MXPA02006021A - Construcciones novedosas para expresion vegetal. - Google Patents

Construcciones novedosas para expresion vegetal.

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MXPA02006021A
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Abstract

La presente invencion se refiere a construcciones novedosas para expresion vegetal; mas especificamente la presente invencion provee construcciones de ADN que comprende secuencia reguladoras hacia 5' para modular la expresion de los genes operativamente unidos en plantas.

Description

CONSTRUCCIONES NOVEDOSAS PARA EXPRESIÓN VEGETAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente ¡nvención se refiere al aislamiento y uso de moléculas de ácido nucleico para el control de la expresión génica en plantas, específicamente promotores vegetales novedosos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Uno de los objetivos de la ingeniería genética de plantas es producir plantas con características o rasgos agronómicamente importantes. Los avances recientes en la ingeniería genética han provisto las herramientas requeridas para producir plantas transgénicas que contienen y expresan genes externos (Kahl et al., World J. of Microbiol. Biotech. 11 : 449- 460, 1995). Los rasgos o cualidades de interés particularmente deseables para la ingeniería genética de plantas podrían incluir pero no se limitan a la resistencia a insectos, enfermedades fúngales, y otras placas o agentes que ocasionan enfermedad, tolerancia a herbicidas, estabilidad o vida de anaquel mejorada, tolerancia ambientales, y mejorías nutricionales. Los avances tecnológicos en la transformación y regeneración vegetal han capacitado a los investigadores para tomar ADN exógeno, tal como un gen o genes a partir de una fuente heteróloga o una fuente nativa, e incorporar el ADN exógeno , AJ .-- AA .. AA.».,.^. A - A .,„- ^ ? kk..^. , A A. A — A -AAA -.. - . .. AA-A,.. ^ -'-^gfífjJ^J^g^l^ dentro del genoma de la planta. En un método, la expresión de un gen novedoso que normalmente no se expresa en una planta o tejido vegetal particular puede conferir un efecto fenotípico deseado. En otro método, la transcripción de un gen o parte de un gen en una orientación antisentido puede producir el efecto deseable mediante la prevención o inhibición de la expresión de un gen endógeno. Con el objeto de producir una planta transgénicas, una construcción que incluye una secuencia de gen heterólogo que confiere un fenotipo deseado cuando se expresa en la planta se introduce dentro de una célula vegetal. La construcción también incluye un promotor vegetal que está operativamente unido a la secuencia del gen heterólogo, frecuentemente un promotor que no está normalmente asociado con el gen heterólogo. La construcción entonces se introduce dentro de una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada, y la célula vegetal transformada se regenera hacia una planta transgénica. El promotor controla la expresión de la secuencia de ADN introducida a la cual el promotor está operativamente unido y por lo tanto afecta la característica deseada conferida por la secuencia de ADN. Podría ser ventajoso tener una variedad de promotores para dirigir la expresión génica de tal manera que un gen o gen(es) se transcriba eficientemente el tiempo adecuado durante el crecimiento y desarrollo vegetal, en la ubicación óptima en la planta, y en la cantidad necesaria para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la expresión constitutiva de un producto génico puede ser benéfica en una ubicación de la planta pero menos benéfica en otra parte de la planta. En otros casos, podría ser benéfico tener un producto génico producido a una cierta etapa de desarrollo de la planta o en respuesta a ciertos estímulos ambientales o químicos. El desarrollo comercial de germoplasmas genéticamente mejorados también ha avanzado a la etapa de introducción de múltiples rasgos dentro de plantas de cosechas, frecuentemente referidos como método de apilamiento de genes. En este método, múltiples genes que confieren diferentes características de interés pueden introducirse dentro de una planta. Es importante cuando se introducen múltiples genes dentro de una planta que cada gen se manipule o controle para la expresión óptima y que los elementos reguladores sean diversos con el objeto de reducir el potencial de efecto de silecio del gen. A la luz de estas y otras consideraciones, es aparente que el control óptimo de la expresión del gen y la diversidad del elemento regulador son importantes en la biotecnología vegetal.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a construcciones de expresión de ADN vegetal que comprenden secuencias de promotores de actina de Arabidopsis (Act) Actla, Actlb y la secuencia del promotor del factor de elongación 1a (EF1a), y fragmentos y elementos cis derivados a partir de «.. „. <» .- ., . . ,.- ,,,- *„ ... *&• *+ . . ***».!> ^. ^ ^^í . í .ét ?ié estos promotores operativamente unidos a la secuencias del gen estructural heterólogo que funciona en las células de plantas de cosechas. Por lo tanto, de conformidad con una modalidad de la ¡nvención, una construcción de ADN recombinante se provee que comprende, en una forma operativamente unido, un promotor que es funcional en una célula de una planta de cosecha, el promotor comprendiendo: al menos un elemento cis derivado a partir de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23; una secuencia de ADN estructural heteróloga al promotor; y una región no traducida hacia 3' que funciona en las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN. Por ejemplo, el promotor puede consistir esencialmente de una región reguladora hacia 5' derivada partir de cualesquiera de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23 (incluyendo o excluyendo cualquier secuencia de intrón localizado en éstas). El gen estructural puede comprender cualquier secuencia nucleotídica heteróloga en donde la expresión de la secuencia resulta en un rasgo o producto agronómicamente útil en una planta de cosecha transgénica. De conformidad con otro aspecto de la ¡nvención es una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN estructural operativamente unida a las secuencias de promotores de la presente ¡nvención que codifican una proteína empleada para conferir tolerancia a herbicidas a una planta de cosecha. Esta proteína para tolerancia de herbicida incluye, pero no se limita a genes de proteína para tolerancia a glifosato tales 11 ?? r ni [íim^^ ^^r^ü fa como el gen de la EPSP resistente a glifosato sólo, o en combinación con uno o más genes de proteínas para degradación de glifosato. De conformidad con otra modalidad de la invención, las construcciones de ADN tales como aquellas descritas anteriormente se proveen en donde el promotor es un promotor híbrido o quimérico que comprende al menos un elemento cis derivada partir de una o más de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 operativamente unidas a una secuencia heteróloga del promotor tal como un promotor de virus de coliflor, por ejemplo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor o el promotor del virus del mosaico de la higuera. De conformidad con otra modalidad de la invención, las construcciones de ADN, tales como aquellas descritas anteriormente, se provee en tándem, en donde el promotor es un promotor híbrido o quimérico que comprende al menos un elemento cis derivada partir de una o más de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23.SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 operativamente unidas a una secuencia heteróloga del promotor que se expresa en las células vegetales transgénicas de cosechas. Las secuencias de promotores quiméricos más específicamente comprenden las secuencias identificadas en SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30.
De conformidad con otra modalidad de la invención, una construcción de ADN tal como aquella descrita anteriormente se provee en donde la secuencia de ADN estructural es un gen de tolerancia a glifosato, de tal manera que cuando la construcción de ADN se introduce dentro de una célula vegetal, ésta confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que incluye al menos 50 gramos de equivalentes de ácido por litro (g e.a./l) de glifosato. En otras modalidades relacionadas, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a las formulaciones de glifosato que tienen concentraciones mayores de glifosato (por ejemplo, al menos 300 gramos de equivalentes de ácido por litro de glifosato). De conformidad con una modalidad, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de Roundup Ultra® a una relación de 473 ml por 4000 metros cuadrados, por ejemplo, y en otras modalidades, la tolerancia a glifosato se extiende de una a dos o más aplicaciones de 473 ml por 4000 metros cuadrados, 946 ml por 4000 metros cuadrados, o 1892 ml por 4000 metros cuadrados, por ejemplo. De conformidad con otra modalidad de la invención, las plantas de cosechas transgénicas se proveen que se transforman con una construcción de ADN como se describió anteriormente, incluyendo especies monocotiledóneas y especies dicotiledóneas. Los inventores han descubierto que los promotores de actina de Arabidopsis y de EF1a de Arabidopsis son suficientemente activos en otras especies vegetales de cosechas tales como algodón, tomate, y girasol, por ejemplo, que cuando se utilizan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato, tal como aroA:CP4, las plantas toleran las relaciones de aplicaciones comerciales de glifosato, exhibiendo buena tolerancia vegetativa y bajo daño a los tejidos reproductivos. Dichos promotores también pueden utilizarse para expresar otros genes de 5 interés en plantas, incluyendo, pero no limitándose a, genes que confieren tolerancia a herbicidas, control de insectos, resistencia a enfermedades, estabilidad o vida de anaquel incrementada, mejoría nutricional, expresión de un producto farmacéutico o de otro producto polipeptídico deseado, o un cambio deseable en la fisiología o morfología vegetal, y otros. 10 De conformidad con otra modalidad de la invención, las plantas de cosechas transgénicas se proveen las cuales están transformadas con múltiples construcciones de ADN que comprenden los promotores de actina de Arabidopsis y de EF1a de Arabidopsis que son suficientemente activos en otras especies vegetales tales como en el algodón, tomate, girasol, por 15 ejemplo, que cuando se utilizan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato tal como aroA:CP4, las plantas toleran las relaciones de aplicaciones comerciales de glifosato, exhibiendo buena tolerancia vegetativa y bajo daño a los tejidos reproductivos. Dichos promotores también pueden utilizarse para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero no 20 limitándose a, genes que confieren tolerancia a herbicidas, control de insectos, resistencia a enfermedades, estabilidad o vida de anaquel incrementada, mejoría nutricional, expresión de un producto farmacéutico o de ü ?kmb~?klál±. . -. , k -~. » faj. , .. &jJ.aa-,A > .A, .».,, .„ ._. {¡¡tÁ £ ^ ~r .kAx^i?á^ ? ^ ft ¡ j 1 * ,í ¡Üilirfilflllii otro producto polipeptídico deseado, o un cambio deseable en la fisiología o morfología vegetal, y otros. De conformidad con otra modalidad de la invención, se proveen plantas de cosechas transgénicas están transformadas con construcciones de ADN que comprenden los promotores de actina de Arabidopsis y de EF1a de Arabidopsis como moléculas de ADN quiméricas en fusión con moléculas de ADN del virus de la coliflor que tienen actividad del promotor en plantas que son suficientemente activos en otras especies vegetales tales como algodón, tomate, cañóla, soya, y girasol, por ejemplo, que cuando se utilizan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato tal como aroA:CP4, las plantas toleran las relaciones de aplicaciones comerciales de glifosato, exhibiendo buena tolerancia vegetativa y bajo daño a los tejidos reproductivos. Dichos promotores también pueden utilizarse para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero no limitándose a, genes que confieren tolerancia a herbicidas, control de insectos, resistencia a enfermedades, estabilidad o vida de anaquel incrementada, mejoría nutricional, expresión de un producto farmacéutico o de otro producto polipeptídico deseado, o un cambio deseable en la fisiología o morfología vegetal, y otros. De conformidad con otra modalidad de la ¡nvención se proveen los métodos para expresar una secuencia de ADN estructural en una planta. Dichos métodos comprenden, proveen una construcción de ADN como se describió anteriormente, introduciendo la construcción de ADN dentro de una célula vegetal, y regenerando la célula vegetal para producir una planta de tal manera que el ADN estructural se expresa en la planta. De conformidad con una modalidad relacionada, se proveen un método para controlar maleza en las que la construcción de ADN comprende un gen de tolerancia a glifosato y se aplica a una planta aansformada de cosecha con la construcción de ADN una cantidad de glifosato que suficiente para controlar maleza sin dañar significativamente la planta de cosecha.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es un mapa plasmídico de pCGN8086 La figura 2es un mapa plasmídico de pMON45325 La figura 3 es un mapa plasmídico de pMON45331 La figura 4 es un mapa plasmídico de pMON45332 La figura 5 es un mapa plasmídico de pCGN9190 La figura 6 es un mapa plasmídico de pCGN9153 La figura 7 es un mapa plasmídico de pCGN8099 La figura 8 es un mapa plasmídico de pCGN8088 La figura 9 es un mapa plasmídico de pCGN8068 La figura 10 es un mapa plasmídico de pCGN8096 La figura 11 es un mapa plasmídico de pCGN9151 La figura 12 es un mapa plasmídico de pMON10156 La figura 13 es un mapa plasmídico de pMON52059 La figura 14 es un mapa plasmídico de pMON54952 ili" ?rf? T •?ij[r'n?vn > 'i? ¡^^^?^^t^a^^^^ki^táu ?^á^ítlá^ MßM t?l?iá ^A ii?á La figura 15 es un mapa plasmídico de pMON54953 La figura 16 es un mapa plasmídico de pMON54954 La figura 17 es un mapa piasmídico de pMON54955 La figura 18 es un mapa plasmídico de pMON54956 BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIA SEQ ID NO: 1 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Act2 SEQ ID NO: 2 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Act2 SEQ ID NO: 3 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Act8 SEQ ID NO: 4 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Act8 SEQ ID NO: 5 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Acti 1 SEQ ID NO: 6 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Acti 1 SEQ ID NO: 7 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor EF1 SEQ ID NO: 8 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor EF1 SEQ ID NO: 9 es la secuencia del promotor Act2 incluyendo la secuencia ¡ntrónica del gen Act2. Las posiciones de las bases 1- 764 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 765- 1215 representan el intrón seguido por 5 bases de la región no transcrita hacia 5' (UTR 5') antes del ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de la base 597. SEQ ID NO: 10 es la secuencia del promotor Act8 incluyendo el primer intrón del gen Act8. Las posiciones de las bases 1- 797 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 798- 1259 representan el intrón seguido por 10 bases de UTR 5' antes del ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de la base 646. SEQ ID NO: 11 es la secuencia del promotor Acti 1 incluyendo el primer intrón del gen Act11. Las posiciones de las bases 1- 1218 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 1219- 1381 representan el intrón seguido por 10 bases de UTR 5' antes del ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de la base 1062. SEQ ID NO: 12 es la secuencia del promotor EF1 incluyendo el primer intrón del gen EF1. Las posiciones de las bases 1- 536 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 537- 1137 representan el intrón seguido por 22 bases de UTR 5' antes del ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de la base 481. SEQ ID NO: 13 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Acti a SEQ ID NO: 14 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Acti b SEQ ID NO: 15 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Actla y Actlb SEQ ID NO: 16 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Act3 SEQ ID NO: 17 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Act3 SEQ ID NO: 18 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Act7 SEQ ID NO: 19 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Act7 SEQ ID NO: 20 es el iniciador de PCR hacia adelante utilizado para el aislamiento del promotor Acti 2 SEQ ID NO: 21 es el iniciador de PCR reverso utilizado para el aislamiento del promotor Acti 2 SEQ ID NO: 22 es la secuencia del promotor Actla incluyendo el primer intrón del gen Actla. Las posiciones de las bases 1- 1033 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 1034- 1578 representan el intrón y UTR 5'. SEQ ID NO: 23 es la secuencia del promotor Acti b incluyendo el primer intrón del gen Actlb. Las posiciones de las bases 1- 914 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 915- 1468 representan el intrón y la secuencia UTR 5'. SEQ ID NO: 24 es la secuencia del promotor Act3 incluyendo el primer intrón del gen Act3. Las posiciones de las bases 1- 1023 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 1024- 1642 representan el intrón y la secuencia UTR 5'. SEQ ID NO: 25 es la secuencia del promotor Act7 incluyendo el primer intrón del gen Act7. Las posiciones de las bases 1- 600 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 601- 1241 representan el intrón y la secuencia UTR 5'. SEQ ID NO: 26 es la secuencia del promotor Acti 2 incluyendo el primer intrón del gen Act12. Las posiciones de las bases 1- 1017 representan la secuencia del promotor; las posiciones de las bases 1018- 1313 representan el intrón y la secuencia UTR 5'. SEQ ID NO: 27 es la secuencia del promotor quimérico FMV- Act1 1 incluyendo el primer intrón del gen Acti 1. Las posiciones de las bases 1- 536 representan la secuencia del promotor FMV; las posiciones de las bases 553- 1946 representan el promotor 11 de actina de Arabidopsis, intrón y la secuencia UTR 5*. SEQ ID NO: 28 es la secuencia del promotor quimérico FMV- EF1a incluyendo el primer intrón del gen EF1a. Las posiciones de las bases 1- 536 representan la secuencia del promotor FMV; las posiciones de las bases 553- 1695 representan el promotor EF1a, intrón y la secuencia UTR 5'.
SEQ ID NO: 29 es la secuencia del promotor CaMV-Act8 incluyendo el primer intrón del gen Actd. Las posiciones de las bases 1- 523 representan la secuencia del promotor CaMV; las posiciones de las bases 534- 1800 representan el promotor Actd, intrón y la secuencia UTR 5'. SEQ ID NO: 30 es la secuencia del promotor CaMV-Act2 incluyendo el primer intrón del gen Act2. Las posiciones de las bases 1- 523 representan la secuencia del promotor CaMV; las posiciones de las bases 534- 1742 representan el promotor Act2, intrón y la secuencia UTR 5'.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta solicitud que reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A: No. 60/171 , 173, presentada el 12/16/99. Las siguientes definiciones y métodos se proveen para una mejor definición, y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente invención. A menos que se mencione otra manera, los términos se deben de entender de conformidad con el uso convencional por aquellos expertos en la técnica relevante. La nomenclatura de las bases de ADN como se establece en 37 CFR ?1. 822 se utiliza. Se utiliza la nomenclatura estándar de una y de tres letras para los residuos de aminoácidos. "(Secuencia de) ácido nucleico" o "(secuencia de) polinucleótido" se refiere a ADN o ARN de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxinucleotídicas o ribonucleotídicas, respectivamente, que se lee ÍA a partir del extremo 5' (corriente arriba) hacia el extremo 3' (corriente abajo). El ácido nucleico puede representar la hebra sentido o complementaria (antisentido). "Nativa" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que ocurre 5 de manera natural ("tipo silvestre"). Secuencia "heteróloga " se refiere una secuencia que se origina a partir de una fuente o especie externa o, si es a partir de la misma fuente, ésta modificada a partir de su forma original. Una secuencia de ácido nucleico "aislada" está substancialmente ío separada o purificada a partir de las secuencias de ácidos nucleicos con las cuales los ácidos nucleicos se asocian normalmente en la célula del organismo en el que el ácido nucleico ocurre de manera natural, es decir, otro ADN cromosomales o extracromosomal. El término considera ácidos nucleicos que están bioquímicamente purificados de manera que se remueven 15 sustancialmente los ácidos nucleico contaminantes y otros componentes celulares. El término también considera ácidos nucleico recombinante y ácidos nucleicos sintetizados químicamente. El término "substancialmente purificada", como se utiliza la presente invención, se refiere a una molécula separada a partir de otras 20 moléculas que normalmente están asociadas con ésta en su estado nativo. Más preferiblemente, una molécula substancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula substancialmente purificada puede estar más que al 60% libre, preferiblemente 75% libre, más preferiblemente 90% libre a partir de otras moléculas (sin excluir el solvente) presentes en la mezcla natural. El término "substancialmente purificada" no se pretende que abarque moléculas presentes en su estado nativo. Una primera secuencia de ácido nucleico exhibe "identidad substancial" a una secuencia de ácido nucleico de referencia sí, cuando se alinean óptimamente (con las inserciones o deleciones apropiadas de nucleótidos haciendo un total de menos del 20 por ciento de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay al menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia nucleotídica, preferiblemente al menos aproximadamente 80% de identidad, más preferiblemente al menos aproximadamente 85% de identidad, y más preferiblemente al menos aproximadamente 90% de identidad sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 posiciones de nucleótidos, más preferiblemente de al menos 100 posiciones de nucleótidos, y más preferiblemente sobre la longitud total del primer ácido nucleico. El alineamiento óptimo de las secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo mediante el algoritmo local de homología de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981 ; mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; preferiblemente mediante las implementaciones computarizadas de los algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA) en the Wisconsin Genetics Software Package Reléase 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl. El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud total o una porción de una molécula más larga. Alternativamente dos ácidos nucleicos tienen una 5 identidad substancial si uno hibrida con el otro bajo condiciones severas, como se define a continuación. Una primera secuencia de ácido nucleico esta "operativamente unida" con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias se arreglan de manera que la primera secuencia de ácido nucleico afecta la ío función de la segunda secuencia de ácido nucleico. Preferiblemente, las dos secuencias son parte de una única molécula contigua de ácido nucleico y más preferiblemente son adyacentes. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a un gen si el promotor regula o media la transcripción del gen en una célula. 15 Un ácido nucleico "recombinante" se elabora mediante la combinación artificial de dos segmentos de secuencia que de otra manera están separados, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de los segmentos aislados de los ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética. Las técnicas para la manipulación del ácido 20 nucleico se conocen bien (véase por ejemplo Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: volumen 1 , Analyzing DNA, (1997), volumen 2, *¿ k »ki¡ai?a»k-kplk .* íi ¡j itljí?¡? Detecting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, New York). Los métodos para la síntesis química de ácidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22: 1859- 1862, 1981 , y Matteucci et al., J. Am. Soc. 103: 3185, de 981. La síntesis química de los ácidos nucleicos puede llevarse a cabo, por ejemplo, sobre sintetizadores automatizados de oligonucleótidos disponibles comercialmente. Una "secuencia de ácido nucleico sintético" puede diseñarse y sintetizarse químicamente para expresión mejorada en células hospederas particulares y para los propósitos de clonación dentro de construcciones apropiadas. La células hospederas frecuentemente exhiben un patrón preferido de uso de codón (Murray et al., 1989). Los ADN sintéticos se diseñan para mejorar la expresión en un hospedero particular que por lo tanto debe reflejar el patrón de uso de codón en la célula hospedera. Los programas de computadora están disponibles para estos propósitos incluyendo pero no limitados a los programas "BestFit" o "Gap" del Sequence Analysis Software Package, Genetics Computer Group, Inc., Centro Biotecnológico de la Universidad de Wisconsin, Madison, Wl 53711. "Amplificación" de ácidos nucleicos o "reproducción de ácido nucleico" se refiere la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico y se lleva a cabo utilizando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Una variedad de métodos amplificación se conocen en la técnica y se describen, entre otros, que las patentes de E.U.A. Nos. 4, r¿sx ...¿M7an 683, 195 y 4, 683, 202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al., Academic Press, San Diego, 1990. En el PCR, un iniciador se refiere a una secuencia corta definida de oligonucleótido la cual se fija a un molde de ADN para iniciar la reacción en cadena de la polimerasa. "Transformada", "transfectadas", o "transgénica" se refiere a una célula, tejido, órgano, un organismo dentro del cual se ha introducido un ácido nucleico externo, tal como una construcción recombinante. Preferiblemente, el ácido nucleico introducido se integra dentro del ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo recipiente de tal manera que el ácido nucleico introducido se hereda a la progenie subsecuente. Una célula u organismo "transgénico" o "transformado" también incluye a la progenie de la célula o del organismo y a la progenie producida a partir un programa de entrecruza que emplea dicha planta "transgénica" como un parental en una cruza y exhibe un fenotipo alterado que resulta a partir de la presencia de una construcción recombinante o construcción. El término "gen" se refiere a ADN cromosomal, ADN plasmídico, ADNc, ADN sintético, o a otros ADN que codifican un péptido, polipéptido, proteínas, o una molécula de ARN, y las regiones flanqueantes de la secuencia codificante implicadas en la regulación de la expresión. Algunos genes pueden transcribirse hacia ARNm y traducirse hacia polipéptidos (genes estructurales); otros genes pueden transcribirse hacia ARN (por ejemplo ARNr, ARNt); y otros tipos de genes funcionan como reguladores de la expresión (genes reguladores).
