ES2386771T3 - Construcciones de ADN para expresión de polipéptidos heterólogos en plantas - Google Patents

Construcciones de ADN para expresión de polipéptidos heterólogos en plantas Download PDF

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Abstract

Un promotor híbrido que comprende la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 28.

Description

Construcciones de ADN para expresión de polipéptidos heterólogos en plantas
Campo de la invención
La presente invención se refiere al aislamiento y uso de moléculas de ácido nucleico para control de expresión génica, específicamente nuevos promotores de plantas.
Antecedentes de la invención
Uno de los objetivos de la ingeniería genética de plantas es producir plantas con características o rasgos agronómicamente importantes. Recientes avances en la ingeniería genética han proporcionado las herramientas necesarias para producir plantas transgénicas que contengan y expresen genes ajenos (Kahl y col., World J. of Microbiol. Biotech. 11:449-460, 1995). Los rasgos o cualidades particularmente deseables de interés para ingeniería genética de plantas incluirían pero sin limitación resistencia a insectos, enfermedades fúngicas y otras plagas y agentes que provocan enfermedades, tolerancias a herbicidas, tiempo de conservación o estabilidad potenciados, rendimiento, tolerancias ambientales y potenciaciones nutricionales. Los avances tecnológicos en transformación y regeneración de plantas han permitido a los investigadores tomar ADN exógeno, tal como un gen o genes de una fuente heteróloga o nativa, e incorporar el ADN exógeno en el genoma de la planta. En un enfoque, la expresión de un nuevo gen que no se expresa normalmente en una planta partícula o tejido vegetal puede conferir un efecto fenotípico deseado. En otro enfoque, la transcripción de un gen o parte de un gen en una orientación antisentido puede producir un efecto deseable evitando o inhibiendo la expresión de un gen endógeno.
Para producir una planta transgénica, una construcción que incluye una secuencia de gen heterólogo que confiere un fenotipo deseado cuando se expresa en la planta se introduce en una célula vegetal. La construcción también incluye un promotor vegetal que se une operativamente a la secuencia del gen heterólogo, con frecuencia un promotor no asociado normalmente con el gen heterólogo. La construcción se introduce después en una célula vegetal para producir una célula vegetal transformada, y la célula vegetal transformada se regenera en una planta transgénica. El promotor controla la expresión de la secuencia de ADN introducida a la que se une operativamente el promotor y de este modo afecta a la característica deseada conferida por la secuencia de ADN.
Sería ventajoso tener varios promotores para adaptar la expresión génica de modo que se transcriba un gen o genes eficazmente en el momento correcto durante el crecimiento y desarrollo de la planta, en la localización óptima de la planta, y en la cantidad necesaria para producir el efecto deseado. Por ejemplo, la expresión constitutiva de un producto génico puede ser beneficiosa en una localización de la planta pero menos beneficiosa en otra planta de la planta. En otros casos, puede ser beneficioso tener un producto génico producido en un cierto estadio del desarrollo de la planta o en respuesta a ciertos estímulos ambientales o químicos. El desarrollo comercial de germoplasma mejorado genéticamente también ha avanzado al estadio de introducir múltiples rasgos en plantas de cultivo, con frecuencia denominado enfoque de apilamiento génico. En este enfoque, pueden introducirse múltiples genes que confieren diferentes características de interés a una planta. Es importante cuando se introducen múltiples genes en una planta que cada gen se module o controle para expresión óptima y que los elementos reguladores sean diversos para reducir el potencial de silenciamiento génico. A la luz de estas y otras consideraciones, resulta evidente que el control óptimo de la expresión génica y diversidad de elementos reguladores son importantes en la biotecnología de plantas.
Sumario de la invención
La presente invención se refiere a un promotor híbrido que comprende las secuencias expuestas en SEC ID Nº: 28. Dicho promotor híbrido es una secuencia promotora quimérica que comprende al menos un elemento potenciador cis de un promotor del Virus del Mosaico de la Escrofularia (FMV) unido operativamente con al menos un elemento cis de un promotor del factor de elongación de Arabidopsis a (EF1a), consistiendo este último esencialmente en una región reguladora 5’ derivada de SEC ID Nº: 12.
La invención se refiere además a una construcción de ADN que comprende: uno o más casetes de expresión que comprenden una secuencia de ADN promotora híbrida como se ha definido anteriormente y una secuencia de ADN estructural unida operativamente con el promotor híbrido.
El gen estructural puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en la que la expresión de la secuencia dé como resultado un rasgo o producto agronómicamente útil en una planta de cultivo transgénica.
De acuerdo con otro aspecto de la invención hay una construcción de ADN que comprende una secuencia de ADN estructural unida operativamente con las secuencias promotoras de la presente invención que codifican una proteína empleada para conferir tolerancia a herbicidas a una planta de cultivo. Esta proteína de tolerancia a herbicidas incluye, pero sin limitación, genes de proteínas de tolerancia a glifosato tales como gen de EPSP sintasa resistente a glifosato solo, o en combinación con uno o más genes de proteína degradante de glifosato.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporciona una construcción de ADN tal como la descrita anteriormente en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de tolerancia a glifosato, de modo que cuando la construcción de ADN se introduce en una célula vegetal, confiere a la célula vegetal tolerancia a una formulación de glifosato acuosa que incluye al menos 50 gramos de equivalente ácido por litro (g a.e/l) de glifosato. En otras realizaciones relacionadas, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a formulaciones de glifosato que tienen concentraciones de glifosato más altas (por ejemplo, al menos 300 gramos de equivalente ácido por litro de glifosato). De acuerdo con una realización, la construcción de ADN confiere a la célula vegetal tolerancia a al menos una aplicación de Roundup Ultra® a una tasa de 1,12 kg/hectárea (16 onzas (oz) por acre), por ejemplo, y en otras realizaciones, la tolerancia de glifosato se extiende a de una a dos o más aplicaciones de 1,12 kg/hectárea (16 onzas (oz) por acre), 2,24 kg/hectárea (32 onzas (oz) por acre) o 4,48 kg/hectárea (64 onzas (oz) por acre), por ejemplo.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan plantas de cultivo transgénicas que se transforman con una construcción de ADN como se ha descrito anteriormente, incluyendo especies monocotiledóneas y especies dicotiledóneas. Los inventores han descubierto que los promotores de actina de Arabidopsis y EF1a de Arabidopsis son suficientemente activos en otras especies vegetales de cultivo tales como algodón, tomate y girasol, por ejemplo, que cuando se usan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato, tal como, aroA:CP4, las plantas toleran tasas de aplicación comerciales de glifosato, mostrando buena tolerancia vegetativa y bajo daño a tejidos reproductivos. Tales promotores también pueden usarse para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero sin limitación, genes que confieren tolerancia a herbicidas, combate de insectos, resistencia a enfermedad, estabilidad o tiempo de conservación aumentados, mayor rendimiento, potenciación nutricional, expresión de un agente farmacéutico u otro producto polipeptídico deseado, o un cambio deseable en la fisiología o la morfología de la planta, y así sucesivamente.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan plantas de cultivo transgénicas que se transforman con múltiples construcciones de ADN que comprenden los promotores de actina de Arabidopsis y EF1a de Arabidopsis que son suficientemente activos en otras especies vegetales tales como algodón, tomate, girasol, por ejemplo, que cuando se usan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato tal como aroA:CP4, las plantas toleraron las tasas de aplicación comerciales de glifosato, mostrando buena tolerancia vegetativa y bajo daño a tejidos reproductivos. Tales promotores pueden usarse también para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero sin limitación, genes que confieren tolerancia a herbicidas, combate de insectos, resistencia a enfermedad, estabilidad o tiempo de conservación aumentados, mayor rendimiento, potenciación nutricional, expresión de un agente farmacéutico u otro producto polipeptídico deseado o un cambio deseable en la fisiología o morfología de la planta, y así sucesivamente.
De acuerdo con otra realización de la invención, se proporcionan plantas de cultivo transgénicas que se transforman con construcciones de ADN que comprenden los promotores de actina de Arabidopsis y EF1a de Arabidopsis como moléculas de ADN quiméricas en fusión con moléculas de ADN de caulimovirus que tienen actividad promotora en plantas suficientemente activa en otras especies vegetales tales como algodón, tomate, colza, soja y girasol, por ejemplo, que cuando se usan para controlar la expresión de un gen de tolerancia a glifosato tal como aroA:CP4, las plantas toleran tasas de aplicación comerciales de glifosato, que muestran buena tolerancia vegetativa y bajo daño a tejidos reproductivos. Tales promotores también pueden usarse para expresar otros genes de interés en plantas, incluyendo, pero sin limitación, genes que confieren tolerancia a herbicidas, combate de insectos, resistencia a enfermedad, estabilidad o tiempo de conservación aumentados, mayor rendimiento, potenciación nutricional, expresión de un agente farmacéutico u otro producto polipeptídico deseado o un cambio deseado en la fisiología o morfología de la planta, y así sucesivamente.
De acuerdo con otra realización de la invención se proporcionan procedimientos para expresar una secuencia de ADN estructural en una planta. Tales procedimientos comprenden proporcionar una construcción de ADN como se ha descrito anteriormente, introducir la construcción de ADN en una célula vegetal y regenerar la célula vegetal para producir una planta de modo que el ADN estructural se pueda expresar en la planta. De acuerdo con una realización relacionada, se proporciona un procedimiento para combatir malas hierbas en el que la construcción de ADN comprende un gen de tolerancia a glifosato y se aplica a una planta de cultivo transformada con la construcción de ADN una cantidad de glifosato que es suficiente para combatir malas hierbas sin dañar significativamente a la planta de cultivo.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un mapa plasmídico de pCGN8086
La Figura 2 es un mapa plasmídico de pMON45325
La Figura 3 es un mapa plasmídico de pMON45331
La Figura 4 es un mapa plasmídico de pMON45332
La Figura 5 es un mapa plasmídico de pCGN9190
La Figura 6 es un mapa plasmídico de pCGN9153
La Figura 7 es un mapa plasmídico de pCGN8099
La Figura 8 es un mapa plasmídico de pCGN8088
La Figura 9 es un mapa plasmídico de pCGN8068
La Figura 10 es un mapa plasmídico de pCGN8096
La Figura 11 es un mapa plasmídico de pCGN9151 La Figura 12 es un mapa plasmídico de pMON10156 La Figura 13 es un mapa plasmídico de pMON52059 La Figura 14 es un mapa plasmídico de pMON54952 La Figura 15 es un mapa plasmídico de pMON54953 La Figura 16 es un mapa plasmídico de pMON54954 La Figura 17 es un mapa plasmídico de pMON54955 La Figura 18 es un mapa plasmídico de pMON54956
Breve descripción de la lista de secuencias
SEC ID Nº: 1 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act2 SEC ID Nº: 2 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act2 SEC ID Nº: 3 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act8 SEC ID Nº: 4 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act8 SEC ID Nº: 5 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act11 SEC ID Nº: 6 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act11 SEC ID Nº: 7 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de EF1 SEC ID Nº: 8 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de EF1 SEC ID Nº: 9 es la secuencia del promotor de Act2 que incluye la secuencia intrónica del gen Act2. Las posiciones de bases 1 -764 representan la secuencia promotora; las posiciones de base 765-1215 representan el intrón seguido de 5 bases de región 5’ no traducida (5’ UTR) antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de base 597. SEC ID Nº: 10 es la secuencia del promotor de Act8 que incluye el primer intrón del gen Act8. Las posiciones de bases 1-797 representan la secuencia promotora; las posiciones de base 798-1259 representan el intrón seguido de 10 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de base 646. SEC ID Nº: 11 es la secuencia del promotor Act11 que incluye el primer intrón del gen Act11. Las posiciones de bases 1-1218 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1219-1381 representan el intrón seguido de 10 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de base 1062. SEC ID Nº: 12 es la secuencia del promotor de EF1 que incluye el primer intrón del gen EF1. Las posiciones de bases 1-536 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 537-1137 representan el intrón seguido de 22 bases de 5’ UTR antes de la ATG; el sitio de inicio de la transcripción se localiza en la posición de bases 481. SEC ID Nº: 13 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act1a SEC ID Nº: 14 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act1b SEC ID Nº: 15 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act1a y Act1b SEC ID Nº: 16 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act3 SEC ID Nº: 17 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act3 SEC ID Nº: 18 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act7 SEC ID Nº: 19 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act7 SEC ID Nº: 20 es el cebador de PCR directo usado para el aislamiento del promotor de Act12 SEC ID Nº: 21 es el cebador de PCR inverso usado para el aislamiento del promotor de Act12 SEC ID Nº: 22 es la secuencia del promotor de Act1a que incluye el primer intrón del gen Act1a. Las posiciones de bases 1-1033 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1034-1578 representan el intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 23 es la secuencia del promotor de Act1b que incluye el primer intrón del gen Act1b. Las posiciones de bases 1-914 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 915-1468 representan la secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 24 es la secuencia del promotor de Act3 que incluye el primer intrón del gen Act3. Las posiciones de bases 1-1023 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1024-1642 representan la secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 25 es la secuencia del promotor de Act7 que incluye el primer intrón del gen Act7. Las posiciones de bases 1-600 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 601-1241 representan la secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 26 es la secuencia del promotor de Act12 que incluye el primer intrón del gen Act12. Las posiciones de bases 1-1017 representan la secuencia promotora; las posiciones de bases 1018-1313 representan la secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 27 es la secuencia del promotor de FMV-Act11 quimérico que incluye el primer intrón del gen Act11. Las posiciones de bases 1-536 representan la secuencia promotora de FMV; las posiciones de bases 553-1946 representan el promotor de Actina 11 de Arabidopsis, secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 28 es la secuencia del promotor de FMV-EF1a quimérico que incluye el primer intrón del gen EF1a. Las posiciones de bases 1-536 representan la secuencia promotora de FMV; las posiciones de bases 553-1695 representan el promotor de EF1a, secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 29 es la secuencia del promotor de CaMV-Act8 que incluye el primer intrón del gen Act8. Las posiciones de bases 1-523 representan la secuencia promotora de CaMV; las posiciones de bases 534-1800 representan el promotor de Act8, secuencia de intrón y 5’ UTR. SEC ID Nº: 30 es la secuencia del promotor de CaMV-Act2 que incluye el primer intrón del gen Act2. Las posiciones de bases 1-523 representan la secuencia promotora de CaMV; las posiciones de bases 534-1742 representan el promotor de Act2, secuencia de intrón y 5’ UTR.
Descripción detallada de la invención
Se proporcionan las siguientes definiciones y procedimientos para definir mejor y para guiar a los expertos habituales en la técnica en la práctica de la presente invención. A no ser que se indique de otro modo, los términos deben entenderse de acuerdo con el uso convencional por los expertos habituales en la técnica relevante. Se usa la nomenclatura para bases de ADN como se expone en 37 CFR § 1.822. Se usa la nomenclatura de una y tres letras convencional para restos de aminoácidos.
“(Secuencia) de ácido nucleico” o “(secuencia) polinucleotídica” se refiere a ADN o ARN bicatenario o monocatenario de origen genómico o sintético, es decir, un polímero de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas, respectivamente, leídas desde el extremo 5’ (cadena arriba) al extremo 3’ (cadena abajo). El ácido nucleico puede representar la hebra sentido o complementaria (antisentido).
“Nativo” se refiere a una secuencia de ácido nucleico de origen natural (“tipo silvestre”). Secuencia “heteróloga” se refiere a una secuencia que se origina de una fuente o especie ajena o, si es de la misma fuente, se modifica desde su forma original.
Una secuencia de ácido nucleico “aislada” está sustancialmente separada o purificada de otras secuencias de ácidos nucleicos con las que normalmente se asocia el ácido nucleico en la célula del organismo en la que aparece de forma natural el ácido nucleico, es decir, otro ADN cromosómico o extracromosómico. El término abarca ácidos nucleicos que se purifican de forma bioquímica de modo que se retienen sustancialmente los ácidos nucleicos contaminantes y otros componentes celulares. El término también abarca ácidos nucleicos recombinantes y ácidos nucleicos sintetizados químicamente.
La expresión “sustancialmente purificada”, como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula separada de otras moléculas normalmente asociadas con ella en su estado nativo. Más preferentemente, una molécula sustancialmente purificada es la especie predominante presente en una preparación. Una molécula sustancialmente purificada puede ser más del 60 % sin, preferentemente 75 % sin, más preferentemente 90 % sin las otras moléculas (excluido el disolvente) presentes en la mezcla natural. La expresión “sustancialmente purificada” no pretende abarcar moléculas presentes en su estado nativo.
Una primera secuencia de ácido nucleico presenta “identidad sustancial” con una secuencia de ácido nucleico de referencia si, cuando se alinea de forma óptima (con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas que suman menos del 20 por ciento de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación) con el otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), hay al menos aproximadamente 75 % de identidad de secuencia de nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 80 % de identidad, más preferentemente al menos 85 % de identidad, y más preferentemente al menos aproximadamente 90 % de identidad sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, preferentemente al menos 50 posiciones de nucleótidos, más preferentemente al menos 100 posiciones de nucleótidos, y más preferentemente sobre la longitud completa del primer ácido nucleico. Puede realizarse el alineamiento óptimo de secuencias para alinear una ventana de comparación por el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981; por el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970; por el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444, 1988; preferentemente por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA) en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics Versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI. El ácido nucleico de referencia puede ser una molécula de longitud completa o una parte de una molécula más larga. Como alternativa, los ácidos nucleicos tienen identidad sustancial si uno hibrida con el otro en condiciones rigurosas, como se define posteriormente.
Una primera secuencia de ácido nucleico está “unida operativamente” a una segunda secuencia de ácido nucleico cuando las secuencias se disponen de tal modo que la primera secuencia de ácido nucleico afecte a la función de la segunda secuencia de ácido nucleico. Preferentemente, las dos secuencias son parte de una molécula de ácido nucleico contigua sencilla y más preferentemente están adyacentes. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a un gen si el promotor regula o media en la transcripción del gen en una célula.
Un ácido nucleico “recombinante” se prepara por una combinación artificial de dos segmentos separados de otro modo de secuencia, por ejemplo, por síntesis química o por la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos por técnicas de ingeniería genética. Se conocen bien técnicas para manipulación de ácidos nucleicos (véase por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga y col., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren y col., Genome Analysis: volumen 1, Analyzing DNA, (1997), volumen 2, Detecting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, Nueva York).
Se analizan procedimientos para síntesis química de ácidos nucleicos, por ejemplo, en Beaucage y Carruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862, 1981 y Matteucci y col., J. Am. Chem. Soc. 103: 3185, 1981. Puede realizarse síntesis química de ácidos nucleicos, por ejemplo, en sintetizadores de oligonucleótidos automáticos comerciales.
