产生突变。与其它辐射源相比，具有更高的束流能量和线性能量传递，突变谱更广，重复性更好等特点。目前，该方法已在拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆、各种花卉等作物的改良中发挥了重要的作用。然而，现有技术中还未公开一种涉及利用重离子辐射进行棉花诱变获得突变体的报道。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明的目的在于提出一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，包括以下步骤：

1)选择籽粒饱满的棉花脱绒种子，置于辐射盘中，使种子合点端向上，种柄端向下，利用重离子束进行轰击；

2)将经过辐射的棉花种子清水浸泡过夜，播于基质中，覆膜保墒，待种子萌发出苗后移除地膜；

3)待诱变植株长至2叶1心进行移栽，M1代所有植株进行封花自交处理，待棉花成熟后进行单株收获自交铃；

4)M1代种子收获后，采用株系进行播种，M2代植株在生育期内对植株的性状进行分析调查，筛选不同表型变异突变体，按单株收获，并继续按株系种植至获得稳定表型变异的突变体。

进一步的，步骤(1)中所述的重离子束为¹²C重离子束。

进一步的，步骤(1)中所述的重离子束进行轰击的能量为100Gy、150Gy、200Gy、300Gy或500Gy。

进一步的，步骤(2)中所述的基质由营养土和蛭石组成，营养土和蛭石的质量比为1:1。

进一步的，步骤(3)中对于因诱变造成晚熟不能在当年获得种子的植株，将其移栽至温室至收获单株自交铃种子。

进一步的，步骤(4)中所述的性状为株高、株型、生育期、铃型、育性、叶型、叶色、花型或纤维质量。

本发明的有益效果为：

1)提高诱变效率。棉花具有坚厚的种皮和十分发达且呈折叠状的子叶，以X、γ射线为诱变源的电离辐射或低能离子束注入能级较低，离子束作用到胚芽部位较为困难，若将种皮和子叶去除不仅费时费工，还降低突变体的成活率。本发明选择的重离子束流能量和线性能量传递高，种子无需去掉种子外种皮处理，从而简化了辐射操作流程。同时，保留种子外种皮可以最大程度的提高辐射材料的种子活力。此外，通过基质育苗、温室移栽等手段极大的提高了突变株的成活率，从而提高诱变效率。

2)重离子诱变变异类型更广。采用不同剂量的重离子辐射谱，提高重离子辐射对棉花诱变影响。拓宽了重离子诱变的变异类型。

3)突变体鉴定更准确。性状调查过程中采用增大株距，减少植株间的相互影响，突变体鉴定过程中采用重测序方法，使突变体鉴定更准确。

附图说明

图1是突变体重测序SNP差异统计分析。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明以河北省农林科学院棉花研究所培育的冀172系为实验材料，该品种主要特征特性属转基因抗虫常规棉晚春播品种，全生育期116天，株高104.3厘米，单株果枝数10.2个，第一果枝节位7.3节，单株成铃10.9个，铃重6.0克，衣分40.8％，上半部平均长度28.0毫米，断裂比强度29.1厘牛/特克斯，马克隆值4.6。

¹²C重离子束由中国原子能科学研究院HI-13串列加速器提供，并进行棉花种子辐射。

辐射材料种植于河北省农林科院学院棉花研究所小安舍试验站。

本实施例提供的一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法包括如下步骤：

1、¹²C重离子束诱变剂量

挑选籽粒饱满均匀的冀172系棉花脱绒种子，送至中国原子能科学研究院进行重离子辐射诱变处理，射线能量为87.5MeV，剂量分别为100、150、200、300、500Gy每剂量棉花种子数量相等，且以未辐射的棉花种子作为对照，标识为CK。辐射护理后的种子即为M0代种子。

2、种子发芽及移栽

因辐射诱变处理可使棉花种子的组织及基因组DNA受损，部分种子表现出萌发迟缓、幼苗弱小等现象。因此，将经过¹²C重离子束辐射的棉花种子清水浸泡过夜，将辐射的种子播于营养土：蛭石＝1:1的营养钵(8cm×8cm)中，播种深度为2cm，覆膜保墒，待种子萌发出苗后移除地膜，从而最大程度的提高突变体的出苗率及成株率。种子萌发过程中每周浇1倍的MS营养液，确保种子正常生长，待生长3～4周后即植株2叶1心时移栽至大田，移栽时按计量进行分行播种，株距为50cm，行距为80cm，以减少后期植株间的相互影响。

3、M1代所有植株进行封花自交处理

¹²C重离子束辐射的棉花属于异源四倍体，M1代植株中一些隐性基因突变株不能被观察到，且M1代植株可能受到辐射粒子的机械损伤和基因组DNA的突变双重作用，其生育期内表型差异悬殊，故M1代植株只进行封花自交处理，并按单株收获M1代种子。M2代按照不同剂量处理进行株行种植，由于M2代植株为分离群体，故播种方式为行距80cm，株距50cm，穴播，花期进行封花自交处理，获得M2代种子。

4、性状调查

步骤3中M1代在生育期内长势与对照相比，M1代植株明显矮小，分枝赘芽多，贪青晚熟，结铃少甚至不育，此现象随剂量的增大出现的比例越大。此外，一些棉苗的生长点受到严重损伤后，出苗后不能继续生长。在生长期内一些棉株还出现畸形叶、联体枝、黄花苗等。经统计M1代植株发生表型突变的变异率为11.63％。

