CN109819891A - 溪荪组培苗60Co-γ射线辐射诱变育种方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种溪荪组培苗⁶⁰Co‑γ射线辐射诱变育种方法，该方法包括以下步骤：1)组培苗的选择；2)⁶⁰Co‑γ射线辐射处理；3)组培苗突变体初选；4)初选突变体继代增殖培养；5)初选突变体组培苗的生根培养；6)驯化移栽；7)田间种苗突变体筛选；8)扦插繁殖、组培繁殖和人工选择；本发明以溪荪组培苗为材料，利用⁶⁰Co‑γ射线进行诱变处理，观察不同辐射剂量对溪荪组培苗的诱变效应，确定适宜辐射剂量，建立溪荪组培苗⁶⁰Co‑γ射线辐射诱变育种技术，此方法可创造丰富的遗传变异，有效缩短溪荪的育种周期，为新品种选育提供一套简便、高效的方法，拓宽溪荪种质资源的遗传基础。

Description

溪荪组培苗60Co-γ射线辐射诱变育种方法

技术领域

本发明涉及一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法。

背景技术

溪荪(Iris sanguinea)属鸢尾科鸢尾属多年生草本花卉，花蓝紫色、白色，外花被片基部有黑褐色的网状及黄色斑纹，无附属物，在湿地及干旱地均能生长良好，有较强的抗病、抗寒及耐湿能力，溪荪有很高的观赏价值，是园林湿地造景及创造自然野趣的优良材料。我国鸢尾属植物育种工作进展缓慢，研究溪荪育种技术，对丰富鸢尾属植物种质资源、开发利用湿地植物资源具有重要的意义。

辐射诱变主要是通过一定剂量的射线辐射处理材料，从而使材料产生突变，诱发变异，经筛选、测定、选择，最终从变异材料中选育出对科研或生产上有利用价值的新品种育种过程。利用辐射诱变技术进行新品种选育是目前育种领域较为常用且效率较高的技术。γ射线是辐射诱变射线中的一种，在育种工作中辐射条件易于控制且效果显著。其辐射源为⁶⁰Co，是一种中性射线，穿透能力较强，辐射剂量相对均匀且一次能够处理大量的材料，是辐射育种工作的首选；近年来，国内外在辐射诱变领域不断尝试新技术，取得了很大的成就，观赏植物的种子、茎段、扦插苗、盆栽苗、组培苗等都可以作为辐射材料，辐射诱变不仅在辐射效应的研究中占有重要地位，在新品种选育方面也有广泛的应用；

目前已经开展观赏植物菊花、玉簪、月季等组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法及半致死剂量的相关研究，如菊花组培苗半致死剂量为20Gy(李黎，胡金萍.辐射对菊花组培苗生长的影响[J].国土与自然资源研究，2011)；紫萼玉簪组培苗半致死剂量为5Gy(李黎，曲彦婷，陈菲.紫萼玉簪组培苗的辐射育种研究[J].林业科技，2014)；丰花月季组培苗半致死剂量为50Gy(张兴，唐焕伟，车代弟.丰花月季⁶⁰Co-γ辐射育种研究及后代变异的初步分析[J].国土与自然资源研究，2010)；

鸢尾属植物育种途径单一，目前只有自交和远缘杂交等常规育种技术，尚未见溪荪组培苗用于辐射诱变并产生稳定突变体的相关报道。利用溪荪增殖培养阶段的组培苗辐射诱变出突变体，再选出变异性状稳定的诱变新品种，既可以缩短育种年限，又能选育出具有观赏价值和应用价值的新品种；

发明内容

本发明的目的是提供一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，培育优质、抗逆性强、观赏价值高的鸢尾属植物新品种，本方法简便易行，有效缩短了溪荪育种周期，以改善溪荪传统杂交育种周期较长、变异率低的现状。本发明技术方案为一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，该方法包括如下步骤：

1)组培苗的选择：选择增殖培养阶段长势优良的组培瓶苗作为辐射材料；

2)⁶⁰Co-γ射线辐射处理：⁶⁰Co-γ射线辐射处理剂量分别为20Gy、30Gy、40Gy、50Gy，分别对不同组培苗辐射后得到不同剂量辐射处理后组培苗组，记作不同剂量辐射实验组；以未进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理的溪荪组培苗作为对照组；

3)组培苗突变体初选：选取辐射后不同剂量辐射实验组中存活的组，记作存活实验组；将存活实验组和对照组的植株性状进行比较，从所述存活组中选叶片大小、形状、颜色和侧芽数量等性状中至少有一种性状与所述对照组有差异的组培苗，记作初选突变体；