Una “secuencia de ácido nucleico sintética” puede diseñarse y sintetizarse químicamente para expresión potenciada en células huésped particulares y para los fines de clonación en construcciones apropiadas. Las células huésped con frecuencia presentan un patrón preferido de uso codónico (Murray y col., 1989). Los ADN sintéticos diseñados para potenciar la expresión en un huésped particular deberían por lo tanto reflejar el patrón de uso codónico en la célula huésped. Están disponibles programas informáticos para estos fines incluyendo pero sin limitación los programas "BestFit" o "Gap" del Paquete de Software de Análisis de Secuencia, Genetics Computer Group, Inc., University of Wisconsin Biotechnology Center, Madison, WI 53711.
“Amplificación” de ácidos nucleicos o “reproducción de ácido nucleico” se refiere a la producción de copias adicionales de una secuencia de ácido nucleico y se lleva a cabo usando tecnologías de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se conoce en la técnica varios procedimientos de amplificación y se describe, entre otros, en las Patentes de Estados Unidos Nº: 4.683.195 y 4.683.202 y en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis y col., Academic Press, San Diego, 1990. En PCR, un cebador se refiere a un oligonucleótido corto de secuencia definida que se hibrida con un molde de ADN para iniciar la reacción en cadena de la polimerasa.
“Transformado”, “transfectado” o “transgénico” se refiere a una célula, tejido, órgano u organismo en el que se ha introducido un ácido nucleico ajeno, tal como una construcción recombinante. Preferentemente, el ácido nucleico introducido se integra en el ADN genómico de la célula, tejido, órgano u organismo receptor de modo que el ácido nucleico introducido se herede por la descendencia posterior. Una célula u organismo “transgénico” o “transformado” también incluye descendencia de la célula u organismo y descendencia producida a partir de un programa de reproducción que emplee una planta “transgénica” tal como un parental en un cruce y que muestre un fenotipo alterado resultante de la presencia de una construcción o construcción recombinante.
El término “gen” se refiere a ADN cromosómico, ADN plasmídico, ADNc, ADN sintético u otro ADN que codifica un péptido, polipéptido, proteína o molécula de ARN, y regiones que flanquean la secuencia codificante implicada en la regulación de la expresión. Algunos genes pueden transcribirse a ARNm y traducirse a polipéptidos (genes estructurales); otros genes pueden transcribirse a ARN (por ejemplo ARNr, ARNt); y otros tipos de genes actúan como reguladores de la expresión (genes reguladores).
“Expresión” de un gen se refiere a la transcripción de un gen para producir el ARNm correspondiente y traducción de este ARNm para producir el producto génico correspondiente, es decir, un péptido, polipéptido o proteína. La expresión génica se controla o modula por elementos reguladores que incluyen elementos reguladores 5’ tales como promotores.
“Componente genético” se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico o elemento genético que también puede ser un componente o parte de una construcción de expresión. Los ejemplos de componentes genéticos incluyen, pero sin limitación regiones promotoras, líderes no traducidos 5’, intrones, genes, regiones no traducidas 3’ y otras secuencias reguladoras o secuencias que afectan a la transcripción o traducción de una o más secuencias de ácido nucleico.
Las expresiones “construcción de ADN recombinante”, “construcción recombinante”, “construcción de expresión” o “casete de expresión” se refieren a cualquier agente tal como un plásmido, cósmido, virus, BAC (cromosoma artificial de bacteria), secuencia de replicación autónoma, fago o secuencia de nucleótidos de ADN o ARN monocatenaria o bicatenaria lineal o circular, derivada de cualquier fuente, capaz de integración genómica o replicación autónoma, que comprende una molécula de ADN en la que se ha unido una o más secuencias de ADN de una manera funcionalmente operativa usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas.
“Complementario” se refiere a la asociación natural de secuencias de ácido nucleico por formación de pares de bases (pares A-G-T con la secuencia complementaria T-C-A). La complementariedad entre dos moléculas monocatenarias puede ser parcial, si solamente algunos de los pares de ácidos nucleicos son complementarios; o completa, si todos los pares de bases son complementarios. El grado de complementariedad afecta a la eficacia y fuerza de hibridación y reacciones de amplificación.
“Homología” se refiere al nivel de similitud entre secuencias de ácido nucleico o aminoácidos con respecto a porcentaje de nucleótidos o identidad posicional de aminoácidos, respectivamente, es decir, similitud o identidad de secuencia. La homología también se refiere al concepto de propiedades funcionales similares entre diferentes ácidos nucleicos o proteínas.
“Promotor” se refiere a una secuencia de ácido nucleico localizada cadena arriba o 5’ de un codón de inicio de la traducción de una fase de abierta de lectura (o región codificante de proteínas) de un gen y que esté implicada en el reconocimiento y unión de ARN polimerasa II y otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) para iniciar la transcripción. Un “promotor vegetal” es un promotor nativo o no nativo que es funcional en células vegetales. Los promotores constitutivos son funcionales en la mayoría o todos los tejidos de una planta durante el desarrollo de la planta. Se expresan promotores específicos de tejido, órgano o célula solamente o predominantemente en un tejido, órgano o tipo celular particular, respectivamente. En lugar de expresarse “específicamente” en un tejido, órgano o tipo celular dado, un promotor puede presentar expresión “potenciada”, es decir, un nivel de expresión más alto en una parte (por ejemplo, tipo celular, tejido u órgano) de la planta en comparación con otras partes de la planta. Los promotores regulados temporalmente son funcionales solamente o predominantemente durante ciertos periodos del desarrollo de la planta o en ciertos momentos del día, como sucede con genes asociados con los ritmos circadianos, por ejemplo. Los promotores inducibles expresan selectivamente una secuencia de ADN unida operativamente en respuesta a la presencia de un estímulo endógeno o exógeno, por ejemplo por compuestos químicos (inductores químicos) o en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo. Los promotores inducibles o regulados incluyen, por ejemplo, promotores regulados por luz, calor, estrés, inundación o sequía, fitohormonas, heridas o agentes químicos tales como etanol, jasmonato, ácido salicílico o protectores.
Cualquier promotor vegetal puede usarse como una secuencia reguladora 5’ para modular la expresión de un gen o genes particulares. Un promotor preferido sería un promotor de ARN polimerasa II vegetal. Los promotores de ARN polimerasa II vegetales, como los de otros eucariotas superiores, tienen estructuras complejas y están comprendidos por varios elementos diferentes. Un elemento tal es la caja TATA o caja Goldberg-Hogness, que se requiere para la expresión correcta de genes eucariotas in vitro e inicio de la transcripción in vivo preciso y eficaz. La caja TATA se sitúa normalmente a aproximadamente -25 a -35, es decir, a 25 a 35 pares de bases (pb) cadena arriba (5’) del sitio de inicio de la transcripción, o sitio de recubrimiento, que se define como posición +1 (Breathnach y Chambon, Ann. Rev. Biochem. 50: 349-383, 1981; Messing y col., In: Genetic Engineering of Plants, Kosuge y col., eds., pp. 211227, 1983). Otro elemento común, la caja CCAAT, se localiza entre -70 y -100 pb. En plantas, la caja CCAAT puede tener una secuencia consenso diferente que la secuencia funcionalmente análoga de promotores de mamíferos (el análogo vegetal se ha denominado la “caja AGGA” para diferenciarla de su homólogo animal; Messing y col., en: Genetic Engineering of Plants, Kosuge y col., eds., pp. 211-227, 1983). Además, prácticamente todos los promotores incluyen secuencias de activación cadena arriba adicionales o potenciadores (Benoist y Chambon, Nature 290: 304310, 1981; Gruss y col., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 943-947, 1981 y Khoury y Gruss, Cell 27:313-314, 1983) que se extienden de aproximadamente -100 pb a -1000 pb o más cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción.
Cuando se fusionan con secuencias de ADN heterólogas, tales promotores normalmente provocan que la secuencia fusionada se transcriba de una manera que es similar a la de la secuencia génica con la que normalmente se asocia el promotor. Pueden añadirse fragmentos promotores que incluyen secuencias reguladoras (por ejemplo, fusionadas con el extremo 5’, o insertadas dentro, de un promotor activo que tiene sus propias secuencias reguladoras parciales
o completas (Fluhr y col., Science 232: 1106-1112, 1986; Ellis y col., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai y col., Plant Mol. Biol. 15: 373-381, 1991). Como alternativa, pueden añadirse secuencias reguladoras heterólogas a la región cadena arriba 5’ de un promotor inactivo truncado, por ejemplo, un promotor que incluye solamente la TATA central y, en ocasiones, los elementos CCAAT (Fluhr y col., Science 232: 1106-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).
Los promotores normalmente comprenden múltiples “elementos reguladores transcripcionales que actúan en cis” distintos, o simplemente “elementos en cis”, cada uno de los cuales confiere un aspecto diferente del control global de la expresión génica (Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Ellis y col., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Benfey y col., EMBO J. 9: 1677-1684, 1990). Los "elementos en cis” se unen a factores proteicos que actúan en trans que regulan la transcripción. Algunos elementos en cis se unen a más de un factor, y los factores de transcripción que actúan en trans pueden interaccionar con diferentes afinidades con más de un elemento en cis (Johnson y McKnight, Ann. Rev. Biochem. 58: 799-839, 1989). Se analizan factores de transcripción de plantas, elementos en cis correspondientes, y análisis de su interacción, por ejemplo, en: Martin, Curr. Opinions Biotech. 7: 130-138, 1996; Murai, en: Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422 y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga y col., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300. Las secuencias promotoras de la presente invención pueden contener “elementos en cis” que confieren o modulan la expresión génica.
Los elementos en cis pueden identificarse por medio de varias técnicas, incluyendo análisis de deleción, es decir, delecionar uno o más nucleótidos del extremo 5’ o internos de un promotor; análisis de proteína de unión a ADN usando huella de Dnasa I, interferencia de metilación, ensayos de desplazamiento de movilidad en electroforesis, huella genómica in vivo por PCR mediada por ligación y otros ensayos convencionales; o por similitud de secuencia con motivos de elementos en cis conocidos por procedimientos de comparación de secuencia convencionales. Las estructura fina de un elemento en cis puede estudiarse además por mutagénesis (o sustitución) de uno o más nucleótidos del elemento o por otros procedimientos convencionales (véase por ejemplo, Methods in Plant Biochemistry and Molecular Biology, Dashek, ed., CRC Press, 1997, pp. 397-422 y Methods in Plant Molecular Biology, Maliga y col., eds., Cold Spring Harbor Press, 1995, pp. 233-300).
Los elementos en cis pueden obtenerse por síntesis química o por clonación de promotores que incluyen tales elementos. Los elementos en cis también pueden sintetizarse con secuencias flanqueantes adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar manipulación posterior. En una realización, los promotores están comprendidos por múltiples “elementos en cis” distintos.
El promotor híbrido de la invención comprende los “elementos en cis” de las secuencias de ácido nucleico de SEC ID Nº: 12, que pueden identificarse usando programas informáticos que incluyen, pero sin limitación, MEME o SIGNALSCAN que se diseñan específicamente para identificar elementos en cis o dominios o motivos dentro de las secuencias.
Los promotores vegetales también pueden incluir promotores producidos a través de la manipulación de promotores conocidos para producir promotores sintéticos, quiméricos o híbridos. Tales promotores también pueden combinar elementos en cis de uno o más promotores, por ejemplo, añadiendo una secuencia reguladora heteróloga a un promotor activo con sus propias secuencias reguladoras parciales o completas (Ellis y col., EMBO J. 6: 11-16, 1987; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Poulsen y Chua, Mol. Gen. Genet. 214: 16-23, 1988; Comai y col., Plant. Mol. Biol. 15: 373-381, 1991). También se han desarrollado promotores quiméricos añadiendo una secuencia reguladora heteróloga a la región cadena arriba 5’ de un promotor inactivo truncado, es decir un promotor que incluye solamente la TATA central y, opcionalmente, los elementos CCAAT (Fluhr y col., Science 232: 1146-1112, 1986; Strittmatter y Chua, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84: 8986-8990, 1987; Aryan y col., Mol. Gen. Genet. 225: 65-71, 1991).
Los promotores quiméricos o híbridos de acuerdo con la presente invención pueden incluir al menos un elemento en cis conocido tal como elementos que se regulan por numerosos factores ambientales tales como luz, calor o estrés; elementos que se regulan o inducen por patógenos o agentes químicos y similares. Tales elementos pueden regular de forma positiva o negativa la expresión génica, dependiendo de las condiciones. Los ejemplos de elementos en cis incluyen, pero sin limitación, elementos sensibles a oxígeno (Cowen y col., J. Biol. Chem. 268(36): 26904, 1993), elementos reguladores de la luz (véase, por ejemplo Bruce y Quail, Plant Cell 2: 1081, 1990 y Bruce y col., EMBO J.
10: 3015, 1991), un elemento en cis sensible a tratamiento con metil jasmonato (Beaudoin y Rothstein, Plant Mol. Biol. 33: 835, 1997), elementos sensibles a ácido salicílico (Strange y col., Plant J. 11: 1315, 1997), elementos de respuesta a choque térmico (Pelham y col., Trends Genet. 1: 31, 1985), elementos sensibles a heridas y estrés abiótico (Loace y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 9230, 1992; Mhiri y col., Plant Mol. Biol. 33: 257, 1997), elementos sensibles al frío (Baker y col., Plant Mol. Biol. 24: 701, 1994; Jiang y col., Plant Mol. Biol. 30: 679, 1996; Nordin y col., Plant Mol. Biol. 21: 641, 1993; Zhou y col., J. Biol. Chem. 267: 23515, 1992), y elementos sensibles a sequía (Yamaguchi y col., Plant Cell 6: 251-264, 1994; Wang y col., Plant Mol. Biol. 28: 605, 1995; Bray E. A. Trends in Plant Science 2: 48, 1997).
Los promotores híbridos pueden diseñarse o modificarse por ingeniería genética mediante varios procedimientos. Muchos promotores contienen secuencias cadena arriba que activan, potencian o definen la fuerza y/o especificidad del promotor (Atchison, Ann. Rev. Cell Biol. 4: 127, 1988). Los genes de ADN T, por ejemplo que contienen cajas “TATA” que definen el sitio de inicio de la transcripción y otros elementos cadena arriba localizados cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción, modulan los niveles de transcripción (Gelvin, en: Transgenic Plants (Kung, S.-D. y Us,R., eds, San Diego: Academic Press, pp.49-87, 1988). Otro promotor quimérico combinó un trímero del activador de octopina sintasa (ocs) con el activador de manopina sintasa (mas) más promotor y se ha indicado un aumento de la expresión de un gen indicador (Min Ni y col., The Plant Journal 7: 661, 1995). La secuencias reguladoras cadena arriba de la presente invención pueden usarse para la construcción de tales promotores quiméricos o híbridos. Los procedimientos para construcción de promotores variantes de la presente invención incluyen pero sin limitación combinar elementos de control de diferentes promotores o duplicar partes o regiones de un promotor (véase por ejemplo Patente de Estados Unidos 5.110.732 y Patente de Estados Unidos 5.097.025). Los expertos en la materia están familiarizados con las condiciones específicas y procedimientos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (por ejemplo, moléculas de ADN, plásmidos, etc.), generación de organismos recombinantes y la exploración y aislamiento de genes (véase por ejemplo Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Mailga y col., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, 1995; Birren y col., Genome Analysis: volumen 1, Analyzing DNA, (1997), volumen 2, Detecting Genes, (1998), volumen 3, Cloning Systems, (1999) volumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, Nueva York).
El diseño, la construcción y el uso de promotores quiméricos o híbridos que comprenden el elemento en cis de SEC ID Nº: 12, para modular o regular la expresión de secuencias de ácido nucleico unidas operativamente, también están abarcados por la presente invención.
La secuencia promotora de SEC ID Nº: 28 es capaz de transcribir secuencias de ADN unidas operativamente en múltiples tejidos y por lo tanto puede regular selectivamente la expresión de genes en múltiples tejidos.
Para varios rasgos agrícolas, la transcripción de un gen o genes de interés es deseable en múltiples tejidos para conferir la característica o características deseadas. La disponibilidad de promotores adecuados que regulen la transcripción de genes unidos operativamente en tejidos diana seleccionados de interés es deseable, puesto que puede no ser deseable expresar un gen en cada tejido, sino solamente en ciertos tejidos. Por ejemplo, si se desea expresar selectivamente un gen diana para expresión de gen para tolerancia a herbicidas, se puede desear expresión del gen de tolerancia a herbicidas en tejidos vegetativos y reproductores. Las secuencias promotoras de la presente invención son útiles para regular la expresión génica en múltiples tejidos incluyendo, pero sin limitación, tejidos del meristemo de crecimiento rápido, tejidos reproductivos masculinos (androceo) tales como polen, anteras y filamentos, y tejidos reproductivos femeninos (gineceo) tales como el estigma, estilo y ovarios, hojas, sépalos y pétalos. Los promotores de la presente invención tienen por lo tanto utilidad para expresión de genes de tolerancia a herbicida, por ejemplo, cuando se desea tolerancia en múltiples tejidos y estadios del desarrollo vegetal. Las secuencias promotoras de la presente invención tienen utilidad para regular la transcripción de cualquier gen diana incluyendo pero sin limitación genes para control de la fertilidad, rendimiento, tolerancia a insectos, tolerancia fúngica, tolerancia a herbicidas o cualquier rasgo deseable de interés. Los genes particularmente preferidos incluyen genes de tolerancia a herbicidas o genes de tolerancia a insectos.
En una realización, los promotores de la presente invención tienen particular utilidad para regular la expresión de un gen de tolerancia a herbicidas cuando se desee expresión de un gen en múltiples tejidos. Por ejemplo, el gen de tolerancia a herbicidas puede conferir tolerancia al herbicida glifosato. Los ejemplos de genes de tolerancia a glifosato adecuados incluyen, pero sin limitación genes de EPSP sintasa resistente a glifosato o productos génicos que degradan glifosato tales como una glifosato oxidorreductasa y fosfonato N-acetil transferasa. Es importante tener una amplia diversidad de elecciones de elementos reguladores 5’ para cualquier estrategia de biotecnología vegetal para tener elementos reguladores adecuados que sean más eficaces para el perfil de expresión deseado.
En otra realización, los promotores de la presente invención tienen utilidad para determinar la función génica. La función de muchos genes es desconocida y los promotores de la presente invención pueden usarse como elementos genéticos en una construcción para permitir una evaluación fenotípica de uno o más genes expresados en una orientación sentido o antisentido. Los promotores de la presente invención pueden ser componentes en una construcción de expresión en plantas desarrollada para un ensayo de alto rendimiento en el que se deseen altos niveles de expresión génica en tejidos constitutivos y reproductores.