"--—— A- "~ '-' • -tümiiaH" --^-^-•"«^^--'^^^fc-^^^^ La "expresión" de un gen se refiere a la transcripción de un gen para producir el ARNm correspondiente y la traducción de este ARNm para producir el producto génico correspondiente, es decir, un péptido, polipéptido, o proteínas. La expresión del gen se controla o se modula mediante los 5 elementos reguladores incluyendo elementos reguladores hacia el extremo 5' tales como promotores. El "componente genético" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o elemento genético el cual también puede ser un componente o parte de una construcción de expresión. Los ejemplo de los componentes ío genéticos incluyen, pero no se limitan a regiones de promotores, líderes no traducidos hacia el extremo 5', intrones, genes, regiones no traducidas hacia el extremo 3', y otra secuencia reguladoras o secuencias que afecta la transcripción o traducción de una o más secuencias de ácido nucleico. Los términos "construcción recombinante de ADN", "construcción 15 recombinante", "construcción de expresión" o "cassette de expresión" se refieren a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, BAC (cromosoma artificial bacteriano), secuencia autónomamente replicante, fago, o secuencia nucleotídica de ADN o ARN lineal o circular de una sola hebra o de doble hebra, derivada partir de cualquier fuente, capaz de llevar a cabo 20 integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la cual una o más secuencias de ADN han sido unidas de manera funcionalmente operativa utilizando técnicas bien conocidas de ADN recombinante.
"Complementaria" se refiere a la asociación natural de la secuencias de ácidos nucleicos mediante apareamiento de bases (A-G-T se aparea con la secuencia complementaria T-C-A). La complementariedad entre dos moléculas de una sola hebra puede ser parcial, si solamente parte del par 5 de ácidos nucleicos son complementarios; o completa, si todas las pares de bases son complementarias. El grado de complementariedad afecta la eficiencia y fuerza de hibridación y las reacciones de amplificación. "Homología" se refiere al nivel de similitudes entre las secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos en términos de porcentaje 10 de identidad posicional de nucleótido o de aminoácido, respectivamente, es decir, similitudes o identidad de secuencia. La homología también se refiere al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas. "Promotor" se refiere a una secuencia de ácido nucleico 15 localizada corriente arriba o hacia el extremo 5' con respecto al codón de inicio de la traducción de un marco abierto de lectura (o región codificante de la proteína) de un gen y que esté implicado en el reconocimiento y unión de la ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor 20 nativo o no nativo que es funcional en células vegetales. Los promotores constitutivos son funcionales en la mayoría o en todos tejidos de una planta a través del desarrollo vegetal. Los promotores específicos de tejido, órgano o célula se expresan solamente o predominantemente en un tejido, órgano, o tipo celular particular, respectivamente. Más que ser expresado "específicamente" en un tejido, órgano, o tipo celular dado, un promotor puede exhibir expresión "mejorada", es decir, un nivel mayor de expresión, en una parte (por ejemplo, tipo celular, tejido, u órgano) de la planta en comparación 5 con otras partes de la planta. Los promotores temporalmente regulados son funcionales solamente o predominantemente durante ciertos periodos de desarrollo vegetal o en ciertos tiempos del día, como es el caso de los genes asociados con el ritmo circadiano, por ejemplo. Los promotores inducibles expresa selectivamente una secuencia de ADN operativamente unida en 10 respuesta a la presencia de estímulos endógenos o exógenos, por ejemplo mediante compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas, y/o del desarrollo. Los promotores inducible o regulados incluyen, por ejemplo, promotores regulados por la luz, calor, estrés, inundación o sequía, fitohormonas, cicatrización, o 15 productos químicos tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico, o conservadores. Cualquier promotor vegetal puede ser utilizado como una secuencia reguladora hacia 5' para modular la expresión de un gen o genes particulares. Un promotor preferido podría ser un promotor de ARN poümerasa 20 II vegetal. Los promotores de ARN polimerasa II vegetal es, como aquellos de otros eucariontes superiores, tienen estructuras complejas y están comprendidos de varios elementos distintos. Uno de dichos elementos es la caja TATA o caja Goldberg-Hogness, la cual se requiere para la expresión ^g^^ia^^i correcta de los genes eucariontes in vitro y el inicio preciso, eficiente de la transcripción in vivo. La caja TATA está típicamente ubicada a aproximadamente -25 a -35, es decir, de 25 a 35 pares de bases (pb) corriente arriba (5') del sitio de inicio de la transcripción, o sitio de casquete, el 5 cual se define como la posición +1 (Breathnach y Chambón, Ann. Rev. Biochem. 50: 349- 383, 1981; Messing et al., En: Genetic Engineering of Plants, Kosugeet al eds., pp. 211- 227, 1983). Otro elemento común, la caja CCAAT, se localiza entre -70 y -100 pb. En las plantas, la caja CCAAT puede tener una secuencia consenso diferente que la secuencia funcionalmente ío análoga de los promotores de mamífero (el análogo vegetal ha sido denominado la "caja AGGA" para diferenciarla a partir de su contraparte animal; Messing et al., En: Genetic Engineering of Plants, Kosuge et al., eds., pp. 211, 227, 1983). Además, virtualmente todos los promotores incluyen secuencias activadoras hacia el extremo 5' adicionales o potenciadores 15 (Benoist y Chambón, Nature 290: 304- 310, 1981 ; Gruss et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78: 943- 947, 1981 ; Khoury y Gruss, Cell 27: 313- 314, 1983) que se extienden desde aproximadamente -100 pb a -1 ,000 pb o más hacia el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción. Los inventores fusionaron a las secuencias de ADN heterólogo, 20 dichos promotores ocasionando típicamente que la secuencia fusionada se transcriba de manera que sea similar a la de la secuencia génica con la cual el promotor esta normalmente asociado. Los fragmentos del promotor que incluyen la secuencia reguladoras pueden ser añadidos (por ejemplo, A.AAA.j^aa^ái^&??» ^^ fusionarse al extremo 5', o insertarse con, un promotor activo que tenga sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Fluhr et al., Science 230 y 2:1106- 1112, 1986; Ellis et al., EMBO J. 6: 11- 16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8986- 8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16- 23, 1988; Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373- 381 , 1991). Alternativamente, la secuencia reguladoras heterólogas pueden añadirse a la región hacia el extremo 5' de un promotor inactivo, truncado, por ejemplo, un promotor que incluye solamente el núcleo TATA y, algunas veces, los elementos CCAAT (Fluhr et al., Science 230 y 2:1106- 1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8986- 8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225: 65- 71 , 1991 ). Los promotores típicamente están comprendidos de múltiples "elementos reguladores de la transcripción que actúan en cis" distintos, o simplemente "elementos cis", cada uno de los cuales confiere un aspecto diferente del control general de la expresión del gen (Strittmatter y Chua, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8986- 8990, 1987; Ellis et al., EMBO J. 6: 11- 16, 1987; Benfey et al., EMBO J. 9: 1677- 1684, 1990). Los "elementos cis" se unen a factores proteicos que actúan en trans que regulan la transcripción. Algunos elementos cis unen más de un factor, y los factores de transcripción que actúan en trans pueden interaccionar con diferentes afinidades con más de un elemento cis (Johnson y McKnight, Ann Rev. Biochem. 58: 799- 839, 1989). Los factores de transcripción vegetal, que comprenden elementos cis, y el análisis de sus interacciones se discute, por ejemplo, en: Martin, Curr.
Opinions Biotech. 7: 130- 138, 1996; Murai, en: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397- 422; y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233- 300. Las secuencias de promotores de la presente ¡nvención pueden contener "elementos cis" que confieren o modulan la expresión del gen. Los elementos cis pueden identificarse mediante varias técnicas, incluyendo análisis de deleción, es decir, deletando uno o más nucleótidos a partir el extremo 5' o de manera interna al promotor; análisis de unión del ADN a la proteína utilizando impresión de huella de DNasa I, interferencia de metilación, ensayos de cambio de movilidad en electroforesis, impresión de huella genómica in vivo mediante PCR mediado por ligación y otros análisis convencionales; o mediante similitud de secuencia con motivos de elementos cis conocidos mediante métodos convencionales de comparación de secuencia. La estructura fina de un elemento cis puede estudiar tradicionalmente mediante mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos del elemento o mediante otros métodos convencionales (véase por ejemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397- 422; y Methods ¡n Plant Molecular Biology, Maliga et al., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233- 300). Los elementos cis pueden obtenerse mediante síntesis química o mediante clonación a partir de promotores que incluyen dichos elementos. Los elementos cis también pueden sintetizarse con secuencias flanqueantes adicionales que contienen sitios útiles para enzima de restricción para facilitar la manipulación subsecuente. En una modalidad, los promotores están comprendidos de múltiples "elementos cis" distintos. En una modalidad preferida las regiones de la secuencia que comprende " elementos cis" de las secuencias de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 son identificadas utilizando programas de computadora incluyendo, pero no limitados a MEME o SIGNALSCAN que se diseñan específicamente para identificar elementos cis, condominios o motivos dentro de las secuencias. La presente invención incluye fragmentos o elementos cis de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 u homólogos de elementos cis conocidos para afectar la regulación del gen y mostrar homología con la secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención. Dichos fragmentos de ácidos nucleicos pueden incluir cualquier región de las secuencias descritas. Las regiones de promotores o la regiones de promotores parciales de la presente invención como se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 pueden contener al menos un elemento regulador incluyendo, pero no limitado a "elementos cis" o dominios que son capaces de regular la expresión de lli ll lll ll - Hit lililí ¿¿Aijl secuencias de ADN operativamente unidas, tales como en los tejidos reproductivos masculinos. Los promotores vegetales también pueden incluir promotores producidos a través de la manipulación de promotores conocidos para producir promotores sintéticos, quiméricos, o híbridos. Dichos promotores también pueden combinar elementos cis a partir de uno o más promotores, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia reguladora heteróloga a un promotor activo con sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Ellis et al., EMBO J. 6: 11- 16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8986- 8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16- 23, 1988; Comai et al., Plant Mol. Biol. 15: 373- 381, 1991). Los promotores quiméricos también han sido desarrollados mediante la adición de una secuencia reguladora heteróloga a la región hacia el extremo 5' de un promotor inactivo, truncado, es decir, un promotor que incluye solamente el núcleo TATA y, opcionalmente, los elementos CCAAT (Fluhr et al., Science 230 y 2:1106- 1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84: 8986- 8990, 1987; Aryan et al., Mol. Gen. Genet. 225: 65- 71, 1991). Los promotores quiméricos o híbridos de conformidad con la presente invención pueden incluir al menos un elemento cis conocido tal como elementos que están regulados por numerosos factores ambientales tales como luz, calor, o estrés; elementos que están regulados o inducidos mediante patógenos o compuestos químicos, y similares. Dichos elementos pueden ya sea regular positivamente o negativamente la expresión del gen, tt H lÉ É'iJ faÉIÉ.?ll.?f-l- j-'-' «- --'- dependiendo de las condiciones. Los ejemplos de ejemplos cis incluyen, pero no se limitan a elementos de respuesta a oxígeno (Cowen et al., J. Biol. Chem. 268 (36): 26904, 1993), elementos reguladores por luz (véase por ejemplo, Bruce y Quail, Plant Cell 2: 1081 , 1990, y Bruce et al., EMBO J. 10:3015, 1991 , un elemento cis de respuesta al tratamiento con jasmonato de metilo (Beudoin y Rothstein, Plant Mol. Biol. 33: 835, 1997, elementos de respuesta a ácido salicílico (Strange et al., Plant J. 11 :1315, 1997, elementos de respuesta a choque térmico (Pelham et al., Trends Genet. 1 :31 , 1985, elementos de respuesta a formación de heridas y a estrés abiótico (Loace et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 9230, 1992; Mhiri et al., Plant Mol. Biol. 33: 257, 1997), elementos de respuesta al frío (Baker et al., Plant Mol. Biol. 24: 701 , 1984; Jiang et al., Plant Mol. Biol. 30: 679, 1996; Nordin et al., Plant Mol. Biol. 21 : 641 , 1993; Zhou et al., J. Biol. Chem. 267: 23515, 1992), y elementos de respuesta a sequía, (Yamaguchi et al., Plant Cell 6: 251- 264, 1994; Wang et al., Plant Mol. Biol. 28: 605, 1995; Bray E.A. Trends in Plant Science 2: 48, 1997). En otra modalidad, las secuencias nucleotídicas como se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 incluyen cualquier longitud de dichas secuencias de nucleótidos que son capaces de regular una secuencia de ADN operativamente unida. Por ejemplo, las secuencias como se describe en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 pueden estar truncadas o tener porciones delicadas e incluso así ser capaces de regular la transcripción de una secuencia de ADN operativamente unida. En una modalidad relacionada, un elemento cis de las secuencias descritas puede conferir una especificidad particular tal como conferir expresión mejorada de las secuencias de ADN operativamente unidas en ciertos tejidos. Consecuentemente, cualesquiera fragmentos de las secuencias, porciones, o regiones de la secuencias descritas de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 pueden ser utilizadas como secuencias reguladoras incluyendo pero no limitadas a los elementos cis o motivos de la secuencias descritas. Por ejemplo, uno o más pares de bases pueden ser deletados a partir del extremo 5' o 3' de una secuencia del promotor para producir un promotor "truncado". Uno o más pares de bases también pueden ser insertados, deletados, o internamente sustituidos en una secuencia del promotor. Los promotores pueden construirse de tal manera que los fragmentos del promotor o elementos estén operativamente unidos, por ejemplo, mediante la colocación de dicho fragmento hacia el extremo 5' de un promotor mínimo. Un promotor mínimo o basal es una pieza de ADN la cual es capaz de reclutar y unir la maquinaria de transcripción basal. Un ejemplo de la maquinaria de transcripción basal en células eucariontes es el i*'- -* "Í^^-*1 -. ía-^,.^ak^AaflmM complejo de ARN polimerasa II y sus proteínas accesorias. Los componentes enzimáticos de la maquinaria de transcripción basal son capaces de iniciar y elongar la transcripción de un gen dado, utilizando un promotor mínimo o basal. Es decir, no hay secuencias añadidas que actúan en cis en la región del promotor que sean capaces de reclutar o unir factores de transcripción que modulan la transcripción, por ejemplo potenciador, represor, transcripción dependiente de hormona, etcétera. Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de las mismas pueden combinarse para producir una construcción final. Las secuencias de los promotores de la presente ¡nvención pueden modificarse, por ejemplo para la expresión en otros sistemas vegetales. En otro método, los promotores híbridos novedosos pueden diseñarse o biodiseñarse mediante varios métodos. Muchos promotores contienen secuencias hacia el extremo 5' las cuales activan, promueven o definen la fuerza y/o especificidad del promotor (Atchinson, Ann. Rev. Cell. Biol. 4: 127, 1988). Los genes de ADN-T, por ejemplo que contienen cajas "TATA" que definen el sitio de inicio de la transcripción y otros elementos hacia el extremo 5' localizados así el extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción modulan los niveles de transcripción (Gelvin, en: Trangenic Plants (Kung, S.-D. y Us, R., eds, San Diego: Academic Press, pp. 49- 87, 1988). Otro promotor quimérico combinado es un trímero del activador de la octopin sintasa (oes) con el activador más el promotor de la manopin sintasa (mas) y que reporta un incremento en expresión de un gen reportero (Min Ni *. f, -^^^ . .-¿^^ f et al., The Plant Journal 7: 661 , 1995). Las secuencias reguladoras hacia el extremo 5' de la presente invención pueden ser utilizadas para la construcción de dichos promotores quiméricos o híbridos. Los métodos para la construcción de variantes de promotores de la presente invención incluyen pero no se limitan a elementos de controles combinados de diferentes promotores o porciones duplicadas o regiones de un promotor (véase por ejemplo patente de E.U.A. 5, 110, 732 y patente de E.U.A. 5, 097, 025). Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con las condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromolecular (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmido, etcétera.), la generación de organismos recombinante y la selección y aislamiento de genes, (véase por ejemplo Sambrook et. al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren et al., Genome Analysis: volumen 1 , Analyzing DNA, (1997), volumen 2, Detecting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, New York). El diseño, construcción, y uso de promotores quiméricos o híbridos comprende uno, de los elementos cis de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, para modular o regular la expresión de secuencias de ácidos nucleicos operativamente unidas y también están considerados por la presente invención.