4)初选突变体继代增殖培养：将溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗转接于MS+6BA2.0+KT1.0+NAA0.1培养基上培养4-6周；所述培养基构成为：基本培养基(MS)，附加2.0mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)、1.0mg/L激动素(KT)和0.1mg/L萘乙酸(NAA),每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去1/2叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复增殖培养；培养室内温度为22-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；

5)初选突变体生根培养：当溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗长到2-4cm高度时，即转入生根培养基中，生根培养基构成为：1/2MS+NAA0.2+活性炭，培养适宜温度为23-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，生根培养基(1/2MS+NAA0.2+活性炭)中加入活性炭，提供局部黑暗环境，可缩短生根时间；

6)初选突变体组培苗驯化移栽：待生根培养基中苗根长为0.5-1.0cm，将所述步骤5)的突变体生根苗和步骤5)的对照组生根苗的培养瓶封口膜打开1/2，打开1/2瓶口的生根苗在培养室内驯化1-2天后，撤去封口膜1天，移栽至装好已消毒珍珠岩的苗盘中，浇透水，置于室温20-25℃、空气相对湿度50-80％的室内环境，10天后扎根，约30天进行田间种植；

7)田间种苗突变体筛选：将步骤6)的初选突变体移栽苗与步骤6)的对照组移栽苗的田间性状进行比较，筛选植株叶片大小、叶状、叶色、侧芽数量、花色、花径、花朵形态、株高等性状中至少一种性状与对照组种苗有差异的辐射移栽苗，即为目标突变体；

8)扦插繁殖、组培繁殖和人工选择：在田间观测初选突变体移栽苗和对照组移栽苗在叶片、花朵、株高、侧芽数量等性状上的差异，筛选出观赏价值、应用价值高的突变体，利用扦插、组培等无性繁殖方式进行种苗扩繁，田间种植后观测其突变性状的稳定性，经过2次以上无性繁殖并栽培后，其性状未发生改变的即为诱变新品种；

发明原理

本发明针对目前溪荪育种还处于引种试验自然筛选和田间杂交方式的不足，在常规育种和其他单源诱变育种中，嵌合体是发现和筛选突变体的主要障碍，而组织培养离体技术可以有效地克服这种困难，提高突变体的显现率，减少嵌合突变体产生的频率，能使诱变、选择、快繁同时进行，使诱变技术更为有效；提供一种具有独特优势的组织培养和辐射相结合的育种方式，可实现对溪荪新品种选育，提高溪荪育种的效率，拓宽⁶⁰Co-γ射线诱变育种的应用范围；

发明依据辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，分子结构的改变又影响到细胞内的一些生化过程，尤其是染色体损伤，由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异，那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异，补充完善现有常规溪荪育种技术中突变频率低，变异幅度和变异范围小、育种周期相对较长的技术局限；

技术效果

本发明以溪荪增殖培养阶段的组培苗为材料，利用⁶⁰Co-γ射线辐照处理，得到初选突变体，经过2次以上无性繁殖并栽培，其表型性状未发生改变即为获得的诱变新品种；

20Gy辐射处理后组培苗的成活率为90％，变异率为1％；30Gy辐射处理后组培苗的成活率为85％，变异率约为1-2％；40Gy辐射处理后组培苗的成活率为60％，变异率约为12％；50Gy辐射处理后组培苗的成活率为45％，变异率约为22％；

以溪荪组培苗作为辐射育种的材料是因为组培苗具有较强的分化和形成新组织、器官的能力，组织培养技术的介入可以节约人力和物力，短时间内得到大量植株群体，扩大选择范围；

在目前辐射育种中较为公认的适宜剂量是半致死剂量，在本发明中溪荪以叶片、花朵、株高、侧芽数量等性状上的差异性状变异作为育种目标时，认为其适宜剂量或能诱发叶片、花朵、株高、侧芽数量等性状的明显变异量高于半致死剂量，从育种目标变异性状水平可以认为溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射的适宜剂量约为50Gy；

本发明筛选出的溪荪组培苗生长的培养基中，激素水平与辐射效应的交互作用对组培苗离体组织具有一定程度的辐射敏感性，离体组织对辐射的敏感性提高，可以大大提高突变频率，扩大变异幅度和变异范围，加速变异稳定，缩短育种周期；

综上所述，在溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法中，组织培养阶段既可改变遗传重组的频率，也可以改变其分布，不同于常规育种和诱变育种，有可能产生新的变异，利用组培苗具有较强的分化和形成新组织、新器官的能力特点，以⁶⁰Co-γ射线辐射剂量高于半致死剂量的50Gy作为适宜辐射剂量，采取组织培养和辐射相结合的育种方式，实现提高育种突变频率，扩大变异幅度和变异范围，加速变异稳定，缩短育种周期，因此，组培技术与辐射两种不同变异来源的复合效应可以作为培育溪荪新型种质资源的有效途径，这也是本发明比对于常规育种及目前应用的单源辐射育种方法的优势所在；