Cualquier planta puede seleccionarse con respecto a la identificación de genes y secuencias reguladoras. Ejemplos de dianas vegetales adecuadas para el aislamiento de genes y secuencias reguladoras incluirían pero sin limitación alfalfa, manzana, albaricoque, Arabidopsis, alcachofa, rúcula, espárrago, aguacate, banana, cebada, judías, remolacha, mora, arándano, brócoli, coles de Bruselas, col, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, ricino, coliflor, apio, cereza, achicoria, cilantro, cítricos, clementinas, trébol, coco, café, maíz, algodón, arándano agrio, pepino, abeto de Douglas, berenjena, endivia, escarola, eucalipto, hinojo, higo, ajo, cucurbitáceas, uva, pomelo, melón verde, jícama, kiwi, lechuga, puerro, limón, lima, pino taeda, lino, mango, melón, champiñón, nectarina, nuez, avena, palma aceitera, colza, ocra, oliva, cebolla, naranja, una planta ornamental, palma, papaya, perejil, chirivía, guisante, melocotón, cacahuete, pera, pimiento, caqui, pino, piña, plátano, ciruela, granada, álamo, patata, calabaza gigante, membrillo, pino insigne, achicoria roja, rábano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, pino del sur, soja, espinaca, calabaza, fresa, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, boniato, liquidámbar, tangerina, té, tabaco, tomate, triticale, césped, nabo, vid, sandía, trigo, ñames y calabacín. Son plantas particularmente preferidas para la identificación de secuencias reguladoras Arabidopsis, maíz, trigo, soja y algodón.
Las secuencias promotoras de la presente invención se aislaron de ADN vegetal de Arabidopsis thaliana. En una realización preferida, una construcción incluye las secuencias promotoras de la presente invención unidas operativamente con una secuencia transcribible junto con secuencias terminadoras y reguladoras adecuadas. Una construcción tal puede transformarse en una planta diana adecuada de interés. Cualquier planta puede usarse como un huésped adecuado para construcciones de ácido nucleico que comprenden las secuencias promotoras de la presente invención. Los ejemplos de plantas diana adecuadas de interés incluirían, pero sin limitación, alfalfa, brócoli, col, colza, coliflor, maíz, algodón, arándano agrio, pepino, lechuga, guisante, álamo, pino, patata, cebolla, arroz, frambuesa, soja, caña de azúcar, remolacha azucarera, girasol, tomate y trigo.
Procedimientos de Aislamiento y Modificación de Promotores
Puede usarse cualquier variedad de procedimientos para aislar fragmentos de las secuencias promotoras desveladas en el presente documento. Puede usarse un enfoque basado en PCR para amplificar regiones flanqueantes de una biblioteca genómica de una planta usando información de secuencia disponible públicamente. Se conocen varios procedimientos por los expertos en la materia para amplificar secuencias de ADN desconocidas adyacentes a una región central de secuencia conocida. Los procedimientos incluyen pero sin limitación PCR inversa (PCRI), PCR vectorette, PCR en forma de Y y enfoques de walking de genoma. Para la presente invención las moléculas de ácido nucleico se aislaron de Arabidopsis diseñando cebadores de PCR basados en información de secuencia disponible.
También pueden obtenerse fragmentos de ácido nucleico por otras técnicas tales como sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, como se practica habitualmente usando un sintetizador de oligonucleótidos automático. También pueden obtenerse fragmentos por la aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) por técnicas de ADN recombinante generalmente conocidas por los expertos en la materia de biología molecular. Con respecto a la amplificación de una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo por PCR) usando un par de cebadores de amplificación particular, las “condiciones de PCR rigurosas” se refieren a condiciones que permiten que el par de cebadores hibriden solamente con la secuencia de ácido nucleico diana con la que se uniría un cebador que tenga la secuencia de tipo silvestre correspondiente (o su complemento) y preferentemente para producir un producto de amplificación único.
Los expertos en la materia conocen procedimientos para preparación de ADN genómico de plantas. En un enfoque, pueden prepararse bibliotecas de ADN genómico de una especie seleccionada por digestión parcial con una enzima de restricción y seleccionando por tamaño los fragmentos de ADN dentro de un intervalo de tamaños particular. El ADN genómico puede clonarse en una construcción adecuada que incluye pero sin limitación un bacteriófago, y prepararse usando una construcción adecuada tal como un bacteriófago usando un kit de clonación adecuado de cualquier variedad de distribuidores (véase por ejemplo Stratagene, La Jolla CA o Gibco BRL, Gaithersburg, MD).
Además de su uso en la modulación de la expresión génica, las secuencias promotoras de la presente invención también tienen utilidad como sondas o cebadores en experimentos de hibridación de ácido nucleico. Las sondas y los cebadores de ácido nucleico de la presente invención pueden hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de ADN diana. La expresión “condiciones de hibridación rigurosas” se define como condiciones en las que una sonda o cebador hibrida específicamente con una secuencia o secuencias diana y no con secuencias no diana, como se puede determinar de forma empírica. La expresión “condiciones rigurosas” se define funcionalmente con respecto a la hibridación de una sonda de un ácido nucleico un ácido nucleico diana (es decir, con una secuencia de ácido nucleico particular de interés) mediante el procedimiento de hibridación específico (véase por ejemplo Sambrook y col., 1989, en 9.52-9.55, Sambrook y col., 1989 en 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, Nucl. Acids Res. 12:203-213, 1984; y Wetmur y Davidson, J. Mol. Biol. 31:349-370, 1968). Las condiciones de rigurosidad apropiada que promueven la hibridación de ADN son, por ejemplo, cloruro sódico 6,0 x/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45 ºC, seguido de un lavado de SSC 2,0 x a 50 ºC, se conocen por los expertos en la materia o pueden encontrarse en manuales de laboratorio que incluyen pero sin limitación, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6. Por ejemplo, la concentración salina en la etapa de lavado puede seleccionarse de una baja rigurosidad de aproximadamente SSC 2,0 x a 50 ºC hasta una ala rigurosidad de aproximadamente SSC 0,2 x a 50 ºC. Además, la temperatura en la etapa de lavado puede aumentarse de condiciones de baja rigurosidad a temperatura ambiente, aproximadamente a 22 ºC, a condiciones de alta rigurosidad a aproximadamente 65 ºC. Tanto la temperatura como la sal pueden variarse, o la temperatura o la concentración salina pueden mantenerse constantes mientras que la otra variable se cambia. Por ejemplo, la hibridación usando sondas de ADN o ARN o cebadores puede realizarse a 65 ºC en SSC 6x, SDS 0,5 %, Denhardt 5x, ADN no específico 100 !g/ml (por ejemplo, ADN de esperma de salmón sonicado) con lavado a SSC 0,5x, SDS 0,5 % a 65 ºC, para alta rigurosidad.
Se dice que una molécula de ácido nucleico es el “complemento” de otra molécula de ácido nucleico si muestran complementariedad completa. Como se usa en el presente documento, se dice que las moléculas muestran “complementariedad completa” cuando cada nucleótido de una de las moléculas es complementario de un nucleótido de la otra. Se dice que dos moléculas son mínimamente complementarias si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que permanezcan hibridadas entre sí en al menos condiciones de “baja rigurosidad” convencionales. De forma similar, se dice que las moléculas son “complementarias” si pueden hibridar entre sí con suficiente estabilidad para permitir que se mantengan hibridadas entre sí en condiciones de “alta rigurosidad” convencionales. Se contempla que pueden usarse condiciones de hibridación de rigurosidad más baja tales como temperaturas de lavado y/o hibridación más bajas para identificar secuencias relacionadas que tengan un grado más bajo de similitud de secuencia si se conserva especificidad de unión de la sonda o cebador con secuencia o secuencias diana. En consecuencia, las secuencias de nucleótidos de la presente invención pueden usarse por su capacidad para formar selectivamente moléculas de doble cadena con tramos complementarios de fragmentos de ADN. Se conoce bien por los expertos en la materia la detección de segmentos de ADN mediante hibridación, y por lo tanto, dependiendo de la aplicación prevista, se deseará emplear diversas condiciones de hibridación para conseguir diversos grados de selectividad de sonda hacia secuencia diana y el procedimiento de elección dependerá de los resultados deseados. Se describen condiciones de rigurosidad convencionales en Sambrook, y col., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, y por Haymes y col., Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC, 1985.
La secuencia de ácido nucleico de SEC ID Nº: 12, o un fragmento, región, elemento en cis, u oligómero de estas secuencias, se usa en ensayos de hibridación de otros tejidos vegetales para identificar genes homólogos o cercanamente relacionados y secuencias reguladoras asociadas. Estos incluyen pero sin limitación ensayos de hibridación de Southern o northern en cualquier sustrato incluyendo pero sin limitación un tejido vegetal preparado de forma apropiada, celulosa, nylon o filtro de combinación, microplaca o portaobjetos de vidrio. Dichas metodologías se conocen bien en la técnica y están disponibles en un kit o preparación que puede proporcionarse por proveedores comerciales.
Un fragmento de un ácido nucleico como se usa en el presente documento es una parte del ácido nucleico que es menor de longitud completa. Por ejemplo, para la presente invención cualquier longitud de secuencia de nucleótidos que sea menor que las secuencias de nucleótidos desveladas de SEC ID Nº: 12, se considera un fragmento. Un fragmento también puede comprender al menos una longitud mínima capaz de hibridar específicamente con un ácido nucleico nativo en condiciones de hibridación rigurosas como se han definido anteriormente. La longitud de un fragmento mínimo tal es preferentemente de al menos 8 nucleótidos, más preferentemente 15 nucleótidos, incluso más preferentemente al menos 20 nucleótidos, y más preferentemente al menos 30 nucleótidos de una secuencia de ácido nucleico nativa.
Una “sonda” es un ácido nucleico aislado al que se une un marcador detectable convencional o molécula indiciadora, por ejemplo, un isótopo radiactivo, ligando, agente quimioluminiscente o enzima. Los “cebadores” son ácidos nucleicos aislados que hibridan con una cadena de ADN diana complementaria por hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, después se extiende a lo largo de la cadena de ADN diana por una polimerasa, por ejemplo, una ADN polimerasa. Pueden usarse pares de cebadores para amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico convencionales.
Las sondas y los cebadores son generalmente de 11 nucleótidos o más de longitud, preferentemente 18 nucleótidos
o más, más preferentemente 25 nucleótidos y más preferentemente 30 nucleótidos o más. Tales sondas y cebadores hibridan específicamente con una secuencia de ADN o ARN diana en condiciones de hibridación de alta rigurosidad e hibridan específicamente con una secuencia nativa diana de otra especie en condiciones de rigurosidad más baja. Preferentemente, las sondas y los cebadores de acuerdo con la presente invención tienen similitud de secuencia completa con la secuencia nativa, aunque pueden diseñarse sondas que difieran de la secuencia nativa y que conserven la capacidad para hibridar con las secuencias nativas diana por procedimientos convencionales. Se describen procedimientos para preparar y usar sondas y cebadores, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed., vol. 1-3, ed. Sambrook y col., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (en lo sucesivo en el presente documento "Sambrook y col., 1989"); Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel y col., Greene Publishing and Wiley-Interscience, Nueva York, 1992 (con actualizaciones periódicas) (en lo sucesivo en el presente documento, "Ausubel y col., 1992”); e Innis y col., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press: San Diego, 1990. Pueden derivarse pares de cebadores de PCR de una secuencia conocida, por ejemplo, mediante el uso de programas informáticos pretendidos para ese fin tales como Primer (Versión 0.5, © 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA). Pueden usarse cebadores y sondas basados en las secuencias promotoras nativas desveladas en el presente documento para confirmar y, si es necesario, modificar las secuencias desveladas por procedimientos convencionales, por ejemplo, volviendo a clonar y volviendo a secuenciar.
Construcciones y Construcciones de Expresión
Pueden incorporarse ácidos nucleicos nativos o sintéticos de acuerdo con la presente invención en construcciones de ácidos nucleicos recombinantes, normalmente construcciones de ADN, capaces de introducción y replicación en una célula huésped. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos de la presente invención como se muestra en la SEC ID Nº: 28 se incorpora en un casete de expresión que incluye las regiones promotoras de la presente invención unidas operativamente con un componente genético tal como gen marcador seleccionable, explorable o puntuable.
En otra realización, las secuencias de ácido nucleico desveladas de la presente invención como se muestran en SEC ID Nº: 28, se unen operativamente con un componente genético tal como un ácido nucleico que confiere una característica deseable asociada con morfología, fisiología, crecimiento y desarrollo de plantas, rendimiento, potenciación nutricional, resistencia a enfermedad o plaga, o tolerancia ambiental o química. Estos componentes genéticos tales como genes marcadores o genes agrónomos de interés pueden actuar en la identificación de una célula vegetal o planta transformada o producir un producto de utilidad agrónoma.
En otra realización, un componente genético produce un producto que actúa como un dispositivo de selección y actúa en un tejido vegetal regenerable para producir un compuesto que conferiría al tejido vegetal resistencia a un compuesto de otro modo tóxico. Los genes de interés para su uso como un marcador seleccionable, explorable o puntuable incluirían pero sin limitación GUS (secuencia codificante de beta-glucuronidasa), GFP (secuencia codifican de proteína verde fluorescente), LUX (gen codificante de luciferasa), genes marcadores de resistencia a antibióticos o genes de tolerancia a herbicidas. Los ejemplos de transposones y genes de resistencia a antibióticos asociados incluyen los transposones Tns (bla), Tn5 (nptII), Tn7 (dhfr), penicilinas, kanamicina (y neomicina, G418, bleomicina); metotrexato (y trimetoprim); cloranfenicol; kanamicina y tetraciclina.
Se han perfilado características útiles para marcadores seleccionables en plantas en un informe sobre el uso de microrganismos (Comité Consultivo sobre Nuevos Alimentos y Procedimientos, julio de 1994). Estas incluyen selección rigurosa con número mínimo de tejidos no transformados, grandes números de acontecimientos de transformación independientes sin interferencia significativa con la regeneración, aplicación a un gran número de especies y disponibilidad de un ensayo para puntuar los tejidos con respecto a presencia del marcador.
Se conocen en la técnica varios genes marcadores seleccionables y varios marcadores de resistencia a antibióticos satisfacen estos criterios, incluyendo los resistentes a kanamicina (nptII), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y aacC4). Los genes marcadores seleccionables dominantes útiles incluyen genes que codifican genes de resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina o espectinomicina); y genes de resistencia a herbicidas (por ejemplo, fosfinotricin acetiltransferasa). Una estrategia útil para selección de transformantes para resistencia a herbicida se describe, por ejemplo, en Vasil, Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vols. I-III, Laboratory Procedures and Their Applications Academic Press, Nueva York, 1984. Serían genes marcadores seleccionables particularmente preferidos para su uso en la presente invención genes que confieran resistencia a compuestos tales como antibióticos como kanamicina, y herbicidas como glifosato (Della-Cioppa y col., Bio/Technology 5(6), 1987, Patente de Estados Unidos 5.463.175, Patente de Estados Unidos 5.633.435). Pueden implementarse también otros dispositivos de selección y aun quedarían dentro del alcance de la presente invención.
Para la práctica de la presente invención, se emplean composiciones y procedimientos convencionales para preparar y usar construcciones de ADN y células hospedadoras, como se analiza, entre otros, en Sambrook y col., 1989. En una realización preferida, la célula huésped es una célula vegetal. Se han descrito varias construcciones de ADN adecuadas para transfección estable de células vegetales o para el establecimiento de plantas transgénicas en, por ejemplo, Pouwels y col., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, sup. 1987; Weissbach y Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; Gelvin y col., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990 y R.R.D. Croy Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publishers, 1993. Las construcciones de expresión en plantas pueden incluir, por ejemplo, uno o más genes vegetales clonados bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5’ y 3’. También pueden incluir un marcador seleccionable como se describe para seleccionar células huésped que contienen la construcción de expresión. Tales construcciones de expresión en plantas también contienen una región reguladora del promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla expresión inducible o constitutiva, regulada ambientalmente o por desarrollo o específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión al ribosoma, una señal de procesamiento de ARN, un sitio de terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación. Otras secuencias de origen bacteriano también se incluyen para permitir que la construcción se clone en un huésped bacteriano. La construcción normalmente también contendrá un origen de replicación procariota de serie de huéspedes amplia. En una realización particularmente preferida, la célula huésped es una célula vegetal y la construcción de expresión en plantas comprende una región promotora como se desvela en SEC ID Nº: 28; una secuencia transcribible unida operativamente; y una secuencia de terminación de la transcripción. Otras secuencias reguladoras previstas como componentes genéticos en una construcción de expresión incluyen pero sin limitación secuencia líder no traducida que puede acoplarse con el promotor. En una realización particularmente preferida, la célula huésped es una célula vegetal y la construcción de expresión en plantas comprende una región promotora como se desvela en SEC ID Nº: 28, una secuencia transcribible unida operativamente y una secuencia de terminación de la transcripción. Las construcciones de expresión en plantas también pueden comprender secuencias adicionales que incluyen pero sin limitación secuencias de poliligador que contienen sitios de enzimas de restricción que son útiles para fines de clonación.
Elementos Genéticos en Construcciones de Expresión en Plantas
Las construcciones de expresión en plantas pueden incluir más de una secuencia génica expresable, cada una unida operativamente a un promotor diferente. Varios promotores tienen utilidad para expresión de genes en plantas para cualquier gen de interés incluyendo pero sin limitación marcadores seleccionables, marcadores puntuables, genes para tolerancia a plagas, tolerancia a enfermedad, potenciaciones nutricionales y cualquier otro gen de interés agrónomo. Los ejemplos de promotores constitutivos útiles para expresión de genes en plantas incluyen pero sin limitación, promotor P-35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere expresión de alto nivel constitutiva en la mayoría de los tejidos vegetales (véase, por ejemplo, Odel y col., Nature 313: 810, 1985), incluyendo monocotiledóneas (véase, por ejemplo, Dekeyser y col., Plant Cell 2: 591, 1990; Terada y Shimamoto, Mol. Gen. Genet. 220: 389, 1990); un promotor 355 potenciado (P-e35S) que comprende una secuencia potenciadora 35S de CaMV duplicada en tándem; el promotor de nopalina sintasa (An y col., Plant Physiol. 88: 547, 1988); el promotor de octopina sintasa (Fromm y col., Plant Cell 1: 977, 1989); y el promotor del virus del mosaico de la escrofularia (P-FMV) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.378.619 y una versión potenciada (P-eFMV) derivada de la secuencia promotora de P-FMV; el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor; un promotor del virus baciliforme de la caña de azúcar; un promotor del virus de manchas amarillas de commelina; y otros promotores de virus de ADN de plantas que se sabe que se expresan en células vegetales.