*M*A^^*^.* *?^£i*m^~ák^JAbkti Las secuencias de los promotores, fragmentos, regiones o elementos cis de los mismos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 son capaces de transcribir secuencias de ADN operativamente unidas en múltiples tejidos y por lo tanto pueden regular selectivamente la expresión de genes en múltiples tejidos. Para varios rasgos agronómicos, la transcripción de un gen o genes de interés es deseable en múltiples tejidos para conferir la característica(s) deseada. La disponibilidad de promotores adecuados que regulan la transcripción de genes operativamente unidos en tejidos blancos seleccionados de interés es deseable. Puesto que puede no ser deseable expresar un gen en cada tejido, sino solamente en ciertos tejidos. Por ejemplo, si uno desea expresar selectivamente un gen blanco para la expresión de un gen para tolerancia a herbicida, uno puede desear la expresión del agente de tolerancia a herbicida en los tejidos degenerativos y reproductivos. Las secuencias de los promotores de la presente invención son útiles para regular la expresión génica en múltiples tejidos incluyendo, pero no limitados a tejidos meristemáticos de crecimiento rápido, tejidos reproductivos masculinos (androecio) tales como polen, anteras, y filamentos, y tejido reproductivos femeninos (ginoecio) tales como el estigma, estilo, y ovarios, hojas, sépalos, y pétalos. Los promotores de la presente ¡nvención por lo tanto tienen utilidad para la expresión de genes de tolerancia a herbicida, por ejemplo, en donde la tolerancia se desea en múltiples tejidos y etapas de desarrollo vegetal. Las secuencias del promotor de la presente invención tienen utilidad para regular la transcripción de cualquier gen blanco incluyendo pero no limitados a los genes para control de la fertilidad, producción, tolerancia de insectos, tolerancia fungal, tolerancia a herbicida, o cualquier rasgo deseable que interés. Los genes particularmente preferidos incluyen genes de tolerancia a herbicidas o genes de tolerancia a insectos. En una modalidad, los promotores de la presente invención tienen utilidad particular para regular la expresión de un gen de tolerancia a herbicida en donde la expresión de un gen se desea en múltiples tejidos. Por ejemplo, el gente tolerancia a herbicida puede conferir tolerancia al herbicida glifosato. Los ejemplos de genes de tolerancia a glifosato adecuados incluyen, pero no se limitan a genes de EPSP sintasa de resistencia a glifosato o productos génicos que degradan el glifosato tales como, una glifosato oxidorreductasa y fosfonato N- acetil transferasa. Es importante tener una amplia variedad de elecciones de elementos reguladores hacia 5' para cualquier estrategia de biotecnología en plantas con el objeto de tener elementos reguladores adecuados que son más eficientes para el perfil de expresión deseado. En otra modalidad, los promotores de la presente invención tienen utilidad para determinar la función del gen. La función de muchos genes se desconoce y los promotores de la presente invención pueden ser utilizados como elementos genéticos en una construcción para permitir una .&- &,*!, ff ít , *i&>-^*^* ¿¿a**** s¿«. ^¡.íMá aa^atM?íáSi¡ Éí& evaluación fenotípica de uno o más genes expresados en una orientación sentido o antisentido. Los promotores de la presente invención pueden ser componentes en una construcción de expresión vegetal desarrollada para un ensayo de alta resolución en donde se desean altos niveles de la expresión del gen en los tejidos constitutivos y reproductivos. Cualquier planta puede seleccionarse para la identificación de genes y secuencias reguladoras. Los ejemplos de blancos vegetales adecuados para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras podrían incluir pero no se limitan a alfalfa, manzana, chabacano, Arabidopsis, alcachofa, arúgula, espárrago, aguacate, plátano, cebada, frijoles, betabel, moras, arándano, brócoli, calabacita de Bruselas, calabaza, cañóla, melón, zanahoria, casava, semilla de ricino, coliflor, apio, cereza, escarola, cilantro, cítricos, clementinas, clavo, coco, café, maíz, algodón, bailas de arándanos, pepino, abeto Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higos, ajo, calabacino, uvas, toronja, ligamaza, jicama, kiwi, lechuga, poro, lima, pino Lobloly, linaza, mango, melón, champiñón, nectarina, no es, apenas, aceite de Palma, aceite de semilla de colza, oliva, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, era, durazno, cacahuate, chícharo, pimiento, pérsimo, pino, pina, banana, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza, membrillo, pino radiata, radiscchio, rábano, semilla de colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sureste, soya, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, azúcar de caña, girasol, patata dulce, ocozol, tangerina, te, tabaco, tomate, pasto, césped, nabo, vid, sandía, trigo, camote, y calabacitas. Las plantas particularmente preferidos para la identificación de secuencias reguladoras son Arabidopsis, maíz, trigo, soya, y algodón. Las secuencias de los promotores de la presente invención se aislaron a partir de ADN vegetal de Arabidopsis thaliana. En una modalidad preferida, una construcción incluye la secuencias de los promotores de la presente invención operativamente unidas a una secuencia capaz de ser transcrita junto con elementos termmadores y reguladores adecuados. Dicha construcción puede transformarse dentro de una planta vegetal adecuada de interés. Cualquier planta puede ser utilizada como un hospedero adecuado para las construcciones de ácido nucleico comprendiendo las secuencias de los promotores de la presente invención. Los ejemplos de las plantas blanco adecuadas de interés podrían incluir, pero no se limitan a alfalfa, brócoli, calabaza, cañóla, coliflor, maíz, algodón, arándanos, pepino, lechuga, chícharo, álamo, pino, patata, cebolla, arroz, frambuesa, soya, azúcar de caña, remolacha azucarera, girasol, tomate, y trigo.
Aislamiento del promotor y métodos de modificación Cualquiera de varios métodos puede ser utilizado para aislar fragmentos de las secuencias de los promotores descritas en la presente. Un método basado en PCR puede ser utilizado para amplificar las regiones flanqueantes a partir de una librería genómica de una planta utilizando informaciones secuencia disponible públicamente. Varios métodos se conocen por los expertos de la técnica para amplificar las secuencias de ADN ^¿^^^ ^^^ á desconocidas adyacentes a una región núcleo de secuencia conocida. Los métodos incluyen pero no se limitan a PCR inverso (IPCR), PCR vectorette, PCR en forma de Y y métodos para caminar sobre el genoma. Para la presente invención, las moléculas de ácido nucleico se aislaron a partir de Arabidopsis al diseñar iniciadores para PCR basados en la información de secuencia disponible. Los fragmentos deciduos nucleicos también pueden obtenerse mediante otras técnicas tales como mediante decir directa del fragmento por métodos químicos, así como se practica comúnmente al utilizar un sintetizador automatizado de oligonucleótidos. Los fragmentos también pueden obtenerse mediante la amplificación de la tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) mediante técnicas de harina recombinante generalmente conocidas por los expertos en la técnica de biología molecular. Con respecto al amplificación de una secuencia blanco de ácido nucleico (por ejemplo, mediante PCR) utilizando un par iniciador de amplificación particular, "condiciones severas para PCR" se requieren las condiciones que permiten que el par iniciador se hibriden solamente a la secuencia blanco de ácido nucleico al cual el iniciador que tiene la secuencia que corresponde al tipo silvestre (o su complemento) puede unirse y preferiblemente produce un producto único de amplificación. Los expertos en la técnica están conscientes de métodos para la preparación de ADN genómico vegetal. En un método, las librerías de ADN genómico puede prepararse a partir de las especies elegidas mediante digestión parcial con una enzima de restricción y selección de tamaño de los fragmentos de ADN dentro de un intervalo particular de tamaño. El ADN genómico puede clonarse dentro de una construcción adecuada incluyendo pero no limitada a un bacteriófago, y preparado utilizando una construcción adecuada tal como un bacteriófago utilizando un equipo de clonación adecuado a partir de varios de los que se venden (véase por ejemplo Stratagene, La Jolla CA o Gibco BRL, Gaithersburg, MD). En otra modalidad, las secuencias nucleotídicas de los promotores descritos en la presente invención pueden ser modificadas. Los expertos en la técnica pueden crear moléculas de ADN que tienen variaciones en la secuencia nucleotídica. Las secuencias nucleotídicas de la presente invención como se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 pueden modificarse o alterarse para mejorar sus características de control. Por ejemplo, las secuencias pueden modificarse mediante inserción, deleción o reemplazo de secuencias molde en un método de modificación del ADN basado en PCR. Las moléculas "variantes" de ADN son moléculas de ADN que contienen cambios en las cuales uno o más nucleótidos de una secuencia nativa están deletados, añadidos, y/o sustituidos, preferiblemente mientras que la función del promotor se mantiene sustancialmente. En el caso de un fragmento promotor, el ADN "variantes" puede incluir cambios que afectan la transcripción de un promotor mínimo al cual está operativamente unido. Las moléculas variantes de ADN pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas de mutagénesis de ADN estándares o mediante síntesis química de las moléculas variantes de ADN o de una porción de la misma. Además de su uso para modular la expresión del gen, las secuencias de los promotores de la presente invención también tienen utilidad como sondas o iniciadores en los experimentos de hibridación del ácido nucleico. Las sondas e iniciadores de ácido nucleico de la presente invención pueden hibridar bajo condiciones severas a una secuencia de ADN blanco. El término "condiciones severas de hibridación" se define como condiciones bajo las cuales una sonda o iniciador hibrida específicamente con una secuencia(s) blanco y no con secuencias no blanco, como se puede determinar empíricamente. El término "condiciones severas" se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de ácido nucleico a un ácido nucleico blanco (es decir, a una secuencia particular de ácido nucleico de interés) mediante el procedimiento específico de hibridación (véase por ejemplo Sambrook et al., 1989, en 9.52- 9.55, Sambrook et al., 1989 en 9.47- 9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, Nucí. Acids Res. 12: 203- 213, 1984; y Wetmur y Davidson. J. Mol. Biol. 31 : 349- 370, 1968). Las condiciones severas apropiadas que promueven la hibridación del ADN son, por ejemplo, cloruro de sodio /citrato de sodio 6.0 x (SSC) a aproximadamente 45°C, seguido por un lavado de SSC 2.0 x a 50°C, los cuales se conoce por los expertos en la técnica o pueden encontrarse en manuales de laboratorio incluyendo pero no limitados a Current Protocols in Molecular Biology, Hohn Wiley & Sons, N. Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración de sal en el paso de lavado puede seleccionarse a partir de una baja severidad de aproximadamente SSC 2.0 x a 50°C a una alta severidad de aproximadamente SSC 0.2 x a 50°C. Además, la temperatura en el paso de lavado puede incrementarse a partir de condiciones de baja severidad a temperatura ambiente, aproximadamente 22°C, a condiciones de alta severidad a aproximadamente 65°C. Tanto la temperatura como la sal puede variar, o ya sea la temperatura o la concentración de sal puede mantenerse constante mientras que la otra variable se cambia. Por ejemplo, la hibridación utilizando sondas de ADN o de ARN o iniciadores puede llevarse a cabo a 65°C en SSC 6x, SDS 0.5%, Denhardt 100 µg/mL, ADN no específico (por ejemplo, ADN de esperma de salmón sonicado) con lavados a SSC 0.5x, SDS 0.5% a 65°C, para alta severidad. Una molécula de ácido nucleico se dice que es el "complemento" de otra molécula de ácido nucleico si éstas exhiben complementariedad completa. Como se utiliza la presente, se dice que las moléculas exhiben "complementariedad completa" cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario a un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son "mínimamente complementarias" si éstas pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer fijas entre sí bajo al menos condiciones de "baja severidad". Similarmente, se dice que las moléculas son "complementarias" si éstas pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitirles permanecer fijas entre sí bajo condiciones de "severidad alta" convencionales. Se contempla que las condiciones de hibridación de baja severidad tales como la hibridación más baja y/o temperatura de lavado pueden utilizarse para identificar secuencia relacionadas que tienen un grado menor de similitudes de secuencia si la especificidad de la unión de la sonda o del iniciador a la secuencia(s) blanco se conserva. Por consiguiente, las secuencias nucleotídicas de la presente invención pueden utilizarse por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con extensiones complementarias de fragmentos de ADN. La detección de los segmentos de ADN mediante la hibridación se conoce bien por los expertos en la técnica, y por lo tanto dependiendo de la aplicación pretendida, uno deseará emplear condiciones de hibridación variables para lograr grados variables de selectividad de la sonda hacia la secuencia blanco y el método de elección dependerá de los resultados deseados. Las condiciones de severidad convencionales se describen en Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, y por Haymes et al., Nucleic Acid Hybrid ization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985. En una modalidad de la presente invención, las secuencias de ácidos nucleicos SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26, o un fragmento, región, elemento cis, u oligómero de esta secuencias, se utilizan en los ensayos de hibridación de otros tejidos .... í^íSUk^?¿aja^kka^áAÍ^?a,^i,J^.l?? ?^^. l&?k^fM^Mz vegetales para identificar genes relacionados cercanamente u homólogos y secuencias reguladoras asociadas. Estas incluyen pero no se limitan a ensayos de hibridación tipo Southern o Northern sobre cualquier sustrato incluyendo pero no limitados a un tejido vegetal adecuadamente preparado, celulosa, nylon, o un filtro de combinación, fragmento, o cubreobjetos de vidrio. Dichas metodologías se conocen bien en la técnica están disponibles en un equipo o preparación del cual puede abastecerse por vendedores comerciales. Un fragmento de un ácido nucleico como se utiliza en la presente invención es una porción del ácido nucleico que es menos que la longitud total. Por ejemplo, para la presente invención cualquier longitud de las secuencias nucleotídicas que es menor que las secuencias nucleotídicas descritas de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 se considera un fragmento. Un fragmento también puede comprender al menos una longitud mínima capaz de hibrida específicamente con un ácido nucleico nativo bajo condiciones de hibridación severas como se definió anteriormente. La longitud de dicho fragmento mínimo preferiblemente es de al menos 8 nucleótidos, más preferiblemente 15 nucleótidos, incluso más preferiblemente al menos 20 nucleótidos, y más preferiblemente al menos 30 nucleótidos de una secuencia nativa de ácido nucleico. Una "sonda" es un ácido nucleico aislado al cual se une una marca detectable o molécula reportera, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente, o enzima. "Iniciadores" son ácidos nucleicos aislados que están fijos a una hebra de ADN blanco complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el iniciador y la hebra de ADN blanco, luego se extiende a lo largo de la hebra de ADN blanco mediante una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Los pares iniciadores pueden utilizarse para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros métodos convencionales de amplificación de ácido nucleico. Las sondas y los iniciadores generalmente son de 11 nucleótidos o más en longitud, preferiblemente 18 nucleótidos o más, más preferiblemente 25 nucleótidos, y más preferiblemente 30 nucleótidos o más. Dichas sondas e iniciadores hibridan específicamente a una secuencia blanco de ADN o ARN bajo condiciones de hibridación de alta severidad e hibridan específicamente a una secuencia nativa blanco de otras especies bajo condiciones bajas de severidad. Preferiblemente, las sondas y los iniciadores de conformidad con la presente invención tienen similitud de secuencia completa con la secuencia nativa, a pesar de que las sondas que difieren de la secuencia nativa y que retienen la capacidad para hibridar a la secuencias nativas blanco pueden diseñarse mediante métodos convencionales. Los métodos para preparar y utilizar sondas e iniciadores se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en adelante, "Sambrook et al., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en adelante, "Ausubel et al., 1992); e Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Los pares iniciadores para PCR pueden derivarse a partir de una secuencia conocida, por ejemplo, al utilizar programas de computadora que se pretenden para ése propósito al como Primer (versión 0.5, (C) 1991 , Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Los iniciadores y sondas basados en la secuencias nativas de los promotores descritas en la presente invención pueden ser utilizadas para confirmar y, si es necesario, para modificar la secuencia descritas mediante métodos convencionales, por ejemplo, mediante re-clonación y re-secuenciación.
Construcciones y construcciones de expresión Los ácidos nucleicos nativos o sintéticos de conformidad con la presente invención pueden incorporarse dentro de construcciones recombinante de ácidos nucleicos, típicamente construcciones de ADN, capaces de introducción dentro de y replicación en una célula hospedera. En una modalidad preferida, las secuencias nucleotídicas de la presente invención como se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 o fragmentos, variantes o derivados de las mismas se .*..»ltÍ talu *.*?ltM .. jjiÜ&j kuUkiu»iniklá.??kJli incorporan dentro de un cassette de expresión el cual incluye las regiones de los promotores de la presente invención operativamente unidas a un componente genético tal como un gen de selección, para tamizaje, o marcador capaz de ser evaluado. En otra modalidad, las secuencias de ácidos nucleicos descritas de la presente invención como se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11.SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 están operativamente unidas a un componente genético tal como un ácido nucleico del cual confiere una característica deseable asociada con la morfología vegetal, fisiología, crecimiento y desarrollo, producción, mejoría nutricional, resistencia a enfermedades o plagas, o tolerancia ambiental o química. Estos componentes genéticos tales como genes marcadores o genes agronómicos de interés pueden funcionar en la identificación de una célula vegetal transformada o planta, o un producir producto de utilidad agronómica. En otra modalidad, un componente genético que produce un producto el cual sirve como un dispositivo de selección y funciona en un tejido vegetal capaz de ser generado para producir un compuesto el cual puede conferir posteriormente al tejido vegetal resistencia a un compuesto que de otra manera resulta tóxico. Los genes de interés para uso como marcadores de selección, para camisas y, o marcador capaz de ser evaluado podrían incluir pero no se limitan a genes marcadores GUS (secuencia codificante para la beta-glucuronidasa), GFP (secuencia codificante para la proteína fluorescente verde), LUX (en codificante para la luciferasa), genes marcadores de resistencia a antibióticos, o genes de tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de transposones y genes de resistencia asociada a antibióticos incluye los transposones Tns (bla), Tn5 (nptll), Tn7 (dgfr), penicilina, canamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprima); cloramfenicol; canamicina y tetraciclina. Las características útiles para marcadores de selección en plantas se han esbozado en un reporte sobre el uso de microorganismos (Advsory Committee on Novel Foods and Processes, julio 1994). Estos incluyen la selección severa con un número mínimo de tejidos no transformados, grandes números de eventos de transformación independientes que no tienen interferencia significativa con la regeneración, aplicación de un gran número de especies, y disponibilidad de un ensayo para evaluar los tejidos para la presencia del marcador. Varios genes marcadores de selección se conocen en la técnica y varios marcadores de resistencia a antibióticos satisfacen estos criterios, incluyendo aquellos resistentes a canamicina (nptll), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4). Los genes de marcadores de selección dominantes útiles incluyen genes que codifican para genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, canamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo, fosfonotricin acetiltransferasa). Una estrategia útil para la selección de transformantes para resistencia a herbicidas se describe, por ejemplo, en Vasil, Cell Culture and Somatic Genetics of Plants, Vols. Mil, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, New York, 1984. Los genes marcadores de selección particularmente preferidos para uso en la presente invención podría ser genes que confieren resistencia a compuestos tales como antibióticos semejantes a canamicina, y herbicidas como glifosato (Della-Cioppa et al., Bio/Technology 5(6), 1987, patente de E.U.A. 5, 463, 175, patente de E.U.A. 5, 633, 435). Otros dispositivos de selección también pueden incrementarse y podrían incluso caer dentro del alcance de la presente invención. Para la práctica de la presente invención, las composiciones convencionales y métodos para preparar y utilizar construcciones de ADN y células hospederas se emplean, como se discute, entre otros, en Sambrook et al., 1989. En una modalidad preferida, la célula hospedera es una célula vegetal. Varios construcciones de ADN adecuadas para la transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas se han descrito en, por ejemplo, Powles et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supl. 1987); Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990; y R. R. D. Croy Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. Las construcciones de expresión vegetal pueden incluir, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de las secuencias l?±?j+*?* M*>.*. reguladoras hacia 5* y 3'. Esta también pueden incluir un marcador de selección como se describe para seleccionar para células hospederas que contienen la construcción de expresión. Dicha construcción de expresión vegetal también contiene una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el ambiente o regulada por el desarrollo, o específica de célula o de tejido), un sitio inició de la transcripción, un sitio de unión al ribosomal, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción, y una señal de poliadenilación. Otra secuencias de origen bacteriano también se incluyen las cuales permiten que la construcción se clone en un hospedero bacteriano. La construcción también contendrá típicamente un origen de replicación de procariontes con un intervalo amplio de hospedero. En una modalidad particularmente preferida, la célula hospedera es una célula vegetal y la construcción de expresión vegetal comprende una región del promotor como se describe en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ,SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30; una secuencia capaz de ser transcrita operativamente unida; y una secuencia de término de la transcripción. Otra secuencias reguladoras que se consideran como componentes genéticos en una construcción de expresión incluyen pero no se limitan a secuencias líder no traducidas las cuales pueden acoplarse con el promotor. En una modalidad particularmente preferida, la célula hospedera es una célula vegetal y la construcción de expresión vegetal comprende una región del promotor como se describe en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30; una secuencia capaz de ser transcrita operativamente unida, y una secuencia de término de la transcripción. Las construcciones de expresión vegetal también pueden comprender secuencias adicionales incluyendo pero no limitadas a secuencias poliadaptadoras que contienen sitios para enzimas de restricción que son útiles para propósitos de clonación.