具体实施方式：

溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，包括如下步骤：

1)组培苗的选择：选择增殖培养阶段长势优良的组培瓶苗作为辐射材料；

2)⁶⁰Co-γ射线辐射处理：⁶⁰Co-γ射线辐射处理剂量分别为20Gy、30Gy、40Gy、50Gy，分别对不同组培苗辐射后得到不同剂量辐射处理后组培苗组，记作不同剂量辐射实验组；以未进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理的溪荪组培苗作为对照组；

3)组培苗突变体初选：选取辐射后不同剂量辐射实验组中存活的组，记作存活实验组；将存活实验组和对照组的植株性状进行比较，从所述存活组中筛选叶片大小、形状、颜色和侧芽数量等性状中至少有一种性状与所述对照组有差异的组培苗，记作初选突变体；

4)初选突变体继代增殖培养：将溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗转接于MS+6BA2.0+KT1.0+NAA0.1培养基上培养4-6周；所述培养基构成为：基本培养基(MS)，附加2.0mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)、1.0mg/L激动素(KT)和0.1mg/L萘乙酸(NAA),每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去1/2叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复增殖培养；培养室内温度为22-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；

5)初选突变体生根培养：当溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗长到2-4cm高度时，即转入生根培养基中，生根培养基构成为：1/2MS+NAA0.2+活性炭，培养适宜温度为23-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，生根培养基(1/2MS+NAA0.2+活性炭)中加入活性炭，提供局部黑暗环境，可缩短生根时间；

6)初选突变体组培苗驯化移栽：待生根培养基中苗根长为0.5-1.0cm，将所述步骤5)的突变体生根苗和步骤5)的对照组生根苗的培养瓶封口膜打开1/2，打开1/2瓶口的生根苗在培养室内驯化1-2天后，撤去封口膜1天，移栽至装好已消毒珍珠岩的苗盘中，浇透水，置于室温20-25℃、空气相对湿度50-80％的室内环境，10天后扎根，约30天进行田间种植；

7)田间种苗突变体筛选：将步骤6)的初选突变体移栽苗与步骤6)的对照组移栽苗的田间性状进行比较，筛选植株叶片大小、叶状、叶色、侧芽数量、花色、花径、花朵形态、株高等性状中至少一种性状与对照组种苗有差异的辐射移栽苗，即为目标突变体；

8)扦插繁殖、组培繁殖和人工选择：在田间观测初选突变体移栽苗和对照组移栽苗在叶片、花朵、株高、侧芽数量等性状上的差异，筛选出观赏价值、应用价值高的突变体，利用扦插、组培等无性繁殖方式进行种苗扩繁，田间种植后观测其突变性状的稳定性，经过2次以上无性繁殖并栽培后，其性状未发生改变的即为诱变新品种；

此方法能够显著提高溪荪组培苗的变异率，缩短育种年限，为选育出具有观赏价值和应用价值的新品种提供了高效、简便的方法；

所述的一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，其特征是：所述的对溪荪组培瓶苗进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理，筛选出适宜的辐射剂量为50Gy，辐射剂量率为5Gy/h；初步筛选组培苗突变体，通过组培繁殖的继代培养扩繁辐射苗，通过生根培养，驯化移栽时间为30天，在田间从叶、花、植株等性状与未辐射苗进行比较，筛选突变体，突变体经两次无性繁殖栽培后变异性状稳定的即为新品种；组培繁殖使用的基本培养基(MS)，包括大量元素、微量元素、有机物和铁盐，大量元素由质量-体积浓度为1900mg/L的硝酸钾(KNO3)、440mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、370mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H2O)、1650mg/L的硝酸铵(NH₄NO₃)、170mg/L的磷酸二氢钾(KH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量-体积浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)、6.2mg/L的硼酸(H₃BO₃)、8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO₄·2H₂O)、0.025mg/L的硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)、0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)、0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，有机物由质量-体积浓度为0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.4mg/L的盐酸硫胺素、2mg/L的甘氨酸、100mg/L的肌醇组成，铁盐由质量-体积浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)加热螯合组成混合液，蔗糖质量-体积浓度30g/L，琼脂粉质量-体积浓度5g/L，pH值为5.8～6.0；所述的生根培养基1/2MS为基本培养基MS中的大量元素减半。

Claims (2)