Puede usarse varios promotores de genes vegetales que se regulan en respuesta a señales ambientales, hormonales, químicas y/o de desarrollo para la expresión de un gen unido operativamente en células vegetales, incluyendo promotores regulados por (1) calor (Callis y col., Plant Physiol. 88: 965, 1988), (2) luz (por ejemplo, promotor rbcS-3A de guisante, Kuhlemeier y col., Plant Cell 1: 471, 1989; promotor rbcS del maíz, Schaffner y Sheen, Plant Cell 3: 997, 1991; o promotor de la proteína de unión a clorofila a/b, Simpson y col., EMBO J. 4: 2723, 1985), (3) hormonas, tales como ácido abscísico (Marcotte y col., Plant Cell 1: 969, 1989), (4) heridas (por ejemplo, wunI, Siebertz y col., Plant Cell 1: 961, 1989); o (5) compuestos químicos tales como metil jasmonato, ácido salicílico
o protector. También puede ser ventajoso emplear (6) promotores específicos de órganos (por ejemplo, Roshal y col., EMBO J. 6: 1155, 1987; Schernthaner y col., EMBO J. 7: 1249, 1988; Bustos y col., Plant Cell 1: 839, 1989).
Los promotores de la presente invención son promotores vegetales que son capaces de transcribir secuencias de ADN unidas operativamente en tejido del meristemo que crece rápidamente y tejidos reproductivos y pueden unirse operativamente a cualquier gen de interés en una construcción de expresión.
Las construcciones de expresión de plantas pueden incluir señales de procesamiento de ARN, por ejemplo, intrones, que pueden situarse cadena arriba o cadena abajo de una secuencia codificante de polipéptidos en el transgén. Además, las construcciones de expresión pueden incluir secuencias reguladoras adicionales de la región no traducida 3’ de genes de plantas (Thomburg y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 744 (1987); An y col., Plant Cell 1: 115 (1989), por ejemplo, una región terminadora 3’ para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la región terminadora PI-II de patata o las regiones terminadoras 3’ de octopina o nopalina sintasa. Las regiones no traducidas 5’ de un ARNm pueden desempeñar un papel importante en el inicio de la traducción y también pueden ser un componente genético en una construcción de expresión en plantas. Por ejemplo, las secuencias líder 5’ no traducidas derivadas de genes de proteínas de choque térmico han demostrado potenciar la expresión génica en plantas (véase, por ejemplo Patente de Estados Unidos 5.362.865). Estas secuencias reguladoras cadena arriba y cadena abajo adicionales pueden derivar de una fuente que es nativa o heteróloga con respecto a los otros elementos presente en la construcción de expresión.
Las secuencias promotoras de la presente invención se usan para controlar la expresión génica en células vegetales. Las secuencias promotoras desveladas son componentes genéticos que son parte de construcciones usadas en transformación de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invención pueden usarse con cualquier plásmido o construcción de transformación de plantas adecuado que contenga un marcador seleccionable
o explorable y elementos reguladores asociados, como se describe, junto con uno o más ácidos nucleicos expresados de una manera suficiente para conferir un rasgo deseable particular. Los ejemplos de genes estructurales adecuados de interés agrónomo previstos por la presente invención incluirían pero sin limitación uno o más genes de tolerancia a insectos, tales como un gen de Bacillus thuringiensis (B.t.), tolerancia a plagas tales como genes para control de enfermedad fúngica, tolerancia a herbicida tal como genes que confieren tolerancia a glifosato, y genes para mejoras de calidad tales como rendimiento, mejoras nutricionales, tolerancias ambientales o a estrés, o cualquier cambio deseable en la fisiología, crecimiento, desarrollo, morfología vegetal o el producto o productos vegetales. Por ejemplo, los genes estructurales incluirían cualquier gen que confiera tolerancia a insectos incluyendo pero sin limitación un gen de proteína de combate de insectos de Bacillus como se describe en el documento WO 9931248, Patente de Estados Unidos Nº: 5.689.052, Patentes de Estados Unidos Nº: 5.500.365 y
5.880.275. En otra realización, el gen estructural puede conferir tolerancia al herbicida glifosato como se confiere por genes que incluyen, pero sin limitación gen de EPSPS resistente a glifosato de Agrobacterium cepa CP4 (aroA:CP4) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.633.435, o gen de glifosato oxidorreductasa (GOX) como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº: 5.463.175.
Como alternativa, las secuencias codificantes de ADN pueden efectuar estos fenotipos codificando una molécula de ARN no traducible que provoca la inhibición dirigida de expresión de un gen endógeno, por ejemplo mediante mecanismos mediados por antisentido o cosupresión (véase, por ejemplo, Bird y col., Biotech. Gen. Engin. Rev. 9: 207,1991). El ARN también podría ser una molécula de ARN catalítica (es decir, una ribozima) modificada por ingeniería genética para escindir un producto de ARNm endógeno deseado (véase por ejemplo, Gibson y Shillitoe, Mol. Biotech. 7: 125,1997). Por lo tanto, cualquier gen que produzca una proteína o ARNm que exprese un fenotipo
o cambio de morfología de interés es útil para la práctica de la presente invención.
Además de elementos reguladores o secuencias localizadas cadena arriba (5’) o dentro de una secuencia de ADN, existen secuencias cadena abajo (3’) que afectan a la expresión génica. Por lo tanto, la expresión secuencia reguladora como se usa en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos localizada cadena arriba, dentro, o cadena abajo de una secuencia de ADN que controla, media en o afecta a la expresión de un producto génico junto con el aparato sintético proteico de la célula.
Los expertos en la materia conocen las construcciones adecuadas para la transformación de plantas. Las secuencias promotoras de la presente invención se incorporan preferentemente en una construcción de expresión usando marcadores explorables o puntuables como se ha descrito y se ensayan en análisis transitorios para proporcionar un indicio de la expresión génica en plantas transformadas. Se conocen procedimientos para ensayar la expresión génica en ensayos transitorios por los expertos en la materia. Se ha indicado expresión transitoria de genes marcadores usando varias plantas, tejidos y sistemas de suministro de ADN. Por ejemplo, los tipos de análisis transitorios pueden incluir pero sin limitación dirigir el suministro génico mediante electroporación o bombardeo de partículas de tejidos en cualquier ensayo de planta transitorio usando cualquier especie vegetal de interés. Tales sistemas transitorios incluirían pero sin limitación protoplastos de cultivos en suspensión en trigo (Zhou y col., Plant Cell Reports 12: 612. 1993), electroporación de protoplastos de hoja de trigo (Sethi y col., J. Crop Sci. 52: 152, 1983); electroporación de protoplasto preparado a partir de tejido de maíz (Sheen, J. The Plant Cell 3: 225, 1991) o bombardeo de partículas de tejidos específicos de interés. La presente invención abarca el uso de cualquier sistema de expresión transitorio para evaluar secuencias reguladoras unidas operativamente a genes indicadores seleccionados, genes marcadores o genes agrónomos de interés. Los ejemplos de tejidos vegetales que se ha previsto ensayar en transitorios mediante un sistema de suministro apropiado incluirían pero sin limitación tejidos de base de las hojas, callos, cotiledones, raíces, endospermos, embriones, tejido floral, polen y tejido epidérmico.
Puede usarse cualquier marcador puntuable o explorable en un ensayo transitorio. Los genes marcadores preferidos para análisis transitorios de los promotores de secuencias reguladoras 5’ de la presente invención incluyen un gen de 1-glucuronidasa (GUS) o un gen de proteína verde fluorescente (GFP). Las construcciones de expresión que contienen las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a un gen marcador se suministran a los tejidos y los tejidos se analizan por el mecanismo apropiado, dependiendo del marcador. Los análisis cuantitativos o cualitativos se usan como una herramienta para evaluar el perfil de expresión potencial de las secuencias reguladoras 5’ cuando se unen operativamente a genes de interés agrónomo en plantas estables. En última instancia, las secuencias reguladoras 5’ de la presente invención se incorporan directamente en construcciones de expresión de transformación de plantas adecuadas que comprenden las secuencias reguladoras 5’ unidas operativamente a una secuencia de ADN transcribible de interés, se transforman en plantas y las plantas transformadas de forma estable y descendencia de las mismas se analizan con respecto al perfil de expresión deseado conferido por las secuencias reguladoras 5’.
Las construcciones de expresión adecuadas para introducir ADN exógeno en células vegetales incluirían pero sin limitación plásmidos Ti desarmados para procedimientos mediados por Agrobacterium. Estas construcciones pueden contener un marcador de resistencia, límites de ADN T 1-2 y orígenes de replicación para E. coli y Agrobacterium junto con uno o más genes de interés y regiones reguladoras asociadas. Los expertos en la materia saben que están disponibles para enfoques mediados por Agrobacterium varias cepas y procedimientos. Tales cepas incluirían pero sin limitación cepas de Agrobacterium C58, LBA4404, EHA101 y EHA105. Son cepas particularmente preferidas las cepas de Agrobacterium tumefaciens.
Ácidos nucleicos a modo de ejemplo que pueden introducirse por los procedimientos abarcados por la presente invención incluyen, por ejemplo, secuencias de ADN o genes de otras especies, o incluso genes o secuencias que se originan con o están presentes en la misma especie, pero se incorporan en células receptoras por procedimientos de ingeniería genética en vez de técnicas de reproducción o cultivo clásicas. Sin embargo, el término “exógeno” también pretende referirse a genes que normalmente no están presentes en la célula que se transforma, o quizá simplemente no están presentes en la forma, estructura, etc., como se haya en el segmento de ADN transformante o gen o genes que normalmente están presentes y que se desea expresar de una manera que difiere del patrón de expresión natural, por ejemplo, sobreexpresar. Por lo tanto, el término gen “exógeno” o ADN pretende referirse a cualquier gen o segmento de ADN que se introduce en una célula receptora, independientemente de si un gen similar ya está presente en una célula tal. El tipo de ADN incluido en el ADN exógeno puede incluir ADN que ya está presente en la célula vegetal, ADN de otra planta, ADN de un organismo diferente o un ADN generado de forma externa, tal como secuencia de ADN que contiene un mensaje antisentido de un gen, o una secuencia de ADN que codifica una versión sintética o modificada de un gen.
Las construcciones de transformación de plantas que contienen las secuencias promotoras de la presente invención pueden introducirse en plantas por cualquier procedimiento de transformación de plantas. Están disponibles varios procedimientos para introducir secuencias de ADN en células vegetales y se conocen bien en la técnica. Los procedimientos adecuados incluyen pero sin limitación infección bacteriana (por ejemplo, con Agrobacterium como se ha descrito anteriormente), construcciones de cromosoma artificial de bacterias binarios, suministro directo de ADN (por ejemplo, mediante transformación mediada por PEG, captación de ADN mediada por desecación/inhibición, electroporación, agitación con fibras de carburo de silicio), y aceleración de partículas revestidas con ADN (revisado en Potrykus, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 42: 205, 1991).
Los procedimientos para transformar específicamente dicotiledóneas usan principalmente Agrobacterium tumefaciens. Por ejemplo, las plantas transgénicas indicadas incluyen pero sin limitación algodón (Patente de Estados Unidos Nº 5.004.863; Patente de Estados Unidos Nº 5.159.135; Patente de Estados Unidos Nº 5.518.908, documento WO 97/43430), soja (Patente de Estados Unidos Nº 5.569.834; Patente de Estados Unidos Nº 5.416.011; McCabe y col., Bio/Technology, 6:923, 1988; Christou y col., Plant Physiol., 87:671, 1988); Brassica (Patente de Estados Unidos Nº 5.463.174), y cacahuete (Cheng y col., Plant Cell Rep., 15: 653, 1996).
Se han presentado procedimientos similares en la transformación de monocotiledóneas. La retransformación y regeneración de plantas usando estos procedimientos se ha descrito para varios cultivos incluyendo pero sin limitación espárragos (Asparagus officinalis; Bytebier y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 5345, 1987); cebada (Hordeum vulgarae; Wan y Lemaux, Plant Physiol., 104: 37, 1994); maíz (Zea mays; Rhodes, C.A., y col., Science,
240: 204, 1988; Gordon-Kamm, y col., Plant Cell, 2: 603, 1990; Fromm, y col., Bio/Technology, 8: 833, 1990; Koziel, y col., Bio/Technology, 11: 194, 1993); avena (Avena sativa; Somers, y col., Bio/Technology, 10: 1589, 1992); Dactylis (Dactylis glomerata; Horn, y col., Plant Cell Rep., 7: 469, 1988); arroz (Oryza sativa, incluyendo variedades índica y japónica, Toriyama, y col., Bio/Technology, 6: 10, 1988; Zhang, y col., Plant Cell Rep., 7: 379, 1988; Luo y Wu, Plant Mol. Biol. Rep., 6: 165, 1988; Zhang y Wu, Theor. Appl. Genet., 76: 835, 1988; Christou, y col., Bio/Technology, 9: 957, 1991); sorgo (Sorghum bicolor; Casas, A.M., y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 11212, 1993); caña de azúcar (Saccharum spp. ; Bower y Birch, Plant J., 2: 409, 1992); festuca alta (Festuca arundinacea; Wang, Z.Y. y col., Bio/Technology, 10: 691, 1992); césped (Agrostis palustris; Zhong y col., Plant Cell Rep., 13: 1, 1993); trigo (Triticum aestivum; Vasil y col., Bio/Technology, 10: 667, 1992; Weeks T., y col., Plant Physiol., 102: 1077, 1993; Becker, y col., Plant, J. 5: 299, 1994), y alfalfa (Masoud, S.A., y col., Transgen. Res., 5: 313, 1996). Resulta evidente para los expertos en la materia que pueden usarse varias metodologías de transformación para producción de plantas transgénicas estables de cualquier variedad de cultivos diana de interés.
Procedimientos de análisis de plantas
Las plantas transformadas se analizan con respecto a la presencia de los genes de interés y el nivel de expresión y/o perfil conferido por las secuencias promotoras de la presente invención. Los expertos en la materia conocen numerosos procedimientos disponibles para análisis de plantas transformadas. Se usan varios procedimientos para evaluar la expresión génica y determinar si el gen o los genes introducidos se integran, actúan de forma apropiada y se heredan como se esperaba. Para la presente invención los promotores pueden evaluarse determinando los niveles de expresión de genes con los que se unen operativamente los promotores. Una evaluación preliminar de la función promotora puede determinarse por un procedimiento de ensayo transitorio usando genes indicadores, pero una evaluación promotora más definitiva puede determinarse a partir del análisis de plantas estables. Los procedimientos para análisis de plantas incluyen pero sin limitación transferencias de Southern o transferencias de Northern, enfoques basados en PCR, análisis bioquímicos, procedimientos de exploración fenotípicos, evaluaciones de campo y ensayos inmunodiagnósticos.
Los procedimientos de la presente invención incluyen pero sin limitación tecnologías de PCR, aislamiento de ADN genómico, construcción de una construcción de expresión, ensayos transitorios y se conocen bien por los expertos en la materia procedimientos de transformación de plantas y se llevan a cabo usando técnicas convencionales o modificaciones de las mismas.
Ensayos de pulverización de glifosato
En una realización se lleva a cabo una evaluación de invernadero o de campo con respecto a la tolerancia de glifosato. El término “glifosato” se usa en el presente documento para referirse colectivamente al herbicida parental N-fosfonometilglicina (conocido de otro modo como ácido de glifosato), a una sal o éster del mismo, o a un compuesto que se convierte a N-fosfonometilglicina en tejidos vegetales o que proporciona de otro modo Nfosfonometilglicina en forma iónica (conocido de otro modo como ión glifosato). De forma ilustrativa, se desvelan sales de glifosato solubles en agua útiles en el presente documento en las Patentes de Estados Unidos Nº 3.799.758 y Nº 4.405.531 de Franz, la divulgación de las cuales se incorpora en el presente documento por referencia. Las sales de glifosato que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen pero sin restricción metales alcalinos, por ejemplo sodio y potasio, sales; sal de amonio; sales de C1-16 alquilamonio, por ejemplo dimetilamonio e isopropilamonio; sal de C1-16 alcanolamonio, por ejemplo monoetanolamonio; sales de C1-16 alquilsulfonio, por ejemplo trimetilsulfonio; mezclas de los mismos y similares. La molécula de ácido de glifosato tiene tres sitios ácidos que tienen diferentes valores de pKa; en consecuencia pueden usarse sales mono, di y tribásicas o cualquier mezcla de las mismas, o sales de cualquier nivel intermedio de neutralización.
Las sales de glifosato son significativas comercialmente en parte debido a que son solubles en agua. Muchas sales de amonio, alquilamonio, alcanolamonio, alquilsulfonio y metales alcalinos son altamente solubles en agua, lo que permite su formulación como soluciones acuosas altamente concentradas que pueden diluirse en agua en el punto de uso.
Dichas soluciones acuosas concentradas pueden contener de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 g por litro de glifosato, expresado como equivalente de ácido (g e.a./l). Se prefieren mayores concentraciones de glifosato, por ejemplo de aproximadamente 300 a aproximadamente 500 g e.a/l.
Las sales de glifosato se formulan de manera alternativa como composiciones solubles en agua o dispersables en agua, por ejemplo, en forma de polvos, gránulos, granza o comprimidos. Tales composiciones se conocen frecuentemente como formulaciones en seco, aunque el término “seco” no debe entenderse en este contexto que implique la ausencia completa de agua. Normalmente, las formulaciones en seco contienen menos de aproximadamente el 5 % en peso de agua, por ejemplo de aproximadamente el 0,5 % a aproximadamente el 2 % en peso de agua. Tales formulaciones están destinadas para la disolución o dispersión en agua en el momento del uso.
Las formulaciones de glifosato en seco contempladas pueden contener de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 80 % en peso de glifosato, expresado como equivalente de ácido (porcentaje de e.a.). Se prefieren mayores concentraciones de glifosato dentro del intervalo anterior, por ejemplo de aproximadamente el 50 % a aproximadamente el 80 % e.a. Las sales de glifosato especialmente útiles para fabricar formulaciones en seco son las sales de sodio y de amonio.
Las composiciones para el tratamiento de plantas y las composiciones de concentrado líquido y seco de la presente invención pueden contener opcionalmente uno o más principios de excipientes deseados. Los principios excipientes especialmente útiles para las composiciones de glifosato son tensioactivos, que ayudan a retener las soluciones de pulverización acuosas en las superficies relativamente hidrófobas de las hojas de las plantas, así como ayudar al glifosato a penetrar en la capa externa cerosa (cutícula) de la hoja y por lo tanto ponerse en contacto con los tejidos vivos dentro de la hoja. Los tensioactivos también pueden realizar otras funciones útiles.