Elementos genéticos en las construcciones de expresión vegetal Las construcciones de expresión vegetal pueden incluir más de una secuencia génica capaz de ser expresada, cada una operativamente unida a un promotor diferente. Varios promotores tienen utilidad para la expresión de genes vegetales a partir de cualquier gen de interés incluyendo pero no limitadas a marcadores de selección, marcadores capaces de ser evaluados, genes para tolerancia a plagas, tolerancia a enfermedades, y mejorías nutricionales y otros genes de interés agronómicos. Los ejemplos de promotores constitutivos útiles para la expresión de genes vegetales incluyen pero no se limitan, al promotor P-35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el cual confiere un elevado nivel de expresión constitutiva en la mayoría de los tejidos vegetales (véase, por ejemplo, Odel et al., Nature 313: 810, 1985), incluyendo monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyset et al., Plant Cell 2: 591 , 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 381 9, 1990); y la versión duplicada en tándem del promotor 35S de CaMV, el promotor 35S mejorado (P-e35S), el promotor de la nopalin sintasa (An et al., Plant Physiol. 88: 547, 1988), el promotor de octopin sintasa (Fromm et al., Plant Cell 1 : 977, 1989); y el promotor del virus del mosaico de la higuera (P- FMV) como se describe en la patente de E.U.A- No. 5, 378, 619 y una versión mejorada del promotor FMV (P-eFMV) en donde la secuencia del promotor de P-FMV esta duplicada en tándem, el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor, un promotor del virus en forma de bacilos de la caña de azúcar, un promotor del virus de la cornelina de motas amarillas, y otros promotores virales de ADN de plantas que se sabe que se expresan en células vegetales. Una variedad de promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas, y/o de desarrollo pueden utilizarse para el expresión de un gen operativamente unido en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1 ) calor (Callis et al., Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) plus (por ejemplo, promotor rbcS-3A de chícharo, Kuhlemeier et al., Plant Cell 1 : 471 , 1989; promotor rbcS del maíz, Schaffner y Sheen, Plant Cell 13: 997, 1991 ; o promotor de la clorofila de unión a la proteína a/b, Simpson et al., EMBO J. cuatro: 2723, 1985), (3) hormonas, tales como ácido abscísico (Marcotte et al., Plant Cell 1 :969, 1989), (4) formación de heridas (por ejemplo.wunl, Siebertz et al., Plant Cell 1 : 961 , 1989); o (5) sustancias químicas tales como jasmonato de metilo, ácido salicílico, o conservador. También puede ser ventajoso el emplear (6) promotores específicos de órganos (por ejemplo, Roshal et al., EMBO J. 6: 1155, 1987; Schernthaner et al., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos et al., Plant Cell 1: 839, 1989). Los promotores de la presente invención son promotores vegetales que son capaces de transcribir secuencias de ADN operativamente unidas en tejidos meristemáticos de crecimiento rápido y tejidos reproductivos y que pueden estar operativamente unidos a cualquier gen de interés en una construcción de expresión. Las construcciones de expresión vegetal pueden incluir señales de procesamiento de ARN, por ejemplo, intrones, los cuales pueden estar ubicados hacia el extremo 5' o extremo 3' de una secuencia codificante del polipéptido en el transgén. Además, las construcciones de expresión pueden incluir secuencia reguladoras adicionales a partir de la región no traducida hacia 3' de los genes vegetales (Thornburg et al., Proc. Nati. Acad. Sci, USA 84: 744 (1987); An et al., Plant Cell 1 :115 (1989), por ejemplo, una región de terminación hacia 3' para incrementar la estabilidad del ARNm del ARNm, tal como la región terminadora Pl-ll de la patata o las regiones terminadoras hacia 3' de la octopin o nopalin sintasa. Las regiones no traducida hacia 5' de un ARNm pueden desempeñar un papel importante en el inicio de la traducción y también pueden ser un componente genético en una construcción de expresión vegetal. Por ejemplo, la secuencias líder no traducida hacia 5' derivadas a partir de los genes de proteína de choque térmico se han demostrado que mejoran la expresión de gen en las plantas (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. 5. 362, 865). Estas secuencias reguladoras adicionales hacia 5' y hacia 3' pueden derivarse a partir de una fuente que es nativa o heteróloga con respecto a los otros elementos presentes en la construcción de expresión. Las secuencias promotor de la presente ¡nvención se utilizan para controlar la expresión del gen en células vegetales. Las secuencias de los promotores descritas son componentes genéticos que son parte de las construcciones utilizadas en la transformación vegetal. Las secuencias de los promotores de la presente ¡nvención pueden ser utilizadas con cualquier plásmido adecuado para transformación vegetal o construcción que contenga un marcador de selección o capaz de ser tamizado y elementos reguladores asociados, como se describe, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados de manera suficiente para conferir un rasgo particular deseable. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agronómicos considerados por la presente invención podrían incluir pero no se limitan a uno o más genes para tolerancia a insectos, tal como el gen de Bacillus thiringiensis (B.t.), tolerancia a placas tales como los genes para control de la enfermedad fungal, tolerancia a herbicidas tales como los genes que confieren tolerancia a glifosato, y genes para mejorar la calidad de dicha producción, mejorías nutricionales, tolerancia al medio ambiente o al estrés, o cualquier cambio deseable en la fisiología vegetal, crecimiento, desarrollo, morfología o producto(s) vegetal. Por ejemplo, los genes estructurales podrían incluir cualquier gen y que confieren tolerancia a insectos incluyendo pero no limitados al gen de la proteína para control del insecto de Bacillus como se describe en WO 9931248, en la presente incorporado como referencia en su totalidad, la patente de E.U.A. No. 5, 689, 052, incorporado en la presente como referencia en su totalidad, las patentes de E.U.A. Nos. 5,500,365 y 5, 880, 275, incorporadas en la presente como referencia en su totalidad. En otra modalidad, el gen estructural puede conferir tolerancia al herbicida glifosato como se confiere por los genes incluyendo, pero no limitados al gen EPSPS de resistencia a glifosato de la cepa CP4 de Agrobacterium (aroA:CP4) como se describió en la patente de E.U.A. No. 5,633,435, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, o el gen de glifosato oxidorreductasa (GOX) como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,463,175, incorpora de la presente como referencia en su totalidad. Alternativamente, las secuencias codificantes de ADN pueden afectar a estos genotipos al codificar una molécula de ARN que no se traduce que ocasiona la inhibición blanco de la expresión de un gen endógeno, por ejemplo mediante mecanismos mediados por antisentido o co-supresión (véase, por ejemplo, Bird et al., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9:207, 1991). El ARN también puede ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) diseñada para escindir un producto de ARNm endógeno deseado (véase por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125, 1997). Por lo tanto, cualquier gen que produce una proteína o ARNm el cual expresa un cambio de fenotipo o morfología de interés es útil para la práctica de la presente invención.
Además de los elementos reguladores o secuencias localizadas a extremo 5' (5') o con una secuencia de ADN, hay secuencias hacia el extremo 3' (3') que afectan la expresión del gen. Por lo tanto, el término secuencia reguladoras como se utilizan la presente se refiere a cualquier secuencia nucleotídica localizada hacia extremo 5', dentro, o hacia el extremo 3' de una secuencia de ADN la cual controla, media, o afecta la expresión de un producto génico en conjunción con el aparato sintético de proteínas de la célula. Los expertos de la técnica están conscientes de las construcciones adecuadas para transformación vegetal. Las secuencias de los promotores de la presente invención preferiblemente están incorporadas dentro de una construcción de expresión que utiliza marcadores de tamizaje o capaces de ser evaluados como se describe y se evalúa en los análisis transitorios para proveer una indicación de la expresión del gen en plantas transformadas. Los métodos para evaluar la expresión del gen en ensayos transitorios se conocen por los expertos en la técnica. La expresión transitoria de los genes marcadores se ha reportado utilizando una variedad de plantas, tejidos y sistemas de administración de ADN. Por ejemplo, los tipos de análisis transitorios pueden incluir pero no se limitan a administración directa del gen mediante electroporación o bombardeo de partículas de tejidos en cualquier ensayo vegetal transitorio utilizando cualquier especie vegetal de interés. Dicho sistema transitorios podrían incluir pero no se limitan a protoplastos a partir de cultivos en suspensión de trigo (Zhou et al., Plant Cell Reports 12: 612, 1993), electroporación de protoplastos de hojas de trigo (Sethi et al., J. Crop Sci. 52: 152, 1983). Electroporación de protoplastos preparados a partir de tejidos de maíz (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991), o bombardeo de partículas de tejidos específicos de interés. La presente ¡nvención considera el uso de cualquier sistema de expresión transitoria para evaluar las secuencias reguladoras operativamente unidas a los genes reporteros de selección, genes marcadores o genes agronómicos de interés. Los ejemplos de tejidos vegetales considerados para evaluarse en elementos transitorios mediante un sistema de administración apropiado podrían incluir pero no se limitan a tejidos de la base de la hoja, callos, cotiledones, raíces, endospermo, embriones, tejidos florales, polen, y tejidos epidermales. Cualquier marcador capaz de ser evaluado o de someterse a selección puede ser utilizado en un ensayo transitorio. Los genes marcadores preferidos para los análisis transitorios de los promotores o secuencias reguladoras hacia 5' de la presente ¡nvención incluyen un gen de ß- glucuronidasa (GUS) o un gen de la proteína fluorescente verde (GFP). Las construcciones de expresión que contienen las secuencias reguladoras hacia 5* operativamente unidas a un gen marcador se administran a los tejidos y los tejidos se analizan mediante el mecanismo apropiado, dependiendo del marcador. Los análisis cuantitativos o cualitativos se utilizan como una herramienta para evaluar el perfil de expresión potencial de las secuencias reguladoras hacia 5' cuando están operativamente unidas a los genes de interés agronómicos en las plantas estables. Finalmente, las secuencias reguladoras hacia 5' de la presente invención están directamente incorporadas dentro de construcciones de expresión para transformación vegetal adecuadas que comprende la secuencia reguladora hacia 5' operativamente unida a una secuencia de ADN de interés capaz de ser transcrita, transformada dentro de plantas y las plantas transformadas de manera estable y la progenie de la misma se analiza para el perfil de expresión deseado conferido mediante la secuencia reguladora hacia 5". Las construcciones de expresión adecuadas para introducir ADN exógeno dentro de células vegetales podrían incluir pero no se limitan a plásmidos-Ti desarmados para métodos mediados por Agrobacterium. Esas construcciones pueden contener un marcador de resistencia, límites del ADN- T 1-2, y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium junto con uno o más genes de interés y regiones reguladoras asociadas. Los expertos en la técnica están conscientes de que para los métodos mediados por Agrobacterium numerosas cepas y métodos están disponibles. Dichas cepas podrían incluir pero no se limitan a cepas de Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 y EHA105. Las cepas particularmente preferidas son cepas de Agrobacterium tumefaciens. Los ácidos nucleicos ejemplares los cuales pueden ser introducidos mediante los métodos considerados por la presente ¡nvención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes a partir de otras especies, o incluso secuencias o genes los cuales se originan con o están presentes en las mismas especies, pero incorpora dentro de células recipientes mediante métodos de ingeniería genética más que mediante la reproducción clásica o técnicas de entrecruza. Sin embargo, el término "exógeno" también se pretende para referirse a los genes que no está normalmente presentes en la células a ser transformadas, o tal vez simplemente no están presentes en la forma, estructura, etcétera, como se encuentran en el segmento o gente ADN transformado, o genes que normalmente están presentes y que uno desea expresar de manera que difieren a partir del patrón de expresión natural, por ejemplo, sobre-expresar. Por lo tanto, el término gen "exógeno" o ADN se pretende que se requiera a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce dentro de una célula recipiente, sin ¡mportar si un gen similar puede ya estar presente en dicha célula. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN el cual está presente en la célula vegetal, ADN a partir de otra planta, ADN a partir de organismos diferentes, o un ADN generado externamente, tal como una secuencia de ADN que contienen un mensajero antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o modificada de un gen. Las construcciones de transformación vegetal que contienen las secuencias de los promotores de la presente invención pueden introducirse dentro de plantas mediante cualquier método de transformación vegetal. Varios métodos están disponibles para la introducción de secuencias de ADN dentro de células vegetales y se conocen bien en la técnica. Los métodos adecuados incluir pero no se limitan a infección bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium como se describió anteriormente), construcciones binarias de cromosomas artificiales bacterianos, administración directa de ADN (por ejemplo mediante transformación mediada por PEG, toma de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicón), y aceleración de partículas revestidas con ADN (revisado en Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991). Los métodos para la transformar específicamente dicotiledóneas utilizan principalmente Agrobacterium tumefaciens. Por ejemplo, las plantas transgénicas reportadas incluyen pero no se limitan a algodón (patente de E.U.A.No. 5,004,863; patente de E.U.A. No. 5,159,135; patente de E.U.A. No. 5,518,908, WO 97/43430), Soya (patente de E.U.A. No. 5,569,834; patente de E.U.A. No. 5.416,011 ; MeCabe et al., Bio/Technology, 6: 923, 1988; Christou et al., Plant Physiol., 87: 671 , 1988); Brassica (patente de E.U.A. No. 5,463,174), y cacahuate (Cheng et al., Plant Cell Rep., 15: 625, 1996). Métodos similares se han reportado en la transformación de monocotiledóneas. La transformación y regeneración vegetal utilizando estos métodos se ha descrito para numerosas cosechas incluyendo pero no limitadas a espárragos (Asparagus officinalis; Bytebier et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345, 1987); cebada (Hordeum vulgarae; Wan y Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); maíz (Zea mays; Rhodes, C. A., et al., Science, 240: 204, 1988; Gordon-Kamm, et al., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm, et al., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, et al., Bio Technology, 11 : 194, 1993); avena (Avena sativa; Somers, et al., Bio/Technology, 10: 1589, 1992); pasto de orquídea (Dactylis glomerata; Horn et al., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); a^ar^«*4 iÍ„_^ arroz (Oryza sativa, incluyendo las variedades indicada y japónica, Toriyama, et al., Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, et al., Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo y Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, et al., Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor; Casas, A.M., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11212, 1993); caña de azúcar (Saccharum spp.; Bower y Birch, Plant J., 2: 409, 1992); cañuela (Festuca arundinacea; Wang, Z. Y. et al., Bio/Technology, 10: 691, 1992); césped (Agrostis palustris; Zhong et al., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); trigo (Triticum aestivus; Vasil et al., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks, T., et al., Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, et al., Plant, J. 5: 299, 1994), y alfalfa (Masoud, S.A., et al., Transgen. Res., 5: 313, 1996). Es aparente los expertos en la técnica que varias metodologías de transformación pueden ser utilizadas y modificadas para la producción de plantas transgénicas estables a partir de cualquier número de cosechas blanco de interés.
Métodos de análisis vegetal Las plantas transformadas se analizan para la presencia de genes de interés y los niveles y/o perfiles de expresión conferidos por las secuencias de los promotores de la presente invención. Aquellos expertos en la técnica están conscientes de los numerosos métodos disponibles para el análisis de las plantas transformadas. Una variedad de métodos se utilizan para evaluar la expresión génica y determinar si el gen(es) introducido está integrado, funciona de manera adecuada, y se hereda como se espera. Para la presente invención los promotores pueden evaluarse mediante la determinación de los niveles de expresión de los genes a los cuales los promotores están operativamente unidos. Una evaluación preliminar de la función del promotor puede determinar si mediante un método de ensayo transitorio utilizando genes reporteros, pero una evaluación del promotor más definitiva puede determinarse a partir del análisis de las plantas estables. Los métodos para análisis vegetal incluir pero no se limitan a Southern blot o Northern blot, métodos basados en PCR, análisis bioquímicos, métodos de selección fenotípica, evaluaciones de campo, y ensayos inmunodiagnósticos. Los métodos de la presente ¡nvención incluyen pero no se limitan a tecnologías de PCR, aislamiento de ADN genómico, expresión de la construcción de construcción, ensayos transitorios, y métodos de transformación vegetal que son bien conocidos por los expertos en la técnica y se llevan a cabo utilizando técnicas estándares o modificaciones de las mismas.
Prueba de aspersión de qlifosato En una modalidad se llevó a cabo una evaluación en invernadero o en campo para la tolerancia a glifosato. El término "glifosato" se utilizan la presente para referirse colectivamente a los herbicidas parentales de N- fosfonometilglicina (de otra manera conocido como ácido glifosato), a una sal o éster del mismo, como un compuesto el cual se convierte a N- fosfonometilglicina en tejidos vegetales o el cual de otra manera provee N-fosfonometilglicina en forma iónica (de otra manera conocido como ion de glifosato). De manera ilustrativa, las sales de glifosato solubles en agua útiles en la presente se describen en las patentes de E.U.A. No. 3,799,758 y 4,405,531 a Franz, la descripción de la cual se incorporen la presente como referencia. Las sales de glifosato que pueden ser utilizadas de conformidad con la presente invención incluyen pero no se restringe a metales alcalinos, por ejemplo sales de sodio y de potasio; sales de amonio; alquilamonio de C1-6, por ejemplo sales de dimetilamonio y de isopropilamonio; alcanolamonio, por ejemplo sal de monoetanolamonio; alquilsulfonio de C1-16, por ejemplo sales de trimetilsulfonio; mezcla de las mismas y similares. La molécula de ácido glifosato tiene tres sitios ácidos que tienen diferentes valores de pKa; por consiguiente sales mono, di y tribásicas, o cualquier mezcla de las mismas, o sales de cualquier nivel intermediario de neutralización pueden ser utilizadas. Las sales de glifosato son comercialmente significativas en parte debido a que éstas son solubles en agua. Muchas sales metálicas de amonio, alquilamonio, alcanolamonio, alquilsulfonio y sales metales alcalinos son altamente solubles en agua, permitiendo la formulación como soluciones a cosas altamente concentradas las cuales pueden diluirse en agua hasta el punto de uso. Dicha soluciones acuosas concentradas pueden contener de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 gramos por litro de glifosato, iikuííéikii&t i.'Z '>kl?ás?fe.*k.^M?i¡^t, expresado como equivalentes de ácido (g e.a./l). Las concentraciones mayores de glifosato, por ejemplo de aproximadamente 300 a aproximadamente 500 g e.a./l, se prefieren. La sales de glifosato se formulan alternativamente como composiciones solubles en agua o con capacidad de dispersión en agua, en la forma de por ejemplo polvos, granulos, pastillas o tabletas. Dichas composiciones frecuentemente se conocen como formulaciones secas, a pesar de que el término "seco" no debe entenderse en este contexto para que implique una ausencia total de agua. Típicamente, las formulaciones secas contienen menos que aproximadamente 5% en peso de agua, por ejemplo aproximadamente 0.5% aproximadamente 2% en peso de agua. Dichas formulaciones se pretenden para disolución o dispersión en agua hasta el punto de uso. Las formulaciones de glifosato secas contempladas pueden contener de aproximadamente 5% a aproximadamente 80% en peso de glifosato, expresado como equivalentes de ácido (% e.a.). Las concentraciones mayores de glifosato dentro de los intervalos anteriormente mencionados, por ejemplo de aproximadamente 50% a aproximadamente 80% de e.a., se prefieren. Las sales de glifosato especialmente útiles para elaborar formulaciones secas son sales de sodio y de amonio. Las composiciones para tratamiento de plantas y las composiciones líquidas y secas concentradas de la invención pueden contener opcionalmente uno o más ingredientes excipientes deseados. Los ingredientes excipiente especialmente útiles para las composiciones de glifosato son agentes tensioactivos, los cuales ayudan a la retención de las soluciones acuosas en aspersión sobre las superficies relativamente hidrófobas de las hojas de las plantas, así como ayudando al glifosato a penetrar la capa externa serosa (cutícula) de la hoja y por lo tanto poniéndolo en con contacto los tejidos vivos dentro de la hoja. Los agentes tensioactivos pueden llevar a cabo otras funciones útiles también. No hay restricción en el tipo o clase química de agentes tensioactivos que puede ser utilizado en las composiciones de glifosato de la ¡nvención. Los tipos no iónicos, aniónicos, catiónicos y amfotéricos, o combinaciones de más de uno de estos tipos, son todos útiles en situaciones particulares. Sin embargo, generalmente se prefiere que al menos uno de los agentes tensioactivos, si es que hay alguna presente, deba ser diferente a uno iónico, es decir, al menos uno de los agentes tensioactivos debe ser no iónico, catiónico o amfotérico. Muchos agentes tensioactivos útiles en la presente tienen una estructura química que comprende una o más porciones cada una que consiste de una unidad de óxido de alquileno de C2-4 o una cadena polimerizada o copolimerizada de unidades de óxido de alquileno de C2-4. Dichos agentes tensioactivos se refieren como agentes tensioactivos de polioxialquileno e incluyen tipos no iónicos, aniónicos, catiónicos y amfotéricos. Los agentes tensioactivos de polioxialquileno útiles en las composiciones actualmente contempladas contienen de aproximadamente 2 a -ri-. i it iiii-Jirirl TiMi-- aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno de C2-4. En los agentes tensioactivos de polioxialquileno preferidos las unidades de óxido de alquileno forman una o más cadenas ya sea de óxido de etileno u óxido de etileno y óxido de propileno copolimerizado, cada cadena de unidades de óxido de alquileno teniendo un grupo hídrido terminal o un alquilo de C1-4 o alcanoilo de C1-4 en el casquete terminal. Las porciones hidrófobas de los agentes tensioactivos útiles en las composiciones de la invención pueden estar basadas esencialmente en hidrocarburos, en cuyo caso las porciones hidrófobas son típicamente cadenas de C8-24, preferiblemente cadenas de C12-18, alquilo, alquenilo, alquilarilo, alcanoilo o alquenoilo. Estas cadenas pueden ser lineales o ramificadas. Alternativamente, las porciones hidrófobas pueden contener átomos de silicón, por ejemplo en la forma de grupos siloxano tales como grupos heptametiltrisiloxano, o átomos de flúor, por ejemplo como cadenas alquilo parcialmente fluorinadas o cadenas perfluoroalquilo. Entre los agentes tensioactivos, las clases especialmente preferidas incluyen alquilo de polioxietileno, éteres de alquenilo o alquilarilo, tales como alcoholes etoxilados primarios o secundarios o alquilfenoles, polioxietilen alquilo o éteres de alquenilo, tales como ácidos grasos etoxilados, éteres de alquilo de polioxietilen sorbitano, éteres de alquilo de glicerilo, éteres de sucrosa, poliglucósidos de alquilo, y similares. Los ejemplos específicos representativos de dichos agentes tensioactivos no iónicos incluyen polioxietilen (9) nonilfenol, Neodol™ 25-7 de Shell (un polioxietileno (7) de ,.• ¿ ^^ .A.^..A,Jj.... ^^jMj^.