1.一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，其特征是：该方法包括如下步骤：

1)组培苗的选择：选择增殖培养阶段长势优良的组培瓶苗作为辐射材料；

2)⁶⁰Co-γ射线辐射处理：⁶⁰Co-γ射线辐射处理剂量分别为20Gy、30Gy、40Gy、50Gy，分别对不同组培苗辐射后得到不同剂量辐射处理后组培苗组，记作不同剂量辐射实验组；以未进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理的溪荪组培苗作为对照组；

3)组培苗突变体初选：选取辐射后不同剂量辐射实验组中存活的组，记作存活实验组；将存活实验组和对照组的植株性状进行比较，从所述存活组中筛选叶片大小、形状、颜色和侧芽数量等性状中至少有一种性状与所述对照组有差异的组培苗，记作初选突变体；

4)初选突变体继代增殖培养：将溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗转接于MS+6BA2.0+KT1.0+NAA0.1培养基上培养4-6周；所述培养基构成为：基本培养基(MS)，附加2.0mg/L 6-苄胺基嘌呤(6-BA)、1.0mg/L激动素(KT)和0.1mg/L萘乙酸(NAA),每个外植体萌发出4-8个小侧芽；切取新长出的侧芽，去1/2叶片后插入增殖培养基中，若需大量繁殖，可进行重复增殖培养；培养室内温度为22-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)；

5)初选突变体生根培养：当溪荪初选突变体组培苗和对照组组培苗长到2-4cm高度时，即转入生根培养基中，生根培养基构成为：1/2MS+NAA0.2+活性炭，培养适宜温度为23-25℃，光照12小时/天，黑暗12小时/天，光照强度为1800-2000勒克斯(Lux)，培养1-2周，生根培养基(1/2MS+NAA0.2+活性炭)中加入活性炭，提供局部黑暗环境，可缩短生根时间；

6)初选突变体组培苗驯化移栽：待生根培养基中苗根长为0.5-1.0cm，将所述步骤5)的突变体生根苗和步骤5)的对照组生根苗的培养瓶封口膜打开1/2，打开1/2瓶口的生根苗在培养室内驯化1-2天后，撤去封口膜1天，移栽至装好已消毒珍珠岩的苗盘中，浇透水，置于室温20-25℃、空气相对湿度50-80％的室内环境，10天后扎根，约30天进行田间种植；

7)田间种苗突变体筛选：将步骤6)的初选突变体移栽苗与步骤6)的对照组移栽苗的田间性状进行比较，筛选植株叶片大小、叶状、叶色、侧芽数量、花色、花径、花朵形态、株高等性状中至少一种性状与对照组种苗有差异的辐射移栽苗，即为目标突变体；

8)扦插繁殖、组培繁殖和人工选择：在田间观测初选突变体移栽苗和对照组移栽苗在叶片、花朵、株高、侧芽数量等性状上的差异，筛选出观赏价值、应用价值高的突变体，利用扦插、组培等无性繁殖方式进行种苗扩繁，田间种植后观测其突变性状的稳定性，经过2次以上无性繁殖并栽培后，其性状未发生改变的即为诱变新品种。

2.根据权利要求1所述的一种溪荪组培苗⁶⁰Co-γ射线辐射诱变育种方法，其特征是：所述的对溪荪组培瓶苗进行⁶⁰Co-γ射线辐射处理，辐射剂量为20Gy、30Gy、40Gy、50Gy，辐射剂量率为5Gy/h；初步筛选组培苗突变体，通过组培繁殖的继代培养扩繁辐射苗，通过生根培养，驯化移栽时间为30天，在田间从叶、花、植株等性状与未辐射苗进行比较，筛选突变体，突变体经两次无性繁殖栽培后变异性状稳定的即为新品种；组培繁殖使用的基本培养基(MS)，包括大量元素、微量元素、有机物和铁盐，大量元素由质量-体积浓度为1900mg/L的硝酸钾(KNO₃)、440mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)、370mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、1650mg/L的硝酸铵(NH₄NO₃)、170mg/L的磷酸二氢钾(KH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量-体积浓度为22.3mg/L的硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)、6.2mg/L的硼酸(H₃BO₃)、8.6mg/L的硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、0.25mg/L的钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、0.025mg/L的硫酸铜(CuSO4·5H2O)、0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)、0.83mg/L的碘化钾(KI)组成，有机物由质量-体积浓度为0.5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.4mg/L的盐酸硫胺素、2mg/L的甘氨酸、100mg/L的肌醇组成，铁盐由质量-体积浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)加热螯合组成混合液，蔗糖质量-体积浓度30g/L，琼脂粉质量-体积浓度5g/L，pH值为5.8～6.0；所述的生根培养基1/2MS为基本培养基MS中的大量元素减半。