No existe limitación en cuanto al tipo o clase química de tensioactivo que puede usarse en las composiciones de glifosato de la presente invención. En situaciones particulares, son del todo útiles los tipos no iónicos, aniónicos, catiónicos y anfotéricos, o combinaciones de más de uno de estos tipos. Sin embargo, generalmente se prefiere que al menos uno de los tensioactivos presente, si hubiese alguno, deba ser distinto de aniónico, es decir, al menos uno de los tensioactivos debe ser no iónico, catiónico o anfotérico.
Muchos tensioactivos útiles en el presente documento tienen una estructura química que comprende uno o más restos consistiendo cada uno en una sola unidad de óxido de alquileno C2-4 o una cadena polimerizada o copolimerizada de unidades de óxido de alquileno C2-4. Tales tensioactivos se denominan tensioactivos de polioxialquileno e incluyen tipos anfotéricos no iónicos, aniónicos y catiónicos. Los tensioactivos de polioxialquileno útiles en las composiciones contempladas en la presente invención contienen de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno C2-4. En los tensioactivos de polioxialquileno preferidos las unidades de óxido de alquileno forman una o más cadenas de óxido de etileno o de óxido de etileno y de óxido de propileno copolimerizado, teniendo cada cadena de óxido de alquileno unidades que tienen un grupo hidrido terminal
o una terminación con protección alquilo C1-4 o alcanoilo C1-4.
Los restos hidrófobos de los tensioactivos útiles en las composiciones de la presente invención pueden basarse esencialmente en hidrocarbono, en cuyo caso los restos hidrófobos son normalmente cadenas de alquilo, alquenilo, alquilarilo, alcanoilo o alquenoilo C8-24, preferentemente C12-18. Estas cadenas pueden ser lineales o ramificadas. Como alternativa, los restos hidrófobos pueden contener átomos de silicio, por ejemplo en forma de grupos siloxano tales como grupos heptametiltrisiloxano, o átomos de flúor, por ejemplo, como cadenas de alquilo o perfluoroalquilo parcialmente fluoradas.
Entre los tensioactivos no iónicos, las clases especialmente preferidas incluyen éteres de polioxietileno de alquilo, alquenilo o alquilarilo, tales como alcoholes primarios o secundarios etoxilados o alquilfenoles, ésteres de polioxietileno de alquilo o alquenilo, tales como ácidos grasos etoxilados, ésteres de polioxietileno sorbitán alquilo sorbitan, ésteres de gliceril alquilo, ésteres de sacarosa, alquil poliglucósidos y similares. Los ejemplos específicos representativos de tales tensioactivos no iónicos incluyen polioxietilen (9) nonilfenol, NeodolTM 25-7 de Shell (un alcohol primario lineal C12-15 de polioxietileno (7)), TergitolTM 15-S-9 de Union Carbide (un alcohol secundario C12-15 de polioxietileno (9)), TweenTM 20 de ICI (un monolaurato de polioxietileno de sorbitan (20)) y AgrimulTM PG-2069 de Henkel (un alquil poliglucósido C9-11).
Entre los tensioactivos catiónicos, las clases especialmente preferidas incluyen alquilaminas o alquenilaminas terciarias de polioxietileno, tales como aminas grasas etoxiladas, tensioactivos de amonio cuaternario, alquileteraminas de polioxietileno, y similares. Los ejemplos específicos representativos de tales tensioactivos catiónicos incluyen polioxietilen (5) cocoamina, polioxietilen (15) seboamina, cloruro de diestearildimetilamonio, bromuro de cetiltrimetilamonio, cloruro de metil bis (2-hidroxietil)cocoamonio, cloruro de N-dodecilpiridina y cloruro de polioxipropilen (8) etoxitrimetilamonio. Las polioxietilen alquileteraminas particularmente preferidas son las descritas en la Publicación PCT Nº WO 96/32839. En la técnica se conocen muchos tensioactivos de amonio cuaternario catiónicos de diversas estructuras que son útiles en combinación con glifosato y que pueden usarse en las composiciones contempladas en el presente documento; tales tensioactivos de amonio cuaternario tienen la fórmula
(NRaRbRcRd)mAn
en la que A es un anión adecuado tal como cloro, bromo, iodo, acetato, sulfato o fosfato, m y n son números enteros de tal manera que las cargas eléctricas positivas sobre los cationes (NRaRbRcRd) equilibran las cargas eléctricas negativas sobre los aniones A, y las opciones para Ra, Rb, Rc y Rd incluyen, sin limitación:
(i)
Ra es bencilo o alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18 y Rb, Rc y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(ii)
Ra y Rb son independientemente alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, y Rc y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(iii) Ra es alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, Rb es una cadena de polioxialquileno que tiene aproximadamente de 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno C2-4, preferentemente unidades de óxido de etileno, y Rc y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo;
(iv)
Ra es alquilo o alquenilo C8-24, preferentemente C12-18, Rb y Rc son cadenas de polioxialquileno que tiene en total de aproximadamente 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno C2-4, preferentemente unidades de óxido de etileno, y Rd es alquilo C1-4, preferentemente metilo; o
(v)
Ra es una cadena de polioxialquileno que tiene de aproximadamente de 2 a aproximadamente 100 unidades de óxido de alquileno C2-4, en la que predominan las unidades de óxido de alquileno C3-4, preferentemente unidades de óxido de propileno y Rb, Rc y Rd son independientemente alquilo C1-4, preferentemente metilo o etilo. Los tensioactivos de amonio cuaternario de este tipo particularmente preferidos son los desvelados en la Patente de Estados Unidos Nº 5.464.807 de Claude y col.
En una realización, el anión A asociado con dicho tensioactivo de amonio cuaternario puede ser un anión de glifosato.
Entre los tensioactivos anfotéricos, incluyendo como es habitual en la técnica los tensioactivos más debidamente descritos como zwitteriónicos, clases especialmente preferidas incluye óxidos de polioxietilen alquilamina, alquilbetainas, aminoácidos sustituidos con alquilo y similares. Los ejemplos representativos de tales tensioactivos anfotéricos incluyen óxido de dodecildimetilamina, óxido de polioxietilen (2) cocoamina y estearildimetilbetaína.
Las fuentes de referencia convencionales a partir de las cuales un experto en la materia puede seleccionar tensioactivos adecuados, sin limitación con respecto a las clases mencionadas anteriormente, incluyen los documentos Handbook of Industrial Surfactants, Segunda Edición (1997) publicado por Gower, McCutcheon’s Emulsifiers and Detergents, North American and International Editions (1997) publicado por MC Publishing Company, e International Cosmetic Ingredient Dictionary, Sexta Edición (1995) Volúmenes 1 y 2, publicado por the Cosmetic, Toiletry and Fragrance Association.
Otros componentes opcionales de las composiciones de la presente invención incluyen agentes para modificar características de color, viscosidad, de gelificación, punto de congelación, higroscopía, comportamiento de apelmazamiento, velocidad de disolución, dispersibilidad u otras características de la formulación.
Ejemplos de formulaciones de glifosato comerciales incluyen, sin limitación, las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP®, ROUNDUP® ULTRA, ROUNDUP® CT, ROUNDUP® EXTRA, ROUNDUP® BIACTIVE, ROUNDUP® BIOFORCE, RODEO®, POLARIS®, SPARK® y ACCORD®, todas ellas conteniendo glifosato como su sal de isopropilamonio; las comercializadas por Monsanto Company como herbicidas ROUNDUP® DRY y RIVAL®, que contienen glifosato como su sal de amonio; las comercializadas por Monsanto Company como ROUNDUP® GEOFORCE, que contienen glifosato como su sal de sodio y la que comercializa Zeneca Limited como herbicida TOUCHDOWN®, que contiene glifosato como su sal trimetilsulfonio.
La selección de las tasas de aplicación para una formulación de glifosato que sea biológicamente eficaz se encuentra dentro de la competencia de la técnica agrícola habitual. Un experto en la materia probablemente reconocerá qué condiciones individuales de la planta, condiciones climatológicas y condiciones de cultivo pueden influir en los resultados conseguidos en la realización práctica del proceso de la presente invención. Durante dos décadas del uso de glifosato y estudios publicados relacionados con dicho uso han proporcionado información abundante a partir de la cual un buen profesional del control de maleza puede seleccionar las tasas de aplicación de glifosato que sean eficaces desde el punto de vista herbicida sobre especies particulares en fases de crecimiento particulares en condiciones de entorno particulares.
Un proceso de la presente invención puede aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biológicamente eficaz como un herbicida o como un regulador del crecimiento de las plantas. Esto incluye una variedad muy amplia de especies vegetales en todo el mundo. Del mismo modo, las composiciones de la invención pueden aplicarse a cualquiera y a todas las especies vegetales en las que el glifosato es biológicamente eficaz.
En una realización, a la planta que comprende las construcciones de ADN de la presente invención se le aplica un herbicida que contiene glifosato y las plantas se evalúan para determinar la tolerancia al herbicida de glifosato. Para someter a ensayo las plantas que comprenden las construcciones de ADN de la presente invención puede usarse cualquier formulación de glifosato. Por ejemplo, puede usarse una composición de glifosato tal como Roundup UltraTM. Los parámetros de ensayo para realizar una evaluación de la planta de la tolerancia a glifosato variarán dependiendo de diversos factores. Los factores incluirían, pero sin limitación, el tipo de formulación de glifosato, la concentración y la cantidad de glifosato usada en la formulación, el tipo de planta, la fase de desarrollo de la planta durante el tiempo de la aplicación, las condiciones ambientales, el procedimiento de aplicación y del número de veces en los que se aplica una formulación particular. Por ejemplo, las plantas pueden someterse a ensayo en un entorno de invernadero usando un procedimiento de aplicación mediante pulverizador. El intervalo de ensayo usando Roundup UltraTM puede incluir, pero sin limitación, de 0,56 a 17,93 kg/ha (8 oz/acre a 256 ozs/acre). El intervalo comercialmente eficaz preferido puede ser de 1,12 a 4.48 kg/ha (16 oz/acre a 64 oz/acre) de Roundup UltraTM, dependiendo del cultivo y de la fase del desarrollo de la planta. Un cultivo puede pulverizarse al menos con una aplicación de una formulación de glifosato. Para ensayar en algodón, una aplicación de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) en la fase de 3 hojas puede continuarse por aplicaciones adicionales en las últimas fases en el desarrollo. Para el trigo puede usarse una aplicación de 2,24 kg/ha (32 oz/acre) de Roundup UltraTM en la fase de 3-5 hojas y puede continuarse con una aplicación previa o posterior a la cosecha, dependiendo del tipo de trigo que vaya a ensayarse. Los parámetros de ensayo pueden optimizarse para cada cultivo con objeto de encontrar la planta particular que comprenda las construcciones de la presente invención que confiera el nivel de tolerancia a glifosato eficaz deseado desde el punto de vista comercial.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención.
Los ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones se reservaron sólo para fines ilustrativos.
EJEMPLOS
Ejemplo 1
Las construcciones de plásmidos usadas son construcciones de clonación de pUC o construcciones de transformación de plantas de doble límite que contiene un origen de replicación de E. coli tal como ori322, un origen de replicación de amplio intervalo de hospedador tal como oriV o oriRi, y una región codificante para un marcador de selección tal como Spc/Str que codifica el aminoglucósido adeniltransferasa (aadA) de Tn7 que confiere resistencia a espectinomicina o a estreptomicina, o un marcador de selección de gentamicina (Gm, Gent). Para la transformación en plantas, la cepa bacteriana hospedadora fue Agrobacterium tumefaciens ABI o LBA4404.
Los elementos genéticos se describen de la siguiente manera: P-e35S es el ARN 35S del VMCa que contiene una duplicación de la región -90-300 como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.424.200 ; P-FMV es el promotor del Virus del Mosaico de la Higuera, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.378.619; PeFMV es un derivado del P-FMV;
CTP2 es la región del péptido de tránsito de la EPSP sintasa de Arabidopsis, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.633.435; aroA:CP4syn (aroA:CP4) es la región codificante de EPSP (secuencia sintética) de CP4, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.633.435 o además modificada para la expresión en plantas en base al uso de codones de especies de plantas particulares; E9 3’ es el extremo 3’ de un aislado del gen RbcS del guisante que actúa como una señal de poliadenilación; nos es el extremo 3’ del gen de nopalina sintasa que actúa como una señal de poliadenilación; Hsp70 es la secuencia líder no traducida de Petunia hybrida como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.362.865; GUS es la secuencia codificante de la beta-glucuronidasa de E. coli (Jefferson, R. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 83: 8447-8451, 1987); el borde derecho (BD) y el borde izquierdo (BI) son del plásmido Ti de las cepas de octopina y nopalina de Agrobacterium tumefaciens. El P-AtAct2 es el promotor del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la región 5’ no traducida (UTR, acrónimo de untranslated region) del gen de actina 2 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct8 es el promotor del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; AtAct2i es el intrón en la UTR 5’ del gen de actina 8 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct11 es el promotor del gen actina 11 de Arabidopsis thaliana; AtAct11i es el intrón en la UTR 5’ del gen de actina 11 de Arabidopsis thaliana; P-AtAct1a es el promotor del gen de actina1a de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1a es la secuencia líder no traducida e I-AtAct1a es el intrón del ADN genómico del gen de actina 1a; P-AtAct1b es el promotor del gen de actina 1b de Arabidopsis thaliana, L-AtAct1b es la secuencia líder no traducida e I-AtAct 1b es el intrón del ADN genómico del gen de actina 1b; P-AtAct3 es el promotor del gen de actina 3 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct3 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct3 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 3; P-AtAct7 es el promotor del gen de actina 7 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct7 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct7 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 7; P-AtAct12 es el promotor del gen de actina 12 de Arabidopsis thaliana, L-AtAct12 es la secuencia líder no traducida e I-AtAct12 es el intrón del ADN genómico del gen de actina 12; P-AtEF1a (P-AtEF1 o EF1a) es el promotor del gen del factor de elongación 1a de Arabidopsis thaliana, AtEF1a-i (AtEF1-i) es el intrón de la UTR 5’ del gen del factor de elongación 1a de Arabidopsis thaliana.
Las Figuras 1-18 proporcionan ejemplos de construcciones de transformación en plantas que contienen de uno a tres casetes de expresión de plantas. Los expertos en la técnica de la biología molecular vegetal pueden construir combinaciones múltiples de casetes de expresión en plantas que comprendan el promotor y los elementos genéticos de la presente invención y pueden realizar ensayos en plantas de cultivo sin demasiada experimentación. Las construcciones ilustradas en las figuras no deben considerarse como las únicas construcciones que pueden ensamblarse, si no que únicamente sirven como ejemplos para los expertos en la técnica. La Figura 1 (pCGN8086) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct8) unido operativamente a un gen de interés (CTP2aroA:CP4syn). La Figura 2 (pMON45325) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden al menos un promotor de la presente invención (P-AtAct 11) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 3 (pMON45331) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtEF 1 más intrón) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 4 (pMON45332) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden al menos un promotor de la presente invención (P-AtEF más intrón) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 5 (pMON9190) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene tres casetes de expresión en el que al menos dos promotores de la presente invención (P-AtEF1 más intrón, AtEF1a-i; PAtAct2 más intrón, AtAct2i) están unidos operativamente a al menos un gen de interés (CTP2aroA:CP4syn) y el promotor P-eFMV está unido operativamente a CTP2-aroA:CP4syn. Los casetes de expresión en plantas de la Figura 6 (pMON9153) son idénticos a los ilustrados en la Figura 4 (pMON45332), este mapa de plásmido se ilustra con el fin de identificar los casetes de expresión para los datos mostrados sobre los fenotipos de plantas en las tablas de datos mostradas en la memoria descriptiva. La Figura 7 (pCGN8099) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden promotores híbridos de la presente invención, P-FMV-AtEF1a y P-e35S-AtAct8, que conducen la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 8 (pCGN8088) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden un promotor de la presente invención, P-AtAct8 más intrón, AtAct8i, y el promotor P-eFMV que conduce la expresión de un gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 9 (pCGN8068) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden un promotor de la presente invención, P-AtAct2 más intrón, AtAct2i, y el promotor PeFMV que conduce la expresión de un gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 10 (pCGN8096) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden promotores híbridos de la presente invención, P- FMV/-AtAct11 y P-e35S-AtAct2, que conducen la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 11 (pCGN9151) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene dos casetes de expresión que comprenden promotores híbridos de la presente invención, P-FMV-AtEF1a y P-e35S-AtAct2, que conducen la transcripción del gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 12 (pMON10156) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende el promotor P-eFMV que conduce la expresión del gen de interés aroA:CP4syn, este vector se usa con fines comparativos con las secuencias promotoras de la presente invención. La Figura 13 (pMON52059) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor híbrido (P_FMV-AtEF1a) que conduce la expresión del gen de interés (aroA:CP4syn). La Figura 14 (pMON54952) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct1a más intrón AtAct1a) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2aroA:CP4syn). La Figura 15 (pMON54953) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en
plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct1b más intrón AtAct1b) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 16 (pMON54954) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct3 más intrón AtAct3) unido operativamente 5 a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn). La Figura 17 (pMON54955) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct7 más intrón AtAct7) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2aroA:CP4syn). La Figura 18 (pMON54956) proporciona un ejemplo de una construcción de transformación en plantas que contiene un casete de expresión que comprende un promotor de la presente invención (P-AtAct12 más
10 intrón AtAct12) unido operativamente a al menos un gen de interés (CTP2-aroA:CP4syn).
Ejemplo 2
Las construcciones de clonación y las construcciones GUS se enumeran en la Tabla 1. El promotor y el intrón de actina 2 de Arabidopsis (número de entrada a Genbank U41998 como se describe en An et al., Plant J. 10: 107-121, 1996) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta (Rogers and Bendich, Plant
15 Mol. Biol. 5: 69, 1998) usando la SEC ID Nº 1 (cebador directo) y la SEC ID Nº 2 (cebador inverso) en una reacción de la siguiente manera: 0,5 !g de ADN molde, 25 pmol de cada cebador, taq polimerasa (BMB, Indianapolis, IN) usando perlas de cera para PCR “de inicio en caliente” (hot start). Las condiciones del termociclador de la PCR fueron las siguientes: 94 ºC durante un minuto; 30 ciclos de: 92 ºC durante 40 segundos, 55 ºC durante un minuto, 72 ºC durante un minuto y 30 segundos; y una prolongación de cinco minutos a 72 ºC. La reacción PCR se purificó
20 usando GeneClean II (Bio101 Inc., Vista, CA), la digestión se realizó con HindIII y NcoI y se ligó en la construcción pMON26149 (Tabla 1) se realizó la digestión con HindIII y NcoI. Se verificó la secuencia del clon promotor y la construcción resultante se denominó pMON26170 (Tabla 1).