C12-15 de alcohol primario lineal), Tergitol™ 15-S-9 de Union Carbide (un polioxietileno (9) de C12-15 del col secundario), Tween ™ 20 de ICI (un polioxietileno (20) de monolaurato de sorbitano) y Agrimul™ PG- 2069 de Henkel (un poliglucósido de alquilo de C9-11 ). Entre los agentes tensioactivos catiónicos, las clases especialmente preferidas incluyen alquilaminas terciarias de polioxietileno o alquenilaminas, tales como aminas grasas etoxiladas, agentes tensioactivos cuaternarias, alquileteraminas de polioxietileno, y similares. Los ejemplos específico representativos de dichos agentes tensioactivos catiónicos incluyen cocoamina de polioxietileno (5), ceboamina de polioxietileno (15), cloruro de diestearildimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de metil bis (2- hidroxietil)cocoamonio, cloruro de N-dodecilpiridina y cloruro de polioxipropilen (8) etoxitrimetilamonio. Las alquileteraminas de polioxietileno preferidas son aquellas descritas en la publicación PCT No. WO 96/32839. Muchos agentes tensioactivos catiónicos de amonio cuaternario de diversas estructuras se conocen en la técnica como útiles en combinación con glifosato y pueden ser utilizados en composiciones contempladas en la presente invención; tales como los agentes tensioactivos de amonio cuaternario que tiene la fórmula (NRaRbRcRd)mAn en donde A es un ion adecuado tal como cloro, cromo, yodo, acetato, sulfato, oh fosfato, m y n son enteros de tal manera que el balance de las cargas eléctricas positivas en los cationes (NRaRbRcRd) ejerce un balance en las cargas eléctricas negativas en los aniones A, y las opciones para Ra, Rb, Rc y Rd incluyen, sin limitación: (i) Ra es bencilo o alquilo o alquenilo de C8-24, preferiblemente de C12-18, y Rb, Rc y Rd son independientemente alquilo de C1-4, preferiblemente metilo; (ii) Ra y Rb son independientemente alquilo o alquenilo de C8-24, preferiblemente de C12-18, y Rc y Rd son independientemente alquilo de C1-4, preferiblemente metilo; (iii) Ra es alquilo o alquenilo de C8-24, preferiblemente de C12-18, Rb es una cadena de polioxialquileno que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno de C2-4, preferiblemente unidades de óxido de etileno, y Rc y Rd son independientemente alquilo de C1-4, preferiblemente metilo; (iv) Ra es alquilo o alquenilo de C8-24, preferiblemente de C12-18, R y Rc son cadenas de polioxialquileno que tienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno de C2-4, preferiblemente unidades de óxido de etileno, y Rd es alquilo de C1-4, preferiblemente metilo; o (v) Ra es una cadena de polioxialquileno que tiene de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno de C2-4 en la cual las unidades de óxido de alquileno de C3-4, preferiblemente unidades de óxido de etileno, predominan y Rb, Rc y Rd son independientemente alquilo de C1-4, preferiblemente metilo o etilo.
Los agentes tensioactivos ^preferidos de amonio cuaternario de este tipo son aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 5,464.807 a Claude et al. En una modalidad, el anión A asociado con bicho agentes tensioactivos de amonio cuaternario puede ser un anión de glifosato. Entre los agentes tensioactivos, incluyendo como es habitual en la técnica de agentes tensioactivos más correctamente descritos como zwitteriónicos, las clases especialmente preferidas incluyen óxidos de alquilaminas de polioxietileno, alquilbetaínas, aminoácidos sustituidos con alquilo y similares. Los ejemplos representativos de dichos agentes tensioactivos incluyen óxido de dodecildimetilamina, óxido de polioxietileno (2) cocoamina y estearildimetilbetaína. Las fuentes de referencia estándares a partir de las cuales un experto en la técnica puede seleccionar agentes tensioactivos adecuados, sin limitación a las clases anteriormente mencionadas, incluyen Handbook of Industrial Surfactants, segunda edición (1997) publicado por Gower, McCutcheon's Emulsifiers and Detergents, North American and International editions (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, sexta edición (1995) volúmenes 1 y 2, publicado por the Cosmetic, Toiletry and Fragance Association. Otros componentes opcionales de las composiciones de la invención incluyen agentes para modificar el color, viscosidad, propiedades formadoras de gel, punto de congelamiento, higroscopicidad, conducta formadora de torta, velocidad de disolución, capacidad de dispersión, u otras características de formulación. Los ejemplos de formulaciones comerciales de glifosato incluyen, sin restricción, aquéllas vendidas por Monsanto Company como los herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® NIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® y ACCORD®, todos los cuales contienen glifosato como su sal de isopropilamonio; aquellos vendidos por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY y RIVAL®, los cuales contienen glifosato como su sal de amonio; aquellos vendidos por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, el cual contiene glifosato como su sal de sodio; y aquellos vendidos por Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, el cual contiene glifosato como su sal de trimetilsulfonio. La selección de las relaciones de aplicación para una formulación de glifosato que es biológicamente efectivo está dentro de las habilidades del técnico ordinario de agricultura. Un experto en la técnica fácilmente reconocerá que las condiciones vegetales individuales, condiciones ambientales y condiciones de crecimiento pueden afectar el resultado logrado en la práctica del procedimiento de la presente invención. Después de dos décadas de uso de glifosato y de relación de los estudios publicados a dicho uso se ha provisto abundante información a partir de la cual el practicante para control de maleza puede seleccionar las relaciones de aplicación de glifosato que son efectivas con respecto al herbicida sobre las especies 4-A. Í í t .tíS particulares a las etapas de crecimiento particulares en condiciones ambientales particulares. Un procedimiento de la presente invención se aplica a cualesquiera y a todas las especies vegetales sobre las cuales el glifosato es biológicamente efectivo como un herbicida o regulador del crecimiento vegetal. Esto abarca una variedad muy amplia de especies vegetales a nivel mundial. Similarmente, las composiciones de la invención pueden aplicarse a cualesquiera u a todas las especies vegetales sobre las cuales el glifosato sea biológicamente efectivo. En una modalidad, un herbicida que contiene glifosato se aplica a la planta que comprende las construcciones de ADN de la presente invención, y las plantas se evalúan para la tolerancia al herbicida glifosato. Cualquier formulación de glifosato puede ser útil para evaluar las plantas que comprenden las construcciones de ADN de la presente invención. Por ejemplo, una composición de glifosato tal como Roundup Ultra ™ puede ser utilizada. Los parámetros de evaluación para una evaluación de la tolerancia de la planta al glifosato variarán dependiendo de numerosos factores. Los factores podrían incluir pero no se limitan al tipo de formulación de glifosato, la concentración y cantidad de glifosato utilizado en la formulación, el tipo de planta, la etapa de desarrollo de la planta durante el tiempo de la aplicación, las condiciones ambientales, el método de aplicación, y el número de veces en que una formulación particular que se aplica. Por ejemplo, las plantas se pueden evaluar en un ambiente de invernadero utilizando un método de aplicación mediante aspersión. El intervalo de prueba utilizando Roundup Ultra ™ puede incluir, pero no se limita a 236.5 ml/4000 metros cuadrados o a 7568 ml/4000 metros cuadrados. El intervalo comercialmente efectivo preferido puede ser a partir de 473 ml/4000 metros cuadrados a 1892 ml/metros cuadrados de Roundup Ultra ™, dependiendo de la cosecha y de la etapa del desarrollo de la planta. Una cosecha puede ser asperjada con al menos una aplicación de una formulación de glifosato. Para evaluar en el algodón una aplicación de 946 ml/4000 metros cuadrados en la etapa de tres hojas puede seguirse por aplicaciones adicionales en etapas posteriores en el desarrollo. Para el trigo una aplicación de 946 ml/4000 metros de Roundup Ultra ™ en la etapa de 3-5 hojas puede ser utilizada y puede seguirse con una aplicación pre o post-cosecha, dependiendo del tipo de trigo a ser evaluado. Los parámetros de prueba pueden optimizarse para cada cosecha con el objeto de encontrar la planta particular que comprende las construcciones de la presente invención que contienen el nivel de tolerancia a glifosato comercialmente efectivo deseado. Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Debe apreciarse por los expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos a continuación representan técnicas descritas por los inventores para que funcionen bien en la práctica de la invención. Sin embargo, los expertos en la técnica deben, a la luz de la presente descripción, apreciar que muchos cambios pueden hacerse en las modalidades específicas los cuales se describen e incluso se obtiene itirtÉH- ^M*"»---**""^ ,! -**— ****.. ^ -.--^j-^- un resultado parecido o similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, por lo tanto todos las explicaciones establecidas o mostradas en los dibujos anexos deben interpretarse como ilustrativas y no en sentido limitante.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Las construcciones de plásmido utilizadas son ya sea las construcciones de clonación pUC o las construcciones de transformación vegetal de doble límite que contienen un origen de la replicación de E. coli tal como ori322, un origen de replicación para intervalo amplio de hospedero tal como oriV u op'Ri, y una región codificante para un marcador de selección tal como Spc/Str que codifica para aminoglucósido adeniltransferasa Tn7 (aadA) que contiene resistencia a espectinomicina o estreptomicina, o un marcador de selección para gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación vegetal, la cepa bacteriana hospedera fue ABl o LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens. Los elementos genéticos se describen a continuación: P-e35S es el ARN 35S a partir de CaMV que contiene una duplicación de la región -90- 300 como se describen en la patente de E.U.A. 5,424,200 incorporada en la presente como referencia en su totalidad; P-FMV es el promotor 34S a partir del virus del mosaico de la higuera como se describe la patente de E.U.A. No. 5,378,619 incorporada en la presente como referencia en su totalidad; PeFMV es un derivado del promotor FMV que contiene un promotor FMV duplicado; CTP2 es la región del péptido de tránsito de la EPSP sintasa de Arabidopsis, se describe la patente de E.U.A. No. 5,633,435; aroA:CP4syn (aroA:CP4) es la región codificante para CP4 EPSP (secuencia sintética) como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,633,435 o la modificación adicional para la expresión en plantas basándose en el uso del codón de especies vegetales particulares; E9 3* es el extremo 3' de un aislado del gen RbcS de chícharo que funciona como una señal de poliadenilación; nos es el extremo 3' del gen de nopalin sintasa que funciona como una señal de poliadenilación; Hsp70 es la secuencia líder no traducida a partir de Petunia hybrida como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,362,865 incorporada en la presente como referencia en su totalidad; GUS es la secuencia codificante de ß- glucuronoidasa a partir de E. coli (Jefferson, R. A. Proc. Nati. Acad. Sci. USA., 83: 8447-8451, 1987); el límite externo (RB) y el límite izquierdo (LB) son a partir del plásmido Ti de las cepas de octopina y nopalina de Agrobacterium tumefaciens. El P-AtAct2 es el promotor a partir del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la región no traducida hacia 5' (UTR) del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct8 es el promotor a partir del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la UTR 5' del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct11 es el promotor a partir del gen de actina 11 de Arabidopsis thaliana; AtActl 1 es el intrón en la UTR 5' del gen de actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct1a es el promotor a partir del gen 1a de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1a es el líder no traducido e l-AtAct1a ese centro a partir del ADN genómico del gen de actina 1a; P-AtActlb es el promotor a partir del gen de actina 1b de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1b es el líder no traducido e l-AtAct1b es el intrón a partir del ADN genómico del gen de actina 1b; P-AtAct3 es el promotor a partir del gen de actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 es el líder no traducido e l-AtAct3 es el intrón a partir del ADN genómico del gen de actina 3; P-AtAct7 es el promotor a partir del gen de actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 es el líder no traducido e l-AtAct.7 es el intrón a partir del ADN genómico del gen de actina 7; P-AtAct12 es el promotor a partir del gen de actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct12 es el líder no traducido e l-AtAct12 es el intrón a partir del ADN genómico del gen de actina 12; P-AtEF1a (P-AtEF1 o EF1a) es el promotor a partir del gen del factor de elongación 1a de Arabidopsis thaliana, AtEF1 -i (AtEF1-i) es el intrón de la UTR 5' del gen del factor de elongación 1a de Arabidopsis thaliana. Las figuras 1-18 proveen ejemplos de las construcciones de transformación vegetal que contienen de uno a tres cassettes de expresión vegetal. Múltiples combinaciones de cassettes de expresión vegetal que comprende del promotor y elementos genéticos de la presente invención pueden construirse y evaluarse en plantas de cosechas por aquellos expertos en la técnica de la biología molecular vegetal sin llevar a cabo experimentación. Las construcciones ilustradas en las figuras no se consideran como las únicas construcciones que pueden ser ensambladas, pero sirven solamente como ejemplos a los expertos en la técnica. La figura 1 fiifiY líjate*!. **"*** ****** (pCGN8086) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct8) operativamente unido a un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 2 (pMON45325) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprenden al menos un promotor de la presente invención (P-AtAct11) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 3 (pMON45331 ) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtEF1 más el intrón) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 4 (pMON45332) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprende al menos un promotor de la presente invención (P-AtEF1 más el intrón) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 5 (pMON9190) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene tres cassettes de expresión en donde al menos dos promotores de la presente invención (P-AtEF1 más el intrón, AtEF1a-i; P-AtAct2 más el intrón, AtAct2i) están operativamente unidos al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn) y el promotor P-eFMV operativamente unido a CTP2-aroA:CP4syn. La figura 6 (pMON9153) provee cassettes de expresión que son idénticos a aquellos ilustrados en la figura 4 (pMON45332), este mapa de plásmido está ilustrado ..MH? ?muT ~* u~*?u?ust?lu para el propósito de la identificación de los cassette de expresión a partir de los datos mostrados en el fenotipo vegetal en las tablas de datos mostrados en la especificación. La figura 7 (pCGN8099) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprenden promotores híbridos de la presente invención, P-FMV-AtEF1a y P-e35S-AtAct8, dirigiendo la transcripción del gen de interés (aroA:cp4syn). La figura 8 (pCGN8088) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprenden un promotor de la presente invención, P-AtAct8 más el intrón, AtActdi, y el promotor P-eFMV que dirige la expresión de un gen de interés (aroA:CP4syn). La figura 9 (pCGN806d) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprende un promotor de la presente invención, P-AtAct2 más el intrón, AtAct2i, y el promotor P-eFMV que dirige la expresión de un gen de interés (aroA:CP4syn). La figura 10 (pCGNd096) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprende promotores híbridos de la presente invención, P-FMV-AtAct11 y P-e35S-AtAct2, dirigiendo la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La figura 11 (pCGN9151) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene dos cassettes de expresión que comprende promotores híbridos de la presente invención, P-FMV-AtEF1a y P-e35S-AtAct2, dirigiendo la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La figura 12 (pMON10156) provee un ejemplo de una á&á. t. ^-?^^ ^^^^A^i^^^^k.^ ,,.^^. construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende el promotor P-eFMV que dirige la expresión del gen de interés aroA:CP4syn, este vector se utiliza para propósitos comparativos con la secuencia del promotor de la presente invención. La figura 13 (pMON52059) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor híbrido (P-FMV-AtEF1a) dirigiendo la expresión del gen de interés (aroA:CP4syn). La figura 14 (pMON54952) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct1a más el intrón AtActla) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 15 (pMON54953) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct1b más el intrón AtActlb) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 16 (pMON54954) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct3 más el intrón AtAct3) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 17 (pMON54955) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct7 más el intrón AtAct7) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La figura 18 (pMON54956) provee un ejemplo de una construcción de transformación vegetal que contiene un cassette de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct12 más el intrón AtAct12) operativamente unido a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn).
EJEMPLO 2 Las construcciones de clonación y las construcciones GUS se listan en el cuadro 1. El promotor y el intrón de actina 2 de Arabidopsis (número de acceso Genbank U 41998 como se describe en An et al., Plant J. 10: 107- 121, 1996) se aisló utilizando ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como un molde (Rogers y Bendich, Plant Mol. Biol. 5: 69, 1998) utilizando SEQ ID NO: 1 (iniciador hacia adelante) y SEQ ID NO: 2 (iniciador reverso) en una reacción como sigue: 0.5 µg de ADN molde, 25 pmoles de cada uno de los iniciadores, polimerasa taq (BMB, indianápolis, IN) utilizando glóbulos de cera para PCR de "inicio caliente". Las condiciones del termociclador de PCR fueron las siguientes: 94°C por un minuto; 30 ciclos de: 92°C por 40 segundos, 55°C por un minuto, 72°C por un minuto y 30 segundos; y una extensión a 72°C de cinco minutos. La reacción de PCR se purificó utilizando GeneClean II (Bio101 Inc., Vista, CA), digerido con Hindlll y Ncol, y ligado dentro de la construcción pMON26149 (cuadro 1) digerido con Hindlll y Ncol. La clonar el promotor se verificó mediante secuencia y la construcción resultante se designó pMON26170 (cuadro 1 ).
CUADRO 1 Construcciones de clonación v construcciones GUS que contienen secuencias de los promotores de actina y de EF1 de Arabidopsis Construcción Descripción Promotor*/gen/3' pMON26149 construcción de clonación pMON26170 construcción de expresión Act2/GUS/nos vegetal pMON26171 construcción de expresión Actd/GUS/nos vegetal pMON8677 construcción de clonación pMON46407 construcción de expresión Act11/GUS/nos vegetal pMON26152 construcción de clonación pMON26177 construcción de expresión EF1/GUS/nos vegetal pMON 11750 construcción de expresión e35S/GUS/nos vegetal pMON 15737 construcción de expresión FMV/GUS/nos vegetal *Las secuencias de los promotores de actina y del factor de elongación también contiene la secuencia intrónica a partir de la UTR 5' del gen correspondiente.
EJEMPLO 3 El promotor y el intrón de actina d de Arabidopsis (número de acceso Genbank U 42007 como se describe en An et al., Plant J. 10: 107- 121 , 1996) se aisló utilizando ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como un molde, condiciones de PCR y los métodos de purificación descritos en el ejemplo 2 utilizando los iniciadores SEQ ID NO: 3 (iniciador hacia adelante) y SEQ ID NO: 4 (iniciador reverso). El promotor se clonó utilizando enzima de restricción como se describió en el ejemplo 2, la secuencia se verificó, y la construcción resultante se designó pMON26171 (cuadro 1 ).
EJEMPLO 4 El promotor y el intrón de actina 11 de Arabidopsis (número de acceso Genbank U 27931 como se describe en Huang et al., Plant Mol. Biol. 33: 125 - 139, 1997) se aisló utilizando ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como un molde, condiciones de PCR y los métodos de purificación descritos en el ejemplo 2 utilizando los iniciadores SEQ ID NO: 5 (iniciador hacia adelante) y SEQ ID NO: 6 (iniciador reverso). El promotor se clonó utilizando las enzimas de restricción EcoRV y Ncol y se ligó dentro de pMONd677 (cuadro 1 ), la secuencia se verificó, y la construcción resultante se designó pMON4d407(cuadro 1).
EJEMPLO 5 El promotor y el intrón del factor de elongación 1 de Arabidopsis (número de acceso Genbank X16430 como se describe en Axelos et al., Mol. Gen. Genet. 219: 106- 112, 19d9; Curie et al., NAR 19: 1305-1310; Curie et al., Plant Mol. Biol. 1d: 1063-1069, 1992; Curie et al., Mol. Gen. Genet, 238: 428-436, 1993) se aisló utilizando ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta como un molde, condiciones de PCR y los métodos de purificación it^^^i-- ?r?iiflí-'<^ - descritos en el ejemplo 2 utilizando los iniciadores SEQ ID NO: 7 (iniciador hacia adelante) y SEQ ID NO: 8 (iniciador reverso). El promotor se clonó utilizando las enzimas de restricción Hindlll y Ncol y se ligó dentro de pMON26152 (cuadro 1 ) como se describe en el ejemplo 2, la secuencia se verificó, y la construcción resultante se designó pMON26177(cuadro 1 ).
EJEMPLO 6 Las construcciones de transformación vegetal descritas se acoplaron dentro de Agrobacterium. La transformación en algodón se llevó a cabo esencialmente como se describe en WO/0036911 , incorporado en la presente como referencia en su totalidad. La transformación en Arabidopsis se llevó a cabo como se describe en Ye et al., Plant Journal 19: 249- 257, 1999. La transformación del tomate se llevó a cabo como se describió en la patente de E.U.A. No. 5,565,347 incorporado en la presente como referencia en su totalidad.
EJEMPLO 7 Una construcción de ADN se transforma dentro de una cosecha blanco de interés mediante un sistema apropiado de administración tal como un método de transformación mediado por Agrobacterium (véase por ejemplo patente de E.U.A. No. 5,569,834 incorporada en la presente como referencia en su totalidad, patente de E.U.A. No. 5,416,011 incorporada en la presente como referencia en su totalidad, patente de E.U.A. No. 5,631,152 incorporada en la presente como referencia en su totalidad, patente de E.U.A. No. 5,004,863 incorporada en la presente como referencia en su totalidad, y solicitud provisional de los E.U.A. No. 60/111795 incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Alternativamente, el método de bombardeo de partículas puede ser utilizado (véase por ejemplo, solicitudes de patentes WO 92/15675, WO 97/48814 y solicitud de patente europea 586,355, y patentes de E.U.A. Nos. 5,120,657, 5,503,998, 5,830,728 y 5,015,580, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia en su totalidad). Un gran número de sistemas y métodos de transformación y regeneración están disponibles y se conocen bien por los expertos en la técnica. Las plantas y progenie establemente transformadas se analizan subsecuentemente para la expresión del gen en los tejidos de interés mediante varios métodos moleculares, de inmunodiagnóstico, bioquímicos, y/o de evaluación de campo conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a una prueba de aspersión con una formulación de glifosato a concentraciones comercialmente efectivas que se lleva a cabo en una cámara de crecimiento o en el ambiente de campo.