步骤3中对M2代群体表型性状进行调查和筛选，具体性状为：

分别在苗期、蕾期、花铃期、和成熟期对植株的田间性状进行调查，系统调查包括生育期、植株形态(株型、株高)、果枝(果枝类型、果枝与主茎夹角)、主茎(茎色、茎毛)、叶(叶形、叶色)、花(花器形态、柱头高度)、铃(铃着生方式、铃形、铃色)、纤维衣分、纤维品质(上半部平均长度、长度整齐度、断裂比强度、断裂伸长率、马克隆值)、抗病性(抗黄萎病、抗枯萎病)、抗虫性(抗棉铃虫、抗棉蚜虫、抗棉盲蝽蟓)等10类25个田农艺性状。

经调查结果显示，经梯度¹²C重离子束辐射诱变后在12580个M2代分离群体中，共有417个单株田间性状发生改变，变异率为3.31％。在调查的突变性状中，生育期、育性和纤维品质变异最丰富分别占突变株的1.12％、0.95％和0.87％(多数植株变异不是一个性状的变异，而是多个性状的综合变异，例如生育期改变同时纤维品质同时改变，因此单个性状的变异率总和要大于总的变异率)。

具体表现类型统计如下：

1)生育期突变体

在M2代¹²C重离子束辐射诱变群体中共发现37株早熟突变株和114株晚熟突变体。与对照相比，早熟突变株生育期提前5-10天，其单株产量和纤维品质均无显著差异；晚熟突变株单株产量高于对照，纤维长度和马克隆值有所提高。

2)植株形态突变体

¹²C重离子束辐射诱变可使棉花株型发生改变，包括植株矮化突变体和株型变异突变体。对照植株株高为94.3cm，而矮化突变体株高为76.2cm。在株型变异方面，对照植株为塔型株型且较为松散，而变异植株有7株为桶型株型且紧凑，6株果枝转变为营养枝株型混乱。

3)铃形突变体

经¹²C重离子束辐射诱变后产生了铃型、铃大小变异突变体。对照铃型为卵圆形，变异植株铃型包括圆形和长卵形，其中圆形铃型突变株5株，长卵形突变株17株；大铃植株3株，小铃植株21株。

4)育性突变体

在¹²C重离子束辐射诱变诱变群体中共发现不育株37株，82株育性显著降低。

5)衣分及纤维品质突变体

¹²C重离子束辐射诱变对棉花衣分、纤维上半部平均长度、纤维断裂比强度、纤维马克隆值(纤维细度，纤维细度在3.7-5.0之间较好，参考NY/T 1426棉花纤维品质评价方法)均有不同程度的影响。如表1结构显示，M2代植株与对照纤维品质相比发生一定改变，其中F2JM-13和F2JM-23单株在纤维上半部平均长度、纤维断裂比强度、纤维马克隆值均比对照有所提高。

表1

5、遗传稳定性调查

为了进一步鉴定¹²C重离子束辐射诱变创制突变体的遗传稳定性，将M2代收获的单株按株行种植，播种方式为行距80cm，株距30cm，条播，记录各生育期变异植株表型变化。调查结果显示，¹²C重离子束辐射诱变在M3代群体中，共有196个变异株系能够稳定遗传。突变稳定性中，以生育期、铃型和纤维品质变异最丰富。其中早熟稳定突变体株系有13个、晚熟突变体株系43个，大铃突变体株系21个、小铃突变体株系33个，纤维品质变异株系58个(优异性状稳定遗传16个，其中在纤维上半部平均长度、纤维断裂比强度、纤维马克隆值均提高的稳定株系有2个，具体见表2)。

表2

6、稳定遗传突变体基因组水平鉴定

对稳定遗传的3个突变体利用重测序技术进行SNP的统计，结果显示突变体差异SNP数量显著高于对照样本(图1)，表明突变体基因组中单核苷酸位点发生了显著变化，从而揭示了重离子辐射可诱导棉花植株染色体结构的变异。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (4)

1.一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）选择籽粒饱满的棉花脱绒种子，置于辐射盘中，使种子合点端向上，种柄端向下，利用重离子束进行轰击，所述的重离子束为¹²C重离子束，所述的重离子束进行轰击的能量为100Gy、150Gy、200Gy、300Gy或500Gy；

2）将经过辐射的棉花种子清水浸泡过夜，播于基质中，覆膜保墒，待种子萌发出苗后移除地膜；

3）待诱变植株长至2叶1心进行移栽，M1代所有植株进行封花自交处理，待棉花成熟后进行单株收获自交铃；

4）M1代种子收获后，采用株系进行播种，M2代植株在生育期内对植株的性状进行分析调查，筛选不同表型变异突变体，按单株收获，并继续按株系种植至获得稳定表型变异的突变体。

2.根据权利要求1所述的一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，其特征在于，所述的基质由营养土和蛭石组成，营养土和蛭石的质量比为1:1。

3.根据权利要求1所述的一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，其特征在于，步骤（3）中对于因诱变造成晚熟不能在当年获得种子的植株，将其移栽至温室至收获单株自交铃种子。

4.根据权利要求1所述的一种利用重离子束诱变获得棉花突变体的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的性状为株高、株型、生育期、铃型、育性、叶型、叶色、花型或纤维质量。

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