Tabla 1. Construcciones de clonación y construcciones GUS que contienen las secuencias promotoras de Actina y de EF1 de Arabidopsis
Construcción Descripción Promotor*/Gen/3’ pMON26149 construcción de clonación pMON26170 construcción de expresión en plantas Act2/GUS/nos pMON26171 construcción de expresión en plantas Act8/GUS/nos pMON8677 construcción de clonación pMON48407 construcción de expresión en plantas Act11/GUS/nos pMON26152 construcción de clonación pMON26177 construcción de expresión en plantas EF1/GUS/nos pMON11750 construcción de expresión en plantas e35S/GUS/nos pMON15737 construcción de expresión en plantas VMH/GUS/nos
* las secuencias promotoras de actina y del factor de elongación también contienen la secuencia intrón de la UTR 5’
del gen correspondiente. 25
Ejemplo 3
El promotor y el intrón de actina 8 de Arabidopsis (número de entrada Genbank U42007 como se describe en An y col., Plant. J. 10:107-121, 1996) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta en condiciones PCR y procedimientos de purificación descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEC ID Nº:
30 3 (cebador directo) y SEC ID Nº: 4 (cebador inverso). El promotor se clonó usando las enzimas de restricción descritas en el Ejemplo 2, se verificaron las secuencias, y la construcción resultante se denominó pMON26171 (Tabla 1).
Ejemplo 4
El promotor e el intrón de actina 11 de Arabidopsis (número de entrada Genbank U27981 como se describe en
35 Huang y col., Plant Mol Biol., 33:125-139, 1997) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta a condiciones PCR y procedimientos de purificación descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEC ID Nº: 5 (cebador directo) y SEC ID Nº: 6 (cebador inverso). El promotor se clonó usando enzimas de restricción EcoRV y Ncol y se ligaron en pMON8677 (Tabla 1), se verificaron las secuencias y la construcción resultante se denominó pMON48407 (Tabla 1).
40 Ejemplo 5
El promotor y el intrón del factor de elongación 1a de Arabidopsis (AtEF1a) (número de entrada a Genbank X 16430 como se describe en Axelos y col., Mol. Gen. Genet. 219:106-112, 1989; Curie y col., NAR 19:1305-1310; Curie y col., Plant. Mol. Biol. 18:1083-1089, 1992; Curie y col., Mol. Gen. Genet. 238:428-436, 1993) se aislaron usando, como molde, ADN de Arabidopsis thaliana Landsberg erecta en condiciones PCR y procedimientos de purificación
45 descritos en el Ejemplo 2 usando los cebadores de la SEC ID Nº: 7 (cebador directo) y SEC ID Nº: 8 (cebador inverso). El promotor se clonó usando enzimas de restricción HindIII y NcoI y se ligó en pMON26152 (Tabla 1) como se describe en el Ejemplo 2, se verificaron las secuencias, y la construcción resultante se denominó pMON26177 (Tabla 1).
Ejemplo 6
Las construcciones de transformación en plantas descritas se acoplaron en Agrobacterium. La transformación del algodón se realizó esencialmente como se describe en el documento WO/0036911, incorporado en el presente documento por referencia en su totalidad. La transformación de Arabidopsis se realizó como se describe en Ye y col., Plant. Journal 19:249-257, 1999. La transformación del tomate se realizó como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.565.347 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.
Ejemplo 7
Una construcción de ADN se transformó en un cultivo diana de interés mediante un sistema de administración apropiado tal como un procedimiento de transformación mediado por Agrobacterium (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.569.834 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad, Patente de Estados Unidos Nº 5.416.011 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad, Patente de Estados Unidos Nº 5.631.152 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad, Patente de Estados Unidos Nº 5.159.135 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad, Patente de Estados Unidos Nº 5.004.863 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad y la Solicitud Provisional de Estados Unidos Nº 60/111795 incorporada por referencia en el presente documento en su totalidad). Como alternativa, puede usarse un procedimiento de bombardeo con partículas (véanse, por ejemplo, las Solicitudes de Patente WO 92/15675, WO 97/48814 y la Solicitud de Patente Europea 586,355 y las Patentes de Estados Unidos Nº 5.120.657, 5.503.998, 5.830.728 y 5.015.580, todas ellas incorporadas por referencia en el presente documento en su totalidad).
Una gran cantidad de sistemas de transformación y regeneración y procedimientos se encuentra disponible y son bien conocidos por los expertos en la materia. Las plantas y la progenie, transformadas de manera estable, se analizan posteriormente para determinar la expresión de los genes en tejidos de interés mediante diversos procedimientos de evaluación molecular, inmunodiagnóstico, bioquímicos y/o de campo, conocidos por los expertos en la materia, que incluyen, pero sin limitación, un ensayo de pulverización con una formulación de glifosato a concentraciones eficaces desde el punto de vista comercial, realizado en una cámara de cultivo o en un entorno de campo.
Ejemplo 8
Los ensayos GUS se realizaron por procedimientos rutinarios conocidos por los expertos en las materia (véase por ejemplo, Jefferson y col., EMBO J. 6:3901, 1987). Para el algodón, se sometieron a ensayo plantas R0. El tejido se seleccionó por tamaño en diversas fases del desarrollo, se tomaron muestras y se agruparon para los análisis. El brote floral del algodón se recogió y se extrajeron muestras de tejido reproductor masculino (anteras y filamentos), muestras de tejido reproductor femenino (todo el estigma, estilo y ovario) y corola (sépalos y pétalos). Para la selección por tamaño, se seleccionaron tres brotes florales de cada fase que incluyeron diversos tamaños incluyendo pequeño (menos de 0,5 cm), mediano (de 0,5-0,7 cm) y grande (fase vela o flor abierta). Las muestras foliares se recogieron aproximadamente después de 1-2 semanas de colocar las plantas de algodón en el invernadero y las otras muestras se recogieron aproximadamente de 1-2 meses más tarde. Las primeras flores no se recogieron (las cinco primeras posiciones de fructificación se dejaron intactas).
Para Arabidopsis, se analizaron plantas V1 y sólo se sometieron a ensayo segregantes homocigotos y heterocigotos. Se analizaron de ocho a diez sucesos por construcción (cinco plantas por suceso). Los resultados GUS para Arabidopsis representan muestras agrupadas de 8-10 sucesos. Los valores en las tablas descritas (Tabla 2 y Tabla 3) representan la expresión GUS promedio para el tejido indicado (pmol/MU/min/mg).
Ejemplo 9
Las plantas se analizaron para la detectar la expresión GUS en tejido foliar y en tejidos reproductores incluyendo brotes florales inmaduros y flores. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Las construcciones sometidas a ensayo incluyeron pMON48407 (P-AtAct11 + intrón/GUS/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/GUS/nos), pMON26171 (P-AtAct8 + intrón/GUS/nos), pMON11750 (e35S/GUS/nos), pMON26177 (P-EF1a + intrón/GUS/nos), y pMON15737 (P-FMV/GUS/nos). Los promotores de actina y del factor de elongación confirieron altos niveles de expresión GUS en tejidos múltiples incluyendo tejidos reproductores.
Tabla 2. Expresión GUS promedio en V1 de Arabidopsis
Construcción Hoja Brote floral inmaduro Flor Gineceo Androceo
pMON48407 6944 7394 8359 ND ND
pMON26170 45238 74099 54502 73623 217292
pMON26171 29343 35884 37125 76311 207100
pMON11750 60844 14032 16263 35882 115049
pMON26177 47598 72871 96420 191066 507370
pMON15737 28314 57903 84457 44696 87876
Ejemplo: 10
Las plantas de algodón R0 se sometieron a ensayo para determinar la expresión del gen indicador de GUS en tejidos seleccionados de diversas fases de desarrollo. Los brotes florales se clasificaron por tamaño (pequeño, 5 mediano y grande; grande = flor en vela y abierta). El androceo representa los tejidos reproductores masculinos. El gineceo representa los tejidos reproductores femeninos incluyendo todo el receptáculo (estigma, estilo y ovarios). La muestra de corola estaba compuesta de sépalos y pétalos. El tejido se preparó y los ensayos GUS se realizaron como se describe en el EJEMPLO 8. Los resultados se resumen en la Tabla 3. Las construcciones sometidas a ensayo incluyeron pMON48407 (P-EF1a + intrón/gus/nos), pMON26170 (P-AtAct2 + intrón/gus/nos) y pMON48407
10 (P-AtAct11 + intrón/gus/nos).
Se sometieron a ensayo seis plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26177. Se sometieron a ensayo veinte plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON26170. Se sometieron a ensayo ocho plantas y se obtuvieron valores GUS promedio para pMON48407. Los resultados demuestran que los promotores de actina y del factor de elongación pueden usarse para la expresión eficaz de genes unidos operativamente,
15 particularmente en tejidos reproductores.
TABLA 3. Resultados de Ensayo GUS para Plantas de Algodón
Construcción Promotor/intrón Tejido sometido a ensayo Resultados GUS
pMON26177 EF1a Hoja 11600 pMON26177 EF1a Corola pequeña 396 pMON26177 EF1a Gineceo pequeño 8670 pMON26177 EF1a Androceo pequeño 13771 pMON26177 EF1a Corola mediana 362 pMON26177 EF1a Gineceo mediano 3318 pMON26177 EF1a Androceo mediano 8006 pMON26177 EF1a Corola grande 351 pMON26177 EF1a Gineceo grande 500 pMON26177 EF1a Androceo grande 15512 pMON26170 Act2 Hoja 12718 pMON26170 Act2 Corola pequeña 1296 pMON26170 Act2 Gineceo pequeño 16684 pMON26170 Act2 Androceo pequeño 7570 pMON26170 Act2 Corola mediana 742 pMON26170 Act2 Gineceo mediano 10041
(continuación) Construcción Promotor/intrón Tejido sometido a ensayo Resultados GUS
pMON26170 Act2 Androceo mediano 7893
pMON26170 Act2 Corola grande 289
pMON26170 Act2 Gineceo grande 3218
pMON26170 Act2 Androceo grande 42737
pMON48407 Act11 Hoja 28289
pMON48407 Act11 Corola pequeña 10
pMON48407 Act11 Gineceo pequeño 40755
pMON48407 Act11 Androceo pequeño 47834
pMON48407 Act11 Corola mediana 742
pMON48407 Act11 Gineceo mediano 52495
pMON48407 Act11 Androceo mediano 35573
pMON48407 Act11 Corola grande 1072
pMON48407 Act11 Gineceo grande 4869
pMON48407 Act11 Androceo grande 42737
Ejemplo 11
Las plantas transformadas también se sometieron a ensayo en un ensayo de pulverización en invernadero usando Roundup Ultra™, una formulación de glifosato, con un dispositivo pulverizador Track (Roundup Ultra es una marca
5 registrada de Monsanto Company). Las plantas estaban en la fase de crecimiento de “dos” o más hojas verdaderas y las hojas se secaron antes de aplicar la pulverización de Roundup ®. La formulación usada fue Roundup Ultra™ como una formulación de 3 libras/galones e.a. (equivalente de ácido). El calibre usado fue el siguiente:
Para un volumen de pulverización de 20 galones/acre:
Velocidad de la boquilla: 9501 flujo uniforme
10 Presión de pulverización: 40 psi Altura de la pulverización: 18 pulgadas entre la parte superior del dosel y la punta de la boquilla Velocidad de rastreo: 1,1 ft/sec., correspondiente a una lectura de 1950-1,0 voltios Formulación: Roundup Ultra™ (3 libras e.a./galones)
Las concentraciones de pulverización variarán, dependiendo de los intervalos de ensayo deseados. Por ejemplo,
15 para una tasa deseada de 8 oz/acre se usa una solución de trabajo de 3,1 ml/l y para una tasa deseada de 64 oz/acre se usa una solución de trabajo de 24,8 ml/l.
El período de evaluación variará dependiendo del cultivo, de la fase del desarrollo de la planta y del nivel de tolerancia deseado.
Ejemplo 12
20 Las construcciones de expresión en plantas usadas para la transformación del tomate se indican en la Tabla 4. Se exploraron plantas de tomate (T0) que contenían construcciones que comprendían al menos un promotor de actina o del factor de elongación (con intrón), unido operativamente a un gen de tolerancia a glifosato, aroA:CP4 en un ensayo de pulverización con glifosato en un invernadero con una formulación de glifosato (Roundup Ultra™) para determinar la eficacia de conferir tolerancia a glifosato a plantas de tomate transgénicas. Opcionalmente, al menos
25 una secuencia promotora de actina o del factor de elongación unido operativamente a un gen aroA:CP4 y un promotor de colimovirus eFMV unido operativamente a un aroA:CP4 transformado en plantas de tomate se exploraron mediante aplicación por pulverización con glifosato (Roundup Ultra™). Las plantas de tomate se pulverizaron con 48 oz/acre, después se evaluaron a las dos semanas tras la aplicación para análisis de tolerancia vegetativa y hasta 60 días después de la aplicación para análisis de tolerancia reproductora. Los resultados se
30 muestran en la Tabla 4 y se clasifican de acuerdo con la eficacia de selección de líneas tolerantes reproductoras. El porcentaje de tolerancia vegetativa es el porcentaje de las líneas exploradas que demuestran tolerancia vegetativa suficiente a lesión por glifosato para considerarse para estudios posteriores de rasgos agronómicos en la
preparación de candidaturas desde el punto de vista comercial. El porcentaje de tolerancia reproductora es el porcentaje de las líneas tolerantes vegetativas que también demuestran tolerancia reproductora suficiente para considerarse para una evaluación agronómica posterior. Todas las construcciones demostraron funcionalidad para proporcionar tolerancia vegetativa y reproductora a las plantas de tomate transgénicas. Diversas combinaciones de 5 promotores son capaces de aumentar, la eficacia a la cual las líneas tolerantes vegetativas y reproductoras deben seleccionarse por exploración en este experimento. Las construcciones que contienen el promotor EF1a de Arabidopsis se asocian más específicamente con un elevado porcentaje de líneas tolerantes desde el punto de vista vegetativo. El promotor P-Act2 en combinación con P-eFMV y P-AtEF1a (pCGN9190), explorados por este procedimiento, proporcionaron un aumento en el porcentaje de líneas tolerantes desde el punto de vista reproductor.
10 Tabla 4. Ensayos de Pulverización Track en Invernadero con una Tasa de Aplicación de 48 oz/Acre*
Construcción Descripción Nº de líneas de tolerancia vegetativa1 de tolerancia sometidas a reproductora2 ensayo
pCGN9190 eFMV/CP4 + EF 1a/CP4 + 930 83,2 52,4
Act2/CP4 pCGN9153 EF1a/CP4 + eFMV/CP4 391 73,9 38,9 pCGN8086 Act8/CP4 21 47,6 38,1 pCGN8099 EF1a/CP4 + Act8/CP4 71 84,5 36,6 pCGN8088 eFMV/CP4 + Act8/CP4 144 79,9 34,7 pMON45325 eFMV/CP4 + Act11/CP4 90 70,0 34,4 pCGN8096 Act11/CP4 + Act2/CP4 201 62,7 10,4 pCGN8067 Act2/CP4 205 67,3 8,8
* una aplicación 1 resultados agrupados de 25 exploraciones. Puntuado 14 días después de la aplicación 2 resultados agrupados de 25 exploraciones. Puntuado hasta 60 días después de la aplicación
La producción de semillas de tomate se usa como una medición de la eficacia de las diversas secuencias promotoras y combinación de casetes de expresión en la presente invención para conferir tolerancia a glifosato a las plantas de tomate transgénicas. En la Tabla 5, se muestran los resultados de tres experimentos de campo en plantas de tomate transgénicas que contienen construcciones con los promotores de la presente invención que 15 conducen la expresión de la secuencia codificante aroA:CP4 para la tolerancia a glifosato. El experimento 1 es un ensayo de las plantas producidas a partir de las construcciones que contienen el promotor del virus del mosaico de la higuera (P-FMV) en la versión natural y derivada duplicada (P-eFMV) y elementos genéticos adicionales en las construcciones que también se encuentran en las construcciones usadas para someter a ensayo las secuencias promotoras de la presente invención. También se sometieron a ensayo otros elementos genéticos, tales como la 20 fuente de la secuencia 5’ no traducida y el péptido tránsito de cloroplastos. La construcción pMON20998 comprende el P-eFMV, unido a la UTR 5’ Hsp70 de petunia, secuencia líder unida al péptido de tránsito de cloroplasto (CTP2), de EPESPS de Arabidopsis, unido a la región de terminación 3’ E9. La construcción pMON20999 solo difiere de pMON20998 porque el promotor es P-FMV. La construcción pMON10156 solo difiere de pMON20998 porque el CTP es el péptido tránsito de cloroplasto de EPSPS de Petunia (CTP4). La construcción pMON45312 solo difiere de
25 pMON20998 porque la secuencia líder es la secuencia líder natural del FMV.
Las plantas de tomate se transplantaron en el campo en surcos. Las plantas se trataron con pulverizador en el campo a una tasa de 48 oz/acre con el herbicida Roundup. La semilla de tomate se recogió del fruto y se pesó. Una línea de tomate no pulverizada sirvió como control con fines comparativos y la eficacia de cada construcción se expresó como un porcentaje del control. El resultado del experimento 1 (columna 1 de la Tabla 5) es que el promotor 30 del FMV y el P-eFMV sólo proporciona del 5-11 % de la producción de semillas de un control sin pulverizar. El experimento 2 y 3 ensayan las construcciones de la presente invención a diferentes localizaciones (columnas 2 y 3 de la Tabla 5). El experimento 2 se realizó en la misma localización que el experimento 1, las construcciones pCGN8099 (Figura 7), pCGN9151 (Figura 11) y pCGN9190 (Figura 5) se realizaron bien proporcionando 25-46 % de la semilla con respecto a un control no pulverizado. En una localización diferente que tenía una estación de cultivo
35 más fría, el experimento 3 demostró que pCGN8068 (Figura 9), pCGN8088 (Figura 8), pCGN8099, pCGN9151, pCGN9153 (Figura 6) y pMON45325 (Figura 2) eran capaces de conferir suficiente tolerancia a glifosato para los tomates hasta ajustar el 34- 77 % de semillas normales de ajuste con respecto a un control no tratado.