¿ MkMá^,^^^^,^,^^^^, A. ^ *^?? ÉÉ ^ m*m* ?m» Mm EJEMPLO 8 Los ensayos GUS se llevan a cabo mediante métodos rutinarios conocidos por los expertos en la técnica (véase por ejemplo, Jefferson et al., EMBO J. 6:3901 , 1987). Para el algodón, las plantas RO se evaluaron. El tejido de seleccionó por tamaño a varias etapas de desarrollo, y las muestras se agruparon para análisis. La yema floral del algodón se cosechó y las muestras de tejido reproductivo masculino (anteras y filamentos), muestras de tejido reproductivo femeninos (estigma completo, estilo, y ovario), y la corona (sépalos y pétalos) se tomaron. Para la selección de tamaño, tres yemas florales a partir de cada etapa se seleccionaron que incluían varios tamaños incluyendo pequeñas (menores de 0.5 cm), medias (de 0.5-0.7 cm) y grandes (etapa de vela o flor abierta). Las muestras de hoja se colectaron aproximadamente a 1-2 semanas después de que las plantas algodón se habían colocado en el invernadero, y los otros tejidos se colectaron aproximadamente 1-2 meses después. Las primeras flores no se colectaron (las primeras cinco posiciones frutales se dejaron intactas). Para Arabidopsis, las plantas V1 se analizaron y solamente se evaluaron los segregantes homocigotos y heterocigotos. Se analizaron de 8 a 10 eventos por construcción (cinco plantas por evento). Los resultados de GUS a partir de Arabidopsis representan las muestras agrupadas de 8-10 eventos. Los valores en los cuadros descritos (cuadro 2 y cuadro 3) representan la expresión promedio de GUS para el tejido designado (pmoles/MU/min/mg).
EJEMPLO 9 Las plantas se analizaron para la expresión de GUS en tejido de hoja tejidos reproductivos incluyendo yemas florales inmaduras y flores. Los resultados demuestran en el cuadro 2. Las construcciones evaluadas incluyen pMON48407 (P-AtAct11 + intrón/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/GUS/nos), pMON26171 (P-AtAct8 + intrón/GUS/nos), pMON11750 (e35S/G US/nos), pMON26177 (P-EF1a + intrón/GUS/nos), y pMON5737 (P- FMV/GUS/nos). Los promotores de actina y del factor de elongación confieren altos niveles a la expresión de GUS en múltiples tejidos incluyendo tejidos reproductivos.
CUADRO 2 Expresión promedio de GUS V1 de Arabidopsis Construcción Hoja Yema floral Flor Ginoecio Androecio inmadura pMON48407 6944 7394 8359 ND ND pMON26170 45238 74099 54502 73623 217292 pMON26171 29343 35884 37125 76311 207100 pMON11750 60844 14032 16263 35882 115049 PMON26177 47598 72871 96420 191066 507370 pMON 15737 28314 57903 84457 44696 87876 i t l i i i ilfia iriritftl i t? -^^--^-^-^-^*^ **^*?»~. 3 EJEMPLO 10 Las plantas algodón RO se evaluaron para expresión del gen reportero de GUS en tejidos seleccionados de varias etapas de desarrollo. Las yemas florales se evaluaron por tamaños (pequeño, medio y grandes; grande= etapa de vela o flor abierta). El androecio representó los tejidos reproductivos masculinos incluyendo el receptáculo completo (estigma, estilo, y ovarios). La muestra de corola estuvo compuesta de sépalos y pétalos. Los tejidos se prepararon y se llevaron a cabo los ensayos para GUS como se describió en el ejemplo 8. Los resultados se resumen en el cuadro 3. Las construcciones evaluadas incluyeron pMON48407 (P-AtAct11 + intrón/gus/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/gus/nos) y pMON48407(P-AtActl 1 + intrón/gus/nos). Seis plantas se evaluaron y los valores promedio de GUS se obtuvieron por pMON26177. Veinte plantas se evaluaron y los valores promedio de GUS se obtuvieron por pMON26170. 8 plantas se evaluaron y los valores promedio de GUS se obtuvieron por pMON48407. Los resultados demuestran que los promotores de actina y del factor de elongación pueden ser utilizados para la expresión efectiva de los genes operativamente unidos, particularmente en tejidos reproductivos.
CUADRO 3 Resultados del ensayo aus para las plantas alaodón Construcción Promotor/intrón Tejido evaluado Resultados GUS pMON26177 EF1a hoja 11600 pMON26177 EF1 Corola pequeña 396 pMON26177 EF1a ginoecio pequeño 8670 pMON26177 EF1a androecio pequeño 13771 pMON26177 EF1a Corola media 362 pMON26177 EF1a ginoecio medio 3318 pMON26177 EF1 androecio medio 8006 pMON26177 EF1a Corola grande 351 pMON26177 EF1a ginoecio grande 500 pMON26177 EF1a androecio grande 15512 pMON26170 Act2 hoja 12718 pMON26170 Act2 Corola pequeña 1296 pMON26170 Act2 ginoecio pequeño 16684 pMON26170 Act2 androecio pequeño 7570 pMON26170 Act2 Corola media 742 pMON26170 Act2 ginoecio medio 10041 pMON26170 Act2 androecio medio 7893 pMON26170 Act2 Corola grande 289 pMON26170 Act2 ginoecio grande 3218 pMON26170 Act2 androecio grande 42737 pMON48407 Act11 hoja 28289 pMON48407 Act11 Corola pequeña 10 pMON48407 Act11 ginoecio pequeño 40755 pMON48407 Act11 androecio pequeño 47834 pMON48407 Act11 Corola media 742 pMON48407 Act11 ginoecio medio 52495 pMON48407 Act11 androecio medio 355573 pMON48407 Act11 Corola grande 1072 pMON48407 Act11 ginoecio grande 4869 pMON48407 Act11 androecio grande 42737 biehfr -ii ifr****4^^-' EJEMPLO 11 Las plantas transformadas también se evaluaron en prueba de aspersión en invernadero utilizando Roundup Ultra TM una formulación de glifosato como dispositivo aspersor Track (Roundup Ultra es una marcada comercial registrada de Monsanto Company). Las plantas estuvieron en la etapa de "dos" hojas verdaderas o en etapas posteriores de crecimiento y las hojas se secaron antes de aplicar la aspersión de Roundup (R). La formulación utilizada fue Roundup Ultra TM como una formulación de 1.35 kg/3.78 It e.a. (equivalente de ácido). La calibración utilizada fue como sigue: para un volumen de aspersión por 75.6 litros/4000 metros cuadrados: Velocidad de la boquilla: 9501 flujo uniforme Presión de la aspersión: 40 psi Altura de la aspersión: 45.7 centímetros entre la parte superior del techo y la punta de la boquilla Velocidad del circuito: 33 cm/seg., que corresponde a una lectura de 1950-1.0 volts. Formulación: Roundup Ultra TM (1.35 kg E.a./3.78 It). La concentración de la aspersión variará, dependiendo de los intervalos de evaluación deseados. Por ejemplo, para una velocidad deseada de 236.5 gramos/4000 metros cuadrados una solución de trabajo de 3.1 ml/L se utiliza, y para una relación deseada de 1892 gramos/4000 metros cuadrados un intervalo de trabajo de 24.8 ml/L se utiliza.
El periodo de evaluación variará, dependiendo de la cosecha, etapa de desarrollo de la planta, y nivel de tolerancia deseado.
EJEMPLO 12 Las construcciones de expresión vegetal utilizadas para la transformación del tomate se listan en el cuadro 4. Las plantas de tomate (TO) que contienen construcciones que comprenden al menos un promotor de actina o del factor de elongación (con el intrón) operativamente unidos a un gen de tolerancia a glifosato aroA:CP4 se seleccionan en una prueba de aspersión de glifosato en invernadero con una formulación de glifosato (Roundup Ultra TM) para la eficiencia de conferir tolerancia a glifosato a las plantas transgénicas de tomate. Opcionalmente, al menos una secuencia del promotor de actina o del factor de elongación operativamente unida a un gen aroA:CP4 y un promotor del virus de la coliflor eFMV operativamente unido a un aroA:CP4 transformado dentro de plantas de tomate se seleccionan mediante aplicación de la aspersión con glifosato (Roundup Ultra TM) . Las plantas de tomate se asperjan con 1419 gramos/4000 metros luego se evaluaron a las dos semanas después de la aplicación para el análisis de la tolerancia vegetativa y después de 60 días después de la aplicación para el análisis de la tolerancia reproductiva. Los resultados demuestran en el cuadro 4 y se clasifican de conformidad con la eficiencia de la selección de las líneas reproductivas tolerantes. El porcentaje de tolerancia vegetativa es el porcentaje de las líneas seleccionadas que demostraron suficiente tolerancia vegetativa al daño de glifosato como para ser consideradas para estudios adicionales de rasgos agronómicos en preparación de los candidatos comerciales. La tolerancia reproductiva porcentual es el porcentaje de las 5 líneas vegetativa tolerantes que también demostraron suficiente tolerancia reproductiva como para ser consideradas para evaluación agronómica adicional. Todas las construcciones probaron ser funcionales para proveer tolerancia vegetativa y tolerancia reproductiva a las plantas transgénicas de tomate. Varias combinaciones de los promotores son capaces de incrementar * 10 la eficiencia en la cual las líneas tolerantes vegetativa y reproductivas pueden * seleccionarse mediante la selección en este experimento. Las construcciones que contienen el promotor EF1a de Arabidopsis son las están más específicamente asociadas con un elevado porcentaje de líneas vegetativa tolerantes. El promotor P-Act2 en combinación con P-eFMV y P-AtEF1a 15 (pCGN9190) provee un incremento en el porcentaje de las líneas reproductivamente tolerantes que se seleccionan mediante este método. •'« f-»*»"». ^j-^Aj^afj-il-aita.fai-A CUADRO 4 Ensayos de aspersión en circuito en invernadero con la relación de aplicación de 1418. 8 aramos/4000 metros cuadrados* Construcción DescriDción Líneas % de tolerancia % de tolerancia evaluadas veqetativa1 reproductiva2 PCGN9190 eFMV/CP4+EF 930 83.2 52.4 1a/CP4+Act2 CP4 pCGN9153 EF1a/CP4 + 391 73.9 38.9 TFMV/CP4 PCGN8086 Act8/CP4 21 47.6 38.1 pCGN8099 FMV- 71 84.5 36.6 EF CP4 + Act8/CP4 pCGN8088 eFMV/CP4 + 144 79.9 34.7 Act8/CP4 PCGN45325 eF V/CP4 + 90 70.0 34.4 Act11/CP4 pCGN8096 FMV- 201 62.7 10.4 Act11/CP4 + Act2/CP4 pCGN8067 Act2/CP4 205 67.3 8.8 *Una aplicación Resultados agrupados a partir de 25 selecciones. Evaluados 14 días después de la aplicación 2 Resultados agrupados a partir de 25 selecciones. Evaluados más de 60 días después de la aplicación La producción de semilla de tomate se utiliza como una medida de la eficiencia de las varias secuencias de los promotores y combinación de los cassettes de expresión utilizados en la presente invención para conferir tolerancia a glifosato a plantas transgénicas de tomate. En el cuadro 5, lo resultados de tres experimentos de campo se muestran en las plantas transgénicas de tomate que contienen construcciones con los promotores de la presente invención dirigiendo la expresión de la secuencia codificante aroA:cp4 para tolerancia a glifosato. El experimento 1 es una evaluación de las plantas producidas a partir de las construcciones que contienen el promotor del virus del mosaico de la higuera (P-FMV) en la versión activa y duplicada (P-eFMV) y elementos genéticos adicionales en las construcciones que se encuentran también en las construcciones utilizadas para evaluar la secuencias de los promotores de la presente invención. Los elementos genéticos adicionales tales como la fuente de la secuencia no traducida hacia 5' y repetido de tránsito del cloroplasto también se evaluaron. La construcción pMON20998 comprende el P-eFMV, unido a la UTR 5' Hsp70 de petunia, el líder unido al péptido de tránsito del cloroplasto (CTP2) de Arabidopsis EPSPS, unido a la región terminadora E9 hacia 3' . La construcción pMON20999 difiere a partir de pMON20998 solamente en que el promotor es P-FMV. La construcción p-MON10156 difiere a partir de pMON20998 solamente en que el CTP esa partir del péptido de tránsito del cloroplasto (CTP4) de petunia EPSPS. La construcción pMON45312 difiere a partir de pMON20998 solamente en que la secuencia líder es la secuencia líder nativa de FMV. Las plantas de tomate se transplantaron hacia el campo en hileras. Las plantas que se asperjaron se trataron en el campo a una relación de 1418.8 gramos/4000 metros cuadrados con herbicida Roundup. La semilla de tomate se colectó a partir de la fruta y se pesó. Una línea de tomate no asperjada sirvió como el control para propósitos de comparación y la eficiencia de cada construcción se expresó como un porcentaje del control. El resultado 5 del experimento 1 (columna 1 del cuadro 5) es que el promotor FMV y P- eFMV solamente provee 5-11% de la producción de semilla de una muestra sin asperjar. El experimento 2 y 3 evaluar las construcciones de la presente invención en diferentes ubicaciones (columna 2 y 3 del cuadro 5). El experimento 2 se lleva cabo en la misma ubicación que el experimento 1 , las " 10 construcciones pCGN8099 (figura 7), pCGN9151 (figura 11) y pCGN9190 * (figura 5) tuvieron un buen desempeño al proveer 25-46% de la semilla con relación a la muestra sin asperjar. En una ubicación diferente que tuvo una temporada de crecimiento más fría, el experimento 3 demostró que pCGN8068 (figura 9), pCGN8088 (figura 8), pCGN8099, pCGN9151 , 15 pCGN9153 (figura 6), y pMON45325 (figura 2) son capaces de conferir suficiente tolerancia a glifosato a los tomates para mostrar 33-77% de las semillas normales establecidas con relación a la muestra sin asperjar. t? -k .* ..í.^.^^SÍSÍ^k^^^^^^&^^^^?i ' ~ CUADRO 5 Experimentos de producción de semilla de tomate Exp. 1 % en peso Exp. 2 °Á » en peso Exp. 3 % en peso de semillas de semillas de semillas Gramos Control Gramos Control Gramos Control pMON20998 0.52 5.3 pMON20999 0.84 8.6 pMON10156 0.50 5.1 pMON45312 1.07 11.0 pCGN8068 0.48 8.4 7.06 77.8 pCGN8088 0.43 7.6 3.09 34.1 pCGN8096 0.40 7.0 pCGN8099 1.85 32.5 6.93 76.4 pCGN9151 1.46 25.7 6.11 67.4 pCGN9153 0.68 12.0 4.03 44.4 pMON45325 2.64 46.4 pCGN8067 0.31 5.4 3.37 37.2 control 9.73 100.0 5.69 100.0 9.07 100.0 EJEMPLO 13 Las SEQ ID NOS: 1-8, y SEQ ID NOS: 13-21 son iniciadores de PCR diseñados a partir de la información de secuencias disponible de manera pública a partir de los genes de Arabidopsis thaliana Acti , Act2 (Genbank # U 41998), Act3, Act7, Act8 (Genbank #ATU 42007), Act11 (Genbank #ATU27981), Act12 y Elfla (Genbank #X 16430). Esa secuencia se utiliza para extender la secuencia de ácido nucleico utilizando técnicas de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase por ejemplo, Mullís et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263, 1986; Erlich, et al., solicitud de patente europea 50, 424; solicitud de patente europea 84, 796, solicitud de patente europea dos 158, 017, solicitud de patente europea 237, 362; Mullis, solicito de patente europeas 201, 184; Mullis et al., solicito de patente de E. U. A. No. 4,683,202; Erlich, solicitud de patente de E.U.A. 4,582,788; y Saiki, et al., patente de E.U.A. No. 4,683,194). Varios método de amplificación de PCR se conoce por los expertos en la técnica y se utiliza para identificar secuencias de ácido nucleicos adyacentes a una secuencia conocida. Por ejemplo, los métodos de PCR inverso (IPCR), los cuales se han utilizado para amplificar secuencias conocidas del ADN adyacentes a una región núcleo de secuencia conocida se han descrito. Otros métodos también están disponibles tal como PCR de captura (Langerstrom M., et al., PCR Methods Applic. 1 : 111 , 1991), y caminar sobre PCR (Parker, et al., Nucleic Acids Res. 19: 3055, 1991). Varios fabricantes también han desarrollado equipos basados en modificaciones de estos métodos para los propósitos de identificar secuencias de interés. Las ventajas técnicas incluyen mejorías en el diseño de iniciadores y del adaptador, mejorías en la enzima polimerasa, y capacidades de termociclador que se han facilitado más rápidas, métodos eficientes para aislar secuencia de interés.
CUADRO 5a Secuencias de iniciadores para aislamiento de secuencias de tos promotores de actina y EF1a de Arabidopsis At. Actina 2 hacia adelante: ! l i l i l í I GATATCAAGCTTCAACTA I I I I I ATGTATGC At. Actma 2 reverso: GCCTCAGCCATGGTGAGTCTGCTGCAAACACACAAAAAGAGTTCAAT At. Actina 8 hacia adelante: I I I I I I I I GATATCAAGCTTCCA I I I I I CTTTTGCATAATTC At. Actma 8 reverso:GCATCGGCCATGGTGAGTCTTCTGCAATCAAAAACATAAAGATCTGA At. Actina 11 hacia adelante: I I I I I i I I IAAGCTTGATATCACAACCAAATGTCAAATGG At. Actina 11 reverso: CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTC At. EF1a hacia adelante: l l l l l l l l l AAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTG At. EF1 a reverso: CTTTTCCCATGGTAGATTCTCTGGTCAACAAATC At. Actina 1a hacia adelante: CCCAAGCTTAAATGACATCAGATACACGC At. Actina 1b hacia adelante: CATAAGCTTAGAGGTCCAAATTCA At. Actina 1 reverso: CCATCAGCCATGGTCTTCTACCTTTATGCAAA At. Actina 3 hacia adelante: CCAAGCCTTACCACACTCAGATGCATAAACAAACACA At. Actina 3 reverso: CATCAGCCATGGTCTACTCTCTGCAAAAACA At. Actina 7 hacia adelante: GCAAAGCTTACTAGTCAACAATTGGCC At. Actina 7 reverso: GATCGGCCATGGTTCACTAAAAAAAAAG At. Actina 12 hacia adelante: GGAAGCTTGCGGCCGCTTTGTACTCTCACTGTTTCT Las hojas de las plantas jóvenes de Arabidopsis thaliana (1 g) se homogeneizaron en 9 ml de amortiguador CTAB (Saghai-Maroof et al., 1984, PNAS 81: 8014-8018). El amortiguador CTAB que contiene TrisHCI 100 mM, pH 7.8, NaCI 700 mM, EDTA 50 mM, CTAB al 1% (bromuro de alquiltrimetilamonio) y 2-mercaptoetanol 140 mM. Después de 90 minutos de incubación a 65°C, se añadieron 4.5 ml de cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1 ) y las muestras se mezclan por diez minutos. La capa acuosas se separó mediante centrifugación por 10 minutos a 1500 g y se re-extrajo con cloroformo: alcohol isoamílico. Después de la segunda centrifugación, la capa acuosa se transfirió a punto que contenían 50 ml de RNasa A 10 mg/ml (libre de DNasa) y se incuba a temperatura ambiente por 30 minutos para remover el ARN. El ADN se precipitó con 6 ml de isopropanol y se re-suspendió en un ml de amortiguador TrisHC1 10 mM pH 8.5. La solución de ADN se extrajo una vez con un volumen igual de fenol y una vez con un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico. Después de la centrifugación, 1/10 del volumen de acetato de sodio (3M, pH 5.2) se añadió a la capa acuosa, seguido por 2.5 volúmenes de ETA no. El ADN de retiró, se lavó con etanol al 70%, y se secó al aire y se re-suspendió en 0.2 ml de amortiguador TrisHC1 10 mM. El ADN genómico de Arabidopsis (100 ng) se utilizó en reacciones de PCR de 50 ml. La reacciones que contenían los iniciadores mostrados en el cuadro 5a contenían 0.2 mM de soluciones de iniciadores reversos y hacia adelante, 200 nM de dNTP y amortiguador para PCR con magnesio y mezcla de ADN polimerasa a partir de Expand TM High Fidelity PCR System (Roche Molecular Biochemicals). Después de una desnaturalización inicial de dos minutos a 94°C la reacciones se sometieron a ciclo 0.5 minutos a 94°C, 0.5 minutos a 55°C y 1.5 minutos a 72°C por 35 ocasiones. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis sobre el de agarosa al 1 %. Los fragmentos de ADN aislados del gel representaron la secuencias de Actina 1a, Actina 1b, Actina 7, y Actina 12 que se fosforilaron con T4 ADN cinasa y se ligaron a la construcción de clonación pUC19 defosforilada y cortada con Sma I. Las colonias blancas se seleccionaron para la presencia de insectos apropiados y se secuenciaron con M13 para confirmar la presencia de los promotores de actina. Las lonas seleccionadas se designaron como pMON54941 (P-AtAct1a), pMON54942 (P-AtAct1b), pMON54943 (P-AtAct7) y pMON54944 (P-AtAct12). Subsecuentemente, ios fragmentos de ADN de los promotores de actina fueron liberados mediante digestión con Hindlll y Ncol de las construcciones pUC19 que contenían las secuencias de los insertos, los fragmentos de ADN se aislaron en gel y se ligaron a pMON26165 que había sido digerido con las mismas enzimas de restricción. Un producto de PCR para el promotor de Actina 3 (P-AtAct3) se digirió con Hindlll y Ncol y se clonó directamente dentro de pMON26165 para formar pMON54951. pMON26165 contiene el segmento del gen GUS/terminador nos. La ligación con los segmentos promotores permite el ensayo de cada promotor para actividad funcional mediante la expresión de la enzima ß-glucuronidasa en las células vegetales. Las células vegetales pueden aislarse, por ejemplo, de protoplastos de hojas de tabaco, o las células vegetales pueden contenerse en un tejido u órgano vegetal, tal como, hoja, raíz, cotiledón, hipocotiledón, embrión, flor, u órgano de almacenamiento. El nivel de expresión de GUS dirigido por estos promotores se evalúa en el hipocotiledón de soya en comparación con GUS dirigido por el promotor P-e35S (cuadro 6). ADN plasmídico/partículas de oro se bombardearon a los hipocotiledones de soya y luego se ensayó histoquímcamente la actividad GUS después de 48 horas. Todos los promotores de Actina evaluados para este ensayo mostraron actividad funcional en un tejido hipocotiledón demostrando su utilidad para la expresión de transgenes en especies de plantas de cosechas heterólogas. Las construcciones que contenían aroA:CP4 EPSPS dirigidas mediante los promotores de actina 1a de Arabidopsis (pMON54952), actina 1b (pMON54953), actina 3 (pMON54954), actina 7 (pMON54955) y actína 12 (pMON54956) de la presente invención se prepararon en construcciones de transformación vegetal binarias de Agrobacterium para la expresión estable de EPSPS resistente a glifosato en plantas de cosechas. Estas construcciones se transforman dentro de células de soya y de algodón, las células se seleccionan y se regeneran hacia plantas sobre medio de cultivo para tejidos que contiene glifosato y los ensayo para la expresión de la proteína aroA:CP4 y para tolerancia a la aplicación de glifosato. Las plantas que demuestran tolerancia a glifosato comercialmente aceptable se desarrollan adicionalmente mediante métodos de cruza convencionales para transferir el rasgo de tolerancia a glifosato hacia germoplasmas adaptados para cultivo.