Tabla 5. Experimentos de producción de semillas de tomate
Exp. 1 Peso en gramos de la semilla de control
Exp. 2 Peso en gramos de la semilla de control Exp. 3 Peso en gramos de la semilla de control
pMON20998
0,52 5,3
pMON20999
0,84 8,6
pMON10156
0,50 5,1
pMON45312
1,07 11,0
pCGN8068
0,48 8,4 7,06 77,8
pCGN8088
0,43 7,6 3,09 34,1
pCGN8096
0,40 7,0
pCGN8099
1,85 32,5 6,93 76,4
pCGN9151
1,46 25,7 6,11 67,4
pCGN9153
0,68 12,0 4,03 44,4
pCGN9190
2,64 46,4
pMON45325 pCGN8067
0,31 5,4 3,37 37,2
Control
9,73 100,0 5,69 100,0 9,07 100,0
Ejemplo 13
Las SEC ID Nº: 1-8 y las SEC ID Nº: 13-21 son cebadores de PCR diseñados a partir de la información de secuencia disponible públicamente para genes de Arabidopsis thaliana Act1, Act2 (Genbank Nº U41998), Act3, Act7, Act8 5 (Genbank Nº ATU42007), Act11 (Genbank Nº ATU27981), Act12 y Elf1a (Genbank Nº X 16430). Estas secuencias se usan para prolongar la secuencia de ácido nucleico usando técnicas de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase por ejemplo, Mullis y col, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1986; Erlich, y col., Solicitud de Patente Europea; 50,424; Solicitud de Patente Europea 84,796, Solicitud de Patente Europea 258,017, Solicitud de Patente Europea 237,362; Mullis, Solicitud de Patente Europea 201,184; Mullis, y col, Patente 10 de Estados Unidos Nº 4.683.202; Erlich, Patente de Estados Unidos Nº 4.582.788; y Saiki, y col, Patente de Estados Unidos Nº 4.683.194). Los expertos en la técnica conocen diversos procedimientos de amplificación por PCR y se usan para identificar secuencias de ácido nucleico adyacentes a una secuencia conocida. Por ejemplo, se han descrito procedimientos de PCR inversa (IPCR), que se usan para amplificar secuencias de ADN desconocidas adyacente a una región núcleo de secuencias conocidas. Otros procedimientos también se encuentran disponibles
15 tales como PCR de captura (Lagerstrom M., y col., PCR Methods Applic. 1:111, 1991) y PCR andante (Parker y col., Nucleic Acids Res 19:3055, 1991). Diversos fabricantes también han desarrollado kits basados en modificaciones de estos procedimientos con objeto de identificar secuencias de interés. Los adelantos técnicos que incluyen mejoras en el diseño de cebador y adaptador, mejoras en la enzima polimerasa y capacidades de termociclador han facilitado procedimientos más rápidos y eficaces para aislar secuencias de interés.
Tabla 5a. Secuencias de cebadores para el aislamiento de secuencias promotoras de actina y EF1a de
Arabidopsis
At. Actina 2 directo: GCCTCAGCCATGGTGAGTCTGCTGCAAACACACAAAAAGA GTTCAAT At. Actina 2 inverso: TTTTTTTTGATATCAAGCTTCAACTATTTTTATGTATGCATAAT TC At. Actina 8 directo: TTTTTTTTGATATCAAGCTTCCATTTTTCT TTTGCATAAT TC At. Actina 8 inverso: GCATCGGCCATGGTGAGTCTTCTGCAATCAAAAACATAAA GATCTGA At. Actina 11 directo: TTTTTTTTTAAGCTTGATATCACAACCAAATGTCAAATGG At. Actina 11 inverso: CCATCTGCCATGGTCTATATCCTGTC At. EF1a directo: TTTTTTTTTAAGCTTGATATCGGAAGTTTCTCTCTTG At. EF1a inverso: CTTTTCCCATGGTAGATCTCTGGTCAACAA ATC At. Actina 1a directo: CCCAAGCTTAAATGACATCAGATACACGC At. Actina 1b inverso: CATAAGCTTAGAGGTCCAAATTCA At. Actina I directo: CCATCAGCCATGGTCTTCTACCTTTATGCAAA At. Actina 3 directo: CCAAGCTTACCACACTCAGATGCATAAACAAACACA At. Actina 3 inverso: CATCAGCCATGGTCTACTCTCTGCAAAAACA At. Actina 7 directo: GCAAAGCTTACTAGTCAACAATTGGCC At. Actina 7 inverso: GATCGGCCATGGTTCACTAAAAAAAAAG At. Actina 12 inverso: GGAAGCTTGCGGCCGCTTTCTACTCTACATGTTTCT
Se homogeneizaron hojas de plantas jóvenes de Arabidopsis thaliana (1 g) en 9 ml de tampón CTAB (Saghai Maroof y col. 1984, PNAS 81:8014-8018). El tampón CTAB contenía TrisHCl 100 mM, pH 7,8, NaCl 700 mM, EDTA 50 mM, 5 CTAB (bromuro de alquiltrimetilamono) al 1 % y 2-mercaptoetanol 140 mM. Después de 90 minutos de incubación a 65 ºC, se añadieron 4,5 ml de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1) y las muestras se mezclaron durante 10 minutos. La capa acuosa se separó por centrifugación durante 10 minutos a 1500 g y se volvió a extraer con cloroformo: alcohol isoamílico. Después de una segunda centrifugación, la capa acuosa se transfirió a un tubo contenía 50 ml de ARNasa 10 mg/ml (sin DNasa) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos para retirar el ARN. El ADN
10 se precipitó con 6 ml de isopropanol y se volvió a suspender en 1 ml de tampón TrisHCl 10 mM, pH 8,5. La solución de ADN se extrajo una vez con un volumen igual de fenol y una vez con un volumen igual de cloroformo: alcohol isoamílico. Después de la centrifugación, se añadió un volumen de 1/10 de acetato de sodio (3 M, pH 5,2) a la capa acuosa, seguido por un volumen de 2,5 de etanol. El ADN se ensartó, se lavó en etanol al 70 % y después se secó al aire y se volvió a suspender en 0,2 ml de tampón TrisHCl 10 mM.
15 El ADN genómico de Arabidopsis (100 ng) se usó en reacciones PCR de 50 ml. Las reacciones contenían los cebadores mostrados en la Tabla 5a que contenían soluciones de cebador inverso y directo de 0,2 mM, los dNTP 200 nM y tampón de PCR con mezcla de magnesio y ADN polimerasa del sistema PCR Expand™ High Fidelity (Roche Molecular Biochemicals). Después de 2 minutos de desnaturalización iniciales a 94 °C las reacciones se ciclaron 35 veces durante 0,5 minutos a 94 °C, 0,5 minutos a 55 °C y 1,5 minutos a 72 °C. Los productos de la PCR
20 se analizaron por electroforesis en gel de agarosa al 1 %. Los fragmentos de ADN aislados en gel, que representaban secuencias de actina 1a, actina 1b, actina 7 y actina 12, se fosforilaron con ADN quinasa de T4 y se ligaron a una construcción de clonación pUC19 de corte Sma I y desfosforilada. Las colonias blancas se exploraron para detectar la presencia de insertos apropiados y se secuenciaron con M13 para confirmar la presencia de promotores de actina. Los clones seleccionados se denominaron pMON54941 (P-AtActla), pMON54942 (P-AtAct1b),
25 pMON54943 (P-AtAct7) y pMON54944 (P-AtAct12). Posteriormente, los fragmentos de ADN promotores de actina se liberaron por digestión con Hind III y Ncol de las construcciones pUC19 que contenían las secuencias inserto, los fragmentos de ADN se aislaron en gel y se ligaron a pMON26165 que se había digerido con las mismas enzimas de restricción. Un producto PCR para el promotor de actina 3 (P-AtAct3) se digirió con Hind III y Nco I y se clonó directamente en pMON26165 para formar pMON54951. pMON26165 contenía el segmento del gen terminador
30 GUS/nos. El ligamiento con los segmentos promotores permite ensayar cada promotor para detectar la actividad funcional por la expresión de la enzima �-glucuronidasa en células vegetales. Las células vegetales pueden aislarse, por ejemplo, protoplastos foliares de tabaco o las células vegetales pueden incluirse en un tejido u órgano vegetal, tal como, hoja, raíz, cotiledón, hipocotiledón, embrión, flor u órgano de almacenamiento.
El nivel de expresión de GUS conducido por esos promotores se sometió a ensayo en hipocotiledones de soja en
35 comparación con GUS conducido por el promotor P-e35S (Tabla 6). Después se bombardeó con partículas de oro/ADN de plásmido a hipocotiledones de soja tras 48 horas se sometió a ensayo la actividad GUS histoquímicamente. Todos los promotores actina sometidos a ensayo en este análisis mostraron actividad funcional en el tejido hipocotiledón demostrando su utilidad para la expresión de transgenes en especies de plantas de cultivo heterólogas. Las construcciones que contenían EPSPS de aroA:CP4 conducidas por los promotores de Arabidopsis
40 actina 1a, (pMON54952), actina 1b (pMON54953), actina 3 (pMON54954), actina 7 (pMON54955) y actina 12 (pMON54956) de la presente invención se prepararon en construcciones de transformación de plantas binarias de Agrobacterium para determinar la expresión estable de l EPSPS resistente a glifosato en plantas de cultivo. Estas construcciones se transformaron en células de soja y de algodón, las células se seleccionaron y se regeneraron en plantas sobre glifosato que contenía medio de cultivo tisular y después se sometieron a ensayo para determinar la
45 expresión de la proteína aroA:CP4 y para determinar la tolerancia a la aplicación de glifosato. Las plantas que demostraron tolerancia a glifosato comercialmente aceptables se desarrollaron posteriormente por procedimientos de cultivo convencionales para transferir el rasgo de tolerancia a glifosato en el plasma germinal adaptado para el cultivo.
Tabla 6. Actividad de diferentes promotores de actina de Arabidopsis en un ensayo transitorio en comparación con P-e35S.
Construcción
Actividad GUS
Pe35S/GUS
+++
P-AtAct1a/GUS
++
P-AtAct1b/GUS
++
P-AtAct3/GUS
++
P-AtAct7/GUS
++
P-AtAct12/GUS
+
5 Ejemplo 14
La producción de algodón se correlaciona con el número de cuadrados establecidos durante las cuatro a cinco primeras semanas de la cuadratura. La conservación de estos cuadrados a bolas maduras y su contribución para la cosecha del hilo de algodón es un componente clave de la producción. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgénicas para conferir tolerancia a herbicida en algodón, la cantidad de conservación de bolas es 10 una medición de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgéncias que contienen promotores de la presente invención (Tabla 7) se sometieron a ensayo en condiciones de invernadero para la conservación de bolas. Los promotores dirigen la expresión de la secuencia codificante aroA:CP4 para el fenotipo tolerante a glifosato. Las plantas se transformaron mediante un procedimiento mediado por Agrobacterium o mediante un procedimiento de bombardeo con partículas. Las construcciones de bombardeo de partículas contenían un GUS 15 adicional que contenía un casete de expresión útil para localización histoquímica de la actividad de la glucuronidasa a partir de los promotores de la presente invención. Las plantas transgénicas se degeneraron en medio que contenía glifosato y las plantas se enraizaron en un medio de enraizamiento. Las plántulas enraizadas se sembraron en el suelo y se transfirieron a una cámara de cultivo durante un período de endurecimiento. Las semillas de estas líneas de planta se recogieron y se plantaron. Quince plantas de cada línea se pulverizaron con glifosato a 20 3,36 kg/ha (48 onzas/acre) en la fase de 4 hojas. Al menos 8 plantas supervivientes de cada línea se pulverizaron de nuevo en la fase de 8 hojas con glifosato a 4 onzas/acre. Al llegar a la madurez, se contó el número de bolas de la primera posición para las cinco primeras bolas. Estas líneas que tenían 3 o más de las primeras posiciones de bolas conservadas después de la pulverización con glifosato (mapa de planta � 3) se hicieron progresar para estudio posterior. La Tabla 7 ilustra los datos producidos a partir de este estudio. El número de líneas mapeadas indica el 25 número de líneas que sobrevive a la primera aplicación con pulverización de glifosato. El patrón comercial es la línea 1445(pMON 17136) que contiene el promotor P-FMV que dirige la expresión del gen CTP2-aroA:CP4/E9 3’, esta línea conserva menos de 1 de las 5 primeras bolas. Las construcciones, pCGN8099, pCGN9153, pCGN8088, pCGN8068 proporcionan suficiente tolerancia a glifosato reproductora en el algodón de tal manera que el 14-35 % de las líneas sometidas a ensayo de estas construcciones se hicieron progresar para ensayos agronómicos
30 posteriores.
Tabla 7. Estudio de conservación de bolas de algodón en invernadero
Construcción Promotores Nº de líneas Mapeo de planta �3 mapeo %� 3
pCGN8099 FMV:EF1a + e35S:Act8 104 36 34,6 % pCGN9153 EF1a + FMV 36 12 33,3 % pCGN9165 EF1a + 35S/GUS 3 1 33,3 % pCGN9152 EF1a 7 0 0,0 % pCGN8088 Act8 + FMV 43 6 14,0 % pCGN8086 Act8 7 0 0,0 % pCGN8068 Act2 + FMV 37 7 18,9 %
(continuación)
Construcción pCGN8067 pCGN8084 pCGN8085 pCGN9164 pMON45325 pCGN8096 pCGN9154
Promotores Act2 Act2 + FMV + 35S/GUS Act2 + FMV/GUS Act11 + 35S/GUS Act11 + FMV FMV:Act11 + e35S:Act2 FMV:Act11 + e35S:Act2 Nº de líneas 37 5 1 21 43 14 16 Mapeo de planta �3 mapeo 0 0 0 1 0 0 1 %� 3 0,0 % 0,0 % 0,0 % 4,8 % 0,0 % 0,0 % 6,3 %
Línea 1445
FMV <1,0
Ejemplo 15
La producción de algodón se correlaciona con el número de cuadrados establecidos durante las primeras cuatro a
5 cinco semanas de la cuadratura. La conservación de estos cuadrados a bolas maduras y su contribución para la cosecha de hilo de algodón es un componente de producción clave. Cuando se determina la eficacia de construcciones transgénicas para conferir tolerancia herbicida en algodón, la cantidad de conservación de bolas es una medida de eficacia y es un rasgo deseable. Las plantas de algodón transgénicas que contienen promotores de la presente invención se sometieron a ensayo en condiciones de campo en dos localizaciones para la conservación
10 de bolas. Las líneas de algodón transgénicas 502-254-2 (pCGN8068), 701-178-2 (pCGN8068), 53-2 (pCGN8088), 178-1 (pCGN9153) y 60-1 (pCGN9153) se compararon con 1445 (línea de tolerancia a glifosato) y se incluyó PM1218BR (parental Paymaster 1218) que contenía la construcción pMON17136 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’), una línea no transgénica de tipo silvestre, Coker 130. El diseño de campo es un diseño en bloque completo al azar que consiste en 2 hileras x 20-30 pies x 3 repeticiones. El glifosato se aplica como una formulación de Roundup
15 UltraTM a tasas de producto de 1,12 lb ai/A = 48 oz y producto 1,5 lb ai/A = 64 oz en la fase de 8 hojas del desarrollo de la planta de algodón. Todas las parcelas de algodón se trataron de manera agresiva para el control de maleza y control de insectos, así como otras entradas agronómicas tales como tiempo de siembra, fertilización, irrigación, uso PGR y desfoliación. La conservación de bola en porcentaje se determinó mapeando la localización de cada una de las bolas conservadas por selección al azar de diez plantas desde el centro de las dos hileras centrales (cinco de
20 cada hilera) de cada parcela a mapear. El primer mapeo debe realizarse 4 semanas antes de la primera flor (mapa de media estación), un segundo mapeo debe realizarse en la cosecha. Los datos recogidos incluyen el número bollas de la primera posición sobre los cinco nodos de floración inferiores que se cuentan como una indicación de la tolerancia reproductora de las líneas de algodón transgénicas a glifosato. La Tabla 8 ilustra la ventaja de que los promotores de la presente invención han conferido a las plantas de algodón transgénicas para la conservación de
25 bolas. Esta tolerancia reproductora potenciada tiene como resultado una producción de hilo aumentada (Tabla 9) y también una producción de semilla aumentada (Tabla 10).
Tabla 8. Conservación de bola en un mapa de planta de estación media de bolas inferiores de las 5 primeras posiciones
Localización 1 Localización 2
Sin tratar 48 oz/A 64 oz/A Sin tratar 48 oz/A 64 oz/A
(17136)1445 68 67 53 81 63 62
(8068) 502-254-2 87 72 64 77 80 69
(8068) 701-178-2 85 77 60 84 86 76
(8088)53-2 89 81 80 79 76 73
(9153) 178-1 77 83 73 85 71 79 (9153) 60-1 80 89 81 77 82 87 PM1218BR 92 56 63
Tabla 9. Producción de hilo (libras/acre) y porcentaje de producción (Localización 1)
Variedad de cultivo Sin tratar 48oz/A 48oz/A % 64oz/A 64oz/A %
8068-502-254-2-4 1103 960 87,0 % 858 77,8 % 8068-701-178-2-2 1326 1219 91,9 % 1177 88,8 % 9153-60-1-1 1177 1206 102,5 % 1171 99,5 % 9153-178-1-1 1112 769 69,2 % 750 67,4 % 8088-53-2-11 1283 1071 83,5 % 1097 85,5 % 1445 1018 563 55,3 % 490 48,1 % C130 1200 0 0,0 % 0 0,0 % PM 1218 BR 1092 826 75,6 % 713 65,3 %
Tabla 10. Producción de semillas de algodón (libras/acre) y producción en porcentaje (Localización 1)
Variedad de cultivo Sin tratar 48oz/A 48oz/A % 64oz/A 64oz/A %
8068-502-254-2-4 3357 2923 87,1 % 2646 78,8 % 8068-701-178-2-2 3720 3521 94,7 % 3328 89,5 % 9153-60-1-1 3294 3413 103,6 % 3316 100,7 % 9153-178-1-1 3468 2355 67,9 % 2218 64,0 % 8088-53-2-11 3404 2950 86,7 % 2968 87,2 %
1445 2835 1624 57,3 % 1372 48,4 % C130 3272 0 0,0 % 0 0,0 % PM 1218 B/RR 3036 2192 72,2 % 1885 62,1 %
5 Ejemplo 16
La eficacia del promotor híbrido P-FMV-AtEF1a que conduce la expresión de la secuencia codificante CTP2aroA:CP4 (Figura 13, pMON52059) y P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’ (pMON15737) se comparó en Arabidopsis thaliana transgénica. Las plantas de Arabidopsis thaliana transgénica se produjeron por infiltración al vacío (Bechtold et al., C R Acad Paris Life Sci 316: 1194-1199) las semillas se sembraron en suelo en bandejas en una cámara de 10 cultivo ajustada a 24ºC, un ciclo de 16 horas de luz (120 !E m-2 s-1) para permitir el crecimiento normal y el desarrollo de las plantas. Se seleccionaron plantas de Arabidopsis transgénicas tolerantes a glifosato suceso V1 pMON52059 por aplicación de pulverización del herbicida glifosato a una tasa de 1,68 kg/ha (24 onzas/acre), las plantas supervivientes se trasplantaron en macetas individuales. Ocho plantas pMON52059 V1 y ocho plantas homocigotas pMON15737 se pulverizaron una segunda vez correspondiente a la observación de la germinación 15 antes de tiempo, aproximadamente 16 días después de una tasa de 1,68 kg/ha (24 onzas/acre). La segunda pulverización determinará la eficacia de las dos construcciones para conferir tolerancia reproductora. Las plantas se observaron para detectar efectos vegetativos de la aplicación de glifosato. Todas las plantas tuvieron tolerancia vegetativa completa y no se observaron flores anómalas. Sin embargo, el aborto de silicuas producido indicó que la semilla no se había establecido en las silicuas abortadas. La cantidad total de silicuas producidas por cada planta y 20 las silicuas que contenían semillas (silicuas fértiles) se contaron y se clasificaron. Los resultados se muestran en la Tabla 9 e indican que la construcción promotora híbrida pMON52059 demostró una mejora mayor de 10 veces en silicuas fértiles, 89 % en comparación con pMON15737 al 8 %. La cantidad de estructuras fructíferas fértiles se relaciona con la cantidad de semillas que pueden producirse, esto es especialmente importante en cultivos cuyo rendimiento está asociado con el número de semillas. Los cultivos tales como algodón, soja, canola, trigo y maíz son
25 cultivos en los que la tolerancia reproductora a glifosato es esencial para la Buena producción.
pMON52059 pMON15737

Tabla 11. Comparación del promotor híbrido P- FMV-EF1a (pMON52059) y P-FMV (pMON15737) en conferir tolerancia reproductora a glifosato en plantas de Arabidopsis.