'"MÍñT*^^- ...»&? i^áíkl?.?iái íi^ffl^.d.^,.^ CUADRO 6 Actividades diferentes promotores de actina de Arabidopsis en ensayos transitorios en comparación con P-e35S EJEMPLO 14 El rendimiento del algodón se correlaciona con el número de brotes establecidos durante las primeras cuatro a cinco semanas de formación de prótesis. La retención de estos brotes hasta cápsulas maduras y su contribución a la cosecha de hilachas de algodón es un componente clave de la producción. Cuando se determina la eficiencia de las construcciones transgénicas para conferir tolerancia a herbicidas en el algodón, la cantidad de la retención de cápsulas es una medida de la eficiencia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgénicas que contiene promotores de la presente ¡nvención (cuadro 7) se evaluaron en condiciones de invernadero para retención de cápsulas. Los promotores dirigieron la expresión de la secuencia codificante aroA:CP4 para el fenotipo de tolerancia a glifosato. Las plantas se transformaron por un método mediado por Agrobacterium o mediante un método de pistola de partículas. Las construcciones para pistola t-4 . .i —-*- de partículas contenían un cassette de expresión que contenía GUS adicionan útiles para la localización histoquímica de la actividad de ß-glucuroidasa a partir de los promotores de la presente ¡nvención. Las plantas transgénicas se regeneran un sobre medio que contenía glifosato y las plantas con raíces sobre un medio para formación de raíces. Las glándulas con raíces se sembraron en el suelo y se transfirieron a una cámara de crecimiento para un periodo de consolidación. Las semillas a partir de estas líneas vegetales se conectaron y se plantaron. Quince plantas a partir de cada línea de asperjaron con glifosato a 1418 gramos/4000 metros cuadrados en la etapa de cuatro hojas. Al menos ocho plantas que sobrevivieron a partir de cada línea se asperjaron de nuevo en la etapa de ocho hojas con glifosato a 1418 gramos/4000 metros. En la madurez, el número de cápsulas en la primera posición de las primeras cinco cápsulas se contaron. Aquellas líneas que tuvieron tres o más de las cápsulas en la primera posición retenidas después de la aspersión con glifosato (mapa vegetal 3) se utilizaron para estudios posteriores. El cuadro 7 ilustra los datos producidos a partir de este estudio. El número de líneas mapeadas indica el número de líneas que sobreviven a la primera aplicación por aspersión de glifosato. El estándar comercial es la línea 1445 (pmon17136) que contiene el promotor P-FMV que dirige la expresión del gen CTP2-aroA:CP4/E9 a hacia 3', esta línea retiene menos que 1 de las 5 primeras cápsulas. Las construcciones, pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088, pCGN8068 proveen suficiente tolerancia reproductiva a glifosato en el algodón de tal manera que 14-35% de las líneas evaluadas a partir de estas construcciones fueron utilizadas para posteriores ensayos agronómicos.
CUADRO 7 Estudio de retención de cápsulas de algodón en invernadero Construcción Promotores # de líneas Mapa % de 3 mapeadas vegetal 3 PCGN8099 FMV:EF1a+e35S 104 36 34.6% :Act8 PCGN9153 EF1a+FMV 36 12 33.3% PCGN9165 EF1a+35S/G 3 1 33.3% US PCGN9152 EF1a 7 0 0.0% pCGN8088 Act8 + FMV 43 6 14.0% pCGN8086 Act8 7 0 0.0% pCGN8086 Act2 + FMV 37 7 18.9% PCGN8067 Act2 37 0 0.0% pCGN8084 Act2 + FMV + 5 0 0.0% 35S/GUS pCGN8085 Act2 + 1 0 0.0% FMV/GUS pCGN9164 Acti 1 + 21 1 4.8% 35S/GUS pMON45325 Acti 1 + FMV 43 0 0.0% PCGN8096 FMV:Act11 + 14 0 0.0% e35S:Act2 pCGN9154 FMV:Act11 + 16 1 6.3% e35S:Act2 Línea 1445 FMV <1.0 EJEMPLO 15 La producción de algodón se correlaciona con el número de brotes durante las primeras cuatro a cinco semanas de formación de brotes.
La retención de estos brotes hasta cápsulas maduras y su contribución a la producción de la hilacha de algodón es un componente clave de la producción. Cuando se determina la eficiencia de las construcciones transgénicas para conferir tolerancia a herbicida en el algodón, la cantidad de la retención de cápsulas es una medida de la eficiencia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgénicas que contienen promotores de la presente invención se evaluaron en condiciones de campo en dos publicaciones para retención de cápsulas. Las líneas de algodón transgénicas 502-254-2 (pCGN8068), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153), y 60-1 (pCGN9153) se compararon con 1445 (línea de tolerancia a glifosato) y PM1218BR (parental Paymaster 1218) que contenían la construcción pMON17136 (P-FMV/CTP2-aroA:E93'), una línea no transgénica de tipo silvestre, Coker 130 se incluyó. El diseño en campo es un diseño del bloque completo al azar que consiste de dos hileras por 60-90 centímetros x 3 réplicas. El glifosato se aplica como una formulación Roundup Ultra TM a relaciones de 0.50 kg ai/0.405 hectáreas = 1418 gramos de producto y 0.67 kg ai/0.405 hectáreas = 1891 gramos de producto en la etapa de ocho hojas del desarrollo de la planta del algodón. Todas las parcelas de algodón se manejaron agresivamente para control de maleza y de plagas de insectos, así como otros factores agronómicos tales como tiempo de plantado, fertilización, irrigación, uso de PGR y defoliación. El porcentaje de retención de cápsulas se determina al mapear la localización de cada una de las cápsulas retenidas mediante selección al azar de diez plantas a partir de la ; j Mí ? Yi.?á /..??£&?^,,tAíAk^Á^MMrí,kkik?¿k^?*tk¿?7 parte central de las dos hileras centrales (cinco a partir de cada hilera) de cada parcela para mapear. El primer mapeado debe realizarse a las cuatro semanas después de la primera flor (mapa de temporada media), un segundo mapa debe realizarse durante la cosecha. La colecta de los datos incluye el número de primeras posiciones de las cápsulas en la parte inferior de los cinco nodulos florales que se cuentan como una indicación de la tolerancia reproductiva de las líneas de algodón transgénicas a glifosato. El cuadro 8 ilustra la ventaja que los promotores de la presente invención han conferido a las plantas transgénicas de algodón para la retención de cápsulas. Esta tolerancia reproductiva mejorada ha resultado en un incremento en la producción de la HILAZA (4 9) y a un incremento en la producción de semillas (cuadro 10) también.
CUADRO 8 Retención de la cápsulas en el mapa de plantas durante temporada media de la parte inferior de las primeras cinco posiciones de las cápsulas ubicación 1 ubicación 2 no 1418 1891 no 1418 1891 tratada gramos/0.4 gramos/0.40 ttrraattaaddaa gramos/0, gramos/0. 05 5 hectáreas 405 405 hectáreas hectáreas hectáreas (17136) 68 67 53 81 63 62 1445 (8068) 87 72 64 77 80 69 502-254-2 (8068) 85 77 60 84 86 76 701-178-2 (8088) 89 81 80 79 76 73 502-53-2 (9153) 77 83 73 85 71 79 178-1 (9153) 60- 80 89 81 77 82 87 1 PM1218B 92 56 63 R CUADRO 9 Rendimiento de hilachas (qramos/0.405 hectáreas) v porcentaje de rendimiento (ubicación 1) Cultivar no tratado 1418 1418 1891 1891 gramos/0.40 gramos/0.405 gramos/0.40 gramos/0.4 5 hectáreas hectáreas 5 hectáreas 05 hectáreas 8068-502- 1103 960 87.0% 858 77.8% 254-2-4 8068-701- 1326 1219 91.9% 1177 88.8% 178-2-2 9153-60-1-1 1177 1206 102.5% 1171 99.5% 9153-178-1- 1112 769 69.2% 750 67.4% 1 8088-53-2- 1283 1071 83.5% 1097 85.5% 11 1445 1018 563 55.3% 490 48.1% C130 1200 0 0.0% 0 0.0% PM 1218 BR 1092 826 75.6% 713 65.3% CUADRO 10 Rendimiento de semilla de algodón (qramos/0.405 hectáreas) y porcentaje de rendimiento (ubicación 1) Cultivar no tratado 1418 1418 1891 1891 gramos/0.40 gramos/0.40 gramos/0.40 gramos/0.40 5 hectáreas 5 hectáreas 5 hectáreas 5 hectáreas 8068-502- 3357 2923 87.1% 2646 77.8% 254-2-4 8068-701- 3720 3521 94.7% 3328 89.5% 178-2-2 9153-60-1-1 3294 3413 103.6% 3316 100.7% 9153-178-1- 3468 2355 67.9% 2218 64.0% 1 8088-53-2- 3404 2950 86.7% 2968 87.2% 11 1445 2835 1624 57.3% 1372 48.4% C130 3272 0 0.0% 0 0.0% PM 1218 3036 2192 72.2% 1885 62.1% B/RR EJEMPLO 16 La eficiencia del promotor híbrido P-FMV-AtEF1a que dirige la expresión de la secuencia codificante CTP2-aroA:CP4 (figura 13, pMON52059) y P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93' (pMON 15737) se comparó en Arabidopsis thaliana transgénica. Las plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas se produjeron mediante la infiltración al vacío (Bechtold et al., C R Acad Paris Life Sci 316: 1194-1199) de semillas que se sembraron en el suelo en hileras en una cámara de crecimiento que se ajustó para 24°C, ciclo de 16 horas de luz (120 µE m"2 s"1) para permitir el crecimiento y desarrollo normal de las plantas. El evento pMON52059 V1 de las plantas de Arabidopsis transgénicas tolerantes a glifosato se seleccionaron mediante aplicación de aspersión de herbicida glifosato a una relación de 709 gramos/0.405 hectáreas, las plantas supervivientes se transplantaron dentro de macetas individuales. Ocho plantas pMON52059 V1 y ocho plantas pMON15737 homocigotas se asperjaron una segunda vez que correspondió con la observación de la posición herida de la planta, aproximadamente 16 días después de la aplicación de 709 gramos/0.405 hectáreas. La segunda aspersión determinará la eficiencia de las dos construcciones para conferir tolerancia reproductiva. Las plantas se observaron para efectos vegetativos de aplicación de glifosato. Todas las plantas tenían una tolerancia vegetativa completa y no se observaron flores anormales. Sin embargo, el aborto de silicuas ocurrió indicando que la semilla no se había establecido en las silicuas afeá taÉii4,A.t^^ abortadas. El número total de silicuas producidas por cada planta y las silicuas que contenían semillas (silicuas fértiles) se contaron y se calcularon. Los resultados se muestran en el cuadro 9 e indican que la construcción del promotor híbrido pMON52059 demostró una mejoría mayor a 10 veces en las silicuas fértiles, 89% en comparación con pMON 15737 al 8%. El número de estructuras fructificantes fértiles está relacionado con la cantidad de semillas que pueden producirse, esto es especialmente importante en las cosechas en donde la producción se asocia con el número de semillas. Las cosechas tales como el algodón, soya, cañóla, trigo, y maíz son cosechas en donde la tolerancia reproductiva a glifosato es esencial para una buena producción.
CUADRO 11 Comparación del promotor híbrido P-FMV-EF1a (pMON52059 )v P-FMV (pMON15737) para conferir tolerancia reproductiva a glifosato en plantas Arabidopsis pMON52059 PMON 15737 numero silicuas silicuas porcenta numero silicuas silicuas porcenta de fértiles totales je de de fértiles totales je de plantas fertilidad plantas fertilidad 8819 39 50 78.0% 1 74 540 13.7% 8820 626 691 90.6% 2 23 600 3.8% 8821 507 561 90.4% 3 1 470 0.2% 8822 0 69 0.0% 4 20 646 3.1% 8823 512 534 95.9% 5 43 717 6.0% 8827 326 354 92.1% 6 22 651 3.4% 8833 432 461 93.7% 7 178 868 20.5% 8838 323 374 86.4% 8 40 520 7.7% total 2765 3094 89.4% total 401 5012 8.0% l *..*** Jtht ^A. ».1S?~ ¡a^ kküri EJEMPLO 17 El girasol (Helianthus annuus L.) es una cosecha de importancia agronómica por su aceite y alimento. Las construcciones pMON45325 (figura 2), pMON45332 (figura 4), y pMON45331 (figura 3) de la presente invención se transformaron en el girasol. La transformación mediada por Agrobacterium del girasol se ha reportado (Schrammeijer et al., Plant Cell Reports, 9: 55-60, 1990; EP 0486 234). Los métodos conocidos por los expertos en la técnica de transformación vegetal con construcciones de expresión para trangenes pueden incluir hipocotiledones, meristemos apicales, protoplastos, y otros tejidos del girasol. Las líneas transgénicas de girasol SFB250-27 contienen el cassette de expresión pMON20999 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93,); SFB288- 01 , SFB295-09 contiene pMON45325 (P-FMV-aroA:CP4/EP3'::P-AtAct11 + intrón/CTP2-aroA:CP4/E93'); SFB289-01 contiene pMON45332 (P-AtEF1a + intrón/CTP2-aroA:CP4/E93'::P-eFMV/CTP2-aroA:CP4/E93'); SFB303-08, SFB303-09, SFB303-11 , y HA300B contienen pMON45331 (P-AtEF1a + intrón/CTP2-aroA:CP4/E9). Estas líneas se evalúan para tolerancia a glifosato como se muestran el cuadro 12. La tolerancia reproductiva a glifosato en el girasol puede medirse como una función del porcentaje de las cabezas normales, porcentaje del tamaño de la cabeza normal y la producción de polen. Estas plantas se asperjaron con glifosato a etapas de hojas V-4 y V-8 a relaciones de 0, 945. 9 gramos/0.405 hectáreas ó 1891.8 gramos/0.405 hectáreas. Las plantas de ^ s-. jy &e.^. a^.tfaa a girasol se evalúan para tolerancia vegetativa a glifosato. La tolerancia vegetativa se logra a 945.9 gramos/0.405 hectáreas y 1191.8 gramos/0.405 hectáreas en las hojas de la aspersión de glifosato en ambas etapas V4 y V8 del desarrollo vegetal. Las líneas vegetativas de girasol transgénico tolerantes a glifosato se han evaluado para valores de cabezas, porcentaje de cabezas normales, porcentaje de tamaño de cabeza normal, y porcentaje de producción de polen normal. Estos rasgos se evalúan en una prueba de campo en una ubicación. La tabulación de las evaluaciones de cabeza y de producción de polen se muestra en el cuadro 12. Las líneas seleccionadas a partir de las construcciones de la presente invención muestran porcentajes mayores de cabezas normales, generalmente porcentajes mayores de tamaño de cabeza normal y mejor producción de polen.
CUADRO 12 Evaluaciones de la resistencia del girasol al glifosato Línea # # de cabezas % de cabezas % de tamaño % de normales de cabeza producción normal de polen SFB250-27 28 29 75 36 SFB288-01 11 36 73 73 SFB295-09 28 57 64 68 SFB289-01 13 38 92 38 SFB303-08 25 68 92 64 SFB303-09 43 81 88 88 SFB305-11 45 71 84 100 HA300B 30 100 97 97 segregante no 0 0 0 0 trans EJEMPLO 18 Los elementos reguladores que actúan en cis necesarios para la regulación adecuada del promotor pueden identificarse mediante numerosos medios. En un método, el análisis de deleción se lleva a cabo para remover las regiones del promotor y los fragmentos resultantes del promotor se ensayan para actividad del promotor. Los fragmentos de ADN se consideran necesarios para la regulación del promotor sí la actividad del promotor truncado está alterada en comparación con el fragmento del promotor original. A través de este análisis de deleción, las pequeñas regiones de ADN pueden identificarse las cuales son necesarias para regulación positiva o negativa de la transcripción. Los motivos de la secuencia del promotor también pueden identificarse y los promotores novedosos pueden diseñarse para que contengan estos elementos cis para modular la expresión de las secuencias capaces de ser transcritas operativamente unidas. Véase por ejemplo patente de E.U.A. No. 5,223,419, incorporada en la presente como referencia en su totalidad, patente de E.U.A. No. 4,990,607 incorporada en la presente como referencia en su totalidad, y patente de E.U.A. No. 5,097,025 incorporada en la presente como referencia en su totalidad. Un método alternativo es buscar secuencias similares entre promotores con perfiles similares de expresión. Los promotores con patrones de actividad que se sobreponen pueden tener mecanismos reguladores comunes. Varios programas de computadora pueden utilizarse para identificar secuencias motivo conservadas, entre los promotores, incluyendo pero no limitadas a MEME, SIGNAL SCAN, o GENE SCAN. Estos motivos pueden representar sitios de unión para factores de transcripción los cuales actúan para regular a los promotores. Una vez que las secuencias motivo se identifican, su función puede ensayarse. Por ejemplo, las secuencias motivo pueden deletarse a partir del promotor para determinar si el motivo es necesario para la función adecuada del promotor. Alternativamente, el motivo puede añadir se ha un promotor mínimo para devaluar si es suficiente para activar la transcripción. Los elementos reguladores que se sospecha que son negativos pueden evaluarse para y ciencia mediante la adición de un promotor activo y evaluando la reducción en la actividad del promotor. Algunos elementos reguladores que actúan en cis pueden requerir otros elementos para funcionar. Por lo tanto, múltiples elementos pueden ser evaluados en varias combinaciones mediante cualquier número de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Una vez que los elementos promotores funcionales han sido identificados, los elementos promotores pueden modificarse al nivel de nucleótidos para afectar la unión a la proteína. Las modificaciones pueden ocasionar ya sea una mayor afinidad de unión o menor afinidad de unión lo cual podría afectar el nivel de transcripción a partir de ese promotor. Los elementos promotores pueden actuar de manera aditiva o sinergísticamente para afectar la actividad del promotor. A este respecto, los elementos promotores a partir de diferente regiones reguladoras hacia 5' pueden colocarse en tándem para obtener un promotor con un espectro de actividad diferente o con un perfil de expresión diferente. Por consiguiente, las combinaciones de elementos promotores a partir de fuentes heterólogas o la duplicación de elementos similares o del mismo elemento pueden conferir un mayor nivel de expresión de secuencias capaces de ser transcritas operativamente unidas. Por ejemplo, un elemento promotor puede multimerizarse para incrementar los niveles de expresión específicamente en el patrón afectado por ese elemento promotor. Los métodos técnicos necesarios para la construcción de construcciones de expresión que contienen los elementos novedosos diseñados que funcionan como reguladores hacia 5' se conocen por los expertos en la técnica. Los promotores diseñados se evalúan en construcciones de expresión y se evalúan de manera transitoria mediante la unión operativa de los promotores novedosos a un gen reportero adecuado tal como GUS y evaluando en un ensayo transitorio de planta. Los promotores novedosos están operativamente unidos a uno o más genes de interés y están incorporados dentro de una construcción de transformación vegetal junto con uno o más elemento reguladores adicionales y se transforman en plantas transgénicas de interés mediante un sistema de administración de ADN adecuado. Las plantas establemente transformadas y la progenie subsecuente se evalúa por varios métodos adecuados moleculares, de inmunodiagnóstico, bioquímicos, fenotípico os, o métodos de campo para evaluar la característica(s) deseada.
Habiendo ilustrado y descrito los principios de la presente invención, debe ser aparente las personas expertas en la técnica que la invención pueden modificarse en su arreglo y detallarse sin apartarse a partir de dichos principios. Los inventores reclaman todas las modificaciones estén dentro del espíritu y alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las publicaciones y documentos de patente publicados citados en esta especificación se incorporan en la presente como referencia hasta el mismo grado como citada publicación individual o solicitud de patente estuviera indicada específicamente e individualmente para ser incorporada como referencia.
LISTADO D SECUENCIAS <110> Fincher, Karen . Flasinski , Stanislaw Wilkinson, Jack Q. <120> Canstruccianßs novedosas para expresión vegetal <130> 11898 . 0018 . OOPCOO MOBS018P <140> US 60/171, 173 <141> 1999-12-16 <160> 30 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> OligonuclBÓtido sintético <400> 1 ttttttttga tatcaagctt caactatttt tatgtatgc <210> 2 <211> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> OliOjanu éotido sintético <400> 2 gcctcagcca tggtgagtct gctgcaaaca cacaaaaaga gttcaat <210> 3 <211> 42 <212> ADN <?!". Artificial <210> 4 <21X> 47 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> OU jonuclßótido sintético <400> 4 gcatcggcca tggtgagtct tctgcaatca aaaacataaa gatctga <210> 5 <211> .40 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> OUgonucleótido sintético <400> 5 ttttttttta agcttgatat cacaaccaaa tgtcaaatgg <210> 6 <211> 26 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 6 ccatctgcca tggtctatat cctgtc <210> 7 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> OUgonucleótido sintético <400> 7 ttttttttta agcttgatat cggaagtttc tctcttg <210> 8 <211> 33 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Oligonucleótido sintético <400> 8 cttttcccat ggtagatctc tggtcaacaa atc <210> 9 <211> 1219 <212> ADN <213> Arabidopsis Thaliana <400> 9 caactatttt tatgtatgca agagtcagca tatgtataat tgattcagaa tcgttttgac 60 gagttcggat gtagtagtag ccattattta atgtacatac taatcgtgaa tagtgatatg 120 atgaaacatt gtatcttatt gtataaatat ccataaacac atcatgaaag acactttctt 180 tcacggtctg aattaattat gatacaattc taatagaaaa cgaattaaat tacgttgaat 240 tgtatgaaat ctaattgaac aagccaacca cgacgacgac taacgttgcc tggattgact 300 cggtttaagt taaccactaa aaaaacggag ctgtcatgta acacgcggat cgagcaggtc 360 acagtcatga agccatcaaa gcaaaagaac taatccaagg gctgagatga ttaattagtt 420 taaaaattag ttaacacgag ggaaaaggct gtctgacagc caggtcacgt tatctttacc 480 tgtggtcgaa atgattcgtg tctgtcgatt ttaattattt ttttgaaagg ccgaaaataa 540 agttgtaaga gataaacccg cctatataaa ttcatatatt ttcctctccg ctttgaattg 600 tctcgttgtc ctcctcactt tcatcagccg ttttgaatct ccggcgactt gacagagaag 660 aacaaggaag aagactaaga gagaaagtaa gagataatcc aggagattca ttctccgttt 720 tgaatcttcc tcaatctcat cttcttccgc tctttctttc caaggtaata ggaactttct 780 ggatctactt tatttgctgg atctcgatct tgttttctca atttccttga gatctggaat 840 tcgtttaatt tggatctgtg aacctccact aaatcttttg gttttactag aatcgatcta 900 agttgaccga tcagttagct cgattatagc taccagaatt tggcttgacc ttgatggaga 960 gatccatgtt catgttacct gggaaatgat ttgtatatgt gaattgaaat ctgaactgtt 1020 gaagttagat tgaatctgaa cactgtcaat gttagattga atctgaacac tgtttaagtt 1080 agatgaagtt tgtgtataga ttcttcgaaa ctttaggatt tgtagtgtcg tacgttgaac 1140 agaaagctat ttctgattca atcagggttt atttgactgt attgaactct ttttgtgtgt 1200 ttgcagcaga ctcaccatg 1219 <210> 10 <211> 1271 <212> ADN <213> AraJsidopsis Thaliana <220> <221> misc_feature <222> (535Í..(536) <223> y = c o t/u <220> <221> misc_feature <222> (561).. 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atctttctct ctcgctgctt 660 ctcgaatctt ctgtatcatc ttcttcttct tcaaggtgag tctctagatc cgttcgcttg 720 attttgctgc tcgttagtcg ttattgttga ttctctatgc cgatttcgct agatctgttt 780 agcatgcgtt gtggttttat gagaaaatct ttgttttggg ggttgcttgt tatgtgattc 840 gatccgtgct tgttggatcg atctgagcta attcttaagg tttatgtgtt agatctatgg 900 agtttgagga ttcttctcgc ttctgtcgat ctctcgctgt tatttttgtt tttttcagtg 960 aagtgaagtt gtttagttcg aaatgacttc gtgtatgetc gattgatctg gttttaatct 1020 ^ # ¡N ~?toaU?¿U*¡S?* ±AJSll í-ñij ?if *¡ '- f f f --** **>-- -<• ?^fcri«hl-. tcgatctgtt aggtgttgat gtttacaagt gaattctagt gttttctctt tgagatctgt 1080 gaagtttgaa cctagttttc tcaataatca acatatgaag cgatgtttga gtttcaataa 1140 acgctgctaa tcttcgaaac taagttgtga tctgattcgt gtttacttca tgagcttatc 1200 caattcattt cggtttcatt ttactttttt tttagtgaac c 1241 <210> 26 <211> 1313 <212> ADN <213> Arabidopsis Thaliana <400> 26 tttctactct acatgtttct tgttattagg taaagtatta ggctcttttt ttaaaaaaaa 60 tgcttaatcc tctgggtacc tcgaaaaggg aataatactc tagttagata agtgcagcga 120 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tgaacgatat taagggccaa agttgcttct gttttccaga aatttttgaa 1020 acccaatttc agggcacgat tccacaacct ctttcttttc ttctagatct acgtaaattc 1080 atcaggtaca tgttattttt tttgtttatt tgatgtcaaa attttgatca caaggaggca 1140 aaaccaatat aaatgtaacg ctaatgcgtt tgattatggt atacgtaacg aattagattt 1200 aatggttaca ttttattgtt ttagatttag ttatgagatt ggcattaatt attggtgttt 1260 cctttgaatt tgctatgttt cttatgttga tgtaatcagc tagagattga acc 1313 é*¡tía**¡u?tA - -' -f ^ á ^i^^?aíiS <210> 27 <211> 1946 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sintético <400> 27 aattctcagt ccaaagcctc aacaaggtca gggtacagag tctccaaacc attagccaaa 60 agctacagga gatcaatgaa gaatettcaa tcaaagtaaa ctactgttcc ageacatgea 120 tcatggtcag taagtttcag aaaaagacat ccaccgaaga cttaaagtta gtgggcatct 180 ttgaaagtaa tcttgtcaac ategageage tggcttgtgg ggaccagaca aaaaaggaat 240 ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300 cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagetgt cctgacagcc 360 cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattage ttgagctcag 420 gatttagcag cattecagat tgggttcaat caacaaggta egagecatat caetttatte 480 aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540 tcgatatccc cgcggccgcg ttatcacaac caaatgtcaa atggaatgca tcagagacca 600 aacctgtaag agtccacaaa acaattcaaa gaaagaatat caacaattea gagattcaat 660 cctaaaacaa aaagagaact gaaaccaaat cgtacctaca cgaccagtga agataccaat 720 agagagetet gttgtagaat acaacacatt aagcgcaatt ageagaaaca gtctcttcat 780 ctgccgattt ccacttgtca ctactccaaa aacctcccaa accatttcca aaacagacac 840 ttttgccatg tetacatett tcccttcccc gaaaaacaca teatttecat caacggagta 900 aatatccggc ggeatatega tgctcgagac cgtcctatcg agaaaaggct tagccgcttc 960 cgtgaccgcc ggcgttcgtg gaccgtgaga ttgctgaaac gagcgagaat aagcaagcct 1020 cegatcatta geageatate cgacatcgct gctccgatca tcagggagct cgttatcgcc 1080 tcgaggatta aaggaaatgg atctctccat tttcttcttt gatcttaaag ttccaacttc 1140 ggcaaatact aaaatcaaca gtcagtcgta caaagaaact ctgettatac agtaaagtca 1200 atgggccact gttetaagee catatataat tttagaagee catagaatac aaaagagtca 1260 agaageattg accgcacaag aaaaaaacaa ttgttaaaaa gggttggtta gtgtgtatgt 1320 atatatgaaa tgcaacaaac attatacage ccattaaata tggttgttat aggtagatgt 1380 ccccattaag gaactttatc cagcccatta aattacttta cagagtaaaa gagagagaga 1440 agatttacag ttacgttacc aaattttcga aatgatttaa ttagtaataa ataaataatt 1500 aaatgtcagt tactctcttt agaaagctaa ataagacagc tgtttccacc aacaacgtga 1560 ctggtcgtgg ggtcctcctt cgttcaaagt gatattcaga aatcaacggc tgagatcttc 1620 tccatcaata tttattacgg gcctattcct tcctttttta aacttcaatt ctccggctca 1680 cattctcttc ttcattcgct ccgtttctct ctcaaaaact acacacccgt accacaccac 1740 caccctcctc gtttcctcag agatcccctc tctaacttct aaggtaatca catttccata 1800 acgttccátc gtcattgatt cttcattagt atgcgtttat gaagcttttt caatttaatt 1860 ctctttggta gatcttaaga ttcctctgtt tcttgcaaaa taaagggttc aattatgcta 1920 atatttttta tatcaatttt gacagg 1946 <210> 28 <211> 1695 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sintético <220> <221> isc_feature <222> (1198) .. 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Afflt 4J ggtgcagaat tgttaggcgc acctaccaaa agcatctttg cctttattgc aaagataaag 300 cagattcctc tagtacaagt ggggaacaaa ataacgtgga aaagagetgt cctgacagcc 360 cactcactaa tgcgtatgac gaacgcagtg acgaccacaa aagaattage ttgagctcag 420 gatttagcag cattccagat tgggttcaat caacaaggta egagecatat caetttatte 480 aaattggtat cgccaaaacc aagaaggaac tcccatcctc aaaggtttgt aaggaagaat 540 tegatatcaa gcttgatatc ggaagtttct ctcttgaggg aggttgctcg tggaatggga 600 cacatatggt tgttataata aaccatttcc attgtcatga gattttgagg ttaatatata 660 ctttacttgt tcattatttt atttggtgtt tgaataaatg atataaatgg ctcttgataa 720 tetgeattea ttgagatatc aaatatttac tetagagaag agtgtcatat agattgatgg 780 tccacaatca atgaaatttt tgggagacga acatgtataa ccatttgctt gaataacctt 840 aattaaaagg tgtgattaaa tgatgtttgt aacatgtagt actaaacatt cataaaacac 900 aaccaaccca agaggtattg agtattcacg gctaaacagg ggcataatgg taatttaaag 960 aatgatatta ttttatgtta aaccctaaca ttggtttcgg attcaacgct ataaataaaa 1020 ccactctcgt tgctgattcc atttatcgtt cttattgacc ctagccgcta cacacttttc 1080 tgcgatatct ctgaggtaag cgttaacgta cccttaratc gttcyttttc yttttcgtct 1140 gctgatcgtt getcatatta tttcgatgat tgttggattc gatgetettt gttgattnat 1200 cgttctgaaa attctnatct gttgtttaga ttttatcgat tgttaatatc aacgtttcac 1260 tgcttctaaa cgataattta ttcatgaaac tattttccca ttctgatcga tcttgttttg 1320 agattttaat ttgttcgatt gattgttggt tggtggatct atataegagt gaacttgttg 1380 atttgcgtat ttaagatgta tgtcgatttg aattgtgatt gggtaattct ggagtagcat 1440 aacaaatcca gtgttccctt tttctaaggg taattctcgg attgtttgct ttatatctct 1500 tgaaattgcc gatttgattg aatttagctc gcttagctca gatgatagag caccacaatt 1560 tttgtggtag aaatcggttt gactccgata gcggcttttt actatgattg ttttgtgtta 1620 aagatgattt tcataatggt tatatatgtc tactgttttt attgattcaa tatttgattg 1680 ttcttttttt tgcag 1695 <210> 29 <211> 1800 <212> DN <213> Artificial •*- lf-i- i- - i fr," "r" ...AJ-A.-A, -Jfrf*- Jt^^kf ^?.rtU?..&^?^ <220> <223> Sintético <220> <22l> misc_feature <222> (1068) .. 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Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una construcción de ADN que comprende: un cassette de expresión que comprende una secuencia de ADN del promotor que comprende al menos un elemento cis derivado a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23, una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína agronómicamente útil; y una región no traducida hacia 3' que funcionan en las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor y la región la traducida hacia 3', y la secuencia de ADN del promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural. 2.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural codifica un gen de tolerancia a herbicida. 3.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato. l iiíii tiJÉít i riirnii -**— «*«. ^- ^^..j-^^u^jjAa AfaA 4.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen de EPSP sintasa o un gen de glifosato oxidorreductasa. 5.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen aroA:CP4. 6.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 50 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 7.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 300 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 8.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de glifosato a una relación de 473 ml por 4000 metros cuadrados. 9.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la secuencia de ADN es un gen de control de Bacillus thuringiensis de insecto. 10.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la secuencia de ADN promotor consiste esencialmente de una región reguladoras hacia 5' derivada a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23. 1 1.- La secuencia de ADN del promotor quimérico que comprende al menos un elemento cis derivado a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23, y dicho al menos un elemento cis está operativamente unido a una secuencia del promotor de virus de ADN vegetal. 12.- La secuencia de ADN del promotor quimérico de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque el promotor de virus de ADN vegetal se selecciona partir del grupo que consiste del virus del mosaico de la coliflor y del virus del mosaico de la higuera. 13.- La secuencia de ADN del promotor quimérico de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la secuencia de ADN del promotor quimérico se selecciona partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, y SEQ ID NO: 30. 14.- Una construcción de ADN que comprende: un cassette de expresión que comprende una secuencia de ADN del promotor quimérico que comprende al menos un elemento cis derivado a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO: 4 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26; y dicho al menos un elemento cis está operativamente unido a una secuencia del promotor del virus de ADN vegetal; una secuencia de ADN estructural; y una región no traducida hacia 3' que funcionan las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y la secuencia de ADN promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural, 15.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural codifica un gen de tolerancia a herbicida. 16.- la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada además porque el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato. 17.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen de EPSP sintasa o un gen de glifosato oxidorreductasa. 18.- la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen aroA:CP4. 19.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque cuando se introduce dentro li ?ÉltÍÉÍII"í-"tafea¿Lt- -—'&^ t^^--^^t ¿'—i—^'' de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 50 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 20.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 300 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 21.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de glifosato a una relación de 473 ml por 4000 metros cuadrados. 22.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural es un gen de control de insecto. 23.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el gen de control de insecto se deriva a partir de Bacillus thuringiensis. 24.- La construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN del promotor quimérico que se selecciona a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, y SEQ ID NO: 30; una secuencia de ADN estructural; y una región no traducida hacia 3' que funcionan en las plantas ocasionando la adición de nucleótidos poliadenilados HÉri l íláiÍla*M lll?l?ÍB í¿s?mJtfjÉ^^Ík.Jlt? AíM*Í??¡ . al extremo 3' de la secuencia de ARN, en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor quimérico y a la región no traducida hacia 3', y la secuencia de ADN del promotor quimérico es heteróloga con respecto a la secuencia vial y estructural. 25.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural codifica un gen de tolerancia a herbicida. 26.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato. 27.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen de EPSP sintasa o un gen de glifosato oxidorreductasa. 28.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque el gen de tolerancia a glifosato es un gen aroA:CP4. 29.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 50 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 30.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque cuando se introduce dentro Irtii i i i iiiiifEf.1t ?t?? tftfftt - ^"^J"*-* »*** — ?^ ?*ú*, t^!**l ?ii***^?fj de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación acuosa de glifosato que comprende al menos 300 gramos de equivalente de ácido por litro de glifosato. 31.- La construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada además porque cuando se introduce dentro de una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de glifosato a una relación de 473 ml por 4000 metros cuadrados. 32.- Una planta de cosecha transgénica que comprende la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 2. 33.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha monocotiledónea. 34.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha dicotiledóneas. 35.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato. 36.- Una planta de cosecha transgénica que comprende la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 9. 37.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha monocotiledónea. 38.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha dicotiledónea. 39.- Una planta de cosecha transgénica que comprende la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 14. 40.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha monocotiledónea. 41.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha dicotiledónea. 42.- Una planta de cosecha transgénica que comprende la construcción de ADN de conformidad con la reivindicación 24. 43.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha monocotiledónea. 44.- La planta de cosecha transgénica de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque dicha planta de cosecha es una especie de cosecha dicotiledónea. 45.- Una construcción de ADN que comprende un primer cassette de expresión y un segundo cassette de expresión, en donde dicho primer cassette de expresión comprende una secuencia de ADN promotor que comprende al menos un elemento cis deriva a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23; una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína agronómicamente útil; y una región no traducida hacia 3' que funcionan en las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos 5 poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y la secuencia de ADN promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural; y dicho segundo cassette de expresión comprende una secuencia de ADN promotor que comprende al menos una ío elemento cis deriva a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo ** que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23; una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína agronómicamente útil; y una región no traducida hacia 3' que funcionan en las plantas para ocasionar la adición de nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de 15 ARN; en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y la secuencia de ADN promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural. 46.- Un método para expresar una secuencia de ADN estructural en una planta, el método comprendiendo: (1 ) proveer una construcción de 20 ADN que comprende un promotor que es funcional en una célula vegetal, el promotor comprendiendo al menos un elemento cis derivado a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, y SEQ ID NO: 23; y dicho al menos un elemento cis está 0 operativamente unido a una secuencia heteróloga del promotor; una secuencia de ADN estructural que codifica una proteína agronómicamente útil; y una región no traducida hacia 3' que funciona ocasionando la adición de nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde 5 el gen estructural está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ADN estructural; (2) introducir la construcción de ADN dentro de una célula vegetal; y (3) regenerar la célula vegetal para producir la planta de manera que la secuencia de ADN estructural sea capaz de expresarse en la planta. ío 47.- Un método para expresar una secuencia de ADN estructural la» en una planta, el método comprendiendo: (1) proveer una construcción de ADN que comprende un promotor que es funcional en una célula vegetal, el promotor comprendiendo una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 15 y SEQ ID NO: 30; una secuencia de ADN estructural; y una región no traducida hacia 3' que funciona ocasionando la adición de nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen estructural está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y el promotor es heterólogo con respecto a la secuencia de ADN 20 estructural; (2) introducir la construcción de ADN dentro de una célula vegetal; y (3) regenerar la célula vegetal para producir la planta de manera que la secuencia de ADN estructural sea capaz de expresarse en la planta. 48.- Un método para controlar malezas, el método comprendiendo: (1 ) proveer una planta de cosecha transformada con una construcción de ADN que comprende un promotor que es funcional en una célula vegetal, el promotor comprendiendo al menos un elemento cis derivado a partir de una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26; un gen de tolerancia a glifosato; una región no traducida hacia 3' que funciona ocasionando la adición de nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen de tolerancia a glifosato está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y el promotor es heterólogo con respecto al gen de tolerancia a glifosato; y (2) aplicar a la planta de cosecha una cantidad suficiente de glifosato para controlar las malezas sin dañar la planta de cosecha. 49.- Un método para controlar malezas, el método comprendiendo: (1) proveer una planta de cosecha transformada con una construcción de ADN que comprende un promotor que es funcional en una célula vegetal, el promotor comprendiendo una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NO. 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, y SEQ ID NO: 30; un gen de tolerancia a glifosato; una región no traducida hacia 3' que funciona ocasionando la adición de nucleótidos poliadenilados en el extremo 3' de la secuencia de ARN; en donde el gen de tolerancia a glifosato está operativamente unido al promotor y a la región no traducida hacia 3', y el promotor es heterólogo con respecto al gen de tolerancia a glifosato; y (2) aplicar a la planta de cosecha una cantidad suficiente de glifosato para controlar las malezas sin dañar la planta de cosecha.
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