Número de
Silicuas Silicuas Porcentaje de Número de Silicuas Silicuas Porcentaje de
Planta
Fértiles Totales Fertilidad Planta Fértiles Totales Fertilidad
8819
39 50 78,0 % 1 74 540 13,7 %
8820
626 691 90,6 % 2 23 600 3,8 %
8821
507 561 90,4 % 3 1 470 0,2 %
8822
0 69 0,0 % 4 20 646 3,1 %
8823
512 534 95,9 % 5 43 717 6,0 %
8827
326 354 92,1 % 6 22 651 3,4 %
8833
432 461 93,7 % 7 178 868 20,5 %
8838
323 374 86,4 % 8 40 520 7,7 %
Total
2765 3094 89,4 % Total 401 5012 8,0 %
Ejemplo 17
El girasol (Helianthus annuus L.) es un cultivo de importancia agronómica para el aceite y como alimento. Las construcciones pMON45325 (Figura 2), pMON45332 (Figura 4) y pMON45331 (Figura 3) de la presente invención se transformaron en girasol. La transformación mediada por Agrobacterium del girasol se ha indicado (Schrammeijer et 5 al., Plant Cell Reports, 9: 55-60, 1990; EP 0 486 234). Los procedimientos conocidos por los expertos en la materia de la transformación de plantas con construcciones de expresión transgénica pueden incluir hipocotiledones, meristemos apicales, protoplasma y otros tejidos del girasol. Las líneas de girasol transgénicas SFB250-27 contienen el casete de expresión de pMON20999 ( P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB288-01, SFB295-09 contiene pMON45325 (P-FMV/CTP2-aroA:CP4/E93’::P-AtAct11 + intrón/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB289-01 contiene
10 pMON45332 (P-AtEF1a + intrón/CTP2-aroA:CP4/E93’::P-eFMV/CTP2-aroA:CP4/E93’); SFB303-08, SFB303-09, SFB303-11 y HA300B contiene pMON45331 (P-AtEF1a + intrón/CTP2-aroA:CP4/E9). Estas líneas se sometieron a ensayo para determinar la tolerancia a glifosato y se muestra en la Tabla 12.
La tolerancia reproductora a glifosato en girasol puede medirse como una función del porcentaje de cabezas normales, porcentaje de tamaño de cabeza normal y producción de polen. Estas plantas se pulverizan con glifosato
15 a en las etapas de hoja V-4 y V-8 a una tasa de 2,14 kg/ha (0,32 oz/acre) o 4,48 kg/ha (64 onzas/acre). Las plantas de girasol se evalúan para determinar la tolerancia vegetativa a glifosato. La tolerancia vegetativa se consigue a 2,24 y 4,48 kg/ha (32 y 64 onzas/acre) niveles de pulverización de glifosato tanto en las etapas V4 como V8 del desarrollo de la planta.
Las líneas de girasol transgénicas tolerantes a glifosato vegetativo se clasifican para el número de cabezas
20 porcentaje de cabezas normal, porcentaje de tamaño de cabeza normal y porcentaje de liberación de polen normal. Estos rasgos se puntúan en un ensayo de campo en una localización. La tabulación de las puntuaciones de cabeza y producción de polen se muestran en la Tabla 12. Las líneas seleccionadas de las construcciones de la presente invención muestran un mayor porcentaje de cabezas normales, generalmente un porcentaje mayor de lo normal de tamaño de cabeza y una mejor liberación de polen.
25 Tabla 12. Puntuaciones de resistencia a glifosato en girasol
Nº de línea Nº de % de cabezas % de tamaño de cabeza % de liberación de cabezasnormal normal polen
SFB250-27 28 29 75 36 SFB288-01 11 36 73 73 SFB295-09 28 57 64 68 SFB289-01 13 38 92 38 SFB303-08 25 68 92 64 SFB303-09 43 81 88 88 SFB305-11 45 71 84 100 HA300B 30 100 97 97 segregante no
0 0 0 0transgénico
Ejemplo 18
Los elementos reguladores de actuación en cis necesarios para una regulación del promotor correcta pueden identificarse mediante diversos medios. En un procedimiento, se realiza análisis de deleción para eliminar regiones
30 del promotor y los fragmentos de promotor resultantes se ensayan para detectar la actividad promotora. Los fragmentos de ADN se consideran necesarios para la regulación del promotor si la actividad del promotor truncado se modifica en comparación con el fragmento promotor original. Aunque este análisis de delección, puede identificar pequeñas regiones de ADN que serán necesarias para la regulación positiva o negativa de la transcripción. Los motivos de secuencia promotora también pueden identificarse y pueden modificarse por ingeniería genética nuevos
35 promotores para contener estos elementos cis para modular la expresión de secuencias que pueden transcribirse unidas operativamente. Véase por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.223.419 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad, la Patente de Estados Unidos Nº 4.990.607 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad y la Patente de Estados Unidos Nº 5.097.025 incorporada en el presente documento por referencia en su totalidad.
40 Una estrategia alternativa es buscar secuencias similares entre promotores con similares perfiles de expresión. Los promotores con modelos de actividad solapantes pueden tener mecanismos reguladores comunes. Pueden usarse diversos programas informáticos para identificar, conservar e identificar motivos entre promotores incluyendo pero sin limitación MEME, SIGNAL SCAN o GENE SCAN. Estos motivos pueden representar sitios de unión para factores de la transcripción que actúan para regular los promotores. Una vez identificados los motivos de secuencia, su
45 función puede someterse a ensayo. Por ejemplo, las secuencias motivo pueden delecionarse del promotor para determinar si el motivo es necesario para una función de promotor correcta. Como alternativa, el motivo puede añadirse a un promotor mínimo para ensayar si es suficiente para activar la transcripción. Los elementos reguladores negativos que se sospecha pueden someterse a ensayo para detectar la suficiencia añadiendo un promotor activo y ensayar para una reducción en la actividad del promotor. Algunos elementos reguladores de actuación en cis pueden requerir otros elementos para funcionar. Por lo tanto, pueden someterse a ensayo elementos múltiples en diversas combinaciones mediante cualquiera de los procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Una vez identificados los elementos promotores funcionales, los elementos promotores pueden modificarse a nivel de nucleótido para influir en la unión de la proteína. Las modificaciones pueden producir afinidades de unión más elevadas o más bajas que podrían influir en el nivel de la transcripción de este promotor.
Los elementos promotores pueden actuar de manera aditiva o sinérgica para influir en actividad promotora. En ese aspecto, los elementos promotores de diferentes regiones reguladoras 5’ pueden colocarse en tándem para obtener un promotor con un espectro diferente de actividad o diferentes perfiles de expresión. Por consiguiente, combinaciones de elementos promotores de fuentes heterólogas o duplicación de elementos similares o el mismo elemento puede conferir un mayor nivel de expresión de secuencias que pueden transcribirse unidas operativamente, por ejemplo, un elemento promotor puede multimerizarse para aumentar los niveles de expresión específicamente en el modelo afectado por el elemento promotor. Los procedimientos técnicos necesarios para la construcción de construcciones de expresión que contienen los nuevos elementos reguladores 5’ modificados genéticamente los conocen los expertos en la materia. Los promotores modificados por ingeniería genética se someten a ensayo en construcciones de expresión y se ensayan transitoriamente mediante unión operativa de los nuevos promotores con respecto a un gen indicador adecuado tal como GUS y se someten a ensayo en un ensayo de planta transitoria. Los nuevos promotores se unen operativamente a uno o más genes de interés y se incorporan en una construcción de transformación de plantas junto con uno o más elementos reguladores adicionales y se transforman en una planta diana de interés mediante un sistema de administración de ADN adecuado. Las plantas transformadas de manera estable y posterior progenie se evalúan mediante cualquier medio molecular de inmunodiagnóstico, bioquímico, fenotípico o de campo adecuado para evaluar la característica ( características) deseada.
Listado de secuencias
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<140> US 60/171,173
<141>
<160> 30
<170> PatentIn version 3.0
<210> 1
<211> 39
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 1 ttttttttga tatcaagctt caactatttt tatgtatgc 39
<210> 2
<211> 47
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 2 gcctcagcca tggtgagtct gctgcaaaca cacaaaaaga gttcaat 47
<210> 3
<211> 42
<212> ADN
<213> Artificial
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 4 gcatcggcca tggtgagtct tctgcaatca aaaacataaa gatctga 47
<210> 5
<211> 40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 5 ttttttttta agcttgatat cacaaccaaa tgtcaaatgg 40
<210> 6
<211> 26
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 6 ccatctgcca tggtctatat cctgtc 26
<210> 7
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 7 ttttttttta agcttgatat cggaagtttc tctcttg 37
<210> 8
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 8 cttttcccat ggtagatctc tggtcaacaa atc 33
<210> 9
<211> 1219
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 9 <210> 10
<211> 1271 5 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221>
misc_feature 10 <222> (535)..(536)
<223> y = c ó t/u
<220>
<221>
misc_feature 15
<222> (561)..(561)
<223> y = c ó t/u
<400> 10
<210> 11
<211> 1393
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 11
<210> 12
<211> 1160 5 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<220>
<221> misc_feature 10 <222> (565) .. (565)
<223> y = c ó t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (571)..(571)
<223> y = c ó t/u
5
<220>
<221> misc_feature
<222> (638)..(638)
<223> n = a ó g ó c ó t/u
10
<220>
<221> misc_feature
<222> (656)..(656)
<223> n = a ó g ó c ó t/u
15
<400> 12
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 13 cccaagctta aatgacatca gatacacgc 29
<210> 14
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 14 cataagctta gaggtccaaa ttca 24
<210> 15
<211> 32
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 15 ccatcagcca tggtcttcta cctttatgca aa 32
<210> 16
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 16 ccaagcttac cacactcaga tgcataaaca aacaca 36
<210> 17
<211> 31
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 17 catcagccat ggtctactct ctgcaaaaac a 31
<210> 18
<211> 27
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 18 gcaaagctta ctagtcaaca attggcc 27
<210> 19
<211> 28
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 19 gatcggccat ggttcactaa aaaaaaag 28
<210> 20
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Oligonucleótido Sintético
<400> 20 ggaagcttgc ggccgctttc tactctacat gtttct 36
<210> 21
<211> 31
<212> ADN
<213> Oligonucleótido Sintético
<400> 21 gactagccgc catggttcaa tctctagctg a 31
<210> 22
<211> 1578
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 22
<210> 23
<211> 1468
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 23
<210> 24
<211> 1642
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 24
<210> 25
<211> 1241
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
5 <220>
<221> misc_feature
<222> (26) .. (26)
<223> n = a ó g ó c ó t/u 10
<400> 25
<210> 26 15 <211> 1313
<212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 26
<210> 27
<211> 1946 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220> 10 <223> Sintético
<400> 27
<210> 28
<211> 1695
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<220>
<221> misc_feature
<222> (1198)..(1198)
<223> n = a o g o c o t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (1216)..(1216)
<223> n = a ó g ó c ó t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (1125)..(1125)
<223> y = c ó t/u
<220>
<221> misc_feature
<222> (1131)..(1131)
<223> y = c ó t/u
<400> 28
<210> 29
<211> 1800
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223>
Sintético 10
<220>
<221> misc_feature
<222> (1068)..(1069)
<223>
y = c ó t/u 5
<220>
<221> misc_feature
<222> (1094)..(1094)
<223>
y = c ó t/u 10
<400> 29
<210> 30
<211> 1742
<212> ADN 5 <213> Artificial
<220>
<223> Sintético 10
<400> 30

Claims (30)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un promotor híbrido que comprende la secuencia como se expone en la SEC ID Nº 28.
  2. 2.
    Una construcción de ADN que comprende: uno o más casetes de expresión que comprenden el promotor híbrido de la reivindicación 1 y una secuencia de ADN estructural unida operativamente al promotor híbrido.
  3. 3.
    La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que dicha secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una región 3’ no traducida.
  4. 4.
    La construcción de ADN de la reivindicación 2 ó 3, en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de tolerancia a herbicida.
  5. 5.
    La construcción de ADN de la reivindicación 4, en la que el gen de tolerancia a herbicida es un gen de tolerancia a glifosato.
  6. 6.
    La construcción de ADN de la reivindicación 5, en la que el gen de tolerancia a glifosato es un gen de la 5enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSP sintasa) o un gen de glifosato oxidorreductasa (GOX).
  7. 7.
    La construcción de ADN de la reivindicación 5, en la que el gen de tolerancia a glifosato es un gen aroA:CP4.
  8. 8.
    La construcción de ADN de la reivindicación 7, en la que el gen aroA:CP4 está además unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un péptido de transito de cloroplasto (CTP), en el que dicho CTP es el CTP2 de Arabidopsis (CTP2-aroA:CP4).
  9. 9.
    La construcción de ADN de la reivindicación 3, en la que la región 3’ no traducida comprende un terminador de la transcripción.
  10. 10.
    La construcción de ADN de la reivindicación 8 ó 9, en la que el CTP2-aroA:CP4 está además unido operativamente a la región de terminación 3’ E9 (CTP2-aroA:CP4-E9 3’).
  11. 11.
    La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que el uno o más casetes de expresión comprenden un promotor híbrido de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4 como se muestra en la FIG. 11 ó 13, cuya secuencia ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y una región de terminación 3’ E9.
  12. 12.
    La construcción de ADN de la reivindicación 2 que comprende un primer y un segundo casete de expresión como se muestra en la Figura 7, en la que el primer casete de expresión comprende un promotor híbrido de la reivindicación 1 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4, cuya secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y la región de terminación 3’ E9, y el segundo casete de expresión comprende un promotor híbrido de CaMV:Act8 unido operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica una EPSPS de aroA:CP4, cuya secuencia de ADN estructural está además unida operativamente a una secuencia de ADN estructural que codifica un CTP2 y la región de la terminación 3’ E9.
  13. 13.
    La construcción de ADN de la reivindicación 2, en la que la secuencia de ADN estructural es un gen de control de insectos de Bacillus thuringiensis.
  14. 14.
    Una célula de planta transgénica que comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
  15. 15.
    Una planta transgénica que comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
  16. 16.
    La planta transgénica de la reivindicación 15, caracterizada además por tener tolerancia vegetativa al glifosato y mostrar daño a glifosato bajo para el tejido reproductor.
  17. 17.
    La planta transgénica de la reivindicación 16, en la que la planta es capaz de tolerar la exposición a glifosato a una tasa de hasta 17,93 kg/ha (256 oz/acre).
  18. 18.
    La planta transgénica de la reivindicación 16, en la que la planta es capaz de tolerar la exposición a glifosato a una tasa que varía de 1,12 a 4,48 kg/ha (de 16 a 24 oz/acre).
  19. 19.
    La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dicha planta transgénica es una especie de cultivo monocotiledónea.
  20. 20.
    La planta transgénica de la reivindicación 19, en el que dicho cultivo monocotiledóneo es cebada, maíz, arroz, sorgo o trigo.
  21. 21.
    La planta transgénica de una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en la que dicha planta es una especie
    de cultivo dicotiledóneo.
  22. 22.
    La planta transgénica de la reivindicación 21, en el que dicho cultivo dicotiledóneo es alfalfa, tomate, soja, algodón, canola o girasol.
  23. 23.
    La planta transgénica de la reivindicación 22, en la que dicho cultivo dicotiledóneo es algodón que comprende la construcción de ADN como se muestra en la FIG. 7, teniendo dicho algodón un valor de mapa de bola mayor que o igual a 3 después de una exposición a glifosato después de la etapa de 4 hojas, en el que el valor de mapa de bola se determina pulverizando el algodón después de la etapa de 4 hojas con glifosato a una tasa de 3,36 kg/ha (48 oz/acre), permitiendo que la planta de algodón se desarrolle hasta la madurez y determinando la cantidad de bolas de primera posición para las cinco primeras bolas.
  24. 24.
    Una semilla de la planta transgénica de la reivindicación 15, en la que dicha semilla comprende dicha construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
  25. 25.
    Una semilla de acuerdo con la reivindicación 24, en la que dicha semilla es una semilla transgénica seleccionada del grupo que consiste en semillas de Arabidopsis thaliana, soja, canola, trigo, maíz, algodón y tomate.
  26. 26.
    Un producto útil desde el punto de vista agronómico procesado a partir de la plante transgénica de la reivindicación 15, en el que el producto comprende la construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13.
  27. 27.
    Uso del promotor híbrido de la reivindicación 1 en la construcción de una planta transgénica, en la que dicha planta transgénica comprende dicho promotor híbrido.
  28. 28.
    Un procedimiento para producir una planta transgénica, que comprende regenerar la célula de la planta transgénica de la reivindicación 14 en una planta transgénica, en la que dicha planta transgénica comprende dicha construcción de ADN.
  29. 29.
    Un procedimiento para expresar una secuencia de ADN estructural en una planta, comprendiendo el procedimiento:
    (1)
    proporcionar una construcción de ADN de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13;
    (2)
    introducir la construcción de ADN en una célula vegetal; y
    (3)
    regenerar la célula vegetal para producir la planta de tal manera que la secuencia de ADN estructural pueda expresarse en la planta.
  30. 30.
    Un procedimiento para el control de malezas, comprendiendo el procedimiento:
    (1)
    proporcionar una planta de cultivo transformada con una construcción de ADN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12; y
    (2)
    aplicar a la planta de cultivo una cantidad suficiente de glifosato para controlar las malezas sin dañar a la planta de cultivo.
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